CZ20023496A3 - Modulátory receptorů pro hormon příštítných tělísek a protein příbuzný s hormonem příštítných tělísek - Google Patents

Modulátory receptorů pro hormon příštítných tělísek a protein příbuzný s hormonem příštítných tělísek Download PDF

Info

Publication number
CZ20023496A3
CZ20023496A3 CZ20023496A CZ20023496A CZ20023496A3 CZ 20023496 A3 CZ20023496 A3 CZ 20023496A3 CZ 20023496 A CZ20023496 A CZ 20023496A CZ 20023496 A CZ20023496 A CZ 20023496A CZ 20023496 A3 CZ20023496 A3 CZ 20023496A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
residue
nonfunctional
pth
amino acid
compound
Prior art date
Application number
CZ20023496A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Kostenuik
Chuan-Fa Liu
David Lee Lacey
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of CZ20023496A3 publication Critical patent/CZ20023496A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A61P5/22—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of calcitonin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/46—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of glucocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Description

Modulátory receptorů pro hormon příštítných tělísek a protein příbuzný s hormonem příštítných tělísek
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká terapeutických činidel, která modulují aktivitu PTH a PTHrP. Podle předkládaného vynálezu mezi modulátory PTH a PTHrP patří: (a) PTH/PTHrP modulující doména; a (b) vehikulum, jako je polymer (například PEG nebo dextran) nebo Fc doména, která je výhodná; kde vehikulum je kovalentně navázané na C-konec PTH/PTHrP modulující domény. Vehikulum a PTH/PTHrP modulující doména mohou být navázány prostřednictvím N- nebo C-konce PTH/PTHrP modulující domény, jak je popsáno dále. Výhodným vehikulem je Fc doména a výhodnou Fc doménou je IgG Fc doména, mezi výhodné PTH/PTHrP modulující domény patří aminokyselinové sekvence odvozené od PTH a PTHrP, které jsou popsané dále. Další PTH/PTHrP modulující domény mohou být generovány fágovým zobrazením, RNA-peptidovým skríningem a dalšími technikami uvedenými dále. Takové peptidy budou obvykle modulátory aktivity PTH a PTHrP, ačkoliv mohou být tyto techniky použity pro přípravu peptidových sekvencí, které slouží jako selektivní modulátory (například účinkují jako agonisté PTH aktivity, ale ne PTHrP aktivity).
i Dosavadní stav techniky
Hormon příštítných tělísek (PTH) a protein příbuzný s hormonem příštítných tělísek (PTHrP) mají významnou fyziologickou úlohu v homeostáze vápníku a při vývoji, v příslušném pořadí. Koncentrace vápníku v krvi je jemně regulována, z důvodu zásadní role vápníku v buněčném metabolismu. PTH je endokrinní hormon, který je vylučován příštítnými tělísky v odpovědi na pokles hladiny vápníku v ·· ···· ·· séru. PTH přímo aktivuje zvýšení kostní resorpce a stimuluje renální reabsorbci vápníku, která zvyšuje nebo udržuje cirkulující zásobu vápníku. PTH také nepřímo zvyšuje absorbci vápníku ve střevě stimulací renální hydroxylace vitaminu D.
Primární i sekundární hyperparathyreoidismus jsou spojeny se zvýšenou hladinou cirkulujícího hormonu příštítných tělísek. Prostřednictvím výše uvedených drah může vzestup hladiny PTH způsobit hyperkalcemii a osteopenii. Inhibitory kostní resorpce, jako bisfosfanáty a OPG, mohou efektivně chránit kost a tlumit příspěvek skeletálního systému k hyperkalcemii. Nicméně kalcemické efekty hyperparathyreoidismu na ledviny a střevo není možné řešit současně dostupnou terapií.
PTHrP je produkován mnoha typy buněk a hraje důležitou roli v regulaci vývoje skeletu. Postnatálně není role PTHrP tak jasně definována. Cirkulující hladina PTHrP není v podstatě detekovatelná u normálních zdravých dospělých. Každopádně, mnoho tumorů embryonálního původu produkuje a vylučuje PTHrP v množství dostatečném pro vznik hyperkalcémie. Humorální hyperkalcémie při malignitách (HHM) je nejběžnější paraneoplastický syndrom, který významně přispívá k morbiditě a mortalitě pacientů.
V současnosti je HHM léčena fysiologickým roztokem a dále inhibitory kostní resorpce, jako jsou bisfosfonáty. Tato léčba obvykle trvá 3-4 dny, aby bylo dosaženo dostatečného snížení kalcia v séru, ale tento efekt je relativně krátkodobý (méně než jeden měsíc). Pro pacienty s vysokou hladinou cirkulujícího PTHrP jsou efekty současné léčby ještě horší. Opakované podávání běžné terapie je obvykle ještě méně efektivní. Tato omezení současné terapie jasně ukazují potřebu
rychlé, efektivní a dlouhotrvající léčby HHM.
Hlavní příčinou omezených možností současné terapie HHM je neschopnost přímé inhibice PTHrP, který je velmi dobře znám jako hlavní patofysiologický faktor HHM. Inhibitory kostní resorpce jako bisfosfonáty pouze inhibují kostní resorpci, zatímco PTHrP má také zřetelné efekty na ledviny a střevo. Úplná neutralizace PTHrP by byla ideální adjuvantní terapií v léčbě HHM.
Oba hormony, PTH i PTHrP, interagují s PTH-1 receptorem, který je odpovědný za většinu jejich efektů. Mannstadt et al. (1999), Am. J. Physiol.277. 5Pt 2. F665-75 (1999). Pouze PTH interaguje s nově objeveným PTH-2 receptorem. Id. PTHrP může být zaměněn za agonistu PTH-2 receptoru a to záměnou dvou zbytků za zbytky na stejných pozicích PTH. Gardella etal. (1996), J. Biol. Chem. 271 (33): 19888-93.
N-koncová část PTH byla využita jako terapeutické činidlo. Intermitentní podávání přirozeného PTH-(1-84) vykazuje osteogenetické vlastnosti, které jsou realizovány C-terminálně zkráceným fragmentem PTH-(1-34). Oba peptidy se váží na a aktivují PTH-1 receptor s podobnými afinitami a způsobují aktivaci adenylát-cyklasy (AC), stejně jako fosfolipasy C (PLC). Aktivace AC prostřednictvím PTH-1 receptoru generuje cAMP, zatímco PLC aktivace prostřednictvím PTH-1 receptoru generuje PKC a intracelulární transport vápníku. PTH-(1-34) může maximálně aktivovat AC i PLC dráhu. Bylo zjištěno, že anabolické efekty PTH(1-34) vyžadují krátké intermitentní (denní) expozice PTH(1-34) Dobnig (1998), Endocrinol. 138: 4607-12. V klinických studiích na postmenopauzálních ženách bylo prokázáno, že denní podkožní injekce nízkých dávek PTH(134) vedou ke tvorbě kostní hmoty v obratlech a krčku femoru s • · · · · • · · · · « * · ···· ·· · · významným snížením incidence fraktur obratlů. Tato klinická data ukazují PTH jako jedno z nejúčinnějších činidel testovaných pro léčbu osteoporosy.
Zkrácené PTH fragmenty mají sníženou schopnost aktivace AC/cAMP a podobně sníženou anabolickou aktivitu. Rixon et al. (1994), J. Bone Min. Res. 9: 1179-89; Hilliker et al. (1996), 19:469-477; Lané et al. (1996), J. Bone Min. Res. 11:614-25. Takové zkrácené PTH fragmenty mají tuto sníženou aktivitu (Rixon et al. (1994); Hilliker et al (1996); Lané et al.
(1996)) i tehdy, pokud si zachovávají úplný agonismus k PKC. Rixon et al., (1994). Tyto objevy vedly k hypotéze, že AC/cAMP dráha je zásadní z hlediska anabolických účinků pro kosti, zatímco PLC/PKC dráha jez tohoto hlediska nevýznamná Rixon et al. (1994); Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 53:81-7.
Opačná, ale zcela vylučující, teorie naznačuje, že aktivace PLC (kromě AC) může být také významnou vlastností anabolických PTH fragmentů. Takasu (1998), Endocrinol. 139: 4293-9. Jasná absence aktivace PLC některými anabolickými Cterminálně zkrácenými PTH peptidy může být artefaktem necitlivých testovacích metod v kombinaci s nízkou vazbou na receptory. Takasu (1998). Progresivní zkracování C-konce PTH(1-34) vede k postupnému snižování vazebné afinity pro PTH1R. Takasu (1998). PKC aktivace prostřednictvím PTH-1 receptoru se zdá být akutně sensitivní na vazebnou afinitu a hustotu receptorů (Guo et al. (1995), Endocrinol 136: 3884-91), zatímco cAMP aktivace je mnohem méně citlivá na tyto faktory. hPTH-(l-31) má mírně sníženou (1-6-krát) afinitu pro PTH-1 receptor ve srovnání s hPTH-(l-34), zatímco hPTH-(l-30) má významně sníženou (10-100-krát) afinitu. Takasu (1998). Snad v důsledku této snížené afinity pro PTH-1 receptor je PTH-(1-30) • · · · slabý a inkompletní agonista pro aktivaci PKC prostřednictvím krysího PTH-1 receptoru.
Ve srovnání s PTH-(l-34) má PTH-(1-31) podobný nebo mírně snížený anabolický potenciál (Rixon et al. (1994); Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 53: 81-7; Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 65: 143-7), vazebnou afinitu pro PTH1R, a indukci cAMP (Takasu (1998)). PTH-(1-31) má také mírně nsíženou schopnost aktivace PLC. Takasu (1998). U zdravých lidí má infuse PTH-(1-31) a PTH-(l-34) podobné stimulační účinky na plasmatickou a močovou koncentraci cAMP, ale oproti PTH-(l-34) selhává PTH-(1-31) ve zvyšování sérové koncentrace vápníku, plasmatické koncentrace 1,25(OH)2D3, nebo močové koncentrace N-TX. Fraher et al.
(1999), J. Clin. Endocrin. Met. 84: 2739-43. Tato data naznačují, že PTH-(1-31) má sníženou kapacitu pro indukci resorpce kosti a pro stimulaci syntézy vitamínu D, což je příznivý profil pro anabolická činidla.
PTH-(l-30) se nejprve považoval za peptid bez anabolických vlastností Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue International 53: 81-7. Nedávno však bylo prokázáno, že PTH(1-30) je anabolický, když je podán ve velmi vysokých dávkách (400-2,000 pg/kg vs. 80 pg/kg pro PTH-(l-34)). Nižší účinnost PTH-(l-30) mohla být předpovězena z jeho nižší vazebné afinity pro PTH-1 receptor, nižší cAMP aktivace, a/nebo jeho značně snížené schopnosti aktivace PKC. Takasu (1998). Zbývá určit, zda má PTH-(1-3G) podobnou nebo lepší snížení aktivity v resorpci kosti.
PTH-(l-28) je nejmenší popsaný fragment, který aktivuje cAMP. Neugebauer et at. (1995), Biochem. 34:8835-42. Nicméně, nejprve se uvádělo, že hPTH(l-28) nemá osteogenní účinky u OVX ·« · · ·· · · · · · · • · · · ♦ · · ···· · · · · · • ··· · · · » • · · ·· ···· ·· ·· krys. Miller et al. (1997), J. Bone Min. Res. 12: S320 (Abstrakt). Nedávno bylo prokázáno, že velmi vysoká dávka PTH(1-28) (1000 μg/kg/den) je anabolická u QVX krys, zatímco dávka
200 gg/kg/den byla neúčinná. Whitfield et al., (2000),
J. Bone Min. Res. 15:964-70. Snížené nebo nepřítomné anabolické efékty některých zkrácených PTH fragmentů se přisuzovaly rychlejší eliminaci in vivo. Rixon et at. (1994).
Rekombinantní a modifikované proteiny jsou významnou skupinou terapeutických činidel. Mezi vhodné modifikace proteinových terapeutických činidel patří kombinování s Fc doménou protilátky a vazba na polymery, jako je polyethylenglykol (PEG) a dextran. Takové modifikace jsou podrobněji popsány v patentové přihlášce nazvané „Modifikovaný Peptides as Therapeutics Agents, U.S. Ser. č. 09/428,082, PCT přihl. č. WO 99/25044, která je zde uvedena jako odkaz ve své úplnosti.
Odlišným přístupem pro vývoj terapeutických činidel je skríning peptidové knihovny. Interakce proteinového ligandu s jeho receptorem často probíhá na relativně velkém rozhraní. Nicméně, jak bylo demonstrováno na lidském růstovém hormonu a jeho receptoru, pouze několik klíčových zbytků na rozhraní přispívá k většině vazebné energie. Clackson et al. (1995), Science 267:383-6. Zbytek proteinového ligandu pouze vystavuje vazebné epítopy ve správné topologii a nebo má funkce nesouvisející s vazbou. Tak se mohou molekuly pouze peptidové délky (2 až 40 aminokyselin) vázat na receptorový protein daného velkého proteinového ligandu. Takové peptidy mohou napodobovat bioaktivity velkého proteinového ligandu („peptidový agonisté) nebo, prostřednictvím kompetitivní vazby, mohou inhibovat bioaktivitu velkého proteinového ligandu (peptidový antagonisté).
• · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· · ·
Fágové zobrazovací peptidové knihovny se používají jako účinná metoda v identifikaci takových peptidových agonistů a antagonistů. Viz např. Scott et al. (1990), Science 249:386; Devlin et al. (1990), Science 249:404; U.S. Pat. č. 5,223,409, udělený 29.6.1993; U.S. Pat. č. 5,733,731, udělený 31.3.1998; US. Pat. č. 5,498,530, udělený 12.3.1996; U.S. Pat. č. 5,432,018, udělený 11.7.1995; U.S. Pat. č. 5,338,665, udělený 16.8.1994; U.S. Pat. č. 5,922,545, udělený 13.7.1999; WO 96/40987, publikovaná 19.12.1996; a WO 98/15833, publikovaná 16.4.1998 (každý z výše uvedených patentů je zde uveden jako odkaz). V takových knihovnách jsou náhodné peptidové sekvence zobrazovány fúzi s obalovými proteiny filamentosniho fágu. Typicky jsou zobrazené peptidy afinitně eluovány proti protilátkou imobilizované extracelulárni doméně receptoru. Zachycené fágy mohou být obohaceny opakovanými koly afinitniho přečištěni a repropagace. Peptid s nejlepši vazbou může být sekvenován za účelem identifikace klíčových zbytků jedné nebo více strukturálně podobných rodin peptidů. Viz, například, Cwirla et at. (1997), Science 276:1696-9, kde jsou identifikovány dvě různé rodiny. Peptidové sekvence mohou také naznačit, které zbytky mohou být bezpečně nahrazeny, při použití alaninového skenování nebo mutagenesí na úrovni DNA. Mohou být připraveny mutagenizované knihovny a ty mohou být testovány pro další optimalizaci sekvence peptidů s nejlepší vazbou Lowman (1997). Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24.
Strukturální analýza interakcí protein-protein může ýt také použita pro určení těch peptidů, které napodobují vazebnou aktivitu velkých proteinových ligandů. V takové analýze může krystalická struktura ukázat identitu a relativní orientaci kritických zbytků velkého proteinového ligandu, ze kterých může být navržen peptid. Viz, například, Takasaki et al.
(1997), Nátuře Biotech. 15: 126-70. Tyto analytické metody mohou být také použity pro zkoumání interakcí mezi receptorovým proteinem a peptidy selektovanými fágOvým zobrazením, z čehož mohou být navrženy další modifikace peptidů zvyšující jejich vazebnou afinitu.
Jiné metody soutěží s fágovým zobrazováním v peptidovém výzkumu. Peptidová knihovna může být fúzována na karboxylový konec lac represoru a exprimována v E. coli. Jiná metoda na bázi E. coli umožňuje zobrazení na vnější buněčné membráně prostřednictvím fúze s lipoproteinem asociovaným s peptidoglykanem (PAL). Dále jsou tyto metody označovány jako E. coli zobrazení. V jiné metodě je translace náhodné RNA ukončena před uvolněním ribosomu, což vede k zisku knihovny polypeptidů s navázanou jejich RNA. Dále jsou tyto a příbuzné metody souhrnně označovány jako ribosomové zobrazení. Jiné metody využívají peptidy navázané na RNA; například, PROfusion technologie, Phylos, lne. Viz, například, Roberts & Szostak (1997), Proč. Nati. Acad. Sd. USA 94:12297-303. Dále jsou tyto a příbuzné metody souhrnně označovány jako RNA-peptidový skríning. Mohou být získány chemicky připravené peptidové knihovny, ve kterých jsou peptidy imobilizovány na stabilních, nebiologických materiálech, jako jsou polyethylenové tyčinky nebo pryskyřice promývatelné rozpouštědlem. Jiné chemicky připravené peptidové knihovny využívají fotolitografie pro skenování peptidů imobilizovaných na sklíčkách. Dále jsou tyto a příbuzné metody souhrnně označovány jako chemický-peptidový skríning. Chemický-peptidový skríning může být výhodný v tom, že umožňuje použití D-aminokyselin a jiných nepřirozených analogů, stejně jako nepeptidových elementů. Jak biologické, tak chemické metody jsou shrnuty v Wells & Lowman (1992),
Curr. Opin. Biotechnol. 3:355-62. Je tedy možné objevit «· peptidová mimetika jakéhokoliv proteinu za použití fágového zobrazení, RNA-peptidového skríningu a jiných metod uvedených výše.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká terapeutických činidel, která modulují aktivitu PTH a PTHrP. Podle předkládaného vynálezu modulátory PTH a PTHrP obsahují:
a) PTH/PTHrP modulující doménu, výhodně aminokyselinovou sekvenci PTH/PTHrP modulující domény PTH a/nebo PTHrP, nebo sekvenci odvozenou od této sekvence pomocí fágového zobrazení, RNA-peptidového skríningu nebo jiné techniky uvedené výše; a
b) vehikulum, jako je polymer (například PEG nebo dextran) nebo Fc doména, která je výhodná;
kde vehikulum je kovalentně navázané na karboxylový konec PTH/PTHrP modulující domény. Výhodným vehikulem je Fc doména, a výhodnou Fc doménou je IgG Fc doména. Mezi výhodné PTH/PTHrP modulující domény patří aminokyselinové sekvence odvozené od PTH a PTHrP popsané dále. Jiné PTH/PTHrP modulující domény mohou být generovány fágovým zobrazením, RNA-peptidovým skríningem a jinými technikami uvedenými výše. Takové peptidy budou typicky antagonisty jak PTH, tak PTHrP, ačkoliv takové techniky mohou být použity pro přípravu peptidových sekvencí, které budou selektivními inhibitory (například inhibitory PTH, ale ne PTHrP).
Dalším aspektem předkládaného vynálezu je proces pro přípravu PTH a PTHrP modulátorů, který zahrnuje:
a) selekci alespoň jednoho peptidu, který se váže na PTH-1 nebo PTH-2 receptor; a
b) kovalentní navázání uvedeného peptidu na vehikulum.
• ·· *
9*9 · · · * · · ·· · · · · 9 9 9 9
Výhodným vehikulem je Fc doména. Stupeň (a) je výhodně provede selekcí z peptidových sekvencí v tabulkách 1 a 2 nebo z fágového zobrazení, RNA-peptidového skríningu, nebo jiných zde uvedených technik.
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny standardními syntetickými metodami, technikami rekombinantní DNA nebo jakýmikoliv jinými metodami přípravy peptidů a fúzních proteinů. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které obsahují nepeptidovou část, mohou být syntetizovány standardními reakcemi organické chemie, společně se standardními reakcemi peptidové chemie, pokud je lze provést.
Primární použití sloučenin podle předkládaného vynálezu j terapeutické nebo profylaktické použití. Peptid vázaný na vehikulum může mít aktivitu srovnatelnou nebo i vyšší než přirozený ligand napodobovaný peptidem.
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro terapeutické nebo profylaktické účely tak, že se připraví s vhodnými farmaceutickými nosiči a podají se v účinném množství pacientovi, jako je člověk (nebo jiný savec), který potřebuje takovou léčbu. Další související aspekty jsou také zahrnuty v předkládaném vynálezu.
Zejména významné v předkládaném vynálezu jsou molekuly obsahující PTH/PTHrP modulující domény mající zkrácenou PTH C terminální sekvenci, jako je PTH-(l-28) nebo (1-34). Dřívější pokusy neprokázaly anabolické účinky při dlouhodobém podávání C-terminálně zkrácených PTH fragmentů. Ačkoliv do dřívější pokusy nenaznačovaly, mohou být molekuly obsahující menší • r »*»·♦ ·* » «« ·* ?«*· e«r* » * · » a»· · · * r a *»··«· x · · < » ·· · * ♦ ? · · a »····*♦ ·· ··»· ·* ·· fragmenty, jako je PTH-(1-30)-Fc, anabolické sami o sobě. I přes slabý agonismus k PLC (viz Dosavadní stav techniky) je hPTH-(l-30) téměř stejně účinný ve stimulaci cAMP jako hPTH(1-34). Bez vazby na konkrétní teorii vynálezci předpokládají, že anabolické vlastnosti PTH fragmentů mohou selektivně souviset s jejich aktivací cAMP a ne s aktivací PKC, a proto mají PTH fragmenty s redukovanou afinitou pro receptor lepší anabolický profil. Je možné, že kontinuální expozice zkrácenému PTH fragmentu bude mít lepší vliv na kosti ve srovnání s kontinuálním podáváním PTH-(1-34) nebo PTH-(1-84), což bylo prokázáno u lidí (Fraher et al. (1999).
Z popisu vynálezu a obrázků budou jasné mnohé další aspekty a výhody předkládaného vynálezu.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 ukazuje příkladné Fc dimery, které mohou být získány z IgGl protilátky. Fc na obr. představuje jakoukoliv z Fc variant spadajících do významuFc doména. X1 a X2 představují peptidy nebo kombinace spojovací sekvence-peptid, jak jsou definovány dále. Specifické dimery jsou následující:
A: Dimery vázané jednou disulfidovou-vazbou. IgGl protilátky typicky mají dvě disulfidové vazby v pantovém regionu mezi konstantní a variabilní doménou. Fc doména na Obr. 1A může být připravena zkrácením mezi dvěma místy pro disulfidové vazby nebo substitucí cysteinylového zbytku nereaktivním zbytkem (například, alanylem). Na obr. 1A je Fc doména navázána na Ckonec peptidu.
B: Dimery vázané dvojitou disulfidovou-vazbou. Tato Fc doména může být připravena zkrácením původní protilátky tak, aby si
99 9
9 zachovala oba cysteinylové zbytky v řetězci Fc domény nebo expresí z konstruktu obsahující sekvenci kódující takovu Fc doménu. Na obr. 1B je Fc doména navázána na C- konec peptidu.
C: Nekovalentní dimery. Tato Fe doména může být připravena eliminací cysteinylových zbytků bud’ zkrácením, nebo substitucí. Může být žádoucí eliminovat cysteinylové zbytky tak, aby se eliminovaly nečistoty tvořené reakcí cysteinylového zbytku s cysteinylovými zbytky jiných proteinů přítomných v hostitelské buňce. Nekovalentní navázání Fc domény je dostatečné pro udržení dimeru pohromadě.
Jiné dimery mohou být připraveny za použití Fc domény získané z jiných typů protilátky (například IgG2, IgM).
Obr. 2 ukazuje strukturu další sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Obr. 2A ukazuje jednořetězcovou molekulu a může též reprezentovat DNA konstrukt pro molekulu. Obr. 2B ukazuje dimer, ve kterém je část spojovací sekvence-peptid přítomna na pouze jednom řetězci dimeru. Obr, 2C ukazuje dimer mající peptidovou část na obou řetězcích. Dimer z Obr. 2C se tvoří spontánně v některých hostitelských buňkách po expresi DNA konstruktu kódujícího jeden řetězec, jak je uvedeno na Obr. 3. V jiných hostitelských buňkách mohou být buňky umístěny do podmínek, které indukují tvorbu dimerů, nebo mohou být dimery tvořeny in vitro.
Obr. 3 ukazuje příkladné sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NOS: 1 a 2, v příslušném pořadí) lidského IgGl Fc, které mohou být užity v předkládaném vynálezu.
Obr. 4 ukazuje kalcemickou odpověď normálních myší na PTH-(113
34) a na PTH-(1-34)-Fc. Myším se aplikuje vehikulum (PBS, -X-, nebo PTH-(1-34) (prázdné symboly) nebo PTH-(1-34)-Fc (plné symboly). Dávky jsou 156 nmol/kg (kolečka), 469 nmol/kg (trojúhelníčky) nebo 1560 nmol/kg (čtverečky). Data představují skupinové průměry, n =6 myší/skupina.
Obr. 5 ukazuje, že [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc inhibuje kalcemickou odpověď normálních myší na PTHrP. Normálním myším samcům se injekčně aplikuje SC vehikulum (PBS, kolečka) nebo lidský PTHrP-(l-34) v dávce 0,5 mg/kg (čtverečky). Myším se aplikací PTHrP se potom ihned aplikuje SC [AsnlO,Leull]PTHrP(7-34)-Fc v dávce 10 mg/kg (trojúhelníčky) nebo 30 mg/kg (kosočtverečky). Data představují skupinové průměry, s n = 6 myši/skupinu.
Obr. 6 ukazuje vliv [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc na chronickou hyperkalcemii indukovanou PTH-(1-34)-Fc. Normálním myším samcům se podá jedna SC injekce PTH-(1-34)-Fc (30 mg/kg) (prázdná kolečka) nebo vehikulum (PBS, prázdné čtverečky). Některé myši s aplikací PTH-(1-34)-Fc mají jednu aplikaci [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc v dávce 10 (plné trojúhelníčky), 30 (plná kolečka) nebo 100 mg/kg (plné čtverečky). Všechny dávky [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc způsobily významné potlačení PTH-(1-34)-Fc-indukované hyperkalcemie. Data představují průměry ± SEM, n =5 myší/skupinu.
Obr. 7 ukazuje akumulaci cAMP v ROS 17/2,8 krysích osteoblastům podobných buňkách. Kultury se ošetřily inhibitorem fosfodiesterasy IBMX a potom se aplikovaly na 15 minut různé PTH fragmenty. cAMP se stanovil ELISA.
Obr. 8 ukazuje efekty jediné aplikace na klinický biochemický profil. Periferní krev se odebírala denně po dobu 3 dnů po jedné podkožní injekci uvedené sloučeniny. Obr. 8A ukazuje celkový vápník v séru; Obr. 8B, alkalickou fosfatasu (AP), markér osteoblastické aktivity; Obr. 8C, tartrat-resistentní kyselou fosfatasu (TRAP), markér osteoklastické aktivity, a Obr. 8D, poměr AP:TRAP, index relativní osteoblastické: osteoklastické aktivity.
Obr. 9 ukazuje efekty PTH konstruktů na kostní densitu.
Periferní kvantitativní počítačová tomografie (pQCT) se provedla na proximální metafýze tibie myši v den 15, po injekcích PTH konstruktů ve dny 0, 5 a 10.
Obr. 10 ukazuje efekt podání PTH-(1-34)-Fc dvakrát týdně versus PTH-(1-34) denně na tibialní, trabekulární a kortikální kostní densitu (BMD). Denní PTH [PTH-(l-34)] byl použit v dávce 80 pg/kg/den (20 nmol/kg/den).
Obr. 11 ukazuje efekty léčby dvakrát týdně na BMD a sérovou koncentraci vápníku u ovarektizomováných (OVX) krys. 11 měsíců po OVX se krysám podávalo dvakrát týdně fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS, vehikulum) nebo APD (0,5 mg/kg) nebo PTH-(1-34)-Fc (50 nmol/kg). DEXA se prováděla jednou týdně. Krev se odebírala 24 hodin po druhé injekci v týdnu, kdy jsou kalcemické efekty PTH-Fc obvykle maximální.
Obr. 12 ukazuje efekt jedné podkožní injekce PTH-(1-34)-Fc na OVX makaky rhesus. Opicím se injekčně podal PTH-(1-34)-Fc v dávkách 1-30 pg/kg (n=l/skupinu) nebo 100-1000 pg/kg (n=2/skupinu). Sérum se analyzovalo na celkovou koncentraci vápníku. Tečkovaná čára ukazuje práh pro hyperkalcemii, na základě elevace vápníku vyšší než tři standardní odchylky nad průměr při dvou nebo více postupných měřeních.
• ·
Podrobný popis vynálezu
Definice termínů
Termíny použití v této přihlášce mají následující významy, pokud není uvedeno jinak.
Termín obsahující znamená, že sloučenina může obsahovat další aminokyseliny na N- nebo C- konci dané sekvence. Samozřejmě, že tyto další aminokyseliny by neměly významně interferovat s aktivitou sloučeniny.
Termín acidický zbytek označuje aminokyselinové zbytky v D- nebo L-formě mající vedlejší řetězce obsahující acidické skupiny. Příkladné acidické zbytky jsou D a E.
Termín aromatický zbytek označuje aminokyselinové zbytky v D- nebo L-formě mající vedlejší řetězce obsahující aromatické skupiny. Příkladné aromatické zbytky jsou F, Y a W.
Termín basický zbytek označuje aminokyselinové zbytky v D- nebo L-formě mající vedlejší řetězce obsahující basické skupiny. Příkladné basické zbytky jsou Η, K a R.
Termíny hydrofilní zbytek a Haa označuje aminokyselinové zbytky v D- nebo L-formě mající vedlejší řetězce obsahující alespoň jednu hydrofilní funkční skupinu nebo polární skupinu. Příkladné hydrofilní zbytky jsou C, D,
E, 1-1, K, N, Q, R, S a T.
Termíny lipofilní zbytek a Laa označují aminokyselinové zbytky v D- nebo L-formě mající vedlejší řetězce obsahující nenabité, alifatické nebo aromatické skupiny. Příkladné.
lipofilní vedlejší řetězce jsou F, I, L, Μ, V, W a Y. Alanin (A) je amfifilní - může účinkovat jako hydrofilní nebo lipofilní zbytek. Alanin je proto zahrnut v definici jak lipofilní zbytek, tak 'hydrofilní zbytek.
Termín nefunkční zbytek označuje aminokyselinové zbytky v D- nebo L-formě mající vedlejší řetězce, které nemají acidické, basické nebo aromatické skupiny. Příkladné nefunkční aminokyselinové zbytky jsou M, G, A, V, I, L a norleucin (Nle).
Termín vehikulum označuje molekulu, která brání degradaci a/nebo zvyšuje poločas, redukuje toxicitu, redukuje imunogenicitu nebo zvyšuje biologickou aktivitu terapeutického proteinu. Příkladné vehikula jsou Fc doména (která je výhodná), stejně jako spojovací polymer (například, polyethylenglykol (PEG), polylysin, dextran, atd); polymer s rozvětveným řetězcem (viz, například, US. Patent č. 4,289,872, Denkenwalter et al., udělený 15.9.1981; 5,229,490, Tam, udělený 20.7.1993; WO 93/21259, Frechet et al., publikovaná 28.10.1993); lipid; cholesterolová skupina (jako je steroid); karbohydrát nebo oligosacharid (například, dextran); lidský sérový albumin (HSA) a příbuzné molekuly; transtheratin (ITR) a příbuzné molekuly; nebo jakýkoliv přirozený nebo syntetický protein, polypeptid nebo peptid, který se váže na receptor. Vehikula jsou popsaná dále.
Termín nativní Fc označuje molekulu nebo sekvencí obsahující sekvenci fragmentu nevázajícího se na antigen vzniklého trávením celé protilátky, ať monomerní, nebo multimerní formy. Původním imunoglobulinovým zdrojem nativního Fc je výhodně lidský zdroj a může se jednat o jakýkoliv imunoglobulin, ačkoliv výhodné jsou IgGl a IgG2. Nativní Fc • · ·
9< · * ·· * · t » * · * * * jsou připraveny z monomerních polypeptidů, které mohou být vázány do dimerních nebo multimerních forem kovalentní (t.j. disulfidovou vazbou) a nekovalentní asociací. Počet intermolekulových disulfidových vazeb mezi monomerními podjednotkami nativních Fc molekul je v rozmezí od 1 do 4, v závislosti na třídě (například, IgG, IgA, IgE) nebo podtřídě (například, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Jedním příkladem nativního Fc je disulfidově vázaný dimer vzniklý papainovým trávením IgG (viz Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10:4071-9). Termín nativní Fc, jak je zde použit, zahrnuje monomerní, dimerní a multimerní formy.
Termín Fc varianta označuje molekulu nebo sekvenci, která je modifikovaná z nativního Fc, ale stále ještě obsahuje vazebné místo pro receptor, FcRn. Mezinárodní přihlášky WO 97/34631 (publikovaná 25.9.1997) a WO 96/32478 popisují příklady Fc variant, stejně jako jejich interakce s receptorem, a jsou zde uvedeny jako odkazy.
Termín Fc varianta zahrnuje molekuly nebo sekvence, které jsou humanizované z non-lidského nativního Fc. Dále, nativní Fe obsahuje místa, která mohou být odstraněna, protože způsobují strukturální vlastnosti nebo biologickou aktivitu, které nejsou žádoucí pro fúzní molekuly podle předkládaného vynálezu. Tak termín Fc variant zahrnuje molekulu nebo sekvenci, která nemá jedno nebo více míst nebo zbytků nativního Fc, které ovlivňují nebo se podílejí na (1) tvorbě disulfidově vazby, (2) inkompatibilitě s danou hostitelskou buňkou; (3) N-terminální heterogenitě po expresí ve vybrané hostitelské buňce; (4) glykosylaci, (5) interakci s komplementem; (6) vazbě na Fc receptor jiný než je požadovaný receptor, nebo (7) cytotoxicitě závislé na protilátkách (ADCC). Fc varianty jsou popsány podrobněji dále.
9 · Λ * »
Termín Fc doména označuje nativní Fc a Fc varianty a sekvence, jak byly definovány výše. Stejně jako Fc varianty a nativní Fc, termín Fc doména zahrnuje molekuly v monomerní nebo multimerní formě, ať trávené z kompletní protilátky nebo produkované jinými způsoby.
Termín multimer, jak je použit pro Fc domény nebo molekuly obsahující Fc domény, označuje molekuly obsahující dva nebo více polypeptidových řetězců asociovaných kovalentně, nekovalentně nebo jak kovalentně, tak nekovalentně. IgG molekuly typicky tvoří dimery; IgM, pentamery; IgD, dimery; a IgA, monomery, dimery, trimery nebo tetramery. Multimery mohou být připraveny testováním sekvence a výsledné aktivity nativního Ig zdroje Fc nebo derivatizací (jak je definována dále) takového nativního Fc.
Termín dimer, jak je použit pro Fc domény nebo molekuly obsahující Fc domény, označuje molekuly obsahující dva polypeptidové řetězce asociované kovalentně nebo nekovalentně. Příklady dimerů podle předkládaného vynálezu jsou uvedeny na obr. 1 a 2.
Termíny derivatizace a deriváty nebo derivatizovaný označují procesy a získané sloučeniny, v příslušném pořadí, kde (1) sloučenina má cyklickou část; například, zesítění mezi cysteinylovými zbytky ve sloučenině; (2) sloučenina je zesítěná nebo má zesíťovací místa; například, sloučenina má cysteinylový zbytek a tak tvoří v kultuře nebo in vivo zesítěné dimery: (3) jedna nebo více peptidylových vazeb je nahrazena nepeptidylovou vazbou; (4) N-konec je nahrazen -NRR1, NRCCOJR1, -NRCÍOÍOR1, -NRS(O)2RX, -NHC(O)NHR, sukcimidovou skupinou nebo substituovaným nebo nesubstituovaným • · · · benzyloxykarbonyl-ΝΗ-, kde R a R1 a substituenty kruhu jsou definovány dále; (5) C-konec je nahrazen -C (0) R2 nebo -NR3R4, kde R2, R3 a R4 jsou definovány dále; a (6) sloučeniny, kde jsou jednotlivé aminokyselinové skupiny modifikovány reakci s činidly reagujícími s vybranými vedlejšími řetězci nebo terminálními zbytky. Deriváty jsou popsány dále.
Termín peptid označuje molekuly délky 1 až 85 aminokyselin, kde výhodné jsou molekuly délky 5 až 34 aminokyselin. Příkladnými peptidy jsou ty, které obsahují PTH/PTHrP modulující doménu přirozené molekuly nebo obsahují randomizované sekvence.
Termín randomizovaný, jak je zde použit pro peptidovou sekvenci, označuje zcela náhodné sekvence (například selektované metodou fágového zobrazení nebo RNA-peptidového skríningu) a sekvence, ve kterých je jeden nebo více zbytků přirozené molekuly nahrazen aminokyselinovým zbytkem nevyskytujícím se v této pozici v přirozené molekule.
Příkladné metody pro identifikaci peptidové sekvence zahrnují fágové zobrazení, E. coli zobrazení, ribosomové zobrazení, RNA-peptidový skríning, chemický skríning a podobně.
Termín „PTH/PTHrP modulující doména označuje jakoukoliv aminokyselinovou sekvenci, která se váže na PTH-1 receptor a/nebo PTH-2 receptor a zahrnuje přirozené sekvence a randomizované sekvence. Příkladné PTH/PTHrP modulující domény mohou být identifikovány nebo derivovány způsobem uvedeným v odkazech k tabulkách 1 a 2.
Termín PTH agonista označuje molekulu, která se váže na PTH-1 nebo PTH-2 receptor a zvyšuje nebo snižuje v testech jednu nebo více PTH aktivit kompletního lidského hormonu • · · · příštítných tělísek. Příklady testů na aktivitu PTH jsou uvedeny v příkladu 1.
Termín „PTH antagonista označuje molekulu, která se váže na PTH-1 nebo PTH-2 receptor a blokuje nebo brání normálním efektům kompletního lidského hormonu příštítných tělísek. Příklady testů na aktivitu PTH jsou uvedeny v příkladu 2.
Termín „inhibitor resorpce kosti označuje takové molekuly, které jsou určeny testy uvedenými v příkladech 4 a 11 WO 97/23614 (která je zde uvedena jako odkaz). Příklady inhibitorů kostní resorpce jsou OPG a OPG-L protilátky, které jsou popsány ve WO 97/23614 a W098/46751, v příslušném pořadí, které jsou zde uvedeny jako odkazy.
Dále fyziologicky přijatelné soli sloučenin podle předkládaného vynálezu také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Termín fyziologicky přijatelné soli označuje soli, které jsou známé nebo budou objeveny a které jsou farmaceuticky přijatelné. Některými specifickými příklady jsou: acetát; trifluoracetát; hydrohalogenidy, jako je hydrochlorid a hydrobromid; sulfát; citrát; tartrát; glykolát; a oxalát.
Struktura sloučenin
Obecně. Aminokyselinové sekvence vazebného místa receptoru pro PTH a PTHrP jsou popsány v tabulkách 1 a 2. Další informace o PTH a PTHrP jsou uvedeny v Mamistadt et al.
(1999), Am. J. Physiol. 277. 5Pt2: F665-75; a Gardella (1996), J. Biol. Chem. 271 (33): 19888-93. Každá z těchto publikací je zde uvedena jako odkaz. Z uvedených sekvencí předkladatelé vynálezu identifikovaly výhodné sekvence odvozené od PTH a • · ·· · · · · ···· • « · · β · · • *·· V · 9 · ··· ·· ···· ·· · ·
PTHrP. Tyto sekvence mohou být randomizovány za použití technik uvedených výše, pomocí kterých může být jedna nebo více aminokyselin zaměněna za zachování nebo zlepšení vazebné afinity peptidu.
V prostředcích podle předkládaného vynálezu může být peptid navázán na vehikulum prostřednictvím C-konce peptidu. Tak mohou být molekuly vehikulum-peptid podle předkládaného vynálezu popsány následujícím vzorcem I:
P1-(L1)a-F1 a jeho multimery, kde:
F1 je vehikulum (výhodně Fc doména) a je navázané na C-konec P^ÍLÚa;
P1 je sekvence PTH/PTHrP modulující domény;
L1 je spojovací sekvence; a a j e 0 nebo 1.
Peptidy. Jakýkoliv z mnoha peptidů může být použit v předkládaném vynálezu. Peptidy mohou obsahovat část sekvence přirozeného proteinu, mohou mít randomizovanou sekvenci odvozenou od sekvence přirozených proteinů, nebo mohou mít zcela randomizovanou sekvenci. Fágové zobrazení a RNApeptidový skríning jsou vhodné pro přípravu peptidů podle předkládaného vynálezu.
Zejména vhodná sekvence PTH/PTHrP modulující domény je sekvence vzorce II xnx8hx10x11x12kx14x15x16x17x18x19rx21x22x23x24x25x26x27x28xc (SEQ ID NO: 3) • · · · · ······ ·· · · · · kde
XN není přítomný nebo je X3X4X5X6X7, X2X3X4X5X6X7, nebo YX1X2X3X4X5X6X7;
X1X2X3X4X5X6X7,
XI je aminokyselinový zbytek {nefunkční, hydrofilní nebo aromatický zbytek je výhodný; A, S nebo Y jsou výhodné);
X2 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, V je nejvýhodnější);
X3 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní zbytek je výhodný, S je nejvýhodnější);
X4 je aminokyselinový zbytek (acidický zbytek je výhodný, E je nejvýhodnější);
X5 je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo basický zbytek je výhodný, H nebo I jsou nejvýhodnější);
X5 je aminokyselinový zbytek (acidický nebo hydrofilní zbytek je výhodný, Q nebo E jsou nejvýhodnější);
X7 je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo aromatický zbytek je výhodný, L nebo F jsou nejvýhodnější);
X8 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, M nebo Me jsou nejvýhodnější);
X10 je aminokyselinový zbytek (acidický nebo hydrofilní zbytek je výhodný, N nebo D jsou nejvýhodnější);
XII je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo basický zbytek je výhodný, L, R nebo K jsou nejvýhodnější);
X je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo aromatický zbytek je výhodný, G, F nebo W jsou nejvýhodnější);
X14 je aminokyselinový zbytek (basický nebo hydrofilní zbytek je výhodný, H nebo S jsou nejvýhodnější);
X15 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný,
L nebo I jsou nejvýhodnější);
X16 je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo hydrofilní zbytek je výhodný, Q, N, S nebo A jsou nejvýhodnější);
X17 je aminokyselinový zbytek (acidický, hydrofilní nebo • · ·· · · ·· ···· nefunkční zbytek je výhodný; S, D nebo L jsou nejvýhodnější); X18 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný,
M, L, V nebo Nle jsou nejvýhodější);
X19 je aminokyselinový zbytek (acidický nebo basický zbytek je výhodný, E nebo R jsou nejvýhodnější);
X21 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek nebo basický zbytek je výhodný; V, M, R nebo Me jsou nejvýhodnější);
X22 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní, acidický nebo aromatický zbytek je výhodný, E nebo F jsou nejvýhodnější);
X23 je aromatický nebo lipofilní zbytek (W nebo F jsou výhodné);
X24 je lipofilní zbytek (L je výhodný);
X25 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní nebo basický zbytek je výhodný, R nebo H jsou nejvýhodnější);
X26 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní nebo basický zbytek je výhodný, K nebo H jsou nejvýhodnější);
X27 je aminokyselinový zbytek (lipofilní, basický nebo nefunkční zbytek je výhodný, K nebo L jsou nejvýhodnější);
X28 je aminokyselinový zbytek (lipofilní nebo nefunkční zbytek je výhodný, L nebo I jsou nejvýhodnější);
Xc není přítomný nebo je X29, X29X30, X29X30X31, X29X30X31X32, X29X30X31X32X33, X29X30X31X32X33X34, X29X30X31X32X33X34X35 nebo
X29X30X31X32X33X34X35X36 ·
X je aminokyselinový zbytek (hydrofilní nebo nefunkční zbytek je výhodný, Q nebo A jsou nejvýhodnější);
X30 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní nebo acidický zbytek je výhodný, D nebo E jsou nejvýhodnější);
X31 je aminokyselinový zbytek (lipofilní nebo nefunkční zbytek je výhodný, V nebo I jsou nejvýhodnější);
X je aminokyselinový zbytek (basický zbytek je výhodný, H je nejvýhodnější);
X je aminokyselinový zbytek (hydrofilní zbytek je výhodný, N nebo T jsou nejvýhodnější);
• · · · • · · » · · · · ·
X34 je aminokyselinový zbytek {nefunkční nebo aromatický zbytek je výhodný, A, F nebo Y jsou nejvýhodnější);
X35 je aminokyselinový zbytek (acidický zbytek je výhodný, E je nejvýhodnější); a
X36 je aminokyselinový zbytek (aromatický zbytek je výhodný, Y je nejvýhodnější).
Výhodná sekvence PTH/PTHrP modulující domény je sekvence vzorce III
JnJ7J8HNLJ12KHLJ16SJ18J19RJ21EWLRKKLJc (SEQ ID NO: 4) kde:
JN není přítomný nebo je vybrán ze skupiny zahrnující J1!2!3!4!5!6, J2J3J4J5J6, J3J4J5J6;
J1 je aminokyselinový zbytek (nefunkční, hydrofilní nebo aromatický zbytek je výhodný; A, S nebo Y jsou nejvýhodnější);
J2 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, V je nejvýhodnější);
J3 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní zbytek je výhodný,
S je nejvýhodnější);
J4 je aminokyselinový zbytek (acidický zbytek je výhodný, E je nejvýhodnější);
J5 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, I je nejvýhodnějšr);
J6 je aminokyselinový zbytek (basický zbytek je výhodný, Q je nejvýhodnější);
J7 je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo aromatický zbytek je výhodný, L nebo F jsou nejvýhodnějšr);
J8 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, M nebo Nle jsou nejvýhodnější);
J je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo aromatický ·· · · · · · · · «····· ·· · · ·· ·· · · zbytek je výhodný, G nebo W jsou nejvýhodnější);
J16 je aminokyselinový zbytek {nefunkční nebo hydrofilní zbytek je výhodný, N, S nebo A jsou nejvýhodnější);
J18 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný,
M, Nle, L nebo V jsou nejvýhodnější);
J19 je acidický nebo basický zbytek (E nebo R jsou výhodné) ; J21 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný,
V, M nebo Me jsou nejvýhodnější);
Jc není přítomný nebo je J29, J29J30, J29J3OJ31, J29J3OJ31J32,
J29J3OJ31J32J33, J29J30J31J32J33J34;
J je aminokyselinový zbytek (hydrofobní nebo nefunkční zbytek je výhodný, Q nebo A jsou nejvýhodnější);
J30 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní nebo acidický zbytek je výhodný, D nebo B jsou nejvýhodnější);
J31 je aminokyselinový zbytek (lipofilní nebo nefunkční zbytek je výhodný, V nebo I jsou nejvýhodnější);
J32 je aminokyselinový zbytek (basický zbytek je výhodný, H je nejvýhodnější);
J33 je aminokyselinový zbytek (acidický zbytek je výhodný, N je nejvýhodnější);
J34 je aminokyselinový zbytek (aromatický zbytek je výhodný,
F nebo Y jsou nejvýhodnější).
Z vzorce SEQ ID NO: 4 jsou peptidy uvedené v tabulce 1 nejvýhodněj š i.
Jiná výhodná sekvence PTH/PTHrP modulující domény je sekvence vzorce IV
ONLHO10O11O12KS IO15OX 6LRRRFO23LHHLI 0c (SEQ ID NO: 5) • · · · · · o” není přítomný nebo je Y01020304050607, 01020304050607, 020304oW, 0304050607, 04050607, O5O6O7, O6O7 nebo 07;
O1 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, A je nejvýhodnější};
O2 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, V je nejvýhodnější);
O3 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní zbytek je výhodný,
S je nejvýhodnější);
O4 je aminokyselinový zbytek (acidický zbytek je výhodný, E je nejvýhodnější);
O5 je aminokyselinový zbytek (basický nebo nefunkční zbytek je výhodný, H nebo I jsou nejvýhodnější);
O6 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní zbytek je výhodný,
Q je nejvýhodnější);
O7 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, L je nejvýhodnější);
O10 je aminokyselinový zbytek (acidický nebo hydrofilní zbytek je výhodný, N nebo D jsou nejvýhodnější);
O11 je aminokyselinový zbytek (basický nebo nefunkční zbytek je výhodný, K nebo L jsou nejvýhodnější);
O je aminokyselinový zbytek (aromatický nebo nefunkční zbytek je výhodný, G, F nebo W jsou nejvýhodnější);
O15 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní nebo nefunkční zbytek je výhodný, I nebo S jsou nejvýhodnější);
O16 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní zbytek je výhodný, Q nebo N jsou nejvýhodnější);
O17 je aminokyselinový zbytek (acidický nebo nefunkční zbytek je výhodný, D nebo L jsou nejvýhodnější);
O23 je aminokyselinový zbytek (aromatický zbytek je výhodný, F nebo W jsou nejvýhodnější);
0c není přítomný nebo je O29, O29O30, O29O30O31, O29O30O31O32, O29O30O31O32O33, O29O30O31O32O33O34, O29O30O31O32O33O34O35 nebo O29O30O31O32O33O34O35O36, a •· ·· ·· ·· ····
O29 až O36 jsou každý nezávisle aminokyselinový zbytek.
Z vzorce SEQ ID NO: 5 jsou peptidy uvedené v tabulce 2 nej výhodně j š i.
Příkladné peptidové sekvence podle předkládaného vynálezu jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. Tyto peptidy mohou být připarveny způsobem popsaným v citovaných odkazech nebo v U.S. Pat. č. 4,423,037, 4,968,669, 5,001,22 a 6,051,686, kde každá z výše uvedených citací je zde uvedena jako odkaz. Molekuly podle předkládaného vynálezu obsahující tyto peptidové sekvence mohou být připraveny způsoby známými v oboru. Jsou použity jednopísmenné zkratky pro aminokyseliny. Jakýkoliv z těchto peptidů může být vázán v tandemu (t.j. sekvenčně) s nebo bez spojovacích sekvencí. Jakýkoliv peptid obsahující cysteinylový zbytek může být zesítěný s jiným peptidem obsahující Cys, kde jeden nebo oba takové peptidy mohou být vázány na vehikulum. Jakýkoliv peptid obsahující více než jeden Cys zbytek může tvořit intrapeptidovou disulfidovou vazbu. Jakýkoliv z těchto peptidů může být derivatizován způsoby uvedenými dále.
Tabulka 1: PTH/PTHrP modulující domény na bázi PTH
1 popi s sekvence SEQ 10 NO:
íiidský^1-84*1 SVSBIQIJMHNIXJKHUíSMERVEWLRKKLQDVHNFV ALGAPLAPRDAGSQRPKKKEDNVLVESHEKSLGEA DKACVNVLTKAXSQ 10
* Hendy etal. (1981), Proč. Nafl. Acad. Sci USA 7& 7365; Kimura etal· (1983), Biochem. Biophys. Res. Commim. 114:493; Zanelli etal. (1985), Endocrinology 117:1962; Wingender etal (1985). T. BioL Chem. 264:4367.
• · • · • · · ·
krysí PTH (1-84)2 AVSEIQLMHNLGKHLASVERMQWLRKKLQDVHNFV slgvqmaaregsyqrptkkednvlvdgnskslgeg DKADVDVLVKAKSQ 11
lidský PTH3(7-84) UyIHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFV7\LGAPL APRDAGSQRPRKKEDNVLVESHEKSLGEADKADVN VLTKAKSQ 12
lidský PTH(l-44)3 S VSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFV ALGAPLAPR 13
lidský PTH(l-38)3 svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdVhnfv ALG 14
lidský PTH (2-38)3 vseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfva lg 15
lidský PTH(1-34)4 svseiqlmhnlgkhi jismervewlrkklqdvhnf 16
fArqllllidský PTH(l-34) svseiqlmhnrgkhlnsmervewlrkklqdvhnf 17
ILysllI lidský PTfl(l -34) SVSEIQLMHNKGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF 18
[Arql91 lidský PTH(l-34) SVSEIQLMHNLGKHLNSMRRVEWLRKKLQDVHNF 19
[Tyrl] lidský PTH (l-34r YVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNP 20
(Leu(8, 18), Tvr341 lidský PTH(134r SVSEIQLLHNIXSKHLNSLERVEWLRKKLQDVHNY 21
toňá. HH(1-34)S AVSEIQFMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQDVHNP 22
(Leii{8. 18), Tvr341 haěá.HH{l34Γ AVSEIQFLHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNY 23
prťťňí PIH CL-34}3 7 SVSEIQLMHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNF 24
krysí PTH (1-34)3 AVSEIQLMHNLGKHLASVERMQWLRKKLQDVHNF 25
(Leu (8, 21 ), Tvr34J rat PTH (1-34)3 AVSEIQIJJHNLGKHIASVERLQWLRKKLQDVHNY 26
lidský PTHfl -31)’ SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDV 27
[Leu27] lidský PTH(1-31)8 SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKLLQDV 28
ÍLeu(8, 18) Tvr341 PTHÍ3-34)9 SEIQLLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQDVHNY 29
Irxěá. HH(3-34)i0 11 SEIQFMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQDVHNP 30
[Leu(8, 18), Tyr34] taězíPTH(3- ϋΐ SEIQFLHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNY 31
2 Heinrich (1984), T. Biol. Chem. 259; 3320.
3 Bachem Caíalogue (1999).
4 Doppdt etaL (1981) Cakňf-Tissuelnt 33:649; Podbesek et al (1983) Endocrinology 112: 1000; Kent etaL (1985), ďn/ScL 68:171; McKee and Caulfield (1989), PeptideRes. 2:161; Lee and Russefl (1989) Biopolymers 28:1115; Reeve etaL (1990) Br. Med. T. 301:314; Neugébauer etaL (1994) Int J, Peptide Protein Res. 43:555.
7Nakanagaetal (1981) Proč. Soc. Exp. BioLMeď 168:168; Lawet al (1983) T.Clin. EndociinoL Metab. 56:1335; Wang etaL (1984) Eur. T. PhannacoL 97209; Sham et al (1986) Gen. Camp. EndocrinoL 61:148; Smitb et al (1987) Arch. Biochem. Biophvs. 253;
81.
6Podle Coftreraetal. (1981) T. BioL Chem. 256:10555;Bergeron et aL (1981),
Endocrinology 109:1552.
7Jouishommeetal. (1994) J. BoneMiner. Res. 9:943; WhitfiddandMoriey; TTPJ16:382.
8Barbier dal(1997) I Med. Chem. 40:1373.
9Podle Schipani dal. (1993), Endocrinology 1322157-65.
10 Scharia daL (1991), Honn. Metab. Res. 23:66-9; McGowan et al (1983) Science 219; 67; Lowik etaL (1985), Cell Calcium 6:311.
11 Podle Jobert etal (1997) Endocrinology 13& 5282; Schipani etaL (1993) Rosenblatt daL (1977) J.BioLChem. 252:5847; Segre dal (1979) J. Biol Chem. 254:6980;
Kdfeký PTHC7-34)12 O4HNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF 32
[Leu(8,18) Tyr34] KdskýPIH(734Ý LLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQDVHNY 33
hovězíPTHí7-34)u FMHNLGKHLS SMERVEWLRKKLQDVHNF 34
fTvr341tó\ězíPIH7-34V4 FMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQDVHNY 35
[Leu(8,18)Tyr34lhov&íPTH(7- 34) FLHNLGKHLS SLERVEWLRKKLQDVHNY 36
[Leu(8,18)Trpl2,Tyr34] hosězí PTH(7-34)“ FLHNLWKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNY 37
(D-Trpl2, Tyr3 4] hověá PTH(7-34)iJ FMHNL-D-Trp-KHLSSMERVEWIJtKKHJBYHNY 38
lidskv ΡΊΗ (1-30) SVSEIQLMNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD 39
ÍArelll lidskv PTHÍl -30) SVSEIQU4HNRGKHIJ9SMERVEWLRKKLQD 40
ILvslll lidský PTHÍl-30) SVSEIQLMHNKGKHLNSMERVEWLRKKLQD 41
rArgl911idskvPTH(l-30) SVSEIQLMHNLGKHLNSMRRVEWLRKKLQD 42
ITvrll Bdský PTHfl-30) YVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD 43
ILeď8.18)1 lidskv PTHfl-30) SVSEIQLLHNLG.KÍILNSLJERVEWLRKKLQD 44
hovězí PTHÍ1-30) AVSEK2:MHNIX9MJSSMERVEWIJRKK^ 45
ILeď8.18)1 hovězí PTH (1-30) AVSEfQIIHNLGKHLSSIERVEWIJtKKLQD 46
nrasečíPTHřl-30) SVSEIQIMHNIjGKIIISSLERVEWLRKKILJD 47
krvsíPTHfl-30) AVSHQLMHNLGKHLASVERMQWLRKKLQD 48
[Leu(8,21),Tyr34]krysí PTH(l-30) AVSEKJLLřlMJjKLLASVERLQWIHKKLQL) 49
ILeu271 lidskv PTHÍl -30) SVSEKJPHNIXKHLNSMERVEWIJRKIIjQD 50
lidský ΡΓΗΓ1-29) SVSEK^MHNLGKHU^SMERVEWLRKKLJQ 51
lidský ΡΊΉΠ-28) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKL 52
fLeu(8.18)lFTH(3-30) SEKJLILIMjGKHINSIHRVEWLRKKLQD 53
hovězí PTHÍ3-30) SEIQENIHNLCXřlIHSMERVEW^ 54
ILeuí8.18)1 hovězí PTHÍ3-30) SElQIHJtMjGKHLSSIJiRVEWkRKKLQD 55
idskvPTHÍ7-30) LMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD 56
!Leu(8.18)1 lidskv PTHÍ7-30) LLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQD 57
hovězí PTHÍ7-30) FMHNLGKHLS SMERVEWLRKKLQD 58
(Leu(8.18)1 hovězíPTHÍ7-30) ithnlgkhiasilrvewlrkki.qd 59
[Leu(8,18)Trpl2]hovězí ΡΓΗ(730) FLHNLWKHLSSLERVEWLRKKLQD 60
p>Ttpl2]hovězíPTH(7-30) FMHNL4>Tm-KHLSSMERVEWUtKKL(í> 61
Nussbaum at el (1980). J. BioL Chem.. 225:10183; Gray at el. (1980), BrJ Pharmac 76:259 12 Nissensonatel. (1999), Endocrmoloev 140:1294-1300.
13 Jueppner atel. (1996), Endocrinology.
14 Horiuchi atel (1983), Science 220:1053.
15 Schipani atd (1993); HoKck atel (1995) Bong 16:140S (abstract 223, Conference, Melboume; Fehruaiy 1995) /<sBasedonDresoer-PoDakatd (1996) TBMR 11:1061-5.
17 Goldman at el. (1988) Endocrinology 123:2597.
Tabulka 2—PTH/PTHrP modulující domény na bázi PTHrP
Popis Sekvence SEQ1D NO:
lidský PTHrP(l-86)3 AVSEHQLLUDKGKSIQDLRRRFFLUHLIAEÍHTAE KRYSÍ SEVSRNSKPSPNIKMÍEVRFGSDDIIGRYEIO KrNKVElYKEQPLKIT 62
lidský PTHrP (l-34)lk AVSEHQLUIDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA 63
[Tyr36] lidský PTHrP(l -36)d AVSEHQUJSDKGKSIQDLRRRFFLÍfflLLIAEIHTAE Y 64
^le5j)Jrp23, Tyr36] lidský PTHrP AVSEIQLLHDKGKSIQDIJtRRFWEHULlAEIHTAEY 65
Tyr-lidský PTHrP(l-34)4 YAVSEHQI1.HDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEUÍTA 66
^mlO,Leuy ,D-Phel2] W— AVSEHQLLHNL-D- Pbe KS1QDLRRRFFLHHLIAEIHTA 67
PTHrP (7-34)*° LIHDKGKS1QDLRRRFFLHHL1AEIHTA 68
[AsnlO, Leull] lidský PTHrPí7-34) LLIINLGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA 69
[Asnl 6, Leul71PTHrP(7-34)4d IlHDKGKSINLLRRRÍTLtíHLIAEÍHTA 70
[Leul 1, D-Trpl2J lidský ΡΓΗίΡ(7- 34Ú LEIíDL-D-Trp-KSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA 71
[AsnlO, Leul 1,D-Trpl 2] PTHrP(7- 34Γ UAHNL-D-Trp-KSIQDLRRRFFLHIILIAEIHTA 72
[D-Trpl21PTHrP(8-34) LHNL-D-Trp-KSIQDLRRRFFLHIÍEIAEIHTA 73
ro-Phel21PTHrPÍ8-34) LHNI^D-Phe-KSIQDLRRRFELHHEIAEIHTA 74
ÁsnlO, Leull, D-Trpl2J lidský ΡΓΗτΡ(7-34Γ LLHNL-D-Trp-KSIQDLRRRFFLHHI.IAEIIITA 75
lidský PTHrP(l-30> AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFF1HHL.IAE 76
[He5, Trp23j lidský ΡΓΗτΡ(1-3θ) AVSEIQUWKGKSIQDLRRRFWLHHLIAE 77
Tyr-lidský PTHrPd-30) YAVSEHQI1HDKGKSIQDUU<RFFLHHLIAE 78
AsnlO, Leul 1 ,D-Phel 21 lidský PTHrP(l-30) AVSEHQLIJFNL-D-Phc-KSIQDLRRRFFLHHLIAB 79
PTHrP J7-30) EEHI5KGKSIQDLRRRFFLHHLIAE 80
[AsnlO, Leu 11J lidský PlHrP(7-30) LLHNLGKS IQDLRRRFFIjHHLIAE 81
[Asnl6,Leul71PTHiP(7-30) LLHDKGKS INLLRRRFFLHHLIAE 82
LeuH, D-Trpl2] lidský PTHrP(730) LLHDL»D-Trp-KSIQDLRRRI'FUIHLIAE 83
[AsnlO,Leul 1$·>Τιρ12] ΡΊΉτΡ(7- 30> LLHNL-D-Trp-KSlQDLRRRTFLíIHLIAB 84
B Moseley et al (1987), Proč. NatL Acad. Srí. USA 84:5048; Sůva atel (1987), Science 237: 893; Kemp atel. (1987). Science238:1568;Paspaliaris atel (1995), Bonei 16:141S (abstract225, Conference, Melboume 1995).
19 Podle JP 07316195, May 25,1994 (Nippon Kayaku).
20 Nagasaki atel (1989), Biochem. Biophys. Res. Commun. 158:1036; Nutt at el; Endocrmology 127,491 (1990).
21 Williams at eL (1998). T. Reproduction & Fertility 112:59-67.
22GardeUaatel(1996), Endocrinol 137:3936-41 ;Fujiyama et al. (1998)Am.T.Phvsiol. 274E297-E303.
23 Li atel· (1996), Endocrinology.
• ·
|D-Tipl2]PIHiP(8-30) LHNL-D-Trp-KSIQDLRRRFFLHHLIAE 85
ÍI>Phel2TPTHrPť8-30) IHNL-D-Phe-KSIQDLRRRFFLBHIJAE 86
[AsrrtO, Leul 1, D-Trpl2] lidský PTHrP(7-30) LLHNL-D-Trp-KSIQDLRRRFFLHHLXAE 87
|Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 311 lidský PTHH-34)24 SVSEIQIMHNlXXHlNSMERVELIJiKIIFKLHNF 88
[Haa(Laa Laa HaaHaa) 2Laaž57 311 lidský PTH (1-34 r SVSFJQLMIÍNIXIKUINSMERVEIJEKI1XK1JINF 89
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 3TLlidský PTH (1-34) SVSEIQIJMHNLGKHLNSIERVAIAEALAEALHNF 90
[Haa(laa Laa Haa Haa) 2 Laa 22- 311 lidský PTH (1-34Γ δν8Κ10Ι.ΜΗΝ1Χ}ΚΗΤΝ8ΜΕΚν8υΤ>8ΤΚΚ8ΤΙΙΝΡ 91
[Haa (La a Laa Haa Haa)2 Laa 22- 31] lidský PTH (1-34)27 SVSEIQIAOT4LGKHLNST4ERVAFYDKVAEKLFINF 92
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] idský PTH (7-34)24 IMIINIXíKElLNíSMERVEIJEKIJTK.LÍ'INF 93
Haa(Laa Laa Haa Haa^ Laa 22-311 lidský PTH (7-34f LMHNLGKHLNSMERVELLEKLLKKLHNF 94
(Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 31] lidský PTH (7-34)* LMHNLGKHLNSMERVALAEALAEALKNF 95
Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] lidský PTH (7-34)26 LM1INLGKHLNSMERVSLI.SS1J.SSLHNF 96
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 31] lidský PIH (7-34)27 LMHNLGKHLNSMERVAFYDKVAEKLHNF 97
[Haa(Laa Laa Haa Haa}2 Laa 22- 31] lidský PTHrPd-34)24 AVSEIJQIJJ1DKGKSIQD1T1RRELLEKLLEKLIÍTA 98
|Haa(Laa Laa Haa Haa) 2 Laa 22- 31] lidský PTHrP (1-34)24 AVSEHQLÍJTDKGKSIQDLRRREIJEKLI.KKLHTA 99
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 31] lidský PTHrP (1-34) AVSEHQUFlDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHrA 100
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 31] lidský PTHrP (1-34)26 AVSEHQIUIDKGKSIQDIJLRRSLLSSI.LSSLHTA 101
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 311 lidský PTHrP (1-34/7 AVSEJIQIJJIDKGKSlQDIRRRAFYDKVAEKLirrA 102
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 311 lidský PTHrP C7-34)2* luidkgksiqdlrrrei.lekijeklhta 103
I Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 3l 1 lidský PTHrP C7-34)24 T J HDKGKSIQDt .RRRET ,T EKTIKKT JJTA 104
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 311 lidský PTHrP (7-S4)25 UHDKGKSlQDIJUU^tAEALAEAlirrA 105
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 311 lidský PTHrP (7-34)26 LLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA 106
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22- 31] lidský PTHrP (7-S4)27 LIJIDKGKSlQDiJtRRAETDKVAEXlilTA 107
[Lysll ,Lysl3;Aigl9, Arg21; Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22311 lidský PTHrP (í-34)29 AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLIJRKLHrA 108
24 S inkoporad SEQ ID Č.26zeUS.Pat Č. 6,051,686.
25 S inkorporací SEQ IDNO28zeUJS. Pat Č. ¢051,686.
26 S inkorporací SEQ ID Č. 29ze us. Pat Č. 6,051,686.
27 S inkorporací SEQIDČ.30zeus. PatČ. 6,051,686.
28 S inkorporací SEQ ID Č. 26 ze US. Pat Č. 6,051,636 29 S inkorporací SEQ ID NO 5 zeUS. Pat Č. 6,051,686.
• ·♦ ·· »· » · • · · · · ···· ·· ···· ·· ·«·· ·· ··
[Lysí l,Lysl3;Argl9, Arg21; HaaíLaa Laa Haa Haa)2 Laa 2231] lidský PTHrP [1-34] AVSEFiQIUlIXGKSIQraXRRHIEKLLEKLHTS 109
Lysí 1, Lysl3; Aigl9, Arg21; HaaíLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] lidský PTHrP (1-34Γ AVSHIQinnJKGKSIQDIKRRELUíKUEKUrrAGRR 110
Lysí l,Lysl 3;Argl9,Arg21; HaaíLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] lidský PTHrP (1-34Γ AVSlJtQUJIDKGKSIQDIXRREUEKIJJXLKH, 111
Lysí 1, Lysí 3, Atal 9, Arg21, HaaíLaa Laa Haa HaA Laa 22-31] idský PTHrP 11-34) AVSEH<^ J J IIXGmSK2f)lARREUXXLIIXI.l-!TA 112
Lysí l,Lysl3,Argl9,Ala21, HaaíLaa Laa Haa JÉfea)2 Laa 22-31] lidský PTHrP (1-34Γ AVSE1IQE1 JU^CGKSlQDIJRRAELIEKr.LIíKLHTA 113
Leul l,Lysl3,Argl9,Arg21, HaaíLaa Laa Haa HaaE Laa 22-31] lidský PIHrP (1-34) AVSEAQUJlDlXiKSlQDiJ<RRELLEKLLEKmAL 114
Lysí 1 ,Lysl 3, Aígl 9, Arg21, HaaíLaa Laa Haa HaaT Laa 22-31] lidský PTHrP (1-34)* AVSEHQUJIIXGKSlQDU^ELLERlIJiHIirrA 115
Argl 1, Argl 3, AigÍ9, Arc21, HaaíLaa Laa Haa Haafe Laa 22-31] lidský PTHrP (1-34) AVSEIlQIUflJRGRSIQDRRREUERLLEKEHTA 116
Argl 1, Lysí 3, Argl 9, Arg21, Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] idský PTHrP (1-34) AVSFW^JLJrERGKSIQDLKRRELLERLLKRLIirA 117
Aígl 1, Argl 3, Argl 9, Aig21, HaaíLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-311 lidský PTHrP 11-34) A VSKHQI1 HORGR SWjOT RRRRTI F.RI J KRT .HTA 118
HaaíLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] lidský PIHrP (1-34)40 AVSEHQLLHDKGKSSQElRRRALAEALAEALHrA 119
Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] lidský PTHrP (1-34)41 ΑνδΕΗρίΙΉΟΚΩΚ^ίρηΐΧΕΚδΙΙΧδίΙ^δΕΗΓΑ 120
HaaíLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] lidsky PTHrP (1-34Γ AVSBIíQmHrXGKSlQOIJtRRAFYEKVAEKIHIA 121
Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-311 idský PTHrP (1-34)* AVSEIQFMHN1OKHLSSMERVEEEEKIJÍNY 122
30 podle SEQ IDNOS: 8,9 z U.S. Pat Č. 6/)51,686 31S inkorporacíSEQ ID C. 10 z US. Pat C. 6,051,686 32 S inkorporacíSEQ BD NO: 11 z US. Pat Č. 6,051,686 33 S inkorporacíSEQ ID NO: 12 z US. Pat Č. 6,051,686 34 S inkorporacíSEQ ID NO: 12 z U.S. Pat Č. 6,051,686 35 S inkorporacíSEQ IDNCh 14 z US. Pat Č. 6,051,686 36 S inkorporacíSEQ ID NO: 15 z US. Pat Č. 6,051,686 37 S inkorporacíSEQ ID NO: 16 z US. Pat Č. 6,051,686 38 S inkorporacíSEQ ID NO: 17 and 18 z US. Pat C. 6,051,686 39 S inkorporacíSEQ ID NO: 19 z US. Pat Č. 6,051,686 40 S inkorporacíSEQ ID NO: 20 z US. Pat Č. 6,051,686 41S inkorporacíSEQ BDNO: 21 z US. Pat Č. 6,051,686 42 S inkorporacíSEQ IDNCh 22 z US. Pat Č. 6,051,686 43 Modifiováno ze SEQ BDNO: 23 z US. Pat Č. 6,051,686 * ·« · · · · · · • · · · · ···· ····«· * » ·«·· ·· ··
Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-31] lidský PTHrP (1-34)44 AVSEJQíMHNLGKHl^SMRRRELIEKIlEKLHNY 123
[Haa(Laa Laa Haa Haa)j Laa 22-30] idský PTH (1-30) SVSEKJLMHNLGKHLUSMERVEUEKIIJEK 124
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-301 idský PTH (1-30) SVSEKJIMHNLtaíHLNSMEKVEIlEKLIJKK 125
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTH (1-30) SVSKIQÍMHNI/iKJfl.NSMERVAEAEALAEA 126
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTH (1-30) SVSEIQLMUNIUKinAÍSMERVSI.IJSSLESS 127
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTH (1-34)27 SVS EIQLMHNLGKHLNSMERVAFYDKVAEKLHNF 128
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTH (7-30) LMHNLGKHLNSMERVELLEKLLEK 129
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] idský PTH (7-30) LMHNLGKHLNSMERVELLEKLLKK 130
[Haa(Laa Laa Haa Haa^ Laa 22- 30L lidský PTH (7-30) LMHNLGKHLNSMERVALAEALAEA 131
[Haa(Laa Laa Haa HaaX Laa 22-30] idský PTH (7-30) LNO^LCKHmSMERVaUSSLLSS 132
[Haa(Laa Laa Haa Haa^ Laa 22-30] lidský PTH (7-30) LMHNLGKHLNSMERVAFYDKVAEK 133
[Haa(Laa Laa Haa Haa^ Laa 22-30] idský PTHrP (1-30) AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEXLLEK 134
(Haa(Laa Laa Haa Haa>2 Laa 22- 30] lidský PTHrP (1-30) AVSELIQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLKK, 135
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSE1IQLIJIDKGKS1QDIILRRAIAEAIAEA 136
(Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSIHIQUJIDKGKSIQDLRRRSIJ.SSLLSS 137
[Haa(Laa Laa Haa Haa^ Laa 22-301 lidský PTHrP (1-30) AVSEHQLLHDKGKSlQDLRRRAl-yDKVAEK 138
[Haa(Laa Laa Haa Haafe Laa 22-30] lidský PTHrP (7-30) LJJJDKGKSlQLXJLRRHiEKLLEK 139
{Haa(LaaLaaHaaHaa)2 Laa22-30] lidský PTHď (7-30) II .HDKGKSIQOIJRRRELI .EKT.I KK 140
[Haa(Laa Laa Haa Haa^ Laa 22-301 idský PTHrP (7-30) LIJIDKGKSKJDLRRRAIAEALAEA 141
[Haa(Laa Laa Haa Haa^ Laa 22-301 idský PTHrP (7-30) UWKGKSIQDLRRRSLLSSLLSS 142
[HaaÍLaaLaaHaaHaah Laa22-30] lidský PTHrP (7-30) miDKGKSIQDLRRRAr^DKVAEK 143
[Lysí 1, Lys 13; ArgÍ9, Arg21; Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-301 idský PTHrP (1-30) AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRR ELLEKLLRK 144
[Lysll, Lysl3; Aigl9, Arg21; Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-301 idský PTHrP (1-30) AVSEIIQLLnDKGKSIQDLRRREIJJEKLLEK 145
[Lysll, Lysl3; Argl9, Arg21; Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSEHQULHDKGKSIQDIJRRREIJLEKLLEKLHT 146
^Modikovánoze SEQ ID NO: 24 z US. Pat č. 6,051,686 • · r · ·· r· «· « · « · · · • · · « • 9 · « t • · · * ··«· · · ·<·«
(Lysí 1, Lysl3; Argl9, Arg21; Haa(Laa Laa Haa HaaX Laa22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSEtlQlIHDKGKSIQOLRKREUJiKULK 147
[Lysí l,Lysl 3,Alal9,Arg2l, Haa(Laa Laa Haa Haajj Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSEHJIWKGKSÍQDIARRELLSCLLEK 148
Lysí 1,Lysí 3 ,Argf9,Á!a2l, HaafiLaa Laa Haa Haal Laa 22-301 lidský PTHrP (1-30) AVSE.HQLIJIDKUKSÍQ13LRRAELLEKIÍIX 149
Lenil ,Lysl3, Aigl9, Are21, Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSEAQIlWLGKSH^UaRRELLEKLUSK 150
LysH, Lysl3jArgl9,Arg'2l, HaaíLaa Laa HaaHaaL Laa 22-30] lidský ΡΊΉτΡ (1-30) Αν8Εΐϊουιπκυκ8κχ)ΐκκκΕυ;·:κιΐΕΚ 151
Argl l,Argl3,Argl9,Are21, HaaíLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSEHQLLIlDRGRSiQDRRREULRLI£R 152
Aígl 1,lysí 3, Arei 9,Aig21, HaaíLaa Laa Haa Haal Laa 22-30} lidský PTHrP (1-30) AVSEHQLLHDRGKSIQDLRRREUIÍRUXR 153
Aígl 1, Aígl 3, Areí 9,Ató21 f HaaíLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSEHQmiDRGRSIQDIXRRELIERLIXR 154
Haa(Laa Laa Haa HaaH Laa 22-30] lidský PTHrP (1-301 avsholhdkcksjqixkrraiaealaea 155
Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSEHQJXHDKGKSIQDLRRRSIJLSSILSS 156
Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVS3ÍQLIHDKGKS1QÍXJRRRAFYDKVAEK 157
Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSEKJíWHNIjCKEII^SMFXVEIILKIIIX 158
HaaíLaa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] lidský PTHrP (1-30) AVSEKJFWÍNUIKÍÍLSSMRRREUJZKUJEK 159
Jiná použitelná PTH/PTHrP modulující doména má sekvenci peptidu známého jako TIP39:
SLALADDAAFRERARLLAAůEBRHWLNSYMHKLLVLDAP {SEQ ID NO: 160)
TIP39 je popsán v Usdin et al., 1999, Nátuře Neurosci 2(11): 941-3; Usdin et al., (1996), Endocrinology 137(10): 4285-97;
Usdin et al., (1995), J. Biol. Chem. 270(26): 15455-8; Usdin et al., (1999), Endocrinol 140(7): 3363-71.
Další použitelná sekvence PTH/PTHrP modulující domény může být získána konzervativními nebo nekonzervativními • ·· ·· ·· ·< ··*« ·· · * « · · · ·· · • · · 9 9 9 9 9 • *999 9 9 9 * 9
9 9 · * 9 9 9 9 ··· ··€· ·· ···· «» 99 modifikacemi aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 3,4,5, T1P39, nebo sekvencí uvedených v Tabulkách 1 a 2.
Konzervativní modifikace budou produkovat peptidy mající funkční a chemické charakteristiky podobné charakteristikám PTH nebo PTHrP peptidu, ve kterém jsou takové modifikace provedeny. Naopak, významná modifikace ve funkčních a/nebo chemických charakteristikách peptidu mohou být provedeny pomocí substitucí v aminokyselinové sekvenci, které mají významný vliv na zachování (a) struktury molekulového skeletu v místě substituce, například ve smyslu struktury šroubovice nebo skládaného listu, (b) náboje nebo hydrofobnosti molekuly v cílovém místě, nebo © velikosti molekuly.
Například, konzervativní aminokyselinová substituce může být substituce nativního aminokyselinového zbytku za nonnativní zbytek tak, že nedojde k ovlivnění nebo dojde k pouze slabému ovlivnění polarity nebo náboje aminokyselinového zbytku v této pozici. Dále, jakýkoliv nativní zbytek v polypeptidu může být také substituován alaninem, jak bylo popsáno pro „alaninovuo skenovací mutagenesi (viz například, MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24, které popisují alaninovou skenovací mutagenesi).
Požadované aminokyselinové substituce (ať konzervativní, nebo nekonzervativní), mohou být určeny odborníky v oboru v době, kdy jsou takové substituce žádány. Například, aminokyselinové substituce mohou být použity pro identifikaci významných zbytků peptidové sekvence, nebo pro zvýšení nebo snížení afinity peptidu nebo molekul vehikulum-peptid (viz předchozí vzorce), které jsou zde popsány. Příkladné aminokyselinové substituce jsou uvedeny v tabulce 3.
·· 44 44 44 e 4 4 4 • 4 4 4 4 *4 • 4 4 4 4 4 4
444 44 4444 44
Tabulka 3 — Aminokyselinové substituce
Původní zbytky Ala Příkladné substituce Výhodné substituce Val
Val, Leu, Ite
Arg Lys, Gin, Asn Lys
Asn Gin Gin
Asp Ghi Glu
Cys Ser, Ala Ser
Gin Asn Asn
Glu Asp Asp
Gly Pro, Ala Ala
His Asn, Gin, Lys, Arg Arg
Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe, Nodeuctns. Leu
Leu Norleucino, Ile, Val, Met, Ala, Phe tte
Lys Arg, 1,4 Diamino butyric Acid, Gin, Asn Arg
Met Leu, Phe, Ile Leu
Pha Leu, Val, Ile, Ala, Tyr . Leu
Pro Ala Gly
Ser Thr, Ala, Cys Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr, Phe Tyr
Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norteucinu Leu
V některých provedení zahrnují konzervativní aminokyselinové substituce též přirozeně se nevyskytující aminokyselinové zbytky, které jsou typicky inkorporovány pří chemické syntéze peptidů a ne při syntéze v biologických systémech.
Jak bylo uvedeno v definicích termínů, mohou být přirozené zbytky děleny do tříd podle vlastností vedlejších řetězců, , které mohou být použitelné pro modifikaci sekvence. Například, nekonzervativní substituce mohou znamenat výměnu člena jedné třídy za člena jiné třídy. Takové substituované zbytky mohou být vloženy do regionů peptidů, které jsou homologní s nonlidskými ortology, nebo do non-homologních regionů molekuly. Také je možné provést takové modifikace za použití P nebo G, když je žádoucí ovlivnění orientace řetězce.
Při provádění takových modifikací může být brán v úvahu hydropatický index aminokyselin. Každé aminokyselině je přiřazen hydropatický index podle hydrofobnosti a náboje a tyto indexy jsou: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); methionin (+1,9); alanin (+1,8); glycin (-0,4); threonin (-0,7); serin (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamát (-3,5); glutamin (-3,5); aspartát (3,5); asparagin (-3,5); lysin (-3,9); a arginin (-4,5).
Význam hydropatického indexu aminokyselin pro interaktivní biologické funkce proteinu je v oboru znám. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Je známo, že některé aminokyseliny mohou být substituované za jiné aminokyseliny mající podobný hydropatický index nebo skóre a mohou si potom zachovat podobnou biologickou aktivitu. Při provádění substitucí podle hydropatického indexu jsou výhodné substituce aminokyselin, jejichž hydropatické indexy jsou ±2, a zejména ±1, a nejlépe ±0,5.
V oboru je také známo, že substituce podobných aminokyselin může být provedena podle hydrofilnosti. Nejvyšši lokální ·· ·· · · ·· ···· průměrná hydrofilnost proteinu, jak je určena hydrofílnosti sousedních aminokyselin, koreluje s jeho imunogenicitou a antigeničitou, t.j. s biologickými vlastnostmi proteinu.
Následující hodnoty hydrofilnosti mohou být přiřazeny aminokyselinovým, zbytkům: arginin (+3,0); lysin (+3,0); aspartát (+3,0 ±1); glutamát (+3,0 ±1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glycin (0); threonin (0,4); prolin (-0,5 ±1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cystein (-1.0); methionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); isoleucin (-1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5); tryptofan (-3,4). Při provádění změn podle podobných hodnot hydrofilnosti jsou výhodné substituce aminokyselin, jejichž hodnoty hydrofilnosti jsou ±2, lépe ±1 a nejlépe ±0,5. Také lze identifikovat epitopy z primární aminokyselinové sekvence podle hydrofilnosti. Tyto regiony jsou také označovány jako epitopové jaderné regiony.
Odborník v oboru bude schopen určit vhodné varianty polypeptidů, jak jsou zde uvedeny, za použití dobře známých technik. Pro identifikaci vhodných oblastí molekuly, které mohou být změněny bez narušení aktivity, může odborník v oboru cíleně zaměřit ty oblasti, o kterých předpokládá, že nejsou významné pro aktivitu. Například, když jsou známé podobné polypeptidy s podobnými aktivitami od stejného druhu nebo od různých druhů, tak může odborník v oboru srovnat aminokyselinové sekvence peptidu s podobnými peptidy. Při takovém srovnání je možné identifikovat zbytky a části molekul, které jsou konzervovány mezi podobnými polypeptidy.
Je třeba si uvědomit, že změny v oblastech peptidu, které nejsou konzervované mezi takovými podobnými peptidy, budou s menší pravděpodobností nežádoucím způsobem ovlivňovat biologickou aktivitu a/nebo strukturu peptidu. Odborníkům v ·» · · · · · · ···· oboru bude také známé, že i v relativně konzervovaných regionech je možné substituovat chemicky podobné aminokyseliny za přirozené zbytky za zachování aktivity {konzervativní aminokyselinové substituce). Tak mohou být i oblasti, které jsou důležité pro biologickou aktivitu nebo pro strukturu předmětem konzervativních aminokyselinových substitucí bez narušení biologické aktivity nebo bez nežádoucího ovlivnění struktury peptidů.
Dále, odborník v oboru si může prohlédnout studie identifikující podobné peptidy, které jsou významné pro aktivitu nebo strukturu. Při takovém srovnání je možné určit význam aminokyselinových zbytků v peptidů, které odpovídají aminokyselinovým zbytkům, které jsou důležité pro aktivitu nebo strukturu v podobném peptidů. Odborník v oboru může určit aminokyselinové substituce pro takové předpokládané významné aminokyselinové zbytky peptidů.
Odborník v oboru může také analyzovat trojrozměrnou strukturu a aminokyselinovou sekvenci v souvislosti se strukturou v podobném polypeptidu. Z této informace může odborník v oboru předpokládat umístění aminokyselinových zbytků peptidů z hlediska jeho trojrozměrné struktury.
Odborník v oboru si může přát nedělat radikální změny v aminokyselinových zbytcích přítomných na povrchu proteinu, protože takové zbytky se mohou podílet na významných interakcích mezi molekulami. Kromě toho může odborník v oboru připravit testovací varianty obsahující substituci jednoho aminokyselinového zbytku požadovaným aminokyselinovým zbytkem. Varianty mohou být testovány za použití testů pro aktivitu známých odborníkům v oboru. Taková data mohou být použita pro získání informací o vhodných variantách. Například, pokud se zjistí, že změna v jednom konkrétním aminokyselinovém zbytku vede k narušení, nežádoucímu snížení aktivity nebo k vzniku nevhodné aktivity, tak mohou být varianty s takovými změnami eliminovány. Jinými slovy, podle informací získaných z takových běžných pokusů, může odborník v oboru snadno určit aminokyseliny, ve kterých mají být další substituce eliminovány, buď samostatně, nebo v kombinaci s jinými mutacemi.
Mnoho vědeckých publikací je věnováno predikci sekundární struktury. Viz Mouit J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al. Biochemistry 13(2): 222-245 (1974); Chou et al. Biochemistry 113(2): 211-222(1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148 (1978); Chou et al. Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 a Chou et al., Biophys. J. 26:367-384(1979). Kromě toho jsou v současnosti dostupné počítačové programy, které napomáhají v predikci sekundární struktury. Jedna metoda predikce sekundární struktury je založena na modelování homologie. Například, dva polypeptidy nebo proteiny, které mají identitu sekvence vyšší než 30%, nebo podobnost vyšší než 40%, mají často podobné strukturální topologie. Nárůst databáze struktury proteinů (PDB) umožňuje lepší předvídání sekundární struktury, včetně potenciálního počtu záhybů ve struktuře polypeptidu nebo proteinu. Viz Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). Bylo naznačeno (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)), že v daném polypeptidu nebo proteinu je omezený počet záhybů a že pokud se určí kritický počet struktur, tak nabyde predikce struktury dramaticky na přesnosti.
Mezi další metody predikce sekundární struktury patří threading (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol. 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure 4(1): 15-9(1996)), analýza profilu (Bowie et al., Science 253:164-170(1991); Gribskov et ·» ·· ·· ·· ···· al. Meth. Enzym., 183: 146-159(1990); Gribskov et al., Proč. Nat. Acad. Sci. 84(13): 4355-8(1987)), a evoluční vazba (viz Home, výše a Breriner, výše).
Vehíkula. Předkládaný vynález vyžaduje přítomnost alespoň jednoho vehíkula (F1) navázaného na peptid prostřednictvím Ckonce nebo vedlejšího řetězce jednoho z aminokyselinových zbytků. Může být použito více vehikul; například, Fc na Ckonci a PEG skupina na vedlejším řetězci.
Fc doména je výhodným vehikulem. Fc doména může být fúzována na C konec peptidu.
Jak bylo uvedeno výše Fc varianty jsou vhodnými vehikuly podle předkládaného vynálezu. Nativní Fc může být různě modifikován za zisku Fc varianty podle předkládaného vynálezu, s podmínkou, že je zachována vazba na receptor; viz, například WO 97/34631 a WO 96/32478. V takových Fc variantách je možno odstranit jedno nebo více míst přirozeného Fc, která způsobují strukturální charakteristiky nebo funkční aktivitu, které nejsou vhodné pro fúzní molekuly podle předkládaného vynálezu. Tato místa je možné odstranit, například, substitucí nebo deletováním zbytků, insercí zbytků do místa, nebo zkrácením o část obsahující místo. Insertované nebo substituované zbytky mohou hýt takto pozměněné aminokyseliny, jako jsou peptidomimetíka nebo D-aminokyseliny. Fc varianty mohou být žádoucí z mnoha důvodů, z nichž některé jsou popsány dále. Příklady Fc variant jsou molekuly a sekvence, kde:
1. jsou odstraněna místa podílející se na disulfídové vazbě. Takové odstranění může zabránit reakci s jinými proteiny obsahujícími cystein v hostitelské buňce použité pro produkci molekul podle předkládaného vynálezu. Pro tento účel může být • · segment obsahující cystein na N-koncí zkrácen nebo mohou být cysteinové zbytky deletovány nebo substituovány jinými aminokyselinami (například alanylem, serylem). Konkrétně je možno zkrátit N-terminální 20-aminokyselinový segment SEQ ID NO: 2 nebo deletovat nebo substituovat cysteinové zbytky v pozicích 7 a 10 SEQ ID NO: 2. I přes odstranění cysteinových zbytků může jednořetězcová Fc doména stále ještě tvořit dimerní Fc doménu, která je udržována pohromadě nekovalentní vazbou.
2. Nativní Fc je modifikován tak, aby byl více kompatibilní s vybranou hostitelskou buňkou. Například je možné odstranit PA sekvenci poblíž N-konce typického nativního Fc, která může být rozpoznávány typickými trávícími enzymy v E. coli, jako je prolin-iminopeptidasa. Také je možné přidat N-terminální methioninový zbytek, zejména tehdy, když je molekula exprimována rekombínantně v bakteriální buňce, jako je ET. coli. Fc doména SEQ ID NO: 2 je jednou takovou Fc variantou.
3. Část N-konce nativního Fc je odstraněna pro zabránění Nterminální heterogenitě při expresi ve vybrané hostitelské buňce. Pro tento účel je možné deletovat jakýkoliv z prvních 20 aminokyselinových zbytků na N-konci, zejména zbytků v pozicích 1,2,3,4 a 5.
4. Je odstraněno jedno nebo více glykosylačních míst. Zbytky, které jsou obvykle glykosylovány (například, asparagin) mohou přispívat k cytolytické reakci. Takové zbytky mohou být deletovány nebo substituovány za neglykosylované zbytky (například, alanin).
5. Místa podílející se na interakci s komplementem, jako je Clq vazebné místo, jsou odstraněna. Například je možné ·· · · ·· ·· ·«·· deletovat nebo substituovat EKK sekvencí lidského IgGl. Aktivace komplementu může být nevýhodná pro molekuly podle předkládaného vynálezu a při použití takových Fc variant k ní nedochází.
6. Jsou odstraněna místa, která ovlivňují vazbu na Fc receptory jiné než je receptor. Nativní Fc může mít místa pro interakci s některými leukocyty, která nejsou vhodná pro molekuly podle předkládaného vynálezu a proto mohou být odstraněna.
7. Je odstraněno ADCC místo. ADCC místa jsou známá v oboru; viz, například, Molec. Iramunol. 29 (5): 633-9(1992) pro ADCC místa v IgGl. Tato místa také nejsou nutná pro fúzní molekuly podle předkládaného vynálezu a proto mohou být odstraněna.
8. Když je nativní Fc odvozen od non-lidské protilátky, tak může být nativní Fc humanizovaný. Obvykle je pro humanizaci nativního Fc nutné substituovat vybrané zbytky v non-lídském nativním Fc zbytky, které se normálně nacházejí v lidském nativním Fc. Techniky pro humanizaci protilátek jsou dobře známé v oboru.
Výhodnými Fe variantami jsou následující varianty. V SEQ ID NO: 2 (Obr. 4) může být leucin v pozici 15 substituován glutamátem; glutamát v pozici 99 alaninem; a lysiny v pozicích 101 a 103 alaniny. Dále, jeden nebo více tyrosinových zbytků může být nahrazen fenyalaninovými zbytky.
Alternativním vehikulem může být protein, polypeptid, peptid, protilátka, protilátkový fragment, nebo malá molekula (například, peptidomimetická sloučenina) schopná vazby na receptor. Například je možné použít jako vehikulum • · polypeptide popsaný v US. Pat. č. 5,739,277, uděleném
14.4.1998, Presta et al. Peptidy mohou být také vybrány za použití fágového zobrazení nebo RNA-peptidového skríningu pro vazbu na FcRn receptor. Takovés loučeniny vážící se na receptor také spadají do definice termínu „vehikulum a do rozsahu předkládaného vynálezu. Taková vehikula by měla být vybrána pro zvýšení poločasu {například eliminací sekvencí rozpoznávaných proteasami) a snížení imunogenicity (například upřednostněním neimunogenních sekvencí, je popsáno při humanizaci protilátek).
Jak bylo uvedeno výše, polymerová vehikula mohou být také použita pro F1 a F2. V současnosti jsou dostupné různé prostředky pro navázání chemických skupin použitelných jako vehikula, viz například. Patent Cooperation Treaty ('PCI) Mezinárodní přihláška č. WO 96/11953, nazvaná N-terminally Chemically Modificated Protein Compositions and Methods, která je zde uvedena jako odkaz. Tato PCT přihláška popisuje mimo jiné - selektivní navázání polymerů rozpustných ve vodě na N-konec proteinů.
Výhodným polymerovým vehikulem je polyethylenglykol (PEG). PEG skupina může mít jakoukoliv běžnou molekulovou hmotnost a může být lineární nebo rozvětvená. Průměrná molekulová hmotnost PEG bude výhodně od přibližně 2 kiloDaltonů (kD) do přibližně 100 kD, lépe od přibližně 5 kD do přibližně 50 kD, nejlépe od přibližně 5 kD do přibližně 10 kD. PEG skupiny budou obvykle navázány na sloučeniny podle předkládaného vynálezu acylací nebo redukční alkyiací prostřednictvím reaktivní skupiny na PEG molekule (například aldehydu, aminu, thioiu nebo esteru) a reaktivní skupiny na sloučenině podle předkládaného vynálezu (například aldehydu, aminu nebo esteru).
Vhodná strategie pro PEGylaci syntetických peptidů se skládá z kombinování, prostřednictvím tvorby konjugátové vazby v roztoku, peptidů a PEG skupiny, kde každá z těchto molekul obsahuje specifickou skupinu, které jsou vzájemně reaktivní. Peptidy mohou být snadno připraveny běžnou syntézou na pevné fázi. Peptidy jsou preaktivovány vhodnou funkční skupinou v specifickém místě. Prekursory jsou přečištěny a plně charakterizovány před jejich reakcí s PEG skupinou. Ligace peptidů s PEG obvykle probíhá ve vodné fázi a může být snadno monitorována analytickou HPLC s reverzní fází. PEGylované peptidy mohou být snadno přečištěny preparativní HPLC a charakterizovány analytickou HPLC, aminokyselinovou analýzou a hmotnostní spektrometrií s desorpcí laserem.
Polysacharidové polymery jsou jiným typem polymerů rozpustných ve vodě, které mohou být použity pro modifikaci proteinů. Dextrany jsou polysacharidové polymery složené z jednotlivých podjednotek glukosy vázaných především al-6 vazbami. Dextran samotný je dostupný v mnoha molekulových hmotnostech a snadno je dostupný v molekulové hmotnosti od přibližně 1 kD do přibližně 70 kD. Dextran vhodným polymerem rozpustným ve vodě pro použití v předkládaném vynálezu jako vehikulum, buď sám o sobě, nebo v kombinaci s jiným vehikulem (například, Fc). Viz, například, WO 96/11953 a WO 96/05309. Použití dextranu konjugovaného na terapeutické nebo diagnostické imunoglobuliny bylo již popsáno; viz, například, Evropská patentová přihláška č. 0 315 456, která je zde uvedena jako odkaz. Dextran hmotnosti přibližně 1 kD až přibližně 20 kD je výhodný, když je dextran použit jako vehikulum. v předkládaném, vynálezu.
Spojovací sekvence. Jakákoliv spojovací sekvence je
volitelná. Když je přítomná, tak není její chemická struktura zásadní, protože slouží primárně jako oddělovací skupina. Spojovací sekvence je výhodně tvořena aminokyselinami vázanými peptidovými vazbami - Ve výhodných provedeních je spojovací sekvence tvořena 1 až 20 aminokyselinami vázanými peptidovou vazbou, kde aminokyseliny jsou vybrány z 20 přirozených aminokyselin. Některé z těchto aminokyselin mohou být glykosylováné, jak je dobře známo v oboru. Ve výhodnějším provedení je 1 až 20 aminokyselin vybráno ze skupiny zahrnující glycin, alanin, prolin, asparagin, glutamin a lysin. Ještě lépe je spojovací sekvence tvořena z většiny z aminokyselin, které jsou stericky neomezené, jako je glycin a alanin. Výhodné spojovací sekvence jsou polyglycíny (zejména (Gly) 4, (Gly) 5) , póly (Gly-Ala), a polyalaniny.
Jiné specifické příklady spojovacích sekvencí jsou:
(Gly) 3Lys (Gly) 4 (SEQ D NO: 6);
(GlyJsAsnGlySer (Gly) 2 (SEQ ID NO: 7) / (Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 8); a GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 9).
Pro vysvětlení výše uvedené nomenklatury je třeba uvést, že například (Gly) 3lys(Gly)4 znamená Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-GlyGly. Kombinace Gly a Ala jsou také výhodné. Spojovací sekvence zde uvedené jsou příklady spojovacích sekvencí; spojovací sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být mnohem delší a mohou obsahovat jiné zbytky.
Nepeptidové spojovací sekvence jsou také možné. Například, alkylové spojovací sekvence, jako je -ΝΉ-{CH2)s~C (O)-, kde s = 2-20, mohou být použity. Tyto alkylové spojovací sekvence mohou být dále substituované jakoukoliv stericky neomezenou • · skupinou, jako je nižší alkyl (například, Ci-Ce) r nižší acyl, halogen (například, Cl, Br), CN, NH2, fenyl, atd. Příkladem, nepeptidové spojovací sekvence je PEG spojovací sekvence vzorce VI
kde n je takové, že spojovací sekvence má molekulovou hmotnost 100 až 5000 kD, výhodně 100 až 500 kD. Peptidové spojovací sekvence mohou být pozměněny za zisku derivátů, jak je popsáno výše.
Deriváty. Vynález také zahrnuje derivatizování peptidové a/nebo vehikulové části sloučeniny. Takové deriváty mohou zlepšovat rozpustnost, absorpci, biologický poločas a podobné vlastnosti sloučeniny. Skupiny mohou alternativně zeslabovat nebo eliminovat jakékoliv nežádoucí účinky sloučeniny a podobně. Příklady derivátů zahrnují sloučeniny, kde:
1. Sloučenina nebo nějaká její část je cyklická. Například, peptidová část může být modifikována tak, aby obsahovala dva nebo více Cys zbytků (například ve spojovací sekvenci), které mohou cyklizovat prostřednictvím tvorby disulfidové vazby.
2. Sloučenina je zesítěná nebo učiněna schopnou zesítění mezi molekulami. Například může být peptidová část modifikována tak, aby obsahovala jeden Cys zbytek a tak mohla tvořit intermolekulovou disulfidovou vazbu s podobnou molekulou. Sloučenina může také být zesítěná prostřednictvím svého Ckonce, jak je tomu v molekule vzorce V.
• β • * ·
ΝΗ;
ΝΗ
F’-(X1)b-CO-N
F1-(X1)b-CO-N
3. Jedna nebo více peptidylových [-C(O)NR-J vazeb je nahrazena nepeptidylovou vazbou. Příklady nepeptidylových vazeb jsou -CH2-karbamát [-CH2-OC (O) NR-], fosfonát, -CH2-sulfonamid [-CH2S(0)2NR-], močovina I-NHC (O)NH-j, -CH2-sekundární amin, alkylovaný peptid. [-C(O)NR' -, kde R6 je nižší alkyl}.
4. N-konec je derivatizovaný. Obvykle může být N-konec acylováný nebo modifikovaný na substituovaný amin. Příklady skupin N-terminálních derivátů jsou -NRR1 (jiný než -NH2) , -NRCÍOIR1, -NRCÍOJOR1, -NRS(0)2R1, -NHC (0) NHR1, sukcinimid nebo benzyloxykarbonyl-NH- (CBZ-NH-), kde R a R1 jsou každý nezávisle vodík nebo nižší alkyl a kde fenylový kruh substituovaný 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, chlor a brom.
5. Volný C-konec je derivatizovaný. Obvykle je C-konec esterifikovaný nebo amidovaný. Příklady skupin pro Cterminální deriváty zahrnují, například, -C(O)R , kde R je nižší alkoxy nebo -NR3R4, kde R3 a R4 jsou nezávisle vodík nebo Ci-C3alkyl (výhodně Ci-C4alkyl) .
6. Disulfidové vazba je nahrazena jinou, výhodně stabilnější, zesítovací skupinou (například alkylenem). Viz, například, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39:3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp. 357-9.
*· »« ·· * * · · ♦ e • * · 9 · · · • 999 9 9 9 · 9 • · · · ···« • ·« 9 9 9 99· 9 9 9 9
7. Jeden nebo více aminokyselinových zbytků je modifikovaný. Jsou známá různá derivatizační činidla, která specificky reagují s vybranými vedlejšími řetězci nebo koncovými zbytky, jak je podrobněji popsáno dále.
Lysinylové zbytky a amino terminální zbytky mohou reagovat s anhydridy kyseliny jantarové nebo jiné karboxylové kyseliny, což změní náboj lysinylových zbytků. Mezi další činidla vhodná pro derivatizaci zbytků obsahujících α-amino skupinu patří imidoestery, jako je methylpicolinimidát; pyridoxal-fosfát; pyridoxal; chlorborohydrid; kyselina trinitrobenzensulfonová; O-methylisomočovina; 2,4-pentandion; a transaminasoukatalyzovaná reakce s glyoxylátem.
Arginylové zbytky mohou být modifikovány reakcí s jedním nebo kombinací následujících běžných činidel, včetně fenylglyoxalu, 2,3-butandionu, 1,2-cyklohexandionu a ninhydrinu. Derivatizace arginylových zbytků vyžaduje to, aby byla reakce provedena za alkalických podmínek z důvodu vyšší hodnoty pKa guanidinové funkční skupiny. Dále, tato činidla mohou reagovat se skupinami lysinu, stejně jako s argininovou epsilon-amino skupinou.
Specifické modifikace tyrosylových zbytků byly důkladně zkoumány, zejména z hlediska možnosti vkládání spektrálních markérů do tyrosylových zbytků reakcí s aromatickými diazoniovými sloučeninami nebo tetranitromethanem. Nej častěji se N-acetylimidazol a tetranitromethan použijí pro přípravu 0acetyl-tyrosylových zbytků a 3-nitro derivátů, v příslušném pořadí.
Karboxylové skupiny vedlejších řetězců (aspartylu nebo glutamylu) mohou být selektivně modifikované reakcí s ·· ·· ·· ·· ··»» • · · · · · 9 9 4 ···· ·»·· · * 4 4» 9944
444 4 4 9 444 44 4 4 karbodiimidy (R'-N=C=N-R'), jako je 1—cyklohexyl-3—(2morfolinyl- (4-ethyl) karbodiimid nebo l-ethyl-3- (4-azonia-4, 4dimethylpentyl)karbodiimid. Dále, aspartylové a glutamylové zbytky mohou být přeměněny na asparaginylové a glutaminylové zbytky reakci s ammoniovými ionty.
Glutaminylové a asparaginylové zbytky mohou být deamidovány na příslušné glutamylové a aspartylové zbytky. Alternativně mohou být tyto zbytky deamidovány za slabých acidíckých podmínek. Všechny formy těchto zbytků spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Cysteinylové zbytky mohou být nahrazeny aminokyselinovými zbytky nebo jinými skupinami, buď pro eliminaci disulfidové vazby nebo, naopak, pro stabilizaci zesítění. Viz, například, Bhatnagar etal. (1996), J. Med. Chem. 39:3814-9.
Derivatizace pomocí bifunkčních činidel jsou výhodné pro zesítění peptidů nebo jejich funkčních derivátů na matrici nerozustné ve vodě nebo na jiných makromolekulových vehikulech. Mezi běžně používaná zesíťovací činidla patří, například, 1,1-bis(diazoacetyl)-2-fenylethan, glutaraldehyd, estery N-hydroxysukcinimidu, například, estery s kyselinou 4azidosalicylovou, homobifunkční imidoestery, včetně disukcinimidylových esterů, jako je 3,3'-dithiobis(sukcinimidylpropionat), a bifunkční maleimidy, jako je bis-N-n-maleimido-1, 8-oktane. Derivatizační činidla, jako je methyl-3-[(p-azidofenyl)dithiolpropioimidát, vedou k zisku fotoaktivovatelných meziproduktů, které mohou tvořit zesítění za přítomnosti světla. Alternativně se pro imobilizaci proteinu použijí reaktivní matrice nerozpustné ve vodě, jako jsou kyanogenbromiděm-aktivované karbohydráty a reaktivní substráty popsané v U.S. Pat. č. 3,969,287; 3,691,016;
• · · · · • · • ·
4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; a 4,330,440.
Karbohydrátové (oligosacharidové) skupiny mohou být navázány na místa, která jsou známá jako glykosylační místa proteinů. Obecně, 0-vázané oligosacharidy jsou navázány na serin (Ser) nebo threonin (Thr), zatímco N-vázané oligosacharidy jsou vázány na asparagin (Asn), když jsou součástí sekvence Asn-X-Ser/Thx, kde X může být jakákoliv aminokyselina s výjimkou prolinu. X je výhodně jedna z 19 přirozených aminokyselin s výjimkou prolinu. Struktury Nvázaných a 0-vázaných oligosacharidů a sacharidových zbytků přítomných v každém typu jsou odlišné. Jedním typem sacharidu, který se vyskytuje v obou typech, je kyselina Nacetylneuraminová (označovaná jako kyselina sialová). Kyselina sialová je obvykle terminálním zbytkem jak N-vázaných, tak 0vázaných oligosacharidů, a v důsledku svého negativního náboje, může přispívat k aeidickým vlastnostem glykosylované sloučeniny. Taková místa mohou být inkorporována do spojovací sekvence sloučeniny podle předkládaného vynálezu a jsou výhodně glykosylována buňkou během rekombinantní produkce polypeptidové sloučeniny (například, v savčích buňkách, jako jsou CHO, BHK, COS). Nicméně, taková místa mohou být také glykosylována syntetickými nebo semi-syntetickými postupy známými v oboru.
Mezi další možné modifikace patří hydroxylace prolinu a lysinu, fosforyla.ee hydroxylové skupiny serylu nebo threonylu, oxidace síry v Cys, methylace α-amino skupiny vedlejšího řetězce lysinu, argininu a histidinu. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), str.79-86 (1983).
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být modifikovány také na úrovni DNA. DNA sekvence pro jakoukoliv část sloučeniny mohou být změněny na kodony, které jsou více kompatibilní s vybranou hostitelskou buňkou. Pro E. coli, která je výhodnou hostitelskou buňkou, jsou optimalizované kodony známé v oboru. Kodony mohou být substituované pro eliminaci restrikčních míst nebo pro vložení silentnich restrikčních míst, které mohou napomáhat při zpracování DNA ve vybrané hostitelské buňce. Vehikulum, spojovací sekvence a peptidová DNA sekvence mohou být modifikovány tak, aby obsahovaly jakoukoliv z uvedených změn.
Způsoby přípravy
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny v transformovaných hostitelských buňkách za použití technik rekombinantní DNA. Při tomto způsobu se připraví rekombinantní DNA molekula kódující peptid. Způsoby přípravy takových DNA molekul jsou dobře známé v oboru. Například, sekvence kódující peptidy mohou být excidovány z DNA za použití vhodných restrikčních enzymů. Alternativně může být DNA molekula syntetizována za použití technik chemické syntézy, jako je fosforamidátová metoda. Také může být použito kombinace těchto technik.
Vynález také poskytuje vektor schopný zprostředkovat expresi peptidů ve vhodném hostiteli. Vektor obsahuje DNA molekulu, která kóduje peptid operativně navázaný na vhodné expresní kontrolní sekvence. Způsoby provádění takové operativní vazby, buď před, nebo poté, co je DNA molekula insertována do vektoru, jsou dobře známé. Mezi expresní kontrolní sekvence patří promotéry, aktivátory, zesilovače transkripce, operátory, vazebná místa pro ribosomy, start signály, stop signály, signály pro čepičky, polyadenylační • · · · • · · · · • · ·· ·· ·· signály a jiné signály podílející se na řízení transkripce nebo translace.
Získaný vektor obsahující DNA molekulu se použije pro transformaci vhodného hostitele. Tato transformace může být provedena za použití způsobů dobře známých v oboru.
Jakákoliv z mnoha dostupných a známých hostitelských buněk může být použita při provádění předkládaného vynálezu. Výběr konkrétního hostitele závisí mnoha faktorech známých v oboru. Mezi tyto faktory patří, například, kompatibilita s vybraným expresím vektorem, toxicita peptidů kódovaných DNA molekulou, rychlost transformace, snadnost získání peptidů, charakteristiky exprese, biologická bezpečnost a cena.
Rovnováha mezi těmito faktory musí být doprovázena pochopeníinO toho, že ne všichni hostitelé jsou stejně účinní pro expresi konkrétní DNA sekvence. Podle tohoto obecného návodu patří k vhodným mikrobiálním hostitelům bakterie (jako je E. coli sp.), kvasinky (jako je Saccharomyces sp.) a jiné houby, hmyzí, rostlinné a savčí (včetně lidských) buňky v kultuře, nebo další hostitelé známí v oboru.
Potom se transformovaný hostitelský organismus kultivuje a přečistí. Hostitelské buňky mohou být kultivovány za vhodných podmínek fermentace tak, aby byla exprimována požadovaná sloučenina. Takové fermentační podmínky jsou dobře známé v oboru. Nakonec se peptidy přečistí z kultury za použití způsobů dobře známých v oboru.
Sloučeniny mohou také být připraveny syntetickými způsoby. Například může být použita technika syntézy na pevné fázi. Vhodné techniky jsou dobře známé v oboru a patří mezi ně techniky popsané v Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, str.
335-61 (Katsoyannis and Panayotis ed.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis et al. (1985), Biochem. Int J. 10: 394-414; Stewart a Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis: U.S. Pat. č. 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3. vyd.) 2: 105-253; a Brickson et al. (1976), The Protelns (3. vyd.) 2: 257-527. Syntéza na pevné fázi je výhodnou technikou pro přípravu jednotlivých peptidů, protože je nejlevnější technikou pro přípravu malých peptidů.
Sloučeniny, které obsahují derivatizované peptidy nebo které obsahují nepeptidové skupiny, mohou být syntetizovány dobře známými technikami organické chemie
Použití sloučenin
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mají farmakologickou aktivitu v důsledku jejich interakce s PTH-1 receptorem nebo PTH-2 receptorem. Mannstadt et al. (1999), Am. J. Physiol. 277. 5Pt2. F665-75. PTH. a jeho agonisté zvyšují resorpci kosti, zvyšují renální reabsorpci vápníku, snižují proliferaci epidermu a snižují růst vlasů. Holick et al.
(1994) Proč. Nati. Sci. USA 91(17): 8014-6; Schilli et al. (1997), J. Invest. Dermatol. 108(6): 928-32. Tak jsou antagonisté PTH-1 receptoru a/nebo PTH-2 receptoru použitelní v léčbě • primárního a sekundárního hyperparathyroidismu;
• hyperkalcemie, včetně hyperkalcemie v důsledku solidních nádorů (prsu, plic a ledvin) a hematologických malignit (mnohotného myelomu, lymfomu a leukemie); idiopatické hyperkalcemie a hyperkalcemie asociované s hyperthyroidismem a poruchami ledvin;
• nádorových metastas, zejména metastas do kostí, a zejména metastas při karcinomu prsu a prostaty;
• · · · · · • kachexie a anorexie, zejména asociované s nádory;
• osteopenie, která souvisí s aberantní signalizací na PTH receptoru, včetně různých forem osteoporosy, jako je:
— primární osteoporosa;
— post-menopausální a stařecká osteoporosa;
— endokrinní osteoporosa (hyperthyroidismus, hyperparathyroidismus, Cushingův syndrom a akromegalie);
— hereditární a kongenitální formy osteoporosy (například, osteogenesis imperfecta, homocysteinurie, Menkesův syndrom a Riley-Den syndrom.) ;
— osteoporosa v důsledku imobilizace končetin;
— osteoporosa sekundární při jiných onemocněních, jako je hemochromatosa, hyperprolaktinemie, anorexia nervosa, thyreotoxikosa, diabetes mellitus, celiakie, zánětlivá onemocnění střevní, primární biliární cirhosa, revmatoidní artritida, ankylosující spondylitisa, mnohotný myelom, lymfoproliferativní onemocnění a systémová mastocytosa;
— osteoporosa sekundární při chirurgickém výkonu (například, gastrektomii) nebo lékové terapii, jako je chemoterapie, antikonvulzivní terapie, imunosupresivní terapie a antikoagulační terapie;
— osteoporosa sekundární při léčbě glukokortikosteroidy při onemocněních jako je revmatoidní artritida (RA), systémový lupus erythematodes (S1E), asthma, arteritis temporalis, vasculitis, chronická obstrukční nemoc bronchopulmonální, polymyalgia reumatica, polymyositis, chronická intersticiální plicní fibrosa;
— osteoporosa sekundární při léčbě glukokortikosteroidy a/nebo imunomodulačními léky při prevenci orgánové rejekce po transplantaci orgánů, jako je ledviny, játra, plíce, srdce;
— osteoporosa způsobená nedostatkem gravitace, jako je osteoporosa u kosmonautů;
— osteoporosa asociovaná s maligním onemocněním, jako je ·♦ · · · · · · ··*· • · · · · · · • · · · · · · « • ·· · · «>·· ·· · · karcinom prsu, karcinom prostaty;
• Pagetova nemoc kostí (osteitis deformans) u dospělých a mladistvých;
• osteomyelitis nebo infekční léze v kosti, která vede ke ztrátě kostní hmoty;
• osteopenie po chirugickém výkonu, indukovaná steroidy a asociovaná s onemocněními tenkého a tlustého střeva a s chronickými nemocemi jater a ledvin.
• Osteonekrosy nebo nekrosy kostních buněk asociované s traumatickým poraněním nebo netraumatická nekrosa asociovaná s Gaucherovou nemocí, srpkovitou anemií, systémovým lupus erythematodes, revmatoidní artritidou, onemocněním periodontu, osteolytickými metastasami a jinými stavy;
• alopecie (deficitu růstu vlasů nebo úplné nebo částečné ztrátě vlasů), včetně androgenní alopecie (mužské plešatosti), toxické alopecie, alopecia senilis, alopecia areata, alopecia pelada a trichotillomanie;
a podobně.
Existují další onemocnění, kdy bude pro pacienta přínosem aktivita PTH nebo PTHrP. Pro tyto indikace jsou agonisté PTH receptoru použitelní jako terapeutická léčba. Konkrétně mezi takové indikace patří hojení zlomenin (včetně hojení nereponovaných zlomenin, osteopenie, včetně různých forem osteoporosy, jako je:
— primární osteoporosa;
— post-menopausální a stařecká osteoporosa;
— endokrinní osteoporosa (hyperthyroidismus, hyperparathyroidismus, Cushingův syndrom a akromegalie);
— hereditární a kongenitální formy osteoporosy (například, osteogenesis imperfecta, homocysteinurie, Menkesův syndrom a Riley-Den syndrom) ;
— osteoporosa v důsledku imobilizace končetin;
• «9 * * · · 99 · 9 · ·
9999 9 9 9 9 u 9 9 « m · 9 9 4«
9 9 9 9 9 · 9 9 »
9· 9 9 9 9 9 9 9
9999999 99 «<·· 99 9« — osteoporosa sekundární při jiných onemocněních, jako je hemochromatosa, hyperprolaktinemie, anorexia nervosa, thyreotoxikosa, diabetes mellitus, celiakie, zánětlivá onemocnění střevní, primární biliární cirhosa, revmatoidní artritida, ankylosující spondylitisa, mnohotný myelom, lymfoproliferativní onemocnění a systémová mastocytosa;
— osteoporosa sekundární při chirurgickém výkonu (například, gastrektomii) nebo lékové terapii, jako je chemoterapie, antikonvulzivní terapie, imunosupresivní terapie a antikoagulační terapie;
— osteoporosa sekundární při léčbě glukokortikosteroidy při onemocněních jako je revmatoidní artritida (RA), systémový lupus erythematodes (SLE), asthma, arteritis temporalis, vasculitis, chronická obstrukční nemoc bronchopulmonální, polymyalgia reumatica, polymyositis, chronická intersticiální plicní fibrosa;
— osteoporosa sekundární při léčbě glukokortikosteroidy a/nebo imunomodulačními léky při prevenci orgánové rejekce po transplantaci orgánů, jako je ledviny, játra, plíce, srdce;
— osteoporosa způsobená nedostatkem gravitace, jako je osteoporosa u kosmonautů;
— osteoporosa asociovaná s maligním onemocněním, jako je karcinom prsu, karcinom prostaty.
PTH agonisté s prodlouženým poločasem (například vázaní na Fc domény) mohou být použiti s inhibitorem resorpce kosti.
Mezi inhibitory resorpce kosti patří OPG a OPG deriváty, OPG-L (RANKL) protilátka, calcitonin (například, Miacalcin®, Calcimar®), bisfosfonáty (například, APD, alendronat, risedronat, etidronat, pamidronat, tiludronat, clodronat, neridronat, ibandronat, zoledronat), estrogeny (například, Premarin®, Estraderm®, Prempro®, Alora®, Climara®, Vivelle®, Estratab®, Ogen®), selektivní modulátory estrogenního • # ·*·Φ • 4 * receptoru (například, raloxifen, droloxifen, lasofoxifen), tibolon, a podobně. Příkladné inhibitory resorpce kosti jsou popsány v WO 98/46751 a WO 97/23614, které jsou zde uvedeny jako odkazy.
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být použity v monoterapii pro léčbu osteoporosy a je také je možné použití k léčbě PTH-Fc také další antiresorpční činidla, která zvýší jak jejich účinnost, tak velikost terapeutického okna. Jak PTH, tak PTH-Fc zvyšují jak tvorbu kostí, tak resorpci kostí. Schopnost antiresorpčních činidel blokovat osteoklastickou odpověď může limitovat hyperkalcemické účinky PTH-Fc a může také zvyšovat kostní hmotu.
Farmaceutické prostředky
Obecně. Předkládaný vynález také poskytuje způsoby použití farmaceutických prostředků obsahujících sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Takové farmaceutické prostředky mohou být podávány injekční nebo orální, plicní, nasální, transdermální nebo jinou cestou. Obecně vynález zahrnuje farmaceutické prostředky obsahující účinné množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu společně s farmaceuticky přijatelnými ředidly, konzervačními činidly, solubilizačními činidly, emulgačními činidly, adjuvans a/nebo nosiči. Takové prostředky obsahují ředidla s různým obsahem pufrů (například, Tris-HCl, acetát, fosfát) , pH a iontovou sílou; aditiva, jako jsou detergenty a solubilizační činidla (například, Tween 80, Polysorbate 80), anti-oxidační činidla (například, kyselinu ascorbovou, metabisiřičitan sodný), konzervační činidla (například, Thimersol, benzylalkohol) a substance zvyšující objem (například, laktosu, manitol); inkorporace materiálu do konkrétního prostředku polymerní sloučeniny, jako je kyselina polymléčná, polyglykolová atd., nebo do liposomů. Také může být použita kyselina hyaluronová a tato může podporovat delší setrvání prostředku v cirkulaci. Takové prostředky mohou ovlivňovat fyzikální stav proteinů a derivátů podle předkládaného vynálezu, jejich stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost eliminace in vivo. Viz, například, Remington7s Pharmaceutical Sciences 18. vyd. {1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), str. 1435-1712, které jsou zde uvedeny jako odkaz. Prostředky mohou být připraveny v kapalné formě nebo ve formě sušeného prášku, jako je lyofilizovaná forma. Vynález také zahrnuje implantovatelné prostředky s prodlouženým uvolňováním, jako jsou transdermální prostředky.
Podávání sloučeniny podle předkládaného vynálezu dvakrát týdně je lepší než denní injekce PTH (1-34) z hlediska zvýšení počtu osteoblastů, objemu kosti a minerální hustoty kosti u hlodavců. Podávání PTH-(1-34)-Fc dvakrát týdně způsobuje vyšší zvýšení density kosti a objemu kosti ve srovnání s denním podáváním PTH-(1-34). (Viz Obr. 10.) V modelu osteoporosy na stárnoucích OVX krysách bylo podávání dvakrát týdně schopné o více než 50% zvrátit ztrátu kosti indukovanou jedním rokem estrogenové ablace. Efekt pozorovaný na modelu stárnoucích krys byl ještě vyšší, když byla léčba kombinována s bisfosfonátem (APD)). U krys způsobila jediná SC injekce PTH(1-34)-Fc (340 nmol/kg) hyperkalcemickou odpověď, která přetrvávala 72 hodin (Obr. 8). Tato doba odpovídá rychlosti eliminace PTH-(1-34)-Fc ze séra a je v souladu s optimálním režimem podání u myší (dvakrát týdně).
Optimální dávkování pro primáty bude ještě méně časté oproti podávání krysám nebo myším. Podání jednou týdně (nebo méně) může být optimální pro primáty, podle zjištění, že • · · · hyperkalcemická odpověď OVX makaků na jedinou podkožní injekci PTH-(1-34)-Fc (10-34 nmol/kg) přetrvává po dobu přibližně 168 hodin (Obr. 11). Toto zjištění naznačuje, že jediná podkožní dávka PTH-(1-34)-Fc u primátů je eliminována za přibližně 1 týden, což také představuje maximální frekvenci aplikací nutnou pro anabolické efekty.
Orální dávkové formy. Vynález zahrnuje orální pevné dávkové formy, které jsou popsány obecně v kapitole 89 Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18th Ed., Mack Publishing Co. Easton PA 18042, která je zde uvedena jako odkaz. Mezi pevné dávkové formy patří tablety, kapsle, pilulky, pastilky, váčky s práškem a pelety. Pro prostředky podle předkládaného vynálezu může být také použito obalení v liposomech nebo proteinoidním obalu (ajk je tomu, například, v proteinoidních mikrosférách popsaných v U.S. Patentu č. 4,925,673). Může být použito liposomální enkapsulace a liposomy mohou být derivatizovány za použití různých polymerů (například, U.S. Patent č. 5,013,556). Popis možných pevných dávkových forem pro terapeutika je uveden v kapitole 10 v Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), ed. G. S. Bankéř a C. T. Rhodes, která je zde uvedena jako odkaz. Obecně prostředky obsahují sloučeninu podle předkládaného vynálezu a inertní přísady, které umožňují ochranu před žaludečním prostředím a uvolňování biologicky aktivního materiálu ve střevu.
Vynález také specificky poskytuje orální dávkové formy pro sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Pokud je to nutné, mohou být sloučeniny chemicky modifikované tak, aby bylo orální podání účinné. Obecně je chemickou modifikací navázání alespoň jedné skupiny na sloučeninu, kde uvedená skupina umožňuje (a) inhibicí proteolýzy; a (b) přechod sloučeniny do cirkulace ze žaludku nebo střeva. Také je žádoucí zvýšení celkové stability sloučeniny a zvýšení jejího cirkulačního poločasu. Skupiny použité jako kovalentně navázaná vehikula v předkládaném vynálezu mohou být také použity pro tento účel. Příklady takových skupin jsou: PEG, kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulosa, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon a polyprolin. Viz, například, Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg a Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, str. 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4:185-9. Dalšími polymery, které mohou být použity, jsou poly-1,3-dioxolan a poly-1,3,6tioxocan. Výhodné pro farmaceutické použití jsou, jak bylo uvedeno výše, PEG skupiny.
Pro orální dávkové formy je také možno použít soli modifikované alifatické aminokyseliny, jako je natrium-N-(8[2-hydroxybenzoyl]amino)kaprylát (SNAC), jako nosiče pro zesílení absorpce terapeutické sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Klinická účinnost heparinového prostředku za použití SNAC byla prokázána ve studii fáze II provedené společností Emisphere Technologies. Viz US Patent č. 5,792,451, Oral drug delivery composition and methods.
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být obsaženy v prostředku ve formě jemných částic, jako jsou granule nebo pelety velikosti přibližně 1 mm. Přípravek pro podání ve formě kapslí může být také ve formě prášku, mírně slisovaných vrstev nebo tablet. Léčiva mohou být připravena lisováním.
Prostředek může obsahovat barviva a chuťová korigens. Například, protein (nebo derivát) může být nejprve připraven (například ve formě liposomu nebo mikrosféry) a potom může být zapracován do poživatelného produktu, jako je chlazený nápoj • · · · · · ·· ···· ·· ·· obsahující barviva a chuťová korigens.
Je možné naředit nebo zvýšit objem sloučeniny podle předkládaného vynálezu za použití inertního materiálu. Mezi taková ředidla patří karbohydráty, zejména mannitol, Cllaktosa, bezvodá laktosa, celulosa, sacharosa, modifikovaný dextran a škrob. Některé anorganické soli mohou být také použity jako plniva, včetně fosforečnanu vápenatého, uhličitanu hořečnatého a chloridu sodného. Mezi komerčně dostupná ředidla patří Fast-Ho, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress a Avicell.
Pevné dávkové formy mohou obsahovat činidla podporující rozpadavost. Mezi materiály, které mohou být použity jako činidla podporující rozpadavost, patří například škroby, včetně komerčních činidel podporujících rozpadavost na bázi škrobů, jako je Explotab. Glykolát škrob sodný, Amberlite, karboxymethylcelulosa sodná, ultramylopektin, naťrium-alginát, želatina, pomerančová kůra, kyselá karboxymethylcelulosa, hubky a bentonint, jsou dalšími vhodnými činidly. Jinou formou činidel podporujících rozpadavost jsou nerozpustné kationtové iontoměničové pryskyřice. Práškové klovatiny mohou být použity jako činidla podporující rozpadavost a mezi taková činidla patří práškové klovatiny jako je agar, Karaya nebo tragant. Kyselina alginová a její sodná sůl jsou také použitelné jako činidla podporující rozpadavost.
Pojivá mhou být použita pro udržení terapeutického činidla pohromadě za zisku tuhé tablety a patří mezi ně materiály z přírodních produktů, jako je arabská klovatina, tragant, škrob a želatina. Mezi další materiály patří methylcelulosa (MC), ethylcelulosa (EC) a karboxymethylcelulosa (CMC). Polyvinylpyrrolidon (PVP) a hydroxypropylmethylcelulosa (HPMC)
mohou být použity v alkoholových roztocích pro granulování terapeutického činidla.
Činidla snižující tření mohou být obsažena v prostředcích pro prevenci slepování během přípravy. Kluzná činidla mohou být použita jako vrstva mezi terapeutickým činidlem a stěnou kádinky a mezi taková činidla patří, například; kyselina stearová, včetně její hořečnaté a vápenaté soli, polytetrafluorethylen (PTFE), kapalný parafin, rostlinné oleje a vosky. Může být také použito solubilní kluzné činidlo, jako je lauryl síran sodný, lauryl síran hořečnatý, polyethylenglykol různé molekulové hmotnosti, Carbowax 4000 a 6000.
Také mohou být použity maziva, které mohou zlepšit tekutost prostředku během přípravy a napomoci přeskupení během lisování. Mezi takové sloučeniny patří škrob, talek, pyrogenní oxid křemičitý a hydratovaný silikoaluminát.
Pro usnadnění rozpouštění sloučeniny podle předkládaného vynálezu ve vodném prostředí může být přidán surfaktant jako smáčivé činidlo. Surfaktanty mohou být aniontové detergenty, jako je lauryl síran sodný, dioktyl-natrium-sulfosukcinát a dioktyl-natrium-sulfonát. Mohou být použity také kationtové detergenty, jako je benzalkoniumchlorid nebo benzethoniumchlorid. Mezi potenciální neiontové detergenty, které mohou být použity v prostředku jako surfaktanty, patří lauromacrogol 400, polyoxyl 40 stearáte, polyoxyethylen hydrogenovaný ricinový olej 10, 50 a 60, glycerol-monostearát, polysorbát 40, 60, 65 a 80, ester sacharosy a mastné kyseliny, methylcelulosa a karboxymethylcelulosa. Tyto surfaktanty mohou být přítomny v přípravku proteinu nebo jeho derivátu buď samostatně, nebo ve směsi v různých poměrech.
• · · ·
Prostředek může také obsahovat přísady, které zvyšují vychytávání sloučeniny. Mezi přísady mající tento účinek patří například mastné kyseliny kyselina olejová, kyselina linoleová a kyselina linolenová.
Může být žádoucí příprava prostředku s řízeným uvolňováním. Sloučenina podle předkládaného vynálezu může být také zapracována do inertní matrice, která umožňuje její uvolňování buď prostřednictvím difuse, nebo odpolavováním, například do klovatiny. Pomalu se rozpadající matrice mohou být také zapracovány do prostředku a těmito mohou být například algináty nebo polysacharisy. Jinou formou řízeného uvolňování sloučeniny podle předkládaného vynálezu je prostředek na bázi Oros terapeutického systému(Alza Corp.), ve kterém je aktivní složka uzavřena v semipermeabilní membráně, která umožňuje průnik vody do prostředku a vytlačování aktivní složky prostřednictvím malých otvorů v důsledku osmotického efektu. Některé enterální potahy způsobují také zpomalení uvolňování.
Prostředky mohou být také opatřeny dalšími potahy. Mezi takové potahy patří různé sacharidy, které mohou být naneseny v potahovací pícce. Terapeutické činidlo může být také aplikováno v tabletě potažené filmem a materiály požívané pro tento účel mohou být rozděleny na dvě skupiny. První jsou nonenterální materiály, jako je methylcelulosa, ethylcelulosa, hydxoxyethylcelulosa, methylhydroxy-ethylcelulosa, hydroxypropylcelulosa, hydroxypropyl-methylcelulosa, karboxymethylcelulosa sodná, providon a polyethylenglykoly. Do druhé skupiny patří enterální materiály, jako jsou běžné estery kyseliny ftalové.
Pro optimální filmový potah může být použito směsi • ♦ · · · · materiál. Potahování filmem může být provedeno na potahovací pánvi nebo ve fluidním loži nebo může být použito potahování lisováním.
Prostředky pro plicní podání. Vynález také předpokládá plicní podání proteinu podle předkládaného vynálezu (nebo jeho derivátu). Protein (nebo jeho derivát) je podán do plic savce prostřednictvím inhalace a přenosem přes plicní epitel do krevního řečiště, (další literatura viz Adjei et al., Pharma. Res. (1990)7:565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135-44 (leuprolid-acetát); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (suppl.5): s.143-146 (endothelin-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3:20612 (al-antitrypsin); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (al-proteinasa); Oswein et al. (March 1990), Aerosolization of Proteins, Proč. Symp. Resp. Drug Delivery II Keystone, Colorado (rekombinantní lidský růstový hormon); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140:3482-8 (interferon-γ a tumor nekrosis faktor a) a Platz et al., U.S. Patent č. 5,284,656 (faktor stimulující kolonie granulocytů).
Předkládaný vynález předpokládá použití různých mechanických prostředků navržených pro plicní podání terapeutických produktů, jako je nebulizátory, inhalátory pro aplikaci určité dávky a inhalátory prášku, které jsou známé odborníkům v oboru. Některé specifické příklady komerčně dostupných prostředků jsou Ultravent nebulizer, vyráběný firmou Mallinckrodt, lne., St. Louis, Missouri; Acorn II nebulizer, vyráběný firmou Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin inhalátor s odměřitelnou dávkou, vyráběný firmou Glaxo lne., Research Triangle Park, North Carolina; a Spinhaler inhalátor prášku, vyráběný firmou Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Všechny takové prostředky vyžadují použití prostředku vhodného pro aplikaci sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Obvykle je každý prostředek specifický pro aplikační zařízení a může využívat různých hnacích plynů a ředidel, adjuvans a/nebo nosičů použitelných v terapii.
Sloučenina podle předkládaného vynálezu je nejlépe připravena ve formě částic s průměrnou velikostí částic méně než 10 pm (nebo mikronů), nejvýhodněji 0,5 to 5 pm, pro nejúčinnější podání do distální části plic.
Mezi farmaceuticky přijatelné nosiče patří karbohydráty, jako je trehalosa, manitol, xylitol, sacharosa, laktosa a sorbitol. Mezi další složky použitelné v prostředcích patří DPPC, DQPE, DSPC a DOPC. Mohou být použity přirozené nebo syntetické surfaktanty. Může být použit PEG (i přes jeho použití při derivatizaci proteinů a analogů). Mohou být použity dextrany, jako je cyklodextran. Mohou být použity žlučové soli a jiné enhancery. Mohou být použity deriváty celulosy a celulosa. Mohou být použity aminokyseliny, například v pufrovaném přípravku.
Předpokládá se též použití liposomů, mikrokapslí a a mikrosfér, inklusních komplexů a jiných nosičů.
Prostředky vhodné pro použití v nebulizátoru, tryskovém nebo ultrazvukovém, obvykle obsahují sloučeninu podle předkládaného vynálezu rozpuštěnou ve vodě v koncentraci přibližně 0,1 až 25 mg biologicky aktivního proteinu na ml roztoku. Prostředky mohou také obsahovat pufr a jednoduchý cukr (například pro stabilizaci proteinu a regulaci osmotického tlaku). Prostředek pro nebulizátor může také obsahovat surfaktant pro snížení nebo prevenci agregace proteinu způsobené atomizací roztoku při vzniku aerosolu.
Prostředky vhodné pro použití v inhalačním prostředku s odměřitelnou dávkou budou obvykle obsahovat jemně dělený prášek obsahující sloučeninu podle předkládaného vynálezu suspendovanou v hnacím plynu za použití surfaktantu. Hnacím plynem může být jakýkoliv materiál běžně používaný pro tento účel, jako je chlorfluorkarbon, hydrochlorfluorkarbon a hydrofluorkarbon, nebo hydrokarbon, včetně trichlorfluormethanu, dichlordifluormethant, dichlortetrafluorethanolt a 1,1,1,2-tetrafluorethant, nebo jejich kombinace. Mezi vhodné surfaktanty patří sorbitantrioleát a sojový lecitin. Kyselina olejová může být také použita jako surfaktant.
Prostředky určené pro aplikaci ze zařízení pro inhalaci prášku budou obsahovat jemně dělený suchý prášek obsahující sloučeninu podle předkládaného vynálezu a mohou také obsahovat činidlo upravující objem, jako je laktosa, sorbitol, sacharosa, manitol, trehalosa nebo xylitol, v množstvích, která usnadňují dispergování prášku z prostředku, například, až 90% hmotnostních prostředku.
Formy pro nasální podání. Předkládaný vynález také zahrnuje nasální podání sloučeniny podle předkládaného vynálezu.
Nasální podání umožňuje průnik proteinu do krevního řečiště přímo po podání terapeutického produktu do nosu, bez nutnosti průniku produktu do plic. Mezi prostředky pro nasální podání patří prostředky obsahující dextran nebo cyklodextran. Podání pomocí transportu přes jiné slizniční membrány se také předpokládá.
• 0 · · · ····
Dávkování. Dávky použité při léčbě výše uvedených onemocnění budou určeny ošetřujícím lékařem, po zvážení různých faktorů, které mohou modifikovat působení léku, jako je například věk, celkový stav, tělesná hmotnost, pohlaví a dietní zvyklosti pacienta, závažnost jakékoliv infekce, doba podání a další klinické faktory. Obecně bude dávka v rozmezí 0,1-1000 pg sloučeniny podle předkládaného vynálezu na kilogram tělesné hmotnosti, výhodně 0,1-150 pg/kilogram.
Předkladatelé vynálezu určily výhodné struktury pro výhodné peptidy uvedené v následující tabulce 4. Symbol A může být jakákoliv spojovací sekvence popsaná výše nebo může představovat normální peptidovou vazbu (tj. spojovací sekvence není přítomná). Tandemové repetitivní sekvence a spojovací sekvence jsou separovány pomlčkami.
Tabulka 4 — Výhodná provedení
“ —- Ί1 ; Sekvence/struktura Popis peptidů SEQ ID NO:
SVSEfQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQO VHNF-A-F1 PTH (1-34) 161
SVSEIQLMHNRGKHLNSMERVEWLRKKLQD VHNF-A-F1 (L11R) PTH (1-34) 162
SVSEIQLMHNKGKHLNSMERVEWLRKKLQD VHNF-A-F1 (L11K) PTH (1-34) 163
SVSE1QLMHNLGKHLNSMRRVEWLRKKLQD VHNF-A-F1 (E19R) PTH (1-34) 164
SVSE1QLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD V-A-F1 PTH (1-31) 165
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD- A-F1 PTH . (1*30) 166
F’-A- SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQ PTH (1-29) 167
f1-a- SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKL PTH (1-28) 168
llhnlgksiqdlrrrfflhhliaeihta-a-f1 (D10N.K11L) PTHrP (7-34) 169
slaladdaafrerarllaalerrhwlnsy 1 MHKLLVLDAP-A-F1 TIP39 170
F je Fc doména, jak byla definována výše. Kromě sloučenin • · ·· ·· ·· · · · · uvedených v tabulce 4 předkladatelé vynálezu dále předpokládají použití heterodimerů, ve kterých je každý řetězec Fc dimeru navázán na jinou peptidovou sekvenci; například, molekuly, ve které může být jeden řetězec popsán SEQ ID NO: 166 a druhý může být popsán SEQ ID NO: 170 nebo může být navázán prostřednictvím Fc na jakoukoliv sekvenci z tabulek 1 a 2.
Všechny sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny způsoby popsanými v PCT přihlášce č. WO 99/25044.
Vynález bude nyní popsán v následujících příkladech, které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Biologická aktivita agonisty PTH/PTHrP receptoru (PTH-R1) konjugovaného na Fc [PTH-(1-34)-Fcl
Úvod
Parathyroidální hormon [PTH-(1-34) nebo nativní PTH(l-84)] zvyšuje tvorbu kosti a zvyšuje kostní hmotu při denním injekčním podávání. Dříve se předpokládalo, že tento anabolický efekt vyžaduje krátkou expozici PTH, která je snadněna jeho krátkým poločasem (méně než 1 hodina). Klinicky vyžaduje anabolický efekt terapie PTH denní SC injekce, což je značnou překážkou pro masové používání PTH. Méně časté injekce PTH by byly klinicky žádoucí a byly by možné při prodloužení poločasu PTH in vivo. Krátkodobá (intermitentní) expozice PTH (<1 h/den) stimuluje osteoblastickou tvorbu kosti, zatímco dlouhodobá (kontinuální) expozice (>2 h/den) stimuluje • ·» ·· ·· · · • · · · · ······ ·· · · · · osteklastickou resorpci kosti (Dobnig et al., Endocrinology 138: 4607,1998). Znalosti z oboru naznačují, že PTH s prodlouženým poločasem zvyšují resorpci kosti a vedou k hyperkalcemii. Nicméně, je možné bránit PTH-indukované osteoklastické aktivita pomocí inhibitorů resorpce kosti. Osteoprotegerin (OPG) může být velmi vhodný pro tento účel. Jediná dávka OPG-Fc podaná krysám, myším nebo lidem způsobuje dlouhodobou resorpci kosti, v důsledku eradikace populace osteklastů. Současné podání účinného inhibitoru resorpce kosti, jako je OPG, může mít ještě větší vliv. Tento režim by měl teoreticky umožnit stimulaci tvorby kosti prostřednictvím PTH, což povede ke zvýšení kostní hmoty. Je pravděpodobné, že jiné inhibitory resorpce kosti, včetně bisfosfonátů nebo estrogenu, budou také inhibovat PTH-indukovanou resorpci kosti a proto by mohly být požity v kombinaci s dlouhodobě působící PTH molekulou. Pro tento účel jsme klonovaly, exprimovaly a přečistily lidský PTH-(1-34)-Fc. Fc konjugace proteinů způsobuje významné zvýšení jejich cirkulačního poločasu, což může umožnit injekční podávání PTH-(1-34)-Fc v podobném režimu jako OPG-Fc. Mezi výhody předkládaného vynálezu patří méně časté injekce PTH, ve srovnání se současným standardem (jedno za den) pouze čtvrtinové.
Materiály, způsoby a výsledky
Test na hyperkalcemii
Testovaly jsme účinnost a trvání účinku PTH-(1-34)-Fc v myším modelu hyperkalcemie. Stručně, myším se injekčně podaly SC různé dávky PTH-(1-34) nebo PTH-(1-34)-Fc a periferní krev se odebírala z retroorbitálního sinu pro stanovení koncentrace ionizovaného vápníku v krvi. Poločas a účinnost PTH-(1-34)-Fc byly vyšší než pro PTH-(1-34), jak je • « · · • · · · « · · · · ··«· ······· · · · · · · ·· ·· dokázáno delší hyperkalcemickou reakcí myší než pro známá činidla (Obr. 4). Hyperkalcemie indukovaná PTH-(1—34) přetrvávala 6-24 h, zatímco ekvimolární dávky PTH-{1-34)-Fc způsobovaly delší hyperkalcemii (48-72 h). Toto trvání odpovědi je v souladu s delším poločasem PTH-(1-34)-Fc konstruktu vs. PTH-(l-34). Účinnost PTH-(1-34)-Fc byla také významně vyšší než účinnost PTH-(l-34) (Obr. 4). Nejvyšší dávka PTH-(1-34)-Fc způsobila vyšší zvýšení v píku koncentrace ionizovaného vápníku než ekvimolární dávka PTH-(1-34). Analýza plochy pod křivkou (AUC) prokázala, že při nejvyšší použité dávce způsoboval PTH-(1-34)-Fc 2,6-vyšší hyperkalcemickou reakcí než ekvimolární dávka PTH(1-34).
Anabolický test
Po prokázání lepší farmakologie a poločasu PTH-(1-34)-Fc ve srovnání s PTH-(1-34) jsme provedly pilotní studii pro stanovení toho, zda současná terapie PTH-(1-34)-Fc a OPG-Fc zvyšují kostní hmotu. Stručně 6-měsíční samci Sprague Dawley (SD) krys se rozdělily do skupin po 6. Základní minerálová kostní densita (BMD) se určila podle třetího bederního obratle (L3) u všech krys za použití rentgenové absorpce při duální energii záření (DEXA) (Den 0). Krysy se potom léčily podle následujícího protokolu:
Skupina 1: Vehikulum (PBS, injikováno SC, Dny 1,3 a 5)
Skupina 2: OPG-Fc, jediná SC injekce (1 mg/kg) v Den 1
Skupina 3: PTH-(1-34), SC injekce v Dny 1,3 a 5, v dávce 20 nM PTH/kg/injekci. Toto představuje optimální anabolický režim podání PTH.
Skupina 4: Stejně jako skupina 3, ale s jedinou OPG-Fc injekcí v Den 1.
Skupina 5: Jediná SC injekce PTH-(1-34)-Fc v dávce 60 nM/kg, v • ·» · · ·· · · « · · · · ··«· ««· ···· ·· ···· ·· ··
Den 1. Toto představuje molární dávku, která je ekvivalentní celkové dávce PTH-(1-34) dané skupině 3, ale v jediné injekci. Skupina 6: Stejně jako skupina 5, ale s jedinou OPG-Fc injekcí (SC, 1 mg/kg) v Den 1.
DEXA lumbální páteře se provedla v den 7 pro hodnocení změn v BMD. BMD v L3 se zvýšila mírně ve skupině s jedinou injekcí OPG-Fc, nebo se 3 injekcemi PTH-(1-34), ve srovnání s krysami léčenými PBS (Obr. 5). PTH-(1-34) + OPG způsobily vyšší zvýšení BMD ve srovnání s jedinou injekcí buď OPG, nebo PTH(1-34) samostatně. V monoterapii jediná injekce PTH-(1-34)-Fc nezvýšila BMD. Nicméně, jediná injekce PTH-(1-34)-Fc plus jediná injekce OFG-Fc způsobila signifikantní zvýšení BMD (Obr. 5). Tento výsledek podporuje předpoklad, že PTH konstrukt s prodlouženým cirkulačním poločasem mže být kombinován s účinným antiresorpčním činidlem, jako je OPG-Fc, za zisku anabolické odpovědi ve skeletu. Anabolický účinek jediné aplikace PTH-(1-34)-Fc plus OPC-Fc byl vyšší než účinek indukovaný mnoha injekcemi PTH-(1-34), s nebo bez současné aplikace OPG-Fc. Největší zisk v BMD byl dosažen při málo frekventovaném injekčním podání PTH-(1-34)-Fc + OPG-Fc, kde tato léčba byla lepší než léčba PTH-(1-34), který musí být injekčně aplikován denně nebo každý druhý den.
Obr. 5 ukazuje vliv PTH-Fc + OPG-Fc na minerální hustotu kosti (BMD) ve třetím bederním obratlů (L3). Normální 6-měsíců staré krysy (samci) se léčily PTH-Fc nebo PTH nebo vehikulem za použití jediné SC injekce. Některým krysám se také podala jediná SC injekce OPG. BMD se určila o 7 dnů později za použití DEXA. Data představují průměry ± SD, n =6 krys/skupinu.
Příklad 2: Biologická aktivita antagonisty PTH/PTHrP receptoru •9 99 9« · 9 9 ·
999 5 99 9* 999* (PTH-Rl) ([AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc) .
Úvod
Některá onemocnění jsou asociovaná se zvýšením koncentrace PTH nebo PTHrP v cirkulaci. Primární a sekundární hyperparathyroidismus (PHPT a SHPT, v příslušném pořadí), jsou asociované se zvýšenými koncentracemi PTH, zatímco humorální hyperkalcemie při malignitách (HuM) je důsledkem zvýšení koncentrace PTHrP. Oba proteiny signalizují prostřednictvím společného PTH/PTHrP receptoru (PTH-Rl), který způsobuje zvýšení resorpce kosti, renální reabsorpci vápníku a renální biosyntézu vitamínu D. Zatímco různé inhibitory resorpce kosti mají různou úspěšnost v inhibici osteoklastické resorpce kosti u těchto onemocnění, není v současnosti dostupná terapie zmírňující střevní a renální efekty PTH nebo PTHrP na nadbytek vápníku. Činidla, která mohou přímo antagonizovat PTH nebo PTHrF signalizaci budou mít tedy pravděpodobně vyšší účinnost ve srovnání s inhibitory resorpce.
Nejprostudovanější antagonisté PTH-Rl signalizace jsou založeny na amino-terminálních zkráceních. PTH-(7-34) peptidy jsou slabě účinnými PTH antagonisty s velmi slabou agonistickou aktivitou. Ve srovnání s PTH-(7-34) má PTHrP-(734) peptid vyšší afinitu pro PTH-Rl a proto je účinnějším antagonistou. Nicméně, PTHrP-(7-34) ma také vyšší (ale stále slabou) agonistickou aktivita ve srovnání s PTH-(7-34) (McKee (1990), Endocrinol. 127:76). Optimální antagonista bude kombinovat slabší agonismus PTH-(7-34) se silnějším antagonismem PTHrP-(7-34). Nutt et al. (1990), Endocrinol. 127:491, prokázali, že substitucí AsnlO a Leull PTH do PTHrP sekvence (nahrazením AsplO a Lysll) vede k vzniku peptidu ([AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc) v podstatě bez agonistické • ·· «· ·· »« 444 » • 4 » · 4 4 4 4 4 « 4 • »4·· «4·· 4 * 4 4 4 4 »444
4·· ·ΙΤ· 4» 4<?4· ·4 «4 aktivity, ale stále ještě s velmi silnou antagonistickou aktivitou.
Podobně jako nativní PTH mají peptidový PTH-R1 antagonisté velmi krátký cirkulační poločas (< 1 h). Dále, aminoterminální zkrácení, které jsou nutné pro odstranění agonismu na receptoru, také významně redukují afinitu těchto peptidů k PTH-Rl. Tyto vlastnosti omezují klinický potenciál běžných peptidových antagonistu. Konjugace amino-terminálně zkrácených PTH- nebo PTHrP peptidů na Pc by měla významně zvyšovat jejich cirkulační poločas, takže může být dosaženo kontinuálního antagonismu PTH-Rl pomocí těchto Fc-antagonistů.
Materiály, způsoby, výsledky
Klonovali jsme, exprimovali a přečistili jsme [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc. Testovali jsme schopnost této sloučeniny antagonizovat jak akutní, tak chronickou hyperkalcemickou odpovědď u myší. PTHrP-(1-34) byl použit jako kalcemické činidlo pro hodnocení akutních efektů (AsnlO,LeullPTHrP-(7-34)-Fc. Protože je PTHrP zásadní mediátor HHM, představuje tento pokus také model pro nádory indukující hyperkalcemii. Stručně, ionizovaný vápník v krvi (BIC) se měřil na začátku pokusu a myším se potom podalo vehikulum (PBS) nebo PTHrP-(1-34) (0,5 mg/kg) pomocí SC injekce. Myším se potom aplikovaly jednou SC různé dávky [AsnlO,Leull]PThrP(7-34)-Fc nebo vehikulum (PBS). U myší léčených vehikulem a s aplikovaným PTHrP-(1-34) byla pozorována přechodná hyperkalcemická reakce. Pík kalcemické reakce byl pozorován 3 hodiny po expozici a přetrvával po expozici alespoň 6 hodin. [AsnlO,Leull]PTH-rP-(7-34)-Fc v dávce 10 mg/kg způsobil rychlejší normalizaci PTHrP-indukované hyperkalcemie ve srovnání s vehikulem. Dávka 30 mg/kg zcela blokovala
• • · • · • · • · • · · ·
• • • · · Λ · • • • · • · *
« · • r/· • · • ·
kalcettiickou reakci na PTHrP-(1-34) (Obr. 6).
Pro testování schopnosti [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc antagonizovat chroničtější hyperkalcemii jsme použili PTH-(134)-Fc jako dlouhodobě působící kalcemické činidlo. Tento pokus také představuje model pro primární a sekundární hyperparathyroidismus, onemocnění, které je charakterizováno persistující elevací koncentrace PTH. U myší léčených vehikulem jediná SC injekce PTH-(1-34)-Fc (30 mg/kg) způsobila silnou hyperkalcemickou reakcí, která dosáhla hodnoty 2,75 mg/dl za 24 h po aplikaci (vs. normální kontrolní hodnota 1,35). Jediná SC injekce [AsnlO,Leull-PTHrP-(7-34)-Fc v dávce 10-100 mg/kg způsobila významné snížení hyperkalcemické reakce na PTH-(1-34)-Fc ve 24 hodině (Obr. 6).
Prokázali jsme antagonistickou aktivitu [AsnlO,Leull]PTHrP(7-34)-Fc, na zvířecích modelech akutní a chronické hyperkalcemie. Tyto modely využívají kalcemických činidel na bázi sekvence PTH a PTHrP. Tato data naznačují, že [AsnlO,Leull]PTHrP-(7-34)-Fc, stejně jako jiní Fc-konjugovaní PTH-R1 antagonisté, mohou být účinnou léčbou při hyperparathyroidismu, HHM a jiných onemocněních asociovaných s aberantní PTH-R1 signalizací.
Příklad 3: Osteogenní vlastnosti Fc-konjugovaných a přirozených C-terminálně zkrácených PTH fragmentů
A. cAMP testy
Testovali jsme relativní schopnost PTH-Fc konstruktů stimulovat akumulaci cAMP v krysích osteoblastům podobných ROS 17/2.8 buňkách. Kultury se ošetřily inhibitorem fosfodiesterasy LBMX pro podpoření akumulace cAMP. Kultury se • · ·· ttft · · *· potom vystavily na dobu 15 minut působení buď vehikula (PBS), nebo různých PTH konstruktů. Akumulace cAMP závislá na dávce se prokázala pro všechny fragmenty. PTH-(1-34) nekonjugovaný na Fc byl o něco účinnější než PTH-(1-31)-Fc a PTH-(1-30)-Fc (Obr. Ί) . Tato data demonstrují, že PTH fragmenty konjugované na Fc si zachovávají schopnost aktivovat AC dráhu v osteoblastěch.
B. Biologický test na myších
Potom jsme testovaly účinky PTH-(l-34), PTH-(1-34)-Fc, PTH(1-31)-Fc a PTH-(1-30)-Fc u myší. 4-týdenním myším samců se injikovalo ve dny 0, 5 a 10 vehikulum nebo PTH fragmenty, SC injekcí. Periferní krev se odebrala pro získání klinické biochemie v 24, 48 a 72 hodině. Myši se utratily v den 15, jejich obratle, tibie a femury se odebraly na histologické vyšetření a jedna tibie se odebrala pro měření kostní density (periferní kvantitativní počítačová tomografie, pQCT). Mezi sledované chemické parametry patřil celková sérová koncentrace vápníku, sérová alkalická fosfatasa (AP, markér osteoblastické aktivity), sérová kyselá fosfatasa resistentní na tartrát (TRAP, markér osteoklastické aktivity). Pro každé zvíře se vypočetl poměr AP:TRAP jako index relativní osteoblastické aktivity ve srovnání s osteoklastickou aktivitou. Vyšší poměr AP:TRAF ukazoval na potenciálně účinnější anabolické činidlo. Relativně vysoké dávky (15-krát vyšší než optimální anabolické dávky) byly vybrány podle předešlých studií, které prokázaly signifikantní změny v sledovaných chemických parametrech. Předpokládalo se, že nižší dávky by mohly prokázat anabolické účinky na kostní densitu a že současná antiresorpční léčba by mohla být nutná pro dosažení anabolické reakce.
Výsledky chemických parametrů jsou uvedeny na Obr. 8.
Sérový vápník nebyl významně odlišný ve 24, 48 nebo 72 hodině po injekci 300 nmol/kg (1,2 mg/kg) PTH-(l-34). Tento výsledek je v souladu s krátkým poločasem peptidů nekonjugovaného na Fc, který normálně způsobuje přechodné (12 h) zvýšení sérové koncentrace vápníku, naopak, ekvimolární dávka PTH-(1-34)-Fc způsobila dramatické a dlouhodobé zvýšení sérové koncentrace vápníku, která dosáhla vrcholu v 24 h. PTH-(1-31)-Fc byl účinejším kalcemických činidlem, zatímco PTH-(1-30)-Fc byl nejméně kalcemický ze 3 3 Fc peptidů (Obr. 8A). Sérová AP (osteoblastický markér) byla nezměněna po podání PTH-(1-34), ale byla významně zvýšena na 300 nmol/kg pro PTH-(1-34)-Fc a pro PTH-(1-31)-Fc v 72 h. PTH-(1-30)-Fc vykazoval nejvyšši zvýšení AP, která dosáhla maxima v 72 h po injekci 1000 nmol/kg (Obr. 8B). Sérový TRAP (osteoklastický markér) nebyl významně změněn pro PTH-(1-34), PTH-(1-34)-Fc nebo PTH-(1-30)Fc, ale byl dramaticky zvýšen pro PTH-(1-31)-Fc (Obr. 8C). Vypočtené poměry AP:TRAF byly stejné pro PTH-(1-34) a byly zvýšené pro PTH-(1-34)-Fc. Nízká dávka PTH-(1-31)-Fc (100 nmol/kg) zvyšovala AP:TRAP, zatímco vysoká dávka (1000 nmol/kg) snižovala AP:TRAP. Nejvyšši zvýšení v AP:TRAP bylo dosaženo s PTH-(1-30)-Fc (1000 nmol/kg) (Obr. 8D).
Efekty různých PTH konstruktů na kostní densitu (proximální metafýzi tibie) jsou uvedeny na obr. 9. Na konci 15-denní studie bylo zjištěno, že PTH-(1-34) (300 nmol/kg) má střední (nesignifikantní) anabolický vliv při injekci v den 0, den 5 a den 10. PTH-(1-34)-Fc (300 nmol/kg) nemá žádný vliv na densitu ksoti, stejně jako PTH-(1-31)-Fc v dávce 100 nmol/kg. Vyšší dávky PTH-(1-31)-Fc (300-1000 nmol/kg) měly významnou toxicitu související s hyperkalcemii a kosti od těchto zvířat se neodebíraly na pQCT. PTH-(1-30)-Fc způsoboval nejvyšši zvýšení v kostní densitě. Byla zřetelné nepřímá závislost
dávka-reakce, kdy PTH-(1-30)-Fc v dávce 100 nmol/kg měl nejvyšší vliv a v dávce 1000 nmol/kg měl nejnižši vliv, ačkoliv při všech dávkách byla BMD vyšší než u kontrol (Obr.
9). Nepřímá závislost dávka-reakce byla v souladu se zjištěním, že použité dávky (vybrané pro dané chemické parametry) byly 5-50-krát vyšší než optimální anabolické dávky. Nízké dávky PTH (nebo PTH-Fc), které selhávají v signifikantním zvýšení sérové koncentrace vápníku, jsou optimální pro anabolické efekty. Viz Hock, J.M. (1992), J.
Bone Min. Res. 7:65-72. V tomto pokusu byl léčebný režim s největším anabolickým účinkem (PTH-(1-30)-Fc v dávce 100 nmol/kg) také jediným PTH-Fc režimem, který signifikantně nezvyšoval sérové koncentrace vápníku (Obr. 8A).
Tato data demonstrují potenciální anabolické efekty Cterminálně zkrácených PTH-Fc peptidů. Delší poločas způsobený konjugací s Fc, v kombinaci se selektivní stimulací AC/cAMP Cterminálně zkrácenými peptidy, může vysvětlit anabolický vliv za absence účinného inhibitoru resorpce kosti. Předpokládá se, že postupným C-terminálním zkracováním PTH-(1-30)-Fc se objeví kratší fragmenty, které si zachovávají nebo mají vyšší anabolický profil než PTH-(1-30)-Fc. Tyto fragmenty mohou být více selektivní ve stimglaci osteoblastů a mohou být méně kalcemické, čímž se dosáhne většího terapeutického okna pro anabolickou terapii.
Příklad 4
Léčba PTH-Fc v monoterapii
Účinnost PTH-(1-34)-Fc v monoterapii byla prokázána u dospělých myší. Stručně, samci BDFl myší (4 měsíce staří) se léčili dvakrát týdně podkožní injekcí různými dávkami PTH-(179
34)-Fc nebo vehikula (PBS). Jiné myši se léčily denními SC injekcemi PTH-(1-34) v dávce 80 pg/kg/den (20 nmol/kg/den), což je léčebný režim, který je optimální pro zvýšení kostní hmoty u hlodavců (M. Gunness-Hey a J.M. Hock, Metab. Bone Dis. & Rel. Res. 5:177-181, 1984). Po 3 týdnech se myši utratili a jejich tibie se analyzovaly na kostní minerální densitu (BMD) za použití pQCF (Obr. 10).
Celková tibiální BMD a mřížovitá BMD byly zvýšené při denní aplikaci injekcí PTH-(1-34) ve srovnání s vehikulem (Obr. 1, dvou čestná ANOVA, p<0,05). Injekce PTH-(1-34)-Fc aplikovaná dvakrát týdně způsobily na dávce závislé zvýšení celkové a mřížovité BMD, při dvou nejvyšších dávkách (50 a 150 nmol/kg), a toto zvýšení bylo signifikantně vyšší než efekty způsobené vehikulem nebo denně aplikovaným PTH-(1-34). Kortikální BMD v tibii nebyla významně zvýšena denním podáváním PTH-(1-34).
PTH-(1-34)-Fc aplikovaný dvakrát týdně způsobil na dávce závislé zvýšení kortikální BMD, které bylo při nejVyšší dávce významně vyšší než hodnoty pozorované u myší léčených vehikulem nebo denní aplikací PTH-(l-34) (p<0,05).
PTH-(1-34)-Fc aplikovaný dvakrát týdně také účinně zvyšuje BMD v monoterapii u ovarektomizováných (OVX) krys. Sprague Dawley krysy byly OVX ve 3 měsících věku umožnil se průběh ztráty kostní hmoty po dobu 11 měsíců.
Jiné krysy byly falešně operovány a byly léčeny dvakrát týdně vehikulem (PBS). OVX byly léčeny dvakrát týdně SC injekcemi buď vehikula, nebo bisfosfonatu APD (pamidronat, 0,5 mg/kg), nebo PTH-(1-34)-Fc (50 nmol/kg) nebo APD + PTH-(1-34)Fc. BME se určovala jednou týdně pomocí rentgenové absorpce s duální energií (DEXA). Krysy se utratily po 4 týdnech léčby. Na konci léčby měly OVX krysy významné snížení v BMD ve všech • · · · analyzovaných místech skeletu ve srovnání s vehikulem-léčenými OVX krysami (Obr. 11, p<0,05, 2-cestná ANOVA). PTH-(1-34)-Fc samostatně nezvyšoval signifikantně BMD v metafýze femuru po 4 týdnech léčby (p<0,05). Léčba OVX krys PTH + ABD byla asociovaná s časnějším zvýšením v BMD v tomto místě (3 týdny). Kombinace APD + PTH-(1-34)-Fc také způsobila významné zvýšení BMD v lumbálním obratli a v metafýze femuru (p<0,05). PTH-(134)-Fc samostatně způsobil mírnou a dočasnou hyperkalcemickou reakcí, která spontánně odezněla po dni 10 i přes pokračující léčbu. Současné podání APD zcela blokovalo kalcemický vliv PTH-(1-34)-Fc.
Tato data naznačují, že PTH-(1-34)-Fc je účinným anabolickým činidlem při použití v monoterapii jak u dospělých, tak u OVX krys. Prokázali jsme také, že přidání antiresorpčního činidla (APD) k PTH-(1-34)-Fc je asociované s podobným nebo rychlejším zvýšením BMD u OVX krys. Současné podání APD také blokovalo dočasnou hyperkalcemickou reakcí produkovanou PTH-(1-34)-Fc, což naznačuje, že terapeutický index PTH-(1-34)-Fc může být významně zlepšen současným podáním účinného antiresorpčního činidla.
Po podrobném popsání vynálezu je nyní odborníkům v oboru jasné, že existují mnohé změny a modifikace předkládaného vynálezu, které spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, jak je zde definován.
• ·
Zkratky
AC adenylát-cyklasa
AP alkalická fosfatása
BMD kostní minerálová densita cAMP cyklický adenosin-monofosfát
DEXA rentgenová absorpce při duální energii HHM humorální hyperkalcemie při malignitách OPG osteoprotegerin
OVX ovarektizomovaný
PBS fosfátem pufrovaný salinický roztok pQCT periferní kvantitativní počítačová tomografie PTH parathyroidní hormon
PTHrP protein příbuzný s parathyroidním hormonem TRAP kyselá fosfatasa resistentní na tartrát • · · · • ·· · · ·· ··»· ···· « • * · · · 1 • · · · · « ······· · · ····
Seznam sekvencí <110> AMGEN lne.
<120> Modulátory receptoru pro hormon příštítných tělísek a
protein příbuzný s hormonem příštítných tělísek
<130> Ά-665Β
<140> PCT/US 01/13528
<141> 2001-04-27
<150> US 09/843,221
<151> 2001-04-26
<150> US 60/266,673
<151> 2001-02-06
<150> US 60/214,860
<151> 2000-06-28
<150> US 60/200,053
<151> 2000-04-27
<160> 170
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 684
<212> DNA <213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)
<223>
<400> 1
atg gac Met Asp 1 aaa act Lys Thr cac His 5 aca Thr tgt cca cct Pro tgt Cys 10 cca gct ccg Pro gaa Glu ctc Leu 15 ctg Leu , 48
Cys Pro Pro Ala
ggg gga ccg tea gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 96
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age 144
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 192
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac age acg 240
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr
65 70 75 80
tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 288
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn
85 90 95
ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 336
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
100 105 110
atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag 384
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin
115 120 125
gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc 432
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val
130 135 140
age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac atc gcc gtg 480
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 528
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr ‘Pro
165 170 175
ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc 576
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg 624
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
atg Met cat His 210 gag Glu get Ala ctg Leu cac His aac Asn 215 cac His tac Tyr acg Thr cag aag age Ser ctc Leu tcc Ser ctg Leu
Gin Lys 220
tet ccg ggt aaa
Ser Pro Gly Lys
225 <210> 2 <211> 228 <212> PRT
<213> Homo <400> 2 sapiens
Met 1 Asp Lys Thr His 5 Thr Cys Pro Pro Cys 10 Pro Ala Pro Glu Leu 15 Leu
Gly Gly Pro Ser 20 Val Phe Leu Phe Pro 25 Pro Lys Pro Lys Asp 30 Thr Leu
Met Ile Ser 35 Arg Thr Pro Glu Val 40 Thr Cys Val Val Val 45 Asp Val Ser
His Glu 50 Asp Pro Glu Val Lys 55 Phe Asn Trp Tyr Val 60 Asp Gly Val Glu
Val 65 His Asn Ala Lys Thr 70 Lys Pro Arg Glu Glu 75 Gin Tyr Asn Ser Thr 80
Tyr Arg Val Val Ser 85 Val Leu Thr Val Leu 90 His Gin Asp Trp Leu 95 Asn
Gly Lys Glu Tyr 100 Lys Cys Lys Val Ser 105 Asn Lys Ala Leu Pro 110 Ala Pro
Ile Glu Lys 115 Thr Ile Ser Lys Ala 120 Lys Gly Gin Pro Arg 125 Glu Pro Gin
Val Tyr 130 Thr Leu Pro Pro Ser 135 Arg Asp Glu Leu Thr 140 Lys Asn Gin Val
Ser 145 Leu Thr Cys Leu Val 150 Lys Gly Phe Tyr Pro 155 Ser Asp Ile Ala Val 160
Glu Trp Glu Ser Asn 165 Gly Gin Pro Glu Asn 170 Asn Tyr Lys Thr Thr 175 Pro
·· ··· · · · · ······· · · ···· ·· ··
Pro Val Leu Asp 180 Ser Asp Gly Ser Phe 185 Phe Leu Tyr Ser Lys 190 Leu Thr
Val Asp Lys 195 Ser Arg Trp Gin Gin 200 Gly Asn Val Phe Ser 205 Cys Ser Val
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225 <210> 3 <211> 21 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence: „ <220>
<223> PTH/PTHrP <220>
<2 21 > různé vlastnosti <222> (1 )..(1) <223> _jvolitelné navázání na X3X4X5X6X7, X2X3X4X5X6X7 , X1X2X3X4X5X6X7 ,‘or YX1X2X3X4X5X6X7 <220>
<22i> různé vlastnosti <222> (1)..(1) <223> 8. ' .
X je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, M nebo Nle jsou nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (3)..(3) < 2 2 3 > x10 je aminokyselinový zbytek (acidický nebo hydrofilní zbytek je výhodný, N nebo D jsou nejvýhodnější);
<220>
< 2 21 > různé vlastnosti <222> (4)..(4) < 2 2 3 > χ je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo basický zbytek je výhodný, L, R nebo K jsou nejvýhodnější);
<220>
<221> různé vlastnosti <222> (5)..(5) <223> X12 je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo aromatický zbytek je výhodný, G, F nebo W jsou nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (7)..(7) <223> X14je aminokyselinový zbytek (basický nebo hydrofilní zbytek je výhodný, H nebo S jsou nejvýhodnější);
<220>
<221> různé vlastnosti <222> (8)..(8) <22 3> χΐ5 jg aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, L nebo I jsou nejvýhodnější);
<220> , <22i> různé vlastnosti <222> (9)..(9) <2 2 3 > x16 je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo hydrofilní zbytek je výhodný, Q, N, S nebo
A jsou nej výhodnější);
<220>
< 2 21 > různé vlastnosti <222> (10)..(10) <22 3> x17 je aminokyselinový zbytek (acidický, hydrofilní nebo nefunkční zbytek je výhodný, S, D
4··
• · · • · 4 4 · 4 nebo L jsou nejvýhodnější);
<220>
<221> různé vlastnosti <222> (11)..(11) <223> x18 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, M, L, V nebo Nle jsou nejvýhodější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (12)..(12) <223> x19 je aminokyselinový zbytek (acidický nebo basický zbytek je výhodný, E nebo R jsou nejvýhodnější);
<220>
<221> různé vlastnosti <222> (14)..(14) < 2 2 3 > x21 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek nebo basický zbytek je výhodný; V, M, R nebo Me jsou nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (15)..(15) < 2 2 3 > -^22 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní, acidický nebo aromatický zbytek je výhodný, E nebo F jsou nejvýhodnější);
<220>
<22l> různé vlastnosti <222> (15)..(16) <223> χ23 je aromatický nebo lipofilní zbytek (W nebo F jsou výhodné);
<220>
<221> různé vlastnosti <222> (17)..(17) • 9 «·9 « • ·» ·« ·· « 9 9 9 9 9 * » ·
9 9 « 9 « · · • · «* 9 · 9999 ·
999 9999 «9« 99»* 99 9 9 9 « 99 99 <2 23 > X24 je lipofilní zbytek (L je výhodný);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (18)..(18) < 2 2 3 > χ25 aminokyselinový zbytek (hydrofilní nebo basický zbytek je výhodný, R nebo H jsou nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (19)..(19) < 2 2 3 > ^26 je amjjjQj^seiiuQYý zbytek (hydrofilní nebo basický zbytek je výhodný, K nebo H jsou nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (20)..(20) c 2 2 3 > ^27 je aminokyselinový zbytek (lipofilní, basický nebo nefiinkění zbytek je výhodný, K nebo
L jsou nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (21)..(21) <2 2 3 > χ28 je aminokyselinový zbytek (lipofilní nebo nefiinkění zbytek je výhodný, L nebo I jsou nejvýhodnější);
<220>
<221> různé vlastnosti <222> (21)..(21) <223> c ; volitelné navázání na x29/ X29x30, X29X30X31, X29X30 X31X32, X29 X30X31X32X33, X29X30X31X32X33X34, X29X30X31X32X33X34X35, or X29X
30X31X32X33X34X35X36 <400> 3
Xaa His Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa 15 10 15 .
9*99 ·* 9· » · » · t
• ·
9 ·9» *
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence * <220>
<223 > PTH/PTHrP <220>
<22i> různé vlastnosti <222> (1)..(1) <223> o volitelné navázání na J1J2 J3 J 4 J5 J6, J2J3J4J5J6, J3J4J5J6 <220>
<22i> různé vlastnosti <222> (1)..(1) <223>. 7·
J je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo aromatický zbytek je výhodný, L nebo F jsou nejvýhodnější);
různé vlastnosti (2)..(2)
J je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, M nebo Nle jsou nejvýhodnější);
různé vlastnosti (6)..(6)
J je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo aromatický zbytek je výhodný, G nebo W jsou nej výhodnější);
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
• · · · · • · · · · · • · « · · · • · ···· ·· 4 <220>
< 2 21 > různé vlastnosti <222> (10)..(10) < 2 2 3 > J16 je aminokyselinový zbytek (nefunkční nebo hydrofilní zbytek je výhodný, N, S nebo A jsou nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (12)..(12) < 2 2 3 > J18 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, M, Nle, L nebo V jsou i nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (13)..(13) < 2 2 3 > j19 je acidický nebo bazický zbytek (E nebo R výhodný) <220> ' <22i> různé vlastnosti <222> (15)..(15) <223> j21 je aminokyselinový zbytek (nefunkční zbytek je výhodný, V, M nebo Nle jsou ; nejvýhodnější);
<220>
<22i> |různé vlastnosti <222> (22)..(22) <223> . svolitelné navázání na J29, J29J30, J29J30J31, J29J30J3U32, J29J
30J31J32J33, or J29J30J31J32J33J3 <400> 4
Xaa Xaa His Asn Leu Xaa Lys His Leu Xaa Ser Xaa Xaa Arg Xaa Glu 1 5 10 15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu 20
• · · · · ···· · · · · <210> 5 <211> 21 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence <220>
<223> PTH/PTHrP <220>
<22i> různé vlastnosti <222> (1)..(1) <223> Ct--xOiVOlitelné navázání na YO1O2O3O4O5O6O7, O1O2O3O4O5O6O7, O2O3O4O5O 607, 0304050607, 04050607, 050607, 0607, or 07 <22 0>
<221> různé vlastnosti <222> (3)..(3) <223> θιο jg aminokyselinový zbytek (acidický nebo hydrofilní zbytek je výhodný, N nebo D jsou nejvýhodnější);
<220>
<221> různé vlastnosti <222> (4)..(4) <223> O11 je aminokyselinový zbytek (basický nebo nefunkční zbytek je výhodný, K nebo L jsou nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (5)..(5) <223> q!2 je aminokyselinový zbytek (aromatický nebo nefimkční zbytek je výhodný, G, F nebo
W jsou nej výhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (9)..(9} • · · · • · • · • · · .
• · · · · · · < 2 2 3 > O15 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní nebo nefunkční zbytek je výhodný, I nebo S jsou nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (10)..(10) <223> o16 je aminokyselinový zbytek (hydrofilní zbytek je výhodný, Q nebo N jsou ί nejvýhodnější);
<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (16)..(16) < 2 2 3 > o23 je aminokyselinový zbytek (aromatický zbytek je výhodný, F nebo W jsou nejvýhodnější);
<220>
<221> různé vlastnosti <222> (21)..(21) <223> C _ volitelné navázání na 029, 029030, 029030031, 029030031032, 0290 30031032033, 029030031032033034 , 029030031032033034035, or 02903 0031032033034035036 <400> 5
Leu His Xaa Xaa Xaa Lys Ser Ile Xaa Xaa Leu Arg Arg Arg Phe Xaa 1 5 10 I5
Leu His His Leu Ile 20 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificiální sekvence >
<220> (výhodná <223> spojovací sekvence ;
<400> 6
Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificiální sekvence :
<220>
< 2 2 3> výhodná spojovací sekvence <400> 7
Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificiální sekvence * <220>
<2 2 3 > výhodná spojovací sekvence <400> 8
Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly ' 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificiální sekvence: >
<220>
< 2 2 3 > výhodná spojovací sekvence <400> 9
Gly Pro Asn Gly Gly 1 5 <210> 10 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Ser Val 1 Ser Glu Ile 5 Gin Leu Met His Asn 10 Leu Gly Lys His Leu 15 Asn
Ser Met Glu Arg 20 Val Glu Trp Leu Arg 25 Lys Lys Leu Gin Asp 30 Val His
Asn Phe Val 35 Ala Leu Gly Ala Pro 40 Leu Ala Pro Arg Asp 45 Ala Gly Ser
Gin Arg 50 Pro Arg Lys Lys Glu 55 Asp Asn Val Leu Val 60 Glu Ser His Glu
Lys Ser 65 Leu Gly Glu Ala 70 Asp Lys Ala Asp Val 75 Asn Val Leu Thr Lys 80
Ala Lys Ser Gin
<210> 11
<211> 84
<212> PRT
<213> Rattus rattus
<400> 11
Ala Val 1 Ser Glu Ile 5 Gin Leu Met His Asn 10 Leu Gly Lys His Leu 15 Ala
Ser Val Glu Arg 20 Met Gin Trp Leu Arg 25 Lys Lys Leu Gin Asp 30 Val His
Asn Phe i Val 35 Ser Leu Gly Val Gin 40 Met Ala Ala Arg Glu 45 Gly Ser Tyr
Gin Arg Pro 50 Thr Lys Lys Glu 55 Asp Asn Val Leu Val 60 Asp Gly Asn Ser
• · · ·
Lys Ser Leu 65
Gly Glu Gly Asp Lys Ala Asd Val Asp Val Leu Val Lys 70 75 80
Ala Lys Ser Gin
<210> 12
<211> 78
<212> PRT
<213> Homo
<400> 12
sapiens
Leu 1 Met His Asn Leu 5 Gly Lys His Leu Asn 10 Ser Met Glu Arg Val 15 Glu
Trp Leu Arg Lys 20 Lys Leu Gin Asp Val 25 His Asn Phe Val Ala 30 Leu Gly
Ala Pro Leu 35 Ala Pro Arg Asp Ala 40 Gly Ser Gin Arg Pro 45 Arg Lys Lys
Glu Asp 50 Asn Val Leu Val Glu 55 Ser His Glu Lys Ser 60 Leu Gly Glu Ala
Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gin
70 75 <210> 13 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13
Ser 1 Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His
20 25 30
Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg
40
<210> 14
<211> 38
<212> PRT
<213> Homo
<400> 14
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met
1 5
Ser Met Glu Arg Val 20 Glu Trp Leu
Asn Phe Val 35 Ala Leu Gly
<210> 15
<211> 37
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Val Ser Glu 1 Ile Gin 5 Leu Met His
Met Glu Arg Val Glu 20 Trp Leu Arg
Phe Val Ala 35 Leu Gly
<210> 16
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Ser Val Ser 1 Glu Ile 5 Gin Leu Met
• ·
Asn. Leu Gly Lys His Leu Asn 10 15
Lys Lys Leu Gin Asp Val His 30
Leu Gly Lys His Leu Asn Ser 10 15
Lys Leu Gin Asp Val His Asn 30
Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30
Asn Phe <210> 17 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <400> 17
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn 15 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30
Asn Phe
<210> 18
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný lidský PTH <400> 18
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Lys Gly Lys His Leu Asn
5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His
25 30
Asn Phe <210> 19
99· ·* · · • · · · • · · « · · • · 9 9·· <211> 34 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence^ <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTH <400> 19
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
5 10 15
Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His
25 30
Asn Phe <210> 20 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence, <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTH <400> 20
Tyr Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Léu Gin Asp Val His
25 30
Asn.Phe
<210> 21
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
• « ·
Ρ· · · · · <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTH <400> 21
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15
Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30
Asn Tyr <210> 22 <211> 34 <212> PRT <213> (Artificiální sekvence <220>
<223> hovězí <400> 22
Ala Val Ser Glu Ile Gin Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser 15 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30
Asn Phe <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence· <220>
< 2 2 3 > modifikovaný hovězí PTH <400> 23
Ala Val Ser Glu Ile Gin Phe .Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser 1 5 10 15 »· ···9 • 100
9« ·» «*
9 «9·· *9 *» < 9 * 9 9 9 ·
9*99 999 9 9
9 9 9 9 9 » 9
9999 99 9999 ·* *·
Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp 20 Leu Arg 25 Lys Lys Leu Gin Asp 30 Val His
Asn Tyr
<210> 24
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence <
<220>
<223> prasečí·
<400> 24
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu 1 5 Met His Asn 10 Leu Gly Lys His Leu 15 Ser
Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His
25 30
Asn Phe
<210> 25
<211> 34
<212> PRT
<213> Rattus rattus
<400> 25
Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu 1 5 Met His Asn Leu Gly Lys His 10 Leu Ala 15
Ser Val Glu Arg Met Gin Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30
Asn Phe <210> 26 ·· · · · ···· ······· ·· ···· ·· · ·
- 101 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence ;
<220>
<223 modifikovaný krysí pth <400> 26
Ala 1 Val Ser Glu Ile 5 Gin Leu Leu His Asn 10 Leu Gly Lys His Leu 15 Ala
Ser Val Glu Arg Leu Gin Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His
25 30
Asn Tyr
<210> 27
<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu
1 5
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp
20
<210> 28
<211> 31 '
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence. ,
<220>
<223> modifikovaný lidský PTH
<400> 28
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 • · • · · ·
102 -
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu- Leu Gin Asp Val
20 25 30
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificiální sekvencei _
<220>
<223> PTH
<400> 29
Ser Glu Ile Gin Leu Leu His 1 5 Asn Leu Gly Lys 10 His Leu Asn Ser 15 Leu
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg 20 Lys Lys 25 Leu Gin Asp Val His 30 Asn Tyr
<210> 30
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence' i
<220>
<223> hovězí
<400> 30
Ser Glu Ile Gin Phe Met His 1 5 Asn Leu Gly 10 Lys His Leu Ser Ser 15 Met
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg 20 tys Lys 25 Leu Gin Asp Val His 30 Asn Phe
<210> 31
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence:
103 • · ·· ·♦ · * <220>
< 2 2 3 > modifikovaný hovězí PTH <400> 31
Ser Glu Ile Gin Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser Leu
1 5 10 15
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Tyr
25 30
<210> 32
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo
<400> 32
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu 1 5 10 . 15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe
20 25
<210> 33
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence » -
<220>
<223> modifikovaný lidský ΡΊΉ
<400> 33
Leu Leu His Asn Leu Gly Lys His 1 5 Leu Asn 10 Ser Leu Glu Arg Val Glu .15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Tyr 20 25
<210> 34
<211> 28
<212> PRT
• ·
104 • · · · • · · · ······ ·· < 213 > Artificiální sekvence <220>
<223> hovězí PTH <400> 34
Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser Met Glu Arg Val Glu 1 5 10 15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe 20 25 <210> 35 <211> 28 <212> PRT <213> Artificiální sekvence, ·;
<220>
<223> modifikovaný hovězí PTH <400> 35
Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser Met Glu Arg Val Glu 15 10 15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Tyr 20 25 <210> 36 <211> 28 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>
<223> modifikovaný hovězí PTH <400> 36
Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser Leu Glu Arg Val Glu 1 5 10 15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Tyr 20 25 • · · ·
-105 <210> 37 <211> 5 <212>· PRT <213> Artificiální sekvence <220>
< 2 2 3 > modifikovaný hovězí PTH <400> 37
Cys Asn Gly Arg Cys
5 <210> 38 <211> 27 <212> PRT <213> Artificiální sekvence .
<22 0>
<223> modifikovaný hovězí PTH <400> 38
Phe Met His Asn Leu Lys His Leu Ser Ser Met Glu Arg Val Glu Trp 15 10 15
Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Tyr 20 25
<210> 39
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo
<400> 39
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15
Ser.Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 25 30
106 • · ·· ···· * · · β 9 · · ♦ · ···· · · « · <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Artificiální sekvence :
<220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTH <400> 40
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val.Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 25 30 <210> 41 <211> 30 <212> PRT <213> Artificiální sekvence1 <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTH <400> 41
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Lys Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 25 30 <210> 42 <211> 30 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence1 <220>
<223> modifikovaný lidský PTH
107 • · · · * · · · ····
<400> 42
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15 »
Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 ' 25 30 <210> 43 <211> 30 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence <220>
<223> modifikovaný lidský PTH <400> 43
Tyr Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10-15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 25 30 <210> 44 <211> 30 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence :e <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTH <400> 44
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15
Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 25 30 <210> 45 <211> 30 <212> PRT
- 108 < 213 > Artificiální sekvence t.
<220>
<223> hovězí <400> 45
Ala Val 1 Ser Glu Ile Gin Phe Met 5 His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser
10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp
20 25 30
<210> 46
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný hovězí PTH
<400> 46
Ala Val Ser Glu.Ile Gin Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser
1 5 10 15
Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp
20 25 30
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence:
<220>
<22 3 > í prasečí PTH
<400> 47
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser
1 5 10 15
Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp
20 25 30
<210> 48 <211> 30 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>
<223> krysí PTH <400> 48
Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala 15 10 15
Ser Val Glu Arg Met Gin Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 25 30 <210> 49 <211> 30 <212> PRT <213> Artificiální sekvence:
<220>
<223> modifikovaný krysí PTH <400> 49
Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala 15 10 15
Ser Val Glu Arg Leu Gin Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp
20
<210> 50
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný lidský pth • · * ·« ·· ·· • · · · · · • · · · · · » · • · · · · t
-£ Q ··· ···· ·» ···· ·« <400> 50
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp
20 25 30
<210> 51
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin
20 25
<21D> 52
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 20 25
<210> 53
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<2232modifikovaný pth • · · « ·· · · ····
111 <400> 53
Ser Glu Ile Gin Leu Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Leu
1 5 10 15
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp
20 25
<210> 54
<211> . 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> hovězí
<400> 54
Ser Glu Ile Gin Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser Met
1 5 10 15
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp
20 25
<210> 55
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence :·
<220>
<223> modifikovaný hovězí PTH
<400> 55
Ser Glu Ile Gin Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser Leu
1 5 10 15
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu. Gin Asp
20 25
<210> 56
<211> 24
<212> PRT
112 ·· »· · · · ♦ · ·· · • · · · ··«· ··· · · ···· · · · · <213> Homo sapiens <400> 56
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu 15 10 15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 <210> 57 <211> 24 <212> PRT <213> Artificiální sekvence1<220>
<223> modifikovaný lidský PTH <400> 57
Leu Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Leu Glu Arg Val Glu 1 5 10 15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp20 <210> 58 <211> 24 <212> PRT <213> Artificiální sekvencí , <220>
<223> hovězí <400> 58
Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser Met Glu Arg Val Glu 15 10 15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 <210> 59 • · · ·
113 <211> 24 ' <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence:
<220>
< 2 2 3 > modifikovaný hovězí PTH <400> 59
Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser Leu Glu Arg Val Glu 1 5 10 15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 <210> 60 <211> 24 <212> PRT <213> Artificiální sekvence :
<220>
<223> modifikovaný hovězí PTH <400> 60
Phe Leu His Asn Leu Trp Lys His Leu Ser Ser Leu Glu Arg Val Glu 1 5 10 15
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 <210> 61 <211> 24 <212> PRT <213> Artificiální sekvencei <220>
<2 2 3 > modifikovaný hovězí PTH <220>
<221> různé vlastnosti
114
<222> (7)·-(7)
<223> D-aminokyselina
<400> 61
Phe Met 1 : His Asn Leu Lys 5
Trp Leu Arg Lys Lys Leu 20
<210> 62
<211> 86
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
His Leu
Asp
Ser Ser Met Glu Arg Val Glu 10 15
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin
1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His
20 25 30
Thr Ala Glu Ile Arg Ala Thr Ser Glu Val Ser Pro Asn Ser Lys Pro
35 40 45
Ser Pro Asn Thr Lys Asn His Pro Val Arg Phe Gly Ser Asp Asp Glu
50 55 60
Gly Arg Tyr Leu Thr Gin Glu Thr Asn Lys Val Glu Thr Tyr Lys Glu
65 70 75 80
Gin Pro Leu Lys Thr Pro
<210> 63
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo
<400> 63 . 115 .
» · · · * 9
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lvs Gly Lys Ser Ile Gin
1.5 10 ' 15
Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30
Thr Ala
<210> 64
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence· 5
<220>
<223> modifikovaný lidskýPTHrP <400> 64
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin
5 10 15 .
Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His
25 30
Thr Ala Glu Tyr 35 <210> 65 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiální sekvence >
<220>
<2233 modifikovaný lidský ρτηγρ <400> 65
Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 1 5 10 .15
Asp Leu Arg Arg Arg Phe Trp Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30
116 « 9* »9 9« ·9 9 9 9 9
9 * 9 9 9 9 9« 9 · 9 9 9 9 9 «9 9*99 ·9 9 9
Thr Ala Glu Tyr
35
<210> 66
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 66
Tyr Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
5 10 15
Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile
25 30
His Thr Ala
35
<210> 67
<211> 33
<212>' PRT
<213> Artificiální sekvencei
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 67
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asn Leu Lys Ser Ile Gin Asp 15 10 15
Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr 20 25 30
Ala <210> 68 <211> 28
9999 • 99 99 ·*
9 9 9 9 9· 99 9 ··· · 5 4 · • 4 · · »444* 4 • 4 4 · 4 »444 *44 4444 44 4444 44 44
117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe 1 5 10 15
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala 20 25 <210> 69 <211> 28 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence i <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 69
Leu Leu His Asn Leu Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe 15 10 15
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala
20
<210> 70
<211> 28
<212> PRT
<213> : Artificiální sekvence
<22 0>
<223: modifikovanýPTHrP <400> 70
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Asn Leu Leu Arg Arg Arg Phe 15 10 15 .
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala 20 25
-118 • ··· ···· ··· · · · · · · ·· · · <210> 71 <211> 28 <212> PRT <213> j Artificiální sekvence <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <220>
<22i> různé vlastnosti <222> (6)..(6) <223> D-aminokyselina <400> 71
Leu Leu His Asp Leu Trp Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe
1 5 10 15
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala
20 25
<210> 72
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný PTHrP
<220>
<221> různé vlastnosti
<222> (6)..(6)
<223> D-aminokyselina
<400> 72
Leu Leu Hi s Asn Leu Trp Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe
1 5 10 15
• ·
- 119
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala
20 25
<210> 73
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný PTHrP
<220>
<221> různé vlastnosti
<222> (5)..(5)
<223> D-aminokyselina
<400> 73
Leu His Asn Leu Trp Lys Ser 1 5 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe 10 15
Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 Ile His 25 Thr Ala
<210> 74
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence ;
<220>
<223> modifikovaný PTHrP
<220>
< 2 21 > různé vlastnosti <222> (5)..(5) <223> D-aminokyselina <400> 74 • · · · · ·
- 120
Leu His Asn Leu Phe Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe
1 5 10 15
Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala
20 25
<210> 75
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence »
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<220>
<221> různé vlastnosti
<222> (6) . . (6)
<223> D-aminokyselina
<400> 75
Leu Leu His Asn Leu Trp Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe
1 5 10 15
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala
20 25
<210> 76
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin
1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu
20 2 5 30
<21Ο> 77 • ·
121
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence <
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 77
Ala Val Ser Glu Ile Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 1 5 10 15
Asp Leu Arg Ařg Arg Phe Trp Leu His His Leu Ile Ala Glu
20 25 30
<210> 78
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence i
<220>
<223> lidský PTHrP s non-lidskýmN-koncovýmpeptiem
<400> 78
Tyr Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile 15 10 15
Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 25 30
<210> 79
<211> 30
<212> PRT
<213> ; Artificiální sekvence^
<220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <220>
<22i> různé vlastnosti • · · · ··· ·· ····
122 <222> (12)..(12) <223> D-aminokyselina <400> 79
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asn Leu Phe Lys Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 25 30 <210> 80 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe 15 10 15
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 <210> 81 <211> 24 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 81
Leu Leu His Asn Leu Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe 15 10 15
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 <210> 82 <211> 24
• 9 ·
'123 <212> PRT <213 > Artificiální sekvence: <220>
<223> modifikovaný PTHrP <400> 82
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Asn Leu Leu Arg Arg Arg Phe 15 10 15
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 <210> 83 <211> 23 <212> PRT <213> Artificiální sekvence1 <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 83
Leu Leu His Asp Leu Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe 1 5 10 15
Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 <210> 84 <211> 23 <212> PRT <213> Artificiální sekvence^ <220>
<223> modifikovaný PTHrP <400> 84
Leu Leu His Asn Leu Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe 1 5 10 15
124 a a · ·* · · ··
Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 <210> 85 <211> 23 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <
<220>
<223> modifikovaný PTHrP <220>
<22i> různé vlastnosti <222> (5)..(5) <223> D-aminokyselina <400> 85
Leu His Asn Leu Trp Lys Ser Ile Gin. Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe 15 10 15
Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 <210> 86 <211> 23 <212> PRT <213 > Artificiální sekvence<
<220>
<223> modifikovaný PTHrP <220>
<221> různé vlastnosti <222> (5)..(5) <22 3> D-aminokyselina <400> 86
125 • * · · · ·· · · • · * · « · · · · · • · · · · · · ·· » · · ···· »····?· ·· ···· ·· ··
Leu His Asn Leu Phe Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe 15 10 15
Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 <210> 87 <211> 24 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <220>
<221> různé vlastnosti <222> (6)..(6) <2 2 3 > D-aminokyselina <400> 87
Leu Leu His Asn Leu Trp Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe 1 5 10 15
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu
20
<210> 88
<211> 34
<212> PRT
<213> ' Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 88
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1.5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His 20 25 30 • · • · · · » · · · · ·«···*· ·· · * *· ·» · ·
126
Asn Phe <210> 89 <211> 34 <212> PRT <213> , Artificiální sekvenceJ <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 89
Ser Val 1 Ser Glu Ile Gin Leu Met 5 His Asn 10 Leu Gly Lys His Leu 15 Asn
Ser Met Glu Arg Val Glu Leu Leu 20 Glu 25 Lys Leu Leu Lys Lys 30 Leu His
Asn Phe
<210> 90
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence,,
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 90
Ser Vad 1 . Ser Glu Ile Gin Leu Met 5 His Asn 10 Leu Gly Lys His Leu 15 Asn
Ser Met Glu Arg Val Ala Leu Ala 20 Glu 25 Ala Leu Ala Glu Ala 30 Leu His
Asn Phe <210> 91
-127 ·* * · » 9 • · * ♦ > 9 »* ·~·9
<211> 34 <212> PRT <213> Artíficiální sekvence <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 91
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15
Ser Met Glu Arg Val Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu His 20 25 30
Asn Phe <210> 92 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence:
<220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 92
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15
Ser Met Glu Arg Val Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu His 20 25 30
Asn Phe
<210> 93
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence:
• ·
128 • · · · ··· · · ···· <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTH <400> 93
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu 15 10 15
Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Asn Phe 20 25 <210> 94 <211> 28 <212> PRT <213> Artificiální sekvence'' <220>
<223> modifikovaný lidský PTH <400> 94
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu 15 10 15
Leu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Lys Leu His Asn Phe 20 25 <210> 95 <211> 28 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence i <220>
<223> modifikovaný lidský PTH <400> 95
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Ala 1 5 10 15
Leu Ala Glu Ala LeuAla Glu Ala Leu His Asn Phe 20 25 <210> 96 • · • · · ·
129
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný lidský PTH
<400> 96
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His 1 5 Leu Asn 10 Ser Met Glu Arg Val 15 Ser
Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser 20 Leu 25 His Asn Phe
<210> 97
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence <
<220>
<223> modifikovaný lidský PTH
<400> 97
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His 1 5 Leu Asn 10 Ser Met Glu Arg Val 15 Ala
Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys 20 Leu 25 His Asn Phe
<210> 98
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificiální sekvencei
<220>
<223> : modifikovaný lidský PTHrP
<400> 98
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu 1 ' 5 His Asp 10 Lys Gly Lys Ser Ile 15 Gin
• · • · · · · · · • · · · . 130
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His 20 25 30
Thr Ala
<210> 99
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 99
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin
5 10 . 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Lys Leu His
25 30
Thr Ala
<210> 100
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence ·
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 100
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin
5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu His
25 30
Thr· Ala
- 131 • · · ·
<210> 101 <211> 34 <2l2> PRT < 213 > ; Artificiální sekvence <220> ' <223 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 101
Ala Val 1 Ser Glu His Gin Leu Leu 5 His Asp 10 Lys Gly Lys Ser Ile 15 Gin
Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu 20 Ser 25 Ser Leu Leu Ser Ser 30 Leu His
Thr Ala
<210> 102
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence'
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 102
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu 1 5 His Asp 10 Lys Gly Lys Ser Ile 15 Gin
Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr 20 Asp 25 Lys Val Ala Glu Lys 30 Leu His
Thr Ala
<210> 103
<211> 28
<212> PRT
• ·
- 132 <213> Artificiální sekvence <220>
<2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 103
Leu Leu 1 His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu
5 10 15
Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 Leu 25 His Thr Ala
<210> 104
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence:
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 104
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 Ile Gin 10 Asp Leu Arg Arg Arg 15 Glu
Leu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Lys 20 Leu 25 His Thr Ala
<210> 105
<211> 2.8
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence :
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 105
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 Ile Gin 10 Asp Leu Arg Arg Arg 15 Ala
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu His Thr Ala 20 25 • · · • · ·
133
<210> 106
<211> 28
<21-2> PRT
<213> Artificiální sekvence:
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 106
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ser 1 5 10 15
Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu His Thr Ala 20 25
<210> 107
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence»
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 107
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala 15 10 15
Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu His Thr Ala 20 25 <210> 108 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence1 <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
• · • · · ·
- 134 <400> 108
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin
1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys Leu His
25 30
Thr Ala <210> 109 <211> 34 <212> PRT < 213 > J Artificiální sekvence.
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 109
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His 20 25 30
Thr Ser <210> 110 <211> 37 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence^ <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 110
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asd Lys Gly Lys Ser Ile Gin 1 5 10 .15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His 20 25 30 e · • · · ·
135
Thr Ala Gly Arg Arg 35 <210>· 111 <211> 34 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvencec <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 111 .
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu Lys 20 25 30
Glu Leu <210> 112 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence^ <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 112
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His 20 25 30
Thr Ala <210> 113 • · <211> 34 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence: <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> . 113
Ala Val 1 Ser Glu His Gin Leu Leu 5 His Asp 10 Lys Gly Lys Ser Ile 15 Gin
Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu 20 Glu 25 Lys Leu Leu Glu Lys 30 Leu His
Thr Ala
<210> 114
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence^
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 114
Ala Val Ser Glu Ala Gin Leu Leu 1 5 His Asp 10 Leu Gly Lys Ser Ile 15 Gin
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu 20 Glu 25 Lys Leu Leu Glu Lys 30 Leu His
Ala Leu
<210> 115
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence1
-137 <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 115
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His 20 25 30
Thr Ala <210> 116 <211> 33 <212> PRT < 213 > Artificiální sekvence <220>
c 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 116
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu. His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His Thr 20 25 30
Ala <210> 117 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <<220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 117
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15 '138 ·
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg Leu His 20 25 30
Thr Ala <210> 118 <211> 34 <212> PRT < 213 > ; Artificiální sekvence:
<220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 118
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gin
5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg Leu His
25 30
Thr Ala <210> 119 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence' <220>
<2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 119
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin
5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu A.la Leu His
25 30
Thr Ala
-139 <210> 120 <211> 34 <212> PRT <213> , Artificiální sekvence:
<220>
< 2 2 3 > imodifikováný lidský PTHrP <400> 120
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu His 20 25 30
Thr Ala <210> 121 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence c <220>
<2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 121
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin
5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu His
25 30
Thr Ala <210> 122 <211> 34 <212> PRT • ·
140 <213> Artificiální sekvence <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 122
Ala Val Ser Glu Ile Gin Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser 15 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His 20 25 30
Asn Tyr <210> 123 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiální sekvence<
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 123
Ala Val Ser Glu Ile Gin Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser 15 10 15
Ser Met Arg Arg Arg Glu. Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His 20 25 30
Asn Tyr
<210> 124
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificiální sekvenceu.
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
- 141
<400> 124
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
20 25 30
<210> 125
<211> . 30
<212> PRT
<213> ; Artificiální sekvence P
<220>
<223> modifikovaný lidský PTH
<400> 125
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Lys
20 25 30
<210> 126
<211> 30
<212> PRT
<213> 'Artificiální sekvence ·
<220>
<223> modifikovaný lidský PTH
<400> 126
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala
20 25 30
<210> 127 <211> 30 <212> PRT
- 142 < 213 > Artificiální sekvence f <220>
c 2 2 3 > modifikovaný lidský PTH <400> 127
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser
20 25 30
<210> 128
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificialm sekvence c
<220>
<223> . modifikovaný lidsky PTH
<400> 128
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu His
20 25 30
Asn Phe
<210> 129
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence -
<220>
<223> modifikovaný lidský PTH
<400> 129
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu 1 5 10 . 15
• · · · _ 143
Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lvs
20
<210> 130
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný lidský PTH
<400> 130
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu 1 5 10 15
Leu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Lys
20
<210> 131
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence r
<220>
<223> modifikovaný lidský PTH
<400> 131
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Ala 15 10 15
LeU Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala 20
<210> 132
<211>· 24
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence'
- 144 ····· <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTH <400> 132
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Ser 15 10 15
Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser 20
<210> 133
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence··-
<220>
<223> modifikovaný lidský PTH
<400> 133
Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Ala 15 10 15
Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys 20
<210> 134
<211> 30
<212> PRT ·
<213> Artificiální sekvence .<
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 134
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30 <210> 135
145
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence t
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 135
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Lys 20 25 30
<210> 136
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence c
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 136
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala
20 25 30
<210> 137
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 137
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 1-5 10 15
146
Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 <210> 138 <211> 30 <212> PRT <213> Artificiální sekvence r <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 138
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys 20 25 30 <210> 139 <211> 24 <212> PRT <213> Artificiální sekvence i <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 139
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu 1 5 10 15
Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
20
<210> 140
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificiální sekvence
• · · ·
147 <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 140
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu 1 5 10 15
Leu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Lys 20 <210> 141 <211> 24 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence' <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 141
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala 1 5 10 15
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala 20 <210> 142 <211> 24 <212> PRT <213 > Arteficiální sekvence -, <220>
< 2 2 3 > í modifikovaný lidský PTHrP <400> 142
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ser 15 10 15
Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser 20 <210> 143 • · · · · 4
148 <211> 24 <212> PRT < 213 > Arteficiální sekvence t _ <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 143
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala 1 5 10 15
Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys 20 <210> 144 <211> 30 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>
<2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 144
Ala Val Ser Glu His Gin· Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys 20 25 30 <210> 145 <211> 30 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence * <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 145
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15
-149 *« 0 0 ·* 0 0 0 · 0 » • · 0 * 0 0 0 ·0· 000
0·0 «0 «000 00 00
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30 <210> 146 <211> 33 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>
<22 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 146
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His 20 25 30
Thr <210> 147 <211> 30 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence.
<220>
<2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 147
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 1 .5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30 <210> 148 <211> 30 <212> PRT
-150 • φφ φφ φ* ·····» «ΦΦΦ · Φ · φ « Β · • Φ φ * Φ·««
Φ Φ » Φ · * · ·
Φ·Φ ·* ΦΦΦ* · · Φ * <213 > Arteficiální sekvence <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 148
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 15
Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30 <210> 149 <211> 30 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 149
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 . 30 <210> 150 <211> 30 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP <400> 150
Ala Val Ser Glu Ala Gin Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile Gin 1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30
151
<210> 151 <211> 30 <212> PRT < 213 > Arteficiální sekvence, <220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP <400> 151
Ala Val 1 Ser Glu His Gin Leu Leu 5 His Asp 10 Lys Gly Lys Ser Ile 15 Gin
Asp Leu . Arg Arg Arg Glu Leu Leu 20 Glu 25 Arg Leu Leu Glu Arg 30
<210> 152
<211> 29
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence/
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 152
Ala Val Ser Glu His Gin. Leu Leu 1 5 His Asp 10 Arg Gly Arg Ser Ile 15 Gin
Asp Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg
25 <210> 153 <211> 30 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence:
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
152 <400> 153 • · ··· ···· ······ · · ···· ·· · ·
Ala Val 1 Ser Glu His Gin Leu Leu 5 His Asn 10 Arg Gly Lys Ser Ile 15 Gin
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu 20 Glu 25 Arg Leu Leu Lys Arg 30
<210> 154
<211> 30
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 154
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu 1 5 His Asp 10 Arg Gly Arg Ser Ile 15 Gin
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu 20 Glu 25 Arg Leu Leu Lys Arg 30
<210> 155
<211> 30
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence <
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 155
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu 1 5 His Asp 10 Lys Gly Lys Ser Ile 15 Gin
Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala 20 Glu 25 Ala Leu Ala Glu Ala 30
<210> 156
<211> 30
<212> PRT
153 • · · ·
<213> Arteficiální sekvence :
-790>
< 2 2 3 > ufied human PTHrP
<40Q> 156
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu 1 5 His Asp 10 Lys Gly Lys Ser Ile 15 Gin
Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu 20 Ser 25 Ser Leu Leu Ser Ser 30
<210> 157
<211> 30
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence ·
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 157
Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu 1 5 His Asp 10 Lys Gly Lys Ser Ile 15 Gin
Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr 20 Asp 25 Lys Val Ala Glu Lys 30
.<210> 158
<211> 30
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence !
<220>
<223> modifikovaný lidský PTHrP
<400> 158
Ala Val Ser Glu Ile.Gin Phe Met 1 5 His Asn 10 Leu Gly Lys His Leu 15 Ser
Ser Met Glu Arg Val Glu Leu Leu 20 Glu 25 Lys Leu Leu Glu Lys 30
- 154 <210> 159 <211> 30 <212> PRT < 213 > Arteficiální sekvence <
<220>
< 2 2 3 > modifikovaný lidský PTHrP;
<400> 159
Ala Val 1 Ser Glu Ile Gin Phe 5 Met His Asn 10 Leu Gly Lys His Leu 15 Ser
Ser Met Arg Arg Arg Glu Leu 20 Leu Glu 25 Lýs Leu Leu Glu Lys 30
<210> 160
<211> 39
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvencer
<220>
<223> TIP39
<400> 160
Ser Leu Ala Leu Ala Asp Asp 1 5 Ala Ala Phe 10 Arg Glu Arg Ala Arg 15 Leu
Leu Ala Ala Leu Glu Arg Arg 20 His Trp 25 Leu Asn Ser Tyr Met 30 His Lys
Leu Leu Val Leu Asp Ala Pro
35
<210> 161
<211> 34
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence
155 -
<220> <223> <220> <221>. <222> <223> výhodná provedení - PTH
různé vlastnosti (34)..(34) the C-terminus
Optional linker and Fc domain attached at
<400> 161
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30
Asn Phe <210> 162 <211> 34 <212> PRT < 213 > Arteficiální sekvence; <220>
<223> výhodná provedení - PTH - pth <220>
<221> různé vlastnosti <222> (34)..(34) < 2 2 3 > volitelná spojovací sekvence a Fc doména navázané na C-konec <400> 162
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn
5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His
25 30
Asn Phe
156
<210> 163
<211> 34
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence
<220>
<223> výhodná provedení - PTH <220>
<22i> různé vlastnosti <222> (34)..(34) <223> volitelná spojovací sekvence a Fc doména navázané na C-konec _ <400> 163
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Lys Gly Lys His Leu Asn
5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His
25 30
Asn Phe
<210> 164
<211> 34
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence,
<220>
<223> výhodná provedení — PTH
<220>
<221> různé vlastnosti
<222> (34)..(34)
<223> volitelná spojovací sekvence a Fc doména navázané na Č-konec
157 • · · • · ·
<400> 164
Ser Val 1 Ser Glu Ile 5 Gin Leu Met His Asn 10 Leu’ Gly Lys His Leu 15 Asn
Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His
25 30
Asn Phe
<210> 165
<211> 31
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence'
<220>
<223> výhodná provedení - PTH
<220>
<221> různé vlastnosti
<222> (31)..(31)
<223> volitelná spojovací sekvence a Fc doména navázané na C-konec
<400> 165
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met 1 5 His Asn Leu Gly Lys His 10 Leu Asn 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu 20 Arg 25 Lys Lys Leu Gin Asp 30 Val
<210> 166
<211> 30
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence
<220>
<223> výhodná provedení - PTH
<220>
158 <22i> různé vlastnosti <222> (30) . . (30) < 2 2 3 > volitelná spojovací sekvence a Fc doména navázané na C-konec s <400> 166
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp 20 25 30 <210> 167 <211> 29 <212> PRT < 213 > Arteficiální sekvence;
<220>
<223> výhodná provedení—ΡΊΉ<220>
<22i> různé vlastnosti <222> (1)..(1) <2 2 3 > Fc doména navázaná na N-konec prostřednictvím volitelné spojovací sekvence <400> 167
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin 20 25 <210> 168 <211> 28 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>
- 159 <223> výhodná provedení — ΡΊΉ <220>
<221> různé vlastnosti <222> (1)..(1) < 2 2 3 > Fc doména navázaná na N-konec prostřednictvím volitelné spojovací sekvence <400> 168
Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 20 25 <210> 169 <211> 28 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>
< 2 2 3 > výhodná provedení — PTHr p <220>
<22i> různé vlastnosti <222> (28)..(28) <223> volitelná spojovací sekvence a Fc doména navázané na C-konec ms <400> 169
Leu Leu His Asn Leu Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe
1 5 10 15
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala
20 25
<210> 170
<211> 39
<212> PRT
<213> Arteficiální sekvence - _
160 • · · · <220>
<223> výhodná provedení - . φρρ39 <220>
<221> různé vlastnosti <222> (39)..(39) <22 3> volitelná spojovací sekvence a Fc doména navázané na C-konec 1 <400> 170
Ser Leu Ala Leu Ala Asp Asp Ala Ala Phe Arg Glu Arg Ala Arg Leu 15 10 15
Leu Ala Ala Leu Glu Arg Arg His Trp Leu Asn Ser Tyr Met His Lys 20 25 30
Leu Leu Val Leu Asp Ala Pro

Claims (76)

1. Sloučenina vzorce
P1—(L1) a-F1 a její multimery, kde:
F1 je vehikulum a je navázané na C-konec P1-(L1)a; P1 je PTH/PTHrP modulující doména;
L1 je spojovací sekvence; a a je 0 nebo 1.
2. Sloučenina podle nároku 1 vzorce
P1-F1.
3. Sloučenina podle nároku 1, kde F1 je Fc doména.
4. Sloučenina podle nároku 1, kde F1 je IgG Fc doména.
5. Sloučenina podle nároku 1, kde F1 je IgGl Fc doména
6. Sloučenina podle nároku 1, kde F1 obsahuje sekvenci SEQ ID NO: 2.
7. Sloučenina podle nároku 1, kde PTH/PTHrP modulující doména má vzorec xnx8hx10x11x12kx14x15x16x17x18x19rx21x22x23x24x25x26x27x28xc (SEQ ID NO: 3) kde
XN není přítomný nebo je X3X4X5X6X7, X2X3X4X5X6X7, Χ1χ2Χ3Χ4Χ5Χ6Χ7, • · ·· ·«·· • · · · · ·
162 nebo YX1X2X3X4X5X6X7;
X1 až X7, X10, X11, X12, X14 až Χ2δ jsou každý nezávisle aminokyseliný zbytek;
Xc není přítomný nebo je X29, X29X30, X29X30X31, X29X30X31X32,
X29X30X31X32X33, X29X30X31X32X33X34, X29X30X31X32X33X34X35 nebo χ29χ30χ31χ32χ33χ34χ35χ36.
X29 až X36 jsou každý nezávisle aminokyselinový zbytek.
8. Sloučenina podle nároku 7, kde:
XN je X1X2X3X4X5X6X7;
XI je hydrofilní nebo nefunkční zbytek;
X2 je V;
X3 je S;
X4 je E;
X5 je nefunkční nebo basický zbytek;
X6 je Q;
X7 j e L;
X10 je acidický nebo hydrofilní zbytek;
XII je nefunkční nebo basický zbytek;
X12 je nefunkční zbytek;
X14 je basický nebo hydrofilní zbytek;
X15 je nefunkční zbytek;
X16 je nefunkční nebo hydrofilní zbytek;
X17 je acidický, hydrofilní nebo nefunkční zbytek;
X je nefunkční zbytek;
X19 je acidický nebo basický zbytek;
X21 je nefunkční nebo basický zbytek;
X je hydrofilní, acidický, nebo aromatický zbytek;
X23 je aromatický nebo lipofilní zbytek;
X24 je lipofilní zbytek (L je výhodný);
X je hydrofilní nebo basický zbytek;
X je hydrofilní nebo basický zbytek;
X je lipofilní, basický, nebo nefunkční zbytek;
• ·
9 · 9 · • «· ·· ·» » Μ · · · » 9 · ·· 4 « · 4 · * · » · * «· « · · · * · ♦ «9«···· 9* *··· ·* * *
163
Χ2θ je lipofilní nebo nefunkční zbytek.
9. Sloučenina podle nároku 8, kde:
Xc je X29X30X31X32X33X34;
X29 je hydrofilní nebo nefunkční zbytek;
X30 je hydrofilní nebo acidický zbytek;
X31 je lipofilní nebo nefunkční zbytek;
X32 je H;
X33 je hydrofilní zbytek; a
X34 je nefunkční nebo aromatický zbytek.
10. Sloučenina podle nároku 8, kde:
Xc je X29X30X31;
X29 je hydrofilní nebo nefunkční zbytek;
X je hydrofilní nebo acidický zbytek;
X31 je lipofilní nebo nefunkční zbytek.
11. Sloučenina podle nároku 8, kde Xc je X29X30;
X je hydrofilní nebo nefunkční zbytek;
X je hydrofilní nebo acidický zbytek.
12. Sloučenina podle nároku 8, kde Xc je X29; a
X je hydrofilní nebo nefunkční zbytek.
13. Sloučenina podle nároku 8, kde Xc není přítomný.
14. Sloučenina podle nároku 8, kde
XI je A, S nebo Y;
X5 je H nebo I;
X10 je N nebo D;
XII je L, R, nebo K;
• » · · · *
164
X12 je C, F nebo W; X14 je H nebo S; x15 je L nebo I; X16 je Q, N, S nebo A; X17 je S, D nebo L; X18 je M, L, V nebo Nle; x19 je E nebo R; x21 je V, M, R nebo Nle; X22 je E nebo F; X23 je W nebo F; X25 je R nebo H; X26 je K nebo H; X27 je K nebo L; a X28 je L nebo I. 15. Sloučenina podle nároku 14, xc j e X29X30X31X32X33X34 ; x29 je Q nebo A; χ30 je D nebo E; x31 je V nebo I; X33 je N nebo T; a X34 je A, F nebo Y. 16. Sloučenina podle nároku 14, xc je x X X ; x29 je Q nebo A; X30 je D nebo E; a x31 j e V nebo I. 17. Sloučenina podle nároku 14, xc je X29X30; x29 je Q nebo A; x30 je D nebo E.
kde:
kde:
kde:
• · · · · · ·· ··· ···· ······· ·· ···· »· ·«
165
18. Sloučenina podle nároku 14, kde:
Xc je X29; a
X29 je Q nebo A.
19. Sloučenina podle nároku 14, kde Xc není přítomný.
20. Sloučenina podle nároku 1, kde PTH/PTHrP modulující doména má vzorec
JNJ7J8HNLJ12KHLJ16SJ18J19RJ21EWLRKKLJc (SEQ ID NO: 4)
JN není přítomný nebo je vybrán ze skupiny zahrnující
J2J3J4J5J6, J3J4J5J6;
J1 je aminokyselinový zbytek;
J2 je aminokyselinový zbytek;
J je aminokyselinový zbytek;
J4 je aminokyselinový zbytek;
J5 je aminokyselinový zbytek;
J6 je aminokyselinový zbytek;
J7 je aminokyselinový zbytek;
J8 je amiriokyselinový zbytek;
J11 je nefunkční nebo basický zbytek; J12 je aminokyselinový zbytek;
J16 je aminokyselinový zbytek;
J je aminokyselinový zbytek;
J19 je acidický nebo basický zbytek; J je aminokyselinový zbytek;
J není přítomný nebo je J , J J J29J3O1J31J32J33, J29^0^1 j32J33J34 a
J29je aminokyselinový zbytek;
J30 je aminokyselinový zbytek;
J je aminokyselinový zbytek;
-.29-.30 ,31 ,29 ,30 ,31 ,32 d d U z d d d d f
166
J32 je aminokyselinový zbytek;
J33 je aminokyselinový zbytek;
J34 je aminokyselinový zbytek.
21. Sloučenina podle nároku 20, kde ,N . ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 .
J jeJJJJJJ;
J1 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J2 je nefunkční zbytek;
J3 je hydrofilní zbytek;
J4 je acidický zbytek;
J5 je nefunkční zbytek;
J6 je basický zbytek;
J7 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J8 je nefunkční zbytek;
J11 je basický nebo nefunkční zbytek;
J12 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J16 je nefunkční nebo hydrofilní zbytek; J18 je nefunkční zbytek;
J19 je acidický nebo basický zbytek; a
J21 je nefunkční zbytek;
,c · „ ,29 ,30 ,31 ,32 ,33 ,34
J J J- J J J J r
J je hydrofilní nebo nefunkční zbytek; J je hydrofilní nebo acidický zbytek; J31 je lipofilní nebo nefunkční zbytek;
J je basický zbytek;
J33 acidický zbytek; a J34 je aromatický zbytek.
22. Sloučenina podle nároku 21, kde: J1 je A, S nebo Y;
J2 je V;
J3 je S;
J4 je E;
·· ·· ·· ·· · · · ·
167 • ··· ···· ··· ·· ···· ·· ·*
J5 je i;
J6 je Q;
J7 je L nebo F;
J8 je M nebo Nle;
J11 je L, R nebo K; J12 je G nebo W; J16 je N, S nebo A; J18 je M, Nle, L nebo J19 je E nebo R; J21 je V, M, nebo Nle J23 * * * * * 29 je Q nebo A; J30 je D nebo E; J31 je V nebo I; J32 * je H; j33 je N; a J34 je F nebo Y.
23. Sloučenina podle nároku 20, kde:
-rN . T1 T2 T3 T4 T5 T6 .
J J Θ JJJuJlJf
JL je nefunkční nebo aromatický zbytek; J2 je nefunkční zbytek;
J3 je hydrofilní zbytek;
J4 je acidický zbytek;
J5 je nefunkční zbytek;
J6 je basický zbytek;
J7 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J8 je nefunkční zbytek;
J11 je basický nebo nefunkční zbytek;
J12 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J16 je nefunkční nebo hydrofilní zbytek; J je nefunkční zbytek;
J19 je acidický nebo basický zbytek; a J21 je nefunkční zbytek;
168 ,c . ,29 ,30 ,31 .
J je J u <J r
J25 * * * 29 je hydrofilní nebo nefunkční zbytek; J30 je hydrofilní nebo acidický zbytek; a J31 je lipofilní nebo nefunkční zbytek.
24. Sloučenina podle nároku 23, kde:
J1 je A, S nebo Y;
J2 je V;
J3 je S;
J4 je E;
J5 je I;
J6 je Q;
J7 je L nebo F;
J8 je M nebo Nle;
J11 je L, R nebo K; J12 je G nebo W; J16 je N, S nebo A; J18 je M, Nle, L nebo J19 je E nebo R; J21 je V, M nebo Nle; J29 je Q nebo A; J30 je D nebo E; a J31 je V nebo I.
25. Sloučenina podle nároku 20, kde:
,Ν . ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 .
J1 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J2 je nefunkční zbytek;
J3 je hydrofilní zbytek;
J4 je acidický zbytek;
J5 je nefunkční zbytek;
J6 je basický zbytek;
J7 je nefunkční nebo aromatický zbytek;
169
J8 je nefunkční zbytek;
J11 je basický nebo nefunkční zbytek;
J12 je nefunkční nebo aromatický zbytek;
J16 je nefunkční nebo hydrofilní zbytek;
-i o
J je nefunkční zbytek;
J19 je acidický nebo basický zbytek; a
J21 je nefunkční zbytek;
Tc . Λ T29 ,30 . u JG u J f
J27 * 29 je hydrofilní nebo nefunkční zbytek; a J30 je hydrofilní nebo acidický zbytek.
26. Sloučenina podle nároku 25, kde:
J1 je A, S nebo Y;
J2 je V;
J3 je S;
J4 je E;
J5 je I;
J6 je Q;
J7 je L nebo F;
J8 je M nebo Nle;
J11 je L, R nebo K;
J12 je G nebo Ví;
J16 je N, S nebo A;
J18 je M, Nle, L nebo V;
J19 je E nebo R;
J21 je V, M nebo Nle;
J je Q nebo A;
J30 je D nebo E.
27. Sloučenina podle nároku 20, kde:
,N . ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6
J je J J J J J J ;
J1 je nefunkční nebo aromatický zbytek;
J2 je nefunkční zbytek;
·· ·· ·· ·· ····
170
J3 je hydrofilní zbytek;
J4 je acidický zbytek;
J5 je nefunkční zbytek;
J6 je basický zbytek;
J7 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J8 je nefunkční zbytek;
J11 je basický nebo nefunkční zbytek;
J12 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J16 je nefunkční nebo hydrofilní zbytek; J18 je nefunkční zbytek;
J19 je acidický nebo basický zbytek; a J21 je nefunkční zbytek;
J 3 θ J r
J28 29 je hydrofilní nebo nefunkční zbytek.
28. Sloučenina podle nároku 27, kde:
J1 je A, S nebo Y;
J2 je V;
J3 je S;
J4 je E;
J5 je I;
J6 je Q;
J7 je L nebo F;
J8 je M nebo Nle;
J11 je L, R nebo K;
J12 je G nebo W;
J16 je N, S nebo A;
J18 je M, Nle, L nebo V;
J19 je E nebo R;
J21 je V, M nebo Nle;
J je Q nebo A.
171
29. Sloučenina podle nároku 20, kde:
JN je J5J6;
J1 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J2 je nefunkční zbytek;
J3 je hydrofilní zbytek;
J4 je acidický zbytek;
J5 je nefunkční zbytek;
J6 je basický zbytek;
J7 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J8 je nefunkční zbytek;
J11 je basický nebo nefunkční zbytek;
J12 je nefunkční nebo aromatický zbytek; J16 je nefunkční nebo hydrofilní zbytek; J18 je nefunkční zbytek;
J19 je acidický nebo basický zbytek;
J21 je nefunkční zbytek; a Jc je není přítomen.
30. Sloučenina podle nároku 29, kde:
J1 je A, S nebo Y;
J2 je V;
J3 je S;
J4 je E;
J5 je I;
J6 je Q;
J7 je L nebo F;
J8 je M nebo Nle;
J11 je L, R nebo K;
J12 je G nebo W;
J16 je N, S nebo A;
J18 je M, Nle, L nebo V;
1 Q
J je E nebo R;
J21 je V, M nebo Nle.
• · • ·
172
31. Sloučenina podle nároku 20, kde PTH/PTHrP modulující doména je vybrána z tabulky 1.
32. Sloučenina podle nároku 1, kde PTH/PTHrP modulující doména má vzorec:
OBLHO1°O11O12KSIO15O16LRRRFO23LHHLIOC (SEQ ID NO: 5) kde:
0N není přítomný nebo je YO1O2O3O4O5O6O7, O1O2O3O4O5O6O7, 020304050607, 0V0W, 040506O7, O5O6O7, O6O7 nebo O7;
O1 je aminokyselinový zbytek;
O2 je aminokyselinový zbytek;
O3 je aminokyselinový zbytek;
O4 je aminokyselinový zbytek;
O5 je aminokyselinový zbytek;
O6 je aminokyselinový zbytek;
O7 je aminokyselinový zbytek;
O10 je aminokyselinový zbytek;
O11 je aminokyselinový zbytek;
O12 je aminokyselinový zbytek;
O15 je aminokyselinový zbytek;
O16 je aminokyselinový zbytek;
O je aminokyselinový zbytek;
O je aminokyselinový zbytek;
Oc není přítomný nebo je O2
0 0, 0“0J0Ji, Ο“Ο~ΟΧΟ
O29O3oO31O32O33 , 02903°031032033034, O29O3°O31O32O33O34O35 nebo
O29O3oO31O32O33O34O35O36; a 29 36
O až O jsou každý nezávisle aminokyselinový zbytek.
33. Sloučenina podle nároku 27, kde:
• ·
173
Ο je Ο ;
Ο7 je nefunkční zbytek;
Ο10 je acidický nebo hydrofilní zbytek;
O1X je basický nebo nefunkční zbytek;
O12 je aromatický nebo nefunkční zbytek;
O15 je hydrofilní nebo nefunkční zbytek;
O16 je hydrofilní zbytek;
O17 je acidický nebo nefunkční zbytek;
O je aromatický zbytek; a Oc není přítomný.
34. Sloučenina podle nároku 23, kde:
0N je O1O2O3O4O5O6O7;
O1 je nefunkční aminokyselinový zbytek;
O2 je nefunkční aminokyselinový zbytek;
O3 je hydrofilní aminokyselinový zbytek;
O4 je acidický aminokyselinový zbytek;
O5 je basický nebo nefunkční aminokyselinový zbytek; O6 je hydrofilní aminokyselinový zbytek;
O7 je nefunkční zbytek;
O10 je acidický nebo hydrofilní zbytek;
O11 je basický nebo nefunkční zbytek;
O12 je aromatický nebo nefunkční zbytek;
O13 je hydrofilní nebo nefunkční zbytek;
O je hydrofilní zbytek; a 17
O je acidický nebo nefunkční zbytek; a O23 je aromatický zbytek.
35. Sloučenina podle nároku 34, kde:
O1 je A;
O2 je V;
O3 je S;
O4 je E;
174
O5 je H nebo I; O6 je Q;
O7 je L;
O10 je N nebo D; o11 je K nebo L; o12 je C , F nebo W; o15 je I nebo S; o16 je Q nebo N; o17 je D nebo L; o32 je F nebo W.
36. Sloučenina podle nároku 27, kde PTH/PTH-rP modulující doména je vybrána z tabulky 2.
37. Sloučenina podle nároku 1, kde PTH/PTHrP modulující doména má aminokyselinovou sekvenci TIP39.
38. Sloučenina podle nároku 1 obsahující sekvenci vybranou z tabulky 4.
39. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje peptid vybraný ze skupiny zahrnující SEQ ID NOS: 17, 18, 19 a
69.
40. Nukleová kyselina vyznačující se tím, že kóduje sloučeninu podle nároku 1.
41. Nukleová kyselina vyznačující se tím, že kóduje sloučeninu podle nároku 7.
42. Nukleová kyselina vyznačující se tím, že kóduje sloučeninu podle nároku 20.
» · · · · · • 9 ♦ * 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
175
43. Nukleová kyselina vyznačující se tím, že kóduje sloučeninu podle nároku 32.
44. Nukleová kyselina vyznačující se tím, že kóduje sloučeninu podle nároku 39.
45. Expresní vektor vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle nároku 40.
46. Expresní vektor vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle nároku 41.
47. Expresní vektor vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle nároku 42.
48. Expresní vektor vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle nároku 43.
49. Expresní vektor vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle nároku 44.
50. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje expresní vektor podle nároku 45.
51. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje expresní vektor podle nároku 46.
52. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje expresní vektor podle nároku 47.
53. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje expresiií vektor podle nároku 48.
• · « «
176
54. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje expresní vektor podle nároku 49.
55. Buňka podle nároku 50 vyznačující se tím, že se jedná o buňku E. coli.
56. Buňka podle nároku 51vyznačující se tím, že se jedná o buňku E. coli.
57. Buňka podle nároku 52 vyznačující se tím, že se jedná o buňku E. coli.
58. Buňka podle nároku 53 vyznačující se tím, že se jedná o buňku E. coli.
59. Způsob pro přípravu antagonisty PTH/PTHrP receptoru vyznačující se tím, že zahrnuje:
a) výběr alespoň jednoho peptidů, který se váže na receptor;
a
b) přípravu farmakologického činidla obsahujícího alespoň jednu Fc doména kovalentně navázanou na alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci vybraného peptidů nebo peptidů.
60. Způsob podle nároku 59 vyznačující se tím, že peptid je vybrán ze skupiny zahrnující SEQ ID NOS: 3, 4a
5.
61. Způsob podle nároku 59 vyznačující se tím, že peptide je vybrán v procesu zahrnujícím skríning fagové zobrazovací knihovny, E. coli zobrazovací knihovny, ribosomální knihovny, RNA-peptidové knihovny nebo knihovny chemických peptidů.
» * · * • · «·· ···· ··· ···« ♦· ··*· ·« ··
177
62. Způsob podle nároku 59 vyznačující se tím, že příprava farmakologického činidla je provedena:
a) přípravou genového konstruktu obsahujícího nukleovou kyselinu kódující vybraný peptid a nukleovou kyselinu kódující Fc doménu; a
b) expresi genového konstruktu.
63. Způsob podle nároku 59vyznačující se tím, že genový konstrukt je exprimován v buňce E. coli.
64. Způsob podle nároku 59 vyznačující se tím, že výběr peptidů je proveden způsobem zahrnujícím:
a) přípravu genového konstruktu obsahujícího nukleovou kyselinu kódující první vybraný peptid a nukleovou kyselinu kódující Fc doménu;
b) provedení polymerasové řetězové reakce za použití genového konstruktu a mutagenních primerů, kde
i) první mutagenní primer obsahuje sekvenci nukleové kyseliny komplementární k sekvenci na nebo poblíž 5' konce kódujícího řetězce genového konstruktu, a ii) druhý mutagenní primer obsahující sekvenci nukleové kyseliny komplementární k 3' konci nekódujícího řetězce genového konstruktu.
65. Způsob pro léčbu osteopenie vyznačující se tím, že zahrnuje podání PTH agonisty a inhibitoru resorpce kosti, kde PTH agonista obsahuje sloučeninu podle nároku 1.
66. Způsob pro léčbu osteopenie vyznačující se tím, že zahrnuje podání PTH agonisty a inhibitoru resorpce kosti, kde PTH agonista obsahuje sloučeninu podle nároku 7.
67. Způsob pro léčbu osteopenie vyznačující se • ·· ·»· ** >····· «··· · · * * » a · • * · · r » » »
178 a · · * · · · i ··* · r ···< « · ·« tím, že zahrnuje podání PTH agonisty a inhibitoru resorpce kosti, kde PTH agonista obsahuje sloučeninu podle nároku 20.
68. Způsob pro léčbu osteopenia vyznačující se tím, že zahrnuje podání PTH agonisty a inhibitoru resorpce kosti, kde PTH agonista obsahuje sloučeninu podle nároku 32.
69. Způsob pro léčbu osteopenie vyznačující se tím, že zahrnuje podání PTH agonisty a inhibitoru resorpce kosti, kde PTH agonista obsahuje sloučeninu podle nároku 39.
70. Způsob podle nároku 65 vyznačující se tím, že inhibitor resorpce kosti je vybrán ze skupiny zahrnující OPG, OPC-L protilátky, kalcitonin, bisfosfonáty, estrogeny, modulátory estrogenového receptoru a tibolon.
71. Způsob podle nároku 66 vyznačující se tím, že inhibitor resorpce kosti inhibitor je vybrán ze skupiny zahrnující OPG, OPC-L protilátky, kalcitonin, bisfosfonáty, estrogeny, modulátory estrogenového receptoru a tibolon.
72. Způsob podle nároku 67 vyznačující se tím, že inhibitor resorpce kosti inhibitor je vybrán ze skupiny zahrnující OPG, OPC-L protilátky, kalcitonin, bisfosfonáty, estrogeny, modulátory estrogenového receptoru a tibolon.
73. Způsob podle nároku 68 vyznačující se tím, že inhibitor resorpce kosti inhibitor je vybrán ze skupiny zahrnující OPG, OPC-L protilátky, kalcitonin, bisfosfonáty, estrogeny, modulátory estrogenového receptoru a tibolon.
74. Způsob podle nároku 69 vyznačující se tím, že inhibitor resorpce kosti inhibitor je vybrán ze skupiny • · · ·
179 zahrnující OPG, OPC-L protilátky, kalcitonin, bisfosfonáty, estrogeny, modulátory estrogenového receptoru a tibolon.
75. Způsob pro léčbu osteopenie vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 1.
76. Způsob pro léčbu osteopenie vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 7.
77. Způsob pro léčbu osteopenie vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 20.
78. Způsob pro léčbu osteopenie vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny padle nároku 32.
79. Způsob pro léčbu osteopenie vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 39.
CZ20023496A 2000-04-27 2001-04-27 Modulátory receptorů pro hormon příštítných tělísek a protein příbuzný s hormonem příštítných tělísek CZ20023496A3 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20005300P 2000-04-27 2000-04-27
US21486000P 2000-06-28 2000-06-28
US26667301P 2001-02-06 2001-02-06
US09/843,221 US6756480B2 (en) 2000-04-27 2001-04-26 Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20023496A3 true CZ20023496A3 (cs) 2003-05-14

Family

ID=27498365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20023496A CZ20023496A3 (cs) 2000-04-27 2001-04-27 Modulátory receptorů pro hormon příštítných tělísek a protein příbuzný s hormonem příštítných tělísek

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6756480B2 (cs)
EP (1) EP1276767A2 (cs)
JP (1) JP2004500838A (cs)
KR (1) KR20030004375A (cs)
CN (1) CN1439021A (cs)
AU (2) AU5732101A (cs)
BG (1) BG107242A (cs)
BR (1) BR0110391A (cs)
CA (1) CA2407493A1 (cs)
CZ (1) CZ20023496A3 (cs)
EA (1) EA200201121A1 (cs)
HK (1) HK1052939A1 (cs)
HU (1) HUP0300465A3 (cs)
IL (1) IL152384A0 (cs)
MX (1) MXPA02010589A (cs)
NO (1) NO20025143L (cs)
SK (1) SK15202002A3 (cs)
WO (1) WO2001081415A2 (cs)

Families Citing this family (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1123401A1 (en) * 1998-10-22 2001-08-16 The General Hospital Corporation BIOACTIVE PEPTIDES AND PEPTIDE DERIVATIVES OF PARATHYROID HORMONE (PTH) AND PARATHYROID HORMONE-RELATED PEPTIDE (PTHrP)
US7820393B2 (en) * 1999-01-14 2010-10-26 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods, kits and antibodies for detecting parathyroid hormone
US6689566B1 (en) 1999-01-14 2004-02-10 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods, kits, and antibodies for detecting parathyroid hormone
AU7734800A (en) * 1999-09-29 2001-04-30 General Hospital Corporation, The Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth)
US20020090646A1 (en) * 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
CA2454275C (en) * 2001-07-23 2012-10-23 The General Hospital Corporation Conformationally constrained parathyroid hormone (pth) analogs
US20050032685A1 (en) * 2001-09-17 2005-02-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedies for bone loss
US7247609B2 (en) 2001-12-18 2007-07-24 Universitat Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
MXPA04006728A (es) * 2002-01-10 2005-08-19 Osteotrophin Llc Tratamiento de desordenes oseos con medicamentos anabolicos esqueleticos.
US20050148763A1 (en) * 2002-02-01 2005-07-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peg-binding pth or peg-binding pth derivative
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
TW200307553A (en) * 2002-05-24 2003-12-16 Akzo Nobel Nv Treatment of post-menopausal complaints in breast cancer patients
US7378495B2 (en) 2002-10-21 2008-05-27 Pevion Biotech, Ltd. PTH-rP related peptide cancer therapeutics
AU2002359391A1 (en) * 2002-11-01 2004-07-29 Amgen, Inc. Modulators of receptors for parathyrois hormone and parathyroid hormone-related protein
US8088734B2 (en) 2003-01-21 2012-01-03 Unigene Laboratories Inc. Oral delivery of peptides
WO2004093902A1 (en) * 2003-03-19 2004-11-04 The General Hospital Corporation CONFORMATIONALLY CONSTRAINED PARATHYROID HORMONES WITH α-HELIX STABILIZERS
AU2016244273B2 (en) * 2003-05-06 2018-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP1624891B2 (en) 2003-05-06 2013-04-10 Biogen Idec Hemophilia Inc. Clotting factor-fc chimeric proteins to treat hemophilia
EP1653985A4 (en) 2003-07-17 2009-08-05 Gen Hospital Corp CONSTRAINTS CONTAINING CONTAINING HORMONE PARATHYROID (PTH) ANALOGUES
US7318925B2 (en) * 2003-08-08 2008-01-15 Amgen Fremont, Inc. Methods of use for antibodies against parathyroid hormone
JP2007521232A (ja) 2003-08-08 2007-08-02 アブジェニックス・インコーポレーテッド 副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）に対する抗体およびその使用
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
AU2004282984B2 (en) 2003-11-13 2011-07-14 Hanmi Science Co., Ltd. Protein complex using immunoglobulin fragment andmethod for the preparation thereof
EP1730192A2 (en) * 2004-03-19 2006-12-13 Zelos Therapeutics, Inc. Compositions and methods for detecting cyclic analogs of human parathyroid hormone (hpth)
JP2007537274A (ja) * 2004-05-10 2007-12-20 ナステック ファーマスーティカル カンパニー インク． 副甲状腺ホルモンの粘膜送達を増強するための組成物及び方法
US20060127320A1 (en) * 2004-05-10 2006-06-15 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Method of delivering parathyroid hormone to a human
US20060052305A1 (en) * 2004-05-10 2006-03-09 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Method of treating osteoporosis using intranasal parathyroid hormone
ES2611984T3 (es) * 2004-06-14 2017-05-11 Basf Beauty Care Solutions France S.A.S. Preparaciones cosméticas que contienen fragmentos de PTH
KR100754667B1 (ko) * 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
US8168592B2 (en) * 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
US20070173447A1 (en) * 2005-10-25 2007-07-26 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Method for treating osteoporosis by intranasal delivery of teriparatide with an anti-resorptive agent
CA2628945A1 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 Board Of Control Of Michigan Technological University Black bear parathyroid hormone and methods of using black bear parathyroid hormone
PE20070684A1 (es) * 2005-11-14 2007-08-06 Amgen Inc MOLECULAS QUIMERICAS DE ANTICUERPO RANKL-PTH/PTHrP
US20080051332A1 (en) * 2005-11-18 2008-02-28 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Method of modulating hematopoietic stem cells and treating hematologic diseases using intranasal parathyroid hormone
JP2009545320A (ja) * 2006-08-04 2009-12-24 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）のポリペプチド誘導体
KR20170067906A (ko) * 2006-10-03 2017-06-16 라디우스 헬쓰, 인코포레이티드 골 아나볼릭 단백질을 위한 약물 전달 방법
US7803770B2 (en) 2006-10-03 2010-09-28 Radius Health, Inc. Method of treating osteoporosis comprising administration of PTHrP analog
USRE49444E1 (en) 2006-10-03 2023-03-07 Radius Health, Inc. Method of treating osteoporosis comprising administration of PTHrP analog
DK2084183T3 (da) * 2006-10-13 2010-08-16 Lilly Co Eli Pegyleret PTH som PTH-receptormodulatorer og anvendelser deraf
WO2009131553A2 (en) * 2006-12-29 2009-10-29 Osteogenex Inc. Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
US20090023655A1 (en) * 2007-04-02 2009-01-22 Louis Luttrell Biased Ligands for Receptors Such as the PTH Receptor
CA2687141C (en) 2007-05-22 2014-04-01 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
KR101661730B1 (ko) 2007-08-01 2016-10-04 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 Ｇ―단백질 결합 수용체를 이용한 스크리닝 방법 및 관련 조성물
MX2010002249A (es) * 2007-08-31 2010-03-17 Amgen Inc Formulacion de proteina de estado solido.
US8383114B2 (en) * 2007-09-27 2013-02-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
JP2012512812A (ja) 2007-12-28 2012-06-07 クロス・バイオサージェリー・アクチェンゲゼルシャフト フィブリンフォームに組込まれたｐｄｇｆ融合タンパク質
WO2010011096A2 (en) 2008-07-23 2010-01-28 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010108153A2 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
US8563513B2 (en) * 2009-03-27 2013-10-22 Van Andel Research Institute Parathyroid hormone peptides and parathyroid hormone-related protein peptides and methods of use
BR112012003511A2 (pt) * 2009-09-09 2019-09-24 Asahi Kasei Pharma Corp agente para o tratamento ou prevenção de osteoporose, preparação de combinação ou kit de tratamento, e, agente para a inibição ou prevenção de fraturas ósseas
WO2011050333A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Amgen Inc. Vial adapter and system
JP2013512688A (ja) 2009-12-07 2013-04-18 ミシガン テクノロジカル ユニバーシティ クロクマの副甲状腺ホルモン及びクロクマの副甲状腺ホルモンを使用する方法
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
WO2011143406A2 (en) 2010-05-13 2011-11-17 The General Hospital Corporation Parathyroid hormone analogs and uses thereof
ES2545411T5 (es) 2010-06-07 2024-04-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármaco
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN103339145A (zh) 2010-09-22 2013-10-02 安姆根有限公司 运载体免疫球蛋白及其用途
CA2824143C (en) 2011-01-14 2018-12-18 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and method of use thereof
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
AU2012245231B2 (en) 2011-04-20 2016-10-13 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
CN103930142B (zh) 2011-10-14 2016-12-14 安姆根有限公司 注射器和装配方法
EP2784080B1 (en) * 2011-10-31 2019-12-18 Shimadzu Corporation Peptide-hinge-free flexible antibody-like molecule
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
CA2859412C (en) 2011-12-14 2021-05-25 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Delivery of therapeutic agents using bacterial collagen-binding polypeptide segments
KR101895047B1 (ko) 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
AR091902A1 (es) 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
SI3081249T1 (sl) 2012-11-21 2021-03-31 Amgen Inc. Naprava za dajanje zdravila
JP6768501B2 (ja) 2013-03-15 2020-10-14 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入機、および自動注入機システム
CA2904725C (en) 2013-03-15 2022-04-12 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US20200354428A9 (en) * 2013-06-23 2020-11-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Analogues of parathyroid hormone (1-34) that function as agonists of the parathyroid hormone receptor-1 and display modified activity profiles
WO2015057836A2 (en) * 2013-10-15 2015-04-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Bone anabolic parathyroid hormone and parathyroid hormone related-protein analogs
PL3060275T3 (pl) 2013-10-24 2019-12-31 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
EP3060281B1 (en) 2013-10-24 2019-01-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
AU2015256082C1 (en) 2014-05-07 2020-09-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
CN112237662B (zh) 2014-06-03 2022-10-21 安姆根有限公司 药物递送系统和使用方法
AU2015332557B2 (en) 2014-10-14 2020-05-14 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
CA2976935C (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
IL255148B2 (en) 2015-04-29 2023-04-01 Radius Pharmaceuticals Inc 1901 rad for use in a method to inhibit a cancerous growth or induce tumor regression in a patient who is resistant to the drug and/or has cancer positive for an estrogen receptor alpha mutation
CN106279424A (zh) * 2015-05-20 2017-01-04 深圳翰宇药业股份有限公司 一种人甲状旁腺激素pth(1-34)融合蛋白及其应用
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
EP3429663B1 (en) 2016-03-15 2020-07-15 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017173372A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 The General Hospital Corporation Parathyroid hormone receptor 1 antagonist and inverse agonist polypeptides and methods of their use
KR20180135458A (ko) 2016-04-26 2018-12-20 알.피.쉐러 테크놀러지즈 엘엘씨 항체 컨쥬게이트 및 이의 제조 및 이용 방법
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
MX2018013616A (es) 2016-05-13 2019-02-21 Amgen Inc Montaje de cubierta protectora de vial.
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
CN106366176B (zh) * 2016-08-30 2020-02-07 杨德鸿 Pth模拟肽及其应用
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
CN117417263A (zh) 2017-01-05 2024-01-19 雷迪厄斯制药公司 Rad1901-2hcl的多晶型形式
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
JP7397440B2 (ja) 2017-02-10 2023-12-13 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー コラーゲン結合薬剤組成物およびその使用方法
WO2018151890A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
MX2019009755A (es) 2017-02-17 2019-10-07 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos.
EP3592403A1 (en) 2017-03-06 2020-01-15 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
IL268386B2 (en) 2017-03-09 2023-11-01 Amgen Inc Insertion mechanism for a drug delivery device
EP4241807A3 (en) 2017-03-28 2023-10-11 Amgen Inc. Plunger rod and syringe assembly system and method
US10996208B2 (en) 2017-04-28 2021-05-04 Radius Health, Inc. Abaloparatide formulations and methods of testing, storing, modifying, and using same
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
AU2018282077B2 (en) 2017-06-08 2023-11-23 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
US11541183B2 (en) 2017-06-22 2023-01-03 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
JP7475860B2 (ja) 2017-06-23 2024-04-30 アムジエン・インコーポレーテツド スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス
ES2972207T3 (es) 2017-07-14 2024-06-11 Amgen Inc Sistema de inserción-retracción de agujas con sistema de resorte de torsión doble
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
EP3658206A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
IL272636B1 (en) 2017-10-06 2024-06-01 Amgen Inc Drug delivery device with combination assembly and related assembly method
WO2019074579A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A DRIVE ASSEMBLY AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP3703778A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
WO2019089178A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
SG11202002966QA (en) 2017-11-10 2020-05-28 Amgen Inc Plungers for drug delivery devices
IL273638B1 (en) 2017-11-16 2024-06-01 Amgen Inc Door lock mechanism for drug delivery device
SG11202002772VA (en) 2017-11-16 2020-04-29 Amgen Inc Autoinjector with stall and end point detection
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
CN112423844A (zh) 2018-07-04 2021-02-26 雷迪厄斯制药公司 Rad1901-2hcl的多晶型形式
MX2021000749A (es) 2018-07-24 2021-03-29 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US12042645B2 (en) 2018-07-24 2024-07-23 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020028009A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
CA3109988A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
MA53912A (fr) 2018-10-15 2022-01-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement
CA3113076A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
JP2022519061A (ja) * 2019-01-29 2022-03-18 シャイア－エヌピーエス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 副甲状腺ホルモンバリアント
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
KR102144688B1 (ko) 2020-05-20 2020-08-14 이상진 폐스티로폼 재활용 감용장치
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4423037A (en) 1982-05-13 1983-12-27 The General Hospital Corporation Inhibitors of peptide hormone action
FR2550204B1 (fr) 1983-08-05 1987-11-13 Toyo Jozo Kk Derives peptidiques de (nle8,nle1b, tyr34)-h-pth
HU205564B (en) * 1987-01-27 1992-05-28 Laszlo Vadnay Spial spindle for apparatus serving for shelling grains, apparatus for shelling grains and disc for the spiral spindle
US4968669A (en) 1988-05-09 1990-11-06 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5171670A (en) 1989-05-12 1992-12-15 The General Hospital Corporation Recombinant dna method for production of parathyroid hormone
US5087562A (en) 1990-04-25 1992-02-11 Merck & Co., Inc. Humoral hypercalcemic factor antagonists with modification at position 13 . . .
ATE125299T1 (de) 1990-09-28 1995-08-15 Takeda Chemical Industries Ltd Synthetisches gen für menschliches parathyroidhormon.
JPH0532696A (ja) * 1990-09-28 1993-02-09 Takeda Chem Ind Ltd 副甲状腺ホルモン誘導体
CA2107569C (en) 1991-04-05 2011-08-02 Gino V. Segre Parathyroid hormone receptor and dna encoding same
US5261686A (en) 1992-04-06 1993-11-16 Buckler Clive E Semi-recumbent
US5118667A (en) 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
US5434246A (en) 1992-03-19 1995-07-18 Takeda Chemical Industries, Ltd. Parathyroid hormone derivatives
CA2098639A1 (en) 1992-06-19 1993-12-20 K. Anne Kronis Bone stimulating, non-vasoactive parathyroid hormone variants
US5589452A (en) 1992-07-14 1996-12-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Analogs of parathyroid hormone and parathyroid hormone related peptide: synthesis and use for the treatment of osteoporosis
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5556940A (en) * 1994-06-20 1996-09-17 National Research Council Of Canada Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis
US5550134A (en) 1995-05-10 1996-08-27 Eli Lilly And Company Methods for inhibiting bone loss
US5599822A (en) 1995-06-06 1997-02-04 Eli Lilly And Company Methods for minimizing bone loss
US5955574A (en) 1995-07-13 1999-09-21 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, S.A. Analogs of parathyroid hormone
US5969095A (en) 1995-07-13 1999-10-19 Biomeasure, Inc. Analogs of parathyroid hormone
US5723577A (en) 1995-07-13 1998-03-03 Biomeasure Inc. Analogs of parathyroid hormone
ES2248853T3 (es) 1996-07-31 2006-03-16 The General Hospital Corporation Nuevos analogos del peptido relacionado con la hormona paratiroidea.
US6313088B1 (en) 1997-02-07 2001-11-06 Emisphere Technologies, Inc. 8-[(2-hydroxy-4-methoxy benzoyl) amino]-octanoic acid compositions for delivering active agents
US6183974B1 (en) 1997-07-31 2001-02-06 The General Hospital Corporation Screening assays for G protein coupled receptor agonists and antagonists
AU740493B2 (en) 1998-01-29 2001-11-08 Kinerton Limited Process for making absorbable microparticles
WO1999038536A1 (en) 1998-01-29 1999-08-05 Poly-Med Inc. Absorbable microparticles
WO1999046283A1 (en) 1998-03-09 1999-09-16 Zealand Pharmaceuticals A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
EA200001071A1 (ru) 1998-04-15 2001-08-27 Авентис Фармасьютикалз Продактс Инк. Способ получения полимер-связанных циклических пептидов
FR2781231B1 (fr) 1998-07-17 2002-01-25 Sederma Sa Compositions cosmetiques amincissantes
ATE290214T1 (de) 1998-09-04 2005-03-15 Aventis Pharma Inc Luciferase-reporter-testverfahren für parathyroidhormon-verbindungen
CA2346695A1 (en) 1998-10-07 2000-04-13 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods of screening for apoptosis-controlling agents for bone anabolic therapies and uses thereof
EP1123401A1 (en) 1998-10-22 2001-08-16 The General Hospital Corporation BIOACTIVE PEPTIDES AND PEPTIDE DERIVATIVES OF PARATHYROID HORMONE (PTH) AND PARATHYROID HORMONE-RELATED PEPTIDE (PTHrP)
EP1175444B1 (en) 1998-11-25 2008-01-23 The General Hospital Corporation Amino-terminal modified parathyroid hormone (pth) analogs
JP4486258B2 (ja) 1998-11-25 2010-06-23 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション ヒト副甲状腺ホルモンの改変、調製および使用
WO2000032771A1 (en) * 1998-11-30 2000-06-08 The General Hospital Corporation Pth1r and pth3r receptors, methods and uses thereof
FR2788058B1 (fr) 1998-12-30 2002-01-25 Sederma Sa Compositions cosmetiques amincissantes
JP2002541779A (ja) 1999-02-24 2002-12-10 ザ ジュネラル ホスピタル コーポレーション シグナル伝達中間体のクローニング方法
WO2000077042A2 (en) 1999-06-15 2000-12-21 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Parathyroid hormone receptor ligands
CO5180628A1 (es) 1999-07-31 2002-07-30 Smithkline Beecham Corp Compuestos calcioliticos
AU7734800A (en) 1999-09-29 2001-04-30 General Hospital Corporation, The Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth)
ATE412670T1 (de) 1999-09-29 2008-11-15 Gen Hospital Corp Parathyroid hormon (pth) polypeptidderivate

Also Published As

Publication number Publication date
BG107242A (en) 2003-06-30
WO2001081415A9 (en) 2002-02-14
WO2001081415A3 (en) 2002-11-28
NO20025143D0 (no) 2002-10-25
IL152384A0 (en) 2003-05-29
AU2001257321B2 (en) 2007-05-17
BR0110391A (pt) 2003-02-25
WO2001081415A2 (en) 2001-11-01
US6756480B2 (en) 2004-06-29
AU5732101A (en) 2001-11-07
JP2004500838A (ja) 2004-01-15
US20030039654A1 (en) 2003-02-27
EA200201121A1 (ru) 2003-06-26
MXPA02010589A (es) 2003-03-10
SK15202002A3 (sk) 2003-06-03
HK1052939A1 (zh) 2003-10-03
KR20030004375A (ko) 2003-01-14
CA2407493A1 (en) 2001-11-01
EP1276767A2 (en) 2003-01-22
HUP0300465A3 (en) 2009-11-30
CN1439021A (zh) 2003-08-27
NO20025143L (no) 2002-12-23
HUP0300465A2 (hu) 2003-06-28
US20040214996A1 (en) 2004-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6756480B2 (en) Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
AU2001257321A1 (en) Parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein antagonists
US20050124537A1 (en) Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
US6677136B2 (en) Glucagon antagonists
CA2349406C (en) Compositions and methods for the prevention or treatment of cancer and bone loss associated with cancer
US6743778B2 (en) Apo-AI/AII peptide derivatives
AU2001257173A1 (en) Apo-AI/AII peptide derivatives
CA2511966A1 (en) Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
US20020090646A1 (en) Calcitonin-related molecules
JP5529014B2 (ja) 部位特異的なペグ化をされた直鎖状のサケカルシトニン類似体
AU2005237128B2 (en) Compositions and Methods for the Prevention or Treatment of Cancer and Bone Loss Associated with Cancer
MXPA01004461A (en) Compositions and methods for prevention or treatment of cancer and bone loss associated with cancer