SK15202002A3 - Modulátory receptorov pre hormón príštitných teliesok a proteín príbuzný s hormónom príštitných teliesok - Google Patents

Modulátory receptorov pre hormón príštitných teliesok a proteín príbuzný s hormónom príštitných teliesok Download PDF

Info

Publication number
SK15202002A3
SK15202002A3 SK1520-2002A SK15202002A SK15202002A3 SK 15202002 A3 SK15202002 A3 SK 15202002A3 SK 15202002 A SK15202002 A SK 15202002A SK 15202002 A3 SK15202002 A3 SK 15202002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
residue
pth
nonfunctional
amino acid
compound
Prior art date
Application number
SK1520-2002A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Kostenuik
Chuan-Fa Liu
David Lee Lacey
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of SK15202002A3 publication Critical patent/SK15202002A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A61P5/22—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of calcitonin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/46—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of glucocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Description

Oblasú techniky
Predkladaný vynález sa týka terapeutických činidiel, ktoré modulujú aktivitu PTH a PTHrP. Podľa predkladaného vynálezu medzi modulátory PTH a PTHrP patrí: (a) PTH/PTHrP modulujúca doména; a (b) vehikulum, ako je polymér (napríklad PEG alebo dextran) alebo Fc doména, ktorá je výhodná; kde vehikulum je kovalentne naviazané na C-koniec PTH/PTHrP modulujúcej domény. Vehikulum á PTH/PTHrP modulu j účä^ doména môžu byú- naviazané prostredníctvom N- alebo C-konca PTH/PTHrP modulujúcej domény, ako je opísané ďalej. Výhodným vehikulom je Fc doména a výhodnou Fc doménou je IgG Fc doména. Medzi výhodné PTH/PTHrP modulujúce domény patria aminokyselinové sekvencie odvodené od PTH a PTHrP, ktoré sú opísané ďalej. Ďalšie PTH/PTHrP modulujúce domény môžu byú generované fágovým zobrazením, RNApeptidovým skríningom a ďalšími technikami uvedenými ďalej. Takéto peptidy budú obvykle modulátormi aktivity PTH a PTHrP, aj keď môžu byú tieto techniky použité na prípravu peptidových sekvencií, ktoré slúžia ako selektívne modulátory (napríklad účinkujú ako agonisti PTH aktivity, ale nie PTHrP aktivity).
Doterajší stav techniky
Hormón príštitných teliesok s hormónom príštitných teliesok fyziologickú úlohu v homeostáze príslušnom poradí. Koncentrácia regulovaná, z dôvodu zásadnej (PTH) a proteín (PTHrP) majú vápnika a pri vápnika .v krvi úlohy vápnika v príbuzný významnú vývoj i, v je j emne bunkovom metabolizme. ΡΊΉ je endokrinný hormón, ktorý je vylučovaný príštítnými telieskami v odpovedi na pokles hladiny vápnika v sére. PTH priamo aktivuje zvýšenie kostnej resorpcie a stimuluje renálnu reabsorbciu vápnika, ktorá zvyšuje alebo udržuje cirkulujúcu zásobu vápnika. PTH tiež nepriamo zvyšuje absorbciu vápnika v čreve stimuláciou renálnej hydroxylácie vitamínu D.
Primárne aj sekundárne hyperparatyreoidizmus sú spojené so zvýšenou hladinou cirkulujúceho hormónu príštitných teliesok. Prostredníctvom vyššie uvedených dráh môže vzostup hladiny PTH spôsobiť hyperkalcémiu a osteopéniu. Inhibítory kostnej resorpcie,--ako—bisfosfanáty a OPG,“môžu“ efektívne “chrániť“ “Kosť a tlmiť príspevok skeletálneho systému k hyperkalcémii. Ale kalcemické efekty hyperparathyreoidizmu na obličky a črevo nie je možné riešiť súčasne dostupnou terapiou.
PTHrP je produkovaný mnohými typmi buniek a hrá dôležitú úlohu v regulácii vývoja skeletu. Postnatálne nie je úloha PTHrP tak jasne definovaná. Cirkulujúca hladina PTHrP nie je v podstate detekovatelná v normálnych zdravých dospelých jedincoch. Každopádne veľa tumorov embryonálneho pôvodu produkuje a vylučuje PTHrP v množstve dostatočnom na vznik hyperkalcémie. Humorálne hyperkalcémie pri malignitách (HHM) je nejbežnejší paraneoplastický syndróm, ktorý významne prispieva k morbidite a mortalite pacientov.
V súčasnosti je HHM liečená fyziologickým roztokom a ďalej inhibítormi kostnej resorpcie, ako sú bisfosfonáty. Táto liečba obvykle trvá 3-4 dni, aby bolo dosiahnuté dostatočné zníženie kalcia v sére, ale tento efekt je relatívne krátkodobý (menej ako jeden mesiac) . Pre pacientov s vysokou hladinou cirkulujúceho PTHrP sú efekty súčasnej liečby ešte horšie. Opakované podávanie bežnej terapie je obvykle ešte menej efektívne. Tieto obmedzenia súčasnej terapie jasne ukazujú potrebu rýchlej, efektívnej a dlhotrvajúcej liečby HHM.
Hlavnou príčinou obmedzených možností súčasnej terapie HHM je neschopnosť, priamej inhibície PTHrP, ktorý je veľmi dobre známy ako hlavný patofyziologický faktor HHM. Inhibítory kostnej resorpcie ako bisfosfonáty len inhibujú kostnú resorpciu, zatiaľ čo PTHrP má tiež zreteľné efekty na obličky a črevo. Úplná neutralizácia PTHrP by bola ideálnou adjuvantnou terapiou v liečbe HHM.
Obidva hormóny, PTH i PTHrP, interagujú s PTH-1 receptorom, ktorý je zodpovedný za väčšinu ich efektov. Mannstadt et al. (1999), Am. J. Physiol.277. 5Pt 2. F665-75 (1999). Len PTH interaguje s novým objaveným PTH-2 receptorom. Id. PTHrP môže byť zamenený za agonistu PTH-2 receptora a to zámenou dvoch zvyškov za zvyšky na rovnakých pozíciách PTH. Gardella etal. (1996), J. Biol. Chem. 271 (33): 19888-93.
N-koncová časť PTH bola využitá ako terapeutické činidlo. Intermitentné podávanie prirodzeného PTH-(1-84) vykazuje osteogenetické vlastnosti, ktoré sú realizované C-terminálne skráteným fragmentom PTH-(1-34). Obidva peptidy sa viažu na a aktivujú PTH-1 receptor s podobnými afinitami a spôsobujú aktiváciu adenylát-cyklázy (AC), rovnako ako fosfolipázy C (PLC). Aktivácia AC prostredníctvom PTH-1 receptora generuje cAMP, zatiaľ čo PLC aktivácia prostredníctvom PTH-1 receptora generuje PKC a intracelulárny transport vápnika. PTH-(1-34) môže maximálne aktivovať AC aj PLC dráhu. Bolo zistené, že anabolické efekty PTH(1-34) vyžadujú krátke intermitentné (denné) expozície PTH(l-34) Dobnig (1998), Endocrinol. 138:
4607-12. V klinických štúdiách na postmenopauzálnych ženách bolo preukázané, Že denné podkožné injekcie nízkych dávok PTH(1-34) vedú na tvorbu kostnej hmoty v stavcoch a krčku femoru s významným znížením incidencie fraktúr stavcov. Tieto klinické dáta ukazujú PTH ako jedno z najúčinnejších činidiel testovaných na liečbu osteoporózy.
Skrátené PTH fragmenty majú zníženú schopnosť aktivácie AC/cAMP a podobne zníženú anabolickú aktivitu. Rixon et al. (1994), J. Bone Min. Res. 9: 1179-89; Hilliker et al. (1996), 19:469-477; Lane et al. (1996), J. Bone Min, Res. 11:614-25. Takéto skrátené PTH fragmenty majú túto zníženú aktivitu fRixoir -etr—at-.—ťľ994j-;—HillíkST- eX“ al“ ’U^sr60“;“ TDäňe ef ~ al7 (1996)) aj vtedy, pokiaľ si zachovávajú úplný agonizmus k PKC. Rixon et al., (1994). Tieto objavy viedli k hypotéze, že AC/cAMP dráha je zásadná z hľadiska anabolických účinkov pre kosti, zatiaľ čo PLC/PKC dráha je z tohto hľadiska nevýznamná Rixon et al. (1994); Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 53:81-7.
Opačná, ale celkom vylučujúca, teória naznačuje, že aktivácia PLC (okrem AC) môže byť tiež významnou vlastnosťou anabolických PTH fragmentov. Takasu (1998), Endocrinol. 139: 4293-9. Jasná absencia aktivácie PLC niektorými anabolickými C-terminálne skrátenými PTH peptidmi môže byť artefaktom necitlivých testovacích metód v kombinácii s nízkou väzbou na receptory. Takasu (1998). Progresívne skracovanie C-konca PTH(1-34) vedie na postupné znižovanie väzbovej afinity pre PTH1R. Takasu (1998). PKC aktivácia prostredníctvom PTH-1 receptora sa zdá byť akútne senzitívna na väzbovú afinitu a hustotu receptorov (Guo et al. (1995), Endocrinol 136: 388491), zatiaľ čo cAMP aktivácia je oveľa menej citlivá na tieto faktory. hPTH-(1-31) má mierne zníženú (1-6-krát) afinitu pre
PTH-1 receptor v porovnaní s hPTH-(1-34), zatiaľ čo hPTH-(l30) má -významne zníženú (10-100-krát)' afinitu. Takasu (1998). Asi v dôsledku tejto zníženej afinity pre PTH-1 receptor je PTH-(1-30) slabý a inkompletný agonista na aktiváciu PKC prostredníctvom krysieho PTH-1 receptora.
V porovnaní s PTH-(l-34) má PTH-(1-31) podobný alebo mierne znížený anabolický potenciál (Rixon et al. (1994); Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 53: 81-7; Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 65: 143-7), väzbovú afinitu pre PTH1R, a indukciu cAMP (Takasu (1998)). PTH-(1-31) má tiež mierne zníženú schopnosť aktivácie -Pte.--Takasu- (1998)-.-'Pre“zdravých^ťTrdí* má _infužfä PTH- Π”-31Τ “ä“ PTH-(l-34) podobné stimulačné účinky na plazmatickú a močovú koncentráciu cAMP, ale oproti PTH-(1-34) zlyháva PTH-(1-31) vo zvyšovaní sérovej koncentrácie vápnika, plazmatickej koncentrácie 1,25(OH)2D3, alebo močovej koncentrácie N-TX. Fraher et al. (1999), J. Clin. Endocrin. Met. 84: 2739-43. Tieto dáta naznačujú, že PTH-(1-31) má zníženú kapacitu na indukciu resorpcie kosti a na stimuláciu syntézy vitamínu D, čo je priaznivý profil pre anabolické činidlá.
PTH-(1-30) sa najprv považoval za peptid bez anabolických vlastností Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 53: 81-7. Nedávno ale bolo preukázané, že PTH(1-30) je anabolický, keď je podaný vo velmi vysokých dávkach (400-2,000 gg/kg vs. 80 gg/kg pre PTH-(1-34)). Nižšia účinnosť PTH-(1-30) mohla byť predpovedaná z jeho nižšej väzbovej afinity pre PTH-1 receptor, nižšej cAMP aktivácie, a/alebo jeho velmi zníženej schopnosti aktivácie PKC. Takasu (1998). Zostáva určiť, či má PTH-(1-30) podobné alebo lepšie zníženie aktivity v resorpcii kosti.
ΡΤΗ-(1-28) je najmenší opísaný fragment, ktorý aktivuje cAMP. Neugebauer et at. (1995), Biochem. 34:8835-42. Ale najprv sa uvádzalo, že hPTH(l-28) nemá osteogénne účinky pre
OVX krysy. Miller et al. (1997), J. Bone Min. Res. 12: S320 (Abstrakt) . Nedávno bolo preukázané, že veľmi vysoká dávka PTH-(1-28) (1000 μg/kg/den) je anabolická pre QVX krysy, zatiaľ čo dávka 200 μg/kg/deň bola neúčinná. Whitfield et al., (2000), J. Bone Min. Res. 15:964-70. Znížené alebo neprítomné anabolické efekty niektorých skrátených PTH fregmentov sa prisudzovali rýchlejšej eliminácii in vivo. Rixon et at. (1994) .
Rekombinantné a modifikované proteíny sú významnou skupinou terapeutických činidiel. Medzi vhodné modifikácie proteínových terapeutických činidiel patrí kombinovanie s Fc doménou protilátky a väzba na polyméry, ako je polyetylénglykol (PEG) a dextran. Takéto modifikácie sú podrobnejšie opísané v patentovej prihláške nazvanej Modificated Peptides as Therapeutics Agents, U.S. Ser. č. 09/428,082, PCT prihl. č. WO 99/25044, ktorá je tu uvedená ako odkaz vo svojej úplnosti.
Odlišným prístupom na vývoj terapeutických činidiel je skríning peptidovej knižnice. Interakcia proteínového ligandu s jeho receptorom často prebieha na relatívne veľkom rozhraní, Ale ako bolo demonštrované na ľudskom rastovom hormóne a jeho receptore, len niekoľko kľúčových zvyškov na rozhraní prispieva k väčšine väzbovej energie. Clackson et al. (1995), Science 267:383-6. Zvyšok proteínového ligandu len vystavuje väzbové epitopy v správnej topológii a alebo má funkcie nesúvisiace s väzbou. Tak sa môžu molekuly len peptidovej dĺžky (2 až 40 aminokyselín) viazač na receptorový proteín daného veľkého proteínového ligandu. Takéto peptidy môžu napodobňovať bioaktivity veľkého proteínového ligandu (peptidoví agonisti) alebo, prostredníctvom kompetitívnej väzby, môžu inhibovať bioaktivitu veľkého proteínového ligandu (peptidoví antagonisti).
Fágové zobrazovacie peptidové knižnice sa používajú ako účinná metóda v identifikácii takých peptidových agonistov a antagonistov. Pozri napríklad Scott et al. (1990), Science
249:386; Devlin et al. (1990), Science 249:404; U.S. Pat. č.
5,223,409, udelený 29.6.1993; U.S. Pat. č. 5,733,731, udelený 31.3.1998; US. Pat. č. 5,498,530, udelený 12.3.1996; U. S. Pat. -č-.-- -Tidelený- -ΤΤ-.Τ7Γ9557~ΤΓ.·37 FäE75ľ'57338,665,' udelený 16.8.1994; U.S. Pat. č. 5,922,545, udelený 13.7.1999; WO 96/40987, publikovaná 19.12.1996; a WO 98/15833, publikovaná 16.4.1998 (každý z vyššie uvedených patentov je tu uvedený ako odkaz). V takých knižniciach sú náhodné peptidové sekvencie zobrazované fúziou s obalovými proteínmi filamentózneho fágu. Typicky sú zobrazené peptidy afinitne eluované proti protilátkou imobilizovanéj extracelulárnej doméne receptora. Zachytené fágy môžu opakovanými kolami afinitného prečistenia
Peptid s najlepšou väzbou môže byť sekvenovaný za účelom identifikácie kľúčových zvyškov jednej alebo viacero štrukturálne podobných rodín peptidov. Pozri napríklad Cwirla et at. (1997), Science 276:1696-9, kde sú identifikované dve rôzne rodiny. Peptidové sekvencie môžu tiež naznačiť, ktoré zvyšky môžu byť bezpečne nahradené, pri použití alanínového skenovania alebo mutagenézií na úrovni DNA. Môžu byť pripravené mutagenizované knižnice a tie môžu byť testované na ďalšiu optimalizáciu sekvencie peptidov s najlepšou väzbou Lowman (1997). Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24.
byť obohatené a repropagácie.
Štrukturálna analýza interakcií proteín-proteín môže byt tiež použitá na určenie tých peptidov, ktoré napodobňujú väzbovú aktivitu veľkých proteínových ligandov. V takejto analýze môže kryštalická štruktúra ukázať identitu a relatívnu orientáciu kritických zvyškov veľkého proteínového ligandu, z ktorých môže byť navrhnutý peptid. Pozri napríklad Takasaki et al. (1997), Náture Biotech. 15: 126-70. Tieto analytické metódy môžu byť. tiež použité na skúmanie interakcií medzi receptorovým proteínom a peptidmi selektovanými fágovým zobrazením, z čoho môžu byť navrhnuté ďalšie modifikácie peptidov zvyšujúce ich väzbovú afinitu.
-----Tné metódy“ súťazďa - š - -fágovým- “zôbŕäľzoväním- “ ν’ ” pept íddvóm výskume. Peptidová knižnica môže byť fúzovaná na karboxylový koniec lac represora a exprimovaná v E. coli. Iná metóda na báze E. coli umožňuje zobrazenie na vonkajšej bunkovej membráne prostredníctvom fúzie s lipoproteínom asociovaným s peptidoglykanom (PAL). Ďalej sú tieto metódy označované ako E. coli zobrazenie. V inej metóde je translácia náhodnej RNA skončená pred uvoľnením ribosómu, čo vedie na zisk knižnice polypeptidov s naviazanou ich RNA. Ďalej sú tieto a príbuzné metódy súhrnne označované ako ribosómové zobrazenie. Iné metódy využívajú peptidy naviazané na RNA; napríklad PROfusion technológie, Phylos, Inc. Pozri, napríklad, Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sd. USA 94:12297-303. Ďalej sú tieto a príbuzné metódy súhrnne označované ako RNA-peptidovy skríning. Môžu byť získané chemicky pripravené peptidové knižnice, v ktorých sú peptidy imobilizované na stabilných, nebiologických materiáloch, ako sú polyetylénové tyčinky alebo živice premývateľné rozpúšťadlom. Iné chemicky pripravené peptidové knižnice využívajú fotolitografie na skenovanie peptidov imobilizovaných na sklíčkach. Ďalej sú tieto a príbuzné metódy súhrnne označované ako chemický-peptidový skríning. Chemický-peptidový skríning môže byú výhodný v tom, .že umožňuje použitie D-aminokyselín a iných neprirodzených analógov, rovnako ako nepeptidových elementov. Ako biologické, tak chemické metódy sú zhrnuté v Wells & Lowman (1992), Curr.
Opin. Biotechnol. 3:355-62. Je teda možné objavié peptidové mimetiká akéhokoľvek proteínu za použitia fágového zobrazenia, RNA-peptidového skríningu a iných metód uvedených vyššie.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález sa týka terapeutických činidiel, ktoré modulujú aktivitu PTH a PTHrP. Podľa predkladaného vynálezu
-------modutártrory- PTH* a* PTHrP~cbsaftu juú
a) PTH/PTHrP modulujúcu doménu, výhodne aminokyselinovú sekvenciu PTH/PTHrP modulujúcu domény PTH a/alebo PTHrP, alebo sekvenciu odvodenú od tejto sekvencie pomocou fágového zobrazenia, RNA-peptidového skríningu alebo inej techniky uvedenej vyššie; a
b) vehikulum, ako je polymér (napríklad PEG alebo dextrán) alebo Fc doména, ktorá je výhodná;
kde vehikulum je kovalentne naviazané na karboxylový, koniec PTH/PTHrP modulujúcej domény. Výhodným vehikulom je Fc doména, a výhodnou Fc doménou je IgG Fc doména. Medzi výhodné PTH/PTHrP modulujúce domény patria aminokyselinové sekvencie odvodené od PTH a PTHrP opísané d'alej . Iné PTH/PTHrP modulujúce domény môžu byú generované fágovým zobrazením, RNApeptidovým skríningom a inými technikami uvedenými vyššie. Takéto peptidy budú typicky antagonistami ako PTH, tak PTHrP, aj keď takéto techniky môžu byť. použité na prípravu peptidových sekvencií, ktoré budú selektívnymi inhibítormi (napríklad inhibítormi PTH, ale ne PTHrP).
Ďalším aspektom predkladaného vynálezu je proces na prípravu PTH a PTHrP modulátorov, ktorý zahŕňa:
a) selekciu aspoň jedného peptidu, ktorý sa viaže na PTH-1 alebo ΡΊΉ-2 receptor; a
b) kovalentné naviazanie uvedeného peptidu na vehikulum.
Výhodným vehikulom je Fc doména. Stupeň (a) je výhodne uskutočnený selekciou z peptidových sekvencií v tabuľkách 1 a 2 alebo z fágového zobrazenia, RNA-peptidového skríningu, alebo iných tu uvedených techník.
Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byt pripravené štandardnými- syríte t i ckýnľŕ-metódami,—X é chnikami rekombinantnej DNA alebo akýmikoľvek inými metódami prípravy peptidov a fúznych proteínov. Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu, ktoré obsahujú nepeptidovú čast, môžu byt syntetizované štandardnými reakciami organickej chémie, spoločne so štandardnými reakciami peptidovej chémie, pokial je ich možné uskutočniť..
Primárne použitie zlúčenín podľa predkladaného vynálezu je terapeutické alebo profylaktické použitie. Peptid viazaný na vehikulum môže mat aktivitu porovnateľnú alebo aj vyššiu ako prirodzený ligand napodobňovaný peptidom.
Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byt použité na terapeutické alebo profylaktické účely tak, že sa pripravia s vhodnými farmaceutickými nosičmi a podajú sa v účinnom množstve pacientovi, ako je človek (alebo iný cicavec), ktorý potrebuje takú liečbu. Ďalšie súvisiace aspekty sú tiež zahrnuté v predkladanom vynáleze.
V predkladanom vynáleze..... sú významné- najmä “ molekuly obsahujúce PTH/PTHrP modulujúce domény majúce skrátenú PTH Cterminálnu sekvenciu, ako je PTH-(1-28) alebo (1-34). Skoršie pokusy nepreukázali anabolické účinky pri dlhodobom podávaní C-terminálne skrátených PTH fragmentov. Aj keď skoršie pokusy nenaznačovali, že môžu byť molekuly obsahujúce menšie fragmenty, ako je PTH-(1-30)-Fc, anabolické samé o sobe. Napriek slabému agonizmu k PLC (pozri Doterajší stav techniky) je hPTH-(1-30) takmer rovnako účinný v stimulácii cAMP ako hPTH-(l-34). Bez väzby na konkrétnu teóriu vynálezcovia predpokladajú, že anabolické vlastnosti PTH fregmentov môžu selektívne súvisieť s ich aktiváciou cAMP a nie s aktiváciou —PKC,—a- preto- “majú- PTH fragmenty s r e dukóvänôu—afinitou pre receptor lepší anabolický profil. Je možné, že kontinuálna expozícia skrátenému PTH fragmentu bude mať lepší vplyv na kosti v porovnaní s kontinuálnym podávaním PTH-(1-34) alebo PTH-(1-84), čo bolo preukázané pre ľudí (Fraher et al. (1999).
Z opisu vynálezu a obrázkov budú jasné ďalšie aspekty a výhody predkladaného vynálezu.
Opis obrázkov na pripojených výkresoch
Obr. 1 ukazuje príkladné Fc diméry, ktoré môžu byť získané z IgGl protilátky. Fc na obr. predstavuje akýkolvek z Fc variantov spadajúcich do významuFc doména. X1 a X2 predstavujú peptidy alebo kombinácie spájacej sekvenciepeptid, ako sú definované ďalej. Špecifické diméry sú nasledujúce:
A: Diméry viazané jednou disulfidovou-väzbou. IgGl protilátky typicky majú dve disulfidové väzby v pantovom regióne medzi konštantnou a variabilnou doménou. Fc doména na Obr. 1A môže byť pripravená-skrátením medzi-dvoma miestami pre disulf idové väzby alebo substitúciou cysteínylového zvyšku nereaktívnym zvyškom (napríklad, alanylom). Na obr. IA je Fc doména naviazaná na C-koniec peptidu.
B: Diméry viazané dvojitou disulfidovou-väzbou. Táto Fc doména môže byή pripravená skrátením pôvodnej protilátky tak, aby si zachovala obidva cysteínylové zvyšky v reťazci Fc domény alebo expresiou z konštruktu obsahujúcou sekvenciu kódujúcu takú Fc doménu. Na obr. IB je Fc doména naviazaná na C-koniec peptidu.
C: Nekovalentné diméry. Táto Fe doména môže byť pripravená elimináciou - - cy s L e í ny lo vych zvyškov buď skrátením, alebo substitúciou. Môže byt žiadúce eliminovať cysteínylové zvyšky tak, aby sa eliminovali nečistoty tvorené reakciou cysteínylového zvyšku s cysteínylovými zvyškami iných proteínov prítomných v hostiteľskej bunke. Nekovalentné naviazanie Fc domény je dostatočné na udržanie diméru pohromade.
Iné diméry môžu byť pripravené za použitia Fc domény získanej z iných typov protilátky (napríklad IgG2, IgM) .
Obr. 2 ukazuje štruktúru ďalšej zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu. Obr. 2A ukazuje jednoreťazcovú molekulu a môže tiež reprezentovať DNA konštrukt pre molekulu. Obr. 2B ukazuje dimér, v ktorom je časť spájacej sekvencie-peptid prítomná na len jednom reťazci diméru. Obr. 2C ukazuje dimér majúci peptidovú časť na obidvoch reťazcoch. Dimér z Obr. 2C sa tvorí spontánne v niektorých hostiteľských bunkách po expresii DNA konštruktu kódujúceho jeden reťazec, ako je uvedené na Obr. 3. V iných hostiteľských bunkách môžu byť bunky umiestnené do podmienok, ktoré · indukujú tvorbudimérov, alebo môžu byť diméry tvorené in vitro.
Obr. 3 ukazuje príkladné sekvencie nukleovej kyseliny a aminokyselinové sekvencie (SEQ ID NOS: 1 a 2, v príslušnom poradí) ľudského IgGl Fc, ktoré môžu byč použité v predkladanom vynáleze.
Obr. 4 ukazuje kalcemickú odpoveď normálnych myší na PTH-(134) a na PTH-(1-34)-Fc. Myšiam sa aplikuje vehikulum (PBS, -X-, alebo PTH-(1-34) (prázdné symboly) alebo PTH-(1-34)-Fc (plné symboly) . Dávky sú 156 nmol/kg (kolieska) , 469 nmol/kg — (trojuholníčkyT alebo Ι5ΈΌ nmol/kg (štvorčeky). Dáta predstavujú skupinové priemery, n =6 myší/skupina.
Obr. 5 ukazuje, že [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc inhibuje kalcemickú odpoveď normálnych myší na PTHrP. Normálnym myšiam samcom sa injekčné aplikuje SC vehikulum (PBS, kolieska) alebo ľudský PTHrP-(1-34) v dávke 0,5 mg/kg (štvorčeky). Myšiam sa aplikáciou PTHrP potom hneď aplikuje SC [AsnlO,Leull]PTHrP-(734)-Fc v dávke 10 mg/kg (trojuholníčky) alebo 30 mg/kg (kosoštvorčeky). Dáta predstavujú skupinové priemery, s n = 6 myší/skupinu.
Obr. 6 ukazuje vplyv [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc na chronickú hyperkalcémiu indukovanú PTH-(1-34)-Fc. Normálnym myšiam samcom sa podá jedna SC injekcia PTH-(1-34)-Fc (30 mg/kg) (prázdne kolieska) alebo vehikulum (PBS, prázdné štvorčeky). Niektoré myši s aplikáciou PTH-(1-34)-Fc majú jednu aplikáciu [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc v dávke 10 (plné trojuholníčky), 30 (plné kolieska) alebo 100 mg/kg (plné štvorčeky). Všetky dávky [AsnlO , Leull] PTHrP-(7-34)-Fc spôsobili významné.
potlačenie— PTH- (1-34) -Fc-indukovanej-.....- hyperkalcémie·. Dáta predstavujú priemery + SEM, n =5 myší/skupinu.
Obr. 7 ukazuje akumuláciu cAMP v ROS 17/2,8 krysiach osteoblastom podobných bunkách. Kultúry sa ošetrili inhibítorom fosfodiesterázy IBMX a potom sa aplikovali na 15 minút rôzne PTH fragmenty. cAMP sa stanovil ELISA.
Obr. 8 ukazuje efekty jedinej aplikácie na klinický biochemický profil. Periférna krv sa odoberala denne počas 3 dní po jednej podkožnej injekcii uvedenej zlúčeniny. Obr. 8A ukazuje celkový vápnik v sére; Obr. 8B, alkalickú fosfatázu TAPj“; marker “ ôs téoblastickej aktivity^ Obr. 8ΧΓ, tartratV rezistentnú kyslú fosfatázu (TRAP), marker osteoklastickej aktivity, a Obr. 8D, pomer AP:TRAP, index relatívnej osteoblastickej: osteoklastickej aktivity.
Obr. 9 ukazuje efekty PTH konštruktov na kostnú hustotu. Periférna kvantitatívna počítačová tomografia (pQCT) sa uskutočnila na proximálnej metafýze tíbie myši v deň 15, po injekciách PTH konštruktov v deň 0, 5 a 10.
Obr. 10 ukazuje efekt podania PTH-(1-34)-Fc dvakrát týždenne verzus PTH-(1-34) denne na tibiálnu, trabekulárnu a kortikálnu kostnú hustotu (BMD) . Denný PTH [PTH-(1-34)] bol použitý v dávke 8 0 gg/kg/deň (2 0 nmol/kg/deň) .
Obr. 11 ukazuje efekty liečby dvakrát týždenne na BMD a sérovú koncentráciu vápnika ovarektizomovaných (OVX) krýs. 11 mesiacov po OVX sa krysiam podávalo dvakrát týždenne fosfátom pufrovaný salinický roztok (PBS, vehikulum) alebo APD (0,5 mg/kg) alebo PTH-(1-34)-Fc (50 nmol/kg). DEXA sa uskutočňovala—raz - za týždeň;— Krv- sa odoberala- 24 hodín po druhej injekcii v týždni, keď sú kalcemické efekty PTH-Fc obvykle maximálne.
Obr. 12 ukazuje efekt jednej podkožnej injekcie PTH-(1-34)-Fc na OVX makaky rhezus. Opiciam sa injekčné podal PTH-(1-34)-Fc v dávkach 1-30 gg/kg (n=l/skupinu) alebo 100-1000 (n=2/skupinu). Sérum sa analyzovalo na celkovú koncentráciu vápnika. Bodkovaná čiara ukazuje prah pre hyperkalcémiu, na základe elevácie vápnika vyšší ako tri štandardné odchýľky nad priemer pri dvoch alebo viacerých postupných meraniach.
Podrobný opis vynálezu
Definícia termínov
Termíny použitia v tejto prihláške majú nasledujúce významy, pokiaľ nie je uvedené inak.
Termín obsahujúci znamená, že zlúčenina môže obsahovať, ďalšie aminokyseliny na N- alebo C- konci danej sekvencie. Samozrejme, že tieto ďalšie aminokyseliny by nemali významne interferovať s aktivitou zlúčeniny.
Termín acidický zvyšok označuje aminokyselinové zvyšky v D- alebo L-forme majúce vedľajšie reťazce obsahujúce acidické skupiny. Príkladné acidické zvyšky sú D a E.
Termín aromatický zvyšok označuje amínokyselinové zvyšky v D- alebo L-forme majúce vedľajšie reťazce obsahujúce aromatické skupiny. Príkladné aromatické zvyšky sú F, Y a W.
---------Termín - bázický - zvyšok- označuje- aminokyselinové zvyšky v
D- alebo L-forme majúce vedľajšie reťazce obsahujúce bázické skupiny. Príkladné bázické zvyšky sú H, K a R.
Termíny hydrofilný zvyšok a Haa označuje aminokyselinové zvyšky v D- alebo L-forme majúce vedľajšie reťazce obsahujúce aspoň jednu hydrofilnú funkčnú skupinu alebo polárnu skupinu. Príkladné hydrofilné zvyšky sú C, D, E,
1-1, K, N, Q, R, S a T.
Termíny lipofilný zvyšok a Laa označujú aminokyselinové zvyšky v D- alebo L-forme majúce vedľajšie reťazce obsahujúce -nenabité, alifatické alebo aromatické skupiny ľ Príkladné lipofilné vedľajšie reťazce sú F, I, L, M, V, W a Y. Alanín (A) je . amfifilný - môže účinkovať ako hydrofilný alebo lipofilný zvyšok. Alanín je preto zahrnutý v definícii ako lipofilný zvyšok, tak aj 'hydrofilný zvyšok.
Termín nefunkčný zvyšok označuje aminokyselinové zvyšky v D- alebo L-forme majúce vedľajšie reťazce, ktoré nemajú acidické, bázické alebo aromatické skupiny. Príkladné nefunkčné aminokyselinové zvyšky sú M, G, A, V, I, La norleucín (Nie).
Termín vehikulum označuje molekulu, ktorá bráni degradácii a/alebo zvyšuje polčas, redukuje toxicitu, redukuje imunogenicitu alebo zvyšuje biologickú aktivitu terapeutického proteínu. Príkladné vehikulá sú Fc doména (ktorá je výhodná), rovnako ako spájací polymér (napríklad, polyetylénglykol (PEG), polylysín, dextrán, atď.); polymér s rozvetveným reťazcom (pozri, napríklad, US. Patent č. 4,289,872, Denkenwalter et al. , udelený 15.9.1981; 5,229,490, Tam, udelený 20.7.1993; WO 93/21259, Frechet et al., publikovaná
28.10.1993) ;-~lipid;- cholesterolová- skupina” (ako ” je 'steroid) ; karbohydrát alebo oligosacharid (napríklad, dextrán); ľudský sérový albumín (HSA) a príbuzné molekuly; transtheratín (ITR) a príbuzné molekuly; alebo ktorýkoľvek prirodzený alebo syntetický proteín, polypeptid alebo peptid, ktorý sa viaže na receptor. Vehikulá sú opísané ďalej.
Termín natívny Fc označuje molekulu alebo sekvenciu obsahujúcu sekvenciu fragmentu neviažúceho sa na antigén vzniknutého trávením celej protilátky, Ču už monomérnej, alebo multimérnej formy. Pôvodným imunoglobulínovým zdrojom natívneho Fc je výhodne ľudský zdroj a môže sa jednať, o ktorýkoľvek—imunoy 1 obU'l'í n,--'aj keď “výhodne “suľ'TgGI ä IgG2 . Natívne Fc sú pripravené z monomérnych polypeptidov, ktoré môžu byú viazané do dimérnych alebo multimérnych foriem kovalentnou (to je disulfidovou väzbou) a nekovalentnou asociáciou. Počet intermolekulových disulfidových väzieb medzi monomérnymi podjednotkami natívnych Fc molekúl je v rozmedzí od 1 do 4, v závislosti na triede (napríklad, IgG, IgA, IgE) alebo podtriede (napríklad, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Jedným príkladom natívneho Fc je disulfidovo viazaný dimér vzniknutý papaínovým trávením IgG (pozri Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10:4071-9). Termín natívny Fc, ako je tu použitý, zahŕňa monomérne, dimérne a multimérne formy.
Termín Fc variant označuje molekulu alebo sekvenciu, ktorá je modifikovaná z natívneho Fc, ale stále ešte obsahuje väzbové miesto pre receptor, FcRn. 97/34631 (publikovaná 25.9.1997) príklady Fc variantov, rovnako
Mezinárodné prihlášky WO a WO 96/32478 opisujú ako ich interakcie s receptorom, a sú tu uvedené ako odkazy.
-Termín—Fc -variant- zahŕňa - molekuly alebo - sekvencie, ktoré sú humanizované z non-ľudského natívneho Fc. Ďalej, natívny Fe obsahuje miesta, ktoré môžu byú odstránené, pretože spôsobujú štrukturálne vlastnosti alebo biologickú aktivitu, ktoré nie sú žiadúce pre fúzne molekuly podľa predkladaného vynálezu. Tak termín Fc variant zahŕňa molekulu alebo sekvenciu, ktorá nemá jedno alebo viacero miest alebo zvyškov natívneho Fc, ktoré ovplyvňujú alebo sa podieľajú na (1) tvorbe disulfidovej väzby, (2) inkompatibilite s danou hostiteľskou bunkou; (3) Nterminálnej heterogenite po expresii vo vybranej hostiteľskej bunke; (4) glykosylácii, (5) interakcii s komplementom; (6) väzbe na Fc receptor iný ako je požadovaný receptor, alebo (7) u y L o tox i c i~L.tr závislej na protilátkach (Ajjľc) 7 ~Fč varianty su opísané podrobnejšie ďalej.
Termín Fc doména označuje natívne Fc a Fc varianty a sekvencie, ako boli definované vyššie. Rovnako ako Fc varianty a natívne Fc, termín Fc doména zahŕňa molekuly v monomérnej alebo multimérnej forme, či už trávené z kompletnej protilátky alebo produkované inými spôsobmi.
Termín multimér, ako je použitý pre Fc domény alebo molekuly obsahujúce Fc domény, označuje molekuly obsahujúce dva alebo viacej polypeptidových reúazcov asociovaných kovalentne, nekovalentne alebo ako kovalentne, tak nekovalentne. IgG molekuly typicky tvoria diméry; IgM, pentamere; IgD, diméry; a IgA, monoméry, diméry, triméry alebo tetraméry. Multiméry môžu byú pripravené testovaním sekvencie a výslednej aktivity natívneho Ig zdroja Fc alebo derivátizáciou (ako je definovaná ďalej) takého natívneho Fc.
Termín dimér, ako je použitý pre Fc domény alebo molekuly obsahujúce Fc domény, označuje molekuly obsahujúce dva — polypeptidové---refazce----asociované-----------kovalentne alebo nekovalentne. Príklady dimérov podľa predkladaného vynálezu sú uvedené na obr. 1 a 2.
Termíny derivatizácia a deriváty alebo derivátizovaný označujú procesy a získané zlúčeniny, v príslušnom poradí, kde (1) zlúčenina má cyklickú časú; napríklad, zosietenie medzi cysteínylovými zvyškami v zlúčenine; (2) zlúčenina je zosietená alebo má zosieúovacie miesta; napríklad, zlúčenina má cysteínylovy zvyšok a tak tvorí v kultúre alebo in vivo zosietené diméry: (3) jedna alebo viacej peptidylových väzieb je nahradená nepeptidylovou väzbou; (4) N-koniec je nahradený
-NRR5--NRC (0)1^--NRCCOOR1;----NRS (0ΠΚ1, ^NHCTOTNHR-,- sukcimidovou skupinou alebo substituovaným alebo nesubstituovaným benzyloxykarbonyl-NH-, kde R a R1 a substituenty kruhu sú definované ďalej; (5) C-koniec je nahradený -C(O)R2 alebo -NR3R4, kde R2, R3 a R4 sú definované ďalej; a (6) zlúčeniny, kde sú jednotlivé aminokyselinové skupiny modifikované reakciou s činidlami reagujúcimi s vybranými vedľajšími reúazcami alebo terminálnymi zvyškami. Deriváty sú opísané ďalej.
Termín peptid označuje molekuly dĺžky 1 až 85 aminokyselín, kde výhodné sú molekuly dĺžky 5 až 34 aminokyselín. Príkladnými peptidmi sú tie, ktoré obsahujú PTH/PTHrP modulujúcu doménu prirodzenej molekuly alebo obsahujú randomizované sekvencie.
Termín randomizovaný, ako je tu použitý pre peptidovú sekvenciu, označuje celkom náhodné sekvencie (napríklad selektované metódou fágového zobrazenia alebo RNA-peptidového skríningu) a sekvencie, v ktorých je jeden alebo viacero zvyškov prirodzenej molekuly nahradený amínokyselinovým zvyškom-- nevyskytujúcim—sa— v— tejto— pozícii— v-- prirodzenej molekule. Príkladné metódy na identifikáciu peptidovej sekvencie zahŕňajú fágové zobrazenie, E. coli zobrazenie, ribosómové zobrazenie, RNA-peptidový skríning, chemický skríning a podobne.
Termín PTH/PTHrP modulujúca doména označuje akúkoľvek amínokyselinovú sekvenciu, ktorá sa viaže na PTH-1 receptor a/alebo PTH-2 receptor a zahŕňa prirodzené sekvencie a randomizované sekvencie. Príkladné PTH/PTHrP modulujúce domény môžu byú identifikované alebo derivované spôsobom uvedeným v odkazoch-pre tabuľky 1 a 2.
Termín PTH agonista označuje molekulu, ktorá sa viaže na PTH-1 alebo PTH-2 receptor a zvyšuje alebo znižuje v testoch jednu alebo viacej PTH aktivít kompletného ľudského hormónu príštitných teliesok. Príklady testov na aktivitu PTH sú uvedené v príklade 1.
Termín PTH antagonista označuje molekulu, ktorá sa viaže na PTH-1 alebo PTH-2 receptor a blokuje alebo bráni normálnym efektom kompletného ľudského hormónu príštitných teliesok. Príklady testov na aktivitu PTH sú uvedené v príklade 2.
Termín inhibítor resorpcie kosti označuje takéto molekuly, ktoré sú určené testami uvedenými v príkladoch 4 a 11 WO 97/23614 (ktorá je tu uvedená ako odkaz). Príklady inhibítorov kostnej resorpcie sú OPG a OPG-L protilátky, ktoré sú opísané vo WO 97/23614 a W098/46751, v príslušnom poradí, ktoré sú tu uvedené ako odkazy.
Ďalej fyziologicky prijateľné soli zlúčenín podľa predkladaného vynálezu tiež spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu-r— Termín- fyziologicky prijateľné-soli’ označuj e -soli ; ktoré sú známe alebo budú objavené a ktoré sú farmaceutický prijateľné. Niektorými špecifickými príkladmi sú: acetát; trifluóracetát; hydrohalogenidy, ako je hydrochlorid a hydrobromid; sulfát; citrát; tartrát; glykolát; a oxalát.
Štruktúra zlúčenín
Všeobecne. Aminokyselinové sekvencie väzbového miesta receptora pre PTH a PTHrP sú opísané v tabulkách 1 a 2 . Ďalšie informácie o PTH a PTHrP sú uvedené v Mamistadt et al. (1999), Am. J. Physiol. 277. 5Pt2: F665-75; a Gardella (1996)., ťh—Biol.—Chemr 271 (33): 19888-93. Každá z týchto publikácií je tu uvedená ako odkaz. Z uvedených sekvencií predkladatelia vynálezu identifikovali výhodné sekvencie odvodené od PTH a PTHrP. Tieto sekvencie môžu byú randomizované za použitia techník uvedených vyššie, pomocou ktorých môže byú jedna alebo viacej aminokyselín zamenená za zachovania alebo zlepšenia väzbovej afinity peptidu.
V prostriedkoch podľa predkladaného vynálezu môže byú peptid naviazaný na vehikulum prostredníctvom C-konca peptidu. Tak môžu byú molekuly vehikulum-peptid podľa predkladaného vynálezu opísané nasledujúcim vzorcom I:
P1- (L^a-F1 a jeho multiméry, kde:
F1 je vehikulum (výhodne Fc doména) a je naviazané na Ckoniec P1-(L1)a;
P1 je sekvencia PTH/PTHrP modulujúcej domény;
L1 je spájacia sekvencia; a a-j e- O- alebo-1Peptidy. Ktorýkoľvek z mnohých peptidov môže byt použitý v predkladanom vynáleze. Peptidy môžu obsahovať časť sekvencie prirodzeného proteínu, môžu mať randomizovanú sekvenciu odvodenú od sekvencie prirodzených proteínov, alebo môžu mat celkom randomizovanú sekvenciu. Fágové zobrazenie a RNApeptidový skríning sú vhodné na prípravu peptidov podľa predkladaného vynálezu.
Najmä vhodná sekvencia PTH/PTHrP modulujúcej domény je sekvencia vzorca II
XhX8HX10X11X12KX14X15X16X17X18X19RX21X22X23X24X25X26X27X28Xc (SEQ ID NO: 3) kde
XN nie je prítomný alebo je X3X4X5X6X7, X2X3X4X5X6X7,
X1X2X3X4X5X6X7, alebo YX1X2X3X4X5X6X7;
X1 je aminokyselinový zvyšok (nefunkčný, hydrofilný alebo aromatický zvyšok je výhodný; A, S alebo Y sú výhodné);
X2 je aminokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok je výhodný, V je najvýhodnejší);
X3 je aminokyselinový zvyšok (hydrofilný zvyšok je výhodný,
S je najvýhodnejší);
X4 je aminokyselinový zvyšok (acidický zvyšok je výhodný, E je najvýhodnejší);
X5 je aminokyselinový zvyšok (nefunkčný alebo bázický zvyšok je výhodný, H alebo I sú najvýhodnejšie);
X5 je aminokyselinový zvyšok (acidický alebo hydrofilný zvyšok je výhodný, Q alebo E sú najvýhodnejšie);
X7 je aminokyselinový zvyšok (nefunkčný alebo aromatický zvyšok je výhodný, L alebo F sú najvýhodnejšie);
— X8-j e*amínokyselinový-zvyšok - (nefunkčný - zvyšok*j e' výhodný, M alebo Me sú najvýhodnejšie);
X10 je aminokyselinový zvyšok (acidický alebo hydrofilný zvyšok je výhodný, N alebo D sú najvýhodnejšie);
X11 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný alebo bázický zvyšok je výhodný, L, R alebo K sú najvýhodnejšie);
X12 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný alebo aromatický zvyšok je výhodný, G, F alebo W sú najvýhodnejšie);
X14 je amínokyselinový zvyšok (bázický alebo hydrofilný zvyšok je výhodný, H alebo S sú najvýhodnejšie);
X15 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok je výhodný, L alebo I sú najvýhodnejšie);
x/* j“e amínokyselinový-- zvyšok (nefunkčný alebo hydrofilný zvyšok je výhodný, Q, N, S alebo A sú najvýhodnejšie);
X17 je amínokyselinový zvyšok (acidický, hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok je výhodný; S, D alebo L sú najvýhodnejšie); X18 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok je výhodný,
M, L, V alebo Nie sú najvýhodnejšie);
X19 je amínokyselinový zvyšok (acidický alebo bázický zvyšok je výhodný, E alebo R sú najvýhodnejšie);
X21 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok alebo bázický zvyšok je výhodný; V, M, R alebo Me sú najvýhodnejšie);
X22 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný, acidický alebo aromatický zvyšok je výhodný, E alebo F sú najvýhodnejšie);
X23 je aromatický alebo lipofilný zvyšok (W alebo F sú výhodné);
X24 je lipofilný zvyšok (L je výhodný) ;
X25 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný alebo bázický zvyšok je výhodný, R alebo H sú najvýhodnejšie);
X26 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný alebo bázický zvyšok je výhodný, K alebo H sú najvýhodnejšie);
X27 je amínokyselinový zvyšok (lipofilný, bázický alebo nefunkčný zvyšok je výhodný, K alebo L sú najvýhodnejšie);
.— χ.?8_. amínokyselinový—zvyšok—(lipof i Iný—alebo— nefunkčný· zvyšok je výhodný, L alebo I sú najvýhodnejšie);
Xc nie je prítomný alebo je X29, X29X30 , X29X30X31, X29X30X31X32 ,
X29X30X31X32X33 , X29X30X31X32X33X34, X29X30X31X32X33X34X3S alebo χ29χ30χ31χ32χ33χ34χ35χ36 .
X29 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok je výhodný, Q alebo A sú najvýhodnejšie);
X30 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný alebo acidický zvyšok je výhodný, D alebo E sú najvýhodnejšie);
X31 je amínokyselinový zvyšok (lipofilný alebo nefunkčný zvyšok je výhodný, V alebo I sú najvýhodnejšie);
X32 je amínokyselinový zvyšok (bázický zvyšok je výhodný, H je najvýhodnejší);
X33 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný zvyšok je výhodný, N alebo T sú najvýhodnejšie);
X34 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný alebo aromatický zvyšok je výhodný, A, F alebo Y sú najvýhodnejšie);
X35 je amínokyselinový zvyšok (acidický zvyšok -je výhodný, E je najvýhodnejší); a
X36 je amínokyselinový zvyšok (aromatický zvyšok je -výhodný, Y je najvýhodnejší).
Výhodná sekvencia PTH/PTHrP modulujúcej domény je sekvencia vzorca III
JNJ7J8HNLJ12KHLJieSJ18J19RJ21EWLRKKLJc (SEQ ID NO: 4) kde:
JN nie je prítomný alebo je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej
J1 J2J3J4J5J6, J2J3J4J5J6, J3J4J5J6;
J1 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný, hydrofilný alebo aromatický zvyšok je výhodný; A, S alebo Y sú najvýhodnejšie);
--J2-j e— amínokyselinový- zvyšok (nefunkčný- zvyšok“ je výhodný,
V je najvýhodnejší);
J3 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný zvyšok je výhodný,
S je najvýhodnejší);
J4 je amínokyselinový zvyšok (acidický zvyšok je výhodný, E je najvýhodnejší);
J5 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok je výhodný,
I je najvýhodnejší);
J6 je amínokyselinový zvyšok (bázický zvyšok je výhodný, Q je najvýhodnejší);
J7 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný alebo aromatický zvyšok je výhodný, L alebo F sú najvýhodnejšie);
J8 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok-j e výhodný, M alebo Nie sú najvýhodnejšie);
J12 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný alebo aromatický zvyšok je výhodný, G alebo W sú najvýhodnejšie);
J16 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný alebo hydrofilný zvyšok je výhodný, N, S alebo A sú najvýhodnejšie);
J18 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok je výhodný, M, Nie, L alebo V sú najvýhodnejšie);
J19 je acidický alebo bázický zvyšok (E alebo R sú výhodné); J21 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok je. výhodný,
V, M alebo Me sú najvýhodnejšie);
Jc nie je prítomný alebo je J29, J29J30, J29J30J31, J29J30J31 J32,
J29J30J31J32 J33, J29 J30 J31 J32 J33 J34 ;
J29 je amínokyselinový zvyšok (hydrofóbny alebo nefunkčný zvyšok je výhodný, Q alebo A sú najvýhodnejšie);
J30 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný alebo acidický zvyšok je výhodný, D alebo B sú najvýhodnejšie);
J31 je amínokyselinový zvyšok (lipofilný alebo nefunkčný zvyšok je výhodný, V alebo I sú najvýhodnejšie),·
J32 je amínokyselinový zvyšok (bázický zvyšok je výhodný, H je najvýhodnejší);
---j?2_j e - amínokyselinový- zvyšok - (acidický zvyšok je výhodný ,~ N je najvýhodnejší);
J34 je amínokyselinový zvyšok (aromatický zvyšok je výhodný, F alebo Y sú najvýhodnejšie) .
Zo vzorca SEQ ID NO: 4 sú peptidy uvedené v tabuľke 1 najvýhodnej šie.
Iná výhodná sekvencia PTH/PTHrP modulujúcej domény je sekvencia vzorca IV
ONLHO10O11O12KSIO15O16LRRRFO23LHHLIOc (SEQ ID NOt~5j-------------:----kde:
0N nie je prítomný alebo je Y01020304050607, 01020304050607,
020304050607, 0304050607, 04050607, O5O6O7, 0607 alebo 07;
O1 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok je výhodný, A je najvýhodnejší);
O2 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok je výhodný, V je najvýhodnejší);
O3 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný zvyšok je výhodný,
S je najvýhodnejší);
O4 je amínokyselinový zvyšok (acidický zvyšok je výhodný, E je najvýhodnejší) ;
O5 je amínokyselinový zvyšok (bázický alebo nefunkčný zvyšok je výhodný, H alebo I sú najvýhodnejšie);
O6 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný zvyšok je výhodný, Q je najvýhodnejší);
O7 je amínokyselinový zvyšok (nefunkčný zvyšok je výhodný,
L je najvýhodnejší);
O10 je amínokyselinový zvyšok (acidický alebo hydrofilný zvyšok je výhodný, N alebo D sú najvýhodnejšie);
— O11- je— amínokyselinový—zvyšok—(bázický— alebo— nefunkčný zvyšok je výhodný, K alebo L sú najvýhodnejšie) ;
O12 je amínokyselinový zvyšok (aromatický alebo nefunkčný zvyšok je výhodný, G, F alebo W sú najvýhodnejšie);
O15 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok je výhodný, I alebo S sú najvýhodnejšie);
O16 je amínokyselinový zvyšok (hydrofilný zvyšok je výhodný, Q alebo N sú najvýhodnejšie);
O17 je amínokyselinový zvyšok (acidický alebo nefunkčný zvyšok je výhodný, D alebo L sú najvýhodnejšie);
O23 je amínokyselinový zvyšok (aromatický zvyšok je výhodný, F alebo W sú najvýhodnejšie);
0c nie je prítomný alebo je O29, O29O30, O29O30O31, Ο29Ο3θΟ31Ο32, O29o30o31o32O33, O29O30O31O32O33O34, O29O30O31O32O33O34O35 alebo
O29O30O31O32O33O34O3SO3fi, a
O29 až O36 sú každý nezávisle amínokyselinový zvyšok.
Zo vzorca SEQ ID NO: 5 sú peptidy uvedené v tabuľke 2 najvýhodnejšie.
Príkladné peptidové sekvencie podľa predkladaného vynálezu sú uvedené v tabuľkách 1 a 2. Tieto peptidy môžu byť pripravené spôsobom opísaným v citovaných odkazoch alebo v U.S. Pat. č. 4,423,037, 4,968,669, 5,001,22 a 6,051,686, kde každá z vyššie uvedených citácií je tu uvedená ako odkaz. Molekuly podľa predkladaného vynálezu obsahujúce tieto peptidové sekvencie môžu byť pripravené spôsobmi známymi v odbore. Sú použité jednopísmenové skratky pre aminokyseliny. Ktorýkoľvek z týchto peptidov môže byť viazaný v tandeme (to je sekvenčne) s alebo bez spájacích sekvencii. Ktorýkoľvek peptid obsahujúci cysteínylový zvyšok môže byť zosietený s iným peptidom obsahujúcim Cys, kde jeden alebo obidva takéto peptidy“ môžu—byť—viazané” na”'vehikulum: Ktorýkoľvek- peptid obsahujúci viac ako jeden Cys zvyšok môže tvoriť intrapeptidovú disulfidovú väzbu. Ktorýkoľvek z týchto peptidov môže byť derivátizovaný spôsobmi uvedenými ďalej.
Tabuľka 1: PTH/PTHrP modulujúce domény na báze PTH
opis sekvencia SEQ 10 NO:
PTH(1-84)‘ ľudský SVSKIQLMHNLGKHLNSMERVBWLRKKLQDVHNPV ALGAPIAPRnAGSQRTRKKEDNVLVESHEKSLGEA DKADVNVLTKAXSQ 10
* Hendy gtal· (1981), ProcNad, Araď SdUSA 78:7365; Xirnuraetal· (1983), Biochem.
Biophvs. Rea, Conunun. 114:493; ZaneM et aL (l9ffi).£ndocrinologv 1174-1962:-Wingender etaL (1985), T.Biol. Chem. 264:4367.
krysí PTH(1-84)* AVSEIQLMHNLGKHLASVERMQWLRKKLQDVHNFV SLGVQMAAREGSYQRPTKKEDNVLVDGNSKSLGEG DKADVDVLVKAKSQ 11
ľudský «^(7-84) LMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPL APRDAGSQRPRKKEDNVLVESHEKSLGEADKADVN VLTKAKSQ 12
ľudský PTH(l-44)3 SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFV ALGAPLAPR 13
ľudský PTH(1-38)3 svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdVhnfv ALG 14
ľudský PTH (2-38)3 VSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVKNFVA LG 15
ľudský PTH(1-34)4 SVSEIQLMHNLGKHIJISMERVEWLRKKLQDVHNF 16
ÍArqlll ľudský PTH(l-34) SVSEIQLMHNRGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF 17
(Lyslll ľudský PTHd -34) SVSEIQIMHNKGKHĽNSMERVEWLRKKLQDVHNF 18
ÍArql91 ľudský PTH(1-34) SVSEIQIWHNLGKHUISMRRVEWLRKKLQDVHNF 19
[Tyrll ľudský PTH (l-34r YVSEIQLMHNLGKH12JSMERVEWLRKKLQDVHNP 20
(Lea (8, 18), Tyr341 ľudský PTH(134)’ SVSEIQLLHNIXSKHLNSLERVEWLRKKLQDVHNY 21
hovädzí HH(1-34)S AVSEIQFMHNLGKHLSSMERVEWLFKKLQDVHNP 22
ÍLen(8. 18), Tyr341 hovädzí HH (1- 34Γ AVSEIQELHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNY 23
prasačl HH (l·-34? SVSEIQLMHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNF 24
krysí PTH (1-34)3 AVSEIQLMHNLGKHLASVERMQWLRKKLQDVHNF 25
(Lea (8, 21), Tvr34JioySíPTH (1-34)1 AVSEIQIJJHNLGKHLASVERLQWLRKKLQDVHNY 26
ľudský PTHd -31)7 S VSE IQLMHNL<2(HLNŠMERVEWLRKKLQDV 27
[Leu27] ľudský PTH(1-31)’ SVSEIQLMHNLGKHIMSMERVEWLRKLLQDV 28
ton, m IgM) naiMti1 SEIQLLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQDVHNY 29
hovädzí ΗΗΟ-34Γ SEIQFMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQDVHNP 30
[Leu(8, 18), Tyr34]hovädzí PTH{3- 34i: SEIQFLHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNY 31
2 Henrich eíaL (1984> T. BioL Chán. 259; 3320.
3 Bachern Catalogue (1999} 4 Doppdt etaL (1981} CalafTissuelnt 33649; Podbesek et al (1983) Endocrinology 112: 1000; Keni etaL (1985} t&VScL 68:171; McKee and Caulfield (1989} Peptidďles. 2:161; Lee and Rassefi (1989} Biopdymere 28:1115; Reeve etaL (1990} Br. Med. T. 301314;Neugebauer etaL (1994} Int J. Peptide Protein Res. 43555.
d^kamuraetal (1981} Proc. Soc. Exp. BioLMed. 168:168; Lawet al (1983} T.Clm, Endociinol Metab. 56:1335; Wang etaL (1984} Eur. T. PhannacoL 97209; Sbam et al (19861 Gen. Comp, EndocrinoL 61:148; Smith et al (1987} Árch. Biochem. Biophvs. 253;
81.
6Podľa Cohrera etaL (1981} T.BioLChem. 256:10555;Bťrgeron et al (1981}
Endocrinology 109:1552.
7 Jouisbonime etaL (1994} J.BoneMmer.Res. 9:943; Whitfidd and Moriey, TTPJ16382 8Bartňer et al (19971 J. Med. Chem, 40:1373.
’Podľa SchipanietaL(1993}Endocrinology 1322157-65.
* Scharla etaL (1991} Horm. Metah. Res. 23:66-9; MoGowan et al (1983} Science 219; 67; Lowik et aL (19851 Celí Calcium 6311.
11 Podľa Jobert etal (1997} Endocrinology 13& 5282; Schipani et aL (1993} RosenblattetaL (1977} J.BioLCban 2525847; Segre dal (1979} J. Biol Chán 254.6980;
rUdskýPTHC7-34)B-—......- WHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF----------------- 32
[Leu(8,18)Tyr34]rudskýPra(7- 34Ý LLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQDVHNY 33
hovädzí PTHÍ7-34Ý3 FMHNLGKHLS SMERVEWLRKKLQDVHNF 34
ITyrMlhovädzi ΠΗ7-34)14 u ... FMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQDVHNY 35
[Leu(8,18)/Ι)τ34ι hovädzí PTH(7- FLHNLGKHLS SLERVEWLRKKLQDVHNY 36
[Leu(8,18) Trpl2,TyT34]hovädzi PTH(7-34)“ FLHNLWKHLS SLERVEWLRKKLQDVHNY 37
[D-Trpl2,Tyr34]hOvädzí PTH(7-34)J' IMHM^TrpXHI^SMHRra 38
ľudský ΡΓΗΠ-30) SVSEIQLMNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD 39
rArslllnidskv PTHÍl -30) SVSEIQU4HNRGKHLNS4EKVEWLKKKLQD 40
ÍLvslll rudskv ΡΓΗΠ -30) SVSEIQLMHNKGKHLNSMERVEWLRKKLQD 41
rArel91ľudskýPTHf)-30) SVSEIQLMHNLGKHLNSMRRVEWLRKKLQD 42
ITvrll ľudský ΡΊΉΠ -30) YVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD 43
ILeuŕB. 18)1 ľudský PTHÍ1-30) SVSSQLLHhRjCLKHINSLERVEWIJUCKLQD 44
hovädzí PTHfl-30) AVSZKJFMHNLGKHLSSMERVEWLRHOjQD 45
ÍLeuŕS. 18)1 hovädzí ΡΓΗΠ-30) AVSEKJHJHNLGKHISS^ 46
prasačí ΡΓΗΠ-30) SVSQQLMHNLGKHLSSLERVEWĹKKKLQP 47
krvsíPTHŕl-30) AVSEIQLMHNLGKHLASVERMQWLRKKLQD 48
p Tyr34]lrrysf ΡΤΤφΤ^ AVSFJQf I HNI ΓΚΡΙ ASVFBT QWT RKVT ΠΠ_
ILai271 ľudský ΚΠΪΙ-30) SVSEXJIONLGKHLNSMEKVEWUtKLLQD 50
ľudský PTHfl-29) SV^QLMHNLGKHLNSMQRVEWLSKKLQ 51
ľudský PTHfl-28) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKL 52
ILeu(8.18)1FTHÍ3-3O) SEKJLmNLCKHllýSlJRVEWIJ<KKljQD 53
hovädzí PTHÍ3-3O) SEKjFMHNLGKHLSSMERVEWLKKKLJQP 54
Π«/8 Ittlhovädzí ΡΓΗΠ-30) S^IIHNIjGKHLSSĽER\^WldRKKIXK> 55
ľudský ΡΙΈΪ7-30) LMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD 56
ILeoíB. 18)1 ľudský FTHf7-3O) LLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQD 57
hovädzí ΡΠΚ7-30) FMHNLGKHLS SMERVEWLRKKLQD 58
ÍLeuŕS. 18)lhovädzi ΡΤΗΠ-30) FlflNLGKHLSSLEKVEWUlK^^ 59
^(8,18ÍTipl2)hovä^i PIHC7- FLHNLWKHLSSLERVEWLRKKLQD 60
[Mipl2] hovädzí PIH(7-3O) FMHNL-D-Tip-KHLSSMERVEWLRKKLQt) 61
Nussbaum al d (1980). J. BioL Chem.. 225:10183; Gray at d. (1980), Br J Phannac 76:259 ĽNissensonat_eL (1999), Endocrinoloev 140:1294-1300.
13 Jueppner atd. (1996), Endocnnology.
14 Horiucfai atd (1983). Scžence220:1053.
15 Sctópani atd (1993); Hobck atd (1995), Bong 16:140S (abstract223, Confereoce, Mdboume; February 1995), ;tfBased onDresoer^^ atd (19961IBMR 11:1061-5.
17 Goldman at d. (198¾ Endocrindogv 1232597.
----Tabuľka-2 PTH/PTHrP-modulujúce domény nabázePTHrP
Opis Sekvencia SEQ1D NO.
ľudský PTHrP(l-86)3 AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIIírAE KRYSÍ SEVSPNSKPSPOTKNHPVRFCSDDEGRYLTQ EINKVEIYKEQFĽKIP 62
ľudský PTHrP (l-34)lH AVSEHQLIJdDKGKSIQDLRRSFFĽHHLIAEIHTA 63
[Tyr36]rudský PTHrP(l -36/ AVSEHQUJIDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAE Y 64
^Ľe5^Jip23, Tyi36] ľudský PlHíP AYSHQlriHDKGKSIQDLRRRFWLHHLIAEIHTAEY 65
Tyr-rudský PTHď(l-34)4 yavsehqujhdkgksiqdlrrrfflhhllaeihta 66
AsnlO,LeulÍ,t)-Pliel2] ľudský PTHrP(l-34r AVSEHQLLHNL-D- Phe KSlQDUtRRFFLHHLIAEIHTA 67
PTHrP (7-34)*° LLHDKQCSIQDIJRRRFFLHHLIAElHrA 68
[AsnlO,Leull J ľudský Fl’HrPí7-34) llBNIXjKSIQDlJUUtFELHHLIAEIHTA 69
[Asnl 6,Leul71PTHď(7-34)w ILHDKGKSINILJUtREFLHHLIAEIHTA 70
ILeul 1, D-Trpl2] ľudský PlUri1^- 34)“ LLHDL-D-Trp-KSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA 71
JAsnIO, Leul 1 JD-Trpllj FľHiP(7- ^HNDILTrp-KSIQDIJlRRITlLlHILAEIHTA 72
[D-Trpl21PTHrP(8-34) ΙΉΝνί^ΤΓρ-ΚδΙΟΒΙΛΚβΙΤΙΉΗΕΙΑΕΠΙΓΑ 73
rn-Phel21PTHrP(8-34) LHNL-D-Phe-KSIQDLRKRFFLHHLIAEIirrA 74
Äsn Ô, LeqJtD-TipiZJ ľudský Ι2ΉΝυθ-ΤΓρ-Κ5^ϋ]υΗ<ΡΙΤΙΉΗΕΙΑΕΙΗΤΑ 75
ľudský PTHrP(l-30> AVSEHQLIJIDKGKSIQDIilRRITILIHLIAE 76
IHe5, Tip23JmTký FľHrP(l-30j AVSEKJILHDKGKS1QDLRRRFWLHHLIAE 77
Tyr- ľudský PTHrPd -30) YAVSEHQĽLHDKGXSIQDIJRRRHIHHLIAE 78
[AsnlU, Leul lJJ-Rtelzj ľudský PTHrPfl-30) AVSEHQLLHNLD-Pbe-KSIQDLRRRFFLHHLIAB 79
PTHrP J7-30) ILHIKGKSHJDLRRRITLHHLIAE 80
[AsnlU, Len 11J ľudský FTHrP(7-30) LLHNLGKS IQDLRRRFFgHHLIAE 81
[Asnl6,Leul71PTHrP(7-30) LLHDKGKSINLLRRREFLHHLIAE 82
[LeuH, D-Trp 12] ľudský PTHď(7- 30) ILHDL^D-Trp-KSIQDLRRRFFLHHLIAE 83
jAsnl0,Leullf>Trpl2J PíHtť(7- LLHÍ«^D-Tip-KSI<^LRRWTlJfflLIAB 84
B Moseley et al (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5048; Suva atel (1987), Science 237: 893; Kemp at eL (1987), Science 238:1568: P&spaliaris at d f19951 Bonei 16:141S(abstract225, Caoference, Melboume 1995).
19 Podľa JP 07316195, May 25,1994 (NipponKayaku).
20Nagasaki at el f1989). Biochem. Biophys. Res. Commun. 158:1036; Nuttald; Endocrmology 127,491 (1990).
21 Williams at eL (1998), T. Reproduction & Fertility 112:59-67.
aGardeUaatel(1996), Endocrinol 137:3936-41 JFujiyama et al. (1998)Am.T.Phvsiol. 274E297-E303.
23 Ľ at eL (19961 Endocnnology.
LHNL-I>Tip-KSIQDU<RRITLHHLIAE
SVSEKJLMHNLCjKHIJýSMERVElJJEKIJJCKlHNF [D-Tipl2]PIHŕ(8-30) n>Phel21
8-30)
AsrrtO, Leul 1, D-Trpl2] ľudský ΡΊΗΓΡΓ7-3Ο)
IHNL-D-Mie-KSIQDIRRRFFLHHUAE
LLHNL-D-Trp-KSIQDLRKRFFLHHLIAE
Haa(Laa Laa Raa Haa)2 Laa 22--
31] ľudský PTHH-34/'
SVSEXJLMHNUjKHLNSMER^^
U] ľudsky PTH
Laa Haa Haa) 2 Laa 2Í ja Haa)
1-34Γ . . W- ......
Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 223TL ľudský PTH (1·
ΠΕψ] .-34y*
SVSE1QLMHNLGKHI74SIERVÄIAEAIAEALHNF [Haa(laa Laa Haa Haa) 2 Laa 22311 ľudský PTH (1-34) ľHä [Haa (La a Laa Haa Haa)2 Laa 22
3i] ^ký πη(Κ τπ— [Haa(Laa Laa Haa Haa)j Laa 22-31] ľudský PTH (7-34)» (Haa(Laa Laa Haa Haa^ Laa 22-311 ľudský PTH (7-34)»
Laa 22SVSEK^J4HNIX3ajmSMERVSU^SIJ^aHNF δν^^ΙΛΰΊΝΕΟΜΙΙΒΜΕΚνΑΙΎΜίνΑΕΚΙΉ^
TMHNIfyfflNSMFRVFIIFKIIFKIťlNF
ΤΜΗΚΤΓτΚΗΐ .nsmf.rvf.it.™ i.Ktn.nwy
LMHNLGXHLNSMBRVALAEALAEALKNF
31] ľudský PTH (7-34' [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-3 lj ľudský PTHÍ7-34)26
U4HNLC3CH1NSMERVSUJSSUJSLHNF [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 2231] ľudský PTH (7-34)
- ^EST··
Täá Haa Haa}2 Laa 2211 ľudský PTHrPd-34)24
- «ÚL
31] n , [Haa(Laa Laa Haa Haa) 2
31] hidský PTHrP(l-34y4 mi [Haa(Laa Täa Haa Haa)2 Laa 2231] ľudský raw(i-34y>
[IÍaa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 2231] ľudský PTIŽP (1-34)' [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 2231] ľudský ΡΊΉιΡ (l-34)~~
Laa Haa Haa)2 Laa 22-
ľudský PTHrPC7-34) [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22311 ľudský PTaPC7-34y* [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22311 ľudský PTHr?(7-S4y\
IHaa(Laa Laa Haa Haa i
3l 1 ľudský PIHŕP(7-34)
Laa 221] ľudský PTHrf(7-S4y7 [Lysí I ,Lysl3; ArgI9, Aig2l;
Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22311 ľudský PTHif (1-34)29
LMHNLGKHLNSMERVAfYDKVAEKLHNF
AVSFHQIJmKfilCNiqpiRRRniHniKiniTrA
AVSEHQUUDKGKSK^PLRKRELLQOXKKLHIA
AVSEHQULHESLQíSKjDLKRRALAEALAEALHTA
AVSEHQUJHIÄGKS1Q1XRRRSUJSSLLSSLHTA
AVSQiQUHDKGKSIQPLRRRAFYDKVAEKLHrA
TinnKfaogtywRRRFJiKKíJľKTHTA
IJJíDKGKSKJ>LRRRELLEKLLKKLHrA
IIB^GKSKKHJUUinAEAlAEALHTA
LLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA
LLHTXGKSQDLRRRAraX^^
AVSrHQTIHnKfiKSTQOTRRRFIIKKTIRKIHTA 24 S inkorporáciou SBQDČ.26Z US. Pat Č 6,051,686. ZS inkorporáciou SEQ DNO28z US. Pat Č. 6,051,686.
S inkorporáciou SEQIDČ.29z US. Pat Č. 6,051,686. Ή S inkorporáciou SEQlDC.30z U S. Pat Č. 6,051,686. 29 S inkorporáciou SEQIDČ.26z US. Pat Č 6,051,636 29 S inkorporáciou SEQIDNO5z US. Pat Č. 6,051,686.
100
101
102
103
104
105
106
107
108
LysllLysl3tÁrgl9, Artíl; 3aa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 2231] ľudský PTHrP [1-34] 109
Lysí 1, Lysl3; Arel9, Arg21; laafLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] ľudský PTHrP (1-34Γ AVSHQLLHDKCXS K^DUlKRHlEKĽĽEKLHrAGRR 110
[Lysí l,Lysl3:Argl9,Are21; HaafLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] ľudský PTHrP (1-34 p AVSSlQUJlIXGKSK^IJ^RREIJJDGlíKLKEL lll
(Lysí 1, Lysí 3, AtaL9, Artíl, HaafLaa Laa Haa Haah Laa 22-31] ľudský PTHď 11-34)” AVSQ1Q[JĹ1][K<j£2K)PLARREL1JSKU£K111IA 112
ILysWsL ľudský PlHď Arel9,Ala21, MLaV Laa 22-31] [1-34Γ AVSEHQL1I1IXGKSK3DLRRAELUlK1JJlKIJí^ llj
(Leull,LysL Haa(LaaLaa ľudský PlHď ,Argl9,Arg21, HaalfeafcLaa 22-31] Ί-34Γ AVSEAQLIllDLGKSiQDUlIQtHlSHISQJHAL 114
[Lysí 1, Lysí; HaafLaaLaa ľudský PTHrP ,Aigl9, Arg21, HaaHaafLaa 22-31] (1-34)· Αν^Η(ϊ1ΉΙΧίΧ5Κ^Ι1»ΚΕΓυΕ»11ΣΗΙΉΓΑ 115
ľudský PTHrP 3,Atgl9,Aig21, AVSF«QIJHDRnRSa(y«RRFIIFRTJFyiHTA 116
HaälWeLaa22-3ir (1-34Γ
IAigll,b®13,Arcl9,Aig21, tÄaa Laa Éaa^ah Laa 22-31] ľudský PIHď(l-34r AVSFWQLLHDRGKSIQDIJRRIUEIXERUJCRLHTA 117
lAigl 1 ,Aigl 3, Ágl 9, Ατώΐ, HaafLaa Laa Haa HaaL Laa 22-311 ľudský PTHď 1Τ-34Γ AVSEHQlIJlDRGSRSK^XJčRREIJiíRIIJKRLHrA 118
HaafLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-311 rudský PTHď (1-34Γ AVSQK^lHnCCKSIQDLKRRALAEALAEALHIA 119
HaafLaa Laa Haa HaaL Laa 22-31] ľudský PTHďíl-34)41 AVSEHQIIJIIXGKSK^IJUšRSUJSSIJLSSLHTA 120
HaafLaa Laa Haa Haab Laa 22-311 ľudský PTHrP (1-34Γ AVSBHCXJJlfXGKSK^XRRRAFilKVAEKliíIA 121
HaafLaa Laa Haa HaaV Laa 22-311 ľudský PTHrP (1-34)^ AVSEKJFMHNLGKHLSSMERVEĽ^OJINY 122
33 podľa SEQ ID NOS: 8^> z U. S. Pat Č. 6,051,686 3' S inkorporáciou SEQ ID C. 10 z US. Pat C. 6,051,686 32 S inkorporáciou SEQ IDNO 11 z US. Pat Č 6,051,686 33 S inkorporáciou SEQ IDNO 12zUS. Pat Č. 6,051,686 34 S inkorporáciou seq IDNO: 12 zU.S. Pat Č. 6,051,686 35 S inkorporáciou SEQ IDNCh 14 z US. Pat Č. 6,051,686 36 S inkorporáciou SEQ IDNO 15 z US. Pat Č 6,051,686 37 S inkorporáciou SEQ IDNO 16 z US. Pat Č 6,051,686 38 S inkorporáciou SEQ IDNO 17 a 18 zUS. Pat C. 6,051,686 39 s inkorporáciou seq IDNO: 19 z US. Plat Č 6,051,686 40 s inkorporáciou seq ID NO: 20 z US. Pat Č 6,051,686 41 S inkorporáciou SEQ IDNO 21 z US. Pat Č. 6,051,686 42 S inkorporáciou SEQ IDNCh 22 z US. Pat Č. 6,051,686 43 Modifikované zo SEQ IDNO: 23 z US. Pat C. 6,051,686
Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-31] ľudský PTHrP (1-34)44 AVSnQTMHNT ηκνπ SSMRKRFI IΕΚΠ EKT HKV 123
[Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] ľudský PTH (1-30) SVSRIQT MHN1 flKTHÍ NSMFRVHIΕΚΤIHC 124
[HaaíLaa Laa Haa Haa)} Laa 22-301 ľudský PTH (1-30) SVSEK^^lHMljKHUýSMERVElIJiKIJLKK 125
[Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] ľudský PTH (1-30) SVS0 QLhO^UMIINSvlERVALAEALAEA. 126
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] ľudský PTH (1-30) SVSElQIMHNIÁaa^^ 127
[HaaíLaa Laa Haa HaaL Laa 22-30J ľudský PTH (l-34f SVS EIQLMHNLGKHLNSMERVAFYDKVAEKLHNF 128
[Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] ľudský PTH (7-30) ΤΜΗ>ΠηΚΉΙ.ΝΧΜΤ«νΡΙΙΡΚΊ.1.Ρ.Κ 129
[Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] ľudský PTH (7-30) lAIHNLGKHI^SMERVELLEKLLKK 130
[Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22- 30L ľudský PTH (7-30) IAODQIOKHINSMERVAIAEALAEA 131
[Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] ľudský PTH (7-30) U4HNlj3aiU«MERVSLLSSLLSS 132
[Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] ľudský PTH (7-30) LMHNLGKHLNSMERVAFYDKVAEK 133
[HaaíLaa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] ľudský PTHrP (1-30) AVSEHQUJTOKGKSKXÍLXRREllJXllJiK 134
[Haa(Laa Laa Haa Haa>2 Laa 22- 301 rudský PTHrP (1-30) AVmy^HnKCK?nqnrRRREtirinilCIC, 135
]Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] ľudský PTHrP (1-30) AVSEľXJLLIOCGKSlQDLRRRALAEALAEA 136
[Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] ľudský PTHrP (1-30) AVSEHQUWKGKSÍQD1JWRSUJSSĽLSS 137
]Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-301 ľudský PTHrP (1-30) AVSDKJLIHDKGKSIQDLRKRAFYDKVAEK. 138
[Haa(Laa Laa Haa Haafe Laa 22-30] ľudský PTHiP (7-30) T JHnKfiKSKjnmBRFl 1ΓΚΤΙJK 139
ffMLaaLaaHaaHaa)2lÄ22-30] ľudský PTHď (7-30) TIHngflgCTQraBBRErirKrilCg 140
[HaaíLaa Laa Haa Haa)} Laa 22-301 ľudský PTHrP (7-30) LLHĽKGKSJQDLRRRALAEAIAEA 141
[Haa(Laa Laa Haa Haa)} Laa 22-301 ľudský PTHrP (7-30) LLHDKGKS1QDLRRRSLLSSLLSS 142
[Haä(LaaLaaHaa Haafe Laa22-30] ľudský PTHrP (7-30) LLHDKÍ3<SK^XJ«<RAFYĽKVAEK 143
[Lysí 1, Lysl3; Arel9, Arg21; HaaíLaa Laa Haa Haa)} Laa 22-301 ľudský PTHrP (1-30) AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRK 144
]Lys 11, Lys 13; Arel9, Are21; HaaíLaa Laa Haa Haa)} Laa 22-301 ľudský PTHrP (1-30) AVSEHQLĽHDKfiKSWy» RRRKt J ΗΠ JKK 145
[Lysí 1, Lys 13; Argl9, Aig21; HaaíLaa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] ľudský PTHrP (1-30) AVSEHQLLHĽeCGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHT . 146
44Modif ikované zo SEQ ID NO: 24 z US. Pat.č.6, 051, 686
[Lysí 1, Lysl3; Aigl9, Arg21; HaafLaa Laa Haa HaafLaa 22-30] ľudský PTHrP (1-30) AV^HQUHDKCKatyi RKRETIEKTIJK 147
[Lysí l,LyšÍ3,Ala i, HaafLaa Laa Haa Haa)i Laa 22-30] ľudský PTHrP (1-30) AVSErK^mnKGKRtQnrARRWIFKIIKK 148
(Lysí lJLysl 3,Arg 19,A!a21, HaafLaa Laa Haa Haa^ Laa 22-301 ľudský PTHiP (1-30) AVSľHQ} J HDKľ^KSkyiT RRAEIIΕΚΤΙKK 149
lieni 1, Lysl3, Arel9, Arg21, HaafLaa Laa HaaHaa^ Laa 22-30] ľudský FfHď (1-30) AVSEAQIJHnirXSIQDIRRREÍjryTJfK 150
ILysh, LysllArgl9,Arg2L HaafLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] ľudský PTIftP (1-30) AVSEHQIJHnKfKSiQniRRRPIJFRIin? 151
1 Arg 1 l^ŠlXÄrel9,Aig21, HaafLaa Laa Haa HaaL Laa 22-30] ľudský PTHrP (1-30) AVSEHQLLHDRGRSKy>RRRI2JJ3<IIIJR 152
lAigl 1 ,lAslÍAig9,Arg2l, HaafLaa Laa Haa Haa)j Laa 22-30} ľudský PTHrP (1-30) AVSEHQLLHIÄGKSKPLRRRELIJiRLLKR. 153
ľudský-FnapaSo)Ä^ AVgJKgnmRr^aQniRRRHIERlJKR 154
HaafLaa Laa Haa HaaL Laa 22-30] ľudský PTHrP (1-301 AVSlHQLUSXGKSQIXERRALAEALAEA 155
HaafLaa Laa Haa Haa)} Laa 22-30] nadskýPTHďfl-30) AVSEHQLLHDK<3aK)DIR^^ 156
HaafLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] ľudský PTHrP (1-30) AVSEHQUlSX£XaQPU<H^^ 157
HaafLaa Laa Haa HaaL Laa 22-30] ľudský praď (i-30) AVSEKjES4HNL£3CHLSSMERVEĽLEKLIEK. 158
HaafLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] ľudský PTHrP (1-30) AVSJQFMHNLGKHIÄMRRRELIIXLIIX 159
Iná použiteľná PTH/PTHrP modulujúca doména má sekvenciu peptidu známeho ako TIP39:
SLALADDAAFRERARLLATkLERRHWLNSYMHKLLVLDAP (SEQ ID NO: 160)
TIP39 je opísaný v Usdin et al. , 1999, Náture Neurosci 2(11): 941-3; Usdin et al., (1996), Endocrinology 137(10): 4285-97; Usdin et al., (1995), J. Biol. Chem. 270(26): 154558,- Usdin et al. , (1999), Endocrinol 140 (7): 3363-71.
Ďalšia použiteľná sekvencia PTH/PTHrP modulujúcej domény môže byť získaná konzervatívnymi alebo nekonzervatívnymi modifikáciami— aminokyselinové j— sekvencie SEQ ' ID~ NO:__3/4;5, T1P39, alebo sekvencií uvedených v Tabuľkách 1 a 2.
Konzervatívne modifikácie budú produkovať peptidy majúce funkčné a chemické charakteristiky podobné charakteristikám PTH alebo PTHrP peptidu, v ktorom sú takéto modifikácie uskutočnené. Naopak, významné modifikácie vo funkčných a/alebo chemických charakteristikách peptidu môžu byú uskutočnené pomocou substitúcie v aminokyselinovéj sekvencii, ktoré majú významný vplyv na zachovanie (a) štruktúry molekulového skeletu v mieste substitúcie, napríklad v zmysle štruktúry skrutkovice alebo skladaného listu, (b) náboja alebo -hydrofobnosti ~ molekuly v~Cieľovom mieste^ alebo (c) veľkostí molekuly.
Napríklad, konzervatívna aminokyselinová substitúcia môže byú substitúcia natívneho amínokyselinového zvyšku za nonnatívny zvyšok tak, že nedôjde na ovplyvnenie alebo dôjde len na slabé ovplyvnenie polarity alebo náboja amínokyselinového zvyšku v tejto pozícii. Ďalej, ktorýkoľvek natívny zvyšok v polypeptide môže byú tiež substituovaný alanínom, ako bolo opísané pre alanínovú skenovaciu mutagenéziu (pozri napríklad, MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al. , 1998, Adv. Biophys. 35:1-24, ktoré opisujú alanínovou skenovaciu mutagenéziu).
Požadované aminokyselinové substitúcie (či už konzervatívne, alebo nekonzervatívne), môžu byú určené odborníkmi v odbore v dobe, keď sú takéto substitúcie žiadané. Napríklad, aminokyselinové substitúcie môžu byú použité na identifikáciu významných zvyškov peptidovej sekvencie, alebo na zvýšenie alebo zníženie afinity peptidu alebo molekúl vehikulum-peptid (pozri predchádzajúce vzorce), ktoré sú tu opísané.- Príkladné- amínokyselinové—substitúcie—sú-uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3 — Amínokyselinóvé substitúcie
Pôvodné zvyšky Príkladné substitúcie Výhodné substitúcie
Ala Val, Leu, íle Val
Arg Lys, Gin, Asn Lys
Asn Gin Gin
Asp Glu Glu
Cys Ser, Ala Ser
Gin Asn Asn
Glu Asp Asp
Gly Pro, Ala Ala
His Asn, Gin, Lys, Arg Arg
íle Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucín Leu
Leu Norleucín, íle, Val, Met, Ala, Phe íle
Lys Arg, 1,4 Diamínobutyric Acid, Gin, Asn Arg
Met Leu, Phe, íle Leu
Phe Leu, Val, íle, Ala, Tyr Leu
Pro Ala Gly
Ser Thr, Ala, Cys Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr, Phe Tyr
Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val íle, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucín Leu
------Y— niektorých uskutočneniach zahŕňaj ú konzervatívne aminokyselinové substitúcie tiež prirodzene sa nevyskytujúce aminokyselinové zvyšky, ktoré sú typicky inkorporované pri chemickej syntéze peptidov a nie pri syntéze v biologických systémoch.
Ako bolo uvedené v definíciách termínov, môžu byú prirodzené zvyšky delené do tried podľa vlastností vedľajších reúazcov, ktoré môžu byú použiteľné na modifikáciu sekvencie. Napríklad, nekonzervatívne substitúcie môžu znamenaú výmenu člena jednej triedy za člena inej triedy. Takéto substituované zvyšky môžu byú vložené do regiónov peptidu, ktoré sú homológne š non-ľudskými ortoiógmi, alebo 3ô non-homo1ógnych regiónov molekuly. Tiež je možné uskutočniú takéto modifikácie za použitia P alebo G, keď je žiadúce ovplyvnenie orientácie reúazca.
Pri uskutočňovaní takých modifikácií môžeme vziaú do úvahy hydropatický index aminokyselín. Každej aminokyseline je priradený hydropatický index podľa hydrofóbnosti a náboja a tieto indexy sú: izoleucín (+4,5); valín (+4,2); leucín (+3,8); fenylalanín (+2,8); cysteín/cystín (+2,5); metionín (+1,9); alanín (+1,8); glycín (-0,4); treonín (-0,7); serín (0,8); tryptofan (-0,9); tyrosín (-1,3); prolín (-1,6); histidín (-3,2); glutamát (-3,5); glutamín (-3,5); aspartát (3,5); asparagín (-3,5); lysín (-3,9); a arginín (-4,5).
Význam hydropatického indexu aminokyselín pre interaktívne biologické funkcie proteínu je v odbore známy. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Je známe, že niektoré aminokyseliny môžu byú substituované za iné aminokyseliny majúce podobný hydropatický index alebo skóre a môžu si potom zachovaú podobnú biologickú aktivitu. Pri uskutočňovaní substitúcií- podľa-hydropatického- indexu- sú” vyhodné~substitúcie aminokyselín, ktorých hydropatické indexy sú +2, a najmä ±1, a najlepšie ±0,5.
V odbore je tiež známe, že substitúcia podobných aminokyselín môže byú uskutočnená podľa hydrofilnosti. Najvyššia lokálna priemerná hydrofilnosú proteínu, ako je určená hydrofilnosúou susedných aminokyselín, koreluje s jeho imunogenicitou a antigenicitou, to je s biologickými vlastnosúami proteínu.
Nasledujúce hodnoty hydrofilnosti môžu byú priradené amí nokyS e1inovým zvyškom: arginín (+3,0); lysín 1+3,0j~ aspartát (+3,0 + 1); glutamát (+3,0 ± 1); serín (+0,3); asparagín (+0,2); glutamín (+0,2); glycín (0); treonín (-0,4); prolín (-0,5 ± 1); alanín (-0,5); histidín (-0,5); cysteín (1.0); metionín (-1,3); valín (-1,5); leucín (-1,8); izoleucín (-1,8); tyrosín (-2,3); fenylalanín (-2,5); tryptofan (-3,4). Pri uskutočňovaní zmien podľa podobných hodnôt hydrofilnosti sú výhodné substitúcie aminokyselín, ktorých hodnoty hydrofilnosti sú ±2, lepšie +1 a najlepšie ±0,5. Tiež je možné identifikovaú epitopy z primárnej aminokyselinovéj sekvencie podľa hydrofilnosti. Tieto regióny sú tiež označované ako epitopové jadrové regióny.
Odborník v odbore bude schopný určiú vhodné varianty polypeptidov, ako sú tu uvedené, za použitia dobre známych techník. Na identifikáciu vhodných oblastí molekuly, ktoré môžu byú zmenené bez narušenia aktivity, môže odborník v odbore cielene zameraú tie oblasti, o ktorých predpokladá, že nie sú významné pre aktivitu. Napríklad, keď sú známe podobné polypeptidy s podobnými aktivitami od rovnakého druhu alebo od rôznych druhov, tak môže odborník v odbore porovnaú — aminokyselinové—sekvencie~pept idu—s—'podobnými- peptidmi.— Pri takom porovnaní je možné identifikovať zvyšky a časti molekúl, ktoré sú konzervované medzi podobnými polypeptidmi. Je treba si uvedomiť, že zmeny v oblastiach peptidu, ktoré nie sú konzervované medzi takými podobnými peptidmi, budú s menšou pravdepodobnosťou nežiadúcim spôsobom ovplyvňovať biologickú aktivitu a/alebo štruktúru peptidu. Odborníkom v odbore bude tiež známe, že aj v relatívne konzervovaných regiónoch je možné substituovať chemicky podobné aminokyseliny za prirodzené zvyšky za zachovania aktivity (konzervatívnej aminokyselinovej substitúcie). Tak môžu byť aj oblasti, ktoré sú dôležité pre biologickú aktivitu alebo pre štruktúru predmetom konzervatívnych aminokyselinových substitúcii bez narušenia biologickej aktivity alebo bez nežiadúceho ovplyvnenia štruktúry peptidu.
Ďalej, odborník v odbore si môže pozrieť štúdie identifikujúce podobné peptidy, ktoré sú významné pre aktivitu alebo štruktúru. Pri takom porovnaní je možné určiť význam aminokyselinových zvyškov v peptide, ktoré zodpovedajú amínokyselinovým zvyškom, ktoré sú dôležité pre aktivitu alebo štruktúru v podobnom peptide. Odborník v odbore môže určiť aminokyselinové substitúcie pre takéto predpokladane významné aminokyselinové zvyšky peptidov.
Odborník v odbore môže tiež analyzovať trojrozmernú štruktúru a amínokyselinovú sekvenciu v súvislosti so štruktúrou v podobnom polypeptide. Z tejto informácie môže odborník v odbore predpokladať umiestnenie aminokyselinových zvyškov peptidu z hľadiska jeho trojrozmernej štruktúry. Odborník v odbore si môže priať nerobiť radikálne zmeny v aminokyselinových zvyškoch prítomných na povrchu proteínu, pretože takéto zvyšky sa môžu podieľať na významných interakciách medzi molekulami. Okrem toho môže odborník v odbore pripraviť testovacie varianty obsahujúce substitúciu jedného amínokyselinového zvyšku požadovaným amínokyselinovým zvyškom. Varianty môžu byť testované za použitia testov pre aktivitu známych odborníkom v odbore. Také dáta môžu byť použité na získanie informácií o vhodných variantoch. Napríklad, pokiaľ sa zistí, že zmena v jednom konkrétnom amínokyselinovom zvyšku vedie na narušenie, nežiadúce zníženie aktivity alebo na vznik nevhodnej aktivity, tak môžu byť varianty s takými zmenami eliminované. Inými slovami, podľa informácií získaných z takých bežných pokusov, môže odborník v odbore jednoducho určiť aminokyseliny, v ktorých majú byť ďalšie substitúcie eliminované, buď samostatne, alebo V kombinácii s inými mutáciami.
Veľa vedeckých publikácií je venovaných predikcii sekundárnej štruktúry. Pozri Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al. Biochemistry 13 (2): 222-245 (1974); Chou et al. Biochemistry 113(2): 211-222(1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148 (1978); Chou et al. Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 a Chou et al., Biophys. J. 26:367-384(1979). Okrem toho sú v súčasnosti dostupné počítačové programy, . ktoré pomáhajú v predikcii sekundárnej štruktúry. Jedna metóda predikcie sekundárnej štruktúry je založená na modelovaní homológie. Napríklad dva polypeptidy alebo proteíny, ktoré majú identitu sekvencie vyššu ako 30%, alebo podobnosť vyššiu ako 40%, majú často podobné štrukturálne topológie. Nárast databáze štruktúry proteínov (PDB) umožňuje lepšie predvídanie sekundárnej štruktúry, vrátane potenciálneho počtu záhybov v štruktúre polypeptidu alebo proteínu. Pozri Holm et al. , Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247(1999). Bolo naznačené (Brenner et al.,
Curr. Op. Struct. Biol., 7 (3): 369-376 (1997)), že v danom polypeptide alebo proteíne je obmedzený počet záhybov a že pokial' sa určí kritický počet štruktúr, tak nadobudne predikcia štruktúry dramaticky na presnosti.
Medzi ďalšie metódy predikcie sekundárnej štruktúry patrí threading (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol. 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure 4(1): 15-9(1996)), analýza profilu (Bowie et al., Science 253:164-170(1991); Gribskov et al. Meth. Enzým., 183: 146-159 (1990); Gribskov et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. 84(13): 4355-8(1987)), a evolučná väzba (pozri Home, vyššie a Breriner, vyššie).
Vehikulá. Predkladaný vynález vyžaduj e prítomnosť aspoň jedného vehikulá (F1) naviazaného na peptid prostredníctvom Ckonca alebo vedľajšieho reťazca jedného z aminokyselinových zvyškov. Môže byť použitých viacero vehikúl; napríklad, Fc na C-konci a' PEG skupina na vedľajšom reťazci.
Fc doména je výhodným vehikulom. Fc doména môže byť fúzovaná na C koniec peptidu.
Ako bolo uvedené vyššie Fc varianty sú vhodnými vehikulami podľa predkladaného vynálezu. Natívny Fc môže byť rôzne modifikovaný za zisku Fc variantu podľa predkladaného vynálezu, s podmienkou, že je zachovaná väzba na receptor; pozri napríklad WO 97/34631 a WO 96/32478. V takých Fc variantoch je možné odstrániť jedno alebo viacej miest prirodzeného Fc, ktoré spôsobujú štrukturálne charakteristiky alebo funkčnú aktivitu, ktoré nie sú vhodné pre fúzne molekuly podľa predkladaného vynálezu. Tieto miesta je možné odstrániť napríklad substitúciou alebo deletovaním zvyškov, inzerciou zvyškov do miesta, alebo skrátením o časť obsahujúcu miesto. Inzertované alebo substituované zvyšky môžu byť takto pozmenené aminokyseliny, ako sú peptidomimetiká alebo Damínokyseliny. Fc varianty môžu byť žiaduce z mnohých dôvodov, z ktorých niektoré sú opísané ďalej. Príklady Fc variantov sú molekuly a sekvencie, kde:
1. Sú odstránené miesta podieľajúce sa na disulfidovej väzbe. Takéto odstránenie môže zabrániť reakcii s inými proteínmi obsahujúcimi cysteín v hostiteľskej bunke použitej na produkciu molekúl podľa predkladaného vynálezu. Na tento účel môže byť segment obsahujúci cysteín na N-konci skrátený alebo môžu byť cysteínové zvyšky deletované alebo substituované inými aminokyselinami (napríklad alanylom, serylom). Konkrétne je možné skrátiť N-terminálny 20-amínokyselinový segment SEQ
ID NO: 2 alebo deletovať alebo substituovať cysteínové zvyšky v pozíciách 7 a 10 SEQ ID NO: 2. Napriek odstránenia cysteínových zvyškov môže jednoreťazcová Fc doména stále ešte tvoriť dimérnu Fc doménu, ktorá je udržiavaná pohromade nekovalentnou väzbou.
2. Natívny Fc je modifikovaný tak, aby bol viacej kompatibilný s vybranou hostiteľskou bunkou. Napríklad je možné odstrániť PA sekvenciu blízko N-konca typického natívneho Fc, ktorá môže byť rozpoznaná typickými tráviacimi enzýmami v E. coli, ako je prolín-imínopeptidáza. Tiež je možné pridať N-terminálny metionínový zvyšok, najmä vtedy, keď je molekula exprimovaná rekombinantné v bakteriálnej bunke, ako je E. coli. Fc doména SEQ ID NO: 2 je jedným takým Fc variantom.
3. Časť N-konca natívneho Fc je odstránená na zabránenie Nterminálnej heterogenite pri expresii vo vybranej hostiteľskej bunke. Na tento účel je možné deletovať ktorýkoľvek z prvých 20 aminokyselinových zvyškov na N-konci, najmä zvyškov v pozíciách 1,2,3,4 a 5.
4. Je odstránené' jedno alebo viacej glykosylačných miest. Zvyšky, ktoré sú obvykle glykosylované (napríklad, asparagín) môžu prispievať, k cytolytickej reakcii. Takéto zvyšky môžu byú deletované alebo substituované za neglykosylované zvyšky (napríklad, alanín).
5. miesta podieľajúce sa na interakcii s komplementom, ako je Clq väzbové miesto, sú odstránené. Napríklad je možné deletovaú alebo substituovaú EKK sekvenciu ľudského IgGl. Aktivácia komplementu môže byú nevýhodná pre molekuly podľa predkladaného vynálezu a pri použití takých Fc variantov na ňu nedochádza.
6. Sú odstránené miesta, ktoré ovplyvňujú väzbu na Fc receptory iné ako je receptor. Natívny Fc môže maú miesta na interakciu s niektorými leukocytmi, ktoré nie sú vhodné pre molekuly podľa predkladaného vynálezu a preto môžu byú odstránené.
7. Je odstránené ADCC miesto. ADCC miesta sú známe v odbore; pozri napríklad, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9(1992) pre ADCC miesta v IgGl. Tieto miesta tiež nie sú nutné pre fúzne molekuly podľa predkladaného vynálezu a preto môžu byú odstránené.
8. Keď je natívny Fc odvodený od non-ludskej protilátky, tak môže byú natívny Fc humanizovaný. Obvykle je na humanizáciu natívneho Fc nutné substituovaú vybrané zvyšky v non-ľudskom natívnom Fc zvyškami, ktoré sa normálne nachádzajú v ľudskom natívnom Fc. Techniky na humanizáciu protilátok sú dobre známe v odbore.
Výhodnými Fe variantami sú nasledujúce varianty. V SEQ ID NO: 2 (Obr. 4) môže byt leucín v pozícii 15 substituovaný glutamátom; glutamát v pozícii 99 alanínom; a lysiny v pozíciách 101 a 103 alaníny. Ďalej, jeden alebo viacej tyrosínových zvyškov môže byú nahradený fenyalanínovými zvyškami.
Alternatívnym vehikulom môže byú proteín, polypeptid, peptid, protilátka, protilátkový fragment, alebo malá molekula (napríklad, peptidomimetická zlúčenina) schopná väzby na receptor. Napríklad je možné použiú ako vehikulum polypeptid opísaný v US. Pat. č. 5,739,277, udelenom 14.4.1998, Presta et -aic—Peptidy môžu byú tiež vybrané žä použitia tägového’ zobrazenia alebo RNA-peptidového skríningu pre väzbu na FcRn receptor. Také zlúčeniny viažúce sa na receptor tiež spadajú do definície termínu vehikulum a do rozsahu predkladaného vynálezu. Také vehikulá by mali byú vybrané na zvýšenie polčasu (napríklad elimináciou sekvencii rozpoznávaných proteázami) a zníženie imunogenicity (napríklad uprednostnením neimunogénnych sekvencii, je opísané pri humanizácii protilátok) .
Ako bolo uvedené vyššie, polymérové vehikulá môžu byú tiež použité pre F1 a F2. V súčasnosti sú dostupné rôzne prostriedky na naviazanie chemických skupín použiteľných ako vehikulá, pozri napríklad, Patent Cooperation Treaty ('PCI) Medzinárodná prihláška č. WO 96/11953, nazvaná N-terminally Chemically Modificated Proteín Compositions and Metods, ktorá je tu uvedená ako odkaz. Táto PCT prihláška opisuje - okrem iného - selektívne naviazanie polymérov rozpustných vo vode na N-koniec proteínov.
Výhodným polymérovým vehikulom je polyetylénglykol (PEG). PEG skupina môže mať akúkoľvek bežnú molekulovú hmotnosť a môže byť lineárna alebo rozvetvená. Priemerná molekulová hmotnosť PEG bude výhodne od približne 2 kiloDaltónov (kD) do približne 100 kD, lepšie od približne 5 kD do približne 50 kD, najlepšie od približne 5 kD do približne 10 kD. PEG skupiny budú obvykle naviazané na zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu acyláciou alebo redukčnou alkyláciou prostredníctvom reaktívnej skupiny na PEG molekule (napríklad aldehyde, amíne, tióle alebo esteri) a reaktívnej skupiny na zlúčenine podľa predkladaného vynálezu (napríklad aldehyde, amíne alebo esteri).
Vhodná stratégia na PEGyláciu syntetických peptidov sa skladá z kombinovania, prostredníctvom tvorby konjugátovej väzby v roztoku, peptide a PEG skupiny, kde každá z týchto molekúl obsahuje špecifickú skupinu, ktoré sú vzájomne reaktívne. Peptidy môžu byť jednoducho pripravené bežnou syntézou na pevnej fáze. Peptidy sú preaktivované vhodnou funkčnou skupinou v špecifickom mieste. Prekurzory sú prečistené a úplne charakterizované pred ich reakciou s PEG skupinou. Ligácia peptidu s PEG obvykle prebieha vo vodnej fáze a môže byť jednoducho monitorovaná analytickou HPLC s reverznou fázou. PEGylované peptidy môžu byť jednoducho prečistené preparatívnou HPLC a charakterizované analytickou HPLC, amínokyselinovou analýzou a hmotnostnou spektrometriou s desorpciou laserom.
Polysacharidové polyméry sú iným typom polymérov rozpustných vo vode, ktoré môžu byť použité na modifikáciu proteínov. Dextrány sú polysacharidové polyméry zložené z jednotlivých podjednotiek glukózy viazaných predovšetkým al-6 väzbami. Déxtrán samotný je dostupný v mnohých molekulových hmotnostiach a jednoducho je dostupný v molekulovej hmotnosti od' približne- 1 kD do približne 70 kD. Dextrán je vhodným polymérom rozpustným vo vode na použitie v predkladanom vynáleze ako vehikulum, buď sám o sebe, alebo v kombinácii s iným vehikulom (napríklad, Fc). Pozri napríklad, WO 96/11953 a WO 96/05309. Použitie dextránu konjugovaného na terapeutické alebo diagnostické imunoglobulíny bolo už opísané; pozri napríklad, Európska patentová prihláška č. 0 315 456, ktorá je tu uvedená ako odkaz. Dextrán hmotnosti približne 1 kD až približne 2 0 kD je výhodný, keď je dextrán použitý ako vehikulum v predkladanom vynáleze.
—Spájacia-sekvencia. * Akákoľvek spájacia sekvencia je“ voliteľná. Keď je prítomná, tak nie je jej chemická štruktúra zásadná, pretože slúži primárne ako oddeľovacia skupina. Spájacia sekvencia je výhodne tvorená aminokyselinami viazanými peptidovými väzbami. Vo výhodných uskutočneniach je spájacia sekvencia tvorená 1 až 20 aminokyselinami viazanými peptidovou väzbou, kde aminokyseliny sú vybrané z 20 prirodzených aminokyselín. Niektoré z týchto aminokyselín môžu byť. glykosylované, ako je dobre známe v odbore. Vo výhodnejšom uskutočnení je 1 až 20 aminokyselín vybraných zo skupiny zahŕňajúcej glycín, alanín, prolín, asparagín, glutamín a lysín. Ešte lepšie je spájacia sekvencia tvorená z väčšiny z aminokyselín, ktoré sú stericky neobmedzené, ako je glycín a alanín. Výhodné spájacie sekvencie sú polyglycíny (najmä (Gly)4, (Gly)5), poly(Gly-Ala) , a polyalaníny.
Iné špecifické príklady spájacích sekvencií sú:
(Gly) 3Ľys (Gly) 4 (SEQ D NO : 6);
(Gly) 3AsnGlySer (Gly) 2 (SEQ ID NO: 7) ;
(Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: .8); a
GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 9).
Na vysvetlenie vyššie uvedenej nomenklatúry je treba uviesú, že napríklad (Gly) 3Lys(Gly)4 znamená Gly-Gly-Gly-LysGly-Gly-Gly-Gly. Kombinácie Gly a Ala sú tiež výhodné. Spájacie sekvencie tu uvedené sú príklady spájacích sekvencii; spájacie sekvencie podľa predkladaného vynálezu môžu byú oveľa dlhšie a môžu obsahovaú iné zvyšky.
Nepeptidové spájacie sekvencie sú tiež možné. Napríklad, alkylové spájacie sekvencie, ako je -NH-(CH2) B-C (0) -, kde s =
2-20, môžu byú použité. Tieto alkylové spájacie sekvencie môžu byú ďalej substituované akoukoľvek sterický ne obrne d z e nou skupinou, ako je nižší alkyl (napríklad, Ci-C6) , nižší acyl, halogén (napríklad, Cl, Br), CN, NH2, fenyl, atď. Príkladom nepeptidovej spájacej sekvencie je PEG spájacej sekvencie vzorca VI
kde n je také, že spájacia sekvencia má molekulovú hmotnosú 100 až 5000 kD, výhodne 100 až 500 kD. Peptidové spájacie sekvencie môžu byú zmenené za zisku derivátov, ako je opísané vyššie.
Deriváty. Vynález tiež zahŕňa derivatizovanie peptidovej a/alebo vehikulovej časti zlúčeniny. Takéto deriváty môžu zlepšovaú rozpustnosú, absorpciu, biologický polčas a podobné vlastnosti zlúčeniny. Skupiny môžu alternatívne zoslabovaú alebo eliminovať akékoľvek nežiadúce účinky zlúčeniny a podobne. Príklady derivátov zahŕňajú zlúčeniny, kde:
1. Zlúčenina alebo nejaká jej časť je cyklická. Napríklad, peptidová časť môže byť modifikovaná tak, aby obsahovala dva alebo viacej Cys zvyškov (napríklad v spájacej sekvencii), ktoré môžu cyklizovať prostredníctvom tvorby disulfidovej väzby.
2. Zlúčenina je zosietená alebo urobená schopnou zosietenia medzi molekulami. Napríklad môže byť peptidová časť modifikovaná tak, aby obsahovala jeden Cys zvyšok a tak mohla tvoriť intermolekuiovú disulfľdovťr^väzbu s podobnou molekulou.
Zlúčenina môže tiež byť zosietená prostredníctvom svojho Ckonca, ako je to v molekule vzorca V.
F1-(X1)„-CO-N___-NH
O
3. Jedna alebo viacej peptidylovych [-C(O)NR-] väzieb je nahradená nepeptidylovou väzbou. Príklady nepeptidylových väzieb sú
-CH2-karbamát [-CH2-0C (O)NR-] , fosfonát, -CH2-sulfonamid [-CH2S(O)2NR-], močovina [-NHC (O) NH-] , -CH2-sekundárny amín, alkylovaný peptid [-C(O)NR'-, kde R6 je nižší alkyl].
4. N-koniec je derivátizovaný. Obvykle môže byť N-koniec acylovaný alebo modifikovaný na substituovaný amín. Príklady skupín N-terminálnych derivátov sú . -NRR1 (iný ako -NH2) , -NRCÍOJR1, -NRCÍOjOR1, -NRSÍO)^1, -NHC(O)NHR1, sukcinimid alebo benzyloxykarbonyl-NH- (CBZ-NH-) , kde R a R1 sú každý nezávisle vodík alebo nižší' alkyl a kde fenylový kruh substituovaný 1 až 3 substituentami vybranými zo skupiny zahŕňajúcej Ci-C4 alkyl, Ci-C4 alkoxy, chlór a bróm.
5. Voľný C-koniec je derivátizovaný. Obvykle je C-koniec esterifikovaný alebo amidovaný. Príklady skupín pre Cterminálne deriváty zahŕňajú, napríklad, -C(O)R2, kde R2 je nižší alkoxy alebo -NR3R4, kde R3 a R4 sú nezávisle vodík alebo Ci-C3alkyl (výhodne Ci-C4alkyl) .
6. Disulfidová väzba je nahradená inou, výhodne stabilnejšou, zosieťovacou skupinou—(napríklad alkylénom) .—Pozri napríkTady Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39:3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp. 357-9.
7. Jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov je modifikovaný. Sú známe rôzne derivatizačné činidlá, ktoré špecificky reagujú s vybranými vedľajšími reťazcami alebo koncovými zvyškami, ako je podrobnejšie opísané ďalej.
Lysinylové zvyšky a amino terminálne zvyšky môžu reagovať s anhydridmi kyseliny jantárovej alebo inej karboxylovej kyseliny, čo zmení náboj lysinylových zvyškov. Medzi ďalšie činidlá vhodné na derivatizáciu zvyškov obsahujúcich a-amíno skupinu patria imidoestery, ako je metylpicolinimidát; pyridoxal- fosfát; pyridoxal; chlórbórohydrid; kyselina trinitrobenzénsulfonová; O-metylizomočovina; 2,4-pentandión; a transaminázou-katalyzovaná reakcia s glyoxylátom.
Arginylové zvyšky môžu byť modifikované reakciou s jedným alebo kombináciou nasledujúcich bežných činidiel, vrátane fenylglyoxalu, 2,3-butandiónu, 1,2-cyklohexandiónu a ninhydrínu. Derivatizácia arginylových zvyškov vyžaduje to, aby bola reakcia uskutočnená za alkalických podmienok z dôvodu vyššej hodnoty pKa guanidínovej funkčnej skupiny. Ďalej, tieto činidlá môžu reagovaú so skupinami lysinu, rovnako ako s arginínovou epsilon-amíno skupinou.
Špecifické modifikácie tyrosylových zvyškov boli dôkladne skúmané, najmä z hľadiska možnosti vkladania spektrálnych markerov do tyrosylových zvyškov reakciou s aromatickými diazoniovými zlúčeninami alebo tetranitrometanom. Najčastejšie sa N-acetylimidazol a tetranitrometan použijú na prípravu 0acetyl-tyrosylových zvyškov a 3-nitro derivátov, v príslušnom poradí.
Karboxylové skupiny vedľajších reúazcov (aspartylu alebo glutamylu) môžu byú selektívne modifikované reakciou s karbodiimidmi (R'-N=C=N-R') , ako je l-cyklohexyl-3-(2morfolinyl-(4-etyl)karbodiimid alebo l-etyl-3-(4-azonia-4,4dimetylpentyl)karbodiimid. Ďalej, aspartylové a glutamylové zvyšky môžu byú premenené na asparaginylové a glutaminylové zvyšky reakciou s ammóniovými iónmi.
Glutaminylové a asparaginylové zvyšky môžu byú deamidované na príslušné glutamylové a aspartylové zvyšky. Alternatívne môžu byú tieto zvyšky deamidované za slabých acidických podmienok. Všetky formy týchto zvyškov spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu.
Cysteínylové zvyšky môžu byú nahradené amínokyselinovými zvyškami alebo inými skupinami, buď na elimináciu disulfidovej väzby alebo, naopak, na stabilizáciu zosietenia. Pozri napríklad, Bhatnagar etal. (1996), J. Med. Chem. 39:3814-9.
Derivatizácie pomocou bifunkčných činidiel sú výhodné na zosietenie peptidov alebo ich funkčných derivátov na matrici nerozpustnej vo vode alebo na iných makromolekulových vehikulách. Medzi bežne používané zosieťovacie činidlá patria napríklad 1,1-bis(diazoacetyl)-2-fenyletan, glutaraldehyd, estery N-hydroxysukcínimidu, napríklad, estery s kyselinou 4azidosalicylovou, homobifunkčné imidoestery, vrátane disukcínimidylových esterov, ako je 3,3'-ditiobis(sukcínimidylpropionát), a bifunkčné maleimidy, ako je bis-N-n-maleimido-1,8-oktan. Derivatizačné činidlá, ako je metyl-3[(p-azidofenyl)ditiolpropioimidát, vedú na zisk fotoaktivovateľných medziproduktov, ktoré môžu tvoriť imobilizáciu proteínu použijú reaktívne matrice nerozpustné vo vode, ako sú kyanogénbromidom-aktivované karbohydráty a reaktívne substráty opísané v U.S. Pat. č. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; a 4,330,440.
Karbohydrátové (oligosacharidové) skupiny môžu byť naviazané na miesta, ktoré sú známe ako glykosylačné miesta proteínov. Všeobecne, 0-viazané oligosacharidy sú naviazané na serín (Ser) alebo treonín (Thr), zatiaľ čo N-viazané oligosacharidy sú viazané na asparagín (Asn), keď sú súčasťou sekvencie Asn-X-Ser/Thx, kde X môže byť akákoľvek aminokyselina s výnimkou prolínu. X je výhodne jedna z 19 prirodzených aminokyselín s výnimkou prolínu. Štruktúry Nviazaných a 0-viazaných oligosacharidov a zvyškov prítomných v každom type sú odlišné, sacharidu, ktorý sa vyskytuje v obidvoch typoch, je kyselina
N-acetylneuramínová (označovaná ako kyselina sialová).
Kyselina sialová je obvykle terminálnym zvyškom ako Nviazaných, tak 0-viazaných oligosacharidov, a v dôsledku svojho negatívneho náboja, môže prispievať k acidickým sacharidových Jedným typom vlastnostiam glykosylovanej zlúčeniny. Také miesta môžu byť inkorporované do spájacej sekvencie zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu a sú výhodne glykosylované bunkou počas rekombinantnej produkcie polypeptidovej zlúčeniny (napríklad, v cicavčích bunkách, ako sú CHO, BHK, COS) . Ale také miesta môžu byť tiež glykosylované syntetickými alebo semisyntetickými postupmi známymi v odbore.
Medzi ďalšie možné modifikácie patrí hydroxylácia prolinu a lysinu, fosforylácia hydroxylovej skupiny serylu alebo treonylu, oxidácia síry v Cys, metylácia α-amíno skupiny vedľajšieho reťazca lysinu, arginínu a histidínu. Creighton, “Pr ot e íňš T S truc tur e and MoleculeT Properties —(Wí Hľ—Freemaň ’ & Co., San Francisco), str.79-86 (1983).
Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť modifikované tiež na úrovni DNA. DNA sekvencie pre akúkoľvek časť zlúčeniny môžu byť zmenené na kodóny, ktoré sú viacej kompatibilné s vybranou hostiteľskou bunkou. Pre E. coli, ktorá je výhodnou hostiteľskou bunkou, sú optimalizované kodóny známe v odbore. Kodóny môžu byť substituované na elimináciu reštrikčných miest alebo na vloženie silentných reštrikčných miest, ktoré môžu pomáhať pri spracovaní DNA vo vybranej hostiteľskej bunke. Vehikulum, spájacia sekvencia a peptidová DNA sekvencia môžu byť modifikované tak, aby obsahovali akúkoľvek z uvedených zmien.
Spôsoby prípravy
Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené v transformovaných hostiteľských bunkách za použitia techník rekombinantnej DNA. Pri tomto spôsobe sa pripraví rekombinantné DNA molekula kódujúca peptid. Spôsoby prípravy takých DNA molekúl sú dobre známe v odbore. Napríklad, sekvencie kódujúce peptidy môžu byú excidované z DNA za použitia vhodných reštrikčných enzýmov. Alternatívne môže byú DNA molekula syntetizovaná za použitia techník chemickej syntézy, ako je fosforamidátová metóda. Tiež môže byú použitá kombinácia týchto techník.
Vynález tiež poskytuje vektor schopný sprostredkovaú expresiu peptidov vo vhodnom hostiteľovi. Vektor obsahuje DNA molekulu, ktorá kóduje peptid operatívne naviazaný na vhodné expresné kontrolne sekvencie. Spôsoby uskutočňovania takejto operatívnej väzby, buď pred, alebo potom, čo je DNA molekula iTrzertovaná—do vektora, sú dobre známe. Medzi expresné kontrolne sekvencie patria promotery, aktivátory, zosilňovače transkripcie, operátory, väzbové miesta pre ribosómy, štart signály, stop signály, signály pre čiapočky, polyadenylačné signály a iné signály podieľajúce sa na vedení transkripcie alebo translácie.
Získaný vektor obsahujúci DNA molekulu sa použije na transformáciu vhodného hostiteľa. Táto transformácia môže byú uskutočnená za použitia spôsobov dobre známych v odbore.
Akákoľvek z mnohých dostupných a známych hostiteľských buniek môže byú použitá pri uskutočňovaní predkladaného vynálezu. Výber konkrétneho hostiteľa závisí na mnohých tieto faktory patrí expresným vektorom, molekulou, rýchlosú faktoroch známych v odbore. Medzi napríklad kompatibilita s vybraným toxicita peptidov kódovaných DNA transformácie, jednoduchosť získania peptidov, charakteristiky expresie, biologická bezpečnosť a cena. Rovnováha medzi týmito faktormi musí byú sprevádzaná pochopením toho, že nie všetci hostitelia sú rovnako účinní na expresiu konkrétnej DNA sekvencie. Podľa tohto všeobecného návodu patria k vhodným mikrobiálnym hostiteľom baktérie (ako je E. coli sp.), kvasnice (ako je Saccharomyces sp.) a iné huby, hmyzie, rastlinné a cicavčie (vrátane ľudských) bunky v kultúre, alebo ďalší hostitelia známi v odbore.
Potom sa transformovaný hostiteľský organizmus kultivuje a prečistí. Hostiteľské bunky môžu byť kultivované za vhodných podmienok fermentácie tak, aby bola exprimovaná požadovaná zlúčenina. Takéto fermentačné podmienky sú dobre známe v odbore. Nakoniec sa peptidy prečistia z kultúry za použitia spôsobov dobre známych v odbore.
Zlúčeniny môžu tiež byť pripravené syntetickými spôsobmi. Napríklad môže byť použitá technika syntézy na pevnej fáze. Vhodné techniky sú dobre známe v odbore a patria medzi ne techniky opísané v Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, str. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis ed.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis et al. (1985), Biochem. Int J. 10: 394-414; Stewart a Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis: U.S. Pat. č. 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3. vyd.) 2: 105-253; a Erickson et al. (1976), The Proteins (3. vyd.) 2: 257-527. Syntéza na pevnej fáze je výhodnou technikou na prípravu jednotlivých peptidov, pretože je nej lacnej šou technikou na prípravu malých peptidov.
Zlúčeniny, ktoré obsahujú derivátizované peptidy alebo ktoré obsahujú nepeptidové skupiny, môžu byť syntetizované dobre známymi technikami organickej chémie.
Použitie zlúčenín
Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu majú farmakologickú aktivitu v dôsledku ich interakcie s PTH-1 receptorom alebo PTH-2 receptorom. Mannstadt et al. (1999), Am. J. Physiol.
277. 5Pt2. F665-75. PTH a jeho agonisti zvyšujú resorpciu kosti, zvyšujú renálnu reabsorpciu vápnika, znižujú proliferáciu epidermu a znižujú rast vlasov. Holick et al. (1994) Proc. Natl. Sci. USA 91(17): 8014-6; Schilli et al. (1997), J. Invest. Dermatol. 108(6): 928-32. Tak sa antagonisti PTH-1 receptora a/alebo PTH-2 receptora môžu použiť v liečbe
• hyperkalcémie, vrátane hyperkalcémie v dôsledku solidných nádorov (prsníka, pľúc a obličiek) a hematologických malignít (mnohotvárneho myelómu, lymfomu a leukémie); idiopatickej hyperkalcémie a hyperkalcémie asociovanej s hypertyroidizrnom a poruchami obličiek;
• nádorových metastáz, najmä metastáz do kostí, a najmä metastáz pri karcinóme prsníka a prostaty;
• kachexie a anorexie, najmä asociovanej s nádormi;
• osteopénie, ktorá súvisí s aberantnou signalizáciou na PTH receptore, vrátane rôznych foriem osteoporózy, ako je:
- primárna osteoporóza;
- post-menopauzálna a starecká osteoporóza;
- endokrinná osteoporóza (hypertyroidizmus, hyperparatyroidizmus, Cushingov syndróm a akromegalie);
- hereditárne a kongenitálne formy osteoporózy (napríklad, osteogenezis imperfecta, homocysteinúrie, Menkesov syndróm a Riley-Den syndróm);
- osteoporóza v dôsledku imobilizácie končatín;
- osteoporóza sekundárna pri iných ochoreniach, ako je hemochromatóza, hyperprolaktinémia, anorexia nervóza, tyreotoxikóza, diabetes mellitus, celiakie, zápalové ochorenia čreva, primárna biliárna cirhóza, reumatoidná artritída, ankylosujúca spondylitíza, mnohotvárny myelom, lymfoproliferatívne ochorenia a systémová mastocytóza;
- osteoporóza sekundárna pri chirurgickom výkone (napríklad, gastrektómii) alebo liekovej terapii, ako je chemoterapia, antikonvulzívna terapia, imunosupresívna terapia a antikoagulačná terapia;
- osteoporóza sekundárna pri liečbe glukokortikosteroidmi pri ochoreniach ako je reumatoidná artritída (RA), systémový lupus erytematodes (SLE), astma, arteritis temporalis, vasculitis, chronická obštrukčná choroba bronchopulmonálna, polymyalgia reuma t i ca-;---poiymyos±t±s-;-chronická----intexsti-ciľáina pľúcna fibróza;
osteoporóza sekundárna pri liečbe glukokortikosteroidmi a/alebo imunomodulačnými liekmi pri prevencii orgánovej rejekcie po transplantácii orgánov, ako sú obličky, pečeň, pľúce, srdce;
osteoporóza spôsobená nedostatkom gravitácie, ako je osteoporóza kozmonautov;
- osteoporóza asociovaná s malígnym ochorením, ako je karcinóm prsníka, karcinóm prostaty;
• Pagetova choroba kostí (osteitis deformans) dospelých a mladistvých;
• osteomyelitis alebo infekčné lézie v kosti, ktorá vedie na stratu kostnej hmoty;
• osteopenia po chirugickom výkone, indukovaná steroidmi a asociovaná s ochoreniami tenkého a hrubého čreva a s chronickými chorobami pečienky a obličiek.
• Osteonekrózy alebo nekrózy kostných buniek asociované s traumatickým poranením alebo netraumatická nekróza asociovaná s Gaucherovou chorobou, kosáčikovitou anémiou, systémovým lupus erytematodes, reumatoidnou artritídou, ochorením periodontu, osteolytickými metastázami a inými stavmi;
• alopecia (deficitu rastu vlasov alebo úplné alebo čiastočné strate vlasov), vrátane androgénnej alopecie (mužskej plešivosti), toxickej alopecie, alopecia senilis, alopecia areata, alopecia pelada a trichotillománia;
a podobne.
Existujú ďalšie ochorenia, keď bude pre pacienta prínosom aktivita PTH alebo PTHrP. Pre tieto indikácie sú agonisti PTH receptora použiteľní ako terapeutická liečba. Konkrétne medzi takéto indikácie patrí hojenie zlomenín (vrátane hojenia “nerepcncvaných z lomeníng OStľeopéuiey- Λττύηηπθ rôznych “foriem osteoporózy, ako je:
- primárna osteoporóza;
- post-menopauzálna a starecká osteoporóza;
- endokrinná osteoporóza (hypertyroidizmus, hyperparatyroidizmus, Cushingov syndróm a akromegalia);
- hereditárne a kongenitálne formy osteoporózy (napríklad, osteogenezis imperfecta, homocysteinúrie, Menkesov syndróm a Riley-Den syndróm);
- osteoporóza v dôsledku imobilizácie končatín;
- osteoporóza sekundárna pri iných ochoreniach, ako je hemochromatóza, hyperprolaktinémia, anorexia nervóza, tyreotoxikóza, diabetes mellitus, celiakie, zápalové ochorenia čreva, primárna biliárna cirhóza, reumatoidná artritída, ankylosujúca spondylitíza, mnohotvárny myelom, lymfoproliferatívne ochorenia a systémová mastocytóza;
- osteoporóza sekundárna pri chirurgickom výkone (napríklad, gastrektómii) alebo liekovej terapii, ako je chemoterapia, antikonvulzívna terapia, imunosupresívna terapia a antikoagulačná terapia;
- osteoporóza sekundárna pri liečbe glukokortikosteroidmi pri ochoreniach ako je reumatoidná artritída (RA), systémový lupus erytematodes (SLE), astma, arteritis temporalis, vasculitis, chronická obštrukčná choroba bronchopulmonálna, polymyalgia reumatica, polymyositis, chronická intersticiálná pľúcna fibróza;
osteoporóza sekundárna pri liečbe glukokortikosteroidmi a/alebo imunomodulačnými liekmi pri prevencii orgánovej rejekcie po transplantácii orgánov, ako sú obličky, pečeň, pl'úce, srdce;
osteoporóza spôsobená nedostatkom gravitácie, ako je osteoporóza kozmonautov;
-- osteoporótar asociovaná—s-mattgnýTmjchorením;ako j e Kareínóm’ prsníka, karcinóm prostaty.
PTH agonisti s predĺženým polčasom (napríklad viazaní na Fc domény) môžu byú použití s inhibítorom resorpcie kosti. Medzi inhibítory resorpcie kosti patria OPG a OPG deriváty, OPG-L (RANKL) protilátka, calcitonín (napríklad, Miacalcin®, Calcimar®), bisfosfonáty (napríklad, APD, etidronát, pamidronát, tiludronát, ibandronát, zoledronát), estrogény alendronát, clodronát, (napríklad, risedronát, neridronát,
Premarin®, Estraderm®, Prempro®, Alora®, Climara®, Vivelle®,
Estratab®, receptora
Ogen®), (napríklad, selektívne modulátory estrogénneho raloxifén, droloxifén, lasofoxifén), tibolón, a podobne. Príkladné inhibítory resorpcie kosti sú opísané vo WO 98/46751 a WO 97/23614, ktoré sú tu uvedené ako odkazy.
Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byú použité v monoterapii na liečbu osteoporózy a je tiež možné použiú na liečbu PTH-Fc ďalšie antiresorpčné činidlá, ktoré zvýšia ako ich účinnosú, tak veľkosú terapeutického okna. Ako PTH, tak
PTH-Fc zvyšujú ako tvorbu kostí, tak resorpciu kostí. Schopnosť antiresorpčných činidiel blokovať osteoklastickú odpoveď môže limitovať hyperkalcemické účinky PTH-Fc a môže tiež zvyšovať kostnú hmotu.
Farmaceutické prostriedky
Všeobecne. Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby použitia farmaceutických prostriedkov obsahujúcich zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu. Takéto farmaceutické prostriedky môžu byť podávané injekčnou alebo orálnou, pľúcnou, nasálnou, transdermálnou alebo inou cestou. Všeobecne vynález zahŕňa >žstvO “zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu spoločne s farmaceutický prijateľnými riedidlami, konzervačnými činidlami, solubilizačnými činidlami, emulgačnými činidlami, adjuvans a/alebo nosičmi. Takéto prostriedky obsahujú riedidlá s rôznym obsahom pufrov (napríklad, Tris-HCl, acetát, fosfát), pH a iónovú silu; aditíva, ako sú detergenty a solubilizačné činidlá (napríklad, Tween 80, Polysorbate 80) , anti-oxidačné činidlá (napríklad, kyselinu askorbovú, metabisiričitan sodný), konzervačné činidlá (napríklad, Thimersol, benzylalkohol) a substancie zvyšujúce objem laktózu, manitol); inkorporácie materiálu do prostriedku polymérnej zlúčeniny, ako je kyselina polymliečna, polyglykolová atď. , alebo do lipozómov. Tiež sa môže použiť kyselina hyaluronová a táto môže podporovať dlhšie zotrvanie prostriedku v cirkulácii. Takéto prostriedky môžu ovplyvňovať fyzikálny stav proteinov a derivátov podľa predkladaného vynálezu, ich stabilitu, rýchlosť uvoľňovania in vivo a rýchlosť eliminácie in vivo. Pozri napríklad, Remington's Pharmaceutical Sciences 18. vyd. (1990, Mack Publishing Co. , Easton, PA 18042), str. 1435-1712, ktoré sú tu uvedené ako (napríklad, konkrétneho odkaz. Prostriedky môžu byú pripravené v kvapalnej forme alebo vo forme sušeného prášku, ako je lyofilizovaná forma. Vynález tiež zahŕňa implantovateľné prostriedky s predĺženým uvoľňovaním, ako sú transdermálne prostriedky.
Podávanie zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu dvakrát týždne je lepšie ako denné injekcie PTH (1-34) z hľadiska zvýšenia počtu osteoblastov, objemu kosti a minerálnej hustoty kosti hlodavcov. Podávanie PTH-(1-34)-Fc dvakrát týždne spôsobuje vyššie zvýšenie hustoty kosti a objemu kosti v porovnaní s denným podávaním PTH-(1-34) (pozri Obr. 10.) V modele osteoporózy na starnúcich OVX krysách bolo podávanie -dvakrát—týždne- 'schopné”σ_víač äko~5zvrátiť stratu kosti’ indukovanú jedným rokom estrogénovej ablácie. Efekt pozorovaný na modele starnúcich krýs bol ešte vyšší, keď bola liečba kombinovaná s bisfosfonátom (APD)). Pre krysy spôsobila jediná SC injekcia PTH-(1-34)-Fc (340 nmol/kg) hyperkalcemickú odpoveď, ktorá pretrvávala 72 hodín (Obr. 8) . Táto doba zodpovedá rýchlosti eliminácie PTH-(1-34)-Fc zo séra a je v súlade s optimálnym režimom podania pre myši (dvakrát týždne).
Optimálne dávkovanie pre primáty bude ešte menej časté oproti podávaniu krysám alebo myšiam. Podanie raz za týždeň (alebo menej) môže byú optimálne pre primáty, podľa zistenia, že hyperkalcemická odpoveď OVX makakov na jedinú podkožnú injekciu PTH-(1-34)-Fc (10-34 nmol/kg) pretrváva počas približne 168 hodín (Obr. 11) . Toto zistenie naznačuje, že jediná podkožná dávka PTH-(1-34)-Fc pre primátov je eliminovaná za približne 1 týždeň, čo tiež predstavuje maximálnu frekvenciu aplikácií nutnú pre anabolické efekty.
Orálne dávkové formy. Vynález zahŕňa orálne pevné dávkové formy, ktoré sú opísané všeobecne v kapitole 89 Remington's
Pharmaceutical Sciences (1990), 18th Ed. , Mack Publishing Co. Easton PA 18042, ktorá je tu uvedená ako odkaz. Medzi pevné dávkové formy patria tablety, kapsule, pilulky, pastilky, vrecúška s práškom a pelety. Pre prostriedky podľa predkladaného vynálezu môže byť tiež použité obalenie v lipozómoch alebo proteínoidnom obale (ako je to napríklad v proteínoidných mikrosférach opísaných v U.S. Patente č. 4,925,673). Môže byť použitá lipozomálna enkapsulácia a lipozómy môžu byť derivátizované za použitia rôznych polymérov (napríklad, U.S. Patent č. 5,013,556). Opis možných pevných dávkových foriem pre terapeutiká je uvedený v kapitole 10 v Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), ed. G. S. Banker a -Ct—Ττ—Rhodes^—ktorá—je—tcr—uvedená—ako—odkazt Všeobecne* prostriedky obsahujú zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu a inertné prísady, ktoré umožňujú ochranu pred žalúdočným prostredím a uvoľňovanie biologicky aktívneho materiálu v čreve.
Vynález tiež špecificky poskytuje orálne dávkové formy pre zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu. Pokiaľ je to nutné, môžu byť zlúčeniny chemicky modifikované tak, aby bolo orálne podanie účinné. Všeobecne je chemickou modifikáciou naviazanie aspoň jednej skupiny na zlúčeninu, kde uvedená skupina umožňuje (a) inhibíciu proteolýzy; a (b) prechod zlúčeniny do cirkulácie zo žalúdka alebo čreva. Tiež je žiadúce zvýšenie celkovej stability zlúčeniny a zvýšenie jej cirkulačného polčasu. Skupiny použité ako kovalentne naviazané vehikulá v predkladanom vynáleze môžu byť tiež použité na tento účel. Príklady takých skupín sú: PEG, kopolyméry etylénglykolu a propylénglykolu, karboxymetylcelulóza, dextrán, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidón a polyprolín. Pozri napríklad, Abuchowski and Davis, Soluble Polymér-Enzýme
Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg a Roberts, eds. ,
Wiley-Interscience, New York, NY, str. 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4:185-9. Ďalšími polymérmi, ktoré môžu byú použité, sú poly-1,3-dioxolán a poly-1,3,6-tioxocán. Výhodné na farmaceutické použitie sú, ako bolo uvedené vyššie, PEG skupiny.
Pre orálne dávkové formy je tiež možno použiú soli modifikované alifatické aminokyseliny, ako je natrium-N-(8-[2hydroxybenzoyl]amino)kaprylát (SNAC), ako nosiče na zosilnenie absorpcie terapeutickej zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu. Klinická účinnosú heparínového prostriedku za použitia SNAC bola preukázaná v štúdii fázy II uskutočnenej
-JJS Patent- “č“.’
5,792,451, Oral drug delivery composition and metods.
Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byú obsiahnuté v prostriedku vo forme jemných častíc, ako sú granule alebo pelety veľkosti približne 1 mm. Prípravok na podanie vo forme kapsulí môže byú tiež vo forme prášku, mierne zlisovaných vrstiev alebo tabliet. Liečivá môžu byú pripravené lisovaním.
Prostriedok môže óbsahovaú farbivá a chuúové korigens. Napríklad proteín (alebo derivát) môže byú najprv pripravený (napríklad vo forme lipozómu alebo mikrosféry) a potom môže byú zapracovaný do požívateľného produktu, ako je chladený nápoj obsahujúci farbivá a chuúové korigens.
Je možné nariediú alebo zvýšiú objem zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu za použitia inertného materiálu. Medzi také riedidlá patria karbohydráty, najmä mannitol, Cl-laktóza, bezvodá laktóza, celulóza, sacharóza, modifikovaný dextrán a škrob. Niektoré anorganické soli môžu byú tiež použité ako plnivá, vrátane fosforečnanu vápenatého, uhličitanu horečnatého a chloridu sodného. Medzi komerčne dostupné riedidlá patria Fast-Ho, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress a Avicell.
Pevné dávkové formy môžu obsahovať činidlá podporujúce rozpadavosť. Medzi materiály, ktoré môžu byť použité ako činidlá podporujúce rozpadavosť, patria napríklad škroby, vrátane komerčných činidiel podporujúcich rozpadavosť na báze škrobov, ako je Explotab. Glykolát škrob sodný, Amberlite, karboxymetylcelulóza sodná, ultramylopektín, natrium-alginát, želatína, pomarančová kôra, kyslá karboxymetylcelulóza, hubky a bentonint, sú ďalšími vhodnými činidlami. Inou formou činidiel—podporujúcich—rozpadavosť’ ~súr- nerozpustné katiónové' iónomeničové živice. Práškové želatíny môžu byť použité ako činidlá podporujúce rozpadavosť a medzi také činidlá patria práškové želatíny ako je agar, Karaya alebo tragant. Kyselina alginová a jej sodná soľ sú tiež použiteľné ako činidlá podporujúce rozpadavosť.
Spojivá môžu byť použité na udržanie terapeutického činidla pohromade za zisku tuhej tablety a patria medzi ne materiály z prírodných produktov, ako je arabská guma, tragant, škrob a želatína. Medzi ďalšie materiály patrí metylcelulóza (MC) , etylcelulóza (EC) a karboxymetylcelulóza (CMC).
Polyvinylpyrrolidón (PVP) a hydroxypropylmetylcelulóza (HPMC) môžu byť použité v alkoholových roztokoch na granulovanie terapeutického činidla.
Činidlá znižujúce trenie môžu byť obsiahnuté v prostriedkoch na prevenciu zlepovania počas prípravy. Klzné činidlá môžu byť použité ako vrstva medzi terapeutickým činidlom a stenou kadičky a medzi také činidlá patrí napríklad kyselina stearová, vrátane jej horečnatej a vápenatej soli, polytetrafluóretylén (PTFE), kvapalný parafín, rastlinné oleje a vosky. Môže byť tiež použité solubilné klzné činidlo, ako je lauryl síran sodný, lauryl síran horečnatý, polyetylénglykol s rôznou molekulovou hmotnosťou, Carbowax 4000 a 6000.
Tiež môžu byť použité mazivá, ktoré môžu zlepšiť tekutosť prostriedku počas prípravy a pomôcť preskupeniu počas lisovania. Medzi takéto zlúčeniny patrí škrob, mastenec, pyrogénny oxid kremičitý a hydrátovaný silikoaluminát.
Na zjednodušenie rozpúšťania zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu vo vodnom prostredí môže byť pridaný surfaktant ako -zmáčavé čin±dľo“._'Surfakt'antynrriôzvr-byť aniónové detergenty;'äko~ je lauryl síran sodný, dioktyl-natrium-sulfosukcinát a dioktyl-natrium-sulfonát. Môžu byť použité tiež katiónové detergenty, ako je benzalkóniumchlorid alebo benzetóniumchlorid. Medzi potenciálne neiónové detergenty, ktoré môžu byť použité v prostriedku ako surfaktanty, patrí lauromacrogol 400, polyoxyl 40 stearáte, polyoxyetylén hydrogenovaný ricínový olej 10, 50 a 60, glycerol-monostearát, polysorbát 40, 60, 65 a 80, ester sacharózy a mastnej kyseliny, metylcelulóza a karboxymetylcelulóza. Tieto surfaktanty môžu byť prítomné v prípravku proteínu alebo jeho derivátu buď samostatne, alebo v zmesi v rôznych pomeroch.
Prostriedok môže tiež obsahovať prísady, ktoré zvyšujú vychytávanie zlúčeniny. Medzi prísady majúce tento účinok patria napríklad mastné kyseliny, kyselina olejová, kyselina linoleová a kyselina linolénová.
Môže byť žiadúca príprava prostriedku s riadeným uvoľňovaním. Zlúčenina podľa predkladaného vynálezu môže byť tiež zapracovaná do inertnej matrice, ktorá umožňuje jej uvoľňovanie buď prostredníctvom difúzie, alebo odplavovaním, napríklad do želatíny. Pomaly sa rozpadajúce matrice môžu byú tiež zapracované do prostriedku a týmito môžu byú napríklad algináty alebo polysacharidy. Inou formou riadeného uvoľňovania zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu je prostriedok na báze Oros terapeutického systému (Alza Corp.), v ktorom je aktívna zložka uzavrená v semipermeabilnej membráne, ktorá umožňuje prienik vody do prostriedku a vytláčanie aktívnej zložky prostredníctvom malých otvorov v dôsledku ozmotického efektu. Niektoré enterálne poťahy spôsobujú tiež spomalenie uvoľňovania.
Medzi takéto poťahy patria rôzne sacharidy, ktoré môžu byť nanesené v poťahovacej piecke. Terapeutické činidlo môže byť tiež aplikované v tablete potiahnutej filmom a materiály používané na tento účel môžu byť rozdelené na dve skupiny. Prvé sú nonenterálne materiály, ako je metylcelulóza, etylcelulóza, hydxoxyetylcelulóza, metylhydroxy-etylcelulóza, hydroxypropylcelulóza, hydroxypropyl-metylcelulóza, karboxymetylcelulóza sodná, providón a polyetylénglykoly. Do druhej skupiny patria enterálne materiály, ako sú bežné estery kyseliny ftálovej.
Na optimálny filmový poťah môže byť použitá zmes materiálov. Poťahovanie filmom môže byť uskutočnené na poťahovacej panve alebo vo fluidnom lôžku alebo môže byť použité poťahovanie lisovaním.
Prostriedky na pľúcne podanie. Vynález tiež predpokladá pľúcne podanie proteínu podľa predkladaného vynálezu (alebo jeho derivátu). Proteín (alebo jeho derivát) je podaný do pľúc cicavca prostredníctvom inhalácie a prenosom cez pľúcny epitel do krvného riečiska, (ďalšia literatúra pozri Adjei et al., Pharma. Res. (1990)7:565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135-44 (leuprolid-acetat); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (suppl.5): s.143-146 (endothelin-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3:20612 (al-antitrypsin); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (al-proteinasa); Oswein et al. (March 1990), Aerosolization of proteins, Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II Keystone, Colorado (rekombinantný ľudský rastový hormón); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140:3482-8 (interferon-γ a tumor nekrosis faktor a) a Plat z et al., U.S. Patent č. 5,284,656 (faktor stimulujúci kolónie granulocytov).
Predkladaný vynález predpokladá použitie rôznych mechanických prostriedkov navrhnutých pre pľúcne podanie terapeutických produktov, ako sú nebulizátory, inhalátory na aplikáciu určitej dávky a inhalátory prášku, ktoré sú známe odborníkom v odbore. Niektoré špecifické príklady komerčne dostupných prostriedkov sú Ultravent nebulizer, vyrábaný firmou Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; Acorn II nebulizer, vyrábaný firmou Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin inhalátor s odmerateľnou dávkou, vyrábaný firmou Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; a Spinhaler inhalátor prášku, vyrábaný firmou Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Všetky takéto prostriedky vyžadujú použitie prostriedku vhodného na aplikáciu zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu. Obvykle je každý prostriedok špecifický pre aplikačné zariadenie a môže využívať rôzne hnacie plyny a riedidlá, adjuvans a/alebo nosiče použiteľné v terapii.
Zlúčenina podľa predkladaného vynálezu je najlepšie pripravená vo forme častíc s priemernou veľkosťou častíc menej ako 10 μπι (alebo mikrónov), najvýhodnejšie 0,5 to 5 μΓη, na najúčinnejšie podanie do distálnej časti pľúc.
Medzi farmaceutický prijateľné nosiče patria karbohydráty, ako je trehalóza, manitol, xylitol, sacharóza, laktóza a sorbitol. Medzi ďalšie zložky použiteľné v prostriedkoch patria DPPC, DOPE, DSPC a DOPC. Môžu byť použité prirodzené alebo syntetické surfaktanty. Môže byť použitý PEG (napriek jeho použití pri derivatizácii proteínov a analógov). Môžu byt použité dextrány, ako je cyklodextrán. Môžu byť použité žlčové -sotŕ —a—iné—enhancery.—Môžu—byť—použŕté deriváty—ce'lul'ózy~a celulóza. Môžu byť použité aminokyseliny, napríklad v pufrovanom prípravku.
Predpokladá sa též použitie lipozómov, mikrokapsulí a mikrosfér, inkluzných komplexov a iných nosičov.
Prostriedky vhodné na použitie v nebulizátore, tryskovom alebo ultrazvukovom, obvykle obsahujú zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu rozpustenú vo vode v koncentrácii približne 0,1 až 25 mg biologicky aktívneho proteínu na ml roztoku. Prostriedky môžu tiež obsahovať pufor a jednoduchý cukor (napríklad na stabilizáciu proteínu a reguláciu ozmotického tlaku). Prostriedok pre nebulizátor môže tiež obsahovať surfaktant na zníženie alebo prevenciu agregácie proteínu spôsobenú atomizáciou roztoku pri vzniku aerosólu.
Prostriedky vhodné na použitie v inhalačnom prostriedku s odmerateľnou dávkou budú obvykle obsahovať jemne delený prášok obsahujúci zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu suspendovanú v hnacom plyne za použitia surfaktantu. Hnacím plynom môže byť ktorýkoľvek materiál bežne používaný na tento účel, ako je chlórfluórkarbon, hydrochlórfluórkarbon a hydrofluórkarbon, alebo hydrokarbon, vrátane trichlórfluórmetanu, dichlórdifluórmetant, dichlórtetrafluóretanolt a 1,1,1,2-tetrafluóretant, alebo ich kombinácie. Medzi vhodné surfaktanty patrí sorbitantrioleát a sójový lecitín. Kyselina olejová môže byť tiež použitá ako surfaktant.
Prostriedky určené na aplikáciu zo zariadenia na inhaláciu prášku budú obsahovať jemne delený suchý prášok obsahujúci zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu a môžu tiež obsahovať činidlo upravujúce obj~em~; ako je laktóza; sorbitol, sacharóza,_ manitol, trehalóza alebo xylitol, v množstvách, ktoré zjednodušujú dispergovanie prášku z prostriedku, napríklad, 50 až 90% hmotnostných prostriedku.
Formy na nasálne podanie. Predkladaný vynález tiež zahŕňa nasálne podanie zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu. Nasálne podanie umožňuje prienik proteínu do krvného riečiska priamo po podaní terapeutického produktu do nosa, bez nutnosti prieniku produktu do pľúc. Medzi prostriedky na nasálne podanie patria prostriedky obsahujúce dextrán alebo cyklodextrán. Podanie pomocou transportu cez iné slizničné membrány sa tiež predpokladá.
Dávkovanie. Dávky použité pri liečbe vyššie uvedených ochorení budú určené ošetrujúcim lekárom, po zvážení rôznych faktorov, ktoré môžu modifikovať pôsobenie lieku, ako je napríklad vek, celkový stav, telesná hmotnosť, pohlavie a dietne zvyklosti pacienta, závažnosť akejkoľvek infekcie, doba podania a ďalšie klinické faktory. Všeobecne bude dávka v rozmedzí 0,1-1000 pg zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu na kilogram telesnej hmotnosti, výhodne 0,1-150 μ9/^ί1θ9Γ3πι.
Predkladatelia vynálezu určili výhodné štruktúry pre výhodné peptidy uvedené v nasledujúcej tabuľke 4. Symbol A môže byť akákoľvek spájacia sekvencia opísaná vyššie alebo môže predstavovať normálnu peptidovú väzbu (to je spájacia sekvencia nie je prítomná). Tandemové repetitívne sekvencie a spájacie sekvencie sú separované pomlčkami.
Tabuľka 4 — Výhodné uskutočnenia
Sekvencia/štruktúra Opis peptidu SEQ ID NO:
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD VHNF-A-F1 PTH (1-34) 161
SVSEIQLMHNRGKHLNSMERVEWLRKKLQD VHNF-A-F1 (L11R) PTH Π-34) 162
SVSEIQLMHNKGKHLNSMERVEWLRKKLQO VHNF-A-F1 (L11K) PTH (1-34) 163
SVSEIQLMHNLGKHLŇSMRRVEWLRKKLQD VHNF-A-F1 (E19R) PTH (1-34) 164
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD V-A-F1 PTH d-31) 165
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD- A-F1 PTH (1-30) 166
f’-a- SVSEKJLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQ PTH 0-29) 167
F’-Λ- ~ SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKL PTH (1-28) 168
LLHNLGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA-A-F1 (D10N.K11L) PTHrP (7-34) 169
SLALADDAAFRERARLLAALÉRRHWLNSY MHKLLVLDAP-A-F1 TIP39 170
F je Fc doména, ako bola definovaná vyššie. Okrem zlúčenín uvedených v tabuľke 4 predkladatelia vynálezu ďalej predpokladajú použitie heterodimérov, v ktorých je každý reťazec Fc diméru naviazaný na inú peptidovú sekvenciu; napríklad molekula, v ktorej môže byť jeden reťazec opísaný SEQ ID NO: 166 a druhý môže byť opísaný SEQ ID NO: 170 alebo môže byť naviazaný prostredníctvom Fc na akúkoľvek sekvenciu z tabuliek 1 a 2.
Všetky zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené spôsobmi opísanými v PCT prihláške č. WO 99/25044.
Vynález bude teraz opísaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré sú len ilustratívne a nijako neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Biologická aktivita agonistu PTH/PTHrP receptora (PTH-R1) konjugovaného na Fc [PTH-(1-34)-Fc] «r. Úvod
Parathyroidálny hormón [PTH-(1-34) alebo natívny PTH(l-84)] zvyšuje tvorbu kosti a zvyšuje kostnú hmotu pri dennom injekčnom podávaní. Skôr sa predpokladalo, že tento anabolický efekt vyžaduje krátku expozíciu PTH, ktorá je zjednodušená jeho krátkym polčasom (menej ako 1 hodina). Klinicky vyžaduje anabolický efekt terapie PTH dennej SC injekcie, čo je veľká prekážka pre masové používanie PTH. Menej časté injekcie PTH by boli klinicky žiadúce a boli by možné pri predĺžení polčasu PTH in vivo. Krátkodobá (intermitentná) expozícia PTH (<1 h/deň) stimuluje osteoblastickú tvorbu kosti, zatiaľ čo dlhodobá (kontinuálna) expozícia (>2 h/deň) stimuluje osteklastickú resorpciu kosti (Dobnig et al., Endocrinology
138: 4607,1998). Znalosti z odboru naznačujú, že PTH s predĺženým polčasom zvyšujú resorpciu kosti a vedú na hyperkalcémiu. Je ale možné brániť PTH-indukovanú osteoklastickú aktivitu pomocou inhibítorov resorpcie kosti. Osteoprotegerín (OPG) môže byú veľmi vhodný na tento účel. Jediná dávka OPG-Fc podaná krysám, myšiam alebo ľuďom spôsobuje dlhodobú resorpciu kosti, v dôsledku eradikácie populácie osteklastov. Súčasné podanie účinného inhibítora resorpcie kosti, ako je OPG, môže maú ešte väčší vplyv. Tento režim by mal teoreticky umožniť stimuláciu tvorby kosti prostredníctvom PTH, čo povedie na zvýšenie kostnej hmoty. Je pravdepodobné, že iné inhibítory resorpcie kosti, vrátane bisfosŕonátov—a±ebo—estrogémr; budú rirež inhibovať PTH indukovanú resorpciu kosti a preto by mohli byú použité v kombinácii s dlhodobou pôsobiacou PTH molekulou. Na tento účel sme klonovali, exprimovali a prečistili ľudský PTH-(1-34)-Fc. Fc konjugácia proteínov spôsobuje významné zvýšenie ich cirkulačného polčasu, čo môže umožniť injekčné podávanie PTH(1-34)-Fc v podobnom režime ako OPG-Fc. Medzi výhody predkladaného vynálezu patria menej časté injekcie PTH, v porovnaní so současným štandardom (raz za deň) len štvrtinové.
Materiály, spôsoby a výsledky
Test na hyperkalcémiu
Testovali sme účinnosú a trvania účinku PTH-(1-34)-Fc v myšacom modele hyperkalcémie. Stručne, myšiam sa injekčné podali SC rôzne dávky PTH-(1-34) alebo PTH-(1-34)-Fc a perifárna krv sa odoberala z retroorbitálneho sinú na stanovenie koncentrácie ionizovaného vápnika v krvi. Polčas a účinnosú PTH-(1-34)-Fc boli vyššie ako pre PTH-(1-34) , ako je dokázané delšou hyperkalcemickou reakciou myší ako pre známe činidlá (Obr. 4). Hyperkalcémia indukovaná PTH-(1-34) trvala 6-24 h, zatiaľ čo ekvimolárne dávky PTH-(1-34)-Fc spôsobovali dlhšiu hyperkalcémiu (48-72 h). Toto trvanie odpovedi je v súlade s dlhším polčasom PTH-(1-34)-Fc konštruktu vs. PTH-(134). Účinnosť PTH-(1-34)-Fc bola tiež významne vyššia ako účinnosť PTH-(1-34) (Obr. 4). Najvyššia dávka PTH-(1-34)-Fc spôsobila vyššie zvýšenie v piku koncentrácie ionizovaného vápnika ako ekvimolárna dávka PTH-(1-34). Analýza plochy pod krivkou (AUC) preukázala, že pri najvyššej použitej dávke spôsoboval PTH-(1-34)-Fc vyššiu hyperkalcemickú reakciu ako ekvimolárna dávka PTH(1-34).
Anabolický test----Po preukázaní lepšej farmakológie a polčasu PTH-(1-34)-Fc v porovnaní s PTH-(1-34) sme uskutočnili pilotnú štúdiu na stanovenie toho, či súčasná terapia PTH-(1-34)-Fc a OPG-Fc zvyšujú kostnú hmotu. Stručne 6-mesační samci Sprague Dawley (SD) krýs sa rozdelili do skupín po 6. Základná minerálová kostná hustota (BMD) sa určila podľa tretieho stavca chrbtice (L3) pre všetky krysy za použitia rôntgenovej absorpcie pri duálnej energii žiarenia (DEXA) (Den 0). Krysy sa potom liečili podľa nasledujúceho protokolu:
Skupina 1: Vehikulum (PBS, injikované SC, Dni 1,3 a 5)
Skupina 2: OPG-Fc, jediná SC injekcia (1 mg/kg) v Deň 1 Skupina 3: PTH-(1-34), SC injekcia v Dňoch 1,3 a 5, v dávke 20 nM PTH/kg/injekciu. Toto predstavuje optimálny anabolický režim podania PTH.
Skupina 4: rovnako ako skupina 3, ale s jedinou OPG-Fc injekciou v Deň 1.
Skupina 5: Jediná SC injekcia PTH-(1-34)-Fc v dávke 60 nM/kg, v Deň 1. Toto predstavuje molárnu dávku, ktorá je ekvivalentná
celkovej dávke PTH-(1-34) danej skupine 3, ale v j edinej
injekcii.
Skupina 6: rovnako ako skupina 5, ale s jedinou OPG-Fc
inj ekciou (SC, 1 mg/kg) v Deň 1.
DEXA lumbálnej chrbtice sa uskutočnila v deň 7 na
hodnotenie zmien v BMD. BMD v L3 sa . zvýšila mierne v skupine s
jedinou injekciou OPG-Fc, alebo s 3 injekciami PTH-(1-34), v porovnaní s krysami liečenými PBS (Obr. 5). PTH-(1-34) + OPG spôsobili vyššie zvýšenie BMD v porovnaní s jedinou injekciou buď OPG, alebo PTH-(1-34) samostatne. V monoterapii jediná injekcia PTH-(1-34)-Fc nezvýšila BMD. Ale jediná injekcia PTH(l-34j”Fc plus jtídiiiá_'i'n'j'ekcia OFG-Fc spôsobila signifľkäntríé zvýšenie BMD (Obr. 5). Tento výsledok podporuje predpoklad, že PTH konštrukt s predĺženým cirkulačným polčasom môže byú kombinovaný s účinným antirezorpčným činidlom, ako je OPG-Fc, za zisku anabolickej odpovedi v skelete. Anabolický účinok jedinej aplikácie PTH-(1-34)-Fc plus OPC-Fc bol vyšší ako účinok indukovaný mnohými injekciami PTH-(1-34), s alebo bez súčasnej aplikácie OPG-Fc. Najväčší zisk v BMD bol dosiahnutý pri málo frekventovanom injekčnom podaní PTH-(1-34)-Fc + OPGFc, kde táto liečba bola lepšia ako liečba PTH- (1-34) , ktorý musí byú injekčné aplikovaný denne alebo každý druhý deň.
Obr. 5 ukazuje vplyv PTH-Fc + OPG-Fc na minerálnu hustotu kosti (BMD) v treúom stavci chrbtice (L3). Normálne 6-mesiacov staré krysy (samci) sa liečili PTH-Fc alebo PTH alebo vehikulom za použitia jedinej SC injekcie. Niektorým krysám sa tiež podala jediná SC injekcia OPG. BMD sa určila o 7 dní pozdejšie za použitia DEXA. Dáta predstavujú priemery ± SD, n = 6 krýs/skupinu.
Príklad 2: Biologická aktivita antagonistu PTH/PTHrP receptora (PTH-R1) ( [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc) .
Úvod
Niektoré ochorenia sú asociované so zvýšením koncentrácie PTH alebo PTHrP v cirkulácii. Primárny a sekundárny hyperparatyroidizmus (PHPT a SHPT, v príslušnom poradí), sú asociované so zvýšenými koncentráciami PTH, zatiaľ čo humorálna hyperkalcémia pri malignitách . (HuM) je dôsledkom zvýšenia koncentrácie PTHrP. Obidva proteíny signalizujú prostredníctvom spoločného PTH/PTHrP receptora (PTH-R1), ktorý zpôsbbuje zvýšenie resorpcie kosti, renälnu“ reabsorpcíu vápnika a renálnu biosyntézu vitamínu D. Zatiaľ čo rôzne inhibitory resorpcie kosti majú rôznu úspešnosť v inhibícii osteoklastickej resorpcie kosti pre tieto ochorenia, nie je v súčasnosti dostupná terapia zmierňujúca črevné a renálne efekty PTH alebo PTHrP na nadbytok vápnika. Činidlá, ktoré môžu priamo antagonizovať PTH alebo PTHrF signalizáciu budú mať teda pravdepodobne vyššiu účinnosť v porovnaní s inhibítormi resorpcie.
Nejpreštudovanej ši antagonisti PTH-R1 signalizácie sú založení na amíno-terminálnych skráteniach. PTH-(7-34) peptidy sú slabo- účinnými PTH antagonistami s veľmi slabou agonistickou aktivitou. V porovnaní s PTH-(7-34) má PTHrP-(734) peptid vyššiu afinitu pre PTH-R1 a preto je účinnejším antagonistom. Ale PTHrP-(7-34) ma tiež vyššiu (ale stále slabú) agonistickú aktivitu v porovnaní s PTH-(7-34) (MčKee (1990), Endocrinol. 127:76). Optimálny antagonista bude kombinovať slabší agonizmus PTH-(7-34) so silnejším antagonizmom PTHrP-(7-34) . Nutt et al. (1990), Endocrinol. 127:491, preukázali, že substitúcia AsnlO a Leull PTH do PTHrP sekvencie (nahradením AsplO a Lysll) vedie na vznik peptidu ([AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc) v podstate bez agonistickej aktivity, ale stále ešte s veľmi silnou antagonistickou aktivitou.
Podobne ako natívne PTH majú peptidový PTH-R1 antagonisti veľmi krátky cirkulačný polčas (< 1 h) . Ďalej, amínoterminálne skrátenia, ktoré sú nutné na odstránenie agonizmu na receptore, tiež významne redukujú afinitu týchto peptidov k PTH-R1. Tieto vlastnosti obmedzujú klinický potenciál bežných peptidových antagonistov. Konjugácia amino-terminálne skrátených PTH- alebo PTHrP peptidov na Fc by mala významne zvyšovať—ich—cirkniačný—polčas, 'takže—môže byť dosiahnutý kontinuálny antagonizmus PTH-R1 pomocou týchto Fcantagonistov.
Materiály, spôsoby, výsledky
Klonovali sme, exprimovali a prečistili sme [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc. Testovali sme schopnosť tejto zlúčeniny antagonizovať ako akútnu, tak chronickú hyperkalcemickú odpoveď myší. PTHrP-(1-34) bol použitý ako kalcemické činidlo na hodnotenie akútnych efektov (AsnlO,Leull-PTHrP-(7-34)-Fc. Pretože je PTHrP zásadný mediátor HHM, predstavuje tento pokus tiež model pre nádory indukujúce hyperkalcémiu. Jednoducho povedané, ionizovaný vápnik v krvi (BIC) sa meral na začiatku pokusu a myšiam sa potom podalo vehikulum (PBS) alebo PTHrP-(1-34) (0,5 mg/kg) pomocou SC injekcie. Myšiam sa potom aplikovali raz SC rôzne dávky [AsnlO,Leull]PThrP-(7-34)-Fc alebo vehikulum (PBS). Pre myši liečené vehikulom a s aplikovaným PTHrP-(l-34) bola pozorovaná prechodná hyperkalcemická reakcia. Pík kalcemickej reakcie bol pozorovaný 3 hodiny po expozícii a trval po expozícii aspoň 6 hodín. [AsnlO,Leull]PTH-rP-(7-34)-Fc v dávke mg/kg spôsobil rýchlejšiu normalizáciu PTHrP-indukovanej hyperkalcémie v porovnaní s vehikulom. Dávka 30 mg/kg celkom blokovala kalcemickú reakciu na PTHrP-(1-34) (Obr. 6).
Na testovanie schopnosti [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc antagonizovaú chronickejšiu hyperkalcémiu sme použili PTH-(134)-Fc ako dlhodobo pôsobiace kalcemické činidlo. Tento pokus tiež predstavuje model pre primárny a sekundárny hyperparatyroidizmus, ochorenie, ktoré je charakterizované perzistujúcou eleváciou koncentrácie PTH. Pre myši liečené vehikulom jediná SC injekcia PTH-(1-34)-Fc (30 mg/kg) -spôsobila-silnú—hyperkadcHrnickú—reakciu', ktorá dosiahla hodnoty 2,75 mg/dl za 24 h po aplikácii (vs. normálna kontrolná hodnota 1,35). Jediná SC injekcia [AsnlO,LeullPTHrP-(7-34)-Fc v dávke 10-100 mg/kg spôsobila významné zníženie hyperkalcemickej reakcie na PTH-(1-34)-Fc v 24 hodine (Obr. 6).
Preukázali sme antagonistickú aktivitu [AsnlO,Leull]PTHrP(7-34)-Fc, na zvieracích modeloch akútnej a chronickej hyperkalcémie. Tieto modely využívajú kalcemické činidlá na báze sekvencie PTH a PTHrP. Tieto dáta naznačujú, že [AsnlO, Leull]PTHrP-(7-34)-Fc, rovnako ako iní Fc-konjugovaní PTH-R1 antagonisti, môžu byť účinnou liečbou pri hyperparatyroidizmu, HHM a iných ochoreniach asociovaných s aberantnou PTH-R1 signalizáciou.
Príklad 3: Osteogénne vlastnosti Fc-konjugovaných a prirodzených C-terminálne skrátených PTH fragmentov
A. cAMP testy
Testovali sme relatívnu schopnosti PTH-Fc konštruktov stimuloval akumuláciu cAMP v krysích osteoblastoch podobných ROS 17/2.8 bunkách. Kultúry sa ošetrili inhibítorom fosfodiesterázy LBMX na podporenie akumulácie cAMP. Kultúry sa potom vystavili na dobu 15 minút pôsobeniu buď vehikula (PBS), alebo rôznych PTH konštruktov. Akumulácia cAMP závislá na dávke sa preukázala pre všetky fragmenty. PTH-(1-34) nekonjugovaný na Fc bol o trochu účinnejší ako PTH-(1-31)-Fc a PTH-(1-30)-Fc (Obr. 7). Tieto dáta demonštrujú, že PTH fragmenty konjugované na Fc si zachovávajú schopnosť: aktivovať. AC dráhu v osteoblastoch.
-B-;—Biologický test na~ myšiach ~
Potom sme testovali účinky PTH-(1-34) , PTH-(1-34)-Fc, PTH(1-31)-Fc a PTH-(1-30)-Fc u myší. 4-týždenným myšiam samcom sa inj ikovalo v dni 0, 5 a 10 vehikulum alebo PTH fragmenty, SC injekciou. Periférna krv sa odobrala na získanie klinickej biochémie v 24, 48 a 72 hodine. Myši sa usmrtili v deň 15, ich stavce, tibie a femury sa odobrali na histologické vyšetrenie a jedna tibia sa odobrala na meranie kostnej hustoty (periférna kvantitatívna počítačová tomografia, pQCT). Medzi sledované chemické parametre patrila celková sérová koncentrácia vápnika, sérová alkalická fosfatáza (AP, marker osteoblastickej aktivity), sérová kyslá fosfatáza rezistentná na tartrát (TRAP, marker osteoklastickej aktivity). Pre každé zviera sa vypočítal pomer AP:TRAP ako index relatívnej osteoblastickej aktivity v porovnaní s osteoklastickou aktivitou. Vyšší pomer AP:TRAF ukazoval na potenciálne účinnejšie anabolické činidlo. Relatívne vysoké dávky (15-krát vyššie ako optimálne anabolické dávky) boli vybrané podľa predchádzajúcich štúdií, ktoré preukázali signifikantné zmeny v sledovaných chemických parametroch. Predpokladalo sa, že nižšie dávky by mohli preukázať anabolické účinky na kostnú hustotu a že súčasná antiresorpčná liečba by mohla byť nutná na dosiahnutie anabolickéj reakcie.
Výsledky chemických parametrov sú uvedené na Obr. 8. Sérový vápnik nebol významne odlišný v 24, 48 alebo 72 hodine po injekcii 300 nmol/kg (1,2 mg/kg) PTH-(l-34). Tento výsledok je v súlade s krátkym polčasom peptidu nekonjugovaného na Fc, ktorý normálne spôsobuje prechodné (12 h) zvýšenie sérovej koncentrácie vápnika. Naopak, ekvimolárna dávka PTH-(1-34)-Fc spôsobila dramatické a dlhodobé zvýšenie sérovej koncentrácie vápnika, ktorá dosiahla vrchol v 24 h. PTH-(1-31)-Fc bol -úč-tnej-ším—kalcemickým—čiľirirďlum, zatiaľ čo PTH- (1-30) -Fč bôľ najmenej kalcemický z 33 Fc peptidov (Obr. 8A) . Sérová AP (osteoblastický marker) bola nezmenená po podaní PTH-(1-34), ale bola významne zvýšená na 300 nmol/kg pre PTH-(1-34)-Fc a pre PTH-(1-31)-Fc v 72 h. PTH-(1-30)-Fc vykazoval najvyššie zvýšenie AP, ktorá dosiahla maximum v 72 h po injekcii 1000 nmol/kg (Obr. 8B) . Sérový TRAP (osteoklastický marker) nebol významne zmenený pre PTH-(1-34), PTH-(1-34)-Fc alebo PTH-(1-30)-Fc, ale bol dramaticky zvýšený pre PTH-(1-31)-Fc (Obr. 8C). Vypočítané pomery AP:TRAF boli rovnaké pre PTH-(134) a boli zvýšené pre PTH-(1-34)-Fc. Nízka dávka PTH-(1-31)Fc (100 nmol/kg) zvyšovala AP:TRAP, zatiaľ čo vysoká dávka (1000 nmol/kg) znižovala AP:TRAP. Najvyššie zvýšenie v AP:TRAP bolo dosiahnuté s PTH-(1-30)-Fc (1000 nmol/kg) (Obr. 8D).
Efekty rôznych PTH konštruktov na kostnú hustotu (proximálnu metafýzu tibie) sú uvedené na obr. 9. Na konci 15dennej štúdie bolo zistené, že PTH-(1-34) (300 nmol/kg) má stredný (nesignifikantný) anabolický vplyv pri injekcii v deň
0, deň 5 a deň 10. PTH-(1-34)-Fc (300 nmol/kg) nemá žiadny vplyv na hustotu kosti, rovnako ako PTH-(1-31)-Fc v dávke 100 nmol/kg. Vyššie dávky PTH-(1-31)-Fc (300-1000 nmol/kg) mali významnú toxicitu súvisiacu s hyperkalcémiou a kosti od týchto zvierat sa neodoberali na pQCT. PTH-(1-30)-Fc spôsoboval najvyššie zvýšenie v kostnej hustote. Bola zreteľná nepriama závislosť dávka-reakcia, keď PTH-(1-30)-Fc v dávke 100 nmol/kg mal najvyšší vplyv a v dávke 1000 nmol/kg mal najnižší vplyv, aj keď pri všetkých dávkach bola BMD vyššia ako pri kontrolách (Obr. 9) . Nepriama závislosť dávka-reakcia bola v súlade so zistením, že použité dávky (vybrané pre dané chemické parametre) boli 5-50-krát vyššie ako optimálne anabolické dávky. Nízke dávky PTH (alebo PTH-Fc), ktoré zlyhávajú v signifikantnom zvýšení sérovej koncentrácie vápnika, sú optimálne -pre-anabol ické- ef ekty; Pozri 'Hoc'kg J.M. (19'92)“ ΤΓ
Bone Min. Res. 7:65-72. V tomto pokuse bol liečebný režim s najväčším anabolickým účinkom (PTH-(1-30)-Fc v dávke 100 nmol/kg) tiež jediným PTH-Fc režimom, ktorý signifikantne nezvyšoval sérové koncentrácie vápnika (Obr. 8A).
Tieto dáta demonštrujú potenciálne anabolické efekty Cterminálne skrátených PTH-Fc peptidov. Dlhší polčas spôsobený konjugáciou s Fc, v kombinácii so selektívnou stimuláciou AC/cAMP C-terminálne skrátenými peptidmi, môže vysvetliť anabolický vplyv za absencie účinného inhibítora resorpcie kosti. Predpokladá sa, že postupným C-terminálnym skracovaním PTH-(1-30)-Fc sa objavia kratšie fragmenty, ktoré si zachovávajú alebo majú vyšší anabolický profil ako PTH-(130)-Fc. Tieto fragmenty môžu byť viacej selektívne v stimulácii osteoblastov a môžu byť menej kalcemické, čím sa dosiahne-väčšie terapeutické okno pre anabolickú terapiu.
Príklad 4
Liečba PTH-Fc v monoterapii
Účinnosť PTH-(1-34)-Fc v monoterapii bola preukázaná pre dospelé myši. Jednoducho povedané, samci BDF1 myší (4 mesiace starí) sa liečili dvakrát týždne podkožnou injekciou rôznymi dávkami PTH-(1-34)-Fc alebo vehikulá (PBS). Iné myši sa liečili dennými SC injekciami PTH-(1-34) v dávke 80 /ig/kg/deň (20 nmol/kg/den) , čo je liečebný režim, ktorý je optimálny na zvýšenie kostnej hmoty hlodavcov (M. Gunness-Hey a J.M. Hock, Metab. Bone Dis. & Rel. Res. 5:177-181, 1984). Po 3 týždňoch sa myši usmrtili a ich tibie sa analyzovali na kostnú minerálnu hustotu (BMD) za použitia pQCF (Obr. 10).
-Celková—Libiálna—BMD—a—rnreŽOVŤtcT-BMD bslí zvýšené““prf dennej aplikácii injekciou PTH-(1-34) v porovnaní s vehikulom (Obr. 1, dvojcestná ANOVA, p<0,05). Injekcie PTH-(1-34)-Fc aplikované dvakrát týždne spôsobili na dávke závislé zvýšenie celkovej a mrežovítej BMD, pri dvoch najvyšších dávkach (50 a 150 nmol/kg), a toto zvýšenie bolo signifikantne vyššie ako efekty spôsobené vehikulom alebo denne aplikovaným PTH-(1-34). Kortikálna BMD v tibii nebola významne zvýšená denným podávaním PTH-(1-34). PTH-(1-34)-Fc aplikovaný dvakrát týždne spôsobil na dávke závislé zvýšenie kortikálnej BMD, ktoré bolo pri najvyššej dávke významne vyššie ako hodnoty pozorované u myší liečených vehikulom alebo dennou aplikáciou PTH-(1-34) (p<0,05).
PTH-(1-34)-Fc aplikovaný dvakrát týždne tiež účinne zvyšuje BMD v monoterapii u ovarektomizovaných (OVX) krýs. Sprague Dawley krysy boli OVX, v 3 mesiacoch veku umožnil sa priebeh straty kostnej hmoty počas 11 mesiacov.
Iné krysy boli falošne operované a boli liečené dvakrát týždne vehikulom (PBS). OVX boli liečené dvakrát týždne SC injekciami buď vehikulá, alebo bisfosfonátu APD (pamidronát, 0,5 mg/kg), alebo PTH-(1-34)-Fc (50 nmol/kg) alebo APD + PTH(1-34)-Fc. BME sa určovala raz za týždeň pomocou rôntgenovej absorpcie s duálnou energiou (DEXA). Krysy sa usmrtili po 4 týždňoch liečby. Na konci liečby mali OVX krysy významné zníženie v BMD vo všetkých analyzovaných miestach skeletu v porovnaní s vehikulom-liečenými OVX krysami (Obr. 11, p<0,05,
2-cestná ANOVA). PTH-(1-34)-Fc samostatne nezvyšoval signifikantne BMD v metafýze femuru po 4 týždňoch liečby (p<0,05). Liečba OVX krýs PTH + ABD bola asociovaná so skorším zvýšením v BMD v tomto mieste (3 týždne).
-Kombinácia APD + PTH- (1-34)-Fc” tie ž spôsobila významné zvýšenie BMD v lumbálnom stavci a v metafýze femuru (p<0,05). PTH-(1-34)-Fc samostatne spôsobil miernu a dočasnú hyperkalcemickú reakciu, ktorá spontánne odoznela po dni 10 aj napriek, pokračujúcej liečbe. Súčasné podanie APD celkom blokovalo kalcemický vplyv PTH-(1-34)-Fc.
Tieto dáta naznačujú, že PTH-(1-34)-Fc je účinným anabolickým činidlom pri použití v monoterapii ako pre dospelých, tak pre OVX krysy. Preukázali sme tiež, že pridanie antiresorpčného činidla (APD) k PTH-(1-34)-Fc je asociované s podobným alebo rýchlejším zvýšením BMD pre OVX krysy. Súčasné podanie APD tiež blokovalo dočasnú hyperkalcemickú reakciu produkovanú PTH-(1-34)-Fc, čo naznačuje, že terapeutický index PTH-(1-34)-Fc môže byť významne zlepšený súčasným podaním účinného antiresorpčného činidla.
Po podrobnom opísaní vynálezu je teraz odborníkom v odbore jasné, že existujú mnohé zmeny a modifikácie predkladaného vynálezu, ktoré spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu, ako je tu definovaný.
Skratky
AC adenylát-cykláza
AP alkalická fosfatáza
BMD kostná minerálová hustota cAMP cyklický adenosín-monofosfát
DEXA rôntgenová absorpcia pri duálnej energii HHM humorálna hyperkalcémia pri malignitách OPG osteoprotegerín
OVX ovarektizomovaný
PBS fosfátom pufrovaný salinický roztok pQCT periférna kvantitatívna počítačová tomograf
PTH paratyroidný hormón
-CTHrP—protreín príbuzný s-paratyroidným hormónom TRAP kyslá fosfatáza rezistentná na tartrát

Claims (12)

NÁROKY
1.8-1 hodiny po aplikácii
1/13 fip 152D- 2ΩΌ2Obr. 2
TT
S s l i s s
TT
TT s s l t s s
Fc
Λ__ \
-P1-L1
Fc
1. Zlúčenina vzorca
P1- (L1)a-F1 a jej multiméry, kde:
F1 je vehikulum a je naviazané na C-koniec P1-(L1)a;
P1 je PTH/PTHrP modulujúca doména;
L1 je spájacia sekvencia; a a je 0 alebo 1.
2/13 —P2-!?
Λ —p'-ľ
-P1-Ľ*
TT 1520-2002—
Obr. 3
ATGGACAAÄACTCACACATCTCCACCTTGTCCAGCTCCGGAACTCCTGGGGGeACCGTCA a MDXTHTCPPCPAPBI.t.GG PS
GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTCAGGTC
CAGAAGGAGAAGGGGGGTTTTGGGTTCCTGTGGGAGTACTASAGGGCCTGGGGACTCCAG a VPLPPPXPKDTI.MISRTPSV TGTACGCACCACCACCTGCACTCGGTGCTTCTGGGACTCCAGTTCAAGTŤGACCATGCAC & TCVVVDVSHBDPBVKPWWYV GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGÁGCAGTACAACAGCACG
CTGCOSCACCTCCAOSIAnACGGTTCTGTTTGGGGQCCCYCCTCGTCAXGTTGTCGTGC a DGVBVHMAXTXPRBBQYHST
241--------+—-----1------1—-—-----i-------h---------+ 300
YRVVaVLTVI.HQDWI.NGXEY wncaAaxciccAWiAivBacaaxMcccccMaGHm^
301 —----1-----1----1-------1------1-------+ 3 SO
XCXVSSXALPAPIBXTISXA
AAAGeGOwGCCCCGAeAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCC&TCCCGGGATGAGCTeACC aei---------+--------4---------μ------►-------♦--------+ 420
TTTCCCGTCGGGGCYCTTQGTGTCCACATGTOGGACGGGQGTSGGGCCCTACTCGACTQG
KGQPRBPQVYTX.PPSRDBX.T
AAGAACCAGGTCAGCCTSACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTO
XHQVSLTCIiVXGFYPSDIAV
GAGÍGGGAGAGCAATCGGCAGaľGGAGAÄCAACTACAACACCACGCCTCCCGTGCTGGAC 481-------►_----1-----1—----1-------+-------+ S 40
BMBSWOQFBHKYKTTPÍVI.D
541-------μ--------------------------------—► 600
AGGCTGCCGAGGAAGAAOGAGATGTCGTOľGAGTGGCÄCCTGTTCTCGTCCACCGTCGTC SDGSPF1.YSXI.TVDXSRMQ Q
GGGIACGlCfTCTCATCCTCCGTGAIGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG
501-------1---------+---------Ί--------►----------+--—γ-----·+ 660
CCCTTGCAGAAGAGTACGAGGCACTACGTACTCCGAGACGTGTTGGTľGATGTGCG'TCTTC
GNVFSCSVKBBAI.HHHYTQX
AGCCTCTCCCIGTCTCCGGGTAAA
661 --------+--------+---- 684
TCGGAGAGGGACAGAGGCCCATTT
S I. SI. S P GK
2. Zlúčenina podľa nároku 1 vzorca
P1-?1.
3/13
Obr. 4 ?P 15Ζΰ--2/ΟΟ~^ ionizovaný Ca (mmol/L)
3. Zlúčenina podľa nároku 1, kde F1 je Fc doména.
4/13
Obr. 5
0 3 6 hodiny po aplikácii
4. Zlúčenina podľa nároku 1, kde F1 je IgG Fc doména.
5/13
Obr. 6
ΡΡ 157() -20οζ_
0 6 24 48 72 hodiny po aplikácii
5. Zlúčenina podľa nároku 1, kde F1 je IgGl Fc doména.
6/13
Obr. 7 (1-3O)Fc1O'
6. Zlúčenina podľa nároku 1, kde F1 obsahuje sekvenciu SEQ ID
NO: 2.
7/13
Obr. 8 sérový vápnik (mg/dL) doba po liečbe (h) n
S
Η-» .CO 'CO
x.
o <
doba po liečbe (h)
7. Zlúčenina podľa nároku 1, kde PTH/PTHrP modulujúca doména má vzorec
XNX8HX10X11X12KX14X15X16X17X18X19RX21X22X23X24X25X26X27X28Xc (SEQ ID NO: 3)
163 kde
XN nie je prítomný alebo je X3X4X5X6X7, X2X3X4X5XeX7,
X1X2X3X4X5X6X7, alebo YX1X2X3X4X5X6X7;
X1 až X7, X10, X11, X12, X14 až X28 sú každý nezávisle amínokyseliný zvyšok;
Xc nie je prítomný alebo je X29, X29X30 , Χ29Χ3θΧ31, X29X30X31X32 ,
X29X30X31X32X33 , X29X30X31X32X33X34 , X29X30X31X32X33X34X35 alebo ^2 9^30^31^3 2^3 3-^34^-3 s 6 ’
X29 až X36 sú každý nezávisle amínokyselinový zvyšok.
8/13
Pomer AP:TRAP | TRAP(uZL)
8. Zlúčenina podľa nároku 7, kde:
XN je X1X2X3X4X5X6X7;
X1 jHhydrofilnýalebo“nefunkčný“zvyšok;
X2 je V;
X3 je S;
X4 je E;
X5 je nefunkčný alebo bázický zvyšok;
X6 je Q;
X7 je L;
X10 je acidický alebo hydrofilný zvyšok;
X11 je nefunkčný alebo bázický zvyšok;
X12 je nefunkčný zvyšok;
X14 je bázický alebo hydrofilný zvyšok;
X15 je nefunkčný zvyšok;
X16 je nefunkčný alebo hydrofilný zvyšok;
X17 je acidický, hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok;
X18 je nefunkčný zvyšok;
X19 je acidický alebo bázický zvyšok;
X21 je nefunkčný alebo bázický zvyšok;
X22 je hydrofilný, acidický, alebo aromatický zvyšok;
X23 je aromatický alebo lipofilný zvyšok;
X24 je lipofilný zvyšok (L je výhodný) ;
X25 je hydrofilný alebo bázický zvyšok;
164
X26 je hydrofilný alebo bázický zvyšok;
X27 je lipofilný, bázický, alebo nefunkčný zvyšok; X28 je lipofilný alebo nefunkčný zvyšok.
9/13
Obr. 9
152Q-2.VOZ500 vehikulum
PTH(S30>Fb ΡΤΗ(1-31>Ρθ ΡΤΗ(144>Α FTH(1-34) liečba trabekuláma hustota (maZcm'1)
~&9~. spôsob na liečbu osteopénie v y ž n a c u j u-č~T š ä tým, že zahŕňa podanie PTH agonistu a inhibítora resorpcie kosti, kde PTH agonista obsahuje zlúčeninu podľa nároku 39.
70. Spôsob podľa nároku 65vyznačujúci sa tým, že inhibítor resorpcie kosti je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej OPG, OPC-L protilátky, kalcitonín, bisfosfonáty, estrogény, modulátory estrogénového receptora a tibolón.
71. Spôsob podľa nároku 66 vyznačujúci sa tým, že inhibítor resorpcie kosti je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej OPG, OPC-L protilátky, kalcitonín, bisfosfonáty, estrogény, modulátory estrogénového receptora a tibolón.
72. Spôsob podľa nároku 67 vyznačujúci sa tým, že inhibítor resorpcie kosti inhibítor je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej OPG, OPC-L protilátky, kalcitonín, bisfosfonáty, estrogény, modulátory estrogénového receptora a tibolón.
180
73. Spôsob podľa nároku 68 vyznačujúci sa tým, že inhibítor resorpcie kosti inhibítor je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej OPG, OPC-L protilátky, kalcitonín, bisfosfonáty, estrogény, modulátory estrogénového receptora a tibolón.
74. Spôsob podľa nároku 69vyzna čujúci sa tým, že inhibítor resorpcie kosti inhibítor je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej OPG, OPC-L protilátky, kalcitonín, bisfosfonáty, estrogény, modulátory estrogénového receptora a tibolón.
75. Spôsob na liečbu osteopénie v y ž n a c u j u~e i S a tým, že zahŕňa podanie zlúčeniny podľa nároku 1.
76. Spôsob na liečbu osteopénie vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie zlúčeniny podľa nároku 7.
77. Spôsob na liečbu osteopénie vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie zlúčeniny podľa nároku 20.
78. Spôsob na liečbu osteopénie vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie zlúčeniny podľa nároku 32.
79. Spôsob na liečbu osteopénie vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie zlúčeniny podľa nároku 39.
181
Obr. 1
9. Zlúčenina podľa nároku 8, kde:
Xc je X29X30X31X32X33X34 ;
X29 je hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok;
X30 je hydrofilný alebo acidický zvyšok;
X31 je lipofilný alebo nefunkčný zvyšok;
X32 je H;
X33 je hydrofilný zvyšok; a
X34 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok.
10/13
1520-1002- kortikálna BMD (mo/em’) trabekulárna BMD (mg/cm celková tibiálna BMD(mg/cm
BOO-i βΧΗ
500-
PTM 15 50 150 vehikulum prop«34>Fc(nmoWtjtf
10. Zlúčenina podľa nároku 8, kde:
Xc je X29X30X31;
X29 je hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok;
X30 je hydrofilný alebo acidický zvyšok;
X31 je lipofilný alebo nefunkčný zvyšok.
11/13
Obr. íl
Á)oupoq -p|£z po euouizpiiud^A äaoj^s dni po liečbe (U a
>o <u c
Ό
11. Zlúčenina podľa nároku 8, kde Xc je X29X30;
X29 je hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok;
X30 je hydrofilný alebo acidický zvyšok.
12. Zlúčenina podľa nároku 8, kde Xc je X29; a
X29 je hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok.
13. Zlúčenina podľa nároku 8, kde Xc nie je prítomný.
14. Zlúčenina podľa nároku 8, kde X1 je A, S alebo Y;
X5 je H alebo I;
165
X10 je N alebo D;
X11 je L, R, alebo K;
X12 je C, F alebo W;
X14 je H alebo S;
X15 j e L alebo I ;
X1S je Q, N, S alebo A;
X17 je S, D alebo L;
X18 je M, L, V alebo Nie;
X19 je E alebo R;
X21 je V, M, R alebo Nie;
X22 je E alebo F;
X23 je W alebo F;
X25- je Rľ'älebô- H“; .....''
X26 je K alebo H;
X27 je K alebo L; a X28 je L alebo I.
15. Zlúčenina podía nároku 14, kde: Xc je X29X30X31X32X33X34 ;
X29 je Q alebo A; x30 je D alebo E; x31 je V alebo i; x33 je N alebo T; a x34 je A, , F alebo Y
16. Zlúčenina podľa nároku 14, kde: Xc je x29X30X31;
X29 je Q alebo A;
X30 je D alebo E; a X31 je V alebo I.
17. Zlúčenina podľa nároku 14, kde:
Xc je X29X3°;
166
X29 je Q alebo A;
X30 je D alebo E.
18. Zlúčenina podl'a nároku 14, kde:
Xc je X29; a
X29 je Q alebo A.
19. Zlúčenina podl'a nároku 14, kde Xc nie je prítomný.
20. Zlúčenina podl'a nároku 1, kde PTH/PTHrP modulujúca doména má vzorec
- - - Ό^σ7σ8ΗΝΒσ12ΚΗΕ·σ16Εσ1όσ19κσ21ΕΝΕΚκκΕσβ '(SESTľD’NOľ4).......
kde:
JN nie je prítomný alebo je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej J1 J2J3J4J5J6, J2J3J4J5J6, J3J4J5J6;
J1 je amínokyselinový zvyšok;
J2 je amínokyselinový zvyšok;
J3 je amínokyselinový zvyšok;
J4 je amínokyselinový zvyšok;
J5 je amínokyselinový zvyšok;
J6 je amínokyselinový zvyšok;
J7 je amínokyselinový zvyšok;
J0 je amínokyselinový zvyšok;
J11 je nefunkčný alebo bázický zvyšok;
J12 je amínokyselinový zvyšok;
J16 je amínokyselinový zvyšok;
J18 je amínokyselinový zvyšok;
J19 je acidický alebo bázický zvyšok;
J21 je amínokyselinový zvyšok;
Jc nie je prítomný alebo je J29, J29J30, J29J30J31, J29J3OJ31J32, j29j30j31j32j33, j29j30j31 j32j33j34 a
167
J29je aminokyselinový zvyšok;
J30 je aminokyselinový zvyšok;
J31 je aminokyselinový zvyšok;
J32 je aminokyselinový zvyšok;
J33 je aminokyselinový zvyšok;
J34 je aminokyselinový zvyšok.
21. Zlúčenina podľa nároku 20, kde JN je JVJ’J'J'J6;
J1 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok; J2 je nefunkčný zvyšok;
J3 je hydrofilný zvyšok;
--J4- j-e--ax: i dický -zvyšok-; ’ ' ' ----J5 je nefunkčný zvyšok;
J6 je bázický zvyšok;
J7 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok; J8 je nefunkčný zvyšok;
J11 je bázický alebo nefunkčný zvyšok;
J12 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok; J16 je nefunkčný alebo hydrofilný zvyšok; J18 je nefunkčný zvyšok;
J19 je acidický alebo bázický zvyšok; a J21 je nefunkčný zvyšok;
Jc je J29 J30 J31 J32 J33 J34;
J29 je hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok; J30 je hydrofilný alebo acidický zvyšok; J31 je lipofilný alebo nefunkčný zvyšok; J32 je bázický zvyšok;
J33 acidický zvyšok; a J34 je aromatický zvyšok.
22. Zlúčenina podľa nároku 21, kde:
J1 je A, S alebo Y;
168
J2 je V;
J3 je S;
J4 je E;
J5 je I;
J6 je Q;
J7 je L alebo F;
J8 je M alebo Nie;
J11 je L, R alebo K;
J12 je G alebo W;
J1S je N, S alebo A;
J* * 18 je M, Nie, L alebo V;
J19 * je E alebo R;
J21 * 23 * * * * * je V;—M-;—alebo N±h;
J29 je Q alebo A;
J30 je D alebo E;
J31 je V alebo I;
J32 je H;
J33 je N; a
J34 je F alebo Y.
23. Zlúčenina podľa nároku 20, kde:
JN je J1 J2J3J4J5J6;
J1 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok; J2 je nefunkčný zvyšok;
J3 je hydrofilný zvyšok;
J4 je acidický zvyšok;
Js je nefunkčný zvyšok;
J6 je bázický zvyšok;
J7 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok;
J8 je nefunkčný zvyšok;
J11 je bázický alebo nefunkčný zvyšok;
J12 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok;
Jie je nefunkčný alebo hydrofilný zvyšok;
169
J18 je nefunkčný zvyšok;
J19 * je acidický alebo bázický zvyšok; a J21 * * * 25 * * * je nefunkčný zvyšok;
Jc je J2 9 J30 J31;
J29 je hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok; J30 je hydrofilný alebo acidický zvyšok; a J31 je lipofilný alebo nefunkčný zvyšok.
24. Zlúčenina podľa nároku 23, kde:
J1 je A, S alebo Y;
J2 je V;
J3 je S;
J4 je Ľ;
j5 je I;
Je je Q;
J7 je L alebo F;
J8 je M alebo Nie;
J11 je L, R alebo K;
J12 je G alebo W;
J16 je N, S alebo A;
J18 je M, Nie, L alebo V;
J19 je E alebo R;
J21 je V, M alebo Nie;
J29 je Q alebo A;
J30 je D alebo E; a
J31 j e V alebo I.
25. Zlúčenina podľa nároku 20, kde:
-i-N · _ -pi -r2 -r3 -p4 t5 -1-6
J je J J J J J J ,
J1 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok;
J2 je nefunkčný zvyšok;
J3 je hydrofilný zvyšok;
J4 je acidický zvyšok;
170
J5 je nefunkčný zvyšok;
J6 je bázický zvyšok;
J7 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok;
J8 je nefunkčný zvyšok;
J11 je bázický alebo nefunkčný zvyšok;
J12 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok;
J16 je nefunkčný alebo hydrofilný zvyšok;
J18 je nefunkčný zvyšok; .
J19 je acidický alebo bázický zvyšok; a J21 je nefunkčný zvyšok;
-rC .2 _ -r29 *t30
J j e J J ;
J29 je hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok; a J30 je hydrofilný alebo acidický zvyšok“.
26. Zlúčenina podľa nároku 25, kde:
J1 je A, S alebo Y;
J2 je V;
J3 je S;
J4 je E;
J5 je I;
J6 je Q;
J7 je L alebo F;
J8 je M alebo Nie;
J11 je L, R alebo K;
J12 je G alebo W;
J16 je N, S alebo A;
J18 je M, Nie, L alebo V;
J19 je E alebo R;
J21 je V, M alebo Nie;
J29 je Q alebo A;
J30 je D alebo E.
27. Zlúčenina podľa nároku 20, kde:
171
I
JN je J1 J2 J3 J4 J5 J6;
J1 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok; J2 je nefunkčný zvyšok;
J3 je hydrofilný zvyšok;
J4 je acidický zvyšok;
J5 je nefunkčný zvyšok;
J6 je bázický zvyšok;
J7 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok; J8 je nefunkčný zvyšok;
J11 je bázický alebo nefunkčný zvyšok;
J12 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok; J16 je nefunkčný alebo hydrofilný zvyšok; J18 je~nefunkčný zvyšok;
J19 je acidický alebo bázický zvyšok; a J21 je nefunkčný zvyšok;
Jc je J29;
J29 je hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok.
28. Zlúčenina podľa nároku 27, kde:
J1 je A, S alebo Y;
J2 je V;
J3 je S;
J4 je E;
J5 je I;
J6 je Q;
J7 je L alebo F;
J8 je M alebo Nie;
J11 je L, R alebo K;
J12 je G alebo W;
J16 je N, S alebo A;
J18 je M, Nie, L alebo V; J19 je E alebo R; J21 je v, M alebo Nie;
172
J29 je Q alebo A.
29. Zlúčenina podľa nároku 20, kde:
-rN T1 T2 -r 3 T-4 TS T6
J ] G J J J u J J ;
J1 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok; J2 je nefunkčný zvyšok;
J3 je hydrofilný zvyšok;
J4 je acidický zvyšok;
J5 je nefunkčný zvyšok;
Js je bázický zvyšok;
J7 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok;
J8 je nefunkčný zvyšuk; .............
J11 je bázický alebo nefunkčný zvyšok;
J12 je nefunkčný alebo aromatický zvyšok; Jie je nefunkčný alebo hydrofilný zvyšok; J18 je nefunkčný zvyšok;
J19 je acidický alebo bázický zvyšok;
J21 je nefunkčný zvyšok; a Jc je nie je prítomný.
30. Zlúčenina podľa nároku 29, kde:
J1 je A, S alebo Y;
J2 je V;
J3 je S;
J4 je E;
J5 je I;
J6 je Q;
J7 je L alebo F;
J8 je M alebo Nie;
J11 je L, R alebo K;
J12 je G alebo W;
J1S je N, S alebo A;
173
J18 je M, Nie, L alebo V;
J19 je E alebo R;
J21 je V, M alebo Nie.
31. Zlúčenina podľa nároku 20, kde PTH/PTHrP modulujúca doména j e vybraná z tabuľky 1.
32. Zlúčenina podľa nároku 1, kde PTH/PTHrP modulujúca doména má vzorec:
ONLHOloO11O12 * *KSIO15O16LRRRFO23LHHLIOc (SEQ ID NO: 5) kde:
0N nie je prítomný alebo je YO1O2O3O4O5O6O7, O1O2O3O4O5O6O7,
020304050607, O3O4O5O6O7, O4O5O6O7, O5O6O7, 0607 alebo O7;
O1 je aminokyselinový zvyšok;
O2 je amínokyselinový zvyšok;
O3 je amínokyselinový zvyšok;
O4 je amínokyselinový zvyšok;
O5 je amínokyselinový zvyšok;
O6 je amínokyselinový zvyšok;
O7 je amínokyselinový zvyšok;
O10 je amínokyselinový zvyšok;
O11 je amínokyselinový zvyšok;
O12 je amínokyselinový zvyšok;
O15 je amínokyselinový zvyšok;
O16 je amínokyselinový zvyšok;
O17 je amínokyselinový zvyšok;
O23 je amínokyselinový zvyšok; Oc nie je prítomný alebo je O O2903°031032033, O29O3°O31O32O33O34,
O29O3°O31O32O33O34O35O36; a
O29O30, o29o3Oo3\
O29O3°O31O32,
O29O3°O31O32O33O34O35 alebo
174
O29 až Ο* 34 35 36 sú každý nezávisle amínokyselinový zvyšok.
33. Zlúčenina podľa nároku 27, kde:
0N je O7;
O7 je nefunkčný zvyšok;
O10 je acidický alebo hydrofilný zvyšok;
O11 je bázický alebo nefunkčný zvyšok;
O12 je aromatický alebo nefunkčný zvyšok;
O15 je hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok;
O16 je hydrofilný zvyšok;
O17 je acidický alebo nefunkčný zvyšok;
01θ je aromatický zvyšok; a uc nie. je prítomný.
34. Zlúčenina podľa nároku 23, kde:
0N je O1O2O3O4O5O6O7;
O1 je nefunkčný amínokyselinový zvyšok;
O2 je nefunkčný amínokyselinový zvyšok;
O3 je hydrofilný amínokyselinový zvyšok;
O4 je acidický amínokyselinový zvyšok;
O5 je bázický alebo nefunkčný amínokyselinový zvyšok; O6 je hydrofilný amínokyselinový zvyšok;
O7 je nefunkčný zvyšok;
O10 je acidický alebo hydrofilný zvyšok;
O11 je bázický alebo nefunkčný zvyšok;
O12 je aromatický alebo nefunkčný zvyšok;
O13 je hydrofilný alebo nefunkčný zvyšok;
O16 je hydrofilný zvyšok; a
O17 je acidický alebo nefunkčný zvyšok; a O23 je aromatický zvyšok.
35. Zlúčenina podľa nároku 34, kde:
O1 je A;
175
O2 je V;
O3 je S;
O4 je E;
O5 je H alebo I; o6 je Q;
O7 je L;
O10 je N alebo D;
O11 je K alebo L;
O12 je C, F alebo W;
O15 je I alebo S;
O16 je Q alebo N;
O17 je D alebo L; o33 je f alebo w. :
36. Zlúčenina podľa nároku 27, kde PTH/PTH-rP modulujúca doména je vybraná z tabuľky 2.
37. Zlúčenina podľa nároku 1, kde PTH/PTHrP modulujúca doména má aminokyselinovú sekvenciu TIP39.
38. Zlúčenina podľa nároku 1 obsahujúca sekvenciu vybranú z tabuľky 4.
39. Prostriedok vyznačujúci sa tým, že obsahuje peptid vybraný zo skupiny zahŕňajúcej SEQ ID NOS: 17, 18, 19 a 69.
40. Nukleová kyselina vyznačujúca sa tým, že kóduje zlúčeninu podľa nároku 1.
41. Nukleová kyselina vyznačujúca sa tým, že kóduje zlúčeninu podľa nároku 7.
176
42. Nukleová kyselina vyznačujúca sa tým, že kóduje zlúčeninu podl'a nároku 20.
43. Nukleová kyselina vyznačuj úca kóduje zlúčeninu podľa nároku 32.
tým, že
44. Nukleová kyselina vyznačuj úca kóduje zlúčeninu podľa nároku 39.
sa t ý m, že
45. Expresný vektor vyznačuj úci obsahuje DNA podľa nároku 40.
sa t ý m, že
4ΈΙ Expresný vektor vyznačuj uci š-ä tým, že obsahuje DNA podľa nároku 41.
47. Expresný vektor vyznaču obsahuje DNA podľa nároku 42.
úci sa t ý m, že
48. Expresný vektor vyznačuj úci obsahuje DNA podl'a nároku 43.
sa t ý m, že
49. Expresný vektor vyznačuj obsahuje DNA podl'a nároku 44.
úci sa t ý m, že
50. Hostiteľská bunka vyznačuj úca obsahuje Expresný vektor podľa nároku 45.
sa t ý m, že
51. Hostiteľská bunka vyznačuj úca obsahuje Expresný vektor podľa nároku 46.
sa t ý m, že
52. Hostiteľská bunka vyznačujúca sa obsahuje Expresný vektor podľa nároku 47.
tým, že
177
53. Hostiteľská bunka vyznačujúca sa tým, že obsahuje Expresný vektor podľa nároku 48.
54. Hostiteľská bunka vyznačujúca sa tým, že obsahuje Expresný vektor podľa nároku 49.
55. Bunka podľa nároku 50 vyznačujúca sa tým, že sa jedná o bunku E. coli.
56. Bunka podľa nároku 51 vyznačujúca sa tým, že sa jedná o bunku E. coli.
57. Bunka podľa nároku 52 vy značujúcä š~a tým, že sa jedná o bunku E. coli.
58. Bunka podľa nároku 53 vyznačujúca sa tým, že sa jedná o bunku E. coli.
59. Spôsob na prípravu antagonistu PTH/PTHrP receptora vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:
a) výber aspoň jedného peptidu, ktorý sa viaže na receptor; a
b) prípravu farmakologického činidla obsahujúceho aspoň jednu Fc doménu kovalentne naviazanú na aspoň jednu amínokyselinovú sekvenciu vybraného peptidu alebo peptidov.
60. Spôsob podľa nároku 59vyznačujúci sa tým, že peptid je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej SEQ ID NOS: 3, 4 a 5.
61. Spôsob podľa nároku 59 vyznačujúci sa tým, že peptid je vybraný v procese zahŕňajúcom skríning fágové zobrazovacie knižnice, E. coli zobrazovacie knižnice,
178' ribozomálne knižnice, RNA-peptidové knižnice alebo knižnice chemických peptidov.
62. Spôsob podľa nároku 59 vyznačujúci sa tým, že príprava farmakologického činidla je uskutočnená:
a) prípravou génového konštruktu obsahujúceho nukleovú kyselinu kódujúcu vybraný peptid a nukleovú kyselinu kódujúcu Fc doménu; a
b) expresiu génového konštruktu.
63. Spôsob podľa nároku 59vyznačujúci sa tým, že génový konštrukt je exprimovaný v bunke E. coli.
64. Spôsob podľa nároku 59 vyznačujúci sa tým, že výber peptidu je uskutočnený spôsobom zahŕňajúcim:
a) prípravu génového konštruktu obsahujúceho nukleovú kyselinu kódujúcu prvý vybraný peptid a nukleovú kyselinu kódujúcu Fc doménu;
b) uskutočnenie polymerázovej reťazovej reakcie za použitia génového konštruktu a mutagénnych primérov, kde
i) prvý mutagénny primér obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny komplementárnu k sekvencii na alebo blízko 5' konca kódujúceho reťazca génového konštruktu, a ii) druhý mutagénny primér obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny komplementárnu k 3' koncu nekódujúceho reťazca génového konštruktu.
65. Spôsob na liečbu osteopénie vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie PTH agonistu a inhibítora resorpcie kosti, kde PTH agonista obsahuje zlúčeninu podľa nároku 1.
179
66. Spôsob na liečbu osteopénie vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie PTH agonistu a inhibítora resorpcie kosti, kde PTH agonista obsahuje zlúčeninu podľa nároku 7.
67. Spôsob na liečbu osteopénie vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie PTH agonistu a inhibítora resorpcie kosti, kde PTH agonista obsahuje zlúčeninu podľa nároku 20.
68. Spôsob na liečbu osteopénie vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie PTH agonistu a inhibítora resorpcie kosti, kde PTH agonista obsahuje zlúčeninu podľa nároku 32.
12/13
Obr. 12
Efekt jednej sc dávky ΡΤΗμ.^ FC na vápnik vápnik (mg/dL) čas (h)
0 zviera# 1 dávka 1 pg/kg zviera # 2 dávka 3 pg/kg —O—zviera #3 dávka 10 pg/kg —O— zviera #4 dávka 30 pg/kg —A— zviera # 5 dávka 100 pg/kg • zviera # 6 dávka 300 pg/kg T 'Zviera #7 dávka 1000 pg/kg —(-í— zviera # 8 dávka 100 pgďcg —0— zviera # 9 dávka 30 pg/kg —·— zviera # 10 dávka 300 pg/kg
SK1520-2002A 2000-04-27 2001-04-27 Modulátory receptorov pre hormón príštitných teliesok a proteín príbuzný s hormónom príštitných teliesok SK15202002A3 (sk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20005300P 2000-04-27 2000-04-27
US21486000P 2000-06-28 2000-06-28
US26667301P 2001-02-06 2001-02-06
US09/843,221 US6756480B2 (en) 2000-04-27 2001-04-26 Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
PCT/US2001/013528 WO2001081415A2 (en) 2000-04-27 2001-04-27 Parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein antagonists

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK15202002A3 true SK15202002A3 (sk) 2003-06-03

Family

ID=27498365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1520-2002A SK15202002A3 (sk) 2000-04-27 2001-04-27 Modulátory receptorov pre hormón príštitných teliesok a proteín príbuzný s hormónom príštitných teliesok

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6756480B2 (sk)
EP (1) EP1276767A2 (sk)
JP (1) JP2004500838A (sk)
KR (1) KR20030004375A (sk)
CN (1) CN1439021A (sk)
AU (2) AU2001257321B2 (sk)
BG (1) BG107242A (sk)
BR (1) BR0110391A (sk)
CA (1) CA2407493A1 (sk)
CZ (1) CZ20023496A3 (sk)
EA (1) EA200201121A1 (sk)
HK (1) HK1052939A1 (sk)
HU (1) HUP0300465A3 (sk)
IL (1) IL152384A0 (sk)
MX (1) MXPA02010589A (sk)
NO (1) NO20025143L (sk)
SK (1) SK15202002A3 (sk)
WO (1) WO2001081415A2 (sk)

Families Citing this family (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4486256B2 (ja) * 1998-10-22 2010-06-23 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の生物活性ペプチドおよびペプチド誘導体
US6689566B1 (en) * 1999-01-14 2004-02-10 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods, kits, and antibodies for detecting parathyroid hormone
US7820393B2 (en) * 1999-01-14 2010-10-26 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods, kits and antibodies for detecting parathyroid hormone
WO2001023521A2 (en) * 1999-09-29 2001-04-05 The General Hospital Corporation Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth)
US20020090646A1 (en) * 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
WO2003009804A2 (en) * 2001-07-23 2003-02-06 The General Hospital Corporation Conformationally constrained parathyroid hormone (pth) analogs
US20050032685A1 (en) * 2001-09-17 2005-02-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedies for bone loss
US7737260B2 (en) * 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof
US7247609B2 (en) 2001-12-18 2007-07-24 Universitat Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
EP1531855A4 (en) * 2002-01-10 2009-07-22 Osteotrophin Llc TREATMENT OF BONE DISEASES WITH SKELETTAL ANABOLIKA
EP1477496A4 (en) * 2002-02-01 2006-08-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PEG BINDING PTH OR PEG BINDING PTH DERIVATIVE
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
TW200307553A (en) * 2002-05-24 2003-12-16 Akzo Nobel Nv Treatment of post-menopausal complaints in breast cancer patients
US7378495B2 (en) 2002-10-21 2008-05-27 Pevion Biotech, Ltd. PTH-rP related peptide cancer therapeutics
WO2004060386A1 (en) * 2002-11-01 2004-07-22 Amgen, Inc. Modulators of receptors for parathyrois hormone and parathyroid hormone-related protein
US8088734B2 (en) 2003-01-21 2012-01-03 Unigene Laboratories Inc. Oral delivery of peptides
WO2004093902A1 (en) * 2003-03-19 2004-11-04 The General Hospital Corporation CONFORMATIONALLY CONSTRAINED PARATHYROID HORMONES WITH α-HELIX STABILIZERS
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
DE602004031390D1 (de) 2003-05-06 2011-03-24 Syntonix Pharmaceuticals Inc Gerinnungsfaktor VII-Fc chimäre Proteine zur Behandlung von hämostatischen Krankheiten
AU2016244273B2 (en) * 2003-05-06 2018-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
WO2005009358A2 (en) 2003-07-17 2005-02-03 The General Hospital Corporation Conformationally constrained parathyroid hormone (pth) analogs
US7318925B2 (en) * 2003-08-08 2008-01-15 Amgen Fremont, Inc. Methods of use for antibodies against parathyroid hormone
JP2007521232A (ja) 2003-08-08 2007-08-02 アブジェニックス・インコーポレーテッド 副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）に対する抗体およびその使用
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
WO2005090404A2 (en) * 2004-03-19 2005-09-29 Zelos Therepeutics, Inc. Compositions and methods for detecting cyclic analogs of human parathyroid hormone (hpth)
US20060127320A1 (en) * 2004-05-10 2006-06-15 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Method of delivering parathyroid hormone to a human
US7244709B2 (en) * 2004-05-10 2007-07-17 Nastech Pharamecutical Company Inc. Compositions and methods for enhanced mucosal delivery of parathyroid hormone
US20060052305A1 (en) * 2004-05-10 2006-03-09 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Method of treating osteoporosis using intranasal parathyroid hormone
US9387235B2 (en) * 2004-06-14 2016-07-12 Basf Beauty Care Solutions France S.A.S. Cosmetic preparations containing PTH fragments
KR100754667B1 (ko) * 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
US8168592B2 (en) * 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
US20070173447A1 (en) * 2005-10-25 2007-07-26 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Method for treating osteoporosis by intranasal delivery of teriparatide with an anti-resorptive agent
WO2007059470A2 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 Board Of Control Of Michigan Technological University Black bear parathyroid hormone and methods of using black bear parathyroid hormone
PE20070684A1 (es) 2005-11-14 2007-08-06 Amgen Inc MOLECULAS QUIMERICAS DE ANTICUERPO RANKL-PTH/PTHrP
US20080051332A1 (en) * 2005-11-18 2008-02-28 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Method of modulating hematopoietic stem cells and treating hematologic diseases using intranasal parathyroid hormone
WO2008019062A2 (en) * 2006-08-04 2008-02-14 The General Hospital Corporation Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth)
US7803770B2 (en) 2006-10-03 2010-09-28 Radius Health, Inc. Method of treating osteoporosis comprising administration of PTHrP analog
USRE49444E1 (en) 2006-10-03 2023-03-07 Radius Health, Inc. Method of treating osteoporosis comprising administration of PTHrP analog
KR101512377B1 (ko) * 2006-10-03 2015-04-28 라디우스 헬쓰, 인코포레이티드 골 아나볼릭 단백질을 위한 약물 전달 방법
WO2008048784A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-24 Eli Lilly And Company Pegylated pth as pth receptor modulators and uses thereof
EP3345607B1 (en) * 2006-12-29 2022-10-26 Ossifi-Mab LLC Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
US20090023655A1 (en) * 2007-04-02 2009-01-22 Louis Luttrell Biased Ligands for Receptors Such as the PTH Receptor
EP2162540A2 (en) 2007-05-22 2010-03-17 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
US8568737B2 (en) 2007-08-01 2013-10-29 The General Hospital Corporation Screening methods using G-protein coupled receptors and related compositions
JP5570989B2 (ja) * 2007-08-31 2014-08-13 アムジエン・インコーポレーテツド 固体タンパク質製剤
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
WO2009083544A2 (en) 2007-12-28 2009-07-09 Kuros Biosurgery Ag Pdgf fusion proteins incorporated into fibrin foams
MX2011000861A (es) 2008-07-23 2011-06-21 Hanmi Holdings Co Ltd Un complejo polipeptidico que consiste en un polimero no-peptidil que posee tres terminaciones funcionales.
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
MX347291B (es) 2009-03-20 2017-04-17 Amgen Inc Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas.
US8563513B2 (en) * 2009-03-27 2013-10-22 Van Andel Research Institute Parathyroid hormone peptides and parathyroid hormone-related protein peptides and methods of use
JPWO2011030774A1 (ja) * 2009-09-09 2013-02-07 旭化成ファーマ株式会社 １回当たり１００〜２００単位のｐｔｈが週１回投与されることを特徴とする、ｐｔｈ含有骨粗鬆症治療／予防剤
AU2010310457B2 (en) 2009-10-23 2015-07-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
JP2013512688A (ja) 2009-12-07 2013-04-18 ミシガン テクノロジカル ユニバーシティ クロクマの副甲状腺ホルモン及びクロクマの副甲状腺ホルモンを使用する方法
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
JP5941040B2 (ja) 2010-05-13 2016-06-29 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 副甲状腺ホルモン類似体およびその使用
RS54291B2 (sr) 2010-06-07 2023-12-29 Amgen Inc Uređaj za isporuku lekova
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
EA201370076A1 (ru) 2010-09-22 2013-08-30 Амген Инк. Иммуноглобулины-переносчики и их применение
RU2606016C2 (ru) 2011-01-14 2017-01-10 Редвуд Байосайнс, Инк. Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
PL2699293T3 (pl) 2011-04-20 2019-08-30 Amgen Inc. Urządzenie do wstrzykiwania automatycznego
DK3045189T3 (en) 2011-10-14 2018-06-18 Amgen Inc Injector and mounting method
JP6158090B2 (ja) * 2011-10-31 2017-07-05 ダニエル・ジェイ・カポン 非ペプチドヒンジ部含有フレキシブル抗体様分子
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
EP3391899B1 (en) 2011-12-14 2020-07-15 The Board of Trustees of the University of Arkansas Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein
KR101895047B1 (ko) 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
AR091902A1 (es) 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
ES2780395T3 (es) 2012-11-21 2020-08-25 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos
US10092703B2 (en) 2013-03-15 2018-10-09 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
JP6768501B2 (ja) 2013-03-15 2020-10-14 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入機、および自動注入機システム
BR112015024282B1 (pt) 2013-03-22 2022-05-17 Amgen Inc Injetor e método de montagem do injetor
US20200354428A9 (en) * 2013-06-23 2020-11-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Analogues of parathyroid hormone (1-34) that function as agonists of the parathyroid hormone receptor-1 and display modified activity profiles
WO2015057836A2 (en) * 2013-10-15 2015-04-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Bone anabolic parathyroid hormone and parathyroid hormone related-protein analogs
US10758683B2 (en) 2013-10-24 2020-09-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
CN105873626A (zh) 2013-10-24 2016-08-17 美国安进公司 注射器和组装方法
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
JP6640113B2 (ja) 2014-05-07 2020-02-05 アムジエン・インコーポレーテツド 衝撃低減要素を有する自動注入器
CA2949846C (en) 2014-06-03 2023-09-05 Amgen Inc. Devices and methods for assisting a user of a drug delivery device
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
WO2016100781A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
CA2976935C (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
IL310069A (en) 2015-04-29 2024-03-01 Radius Pharmaceuticals Inc Cancer treatment methods
CN106279424A (zh) * 2015-05-20 2017-01-04 深圳翰宇药业股份有限公司 一种人甲状旁腺激素pth(1-34)融合蛋白及其应用
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
WO2017160799A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017173372A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 The General Hospital Corporation Parathyroid hormone receptor 1 antagonist and inverse agonist polypeptides and methods of their use
CN109071634A (zh) 2016-04-26 2018-12-21 R.P.谢勒技术有限责任公司 抗体偶联物及其制备和使用方法
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
JP7309363B2 (ja) 2016-05-13 2023-07-18 アムジエン・インコーポレーテツド バイアル・スリーブ組立体
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
CN106366176B (zh) * 2016-08-30 2020-02-07 杨德鸿 Pth模拟肽及其应用
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
WO2018129419A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Radius Pharmaceuticals, Inc. Polymorphic forms of rad1901-2hcl
JP2020503976A (ja) 2017-01-17 2020-02-06 アムジエン・インコーポレーテツド 注入デバイスならびに関連する使用および組立方法
JP7397440B2 (ja) 2017-02-10 2023-12-13 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー コラーゲン結合薬剤組成物およびその使用方法
WO2018151890A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
JP7280189B2 (ja) 2017-02-17 2023-05-23 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達装置用の挿入機構
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
WO2018165499A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
CA3052676A1 (en) 2017-03-28 2018-10-04 Amgen Inc. Plunger rod and syringe assembly system and method
US10996208B2 (en) 2017-04-28 2021-05-04 Radius Health, Inc. Abaloparatide formulations and methods of testing, storing, modifying, and using same
CN110709121B (zh) 2017-06-08 2022-06-24 安进公司 扭矩驱动式药物递送装置
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
MA49447A (fr) 2017-06-22 2020-04-29 Amgen Inc Réduction des impacts/chocs d'activation d'un dispositif
EP3641861A1 (en) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
WO2019014014A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Amgen Inc. NEEDLE INSERTION-RETRACTING SYSTEM HAVING DOUBLE TORSION SPRING SYSTEM
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
JP2020528296A (ja) 2017-07-25 2020-09-24 アムジエン・インコーポレーテツド ギヤモジュールを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
IL272636B1 (en) 2017-10-06 2024-06-01 Amgen Inc Drug delivery device with combination assembly and related assembly method
EP3694578A1 (en) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
US11826480B2 (en) 2017-11-03 2023-11-28 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
CA3079197A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
US20200338271A1 (en) 2017-11-06 2020-10-29 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CN116832271A (zh) 2017-11-10 2023-10-03 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
CA3079540A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
JP2021503311A (ja) 2017-11-16 2021-02-12 アムジエン・インコーポレーテツド 失速及び終点検出を有するオートインジェクタ
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
SG11202013177WA (en) 2018-07-04 2021-01-28 Radius Pharmaceuticals Inc Polymorphic forms of rad 1901-2hcl
EP3826699A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
CN112469454B (zh) 2018-07-24 2024-01-26 安进公司 用于施用药物的输送装置
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
EP3829692A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
MA53724A (fr) 2018-09-24 2021-12-29 Amgen Inc Systèmes et procédés de dosage interventionnel
WO2020068476A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CN112805048B (zh) 2018-10-02 2023-09-22 安进公司 具有内部力传递的用于药物递送的注射系统
AR116607A1 (es) 2018-10-05 2021-05-26 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con indicador de dosis
AR116704A1 (es) 2018-10-15 2021-06-02 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con mecanismo de amortiguación
SG11202101824VA (en) 2018-10-15 2021-03-30 Amgen Inc Platform assembly process for drug delivery device
MA54057A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction partielle d'élément d'administration de médicament
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
CN113840625A (zh) * 2019-01-29 2021-12-24 夏尔-Nps医药品有限公司 甲状旁腺激素变体
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
CA3148261A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
KR102144688B1 (ko) 2020-05-20 2020-08-14 이상진 폐스티로폼 재활용 감용장치
WO2022246055A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4423037A (en) 1982-05-13 1983-12-27 The General Hospital Corporation Inhibitors of peptide hormone action
FR2550204B1 (fr) 1983-08-05 1987-11-13 Toyo Jozo Kk Derives peptidiques de (nle8,nle1b, tyr34)-h-pth
JPH02501898A (ja) * 1987-01-27 1990-06-28 バドネイ，ラズロ 穀類の脱穀
US4968669A (en) 1988-05-09 1990-11-06 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5171670A (en) 1989-05-12 1992-12-15 The General Hospital Corporation Recombinant dna method for production of parathyroid hormone
US5087562A (en) 1990-04-25 1992-02-11 Merck & Co., Inc. Humoral hypercalcemic factor antagonists with modification at position 13 . . .
EP0483509B1 (en) 1990-09-28 1995-07-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Synthetic gene coding for human parathyroid hormone
JPH0532696A (ja) * 1990-09-28 1993-02-09 Takeda Chem Ind Ltd 副甲状腺ホルモン誘導体
US5261686A (en) 1992-04-06 1993-11-16 Buckler Clive E Semi-recumbent
EP0579758B1 (en) 1991-04-05 2005-01-26 The General Hospital Corporation Parathyroid hormone receptor and dna encoding same
US5118667A (en) 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
US5434246A (en) 1992-03-19 1995-07-18 Takeda Chemical Industries, Ltd. Parathyroid hormone derivatives
CA2098639A1 (en) 1992-06-19 1993-12-20 K. Anne Kronis Bone stimulating, non-vasoactive parathyroid hormone variants
US5589452A (en) 1992-07-14 1996-12-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Analogs of parathyroid hormone and parathyroid hormone related peptide: synthesis and use for the treatment of osteoporosis
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5556940A (en) * 1994-06-20 1996-09-17 National Research Council Of Canada Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis
US5550134A (en) 1995-05-10 1996-08-27 Eli Lilly And Company Methods for inhibiting bone loss
US5599822A (en) 1995-06-06 1997-02-04 Eli Lilly And Company Methods for minimizing bone loss
US5969095A (en) 1995-07-13 1999-10-19 Biomeasure, Inc. Analogs of parathyroid hormone
US5955574A (en) 1995-07-13 1999-09-21 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, S.A. Analogs of parathyroid hormone
US5723577A (en) 1995-07-13 1998-03-03 Biomeasure Inc. Analogs of parathyroid hormone
ATE304020T1 (de) 1996-07-31 2005-09-15 Gen Hospital Corp Parathyroidhormon-verwandthe peptidanaloge
US6313088B1 (en) 1997-02-07 2001-11-06 Emisphere Technologies, Inc. 8-[(2-hydroxy-4-methoxy benzoyl) amino]-octanoic acid compositions for delivering active agents
US6183974B1 (en) 1997-07-31 2001-02-06 The General Hospital Corporation Screening assays for G protein coupled receptor agonists and antagonists
PL342135A1 (en) 1998-01-29 2001-05-21 Kinerton Ltd Method of obtaining absorbable microparticle
ES2217738T3 (es) 1998-01-29 2004-11-01 Poly-Med Inc. Microparticulas absorbibles.
WO1999046283A1 (en) 1998-03-09 1999-09-16 Zealand Pharmaceuticals A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
EP1093458A4 (en) 1998-04-15 2001-07-18 Aventis Pharm Prod Inc METHOD FOR THE PRODUCTION OF RESIN-TIED CYCLIC PEPTIDES
FR2781231B1 (fr) 1998-07-17 2002-01-25 Sederma Sa Compositions cosmetiques amincissantes
AU749288B2 (en) 1998-09-04 2002-06-20 Aventis Pharmaceuticals Inc. Luciferase reporter bioassay of parathyroid hormone compounds
AU6510999A (en) 1998-10-07 2000-04-26 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, The Methods of screening for apoptosis-controlling agents for bone anabolic therapies and uses thereof
JP4486256B2 (ja) 1998-10-22 2010-06-23 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の生物活性ペプチドおよびペプチド誘導体
DE69942035D1 (de) 1998-11-25 2010-04-01 Gen Hospital Corp Menschliches parathyroidhormon, modifikationen, herstellung und verwendung
JP2003533167A (ja) 1998-11-25 2003-11-11 ザ ゼネラル ホスピタル コーポレーション アミノ末端改変副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）アナログ
WO2000032771A1 (en) * 1998-11-30 2000-06-08 The General Hospital Corporation Pth1r and pth3r receptors, methods and uses thereof
FR2788058B1 (fr) 1998-12-30 2002-01-25 Sederma Sa Compositions cosmetiques amincissantes
WO2000050633A1 (en) 1999-02-24 2000-08-31 The General Hospital Corporation Method for cloning signal transduction intermediates
WO2000077042A2 (en) 1999-06-15 2000-12-21 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Parathyroid hormone receptor ligands
CO5180628A1 (es) 1999-07-31 2002-07-30 Smithkline Beecham Corp Compuestos calcioliticos
ATE412670T1 (de) 1999-09-29 2008-11-15 Gen Hospital Corp Parathyroid hormon (pth) polypeptidderivate
WO2001023521A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 The General Hospital Corporation Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth)

Also Published As

Publication number Publication date
EP1276767A2 (en) 2003-01-22
CZ20023496A3 (cs) 2003-05-14
NO20025143D0 (no) 2002-10-25
BR0110391A (pt) 2003-02-25
AU2001257321B2 (en) 2007-05-17
CA2407493A1 (en) 2001-11-01
NO20025143L (no) 2002-12-23
US20040214996A1 (en) 2004-10-28
JP2004500838A (ja) 2004-01-15
HUP0300465A3 (en) 2009-11-30
BG107242A (en) 2003-06-30
WO2001081415A9 (en) 2002-02-14
IL152384A0 (en) 2003-05-29
MXPA02010589A (es) 2003-03-10
KR20030004375A (ko) 2003-01-14
WO2001081415A3 (en) 2002-11-28
AU5732101A (en) 2001-11-07
US20030039654A1 (en) 2003-02-27
WO2001081415A2 (en) 2001-11-01
CN1439021A (zh) 2003-08-27
HK1052939A1 (zh) 2003-10-03
HUP0300465A2 (hu) 2003-06-28
US6756480B2 (en) 2004-06-29
EA200201121A1 (ru) 2003-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK15202002A3 (sk) Modulátory receptorov pre hormón príštitných teliesok a proteín príbuzný s hormónom príštitných teliesok
AU2001257321A1 (en) Parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein antagonists
US20050124537A1 (en) Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
US6677136B2 (en) Glucagon antagonists
CA2349406C (en) Compositions and methods for the prevention or treatment of cancer and bone loss associated with cancer
EP1290013B1 (en) Apo-ai/aii peptide derivatives
EP1567178A1 (en) Modulators of receptors for parathyrois hormone and parathyroid hormone-related protein
AU2001257173A1 (en) Apo-AI/AII peptide derivatives
US20020090646A1 (en) Calcitonin-related molecules
AU2005237128B2 (en) Compositions and Methods for the Prevention or Treatment of Cancer and Bone Loss Associated with Cancer
MXPA01004461A (en) Compositions and methods for prevention or treatment of cancer and bone loss associated with cancer

Legal Events

Date Code Title Description
FB9A Suspension of patent application procedure