WO2007085464A1 - Regulatorische und cytotoxische cd8+ t-zellen - Google Patents

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WO2007085464A1
WO2007085464A1 PCT/EP2007/000667 EP2007000667W WO2007085464A1 WO 2007085464 A1 WO2007085464 A1 WO 2007085464A1 EP 2007000667 W EP2007000667 W EP 2007000667W WO 2007085464 A1 WO2007085464 A1 WO 2007085464A1
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Thomas Luger
Thomas Brzoska
Stephan Grabbe
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Universität Duisburg-Essen
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    • C12N2501/85—Hormones derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C12N2501/86—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing regulatory and cytotoxic CD8 + T cells.
  • the cells according to the invention can advantageously be used for the treatment of unwanted immune reactions, for example for the treatment of autoimmune diseases, inflammatory bowel diseases and allergies.
  • the present invention furthermore relates to the use of the cells according to the invention for the treatment of cancerous diseases, in particular of skin cancer.
  • the task of the immune system is to protect the organism from a variety of diseases and enemies, such as viruses or bacteria.
  • the innate immunity and adaptive immunity are responsible for specific reactions in which attackers or their own, degenerate cells are specifically eliminated.
  • the adaptive immune system between "self” and “foreign” too can distinguish. It is also necessary to distinguish between foreign antigens that pose a threat and those that are foreign but do not pose a threat to the organism.
  • the malfunction of these very sensitive detection mechanisms leads to a variety of diseases ranging from allergies to autoimmune diseases.
  • the high level of complexity of the immune system allows one to deal with an extraordinarily large number of disease-causing factors, but at the same time it is the source of errors that occur when dysregulations occur.
  • Another common type of error is the persistence or overshoot of inflammatory responses. In these cases, an immune response has been triggered and will no longer be switched off or turned on, e.g. by multiple triggering stimuli, out of control. Both can lead to serious damage to the organism.
  • T cells are an important component of the adaptive immune response and can participate in both of the described types of errors.
  • T cells are initially present in a dormant, naive form in the lymphoid organs, especially in the lymph nodes and the spleen.
  • Antigen presenting cells such as e.g. Dendritic cells are able to activate T cells. This is done by contact of the antigen bound on the surface of the antigen-presenting cells with the T-cell receptor on the surface of the T-cell.
  • These T cell receptors have a high diversity, which leads to the fact that an extremely large number of antigens can be recognized.
  • T cells which, in addition to contact with the antigen, also requires a few more cell-cell contacts between antigen-presenting cell and T cell. Activation of the T-cell causes it to proliferate rapidly, and the resulting cells begin to migrate from the lymphoid tissues to other tissues and organs. These T cells then specifically attack the foreign aggressor.
  • the contact between T cells and antigen-presenting cells can be influenced by a number of mediators. It can be directly mediated either by an influence of the mediators on the antigen presenting cells or on the T cells. It is possible that instead of activating the T-cell, elimination of the T-cell occurs, as a result of which, for example, autoimmunity can be avoided. In other cases, it may happen that a subtype of T cells is created, which is a regulatory or suppressor phenotype and is able to specifically suppress the activity of other T cells (regulatory T cells, T reg ).
  • T cells can lead to the generation of different types of these T re g cells.
  • An important distinction is the division into CD4 + and CD8 + regulatory T cells.
  • ⁇ -melanocyte stimulating hormone ⁇ -melanocyte stimulating hormone
  • This peptide hormone which is only 13 amino acids in size, has potent antiinflammatory properties and is able to influence a large number of cells via its melanocortin receptor receptors.
  • ⁇ -MSH for example, its C-terminal tripeptide KPV (amino acids: Lys-Pro-Val) and the related KPT (amino acids: Lys-Pro-Thr) and the dipeptide KP (amino acids: Lys-Pro) have anti-inflammatory properties.
  • ⁇ -MSH is able to directly influence both dendritic cells and T cells.
  • the exact mechanism of action of the action of ⁇ -MSH and also of the smaller peptides is currently not fully understood. However, it is believed that at least some of the effects mediated by these molecules are due to inhibition of activation of the central transcription factor NF- ⁇ B.
  • TGF- ⁇ 2 transforming growth factor ⁇ 2
  • An object of the present invention is to provide an effective means of treating unwanted immune reactions. Another object is to provide a means of treating cancerous diseases.
  • the subject matter of the present invention is therefore a process for the production of T cells which comprises the following steps:
  • naive and / or CD8 + T cells a) providing naive and / or CD8 + T cells; and b) contacting the naive and / or CD8 + T cells with ⁇ -MSH or a biologically active derivative or fragment thereof.
  • the starting T cells are usually CD8 + , the T cells produced preferably have regulatory and / or cytotoxic potential.
  • regulatory T cells refers to T lymphocytes whose main function is to suppress and / or regulate immune responses. Regulatory T cells are suppressive and mostly anergic. Regulatory T cells are characterized by the presence of the transcription factor Foxp3. There is a suppressive effect of regulatory T cells if they can inhibit the proliferation of responder cells in an experiment according to Example 2B.
  • the regulatory T cells express the molecules neuropilin-1, GIT receptor and Foxp3.
  • Activated T cells differ from regulatory T cells in that they are non-suppressive and have no Foxp3 expression.
  • cytotoxic refers to T cells which have the ability to express cytotoxic molecules, to destroy other cells, or else to have the ability to infiltrate into tumors more intensively and to reduce tumor growth.
  • One possible assay for the determination of cytotoxicity is shown in Example 4 in conjunction with Figure 4C.
  • Neive T cells in the sense of the present invention are T cells which are present in a dormant form in the lymphoid organs and have not yet reacted with antigen-presenting cells, such as e.g. dendritic cells have come into contact. Naive T cells did not yet have contact with "their specific antigen.” Naive T cells are usually negative for the markers CD44 and CD69.
  • T cells are provided.
  • T cells can be obtained from blood.
  • lymphocytes are obtained from the patient's blood by Bicoll gradient centrifugation, followed by further purification of the T cells by means of magnetic cell separation (eg by means of anti-GD3 antibody) according to the manufacturer of the cell separation kits (Miltenyi Biotech , Bergisch Gladbach).
  • the T cells it is possible for the T cells to be subjected to an enrichment step before they are brought into contact in step b) of the process according to the invention.
  • the T cells must first be cultured and expanded ex vivo after isolation from the blood.
  • Possible enrichment processes according to the invention are well known to the person skilled in the art. Particularly preferred is in the context of the present Invention an enrichment of CD8 + cells.
  • Enrichment of CD8 + cells can be carried out by conventional methods, for example by magnetic separation or FACS, (see, for example, cell separation kits from Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach or "Gunzer, Weishaupt, Planelles, Grabbe (2001) Two-step negative enrichment of CD4 + and CD8 + T cells from murine spike via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J Immunol Methods, 2001 Dec 1; 258 (1-2): 55-63 ").
  • an enrichment of naive T cells can take place, for example by depletion or depletion of CD69 + and / or CD44 + T cells.
  • the cell population contacted with ⁇ -MSH or a derivative or fragment thereof typically contains at least 10%, or at least 20%, preferably at least 30% or at least 40%, more preferably at least 50%, most preferably at least 75% naive T cells (based on the total number of T cells in the composition).
  • the cell population contacted with ⁇ -MSH or a fragment or derivative thereof is at least 10%, preferably at least 25%, more preferably at least 50%, even more preferably at least 75%, most preferably at least 90%.
  • the ⁇ -MSH which can be used according to the invention has the following amino acid sequence:
  • biologically active fragments or biologically active derivatives of ⁇ -MSH are those fragments and derivatives of ⁇ -MSH which can be used in the method of the present invention instead of the ⁇ -MSH and lead to the formation of regulatory and cytotoxic CD8 + T cells.
  • Naturally occurring amino acids usually have the (L) -configuration.
  • the amino acids of the ⁇ -MSH which can be used in the method according to the invention can be present either in (L) or (D) configuration. Accordingly, the ⁇ -MSH which can be used according to the invention can have an amino acid sequence in all statistically possible configuration combinations.
  • the amino acids of the biologically active fragments of the ⁇ -MSH which can be used according to the invention can likewise have all the configuration combinations described above.
  • ⁇ -MSH which can be used according to the invention and the biologically active fragments thereof can also have amino acid exchanges, one of the amino acids being exchanged conservatively.
  • the compounds which can be used according to the invention can be chemically modified at the N-terminus and / or at the C-terminus. This is possible, for example, by an acylation at the N-terminus and / or an amidation or esterification at the C-terminus. Possible groups at the N-terminus are acetyl, propionyl, butyryl, etc. These groups may optionally be substituted. Possible groups at the C-terminus are optionally mono- or dialkylated amide groups of the formula -NR 1 R 2 , where R 1 and R 2 independently of one another are H or C 1 -C 4 -alkyl! are.
  • ⁇ -MSH or “biologically active derivative or fragment thereof” also encompasses the corresponding pharmaceutically acceptable salts of the compounds.
  • the naive and / or CD8 + T cells can be brought into contact with ⁇ -MSH or a biologically active derivative or fragment thereof for about 1 to about 120 hours.
  • the T cells are contacted for 12 to 72 hours with ⁇ -MSH or a biologically active derivative or fragment thereof, with a period of 24 to 48 hours being particularly preferred.
  • the ⁇ -MSH or biologically active derivative or fragment thereof used in the method according to the invention can be used in a concentration of about 10 -15 to about 10 -2 M.
  • a concentration of 10 "13 to 10" 4 M is more preferably a concentration of 10 "11 to 1CT 6 M, more preferably at a concentration of 10 -10 to 10 '8, wherein a concentration of 10 9 M particularly preferably ,
  • the method is a pure in vitro method, ie all method steps take place in vitro / ex vivo.
  • the method comprises the step of obtaining naive and / or CD8 + T cells from the human body.
  • the T cells are preferably human T cells.
  • step b It is also possible to carry out one or more of the enrichment steps described above (eg for naive and / or CD8 + T cells) after step b).
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells which can be prepared by the process according to the invention are distinguished by the ability to express cytotoxic molecules such as granzyme A, granzyme B, CTLA-4 and perforin. These molecules are also expressed to an increased degree by CD8 + T cells activated by contact with antigen presenting cells. However, these imprinted cells express those for the regulatory T-cell type characteristic molecules neuropilin-1, GIT receptor and Foxp3 not increased.
  • the present invention also relates to cells obtainable by the method according to the invention.
  • these cells express at least one, at least two, at least three or all four of the molecules granzyme A, granzyme B, CTLA-4 and perforin to an increased extent.
  • the cells according to the invention express neuropilin, GIT receptor and / or Foxp3, preferably to an increased extent.
  • Expression "at an increased level” means at least 20%, preferably at least 50%, most preferably at least 100% increased expression relative to corresponding cells not contacted with ⁇ -MSH or a biologically active fragment or derivative thereof.
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells according to the invention can be used for the treatment and / or prevention of immune reactions. These are preferably human cells, preferably autologous human cells. It is also possible to use the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells according to the invention for the treatment of diseases which are caused by immune reactions or are associated with immune reactions. These include autoimmune diseases, allergies, inflammatory bowel disease, but also overshooting immune reactions.
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells according to the invention are preferably used in the context of the diseases listed above for the treatment of contact allergies and immune reactions due to viral infections or infections with superantigens.
  • a viral infection may be an inherently desirable immune response, but may become out of control due to excessive activation of defense responses, which may result in tissue damage and even death.
  • a viral infection may be an inherently desirable immune response, but may become out of control due to excessive activation of defense responses, which may result in tissue damage and even death.
  • CD8 + T-Ze! Ens an overactivation of the immune system by these cells reduce the number of effector T cells by their regulatory and cytotoxic effect and thus mitigate the immune response.
  • Such harmful, attributable to T cells, immune reactions are z.
  • Superantigens can activate many T cells, resulting in the production of high levels of cytokines and can lead to a clinical syndrome similar to septic shock.
  • Certain staphylococcal enterotoxins are superantigens.
  • Superantigens bind antigen presenting at non-polymorphic regions of MHC II molecules on cells and interact with conserved regions of TCR V beta domains.
  • Autoimmune diseases that can be treated include the following diseases: Hashimoto's thyroiditis, Graves' disease, sympathetic ophthalmia, Addison's disease, pernicious anemia, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, scleroderma, Sjogren's syndrome, haemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenic purpura and idiopathic leukopenia.
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells of the present invention may also be useful in reducing or preventing damage associated with autoimmune diseases or other types of unwanted immune response, such as: As allergies, are used. Such allergies are, in particular, contact allergies.
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells according to the invention can also be used for the treatment of diseases in which there is a lack of such cells.
  • This is z. B. in connection with inflammatory bowel disease possible.
  • the inflammatory bowel disease may be for example Crohn's disease or ulcerative colitis.
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells according to the invention can also be used for the treatment, prevention and / or aftercare of cancerous diseases. Since the regulatory CD8 + T cells obtained by the method according to the invention have an increased cytotoxic activity, it is possible to use them for example in tumor therapy. Cancerous diseases in the The purposes of the present invention include major tumors, metastases and / or tumor remnants.
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells obtained by the method according to the invention are used for the treatment of skin cancer and / or melanoma:
  • the inventors found that regulatory and cytotoxic CD8 + T cells generated by the method according to the invention migrate in large numbers into melanomas in vivo, where their cytotoxic activity leads to a significant reduction in tumor growth (see Example 5).
  • Other cancers that can be treated according to the invention include breast cancer, colon cancer, lung cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver cancer, leukemia and bladder cancer.
  • Treatment with the cells of the invention may be combined with established cancer therapy, e.g. with the treatment by chemotherapeutics, radiation, differentiation-inducing agents, etc.
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells of the invention are preferably administered intraperitoneally, subcutaneously or intravenously.
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells according to the invention can already be used alone for the cell-therapeutic treatment of tumors, a combination with tumor-specific activated antigen-presenting cells is also possible. In such a combination or co-application, an additional activation of the body's immune system by these antigen-presenting cells is used.
  • the antigen-presenting cells are preferably dendritic cells (Banchereau J, Pakucka AK, Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer, Nat Rev Immuno! 2005 Apr; 5 (4): 296-306; Gunzer M, Grabbe S.
  • the combination or co-application can take place simultaneously or at intervals. Furthermore, it is possible that this combination or co-application in any order and in different proportions. According to the invention, a time interval of up to 7 days is possible, wherein a time interval of 1 to 5 days is preferred and a time interval of 1 to 2 days is particularly preferred. According to the invention, it is therefore conceivable that the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells generated by the method according to the invention are administered before the tumor-specific activated antigen-presenting cells or that the tumor-specific activated antigen-presenting cells are administered first.
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells generated by the method according to the invention can be present in a ratio of 1: 10,000 to 1000: 1 to the tumor-specific activated antigen-presenting cells.
  • the ratio of the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells according to the invention to the antigen-presenting cells is preferably 1:10 to 8: 1, a ratio of 1: 2 to 2: 1 being particularly preferred.
  • compositions containing the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells of the invention are a pharmaceutical composition, wherein pharmaceutical compositions for the treatment and / or prevention of immune reactions or of diseases caused by immune reactions or associated with immune reactions, and pharmaceutical compositions for the treatment, prevention and / or Aftercare of cancerous diseases are particularly preferred. All embodiments described above are included in this composition in an analogous manner.
  • the regulatory and cytotoxic CD8 + T cells of the invention are usually mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • ⁇ -MSH or a biologically active derivative or fragment thereof for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of diseases caused by immune reactions or associated with immune reactions.
  • ⁇ -MSH or a biologically active derivative or fragment thereof can be used for the production of a medicament for the treatment, prevention and / or aftercare of cancerous diseases.
  • Figure 1 shows that CD8 + T cells exposed to ⁇ -MSH show a marked upregulation of MC-1 receptor expression.
  • Figure 2A shows the IFN (interferon) - ⁇ , TNF (tumor necrosis factor) - ⁇ and IL (interleukin) -10 production of ⁇ -MSH and PBS-treated CD4 + and CD8 + T cells, respectively.
  • Figure 2B shows the suppression of proliferation of CD4 + and CD8 + T cells by ⁇ -MSH stimulated CD8 + T cells.
  • Figure 3A shows that ⁇ -MSH and KPV stimulated CD8 + T cells significantly suppress the induction of a contact allergy reaction.
  • Figure 3B shows that ⁇ 4-MSH-stimulated CD4 + T cells do not suppress the contact allergy reaction.
  • Figure 4A shows that up-regulation of cytotoxic gene expression occurs in ⁇ -MSH stimulated CD8 + T cells.
  • Figure 4B shows that an upregulation of the expression of cytotoxic genes takes place in KPV-stimulated CD8 + T cells.
  • Figure AC shows that CD8 + T cells treated with ⁇ -MSH have a higher cytotoxic potential than PBS-treated CD8 + T cells.
  • Figure 5 shows that tumor growth on vaccination with CD8 * T cells previously treated with ⁇ -MSH results in a significant reduction in tumor growth.
  • T cells To detect the expression of MC receptors on the surface of T cells, single cell suspensions from the spleens and lymph nodes of C57BL / 6 mice were prepared and subsequently the CD4 + and CD8 + T cells isolated by magnetic separation. Both T-cell populations were incubated for 48 h with ⁇ -MSH (10 "9 molar) or PBS stimulated, followed by the isolation of total RNA using the RNeasy kit from Qiagen and the synthesis of cDNA using the reverse transcriptase Kits from MBI Fermentas The sequence coding for the individual MC receptors was amplified by means of specific primers in RT-PCR reactions and the products were analyzed by gel electrophoresis.
  • CD4 + and CD8 + cells were also examined. It was found that a small number of CD8 + T-cells at mRNA level also show an expression of the mRNA for MC-2R and MC-3R, while unstimulated CD4 + T-cells do not have any mRNA for one of the MC-Rs. Express 4. After treatment with ⁇ -MSH, there was a slight increase in MC-1R expression at mRNA level in CD4 + cells, which, however, was not observed at the protein level.
  • CD4 + and CD8 + T-Zelien were isolated from the spleens and lymph nodes of naive C57BL / 6 mice by magnetic cell separation and stimulated for 48 hours with ⁇ -MSH (10 '9 molar). Subsequently, the T cells were incubated for a further 4 days at 37 0 C in the presence of 5% CO 2 and anti-CD3 and anti-CD28 and the cytokines in the cell culture supernatant using the Cytometric Bead Array of Becton Dickinson after the Information provided by the manufacturer. Results
  • CD4 + and CD8 + T cells were isolated from the spleens and lymph nodes of naive C57BL / 6 mice by magnetic cell separation and mixed 1: 1 with PBS or ⁇ -MSH stimulated CD4 + or CD8 + T cells. These co-cultures were stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 and cultured for 4 days at 37 0 C in the presence of 5% CO2. For the last 16 h of culture, 1 ⁇ Ci of 3 H thymidine was added to the batches and subsequently thymidine incorporation was determined by scintillation measurement. Some of these suppression assays were performed in Transwell plates (pore size 3 ⁇ m) to inhibit direct cell-cell contact and exclude the influence of soluble mediators on the observed effect.
  • C57BL / 6 mice were epicutaneously sensitized on the shaved back with 0.5% dinitrofluorobenzene (DNFB) dissolved in acetone / olive oil (4: 1).
  • DNFB dinitrofluorobenzene
  • 12 ⁇ l of 0.3% DNFB was applied to the left ear of the sensitized animals 5 days after sensitization.
  • the extent of the contact allergy was determined by measuring the ear swelling of the treated left compared to the untreated right ear.
  • 2 ⁇ 10 6 T cells previously treated with PBS, ⁇ -MSH or KPV were injected intravenously into the sensitized mice 24 hours prior to initiation of the contact allergy reaction.
  • T cells were contacted only with ⁇ -MSH, but not with an antigen, it can be assumed that the effects observed are an antigen-unspecific effect of the T cells. It is primarily a cytotoxic activity of these ⁇ -MSH treated T cells into consideration.
  • 51 chromium release assays were performed to determine the cytotoxic potential of ⁇ -MSH stimulated CD8 + T cells.
  • MC57-G target cells were loaded with 51 chromium and co-incubated with previously activated PBS or ⁇ -MSH treated CD8 + T cells. After a 3-day coculture, the culture supernatants were harvested, transferred to a scintillation plate, and 51 Cr released in a scintillation counter.
  • 50,000 B16 melanoma cells were injected subcutaneously in C57BL / 6 mice.
  • the first therapeutic vaccination was carried out by injecting 5 ⁇ 10 6 PBS or ⁇ -MSH-treated CD8 + T cells intravenously into the tumor-bearing C57BL / 6 mice.
  • the second therapeutic vaccination was 8 days after injection of the melanoma cells.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zu Herstellung regulatorischer und cytotoxischer CD8+ T-Zellen. Die erfindungsgemäßen Zellen können vorteilhafterweise zur Behandlung unerwünschter Immunreaktionen eingesetzt werden, beispielsweise zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, entzündlichen Darmerkrankungen und Allergien. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellen zur Behandlung canceröser Erkrankungen, insbesondere von Hautkrebs.

Description

Regulatorische und cytotoxische CDS* T-Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zu Herstellung regulatorischer und cytotoxischer CD8+ T-Zellen. Die erfindungsgemäßen Zellen können vorteilhafterweise zur Behandlung unerwünschter Immunreaktionen eingesetzt werden, beispielsweise zur Behandlung von Autoimmunerkrankuπgen, entzündlichen Darmerkrankungen und Allergien. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellen zur Behandlung canceröser Erkrankungen, insbesondere von Hautkrebs.
Die Aufgabe des Immunsystems ist es, den Organismus vor einer Vielzahl von Erkrankungen und Feinden, wie Viren oder Bakterien, zu schützen. Hierbei kommen beide unterschiedlichen, aber eng miteinander verzahnten Bereiche der Immunabwehr zu tragen: die angeborene Immunität und die adaptive Immunität. Insbesondere die adaptive Immunität ist für spezifische Reaktionen verantwortlich, bei denen Angreifer oder eigene, entartete Zellen gezielt eliminiert werden. In diesem Zusammenhang ist es von großer Bedeutung, dass das adaptive Immunsystem zwischen "Selbst" und "Fremd" zu unterscheiden vermag. Auch muss zwischen solchen Fremd-Antigenen unterschieden werden, die eine Bedrohung bedeuten und solchen, die zwar fremd sind, aber keine Gefahr für den Organismus bedeuten. Die Fehlsteuerung dieser sehr sensitiven Erkennungsmechanismen führt zu einer Vielzahl von Erkrankungen, die von Allergien bis zu Autoimmunerkrankungen reichen.
Die hohe Komplexität des Immunsystems erlaubt somit also einerseits den Umgang mit einer außerordentlich großen Zahl krankheitsauslösender Faktoren, birgt aber zugleich die Quelle für Fehler, die auftreten, wenn es zu Dysregulationen kommt. Ein weiterer, verbreiteter Fehlertyp ist das Persistieren oder Überschießen von Entzündungsreaktionen. In diesen Fällen wurde eine Immunreaktion ausgelöst und wird nicht mehr abgeschaltet oder gerät, z.B. durch mehrfach auftretende auslösende Reize, außer Kontrolle. Beides kann zu schweren Schäden am Organismus führen.
T-Zellen sind ein wichtiger Bestandteil der adaptiven Immunantwort und können an beiden der beschriebenen Fehlertypen teilhaben. T-Zellen liegen zunächst in einer ruhenden, naiven Form in den lymphoiden Organen vor, insbesondere in den Lymphknoten und der Milz. Antigen-präsentierende Zellen wie z.B. dendritische Zellen vermögen T-Zellen zu aktivieren. Dies geschieht durch einen Kontakt des auf der Oberfläche der Antigen- präsentierenden Zellen gebundenen Antigens mit dem T-Zell-Rezeptor auf der Oberfläche der T-ZeIIe. Diese T-Zell-Rezeptoren weisen eine hohe Vielfalt auf, die dazu führt, dass eine außerordentlich große Anzahl von Antigenen erkannt werden kann. Dadurch kommt es zu einer spezifischen, sogenannten klonalen Aktivierung von T-Zellen, die über den Kontakt zum Antigen hinaus auch noch einige weitere Zell-Zell-Kontakte zwischen antigen- präsentierender Zelle und T-ZeIIe erfordert. Die Aktivierung der T-ZeIIe führt dazu, dass diese beginnt, stark zu proliferieren und die entstehenden Zellen beginnen aus den lymphatischen Geweben in andere Gewebe und Organe auszuwandern. Diese T-Zellen attackieren sodann in spezifischer Weise den fremden Angreifer.
Der Kontakt zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen kann durch eine Anzahl von Mediatoren beeinflusst werden. Er kann entweder durch einen Einfluss der Mediatoren auf die Antigen-präsentierenden Zellen oder auf die T-Zellen direkt vermittelt werden. Dabei ist es möglich, dass es anstelle der Aktivierung der T-ZeIIe zu einer Eliminierung der T-ZeIIe kommt, wodurch z.B. eine Autoimmunität vermieden werden kann. In anderen Fällen kann es dazu kommen, dass ein Subtyp von T-Zellen entsteht, der einen regulatorischen bzw. suppressorischen Phänotyp hat und die Aktivität anderer T-Zellen gezielt zu unterdrücken vermag (regulatorische T-Zellen; Treg).
Die Induktion regulatorischer T-Zellen kann zur Generierung unterschiedlicher Typen ebendieser Treg-Zellen führen. Eine wichtige Unterscheidung ist die Einteilung in CD4+ und CD8+ regulatorische T-Zellen. Schließlich ist zu unterscheiden, ob die regulatorische Aktivität dieser T-Zellen über Kontakt-abhängige Mechanismen oder über soluble Mediatoren vermittelt wird.
Einer der Mediatoren, der über seinen Einfluss auf Antigen-präsentierende dendritische Zellen auf diese Weise eine Hapten-spezifische T-Zell-vermittelte Toleranz zu induzieren vermag, ist das α-Melanozyten-stimulierende Hormon (α-MSH). Dieses nur 13 Aminosäuren große Peptidhormon besitzt potente antiinflammatorische Eigenschaften und vermag über seine Rezeptoren aus der Familie der Melanocortin-Rezeptoren eine Vielzahl von Zellen zu beeinflussen. Neben α-MSH weisen beispielsweise auch sein C-terminales Tripeptid KPV (Aminosäuren: Lys-Pro-Val) und das verwandte KPT (Aminosäuren: Lys-Pro- Thr) sowie das Dipeptid KP (Aminosäuren: Lys-Pro) antientzündliche Eigenschaften auf.
Es ist bereits bekannt, dass α-MSH sowohl dendritische Zellen als auch T-Zellen direkt zu beeinflussen vermag. Der genaue Wirkmechanismus der Wirkung von α-MSH und auch der kleineren Peptide ist aber zur Zeit noch nicht völlig aufgeklärt. Man nimmt jedoch an, dass zumindest ein Teil der von diesen Molekülen vermittelten Effekte auf einer Inhibition der Aktivierung des zentralen Transkriptionsfaktors NF-κB beruht.
Die gleichzeitige Behandlung dendritischer Zellen ex vivo mit einem Antigen und α-MSH bzw. einem der kleineren Peptide führt dazu, dass diese dendritischen Zellen nach Injektion in naive Mäuse eine Hapten-spezifische Toleranz induzieren. Hierzu reicht es aus, die Zellen für drei Stunden mit α-MSH in einer Konzentration von 10"11 M zu stimulieren (WO 02/064131). Eine solche Methode zur Induktion von Toleranz ist gut dazu geeignet, z.B. Autoimmunerkrankungen zu behandeln oder zu vermeiden. Ebenso kann ein solches Verfahren zur Verhinderung von Transplantatabstoßungen verwendet werden, oder um überschießende Immunreaktionen zu dämpfen bzw. zu beenden.
Neben der indirekten Beeinflussung von T-Zellen über dendritische Zellen ist aber auch ein direkter Effekt von α-MSH bzw. der kleineren Peptide auf T-Zellen möglich. Von Neumann- Andersen et al. (G. Neumann Andersen et al., 2001 , Clin. Exp. Immunol. 126: 441-446) konnte gezeigt werden, dass T-Zellen des CD8+ Typs durch Behandlung mit α-MSH Melanocortin-Rezeptoren des Typs 1 (MC-1R) exprimieren, während dieser von CD4+ T- Zellen quasi nicht exprimiert wird. Taylor et al. (A.W. Taylor und K. Namba 2001, Immunol. Cell. Biol. 79: 358-367) zeigten in demselben Jahr, dass CD3+ Zellen nach Behandlung mit α-MSH den Rezeptor MC-5R exprimieren.
Taylor et al. fanden außerdem, dass die Aktivierung von Antigen-spezifischen CD4+ regulatorischen T-Zellen durch die Behandlung mit α-MSH und dem transformierenden Wachstumsfaktor ß2 (TGF-ß2) induziert werden kann. Derartig aktivierte Treg-Zellen, die die Spezifität zu einem bestimmten Augen-Antigen aufwiesen, wurden in Experimenten erfolgreich zur Behandlung einer speziellen Autoimmun-Augenerkrankung (Uveoretinitis, EAU) eingesetzt (A.W. Taylor et al., 2002, J. Leu. Bio. 72: 946-951).
Im Stand der Technik war man der Auffassung, dass eine Induktion regulatorischer T-Zellen nur nach einer Antigen-spezifischen (Vor)Prägung möglich ist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wirksames Mittel zur Behandlung unerwünschter Immunreaktionen bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Mittel zur Behandlung canceröser Erkrankungen bereitzustellen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass durch Behandlung naiver T-Zellen mit α- MSH regulatorische CD8+ T-Zellen generiert werden können, die eine Antigen- unspezifische regulatorische Wirkung besitzen, vermittelt durch ein gesteigertes cytotoxisches Potential.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von T- Zellen, das folgende Schritte umfasst:
a) Bereitstellung von naiven und/oder CD8+ T-Zellen und b) In-Kontakt-Bringen der naiven und/oder CD8+ T-Zellen mit α-MSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon.
Die Ausgangs-T-Zellen sind üblicherweise CD8+, die hergestellten T-Zellen besitzen vorzugsweise regulatorisches und/oder cytotoxisches Potential. Der Begriff "regulatorische T-Zellen" bezieht sich dabei auf T-Lymphozyten, deren Hauptfunktion darin besteht, Immunantworten zu unterdrücken und/oder zu regulieren. Regulatorische T-Zellen sind suppressiv und meist anerg. Regulatorische T-Zellen sind durch Vorhandensein des Transkriptionsfaktors Foxp3 gekennzeichnet. Eine suppressive Wirkung von regulatorischen T-Zellen liegt vor, wenn sie in einem Versuch gemäß Beispiel 2B die Proliferation von Responder-Zellen hemmen können. Vorzugsweise exprimieren die regulatorischen T-Zellen die Moleküle Neuropilin-1, GIT-Rezeptor und Foxp3. Aktivierte T- Zellen unterscheiden sich von regulatorischen T-Zellen dadurch, dass sie nicht suppressiv sind und keine Foxp3-Expression aufweisen.
Als "cytotoxisch" im Sinne der vorliegenden Erfindung werden T-Zellen bezeichnet, die über die Fähigkeit verfügen cytotoxische Moleküle zu exprimieren, andere Zellen zu vernichten oder aber auch die Fähigkeit besitzen, verstärkt in Tumoren zu infiltrieren und ein Tumorwachstum zu reduzieren. Ein möglicher Assay für die Bestimmung der Cytotoxizität ist in Beispiel 4 in Verbindung mit Figur 4C dargestellt.
"Naive T-Zellen" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind T-Zellen, die in einer ruhenden Form in den lymphoiden Organen vorliegen und noch nicht mit Antigen-präsentierenden Zellen, wie z.B. dendritischen Zellen, in Kontakt gekommen sind. Naive T-Zellen hatten noch keinen Kontakt mit "ihrem spezifischen Antigen". Naive T-Zellen sind üblicherweise negativ für die Marker CD44 und CD69.
In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden T-Zellen bereitgestellt. T-Zellen können beispielsweise aus Blut gewonnen werden. Dazu werden beispielsweise Lymphozyten aus dem Patienten-Blut durch Bicoll-Gradienten-Zentrifugation gewonnen, anschließend erfolgt die weitere Aufreinigung der T-Zellen mit Hilfe magnetischer Zellseparation (z.B. mittels anti-GD3-Antikörper) nach Angaben des Herstellers der Zellseparations-Kits (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach).
Erfindungsgemäß ist es möglich, dass die T-Zellen vor dem In-Kontakt-Bringen gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens einem Anreicherungsschritt unterworfen werden. Die T-Zellen müssen dazu nach der Isolation aus dem Blut ex vivo zunächst kultiviert und expandiert werden. Mögliche erfindungsgemäße Anreicherungsverfahren sind dem Fachmann wohlbekannt. Besonders bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anreicherung von CD8+-Zellen. Die Anreicherung von CD8+-Zellen kann nach üblichen Verfahren erfolgen, z.B. durch magnetische Separation oder FACS, (siehe beispielsweise Zellseparations-Kits der Firma Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach oder „Gunzer, Weishaupt, Planelles, Grabbe (2001) Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spieen via nylon wool adherence and an optimized antibody Cocktail. J Immunol Methods. 2001 Dec 1 ;258(1-2):55-63").
Optional kann eine Anreicherung naiver T-Zellen erfolgen, beispielsweise durch Depletion oder Abreicherung von CD69+ und/oder CD44+ T-Zellen. Die Zellpopulation, die mit α-MSH oder einem Derivat oder Fragment davon in Kontakt gebracht wird, enthält in der Regel wenigstens 10%, oder wenigstens 20%, vorzugsweise wenigstens 30% oder wenigstens 40%, noch bevorzugter wenigstens 50%, am bevorzugtesten wenigstens 75% naive T- Zellen (bezogen auf die Gesamtzahl an T-Zellen in der Zusammensetzung).
Es ist auch bevorzugt, dass die Zellpopulation, die mit α-MSH oder einem Fragment oder Derivat davon in Kontakt gebracht wird, wenigstens 10%, bevorzugt wenigstens 25%, bevorzugter wenigstens 50%, noch bevorzugter wenigstens 75%, am bevorzugtesten wenigstens 90% CD8+ T-Zellen enthält (bezogen auf die Gesamtzahl an T-Zellen in der Zusammensetzung). .
Das erfindungsgemäß einsetzbare α-MSH weist folgende Aminosäuresequenz auf:
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 1)
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch biologisch aktive Fragmente oder biologisch aktive Derivate von α-MSH eingesetzt werden. "Biologisch aktiv" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind dabei solche Fragmente und Derivate von α-MSH, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung anstelle des α-MSH eingesetzt werden können und zur Bildung von regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen führen.
Mögliche erfindungsgemäße Fragmente des α-MSH sind Peptide, die aus den Aminosäuren 2-13, 3-13, 4-13, 5-13, 6-13, 7-13, 8-13, 9-13, 10-13 oder 11-13 von SEQ ID NO:1 bestehen, beispielsweise das C-terminale Tripeptid Lysin-Prolin-Valin (= KPV). Auch kann das verwandte Tripeptid Lysin-Prolin-Threonin (= KPT) sowie das Dipeptid Lysin-Prolin (= KP) zur Behandlung der naiven und/oder CD8+ T-Zellen eingesetzt werden. Besonders bevorzugt sind α-MSH und KPV.
Natürlicherweise vorkommende Aminosäuren weisen meist die (L)-Konfiguration auf. Die Aminosäuren des in dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren α-MSH können entweder in (L)- oder (D)-Konfiguration vorliegen. Das erfindungsgemäß einsetzbare α- MSH kann demnach eine Aminosäuresequenz in allen statistisch möglichen Konfigurations- Kombinationen aufweisen. Die Aminosäuren der erfindungsgemäß einsetzbaren biologisch aktiven Fragmente des α-MSH können ebenfalls alle zuvor beschriebenen Konfigurations- Kombinationen aufweisen.
Mögliche Verbindungen der Struktur KPV sind somit beispielsweise
(L)Lys-(D)Pro-(L)Val,
(L)l_ys-(L)Pro-(D)Val,
(L)LyS-(D)PrO-(D)VaI1
(L)Lys-(L)Pro-(L)Val,
(D)Lys-(D)Pro-(L)Val,
(D)Lys-(D)Pro-(D)Val,
(D)Lys-(L)Pro-(L)Val,
(D)Lys-(L)Pro-(D)Val,
Das erfindungsgemäß einsetzbare α-MSH sowie die biologisch aktiven Fragmente davon können auch Aminosäuren-Austausche aufweisen, wobei eine der Aminosäuren konservativ getauscht wurde.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen können am N-Terminus und/oder am C- Terrninus chemisch modifiziert sein. Dies ist beispielsweise durch eine Acyüerung am N- Terminus und/oder eine Amidierung oder Veresterung am C-Terminus möglich. Mögliche Gruppen am N-Terminus sind Acetyl, Propionyl, Butyryl, etc. Diese Gruppen können gegebenenfalls substituiert sein. Mögliche Gruppen am C-Terminus sind gegebenenfalls mono- oder dialkylierte Amidgruppen der Formel -NR1R2, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander H oder C^C^-Alky! sind. Weitere mögliche Gruppen/Modifikationen am C- Terminus sind gegebenenfalls substituierte Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylester, etc. Weitere, an sich bekannte Schutzgruppen sind ebenfalls möglich. Die Modifikationen können auch die Aminogruppe in der Seitenkette von Lysin oder die Hydroxylgruppe von Threonin betreffen. Auch am N-terminalen Ende der biologisch aktiven Fragmente des α-MSH sind noch andere Modifikationen denkbar, z.B. Verlängerung um eine oder mehrere Aminosäuren bis zur Länge von α-MSH.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung umfasst der Begriff "α-MSH" oder "biologisch aktives Derivat oder Fragment davon" auch die entsprechenden pharmazeutisch verträglichen Salze der Verbindungen.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können die naiven und/oder CD8+ T-Zellen für ca. 1 bis ca. 120 Stunden mit α-MSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon in Kontakt gebracht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die T-Zellen für 12 bis 72 Stunden mit α-MSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon in Kontakt gebracht, wobei ein Zeitraum von 24 bis 48 Stunden besonders bevorzugt ist.
Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte α-MSH bzw. biologisch aktive Derivat oder Fragment davon kann in einer Konzentration von ca. 10"15 bis ca. 10"2 M eingesetzt werden. Bevorzugt ist eine Konzentration von 10"13 bis 10"4 M, bevorzugter eine Konzentration von 10"11 bis 1CT6 M, noch bevorzugter eine Konzentration von 10'10 bis 10'8, wobei eine Konzentration von 10'9 M besonders bevorzugt ist.
In einer Ausführungsform ist das Verfahren ein reines in vitro-Verfahren, d.h. alle Verfahrensschritte finden in vitro/ex vivo statt. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt der Gewinnung von naiven und/oder CD8+ T-Zellen aus dem menschlichen Körper. Die T-Zellen sind vorzugsweise humane T-Zellen.
Es ist auch möglich, einen oder mehrere der oben beschriebenen Anreicherungsschritte (z.B. für naive und/oder CD8+ T-Zellen) nach Schritt b) durchzuführen.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellbaren regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen zeichnen sich durch die Fähigkeit zur Expression cytotoxischer Moleküle wie Granzym A, Granzym B, CTLA-4 und Perforin aus. Diese Moleküle werden auch von CD8+ T-Zellen, die durch Kontakt mit Antigen präsentierenden Zellen aktiviert wurden, in erhöhtem Maße exprimiert. Diese geprägten Zellen exprimieren aber die für den regulatorischen T-Zell-Typ charakteristischen Moleküle Neuropilin-1, GIT-Rezeptor und Foxp3 nicht in erhöhtem Maß.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zellen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind. Vorzugsweise exprimieren diese Zellen wenigstens eines, wenigstens zwei, wenigstens drei oder alle vier der Moleküle Granzym A, Granzym B, CTLA-4 und Perforin in erhöhtem Maß. Weiterhin exprimieren die erfindungsgemäßen Zellen Neuropilin, GIT- Rezeptor und/oder Foxp3, vorzugsweise in erhöhtem Maß. Expression "in erhöhtem Maß" bedeutet eine um wenigstens 20%, vorzugsweise wenigstens 50%, am bevorzugtesten um wenigstens 100% erhöhte Expression gegenüber entsprechenden Zellen, die nicht mit α- MSH oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon in Kontakt gebracht wurden.
Die erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen können zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Immunreaktionen eingesetzt werden. Dabei handelt es sich bevorzugt um humane Zellen, bevorzugt um autologe humane Zellen. Ebenfalls ist es möglich, die erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen zur Behandlung von Krankheiten einzusetzen, die durch Immunreaktionen hervorgerufen werden oder mit Immunreaktionen assoziiert sind. Hierzu zählen u. a. Autoimmunerkrankungen, Allergien, entzündliche Darmerkrankungen, aber auch überschießende Immunreaktionen. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen im Rahmen der zuvor aufgeführten Erkrankungen zur Behandlung von Kontaktallergien und Immunreaktionen aufgrund viraler Infektionen oder Infektionen mit Superantigenen eingesetzt. Bei einer viralen Infektion kann es sich beispielsweise um eine an sich erwünschte Immunreaktion handeln, die jedoch durch eine zu starke Aktivierung der Abwehrreaktionen außer Kontrolle geraten kann, wodurch in der Folge Gewebeschäden und sogar Tod auftreten können. Hier kann durch Einsatz der erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Ze!!en eine Überaktivierung des Immunsystems verhindert werden, indem diese Zellen durch ihre regulatorisch und cytotoxische Wirkung die Anzahl der Effektor T-Zellen vermindern und so die Immunreaktion abmildern. Solche schädlichen, auf T-Zellen zurückzuführenden, Immunreaktionen werden z. B. im Zusammenhang mit der Grippeepidemie des Jahres 1918 ("spanische Grippe") für die hohe Mortalitätsrate gerade unter den 15- bis 35-Jährigen verantwortlich gemacht. Superantigene können sehr viele T-Zellen aktivieren, was zur Produktion großer Mengen an Cytokinen führt und zu einem klinischen Syndrom führen kann, das ähnlich dem septischen Schock ist. Bestimmte Staphylococcen-Enterotoxine sind Superantigene. Superantigene binden an nicht-polymorphe Regionen von MHC Il-Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen und interagieren mit konservierten Regionen von TCR Vß-Domänen.
Autoimmunerkrankungen, die behandelt werden können, schließen folgende Erkrankungen ein: Hashimoto-Thyreoiditis, Morbus Basedow, sympathische Ophthalmie, Morbus Addison, perniziöse Anämie, Myasthenia gravis, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, multiple Sklerose, primär chronische Polyarthritis (Rheumatoide Arthritis), systemischer Lupus erythematodes, Sklerodermie, Sjögren-Syndrom, hämolytische Anämie, idiopathischthrombozytopenische Purpura und idiopathische Leukopenie.
In ähnlicher Weise können die erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen auch zur Verminderung bzw. Verhinderung von Schäden im Rahmen von Autoimmunerkrankungen oder anderen Arten unerwünschter Immunantwort, wie z. B. Allergien, verwendet werden. Bei solchen Allergien handelt es sich im Besonderen um Kontaktallergien.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T- Zellen auch zur Behandlung von Erkrankungen eingesetzt werden, bei denen ein Mangel an ebensolchen Zellen vorliegt. Dies ist z. B. im Zusammenhang mit entzündlichen Darmerkrankungen möglich. Bei der entzündlichen Darmerkrankung kann es sich beispielsweise um Morbus Crohn oder Colitis Ulcerosa handeln.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, dass die Behandlung überschießender Immunreaktionen bei viralen Infektionen oder Infektionen mit Superantigenen direkt in vivo erfolgt.
Die erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen können jedoch auch zur Behandlung, Vorbeugung und/oder Nachsorge von cancerösen Erkrankungen eingesetzt werden. Da die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen regulatorischen CD8+ T-Zellen eine erhöhte cytotoxische Aktivität aufweisen, ist es möglich, diese beispielsweise in der Tumortherapie zu verwenden. Canceröse Erkrankungen im Sinne der vorliegenden Erfindung schließen Haupttumoren, Metastasen und/oder Tumorreste ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen zur Behandlung von Hautkrebs und/oder Melanomen eingesetzt: Überraschenderweise wurde von den Erfindern gefunden, dass nach dem erfindungsgemäßen Verfahren generierte regulatorische und cytotoxische CD8+ T-Zellen in vivo in großer Zahl in Melanome einwandern und dort durch ihre cytotoxische Aktivität zu einer signifikanten Verringerung des Tumorwachstums führen (siehe Beispiel 5). Weitere Krebserkrankungen, die erfindungsgemäß behandelt werden können, sind Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Leukämie und Blasenkrebs.
Die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Zellen kann mit einer etablierten Krebstherapie kombiniert werden, z.B. mit der Behandlung durch Chemotherapeutika, Bestrahlung, Differenzierungs-induzierende Agenzien, etc.
Die erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen werden vorzugsweise intraperitoneal, subkutan oder intravenös verabreicht.
Während also die erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen alleine bereits zur zelltherapeutischen Behandlung von Tumoren herangezogen werden können, ist aber auch eine Kombination mit tumorspezifisch aktivierten Antigen- präsentierenden Zellen möglich. Bei einer solchen Kombination bzw. Co-Applikation wird eine zusätzliche Aktivierung des körpereigenen Immunsystems durch diese Antigen- präsentierenden Zellen genutzt. Bei den Antigen-präsentierenden Zellen handelt es sich im Sinne der vorliegenden Erfindung bevorzugt um dendritische Zellen (Banchereau J, Pakucka AK. Dendritic cells as therapeutic vaccines against Cancer. Nat Rev Immuno!. 2005 Apr;5(4):296-306; Gunzer M, Grabbe S. Dendritic cells in Cancer immunotherapy. Crit Rev Immunol. 2001 ;21 (1-3): 133-45; Gunzer M, Janich S, Varga G, Grabbe S. Dendritic cells and tumor immunity. Semin Immunol. 2001 Oct;13(5):291-302).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Kombination bzw. Co-Applikation gleichzeitig oder in zeitlichem Abstand erfolgen. Weiterhin ist es möglich, dass diese Kombination bzw. Co-Applikation in jeder beliebigen Reihenfolge und in verschiedenen Verhältnissen erfolgt. Erfindungsgemäß ist ein zeitlicher Abstand von bis zu 7 Tagen möglich, wobei ein zeitlicher Abstand von 1 bis 5 Tagen bevorzugt und ein zeitlicher Abstand von 1 bis 2 Tagen besonders bevorzugt ist. Erfindungsgemäß ist es daher denkbar, dass die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren generierten regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen vor den tumorspezifisch aktivierten Antigen-präsentierenden Zellen appliziert werden oder, dass die tumorspezifisch aktivierten Antigen-präsentierenden Zellen zuerst appliziert werden. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren generierten regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen können dabei im Verhältnis von 1 :10.000 bis 1000:1 zu den tumorspezifisch aktivierten Antigen- präsentierenden Zellen vorliegen. Bevorzugt liegt das Verhältnis der erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen zu den Antigen-präsentierenden Zellen bei 1 :10 bis 8:1 , wobei ein Verhältnis von 1:2 bis 2:1 besonders bevorzugt ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen enthält. Bevorzugt handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung um eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Immunreaktionen bzw. von Krankheiten, die durch Immunreaktionen hervorgerufen werden oder mit Immunreaktionen assoziiert sind, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung, Vorbeugung und/oder Nachsorge von cancerösen Erkrankungen besonders bevorzugt sind. Alle bereits zuvor beschriebenen Ausführungsformen sind von dieser Zusammensetzung in analoger Weise mit umfasst. Die erfindungsgemäßen regulatorischen und cytotoxischen CD8+ T-Zellen werden üblicherweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel gemischt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von α-MSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten, die durch Immunreaktionen hervorgerufen werden bzw. mit Immunreaktionen assoziiert sind. Ebenso kann α-MSH oder ein biologisch aktives Derivat oder Fragment davon im Sinne der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zu Behandlung, Vorbeugung und/oder Nachsorge von cancerösen Erkrankungen eingesetzt werden. Abbildung 1 zeigt, dass in mit α-MSH in Kontakt gebrachten CD8+ T-Zellen eine deutliche Aufregulation der MC-1 Rezeptorexpression stattfindet.
Abbildung 2A zeigt die IFN(lnterferon)-γ, TNF(Tumornekrosefaktor)-α und IL(lnterleukin)-10 Produktion von mit α-MSH bzw. PBS behandelten CD4+ und CD8+ T-Zellen.
Abbildung 2B zeigt die Suppression der Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen durch mit α-MSH stimulierten CD8+ T-Zellen.
Abbildung 3A zeigt, dass mit α-MSH bzw. KPV stimulierte CD8+ T-Zellen die Auslösung einer Kontaktallergiereaktion signifikant unterdrücken.
Abbildung 3B zeigt, dass durch α-MSH stimulierte CD4+ T-Zellen keine Unterdrückung der Kontaktallergiereaktion bewirken.
Abbildung 4A zeigt, dass eine Aufregulation der Expression cytotoxischer Gene in mit α- MSH stimulierten CD8+ T-Zellen stattfindet.
Abbildung 4B zeigt, dass eine Aufregulation der Expression cytotoxischer Gene in mit KPV stimulierten CD8+ T-Zellen stattfindet.
Abbildung AC zeigt, dass mit α-MSH behandelte CD8+ T-Zellen ein höheres cytotoxisches Potential aufweisen als mit PBS behandelte CD8+ T-Zellen.
Abbildung 5 zeigt, dass das Tumorwachstum bei Vakzinierung mit CD8* T-Zellen, die zuvor mit α-MSH behandelt wurden, zu einer signifikanten Reduktion des Tumorwachstums führt.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher
BEISPIEL 1
Material und Methoden
Zum Nachweis der Expression der MC-Rezeptoren auf der Oberfläche von T-Zellen wurden Einzelzellsuspensionen aus den Milzen und Lymphknoten von C57BL/6 Mäusen präpariert und nachfolgend die CD4+ sowie CD8+ T-Zellen mittels magnetischer Separation isoliert. Beide T-Zell-Populationen wurden für 48 h mit α-MSH (10"9 molar) oder PBS stimuliert, anschließend erfolgte die Isolation von Gesamt-RNA unter Verwendung des RNeasy Kits der Firma Qiagen sowie die Synthese von cDNA mit Hilfe des Reverse Transkriptase Kits der Firma MBI Fermentas. Die für die einzelnen MC-Rezeptoren codierende Sequenz wurde mittels spezifischer Primer in RT-PCR Reaktionen amplifiziert und die Produkte gelelektrophoretisch analysiert.
Ergebnisse
In CD8+ T-Zellen, nicht jedoch in CD4+ T-Zellen ließ sich eine deutliche Aufregulation der MC-1 Rezeptorexpression nach Stimulation mit α-MSH beobachten (Abb. 1). Entgegen früherer Experimente, in denen die Expression der unterschiedlichen MC-Rezeptoren in dendritischen Zellen untersucht worden war, scheinen T-Zellen lediglich den MC-1 Rezeptor zu exprimieren (Abb.1). Die Expression dieses Rezeptors in einer Subpopulation CD8+ T-Zellen konnte auf Proteinebene durchflusszytometrisch bestätigt werden (nicht abgebildet).
Zugleich wurde auch die Expression der weiteren MC-Rezeptortypen auf CD4+ bzw. CD8+ Zellen überprüft. Dabei konnte festgestellt werden, dass eine geringe Anzahl CD8+ T-Zellen auf mRNA-Ebene ebenfalls eine Expression der mRNA für MC-2R und MC-3R aufweisen, während unstimulierte CD4+ T-Zellen keine mRNA für einen der MC -Rs 1-4 exprimieren. Nach Behandlung mit α-MSH zeigt sich eine lediglich leichte Verstärkung der MC-1 R Expression auf mRNA-Ebene in CD4+-Zellen, die auf Proteinebene allerdings nicht zu beobachten war.
BEISPIEL 2A
Material und Methoden
CD4+ sowie CD8+ T-Zelien wurden aus den Milzen und Lymphknoten naiver C57BL/6 Mäuse mittels magnetischer Zellseparation isoliert und für 48 h mit α-MSH (10'9 molar) stimuliert. Im Anschluss wurden die T-Zellen für weitere 4 Tage bei 37 0C in Gegenwart von 5 % CO2 sowie anti-CD3 und anti-CD28 inkubiert und die Zytokine im Zellkultur-Überstand mit Hilfe des Cytometric Bead Arrays der Firma Becton Dickinson nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Ergebnisse
Im Gegensatz zu PBS-behandelten Zellen zeigen die α-MSH stimulierten CD8+ T-Zellen eine signifikant reduzierte IFNγ sowie TNFα Produktion, wohingegen die IL-10 Synthese durch α-MSH Stimulation unbeeinflusst ist (Abb. 2A).
BEISPIEL 2B
Material und Methoden
CD4+ sowie CD8+ T-Zellen wurden aus den Milzen und Lymphknoten naiver C57BL/6 Mäuse mittels magnetischer Zellseparation isoliert und im Verhältnis 1:1 mit PBS bzw. α- MSH stimulierten CD4+ oder CD8+ T-Zellen gemischt. Diese Kokulturen wurden mit anti- CD3 und anti-CD28 stimuliert und für 4 Tage bei 37 0C in Gegenwart von 5 % CO2 kultiviert. Für die letzten 16 h der Kultur wurden den Ansätzen 1 μCi 3H Thymidin zugesetzt und nachfolgend die Thymidin-Inkorporation mittels Szintillationsmessung bestimmt. Einige dieser Suppressionsassays wurden in Transwell-Platten (Porengröße 3 μm) durchgeführt, um einen direkten Zell-Zell-Kontakt zu unterbinden und den Einfluss löslicher Mediatoren auf den beobachteten Effekt ausschließen zu können.
Ergebnisse
Im Gegensatz zu PBS behandelten Zellen supprimierten CD8+ T-Zellen, die für 48 h mit α- MSH stimuliert wurden, sowohl die Proliferation von CD4+ als auch CD8+ Responder T- Zellen. Interessanterweise waren α-MSH stimulierte CD4+ T-Zellen nicht in der Lage, die Responder T-Zell-Proliferation zu unterdrücken (Abb. 2B).
BEISPIEL 3
Material und Methoden
C57BL/6 Mäuse wurden epikutan am rasierten Rücken mit 0,5 % Dinitrofluorbenzol (DNFB), gelöst in Aceton/Ol ivenöl (4:1), sensibilisiert. Zur Auslösung der Kontaktallergie- Reaktion wurden 12 μl 0,3 % DNFB 5 Tage nach Sensibilisierung auf das linke Ohr der sensibilisierten Tiere aufgetragen. Die Bestimmung des Ausmaßes der Kontaktallergie erfolgte durch Messung der Ohrschwellung des behandelten linken im Vergleich zum unbehandelten rechten Ohr. Um den suppressiven Effekt α-MSH oder KPV behandelter CD8+ T-Zellen in vivo zu analysieren, wurden 2 x 106 T-Zellen, die zuvor mit PBS, α-MSH oder KPV stimuliert worden waren, 24 h vor Auslösung der Kontaktallergie-Reaktion intravenös in die sensibilisierten Mäuse gespritzt.
Ergebnisse
Sowohl α-MSH als auch KPV stimulierte CD8+ T-Zellen waren in der Lage, die Auslösung einer Kontaktallergie-Reaktion in C57BL/6 Mäusen signifikant zu unterdrücken (Abb. 3A). Die Injektion α-MSH stimulierter CD4+ T-Zellen bewirkte keine Unterdrückung der Kontaktallergie-Reaktion (Abb. 3B).
Da diese T-Zellen nur mit α-MSH, nicht aber mit einem Antigen kontaktiert wurden, kann angenommen werden, dass es sich bei den beobachteten Effekten um eine antigen- unspezifische Wirkung der T-Zellen handelt. Dabei kommt in erster Linie eine cytotoxische Aktivität dieser α-MSH behandelten T-Zellen in Betracht.
BEISPIEL 4
Material und Methoden
Zur Analyse der Genexpression wurde Gesamt-RNA aus α-MSH, KPV bzw. PBS behandelten CD8+ T-Zellen mit Hilfe des RNeasy Kits (Qiagen) isoliert. Anschließend erfolgte die reverse Transkription von 1 μg RNA in cDNA unter Verwendung von "Random- Hexamer-Primern". Quantitative realtime PCR Analysen wurden mit dem ABI PRISM 7000 Cycler der Firma Applied Biosystems durchgeführt unter Verwendung von spezifischen Primern für Granzym A, Granzym B1 Perforin, CTLA-4, Neuropilin-1 , Foxp3 und ß-Aktin. Die jeweils gemessenen Genexpressionen wurden auf die ß-Aktin-Expression normiert (AACt).
Zur Bestimmung des cytotoxischen Potentials α-MSH stimulierter CD8+ T-Zellen wurden 51Chrom-Freisetzungs-Assays durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden MC57-G Target- Zellen mit 51Chrom beladen und mit zuvor aktivierten PBS bzw. α-MSH behandelten CD8+ T-Zellen koinkubiert. Nach einer 3-tägigen Kokultur wurden die Kultur-Überstände geerntet, auf eine Scintillationsplatte transferiert und die 51Chrom-Freisetzung in einem Scintillationszähler bestimmt. Die prozentuale spezifische Lyse der Target-Zellen durch die T-Zellen ergab sich nach folgender Formel: % spezifische Lyse = (Chrom-Freisetzung in den experimentellen Gruppen - Chromfreisetzung in der Negativkontrolle)/(Chrom- freisetzung in der Positivkontrolle - Chromfreisetzung in der Negativkontrolle) x 100. Ergebnisse
In den α-MSH sowie den KPV stimulierten CD8+ T-Zellen ließ sich eine deutliche Aufregulation der Expression cytotoxischer Gene (Granzym A, Granzym B, Perforin und CTLA-4) wie auch regulatorischer Marker (Foxp3, Neuropilin-1 , GITR) nachweisen, was auf eine höhere cytotoxische Aktivität der α-MSH bzw. KPV stimulierten CD8+ T-Zellen hindeutet (Abb. 4A und 4B).
Dieses höhere cytotoxische Potential konnte durch Chrom-Freisetzungs-Assays bestätigt werden, die eine signifikant gesteigerte spezifische Lyse Chrom-beladener Target-Zellen durch α-MSH stimulierte CD8+ T-Zellen ergaben verglichen mit PBS behandelten CD8+ T- Zellen (Abb. 4C).
BEISPIEL 5
Material und Methoden
50.000 B16-Melanomzellen wurden subkutan in C57BL/6 Mäuse injiziert. 3 Tage nach Injektion der Tumorzellen erfolgte die erste therapeutische Vakzinierung, indem 5 x 106 PBS bzw. α-MSH behandelte CD8+ T-Zellen intravenös in die Tumor-tragenden C57BL/6 Mäuse gespritzt wurden. Die zweite therapeutische Vakzinierung erfolgte 8 Tage nach Injektion der Melanomzellen.
Ergebnisse
Die therapeutische Vakzinierung mit CD8+ T-Zellen, die zuvor für 48 h mit α-MSH stimuliert worden waren, führte zu einer signifikanten Reduktion des Tumorwachstums. Tumortragende Mäuse dagegen, die mit PBS stimulierten CD8+ T-Zellen behandelt worden waren, zeigten ein den unbehandelten Kontrolltieren vergleichbares Tumor-Wachstum (Abb. 5). Parallel dazu konnte in histologischen Analysen des Tumor-Gewebes festgestellt werden, dass α-MSH stimulierte T-Zellen, die bereits zuvor in in vitro Studien ein cytotoxisches Potential aufwiesen, verstärkt die Tumore infiltrierten, wohingegen PBS-stimulierte CD8+ T- Zellen nicht im Tumor-Gewebe detektierbar waren (nicht abgebildet).

Claims

Ansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung regulatorischer und cytotoxischer CD8+ T-Zellen, das folgende Schritte umfasst:
a) Bereitstellung von naiven T-Zellen und b) In-Kontakt-Bringen der naiven T-Zellen mit α-MSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die naiven T-Zellen für 1 bis 120 h mit α-MSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon in Kontakt gebracht werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die naiven T- Zellen vor Schritt b) einem Anreicherungsschritt zur Anreicherung von CD8+ T-Zellen unterworfen werden.
4. Regulatorische und cytotoxische CD8+ T-Zellen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
5. Regulatorische und cytotoxische CD8+ T-Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Expression von Granzym A, Granzym B, CTLA 4 und/oder Perforin zeigen.
6. Regulatorische und cytotoxische CD8+ T-Zellen nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie Neuropilin, GIT-Rezeptor und/oder Foxp3 exprimieren.
7. Verwendung regulatorischer und cytotoxischer CD8+ T-Zellen nach einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Immunreaktionen.
8. Verwendung regulatorischer und cytotoxischer CD8+ T-Zellen nach einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Behandlung von Krankheiten, die durch Immunreaktionen hervorgerufen werden oder mit Immunreaktionen assoziiert sind.
9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit oder die Immunreaktion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunerkrankungen, Allergien, entzündlichen Darmerkrankungen und überschießenden Immunreaktionen.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergie eine Kontaktallergie ist.
11. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die überschießende Immunreaktion eine Immunreaktion auf Grund viraler Infektion oder Infektion mit Superantigenen ist.
12. Verwendung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung direkt in-vivo erfolgt.
13. Verwendung regulatorischer und cytotoxischer CD8+ T-Zellen nach einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Behandlung, Vorbeugung und/oder Nachsorge von cancerösen Erkrankungen.
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den cancerösen Erkrankungen um Haupttumoren, Metastasen und/oder Tumorreste handelt.
15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den cancerösen Erkrankungen um Melanome handelt.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung durch Co-Applikation tumorspezifisch aktivierter antigen-präsentierender Zellen erfolgt.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Co-Applikation gleichzeitig oder in zeitlichem Abstand erfolgt.
18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Co- Applikation in jeder beliebigen Reihenfolge und in verschiedenen Verhältnissen erfolgt.
19. Zusammensetzung, enthaltend regulatorische und cytotoxische CD8+ T-Zellen nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pharmazeutische Zusammensetzung handelt.
21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zusammensetzung um eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Immunreaktionen handelt.
22. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zusammensetzung um eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung, Vorbeugung und/oder Nachsorge von cancerösen Erkrankungen handelt.
23. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch . gekennzeichnet, dass es sich bei der Zusammensetzung um eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten handelt, die durch Immunreaktionen hervorgerufen werden oder mit Immunreaktionen assoziiert sind.
24. Verwendung von α-MSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten, die durch Immunreaktionen hervorgerufen werden oder mit Immunreaktionen assoziiert sind.
25. Verwendung von α-MSH oder einem biologisch aktiven Derivat oder Fragment davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung, Vorbeugung und/oder Nachsorge von cancerösen Erkrankungen.
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