WO2000010606A1 - Medicaments de sedation de l'agression du carbonyle et des dialysats peritoneaux - Google Patents

Description

明細書 カルボニルストレス状態改善剤、 および腹膜透析液 技術分野

本発明は、 腎不全患者の治療に用いられる腹膜透析液に関する。 背景技術

慢性腎不全患者に行われる透析には、 血液透析と腹膜透析とがある。 腹膜透析 とは、 腹腔内に透析液を一定時間蓄留させ、 体内の老廃物を腹膜を通して透析液 中へ排泄させた後、 透析液を回収することにより行われる透析方法である。 腹膜 透析は、 間欠的腹膜透析法 （IPD) と持続的外来腹膜透析法 （CAPD： continuous ambulatory peritoneal dialysis) に大別される。 CAPD法は、 IPD法の長所を取り 入れ、 腹腔内に注入する灌流液の貯留時間を長くして、 1日 4回程度の液交換と する腹膜透析法である。

腹膜透析は簡便で時間的な拘束が少ないなどの長所を持つが、 腹膜透析を長期 間続けていると次第に除水能が低下し、 腹部のタンパク質の変性や硬化、 腹膜融 合などが起きる場合があることが知られている。

これらの原因の一部は、 腹膜透析液に含まれるグルコースにあると考えられる 。 現在、 使用されている腹膜透析液の多くは、 浸透圧調節剤としてグルコースを 含有する。 グルコースは熱に対して不安定で、 滅菌時に一部が分解し、 タンパク 質を修飾し得る反応性の高いカルボニル化合物が分解産物として生成すると考え られる。 また、 グルコースを含む腹膜透析液は、 滅菌後、 保存中にも分解産物が 生成 ·蓄積すると考えられる。

一般にグルコースの分解は、 中性付近から塩基性側で生じ易いことから、 通常 の腹膜透析液では、 グルコースの安定性を考慮して、 酸性側 （pH 5.0-5.4) の p Hを与える緩衝系が用いられることが多い。 ところが、 このような酸性の腹膜透析 液は、 腹腔マクロファージの免疫防御機構の低下や細菌の進入による腹膜炎の発 生、 腹膜中皮細胞への傷害性などが危惧される。 このような相反する問題点を解 消するために、 中性付近における腹膜透析液中のグルコースの分解に由来する力 ルポニル化合物生成防止、 あるいはカルボニル化合物の除去が切望されていた。 一方、 高濃度のグルコースが配合された腹膜透析液は、 タンパク質を修飾する など、 腹膜にとって好ましくないとの観点から、 より分解物の生成が低いグルコ ースポリマ一を用いた腹膜透析液が開発されている （特開平 10— 94598号 、 Wilkie, M.E. et al.， Perit. Dial. Int., 17: S47-50 (1997))。

さらに同様の視点から浸透圧調節剤としてグルコースに代えてシクロデキスト リン （特開平 8— 71 146号)、 二糖類 （特開平 8— 131541号)、 ァミノ 酸（Faller, B. et al.， Kidney Int., 50(suppl.56), S81-85 (1996))を使用し た腹膜透析液も提案されている。 また、 システィンを添加してグルコースの分解 を抑制した腹膜透析液も開示されている （特開平 5— 105633号）。

これらの方法はいずれも、 腹膜透析液中の高濃度グルコースに起因する不都合 の改善を目的としたものである。

ところで、 慢性腎不全の患者では、 高血糖の有無に関わらず血中や組織中に反 応性の高いカルボニル化合物や AGE (Advanced glycation end products) が著し く蓄積していることが報告されている （Miyata, T. et aL, Kidney Int., 51: 1170-1181 (1997)、 Miyata, T. et al.， J. Am. Soc. Nephrol., 7: 1198-1206 (1996)、 Miyata, T. et al.， Kidney Int.54: 1290-1295(1998)、 Miyata, T. et al.， J. Am. Soc. Nephrol.9:2349-2356(1998))。腎不全においては、非酵素的生 化学反応によりカルボニル化合物が高負荷の状態 （カルボニストレス） となり、 タンパク質修飾が亢進される病態が存在しており、 糖 ·脂質からカルボニル化合 物が生成されタンパク質を修飾するためであると考えられる（Miyata, T.et al.,K idney Int.55:389- 399，（1999))。 カルボニルス卜レスは、 単にコラーゲンゃフィ ブロネクチンなどのマトリックスタンパク質の構築を変化させるという問題のみ ならず、 カルボニル化合物の持つ各種の細胞に対する生理活性のために、 腹膜透 過性の亢進 ·炎症の惹起等にも関係すると考えられる。

腹膜透析の場合、 血中の老廃物は腹膜を通して腹膜透析液中に排泄される。 高 浸透圧の腹膜透析液は、 腎不全患者の血中に蓄積した反応性の高いカルボニル化 合物を、 腹膜を介して腹腔内の腹膜透析液中に集める作用がある。 そのため腹膜 透析液中のカルボニル化合物濃度の高いカルボニルストレスの状態がもたらされ 、 腹腔内のタンパク質がカルボニル修飾を受けて腹膜の機能が低下し、 腹膜硬化 症の進展に関与すると考えられる 。

実際に、 腹膜透析患者において、 腹腔内が導入されたグルコースによってカル ボニルストレス状態となっていることは、 内皮および中皮の免疫組織学的検討か ら証明された (Yamada, K. et al .， Clin. Nephrol . , 42 : 354-361 ( 1994)、 Nak ay ， M. et al .， Kidney Int. , 51 : 182-186 ( 1997)、 Miyata, T. et al .， J. Am. Soc. Nephrol , in press、 Combet, S. et al . , J. Am. So ephrol , in press、 Inagi , R. et al . , J. Am. Soc. Nephrol , in press)₀ 発明の開示

本発明は、 腹膜透析におけるカルボニル化合物による障害、 すなわちカルボ二 ルストレス状態の改善のための方法、 並びにこの方法を実現するための透析液や 薬剤の提供を課題とする。 本発明におけるカルボニル化合物とは、 腹膜透析を受 ける患者に由来するカルボニル化合物、 腹膜透析液自体がその製造中または保存 中に生成したカルボニル化合物、 並びに腹膜透析中に腹腔内で生成されるカルボ ニル化合物が対象となる。 これらのカルボニル化合物による透析患者に対する障 害を、 できるだけ小さくすることが本発明の課題である。

本発明者は、 患者の腹腔内に注入された腹膜透析液中に含まれる反応性の高い カルボニル化合物は、 もともとの腹膜透析液に由来するものだけではないという 知見を得た。 即ち、 腹膜透析患者から回収された腹膜透析排液中のグルコース以 外のカルボニル化合物は、 透析前の 5倍となり、 増加分は血液由来のカルボニル 化合物と考えられた （図 1 )。 このことから、腹腔内の腹膜透析液中のカルボニル 化合物は、 腹膜透析液の加熱滅菌の過程で生じるカルボニル化合物、 あるいは腹 膜透析液の保存中に生成 ·蓄積したカルボニル化合物に加え、 血液由来のカルボ ニル化合物および腹腔内で生成 ·蓄積するカルボニル化合物の存在も無視できな いことがわかった。 実際、 免疫染色法を用いた腹膜透析患者の腹膜組織の検査に おいても、 カルボニル修飾蛋白が組織内に局在していた （図 2 )。 したがって、腹 膜透析に伴い血液より腹腔内に流出するカルボニル化合物をも除去することがで きれば、 カルボニルス卜レス状態の改善がより一層効果的に行われるものと推測 される。

本発明者は、 腎不全においては生体内タンパク質修飾を亢進する病態が存在し ており、 腹膜透析のように腹腔内に持続的に高濃度のグルコースを注入する場合 、 腹腔内のカルボニル化合物が蓄積した腹膜透析液によって、 腹腔タンパク質は 一層、 非酵素的に修飾を受け易い状態に置かれるのではないかと考えた （図 7 ) 以上のような背景のもとで、 本発明者は腹膜透析液に由来するカルボニル化合 物を軽減する透析液を作成するためにカルボニル化合物トラップ剤が有効である ことを見出し、 本発明を完成した。 更に本発明者は、 血中に蓄積するカルボニル 化合物を重視し、 カルボニルストレスによるタンパク質修飾を中心として腹膜透 析合併症を阻害することができる薬剤が有用であることを見出し本発明を完成し た。

すなわち本発明は、 カルボニルストレス状態改善剤とそれを応用した腹膜透析 液、 並びに薬剤に関し、 より具体的には、

( 1 ) カルボニル化合物トラップ剤を有効成分とする腹膜透析における腹腔 内のカルボニルストレス状態改善剤、 (2) カルボニル化合物トラップ剤が、 不溶性の担体に固定化されている （1 ) に記載のカルボニルストレス状態改善剤、

(3) カルボニル化合物トラップ剤が、 腹膜透析液に混入させるためのもので ある （ 1 ) に記載のカルボニルストレス状態改善剤、

( 4 ) カルボニル化合物トラップ剤が、 ァミノグァニジン、 ピリ ドキサミン、 ヒドラジン、 または SH基含有化合物、 あるいはそれらの誘導体からな る群から選択される化合物である、 （1) 〜 （3) のいずれかに記載の カルボニルス トレス状態改善剤、

(5) カルボニル化合物トラップ剤が、 メイラード反応阻害剤である、 （1) 〜 （ 3 ) のいずれかに記載のカルボニルストレス状態改善剤、

(6) カルボニル化合物トラップ剤が、 カルボニル化合物を吸着することがで きる腹膜透析液に不溶性の化合物である、 （1) に記載のカルボニルス トレス状態改善剤、

(7) (2) および/または （6) のカルボニル化合物トラップ剤を充填した 腹莫透析液中のカルボニル化合物トラップ用力一トリヅジ、

(8) (7) に記載のカルボニル化合物トラップ用カー卜リッジに腹膜透析液 を通過させる工程を含む、 カルボニル化合物含有量が低減された腹膜透 析液の調製方法、

(9) 次の工程を含む、 カルボニル化合物含有量が低減された腹膜透析液の調 製方法、

a) (2) および/または （6) に記載のカルボニル化合物トラップ剤 と腹膜透析液とを接触させる工程、 および

b ) 力ルポニル化合物トラップ剤と腹膜透析液を分離する工程

(10) カルボニル化合物トラップ剤を含む腹膜透析液、

(11) 第 1室および第 2室からなる分画された容器に収容された腹膜透析液 において、 第 1室に還元糖が収容され、 第 2室にカルボニル化合物トラ ップ剤が収容されているものである、 （ 1 0 ) に記載の腹膜透析液、 ( 1 2 ) カルボニル化合物トラップ剤が腹膜透析液とともに腹腔内に投与する ためのものである、 （ 1 0 ) に記載の腹膜透析液、

に関する。

あるいは本発明は、 腹腔内のカルボニルストレス状態改善方法におけるカルボ ニル化合物トラップ剤の使用に関する。 本発明は、 腹膜透析治療におけるカルボ ニル化合物トラップ剤の使用にも関する。 更に本発明は、 カルボニルス卜レス改 善剤の製造方法におけるカルボニル化合物トラップ剤の使用に関する。

本発明において、 卜ラップの対象となるカルボニル化合物とは、 例えば腹膜透 析液の製造過程、 ならびに保存中に生成するカルボニル化合物を挙げることがで きる。 先に述べたとおり、 浸透圧調節剤としてグルコースを高濃度で含む腹膜透 析液には、 常にカルボニル化合物生成の可能性が伴う。 この種のカルボニル化合 物としては、 たとえば以下のような物質が知られている（Richard, J. U. et al. , Fund. Appl . Toxic , 4: 843-853 ( 1984) )。

• 3-デォキシグルコソン

• 5-ヒドロキシメチルフルフラール （5- hydroxymethylfurfural、 以下 5-HMFと省 略する）

•ホルムアルデヒド

•ァセトアルデヒド

•グリオキサール

•メチルグリオキサール

• レブリン酸

• フルフラール

• ァラビノース

本発明では、 カルボニル化合物トラップ剤を透析施行中を通じて使用すること により、 腹膜透析液の製造過程や保存中に生成するカルボニル化合物のみならず 、 腎不全患者の血中に蓄積し、 腹膜透析にともなって腹腔内に輸送される以下の ような力ルポニル化合物の除去をも達成することができる。

ァスコルビン酸に由来するカルボニル化合物：

.デヒドロアスコルビン酸

炭水化物、 脂質、 またはアミノ酸に由来するカルボニル化合物：

*グリオキサール、

•メチルグリオキサール、

• 3-デォキシグルコソン

•ヒドロキシノネナール

•マロンジアルデヒド

•ァクロレイン

本発明におけるカルボニル化合物トラップ剤としては、 これら全てのカルボ二 ル化合物に対し、 化学的な反応や吸着によってカルボニル化合物のタンパク質に 対する修飾活性を失わせる、 または低下させるものであることが望ましいが、 こ れらのカルボニル化合物の中で主要なもののみに対して有効な場合も含まれる。 たとえばメチルグリォキサールは、 カルボニル化合物の中でも比較的反応性が高 いとされており（Thornal ley, R.J. , Endocrinol . Metab. 3 : 149-166 ( 1996)、 I nagi, R. et al . , J. Am. Soc. Nephrol, in press、および実施例 3参照）、その 活性を奪うことは病態生理学的な意義が大きい。 したがって、 メチルグリオキサ —ルに対して有効な化合物は、 本発明におけるカルボニル化合物トラップ剤とし て望ましいと言うことができる。 具体的には、 実施例にも示すように、 活性炭、 グァニジン、 アミノグァ二ジン、 ビグアナイ ド剤、 システィン、 あるいはアルブ ミン等の化合物は、 メチルグリオキサールに対して特に有効なカルボニル化合物 トラップ剤である。

浸透圧調節剤として用いる炭水化物には、 グルコースよりも安定性に優れたも のも報告されているが、 加熱滅菌や保存中にこれらのカルボニル化合物の生成を 完全に抑制することは容易ではない。 したがって、 グルコース以外の炭水化物を 用いる場合であっても、 カルボニル化合物トラップ剤の使用には意味がある。 グ ルコース以外に腹膜透析の浸透圧調節剤として用いることが可能な炭水化物には 、 トレハロース （特閧平 7一 ₃23084)、 加水分解でんぷん（特開平 8— 85 701)、 マルチトールゃラクチトール （特開平 8— 131541)、 あるいは非 還元性オリゴ糖ゃ非還元性多糖 （特開平 10— 94598) 等が知られている。 本発明におけるカルボニル化合物トラップ剤としては、 カルボニル化合物との 化学的な反応や吸着によってカルボニル化合物の透析患者に対する障害活性を失 わせる化合物、 あるいは低下させる化合物であって、 その化合物そのものは透析 患者に対して安全である物質を用いる。 このような化合物には、 例えば以下のよ うなものが知られている。 なお、 本発明のカルボニル化合物トラップ剤は、 単独 で用いるほか、 2種類以上の配合剤として使用してもよい。

•アミノグァ二ジン（Foote, E. F. et al., Am. J. Kidney Dis., 25: 420-425 (1995))

• ±2-イソプロピリデネヒドラゾノ -4-ォクソ -チアゾリジン- 5-ィルァセ夕ニリ ド \ ±2-isopropyl idenehydrazono-4-oxo-thiazolidin-o-ylacetani 1 ide： 0PB-91

95)(S.Nakamura,1997,Diabetes.46:895-899)

さらにカルボニル化合物トラップ剤としては、 例えば以下のような化合物また はそれらの誘導体であって、 カルボニル化合物卜ラップ剤として機能する化合物 を用いることができる。 なお、 誘導体とは、 化合物のいずれかの位置で原子また は分子の置換が起きている化合物を指す。

(1)メチルグァニジンなどのグァニジン誘導体 （特開昭 62- 1421 14号、 特開昭 62— 249908号、 特開平 1— 56614号、 特開平 1一 83059 号、 特開平 2— 156号、 特開平 2— 765号、 特開平 2— 42053号、 特閧 平 6— 9380号、 特表平 5— 505189号）。

(2)スルホニルヒドラジンなどのヒドラジン誘導体。 (3)ビラゾロン （特開平 6— 287179号）、 ピラゾリン （特閧平 10— 16 7965号）、 ピラゾール（特開平 6— 192089号、 特開平 6— 298737 号、 特開平 6— 298738号）、 ィミダゾリジン （特開平 5— 201993号、 特開平 6— 135968号、 特開平 7— 133264号、 特開平 10— 1824

60号)、 ヒダントイン（特開平 6— 135968号）などの 2個の窒素原子を有 する 5員複素璟式化合物。

(4)トリアゾール（特開平 6— 192089号）などの 3個の窒素原子を有する 5員複素環式化合物。

(5)チアゾリン （特開平 10— 167965号）、 チアゾ一ル （特開平 4一 93

75号、 特開平 9— 59258号)、 チアゾリジン （特開平 5— 201993号、 特閧平 3— 26 1772号、 特開平 7— 133264号、 特開平 8— 15747 3号） などの 1個の窒素原子と 1個の硫黄原子を有する 5員複素環式化合物。

(6)ォキサゾ一ル（特開平 9— 59258号）などの 1個の窒素原子と 1個の酸 素原子を有する 5員複素環式化合物。

(7)ピリジン （特開平 10— 158244号、 特開平 10— 175954号)、 ピリミジン （特表平 7 _ 5008 1 1号） などの含窒素 6員複素環式化合物。

(8)ィンダゾール （特開平 6 _ 287180号)、 ベンゾイミダゾール （特開平 6- 305964号）、 キノリン （特開平 3— 161441号）などの含窒素縮合 複素環式化合物。

(9)ベンゾチアゾール（特開平 6— 305964号）などの含硫含窒素縮合複素 環式化合物。

(10)ベンゾチォフェン （特開平 7— 196498号） などの含硫縮合複素環式 化合物。

(11)ベンゾピラン （特開平 3— 2◦ 4874号、 特開平 4— 308586号） などの含酸素縮合複素環式化合物。

(12)力ルバゾィル（特閧平 2— 156号、 特閧平 2— 753号）、 カルバジン酸 (特開平 2— 1 67264号)、 ヒ ドラジン （特開平 3— 148220号）などの 窒素化合物。

(13)ベンゾキノン （特開平 9— 3 1 5960号)、 ヒドロキノン（特開平 5— 9 1 14号） などのキノン類。

(14)脂肪族ジカルボン酸 （特開平 1一 566 14号、 特閧平 5— 3 10565 号)。

(15)ケィ素含有化合物 （特開昭 62— 249 709号)。

(16)有機ゲルマニウム化合物 （特開平 2— 62885号、 特開平 5— 255 1 30号、 特閧平 7— 247296号、 特開平 8— 59485号）。

(17)フラボノィ ド類 （特開平 3— 240725号、 特閧平 7— 206838号 、 特閧平 9一 24 1 1 65号、 WO 94/04520)。

(18)アルキルアミン類 （特開平 6— 2068 18号、 特閧平 9— 59233号 、 特開平 9— 40626号、 特開平 9— 12447 1号）。

(19)アミノ酸類 （特表平 4— 5026 1 1号、 特表平 7— 5037 13号）。

(20)ァスコクロリン （特開平 6— 3059 59号）、 安息香酸（W09 1/1 1 997)、 ピロ口ナフチリジニゥム （特開平 1 0— 1 58265号）などの芳香族 化合物。

(21)ポリペプチド （特表平 7— 500580号）。

(22)ピリ ドキサミンなどのビ夕ミン類 （WO 97/0998 1 )。

(23)グル夕チオン、 システィン、 N-ァセチルシスティンなどの SH基含有化合 物。

(24)還元型アルブミンなどの SH基含有蛋白。

(25)テトラサイクリン系化合物 （特開平 6— 256280号)。

(26)キトサン類 （特開平 9— 22 1427号）。

(27)タンニン類 （特開平 9一 405 19号）。

(28)第 4級アンモニゥムイオン含有化合物。 (29)フェンホルミン、 ブホルミン、 あるいはメ トホルミン等のビグアナイ ド剤

(30)イオン交換樹脂。

(31 )活性炭、 シリカゲル、 アルミナ、 炭酸カルシウムなどの無機化合物。

以上のような化合物には、 一般にメイラード反応阻害剤として知られている化 合物が含まれる。 メイラード反応とは、 グルコースなどの還元糖とアミノ酸や夕 ンパク質との間に生じる非酵素的な糖化反応であり、 1912年にメイラ一ド （Mail lard) がアミノ酸と還元糖の混合物を加熱すると褐色に着色する現象に注目して 報告した (Mai Hard, L. ， Compt. Rend. Soc. Biol . , 72: 599 ( 1912) )。 この メイラード反応は、 食品の加熱処理や貯蔵の間に生じる褐変化、 芳香成分の生成 、 呈味、 タンパク質変性などに関与していることから、 食品化学の分野で研究が 進められてきた。

ところが、 1968年ヘモグロビンの微小画分であるグリコシルヘモグロビン （Hb Ale)が生体内で同定され、 さらにこれが糖尿病患者において増加することが判明 し (Rahbar. S.， Clin. Chim. Acta, 22: 296( 1968) )、 それを契機に生体内にお けるメイラード反応の意義並びに糖尿病合併症、 動脈硬化などの成人病の発症や 老化の進行との関係が注目されるようになってきた。 そして、 このような生体内 のメィラード反応を阻害する物質の探索が精力的に行われ、 前述の化合物類がメ イラ一ド反応阻害剤として見出された。

しかし、 このようなメイラード反応阻害剤が、 腹膜透析液や血中由来のカルボ ニル化合物を排除して腹膜透析患者のカルボニルストレス状態を改善し、 カルボ ニルストレスに起因する腹膜透析合併症を阻害することができるということは、 全く知られていなかった。

また、 本発明のカルボニル化合物トラップ剤には、 前述のメイラード反応阻害 剤に代表される有機化合物の他、 イオン交換樹脂などの高分子化合物、 あるいは 活性炭やシリカゲル、 アルミナ、 炭酸カルシウムなどの無機化合物も使用できる 。 これらの化合物は腹膜透析液に対して不溶性のカルボニル化合物トラップ剤で あり、 そのカルボニル化合物吸着能を利用してカルボニル化合物をトラップする ことができる。 これらはクロマトグラフィ一の充填剤として知られているもので あるが、 カルボニルス卜レス状態の改善に有用であることは知られていない。 従来、 活性炭を使用した吸着型血液浄化器が、 薬物中毒や肝性昏睡時の血液浄 化や、 多臓器不全としての急性腎不全発症の初期に増加する内因性 ·外因性の各 種トキシンや血管作動性物質の除去を目的とした血液透析の補助療法として使用 されている。 しかしながら、 かかる吸着型血液浄化器が腹膜透析液中あるいは透 析中に腹腔に蓄積するカルボニル化合物の除去に有効であるということは全く知 られていなかった。

また、 特開昭 5 8 - 1 6 9 4 5 8号公報には、 固体粒子状吸収剤を含有する腹 膜透析液および該腹膜透析液を用いた腹膜透析方法に関する発明が記載されてい る。 しかし、 同公報によれば、 固体粒子状吸収剤は、 クレアチニンや低分子量の 代謝産物の除去のために添加されており、 このものが腹膜透析液中あるいは透析 中に腹腔に蓄積するカルボニル化合物の除去に有効であるとする記載は全くない 。 また、 該腹膜透析方法を用いることによって、 腹膜透析患者のカルボ二ルスト レス状態が改善されるといったことは、 示唆も教唆もされていない。

本発明におけるカルボニル化合物トラップ剤を添加するベースとなる腹膜透析 液の組成は、 公知のものとすればよい。 一般的な腹膜透析液は、 浸透圧調節剤、 緩衝剤、 および無機塩類などで構成されている。 浸透圧調節剤には先に列挙した ような糖類が用いられる。 緩衝剤としては、 主としてグルコースの安定性を考慮 して酸性側 ( PH5.0-5.4 )の pHを与える緩衝系が用いられることが多い。 もちろん、 浸透圧調節剤にグルコースを加えないものでは、より生理的な pHである 7. 0前後の pHを与える緩衝剤が利用できる。 また、 グルコースを用いながら中性域の pHを利 用できるように、 使用時に pHを調節するための緩衝系を別に包装する商品形態も 考案されている。 なお、 本発明では、 加熱滅菌や長期保存時のグルコースの分解 に由来するカルボニル化合物が除去されるため、 従来グルコースの分解のために 製剤学的に調製が困難であった中性域の pHを与える緩衝系を好適に用いることが できる。 更に腹膜透析液には、 通常、 塩化ナトリウム、 塩化カルシウム、 あるい は塩化マグネシウムのような無機塩類が添加される。 これらの塩類は、 腹膜透析 を生理的な条件に近づけ、 生体適合性の向上を期待して添加されるものである。 本発明のカルボニル化合物トラップ剤は、 このような公知の処方に対して、 腹 膜透析液の配合時に添加し、 そのまま密封して加熱滅菌することができる。 そう することによって、 加熱滅菌処理に伴う、 これら主成分からのカルボニル化合物 の生成に対して予防的な作用を期待できる。 また、 第 1室および第 2室からなる 分画された容器に腹膜透析液を収容し、 第 1室に還元糖を収容し、 第 2室にカル ボニル化合物トラップ剤を収容し、 使用直前に混合してもよい。 この場合、 滅菌 時および保存時に生成したカルボニル化合物は、 混合されたカルボニル化合物ト ラヅプ剤と速やかに結合する。 そして、 腹腔内に投与された後、 余剰のカルボ二 ル化合物トラップ剤が血中由来のカルボニル化合物を捕捉する。 腹膜透析液に添 加されるカルボニル化合物トラップ剤は、 単独であっても良いし、 複数種を混合 して用いることもできる。

一方、 カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体や自身腹膜透析液に不溶 性のカルボニル化合物トラップ剤と腹膜透析液との接触方法としては、 種々の形 態が考えられる。 例えば、 カルボニル化合物トラップ剤を内部に固定化した容器 、 あるいは粒子や繊維のような担体に固定したカルボニル化合物トラップ剤入り の容器に腹膜透析液を収容し、 保存中に生成 ·蓄積するカルボニル化合物をトラ ヅプさせることができる。 後者においては、 不溶性担体を濾過などによって腹膜 透析液から分離することができる。 またカルボニル化合物卜ラップ剤を固定化し たビーズ状や繊維状等の担体、 あるいは自身が不溶性のカルボニル化合物トラッ プ剤をカラムに充填してカルボニル化合物卜ラップ用カートリッジとし、 この力 —トリッジに腹膜透析液を接触させた後に腹腔内に導入することもできる。 かか るカートリッジは、 腹膜透析開始時の空気混入を防ぐために、 予め蒸留水などを 充填しておくのが好ましい。 腹腔導入時にカルボニル化合物トラップ用カートリ ッジに接触させる場合、 透析中に蓄積する患者由来のカルボニル化合物を除去す ることはできないが、 透析液中のカルボニル化合物の除去は可能である。 あるい は腹膜透析液を小型の循環ポンプを使用して閉鎖系回路内で循環させるような腹 膜透析法の場合にあっては、 循環回路中にカルボニル化合物トラップ剤を固定化 した前記カルボニル化合物トラップ用カートリッジを設置することにより、 腹膜 透析液のみならず、 透析中に腹腔内に蓄積するカルボニル化合物の除去をも達成 することができる。

本発明におけるカルボニル化合物トラップ剤を固定化する担体としては、 人体 に対して無害なもの、 腹膜透析液に直接接触する材料として安全性および安定性 を有するものであれば特に制限はなく、 例えば、 合成または天然の有機高分子化 合物や、 ガラスビーズ、 シリカゲル、 アルミナ、 活性炭などの無機材料、 および これらの表面に多糖類、 合成高分子などをコ一ティングしたものなどが挙げられ る。 カルボニル化合物トラップ剤を固定化するための担体や自身腹膜透析液に対 し不溶性のカルボニル化合物トラップ剤は、 公知の修飾、 改質または変性などを 施すことにより、 物質透過性、 薬液適合性、 保護強度、 吸着能力、 またはカルボ ニル化合物に対する特異性を高めることができる。

高分子化合物からなる担体としては、 例えば、 ポリメチルメタクリレート系重 合体、 ポリアクリロニトリル系重合体、 ポリスルフォン系重合体、 ビニル系重合 体、 ポリオレフイン系重合体、 フッ素系重合体、 ポリエステル系重合体、 ポリア ミ ド系重合体、 ポリイミ ド系重合体、 ポリウレタン系重合体、 ポリアクリル系重 合体、 ポリスチレン系重合体、 ポリケトン系重合体、 シリコン系重合体、 セル口 ース系重合体、 キトサン系重合体などが挙げられる。 具体的には、 ァガロース、 セルロース、 キチン、 キトサン、 セファロース、 デキストラン等の多糖類および それらの誘導体、 ポリエステル、 ポリ塩化ビニル、 ポリスチレン、 ポリスルフォ ン、 ポリエーテルスルフォン、 ポリプロピレン、 ポリビニルアルコール、 ポリア リルエーテルスルフォン、 ポリアクリル酸エステル、 ポリメ夕クリル酸エステル 、 ポリカーボネート、 ァセチル化セルロース、 ポリアクリロニトリル、 ポリェチ レンテレフ夕レート、 ポリアミ ド、 シリコン樹脂、 フッ素樹脂、 ポリウレタン、 ポリエーテルウレタン、 ポリアクリルアミ ド、 それらの誘導体などが挙げられる 。 これらの高分子材料は単独、 あるいは 2種以上を組み合わせて使用され得る。 2種以上組み合わせる場合は、 そのうち少なくとも 1種にカルボニル化合物トラ ップ剤が固定化される。 固定化されるカルボニル化合物トラップ剤は、 単独で固 定化するほか、 2種類以上を固定化してもよい。 また、 上記の高分子材料は、 単 一のポリマーとして用いられるほか、 異種ポリマーとの共重合体とすることもで きる。 さらに、 適当な改質剤を添加したり、 放射線架橋、 過酸化物架橋などの変 性処理を施してもよい。

担体の形状に制限はなく、 例えば膜状、 繊維状、 顆粒状、 中空糸状、 不織布状 、 多孔形状、 ハニカム形状などが挙げられる。 これらの担体は、 厚さ、 表面積、 太さ、 長さ、 形状、 および/または大きさを種々変えることにより、 腹膜透析液 との接触面積を制御することができる。 更に、 腹膜透析液を収容する容器の内壁 や、 腹膜透析液循環回路の内部などにカルボニル化合物トラップ剤を固定するこ ともできる。

上記担体にカルボニル化合物トラップ剤を固定化するには、 公知の方法、 例え ば、 物理的吸着法、 生化学的特異結合法、 イオン結合法、 共有結合法、 グラフ ト 化などを用いればよい。 また必要によりスぺ一サ一を担体とカルボニル化合物ト ラヅプ剤の間に導入してもよい。 カルボニル化合物トラップ剤に毒性がある場合 など、 担体からの溶出が問題となる場合には、 溶出量をできるだけ少なくするた めにカルボニル化合物トラップ剤は担体に共有結合で固定化されていることが好 ましい。 カルボニル化合物トラップ剤を担体に共有結合するには、 担体に存在す る官能基を用いればよい。 官能基としては、 例えば、 水酸基、 アミノ基、 アルデ ヒ ド基、 カルボキシル基、 チオール基、 ヒ ドロキシル基、 シラノール基、 アミ ド 基、 エポキシ基、 サクシ二ルイミ ド基等が挙げられるが、 これらに制限されない 。 共有結合の例としてエステル結合、 エーテル結合、 ァミノ結合、 アミ ド結合、 スルフイ ド結合、 ィ ミノ結合、 ジスルフイ ド結合等が挙げられる。

カルボニル化合物トラップ剤が固定化された担体としては、 例えば、 スルホ二 ルヒドラジン基を有するポリスチレン担体 （PS- TsNHNH2， ARGONAUT TECHNOLOGIE S社） などの市販のものを用いることもできる。

本発明に基づくカルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体の滅菌は、 公知 の滅菌法から、 カルボニル化合物トラップ剤や担体などの種類により適当な滅菌 法が選択される。 滅菌処理には高圧蒸気滅菌、 ガンマ線照射滅菌、 ガス滅菌など が挙げられる。 不溶性のカルボニル化合物トラップ剤や担体に結合されたカルボ ニル化合物トラップ剤を充填した力一トリッジを用意し、 これを腹膜透析液を収 容した容器に接続した状態で両者を同時に滅菌することもできる。

腹膜透析液と接触するカルボニル化合物トラップ剤が少ないと、 腹膜透析液中 のカルボニル化合物を十分に除去することができなくなるケースが予想される。 一般には腹膜透析中のカルボニル化合物の量をあらかじめ予測することは困難な ので、 患者に対する安全性を保障できる範囲内でできるだけ多量のカルボニル化 合物トラップ剤が活性を維持できるようにするのが効果的である。 カルボニル化 合物トラップ剤の用量は、 担体へのカルボニル化合物トラップ剤の固定化量、 ま たはカルボニル化合物トラップ剤が固定化された担体の使用量を変更して調整す ることができる。

あるいは、 適当な混注用コネクターを装備した腹膜透析回路に、 カルボニル化 合物トラップ剤を注入することもできる。 この場合は、 滅菌時および保存時に生 成したカルボニル化合物は、 回路中で捕捉される。

さらに、 カルボニル化合物トラップ剤を直接腹腔内に投与して、 腹腔内で腹膜 透析液と混合することもできる。 このとき腹膜透析液由来および血中由来のカル ボニル化合物は、 腹腔内で不活性化される。

また、 腹膜透析液を患者へ注入する前または腹腔内貯留中に、 カルボニル化合 物トラップ剤を静脈注射等によつて腹膜透析患者体内へ投与することによって、 腹腔内のカルボニルス卜レス状態の改善を図ることもできる。

以下に本発明による腹膜透析液の望ましい実施態様を具体的に示す。

まずベースとなる透析液の組成は、 一般的には次のような処方が利用される。 これらの処方はあくまでも一般的なものであり、 実際には患者の症状に合わせて より適切な組成が採用される。

グルコース 卜 5%w/v

ナトリウムイオン 100- 150meq

カリウムイオン 0-0. 05meq

0 - 2meq

0-4meq

塩素イオン 80- 150meq

緩衝剤 10-50mM

(乳酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 酢酸、 ピルビン酸、 コハク酸等の有機酸） 以上のような基本処方に対して、 本発明によるカルボニル化合物トラップ剤の 有効量を添加する。たとえばアミノグァ二ジンを添加する場合には、 ImM以上、 好 ましくは 10mM以上、より好ましくは lOmM以上 lOOmM以下の濃度となるように添加す る。 添加量が少ない場合には、 製造ならびに保存中に発生するカルボニル化合物 にカルボニル化合物トラップ剤が消費されてしまい、 実際の透析時に患者の血液 や組織から透析液に浸出するカルボニル化合物を処理することができなくなるケ —スが予想される。 特に患者の血液や組織から浸出するカルボニル化合物の量を あらかじめ予測することは困難なので、 患者に対する安全性を保障できる範囲内 でできるだけ多量のカルボニル化合物トラップ剤が活性を維持できるようにする のが効果的である。 アミノグァ二ジンは、 動物に対し低毒性であることが知られ ている。 「化学物質の毒性効果表 (Registry of Toxic Effect of Chemical Subst ances )」 （1978) によれば、 アミノグァ二ジンの半致死量は、 ラッ卜皮下注射の場 合 1258mg/kgであり、 マウスでは 963mg/kgである。 また、 水溶性にも優れている。 この他 0PB- 9195の場合も同様に、 lmM以上、 好ましくは 10mM以上、 より好ましくは 1 OmM以上 1 OOmM以下の濃度となるように添加する。

上記のような処方で配合された本発明による腹膜透析液は、 適当な密閉容器に 充填し、 滅菌処理する。 滅菌処理には高圧蒸気滅菌や熱水滅菌などの加熱滅菌が 有効である。 この場合、 高温で有害物質を溶出せず、 滅菌後も輸送に耐える強度 を備えた容器を用いる。 具体的にはポリ塩化ビニルやポリプロピレン、 ポリェチ レン、 ポリエステル、 エチレン酢酸ビニル共重合体などからなる可撓性プラスチ ックバッグが挙げられる。 また、 外気の影響による液の劣化を避けるために、 腹 膜透析液を充填した容器をさらにガスバリアー性の高い包装材で包装してもよい。 加熱滅菌に代えて、 濾過滅菌を施すこともできる。例えば、孔径 0.2 /m程度の メンブランフィル夕一を備えた精密濾過器を用いて濾過することにより滅菌する。 この場合は、 加熱に由来するカルボニル化合物の生成を防止することができる。 濾過滅菌された腹膜透析液は、 可撓性ブラスチックバッグなどの容器に充填され た後、 密封される。 滅菌から輸送にいたる一連の処理は、 現行の透析液の製造と 何ら変わるところは無いので、 同様の工程で本発明による腹膜透析液を製造する ことができる。

高圧加熱滅菌を含む加熱滅菌により滅菌処理を行う場合、 用いられるカルボ二 ル化合物トラップ剤が加熱などの処理に対して十分安定であるならば、 腹膜透析 液配合時に該カルボニル化合物卜ラップ剤を予め添加してから、 加熱滅菌操作を 行うことができる。 このようにすれば、 加熱時の透析液由来のカルボニル化合物 の生成 ·蓄積を抑制することができる。 勿論、 保存時や腹膜透析中にも該カルボ ニル化合物トラップ剤が機能し、 カルボニル化合物の生成 ·蓄積を抑えることが できる。 用いるカルボニル化合物トラップ剤が加熱滅菌に安定ではない場合は、 加熱を 要しない滅菌法を用いることもできる。 このような滅菌法には、 例えば濾過滅菌 などがある。 また、 予め加熱滅菌した腹膜透析液に、 後で該カルボニル化合物ト ラップ剤を添加してもよい。 添加する時期は特に制限されない。 例えば、 液を滅 菌後に該カルボニル化合物トラップ剤を添加すれば、 腹膜透析中のみならず、 透 析前の腹膜透析液保存中のカルボニル化合物の生成および/または蓄積を抑制す ることができるため好適である。

あるいは、 腹膜透析直前または同時に該カルボニル化合物トラップ剤を添加す ることもできる。 例えば、 使用直前までベースとなる溶液とカルボニル化合物ト ラヅプ剤を前述の軟質プラスチヅクバッグなどに別々に収容し、 腹膜透析開始直 前に両者を無菌的に混合する。 このためには、 特開昭 6 3 - 1 9 1 4 9号に開示 されているような剥離可能な接着部により仕切られた可撓性プラスチックバッグ が好適に用いられる。

あるいはまた、 腹膜透析回路の途中に混注のためのコネクタ一部材を設け、 該 コネクタ一からカルボニル化合物トラップ剤を注入してもよい。

このような腹膜透析液の調製方法は、 熱に不安定なカルボニル化合物トラップ 剤のみならず、 熱に安定なカルボニル化合物トラップ剤に対しても用いることが できる。

さらにまた、 腹膜透析液を小型の循環ポンプを使用して閉鎖系回路内で循環さ せるような腹膜透析法の場合にあっては、 回路中のいずれかの箇所にカルボニル 化合物トラップ剤を充填した濾過器を装置することもできる。

本発明の腹膜透析液は、現行の腹膜透析液と同様の腹膜透析処置に利用される。 すなわち、 透析患者の腹腔内に本発明による腹膜透析液を適量注入し、 腹膜を通 して生体内の低分子量成分を腹膜透析液内に移行させる。 腹膜透析液は間欠的に 循環させ、 患者の症状に応じて透析を継続する。 このときカルボニル化合物は、 クレアチニンや無機塩類、 あるいは塩素イオン等の透析成分ととともに、 血中や 腹膜内から腹膜透析液中へ移行する。 同時に、 カルボニル化合物卜ラップ剤の作 用により、 その生体に対する障害活性がうばわれ、 無害化される。 図面の簡単な説明

図 1は、 腹膜透析液および腹膜透析排液中のカルボニル化合物量を示す図であ る。

図 2は、 腹膜透析患者の腹膜におけるカルボニル修飾蛋白の組織的局在を示す 写真 （上段） およびその模式図 （下段） である。 図中、 Aは剥離した中皮細胞下の 結合組織中の陽性箇所を表す。 Bは肥厚した血管壁の陽性箇所を表す。

図 3は、 グリオキサール、 メチルダリオキサール、 および 3-デォキシグルコソ ンを添加した中皮細胞における VEGF inRNA の発現を示す図である。様々な濃度（0 ， 100, 200, 400 M)のグリオキサール（A)、 3-デォキシグルコソン （B)、 および メチルグリオキサール（C) でインキュベートしたラット中皮細胞培養から抽出 した全 RNAの逆転写を行った。 VEGFおよび G3PDH cDNAを、 それぞれ 30 および 21 サイクルの PCRにより増幅した。 3連で実験を行い平均を求めた。 それぞれの実 験の平均値に関して、 G3PDH mRNA に対する VEGF mRNA の比を計算した。 実験は 3回行い、 その平均土 S. D.をグラフにした。 *P<0.0005。

図 4は、 メチルグリォキサール添加による微小血管内皮細胞における VEGF蛋白 質の産生を示す図である。 ヒ卜微小血管内皮細胞を様々な濃度 （0, 200， 400 M )のメチルグリオキサールの存在下で培養し、 ELISAにより培養上清中に放出され る VEGF蛋白質を定量した。 3回の実験の代表的な結果を示す。 データは平均土 ra ngeで表した。 *Pく 0.05、 **P<0.01。

図 5は、 メチルグリオキサールを添加した内皮細胞における VEGF mRNA の発現 を示す図である。 ヒト内皮細胞を様々な濃度（0， 100, 200, 400 M)のメチルグ リオキサールの存在下で培養し、 全 mMAを抽出後に逆転写反応を行った。 VEGFお よび G3PDH cDNAを、 それぞれ 30 および 21 サイクルの PCRにより増幅した。 3連 で実験を行い平均を求めた。それぞれの実験の平均値に関して、 G3PDH mRNA に対 する VEGF mRNA の比を計算した。実験は 3回行い、 その平均土 S.D.をグラフにし た。 *Pく 0.05、 **Pく 0.005、 ***Pく 0.0001。

図 6は、 10日間、 毎日メチルダリオキサールを腹腔内投与したラット腹腔組織 での VEGF mRNA の発現を示す図である。腹膜での VEGFおよび G3PDH mRNAの発現を、 それぞれ 28 および 16 サイクルの RT-PCRにより増幅した。 3連で実験を行い平 均を求めた。 それぞれの実験の平均値に関して、 G3PDH mRNAに対する VEGF mRNA の比を計算した。 実験は 3回行い、 その平均士 S.D.をグラフにした。 *Pく 0.05。

図 7は、 腹膜透析患者の腹腔内でのカルボニルストレスを表す図である。

図 8は、 腹膜透析排液ィンキュベ一シヨンによるペン卜シジン生成に対するァ ミノグァニジンの添加効果を示す図である。

図 9は、 腹 S莫透析排液ィンキュベ一シヨンによるプロティンカルボニル生成に 対するァミノグァニジンの添加効果を示す図である。

図 1 0は、 3人の腹膜透析患者 （患者 I、 患者 Sおよび患者 K ) の腹膜透析 (C APD)排液中のカルボニル化合物量に対する、 ァミノグァニジンの添加効果を示す 図である。

図 1 1は、酸性環境における腹膜透析液中の 5- HMF生成に対する、 ァミノグァニ ジンの添加効果を示す図である。

図 1 2は、 中性環境における腹膜透析液中の 5- HMF生成に対する、 アミノグァ二 ジンの添加効果を示す図である。

図 1 3は、 酸性および中性環境における腹膜透析液中のカルボニル化合物量に 対するァミノグァニジンの添加効果を示す図である。

図 1 4は、 腹膜透析液へのカルボニル化合物トラップビーズ添加によるベント シジン生成抑制効果を示す図である。

図 1 5は、 腹膜透析液へのカルボニル化合物トラップビーズ添加によるカルボ ニル化合物除去効果を示す図である。 図 1 6は、 ジカルボニル溶液への活性炭添加によるカルボニル化合物除去効果 を示す図である。

図 1 7は、 腹膜透析液への活性炭添加によるカルボニル化合物除去効果を示す 図である。

図 1 8は、 グァニジンを用いたときの、 グリオキサール、 メチルグリオキサ一 ル、 3-デォキシグルコソンに対するトラップ効果を示す図である。

図 1 9は、 ビグアナィ ド剤にメ 卜ホルミン （Metformin) を用いたときの、 グリ ォキサール、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコソンに対するトラップ効 果を示す図である。

図 2 0は、 ビグアナイ ド剤にブホルミン （Buformin) を用いたときの、 グリオ キサール、 メチルダリオキサール、 3-デォキシグルコソンに対するトラップ効果 を示す図である。

図 2 1は、 ビグアナイ ド剤にフェンホルミン （Phenfonnin) を用いたときの、 グリオキサール、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコソンに対するトラッ プ¾1果を示す図である。

図 2 2は、 アミノグァ二ジンを用いたときの、 グリオキサール、 メチルグリオ キサール、 3-デォキシグルコソンに対するトラップ効果を示す図である。

図 2 3は、 SH化合物にシスティンを用いたときの、 グリオキサール、 メチルグ リオキサール、 3-デォキシグルコソンに対するトラップ効果を示す図である。 図 2 4は、 SH化合物に N-ァセチルシスティンを用いたときの、 グリオキサール 、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコソンに対するトラップ効果を示す図 である。

図 2 5は、 SH化合物に GSHを用いたときの、 グリオキサール、 メチルグリオキサ —ル、 3-デォキシダルコソンに対するトラップ効果を示す図である。

図 2 6は、 SH化合物にアルブミンを用いたときの、 グリオキサール、.メチルグ リオキサール、 3-デォキシグルコソンに対するトラップ効果を示す図である。 図 2 7は、 腹膜透析液に SH化合物を添加したときのペントシジンの生成抑制効 果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態

以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に よって制限されるものではない。

[実施例 1 ] 腹膜透析液および腹膜透析排液中のカルボニル化合物量の測定 腹腔内におけるカルボニルストレスの発生を証明するため、 以下の実験方法に 従い、 腹膜透析排液中のカルボニル化合物量を測定した。

1 ) カルボニル化合物の測定

腹膜透析液 （バクスター製、 ダイァニール PD- 2 2.5) および腹膜透析患者に前 記の腹膜透析液を投与し腹腔内に一夜貯留後の腹膜透析排液をそれぞれ 400 L採 り、 1.5mMの 2, 4-ジニトロフエニルヒドラジン （2, 4- DNPH) (和光純薬製） を 0.5N 塩酸溶液 400 Lと混合後、 3 0分間室温で攪拌し、 液中のカルボニル化合物と 2， 4-DNPHを反応させた。 次に 1Mのアセトン水溶液 40〃Lを添加し、 室温で 5分間攪拌 して過剰の 2, 4- DNPHをァセトンと反応させて除去した後、 400〃Lの n-へキサンで 3回洗浄し、水層について 360nmにおける吸光度をマイクロプレート用分光光度計 (日本モレキュラーデバイス製 SPECTRAmax250) で測定した。

2 ) 検量線の作成

種々の濃度のグルコース水溶液を調製し、 1 ) と同様に操作して、 グルコース とグルコース由来のカルボニル化合物量に対する検量線を作成した。

3 ) カルボニル化合物の定量

腹膜透析液および腹膜透析排液中のグルコース濃度をグルコース測定キッ 卜 （ 和光純薬製、 グルコース CI I-テストヮコ一） を用いて測定した。検量線からグル コース由来のカルボニル化合物の量を求めた。 液中の総カルボニル化合物の量か らグルコース由来のカルボニル化合物の量を差し引き、 カルボニル化合物の量と した。

得られた結果を図 1に示す。 腹腔内に一夜貯留された後の腹膜透析排液では、 投与前の腹膜透析液と比較してカルボニル化合物量は約 5倍となり、 血中から腹 腔内へのカルボニル化合物の移行が示された。

[実施例 2 ] 腹膜透析液患者の腹膜におけるカルボニル修飾蛋白の組織的局在 腹膜透析患者の腹膜組織中のカルボニル化合物をマロンジアルデヒドを指標と した免疫染色法により調査した。

腹膜透析患者 （5 0歳男性、 腹膜透析歴 5年） の腹膜組織について、 Horieらの 方法 (Horie, K. et al . , J. Clin. Invest. , 100， 2995-3004( 1997) ) に従い、 一次抗体としてマウス抗マロンジアルデヒドモノクローナル抗体を用いて免疫染 色を行った。 その結果、 剥離した中皮細胞下の結合組織および肥厚した血管壁に 強い陽性所見を認めた （図 2 )。

マロンジアルデヒド（MDA)は過酸化脂質の分解により生成するカルボニル化合 物である。 そこで、 MDA以外の過酸化脂質分解生成物である 4-ヒドロキシ- 2-ノネ ナール、 および糖酸化反応の結果生成するカルボキシメチルリジンやペントシジ ンに対する抗体を用いて、 同様に免疫染色を行った結果、 図 2で示された陽性部 位と同様の箇所が陽性であった。 このことから、 腹膜透析患者の腹膜組織は、 過 酸化脂質分解生成物および糖酸化生成物由来の力ルポニル化合物に起因する力ル ボニルストレスの亢進により、 蛋白修飾を受けていることが分かった。

[実施例 3 ] メチルグリォキサールによる腹膜細胞障害

長期間の腹膜透析による腹膜の限外濾過機能の低下は、 拡散による物質交換が 可能な腹膜の表面積の増加を証拠付けるものである （Krediet, R. T. , 1999， Kid ney Int. 55 : 341-356; Heimburger, 0. et al . , 1990, Kidney Int 38: 495-50 6 ; Imholz, A.L. et al . , 1993， Kidney Int. 43 : 1339-1346; Ho-dac-Pannekee t， M.M. et al . , 1997, Perit. Dial . Int. 17: 144-150)。 すなわち、 腹膜透析 液中のグルコースが拡散し腹腔内から流出することにより浸透圧勾配による透析 機能が低下する。 これは、 腹膜内の血管表面積の増加により説明することも可能 である。 そしてこの病態には、 血管内皮増殖因子 （VEGF) が重要な役割を果たす と考えられる。 VEGFは血管の透過性を亢進し （Senger, D.R. et al., 1983, Sci ence 219: 983-985; Connolly, D.T. et al., 1989， J. Biol. Chem. 264: 2001 7-20024)、 NOの合成を刺激し血管を拡張させ （Hood, J.D. et al., 1998, Ai. J . Physiol. 274: H1054- 1058)、 炎症反応を誘導する (Clauss, M. et al., 1990 ， J. Exp. Med. 172: 1535-1545; Melder, R.J. et al., 1996, Nat. Med. 2: 9 92-997)。 また、 VEGFは強力な血管新生因子であり、 血管傷害を回復させる機能を 持つ (Thomas, K丄, 1996, J. Biol. Chem. 271: 603-606; Ferrara, N. et al 1997, Endocr. Rev. 18: 4-25; Shoji, M. et al., 1998, Am. J. Pathol. 1 52: 399-411)。 そこで、 透析液に含まれるグルコース分解産物が VEGF産生に及ぼ す効果を検証した。

< 3— 1 > グルコース分解産物の存在下での腹膜中皮および血管内皮細胞培養 における VEGF の発現

6週齢の雄 CD (SD) IGSラット （Charles- River, Kanaga a, Japan) より腹膜を 採取した。 中皮細胞は Hjelleらの方法 （Hjelle. J.T. et al., 1989, Perit. D ial. Int. 9: 341-347) に基づいて単離し、 10%ゥシ胎児血清を含むダルベッコ 改変イーグル培地（DMEM)にて培養した。 7〜10継代目の中皮細胞を、様々な濃度 のグルコース分解産物 （グリオキサール、 メチルグリオキサール （Sigma, St. L ouis, M0)、 または 3-デォキシグルコソン （Fuji Memorial Research Institute , Otsuka Pharmaceutical Co., Kyoto, Japanより供与）） の存在下、 C0₂ インキ ュべ一夕で 3時間培養した。 VEGF mRNAの発現の解析は、半的量的 RT-PCRにより行 つた。 Uneasy Mini Kit (Qiagen, Germany)を用いて中皮細胞から全 RNAを単離し た。 RNA 5〃gをオリゴ （dT) _{| 18}プライマー （Gibco BRL, Gaithersburg, MD) と 2 00 unitsの RNase Hフリーの逆転写酵素 （Superscript II： Gibco BRL) を用いて 逆転写し、 PCR増幅を以前記載した条件にて行った （Miyata, T. et al., 1994, J. Cl in. Invest. 93 : 52卜 528)。 用いたオリゴヌクレオチドプライマ一配列は、 ラッ 卜 VEGFの増幅に使用したプライマーについては 5' -ACTGGACCCTGGCTTTACTGC- 3， (配列番号： 1 ) および 5' - TTGGTGAGGTTTGATCCGCATG- 3' (配列番号： 2 ) で、 3 10bpの増幅産物を得た。ラットグリセロアルデヒド- 3-ホスフエ一トデヒドロゲナ ーゼ （G3PDH) の増幅に使用したプライマ一は 5， - CCTGCACCACCMCTGCTTAGCCC-3，

(配列番号： 3 ) および 5，- GATGTCATCATATTTGGCAGGTT- 3， (配列番号： 4 ) であり 、 322bpの断片を増幅した。 G3PDHは RNAの内部標準として使用し、 異なる試料間で の RNAレベルの比較を行った。 各試料は DNA Thermal cycler (Perkin Elmer Cet us, Norwork, CT) を用いて、 94°C 0.5分、 60°C 1分、 72°C 1.5分の条件で、 まず 適当なサイクル数を決定した。予備的な実験として、逆転写および PCR増幅を様々 な RNA量を用いて、 16、 18、 21、 25、 28、 31、 および 34サイクルの条件で行った。 その結果、 VEGF mRNA の増幅では 30サイクル、 G3PDH mRNA の増幅では 21サイクル の条件で、加えた RNAと定量的に相関した PCR産物のシグナルが得られた。 PCR産物 は 1.5%ァガロースゲルで電気泳動し、 ェチジゥムブ口マイ ドで染色した後、 定 量プログラム （NIH image) でシグナル強度を測定して定量化した。 実験は、 それ それのグルコース分解産物濃度において行った。 3連の実験で mRNA を定量し、 各実験の平均を求めた。計 3〜 4回の独立した実験を各実験条件にて行った。結果 は平均をとり、 平均土 S.D.で表した。 分散分析 （AN0VA) により統計的有意性を評 価した。 この分析により有意な違いが示された場合は、 Scheffeの t検定により、 異なるメチルグリオキサール濃度で得られた結果を比較した。

0〜400〃Mの様々な濃度において、グリオキサールや 3-デォキシグルコソンは V EGFの発現を変化させなかった（図 3 ぉょび8)。 メチルグリオキサールのみが、 4 00 /Mの濃度で VEGF mRNA の発現を刺激した（Pく 0.0005) (図 3 C)。逆転写を行わ なかった RNA試料からは PCR産物は生成されなかった。 すべての細胞は生存可能で あった。 中皮細胞を高濃度の 3-デォキシグルコソン （0.625, 2.5， および 5mM ) の存在下で培養したところ、 細胞の生存率の低下が見られた （細胞生存率は、 0 .625 , 2.5, 5mM の 3-デォキシグルコソン存在下において、 それぞれ 80, 55， 8 %であった）。細胞の生存率が低下したため、 VEGF mRNA 発現の測定はできなかつ た。 これらの観察結果から、 メチルグリオキサールのみを以下の実験に用いた。 様々な濃度のメチルグリオキサール存在下で 24時間培養したヒト微小血管内 皮細胞の培養上清中への VEGF蛋白質の放出を、 ELISAにより測定した。ヒ卜微小血 管内皮細胞はクラボー （Osaka, Japan) より購入し、 VEGF欠失 EGM- 2培地 （Takar a, Tokyo, Japan)で培養した。メチルグリオキサールとのィンキュベ一トは上記 のラット腹膜中皮細胞と同様に行った。 VEGF蛋白質は、 2連で調製した培養上清 に対し、 キット (Quantikine : R&D Systems, Minneapol is, USA) を用いて添付の 説明書に従い、 酵素結合ィムノソルベントアツセィ （ELISA) により定量ィヒした。 実験は 3回繰り返し、 結果を上記と同様に統計解析した。

その結果、 培地中へのメチルグリオキサールの添加により、 用量依存的に VEGF の増加が認められた （図 4 )。 メチルグリオキサール非存在下では、 VEGFの放出は 検出されなかった。 すなわち、 蛋白質レベルでも、 メチルグリオキサールの用量 依存的に VEGF産生 ·放出が刺激されることが示された。

次に、様々な濃度（0〜400〃M)のメチルグリオキサール存在下で培養した内皮 細胞の VEGF mRNA の発現を調べた。実験はラット中皮細胞の場合と同様に行った 。 ただし、 ヒト VEGFの増幅には 5' -GGCAGAATCATCACGAAGTGGTG- 3' (配列番号： 5 ) および 5，- CTGTAGGMGCTCATCTCTCC- 3， （配列番号： 6 ) のプライマーを使用し、 増幅された断片は 271bpであった。 ヒト G3PDH の増幅にはラッ 卜と同じプライマ 一を使用した。 解析の結果、 VEGF mRNA の発現は用量依存的に増加することが判 明した （図 5 )。

< 3 - 2 > メチルグリオキサールを腹腔内投与されたラッ 卜の腹膜組織におけ る VEGF発現

メチルグリオキサールが腹膜における VEGF mRNA の発現に及ぼす生物学的影 響をさらに in vivo 系にて調べるため、ラッ卜の腹腔に様々な量のメチルグリオ キサールを 10日間投与する実験を行った。 6週齢の雄 CD (SD) IGSラットに、 様 々な濃度のメチルグリオキサールを含む生理食塩水 50ml/kg を 10日間、毎日腹腔 内に投与した。 腹壁から腹膜を単離し VEGF mRNA の発現を調べた。 実験は上記ラ ット中皮細胞の in vitro 実験と同様に行った。 ただし、 腹膜組織からの mRNA の抽出には ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan) を用いた。 また PCR増幅は、 V EGF mRNA の増幅では 28サイクル、 G3PDH mRNA の増幅では 16サイクルの条件で行 つ ,こ

図 6に示すように、 メチルグリオキサール濃度により、 腹壁腹膜試料の VEGF m RNA発現は有意に上昇した（P<0.05)。光学顕微鏡観察では、腹膜組織に変化は見 られなかった （血管数、 血管壁、 間隙、 および中皮細胞は正常であった）。

< 3 - 3 > 長期腹膜透析患者の腹膜組織の VEGFおよびカルボキシメチルリジン (CML)の免疫染色

腹膜透析患者 9名の腹膜組織における VEGFおよびカルボキシメチルリジンの 分布を免疫組織化学分析により調べた。 カルボキシメチルリジンは、 グリオキサ ールゃ 3-デォキシグルコソンなどのグルコース分解産物に由来する （Miyata， T . et al . , 1999， Kidney Int. 55 : 389-399)。 従って、 抗カルボキシメチルリジ ン抗体は、 グルコース分解産物で修飾された蛋白質に対するマーカーとして用い られる。

インフォームドコンセントを得た後、 カテーテル再挿入時に 9人の非糖尿病腹 膜透析患者より腹膜組織を単離した （表 1 )。 カテーテル再挿入の必要性は、 カテ 一テルの損傷、 位置のずれ、 および/または閉塞による生じたものである。腹膜炎 患者はいなかった。 腎機能が正常な男性 2名 （48および 58歳） から、 腹部切開時 に正常な腹膜組織を単離した。

2〃厚の腹膜組織切片を、 3-ァミノプロビルトリエトキシシラン（Signa)をコ一 卜したスライ ドにマウントし、 脱パラフィン後、 蒸留水を通してから、 Pronase (0.5mg/^ l :Dako, Glostrup, Denmark) を含むバッファー溶液 (0.05 Tris-HC 1 (pH7.2) , 0. 1M NaCl )で室温で 15分インキュベートした。スライ ドは、 0.5% Tween20を含む PBSで洗浄し、 4%スキムミルクで 2時間ブロッキングを行った後、 抗 VEGFゥサギ IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、 または抗 AGE マウス IgG ( Ikeda, K. et al .， 1996, Biochemistry 35 : 8075-8083) (カルボキ シメチルリジンをェビトープとする： Miyata, T. et al ,， 1997， Kidney Int. 5 1 : 1170-1181 )でー晚、 4°Cにて、 ヒユーミツ ドチヱンバ一中でインキュベートし た。 切片を洗浄後、 1 : 100 希釈のペルォキシダーゼ結合ャギ抗ゥサギ IgG または ペルォキシダーゼ結合ャギ抗マウス IgG (Dako)で 2時間室温でィンキュペートし 、 0.003% H₂0₂ を含む 3, 3' -ジァミノべンジジン溶液でシグナルを検出した。 ま た、 過ヨウ素酸—シッフ染色により組織学的分析を行った。 免疫染色は 2人で独 立に観察して、 シグナル強度と分布の評価を行った。

結果は表 1に示した。 表中 「正常 1」 および 「正常 2」 は腎機能が正常な被験者 由来の試料、 「PD1」〜「PD9」は腹膜透析患者由来の試料を表す。代表的な長期腹 膜透析患者の腹膜組織像（表 1の PD6) の観察では、 間質性のフィブローシス、 血 管壁の肥厚およひヒアリン症が認められた。 中皮細胞および血管壁には、 VEGF

¹ '共局在していた。 中皮層では、 VEGFのシグナルは力

'弱かった。 結果は、 他の 8人の患者でも 同様であった。 正常な腹膜試料 （表 1の正常 2) では、 腹膜透析試料に比べ、 VEG Fは血管壁にしか存在しておらず、 中皮層では検出されなかった。カルボキシメチ ルリジンは中皮層では検出されず、 血管壁のシグナルも極弱いものであった。 こ れらの観察は他の対照正常試料でも同様であつた。正常マゥス IgGを用いた場合は、 免疫染色は検出されなかった。 このように、 腹膜透析患者においてのみ、 中皮で の VEGF発現とカルボキシメチルリジンの共局在が見られる事実は、 腹膜透析によ り、腹膜透析液中のグルコース分解産物が、尿毒症患者において実際に VEGF産生 を増強していることを示唆している。 表 1 腹膜透析患者腹膜組織における CMLおよび VEGFの免疫組織化学的検出 i料 性別 年齢 腹膜透析期間 C M L V E G F

Ε3

(歳） (月） 中皮層 血管 中反層 血管壁 正常 1 M 48 ― ± + ic nf¾ ^ j ιν丄τ CO

00 +

PDl F 53 3 + + + +

PD2 M 44 4 + + + +

PD3 M 43 45 + + + +

PD4 F 54 60 + + + + + + +

PD5 M 52 70 + + + + + +

PD6 M 51 90 + + + + + + + +

PD7 M 45 105 + + + + + + + +

PD8 M 62 108 + + + + + + + +

PD9 M 66 110 + + + + + + + +

： 陰性、 士： 極弱いシグナル、 + : 陽性、 + + : 強く陽性 以上の結果は、 腹膜透析患者が、 腹膜透析液中のグルコース分解産物等により カルボニルス卜レス状態に置かれていることを裏付けるものであり、 更に、 メチ ルグリオキサールが腹膜細胞で VEGFの産生を増強することを初めて実証するもの である。 腹膜透析液に含まれるグルコース分解産物が腹膜の透過性を低下させる 原因の少なくとも一部は、 VEGF産生の亢進とそれに伴う血管新生の刺激によるも のであることが示唆される。

[実施例 4 ] 腹膜透析患者の透析液排液に対するカルボニル化合物トラップ剤 の添加効果

< 4 - 1 >

ペントシジンは AGEの構造体の 1つであり、腎不全患者の血中には健常人と比較 して約 20倍の蓄積が認められている （Miyata, T. et al .， J. Am. Soc. Nephrol 7 : 1198 - 1206 ( 1996 ) )。 腹膜透析患者の排液を 37°Cでインキュベートした場 合に増加するペントシジンおよびタンパク質上に存在するカルボニル基 （プロテ ィンカルボニル） に対するァミノグァニジンの添加効果の検討を行った。 腹膜透析患者の一夜貯留排液を遠心後、 上清を濾過滅菌 (孔径 0.45 zm)し、 ァ ミノグァニジン （東京化成製） を 0、 1、 10、 100 mMの濃度になるように添加し、 3 7°Cでィンキュベートした。ィンキュベ一ト期間は、ペントシジンを測定する場合 は 1乃至 2週間、 プロテインカルボニルを測定する場合では 2週間とした。 ベント シジンの測定は、 6N HC1中 110°Cでタンパク質を加水分解した後、 HPLC (島津製作 所製、 LC-10A) で定量した （T.Miyataら， 1996, J.Am.Soc.Nephrol, 7:1198-1206, T.Miyataら， 1996, Proc. Natl. Acad. Aci.USA， 93:2353- 2358)。プロティンカルボ二 ルの測定は、 2，4-ジニトロフヱニルヒドラジン（2,4- DNPH) (和光純薬製）と反応さ せた後、力ルポニル基と反応して生成したヒドラゾンの吸光度を測定（日本モレキ ユラ一デバイス製、 SPECTRAmax 250)することにより行った （Levine， R. L. et al.， Methods EnzymoL, 233， 346-357 (1994))。

その結果、 ペントシジンの生成に対して、 濃度依存的にアミノグァ二ジンの抑 制効果が認められた （図 8)。 同様に、 プロテインカルボニルの生成に対しても、 濃度依存的にアミノグァニジンの抑制効果が認められた （図 9 )。

<4-2>

次に、 以下の実験方法に従い、 腹膜透析患者の一夜貯留排液中のグルコース以 外のカルボニル化合物量に対するァミノグァニジンの添加効果を検討した。

(A)腹膜透析排液のィンキュベーシヨン

腹膜透析施行患者の排液を採取し、 孔径 0.45 /D1のフィル夕一で濾過した後、 アミノグァ二ジン （東京化成製） を 0、 10、 50および 250mMの濃度となるように加 え、 試料溶液とした。 試料溶液 1mlを採り、 スクリユーキャップ付プラスチック チューブに分注した後、 37°Cで 15時間インキュベートした。 なお、 試料溶液は、 インキュベーション直前まで、 - 30°Cで保存した。

(B)カルボニル化合物の定量

1) 試料溶液の測定

試料溶液 400〃Lを採り、 1.5mMの 2,4- DNPH (和光純薬製） を 0.5N塩酸溶液 40 Lと混合後、 30分間室温で攪拌し、 試料溶液中のカルボニル化合物と 2，4- DNP Hを反応させた。 次に、 1Mのアセトン水溶液 を添加し、 室温で 5分間攪拌し て過剰の 2,4- DNPH をァセトンと反応させて除去した後、 試料溶液を 400 ^の n-へキサンで 3回洗浄し、水層について 360nmにおける吸光度をマイクロプレート 用分光光度計 （日本モレキュラーデバイス製 SPECTRAmax250) で測定した。

2) 検量線の作成

種々の濃度のグルコース水溶液を調製し、 1) と同様に操作して、 グルコースと グルコース由来のカルボニル化合物量に対する検量線を作成した。

3) カルボニル化合物の定量

試料溶液中のグルコース濃度をグルコース測定キット （和光純薬製、 グルコ一 ス CI I-テストヮコ一） を用いて測定した。 検量線からグルコース由来のカルボ二 ル化合物量を求めた。 腹膜透析排液中の総カルボニル化合物の量からグルコース 由来のカルボニル化合物の量を差し引き、 カルボニル化合物の量とした。

その結果を図 1 0に示す。 腹膜透析患者の腹膜透析液排液中のグルコース以外 のカルボニル化合物量は、 ィンキュベ一トしないものおよび 37°Cで 15時間のィン キュベ一トをしたもの共に、アミノグァ二ジンの濃度が増加するに従い減少した。 これらの結果から、 カルボニル化合物トラップ剤を腹膜透析液に添加、 あるい は患者に投与することが、 腹腔内に注入された腹膜透析液中のカルボニル化合物 の生成および/または蓄積を抑制するために有効であることが明らかとなった。 それにより、 腹腔内に存在する腹膜透析液由来および血中由来のカルボニル化合 物が除去され、 腹膜透析患者のカルボニルストレス状態が改善される。

[実施例 5 ] 腹膜透析液の加熱滅菌過程におけるカルボニル化合物トラップ剤 の添加効果

腹膜透析液中には、 浸透圧調節剤として、 高濃度（L 35〜4.0 w/v%)のグルコ一 スが含まれている。 グルコースは熱に対して不安定で、 加熱滅菌や保存中に分解 する。 グルコースの分解物として、 5-ヒドロキシメチルフルフラール（5- hydrox ymethylfurfural ;5-HMF ) レブリン酸、 ァセトアルデヒドなどが生成することが 報告されている (Richard, J. U. et al.， Fund. Appl. Toxic, 4: 843-853(19 84)、 Nilsson， C. B. et al.， Perit. Dial. Int., 13: 208- 213(1993))。腹膜透 析液の加熱滅菌過程におけるァミノグァニジンのカルボニル化合物の生成抑制効 果を 5-HMF、 カルボニル化合物量を測定することにより検討した。なお、 グルコ一 スの分解の程度は液の pHの影響を受けることから、 滅菌前の pHが酸性 (pH5.3)お よび中性 （pH7.0) の 2種類の腹膜透析液を調製し、 実験に供した。 滅菌温度は 12 1°Cとした。

< 5 - 1 >

5-HMFの測定は、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、 LC- 10A)を用いて、 測定した (Nilsson, C. B. et al.， Perit. Dial. Int., 13: 208-213(1993))。 その結果、 酸性環境 （図 1 1) および中性環境 （図 12) 共に、 5- HMFの生成に 対して、 濃度依存的にアミノグァニジンの抑制効果が認められた。

<5-2>

腹膜透析液中のカルボニル化合物の定量は、実施例 1と同様に 2,4-DNPHと反応 させた後、 吸光度を測定することにより行った （Levine, R. L. et al., Method s EnzymoL, 233: 346-357(1994))。 滅菌温度は 121°Cとした。

その結果、 カルボニル化合物量に関しても、 濃度依存的にアミノグァ二ジンの 抑制効果が認められた （図 13)。

これらの結果から、 腹膜透析液中にカルボニル化合物の生成を抑える薬剤を添 加することが、 腹膜透析液中のカルボニル化合物の生成および/または蓄積を抑 制するために非常に有効であることが明らかとなった。

[実施例 6] 腹膜透析液中のペントシジン生成に対するカルボニル化合物ト ラヅプビーズの添加効果

架橋したポリスチレン樹脂にスルホニルヒドラジン基を結合したもの （PS-TsN HNH2 , ARGONAUT TECHN0L0G I ES社）をカルボニル化合物トラップビーズとして用い て、 腹膜透析液中のカルボニル化合物の除去効果を検討した。 腹膜透析液及び力 ルポニル化合物トラップビ一ズを添加した腹膜透析液を 37°Cでィンキュベ一トし、 ペントシジンの形成抑制効果を確認した。 カルボニル化合物トラップビーズの入 つたチューブに、 ジメチルスルホキシド 100 1を加え膨潤させた後、 腹膜透析液

(バクスター製、 ダイァニール PD- 4，1.5) 800〃L、水に溶解した 150mg/mL濃度の ゥシ血清アルブミン 200 /Lを添加し、 37°Cで 1週間ィンキュベ一トした。ィンキュ ペート終了後、 ポア一サイズ 0.22〃mの遠心式濾過チューブ （ミリポア製、 UFC30 GV00) を用いてビーズを除去した。つぎに、 ビーズを除去した溶液 50〃1に 10%ト リクロル酢酸 50〃1を加え、遠心して蛋白を沈殿させた。蛋白を 300〃1の 5%トリ クロル酢酸で洗浄し、 乾固させた。 つぎに、 6N HC1を 100〃1添加し、 110°Cで 16 時間加熱した後、 HPLCでペントシジンを定量した （T. Miyataら， 1996， J. Am. Soc. Nephrol . , 7: 1198-1206, T, Miyataら， 1996， Proc. Natl . Acad. Sci . U SA, 93 : 2353-2358)。

37°Cでィンキュベ一トしたときに生成するペントシジン量を図 1 4に示した。 カルボニル化合物トラヅプビーズの添加により、 ペントシジンの生成が著しく抑 制されることが判明した。

[実施例 Ί ] 腹膜透析液中のカルボニル化合物量に対するカルボニル化合物 トラップビーズの添加効果

カルボニル化合物トラップビーズによる腹膜透析液中のカルボニル化合物の除 去効果を検討した。 カルボニル化合物トラップビーズ （PS- TsNHNH2， ARGONAUT T ECHN0L0GIES社）の入ったチューブに、 ジメチルスルホキシド 100〃1を加え膨潤さ せた後、 腹膜透析液 （バクスター製、 ダイァニール PD- 4, 1.5) を添加し、 ローテ一夕一を用いて室温で 16時間撹拌した。 次に、 カルボニル化合物トラップ ビーズの入った懸濁液を、 ポア一サイズ 0.22 mの遠心式濾過チューブ（ミリポア 製、 UFC30GV00)で濾過し、 濾液中のカルボニル化合物量を以下のようにして測定 した。

<力ルボニル化合物の定量〉 1) 試料溶液の測定

試料溶液 200 Lと、 2, 4- DNPHを 0.5N 塩酸に溶かした溶液 （0.025% ) 200 L を混合後、 30°Cで 30分間反応させた。 次に、 1Mのアセトン水溶液 20〃Lを添加し 、 30°Cで 10分間インキュベートした後、 200 /Lの n-へキサンで 3回洗浄した。 さ らに、水層に 200〃Lのォク夕ノールを加えてヒドラゾンを抽出し、ォクタノール 層について 360nmにおける吸光度をマイクロプレー卜用分光光度計 （日本モレキ ユラ一デバイス製 SPECTRAmax250) で測定した。

2) 検量線の作成

種々の濃度のグルコース水溶液を調製し、 1) と同様に操作して、 グルコースと グルコース由来のカルボニル化合物量に対する検量線を作成した。

3) カルボニル化合物量の定量

試料溶液中のグルコース濃度をグルコース測定キット （和光純薬製、 グルコ一 ス CI I-ヮコ一） を用いて測定した。 検量線からグルコース由来のカルボニル化合 物量を求めた。 試料溶液中の総カルボニル化合物量からグルコース由来のカルボ ニル化合物の量を差し引き、 試料溶液中のカルボニル化合物の量とした。

その結果を図 1 5に示す。腹膜透析液に 2mg のカルボニル化合物トラップビー ズを添加し、室温で 16時間撹拌することにより、 カルボニル化合物量は 55%減少 した。また、添加するカルボニル化合物トラップビーズの量を 10mgまで増加させ た場合、 カルボニル化合物量はさらに減少した。。

これらの結果から、 カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体を用いて、 腹 J5莫透析液中のカルボニル化合物の生成および/または蓄積を抑制できることが 明らかとなった。

[実施例 8 ] 活性炭によるジカルボニル溶液中のカルボニル化合物トラップ 作用

カルボニル化合物トラップ剤として活性炭を用い、 ジカルボニル溶液中のカル ボニル化合物の除去効果を検討した。活性炭（和光純薬工業製） 2 5 /gまたは 5 0〃gを入れたチューブに、 ジカルボニル化合物をリン酸緩衝液 （以下 PBSと省略 する） に溶解したジカルボニル溶液 （いずれも 1 0 0〃M) をそれぞれ 9 O O u l 分注した。 ジカルボニル化合物としては、 グリオキサール、 メチルグリオキサー ル、 および 3-デォキシグルコソンを用いた。 このチューブをローテ一ターにセッ トして室温で 1 9時間撹拌した。 撹拌後、 チューブ内の溶液をポア一サイズ 0.22 mの遠心式濾過チューブ （ミリポア製、 UFC30GV00) で濾過し、 各ジカルボニル 化合物の濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。 測定方法は、 公 知の方法に従った。

結果は図 1 6に示した。 9 0 0〃1のジカルボニル溶液に活性炭 2 5〃gを添加 した場合、 グリオキサール（GO )で 71 、 メチルグリオキサール (MG0 )で 94%、 そして 3-デォキシグルコソン（3DG )では 93%が活性炭によってトラップされていた。 活性 炭を 5 0〃g用いた場合には、 グリオキサールで 85%、 メチルグリオキサールや 3 - デォキシグルコソンでは 98%と、試験した全てのジカルボニル化合物の大部分が活 性炭によってトラヅプされることが確認できた。

[実施例 9 ] 活性炭による腹膜透析液中のカルボニル化合物卜ラップ作用 カルボニル化合物トラップ剤として活性炭を用い、 腹膜透析液中のカルボニル 化合物の除去効果を検討した。 活性炭 （和光純薬工業製） 2 5〃gまたは 5 0〃g を入れたチューブに、 腹膜透析液 （バクス夕一製、 ダイァニール PD-4, 1. 5、 商品 名）を 9 0 0〃1分注した。このチューブをローテ一夕一にセッ 卜して室温で 1 9 時間撹拌した。撹拌後、チューブ内の腹膜透析液をポア一サイズ 0.22 111の遠心式 濾過チューブ（ミリポア製、 UFC30GV00) で濾過し、 濾液に含まれるグリオキサー ル、 メチルグリオキサール、 および 3-デォキシグルコソンの濃度を高速液体クロ マトグラフィーを用いて測定した。 測定方法は、 公知の方法に従った。

結果は図 1 7に示した。 9 0 0〃1の腹膜透析液に活性炭 2 を添加した場 合、活性炭を加えない腹膜透析液に対して、 グリオキサール（GO )で 56°ん メチルグ リオキサール (MG0 )で 71 、 そして 3-デォキシグルコソン（3DG )では 62 が活性炭に よってトラップされていた。活性炭を 5 0〃g用いた場合には、 グリオキサールで 64%、 メチルグリオキサールで 78%、そして 3-デォキシグルコソンでは 77%のジカル ボニル化合物が活性炭によってトラップされることが確認できた。

[実施例 1 0 ] グリオキサール、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコ ソンに対するグァニジン、 アミノグァ二ジン、 ビグアナイ ド剤のトラップ効果 グリオキサール、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコソンの混合溶液 （ 各 ImM) 50 1、 0.1Mのリン酸緩衝液 （pH7.4) 400 l, 30mMのグァニジン、 ァミノ グァニジン、 またはビグアナィ ド剤溶液 50〃1を混合し、 37。Cでィンキュベ一トし た。 ビグアナィ ド剤には、 メ トホルミン（metfonnin)、 ブホルミン（buformin)、 お よびフェンホルミン（phenformin)を用いた。 インキュベート終了後、 グリオキサ —ル、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコソンを、 0_フエ二レンジァミン を用いてキノキサリン誘導体とし、 それぞれの濃度を高速液体クロマトグラフィ —を用いて測定した。

結果は図 1 8 (グァ二ジン）、 図 1 9 (メ トホルミン）、 図 2 0 (ブホルミン）、 図 2 1 (フェンホルミン）、 図 2 2 (アミノグァ二ジン） に示した。 グァニジン、 アミノグァ二ジン、 および、 いずれのビグアナイ ド剤も、 特にメチルグリオキサ —ルの濃度を顕著に低下させる効果が確認された。 またアミノグァニジンにおい ては、 メチルグリオキサールに対して劇的に濃度を低下させ、 更にその他のビグ ァナイ ドでは顕著な濃度低減作用が見られなかった 3-デォキシグルコソンに対し ても濃度を著しく低下させている。

[実施例 1 1 ] グリオキサール、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコ ソンに対する SH剤の卜ラップ効果

グリオキサール、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコソンの混合溶液 （ 各 ImM) 0.1Mのリン酸緩衝液 （pH7.4) 400〃1、 30mMの SH化合物溶液 50〃1 を混合し、 37°Cでインキュベートした。 インキュベートした。 SH化合物には、 シ スティン（cystein)、 N—ァセチルシスティン（N-acetylcysteine )、 および GSH を用いた。 インキュベート終了後、 グリオキサール、 メチルグリオキサール、 3- デォキシグルコソンを 0-フエ二レンジアミンを用いてキノキサリン誘導体とし、 それぞれの濃度を高速液体クロマトグラフィ一を用いて測定した。

結果は図 2 3 (システィン）、 図 2 4 ( N—ァセチルシスティン）、 および図 2 5 (GSH) に示した。 いずれの SH化合物にも、 グリオキサールとメチルグリオキサ ールの両方に対して、 顕著に濃度を低下させる作用が確認された。

[実施例 1 2 ] グリオキサール、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコ ソンに対するアルブミンのトラップ ¾¾果

グリオキサール、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコソンの混合溶液 （ 各 ImM) 50 1、 0. 1Mのリン酸緩衝液 （pH7.4) 400 j 1 0 O mg/mlのゥシ血清ァ ルブミン溶液 50 1を混合し、 37°Cでィンキュベートした。ィンキュベ一ト終了後 、 グリオキサール、 メチルグリオキサール、 3-デォキシグルコソンを 0-フエニレ ンジァミンを用いてキノキサリン誘導体とし、 それぞれの濃度を高速液体クロマ トグラフィ一を用いて測定した。

結果は図 2 6に示した。 ゥシ血清アルブミンには、 グリオキサールとメチルグ リオキサールの濃度を顕著に低下させる作用が確認された。

[実施例 1 3 ] 腹膜透析液に SH化合物を添加し、 37°Cでィンキュベ一トした ときのペントシジンの生成抑制効果

腹膜透析液 （バクス夕一製 PD-4，1.5) 490 1、 SH化合物を 0. 1Mリン酸緩衝液 (PH7.4)に溶かした液 70 1、 ゥシ血清アルブミンを腹膜透析液（バクス夕一製 PD-4, 1.5) に 30mg/mlとなるように溶かした液 140 1を混合し、 37°Cで 1週間ィ ンキュベー卜した。 SH化合物には、 システィン（cystein)、 N—ァセチルシスティ ン（N- acetylcysteine ) GSH, およびアミノグァ二ジンを用いた。 インキュベート 終了後、 溶液 50〃1に 10%卜リクロル酢酸 50〃1を加え、 遠心して蛋白を沈殿させ た。 蛋白を 300〃1の 5 %トリクロル酢酸で洗浄し、 乾固させた。 次に、 6 N HC1 を 100〃添加し、 110°Cで 16時間加熱した後、 高速液体クロマトグラフィーでペン トシジンを定量した （T.Miyataら、 1996, J. Am. Soc . Nephrol . , 7: 1198-1206, T.Mi yataら， 1996, Proc.Natl .Acad. Sci . USA.，93 :2353- 2358)。

結果は図 2 7に示した。 SH化合物の添加によって、 ペントシジンの生成量が顕 著に抑制されることが確認できた。 産業上の利用の可能性

本発明によれば、 腹膜透析において患者を苦しめていた力ルポニル化合物によ る障害を、 簡単に取り除くことができる。 公知の腹膜透析液においては、 製造中 に生じたカルボニル化合物とともに、 透析によって生体内から腹腔中に浸出した カルボニル化合物により、 透析患者の腹膜は常にカルボニルストレスの状態に置 かれていた。 これに対して本発明では、 腹膜透析液中に生成するカルボニル化合 物を効果的に除去することができるので、 透析患者のカルボニルストレス改善に 貢献する。 更に、 カルボニル化合物トラップ剤の腹腔内への導入、 あるいはカル ボニル化合物トラップ用力一トリッジへの透析液の循環によって、 腹腔中に浸出 したカルボニル化合物をも効果的に不活性化、 あるいは除去することができる。 このように、 本発明は腹膜透析に伴うカルボニル化合物に起因する腹膜障害を含 む腹膜透析に起因する障害の対策として非常に有効なアプローチを提供するもの である。

また、 本発明では、 加熱滅菌や長期保存時のグルコースの分解に由来するカル ボニル化合物が除去されるため、 従来グルコースの分解のために製剤学的に調製 が困難であった中性域の pH を有する腹膜透析液を提供することができ、 より生 理的な腹膜透析療法が可能となる。

本発明の腹膜透析液は、 カルボニル化合物トラップ剤との接触あるいは投与と いった簡単な操作のみで実施することができ、 特殊な製造設備も要求しない。 し たがって、 本発明によるカルボニル化合物トラップ剤とそれを利用した腹膜透析 液、 ならびにその製造方法は、 腹膜透析治療における新しい治療概念を生み出す ものである。

Claims

請求の範囲 カルボニル化合物トラップ剤を有効成分とする腹膜透析における腹腔内の力 ルポニルス 卜レス状態改善剤。

カルボニル化合物トラップ剤が、 不溶性の担体に固定化されている請求項 1 に記載のカルボニルストレス状態改善剤。

カルボニル化合物トラップ剤が、 腹膜透析液に混入させるためのものである 請求項 1に記載のカルボニルストレス状態改善剤。

カルボニル化合物トラップ剤が、 アミノグァ二ジン、 ピリ ドキサミン、 ヒド ラジン、 ビグアナイ ド化合物、 または S H基含有化合物、 あるいはそれらの 誘導体からなる群から選択される化合物である、 請求項 1 ~ 3のいずれかに 記載のカルボニルストレス状態改善剤。

カルボニル化合物トラップ剤が、 メイラード反応阻害剤である、 請求項 1〜 3のいずれかに記載のカルボニルストレス状態改善剤。

カルボニル化合物卜ラップ剤が、 カルボニル化合物を吸着することができる 腹膜透析液に不溶性の化合物である、 請求項 1に記載のカルボニルストレス 状態改善剤。

請求項 2および/または請求項 6のカルボニル化合物卜ラップ剤を充填した 腹膜透析液中のカルボニル化合物トラップ用カートリッジ。

請求項 7に記載のカルボニル化合物卜ラップ用力一卜リッジに腹膜透析液を 通過させる工程を含む、 カルボニル化合物含有量が低減された腹膜透析液の 調製方法。

次の工程を含む、 カルボニル化合物含有量が低減された腹膜透析液の調製方 。

a ) 請求項 2および/または請求項 6に記載のカルボニル化合物トラップ剤 と腹膜透析液とを接触させる工程、 および b ) カルボニル化合物トラップ剤と腹膜透析液を分離する工程

. カルボニル化合物トラップ剤を含む腹莫透析液。

. 第 1室および第 2室からなる分画された容器に収容された腹膜透析液にお いて、 第 1室に還元糖が収容され、 第 2室にカルボニル化合物卜ラップ剤が収 容されているものである、 請求項 1 0に記載の腹膜透析液。

. カルボニル化合物トラップ剤が腹膜透析液とともに腹腔内に投与するため のものである、 請求項 1 0に記載の腹膜透析液。