KR20030004375A - 부갑상선 호르몬 및 부갑상선 호르몬 - 관련 단백질의수용체 조절인자 - Google Patents

부갑상선 호르몬 및 부갑상선 호르몬 - 관련 단백질의수용체 조절인자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PTH 와 PTHrP 의 활성도를 조절하는 치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따라, PTH 와 PTHrP 의 조절인자는 (a) PTH/PTHrP 조절 도메인 ; 및 (b) 중합체(예를 들어, PEG 또는 덱스트란) 또는 Fc 도메인(바람직함)과 같은 부형제를 포함하며, 여기에서 부형제는 PTH/PTHrP 조절 도메인의 C-말단에 공유결합된다. 부형제 및 PTH/PTHrP 조절 도메인은 하기에 더 기재한 바와 같이, PTH/PTHrP 조절 도메인의 N-말단 또는 C-말단을 통해 결합될 것이다. 바람직한 부형제는 Fc 도메인이고 바람직한 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 바람직한 PTH/PTHrP 조절 도메인은 하기에 기재한 PTH 와 PTHrP-유도 아미노산 서열을 포함한다. 그밖의 다른 PTH/PTHrP 조절 도메인은 파지 디스플레이, RNA-펩티드 스크리닝 및 본원에서 언급한 다른 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 기술이 선택적 조절인자(예를 들어, PTHrP 활성도가 아닌 PTH 활성도의 작동물질)로서 작용하는 펩티드 서열을 생성하는 데 사용될 수 있을지라도, 이러한 펩티드는 전형적으로 PTH 활성도와 PTHrP 활성도 둘 다의 조절인자가 될 것이다.

Description

부갑상선 호르몬 및 부갑상선 호르몬 - 관련 단백질의 수용체 조절인자 {MODULATORS OF RECEPTORS FOR PARATHYROID HORMONE AND PARATHYROID HORMONE - RELATED PROTEIN}
본 출원은 본원에서 참고문헌으로 인용한, 2001 년 2 월 6 일에 제출된 미국 가출원 번호 제 60/266,673 호, 2000 년 6 월 28 일에 제출된 미국 가출원 번호 제 60/214,860 호 및 2000 년 4 월 27 일에 제출된 미국 가출원 번호 제 60/200,053 호를 우선권으로 주장하고 있다.
부갑상선 호르몬(PTH) 및 부갑상선 호르몬 - 관련 단백질(PTHrP)은 각각 칼슘 항상성 및 발육에 있어 중요한 생리학적 역할을 한다. 세포 대사에서 칼슘이 필수적으로 중요한 역할을 하기 때문에, 혈중 칼슘 농도는 일정한 농도로 유지된다. PTH 는 혈청 칼슘 농도가 감소하였을 때 부갑상선으로부터 분비되는 내분비 호르몬이다. PTH 는 골흡수를 증가시키고 신장의 칼슘 재흡수를 촉진시키는 데 직접 관여함으로써 혈액내 칼슘 저장을 증가시키거나 보존하게 한다. PTH 는 또한비타민 D 의 신장에서의 히드록시화를 자극함으로써 장에서의 칼슘 흡수를 간접적으로 증가시킨다.
1 차 및 2 차 부갑상선기능항진증은 부갑상선 호르몬의 과도한 혈중 농도와 관련된 질병이다. 전술한 경로를 통하여, 과도한 PTH 농도는 칼슘과잉혈증 및 골감소증을 야기할 수 있다. 비스포스포네이트와 같은 골흡수 저해제 및 OPG 는 효과적으로 뼈를 보호할 수 있고 골격이 칼슘과잉혈증에 의해 받는 영향을 저해할 수 있다. 그러나, 현재로서는 신장과 장에서 부갑상선기능항진증에 관한 칼슘혈증 영향에 대하여 이용가능한 치료가 존재하지 않는다.
PTHrP 는 다수의 세포 유형에 의해 생성되며 골격 형성을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 출생 후에, PTHrP 에 관한 역할은 완전히 규명되지 않았다. PTHrP 는 건강한 정상 성인의 혈액에서는 실질적으로 탐지되지 않는다. 그러나, 다양한 태생 기원을 갖는 여러 종양은 칼슘과잉혈증을 야기하기에 충분한 양의 PTHrP 를 생산하고 분비한다. 사실상, 악성의 체액성 칼슘과잉혈증(HHM)은 가장 일반적인 부신생물 증후군으로서 환자의 유의한 이환상태 및 사망률을 나타낸다.
일반적으로, HHM 은 수화된 식염수 사용 후에 비스포스포네이트와 같은 골흡수 저해제로 치료된다. 이러한 치료 양생법은 혈청내 칼슘이 현저하게 감소되는데 일반적으로 3 - 4 일이 소요되고 이러한 효과는 상대적으로 짧게 지속된다(1 달 이하). PTHrP 의 높은 혈중 농도를 나타내는 환자의 경우에, 현행의 치료 효과는 효율적이지 못하다. 통상적인 치료 중 반복 투여는 일반적으로 비효과적이다. 이러한 단점으로 인해 현행의 치료법은 HHM 에 대한 신속하고 효과적이며 장기간 지속되는 치료로서는 명백히 부적당한 것으로 여겨진다.
현행의 HHM 치료법의 제한된 이점에 대한 주요 원인은 HHM 에서 주요한 병태생리학적 요소로서 상당히 확립된 PTHrP 를 직접적으로 저해하는데 실패한 것이다. 비스포스포네이트와 같은 골흡수 저해제만이 골흡수를 저해하지만, PTHrP 는 또한 신장 및 장에서 유의한 칼슘혈증 효과를 갖는다. PTHrP 의 총 중화반응은 HHM 치료에 근접한 이상적인 보조 치료가 된다.
PTH 와 PTHrP 는 PTH-1 수용체와 상호작용하며 이는 PTH 와 PTHrP 의 대부분의 공지된 효과를 나타낸 것이다. Mannstadt 등의 (1999), Am. J. Physiol. 227. 5Pt2. F665 - 75 (1999) 문헌을 참조하라. PTH 는 최근 발견된 PTH-2 수용체와 상호작용한다. Id. PTHrP 는 PTH의 위치에서 두 잔기를 특정 잔기로 치환시킴으로써 PTH-2 수용체 작동물질로 변형될 수 있다. Gardella 등의 (1996), J. Biol. Chem. 271(33) : 19888 - 93 문헌을 참조하라.
PTH 의 N-말단 단편은 치료제로서 사용되어 왔다. 간헐적으로 투여되는 천연 PTH-(1-84) 는 골형성 특성을 나타내며, 이러한 특성이 C-말단이 절두된 단편 PTH-(1-34) 로 완전하게 이해되는데 10 년이 소비되었다. 두 펩티드는 포스포리파제C (PLC) 뿐만 아니라 아데닐산 사이클라제(AC)의 활성을 야기하는, 유사한 친화성을 갖는 PTH-1 수용체와 결합하고 이 수용체를 활성화시킨다. PTH-1 수용체를 통한 AC 활성화는 cAMP 를 생성하며 PTH-1 수용체를 통한 PLC 활성화는 PKC 및 일시적인 세포내 칼슘이 생성된다. PTH-(1-34) 는 AC 와 PLC 경로를 최대한으로 활성화시킬 수 있다. Dobnig (1998), Endocrinol. 138 : 4607 - 12 에는, PTH-(1-34) 의 동화작용의 효과가 간헐성(일일)의 짧은 노출을 필요로한다고 기재되어 있다. 저 투여량의 PTH-(1-34) 를 일일 피하 주사로 투여한 폐경기 이후의 여성에게서의 인체 실험에서 척추 골절에 의해 유의한 감소를 나타내는 척추 및 대퇴골 경부에서 현저한 골 형성이 나타났다. 이러한 임상 데이터로 PTH 가 골다공증에 대하여 시험한 가장 유효한 제제 중에 하나로 판명되었다.
절두된 PTH 단편은 AC/cAMP 활성화를 감소시키고 유사하게 동화작용의 활성도를 감소시킨다. Rixon 등의 (1994), J. Bone Min. Res. 9 : 1179 - 89 ; Hilliker 등의 (1996), Bone 19 : 469 - 477 ; Lane 등의 (1996), J. Bone Min. Res. 11 : 614 - 25 문헌을 참조하라. 비록 상기 절두된 PTH 단편이 PKC 에 대하여 완전한 아고니즘(agonism : 작동물질의 작용기작)을 유지할지라도, 상기 절두된 PTH 단편은 활성도를 감소시킨다[Rixon 등의 (1994) ; Hillker 등의 (1996) ; Lane 등의 (1996)]. 이러한 관찰로 인해 AC/cAMP 경로가 PTH 의 골의 동화작용 특성에 중요하다는 것과, 반면에 이러한 점에 있어서 PLC/PKC 경로는 필요하지 않다는 사실에 이르게 되었다. Rixon 등의 (1994) ; Whitfield 등의 (1996), Calcified Tissue International 53 : 81 - 7 문헌을 참조하라.
대조적이지만 상호간에 배타적이지 않은 이론은 PLC 활성화(AC 에 더하여)가 동화작용의 PTH 단편의 중요한 특성임을 시사하고 있다. Takasu (1998), Endocrinol. 139 : 4293 - 9 문헌을 참조하라. 몇몇 동화작용의 C-말단이 절두된 PTH 펩티드에 의한 PLC 활성화의 명백한 결여는 낮은 수용체 결합과 화합된 불감성 검정 방법의 인공물일 것이다. Takasu (1998) 문헌을 참조하라. PTH-(1-34) 의 C-말단으로부터의 연속적인 절두로 PTH1R 에 대한 결합 친화력에 있어서 단계적으로 감소된다. Takasu (1998) 문헌을 참조하라. PTH-1 수용체를 통한 PKC 활성화는 결합 친화력 및 수용체 밀도에 매우 민감한 것으로 보이지만 [Guo 등의 (1995), Endocrinol 136 : 3884 - 91], cAMP 활성화는 이러한 변수에 훨씬 덜 민감하다. 상기와 같이, hPTH-(1-31) 은 hPTH-(1-34) 와 비교하여 PTH-1 수용체에 대한 친화력을 경미하게 감소시키지만(1 - 6 배), hPTH-(1-30) 은 친화력을 현저하게 감소시킨다(10 - 100 배)[Takasu (1998) 문헌 참조]. 아마도 이러한 감소된 PTH-1 수용체 친화력으로 인해, PTH-(1-30) 은 랫의 PTH-1 수용체를 통한 PLC 활성화에 대한 약하고 불완전한 작동물질이다.
PTH-(1-34) 와 비교하여, PTH-(1-31) 은 동화작용의 전위[Rixon 등의 (1994) ; Whitfield 등의 (1996), Calcified Tissue International 53 : 81 - 7 ; Whitfield 등의 (1996), Calcified Tissue International 65 : 143 - 7], PTH1R 에 대한 결합 친화력 및 cAMP 유도를 유사하거나 경미하게 감소시킨다[Takasu (1998) 문헌 참조]. PTH-(1-31) 은 또한 PLC 활성화를 경미하게 감소시킨다. Takasu (1998) 문헌을 참조하라. 건강한 인체에서, PTH-(1-31) 및 PTH-(1-34) 의 주입은, PTH-(1-34) 와는 달리, 혈장 및 뇨로 cAMP 농도에 있어 동시에 유사한 효과를 가지며, PTH-(1-31) 은 혈청내 칼슘, 혈장 1,25(OH)2D3 또는 뇨로 N-TX 농도를 상승시키는데 실패하였다[Fraher 등의 (1999), J. Clin. Endocrin. Met. 84 : 2739 - 43]. 이러한 데이터는 PTH-(1-31) 이 골의 동화작용제(anabolicagent) 에 대한 유리한 프로필인 비타민 D 합성 자극 및 골흡수를 유도하는 능력을 감소시킴을 시사하는 것이다.
초기에 PTH-(1-30) 은 동화작용의 특성이 결여된 것으로 나타났다[Whitfield 등의 (1996), Calcified Tissue International 53 : 81 - 7 참조]. 그러나 최근에는, 고 투여량[PTH-(1-34) 80 ㎍/㎏ 에 대하여 400 - 2,000 ㎍/㎏]으로 투여했을 때 PTH-(1-30) 이 동화작용을 나타낸다고 입증되었다. PTH-1 수용체에 대한 PTH-(1-30) 의 낮은 결합 친화력, PTH-(1-30) 의 감소된 cAMP 활성화 및/또는 현저하게 감소된 PKC 활성화로 PTH-(1-30) 의 낮은 효력을 추측할 수 있었다. Takasu (1998) 문헌을 참조하라. PTH-(1-30) 이 표면상의 골흡수 활성도에서 비슷하거나 훨씬 더 바람직한 감소를 나타내는 지를 측정하는 것이 남아있다.
PTH-(1-28) 은 cAMP 를 충분히 활성화시키는 가장 작은 단편으로 공지되었다. Neugebauer 등의 (1995), Biochem. 34 : 8835 - 42 문헌을 참조하라. 그러나, hPTH-(1-28) 은 OVX 랫에서 초기에는 골형성의 특성이 없는 것으로 보고되었다. Miller 등의 (1997), J. Bone Min. Res. 12 : S320 (요약서) 참조하라. 최근에, PTH-(1-28) 의 고 투여량(1,000 ㎍/㎏/일)은 OVX 랫에서 동화작용을 나타냈으며, 200 ㎍/㎏/일 투여량은 비효과적이었다. Whitfield 등의 (2000), J. Bone Min. Res. 15 : 964 - 70 문헌을 참조하라. 일부 절두된 PTH 단편의 감소되거나 나타나지 않는 동화작용의 효과는 생체내에서의 급속한 청소율에서 기인한 것이다. Rixon 등의 (1994) 문헌을 참조하라.
재조합 및 변형된 단백질은 최근 만들어진 치료제의 종류이다. 단백질 치료제의 유용한 변형에는 항체의 "Fc" 도메인과의 결합 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 덱스트란과 같은 중합체에 결합이 포함된다. 상기 변형은 본원에서 그 전부를 참고문헌으로 인용한, 특허출원의 발명의 명칭이 "치료제로서의 변형 펩티드" 인 미국 출원 번호 제 09/428,082 호, PCT 출원 번호 제 WO 99/25044 호에 상세하게 논의되어 있다.
치료제 개발에 관한 다수의 상이한 연구법은 펩티드 라이브러리 스크리닝이다. 단백질 리간드와 그것의 수용체와의 상호작용은 상대적으로 넓은 접촉면에서 종종 발생한다. 인체 성장 호르몬 및 그것의 수용체에 관해 논의된 바와 같이, 접촉면에서 몇몇 핵심 잔기만이 대부분의 결합 에너지에 기여한다. Clackson 등의 (1995), Science 267 : 383 - 6 문헌을 참조하라. 대부분의 단백질 리간드만이 오른쪽 위상수학에서 결합 에피토프를 나타내며 또한 결합에 관련되지 않은 기능도 나타낸다. 따라서, "펩티드" 길이(2 내지 40 개의 아미노산)로 이루어진 분자는 특정한 거대 단백질 리간드의 수용체 단백질에 결합할 수 있다. 상기 펩티드는 거대 단백질 리간드("펩티드 작동물질")의 생물학적 활성도를 모방하거나, 경쟁적 결합을 통해 거대 단백질 리간드("펩티드 길항물질")의 생물학적 활성도를 저해할 것이다.
파지 디스플레이 펩티드 라이브러리(phage display peptide libraries)는 상기 펩티드 작동물질 및 길항물질을 입증하는데 강력한 방법으로 대두되고 있다. 예를 들어, Scott 등의 (1990), Science 249 : 386 ; Devlin 등의 (1990), Science 249 : 404 ; 1993 년 6월 29 일에 공고된 미국 특허 번호 제 5,223,409 호 ; 1996 년 3 월 12 일에 공고된 미국 특허 번호 제 5,498,530 호 ; 1995 년 7 월 11 일에 공고된 미국 특허 번호 제 5,432,018 호 ; 1994 년 8 월 16 일에 공고된 미국 특허 번호 제 5,338,665 호 ; 1999 년 7 월 13 일에 공고된 미국 특허 번호 제 5,922,545 호 ; 1996 년 12 월 19 일에 공개된 제 WO 96/40987 호 ; 및 1998 년 4 월 16 일에 공개된 제 WO 98/15833 호(이들 각각은 그 전부가 참고문헌으로 인용되었음)를 참조하라. 상기 라이브러리에서, 무작위 펩티드 서열은 섬유상 파지의 외피 단백질과의 융합에 의해 디스플레이된다. 전형적으로, 수용체의 항체 - 고정화 세포외 도메인에 대항하여 디스플레이된 펩티드를 친화성 - 용리시켰다. 보유된 파지는 친화성 정제 및 재증식의 연속적 순환에 의해 풍부해질 것이다. 펩티드의하나 또는 그 이상의 구조적으로 관련된 군 내에서의 핵심 잔기를 확인하기 위해 최상의 결합 펩티드의 서열을 결정할 것이다. 예를 들어, Cwirla 등의 (1997), Science 276 : 1696 - 9 를 참조하며, 여기에서 별개의 두 군을 확인하였다. 펩티드 서열은 또한 잔기가 DNA 수치에서 돌연변이유발 또는 알라닌 스캐닝에 의해 안전하게 치환될 수 있음을 시사하고 있다. 가장 바람직한 결합제의 서열을 좀 더 최적화하기 위해 돌연변이유발 라이브러리를 생성하고 스크리닝할 수 있다. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26 : 401 - 24 문헌을 참조하라.
다량의 단백질 리간드의 결합 활성도를 모방하는 펩티드를 제시하는데 단백질 - 단백질 상호작용의 구조 분석을 사용할 것이다. 이러한 분석에서, 결정 구조는 다량의 단백질 리간드의 임계 잔기의 상대적 방향 및 동일성을 암시하는 것이고 이것으로부터 펩티드를 제조할 것이다. 예를 들어, Takasaki 등의 (1997), Nature Biotech. 15 : 1266 - 70 문헌을 참조하라. 이러한 분석적 방법은 파지 디스플레이(phage display)에 의해 선택된 펩티드와 수용체 단백질 사이의 상호작용을 조사하는 데 사용될 수 있으며 상기 파지 디스플레이는 결합 친화력을 증가시키기 위해 펩티드의 다른 변형을 의미하는 것이다.
그밖의 다른 방법은 펩티드 연구에서 파지 디스플레이와 경쟁하였다. 펩티드 라이브러리는 lac 리프레서 카르복시 말단에 융합될 수 있고 E. coli 에서 발현된다. 다른 E. coli - 기저 방법으로 펩티도글리칸-관련 리포단백질(PAL)과의 융합에 의해 세포의 외막으로 디스플레이가 가능하게 되었다. 하기에, 이러한 방법과 이와 관련된 방법들을 총괄하여 "E. coli 디스플레이(E. coli display)" 라고 언급하였다. 다른 방법에서, 리보솜이 방출되기 전에 무작위 RNA 의 번역이 중단되었고, 결과적으로 관련 RNA 와 함께 폴리펩티드의 라이브러리가 또한 결합되었다. 하기에, 이러한 방법과 이와 관련된 방법들을 총괄하여 "리보솜 디스플레이(ribosome display)" 라고 언급하였다. 다른 방법은 RNA 에 결합된 펩티드를 사용할 것이다 ; 예를 들어, PRO 융합 기술, Phylos, Inc 참조. 예를 들어, Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 : 12297 - 303 문헌을 참조하라. 하기에, 이러한 방법과 이와 관련된 방법들을 총괄하여 "RNA - 펩티드 스크리닝" 이라고 언급하였다. 화학적으로 유도된 펩티드 라이브러리가 발생되었으며 여기에서의 펩티드는 폴리에틸렌 로드(polyethylene rod) 또는 용매 - 투과성 수지와 같이 안정하며, 비 - 생물학적 물질 상에 고정시켰다. 다른 화학적으로 유도된 펩티드 라이브러리는 유리 슬라이드 상에 고정된 펩티드를 스캔하기 위해 석판술을 사용하였다. 하기에, 이러한 방법과 이와 관련된 방법들을 총괄하여 "화학 - 펩티드 스크리닝(chemical-peptide screening)" 이라고언급하였다. 화학 - 펩티드 스크리닝은 비 - 펩티드 요소 뿐만 아니라 D-아미노산 및 그밖의 다른 비천연 유사체를 사용할 수 있는 것이 장점이다. 생물학적 및 화학적 방법 모두 Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3 : 355 - 62 에 자세히 보고되어 있다. 개념상으로, 파지 디스플레이, RNA - 펩티드 스크리닝 및 상기 언급된 그밖의 다른 방법을 이용하여 모든 단백질의 펩티드 유사체를 발견할 것이다.
발명의 요약
본 발명은 PTH 와 PTHrP 의 활성도를 조절하는 치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따라, PTH 와 PTHrP 의 조절인자는 다음을 포함한다 :
a) PTH/PTHrP 조절 도메인, 바람직하게 PTH 및/또는 PTHrP 의 PTH/PTHrP 조절 도메인의 아미노산 서열 또는 파지 디스플레이, RNA - 펩티드 스크리닝 또는 상기 언급한 그밖의 다른 기술에 의해 PTH/PTHrP 조절 도메인으로부터 유도된 서열 ; 및
b) 중합체(예를 들어, PEG 또는 덱스트란)와 같은 부형제 또는 바람직한 Fc 도메인 ;
여기에서 부형제는 PTH/PTHrP 조절 도메인의 카르복시 말단에 공유결합 되었다. 바람직한 부형제는 Fc 도메인이고, 바람직한 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 바람직한 PTH/PTHrP 조절 도메인은 하기에 언급한 PTH 및 PTHrP - 유도 아미노산 서열을 포함한다. 그밖의 다른 PTH/PTHrP 조절 도메인은 파지 디스플레이, RNA - 펩티드 스크리닝 및 본원에서 언급한 다른 기술에 의해 생성될 수 있다. 상기 기술이 선택적 저해제(예를 들어, PTHrP 가 아닌 PTH 의 저해제)로서 역할을 하는 펩티드 서열을 생성하는 데 사용될 수 있지만, 상기 펩티드는 전형적으로 PTH 와 PTHrP 의 길항물질일 것이다.
본 발명에는 PTH 및 PTHrP 를 제조하는 방법이 더 포함되며, 다음를 포함한다 :
a) PTH-1 또는 PTH-2 수용체에 결합하는 적어도 하나의 펩티드를 선택하는 단계 ; 및
b) 부형제에 상기 펩티드를 공유결합시키는 단계.
바람직한 부형제는 Fc 도메인이다. 단계(a)는 바람직하게 하기의 표 1 및 2 에 기재된 펩티드 서열이나 파지 디스플레이, RNA - 펩티드 스크리닝 또는 본원에서 언급한 다른 기술로 선택하여 시행하였다.
본 발명의 화합물은 표준 합성 방법, 재조합 DNA 기술 또는 펩티드와 융합 단백질의 다른 제조방법에 의해 제조될 것이다. 비 - 펩티드 부분을 포함하는 본 발명의 화합물은 표준 유기 화학 반응, 적용가능하다면 표준 펩티드 화학 반응에 의해 합성될 것이다.
본 발명의 화합물의 1 차 용도로 생각할 수 있는 것은 치료제 또는 예방제로서 사용되는 것이다. 부형제 - 결합 펩티드는 펩티드에 의해 모방된 천연 리간드와 비교하여 훨씬 큰 활성도를 가질 것이다.
본 발명의 화합물은 적절한 약학적 담체 물질과 화합물을 제형화하고 그것을 필요로하는 인체(또는 그밖의 다른 포유동물)와 같은 환자에게 유효량을 투여함으로써 치료 목적이나 예방 목적으로 사용될 것이다. 그밖의 다른 관련 양상들 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 특별한 관심사는 PTH-(1-28) 또는 (1-34) 와 같은 단축된 PTH C-말단 서열을 갖는 PTH/PTHrP 조절 도메인을 포함하는 분자에 있다. 선행기술에는 상기 C-말단이 절두된 PTH 단편을 수송하는 동안에 서방성을 이용한 동화작용 연구에 관해서는 전혀 나타나있지 않았다. 선행기술이 이를 제시하지 않았더라도, PTH-(1-30)-Fc 와 같은 소형의 단편을 포함하는 분자는 그 자신 스스로가 동화작용을 나타낼 수 있다. PLC 에 대한 그들의 미약한 아고니즘(발명의 배경 부분을 참조하라)에도 불구하고, hPTH-(1-30) 은 cAMP 를 활성화하는데 hPTH-(1-34) 만큼이나 거의 효과적이다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 본 발명자들은 PTH 단편의 동화작용의 특성이 PLC 활성화보다는 선택적으로 cAMP 활성화와 관련되어 있음을 언급하였으며, 그러므로 감소된 수용체 친화력을 갖는 PTH 단편은 유리한 동화작용의 프로필을 갖게될 것이다. 절두된 PTH 단편에의 연속적인 노출이 Fraher 등의 (1999) 문헌에 의해 인체에서 증명된 PTH-(1-34) 또는 PTH-(1-84) 에 연속적인 노출과 비교하여 뼈에 대하여 상이하고 좀더 유리한 효과를 갖는다.
본 발명의 수 많은 다른 양상 및 이점들은 본 발명의 도면과 상세한 설명을 고려해 볼 때 좀더 명백해질 것이다.
도 1 은 IgG1 항체로부터 유도될 수 있는 전형적인 Fc 이량체를 나타낸 것이다. 도면에 기재된 "Fc" 는 본원에서 "Fc 도메인" 의 의미내에서 모든 Fc 변이체를 나타낸다. "X1" 및 "X2" 는 하기에 규정한 바와 같이 펩티드 또는 링커 - 펩티드 조합을 나타낸다. 구체적으로 이량체는 다음과 같다 :
A : 단일 이황화물 - 결합된 이량체.
IgG1 항체는 전형적으로 불변 도메인과 가변 도메인 사이의 힌지 영역에서 두 개의 이황화물 결합을 갖는다. 도 1A 의 Fc 도메인은 두 개의 이황화물 결합 부위 사이의 절두 또는 시스테인 잔기 대신에 비반응 잔기(예를 들어, 알라닌 잔기)로의 치환에 의해 형성될 것이다.도 1A 에서, Fc 도메인은 펩티드의 C-말단에 결합된다.
B : 이중의 이황화물 - 결합된 이량체.
이러한 Fc 도메인은 Fc 도메인 사슬에서 양쪽의 시스테인 잔기를 보유하도록 모항체를 절두하거나 Fc 도메인을 코드하는 서열을 포함하는 구성물로부터의 발현에 의해 형성될 것이다. 도 1B 에서, Fc 도메인은 펩티드의 C-말단에서 결합된다.
C : 비공유결합된 이량체.
이러한 Fc 도메인은 절두 또는 치환에 의해 시스테인 잔기를 제거함으로써 형성될 것이다. 시스테인 잔기와 숙주 세포에 존재하는 다른 단백질의 시스테인 잔기와의 반응에 의해 형성된 불순물을 저해하기 위해 시스테인 잔기를 제거하는 것이 바람직할 것이다. 이량체와 함께 고정시키기에 Fc 도메인의 비공유 결합이 충분하다. 그밖의 다른 이량체는 상이한 유형의 항체(예를 들어, IgG2, IgM)로부터 유도된 Fc 도메인을 사용함으로써 형성될 것이다.
도 2 는 본 발명의 또다른 화합물 구조를 나타낸 것이다. 도 2A 는 단쇄상의 분자를 나타낸 것이고 분자에 대한 DNA 구성물 또한 나타낸 것이다. 도 2B 는 이량체의 한 사슬 상에 나타나 있는 링커 - 펩티드 부분이 있는 이량체를 나타낸 것이다. 도 2C 는 양 사슬 상에 상기 펩티드 부분을 갖는 이량체를 나타낸 것이다. 도3 에 나타난 바와 같이 단쇄상을 코드하는 DNA 구성물이 발현될 경우에 도 2C 의 이량체는 특정 숙주 세포에서 자발적으로 형성될 것이다. 다른 숙주 세포에서, 이량체가 형성되는 조건에서 세포를 두었으며 또한 이량체는 생체외에서 형성될 수 있다.
도 3 은 본 발명에서 사용되는 인체 IgG1 Fc 의 전형적인 핵산 및 아미노산 서열(각각 SEQ ID NOS : 1 및 2)을 나타낸 것이다.
도 4 는 PTH-(1-34) 및 PTH-(1-34)-Fc 에 대한 정상 마우스의 칼슘혈증 반응을 나타낸 것이다. 마우스에게 부형약(PBS, -X-)이나 PTH-(1-34)(○,□,△) 또는 PTH-(1-34)-Fc (●,■,▲)를 항원투여하였다. 156 nmol/㎏ (○,●), 469 nmol/㎏ (△,▲) 또는 1,560 nmol/㎏ (□,■)을 투여하였다. 데이터는 그룹의 평균치, n = 6 마우스/그룹을 나타낸 것이다.
도 5 는 [Asn10, Leu 11]PTHrP-(7-34)-Fc 가 PTHrP 에 대해 정상 마우스의 칼슘혈증 반응을 저해함을 나타내고 있다. 정상의 수컷 마우스에게 부형약(PBS, ●) 또는 인체 PTHrP-(1-34) 0.5 ㎎/㎏ (■)를 SC 주사하였다. 그리고나서 PTHrP-항원투여한 마우스에게 10 ㎎/㎏ (▲)의 [Asn 10, Leu 11] PTHrP-(7-34)-Fc 또는 30 ㎎/㎏ (◆)를 SC 주사하였다.데이터는 그룹의 평균치, n = 6 마우스/그룹을 나타낸 것이다.
도 6 은 PTH-(1-34)-Fc 에 의해 유도된 만성 칼슘과잉혈증에 대한 [Asn 10, Leu 11] PTHrP-(7-34)-Fc 의 효과를 나타낸 것이다. 정상의 수컷 마우스에게 PTH-(1-34)-Fc (30 ㎎/㎏ ; ○) 또는 부형약(PBS ; □)을 1 회 SC 주사에 의해 항원투여하였다. 항원투여한 후에 즉시 일부 PTH-(1-34)-Fc-항원투여한 마우스를 [Asn 10, Leu 11] PTHrP-(7-34)-Fc 10 ㎎/㎏ (▲), 30 ㎎/㎏ (●) 또는 100 ㎎/㎏ (■)으로 처리하였다. [Asn 10, Leu 11] PTHrP-(7-34)-Fc 의 모든 투여량은 PTH-(1-34)-Fc-매개 과잉칼슘혈증을 현저하게 억제하였다. 데이터는 평균치 ± SEM, n = 5 마우스/그룹을 나타낸 것이다.
도 7 은 ROS 17/2.8 랫 조골세포 - 유사 세포에서 cAMP 축적을 나타낸 것이다. 배양물을 포스포디에스테라제 저해제 IBMX 로 처리한 다음 다양한 PTH 단편으로 15 분 동안 처리하였다. ELISA 로 cAMP 를 측정하였다.
도 8 은 임상 화학에 대해 단일치료의 효과를 나타낸 것이다. 지시된 화합물의 단일 피하내 주사 후에 3 일 동안 매일 말초혈을 수득하였다. 도 8A 는 혈청내 칼슘 농도 ; 도 8B 는 조골세포 활성도의 마커인 알칼리성 포스파타제 (AP) ; 도 8C 는 파골세포 활성도의 마커인 주석산염 - 저항성 산성 포스파타제(tartrate-resistant acid phosphatase : TRAP) 및 도 8D 는 조골세포 : 파골세포 활성도의 상대적 지표인 AP : TRAP 비율을 나타낸 것이다.
도 9 는 골밀도에 관한 PTH 구성물의 효과를 나타낸 것이다. 0, 5 및 10 일에 PTH 구성물을 주사한 후에, 15 일에 마우스의 근위 경골측 골간단에 대해 말초 정량적 전산화 단층촬영술(pQCT)을 시행하였다.
도 10 은 경골(tibial), 소주(trabecular) 및 피질(cortical)의 골밀도(BMD)에 대하여 매주 2 회 투여한 PTH-(1-34)-FC 대 일일 투여한 PTH-(1-34) 의 효과를 나타낸 것이다. 매일 PTH[PTH-(1-34)] 를 80 ㎍/㎏/일 (20 nmol/㎏/일) 투여하였다.
도 11 은 난소절제된(OVX) 성숙한 랫에게서 혈청내 칼슘 및 BMD 에 관하여 매주 2 회 치료한 효과를 나타낸 것이다. OVX 시킨 후에, 11 달 동안 매주 2 회 인산완충식염수(PBS, 부형약) 또는 ADP(0.5 ㎎/㎏) 또는 PTH-(1-34)-Fc (50 nmol/㎏)으로 랫을 치료하였다. 매주 DEXA 를 시행하였다. PTH-Fc 의 칼슘혈증 효과가 전형적으로 최대가 되었을 때, 매주 두 번째 주사한 지 24 시간 후에 채혈하였다.
도 12 는 OVX 시아노몰구스 원숭이에게 PTH-(1-34)-Fc 를 단일 피하 주사한 효과를 나타낸 것이다. 원숭이에게 1 - 30 ㎍/㎏ (n = 1/그룹) 또는 100 - 1000 ㎍/㎏ (n = 2/그룹) 투여량의 PTH-(1-34)-Fc 를 주사하였다. 총 칼슘에 대해 혈청을 분석하였다. 점선은, 표준적인 평균값 이상의 3 표준 편차보다 큰 칼슘의 상승을 기본으로 하여, 둘 또는 그 이상의 연속된 시간지점 상에서 칼슘과잉혈증의 역치를 표시한 것이다.
용어의 정의
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어는 특정한 실시예로 제한하지 않는 한, 다음과 같이 규정하였다.
“포함하는” 이란 용어는 특정 서열의 N-말단이나 C-말단 또는 N-말단과 C-말단 둘 다에 다른 아미노산을 포함할 수 있는 화합물을 의미한다. 물론, 이러한 다른 아미노산은 본 발명 화합물의 활성도를 유의하게 방해하지 않아야 한다.
“산성 잔기”란 용어는 산성 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 D 형 또는 L 형에서의 아미노산 잔기를 의미한다. 전형적인 산성 잔기는 D 와 E 를 포함한다.
“방향족 잔기”란 용어는 방향족 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 D 형 또는 L 형에서의 아미노산 잔기를 의미한다. 전형적인 방향족 잔기는 F, Y 및 W 를 포함한다.
“염기성 잔기”란 용어는 염기성 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 D 형 또는 L 형에서의 아미노산 잔기를 의미한다. 전형적인 염기성 잔기는 H, K 및 R 을 포함한다.
“친수성 잔기” 및 “Haa”란 용어는 적어도 하나의 친수성 작용기 또는 극성 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 D 형 또는 L 형에서의 아미노산 잔기를 의미한다. 전형적인 친수성 잔기는 C, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T 를 포함한다.
“지방친화성 잔기” 및 “Laa”란 용어는 비하전된 지방족 또는 방향족 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 D 형 또는 L 형에서의 아미노산 잔기를 의미한다. 전형적인 지방친화성 곁사슬은 F, I, L, M, V, W 및Y 를 포함한다. 알라닌(A)은 물과 기름에 대한 양쪽 친화성(amphiphilic)을 나타내며 이는 친수성 잔기 또는 지방친화성 잔기로 작용할 수 있음을 의미하는 것이다. 그러므로, 알라닌은 지방친화성 잔기와 친수성 잔기 둘 다의 규정 의미내에 포함된다.
“비작용성 잔기(nonfunctional residue)”란 용어는 산성 기, 염기성 기 또는 방향족 기가 결여된 곁사슬을 갖는 D 형 또는 L 형에서의 아미노산 잔기를 의미한다. 전형적인 비작용성 아미노산 잔기는 M, G, A, V, I, L 및 노르로이신(NIe)이 포함된다.
“부형제(vehicle)”란 용어는 분해를 예방하고/하거나 반감기를 증가시키고 독성을 감소시키며 면역원성을 감소시키거나 치료 단백질의 생물학적 활성도를 증가시키는 분자를 의미한다. 전형적인 부형제로는 다음을 포함한다 : 선형의 중합체[예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리리신, 덱스트란 등] 뿐만 아니라 Fc 도메인(바람직함) ; 가지난 사슬 중합체(예를 들어, 1981 년 9 월 15 일에 공고된 Denkenwalter 등의 미국 특허 번호 제 4,289,872 호 ; 1993 년 7 월 20 일에 공고된 Tam 의 제 5,229,490 호 ; 1993 년 10 월 28 일에 공개된 Frechet 등의 제 WO 93/21259 호를 참조하라) ; 지질 ; 콜레스테롤 그룹(예를 들어, 스테로이드) ; 탄수화물 또는 올리고당(예를 들어, 덱스트란) ; 인체 혈청 알부민(HSA) 및 관련 분자 ; 트랜스테라틴(transtheratin : TTR) 및 관련 분자 ; 또는 샐비지(salvage) 수용체에 결합하는 모든 천연 또는 합성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드. 하기에 다른 부형제를 기재하였다.
“천연 Fc”란 용어는 단량체이거나 다량체 형태인 전 항체의 절단에 의한 비 - 항원 - 결합 단편의 서열을 포함하는 분자 또는 서열을 의미한다. 본래의 천연 Fc 의 면역글로불린 원은 인체 기원이 바람직하고 IgG1 및 IgG2 가 바람직하지만 모든 면역글로불린이 가능하다. 천연 Fc's 는 공유 결합(즉, 이황화물 결합) 및 비 - 공유 결합에 의해 이량체 또는 다량체에 결합할 수 있는 단량체 폴리펩티드로 구성되어 있다. 천연 Fc 분자의 단위체 아단위 사이의 분자간의 이황화물 결합의 수는 군(예를 들어, IgG, IgA, IgE) 또는 아군(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2)에 따라 1 내지 4 일 것이다. 천연 Fc 의 예로는 IgG 의 파파인 절단에 의한 이황화물 결합된 이량체가 존재한다[Ellison 등의 (1982), Nucleic Acids Res. 10 : 4071 - 9 문헌을 참조하라]. 본원에서 사용된 바와 같이 “천연 Fc”란 용어는 일반적으로 단량체, 이량체 및 다량체 형태이다.
"Fc 변이체" 란 용어는 천연 Fc 로부터 변형된 분자나 서열을 의미하며 샐비지 수용체인 FcRn 에 대한 결합 부위 또한 포함한다.국제 출원 번호 제 WO 97/34631 호 (1997 년 9 월 25 일에 공개됨) 및 제 WO 96/32478 호에는 샐비지 수용체와의 상호작용 뿐만 아니라 전형적인 Fc 변이체에 관해 기재되어 있으며 그 전부를 본원에서는 참고문헌으로 인용하였다. 따라서, "Fc 변이체" 란 용어는 비 - 인체화된 천연 Fc 로부터 인체화된 분자나 서열을 포함한다. 더욱이, 천연 Fc 는 제거할 수 있는 부위를 포함한다. 이러한 부위는 본 발명의 융합 분자에 불필요한 생물학적 활성도 또는 구조적 특징을 제공하기 때문이다. 따라서 "Fc 변이체" 란 용어는 하기에 기재한 사항과 관련되어 있거나 영향을 미치는 하나 또는 그 이상의 천연 Fc 부위 또는 잔기가 결여된 분자 또는 서열을 포함한다 : (1) 이황화물 결합 형성, (2) 선택한 숙주 세포와의 부적합성, (3) 선택한 숙주 세포에서의 발현시 N-말단의 이질성, (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 샐비지 수용체 이외의 Fc 수용체에 결합 또는 (7) 항체 - 의존형 세포의 세포독성(ADCC). Fc 변이체는 하기에 좀더 상세히 기재하였다.
"Fc 도메인" 이란 용어는 상기에 규정한 바와 같이 천연 Fc 및 Fc 변이체 분자 및 서열을 포함한다. Fc 변이체 및 천연 Fc's 와 함께 "Fc 도메인" 이란 용어는 전 항체로부터 절단되었거나 다른 방법에 의해 생성된 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함한다.
Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 분자에 적용하는 "다량체" 란 용어는 공유 결합, 비공유 결합 또는 공유 및 비 - 공유 상호작용과 관련된 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드 쇄를 갖는 분자를 의미한다. IgG 분자는 전형적으로 이량체 ; IgM, 오량체 ; IgD, 이량체 ; 및 IgA, 단량체, 이량체, 삼량체 또는 사량체를 형성한다. Fc 의 천연 Ig 원의 결과적으로 생성된 활성도 및 서열을 개발하거나 상기 천연 Fc 를 유도(하기에 정의하였음)함으로써 다량체를 형성할 것이다.
Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 분자에 적용하는 "이량체" 란 용어는 공유 또는 비 - 공유적으로 결합된 두 폴리펩티드 쇄를 갖는 분자를 의미한다. 따라서, 본 발명의 범주내의 전형적인 이량체는 도 1 및 2 에 나타나 있다.
"유도체화(derivatizing)" 및 "유도체(derivative)" 또는 "유도체화된 (derivatized)" 이란 용어는 하기의 화합물과 조건에 따라 결과적으로 생성된 화합물 및 이를 제조하는 과정을 각각 포함한다 :
(1) 고리형 부분을 포함하는 화합물 ; 예를 들어, 화합물 내의 시스테이닐 잔기 간의 교차결합 ; (2) 교차 - 결합된 화합물 또는 교차 - 결합 부위를 갖는 화합물 ; 예를 들어, 화합물은 시스테이닐 잔기를 가지므로 배양물 또는 생체내에서 교차 - 결합된 이량체를 형성한다 ; (3) 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합은 비 - 펩티드 결합으로 치환하였다 ; (4) N-말단은 -NRR1, NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, 숙신이미드기 또는 치환되었거나 비치환된 벤질옥시카르보닐-NH- 로 치환되었으며, 여기에서 R 과 R1및 고리형 치환기는 하기에 규정하였다 ; (5) C-말단은 -C(O)R2또는 -NR3R4로 치환되었으며, 여기에서 R2, R3및 R4는 하기에 규정하였다 ; 및 (6) 화합물 각각의 아미노산 부분은 선택한 곁사슬 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 제제로의 처리를 통해 변형될 수 있다. 유도체에 관해 하기에 좀더 기재하였다.
"펩티드" 란 용어는 1 내지 85 개의 아미노산으로 이루어진 분자, 바람직하게는 5 내지 34 개의 아미노산으로 이루어진 분자를 의미한다. 전형적인 펩티드는 천연 분자의 PTH/PTHrP 조절 도메인을 포함하거나 무작위화한 서열을 포함할 것이다.
펩티드 서열을 의미하는데 사용되는 "무작위화한(randomized)" 이란 용어는 완전한 무작위 서열(예를 들어, 파지 디스플레이 방법 또는 RNA-펩티드 스크리닝에 의한 선택) 및 천연 분자내의 위치에서 나타나지 않는 아미노산 잔기로 치환되는 천연 분자의 하나 또는 그 이상의 잔기의 서열을 의미한다. 펩티드 서열을 확인하는 전형적인 방법으로는 파지 디스플레이, E. coli 디스플레이, 리보솜 디스플레이, RNA-펩티드 스크리닝, 화학적 스크리닝 등이 있다.
"PTH/PTHrP 조절 도메인" 이란 용어는 PTH-1 수용체 및/또는 PTH-2 수용체에 결합하는 모든 아미노산 서열을 의미하며 상기 도메인은 천연 서열 또는 무작위화한 서열을 포함한다. 전형적인 PTH/PTHrP 조절 도메인은 표 1 및 2 에 기입된 참조부호에 기재된 바와 같이 확인하거나 유도될 수 있으며 그 전부를 본원에서 참고문헌으로 인용하였다.
"PTH 작동물질" 이란 용어는 PTH-1 또는 PTH-2 수용체에 결합하는 분자를 의미하며 전장의 천연 인체 부갑상선 호르몬 투여시 하나 또는 그 이상의 PTH 활성도 검정 파라미터를 증가시키거나 감소시킨다. 전형적인 PTH 활성도 검정은 실시예 1 에 기재되어 있다.
"PTH 길항물질" 이란 용어는 PTH-1 또는 PTH-2 수용체에 결합하는 분자를 의미하며 전장의 천연 인체 부갑상선 호르몬에 의한 파라미터의 정상적인 효과를 저해하거나 방지한다. 전형적인 PTH 활성도 검정은 실시예 2 에 기재하였다.
"골흡수 저해제" 란 용어는 그 전부를 본원에서 참고문헌으로 인용한 제 WO 97/23614 호의 실시예 4 및 11 의 검정에 의해 측정한 분자를 의미한다. 전형적인 골흡수 저해제는 OPG 및 OPG-L 항체를 포함하며, 이 항체는 그 전부를 본원에서 참고문헌으로 인용한 제 WO 97/23614 호 및 제 WO 98/46751 호에 각각 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 생리학적으로 용인가능한 염 또한 본원에 포함된다. "생리학적으로 용인가능한 염" 은 후에 약학적으로 용인가능한 것으로 밝혀진 모든 염을 의미한다. 몇몇 특정 예로는 아세트산염 ; 트리플루오로아세테이트 ; 염화수소산염 및 브롬화수소산염과 같은 할로겐화수소산염(hydrohalide) ; 황산염 ; 시트르산염 ; 타르타르산염 ; 글리콜산염 ; 옥살산염이 있다.
화합물의 구조
일반 형태.
PTH 및 PTHrP 수용체 결합 아미노산 서열은 표 1 및 2 에 기재되어 있다. PTH 및 PTHrP 에 관한 정보는 Mannstadt 등의 (1999), Am. J. Physiol. 277. 5Pt 2 : F665 - 75 및 Gardella (1996), J. Biol. Chem. 271 (33) : 19888 - 93 에 기재되어 있다. 각각의 이러한 참고문헌은그 전부를 본원에서 참고문헌으로 인용하였다.
전술한 서열로부터, 본 발명자들은 PTH 및 PTHrP 로부터 유도된 특정한 바람직한 서열을 확인하였다. 펩티드의 결합 친화력을 유지하거나 증진시키면서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 변화되는 상기 언급한 기술을 통해 이러한 서열은 무작위화될 수 있다.
본 발명에 따라 제조한 물질로 이루어진 조성물에서, 펩티드는 펩티드의 C-말단을 통해 부형제에 결합된다. 따라서, 본 발명은 다음 화학식 Ⅰ
P1-(L1)a-F1
여기에서, F1은 부형제(바람직하게 Fc 도메인임)로서 P1-(L1)a의 C-말단에 결합되며 ;
P1은 PTH/PTHrP 조절 도메인의 서열이고 ;
L1은 링커이며 ;
a 는 0 또는 1 이다
을 갖는 부형제 - 펩티드 분자 및 이의 다량체에 관한 것이다.
펩티드.
다수의 펩티드는 본 발명과 관련하여 사용될 것이다. 펩티드는 천연 단백질의 서열 중 일부를 포함하고, 천연 단백질의 서열로부터 유도된 무작위화된 서열 또는 전체의 무작위화된 서열일 것이다. 본 발명에 사용되는 펩티드를 제조하는데 파지 디스플레이 및 RNA-펩티드 스크리닝이 특히 유용하다.
PTH/PTHrP 조절 도메인 서열은 특히 다음 화학식 Ⅱ 와 같다 :
XNX8HX10X11X12KX14X15X16X17X18X19RX21X22X23X24X25X26X27X28XC
(SEQ ID NO : 3)
여기에서,
XN은 존재하지 않거나 또는, X3X4X5X6X7, X2X3X4X5X6X7, X1X2X3X4X5X6X7또는 YX1X2X3X4X5X6X7이고 ;
X1은 아미노산 잔기이고 (비작용성, 친수성 또는 방향족 잔기가 바람직하고, A, S 또는 Y 가 바람직함) ;
X2는 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, V 가 가장 바람직함) ;
X3은 아미노산 잔기이고 (친수성 잔기가 바람직하고, S 가 가장 바람직함) ;
X4는 아미노산 잔기이고 (산성 잔기가 바람직하고, E 가 가장 바람직함) ;
X5는 아미노산 잔기이고 (비작용성 또는 염기성 잔기가 바람직하고, H 또는 I 가 가장 바람직함) ;
X6은 아미노산 잔기이고 (산성 또는 친수성 잔기가 바람직하고, Q 또는 E 가 가장 바람직함) ;
X7은 아미노산 잔기이고 (비작용성 또는 방향족 잔기가 바람직하고, L 또는 F 가 가장 바람직함) ;
X8은 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, M 또는 Nle 가 가장 바람직함) ;
X10은 아미노산 잔기이고 (산성 또는 친수성 잔기가 바람직하고, N 또는 D 가 가장 바람직함) ;
X11은 아미노산 잔기이고 (비작용성 또는 염기성 잔기가 바람직하고, L, R 또는 K 가 가장 바람직함) ;
X12는 아미노산 잔기이고 (비작용성 또는 방향족 잔기가 바람직하고, G, F 또는 W 가 가장 바람직함) ;
X14는 아미노산 잔기이고 (염기성 또는 친수성 잔기가 바람직하고, H 또는 S 가 가장 바람직함) ;
X15는 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, L 또는 I 가 가장 바람직함) ;
X16은 아미노산 잔기이고 (비작용성 또는 친수성 잔기가 바람직하고, Q, N, S 또는 A 가 가장 바람직함) ;
X17은 아미노산 잔기이고 (산성, 친수성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, S, D 또는 L 이 가장 바람직함) ;
X18은 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, M, L, V 또는 Nle 가 가장 바람직함) ;
X19는 아미노산 잔기이고 (산성 또는 염기성 잔기가 바람직하고, E 또는 R 이 가장 바람직함) ;
X21은 아미노산 잔기이고 (비작용성 또는 염기성 잔기가 바람직하고, V, M, R 또는 Nle 가 가장 바람직함) ;
X22는 아미노산 잔기이고 (친수성, 산성 또는 방향족 잔기가 바람직하고, E 또는 F 가 가장 바람직함) ;
X23은 방향족 또는 지방친화성 잔기이고 (W 또는 F 가 바람직함);
X24는 지방친화성 잔기이고 (L 이 바람직함) ;
X25는 아미노산 잔기이고 (친수성 또는 염기성 잔기가 바람직하고, R 또는 H 가 가장 바람직함) ;
X26은 아미노산 잔기이고 (친수성 또는 염기성 잔기가 바람직하고, K 또는 H 가 가장 바람직함) ;
X27은 아미노산 잔기이고 (지방친화성, 염기성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, K 또는 L 이 가장 바람직함) ;
X28은 아미노산 잔기이고 (지방친화성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, L 또는 I 가 가장 바람직함) ;
XC는 존재하지 않거나 또는, X29, X29X30, X29X30X31, X29X30X31X32, X29X30X31X32X33, X29X30X31X32X33X34, X29X30X31X32X33X34X35또는 X29X30X31X32X33X34X35X36이고;
X29는 아미노산 잔기이고 (친수성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, Q 또는 A 가 가장 바람직함) ;
X30은 아미노산 잔기이고 (친수성 또는 산성 잔기가 바람직하고, D 또는 E 가 가장 바람직함) ;
X31은 아미노산 잔기이고 (지방친화성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, V 또는 I 가 가장 바람직함) ;
X32는 아미노산 잔기이고 (염기성 잔기가 바람직하고, H 가 가장 바람직함) ;
X33은 아미노산 잔기이고 (친수성 잔기가 바람직하고, N 또는 T 가 가장 바람직함) ;
X34는 아미노산 잔기이고 (비작용성 또는 방향족 잔기가 바람직하고, A, F 또는 Y 가 가장 바람직함) ;
X35는 아미노산 잔기이고 (산성 잔기가 바람직하고, E 가 가장 바람직함) ; 및
X36은 아미노산 잔기이다 (방향족 잔기가 바람직하고, Y 가 가장 바람직함).
바람직한 PTH/PTHrP 조절 도메인 서열은 다음 화학식 Ⅲ 과 같다 :
JNJ7J8HNLJ12KHLJ16SJ18J19RJ21EWLRKKLJC
(SEQ ID NO : 4)
여기에서,
JN은 존재하지 않거나 또는, J1J2J3J4J5J6, J2J3J4J5J6, J3J4J5J6중에서 선택하고 ;
J1은 아미노산 잔기이고 (비작용성, 친수성 또는 방향족 잔기가 바람직하고, A, S 또는 Y 가 가장 바람직함) ;
J2는 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, V 가 가장 바람직함) ;
J3은 아미노산 잔기이고 (친수성 잔기가 바람직하고, S 가 가장 바람직함) ;
J4는 아미노산 잔기이고 (산성 잔기가 바람직하고, E 가 가장 바람직함) ;
J5는 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, I 가 가장 바람직함) ;
J6은 아미노산 잔기이고 (염기성 잔기가 바람직하고, Q 가 바람직함) ;
J7은 아미노산 잔기이고 (비작용성 또는 방향족 잔기가 바람직하고, L 또는 F 가 바람직함) ;
J8은 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, M 또는 Nle 가 가장 바람직함) ;
J12는 아미노산 잔기이고 (비작용성 또는 방향족 잔기가 바람직하고, G 또는 W 가 가장 바람직함) ;
J16은 아미노산 잔기이고 (비작용성 또는 친수성 잔기가 바람직하고, N, S 또는 A 가 가장 바람직함) ;
J18은 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, M, Nle, L 또는 V 가 가장 바람직함) ;
J19는 산성 또는 염기성 잔기이고(E 또는 R 이 바람직함) ;
J21은 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, V, M 또는 Nle 가 가장 바람직함) ;
JC는 존재하지 않거나 또는, J29, J29J30, J29J30J31, J29J30J31J32,J29J30J31J32J33또는 J29J30J31J32J33J34이고 ;
J29는 아미노산 잔기이고 (친수성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, Q 또는 A 가 가장 바람직함) ;
J30은 아미노산 잔기이고 (친수성 또는 산성 잔기가 바람직하고, D 또는 E 가 가장 바람직함) ;
J31은 아미노산 잔기이고 (지방친화성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, V 또는 I 가 가장 바람직함) ;
J32는 아미노산 잔기이고 (염기성 잔기가 바람직하고, H 가 가장 바람직함) ;
J33은 아미노산 잔기이고 (산성 잔기가 바람직하고, N 이 가장 바람직함) ;
J34는 아미노산 잔기이다(방향족 잔기가 바람직하고, F 또는 Y 가 가장 바람직함).
SEQ ID NO : 4 의 서열 중에서 하기 표 1 에 나타나 있는 펩티드가 가장 바람직하다.
그 외에 바람직한 PTH/PTHrP 조절 도메인 서열은 다음 화학식 IV 와 같다 :
ONLHO10O11O12KSIO15O16LRRRFO23LHHLIOC
(SEQ ID NO : 5)
여기에서,
ON은 존재하지 않거나 또는, YO1O2O3O4O5O6O7, O1O2O3O4O5O6O7, O2O3O4O5O6O7, O3O4O5O6O7, O4O5O6O7, O5O6O7, O6O7또는 O7이고 ;
O1은 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, A 가 가장 바람직함) ;
O2는 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, V 가 가장 바람직함) ;
O3은 아미노산 잔기이고 (친수성 잔기가 바람직하고, S 가 가장 바람직함) ;
O4는 아미노산 잔기이고 (산성 잔기가 바람직하고, E 가 가장 바람직함) ;
O5는 아미노산 잔기이고 (염기성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고,H 또는 I 가 바람직함) ;
O6은 아미노산 잔기이고 (친수성 잔기가 바람직하고, Q 가 가장 바람직함) ;
O7은 아미노산 잔기이고 (비작용성 잔기가 바람직하고, L 이 가장 바람직함) ;
O10은 아미노산 잔기이고 (산성 또는 친수성 잔기가 바람직하고, N 또는 D 가 가장 바람직함) ;
O11은 아미노산 잔기이고 (염기성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, K 또는 L 이 가장 바람직함) ;
O12는 아미노산 잔기이고 (방향족 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, G, F 또는 W 가 가장 바람직함) ;
O15는 아미노산 잔기이고 (친수성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, I 또는 S 가 가장 바람직함) ;
O16은 아미노산 잔기이고 (친수성 잔기가 바람직하고, Q 또는 N 이 가장 바람직함) ;
O17은 아미노산 잔기이고 (산성 또는 비작용성 잔기가 바람직하고, D 또는 L 이 가장 바람직함) ;
O23은 아미노산 잔기이고 (방향족 잔기가 바람직하고, F 또는 W 가 가장 바람직함) ;
OC는 존재하지 않거나 O29, O29O30, O29O30O31, O29O30O31O32, O29O30O31O32O33, O29O30O31O32O33O34, O29O30O31O32O33O34O35또는 O29O30O31O32O33O34O35O36이며 ; 및
O29내지 O36은 각각 독립적으로 아미노산 잔기이다.
SEQ ID NO : 5 의 서열 중에서 하기 표 2 에 나타나 있는 펩티드가 가장 바람직하다.
본 발명에 적합한 전형적인 펩티드 서열은 하기 표 1 및 2 에 나타나 있다. 이러한 펩티드는 그 전부를 본원에서 참고문헌으로 각각 인용한 미국 특허 번호 제 4,423,037 호, 제 4,968,669 호, 제 5,001,22 호 및 제 6,051,686 호 또는 인용문헌에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 이러한 펩티드 서열을 삽입한 본 발명의 분자는 본 분야의 공지된 방법에 의해 제조할 것이다. 아미노산을 단일 문자(약자)로 표현하였다. 이러한 모든 펩티드는 링커에 의해 또는 링커 없이 세로로 일렬로 (즉, 순서대로) 연결될 것이다. 시스테이닐 잔기를 포함하는 모든 펩티드는 다른 Cys-함유 펩티드 및 부형제와 교차-결합되거나 상기 시스테이닐 잔기를 포함하는 모든 펩티드와 부형제와 교차결합될 것이다. 하나 이상의 Cys 잔기를 갖는 모든 펩티드는 펩티드 간의 이황화물 결합을 형성할 것이다. 이러한 모든 펩티드는 하기에 기재한 바와 같이 유도체화될 것이다.
다른 유용한 PTH/PTHrP 조절 도메인은 TIP39 로 알려진 다음 펩티드 서열을 갖는다 :
SLALADDAAFRERARLLAALERRHWLNSYMHKLLVLDAP
(SEQ ID NO : 160)
TIPG39 는 Usdin 등의 (1999), Nature Neurosci. 2(11) : 941 - 3 ; Usdin 등의 (1996), Endocrinology 137(10) : 4285 - 97 ; Usdin 등의 (1995), J. Biol.Chem. 270(26) : 15455 - 8 ; Usdin 등의 (1999), Endocrinol. 140(7) : 3363 - 71 에 기재되어 있다.
기타 유용한 PTH/PTHrP 조절 도메인 서열은 SEQ ID NO : 3, 4, 5, TIP39 또는 표 1 및 2 에 열거한 서열의 보존적 및/또는 비-보존적 변이로 인해 생성된다.
보존적 변이로 인해, 변이시키기 전의 PTH 또는 PTHrP 펩티드의 기능적·화학적 특성과 유사한 특성을 갖는 펩티드를 제조할 수 있을 것이다. 이와는 대조적으로, 펩티드의 기능적 특성 및/또는 화학적 특성이 상당히 변화되는 변이를 실시하려면 (a) 예를 들어 쉬트 형태나 나선 형태와 같은 치환 영역내 분자 골격 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 분자 크기를 상당히 변화시키는 아미노산 서열을 선택하여 치환한다.
예를 들어, "보존적인 아미노산 치환" 은 치환 위치의 아미노산 잔기의 극성이나 전하에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 비천연 잔기로 원래의 잔기를 치환함을 포함한다. 또한, 이미 기술한 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" 에 관하여 폴리펩티드내 모든 천연 잔기를 알라닌으로 치환할 수 있다[예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 관하여 기술한 MacLennan 등의 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643 : 55 - 67 ; Sasaki 등의 1998, Adv. Biophys. 35 : 1 - 24 참조].
바람직한 아미노산 치환(보존적 치환이든 비-보존적 치환이든 간에)은 이러한 치환을 원할 때 본 분야의 숙련자들이 결정할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 펩티드 서열내 중요 잔기를 확인하거나 또는 본원에 기술된 펩티드 또는 부형제-펩티드 분자(전술한 식 참조)의 친화성을 증가시키거나 감소시키는 데 이용할 수 있다. 전형적인 아미노산 치환은 표 3 에 기술되어 있다.
특정 실시형태에 있어서, 보존적 아미노산 치환은 생물계에서의 합성에 의해서라기 보다는 화학 펩티드 합성에 의해 일반적으로 도입되는 비-자연발생적인 아미노산 잔기를 포함한다.
상기 "용어의 정의" 항목에 기술한 바와 같이, 자연발생적인 잔기는 서열 변이에 유용한 곁사슬의 공통적인 성질을 기준으로 분류할 수 있다.예를 들어, 비-보존적 치환은 한 군에 속하는 잔기를 다른 군에 속하는 잔기로 치환함을 포함한다. 이렇게 치환된 잔기는 비-인체 오르토로그와 상동인 펩티드 영역 또는 분자의 비-인체 영역 내로 도입될 것이다. 또한 사슬 배향에 영향을 끼치기 위해 P 또는 G 를 이용하여 변이시킬 수도 있다.
이러한 변이를 이루려 할 때, 아미노산의 수치료 지수가 고려될 것이다. 각 아미노산의 소수성과 전하적인 특성을 근거로 수치료 지수를 다음과 같이 정하였다 : 이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파라긴산(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질에 대해 생물학적 상호작용을 부여하는 데 있어서 아미노산 수치료 지수가 중요하다는 사실은 본 분야에서 인지되는 것이다[Kyte 등의J. Mol. Biol., 157 : 105 - 131 (1982) 참조]. 특정 아미노산이 유사한 수치료 지수를 갖는 다른 아미노산으로 치환되면 유사한 생물학적 활성도를 가질 수 있는 것으로 인지된다. 수치료 지수를 근거로 변이시키려 할 때, 치환 아미노산의 수치료 지수가 ±2 이내인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내이다.
친수성을 근거로 한 유사 아미노산 치환이 효과적으로 이루어질 수 있는 것으로 인지된다. 인접 아미노산의 친수성에 의해 결정되는 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 관계가 있다.
각 아미노산 잔기에 대해 다음과 같이 친수성 수치가 정해졌다 : 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파라긴산(+3.0±1); 글루탐산(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 이소루이신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 친수성 값의 유사성을 근거로 치환하려 할 때, 치환 아미노산의 친수성 값은 ±2 이내가 바람직하고, ±1 이내가 더욱 바람직하며, ±0.5 이내가 보다 더 바람직하다. 또한,친수성을 근거로 1 차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다. 이러한 영역은 "에피토프 결정 영역" 이라고도 한다.
숙련자들은 널리 공지된 기술을 이용하여 전술한 서열에 나타나 있는 폴리펩티드의 적당한 변이체를 결정할 수 있다. 활성도를 잃지 않으면서 변이시킬 수 있는 분자의 적당한 부분을 확인하기 위해, 본 분야의 숙련자들은 활성도에 중요한 영향을 미치지 않을 것으로 여겨지는 부분을 표적으로 삼을 것이다. 예를 들어, 동종이나 다른 종 간에 유사한 활성을 갖는 유사한 폴리펩티드가 공지되었을 때, 본 분야의 숙련자들은 펩티드의 아미노산 서열을 유사한 펩티드와 비교할 수 있다. 이러한 비교를 통해, 유사한 폴리펩티드 중에 보존적인 잔기와 영역을 확인할 수 있다. 유사한 펩티드에 비해 보존적이지 않은 펩티드 영역을 변이시키면, 펩티드의 생물학적 활성도 및/또는 구조에 불리한 영향을 끼치지 않을 것이다. 상대적으로 보존적인 영역에서조차도 활성도를 유지시키면서 자연발생적인 잔기를 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환할 수 있는 것으로 본 분야의 숙련자들에게 알려져 있다(보존적인 아미노산 잔기 치환). 따라서, 생물학적 활성도나 구조에 중요한 영향을 미치는 영역 조차도 생물학적 활성도를 상실하거나 펩티드 구조에 불리한 영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환을 실시할 수 있다.
또한 본 분야의 숙련자들은 활성도나 구조에 중요한 유사한 펩티드들의 잔기를 확인하는 구조-작용 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교를 통해, 유사한 펩티드들에서 활성도나 구조에 중요한 아미노산 잔기에 해당하는 펩티드내 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 펩티드의 중요한 잔기로 예측된 아미노산 잔기를 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 선택하여 치환할 수 있다.
본 분야의 숙련자들은 또한 유사한 펩티드들의 구조에 관한 아미노산 서열과 3 차원 구조를 분석할 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 이러한 정보를 통해 펩티드의 3 차원 구조에 관한 펩티드 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관계하는 잔기일 경우, 단백질의 표면에서 예측되는 아미노산 잔기에 대한 라디칼 변화가 일어나지 않도록 선택할 수 있다. 또한, 본 분야의 숙련자들은 각각의 바람직한 아미노산 잔기에서의 단일 아미노산을 치환시킨 실험 변이체를 제조할 수 있다. 그런 다음 본 분야의 숙련자들에게 공지된 활성도 분석방법을 이용하여 이 변이체를 스크리닝할 수 있다. 이러한 데이터는 적당한 변이체에 관한 정보를 수집하는 데 이용할 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기의 변화로 활성도가 손실되거나 바람직하지 못하게 감소되거나 부적당하게 된다면, 이러한 변이를 갖는 변이체는 피하는 것이 좋을 것이다.즉, 본 분야의 숙련자들은 일반적인 실험으로부터 수집한 정보를 토대로 단독으로 또는 다른 돌연변이와의 조합을 삼가해야 하는 아미노산을 용이하게 결정할 수 있다.
2 차 구조를 예상하는 많은 과학적 발표가 있었다. Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4) : 422 - 427 (1996), Chou 등의 Biochemistry, 13(2) : 222 - 245 (1974) ; Chou 등의 Biochemistry, 113(2) : 211 - 222 (1974) ; Chou 등의 Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47 : 45 - 148 (1978) ; Chou 등의 Ann. Rev. Biochem., 47 : 251 - 276 및 Chou 등의 Biophys. J., 26 : 367 - 384 (1979)을 참조하라. 게다가, 2 차 구조를 예상하는데 도움이 되는 컴퓨터 프로그램을 일반적으로 이용할 수 있다. 2 차 구조를 예상하는 한 방법은 상동성 모델링에 기초하는 방법이다. 예를 들어, 30 % 이상의 서열 동일성 또는 40 % 이상의 유사성을 갖는 두 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사 위상수학을 갖는다. 최근 단백질 구조 데이타 베이스(PDB)의 발달은 폴리펩티드나 단백질 구조내의 가능한 접힘의 수를 포함하는 2 차 구조의 예상가능성을 높여주었다. Holm 등의 Nucl. Acid. Res., 27(1) : 244 - 247 (1999)를 참조하라. 특정 폴리펩티드 또는 단백질에서의 제한된 접힘의 수가 존재하며 구조의 임계수(critical number)가 일단 정해지면 구조의 예측은 정확해질 것이라고 제시되어 있다[Brenner 등의 Curr. Op. Struct. Biol., 7(3) : 369 - 376 (1997)을 참조].
2 차 구조를 예상하는 부가적인 방법은 "트레딩(threading)" [Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3) : 377 - 87 (1997) ; Sippl 등의 Structure, 4(1) : 15 - 9 (1996)], "프로필 분석" [Bowie 등의 Science, 253 : 164 - 170 (1991) ; Gribskov 등의 Meth. Enzym, 183 : 146 - 159 (1990) ; Gribskov 등의 Proc. Nat. Acad. Sci. 84(13) : 4355 - 8 (1987)] 및 "진화론적 연관" (Home 의 상기 문헌 및 Brenner 의 상기 문헌)를 포함한다.
부형제.본 발명은 C-말단 또는 하나의 아미노산 잔기의 곁사슬을 통해 펩티드로 결합하는 적어도 하나의 부형제(F1)를 필요로한다. 다중 부형제도 또한 사용하였다 ; 예를 들어, C-말단에서의 Fc 및 곁사슬에서의 PEG 군.
Fc 도메인은 바람직한 부형제이다. Fc 도메인은 펩티드의 C 말단에 융합될 것이다.
상기 언급한 바와 같이, Fc 변이체는 본 발명의 범주내에서 적합한 부형제이다. 천연 Fc 는 본 발명에 따라 Fc 변이체를 형성하도록광범위하게 변이되며 샐비지 수용체로의 결합이 유지되었다 ; 예를 들어 제 WO 97/34631 호 및 제 WO 96/32478 호를 참조하라. 상기 Fc 변이체에서, 본 발명의 융합 분자에서는 필요하지 않은 구조적 특성 및 기능적 활성을 제공하는 천연 Fc 의 하나 또는 그 이상의 부위를 제거할 것이다. 이 부위는 예를 들어, 잔기를 치환하거나 삭제하거나, 이 부위로 잔기를 삽입하거나 이 부위를 포함하는 부분을 절두하여 제거할 수 있다. 삽입되거나 치환되는 잔기 또한 펩티드유사체 또는 D-아미노산과 같은 아미노산으로 바뀔 것이다. 하기에 기술된 각각의 여러 이유로 Fc 변이체가 바람직할 것이다. 전형적인 Fc 변이체는 다음의 분자 및 서열을 포함한다 :
1. 이황화물 결합 형성과 관련된 부위를 삭제하였다. 이 부위의 삭제로 인해 본 발명의 분자를 생성하는데 사용하는 숙주 세포에 존재하는 다른 시스테인-함유 단백질과의 반응을 피할 수 있다. 이런 효과를 위해, N-말단의 시스테인-함유 세그먼트를 절두하거나 시스테인 잔기를 다른 아미노산(예를 들어, 알라닐, 세릴)으로 치환하거나 삭제할 것이다. 특히, SEQ ID NO : 2 의 N-말단 20-아미노산 세그먼트를 절두하거나 SEQ ID NO : 2 의 위치 7 및 10 에서의 시스테인 잔기를 치환할 것이다. 시스테인 잔기를 제거했을 때에도, 단일 사슬 Fc 도메인은 여전히 비공유 결합된 이량체 Fc 도메인을 형성할 수 있다.
2. 천연 Fc 를 선택된 숙주 세포와 좀더 양립할 수 있도록 변이시켰다. 예를 들어, 프롤린 이미노펩티다제와 같은 E. coli 의 소화 효소에 의해 인지되는 전형적인 천연 Fc 의 N-말단 근처의 PA 서열을 제거할 것이다. 특히 분자가 E. coli 와 같은 박테리아 세포에서 재조합되어 발현될 때, N-말단 메티오닌 잔기가 첨가될 것이다. SEQ ID NO : 2 의 Fc 도메인은 이러한 Fc 변이체이다.
3. 천연 Fc 의 N-말단 부분을 선택된 숙주 세포에서 발현시 N-말단 이질성을 예방하기 위해 제거하였다. 이런 목적으로, N-말단의 처음 20 개의 아미노산 잔기 중 어떤 것, 특히 위치 1, 2, 3, 4 및 5 의 아미노산을 삭제할 것이다.
4. 하나 또는 그 이상의 글리코실화된 부위를 삭제하였다. 전형적으로 글리코실화된 잔기(예를 들어, 아스파라긴)는 세포융해 반응을 일으킬 것이다. 이러한 잔기를 비글리코실화된 잔기(예를 들어, 알라닌)로 치환하거나 삭제할 것이다.
5. C1q 결합 부위와 같은 보체와의 상호작용에 관련된 부위를 제거하였다. 예를 들어, 인체 IgG1 의 EKK 서열로 치환하거나 제거할 것이다. 보체의 보충은 본 발명의 분자에 유리하지 않으므로 Fc변이체에서는 피할 것이다.
6. 샐비지 수용체 이외에 Fc 수용체로의 결합에 영향을 미치는 부위를 제거하였다. 천연 Fc 는 본 발명의 융합 분자에서 필요로 하지 않는 특정 백혈구 세포와 상호작용하는 부위를 가지므로 이 부위를 제거할 것이다.
7. ADCC 부위를 제거하였다. ADCC 부위는 본 분야에 공지된 것이다 ; 예를 들어, IgG1 의 ADCC 부위에 관한 Molec. Immunol. 29(5) : 633 - 9 (1992)를 참조하라. 이 부위도 본 발명의 융합 분자에서 필요로 하지 않으므로 제거할 것이다.
8. 비-인체 항체에서 천연 Fc 가 유도되었을 때, 이 천연 Fc 를 인체화할 것이다. 일반적으로, 천연 Fc 를 인체화하기 위해, 인체 천연 Fc 에서 일반적으로 발견되는 잔기로 비-인체 천연 Fc 의 선택된 잔기를 치환할 것이다. 항체 인체화 기술은 본 분야에 널리 공지되어있다.
다음을 포함하는 Fc 변이체가 바람직하다. SEQ ID NO : 2 (도 4)에서, 위치 15 의 루이신을 글루탐산으로 치환하였다 ; 위치 99 의 글루탐산을 알라닌으로, 위치 101 및 103 의 리신을 알라닌으로 치환하였다. 게다가, 하나 또는 그 이상의 티로신 잔기를 페닐알라닌 잔기로 치환할 수 있다.
대안적인 부형제는 샐비지 수용체에 결합할 수 있는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항체 단편 또는 소분자(예를 들어, 펩티드유사체 화합물)이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,739,277 호(Presta 등에 의해 1998 년 4 월 14 일 발행됨)에 기술된 바와 같이 폴리펩티드를 부형제로서 사용할 수 있다. 펩티드 또한 파지 디스플레이 또는 FcRn 샐비지 수용체에 결합하는 RNA-펩티드 스크리닝에 의해 선택할 수 있다. 이러한 샐비지 수용체-결합 화합물 또한 "부형제" 의 의미내에 포함되며 본 발명의 범주에 포함된다. 이러한 부형제는 증가된 반감기(예를 들어, 프로테아제에 의해 인식되는 서열을 피하는 것에 의해) 및 감소된 면역원성(항체 인체화에서 발견되는 바와 같이, 비-면역원성 서열을 선호함에 의해)으로 인해 선택될 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 중합체 부형제 또한 F1및 F2로 사용할 수 있다. 부형제로서 유용한 화학 성분을 결합시키기 위한 다양한 방법이 현재 가능하다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용된,제목이 "N-말단이 화학적으로 변이된 단백질 조성물 및 방법" 인 특허 협력 조약("PCT") 국제 공개 번호 제 WO 96/11953 호를 참조하라. 이 PCT 공개는, 다른 것들 중에서도, 단백질 N-말단으로의 수용성 중합체의 선택적 결합을 나타낸다.
바람직한 중합체 부형제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. PEG 군은 사용하기 좋은 분자량일 것이며 선형 또는 가지난 형태일 것이다. PEG 의 평균 분자량은 바람직하게는 약 2 킬로달톤("kD") 내지 약 100 kD, 좀더 바람직하게는 5 kD 내지 50 kD, 가장 바람직하게는 5 kD 내지 10 kD 의 범위일 것이다. 본 발명의 화합물의 반응기(예를 들어, 알데하이드기, 아미노기 또는 에스테르기)에 PEG 성분의 반응기(예를 들어, 알데하이드기, 아미노기, 티올기 또는 에스테르기)를 아실화 또는 환원성 알킬화함에 의해 PEG 군이 일반적으로 본 발명의 화합물에 결합할 것이다.
합성 펩티드의 폴리에틸렌 글리콜화의 유용한 전략은 용액에서 복합체 결합을 형성함에 의해서, 각각 다른 것을 향해 서로 반응하는 특별한 기능성을 가지는 펩티드 및 PEG 성분의 결합으로 구성된다. 펩티드는 통상적인 고체상 합성으로 쉽게 제조할 수 있다. 펩티드는 특이 부위의 적절한 작용기가 "예비활성화" 된 것이다. 전구체를 PEG 성분과 반응시키기 전에 정제하고 완전히 특성화하였다. PEG를 가지는 펩티드의 결합은 수성상에서 일어나며 역상 분석 HPLC 로 쉽게 확인할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 펩티드는 예비 HPLC 로 쉽게 정제할 수 있으며 분석 HPLC, 아미노산 분석 및 레이저탈착 질량 분석법으로 특성화할 수 있다.
다당류 중합체는 단백질 변이에 이용할 수 있는 수용성 중합체의 다른 형태이다. 덱스트란은 주로 α1-6 결합으로 결합되는 글루코스의 각 소단위를 포함하는 다당류 중합체이다. 덱스트란은 그 자체로 많은 분자량 범위내에서 사용할 수 있으며 약 1 kD 내지 약 70 kD 의 분자량으로 쉽게 사용할 수 있다. 덱스트란은 그 자체가 부형제로 또는 다른 부형제(예를 들어, Fc)와 결합하여 본 발명에 사용하기에 적절한 수용성 중합체이다(제 WO 96/11953 호 및 제 WO 96/05309 호 참조). 치료 또는 진단 면역글로불린과 덱스트란을 결합시켜 사용하는 것은 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 유럽 특허 공개 번호 제 0 315 456 호에 발표되었다. 약 1 kD 내지 약 20 kD 의 덱스트란이 본 발명에 따른 부형제로서 사용되기에 바람직하다.
링커.모든 "링커" 는 선택적이다. 링커가 존재하면, 주로 스페이서로 공급된 것이므로 링커의 화학 구조는 중요하지 않다. 링커는 펩티드 결합으로 서로 결합된 아미노산으로 구성된 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 링커는 펩티드 결합으로 결합된 1 내지 20 개의 아미노산으로 구성되며 이 아미노산은 20 개의 천연 아미노산 중에서 선택하였다. 이 아미노산 중 몇몇은 본 분야에서 널리 인지된 바와 같이, 글리코실화될 것이다. 좀더 바람직한 실시형태에서, 1 내지 20 개의 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신 중에서 선택하였다. 더 바람직하게, 링커를 글리신 및 알라닌과 같이, 입체적으로 장애를 일으키지 않는 아미노산으로 대부분 구성하였다. 따라서, 바람직한 링커는 폴리글리신[특히 (Gly)4, (Gly)5], 폴리(Gly-Ala) 및 폴리알라닌이다. 링커의 다른 특정한 예는 다음과 같다 :
(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO : 6) ;
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO : 7) ;
(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO : 8) ; 및
GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO : 9).
상기 명명을 설명하기 위해, 예를 들어, (Gly)3Lys(Gly)4는 Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly 를 의미한다. Gly 및 Ala 의 결합 또한 바람직하다. 여기에서 보여진 아미노산은 전형적인 것이다 ; 본 발명의 범주에 속하는 링커는 훨씬 길어질 수 있으며 다른 잔기를 포함할 수있다.
비-펩티드 링커도 가능하다. 예를 들어, -NH-(CH2)s-C(0)-(여기에서 s = 2 - 20)와 같은 알킬 링커를 사용할 수 있다. 이 알킬 링커를 저급 알킬(예를 들어, C1-C6), 저급 아실, 할로겐(예를 들어, Cl, Br), CN, NH2, 페닐 등과 같은 특정한 입체적으로 장애를 일으키지 않는 기로 더 치환할 수 있다. 전형적인 비-펩티드 링커는 PEG 링커이며 이것은 화학식 V 를 갖는다 :
여기에서, n 은 링커가 100 내지 5000 kD, 바람직하게는 100 내지 500 kD 의 분자량을 가지는 것과 같다. 펩티드 링커를 상기에 기술된 바와 같은 방법으로 유도체를 형성하여 대체할 수 있다.
유도체.발명자는 또한 화합물의 펩티드 및/또는 부형제 부분을 유도하는 것을 의도하였다. 이러한 유도체는 화합물의 가용성, 흡수성, 생물학적 반감기 등을 향상시킬 것이다. 이 성분은 화합물 등의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 감소시킬 것이다. 전형적인 유도체는 다음의 화합물을 포함한다 :
1. 화합물 또는 그것의 몇몇 부분은 고리형태이다. 예를 들어, 펩티드 부분은 둘 또는 그 이상의 Cys 잔기를 포함하기 위해 변이될 것이며(예를 들어, 링커에서) 이는 이황화물 결합을 형성하여 고리화될 것이다.
2. 화합물이 교차-결합하거나 분자간 교차-결합을 할 수 있게 하였다. 예를 들어, 펩티드 부분은 하나의 Cys 잔기를 포함하도록 변이될 것이며 그것에 의해 유사 분자와 분자간 이황화물 결합을 형성할 수 있다. 화합물은 또한 화학식 VI 의 분자에서와 같이, C-말단을 통해 교차-결합할 것이다.
3. 하나 또는 그 이상의 펩티딜[-C(O)NR-]결합(linkage, bond)을 비-펩티딜 결합으로 치환하였다. 전형적인 비-펩티딜 결합은 -CH2-카르밤산염[-CH2-OC(O)NR-], 포스포네이트, -CH2-술폰아미드[-CH2-S(O)2NR-], 요소[-NHC(O)NH-], -CH2-이차 아민 및 알킬화된 펩티드[-C(O)NR6-, R6는 저급 알킬]이다.
4. N-말단을 유도하였다. 일반적으로, N-말단을 치환된 아민으로 아실화시키거나 변이시킬 것이다. 전형적인 N-말단 유도체기는 -NRR1(-NH2이외에), -NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, 숙신이미드 또는 벤질옥시카르보닐-NH-(CBZ-NH-)을 포함하며, 여기에서 R 및 R1은 각각 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이며 페닐 고리를 C1-C4알킬, C1-C4알콕시, 클로로 및 브로모 중에서 선택한 1 내지 3 개의 치환기로 치환할 것이다.
5. 유리 C-말단을 유도하였다. 일반적으로, C-말단을 에스테르화 또는 아미드화시켰다. 전형적인 C-말단 유도체기는 예를 들어, -C(O)R2(R2는 저급 알킬) 또는 -NR3R4(R3및 R4는 독립적으로 수소 또는 C1-C8알킬, 바람직하게는 C1-C4알킬)을 포함한다.
6. 이황화물 결합을 바람직하게는 좀더 안정한, 다른 교차-결합 성분(예를 들어, 알킬렌)으로 치환하였다. 예를 들어, Bhatnagar 등의 (1996) J. Med. Chem. 39 : 3814 - 9 ; Alberts 등의 (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357 - 9 를 참조하라.
7. 하나 또는 그 이상의 각 아미노산 잔기를 변이시켰다. 다양한 유도제는 하기에 상세히 기술된 바와 같이, 특히 선택된 곁사슬 또는 말단 잔기와 반응한다고 알려져 있다.
리시닐(Lysinyl) 잔기 및 아미노 말단 잔기는 리시닐 잔기의 전위를 바꾸는 숙신산 또는 다른 카르복시산 무수물과 반응하였다. 알파-아미노-함유 잔기를 유도하는 다른 적절한 시약은 다음을 포함한다 : 메틸 피콜린이미데이트(methyl picolinimidate)와 같은 이미도에스테르 ; 피리독살 인산 ; 피리독살 ; 클로로보로히드라이드(chloroborohydride) ; 트리니트로벤젠술폰산 ; O-메틸이소우레아 ; 2, 4 펜탄디온 ; 및 글리옥실산염의 트랜스아미나제-촉매반응.
아르기닐(Arginyl) 잔기는 페닐글리옥살, 2, 3-부탄디온, 1, 2-시클로헥산디온 및 닌히드린을 포함하는 여러 통상적인 시약 중 어느 하나 또는 그것의 조합과 반응시켜 변이될 것이다. 아르기닐 잔기의 유도체화는 구아니딘 작용기의 높은 pka 로 인해 염기성 조건에서 반응을 수행하였다. 게다가, 이 시약은 아르기닌 엡실론-아미노기 뿐만 아니라 리신기와도 반응할 것이다.
티로실 잔기의 특이 변이는 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응시켜 티로실 잔기에 스펙트럼 표지를 도입하는 것에 특히 흥미를 가지고 널리 연구되었다. 가장 일반적으로, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄을 각각 O-아세틸 티로실 종류 및 3-니트로 유도체를 형성하는데 사용하였다.
카르복시 곁사슬기[아스파틸(aspartyl) 또는 글루타밀(glutamyl)]는 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-(4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4, 4-디메틸펜틸) 카르보디이미드와 같은 카르보디이미드(R'-N=C=N=R')와 반응하여 선택적으로 변이될 것이다. 게다가, 아스파틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과 반응하여 아스파라기닐(asparaginyl) 및 글루타미닐(glutaminyl) 잔기로 변환될 것이다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로 탈아미드화될 것이다. 대안적으로, 이들 잔기는 약산 조건하에서 탈아미드화되었다. 이 잔기의 어떤 형태도 본 발명의 범주에 속한다.
시스테이닐(Cysteinyl) 잔기를 이황화물 결합을 제거하거나, 반대로 교차-결합이 안정되도록 아미노산 잔기 또는 다른 성분으로 치환할 수 있다. 예를 들어, Bhatnagar 등의 (1996), J. Med. Chem. 39 : 3814 - 9 를 참조하라.
이기작용제를 수반한 유도체화는 펩티드 또는 그것의 작용적 유도체를 불용성 지지 매트릭스 또는 다른 거대분자 부형제로 교차-결합시키는데 유용하다. 일반적으로 사용되는 교차-결합제는 다음을 포함한다 : 1, 1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르(예를 들어, 4-아지도살리실산을 수반한 에스테르), 3, 3'-디티오비스(숙신이미딜프로피온산염)과 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 호모이기작용성(homobifunctional) 이미도에스테르 및 비스-N-말레이미도-1, 8-옥탄과 같은 이기작용성 말레이미드. 메틸-3-[(P-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도제는 빛이 존재할 때에도 교차결합을 형성할 수 있는 광활성화할 수 있는 중간체를 생산하였다. 대안적으로, 시아노겐 브로마이드-활성 탄수화물 및 반응성 기질과 같은 반응적 불용성 매트릭스는 미국 특허 번호 제 3,969,287 호 ; 3,691,016 호 ; 제 4,195,128 호 ; 제 4,247,642 호 ; 제 4,229,537 호 ; 및 제 4,330,440 호에 기술되어 있으며 단백질 고정에 사용한다.
탄수화물(올리고당)군은 단백질의 글리코실화 부위로 알려진 부위에 쉽게 결합할 것이다. 일반적으로, 서열 Asn-X-Ser/Thr(X 는 프롤린을 제외한 어떤 아미노산이든 가능함)에서 O-결합 올리고당은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr)에 결합하는 반면 N-결합 올리고당은 아스파라긴(Asn) 잔기에 결합한다. X 는 바람직하게는 프롤린 이외에 19 개의 천연 아미노산 중 하나이다. 각 형태에서 발견된 N-결합 및 O-결합 올리고당 및 당 잔기는 상이하다. 둘 중에서 일반적으로 발견되는 당의 형태는 N-아세틸노이라민산(시알산이라고도 함)이다. 시알산은 보통 N-결합 및 O-결합 올리고당 둘 다의 말단 잔기이며, 그것의 음전하에 의해 글리코실화된 화합물이 산성 성질을 띄게될 것이다. 이러한 부위는 본 발명의 화합물의 링커에 삽입될 것이며 바람직하게는 폴리펩티드 화합물(예를 들어, CHO, BHK, COS 와 같은 포유동물 세포에서의)의 재조합체 생성 동안에 세포에 의해 글리코실화되었다. 그러나, 이러한 부위는 본 분야에 알려진 합성 또는 반합성 방법에 의해 더 글리코실화할 수 있다.
그외의 가능한 변이는 다음을 포함한다 : 프롤린 및 리신의 히드록시화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록시기의 인산화, Cys 상의 황 원자의 산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 곁사슬의 알파-아미노기의 메틸화 [Creighton, Proteins : Structure and Molecule Properties(미국 샌프란시스코에 소재하는 더블유. 에이치. 프리맨 앤드 컴파니) pp. 79 - 86 (1983) 참조].
본 발명의 화합물은 DNA 수준에서도 변화될 것이다. 화합물의 어떤 부분의 DNA 서열은 코돈이 선택된 숙주 세포에 좀더 양립할 수 있도록 변화될 것이다. 바람직한 숙주 세포인 E. coli 에서, 최적 코돈이 본 분야에 공지되어 있다. 제한 부위를 제거하거나 잠재성 제한 부위를 포함하도록 코돈을 치환할 것이며 이는 선택된 숙주 세포의 DNA 프로세싱을 촉진시킬 것이다. 부형제, 링커 및 펩티드 DNA 서열은 상기 서열 변화 중 어느 것이든지 포함하도록 변이될 것이다.
제조 방법
본 발명의 화합물은 재조합 DNA 기술을 사용하여 형질전환 숙주 세포에서 주로 만들어질 것이다. 그렇게 하기 위해서, 펩티드를 코드하는 재조합 DNA 분자를 제조하였다. 이러한 DNA 분자의 제조 방법은 본 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 펩티드를 코드하는 서열을 적절한 제한효소를 사용하여 DNA 로부터 절단할 수 있다. 대안적으로, DNA 분자는 포스포아미데이트(phosphoramidate) 방법과 같은 화학적 합성 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 또한, 이 기술들을 함께 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 적절한 숙주에서 펩티드를 발현시킬 수 있는 벡터를 포함한다. 이 벡터는 적절한 발현 조절 서열에 효과적으로 결합하는 펩티드를 코드하는 DNA 분자를 포함한다. DNA 분자를 벡터에 삽입하기 전 또는 후에 이 효과적인 결합을 이루는 방법은 널리 공지되어 있다. 발현 조절 서열은 전사 또는 번역의 조절에 관련된 프로모터, 활성제, 증강제, 작동인자, 리보솜 결합 부위, 개시 시그널, 종결 시그널, 캡(cap) 시그널, 폴리아데닐화 시그널 및 그외 시그널을 포함한다.
결과적으로 생성된 벡터는 DNA 분자를 가지며 적절한 숙주에 형질전환하는데 사용하였다. 이 형질전환은 본 분야에 널리 공지된 방법으로 수행하였다.
입수가능하고 널리 공지된 많은 숙주 세포 중 어느 것이든 본 발명을 실행하는데 사용할 수 있다. 특별한 숙주는 본 분야에서 인지된 여러 인자에 의해 선택하였다. 이 인자는 다음을 포함한다 : 선택된 발현 벡터의 적합성, DNA 분자에 의해 코드되는 펩티드의 독성, 형질전환 비율, 펩티드 회수의 용이함, 발현 특성, 생-안정성 및 비용. 상기 인자의 조화에서 모든 숙주가 특정 DNA 서열을 발현시키는데 있어 동일하게 효과적일 수 없다는 것이 인지되어야만 한다. 일반적인 지침에서, 유용한 미생물 숙주는 배지에서의 박테리아(예를 들어, E. coli 종), 효모[예를 들어, 사카로마이세스 종.(Saccharomyces sp.)] 및 그외 진균류, 곤충, 식물, 포유동물(인체 포함) 세포 또는 본 분야에 공지된 다른 숙주를 포함한다.
그런 다음, 형질전환 숙주를 배양하고 정제하였다. 바람직한 화합물이 발현되도록 숙주 세포를 통상적인 발효 조건하에서 배양할 것이다. 이러한 발효 조건은 본 분야에 널리 공지되어 있다. 최종적으로, 펩티드를 본 분야에 널리 공지된 방법으로 배지에서 정제하였다.
이 화합물 또한 합성 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 고체상 합성 기술을 사용할 수 있다. 적절한 기술은 본 분야에 널리 공지되어 있으며 Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335 - 61 (Katsoyannis 및 Panayotis eds.) ; Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85 : 2149 ; Davis 등의 (1985), Biochem. Intl. 10 : 394 - 414 ; Stewart 및 Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis ; 미국 특허 번호 제 3,941,763호 ; Finn 등의 (1976), The Proteins (3rd ed.) 2 : 105 - 253 ; 및 Erickson 등의 (1976), The Proteins (3rd ed.) 2 : 257 - 527 에 기술되어 있는 기술을 포함한다. 고체상 합성은 작은 펩티드를 만드는 비용면에서 가장 효율적인 방법이므로 각각의 펩티드를 만드는데 바람직한 기술이다.
유도된 펩티드를 포함하거나 또는 비-펩티드군을 포함하는 화합물은 널리 공지된 유기화학 기술로 합성할 수 있다.
화합물의 용도
본 발명의 화합물은 PTH-1 수용체 또는 PTH-2 수용체와의 상호작용에서 기인한 약리학적 활성을 갖는다[Mannstadt 등의 (1999) Am. J. Physiol. 277. 5Pt 2. F665 - 75 참조]. PTH 및 그것의 작동물질은 골흡수 및 신장 칼슘 재흡수를 증가시키고 표피성 증식 및 모발성장을 감소시킨다(Holick 등의 (1994) Proc. Natl. Sci. USA 91 (17) : 8014 - 6 ; Schilli 등의 (1997), J. Invest. Dermatol. 108(6) : 928 - 32 참조). 게다가 PTH-1 수용체 및/또는 PTH-2 수용체의 길항물질은 다음을 치료하는데 유용하다 :
ㆍ 일차 및 이차 부갑상선기능항진증 ;
ㆍ 충실성종양(유방, 폐 및 신장)에서 기인한 칼슘과잉혈증 및 혈액암(다발성골수종, 림프종 및 백혈병)을 포함하는 칼슘과잉혈증 ; 특발성칼슘과잉혈증 및 갑상선기능항진증과 신장기능장애에 관련된 칼슘과잉혈증 ;
ㆍ 종양 전이(특히 뼈로의 전이 및 유방 및 전립선암에 관련됨) ;
ㆍ 악액질 및 식욕부진(특히 암과 관련된 것임)
ㆍ 변형 PTH 수용체 시그널링에 관계되거나 그에 의해 더욱 악화된, 다음과 같은 골다공증의 다양한 형태를 포함하는 골감소증 :
- 일차 골다공증 ;
- 폐경기후 골다공증 및 연령에 관련된 골다공증 ;
- 내분비성 골다공증(갑상선기능항진증, 부갑상선기능항진증, 쿠싱 증후군 및 말단거대증) ;
- 골다공증의 유전적 및 선천적 형태(예를 들어, 불완전골형성증, 호모시스틴뇨증, 멘케스 증후군 및 릴리-데이 증후군) ;
- 사지의 부동화에 기인하는 골다공증 ;
- 혈색증, 과프로렉틴혈증, 신경성 식욕부진, 갑상선중독증, 진성당뇨병, 소아지방병증, 염증성장질환, 원발담즙성간경변, 류마티스성관절염, 강직성척추염, 다발성골수종, 림프성증식성질환 및 전신성비반세포증과 같은 다른 질환으로 인해 이차적으로 발생하는 골다공증 ;
- 화학치료, 항경련성 치료, 면역억제 치료, 항응고성 치료와 같은 약물 치료 또는 수술(예를 들어, 위절제술)로 인해 이차적으로 발생하는 골다공증 ;
- 류마티스성관절염(RA), 전신성홍반성루푸스(SLE), 천식, 측두동맥염, 맥관염, 만성폐쇄성폐질환, 류마티스성다발성근육통, 다발성근염, 만성간질성폐질환과 같은 질환의 당질피질스테로이드 치료로 인해 이차적으로 발생하는 골다공증 ;
- 신장, 간, 폐, 심장 이식과 같은 장기 이식 후의 장기 거부반응을 예방하기 위한 면역조절 치료 및/또는 당질피질스테로이드 치료로 인해 이차적으로 발생하는 골다공증 ;
- 우주여행 중에 관찰되는 것과 같은 극미중력에 의해 발생하는 골다공증 ;
- 유방암 및 전립선암과 같은 종양질환에 관련된 골다공증 ;
ㆍ 성인기 및 유년기에 뼈에 발생하는 파제트병(변형성골염) ;
ㆍ 골손실을 야기하는 골수염 또는 뼈의 감염성 손상 ;
ㆍ 수술 후의 골감소증, 스테로이드 투여로 인해 유도된 골감소증 및 소장과 대장 및 만성 간질환 및 신장질환에 따른 골감소증.
ㆍ 외상 손상 또는 다음에 관련된 비-외상 괴사 관련된 골괴사 또는 골세포 사멸 : 고세병, 겸상적혈구빈혈, 전신성홍반성루푸스, 류마티스성관절염, 치주질환, 골용해성 전이 및 다른 증상들 ;
ㆍ 안드로젠성탈모증(남성형 대머리), 독소탈모증, 노인성탈모증, 원형탈모증(alopecia areata, alopecia pelada) 및 발모광을 포함하는 탈모증(부족한 모발성장 및 부분 또는 전체 모발의 손실) ; 등등.
PTH 또는 PTHrP 의 활성으로 치료할 수 있는 그외의 증상이 있다. 이러한 적용에 있어서, PTH 수용체 작동물질은 치료학적 요법으로 유용하다. 특히, 이러한 적용은 골절 치유(비-유합 골절의 치료를 포함함) 및 다음과 같은 골다공증의 다양한 형태를 포함하는 골감소증을 포함한다 :
- 일차 골다공증 ;
- 폐경기후 골다공증 및 연령에 관련된 골다공증 ;
- 내분비성 골다공증(갑상성기능항진증, 쿠싱 증후군 및 말단거대증) ;
- 골다공증의 유전적 및 선천적 형태(예를 들어, 불완전골형성증, 호모시스틴뇨증, 멘케스 증후군 및 릴리-데이 증후군) ;
- 사지의 부동화에 기인하는 골다공증 ;
- 혈색증, 과프로렉틴혈증, 신경성 식욕부진, 갑상선중독증, 진성당뇨병, 소아지방병증, 염증성장질환, 원발담즙성간경변, 류마티스성관절염, 강직성척추염, 다발성골수종, 림프성증식성질환 및 전신성비반세포증과 같은 다른 질환으로 인해 이차적으로 발생하는 골다공증 ;
- 화학치료, 항경련성 치료, 면역억제 치료, 항응고성 치료와 같은 약물 치료 또는 수술(예를 들어, 위절제술)로 인해 이차적으로 발생하는 골다공증 ;
- RA, SLE, 천식, 측두동맥염, 맥관염, 만성폐쇄성폐질환, 류마티스성다발성근육통, 다발성근염, 만성간질성폐질환과 같은 질환의 당질피질스테로이드 치료로 인해 이차적으로 발생하는 골다공증 ;
- 신장, 간, 폐, 심장 이식과 같은 장기 이식 후의 장기 거부반응을 예방하기 위한 면역조절 치료 및/또는 당질피질스테로이드 치료로 인해 이차적으로 발생하는 골다공증 ;
- 우주여행 중에 관찰되는 것과 같은 극미중력에 의해 발생하는 골다공증 ;
- 유방암, 전립선암과 같은 종양질환에 관련된 골다공증 ;
연장된 반감기를 가지는 PTH 작동물질(예를 들어, Fc 도메인에 결합한 것)을 골흡수 저해제로 사용할 것이다. 골흡수 저해제는 다음을 포함한다 : OPG 및 OPG 유도체, OPG(RANKL) 항체, 칼시토닌(예를 들어, Miacalcin®, Calcimar®), 비스포스포네이트[예를 들어, APD, 알렌드로네이트, 리세드로네이트, 에티드로네이트, 파미드로네이트, 틸루드로네이트 (tiludronate), 클로드로네이트(clodronate), 네리드로네이트(neridronate), 이반드로네이트(ibandronate), 졸레드로네이트(zoledronate)], 에스트로겐(예를 들어, Premarin®, Estraderm®, Prempro®, Alora®, Climara®, Vivelle®, Estratab®, Ogen®), 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자[예를 들어, 랄록시펜, 드롤록시펜(droloxifene), 라소팍시펜], 티볼론 등등. 전형적인 골흡수 저해제는 본원에 참고문헌으로 인용된 제 WO 98/46751 호 및 제 WO97/23614 호에 기술되어 있다.
본 발명의 화합물은 골다공증 치료시 단일치료(monotherapy)로 적당하며 PTH-Fc 치료시 항흡수제(antiresorptive agent)를 첨가하면 효능 및 치료학적 창(window) 모두 증가할 것이다. PTH 및 PTH-Fc 둘 다 골형성 및 골흡수를 증가시킬 것이다. 파골세포 반응을 방해하는 항흡수제의 능력은 PTH-Fc 의 칼슘과잉혈증 효과를 제한할 수 있으며 골질량 또한 증가시킬 수 있다.
약학적 조성물
일반 형태.본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 약학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 주사로 투여하거나 경구, 호흡기, 비강, 경피로 또는 다른 형태로 투여할 것이다. 일반적으로, 본 발명은 약학적으로 용인가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 본 발명의 화합물의 유효량을 함유하는 약학적 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 다양한 완충용액 함량(예를 들어, 트리스-HCl, 아세트산염, 인산염), pH 및 이온 강도를 가지는 희석제 ; 계면활성제 및 용해제[예를 들어, 트윈 80(Tween 80), 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80)], 산화방지제(예를 들어,아스코르빈산, 메타중아황산나트륨), 방부제(예를 들어, 치메로살, 벤질알콜) 및 증량제(예를 들어, 락토스, 만니톨)과 같은 첨가제 ; 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체 화합물의 미립자 제제로의 물질 삽입 또는 리포솜으로의 삽입을 포함한다. 히알루론산 또한 사용할 수 있으며 순환시 지속 기간을 촉진시키는 효과가 있다. 이러한 조성물은 신체 상태, 안정성, 생체내 방출속도 및 존재하는 단백질 또는 유도체의 생체내 제거율에 영향을 미친다. 본원에 참고문헌으로 인용된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, 펜실베이니아 18042 이스톤에 소재하는 맥 퍼블리싱 컴파니) 1435 - 1712 페이지를 참조하라. 조성물을 액체 형태로 제조하거나 동결건조된 형태와 같은 건조 분말로 제조할 것이다. 체내로 삽입할 수 있는 서방성 제제형 또한 고려할 수 있으며 경피성 제제형도 고려할 수 있다.
본 발명의 화합물의 매주 2 회 투여가 PTH(1-34) 의 일일 투여보다 설치류에서의 조골세포 수, 골부피 및 골밀도의 증가면에서 더 우수하다. 성숙한 마우스에서는, PTH-(1-34)-Fc 의 매주 2 회 투여가 PTH-(1-34) 의 일일 투여보다 높은 골밀도 및 골부피의 증가를 나타낸다(도 10 을 참조하라). 골다공증에 걸린 노화된 OVX 랫 모델에서, 매주 2 회 투여는 에스트로겐을 제거한 1 년 동안 유도된 골손실의 50 % 이상을 되돌릴 수 있다. 노화된 랫 모델에서 보여지는 이 효과는 비스포스포네이트(APD)와 함께 투여했을 때 더 우수하였다. 랫에서, PTH-(1-34)-Fc(340 nmol/kg) 의 단일 SC 주사는 72 시간 동안 지속되는 칼슘과잉혈증 반응을 일으켰다(도 8 참조). 이 기간은 혈청에서 PTH-(1-34)-Fc 가 제거되는 속도와 일치하며 이는 랫에서의 최적의 매주 2 회 투여 양생법과 일치한다.
영장류에서의 최적 투여는 랫 또는 마우스와 비교해서 더 적은 빈도로 투여하는 것이다. PTH-(1-34)-Fc(10 - 34 nmol/kg) 의 단일 피하 주사로 투여한 OVX 시아노몰구스 원숭이에서 관찰되는 약 168 시간 동안 지속되는 칼슘과잉혈증 반응에 기초하여, 매주(또는 더 적은 빈도로) 투여하는 것이 영장류에게 최적일 것이다(도 11 참조). 이 관찰은 영장류에서 PTH-(1-34)-Fc 의 단일 피하 투여분이 약 1 주내에 제거되며 또한 이는 동화작용 효과에서 요구되는 최대 투여 빈도를 나타내는 것임을 제시한다.
경구 투여용 약제학적 제형.본원에서는 고형의 경구 투여용 약제학적 제형이 사용되었으며 이는 본원에 참고문헌으로 인용된 Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18th Ed. (펜실베이니아 18042 이스톤에 소재하는 맥 퍼블리싱 컴파니)의 89 장에 일반적으로 기술되어 있다. 고형의 약제학적 제형은 정제, 캡슐, 알약, 구내정 또는 구중정, 카세제 또는 펠렛을 포함한다. 또한, 본 조성물을 제제화하는데 리포솜 또는 프로테노이드 캡슐화를 사용할 것이다(예를 들어, 프로테노이드 입자는 미국 특허 번호 제 4,925,673 호에 나타나있다). 리포솜 캡슐화를 사용할 수 있으며 리포솜은 다양한 중합체에서 유도될 것이다(예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,013,556 호 참조). 치료시 사용할 수 있는 고형의 약제학적 제형은 본원에 참고문헌으로 인용된 Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979)(G.S. Banker 및 C.T. Rhodes 에 의해 발행됨)의 10 장에 나타나있다. 일반적으로, 제제형은 위장내 환경서 보호되며 장에서 생물학적 활성물질을 방출하는 본 발명의 화합물 및 불활성 성분을 포함할 것이다.
또한 보다 명확하게 상기 본 발명의 화합물의 경구 투여용 약제학적 제형이 예상된다. 만일 필요하다면, 화합물의 경구 투여가 효과적이도록 화학적으로 변이시킬 것이다. 일반적으로, 화학적 변이는 화합물 분자 자체로 적어도 하나의 성분이 결합한다고 예상되며 상기 성분은 (a) 단백질분해의 저해 ; 및 (b) 위장 또는 장에서 혈류로의 유입을 가능하게한다. 또한 화합물의 총 안정성이 증가하고 혈액에서의 순환 시간이 증가하는 것이 바람직하다. 본 발명의 부형제에 공유적으로 결합하는 유용한 성분 또한 본 목적에 사용할 수 있다. 이러한 성분의 예는 다음을 포함한다 : PEG, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리딘 및 폴리프롤린. 예를 들어, Abuchowski 및 Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs(1981), Hocenberg 및 Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp.367 - 83 ; Newmark 등의 (1982), J. Appl. Biochem. 4 : 185 - 9 를 참조하라. 사용할 수 있는 다른 중합체는 폴리-1,3-디옥솔레인 및 폴리-1,3,6-티옥소칸이다. 상기 기재된 바와 같이, 약학적으로 사용하기 위해서는 PEG 성분이 바람직하다.
경구 투여용 약제학적 제형에서는 본 발명의 치료학적 화합물의 흡수를 향상시키기 위해 담체로서 소듐 N-(8-[2-히드록시벤조일]아미노) 카프릴에이트(SANC)와 같은 변형 지방족 아미노산의 염을 사용하는 것이 또한 가능하다. SNAC 를 사용하는 헤파린 제제형의 임상학적 효능은 에미스피어 테크놀로지(Emisphere Technogies)에 의해 수행되는 단계 Ⅱ 실험에서 증명되었다. 미국 특허 번호 제 5,792,451 호 "경구 투여용 조성물 및 방법" 을 참조하라.
본 발명의 화합물은 과립 또는 약 1 mm 크기 조각의 펠릿 형태인 정제된 다중미립자와 같은 제제형에 포함된다. 캡슐 투여를 위한 물질의 제제형은 또한 가루, 경미하게 압축시킨 플러그 또는 정제이다.치료제는 압축함으로써 제조할 수 있다.
색소 및 향미료 모두 포함될 수 있다. 예를 들어, 단백질(또는 유도체)은 제제화(리포솜 또는 마이크로스피어 캡슐화에 의한 것과 같이)된 후 색소 및 향미료를 포함하는 냉장 음료와 같은 식용 제품내에 포함된다.
불활성 물질을 갖는 본 발명의 화합물의 부피를 희석시키거나 증가시킬 수 있다. 희석제는 탄수화물, 특히 만니톨, α-락토오스, 무수락토오스, 셀룰로오스, 수크로오스, 변형 덱스트란류 및 녹말을 포함할 수 있다. 어떤 무기염은 또한 3인산칼슘, 탄산마그네슘 및 염화나트륨을 포함하는 충전제로서 사용할 수 있다. 몇몇 통상적으로 입수가능한 희석제는 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress 및 Avicell 이다.
붕해제는 고형의 약제학적 제형으로 치료학적 제제형에 포함될 수 있다. 붕해제로 사용하는 물질은 녹말, 엑스플로탭(Explotab) 에 기초를 두는 통상적인 붕해제를 포함하는 녹말을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 소듐 녹말 글리콜레이트, 암버라이트(Amberlite), 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 울트라아밀로펙틴, 알긴산나트륨, 젤라틴, 오렌지 껍질,카르복시메틸셀룰로스산, 천연 스폰지 및 벤토나이트는 모두 사용할 수 있다. 붕해제의 다른 형태는 불용성 양이온 교환 수지이다. 분말 고무는 붕해제 및 접합제로서 사용될 수 있으며 아가, 카라야 또는 트라가칸트와 같은 분말 고무를 포함할 수 있다. 알긴산 및 그의 나트륨염도 또한 유용한 붕해제이다.
접합제는 단단한 정제를 형성하여 치료제를 유지하는데 사용할 수 있으며 아카시아, 트라가칸트, 녹말 및 젤라틴과 같은 천연물로부터 수득한 물질을 포함한다. 다른 것으로는 메틸 셀룰로스(MC), 에틸 셀룰로스(EC) 및 카르복시메틸 셀룰로스(CMC)를 포함한다. 폴리비닐 피롤리돈(PVP) 및 히드록시프로필메틸 셀룰로스(HPMC)는 둘다 치료제를 과립화하기 위해 알콜 용액에서 사용될 수 있다.
항마찰제는 제제화 과정 중에 달라붙는 것을 막기 위해 치료학적 제제형내에 포함될 수 있다. 윤활제는 치료제 및 다이(die) 벽 사이의 막으로서 사용될 수 있으며, 그의 마그네슘염 및 칼슘염을 포함하는 스테아르산, 폴리테트라플로로에틸렌(PTFE), 액체 파라핀, 식물성 기름 및 왁스를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 또한 수용성 윤활제로 라우릴 황산나트륨, 라우릴 황산마그네슘, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, Carbowax 4000 및 6000 을 사용할 수 있다.
제제화하는 동안 약제의 유동성을 향상시키고 압축하는 동안 재배열을 촉진하는 활택제가 첨가될 수 있다. 활택제는 녹말, 활석, 발열규소 및 수화실리코알루미늄산염을 포함한다.
본 발명의 화합물이 수성 상태로 용해되는 것을 촉진시키기 위해 계면활성제는 습윤제로서 첨가될 수 있다. 계면활성제는 라우릴 황산나트륨, 디옥틸 소듐 술포석시네이트 및 디옥틸 소듐 술포네이트와 같은 음이온성 계면활성제를 포함한다. 양이온성 계면활성제도 사용될 수 있으며 이는 염화벤잘코늄 또는 염화벤제토늄을 포함한다. 계면활성제로 제제형내에 포함될 수 있는 잠재적인 비이온성 계면활성제의 예로는 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아르산염, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 10, 50 및 60, 모노스테아르산글리세롤, 폴리소르베이트 40, 60. 65 및 80, 수크로오스지방산에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스가 있다. 계면활성제는 단독 또는 다른 비율의 혼합물로서 단백질 또는 유도체의 제제형내에 존재한다.
첨가제는 화합물의 흡수를 향상시키기 위해 또한 제제형에 포함될 수 있다. 잠재적으로 이러한 특성을 갖는 첨가제의 예로는 지방산류 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이 있다.
조절 방출 제제형이 바람직하다. 본 발명의 화합물은 확산 또는 예를 들어, 고무와 같은 침출 메카니즘에 의해 방출되도록 불활성 기질로 통합할 수 있다. 서서히 퇴화하는 기질을 예를 들어, 알긴산염, 다당류와 같은 제제형에 또한 통합할 수 있다. 본 발명의 조절 방출 화합물의 다른 형태는 오로스(Oros) 치료 시스템[알자(Alza) 코포레이션에서 입수]에 기초한 방법에 의한 것으로 즉, 삼투압에 의해 약제가 단일 작은 구멍을 통해 출입할 수 있는 반투과성 막으로 싸여있는 약제이다. 몇몇 장용성제피는 또한 서방성 효과를 갖는다.
다른 제피는 제제형에 사용할 수 있다. 이는 제피기에 적용시킬 수 있는 여러 당을 포함한다. 치료제는 또한 얇은 코팅 정제로 주어지며, 이 예로 사용되는 물질은 2 그룹으로 나누어질 수 있다. 첫째는 비장용성 물질이며 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 메틸히드록시-에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필-메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시-메틸 셀룰로스, 프로비돈 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 두 번째 그룹은 일반적으로 프탈산의 에스테르인 장용성 물질로 이루어져 있다.
물질의 혼합은 최적의 얇은 제피를 제공하는데 사용한다. 얇은 제피는 팬 제피기 또는 유동층내에서 수행되거나 압축 제피에 의해이루어진다.
호흡기 투여 형태.또한 본원에서는 본 단백질(또는 그의 유도체)을 호흡기 투여한다. 단백질(또는 유도체)은 흡입하는 동안 포유동물의 호흡기로 투여하면 혈류로 폐 상피조직 내층을 통해 관통한다. 다른 문헌으로는 Adjei 등의 Pharma. Res. (1990) 7 : 565 - 9 ; Adjei 등의 (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63 : 135 - 44 (루프로라이드 아세테이트) ; Braquet 등의 (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (부록 5) : s.143 - 146 (엔도테린-1; endothelin-1) ; Hubbard 등의 (1989), Annals Int. Med. 3 : 206 - 12 (α1-안티트립신) ; Smith 등의 (1989), J. Clin. Invest. 84 : 1145 - 6 (α1-프로테이나아제) ; Oswein 등의 (March 1990), "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery П, Keystone, Colorado (재조합 인체 성장 흐르몬) ; Debs 등의 (1988), J. Immunol. 140 : 3482 - 8 (인터페론-γ 및 종양 괴사 인자 α) 및 Platz 등의 미국 특허 번호 제 5,284,656 호 (과립성백혈구 콜로니 자극 인자)이 포함된다.
본 발명의 실험에서 사용하는 것은 분무기, 정량식 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하나 이에 국한되지 않는 치료학적 제품의 호흡기 투여를 위해 고안된 기계적 장치의 넓은 범위이며, 이는 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 본 발명의 실험에 적절한 통상적으로 입수가능한장치의 몇몇 특정한 예는 미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 마린크로드트 인코포레이티드(Mallinckrodt, Inc.)에서 생산하는 울트라벤트 (Ultravent) 분무기 ; 미국 콜로라도 잉글우드에 소재하는 말퀘스트 메디칼 프로덕트(Marquest Medical Products)에서 생산하는 Acorn Ⅱ 분무기 ; 미국 노스캐롤라이나 리서치 트라이앵글 파크에 소재하는 그락소 인코포레이티드 (Glaxo Inc.)에서 생산하는 벤톨린(Ventolin) 정량식 흡입기 ; 및 미국 매사추세츠 베드퍼드에 소재하는 피손스 코포레이션(Fisons Corp.)에서 생산하는 스핀핼러(Spinhaler) 분말 흡입기이다.
이같은 모든 장치는 본 발명의 화합물을 제조하기 위해 적당한 제제형의 사용이 요구된다. 전형적으로, 각각의 제제형은 사용하는 장치의 유형에 있어 특정하고, 적절한 추진제 물질, 게다가 치료에 유용한 희석제, 보조제 및/또는 담체의 사용을 포함한다.
원위성 폐에 가장 효과적으로 투여하기 위해서, 발명의 화합물은 10 ㎛ (또는 마이크론)이하, 바람직하게 0.5 내지 5 ㎛ 평균 조각 크기의 형태가 특히 바람직하다.
약학적으로 용인가능한 담체는 트리할로스, 만니톨, 수크로오스, 락토오스 및 소르비탈과 같은 탄수화물을 포함한다. 제제형내에서 사용하는 다른 성분은 DPPC, DOPE, DSPC 및 DOPC 이다. 천연 계면활성제 또는 합성 계면활성제를 사용할 수 있다. PEG 를 사용할 수 있다(단백질 또는 유사체에서 유래된 용도와는 별도이다). 시클로덱스트란과 같은 덱스트란류를 사용할 수 있다. 담즙염 및 다른 관련 증강제를 사용할 수 있다. 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체는 사용할 수 있다. 완충용액 제제형내에서의 용도와 같이, 아미노산도 사용할 수 있다.
또한, 리포솜, 복합체를 포함하는 마이크로캡슐이나 미소립자 또는 담체의 다른 형태를 사용할 수 있다.
분무기, 제트 또는 초음파 중 하나와 함께 사용하기에 적절한 제제형은 전형적으로 용액 ㎖ 당 약 0.1 내지 25 ㎎ 의 생물학적인 활성 단백질의 농도로 물에 용해되는 발명의 화합물을 함유한다. 제제형은 또한 완충용액 및 단일 당(예를 들어 단백질 안정성 및 삼투압 조절을 위해)을 포함한다. 분무기 제제형은 에어로졸을 형성하여 용액을 미립화함으로써 야기되는 단백질의 집성체를 일으키는 표면을 감소시키거나 방지하기 위한 계면활성제를 포함한다.
정량식 흡입기에 사용하는 제제형은 일반적으로 계면활성제의 도움으로 추진제로 현탁된 본 발명의 화합물을 포함하는 잘 분리된 분말을 함유한다. 추진제는 트리클로로플루오르메탄, 디클로로디플루오르메탄, 디클로로테트라플루오르에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오르에탄을 포함하는 클로로플루오르카본, 히드로클로로플루오르카본, 히드로플루오르카본이나 히드로카본 또는 그의 화합물과 같은, 이 목적을 위해 사용하는 통상적인 물질이다. 적절한 계면활성제는 소르비탄 트리올에이트 및 소야 레시틴을 포함한다. 또한 올레산도 유용한 계면활성제이다.
분말 흡입기로부터 제조되는 제제형은 본 발명의 화합물을 포함하는 잘 분리된 건조 분말을 함유하며, 또한 장치로부터 분말의 분산을 촉진시키는, 양으로 말하면 예를 들어, 제제형의 50 내지 90 중량 % 의 락토오스, 소르비톨, 수크로오스, 만니톨, 트리할로스 또는 크실리톨과 같은 증량제를 포함한다.
비강 투여 형태.본 발명의 화합물을 또한 비강 투여한다. 비강 투여는 허파내에서 제품의 침전없이 비강으로 치료학적 제품을 투여한 후에 직접 혈류로 단백질이 이동하도록 한다. 비강 투여를 하기 위한 제제형은 덱스트란 또는 시클로 덱스트란을 포함한다. 다른 점막을 통과하는 수송을 통한 투여도 또한 가능하다.
투여량 결정 방법.상기 설명된 상태를 치료하기 위한 방법에 포함된 투여량 양생법은 약제의 효과를 변화시키는 여러 요인 예를 들어, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별과 식이요법, 감염 정도, 투여시간 및 다른 임상학적 요인을 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 일반적으로 일일 양생법은 체중의 ㎏ 당 본 발명 화합물의 0.1 - 1000 ㎍, 바람직하게 ㎏ 당 0.1 - 150 ㎍ 의 범위이다.
바람직한 특정 실시형태
본 발명자는 하기 표 4 에 바람직한 펩티드의 바람직한 구조를 타나내었다. 기호 "∧" 는 본원에 기재된 링커의 수를 나타내거나 단순히 표준 펩티드 결합을 나타낸다(즉, 링커가 존재하지 않는다). 일련의 반복 및 링커를 명확하게 하기 위해 대시로 구분하여 나타내었다.
"F1" 은 앞서 본원에서 설명한 Fc 도메인이다. 표 4 에 나타나 있는 것에 더하여, 본 발명자는 Fc 이량체의 각각의 가닥이 상이한 펩티드 서열(예를 들어 SEQ ID NO : 166 에 의해 설명된 한 가닥, SEQ ID NO : 170 에 의한 다른 가닥 또는 표 1 및 2 의 서열에 결합된 Fc)에 결합된 상태에서의 헤테로다이머도 생각하였다.
본 발명의 모든 화합물은 PCT 출원 번호 제 WO 99/25044 호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 하기 수행되는 실시예에 의해 설명될 것이나 이에 국한되지 않는다.
실시예 1
Fc-결합된 PTH/PTHrP 수용체(PTH-R1) 작동물질[PTH-(1-34)-Fc]의
생물학적 활성도
도입부
부갑상선 호르몬[PTH-(1-34) 또는 천연 PTH-(1-84)] 은 일일 주사하면 골형성 및 골질량의 증가를 야기한다. 이전에는 PTH 의 반감기가 짧기(1 시간 이하)때문에 이렇게 골형성 및 골질량을 증가시키려면 PTH 를 자주 투여해야 한다고 여겨졌다. 임상학적으로, PTH 치료법의 작용의 효과는 일일 SC 주사를 요구하는데, 이는 PTH 의 광범위한 사용에 주요한 방해가 된다. PTH 는 적은 빈도로 주사하는 것이 임상학적으로 바람직하며 PTH 의 생체내 반감기를 증가시킴으로써 획득될 수 있다. PTH 의 단-기간(간헐적인)의 투여(< 1 시간/일)는 조골세포의 골형성을 자극하며, 반면에 장-기간(연속적인)의 투여(> 2 시간/일)는 조골세포의 골흡수를 자극한다(Dobnig 등의 Endocrinology 138 : 4607, 1998 참조). 연장된 반감기를 갖는 PTH 를 제안하는 본 기술은 골흡수를 증가시켜서 칼슘과잉혈증에 이르게 할 수 있다. 그러나, 골흡수 저해제를 갖는 PTH-유래 파골세포 활성을 막는것은 가능하다. 오스테오프로테게린 (osteoprotegerin, OPG)은 본 발명의 목적에 매우 적합하다. OPG-Fc 를 갖는 랫, 마우스 또는 사람의 단일치료는 파골세포 집단을 근본적으로 근절함으로써 골흡수의 지속된 저해를 일으킨다. OPG 와 같은 유력한 골흡수 저해제의 공동-투여는 큰 효과를 제공한다. 양생법은 골질량의 증가를 일으키는 PTH 에 의한 골형성의 비경쟁적 자극을 치료학적으로 가능하게 한다. 비스포스포네이트 또는 에스트로겐을 포함하는 다른 골흡수 저해제는 또한 PTH-유래 골흡수를 저해하므로 지속성의 PTH 분자와 화합하여 사용할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 인체 PTH-(1-34)-Fc 를 복제, 발현 및 정제하였다. 단백질의 Fc 결합은 그의 혈중 반감기의 현저한 증가를 일으키고, OPG-Fc 와 유사하거나 동일한 방식으로 인체 PTH-(1-34)-Fc 를 주사하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 이점은 하루에 한번인 현행 기준보다 매우 드물게 1/4 당 한번의 빈도로 PTH 를 적은 빈도수로 주사하는 것이다.
재료, 방법 및 결과
칼슘과잉혈증 분석
마우스의 칼슘과잉혈증 모델에서 PTH-(1-34)-Fc 효과의 잠재력 및 지속력을 실험하였다. 간단히 말해서, 마우스에 다양한 투여량의 PTH-(1-34) 또는 PTH-(1-34)Fc 를 SC로 한번 주사하고, 말초혈은 칼슘을 이온화하는 혈액의 정량을 위해 안와후의 동으로부터 수집하였다. 성형제에 대한 마우스의 칼슘과잉혈증 반응을 확인함으로써 입증된 바와 같이 PTH-(1-34)-Fc 의 반감기 및 잠재력은 PTH-(1-34) 보다 뛰어나다(도 4). 칼슘과잉혈증이 6-24 시간 동안 지속되는 PTH-(1-34) 에 의해 유도되는 반면에, PTH-(1-34)-Fc 의 등몰투여량은 더 지속적인 칼슘과잉혈증을(48 - 72 시간) 유발하였다. 반응의 지속력은 PTH-(1-34) 보다 PTH-(1-34)-Fc 구조물의 더 뛰어난 반감기와 조화를 이룬다. PTH-(1-34)-Fc 의 잠재력은 또한 PTH-(1-34) 에 비해 현저하게 뛰어나다(도 4). PTH-(1-34) 의 높은 투여량은 PTH-(1-34) 의 등몰투여량에 비해 이온화된 칼슘 농도 피크의 더 높은 증가를 유발하였다. 곡선하면적 (AUC)의 분석은 사용되는 가장 높은 투여량을 나타내고, PTH-(1-34)-Fc 는 PTH-(1-34) 의 등몰투여량보다 2.6 배 더 높은 칼슘과잉혈증을 유발하였다.
동화작용 분석
본 출원인은 PTH-(1-34) 보다 PTH-(1-34)-Fc 가 우수한 약리학 및 반감기를 갖는다는 것을 증명하기 위해, OPG-Fc 와 함께 처리되는 PTH-(1-34)-Fc 가 골질량을 증가시키는지 아닌지를 결정하기위해 예비연구를 하였다. 간단히 말해서, 생후 5 개월된 수컷 스프래그 돌레이(SD) 랫을6 그룹으로 나누었다. 기준선 골밀도 (BMD)는 이중에너지 X-선 촬영법 (DEXA)로 모든 랫의 세번째 요부 척추(L3)를 측정하였다(0 일). 후에 랫을 하기 계획에 따라 처리하였다 :
그룹 1 :부형약 조절 (1, 3 및 5 일에 SC로 주입된 PBS).
그룹 2 :OPG-Fc, 1 일에 단일 SC 주사 (1 ㎎/㎏).
그룹 3 :PTH-(1-34), 20 nMoles PTH/㎏/주사로 1, 3 및 5 일에 SC 주사. 이는 최적 동화 작용의 PTH 양생법을 나타낸다.
그룹 4 :1 일에 단일 OPG-Fc 주사를 제외하고 그룹 3 과 동일.
그룹 5 :1 일에 60 nMolse/㎏ 의 PTH-(1-34)-Fc 를 단일 SC 주사. 단일 주사를 제외하고 그룹 3 에 의해 주사된 PTH-(1-34) 의 총 투여량과 동일한 몰투여량을 나타낸다.
그룹 6 :1 일에 단일 OPG-Fc 주사 (1 ㎎/㎏의 SC)를 제외하고 그룹 5 와 동일.
요부 척추의 DEXA 는 BMD 의 변화를 측정하기 위해 7일에 다시 수행하였다. L3 에서의 BMD 는 PBS-처리된 랫에 비해 대부분 OPG-Fc의 단일 주사 또는 PTH-(1-34) 의 3 주사로 증가하였다. PTH-(1-34) + OPG 는 OPG 또는 PTH-(1-34) 가 단독으로 주사할 때 보다 BMD 를 더 증가시킨다. 단일치료로서, PTH-(1-34)-Fc 의 단일 주사는 BMD 를 증가시키지 못한다. 그러나 PTH-(1-34)-Fc 의 단일 주사와 OPG-Fc 의단일 주사와 함께 처리하면 BMD 가 현저하게 증가하였다(도 5). 이러한 결과는 연장된 혈중 반감기를 갖는 PTH 가 동화작용의 골격반응을 일으키기 위해 OPG-Fc 와 같이 효과있는 항흡수제와 조화를 이룰 수 있다는 증거를 제공하였다. PTH-(1-34)-Fc 에 OPG-Fc 를 더한 단일 처리의 동화작용의 효과는 OPG-Fc 와 공동-처리가 있건 없건 간에, PTH-(1-34) 의 다중주사에 의해 유도되는 것보다 뛰어나다. 결론적으로, BMD 의 최대 증가는 PTH-(1-34) 에 비해 우수한 치료 양생법이며, 일일 또는 이틀마다 주사해야 하는 PTH-(1-34)-Fc + OPG-Fc 의 덜 빈도적인 주사로 나타난다.
도 5 는 세번째 요부 척추(L3)에서의 골밀도(BMD)에 대한 PTH-Fc + OPG-Fc 의 효과를 나타낸다. 생후 6 개월된 정상적인 랫에 PTH-Fc 나 PTH 또는 부형약을 단일 SC 주사로 처리하였다. 또한 몇몇 랫은 OPG 의 단일 SC 주사를 처리하였다. DEXA 로 BMD 를 7 일 후에 측정하였다. 데이터는 ±SD, n = 6 랫/그룹을 의미한다.
실시예 2
Fc-결합된 PTH/PTHrP 수용체(PTH-R1) 길항물질([Asn 10, Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc)
도입부
여러 질환 상태는 PTH 또는 PTHrP의 증가된 혈중 농도와 관계가 있다. 일차 및 이차 부갑상선기능항진증(PHPT 및 SHPT, 각각)은 증가된 PTH 농도와 관계가 있는 반면에, 악성종양의 체액성 칼슘과잉혈증(HHM)은 증가된 PTHr 농도를 일으킨다. 일반적인 PTH/PTHrP 수용체(PTH-R1)를 통한 두 단백질의 시그널은 골흡수, 신장 칼슘 재흡수 및 비타민 D 의 신장 합성의 증가를 일으킨다. 골흡수 저해제는 이러한 질환 상태에서 파골세포의 골흡수를 저해하는데 성공적인 반면에, 칼슘혈에서 PTH 또는 PTHrP 과잉의 장 및 신장의 영향을 완화시키는 치료법은 없다. PTH 또는 PTHrP 시그널에 직접적으로 반대로 작용하는 약제는 흡수 저해제에 비해 뛰어난 효능을 나타낸다.
PTH-R1 시그널의 가장 잘 연구된 길항물질은 아미노 말단의 절두에 기초를 둔다. PTH-(7-34) 펩티드는 매우 온화한 길항작용의 활성을 나타내는 효과적인 PTH-R1 길항물질이다. PTH-(7-34) 에 비해, PTHrP-(7-34) 펩티드는 PTH-R1 에 대한 뛰어난 친화력을 갖고 그 자체로서 효과있는 길항물질이다. 그러나, PTHrP-(7-34) 도 또한 PTH-(7-34) 에 비해 뛰어난 길항작용의 활성을 갖는다[McKee (1990), Endocrinol.127 : 76 참조]. 최적 길항물질은 PTHrP-(7-34) 의 강한 길항작용과 PTH-(7-34) 의 약한 아고니즘을 결합시킬 수 있다. Nutt 등의 (1990),Endocrinol. 127 : 491 에서 PTH 의 Asn10 및 Leull 을 PTHrP 서열(대체 Asp10 및 Lysll)로 치환하는 것이 실질적으로 작동활성이 아니라 매우 효과있는 길항작용의 활성을 갖는 펩티드([Asn10,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc)를 유발함을 증명하였다.
천연 PTH와 같은 모든 펩티드-기초 PTH-R1 길항물질은 매우 짧은 혈중 반감기(1 시간)의 특성을 나타낸다. 더욱이, 수용체 아고니즘아고니즘하기 위해 요구되는 아미노-말단 절두는 또한 PTH-R1 에 대한 펩티드의 친화력을 현저하게 감소시킨다. 이러한 특성은 통상적인 펩티드 길항물질의 임상학적인 잠재력을 제한한다. 아미노-말단에 절두된 PTH- 또는 PTHrP 펩티드의 Fc-결합은 그의 혈중 반감기를 현저하게 증가시키고, PTH-R1 의 지속적인 길항작용은 Fc-길항물질을 충분히 투여함으로써 나타난다.
재료, 방법 및 결과
본 출원인은 [Asn10,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc 를 복제, 발현 및 정제하였다. 마우스내의 급성 및 만성적인 칼슘과잉혈증 반응에 반대로 작용하는 이 화합물의 능력을 실험하였다. PTHrP-(1-34) 는 [Asn10,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc 의 급성효과를 상승시키기 위한 칼슘혈증제로서사용할 수 있다. PTHrP는 HHM의 주요한 매개체이므로, 이 연구는 또한 종양을 포함하는 칼슘과잉혈증의 모델을 나타낸다. 간단히 말해서, 혈중 이온화된 칼슘(BIC) 은 기준선에서 측정하고, 마우스에 부형약(PBS) 또는 PTHrP-(1-34) (0.5 ㎎/㎏)를 SC 주사로 처리하였다. 그런 다음 마우스에 다양한 투여량의 [Asn10,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc 또는 부형약(PBS)을 SC 로 한번 처리하였다. PTHrP-(1-34) 를 처리한 부형약-처리 마우스에서, 일시적인 칼슘과잉혈증이 관찰되었다. 칼슘혈증 반응의 피크는 주사한 지 3 시간 후에 나타나며, 적어도 주사한 지 6 시간 후까지 지속된다. 10 ㎎/㎏ 의 [Asn10,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc 는 부형약 처리에 비해 PTHrP-유도 칼슘과잉혈증의 더 빠른 회복을 유발하였다. 30 ㎎/㎏ 의 투여량은 PTHrP-(1-34) 에 대한 칼슘혈증 반응을 완벽하게 저해하였다(도 6).
더 만성적인 칼슘과잉혈증에 반대로 작용하는 [Asn10, Leull]PTHrP-(7-34)-Fc 의 능력을 실험하기 위해, 지속적인 칼슘혈증제로서 PTH-(1-34)-Fc 를 사용하였다. 이 연구는 또한 PTH 농도의 지속적인 증가를 특징으로 하는 질환인 일차 및 이차 부갑상선기능항진증의 모델을 나타낸다. 부형약-처리 마우스에서, PTH-(1-34)-Fc(30 ㎎/㎏) 의 단일 주사는 정상 마우스에서 주사한 지 24 시간 후에 2.75 ㎎/㎗ 의 농도(정상 표준치 1.35 와 비교)에 달하는 강한 칼슘과잉혈증의 반응을 유발하였다. 10 -100 ㎎ 의 [Asn10,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc 의 단일 SC 주사는 24 시간에 PTH-(1-34)-Fc 에 대한 칼슘과잉혈증 반응 피크의 현저한 감소를 유발하였다(도 6).
결론적으로, 칼슘과잉혈증의 급성 및 만성적인 동물 모델에서 [Asn10,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc 의 길항작용의 활성을 증명하였다. 이러한 모델은 PTH 및 PTHrP 둘 다에 기초한 칼슘혈증제를 사용하였다. 데이터는 다른 Fc-결합 PTH-R1 길항물질 뿐만 아니라 [Asn10,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc 가 부갑상선기능항진증, HHM 및 이상형 RTH-R1 시그널과 관계된 다른 질환에 대한 효과적인 치료 선택이라는 것을 나타낸다.
실시예 3
Fc - 결합 및 천연 C-말단 절두 PTH 단편의 골생성 특성
A. cAMP 분석
랫 조골세포와 같은 ROS 17/2.8 세포에서 cAMP 축적을 자극하기위한 PTH-Fc 구조물의 능력을 실험하였다. 배양물은 cAMP의 축적을 향상시키기 위해 포스포디에스테라제 저해제 IBMX 로 처리한 다음 부형약(PBS) 또는 다양한 PTH 구조물 중 하나로 15 분 동안 처리하였다. 모든 단편에 대한 투여량-의존 cAMP 축적을 증명하였다. Fc-비결합된PTH-(1-34) 는 PTH-(1-31)-Fc 및 PTH-(1-30)-Fc 보다 더 효과적이다(도 7). 데이터는 Fc-결합 PTH 단편이 조골세포에서 AC 흐름을 활성화시키는 능력을 유지한다는 것을 증명하였다.
B. 마우스 생물학적 검정
본 출원인은 마우스에서 PTH-(1-34), PTH-(1-34)-Fc, PTH-(1-31)-Fc 및 PCT-(1-30)-Fc 의 효과를 실험하였다. 생후 4 주된 수컷 마우스에 부형약 또는 PTH 단편을 SC 주사로 0, 5 및 10 일에 주사하였다. 말초혈은 24, 48 및 72 시간에 임상학적 화학작용에 의해 수득된다. 마우스를 15일에 희생시키고, 척추, 경골 및 대퇴골은 조직학을 위해 수확하며 하나의 경골은 골밀도를 측정(말초 정량적 전산화 단층활영술,pQCT)하기 위해 수집한다. 임상학적 화학작용 끝점(endpoint)은 총 혈청 칼슘, 알칼리성 포스파타제(AP, 조골세포 활성의 마커) 및 주석산염-저항성 산성 포스파타제(TRAP, 파골세포 활성의 마커)를 포함한다. 각 동물에서, AP:TRAP 의 비율은 파골세포 활성에 비해 상대적인 조골세포 활성의 마커로서 측정된다. 높은 AP:TRAP 비율은 잠재적으로 더 많은 동화작용제(anabolic agent)를 나타낸다. 상대적으로 높은 투여량 (최적 동화투여량보다 15 배)은 임상학적 화학작용 끝점에서의 현저한 변화를 증명하는 선행 연구에 기초를 두고 선택하였다. 낮은 투여량은 골밀도에 대한 동화작용의 효과를 증명하기 위해 요구될 수 있으며, 항흡수제의 공동-처리는 또한 동화작용의 반응을 나타내기 위해 요구될 수 있다.
임상학적 화학작용 결과를 도 8 에 나타내었다. 혈청 칼슘은 30 nmoles/㎏(1.2 ㎎/㎏)의 PTH-(1-34) 를 주사한 지 24, 48 또는 72 시간 후에도 현저하게 다르지 않다. 이 결과는 혈청 칼슘에서 정상적으로 일시적인(12 시간) 증가를 유발하는 Fc-비결합 펩티드의 짧은 반감기와 일치한다. 결론적으로, PTH-(1-34)-Fc 의 등몰투여량은 24 시간 후에 피크가 되는 혈청 칼슘에서 극적이고 지속적인 증가를 유발하였다. PTH-(1-31)-Fc 는 더 효과있는 칼슘혈증제인 반면에, PTH-(1-30)-Fc 는 3 Fc 펩티드의 약한 칼슘혈증제이다(도 8A). 혈청 AP(조골세포 마커)는 PTH-(1-34) 투여에 의해서는 변하지 않지만, 72 시간 후에 30 nmoles/㎏ 의 PTH-(1-34)-Fc 및 PTH-(1-31)-Fc 에 의해서는 현저하게 상승하였다. PTH-(1-30)-Fc 1,000 nmoles/㎏ 을 주사한 지 72 시간 후에 피크가 되는 AP의 높은 상승을 증명하였다(도 8B). 혈청 TRAP(파골세포 마커)는 PTH-(1-34), PTH-(1-34)-Fc 또는 PTH-(1-30)-Fc 에 의해서는 변하지 않지만, PTH-(1-34)-Fc 에 의해서는 극적으로 증가하였다(도 8C). 계산된 AP:TRAP 의 비율은 PTH-(1-34) 에 의해서는 변하지 않지만, PTH-(1-34)-Fc 에 의해서는 증가하였다. PTH-(1-31)-Fc 의 낮은 투여량(100 nmoles/㎏)은 AP:TRAP 를 증가시키는 반면에, 높은 투여량(1,000 nmole/㎏)은AP:TRAP 를 감소시킨다. PTH-(1-30)-Fc(1,000 nmoles/㎏)에 의해 AP:TRAP 가 현저하게 증가하였다(도 8D).
골밀도(근위 경골 골간단)에 대한 다양한 PTH 구조물의 영향을 도 9 에 나타내었다. 15 일 연구의 끝에, PTH-(1-34) (300 nmoles/㎏)은 0, 5 및 10 일에 주사되었을 때, 알맞은(비-현저한) 동화작용의 효과를 갖는다는 것이 관찰되었다. PTH-(1-34)-Fc(300 nmoles/㎏)은 골밀도에 대한 효과를 나타내지 않으며, 100 nmoles/㎏ 의 높은 투여량은 현저한 칼슘과잉혈증-관련 독성을 유발하고, 뼈를 pQCT 로 측정한 동물에서 수득하지 않는다. PTH-(1-30)-Fc 는 골밀도에서 현저한 증가를 유발하였다. 명백한 역 투여량-반응에 있어서, 100 nmoles/㎏ 에서 PTH-(1-30)-Fc 는 뛰어난 효과를 나타내며, 모든 투여량 BMD 가 대조군보다 뛰어남에도 불구하고 1,000 nmoles/㎏ 에서는 낮은 효과를 나타낸다(도 9). 역 투여량-반응은 사용되는 투여량(임상학적 화학작용 끝점에 의해 선택)은 최적 동화작용의 투여량보다 5 - 50 배 높다. 혈청 칼슘을 현저하게 증가시키지 못하는 PTH(또는 PTH-Fc) 의 낮은 투여량은 작용의 효과에 대해서 최적이다. Hock,J.M.(1992), J. Bone Min. Res.7 : 65 - 72 를 참조하라. 본 연구에서, 뛰어난 작용의 효과를 갖는 치료 양생법[100 nmoles/㎏ 에서 PTH-(1-30)-Fc] 은 혈청 칼슘을 현저하게 증가시키지 않는 PTH-Fc 처리일 뿐이다(도 8A).
이러한 데이터는 C-말단에서 절두된 PTH-Fc 펩티드의 잠재적인 동화작용의 효과를 나타낸다. Fc 결합에 의해 참조되고, C-말단 절두에 의한 AC/cAMP 의 선택적인 자극과 조화이루는 긴 반감기는 효과있는 골흡수 저해제에 의한 작용의 효과를 설명할 수 있다. PTH-(1-30)-Fc 의 순차적인 C-말단 절두가 PTH-(1-30)-Fc 의 동화작용의 프로필을 유지하거나 초과하는 짧은 단편을 드러낼 것이라고 예상되었다. 단편은 자극성 조골세포에서 더 선택적이며 낮은 칼슘혈증을 나타내므로, 동화작용의 치료에 대해 넓은 치료학적 영역을 제공한다.
실시예 4
단일치료로서의 PTH-Fc 처리
단일치료로서의 PTH-(1-34)-Fc 의 효과는 성숙한 마우스에서 증명되었다. 간단히 말해서, 수컷 BDF1 마우스(생후 4 개월)에 다양한 투여량의 PTH-(1-34)-Fc 또는 부형약(PBS)을 피하주사로 일주일에 2 회 처리하였다. 다른 마우스는 설치류에서 증가하는 골질량에 최적인 치료 양생법 80 ㎍/㎏/일(20 nmol/kg/일) 투여량으로 PTH-(1-34) 를 일일 SC 주사로 처리한다(M.Gunness-Hey 및 J. M. Hock. Metab. Bone Dis.δ Rel. Res. 5 : 177 - 181, 1984 참조). 3 주 후에, 마우스를 죽이고, 경골을 pQCT를 통해 골밀도(BMD)에 대해 분석하였다(도 10).
부형약-처리 대조군과 비교하여 PTH-(1-34)-Fc 를 일일 주사함으로써 총 경골 BMD 및 망상구조의 BMD 가 둘 다 현저하게 증가하였다[도 1, 이원분산분석(2-way ANOVA), p < 0.05]. PTH-(1-34)-Fc 를 부형약 또는 일일 PTH-(1-34) 의 효과보다 현저하게 뛰어난 높은 투여량(50 및 150 nmol/㎏)으로 매주 2 회 주사하는 것은 총 및 망상조직의 BMD 둘 다에서 투여량-의존 증가를 유발하였다. 경골에서의 피질 BMD 는 일일 PTH-(1-34) 처리에 의해 현저하게 증가하지 않는다. 주 2 회의 PTH-(1-34)-Fc 처리는 부형약 또는 일일 PTH-(1-34) 를 처리한 마우스(p < 0.05)에서 관찰한 것 보다 높은 투여량에서 현저하게 뛰어난 피질 BMD 의 투여량-의존 증가를 유발하였다.
주 2 회의 PTH-(1-34)-Fc 처리는 또한 난소절제된(OVX) 성숙한 랫에서 단일치료로서 BMD 를 증가시킨다. 스프래그 돌레이 랫은 생후 3 개월에 OVX 를 하고 11 개월 동안 뼈가 손실되도록 하였다. 다른 랫은 겉보기 수술을 하고 부형약(PBS)으로 주 2 회 처리하였다. OVX 랫은 부형약 또는 비스포스네이트 APD(파미드로네이트, 0.5 ㎎/㎏)나 APD + PTH-(1-34)-Fc 중 하나로 주 2 회 SC 주사하였다. BMD 는 이중에너지 X-선 촬영법(DEXA)을 통해 매주 측정하였다. 랫은 처리한 지 4 주 후에 사망하였다. 치료의 초기 단계에서, OVX 랫은 부형약-처리 OVX 랫에 비해 골격 부위 분석에서 BMD 의 현저한 감소를나타낸다(도 11, p < 0.05, 이원분산분석). APD 단독 처리는 부형약-처리 OVX 랫에 비해 골격 부위에서 BMD 를 현저하게 증가시키지 않는다. PTH-(1-34)-Fc 단독 처리는 처리한 지 4 주 후에 대퇴부 골간단에서 BMD의 현저한 증가를 유발하였다. PTH + ABD 로 OVX 랫의 처리는 이 부위에서 BMD 의 빠른 현저한 증가를 나타낸다(3 주). APD + PTH-(1-34)-Fc 의 화합물은 요부 척추 및 대퇴부 골간단에서 현저한 BMD 증가를 유발하였다(p < 0.05). PTH-(1-34)-Fc 단독 처리는 계속적인 처리에도 불구하고 10 일 후에 자발적으로 나타나는 온화하고 일시적인 칼슘과잉혈증 반응을 유발하였다. APD 의 공동-투여는 PTH-(1-34)-Fc 의 칼슘혈증 효과를 완벽하게 차단하였다.
이러한 데이터는 PTH-(1-34)-Fc 가 성숙한 마우스 및 성숙한 OVX 랫에서 단일치료로서 사용될 때 효과적인 동화작용제임을 나타낸다. 또한 PTH-(34)-Fc 에 항흡수제(APD)를 첨가하는 것은 성숙한 OVX 랫에서 BMD 를 유사하거나 더 빠르게 증가시킨다. APD 의 공동-투여는 PTH-(1-34)-Fc 에 의해 나타나는 일시적인 칼슘과잉혈증 반응을 또한 차단하며, PTH-(1-34)-Fc 의 치료적 마커가 효과적인 항흡수제를 공동-투여함으로써 현저하게 상승됨을 나타낸다.
본 발명을 충분히 설명하였으나, 본 발명의 양상 및 범주를 벗어나지 않는 한도내에서 본 분야의 숙련자들은 본 발명을 다양하게 변화시킬 수 있다.
약 어
AC 아데닐산 사이클라제
AP 알칼리성 포스파타제
BMD 골밀도
cAMP 사이클릭 아데노신 모노포스파타제
DEXA 이중에너지 X-선 촬영법
HHM 악성종양의 체액성 칼슘과잉혈증
OPG 오스테오프테게린
OVX 난소절제된
PBS 인산완충식염수
pQCT 말초 정량적 전산화 단층촬영술
PTH 부갑상선 호르몬
PTHrP 부갑상선 호르몬-관련 단백질
TRAP 주석산염-저항성 산성 포스파타제

Claims (79)

  1. 다음 화학식 Ⅰ
    화학식 Ⅰ
    P1-(L1)a-F1
    여기에서, F1은 부형제로서 P1-(L1)a의 C-말단에 결합되며 ;
    P1은 PTH/PTHrP 조절 도메인이고 ;
    L1은 링커이며 ;
    a 는 0 또는 1 이다
    을 갖는 부형제 - 펩티드 분자 및 이의 다량체로 이루어진 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 화학식 Ⅰ 은 P1-F1임을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, F1은 Fc 도메인임을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, F1은 IgG Fc 도메인임을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, F1은 IgG1 Fc 도메인임을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, F1은 SEQ ID NO : 2 의 서열을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, PTH/PTHrP 조절 도메인은 다음 식
    XNHX10X11X12KX14X15X16X17X18X19RX21X22X23X24X25X26X27X28XC
    (SEQ ID NO : 3)
    여기에서,
    XN은 존재하지 않거나 또는 X3X4X5X6X7, X2X3X4X5X6X7, X1X2X3X4X5X6X7또는 YX1X2X3X4X5X6X7이고 ;
    X1내지 X7, X10, X11, X12, X14내지 X28은 각각 독립적으로 아미노산 잔기이며 ;
    Xc는 존재하지 않거나 또는 X29, X29X30, X29X30X31, X29X30X31X32, X29X30X31X32X33, X29X30X31X32X33X34, X29X30X31X32X33X34X35또는 X29X30X31X32X33X34X35X36이고 ;
    X29내지 X36은 각각 독립적으로 아미노산 잔기이다
    을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    XN은 X1X2X3X4X5X6X7이고 ;
    X1은 친수성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    X2는 V 이고 ;
    X3은 S 이며 ;
    X4는 E 이고 ;
    X5는 비작용성 또는 염기성 잔기이며 ;
    X6은 Q 이고 ;
    X7은 L 이며 ;
    X10은 산성 또는 친수성 잔기이고 ;
    X11은 비작용성 또는 염기성 잔기이며 ;
    X12는 비작용성 잔기이고 ;
    X14는 염기성 또는 친수성 잔기이며 ;
    X15는 비작용성 잔기이고 ;
    X16은 비작용성 또는 친수성 잔기이며 ;
    X17은 산성, 친수성 또는 비작용성 잔기이고 ;
    X18은 비작용성 잔기이며 ;
    X19는 산성 또는 염기성 잔기이고 ;
    X21은 비작용성 또는 염기성 잔기이며 ;
    X22는 친수성, 산성 또는 방향족 잔기이고 ;
    X23은 방향족 또는 지방친화성 잔기이며 ;
    X24는 지방친화성 잔기이고(L 이 바람직함) ;
    X25는 친수성 또는 염기성 잔기이며 ;
    X26은 친수성 또는 염기성 잔기이고 ;
    X27은 지방친화성, 염기성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    X28은 지방친화성 또는 비작용성 잔기
    임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    XC는 X29X30X31X32X33X34이고 ;
    X29는 친수성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    X30은 친수성 또는 산성 잔기이고 ;
    X31은 지방친화성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    X32는 H 이고 ;
    X33은 친수성 잔기이며 ;
    X34는 비작용성 또는 방향족 잔기
    임을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서,
    XC는 X29X30X31이고 ;
    X29는 친수성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    X30은 친수성 또는 산성 잔기이고 ;
    X31은 지방친화성 또는 비작용성 잔기
    임을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서,
    XC는 X29X30이고 ;
    X29는 친수성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    X30은 친수성 또는 산성 잔기
    임을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 8 항에 있어서,
    XC는 X29이고 ;
    X29는 친수성 또는 비작용성 잔기
    임을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 8 항에 있어서, XC는 존재하지 않음을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 8 항에 있어서,
    X1은 A, S 또는 Y 이고 ;
    X5는 H 또는 I 이며 ;
    X10은 N 또는 D 이고 ;
    X11은 L, R 또는 K 이며 ;
    X12는 G, F 또는 W 이고 ;
    X14는 H 또는 S 이며 ;
    X15는 L 또는 I 이고 ;
    X16은 Q, N, S 또는 A 이며 ;
    X17은 S, D 또는 L 이고 ;
    X18은 M, L, V 또는 Nle 이며 ;
    X19는 E 또는 R 이고 ;
    X21은 V, M, R, 또는 Nle 이며 ;
    X22는 E 또는 F 이고 ;
    X23은 W 또는 F 이며 ;
    X25는 R 또는 H 이고 ;
    X26은 K 또는 H 이며 ;
    X27은 K 또는 L 이고 ;
    X28은 L 또는 I
    임을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    XC는 X29X30X31X32X33X34이고 ;
    X29는 Q 또는 A 이며 ;
    X30은 D 또는 E 이고 ;
    X31은 V 또는 I 이며 ;
    X33은 N 또는 T 이고 ;
    X34는 A, F 또는 Y
    임을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    XC는 X29X30X31이고 ;
    X29는 Q 또는 A 이며 ;
    X30은 D 또는 E 이고 ;
    X31은 V 또는 I
    임을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 14 항에 있어서,
    XC는 X29X30이고 ;
    X29는 Q 또는 A 이며 ;
    X30은 D 또는 E
    임을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 14 항에 있어서,
    XC는 X29이고 ;
    X29는 Q 또는 A
    임을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 14 항에 있어서, XC는 존재하지 않음을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 1 항에 있어서, PTH/PTHrP 조절 도메인은 다음 식
    JNJ7J8HNJ11J12KHLJ16SJ18J19RJ21EWLRKKLJC
    (SEQ ID NO : 4)
    여기에서,
    JN은 존재하지 않거나 J1J2J3J4J5J6, J2J3J4J5J6, J3J4J5J6중에서 선택하고 ;
    J1은 아미노산 잔기이며 ;
    J2는 아미노산 잔기이고 ;
    J3은 아미노산 잔기이며 ;
    J4는 아미노산 잔기이고 ;
    J5는 아미노산 잔기이며 ;
    J6은 아미노산 잔기이고 ;
    J7은 아미노산 잔기이며 ;
    J8은 아미노산 잔기이고 ;
    J11은 비작용성 또는 염기성 잔기이며 ;
    J12는 아미노산 잔기이고 ;
    J16은 아미노산 잔기이며 ;
    J18은 아미노산 잔기이고 ;
    J19는 산성 또는 염기성 잔기이며 ;
    J21은 아미노산 잔기이고 ;
    JC는 존재하지 않거나 또는 J29, J29J30, J29J30J31, J29J30J31J32, J29J30J31J32J33, J29J30J31J32J33J34이며 ;
    J29는 아미노산 잔기이고 ;
    J30은 아미노산 잔기이며 ;
    J31은 아미노산 잔기이고 ;
    J32는 아미노산 잔기이며 ;
    J33은 아미노산 잔기이고 ;
    J34는 아미노산 잔기이다
    을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    JN은 J1J2J3J4J5J6이고 ;
    J1은 비작용성 또는 방향족 잔기이며 ;
    J2는 비작용성 잔기이고 ;
    J3은 친수성 잔기이며 ;
    J4는 산성 잔기이고 ;
    J5는 비작용성 잔기이며 ;
    J6은 염기성 잔기이고 ;
    J7은 비작용성 또는 방향족 잔기이며 ;
    J8은 비작용성 잔기이고 ;
    J11은 염기성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    J12는 비작용성 또는 방향족 잔기이고 ;
    J16은 비작용성 또는 친수성 잔기이며 ;
    J18은 비작용성 잔기이고 ;
    J19는 산성 또는 염기성 잔기이며 ;
    J21은 비작용성 잔기이고 ;
    JC는 J29J30J31J32J33J34이며 ;
    J29는 친수성 또는 비작용성 잔기이고 ;
    J30은 친수성 또는 산성 잔기이며 ;
    J31은 지방친화성 또는 비작용성 잔기이고 ;
    J32는 염기성 잔기이며 ;
    J33은 산성 잔기이고 ;
    J34는 방향족 잔기
    임을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서,
    J1은 A, S 또는 Y 이고 ;
    J2는 V 이며 ;
    J3은 S 이고 ;
    J4는 E 이며 ;
    J5는 I 이고 ;
    J6은 Q 이며 ;
    J7은 L 또는 F 이고 ;
    J8은 M 또는 Nle 이며 ;
    J11은 L, R 또는 K 이고 ;
    J12는 G 또는 W 이며 ;
    J16은 N, S 또는 A 이고 ;
    J18은 M, Nle, L 또는 V 이며 ;
    J19는 E 또는 R 이고 ;
    J21은 V, M 또는 Nle 이며 ;
    J29는 Q 또는 A 이고 ;
    J30은 D 또는 E 이며 ;
    J31은 V 또는 I 이고 ;
    J32는 H 이며 ;
    J33은 N 이고 ;
    J34는 F 또는 Y
    임을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 20 항에 있어서,
    JN은 J1J2J3J4J5J6이고 ;
    J1은 비작용성 또는 방향족 잔기이며 ;
    J2는 비작용성 잔기이고 ;
    J3은 친수성 잔기이며 ;
    J4는 산성 잔기이고 ;
    J5는 비작용성 잔기이며 ;
    J6은 염기성 잔기이고 ;
    J7은 비작용성 또는 방향족 잔기이며 ;
    J8은 비작용성 잔기이고 ;
    J11은 염기성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    J12는 비작용성 또는 방향족 잔기이고 ;
    J16은 비작용성 또는 친수성 잔기이며 ;
    J18은 비작용성 잔기이고 ;
    J19는 산성 또는 염기성 잔기이며 ;
    J21은 비작용성 잔기이고 ;
    JC는 J29J30J31이며 ;
    J29는 친수성 또는 비작용성 잔기이고 ;
    J30은 친수성 또는 산성 잔기이며 ;
    J31은 지방친화성 또는 비작용성 잔기
    임을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    J1은 A, S 또는 Y 이고 ;
    J2는 V 이며 ;
    J3은 S 이고 ;
    J4는 E 이며 ;
    J5는 I 이고 ;
    J6은 Q 이며 ;
    J7은 L 또는 F 이고 ;
    J8은 M 또는 Nle 이며 ;
    J11은 L, R 또는 K 이고 ;
    J12는 G 또는 W 이며 ;
    J16은 N, S 또는 A 이고 ;
    J18은 M, Nle, L 또는 V 이며 ;
    J19는 E 또는 R 이고 ;
    J21은 V, M 또는 Nle 이며 ;
    J29는 Q 또는 A 이고 ;
    J30은 D 또는 E 이며 ;
    J31은 V 또는 I
    임을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 20 항에 있어서,
    JN은 J1J2J3J4J5J6이고 ;
    J1은 비작용성 또는 방향족 잔기이며 ;
    J2는 비작용성 잔기이고 ;
    J3은 친수성 잔기이며 ;
    J4는 산성 잔기이고 ;
    J5는 비작용성 잔기이며 ;
    J6은 염기성 잔기이고 ;
    J7은 비작용성 또는 방향족 잔기이며 ;
    J8은 비작용성 잔기이고 ;
    J11은 염기성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    J12는 비작용성 또는 방향족 잔기이고 ;
    J16은 비작용성 또는 친수성 잔기이며 ;
    J18은 비작용성 잔기이고 ;
    J19는 산성 또는 염기성 잔기이며 ;
    J21은 비작용성 잔기이고 ;
    JC는 J29J30이며 ;
    J29는 친수성 또는 비작용성 잔기이고 ;
    J30은 친수성 또는 산성 잔기
    임을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서,
    J1은 A, S 또는 Y 이고 ;
    J2는 V 이며 ;
    J3은 S 이고 ;
    J4는 E 이며 ;
    J5는 I 이고 ;
    J6은 Q 이며 ;
    J7은 L 또는 F 이고 ;
    J8은 M 또는 Nle 이며 ;
    J11은 L, R 또는 K 이고 ;
    J12는 G 또는 W 이며 ;
    J16은 N, S 또는 A 이고 ;
    J18은 M, Nle, L 또는 V 이며 ;
    J19는 E 또는 R 이고 ;
    J21은 V, M 또는 Nle 이며 ;
    J29는 Q 또는 A 이고 ;
    J30은 D 또는 E
    임을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 20 항에 있어서,
    JN은 J1J2J3J4J5J6이고 ;
    J1은 비작용성 또는 방향족 잔기이며 ;
    J2는 비작용성 잔기이고 ;
    J3은 친수성 잔기이며 ;
    J4는 산성 잔기이고 ;
    J5는 비작용성 잔기이며 ;
    J6은 염기성 잔기이고 ;
    J7은 비작용성 또는 방향족 잔기이며 ;
    J8은 비작용성 잔기이고 ;
    J11은 염기성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    J12는 비작용성 또는 방향족 잔기이고 ;
    J16은 비작용성 또는 친수성 잔기이며 ;
    J18은 비작용성 잔기이고 ;
    J19는 산성 또는 염기성 잔기이며 ;
    J21은 비작용성 잔기이고 ;
    JC는 J29이며 ;
    J29는 친수성 또는 비작용성 잔기
    임을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서,
    J1은 A, S 또는 Y 이고 ;
    J2는 V 이며 ;
    J3은 S 이고 ;
    J4는 E 이며 ;
    J5는 I 이고 ;
    J6은 Q 이며 ;
    J7은 L 또는 F 이고 ;
    J8은 M 또는 Nle 이며 ;
    J11은 L, R 또는 K 이고 ;
    J12는 G 또는 W 이며 ;
    J16은 N, S 또는 A 이고 ;
    J18은 M, Nle, L 또는 V 이며 ;
    J19는 E 또는 R 이고 ;
    J21은 V, M 또는 Nle 이며 ;
    J29는 Q 또는 A
    임을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제 20 항에 있어서,
    JN은 J1J2J3J4J5J6이고 ;
    J1은 비작용성 또는 방향족 잔기이며 ;
    J2는 비작용성 잔기이고 ;
    J3은 친수성 잔기이며 ;
    J4는 산성 잔기이고 ;
    J5는 비작용성 잔기이며 ;
    J6은 염기성 잔기이고 ;
    J7은 비작용성 또는 방향족 잔기이며 ;
    J8은 비작용성 잔기이고 ;
    J11은 염기성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    J12는 비작용성 또는 방향족 잔기이고 ;
    J16은 비작용성 또는 친수성 잔기이며 ;
    J18은 비작용성 잔기이고 ;
    J19는 산성 또는 염기성 잔기이며 ;
    J21은 비작용성 잔기이고 ;
    JC는 존재하지 않음을
    특징으로 하는 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서,
    J1은 A, S 또는 Y 이고 ;
    J2는 V 이며 ;
    J3은 S 이고 ;
    J4는 E 이며 ;
    J5는 I 이고 ;
    J6은 Q 이며 ;
    J7은 L 또는 F 이고 ;
    J8은 M 또는 Nle 이며 ;
    J11은 L, R 또는 K 이고 ;
    J12는 G 또는 W 이며 ;
    J16은 N, S 또는 A 이고 ;
    J18은 M, Nle, L 또는 V 이며 ;
    J19는 E 또는 R 이고 ;
    J21은 V, M 또는 Nle
    임을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 20 항에 있어서, PTH/PTHrP 조절 도메인은 표 1 에서 선택함을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 1 항에 있어서, PTH/PTHrP 조절 도메인은 다음 식
    ONLHO10O11O12KSIO16O17LRRRFO23LHHLIOC
    (SEQ ID NO : 5)
    여기에서,
    ON은 존재하지 않거나 또는 YO1O2O3O4O5O6O7, O1O2O3O4O5O6O7, O2O3O4O5O6O7, O3O4O5O6O7, O4O5O6O7, O5O6O7, O6O7또는 O7이고 ;
    O1은 아미노산 잔기이고 ;
    O2는 아미노산 잔기이며 ;
    O3은 아미노산 잔기이고 ;
    O4는 아미노산 잔기이며 ;
    O5는 아미노산 잔기이고 ;
    O6은 아미노산 잔기이며 ;
    O7은 아미노산 잔기이고 ;
    O10은 아미노산 잔기이며 ;
    O11은 아미노산 잔기이고 ;
    O12는 아미노산 잔기이며 ;
    O16은 아미노산 잔기이고 ;
    O17은 아미노산 잔기이며 ;
    O23은 아미노산 잔기이고 ;
    OC는 존재하지 않거나 또는 O29, O29O30, O29O30O31, O29O30O31O32, O29O30O31O32O33, O29O30O31O32O33O34, O29O30O31O32O33O34O35또는 O29O30O31O32O33O34O35O36이고 ;
    O29내지 O36은 각각 독립적으로 아미노산 잔기이다
    을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 27 항에 있어서,
    ON은 O7이고 ;
    O7은 비작용성 잔기이며 ;
    O10은 산성 또는 친수성 잔기이고 ;
    O11은 염기성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    O12는 방향족 또는 비작용성 잔기이고 ;
    O15는 친수성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    O16은 친수성 잔기이고 ;
    O17은 산성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    O23은 방향족 잔기이고 ;
    OC는 존재하지 않음을
    특징으로 하는 조성물.
  34. 제 23 항에 있어서,
    ON은 O1O2O3O4O5O6O7이고 ;
    O1은 비작용성 아미노산 잔기이며 ;
    O2는 비작용성 아미노산 잔기이고 ;
    O3은 친수성 아미노산 잔기이며 ;
    O4는 산성 아미노산 잔기이고 ;
    O5는 염기성 또는 비작용성 아미노산 잔기이며 ;
    O6은 친수성 아미노산 잔기이고 ;
    O7은 비작용성 잔기이며 ;
    O10은 산성 또는 친수성 잔기이고 ;
    O11은 염기성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    O12는 방향족 또는 비작용성 잔기이고 ;
    O15는 친수성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    O16은 친수성 잔기이고 ;
    O17은 산성 또는 비작용성 잔기이며 ;
    O23은 방향족 잔기
    임을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 34 항에 있어서,
    O1은 A 이고 ;
    O2는 V 이며 ;
    O3은 S 이고 ;
    O4는 E 이며 ;
    O5는 H 또는 I 이고 ;
    O6은 Q 이며 ;
    O7은 L 이고 ;
    O10은 N 또는 D 이며 ;
    O11은 K 또는 L 이고 ;
    O12는 G, F 또는 W 이며 ;
    O15는 I 또는 S 이고 ;
    O16은 Q 또는 N 이며 ;
    O17은 D 또는 L 이고 ;
    O23은 F 또는 W
    임을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제 27 항에 있어서, PTH/PTHrP 조절 도메인은 표 2 에서 선택함을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제 1 항에 있어서, PTH/PTHrP 조절 도메인은 TIP39 의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제 1 항에 있어서, 표 4 에서 선택한 서열을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  39. SEQ ID NO : 17, 18, 19 및 69 중에서 선택한 펩티드를 포함하는 조성물.
  40. 제 1 항의 부형제 - 펩티드 분자를 코드하는 핵산.
  41. 제 7 항의 부형제 - 펩티드 분자를 코드하는 핵산.
  42. 제 20 항의 부형제 - 펩티드 분자를 코드하는 핵산.
  43. 제 32 항의 부형제 - 펩티드 분자를 코드하는 핵산.
  44. 제 39 항의 부형제 - 펩티드 분자를 코드하는 핵산.
  45. 제 40 항의 DNA 를 포함하는 발현 벡터.
  46. 제 41 항의 DNA 를 포함하는 발현 벡터.
  47. 제 42 항의 DNA 를 포함하는 발현 벡터.
  48. 제 43 항의 DNA 를 포함하는 발현 벡터.
  49. 제 44 항의 DNA 를 포함하는 발현 벡터.
  50. 제 45 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  51. 제 46 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  52. 제 47 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  53. 제 48 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  54. 제 49 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  55. 제 50 항에 있어서, 세포는 E.coli 세포임을 특징으로 하는 세포.
  56. 제 51 항에 있어서, 세포는 E.coli 세포임을 특징으로 하는 세포.
  57. 제 52 항에 있어서, 세포는 E.coli 세포임을 특징으로 하는 세포.
  58. 제 53 항에 있어서, 세포는 E.coli 세포임을 특징으로 하는 세포.
  59. 다음 단계를 포함하는 PTH/PTHrP 수용체의 길항물질을 제조하는 방법 :
    (a) 수용체에 결합하는 펩티드 중 적어도 하나를 선택하는 단계 ;및
    (b) 선택한 펩티드(들)의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 공유결합되는 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하는 약리학적 제제를 제조하는 단계.
  60. 제 59 항에 있어서, 펩티드는 SEQ ID NO : 3, 4 또는 5 중에서 선택함을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 59 항에 있어서, 펩티드는 파지 디스플레이 라이브러리, E. coli 디스플레이 라이브러리, 리보솜 라이브러리, RNA-펩티드 라이브러리 또는 화학 펩티드 라이브러리 스크리닝을 포함하는 방법에서 선택함을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 59 항에 있어서, 약리학적 제제는 다음 단계에 의해 제조함을 특징으로 하는 방법 :
    (a) 선택한 펩티드를 코드하는 핵산 서열 및 Fc 도메인을 코드하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 구성물을 제조하는 단계 ; 및
    (b) 유전자 구성물을 발현시키는 단계.
  63. 제 59 항에 있어서, 유전자 구성물을 E. coli 세포에서 발현시킴을특징으로 하는 방법.
  64. 제 59 항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법으로 펩티드를 선택함을 특징으로 하는 방법 :
    (a) 최초로 선택한 펩티드를 코드하는 핵산 서열 및 Fc 도메인을 코드하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 구성물을 제조하는 단계 ; 및
    (b) 유전자 구성물과 돌연변이유발 프라이머를 이용하여 폴리메라제 연쇄 반응(PCR)을 실시하는 단계, 여기에서 제 1 돌연변이유발 프라이머는 유전자 구성물의 코딩 가닥의 5' 말단 또는 인접부의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하며, 제 2 돌연변이유발 프라이머는 유전자 구성물의 비코딩 가닥의 3' 말단에 상보적인 핵산 서열을 포함한다.
  65. 제 1 항의 부형제 - 펩티드 분자를 포함하는 PTH 작동물질 및 골흡수 저해제를 투여함을 포함하는 골감소증 치료방법.
  66. 제 7 항의 부형제 - 펩티드 분자를 포함하는 PTH 작동물질 및 골흡수 저해제를 투여함을 포함하는 골감소증 치료방법.
  67. 제 20 항의 부형제 - 펩티드 분자를 포함하는 PTH 작동물질 및 골흡수 저해제를 투여함을 포함하는 골감소증 치료방법.
  68. 제 32 항의 부형제 - 펩티드 분자를 포함하는 PTH 작동물질 및 골흡수 저해제를 투여함을 포함하는 골감소증 치료방법.
  69. 제 39 항의 부형제 - 펩티드 분자를 포함하는 PTH 작동물질 및 골흡수 저해제를 투여함을 포함하는 골감소증 치료방법.
  70. 제 65 항에 있어서, 골흡수 저해제는 OPG, OPG-L 항체, 칼시토닌, 비스포스포네이트, 에스트로겐, 에스트로겐 수용체 조절인자 및 티볼론 중에서 선택함을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 66 항에 있어서, 골흡수 저해제는 OPG, OPG-L 항체, 칼시토닌, 비스포스포네이트, 에스트로겐, 에스트로겐 수용체 조절인자 및 티볼론 중에서 선택함을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 67 항에 있어서, 골흡수 저해제는 OPG, OPG-L 항체, 칼시토닌, 비스포스포네이트, 에스트로겐, 에스트로겐 수용체 조절인자 및 티볼론 중에서 선택함을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 68 항에 있어서, 골흡수 저해제는 OPG, OPG-L 항체, 칼시토닌, 비스포스포네이트, 에스트로겐, 에스트로겐 수용체 조절인자 및 티볼론 중에서 선택함을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 69 항에 있어서, 골흡수 저해제는 OPG, OPG-L 항체, 칼시토닌, 비스포스포네이트, 에스트로겐, 에스트로겐 수용체 조절인자 및 티볼론 중에서 선택함을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 1 항의 조성물을 투여함을 포함하는 골감소증 치료방법.
  76. 제 7 항의 조성물을 투여함을 포함하는 골감소증 치료방법.
  77. 제 20 항의 조성물을 투여함을 포함하는 골감소증 치료방법.
  78. 제 32 항의 조성물을 투여함을 포함하는 골감소증 치료방법.
  79. 제 39 항의 조성물을 투여함을 포함하는 골감소증 치료방법.
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