MXPA02010589A - Moduladores de receptores para la hormona para tiroidea y para la proteina relacionada a la hormona paratiroidea. - Google Patents

Moduladores de receptores para la hormona para tiroidea y para la proteina relacionada a la hormona paratiroidea.

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MXPA02010589A
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David Lee Lacey
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Abstract

La presente invencion se refiere a los agentes terapeuticos que modulan la actividad de PTH y PTHrP. De acuerdo con la presente invencion, los moduladores de PHT y PTHrP comprenden: (a) un dominio de modulacion de PTH/PTHrP; y (b) un vehiculo, tal como un polimero (por ejemplo PEG o dextrano) o un dominio Fc, el cual es preferido: en donde el vehiculo esta covalentemente enlazado al extremo C del dominio de modulacion de PTH/PTHrP. El vehiculo y el dominio de modulacion de PTH/PTHrP pueden estar enlazados a traves del extremo N o C del dominio de modulacion de PTH/PTHrP como se describe enseguida. El vehiculo preferido es un dominio Fc, y el dominio Fc preferido es un dominio Fc de IgG. Los dominios de modulacion de PTH/PTHrP preferidos comprenden las secuencias de aminoacidos derivadas de PTH y de PTHrP descritas en la presente. Otros dominios de modulacion de PTH/PTHrP pueden ser generados mediante despliegue de fagos, seleccion de ARN-peptido y las otras tecnicas mencionadas en la presente. Tales peptidos seran tipicamente moduladores de la actividad de PTH/PTHrP, aunque tales tecnicas pueden ser utilizadas para generar secuencias peptidicas que sirven como moduladores selectivos (por ejemplo agonistas de la actividad de PTH pero no de la actividad de PTHrP).

Description

MODULADORES DE RECEPTORES PARA LA HORMONA PARATIROIDEA Y PARA LA PROTEINA RELACIONADA A LA HORMONA PARATIROIDEA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona paratiroidea (PTH) y la proteína relacionada a la hormona paratiroidea (PTHrP) juegan papeles fisiológicos importantes en la homeostasis del calcio y en el desarrollo, respectivamente. La concentración de calcio en la sangre está fuertemente regulada, debido al papel esencial del calcio en el metabolismo celular. La PTH es una hormona endocrina que es secretada de la glándula paratiroidea en respuesta a los niveles de calcio séricos disminuidos. La PTH actúa directamente para incrementar la resorción ósea y para estimular la reabsorción de calcio renal, incrementando de este modo o preservando los almacenes de calcio en circulación. La PTH también incrementa indirectamente la absorción del calcio en el intestino al estimular la hidroxilación renal de la vitamina D. El hiperparatiroidismo primario y secundario son condiciones que están asociadas con niveles excesivos de la hormona paratiroidea en circulación. A través de las vías anteriormente mencionadas, los niveles de PTH en exceso pueden provocar hipercalcemia y osteopenia. Los REF: 143028 inhibidores de la resorción ósea tales como bisfosfonatos y OPG pueden proteger de manera efectiva el hueso y pueden inhibir la contribución del esqueleto a la hipercalcemia. No obstante, los efectos calcémicos del hiperparatiroidismo sobre el riñon e intestino no son enfrentados por la terapia actualmente disponible. La PTHrP es producida por muchos tipos celulares, y juega un papel importante en la regulación del desarrollo del esqueleto. Postnatalmente, los papeles para PTHrP están menos claramente definidos. Los niveles de circulación de PTHrP son esencialmente no detectables en adultos saludables normales. No obstante, muchos tumores de diversos orígenes embriológicos producen y secretan PTHrP en cantidades suficientes para provocar hipercalcemia. De hecho, la hipercalcemia humoral de malignidad (HHM) es el síndrome paraneoplásico más común, el cual explica la morbilidad y mortalidad significativa de los pacientes. Actualmente, la HHM es tratada con hidratación salina, seguida por inhibidores de la resorción ósea tales como bisfosfonatos. Este régimen de tratamiento toma típicamente de 3 a 4 días para lograr reducciones significativas en el calcio sérico, y los efectos son relativamente de vida corta (menos de un mes) . Para pacientes con altos niveles de circulación de PTHrP, los efectos de las opciones actuales de tratamiento son aún menos impresionantes. La administración respectiva de las terapias convencionales es usualmente progresivamente menos efectiva. Estas limitaciones a la terapia actual indican fuertemente una necesidad médica no cumplida para los tratamientos rápidos, efectivos y de larga duración para la HHM. Una razón principal para los beneficios limitados de la terapia contra HHM actual, es la falla para inhibir directamente PTHrP, que está muy bien establecido como el factor patofisiológico principal en HHM. Los inhibidores de la resorción ósea tales como los bisfosfonatos únicamente inhiben la resorción ósea, mientras que la PTHrP también tiene efectos calcémicos significativos sobre el riñon y el intestino. La neutralización total de PTHrP podría ser el procedimiento terapéutico adyuvante, ideal para el tratamiento de la HHM. La PTH y la PTHrP interactúan con el receptor de PTH-1, que explica la mayoría de sus efectos conocidos. Mannstadt et al. (1999), Am. J. Physiol. 277, 5Pt 2. F665-75 (1999) . Únicamente la PTH interactúa con el receptor de PTH-2 recién descubierto. Id. PTHrP puede ser cambiada a un agonista del receptor de PTH-2, no obstante, cambiando dos residuos a los residuos en aquellas posiciones en PTH. Gardella et al. (1996), J. Biol. Chem. 271 (33): 19888-93.
Un fragmento N-terminal de PTH ha sido utilizado como un agente terapéutico. La PTH- (1-84) nativa, administrada intermitentemente, muestra propiedades osteogénicas, y ha sido reconocido por décadas que estas propiedades pueden ser completamente realizadas con el fragmento PTH- (1-34) C-terminalmente truncado. Ambos péptidos se enlazan y activan el receptor de PTH-1 con afinidades similares, provocando la activación de la adenilato-ciclasa (AC) así como la fosfolipasa C (PLC) . La activación de la AC a través del receptor de PTH-1 genera AMP cíclico (cAMP) , mientras que la activación de PLC a través del receptor de PTH-1 genera PKC y transitorios de calcio intracelular. PTH- (1-34) puede activar de manera máxima la AC y las vías de la PLC. Se ha demostrado que los efectos anabólicos de PTH- (1-34) requieren exposiciones intermitentes cortas (diarias) Dobnig (1998) , Endocrinol . 138: 4607-12. En humanos, las pruebas sobre mujeres postmenopaúsicas, con la inyección subcutánea diaria de bajas dosis de PTH(l-34), mostraron que dan como resultado formación ósea impresionante en la espina dorsal y en el cuello femoral, con reducción significativa en la incidencia de fracturas vertebrales. Estos datos clínicos revelan que PTH es uno de los agentes más eficaces probados para la osteoporosis. Los fragmentos de PTH truncados han disminuido la activación de AC/cAMP y la actividad anabólica similarmente disminuida. Rixon et al. (1994), J. Bone Min. Res. 9: 1179-89; Hilliker et al. (1996), Bone 19: 469-477; Lañe et al. (1996), J. Bone Min. Res. 11: 614-25. Tales fragmentos de PTH truncados tienen esta actividad disminuida (Rixon et al. (1994); Hilliker et al. (1996); Lañe et al. (1996) incluso si éstos mantienen agonismo completo hacia PKC. Rixon et al., (1994). Estas observaciones han conducido a la proposición de que la vía de AC/cAMP es crítica para las propiedades anabólicas óseas de PTH, mientras que la vía de PLC/PKC es prescindible a este respecto. Rixon et al., (1994); Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 53: 81-7. Una teoría opuesta, pero no mutuamente exclusiva, sugiere que la activación de PLC (además de AC) debe también ser una propiedad importante de los fragmentos de PTH anabólicos. Takasu (1998), Endocrinol . 139: 4293-9. La ausencia aparente de la activación de PLC por algunos péptidos de PTH C-terminalmente truncados, anabólicos, puede ser un artefacto de métodos de ensayo insensibles, combinados con el menor enlace al receptor. Takasu (1998) . Los truncamientos progresivos desde el extremo C de PTH- (1-34) dan como resultado reducciones graduales en la afinidad de enlace para PTH1R (Takasu 1998) . La activación de PKC a través del receptor de PTH-1 parece ser agudamente sensible a la afinidad de enlace y a la densidad del receptor (Guo et al. (1995), Endocrinol 136: 3884-91), mientras que la activación de cAMP es menos sensible a estas variables. Como tal, hPTH- (1-31) tiene una afinidad ligeramente reducida (1 a 6 veces) para el receptor de PTH-1 en comparación a hPTH- (1-34) , mientras que hPTH- (1-30) tiene una afinidad significativamente reducida (10-100 veces) (Takasu 1998) . Quizás, debido a esta afinidad disminuida por el receptor de PTH-1, PTH- (1-30) es un agonista débil e incompleto para la activación de PLC vía el receptor de PTH-1 de rata. En comparación a PTH- (1-34) , PTH- (1-31) tiene un potencial anabólico similar o ligeramente reducido (Rixon et al. (1994); Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 53: 81-7; Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 65: 143-7), la afinidad de enlace para PTH1R, y la inducción de cAMP (Takasu (1998)). PTH- (1-31) también tiene activación de PLC ligeramente reducida.
(Takasu (1998)). En humanos saludables, la infusión de PTH- (1-31) y PTH- (1.-34) tiene efectos estimuladores similares sobre la concentración del cAMP plasmático y en orina, pero de manera contraria a PTH- (1-34) , PTH- (1-31) falló en elevar el calcio en suero, y los niveles plasmáticos de l,25(OH)2D3, o de N-TX en orina. Fraher et al. (1999), J. Clin. Endocrin. Met. 84: 2739-43. Estos datos sugieren que PTH- (1-31) tiene capacidad disminuida para inducir la resorción ósea y para la estimulación de la síntesis de vitamina D, lo cual es un perfil favorable para los agentes anabólicos óseos. PTH- (1-30) ha mostrado inicialmente que carece de propiedades anabólicas Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 53: 81-7. Más recientemente, no obstante, se ha demostrado que PTH- (1-30) es anabólico cuando se administra a dosis muy altas (400-2,000 µg/kg versus 80 µg/kg para PTH- (1-34) ) . La menor potencia de PTH- (1-30) podría ser predicha por su menor afinidad de enlace para el receptor de PTH-1, su activación de cAMP disminuida, y/o a su activación de PKC disminuida en gran medida. Takasu (1998) . Queda por ser determinado si PTH- (1-30) tiene una reducción similar o aún más deseable en la actividad de resorción ósea aparente. PTH- (1-28) es el fragmento reportado más pequeño para activar completamente a cAMP. Neugebauer et al. (1995), Biochem. 34: 8835-42. ?o obstante, hPTH- (1-28) fue inicialmente reportada como carente de efectos osteogénicos sobre ratas OVX. Miller et al. (199/), J. Bone Min. Res. 12: S320 (Extracto). Recientemente, una dosis muy alta de PTH- (1-28) (1,000 µg/kg/día) mostró que es anabólica en ratas OVX, mientras que 200 µg/kg/día no fueron efectivos. Whitfield et al. (2000), J. Bone Min. Res. 15: 964-70. Los efectos anabólicos disminuidos o ausentes de algunos fragmentos de PTH truncados han sido atribuidos al despejo rápido in vivo . Rixon et al. (1994) . Las proteínas recombinantes y modificadas son una clase naciente de agentes terapéuticos. Las modificaciones útiles de los agentes terapéuticos proteicos incluyen la combinación con el dominio "Fc" de un anticuerpo y el enlace a los polímeros tales como el polietilenglicol (PEG) y dextrano. Tales modificaciones son discutidas con detalle en una solicitud de patente titulada "Péptidos Modificados como Agentes Terapéuticos", solicitud de los Estados Unidos No. de Serie 09/428,082, solicitud del PCT No . WO99/25044, que es incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. Un procedimiento muy diferente al desarrollo de los agentes terapéuticos es la selección de bibliotecas de péptidos. La interacción de un ligando proteico con su receptor frecuentemente tiene lugar en una interfaz relativamente grande. ?o obstante, como es demostrado para la hormona humana del crecimiento y su receptor, únicamente unos pocos residuos clave en la interfaz contribuyen a la mayor parte de la energía de enlace. Claxon et al. (1995), Science 267: 383-6. El gran volumen del ligando proteico muestra meramente los epítopes de enlace en la topología correcta, o sirve funciones no relacionadas al enlace. De este modo, las moléculas únicamente de longitud de "péptido" (2 a 40 aminoácidos) pueden enlazarse a la proteína receptora de un ligando proteico grande, dado. Tales péptidos pueden imitar la bioactividad del ligando proteico grande ("agonistas peptídicos") o, a través del enlace competitivo, inhiben la bioactividad del ligando proteico grande ("antagonistas peptídicos"). Las bibliotecas de péptidos de despliegue de fagos han emergido como un método poderoso en la identificación de tales agonistas y antagonistas peptídicos. Ver, por ejemplo, Scott et al. (1990), Science 249: 386; Devlin et al. (1990), Science 249: 404; Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409, expedida el 29 de junio de 1993; Patente de los Estados Unidos No. 5,733,731, expedida el 31 de marzo de 1998; Patente de los Estados Unidos No. 5,498,530, expedida el 12 de marzo de 1996; Patente de los Estados Unidos No. 5,432,018, expedida el 11 de julio de 1995; Patente de los Estados Unidos No. 5, 338,.665, expedida el 16 de agosto de 1994; Patente de los Estados Unidos No. 5,922,545, expedida el 13 de julio de 1999; WO96/40987, publicada el 19 de diciembre de 1996; y W098/15833, publicada el 16 de abril de 1998 (cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) . En tales bibliotecas, las secuencias peptídicas aleatorias son desplegadas mediante fusión con las proteínas de recubrimiento del fago filamentoso. Típicamente, los péptidos desplegados son eluidos por afinidad contra un dominio extracelular inmovilizado con anticuerpo de un receptor. Los fagos retenidos pueden ser enriquecidos mediante rondas sucesivas de purificación y repropagación de afinidad. Los mejores péptidos de enlace pueden ser secuenciados para identificar los residuos clave dentro de una o más familias de péptidos estructuralmente relacionados. Ver, por ejemplo, Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, en la cual fueron identificadas dos familias distintas. Las secuencias peptídicas pueden también sugerir cuáles residuos pueden ser reemplazados de manera segura por selección de alanina o mediante mutagénesis al nivel de ADN. Las bibliotecas de mutagénesis pueden ser creadas y seleccionadas para optimizar adicionalmente la secuencia de los mejores enlazadores. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24. El análisis estructural de la interacción proteína-proteína puede también ser utilizado para sugerir los péptidos que imitan la actividad de enlace de los ligandos proteicos grandes. En tal análisis, la estructura cristalina puede sugerir la identidad y orientación relativa de los residuos críticos del ligando proteico grande, a partir del cual puede ser diseñado un péptido.
Ver, por ejemplo, Takasaki et al. (199/), Nature Biotech. 15: 1266-70. Estos métodos analíticos pueden también ser utilizados para investigar la interacción entre una proteína receptora y los péptidos seleccionados por despliegue de fago, los cuales pueden sugerir la modificación adicional de los péptidos para incrementar la afinidad de enlace . Otros métodos compiten con el despliegue de fago en la investigación de los péptidos. Una biblioteca peptídica puede ser fusionada al extremo carboxilo del represor lac y expresado en E. coli . Otro método basado en E. coli muestra el despliegue sobre la membrana exterior de la célula mediante fusión con la lipoproteína asociada al peptidoglucano (PAL) . De aquí en adelante, éstos y otros métodos relacionados son colectivamente denominados como "despliegue de E. coli " . En otro método más, la traducción del ARN aleatorio es interrumpida antes de la liberación del ribosoma, dando como resultado una biblioteca de polipéptidos con su AR? asociado todavía enlazado. De aquí en adelante, éstos y otros métodos relacionados son colectivamente denominados como "despliegue de ribosoma" . Otros métodos emplean péptidos ligados al AR?; por ejemplo, la tecnología de PROfusion, Phylos, Inc. Ver, por ejemplo, Roberts & Szostak (1997), Proc. Nati . Acad. Sci. EUA, 94: 12297-303. De aquí en adelante, éstos y otros métodos relacionados son colectivamente denominados como "selección de ARN-péptido" . Las bibliotecas peptídicas químicamente derivadas han sido desarrolladas, en las cuales los péptidos son inmovilizados sobre materiales no biológicos, estables, tales como varillas de polietileno o resinas permeables al solvente. Otra biblioteca peptídica químicamente derivada utiliza fotolitografía para seleccionar los péptidos inmovilizados sobre portaobjetos de vidrio. De aquí en adelante, éstos y otros métodos relacionados son colectivamente denominados como "selección químico-peptídica" . La selección químico-peptídica puede ser ventajosa ya que ésta permite el uso de D-aminoácidos y otros análogos no naturales, así como elementos no peptídicos. Los métodos biológicos y químicos son revisados en Wells & Lowman (1992) , Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62. Conceptualmente, se pueden descubrir los miméticos peptídicos de cualquier proteína utilizando selección de ARN-péptido, y los otros métodos mencionados anteriormente .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los agentes terapéuticos que modulan la actividad de PTH y PTHrP. De acuerdo con la presente invención, los moduladores de PTH Y PTHrP comprenden: a) un dominio de modulación de PTH/PTHrP, preferentemente la secuencia de aminoácidos de PTH/PTHrP que modula los dominios de PTH y/o PTHrP, o las secuencias derivadas de éstas mediante despliegue de fagos, la selección de ARN-péptido , o las otras técnicas mencionadas anteriormente; y b) un vehículo, tal como un polímero (por ejemplo, PEG o dextrano) o un dominio Fc, el cual es preferido; en donde el vehículo está covalentemente enlazado al extremo carboxílo del dominio de modulación PTH/PTHrP. El vehículo preferido es un dominio Fc y el dominio Fc preferido es un dominio Fc de IgG. Los dominios de modulación de PTH/PTHrP preferidos comprenden las secuencias de aminoácidos derivadas de PTH y PTHrP descritas posteriormente en la presente. Otros dominios de modulación de PTH/PTHrP pueden ser generados mediante despliegue de fagos, selección de ARN-péptido y las otras técnicas mencionados en la presente. Tales péptidos serán típicamente antagonistas de PTH y PTHrP, aunque tales técnicas pueden ser utilizadas para generar las secuencias peptídicas que sirven como inhibidores selectivos (por ejemplo, los inhibidores de PTH pero no PTHrP) . Además, de acuerdo con la presente invención, se muestra un proceso para la elaboración de los moduladores de PTH y de PTHrP, que comprende : a) la selección de al menos un péptido que se enlaza al receptor de PTH-1 o al receptor de PTH-2; y b) el enlace covalente del péptido a un vehículo. El vehículo preferido es un dominio Fc. El paso (a) es preferentemente llevado a cabo mediante selección a partir de las secuencias peptídicas en las Tablas 1 y 2 mostradas posteriormente, o a partir del despliegue de fago, la selección de ARN-péptido , y las otras técnicas mencionadas en la presente. Los compuestos de esta invención pueden ser preparados mediante métodos sintéticos estándares, técnicas de AD? recombinantes, o cualesquiera otros métodos de preparación de péptidos y de proteínas de fusión. Los compuestos de esta invención que abarcan las porciones no peptídicas pueden ser sintetizados mediante reacciones estándares de química orgánica, además de las reacciones estándares de química de los péptidos, cuando sea aplicable . El uso principal contemplado para los compuestos de esta invención es como agentes terapéuticos o profilácticos. El péptido enlazado al vehículo puede tener actividad comparable a -o incluso mayor que- el ligando natural mimetizado por el péptido. Los compuestos de esta invención pueden ser utilizados para fines terapéuticos o profilácticos, al formularlos con materiales portadores farmacéuticos, apropiados, y administrando una cantidad efectiva a un paciente, tal como un humano (u otro mamífero) en necesidad del mismo. Otros aspectos relacionados son también incluidos en la presente invención. De interés particular en la presente invención están las moléculas que comprenden dominios de modulación de PTH/PTHRP que tienen una secuencia C-terminal de PTH, acortada, tal como PTH- (1-28) o (1-34). La técnica anterior no muestra estudios anabólicos que utilicen la administración de duración sostenida de tales fragmentos de PTH C-terminalmente truncados. Aunque la técnica no lo sugiere, las moléculas que comprenden fragmentos más pequeños tales como PPT- (1-30) -Fc pueden ser anabólicos por sí mismos. A pesar de su débil agonismo a su PLC (ver Antecedentes de la Invención; hPTH-(l-30) es casi tan efectiva en la estimulación de cAMP como lo es hPTH- (1-34) . Mientras que no se desea estar constreñido por la teoría, los inventores notan que las propiedades anabólicas de los fragmentos de PTH pueden ser selectivamente relacionadas a su activación de cAMP, en vez de la activación de PLC, de modo que los fragmentos de PTH con afinidad reducida por el receptor tendrán un perfil anabólico favorable. Es posible que la exposición continua a los fragmentos de PTH truncados pudiera tener un efecto diferente y más favorable sobre el hueso en comparación a la exposición continua a PTH- (1-34) o PTH- (1-84) que ha sido demostrado en humanos por Fraher et al. (1999) . Numerosos aspectos y ventajas adicionales de la presente invención se volverán aparentes a partir de la consideración de las figuras y de la descripción detallada de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los dímeros Fc ejemplares que pueden ser derivados de un anticuerpo IgGl . "Fc" en la figura representa cualquiera de las variantes de Fc dentro del significado del "dominio de Fc" en la presente. "X1" y "X2" representan péptidos o combinaciones ligador-péptido como se definen posteriormente en la presente . Los dímeros específicos son como sigue: A: Dímeros simples enlazados por puentes disulfuro. Anticuerpos IgGl tienen típicamente dos enlaces disulfuro en la región de bisagra entre los dominios constante y variable . El dominio Fc en la Figura 1A puede ser formado mediante truncamiento entre los dos sitios de enlace disulfuro o mediante sustitución de un residuo de cisteinilo con un residuo no reactivo (por ejemplo, alanilo) . En la Figura ÍA, el dominio Fc está enlazado en el extremo C del péptido. B: Dímeros enlazados por doble puente disulfuro. Este dominio Fc puede ser formado mediante truncamiento del anticuerpo progenitor para retener los residuos de cisteinilo en las cadenas del dominio Fc, o mediante expresión a partir de una construcción que incluye una secuencia que codifica para tal dominio Fc . En la Figura IB, el dominio Fc está enlazado en el extremo C del péptido. C: Dímeros no covalentes. Este dominio Fc puede ser formado mediante la eliminación de residuos de cisteinilo ya sea mediante truncamiento o sustitución. Se puede desear eliminar los residuos de cisteinilo para evitar impurezas formadas por la reacción del residuo de cisteinilo con residuos de cisteinilo de otras proteínas presentes en la célula huésped. El enlace no covalente de los dominios Fc es suficiente para mantener junto el dímero. Pueden ser formados otros dímeros mediante el uso de dominios Fc derivados de diferentes tipos de anticuerpos (por ejemplo, IgG2 , IgM) .
La Figura 2 muestra la estructura de compuestos adicionales de la invención. La Figura 2A muestra una molécula de cadena simple y puede también representar la construcción de ADN para la molécula. La Figura 2B muestra un dímero en el cual la porción ligador-péptido está presente únicamente sobre una cadena del dímero. La Figura 2C muestra un dímero que tiene la porción peptídica sobre ambas cadenas. El dímero de la Figura 2C se formará espontáneamente en ciertas células huésped después de la expresión de una construcción de ADN que codifica para la cadena simple, como es mostrado en la Figura 3. En otras células huésped, las células podrían ser colocadas en condiciones que favorezcan la formación de dímeros, o los dímeros pueden ser formados in vi tro. La Figura 3 muestra las secuencias ejemplares de ácido nucleico y de aminoácidos (SEQ ID Nos. 1 y 2, respectivamente) de Fc de IgGl humana que puede ser utilizado en esta invención. La Figura 4 muestra la respuesta calcémica de los ratones normales a PTH- (1-34) y a PTH- (1-34) -Fc . Los ratones fueron retados con vehículo (PBS, -X-) , o con PTH- (1-34) (símbolos abiertos) o con PTH- (1-34) -Fc (símbolos cerrados) . Las dosis fueron 156 nmol/kg (círculos) , 469 nmol/kg (triángulos) o 1,560 nmol/kg (cuadrados). Los datos representan las medias grupales, n = 6 ratones/grupo.
La Figura 5 muestra que [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc inhibe la respuesta calcémica de ratones normales a PTHrP. Ratones machos normales fueron inyectados subcutáneamente con el vehículo (PBS, círculos) o con PTHrP- (1-34) humana a 0.5 mg/kg (cuadrados) . Los ratones retados con PTHrP fueron luego inmediatamente inyectados subcutáneamente con [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc a 10 mg/kg (triángulos) o 30 mg/kg (diamantes) . Los datos representan las medias grupales, con un n de 6 ratones/grupo. La Figura 6 muestra el efecto de [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc sobre la hipercalcemia crónica inducida por PTH- (1-34) -Fc . Ratones macho normales fueron retados una vez mediante inyección subcutánea con PTH-(1-34) -Fc (30 mg/kg) (círculos abiertos) o con vehículo (PBS, cuadrados abiertos). Algunos ratones retados con PTH-(1-34) -Fc fueron tratados una vez, al tiempo del reto, con [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc a 10 (triángulo cerrado) 30 (círculo cerrado) , o 100 mg/kg (cuadrado cerrado) . Todas las dosis de [AsnlO , Leull] PTHrP- (7-34) -Fc provocaron una supresión significativa de la hipercalcemia mediada por PTH- (1-34) -Fc. Los datos representan las medias ± SEM, n = 5 ratones/grupo. La Figura 7 muestra la acumulación de cAMP sobre células similares a osteoblastos de rata, ROS 17/2.8. Los cultivos fueron tratados con el inhibidor de fosfodiestereasa IBMX y luego retados por 15 minutos con varios fragmentos de PTH. cAMP fue medido mediante ELISA. La Figura 8 muestra los efectos de los tratamientos simples sobre la química clínica. La sangre periférica fue obtenida diariamente por 3 días después de inyecciones subcutáneas simples de los compuestos indicados. La Figura 8A muestra el calcio total en suero; la Figura 8B, fosfatasa alcalina (AP) , un marcador de actividad de osteoblastos; Figura 8C, fosfatasa acida resistente al tartrato (TRAP) , un marcador de actividad de osteoblastos, y la Figura 8D, la proporción AP:TRAP, un índice de la actividad relativa de los osteoblastos : osteoclastos . La Figura 9 muestra los efectos de las construccioines de PTH sobre la densidad de los minerales óseos. La tomografía computarizada cuantitativa, periférica (pQCT) fue realizada sobre la metafisis tibial proximal de ratones en el día 15, después de inyecciones de las construcciones de PTH en el día 0, 5 y 10. Las Figuras 10A - 10C muestra el efecto de la PTH-(1-34) -Fc dos veces a la semana versus la PTH- (1-34) diaria, sobre la densidad de minerales óseos tibial, trabecular y cortical (BMD). La PTH diaria [ PTH-J 1-34 ) ] fue administrada a 80 µg/kg/día (20 nmol/kg/día) .
Las Figuras 11A-11D muestra los efectos del tratamiento de dos semanas sobre BMD y el calcio en suero en ratas ovariectomizadas (OVX) . Once meses después de la OVX, las ratas fueron tratadas dos veces por semana con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, vehículo) o con APD (0.5 mg/kg) o con PTH- (1-34) -Fc (50 nmol/kg). DEXA fue realizada semanalmente. La sangre fue extraída 24 horas después de la segunda inyección semanal, cuando los efectos calcémicos de PHT-Fc son típicamente máximos. La Figura 12 muestra el efecto de una inyección subcutánea simple de PTH- (1-34) -Fc en monos cynomologus OVX. Los monos fueron inyectados con PTH- (1-34) -Fc a dosis de 1-30 µg/kg (n = 1/grupo) o 100-1000 µg/kg (n = 2/grupo) . El suero fue analizado para el calcio total. La línea discontinua indica el umbral para la hipercalcemia, con base en una elevación de calcio mayor de tres desviaciones estándares por arriba de la media normal, sobre dos o más puntos de tiempo consecutivos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones de los Términos Los términos utilizados a todo lo largo de esta especificación son definidos como sigue, a no ser que sea limitado de otro modo en casos específicos.
El término "que comprende" significa que un compuesto puede incluir aminoácidos adicionales sobre uno o ambos de los extremos N o C de la secuencia dada. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deben interferir significativamente con la actividad del compuesto. El término "residuo ácido" se refiere a los residuos de aminoácidos en la forma D o L que tiene cadenas laterales que comprenden grupos ácidos . Los residuos ácidos ejemplares incluyen D y E. El término "residuo aromático" se refiere a los residuos de aminoácidos en la forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos aromáticos. Los residuos aromáticos ejemplares incluyen F, Y y W. El término "residuo básico" se refiere a los residuos de aminoácidos en la forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos básicos. Los residuos básicos ejemplares incluyen H, K y R. Los términos "residuo hidrofílico" y "Haa" se refieren a los residuos de aminoácidos en la forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden al menos un grupo funcional hidrofílico o un grupo polar. Los residuos hidrofílicos ejemplares incluyen C, D, E, H, K, N, Q, R, S y T. Los términos "residuo lipofílico" y "Laa" se refieren a los residuos de aminoácidos en la forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos no cargados, alifáticos o aromáticos. Las cadenas laterales lipofílicas ejemplares incluyen F, I, L, M, V, W e Y. La alanina (A) es anfifílica -es capaz de actuar como un residuo hidrofílico o lipofílico. La alanina, por lo tanto, es incluida dentro de la definición del "residuo lipofílico" y el "residuo hidrofílico". El término "residuo no funcional" se refiere a los residuos de aminoácidos en la forma D o L que tienen cadenas laterales que carecen de los grupos ácidos, básicos o aromáticos. Los residuos de aminoácidos no funcionales, ejemplares incluyen M, G, A, V, I, L y norleucina (Nle) . El término "vehículo" se refiere a una molécula que previene la degradación y/o incrementa la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad, o incrementa la actividad biológica de una proteína terapéutica. Los vehículos ejemplares incluyen un dominio Fc (el cual es preferido) así como un polímero lineal (por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , polilisina, dextrano, etc.); un polímero de cadena lateral (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,289,872 a Denkenwalter et al., expedida el 15 de septiembre de 1981; Patente de los Estados Unidos No. 5,299,490 a Tam, expedida el 20 de julio de 1993; W093/21259 por Frechet et al., publicada el 28 de octubre de 1993) ; un lípido; un grupo colesterol (tal como un esteroide) , un carbohidrato o un oligosacárido (por ejemplo, dextrano) ; albúmina sérica humana (HSA) y moléculas relacionadas; la transteratina (TTR) y moléculas relacionadas; o cualquier proteína natural o sintética, polipéptidos o péptido que se enlace a un receptor silvestre. Los vehículos son además descritos posteriormente en la presente. El término "Fc nativo" se refiere a la molécula o secuencia que .comprende la secuencia de un fragmento que no se enlaza al antígeno, que resulta de la digestión del anticuerpo completo, ya sea en forma monomérica o multimérica. La fuente de inmunoglobulina original del Fc nativo es preferentemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque son preferidas la IgGl e IgG2. los Fc nativos están constituidos de polipéptidos monoméricos que pueden ser enlazado en formas dimérica o multimérica mediante asociación covalente (por ejemplo, enlaces disulfuro) y no covalente. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas Fc nativas está en el intervalo de 1 a 4, dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o la subclase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2) . Un ejemplo de un Fc nativo es un dímero enlazado por puente disulfuro que resulta de la digestión con papaína de una IgG (ver Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). El término "Fc nativo" como se utiliza en la presente, es genérico para las formas monoméricas, diméricas y multiméricas. El término "variante de Fc" se refiere a una molécula o secuencia que es modificada a partir de un Fc nativo pero que comprende todavía un sitio de enlace para el receptor silvestre, FcRn. Las solicitudes Internacionales W097/34631 (publicada el 25 de septiembre de 1997) y W096/32478 describen variantes de Fc ejemplares, así como la interacción con el receptor silvestre, y son incorporadas por referencia en la presente, en su totalidad. De este modo, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que es humanizada a partir de un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende sitios que pueden ser removidos debido a que éstos proporcionan características estructurales o actividad biológica que no son requeridos para las moléculas de fusión de la presente invención. De este modo, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos de Fc nativos que afectan o están involucrados en (1) la formación del enlace disulfuro, (2) la incompatibilidad con una célula huésped seleccionada, (3) la heterogeneidad N-terminal después de la expresión en una célula huésped seleccionada, (4) glucosilación, (5) interacción con el complemento, (6) enlace a un receptor de Fc diferente de un receptor silvestre, o (7) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (DAC) . Las variantes de Fc son descritas con más detalle posteriormente en la presente. El término "dominio de Fc" abarca las moléculas variantes de Fc y Fc nativo y las secuencias como se definen anteriormente. Como con las variantes de Fc y los Fc nativos, el término "dominio de Fc" incluye las moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas a partir del anticuerpo completo o producidas por otros medios. El término "multímero" como se aplica a los dominios de Fc o a las moléculas que comprenden los dominios Fc se refiere a las moléculas que tienen dos o más cadenas polipeptídicas asociadas covalentemente, no covalentemente o mediante interacciones covalentes o no covalentes. Las moléculas IgG forman típicamente dímeros; IgM, pentámeros; IgD, dímeros; e IgA, monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. Los multímeros pueden ser formados mediante la explotación de la secuencia y la actividad resultante de la fuente de Ig nativa del Fc o mediante derivatización (como se define más adelante) tal como un Fc nativo. El término "dímero" como se aplica a los dominios Fc o a las moléculas que comprenden los dominios Fc se refiere a las moléculas que tienen dos cadenas polipeptídicas asociadas covalentemente o no covalentemente. De este modo, los dímeros ejemplares dentro del alcance de esta invención son como se muestran en las Figuras 1 y 2. Los términos "derivatización" y "derivado" o "derivatizado" comprenden los procesos y los compuestos resultantes respectivamente en los cuales (1) el compuesto tiene una porción cíclica; por ejemplo, la reticulación entre los residuos de cisteinilo dentro del compuesto; (2) el compuesto es reticulado o tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el compuesto tiene un residuo de cisteinilo y de este modo forma dímeros reticulados en cultivo o in vivo; (3 ) uno o más enlaces peptidilo son reemplazados por un enlace no peptidilo; (4) el extremo N es reemplazado por -NRR1, NRCJO R1 , -NRC(0)OR1, -NRS(0)2R1, -NHC (O) HR, un grupo succinimida, o benciloxicarbonil-NH-sustituido o no sustituido, en donde R y R1 y los sustituyentes del anillo son como se definen posteriormente en la presente; (5) el extremo C es reemplazado por -C(0)R2 o -NR3R4 en donde R2, R3 y R4 son como se definen posteriormente en la presente; y (6) los compuestos en los cuales las porciones individuales de aminoácidos son modificadas a través del tratamiento con agentes capaces de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas por residuos termínales. Los derivados son además descritos posteriormente en la presente. El término "péptido" se refiere a las moléculas de 1 a 85 aminoácidos, con las moléculas de 5 a 34 aminoácidos que son las preferidas. Los péptidos ejemplares pueden comprender el dominio de modulación de PTH/PTHrP de una molécula de origen natural o comprenden secuencias aleatorizadas. El término "aleatorizado" como se utiliza para referirse a las secuencias peptídicas, se refiere a las secuencias completamente aleatorias (por ejemplo, seleccionadas por métodos de despliegue de fagos o selección de ARN-péptido) y las secuencias en las cuales uno o más residuos de una molécula de origen natural son reemplazados por un residuo de aminoácido que no aparece en esa posición en la molécula de origen natural. Los métodos ejemplares para la identificación de las secuencias peptídicas incluyen el despliegue de fago, el despliegue de E. coli, el despliegue de ribosoma, la selección de ARN-péptido, la selección química, y similares. El término "dominio de modulación de PTH/PTHrP" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que se enlace al receptor de PTH-1 y/o al receptor de PTH-2, y comprende las secuencias de origen natural o las secuencias aleatorizadas. Los dominios de modulación de PTH/PTHrP ejemplares pueden ser identificados o derivados como se describen en las referencias listadas para las Tablas 1 y 2, que son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. El término "agonista de PTH" se refiere a una molécula que se enlaza al receptor de PTH-1 o al receptor de PTH-2, e incrementan o disminuyen uno o más de los parámetros del ensayo de actividad de PTH, como los hace la hormona paratiroidea humana, nativa de longitud completa. Un ensayo de actividad de PTH ejemplar se describe en el Ejemplo 1. El término "antagonista de PTH" se refiere a una molécula que se enlaza al receptor de PTH-1 o al receptor de PTH-2, y que bloquea o previene el efecto normal sobre aquellos parámetros por la hormona paratiroidea humana, nativa de longitud competa. Un ensayo de actividad de PTH ejemplar se describe en el Ejemplo 2. El término "inhibidor de la resorción ósea" se refiere a moléculas tales como son determinadas por los ensayos ' de los Ejemplos 4 y 11 de W097/23614, la cual es incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. Los inhibidores ejemplares de la resorción ósea incluyen OPG y el anticuerpo contra OPG-L, que son descritos en W097/23614 y W098/46751, respectivamente, los cuales son incorporadas por referencia en la presente, en su totalidad. Adicionalmente, las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de esta invención son también abarcadas en la presente. Por "sales fisiológicamente aceptables" se entiende cualesquiera sales que son conocidas o posteriormente descubiertas, que son farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos específicos son: acetato; tirfluoroacetato; hidrohaluros, tales como clorhidrato y bromhidrato; sulfato; citrato; tartrato; glicolato; y oxalato.
Estructura de los compuestos En General. Las secuencias , de aminoácidos del enlace al receptor de PTR y PTHrP son descritas en las Tablas 1 y 2. Otra información sobre PTH y PTHrP es encontrada en Mannstadt et al. (1999), Am. J. Physiol. 277. tPt 2: F665-75; y Gardella (1996); J. Biol. Chem. 271 (33): 19888-93. Cada una de estas referencias es incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. A partir de las secuencias anteriores, los presentes inventores identificaron en particular, secuencias preferidas derivadas de PTH y PTHrP. Estas secuencias pueden ser aleatorizadas a través de las técnicas mencionadas anteriormente, mediante las cuales uno o más aminoácidos pueden ser cambiados, mientras que se mantiene o incluso se mejora la afinidad de enlace del péptido. En las composiciones de materia preparadas de acuerdo con esta invención, el péptido puede ser enlazado al vehículo a través del extremo C del péptido. De este modo, las moléculas vehículo-péptido de esta invención pueden ser descritas por la siguiente fórmula I: I y multímeros de los mismos, en donde: F1 es un vehículo (preferentemente un dominio Fc) y está enlazado en el extremo C de P1-(L1)a; P1 es una secuencia de un dominio de modulación de PTH/PTHrP; L1 es un ligador; y a es 0 ó 1. Péptidos. Cualquier número de péptidos pueden ser utilizados en conjunto con la presente invención. Los péptidos pueden comprender parte de la secuencia de las proteínas de origen natural, pueden ser secuencias aleatorizadas derivadas de la secuencia de las proteínas natural, o pueden ser secuencias completamente aleatorizadas. El despliegue de fago y la selección de ARN-péptido, en particular, son útiles en la generación de los péptidos para el uso en la presente invención. Una secuencia del dominio de modulación de PTH/PTHrP, particularmente de interés, es de la fórmula II XNX8HX10X11X12KX14X15X16X17X18X19RX21X22X23X24X25X26X27X28XC (SEQ ID No . 3 ) en donde : XN está ausente o es X 3JvC4vXJ*'vr''xv''"J X1X2X3X4X5X6X7, o YX1X2X3X4X5X6X7; X1 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional, hidrofílico o aromático, preferido; A, S o Y preferidos) ; X2 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, V el más preferido) ; X3 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico preferido, S el más preferido) ; X4 es un residuo de aminoácido (residuo ácido preferido, E el más preferido) ; X5 es un residuo de aminoácido (residuo no funiconal o básico preferido, H o I los más preferidos) ; X6 es un residuo de aminoácido (residuo ácido o hidrofílico preferido, Q o E los más preferidos) ; X7 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional o aromático preferido, L o F los más preferidos) ; X es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, M o Nle los más preferidos) ; X10 es un residuo de aminoácido (un residuo ácido o hidrofílico preferido, N o D los más preferidos) ; X11 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional o básico, L, R o K los más preferidos) ; X12 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional o aromático, G, F o W los más preferidos) ; X14 es un residuo de aminoácido (residuo básico o hidrofílico preferido, H o S los más preferidos) ; X15 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, con L o I los más preferidos) ; X16 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional o hidrofílico preferido, Q, N, S o A los más preferidos) ; X17 es un residuo de aminoácido (residuo ácido, hidrofílico o no funcional preferido; S, D o L los más preferidos) ; X18 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, M, L, V o Nle los más preferidos) ; X19 es un residuo de aminoácido (residuo ácido o básico preferido, E o R los más preferidos) ; X21 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional o residuo básico preferido; V, M, R, o Nle los más preferidos) ; X22 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico, ácido o aromático, E o F los más preferidos) ; X23 es un residuo aromático o lipofílico (W o F preferidos) ; X24 es un residuo lipofílico (L preferido) ; X25 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico o básico preferido, R o H los más preferidos); X26 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico o básico preferido, K o H los más preferidos) ; X27 es un residuo de aminoácido (residuo lipofílico, básico o no funcional preferido, K o L los más preferidos) ; X28 es un residuo de aminoácido (residuo lipofílico o no funcional preferido, L o I los más preferidos) ; Xc es ausente o es X29, X29X30 , X29X30X31, X29X30X31X32, 29v30 31 32?33 j,29?30v31 32 33 34 X29X30X31X32X33X4X35 O X29 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico o no funcional preferido, Q o A los más preferidos) ; X30 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico o ácido preferido, D o E los más preferidos) ; X31 es un residuo de aminoácido (residuo lipofílico o no funcional preferido, V o l los más preferidos) ; X32 es un residuo de aminoácido (residuo básico preferido, H el más preferido) ; X33 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico preferido, N o T los más preferidos) ; X34 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional o aromático preferido, A, F o Y los más preferidos) ; X35 es un residuo de aminoácido (residuo ácido preferido, E el más preferido) ; y X36 es un residuo de aminoácido (residuo aromático preferido, Y el más preferido) . Una fórmula de la secuencia del dominio de modulación de PTH/PTHrP preferido, es III JNJ7J8HNLJ12KHLJ16SJ18J19RJ21EWLRKKLJC (SEQ ID No. 4) en donde: JN está ausente o se selecciona de J1J2J3J4J5J6, J2J3J4J5J6, J3J4J5J6; J1 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional, hidrofílico o aromático preferido; A, S, o Y los más preferidos) ; J2 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, V el más preferido) ; J es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico preferido, S el más preferido) ; J4 es un residuo de aminoácido (residuo ácido preferido, E el más preferido) ; J5 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, I el más preferido) ; J6 es un residuo de aminoácido (residuo básico preferido, Q preferido) ; J7 es un residuo de aminoácido (residuo no 1! funcional o aromático preferido, L o F los mas preferidos) ; J8 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, M o Nle los más preferidos) ; J12 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional o aromático preferido, G o W los más preferidos) ; J16 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional o hidrofílico preferido, N, S o A los más preferidos) ; J18 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, M, Nle, L o V los más preferidos) ; J19 es un residuo ácido o básico (E o R preferidos) ; J21 es un residuo de aminoácidos (residuo no funcional preferido, V, M, o Nle los más preferidos) ; Jc está ausente o es J29, J29J30, J29J30J31, J29J30J31J32, J29J30J31J3 J33, o J29J30J31J32J33j;34; J29 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico o no funcional preferido, Q o A los más preferidos) ; J30 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico o ácido preferido, D o E los más preferidos) ; J31 es un residuo .de aminoácido (residuo lipofílico o no funcional preferido, V o l los más preferidos) ; J32 es un residuo de aminoácido (residuo básico preferido, H el más preferido) ; J33 es un residuo de aminoácido (residuo ácido preferido, N el más preferido) ; J34 es un residuo de aminoácidos (residuo aromático preferido, F o Y los más preferidos) . A partir de la fórmula de la SEQ ID No. 4, los péptidos que aparecen en la Tabla 1 siguiente son los más preferidos. Otra secuencia del dominio de modulación de PTH/PTHrP, preferida, es IV (SEQ ID No . 5 ) en donde : 0N está ausente o es Y01020304050607, 01020304050607, 020304050607, 0300506O7, 04050607, 050607, 0607, u O7; 01 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, A el más preferido) ; 02 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, V el más preferido) ; O3 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico preferido, S el más preferido) ; 04 es un residuo de aminoácido (residuo ácido preferido, E el más preferido) ; 05 es un residuo de aminoácido (residuo básico o no funcional preferido, H o I preferidos) ; 06 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico preferido, Q el el más preferido) ; 07 es un residuo de aminoácido (residuo no funcional preferido, L el más preferido) ; O10 es un residuo de aminoácido (residuo ácido o hidrofílico preferido, N o D los más preferidos) ; 011 es un residuo de aminoácido (residuo básico o no funcional preferido, K o L los más preferidos) ; 012 es un residuo de aminoácido (residuo aromático o no funcional preferido, G, F o W los más preferidos) ; 015 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico o no funcional preferido, I o S los más preferidos) ; 016 es un residuo de aminoácido (residuo hidrofílico preferido, Q o N los más preferidos) ; O17 es un residuo de aminoácido ( residuo ácido o no funcional preferido, D o L los más preferidos) ; O23 es un residuo de aminoácido (residuo aroma ' tico preferido, con F o W los más preferidos ) ; 0C está ausente o es O29, 029030, O29O30O31 , O29O30O31O32, O29O30O31O3 O33, O29O30O31O32O33O34, O29O30O31O32O33O34O35, o O29030O31032O33034035o36; y O29 al O36 son cada uno independientemente residuos de aminoácidos . A partir de la fórmula de la SEQ ID No . 5 , los péptidos que aparecen en la Tabla 2 siguiente son los más preferidos . Las secuencias peptídicas ej emplares para esta r invención aparecen en las Tablas 1 y 2 siguientes. Estos péptidos pueden ser preparados como se describe en las referencias citadas o en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,423,037, 4,968,669, 5,001,22 y 6,051,686, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad. Las moléculas de esta invención que incorporan estas secuencias peptídicas pueden ser preparadas mediante los métodos conocidos en la técnica.
Son utilizadas las abreviaturas de aminoácidos de una sola letra. Cualquiera de estos péptidos pueden ser enlazados en tándem (por ejemplo, secuencialmente) , con o sin ligadores. Cualquier péptido que contenga un residuo de cisteinilo puede ser re±iculado con otro péptido que contenga Cys, uno o ambos de los cuales pueden estar enlazados a un vehículo. Cualquier péptido que tenga más de un residuo de Cys puede formar un enlace disulfuro intrapeptídico, también. Cualquiera de estos péptidos puede ser derivatizado como se describe posteriormente en la presente.
Tabla 1 - Dominios de modulación de PTH/PTHrP basados en PTH Tabla 2 - Dominios de modulación de PTH/PTHrP basados en PTHrP Hendy et al. (1981), Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78: 7365; Kimura et al. (1983), Biochem. Biophys. Res. Commun . 114: 493; Zanelli et al. (1985), Endocrinology 117: 1962; ingender et al. (1985), J. Bio. Chem. 264: 4367. Heinrich et al. (1984), J. Biol. Chem. 259: 3320. Bachem Catalogue (1999) . Doppelt et al. (1981), Calcif. Tissue Int. 33: 649; Podbesek et al. (1983) Endocrinology 112: 1000; Kent et al. (1985), Clin. Sci. 68: 171; McKee y Caulfield (1989), Peptide Res. 2: 161; Lee y Russell (1989); Biopoly ers 28: 1115; Reeve et al. (1990), Br. Med. J. 301: 314; Neugebauer et al. (1994), Int. J. Peptide Protein Res. 43: 555. Nakamura et al. (1981); Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168: 168; Law et al. 81983), J. Clin. Endocrinol. Metab. 56: 1335; Wang et al. (1984), Eur. J. Pharmacol. 97, 209; Sham et al. (1986), Gen. Comp . Endocrinol. 61: 148; Smith et al. 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(1996), Endocrinology. 24 Que incorpora la SEQ ID No. 26 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 25 Que incorpora la SEQ ID No. 27 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 26 Que incorpora la SEQ ID No. 28 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 27 Que incorpora la SEQ ID No. 29 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 28 Que incorpora la SEQ ID No. 29 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 27 Que incorpora la SEQ ID No. 30 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 28 Que incorpora la SEQ ID No. 26 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 29 Que incorpora la SEQ ID No. 5 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 30 Con base en las SEQ ID Nos. 8, 9 de la Patente de los Estados Unidos No. 5,051,686. 31 Que incorpora la SEQ ID No. 10 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 32 Que incorpora la SEQ ID No. 11 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 33 Que incorpora la SEQ ID No. 12 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 34 Que incorpora la SEQ ID No. 12 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 35 Que incorpora la SEQ ID No. 14 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 36 Que incorpora la SEQ ID No. 15 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 37 Que incorpora la SEQ ID No. 16 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 38 Que incorpora la SEQ ID No. 17 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 39 Que incorpora la SEQ ID No. 19 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 0 Que incorpora la SEQ ID No. 20 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 41 Que incorpora la SEQ ID No. 21 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 42 Que incorpora la SEQ ID No. 22 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 43 Modificada de la SEQ ID No. 23 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. 44 Modificado de la SEQ ID No. 24 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,686. Otro dominio de modulación de PTH/PTHrP útil tiene la secuencia del éptido conocido como TIP39: SLALADDAAFRERARLLAALERRHWLNSYMHKLLVLDAP (SEQ ID No. 160) TIP39 es descrito por Usdin et al. (1999), Nature Neurosci. 2(11): 941-3; Usdin et al. (1996), Endocrinology 137 (10): 4285-97; Usdin et al. (1995), J. Biol. Chem. 270 (26): 15455-8; Usdin et al. (1999), Endocrinol. 140 (7): 3363-71. Las secuencias del dominio de modulación PTH/PTHrP útiles, adicionales, pueden resultar de modificaciones conservadoras y/o no conservadoras de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos. 3, 4, 5, TIP39, o las secuencias listadas en las Tablas 1 y 2.
Las modificaciones conservadoras producirán péptidos que tengan características funcionales y químicas similares a aquellas del péptido PTH o PTHrP a partir del cual se realizan tales modificaciones. En contraste, modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de los péptidos pueden ser logradas mediante la selección de sustituciones • en la secuencia de aminoácidos que difiere significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura de la cadena principal molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o en hélice, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el tamaño de la molécula. Por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" puede involucrar una sustitución de un residuo de aminoácidos nativo con un residuo no nativo tal que existe poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoácidos en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido puede también ser sustituido con alanina, como ha sido previamente descrito para la "mutagénesis de exploración de alanina" (ver, por ejemplo, MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24, que discute la de exploración de alanina) . Las sustituciones deseadas de aminoácidos (ya sea conservadoras o no conservadoras) pueden ser determinadas por aquellos expertos en la técnica al tiempo en que se deseen tales sustituciones. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden ser utilizadas para identificar residuos importantes de la secuencia peptídica, o para incrementar o disminuir la afinidad del péptido o de las moléculas de vehículo-péptido (ver fórmulas precedentes) descritas en la presente. Las sustituciones de aminoácidos ejemplares son descritas en la Tabla 3.
Tabla 3 - Sustituciones de Aminoácidos En ciertas modalidades, las sustituciones conservadoras de aminoácidos también abarcan los residuos de aminoácidos no de origen natural que son típicamente incorporados por síntesis químico-peptídicas en vez de por la síntesis en los sistemas biológicos. Como se anotó en la sección anterior "Definición de Términos", los residuos de origen natural pueden ser divididos en clases con base en las propiedades comunes de cadena lateral que pueden ser útiles para las modificaciones de la secuencia. Por ejemplo, las sustituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase más. Tales residuos sustituidos pueden ser introducidos en las regiones del péptido que son homologas con ortólogos no humanos, o en las regiones no homologas de la molécula. Además, se pueden también realizar modificaciones utilizando P o G para fines de influenciar la orientación de la cadena. En la elaboración de tales modificaciones, el índice hidropático de aminoácidos puede ser considerado. Cada aminoácido ha sido asignado con un índice hidropático con base en su hidrofobicidad y características de carga, éstas son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteina/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-07); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3) prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5) glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5) lisina (-3.9); y arginina (-4.5). En la técnica, es entendida la importancia del índice hidropático de aminoácidos al conferir la función biológica interactiva sobre una proteína. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o calificación hidropática similar y que conserven todavía una actividad biológica similar. En la elaboración de los cambios con base en el índice hidropático, la sustitución de los aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2 es preferida, aquellos que están dentro de ±1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de ±0.5 son aún más particularmente preferidos. Se entiende también en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede ser realizada de manera efectiva con base en la hidrofilicidad. La hidrofilicidad local promedio, más grande de una proteína, como es gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, por ejemplo, con una propiedad biológica de la proteína. Los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0'+l); glutamato (+3.0±1; serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5±1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteina (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptofano (-3.4). En la elaboración de los cambios con base en los valores de hidrofilicidad similares, la sustitución de los aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2 son los preferidos, aquellos que están dentro de ±1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de +0.5 son aún más particularmente preferidos. Se puede también identificar epítopes a partir de secuencias de aminoácidos primarias con base en la hidrofilicidad. Estas regiones son también denominadas como "regiones de núcleo epitópico". Un experto en la técnica será capaz de determinar las variantes adecuadas del polipéptido como se describe en las secuencias anteriores utilizando técnicas bien conocidas. Para la identificación de áreas adecuadas de la molécula que pueden ser cambiadas sin destruir la actividad, una persona experta en la técnica puede dirigirse a las áreas que no se cree sean importantes para la actividad. Por ejemplo, cuando péptidos similares con actividades similares provenientes de la misma especie o de otra especie son conocidos, una persona de experiencia en la técnica puede comparar la secuencia de aminoácidos de un péptido a péptidos similares. Con tal comparación, se pueden identificar los residuos y _ porciones de las moléculas que están conservadas entre polipéptidos similares. Se apreciará que los cambios en las áreas de un péptido que no están conservadas con relación a tales péptidos similares, es menos probable que pudieran afectar de manera adversa la actividad biológica y/o la estructura del péptido. Un experto en la técnica podría también saber que, incluso en regiones relativamente conservadas, se pueden sustituir aminoácidos químicamente similares por los residuos de origen natural mientras que se conserva la actividad (sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos) . Pro lo tanto, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden ser sometidas a sustituciones conservadoras de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura de los péptidos . Adicionalmente, una persona de experiencia en la técnica puede revisar los estudios de estructura-función que identifican los residuos en péptidos similares, que son importantes para la actividad o la estructura. En vista de tal composición, se puede predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en un péptido, que corresponden a los residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en péptidos similares. Una persona de experiencia en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes, predichos de los péptidos. Una persona de experiencia en la técnica puede también analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación a aquella estructura en polipéptidos similares. En vista de esa información, una persona de experiencia en la técnica puede predecir el alineamiento de los residuos de aminoácidos de un péptido con respecto a su estructura tridimensional. Una persona de experiencia en la técnica puede elegir no elaborar cambios radicales a los residuos de aminoácidos predichos para estar sobre la superficie de la proteína, ya que tales residuos pueden estar involucrados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, una persona de experiencia en la técnica puede generar variantes de prueba que contengan una sustitución de aminoácidos simple en cada residuo de aminoácidos deseado. Las variantes pueden ser luego seleccionadas utilizando ensayos de actividad conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. Tales datos podrían ser utilizados para obtener información respecto a las variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubriera que un cambio a un residuo de aminoácidos particular da como resultado actividad destruida, indeseablemente reducida o inadecuada, las variantes con tal cambio podrían ser evitadas. En otras palabras, con base en la información obtenida de tales experimentos rutinarios, una persona de experiencia en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos donde sustituciones adicionales deben ser evitadas, ya sea solas o en combinación con otras mutaciones. Un número de publicaciones científicas han estado abocadas a la predicción de la estructura secundaria. Ver Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7 (4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13 (2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Áreas Mol. Biol., 47: 45.-148 (1978); Chou et al. Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26: 367-384 (1979) . Además, actualmente están disponibles los programas de computadora para ayudar con la predicción de la estructura secundaría. Un método para predecir la estructura secundaria está basado en la modelación de la homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tengan una identidad secuencial mayor de 30%, o una similitud mayor de 40%, frecuentemente tienen topologías estructurales similares. El desarrollo reciente de la base de datos estructural de las proteínas (PDB) ha proporcionado capacidad de predicción aumentada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos dentro de una estructura del polipéptido o de la proteína. Ver Holm et al., Nucí. Acid. Res., 27 (1); 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7 (3) : 369-376 (1997) ) que existe un número limitado de plegamientos en un polipéptido o proteína dada y que una vez que un número crítico de estructuras ha sido resuelto, la predicción estructural ganará dramáticamente en precisión. Los métodos adicionales de predicción de la estructura secundaria incluyen el "entretejido" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol.., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4 (1): 15-9 (1996)), "profile analysis" (Bowie et al-, Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 84 (13): 4355-8 (1987)), y el "enlace evolutivo" (Ver Home, supra, y Brenner, supra) . Vehículos. Esta invención requiere la presencia de al menos un vehículo (F1) enlazado a un péptido a través del extremo C o una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácidos. Vehículos múltiples pueden también ser utilizados, por ejemplo, un Fc en el extremo C y un grupo PEG en una cadena lateral. Un dominio Fc es el vehículo preferido. El dominio Fc puede ser fusionado al extremo C de los péptidos . Como se anotó anteriormente, las variantes de Fc son vehículos adecuados dentro del alcance de esta invención. Un Fc nativo puede ser extensamente modificado para formar una variante de Fc de acuerdo con esta invención, con la condición de que el enlace al receptor silvestre sea mantenido; ver, por ejemplo W097/34631 y W096/32478. En tales variantes de Fc, se pueden eliminar uno o más sitios de un Fc nativo que proporcionan características estructurales o actividad funcional no requeridas por las moléculas de fusión de esta invención. Se pueden remover estos sitios por ejemplo mediante sustitución o supresión de residuos, inserción de residuos dentro del sitio, o truncamiento de porciones que contienen el sitio. Los residuos insertados o sustituidos pueden también ser aminoácidos alterados, tales como los peptidomiméticos o D-aminoácidos. Las variantes de Fc pueden ser deseables por un número de razones, varias de las cuales se describen más adelante. Las variantes de Fc ejemplares incluyen moléculas y secuencias en las cuales: 1. Son removidos los sitios involucrados en la formación del enlace disulfuro. Tal eliminación puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína, presentes en la célula huésped utilizada para producir las moléculas de la invención. Para este propósito, el segmento que contiene cisteina en el extremo N puede ser truncado o los residuos de cisteina pueden ser suprimidos o sustituidos con otros aminoácidos (por ejemplo, alanilo, serilo) . En particular, se puede truncar el segmento N-terminal de 20 aminoácidos de la SEQ ID No. 2 o suprimir o sustituir los residuos de cisteina en las posiciones 7 y 10 de la SEQ ID No. 2. Incluso cuando son eliminados los residuos de cisteína, los dominios Fc de cadena simple pueden todavía formar un dominio Fc dimérico que es mantenido junto no covalentemente. Un Fc nativo es modificado para hacerlo más compatible con una célula huésped seleccionada. Por ejemplo, se puede eliminar la secuencia PA cerca del extremo N de un Fc nativo, típico, que puede ser reconocido por una enzima digestiva en E. coli, tal como la prolina-iminopeptidasa. Se puede también agregar un residuo de metionina N-terminal, especialmente cuando la molécula es expresada recombinantemente en una célula bacteriana tal como E. coli . El dominio Fc de la SEQ ID No. 2 es una de tal variante de Fc. Una porción del extremo N de un Fc nativo es eliminada para prevenir la heterogeneidad N-terminal cuando es expresada en la célula huésped seleccionada. Para este propósito, se pueden suprimir cualquiera de los 20 residuos de aminoácidos en el extremo N, particularmente aquellos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5. Uno o más sitios de glucosilación son eliminados. Los residuos que son típicamente glucosilados (por ejemplo, asparagina) pueden conferir respuesta citolítica. Tales residuos pueden ser suprimidos o sustituidos con residuos no glucosilados (por ejemplo, alanina) . Los sitios involucrados en la interacción con el complemento, tales como el sitio de enlace Clq, son eliminados. Por ejemplo, se puede suprimir o sustituir la secuencia EKK de la IgGl humana. El reclutamiento del complemento puede no ser ventajoso para las moléculas de esta invención, y así pues puede ser evitado con tal variante de Fc. Son eliminados los sitios que afectan el enlace a los receptores Fc diferentes de un receptor silvestre. Un Fc nativo puede tener sitios para la interacción con ciertas . células sanguíneas blancas que no son requeridas para las moléculas de fusión de la presente invención, y así pues pueden ser eliminadas. El sitio ADCC es eliminado. Los sitios ADCC son conocidos en la técnica; ver, por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5) : 633-9 (1992) con respecto a los sitios ADCC en IgGl. Estos sitios, también, no son requeridos para las moléculas de fusión de la presente invención y pueden también ser eliminados . • Cuando el Fc nativo es derivado de un anticuerpo no humano, el Fc nativo puede ser humanizado. Típicamente, para humanizar un Fc nativo, se sustituirán los residuos seleccionados en el Fc nativo, no humano, con residuos que son normalmente encontrados en el Fc nativo, humano .__ Las técnicas para la humanización de los anticuerpos son bien conocidas en la materia. Las variantes de Fc preferidas incluyen las siguientes. En la SEQ ID No. 2 (Figura 4) la leucina en la posición 15 puede ser sustituida con glutamato; el glutamato en la posición 99, con alanina; y las usinas en las posiciones 101 y 103, con alaninas. Además, uno o más residuos de tirosina pueden ser reemplazados por residuos de fenilalanina. Un vehículo alternativo podría ser una proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto peptidomimético) capaz de enlazarse a un receptor silvestre. Por ejemplo, se podría utilizar como un vehículo un polinucleótido como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,739,277, expedida el 14 de abril de 1998 a Presta et al. Los péptidos podrían también ser seleccionados mediante despliegue de fagos o selección de ARN-péptido para el enlace al receptor silvestre FcRn.
Tales compuestos silvestres de enlace al receptor son también incluidos dentro del significado de "vehículo" y están dentro del alcance de esta invención. Tales vehículos podrían ser seleccionados para la vida media incrementada (por ejemplo, al evitar las secuencias reconocidas por las proteasas) y la inmunogenicidad disminuida (por ejemplo, al favorecer las secuencias no inmunogénicas, como es descubierto en la humanización de los anticuerpos) . Como se anotó anteriormente, los vehículos poliméricos pueden también ser utilizados para F1 y F2. Diversos medios para acoplar las moléculas químicas, útiles como vehículos, son actualmente disponibles, ver, por ejemplo la Publicación Internacional del Tratado de Cooperación en Materia de Patentes ("PCT") No. W096/11953, titulada "Composiciones y Métodos de Proteínas Químicamente Modificadas N-terminalmente", incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. Esta publicación del PCT describe, entre otras cosas, el acoplamiento selectivo de los polímeros solubles en agua al extremo N de las proteínas . Un vehículo polimérico preferido es el polietilenglicol (PEG) . El grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del PEG estará preferentemente en el intervalo de aproximadamente 2 kiloDaltones (kD) hasta aproximadamente 100 kD, más preferentemente de aproximadamente 5 kD a aproximadamente 50 kD, lo más preferentemente de aproximadamente 5 kD a aproximadamente 10 kD. Los grupos PEG serán en general acoplados a los compuestos de la invención vía la acilación o la alquilació " reducida a través de un grupo reactivo sobre la porción PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo sobre el compuesto de la invención (por ejemplo, un grupo aldehido, amino o éster) . Una estrategia útil para la PEGilación de los péptidos sintéticos consiste en la combinación, a través de la formación de un enlace conjugado en solución, de un péptido y una porción PEG, cada una poseyendo una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva una hacia la otra. Los péptidos pueden ser fácilmente preparados con síntesis convencional en fase sólida. Los péptidos son "pre-activados" con un grupo funcional apropiado en un sitio específico. Los precursores son purificados y completamente caracterizados antes de la reacción con la porción PEG. La ligadura del péptido con PEG usualmente tiene lugar en fase acuosa y puede ser fácilmente monitorizada mediante HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados pueden ser fácilmente purificados mediante HPLC preparativa y caracterizados por HPLC analítica, el análisis de aminoácidos y la espectrometría de masa de desorción de láser. Los polímeros polisacáridos son otro tipo de polímero soluble en agua que pueden ser utilizados para la modificación de las proteínas. Los dextranos son polímeros polisacáridos comprendidos de subunidades individuales de glucosa predominantemente enlazadas por enlaces al-6. El dextrano mismo es disponible en muchos intervalos de peso molecular, y es fácilmente disponible en pesos moleculares de aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 70 kD. El dextrano es un polímero soluble en agua, adecuado para el uso en la presente invención, como un vehículo por sí solo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo Fc) . Ver, por ejemplo, los documentos W096/11953 y WO96/05309. El uso del dextrano conjugado a inmunoglobulinas terapéuticas o de diagnóstico ha sido también reportado; ver, por ejemplo, la Publicación de Patente Europea No. 0,315,456, la cual es incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. El dextrano de aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 20 kD es preferido cuando el dextrano es utilizado como un vehículo de acuerdo con la presente invención. Ligadores. Cualquier grupo "ligador" es opcional. Cuando está presente, su estructura química no es crítica, ya que éste sirve principalmente como un espaciador. El ligador está preferentemente constituido de aminoácidos enlazados entre sí por enlaces peptídicos. De este modo, en las modalidades preferidas, el ligador está constituido de 1 a 20 aminoácidos ligados por enlaces peptídicos, en donde los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos de origen natural. Algunos de estos aminoácidos pueden estar glucosilados, como es bien comprendido por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad preferida, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Aún más preferentemente, un ligador está constituido de una mayor parte de aminoácidos que están estéricamente no impedidos, tales como glicina y alanina. De este modo, los ligadores preferidos son poliglicinas (particularmente (Gly)4, (Gly)5), poli (Gly-Ala) , y polialaninas. Otros ejemplos específicos de ligadores son: (Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID No. 6) ; (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID No. 7); (Gly)3Cys (Gly) (SEQ ID No. 8); y GlyProAsnGlyGly (SEQ ID No. 9) .
Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo, (Gly) 3Lys (Gly) significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Las combinaciones de Gly y Ala son también preferidas. Los ligadores mostrados aquí son ejemplares; los ligadores dentro del alcance de esta invención pueden ser mucho más largos y pueden incluir otros residuos.
Los ligadores no peptídicos son también posibles. Por ejemplo, los ligadores de alquilo tales como -NH- (CH2) 5-C (O) -, en donde s = 2.20 podrían ser utilizados. Estos ligadores de alquilo pueden además estar sustituidos con cualquier grupo sin impedimento estérico tal como alquilo inferior (por ejemplo, de 1 a 6 átomos de carbono), acilo inferior, halógeno (por ejemplo, cloro, bromo) , CN, NH2, fenilo, etc. Un ligador no peptídico ejemplar es un ligador PEG, VI en donde n es tal que el ligador tiene un peso molecular de 100 a 5000 kD, preferentemente de 100 a 500 kD. Los ligadores peptídicos pueden ser alterados para formar derivados de la misma manera que se describió anteriormente . Derivados . , Los inventores también contemplan la derivatización de la porción peptídica y/o de vehículo de los compuestos. Tales derivados pueden mejorar la solubilidad, la absorción, la vida media biológica, y similares, de los compuestos. Las porciones pueden eliminar o atenuar alternativamente cualquier efecto colateral indeseable de los compuestos, y similares. Los derivados ejemplares incluyen los compuestos _en los cuales: 1. • El compuesto" o alguna porción del mismo es cíclico.
Por ejemplo, la porción peptídica puede ser modificada para contener dos o mas residuos Cys (por ejemplo, en el ligador) , que podrían ciclizarse mediante formación del enlace disulfuro. 2. El compuesto es reticulado o es hecho capaz de reticularse entre las moléculas. Por ejemplo, la porción peptídica puede ser modificada para contener un residuo Cys y con esto ser capaz de formar un enlace disulfuro intermolecular con una molécula similar. El compuesto puede también ser reticulado a través de su extremo C, como en la molécula mostrada enseguida. V 3. Uno o más enlaces (uniones) peptidilo [-C(0)NR-] es reemplazado por un enlace no peptidilo. Los enlaces no peptidilo ejemplares son -CH2-carbamato t-CH2-0C (O)NR-] , fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S(0)2NR-] , urea [-NHC (O) NH-] , -CH2-amina secundaria, y péptido alquilado [-C(0)NR6- en donde R6 es alquilo inferior] . El extremo es derivatizado. Típicamente, el extremo N puede ser acilado o modificado a una amina sustituida. Los grupos derivados N-terminales, ejemplares incluyen -NRR1 (diferente de -NH2) , -NRCÍOJR1, -NRCÍOJOR1, -NRS (0) 2R-J -NHC (O) NHR1, succinimida, o benciloxicarbonil-NH- (CBZ-NH-) , en donde R y R1 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo inferior y en donde el anillo fenilo puede ser sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, cloro y bromo . El extremo C libre es derivatizado. Típicamente, el extremo C es esterificado o amidado. Los grupos derivados C-terminales, ejemplares, incluyen, por ejemplo, -C(0)R2 en donde R2 es alcoxi inferior o -NR3R4, en donde R3 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono (preferentemente alquilo de 1 a 4 átomos de carbono) . Un enlace disulfuro es reemplazado con otra porción de reticulación, preferentemente más estable (por ejemplo, un alquileno) . Ver, por ejemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp. 357.9. 7. " Uno o más residuos de aminoácidos individuales son modificados. Se sabe que diversos agentes de derivatización reaccionan específicamente con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos terminales, como se describe con detalle más adelante. Los residuos de lisinilo y los residuos amino-terminales se pueden hacer reaccionar con el anhídrido succínico o de otro ácido carboxílico, los cuales revierten la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para la derivatización de los residuos que contienen alfa-amino incluyen los imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencensulfónico; 0- etilisourea; 2, 4-pentanodiona; y la reacción catalizada por transaminasa con glioxilato. Los residuos de arginilo pueden ser modificados mediante la reacción con uno o una combinación de varios reactivos convencionales, incluyendo fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1, 2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivatización de los residuos arginilo requiere que la reacción sea realizada en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo epsilon-amino de la arginina. La modificación específica de los residuos de tirosilo ha sido estudiada extensamente, con interés particular en la introducción de marcadores espectrales dentro de los residuos tirosilo, mediante la reacción con los compuestos de diazonio aromático o de tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil-tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los grupos con cadena lateral carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden ser selectivamente modificados mediante reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R' ) tales como l-ciclohexil-3- (2-morfolinil- (4-etil) carbodiimida o l-etil-3- (4-azonia-4, 4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo pueden ser convertidos a residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con los iones amonio. -Los residuos de glutaminilo y asparaginilo pueden ser desamidados a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos son desamidados bajo condiciones brevemente acidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención. Los residuos de cisteinilo pueden ser reemplazados por residuos de aminoácidos u otras porciones, ya sea para eliminar el enlace disulfurq_ o, de manera contraria, para estabilizar la reticulación. Ver, por ejemplo, Bhatnagar et al. (1996, J. Med. Chem. 39: 3814-9. La derivatización con agents bifuncionales es útil para la reticulación de los péptidos o sus derivados funcionales a una matriz de soporte insoluble en agua o a otros vehículos macromoleculares. Agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis (diazoaceteil) -2-feniletano, glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo esteres con ácido 4-azidosalicílico, i idoésteres homobifuncionales, incluyendo esteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , y maleimidas bifuncionales tales como bís-N-maleimido-1, 8-octano. Los agentes de derivatización tales como el metil-3- [ (p-azidofenil) ditio] propioimidato producen intermediarios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices insolubles en agua, reactivas, tales como los carbohidratos activados por bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440 son empleados para la inmovilización de las proteínas.
Los grupos carbohidrato (oligosácaridos) pueden ser convenientemente enlazados a los sitios __que se sabe que son sitios de glucosilación en las proteínas. En general, los oligosacáridos O-enlazados son acoplados a los residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) mientras que los oligosacáridos N-enlazados son acoplados a los residuos de asparagina (Asn) , cuando éstos son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferentemente uno de los 19 aminoácidos de origen natural excepto la prolina. Las estructuras de los oligosacáridos N-enlazados y 0-enlazados, y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo, son diferentes. Un tipo de azúcar que es comúnmente encontrado sobre ambos es el ácido N-acetilneuramínico (denominado como ácido siálico) . El ácido siálico es usualmente el residuo terminal de los oligosacáridos N-enlazados y O-enlazados y, en virtud de su carga negativa, pueden conferir propiedades acidas al compuesto glucosilado. Tal o tales sitios pueden ser incorporados en el ligador de los compuestos de esta invención y son preferentemente glucosilados por una célula durante la producción recombinante de los compuestos polipeptídicos (por ejemplo, en células de mamífero tales como CHO, BHK, COS) . No obstante, tales sitios pueden además ser glucosilados mediante procedimientos sintéticos o semisintéticos, conocidos en la técnica. Otras posibles modificaciones __ incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos de serilo o treonilo, la oxidación del átomo de azufre en Cys, la metilación de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de la lisina, arginina e histidina. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co . , San Francisco), p. 79-86 (1983). Los compuestos de la presente invención pueden ser cambiados al nivel del ADN, también. Las secuencias de ADN de cualquier porción de los compuestos puede ser cambiada a codones más compatibles con la célula huésped elegida. Para E. coli, que es la célula huésped preferida, los codones optimizados son conocidos en la técnica. Los codones pueden ser sustituidos para eliminar sitios de restricción o para incluir sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar el procesamiento del ADN en las célula huésped seleccionada. Las secuencias de ADN del vehículo, del ligador y del péptido pueden ser modificadas para incluir cualquiera de los cambios secuenciales anteriormente mencionados.
Métodos de Elaboración Los compuestos de esta invención pueden ser elaborados en gran medida en células huésped_ transformadas, utilizando técnicas de ADN recombinantes. Para hacerlo así, es preparada una molécula de ADN recombinante que codifica para el péptido. Los métodos de preparación de tales moléculas de ADN son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias que codifican para los péptidos podrían ser extirpadas del ADN utilizando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de ADN podría ser sintetizada utilizando técnicas de síntesis química, tales como el método del fosforamidato. También, podría ser utilizada una combinación de estas técnicas. La invención también incluye un vector capaz de expresar los péptidos en un huésped apropiado. El vector comprende la molécula de ADN que codifica para los péptidos operativamente enlazados a las secuencias de control de la expresión, apropiadas. Los métodos para efectuar este enlace operativo, ya sea antes o después de que la molécula de ADN sea insertada dentro del vector, son bien conocidos. Las secuencias de control de la expresión incluyen promotores, activadores, aumentadores, operadores, sitios de enlace al ribosoma, señales de inicio, señales de detención, señales de casquete, señales de poliadenilación, y otras señales involucradas con el control de la transcripción o la traducción.
El vector resultante que tiene la molécula de ADN sobre éste, es utilizado para transformar un huésped apropiado. Esta transformación puede ser realizada utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Cualquiera de un gran número de células huésped disponibles y bien conocidas pueden ser utilizadas en la práctica de esta invención. La selección de un huésped particular es dependiente de un número de factores reconocidos por la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión elegido, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, la velocidad de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la bioseguridad y los costos. Un balance de estos factores debe ser crucial con el entendimiento de que no todos los huéspedes pueden ser igualmente efectivos para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estos lineamientos generales, los huéspedes microbianos útiles incluyen bacterias (tales como E. coli sp.), levaduras (tales como Saccharomyces sp. ) y otros hongos, células de insectos, de plantas, de mamíferos (incluyendo humanos) en cultivo u otros huéspedes conocidos en la técnica. Enseguida, el huésped transformado es cultivado y purificado. Las células huésped pueden ser cultivadas bajo condiciones de fermentación convencionales de modo que los compuestos deseados son expresados. Tales__condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Finalmente, los péptidos son purificados a partir del cultivo mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los compuestos pueden ser también elaborados mediante métodos sintéticos. Por ejemplo, pueden ser utilizadas las técnicas de síntesis en fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en la materia, e incluyen aquellas descritas en Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, p. 335-61 (Katsoyannis y Panayotis eds.); Merrifield (1963); J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; Patente de los Estados Unidos No. 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 105-253; y Erickson et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 257-527. La síntesis en fase sólida es la técnica preferida de elaboración de los péptidos individuales, ya que éste es el método de más bajo costo para la elaboración de péptidos pequeños. Los compuestos que contienen péptidos derivatizados o los cuales contienen grupos no peptídicos pueden ser sintetizados mediante técnicas de química orgánica bien conocidas.
Usos de los Compuestos Los compuestos de esta invención tienen actividad farmacológica resultante de su interacción con el receptor de PTH-1 o el receptor de PTH-2. Mannstadt et al. (1999), Am. J. Physiol. 277. 5Pt 2. F665-75. La PTH y los agonistas de la misma incrementa la resorción ósea, incrementan la reabsorción de calcio renal, y disminuye la proliferación epidérmica, y disminuyen el crecimiento del cabello. Holick et al. (1994) Proc. Nati. Sci. EUA 91 (17): 8014-6; Schilli et al. (1997), J. Invest. Dermatol. 108 (6): 928-32. De este modo, los antagonistas del receptor de PTH-1 y/o del receptor del PTH-2 son útiles en el tratamiento de: " hiperparatiroidismo primario y secundario; B hipercalcemia, incluyendo hipercalcemia resultante de tumores sólidos (mama, pulmón y riñon) y malignidades hematológicas (mieloma múltiple, linfoma y leucemia) ; hipercalcemia idiopática, e hipercalcemia asociada con hipertiroidismo y desórdenes de la función renal; a metástasis tumorales, particularmente metástasis hacia el hueso, y particularmente relacionadas al cáncer de mama y de próstata; " caquexia y anorexia, particularmente aquella asociada con el cáncer; osteopenia que está relacionada a o agrabada por la señalización aberrante del receptor de _PTH, incluyendo diversas formas de osteoporosis, tales como: - osteoporosis primaria; - osteoporosis post-menopáusica y relacionada a la edad; osteoporosis endocrina (hipertiroidismo, hiperparatiroidismo, síndrome de Cushing y acromegalia) , formas hereditarias y congénitas de la osteoporosis (por ejemplo, osteogénesis imperfecta, homocistinuria, síndrome de Menkes, y síndrome de Riley-Day) ; osteoporosis debida a inmovilización de las extremidades ; - osteoporosis secundaria a otros desórdenes, tales como hemocromatosis, hiperprolactinemia, anorexia nerviosa, tirotoxicosis, diabetes mellitus, enfermedad celiaca, enfermedad inflamatoria del intestino, cirrosis biliar primaria, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, mieloma múltiple, enfermedades linfoproliferativas y mastocitosis sistémica; osteoporosis secundaria a la cirugía (por ejemplo, gastrectomía) o a la terapia con fármacos, tales como la quimioterapia, terapia anticonvulsivante, terapia inmunosupresora, y terapia antícoagulante; - osteoporosis secundaria al tratamiento con glucocorticosteroides para enfermedades tales como la artritis reumatoide (RA) , lupus eritematoso sistémico (SLE) , asma, arteritis temporal, vasculitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, polimialgia reumática, polimiositis, enfermedad pulmonar intersticial crónica; - osteoporosis secundaria al tratamiento con glucocorticosteroides y/o inmunomoduladores, para prevenir el rechazo de órganos después del transplante de órganos, tales como riñon, hígado y corazón; - osteoporosis debida al sometimiento a microgravedad, tal como la observada durante los viajes espaciales; osteoporosis asociada con enfermedad maligna, tal como cáncer de mama, cáncer de próstata; • enfermedad ósea de Paget (osteítis deformans) en adultos y jóvenes; • osteomielitis, o una lesión infecciosa en el hueso, que conduce a la pérdida del hueso; • osteopenia después de la cirugía, inducida por la administración de esteroides, y asociada con desórdenes del intestino delgado y grueso y con enfermedades hepáticas y renales crónicas. • - osteonecrosis", o muerte de las células óseas, asociada con daño traumático o necrosis no traumática asociada con la enfermedad de Gaucher, anemia de células falciformes, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, enfermedad periodontal, metástasis osteolítica, y otras condiciones; • alopecia (desarrollo deficiente del cabello o pérdida parcial o completa del cabello) , incluyendo alopecia androgénica (calvicie de patrón masculino) , alopecia tóxica, alopecia senilis, alopecia areata, alopecia pelada, y tricotilomanía; y similares. Existen otras condiciones en donde un paciente se podría beneficiar de la actividad de PTH o PTHrP. Para estas indicaciones, los agonistas del receptor de PTH son útiles como un tratamiento terapéutico. En particular, tales indicaciones incluyen la reparación de fracturas (incluyendo sanado de fracturas no de unión) , osteopenia, incluyendo diversas formas de osteoporosis, tales como: - osteoporosis primaria; - osteoporosis post-menopáusica y relacionada a la edad; - osteoporosis endocrina (hipertiroidismo, síndrome de Cushing, y acromegalia) ; formas hereditarias y congénitas de la osteoporosis (por ejemplo, osteogénesis imperfecta, homocistinuria, síndrome de Menkes, y síndrome de Riley-Day) ; osteoporosis debida a la inmovilización de las extremidades; osteoporosis secundaria a otros desórdenes, tales como hemocromatosis, hiperprolactinemia, anorexia nerviosa, tirotoxicosis, diabetes mellitus, enfermedad celiaca, enfermedad inflamatoria del intestino, cirrosis biliar primaria, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, mieloma múltiple, enfermedades linfoproliferativas y mastocitosis sistémica; osteoporosis secundaria a la cirugía (por ejemplo, gastrectomía) o a la terapia con fármacos, tales como quimioterapia, terapia con anticonvulsivos, terapia con inmunosupresores, y terapia con anticoagulantes; osteoporosis secundaria al tratamiento con glucocorticosteroides para enfermedades tales como RA, SLE, asma, arteritis temporal, vasculitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, polimialgia reumática, polimiositis, enfermedad pulmonar instersticial crónica; osteoporosis secundaria a tratamiento con glucocorticosteroides y/o inmunomoduladores, para prevenir el rechazo de órganos después del transplante de órganos tales como riñon, hígado, pulmón y corazón; - osteoporosis debida al sometimiento a__ microgravedad, tal como la observada durante los viajes espaciales; - osteoporosis asociada con enfermedad maligna, tal como cáncer de mama, cáncer de próstata; los agonistas de PTH que extienden la vida media (por ejemplo, aquellos enlazados a los dominios Fc) pueden ser utilizados con un inhibidor de la resorción ósea. Los inhibidores de la resorción ósea incluyen OPG y derivados de OPG, anticuerpo contra OPG-L (RANKL) , calcitonina (por ejemplo, Miacalcin®, Calcimar®, bisfosfonatos (por ejemplo, APD, alendronato, risedronato, etidronato, pamidronato, tiludronato, clodronato, neridronato, ibandronato, zoledronato) , estrógenos (por ejemplo, Premarin®, Estraderm®, Prempro®, Alora®, Climara®, Vivelle®, Estratab®, Ogen®) , moduladores selectivos del receptor de estrógeno (por ejemplo, raloxifeno, droloxifeno, lasofoxifeno) , tibolona, y similares. Los inhibidores ejemplares de la resorción ósea son descritos en los documentos W098/46751 y W097/23614, los cuales son incorporados por referencia en la presente, en su totalidad. Los compuestos de esta invención pueden ser apropiados como una monoterapia para el tratamiento de la osteoporosis, y es posible que la adición de un agente antirresortivo al tratamiento con PTH-Fc, incrementará su eficacia y ventaja terapéutica. PTH y PTH^Fc provocan un incremento en la " formación del hueso y en la resorción ósea. La habilidad de los anti-resortivos para bloquear la respuesta de los osteoblastos podría limitar los efectos hipercalcémicos de PTH-Fc y podría también incrementar la masa ósea.
Condiciones Farmacéuticas En General. La presente invención también proporciona los métodos para utilizar las composiciones farmacéuticas de los compuestos de la invención. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser para la administración, para la inyección, o para la administración oral, pulmonar, nasal, transdérmica u otras formas de administración. En general, la invención abarca las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de un compuesto de la invención, junto con los diluyentes farmacéuticamente aceptables, conservadores, solubilizadores, emulsificantes, adyuvantes y/o portadores también farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes de diversos contenidos de amortiguador (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) , pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizadores (por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbicq, metabisulfito de - sodio) , conservadores (por ejemplo, timersol, alcohol bencílico) y sustancias de volumen (por ejemplo, lactosa, manitol) ; incorporación del material en las preparaciones particuladas de los compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas. El ácido hialurónico puede también ser utilizado, y éste puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Tales composiciones pueden influenciar el estado físico, la estabilidad, la velocidad de la liberación in vivo, y la velocidad del despejo in vivo de las presentes proteínas y derivados. -Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712 la cual se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad. Las composiciones pueden ser preparadas en forma líquida, o pueden estar en forma de polvo seco, tal como la forma liofilizada. Las formulaciones de liberación sostenida, implantables, son también contempladas, como los son las formulaciones transdérmicas. La dosificación dos veces a la semana de los compuestos de esta invención es superior a la inyección diaria de PTH- (1-34) para incrementar el número de osteoblastos, el volumen óseo, y la densidad mineral de los huesos en roedores. En ratones adultos, la dosificación dos veces a la semana con PTH- (1-34) -Fc provocó incrementos mayores en la densidad ósea y volumen óseo comparado a PTH- (1-34) diaria. (Ver Figura 10). En un modelo de rata ovariectomizada OVX de edad avanzada, de osteoporosis, la dosificación de dos semanas fue capaz de revertir más de 50% de la pérdida ósea inducida por un año de ablación de estrógenos. El efecto observado en el modelo de rata de edad avanzada fue aún mayor cuando se combinó con un bifosfonato (APD) . En ratas, una inyección simple de PTH- (1-34) -Fc (340 nmol/kg) provocó una respuesta hipercalcémica que persistió por 72 horas (Figura 8) . Esta duración es concordante con la velocidad de despejo de PTH- (1-34) -Fc a partir del suero, y es consistente con un régimen de dosificación dos veces a la semana, óptimo en ratas . La dosificación óptima de primates puede ser menos frecuente en comparación a las ratas o ratones. Semanalmente (o menos frecuentemente) la dosificación puede ser óptima en primates, con base en la observación de que la respuesta hipercalcémica de los monos cynomolgus OVX a una inyección subcutánea simple de PTH- (1-34) -Fc (10-34 nmol/kg) persistieron por aproximadamente 168 horas (Figura 11) . Esta observación sugiere que una dosis subcutánea simple de PTH- (1-34) -Fc en primates es despejada dentro de aproximadamente 1 semana, que podría también representar la frecuencia de dosificación máxima requerida para los efectos anabólicos. Formas de Dosificación Oral. Contempladas para el uso en la presente, están las formas de dosis sólida oral, las cuales son descritas en general en el Capítulo 89 de Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18a Edición, Mack Publishing Co. Easton PA 18042, la cual se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad. Las formas de dosis sólidas incluyen tabletas, cápsulas, pildoras, pastillas o trociscos, esferas o pellas. También puede ser utilizado el encapsulamiento liposomal o proteinoide para formular las presentes composiciones (como por ejemplo, las microesferas proteinoides reportadas en la Patente de los Estados Unidos No. 4,925,673). El encapsulamiento liposomal puede ser utilizado y los liposomas pueden ser derivatizados con diversos polímeros (por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No. 5,013,556). Una descripción de las formas de dosis sólidas posibles para el agente terapéutico se da en el Capítulo 10 de Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), editado por G.S. Banker y C. T. Rodees, incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. En general, la formulación incluirá el compuesto de la invención, y los ingredientes inertes que permiten la protección contra el ambiente estomacal, y la liberación del material biológicamente activo en el intestino. __ También contempladas específicamente están las formas de dosis oral de los compuestos de la invención anteriormente descritos. Si es necesario, los compuestos pueden ser químicamente modificados de modo que la administración oral es eficaz. En general, la modificación química contemplada es el acoplamiento de al menos una porción a la molécula misma del compuesto, donde la porción permite (a) la inhibición de la proteolisis; (b) la captación en la corriente sanguínea desde el estómago o el intestino. También se desea el incremento en la estabilidad total del compuesto y el incremento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Porciones útiles como vehículos covalentemente enlazados en esta invención, pueden también ser utilizadas para este propósito. Los ejemplos de tales porciones incluyen: PEG, Copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y poliprolina. Ver, por ejemplo, Abuchowski y Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Encimes as Drugs (1981), Hocenber y Roberts, eds., Wiley-Interscience, Nueva York, NY, p. 367-83; Newmark et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4: 185-9. Otros polímeros que podrían ser utilizados son poli-1,3-dioxolano y poli-1, 3, 6-tioxocano. Preferidas para el uso farmacéutico, como se indicó anteriormente, son las porciones PEG. __ Para las* formas de dosis de administración oral, es también posible utilizar una sal de un aminoácido alifático modificado, tal como el N-(8-[2-hiroxibenzoil] amino) caprilato de sodio (SNAC) , como un portador para aumentar la absorción de los compuestos terapéuticos de esta invención. La eficacia clínica de una formulación de heparina utilizando SNAC ha sido demostrada en una prueba en Fase II conducida por Emisphere Technologies. Ver Patente de los Estados Unidos No. 5,792,451, "Composición de administración oral de fármacos y métodos". Los compuestos de esta invención pueden ser incluidos en la formulación como microparticulados finos en la forma de granulos o pellas de tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La formulación del material para la administración de cápsulas podría ser también como un polvo, granulos ligeramente comprimidos o incluso como tabletas. El agente terapéutico podría ser preparado mediante compresión. Los colorantes y agentes saborizantes pueden también ser incluidos. Por ejemplo, la proteína (o derivado) puede ser formulada (tal como mediante encapsulamiento en liposomas o en microesferas) y luego adicionalmente contenido dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contiene agentes colorantes y saborizantes. Se puede diluir o incrementar el volumen del compuesto de la invención con un material inerte. Estos diluyentes podrían incluir carbohidratos, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sucrosa, dextranos modificados y almidón. Ciertas sales orgánicas pueden también ser utilizadas como rellenadores, incluyendo trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell. Los desintegradores pueden ser incluidos en la formulación del agente terapéutico en una forma de dosis sólida. Los materiales utilizados como desintegradores incluyen, pero no están limitados a almidón, incluyendo el desintegrador comercial basado en almidón, Explotab. El glicolato de almidón de sodio, Amberlite, carboximetilcelulosa de sodio, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, cascara de naranja, carboximetilcelulosa acida, esponja natural y bentonita pueden todos ser utilizados también. Otra forma más de los desintegradores son las resinas de intercambio catiónico insolubles. Las gomas en polvo pueden ser utilizadas como desintegradores y como aglutinantes, y éstas pueden incluir gomas en polvo tales como agar, Karaya o tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio son también útiles como desintegradores . Los aglutinantes pueden ser utilizados para mantener unido el agente terapéutico para formar una tableta dura, e incluyen materiales provenientes de productos naturales tales como acacia, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC) , etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC) . La polivinilpirrolidona (PVP) y la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) podrían ser ambas utilizadas en soluciones alcohólicas para granular el producto terapéutico. Un agente antifricción puede ser incluido en la formulación del agente terapéutico, para prevenir la adherencia durante el proceso de formulación. Pueden ser utilizados lubricantes como una capa entre el agente terapéutico y la pared del troquel, y éstos pueden incluir, pero no están limitados a; ácido esteárico, incluyendo sus sales de magnesio y de calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. Pueden también ser utilizados lubricantes solubles tales como laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000. Los deslizantes que pueden mejorar las propiedades del flujo del fármaco durante la formulación y para ayudar al reacomodo durante la compresión, pueden ser también agregados: Los deslizantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirogénica y silicoaluminato hidratado. Para ayudar a la disolución del compuesto de esta invención en el ambiente acuoso puede ser agregado un surfactante como agente humectante. Los surfactantes pueden incluir detergentes aniónicos tales como laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctil-sodio y sulfonato de dioctil-sodio. Los detergentes catiónicos pueden ser utilizados y podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que podrían ser incluidos en la formulación como surfactantes son lauro acrogol 400, estearato de polioxil 40, aceite de ricino polioxietilen-hidrogenado 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sucrosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos surfactantes podrían estar presentes en la formulación de la proteína o derivado ya sea solos o como una mezcla en diferentes proporciones. Los aditivos pueden ser incluidos en la formulación para aumentar la captación del compuesto. Los aditivos que tienen potencialmente esta propiedad son por ejemplo los ácidos grasos, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. La formulación de liberación controlada puede ser deseable. El compuesto de esta invención podría ser incorporado en una matriz inerte que permite la liberación ya sea mediante mecanismos de difusión o de lixiviación, por ejemplo, las gomas. Las matrices que se degeneran lentamente pueden también ser incorporadas en la formulación, por ejemplo, alginatos, polisacáridos. Otra forma de una liberación controlada de los compuestos de esta invención es mediante un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), por ejemplo, el fármaco está encerrado en una membrana semipermeable que permite que el agua entre o empuje el fármaco hacia afuera a través de una pequeña abertura simple debido a efectos osmóticos. Algunos recubrimientos entéricos también tienen un efecto de liberación retardada. Pueden ser utilizados para la formulación otros recubrimientos. Estos incluyen una variedad de azucares los cuales podrían ser aplicados en un tambor de recubrimiento. El agente terapéutico podría ser administrado también en una tableta recubierta con película y los materiales utilizados en este caso son divididos en 2 grupos. Los primeros son los materiales no entéricos e incluyen metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, povidona y polietilenglicoles. El segundq_ grupo consiste de- los materiales* entéricos que son comúnmente esteres de ácido ftálico. Una mezcla de materiales puede ser utilizada para proporcionar recubrimiento óptimo de la película. El recubrimiento de película puede ser llevado a cabo sobre un recubridor de tambor o en un lecho fluidizado o mediante recubrimiento por compresión. Formas de administración pulmonar. También contemplada en la presente está la administración pulmonar de la presente proteína (o derivados de la misma) . La proteína (o el derivado) es distribuida a los pulmones de un mamífero mientras que se inhala y viaja a través del revestimiento epitelial pulmonar hacia la corriente sanguínea. (Otros reportes de esto incluyen Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135-44 (acetato de leuprólido); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol 13 (suppl. 5): s. 143-146 (endotelina-1) ; Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3 : 206-12 (al-antitripsina) ; Smith et al (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (a-proteinasa) ; Oswein et al. (marzo de 1990), "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (hormona humana del crecimiento, recombinante); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140: 3482-8 (interferon-? y factor de necrosis tumoral a) y Platz et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,284,656 (factor de estimulación de colonias de granulocitos) . Contemplados para el uso en la práctica de esta invención está una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de los productos terapéuticos, incluyendo pero no limitados a nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para aquellos expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles, adecuados para la práctica de esta invención, son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., Saint Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medida Ventolín, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; y el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachussets . Todos los dispositivos tales requieren el uso de formulaciones adecuadas para el surtido del compuesto de la invención. Típicamente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado y puede involucrar el uso de un material propelente apropiado, además de los diluyentes, adyuvantes y/o portadores útiles en terapia.
El compuesto de la invención debe ser más ventajosamente preparado en forma particulada con un tamaño de partícula promedio menor de 10 µm (o mieras), lo más preferentemente 0.5 a 5 µm, para la administración más efectiva hacia el pulmón distal. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen carbohidratos tales como trehalosa, manitol, xilitol, sucrosa, lactosa y sorbitol. Otros ingredientes para el uso en las formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Pueden ser utilizados surfactantes naturales o sintéticos. PEG puede ser utilizado (incluso aparte de su uso en la derivatización de la proteína o del análogo) . Los dextranos, tales como ciclodextrano, pueden también ser utilizados. Se pueden utilizar también las sales biliares y otros aumentadores relacionados. Se pueden utilizar la celulosa y los derivados de celulosa. Se pueden utilizar aminoácidos, tales como el uso en una formulación amortiguadora . También, es contemplado el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión u otros tipos de portadores. Las formulaciones adecuadas para el uso con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, comprenderán típicamente el compuesto de la invención disuelto en agua a una concentración de aproximadamente 0.1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por ml de solución. La formulación puede también incluir un amortiguador y un azúcar simple (por ejemplo, para la estabilización de la proteína y la regulación de la presión osmótica) . La formulación de nebulizador puede también contener un surfactante, para reducir o prevenir la agregación inducida por la superficie, de la proteína, provocado por la atomización de la solución en la formación del aerosol. Las formulaciones para el uso con un dispositivo inhalador de dosis medida comprenderán, en general, un polvo finamente dividido que contiene el compuesto de la invención suspendido en un propelente con ayuda de un surfactante. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como un clorofluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo, o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol, y 1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los surfactantes adecuados incluyen trioleato de sorbitán y lecitina de soya. El ácido oleico puede también ser útil como un surfactante. Las formulaciones para surtirse desde un dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene el compuesto de la invención y puede también incluir un agente de volumen, tal como lactosa, sorbitol, sucrosa, manitol, trehalosa o xilitol en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo 50 a 905 de la formulación. Formas de administración nasal . La administración nasal del compuesto de la invención es también contemplada. La administración nasal permite el paso de la proteína hacia la corriente sanguínea directamente después de la administración del producto terapéutico a la nariz, sin la necesidad para la deposición del producto en el pulmón. Las formulaciones para la administración nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano. La administración vía el transporte a través de otras membranas mucosas es también contemplada. Dosificaciones . El régimen de dosificación involucrado en un método para tratar las condiciones anteriormente mencionadas será determinado por el médico que atiende, considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la edad, la condición, el peso corporal, el seco y la dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. En general, el régimen diario debe estar en el intervalo de 0.1-1000 microgramos del compuesto de la invención por kilogramo de peso corporal, preferentemente 0.1-150 microgramos por kilogramo.
Modalidad preferidas especificas Los inventores han determinado las estructuras preferidas para los péptidos preferidos listados en la Tabla 4 siguiente. El símbolo "?" puede ser cualquiera de los ligadores descritos en la presente o pueden representar simplemente un enlace peptídico normal (por ejemplo, de modo que no está presente ningún ligador) . Las repeticiones en tándem y los ligadores son mostrados separados por guiones, por claridad.
Tabla 4 - Modalidad preferidas "F " es un dominio Fc como se describe previamente en la presente. Además de aquellos listados en la Tabla 4, los inventores contemplan además los heterodímeros en los cuales cada hebra de un dímero Fc está ligada a una secuencia peptídica diferente; por ejemplo, una molécula en la cual una hebra puede ser descrita por la SEQ ID No. 166, la otra por la SEQ ID No. 170 o un Fc ligado con cualquiera de las secuencias en las Tablas 1 y 2. Todos los compuestos de esta invención pueden ser preparados mediante los métodos descritos en la solicitud del PCT No. WO99/25044. La invención será ahora adicionalmente descrita por los siguientes ejemplos de trabajo, los cuales son ilustrativos en vez de limitantes.
Ejemplo 1 BIOACTIVIDAD DE ÜN AGONISTA DEL RECEPTOR DE PTH/PTHrP (PTH- Rl) CONJUGADO A Fc [PTH- (1-34) -Fc] INTRODUCCIÓN La hormona paratiroidea [PTH- (1-34) o PTH- (1-84) nativa] provoca formación incrementada del hueso y masa ósea incrementada cuando se inyectan diariamente. Se pensaba previamente que esta respuesta anabólica requería la breve exposición a PTH, lo cual es facilitado por la vida media corta (menos de 1 hora) de la PTH. Clínicamente, el efecto anabólico de la terapia con PTH requiere inyección subcutánea diaria, lo cual es una barrera significativa para el uso difundido de la PTH. Inyecciones menos frecuentes de PTH podrían ser clínicamente deseables y podrían ser logradas mediante el incremento de la vida media in vivo de la PTH. la exposición a corto plazo (intermitente) a la PTH (< 1 hora/día) estimula la formación ósea osteoblástica, mientras que la exposición a largo plazo __(>2 horas/día) estimula la resorción ósea osteoclástica (Dobnig et al., Endocrinology 138: 4607, 1998). La técnica sugiere que la PTH con una vida media extendida por sí misma puede incrementar la resorción ósea y conducir a la hipercalcemia. No obstante, debería ser posible prevenir la actividad de los osteoclastos inducida por PTH, con los inhibidores de la resorción ósea. La osteoprotegerina (OPG) puede ser muy adecuada para este propósito. Un tratamiento simple de las ratas, ratones o humanos con OPG-Fc provoca inhibición sostenida de la resorción ósea, al erradicar esencialmente la población de osteoclastos. La co-administración de un potente inhibidor de la resorción ósea, como OPG, puede proporcionar mayor efecto. Este régimen podría permitir teóricamente la estimulación no opuesta de la formación del hueso por la PTH, conduciendo a masa ósea incrementada. Es probable que otros inhibidores de la resorción ósea, incluyendo los bisfosfonatos o estrógeno, podrían también inhibir la resorción ósea inducida por PTH, y podrían por lo tanto ser utilizados en combinación con una molécula de PTH de acción prolongada. Hacia esta meta, se ha clonado, expresado y purificado la PTH- (1-34) -Fc humana. La conjugación con Fc de la proteína provoca un incremento significativo en su vida media en circulación, lo cual puede permitir inyecciones de PTH-(1-34) -Fc en un esquema similar o idéntico a aquel de OPG-Fc. Los beneficios de ' esta invención incluyen inyecciones menos frecuentes de PTH, a partir del estándar actual de una vez al día hasta tan frecuentemente como una vez por trimestre.
MATERIALES, MÉTODOS Y RESULTADOS Ensayo de Hipercalcemia Se probó la potencia y duración del efecto de PTH- (1-34) -Fc en un modelo de hipercalcemia murina. En resumen, los ratones fueron inyectados una vez subcutáneamente con dosis variantes de PTH- (1-34) o PTH-(1-34) -Fc, y se recolectó sangre periférica del seno retroorbital para la determinación del calcio ionizado en sangre. La vida media y la potencia de PTH- (1-34) -Fc fue mayor que aquella de PTH- (1-34), como se pone en evidencia por la respuesta hipercalcémica sostenida de los ratones al primer agente (Figura 4) . La hipercalcemia inducida por PTH- (1-34) persistió por 6-24 horas, mientras que dosis equimolares de PTH- (1-34) -Fc provocaron hipercalcemia más sostenida (48-72 horas) . Esta duración de la respuesta es consistente con la vida media mayor de la construcción de PTH- (1-34) -Fc versus PTH- (1-34). La potencia de PTH-(1- 34) -Fc fue también significativamente mayor que aquella de PTH- (1-34) (Figura 4). La más alta dosis de PTH- ( 1-34) -Fc provocó un mayor incrementó en los niveles pico de calcio ionizado, en comparación con una dosis equimolar de PTH-(1-34) . El análisis del área bajo la curva (AUC) demostró que a la más alta dosis empleada, PTH- (1-34) -Fc provocó una respuesta hipercalcémica mayor de 2.6 veces que la que provocaron dosis equimolares de PTH- (1-34).
Ensayo Anabólico Habiendo demostrado la farmacología superior y la vida media de PHT- (1-34) -Fc sobre PHT-(l-34), se condujo un estudio piloto para determinar si el co-tratamiento con PTH- (1-34) -Fc con OPG-Fc podría incrementar la masa ósea. En resumen, ratas Sprague Dawley (SD) de 6 meses de edad fueron divididas en grupos de 6. La densidad del mineral óseo de línea base (BMD) , fue determinada en la tercera vértebra lumbar (L3) de todas las ratas mediante absortimetría de rayos X de energía doble (DEXA) (Día 0) . Las ratas fueron luego tratadas de acuerdo al siguiente esquema: Grupo 1: Controles con vehículo (PBS, inyectada subcutáneamente, días 1, 3 y 5) Grupo 2: Inyección subcutánea simple OPG-Fc (1 mg/kg) en el dia 1 Grupo 3: PTH- (1-34), inyecciones _ subcutáneas en los días 1, 3 y 5, a 20 nmoles de PTH/kg/inyección. Esto representa un régimen de PTH anabólico óptimo. Grupo 4: Lo mismo que el grupo 3, pero con una inyección OPG-Fc simple en el día 1. Grupo 5: Inyección subcutánea simple de PTH-(1-34) -Fc a 60 nmoles/kg, en el día 1. Esto representa una dosis molar que es equivalente a la dosis total de PTH-(1-34) recibida por el grupo 3, pero en una inyección única. Grupo 6: Lo mismo que el grupo 5, pero con una inyección de OPG-Fc simple (subcutánea, 1 mg/kg) en el día 1. Se realizó la DEXA de la espina lumbar nuevamente en el día 7 para evaluar los cambios en BMD. BMD en L3 se incrementó modestamente con una inyección única de OPG-Fc, o con 3 inyecciones de PTH- (1-34), en comparación a las ratas tratadas con PBS (Figura 5). PTH- (1-34) + OPG provocó un incremento mayor en BMD que OPG o PTH- (1-34) solo. Como una monoterapia, una inyección simple de PTH- (1-34) -Fc falló en incrementar BMD. No obstante, una inyección simple de PTH- (1-34) -Fc más una inyección simple de OPG-Fc provocó un incrementó significativo en BMD (Figura 5) . Este resultado proporciona la prueba del principio de que una construcción de PTH con vida media en circulación, extendida, puede ser combinada con un anti-resortivo potente, como OPG-Fc, para crear una respuesta esquelética anabólica. El efecto anabólico de un tratamiento simple con PTH- (1-34) -Fc más OPG-Fc fue mayor que aquel inducido por inyecciones múltiples de PTH- (1-34), con o sin el co-tratamiento con OPG-Fc. En conclusión, pueden ser logradas ganancias máximas en BMD con inyecciones no frecuentes de PTH- (1-34) -Fc + OPG-Fc, el cual es un régimen de tratamiento superior en comparación a PTH- (1.-34), que debe ser inyectado diariamente o cada tercer día. La Figura 5 muestra el efecto de PTH-Fc + OPG-Fc sobre la densidad mineral ósea (BMD) en la tercera vértebra lumbar (L3) . Ratas macho normales de 6 meses de edad fueron tratadas con PTH-Fc o PTH o vehículo, mediante una inyección subcutánea simple. Algunas ratas también recibieron una inyección subcutánea simple de OPG. Se determinó BMD 7 días después mediante DEXA. Los datos representan las medias + SD, n = 6 ratas/grupo.
Ejemplo 2 BIOACTIVIDAD DE UN ANTAGONISTA DEL RECEPTOR DE PTH/PTHrP (PTH-R1) CONJUGADO A Fc ( [AsnlO ,Leull] PTHrP- (7-34) -Fc) INTRODUCCIÓN Varios estados de enfermedad están asociados con los niveles incrementados en circulación de PTH o PTHrP. El -hiperparatiroidismo primario y secundario (PHPT y SHPT, respectivamente) , están asociados con niveles de PTH incrementados, mientras que la hipercalcemia humoral de la malignidad (HHM) da como resultado niveles elevados de PTHrP. Ambas proteínas señalan a través del receptor PTH/PTHrP (PTH-Rl) para provocar incrementos en la resorción ósea, reabsorción renal de calcio, y biosíntesis renal de la vitamina D. Mientras que los inhibidores de la resorción ósea tienen éxito variable en inhibir la resorción ósea osteoclástica en estos estados de enfermedad, ninguna terapia actualmente mitiga la influencia renal e intestinal del exceso de PTH o PTHrP sobre la calcemia. Los agentes que antagonizan directamente la señalización de PTH o PTHrP son por lo tanto probable que tengan mayor eficacia en comparación a los inhibidores de la resorción. Los antagonistas más estudiados de la señalización de PTH-Rl están basados en los truncamientos amino-terminales. Los péptidos PTH- (7-34) son antagonistas de PTH-Rl claramente efectivos, con actividad agonista muy leve. En comparación a PTH- (7-34), el péptido PTHrP- (7-34) tiene mayor afinidad por PTH-Rl, y como tal es un antagonista más potente. No obstante, PTHrP- (7-34) tiene también mayor actividad agonista (pero todavía leve) en comparación a PTH- (7-34) (McKee (1990), Endocrinol. 127: 76)'. El antagonista óptimo puede combinar el agonismo más débil PTH- (7-34) con el antagonismo más fuerte de PTHrP- (7-34). Nutt et al. (1990), Endocrinol. 127: 491, demuestra que sustituyendo AsnlO y Leull de PTH en la secuencia de PTHrP (reemplazando AsplO y Lysll) da como resultado un péptido ( [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc) virtualmente sin actividad agonista pero con actividad antagonista muy potente. Como la PTH nativa, todos los antagonistas de PTH-Rl basados en péptidos comparten la propiedad de vidas medias en circulación muy cortas (< 1 hora) . Además, los truncamientos amino-terminales que son requeridos para eliminar el agonismo del receptor, también reducen significativamente la afinidad de estos péptidos por PTH-Rl . Estas propiedades limitan el potencial clínico de los antagonistas peptídicos convencionales. La conjugación a Fc de los péptidos PTH , o PTHrP truncados amino-terminalmente, debe incrementar significativamente su vida media en circulación, tal que el antagonismo continuo de PTH-Rl puede ser Ignorado con suficiente exposición de estos antagonista de Fc.
MATERIALES, MÉTODOS Y RESULTADOS Se clonó, se expresó y se purificó [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc. Se probó la habilidad de este compuesto para antagonizar Las respuestas de hipercalcemia aguda y crónica en ratones. PTHrP- (1-34) se utilizó como un agente calcémico para evaluar los efectos agudos de [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc. Debido a que PTHrP es el mediador principal de la HHM, este estudio también representa ~ un modelo para tumores inductores de hipercalcemia. En resumen, el calcio ionizado en sangre (BIC) fue medido en línea base, y los ratones fueron retados con el vehículo (PBS) o con PTHrP- (1-34) (0.5 mg/kg) mediante inyección subcutánea. Los ratones fueron luego tratados una vez subcutáneamente con dosis variantes de [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc, o con vehículo (PBS). En ratones tratados con el vehículo, retados con PTHrP- (1-34) , se observó una respuesta hipercalcémica transitoria. La respuesta calcémica pico ocurrió a las 3 horas después del reto, y persistió hasta al menos 6 horas después del reto. [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc a 10 mg/kg provocó una normalización más rápida de la hipercalcemia inducida por PTHrP en comparación al tratamiento con vehículo. Una dosis de 30 mg/kg bloqueó completamente la respuesta calcémica de PTHrP- (1-34) (Figura 6).
Con el fin de probar la habilidad de [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc para antagonizar la hipercalcemia más "crónica, se utilizó PTH- (1-34) -Fc como un agente calcémico de acción prolongada. Este estudio también representa un modelo para el hiperparatiroidismo primario y secundario, enfermedades que están caracterizadas por elevación persistente de los niveles de PTH. En ratones tratados con vehículo, una inyección subcutánea simple de PHT- (1-34) -Fc (30 mg/kg) provocó una respuesta hipercalcémica robusta en ratones normales, alcanzando un nivel de 2.75 mg/decilitro a las 24 horas después del reto (versus valor control normal de 1.35) . Una inyección subcutánea simple de [AsnlO, Leull] PTHrP-) (7-34) -Fc a 10-100 mg/kg provocó una disminución significativa en la respuesta hipercalcémica pico de PTH- (1-34) -Fc a las 24 horas (Figura 6) . En conclusión, se ha demostrado la actividad antagonista de [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc, en modelos animales agudos y crónicos de hipercalcemia. Estos modelos emplearon agentes calcémicos basados en PTH y en las secuencias de PTHrP. Estos datos sugieren que [AsnlO, Leull] PTHrP- (7-34) -Fc, así como otros antagonistas de PTH-Rl conjugados a Fc, pueden ser opciones de tratamiento efectivas para el hiperparatiroidismo, HHM, y otras enfermedades asociadas con la señalización aberrante de PTH-Rl.
Ejemplo 3 PROPIEDADES OSTEOGENICAS DE LOS FRAGMENTOS DE PTH C- TERMINALMENTE TRUNCADOS, CONJUGADOS A FC Y NATIVOS A. Ensayos de cAMP Se probó la habilidad relativa de las construcciones de PTH-Fc para estimular la acumulación de cAMP en células ROS 17/2.8 similares a osteoblastos de rata. Los cultivos fueron tratados con el inhibidor de fosfodiesterasa IBMX para promover la acumulación de cAMP.
Los cultivos fueron luego retados por 15 minutos ya sea con el vehículo (PBS) , o diversas construcciones PTH. la acumulación de cAMP, dependiente de la dosis, fue demostrada a partir de todos los fragmentos. PTH- (1-34) no conjugado a Fc fue ligeramente más potente que PTH- (1-31)- Fc y PTH- (1-30) -Fc (Figura 7). Estos datos demuestran que los fragmentos de PTH conjugados a Fc mantienen la habilidad para activar la vía de AC en los osteoblastos.
B. Bioensayo en Ratón Se probaron luego los efectos de PTH- (1-34 PTH- (1-34) -Fc, PTH- (1-31) -Fc y PTH- (1-30 ) -Fc en ratones. Ratones macho de cuatro semanas de edad fueron inyectados en " los días 0, 5 y 10 con vehículo o con los fragmentos de PTH, mediante inyección subcutánea. Se obtuvo sangre periférica para la química clínica a las 24, 48 y 72 horas. Los ratones fueron sacrificados en el día 15, se retiraron las vértebras, las tibias y los fémures para la histología y una tibia fue recolectada para las mediciones de la densidad ósea (tomografía computarizada cuantitativa, periférica, pQCT) . Los puntos finales de la química clínica incluyeron el calcio sérico total, fosfatasa alcalina sérica (AP, un marcador de la actividad de los osteoblastos) , y fosfatasa acida resistente al tartrato, sérica (TRAP, un marcador de la actividad de los osteoplastos) . A cada animal, se calculó la proporción de A : TRAP como un índice de la actividad relativa de los osteoblastos en comparación a la actividad de los osteoclastos. Una proporción AP:TRAP más alta podría indicar un agente potencialmente más anabólico. Dosis relativamente altas (15 veces mayores que las dosis anabólicas óptimas) fueron seleccionadas con base en los estudios previos, que demostraron cambios significativos en los puntos finales de la química clínica. Se anticipó que dosis más bajas pueden ser requeridas para demostrar los efectos anabólicos sobre la densidad ósea, y que el co- tratamiento anti-resortivo puede ser también requerido para lograr las respuesta anabólicas. _ Los resultados de la química clínica son demostrados en la Figura 8. El calcio en suero no fue significativamente diferente a las 24, 48 ó 72 horas después de la inyección de 300 nmoles/kg (1.2 mg/kg) de PTH- (1-34). Este resultado es consistente con la vida media corta del péptido no conjugado a Fc, el cual normalmente provoca un incremento transitorio (12 horas) en el calcio en suero. En contraste, una dosis equimolar de PTH- (1-34) -Fc provocó un incremento dramático y sostenido en el calcio sérico, que alcanzó máximo las 24 horas. PTH- (1-31) -Fc fue un agente calcémico más potente, mientras que PTH- (1-30) -Fc fue el menos calcémico de los tres péptidos de Fc (Figura 8A) . El AP sérico (marcador de osteoblastos) no fue cambiado por la administración de PTH- (1-34), pero se elevó significativamente por 300 nmoles/kg de PTH-(1-34) -Fc y por PTH- (1-31) -Fc a las 72 horas. PTH- (1-30) -Fc demostró la mayor elevación de AP, que alcanzó un máximo 72 horas después de la inyección de 1,000 nmoles/kg (Figura 8B) . TRAP sérico (marcador de osteoclastos) no fue significativamente cambiado por PTH- (1-34), PTH- (1-34 ) -Fc o PTH- (1-30) -Fc, pero fue dramáticamente incrementado por PTH- (1-31) -Fc (Figura 8C) . Las proporciones calculadas de AP:TRAP no fueron cambiadas por PTH- (1-34), y fueron incrementadas con el tiempo por PTH- (1-34) -Fc. La baja dosis de PHT- (1-31) -Fc (100 nmoles/kg) incrementó AP:TRAP, mientras que la 'alta dosis (1,000 nmoles/kg) disminuyó AP:TRAP. El mayor incremento en AP:TRAP fue realizado con PTH- (1-30) -Fc (1,000 nmoles/kg) (Figura 8D) . Los efectos de las diversas construcciones de PTH sobre la densidad mineral ósea (metafisis tibial proximal) son demostrados en la Figura 9. Al final del estudio de 15 días, se observó que PTH- (1-34) (300 nmoles/kg) tiene un efecto anabólico modesto (no significativo) , cuando se inyecta en el día 0, en el día 5 y en el día 10. PHT-(1-34) -Fc (300 nmoles/kg) no tuvo efecto sobre la densidad ósea, ni tampoco PTH- (1-31) -Fc a 100 nmoles/kg. Más altas dosis de PTH- (1-31) -Fc (300-1,000 nmoles/kg) provocaron toxicidad significativa relacionada a la hipercalcemia, y los huesos no fueron cosechados de estos animales para pQCT. PTH- (1-30) -Fc provocó el mayor incremento en la densidad ósea. Existió una aparente respuesta inversa a la dosis, donde PTH- (1-30) -Fc a 100 nmoles/kg tuvo el mayor efecto y a 1,000 nmoles/kg tuvo el menor efecto, aunque a todas las dosis BMD fue mayor que en los controles (Figura 9) . La respuesta a la dosis, inversa, fue consistente con la noción de que las dosis empleadas (elegidas para los puntos finales de la química clínica) fueron 5-50 veces mayores que las dosis anabólicas óptimas. Dosis menores de PTH (o PTH-Fc) que fallan en incrementar significativamente el calcio en suero, son óptimas para los efectos anabólicos. Ver "Hock, J.M. (1992), J. Bone Min. Res. 7: 65-72. En el estudio actual, el régimen de tratamiento con el mayor efecto anabólico (PTH- (1-30) -Fc a 100 nmoles/kg) fue también el único tratamiento con. PTH-Fc que falló en incrementar significativamente el calcio en suero (Figura 8A) . Estos datos demuestran los efectos anabólicos potenciales de los péptidos PTH-Fc C-terminalmente truncados. La vida media más prolongada conferida por la conjugación a Fc, combinada con la estimulación selectiva de AC/cAMP por truncamientos C-terminales, pueden explicar el efecto anabólico en ausencia de un potente inhibidor de la resorción ósea. Se espera que el truncamiento C-terminal de PTH- (1-30) -Fc revelará fragmentos más cortos que mantienen o exceden el perfil anabólico de PTH- (1-30)-Fc. Estos fragmentos pueden ser más selectivos al estimular los osteoblastos, y pueden ser menos calcémicos, proporcionando de este modo una ventana terapéutica más amplia para la terapia anabólica.
Ejemplo 4 TRATAMIENTO CON PTH-Fc COMO UNA MONOTERAPIA La eficacia de PTH- (1-34) -Fc como una monoterapia fue demostrada en ratones adultos. En resumen, los ratones BDFl macho (4 meses de edad) fueron tratados dos veces por semana por inyección subcutánea con diversas dosis de PTH-(1-34) -Fc o con el vehículo (PBS). Otros ratones fueron tratados diariamente con inyecciones subcutáneas de PTH-(1.34) a una dosis de 80 µg/kg/día (20 nmol/kg/día) , un régimen de tratamiento que es óptimo para incrementar la masa ósea en roedores (M. Gunnes-Hey y J.M. Hock, Metab. Bone Dis . & Reí . Res . 5: ^177-181, 1984). Después de 3 semanas, los ratones fueron sacrificados y las tibias fueron analizadas para la densidad mineral ósea (BMD) vía pQCT (Figura 10) . La BMD tibial total y la BMD cancelosa fueron ambas significativamente incrementadas por inyecciones diarias de PTH- (1-34), en comparación a los controles tratados con vehículo (Figura 1, ANDEVA de dos vías, p<0.05). Inyecciones dos veces a la semana de PTH- (1-34)-Fc provocaron incrementos dependientes de la dosis en la BMD total y cancelosa, las cuales, a las dosis más altas (50 y 150 nmol/kg) , fueron significativamente mayores que los efectos ya sea del vehículo o de PTH- (1-34) diaria. La BMD cortical en la tibia no fue significativamente aumentada por los tratamientos diarios con PTH- (1-34). PTH- (1-34) -Fc dos veces a la semana provocó un incremento dependiente de la dosis en la BMD cortical la cual, a la dosis más alta, fue significativamente mayor que aquella observada en ratones tratados con vehículo o con PTH- (1-34) (p<0.05) . PTH- (1-34) -Fc dos veces a la semana también incrementó de manera efectiva la BMD como una monoterapia en ratas ovariectomizadas (OVX) de edad avanzada. Ratas Sprague Dawley fueron ovariectomizadas (OVX) a los 3 meses de edad y se dejaron perder hueso por 11 meses. Otras ratas fueron pseudo-operadas y tratadas dos veces por semana con vehículo (PBS) . Las ratas OVX fueron tratadas dos veces por semana con inyecciones subcutáneas ya sea de vehículo o de APD bisfosfonato (pamidronato, 0.5 mg/kg), o con PTH- (1-34) -Fc (50 nmol/kg) o con APD + PTH- (1-34 ) -Fc. La BMD fue determinada semanalmente vía la absortimetría de rayos X de energía doble (DEXA) . Las ratas fueron sacrificadas después de 4 semanas de tratamiento. Al inicio del tratamiento, las ratas OVX tuvieron reducciones significativas en BMD en todos los sitios esqueléticos analizados, en comparación a las ratas OVX tratadas con el vehículo (Figura 11, p<0.05, ANDEVA de 2 vías). APD sola no incrementó significativamente la BMD en ningún sitio esquelético en comparación a las ratas OVX tratadas con vehículo. La PTH- (1-34) -Fc sola provocó un incremento significativo en BMD en la metafisis femoral después de 4 semanas de tratamiento (p<0.05). El tratamiento de las ratas OVX con PTH + ABD estuvo asociado con un incremento significativo más" temprano en BMD en este sitio (3 semanas). La combinación de APD + PTH- (1-34) -Fc también provocó un incrementó significativo en BMD en las vértebras lumbares y en la metafisis femoral (p<0.05). PTH- (1-34) -Fc solo provocó una respuesta hipercalcémica leve y transitoria que se resolvió espontáneamente después del día 10 a pesar de tratamientos continuos. La co-administración de APD bloqueó completamente el efecto calcémico de PTH-(1-34)-Fc. Estos datos sugieren que PTH- (1-34) -Fc es un agente anabólico efectivo cuando se utiliza como una monoterapia en ratones adultos y en ratas OVX de edad avanzada. Se ha demostrado también que la adición de un agente anti-resortivo (APD) a PTH- (1-34) -Fc estuvo asociada con incrementos similares o más rápidos en BMD en ratas OVX de edad avanzada. La co-administración de APD también bloqueó la respuesta hipercalcémica transitoria producida por PHT- (1-34) -Fc, lo cual sugiere que el índice terapéutico de PTH- (1-34) -Fc pudo ser significativamente mejorado por la co-administración de un agente anti-resortivo efectivo. Habiendo sido ahora completamente descrita la invención, será aparente para una persona de experiencia ordinaria en la técnica, que pueden ser realizados en ésta muchos cambios y modificaciones, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se describe en la presente.
Abreviaturas AC adenilato-ciclasa AP fosfatasa alcalina BMD densidad mineral ósea cAMP monofosfato de adenosina cíclica DEXA absortimetría de rayos X de energía doble HHM hipercalcemia humoral de malignidad OPG osteoprotegerina OVX o ariectomizada PBS solución salina amortiguada con fosfato pQCT tomografía computarizada cuantitativa periférica PTH hormona paratiroidea PTHrP proteína relacionada la hormona paratiroidea TRAP fosfatasa acida resistente al tartrato Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (79)

  1. REIVINDICACIONES
  2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una composición de materia de la fórmula y multímeros de la misma, caracterizada porque: F1 es un vehículo y está enlazado en el extremo C de P1-(L1)a; P1 es un dominio de modulación de PTH/PTHrP; L1 es un ligador; y a es 0 ó 1. 2. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene la fórmula P^F1.
  3. 3. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque F1 es un dominio Fc.
  4. 4. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque F1 es un dominio Fc de IgG.
  5. 5. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque F1 es un dominio Fc de IgGl.
  6. 6. La composición de materia de -conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque F1 comprende la secuencia de lá SECT ID No. 2. 7. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio de modulación de PTH/PTHrP es de la fórmula ?NH?10?ll?l2 ??l4?15?16?lT?l8?19R?21?22?23?2 ?25?26?27?- 8?c
  7. (SEQ ID No. 3) en donde: X" está ausente es X3X X5X6XJ X2X3X4X5X6X7
  8. X1X2X3X4X5X6X7 , o YX1X2X3X X5X6X7 ; X1 a X7' X1C , X11 , X12 , X14 a X28 son cada uno independientemente residuos de aminoácidos ; Xc está ausente o es X 29 , ?- -93XV30 , ?29?30?31?32 ?29?30?31?32?33 ?29?30?31?32?33?34 X29?3°X31?32?33X4?35 o X29X30X31X32X 3X34X35X36; X29 a X36 son cada uno independientemente residuos de aminoácidos. 8. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque: XN es X1X2X3X4X5X6X7, X1 es un residuo hidrofílico o no funcional; X2 es V; Xj es S; Xq es E;
  9. X es un residuo no funcional o básico; X6 es Q; X7 es L; * X10 es un residuo ácido o hidrofílico; X11 es un residuo no funcional o básico; X12 es un residuo no funcional; X14 es un residuo básico o hidrofílico; X15 es un residuo no funcional; X16 es un residuo no funcional o hidrofílico; X 17 es un residuo ácido, hidrofílico o no funcional; X es un residuo no funcional; X19 es un residuo ácido o básico; Xr21 es un residuo no funcional o básico; X 2 es un residuo hidrofílico, ácido o aromático; X23 es un residuo aromático o lipofílico; X24 es un residuo lipofílico (L preferido) ; X25 es un residuo hidrofílico o básico; X26 es un residuo hidrofílico o básico; X 27 es un residuo lipofílico, básico o no funcional; y X28 es un residuo lipofílico o no funcional. 9. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: Xc es X29X30X31X32X3V34 ;
  10. X,29 es un residuo hidrofílico o no funcional; Xr30 es un residuo hidrofílico o ácido; X31 es un residuo lipofílico o no funcional; X32 es H; X33 es un residuo hidrofílico; y X34 es un residuo no funcional o aromático. 10. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: Xc es X29X30X31: X29 es un residuo hidrofílico o no funcional; y X30 es un residuo hidrofílico o ácido. X31 es un residuo lipofílico o no funcional.
  11. 11. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: Xc es X29X30; X29 es un residuo hidrofílico o no funcional; X30 es un residuo hidrofílico o ácido;
  12. 12. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: Xc es X29; y X29 es un residuo hidrofílico o no funcional.
  13. 13. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque Xc está ausente.
  14. 14. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: X" es A, S o Y; X5 es H o I; X10 es" N o D; X11 es L, R o K; X12 es G, F o W; X14 es H o S; X15 es L o I; X16 es Q, N, S o A; X17 es S, D o L; X18 es M, L, V o Nle; X19 es E o R; X21 es V, M, R o Nle; X22 es E o F; X23 es W o F; X25 es R o H; X26 es K o H; X27 es K o L; y X28 es L o I.
  15. 15. La composición de materia de conformidad con - la reivindicación 14, caracterizada porque: Xc es X29X30X31X3 X3 X34; x r29 es Q o A; X r30 es D o E; X r3a1 es V o I; X r3J3J es N o T; y X34 es A, F o Y.
  16. 16. La composición de materia de conformidad con la -reivindicación "14, caracterizada porque: Xc es X29X30X31; X29 es Q o A; X30 es D o E; y X31 es V o I.
  17. 17. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque: Xc es X29X30; X29 es Q o A; y X30 es D o E.
  18. 18. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque: Xc es X29; y X29 es Q o A.
  19. 19. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque Xc está ausente.
  20. 20. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio de modulación de PTH/PTHrP es de la fórmula JNJ7J8HNJ11J12KHLJ16SJ18J19RJ21EWLRKKLJC (SEQ ID No. 4) en donde: JN está ausente o se selecciona de J1J2J3JJ5J6, J2J3J4J5J6, J3J4J5J6; J1 es un residuo de aminoácidos; J2 es" un residuo de aminoácidos; J3 es un residuo de aminoácidos; J4 es un residuo de aminoácidos; J3 es un residuo de aminoácidos; J6 es un residuo de aminoácidos; J7 es un residuo de aminoácidos; J8 es un residuo de aminoácidos; J11 es un residuo no funcional o básico; J12 es un residuo de aminoácidos; J16 es un residuo de aminoácidos; J18 es un residuo de aminoácidos; J19 es un residuo ácido o básico; J21 es un residuo de aminoácidos; J está ausente es J 29 J29J3C\ J 9J3°J3J J29J30J31J32, J29J30J 1J32J33 , y J29 es un residuo de aminoácidos; j30 es un residuo de aminoácidos; j31 es un residuo de aminoácidos; j32 es un residuo de aminoácidos; j33 es un residuo de aminoácidos; j34 es un residuo de aminoácidos.
  21. 21. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque: JN es J1J2J3J4J5J6; J1 es un residuo no funcional o aromático; J2 es un residuo no funcional; J3 es un residuo hidrofílico; 5 J4 es un residuo ácido; J5 es un residuo no funcional; J6 es un residuo básico; J7 es un residuo no funcional o aromático; J8 es un residuo no funcional; 10 J11 es un residuo básico o no funcional; J12 es un residuo no funcional o aromático; J16 es un residuo no funcional o hidrofílico; J18 es un residuo no funcional; J19 es un residuo ácido o básico; 15 J21 es un residuo no funcional; J° es J29J30J31J32J33J34; J29 es un residuo hidrofílico o funcional; J30 es un residuo hidrofílico o ácido; J31 es un residuo lipofílico o no funcional; 20 J32 es un residuo básico; J33 es un residuo ácido; J34 es un residuo aromático.
  22. 22. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque: 25 J1 es A, S o Y; J2 es V; J3 es S; J4 es E;" J5 es I; J6 es Q; J7 es L o F; J8 es M o Nle; J11 es L, R o K; J12 es G o W; 10 J16 es N, S o A; J18 es M, Nle, L o V; J19 es E o R; J21 es V, M o Nle; J29 es Q o A; 15 J30 es D o E; J31 es V o I; J32 es H; J33 es N; y J34 es F o Y. 20
  23. 23. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque: JN es J1J2J3J4J5J6; J1 es un residuo no funcional o aromático; J2 es un residuo no funcional; 25 J3 es un residuo hidrofílico; J es un residuo ácido; J5 es un residuo no funcional; J5 es un" residuo básico; J7 es un residuo no funcional o aromático; J8 es un residuo no funcional; J11 es un residuo básico o no funcional; J12 es un residuo no funcional o aromático; J16 es un residuo no funcional o hidrofílico; J18 es un residuo no funcional; 10 J19 es un residuo ácido o básico; J21 es un residuo no funcional; Jc es J29J30J31; J29 es un residuo hidrofilico o no funcional; J30 es un residuo hidrofílico o ácido; y 15 J31 es un residuo lipofílico o no funcional.
  24. 24. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque: J1 es A, S o Y; J2 es V; 20 J3 es Si J4 es E; J5 es I, J6 es Q; J7 es L o F; 25 J8 es M o Nle; J rl±lx es L, R o K; J12 es G o W; J16 es N", S o A; J18 es M, Nle , L o V; J19 es E o R; J21 es V, M o Nle; J29 es Q o A; J30 es D o E ; y J31 es V o I . 10
  25. 25. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque: JN es J1J2J3J4J5J6; J1 es un residuo no funcional o aromático; J2 es un residuo no funcional; 15 J3 es un residuo hidrofílico; J4 es un residuo ácido; J5 es un residuo no funcional; J6 es un residuo básico; J7 es un residuo no funcional o aromático; 20 J8 es un residuo no funcional; J11 es un residuo básico o no funcional; J12 es un residuo no funcional o aromático; J16 es un residuo no funcional o hidrofílico; J18 es un residuo no funcional; 25 J?-19 es un residuo ácido o básico; J es un residuo no funcional; e ^s„ J t 9 J t30 , J es urt residuo hidrofílico o no funcional; y J30 es un residuo hidrofílico o ácido.
  26. 26. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque: J1 es A, S o Y; J2 es V; J es S ; J4 es E ; J5 es I ; J6 es Q ; J7 es L o F; J8 es M o Nle; rll es L, R o K; rl2 es G o W; J G16? es N, S O A; J t1?8a es M, Nle , L o V; J 1-19 * es E o R; J 1-2^1 es V, M o Nle ; J r2"9 es Q o A; y J30 es D o E .
  27. 27. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque: JN es J1J2J3J4J5J6; J1 es un residuo no funcional o aromático; J2 es un residuo no funcional; __ J3 es un* residuo hidrofflico; J4 es un residuo ácido; J5 es un residuo no funcional; J6 es un residuo básico; J7 es un residuo no funcional o aromático; J8 es un residuo no funcional; J11 es un residuo básico o no funcional; 10 J12 es un residuo no funcional o aromático; J16 es un residuo no funcional o hidrofílico; J18 es un residuo no funcional; J19 es un residuo ácido o básico; J21 es un residuo no funcional; 15 Jc es J29; y J29 es un residuo hidrofílico o no funcional.
  28. 28. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque: J1 es A, S o Y; 20 J2 es V; J3 es S; J es E; J° es I, Jb es Q; 25 J' es L o F; Jb es M o Nle ; J rl1 l es L , R o K; J rlx2 es G" o W; r16a es N , S o A; J r1±8c es M, Nle , L o V; J19 es E o R; J21 es V, M o Nle ; y J29 es Q o A .
  29. 29. La composición de materia de conformidad con 10 la reivindicación 20, caracterizada porque: JN es J1J2J3J4J5J6; J1 es un residuo no funcional o aromático; J2 es un residuo no funcional; J3 es un residuo hidrofílico; 15 J4 es un residuo ácido; J5 es un residuo no funcional; J6 es un residuo básico; J7 es un residuo no funcional o aromático; J8 es un residuo no funcional; 20 J11 es un residuo básico o no funcional; J12 es un residuo no funcional o aromático; J16 es un residuo no funcional o hidrofílico; J18 es un residuo no funcional; Jr!9 es un residuo ácido o básico; 25 J21 es un residuo no funcional; J es ausente.
  30. 30. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque: J1 es A, S o Y; J2 es V J3 es S J4 es E J5 es I J6 es Q; J7 es L o F; J8 es M o Nle; J11 es L, R o K; J12 es G o W; J16 es N, S o A; J18 es M, Nle, L o V; J19 es E o R; y J21 es V, M o Nle.
  31. 31. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el dominio de modulación de PTH/PTHrP se selecciona de la Tabla 1.
  32. 32. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio de modulación de PTH/PTHrP es de la fórmula ONLHO10O1:LO1KSIO16O17LRRRFO23LHHLIOc (SEQ ID No. 5] en donde: 0N es ausente o es Y01020304050607, 01020304050607, 020304050607, 03Oí050607, 0050607, 050607, 0607, o O7; 01 es un residuo de aminoácidos; 02 es un residuo de aminoácidos; 03 es un residuo de aminoácidos; 04 es un residuo de aminoácidos; 05 es un residuo de aminoácidos; 06 es un residuo de aminoácidos; 07 es un residuo de aminoácidos; 010 es un residuo de aminoácidos; 011 es un residuo de aminoácidos; 012 es un residuo de aminoácidos; 016 es un residuo de aminoácidos; 017 es un residuo de aminoácidos; O23 es un residuo de aminoácidos; Oc está ausente es O 29 O29030 O29030031 O29O30O31O32 , O29O30O31O32O33, O29O30O31O32O33O34 , O29O30O31O32O33O34O35, O29030031032033034035036 . y O29 a O36 son cada uno independientemente residuos de aminoácidos.
  33. 33. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque: 0N es O7; O7 es un residuo no funcional; 010 es un residuo ácido o hidrofílico; 011 es un residuo básico o no funcional; 012 es uñ residuo aromático o no funcional; 015 es un residuo hidrofílico o no funcional; 016 es un residuo hidrofílico; O17 es un residuo ácido o no funcional; 0 es un residuo aromático; y Oc está ausente.
  34. 34. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque: 0N es 01020304050607; 01 es un residuo de aminoácido no funcional; 02 es un residuo de aminoácido no funcional; 03 es un residuo de aminoácido hidrofílico; 04 es un residuo de aminoácido ácido; 05 es un residuo de aminoácido básico o no funcional; O es un residuo de aminoácidos hidrofílico; O7 es un residuo no funcional; O .10 es un residuo ácido o hidrofílico; 011 es un residuo básico o no funcional; 012 es un residuo aromático o no funcional; 015 es un residuo hidrofilico o no funcional; 016 es un residuo hidrofílico; y 017 es un residuo ácido o no funcional; y O23 es un residuo aromático.
  35. 35. La composición de materia de conformidad con la -reivindicación "34, caracterizada porque: 01 es A; 02 es V; 03 es S; 04 es E; 05 es H o I; 06 es Q; O7 es L; 016 es Q o N; 017 es D o L; ' O23 es F o W.
  36. 36. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el dominio de modulación de PTH/PTHrP se selecciona de la Tabla 2.
  37. 37. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio de modulación de PTH/PTHrP tiene la secuencia de aminoácidos de TIP39.
  38. 38. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia seleccionada de la Tabla 4.
  39. 39. Una composición de materia, caracterizada porque comprende un péptido seleccionado de las SEQ ID Nos. 17, 18, 19 y 69.
  40. 40. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica para una composición de materia de conformidad con la reivindicación 1.
  41. 41. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica para una composición de materia de conformidad con la reivindicación 7.
  42. 42. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica para una composición de materia de conformidad con la reivindicación 20.
  43. 43. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica para una composición de materia de conformidad con la reivindicación 32.
  44. 44. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica para una composición de materia de conformidad con la reivindicación 39.
  45. 45. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 40.
  46. 46. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 41.
  47. 47. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 42.
  48. 48. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 43.
  49. 49. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 44.
  50. 50. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 45.
  51. 51. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 46.
  52. 52. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 47.
  53. 53. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 48.
  54. 54. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 49.
  55. 55. La célula de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque la célula es una célula de E. coli .
  56. 56. La célula de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la célula es una célula de E. coli .
  57. 57. La célula de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la célula es una célula de E. coli .
  58. 58. La célula de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque la célula es una célula de E. coli .
  59. 59. Un proceso para la preparación de un antagonista del receptor de PTH/PTHrP, caracterizado porque comprende: a) la selección de al menos un péptido que se enlaza al receptor; y b) la preparación de un agente farmacológico que comprende al menos un dominio Fc covalentemente enlazado al menos a una secuencia de aminoácidos del péptido o péptidos seleccionados.
  60. 60. El proceso de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el péptido se selecciona de las SEQ ID Nos. 3, 4 ó 5.
  61. 61. El proceso de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el péptido se selecciona en un proceso que comprende la selección de una biblioteca de despliegue de fagos, una biblioteca de despliegue de E. coli, una biblioteca ribosomal, una biblioteca de ARN-péptido, o una biblioteca químico- peptídica.
  62. 62. El proceso de conformidad con la reivindicación 59-, caracterizado porque la preparación del agente farmacológico es llevada a cabo„ ediante: a) la preparación de una construcción génica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el péptido seleccionado y una secuencia de ácido nucleico que codifica para un dominio Fc; y b) la expresión de la construcción del gen.
  63. 63. El proceso de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la construcción del gen es expresada en una célula de E. coli .
  64. 64. El proceso de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la selección del péptido es llevada a cabo mediante un proceso que comprende : a) la preparación de una construcción génica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un primer péptido seleccionado y una secuencia de ácido nucleico que codifica para un dominio Fc; b) la conducción de una reacción en cadena de polimerasa utilizando la construcción génica y cebadores mutagénicos, en donde: i) un primer cebador mutagénico comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una secuencia en o cerca del extremo 5' de una hebra de codificación de la construcción genica; y ii) un segundo cebador mutagénico comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria al extremo 3 ' de la hebra de no codificación de la construcción génica.
  65. 65. Un método de tratamiento de la osteopenía, caracterizado porque comprende la administración de un agonista de PTH y un inhibidor de la resorción ósea, en donde el agonista de PTH comprende una composición de materia de conformidad con la reivindicación 1.
  66. 66. Un método de tratamiento de la osteopenia, caracterizado porque comprende la administración de un agonista de PTH y un inhibidor de la resorción ósea, en donde el agonista de PTH comprende una composición de materia de conformidad con la reivindicación 7.
  67. 67. Un método de tratamiento de la osteopenia, caracterizado porque comprende la administración de un agonista de PTH y un inhibidor de la resorción ósea, en donde el agonista de PTH comprende una composición de materia de conformidad con la reivindicación 20.
  68. 68. Un método de tratamiento de la osteopema, caracterizado porque comprende la administración de un agonista de PTH y un inhibidor de la resorción ósea, en donde el agonista de PTH comprende una composición de y materia de conformidad con la reivindicación 32.
  69. 69. Un método de tratamiento de la osteopenia, caracterizado porque comprende la administración de un agonista de PTH y un inhibidor de la resorción ósea, en donde el agonista de PTH comprende una composición de materia de conformidad con la reivindicación 39.
  70. 70. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el inhibidor de la resorción ósea se selecciona de OPG, anticuerpo OPG-L, calcitonina, bisfosfonatos, estrógenos, moduladores del receptor de estrógeno, y tibolona.
  71. 71. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el inhibidor de la resorción ósea se selecciona de OPG, anticuerpo OPG-L, calcitonina, bisfosfonatos, estrógenos, moduladores del receptor de estrógeno, y tibolona.
  72. 72. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el inhibidor de la resorción ósea se selecciona de OPG, anticuerpo OPG-L, calcitonina, bisfosfonatos, estrógenos, moduladores del receptor de estrógeno, y tibolona.
  73. 73. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el inhibidor de la resorción ósea se selecciona de OPG, anticuerpo OPG-L, calcitonina, bisfosfonatos, estrógenos, moduladores del receptor de estrógeno, y tibolona.
  74. 74. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el inhibidor de la resorción ósea s'e selecciona de OPG, anticuerpo OPG-L, calcitonina, bisfosfonatos, estrógenos, moduladores del receptor de estrógeno, y tibolona.
  75. 75. Un método de tratamiento de la osteopenia, caracterizado porque comprende la administración de una composición de materia de conformidad con la reivindicación 1.
  76. 76. Un método de tratamiento de la osteopenia, caracterizado porque comprende la administración de una composición de materia de conformidad con la reivindicación 7.
  77. 77. Un método de tratamiento de la osteopenia, caracterizado porque comprende la administración de una composición de materia de conformidad con la reivindicación 20.
  78. 78. Un método de tratamiento de la osteopenia, caracterizado porque comprende la administración de una composición de materia de conformidad con la reivindicación 32.
  79. 79. Un método de tratamiento de la osteopenia, caracterizado porque comprende la administración de una composición de materia de conformidad con la reivindicación 39.
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