PT1482046E - Composições de análogos de fec-g e respectivos processos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÕES DE ANÁLOGOS DE FEC-G E RESPECTIVOS

PROCESSOS Âmbito da invenção A presente invenção tem por objecto análogos do factor estimulador de colónias de granulócitos ("FEC-G"). Também tem por objecto composições que contêm esses análogos e composições relacionadas, ácidos nucleicos que codificam os análogos da presente invenção ou ácidos nucleicos relacionados, células hospedeiras e vectores relacionados.

Antecedentes A hematopoiese é controlada por dois sistemas: as células contidas no microambiente da medula óssea e os factores de crescimento. Os factores de crescimento, também designados por factores estimuladores de colónias, estimulam as células progenitoras envolvidas no processo, levando-as a proliferarem e a formarem colónias de diferenciação de células do sangue. Um destes factores é o factor estimulador de colónias de granulócitos, aqui designado por FEC-G, que estimula, preferencialmente, o crescimento e o desenvolvimento de neutrófilos, o que significa que têm uma utilidade potencial em doenças neutropénicas. Welte et al., PMAS-USA 82: 1526-1530 (1985); Souza et al., Science 232: 61-65 (1986) e Gabrilove, J.

Seminars in Hematology 26: (2) 1-14 (1989).

Nos seres humanos o FEC-G endógeno é detectável no plasma sanguíneo. Jones et al., Bailliere's Clinicai 2

Hematology 2 (1): 83-111 (1989). 0 FEC-G e produzido pelos fibroblastos, macrófagos, trofoblastos das células T, células endoteliais e células epiteliais e é o produto da expressão de um gene de uma só cópia constituido por quatro exões e cinco intrões localizados no décimo sétimo cromossoma. A transcrição deste locus produz uma espécie de ARNm que é modificada diferencialmente, dando origem a duas formas de ARNm do FEC-G, uma versão codificando para uma proteina de 177 aminoácidos e a outra codificando para uma proteina de 174 aminoácidos, Nagata, et al., EMBO J 5: 575-581 (1986) e tendo sido comprovado que a forma constituída pelos 174 aminoácidos possui a maior actividade biológica específica in vivo. 0 FEC-G é uma espécie intereactiva, de tal forma que, ao ser administrado o FEC-G humano a um outro mamífero, tal como um murganho, um canino ou um macaco, provoca-se uma leucocitose persistente dos neutrófilos. Moore et al., PNAS-USA 84: 7134-7138 (1987). 0 FEC-G humano pode ser obtido e purificado a partir de inúmeras fontes. 0 FEC-G humano natural (FEE-Ghn), pode ser isolado a partir dos sobrenadantes de linhagens de células tumorais humanas criadas em cultura. 0 desenvolvimento da tecnologia do ADN recombinante, conforme explicado, por exemplo, na patente de invenção norte-americana n° 4 810 643 (Souza), veio permitir a produção, à escala comercial, de quantidades de FEC-G, numa forma glicosilada, sob a forma de um produto de expressão de células hospedeiras eucarióticas e a produção de FEC-G numa forma não glicosilada sob a forma de um produto de expressão de células hospedeiros procarióticas.

Verificou-se que o FEC-G é útil no tratamento de casos em que seja benéfico um aumento de neutrófilos. Por exemplo, no caso de doentes com cancro, o FEC-G e benéfico 3 como meio para estimular, de forma selectiva, a produção de neutrófilos para compensar os deficites hematopoiéticos resultantes da quimioterapia ou da radioterapia. Também podem ser prescritos para o tratamento de diversas doenças infecciosas e estados clincios congéneres, tais como a septicémia que é normalmente provocada por um metabolito de origem bacteriana. 0 FEC-G também é útil quando utilizado por si só ou em combinação com outros compostos, tais como outras citocinas, para induzir o crescimento ou a multiplicação de células em cultura, por exemplo, para os transplantes de medula óssea. A transdução de sinal, que é a via pela qual o FEC-G participa no metabolismo celular, não é ainda um processo perfeitamente conhecido. 0 FEC-G liga-se a um receptor da superfície celular que inicia, aparentemente, as modificações dentro de células progenitoras particulares, levando à diferenciação celular.

Foram já descritos diversos FEC-G modificados. De um modo geral, para a concepção de fármacos, sabe-se que há determinadas modificações que conferem determinados efeitos estruturais. Por exemplo, a supressão de uma cisteína poderia originar o desdobramento de uma molécula que, no seu estado inalterado, se encontra normalmente entrelaçada por uma ponte de dissulfureto. Há outros processos conhecidos para acrescentar, suprimir ou substituir aminoácidos, com o intuito de se modificar a função de uma proteína.

Foram já produzidos mutantes dos FEC-G humanos recombinantes, mas o processo para a sua preparação não inclui informação geral sobre a relação entre a estrutura/função. Por exemplo, foram já descritas a mutação 4 e a modificação bioquímica de Cis 18. Kuga et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 159: 103-111 (1989); Lu et al., Arch. Biochem. Biosphys. 268: 81-92 (1989).

Na patente de invenção norte-americana n° 4.810.643, com o título "Produção do factor estimulador de colónias de granulócitos pluripotentes" ("Production of Pluripotent Granulocyte Colony Stimulating Factor"), (citada supra) estão descritos, genericamente, análogos de polipéptidos e fragmentos peptídicos do FEC-G. Os análogos específicos do FEC-G descritos são aqueles em que os resíduos de cisteína nas posicoes 17, 36, 42, 64 e 74 (das espécies de 174 aminoácidos ou daquelas que possuem 175 aminoácidos, sendo o aminoácido adicional o resíduo metionina do terminal N) substituídos com outro aminoácido (tal como serina) e ainda os FEC-G com uma alanina na primeira posição (terminal N). A patente europeia EP 0 335 423, cm o título "FEC-G humano modificado" ("Modified Human G-CSF) descreve com rigor a modificação de pelo menos um grupo amino num polipéptido que possui actividade de FEC-Gh. A modificação química de FEC-G humano recombinate por PEG (4.500) ou PEG (10.000) já foi descrita em Rita Stake et al., Cell Structure and Function 17: 157-160 (1992); A ligação de PEG a FEC-Ghn aument a sua actividade farmacológica in vivo devido a um semi-período de vida maior no plasma, mas diminui a sua actividade in vitro. O aumento foi superior com PEG (10.000) do que com PEG (4.500). A patente europeia EP 0 272 703 com o título "Novos Polipéptidos" ("Novel Polypeptide") descreve, a preceito, 5 derivados de FEC-G que possuem um aminoácido substituído ou suprimido no "na vizinhança" do terminal N. A patente europeia EP 0 459 630, com o título "Polipéptidos" ("Polypeptides") descreve com minúcia derivados de FEC-G que ocorrem naturalmente e que possuem pelo menos uma das propriedades biológicas dos FEC-G que ocorrem naturalmente e uma estabilidade, em solução, que é pelo menos de 35 % para uma concentração de 5 mg/mL, em que o derivados possui pelo menos um resíduo de Cis17 da sequência natural substituído por um resíduo de Ser17 e possui um resíduo de Asp27 da sequência natural substituído por um resíduo de Ser27. A patente europeia EP 0 256 843, com o título "Expressão de FEC-G, as suas muteínas e as suas utilizações" ("Expression of G-CSF and Muteins Thereof and Their Uses") descreve convenientemente uma sequência de ADN modificada que codifica o FEC-G, em que o terminal N está modificado para uma expressão destacada da proteína em células hospedeiras recombinantes, sem nenhuma modificação da sequência de aminoácidos da proteína. A patente europeia EP 0 243 153 com o título "Human G-CSF Protein Expression" descreve adequadamente os FEC-G que vão ser modificados inactivando pelo menos um local de transformação da protease de levedura KEX2 para que haja um aumento do rendimento da produção recombinante, utilizando levedura. A patente de invenção norte-americana n° 4 904 584, de Shaw, com o título "Modificação de polipéptidos homogéneos específicos do local" ("Site-Specific Homogeneous 6

Modification of Polypeptides") descreve perfeitamente proteínas modificadas pelo resíduo lisina. A patente WO/9012874 descreve adequadamente as variantes de proteínas modificadas pelo resíduo cisteína. 0 pedido de patente de invenção australiana n° AU-A-10948/92, com o título "Activação aperfeiçoada de proteínas recombinantes" ("Improved Activation of Recombinant Proteins") descreve, na perfeição a adição de aminoácidos a qualquer dos terminais da molécula de FSC-G com a finalidade de ajudar a entrelaçar a molécula após a expressão procariótica. O pedido de patente de invenção australiana n° AU-A-76380/91 com o título "Muteínas do factor estimulador de colónias de granulócitos (FEC-G)" ("Granulocyte Colony

Stimulating Factor (G-CSF)") descreve, convenientemente, muteínas do factor estimulador de colónias de granulócitos (FEC-G) na sequência Leu-Gli-His-Ser-Leu-Gli-Ile na posição 50-56 do FEC-G com 174 aminoácidos e na posição 53-59 do FEC-G com 177 aminoácidos e/ou pelo menos um dos quatro resíduos de histidina nas posições 43, 79, 156 e 170 do

FEC-G maduro (perfeitamente desenvolvido) com 174 aminoácidos ou nas posições 46, 82, 159 ou 173 do FEC-G maduro com 177 aminoácidos. A patente GB 2 213 821 com o título "Gene sintético do factor estimulador de colónias de granulócitos humanos" ("Synthetic Human Granulocyte Colony Stimulating Factor Gene") descreve com minúcia uma sequência sintética de ácido nucleico que codifica o FEC-G que incorpora locais de restrição de flanqueio, para facilitar a mutagénese da cassete das regiões seleccionadas e locais de restrição de 7 flanqueio, para facilitar a incorporação do gene num sistema de expressão desejado. 0 FEC-G já foi referenciado como tendo sido cristalizado numa certa medida, por exemplo a patente europeia EP 344.796 e a estrutura global do FEC-G têm sido sujeitas a conjecturas, mas apenas por alto. Bazan, Immunology Today 11: 350-354 (1990): Parry et al., J.

Molecular Recognition 8: 107-110 (1988). Até ao momento presente, não houve mais nenhuma descrição sobre a estrutura geral do FEC-G nem foram realizados estudos sistemáticos sobre a relação entre a estrutura geral e a função da molécula, estudos esses que são essenciais para se conceber e projectar, de forma sistemática, análogos de FEC-G. Assim sendo, é necessário que haja um processo para se conceber e projectar de forma sistemática análogos do FEC-G e para a preparação das composições resultantes.

Sumário da invenção A estrutura tridimensional do FEC-G foi agora determinada ao nivel atómico. A partir desta estrutura tridimensional, é possivel agora antever, com um grau de certeza substancial, o modo como as alterações na composição de uma molécula de FEC-G podem dar origem a modificações estruturais. Estas caracteristicas estruturais podem ser correlacionadas com a actividade biológica para efeitos de concepção e de produção de análogos de FEC-G.

Embora outros autores tivessem especulado a propósito da estrutura tridimensional do FEC-G, Bazan, Immunology Today, 11: 350-354 (1990) e Parry et al., J. Molecular Recognition 8: 107-110 (1988), tais especulações não ajudaram nada aqueles que pretenderam preparar análogos do FEC-G ou porque a estrutura inferida estava incorrecta (Parry et al., supra) e/ou porque a estrutura inferida não deu nenhum detalhe que correlacionasse as partes constituintes com a estrutura. A presente determinação da estrutura tridimensional ao nivel atómico é, de longe, a análise mais completa até à data realizada e proporciona informação importante a todos quantos pretendam conceber e preparar análogos do FEC-G. Por exemplo, a partir da presente análise estrutural tridimensional foram determinadas áreas precisas de hidrofobicidade e de hidrofilicidade. A hidrofobicidade relativa é importante, porque está directamente relacionada com a estabilidade da molécula. De um modo geral, as moléculas biológicas, existentes em ambientes aquosos são extemamente hidrófilas e internamente hidrofobas; de acordo com isto, a segunda lei da termodinâmica, este é o estado energético mais baixo e que confere estabilidade. Embora se tenha especulado sobre a hipótese de núcleo interno do FEC-G poder ser hidrófobo e as áreas exteriores poderem ser hidrófilas, nunca houve forma de se conhecer áreas especificas hidrófobas ou hidrófilas. Munidos do conhecimento actual, respeitante às áreas de hidrofobicidade/hidrofilicidade, é possivel antever, com um grau de certeza substancial, quais as modificações da molécula do FEC-G que irão afectar a estrutura geral da molécula.

Como regra geral, é possivel recorrer ao conhecimento da geografia das regiões hidrofóbicas e hidrofilicas para conceber e projectar análogos em que a estrutura geral do FEC-G não a alterada, mas em que a modificação afecta realmente a actividade biológica (sendo a expressão "actividade biológica" aqui utilizada no seu sentido mais 9 amplo para designar uma função). É possível correlacionar a actividade biológica com a estrutura. Se a estrutura não tiver sido modificada e se a mutação não tiver nenhum efeito sobre a actividade biológica, então a mutação não tem nenhuma função biológica. No entanto, se a estrutura não tiver sido modificada e se a mutação afectar realmente a actividade biológica, então o resíduo (ou o átomo) é essencial, pelo menos para uma função biológica. Alguns dos presentes exemplos experimentais foram concebidos para gue não houvesse nenhumas modificações na estrutura geral, se bem que houvesse uma modificação na função biológica.

Com base na correlação entre estrutura e a actividade biológica, podem gerar-se análogos do FEC-G. Estes análogos são moléculas que possuem mais, resíduos de aminoácidos menos, diferentes ou modificados, da sequência de aminoácidos do FEC-G. As modificações podem ser obtidas por adição, substituição ou supressão de um ou vários residuos de aminoácidos. A modificação pode incluir a adição ou a substituição de análogos dos propórios aminoácidos, tais como peptidomiméticos ou aminoácidos com partes modificadas, tais como grupos laterais modificados. 0 FEC-G utilizado como base de comparação pode ser de origem humana, animal ou obtido por meio da tecnologia do ácido nucleico recombinante (embora os exemplos experimentais aqui descritos tenham por base a produção recombinante das espécies de 174 aminoácidos do FEC-G humano, possuindo um resíduo adicional de metionilo no terminal N). Os análogos podem ter funções diferentes das funções da molécula natural do FEC-G humano ou podem ter as mesmas funções ou ainda graus variáveis das mesmas funções. Por exemplo, os análogos podem ser concebidos para terem uma actividade biológica maior ou menor, um semi-período de vida mais longo ou uma menor estabilidade, para serem mais fáceis de 10 formular ou mais difíceis de combinar com outros ingredientes. Os análogos podem não ter nenhuma actividade hematopoiética e, por esse motivo, podem ser úteis como antagonistas contra o efeito do FEC-G (por exemplo, nos casos em que haja uma produção excessiva de FEC-G). De vez em quando e por razões de conveniência, os análogos aqui descritos recebem a designação de proteínas ou péptidos, mas também estão aqui contemplados outros tipos de moléculas, tais como moléculas peptidomiméticas ou péptidos modificados por via química. A presente invenção tem por objecto análogos particulares de FEC-G. De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto polipéptidos de FEC-G modificados que compreendem uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO: 2 e uma primeira parte química ligada indirectamente, por via de uma segunda parte química, a uma espiral externa; em que a espiral externa é a espiral CD nos aminoácidos 119-145 ou na espiral AB dos aminoácidos 58 a 72; em que a primeira parte química é polietileno-glicol; e em que a metionina do terminal N, ilustrada na SEQ ID NO: 2 é opcional.

As composições relacionadas podem conter um análogo de FEC-G como ingrediente activo. A expressão "composição congénere ou relacionada", tal como aqui utilizada, designa uma composição que pode ser obtida logo que confirmada a identidade do análogo do FEC-G (tal como um análogo de FEC-G marcado com um marcador detectável, um receptor congénere ou uma composição farmacêutica). Também se consideram como composições congéneres ou relacionadas as versões quimicamente modificadas dos análogos de FEC-G, tais como aqueles aos quais esteja acoplada pelo menos uma molécula de polietileno-glicol. 11

Por exemplo, é possível preparar um análogo de FEC-G ao qual está acoplado um marcador detectável, tal como uma molécula fluorescente, quimioluminescente ou radioactiva.

Outro exemplo é uma composição farmacêutica que pode ser formulada por meio de técnicas conhecidas, utilizando materiais conhecidos, ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 18042), páginas 1435-1712. De um modo geral, a formulação vai depender de inúmeros factores, tais como a via de administração, a estabilidade, os parâmetros de produção e outros factores. O análogo de FEC-G pode ser administrado por injecção ou pode ser administrado aos pulmões por inalação. Também estão disponíveis formas de dosagem entéricas para as composições dos análogos de FEC-G da presente invenção e, consequentemente, a administração por via oral pode ser eficaz. Os análogos de FEC-G podem ser incorporados em lipossomas ou noutros microveículos para efeitos de administração e podem ser formulados em géis ou noutras composições de libertação sustentada. Embora as composições preferenciais possam variar em função da utilização que lhes está destinada, geralmente, no caso dos análogos de FEC-G que possuam pelo menos uma das actividades biológicas dos FEC-G naturais, as composições farmacêuticas preferidas são as preparadas para injecção subcutânea ou para administração pulmonar por inalação, embora as formulações particulares para cada tipo de administração dependerão das características do análogo.

Um outro exemplo de uma composição congénere é um receptor para um análogo da presente invenção. Tal como aqui utilizado, o termo "receptor" designa um radical que se liga de forma selectiva à molécula do análogo da 12 presente invenção. Por exemplo, é possível utilizar, como receptores, anticorpos ou os seus fragmentos ou "anticorpos recombinantes" (ver Huse et al., Science 246: 1275 (1989)). A ligacao selectiva não significa apenas uma ligação específica (embora aqui estejam contemplados os receptores específicos da ligação), mas também significa que a ligação não é um fenómeno aleatório. Os receptores podem estar na superfície da célula ou podem ser intracelulares ou extracelulares e podem actuar de modo a inibirem ou localizarem a actividade biológica dos análogos da presente invenção. A ligação ao receptor também pode ser um mecanismo que desencadeie uma cascata de actividade indirectamente relacionada com o próprio análogo. Também se contemplam também aqui os ácidos nucleicos, os vectores que contenham esses ácidos nucleicos e as células hospedeiras que contenham esses ácidos nucleicos que codificam esses receptores.

Um outro exemplo de uma composição congénere é um análogo de FEC-G com um radical químico acoplado. De um modo geral, a modificação química pode alterar a actividade biológica ou as propriedades antigénicas de uma proteína ou pode alterar outras características, devendo tais factores ser tidos em consideração pelos especialistas na matéria. Conforme se disse antes, um exemplo de um tal radical químico é o polietileno-glicol. A modificação pode incluir a adição de uma ou mais moléculas poliméricas hidrofílicas ou hidrofóbicas, moléculas de ácidos gordos ou moléculas de polissacáridos. Exemplos de modificadores químicos incluem polietileno-glicol, alquil-polietileno-glicóis, Dl-poli-(aminoácidos), polivinil-pirrolidona, álcool polivinílico, copolímeros de pirano, ácido acético/acilação, ácido propiónico, ácido palmítico, ácido esteárico, dextrano, carboximetil-celulose, pululano ou agarose. Ver, Francis, 13

Focus on Growth Factors 3: 4-10 (Maio de 1992) (publicado por Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, Londres N20 OLD, RU) . A modificação química também pode compreender uma outra proteína ou uma sua porção, a utilização de um agente citotóxico ou de um anticorpo. A modificação química também pode compreender a lecitina.

Também se descrevem aqui ácidos nucleicos que codificam esses análogos. Os ácidos nucleicos podem ser ADN ou ARN ou os seus derivados e irão ser, normalmente, clonados e expressos num vector, tal como um fago ou um plasmido que contenha as sequências reguladoras adequadas. Os ácidos nucleicos podem ser marcados (por exemplo, utilizando um marcador radioactivo, quimioluminescente ou fluorescente) para fins de diagnóstico ou de prognóstico. A sequência de ácidos nucleicos pode ser optimizada para efeitos de expressão, por exemplo, incluindo codões preferenciais para efeitos de expressão bacteriana. Também estão contemplados o ácido nucleico e a sua cadeia helicoidal complementar e ainda as suas modificações que não impeçam a codificação do análogo pretendido.

Também se descrevem aqui células hospedeiras que contenham os ácidos nucleicos referidos supra que codifiquem os análogos da presente invenção. As células hospedeiras podem ser eucarióticas ou procarióticas e os sistemas de expressão podem compreender etapas complementares referentes ao acoplamento (ou à prevenção) de grupos açúcar (glicosilação), o entrelaçamento adequado da molécula, a adição ou a supressão de sequência líderes ou outros factores associados à expressão recombinante. A presente invenção também propicia programas informáticos para serem usados para a expressão (por 14 exemplo, para permitir a visualização) do FEC-G ou estruturas tridimensionais de um seu análogo e também programas informáticos que podem ser utilizados para expressar a identidade de cada constituinte de uma molécula de FEC-G e a localização exacta desse constituinte dentro da estrutura global, indo até ao nivel atómico. Apresenta-se mais adiante um exemplo de um desses programas. Presentemente, há disponíveis inúmeros programas informáticos para a expressão da estrutura tridimensional de uma molécula. De um modo geral, estes programas providenciam a introdução das coordenadas para a estrutura tridimensional de uma molécula (isto é, por exemplo, a atribuição de um valor numérico a cada átomo de uma molécula do FEC-G, segundo os eixos das coordenadas x, y e do eixo dos z), meios para expressar (por exemplo, mostrar visualmente) essas coordenadas, meios para alterar tais coordenadas e meios para expressar uma imagem de uma molécula em que tais coordenadas tenham sido alteradas. É possível programar informação cristalográfica, isto é, as coordenadas da localização dos átomos de uma molécula de FEC-G no espaço tridimensional, em que tais coordenadas tenham sido obtidas por análise cristalográfica da referida molécula de FEC-G, nesses programas para gerar um programa informático para a expressão (por exemplo, para visualizar) da estrutura tridimensional do FEC-G. Assim, pode-se utilizar um programa informático para a expressão da estrutura tridimensional de um análogo do FEC-G. É preferível o programa informático Insight II, versão 4, que pode ser obtido na Biosym, San Diego, Califórnia, com as coordenadas dadas a conhecer na figura 5. Os meios de expressão preferidos são os do computador Silicon Graphics 320 VGX, com lentes de Crystal Eyes (também disponíveis na Silicon Graphics), que permitem observar, estereoscopicamente, a molécula de FEC-G ou de um seu 15 análogo. Em alternativa, as presentes coordenadas cristalográficas do FEC-G e os correspondentes valore numéricos de difracção também estão depositados no banco de dados de proteínas do Chemistry Department, Brookhaven National Laboratory, Upton, Nova Iorque 119723, E.U.A. Estes valores numéricos podem ser utilizados para a preparação de um programa informático diferente para a expressão da estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G ou de um seu análogo. Pode-se utilizar um programa informático para a expressão da estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G. Também se pode utilizar o referido programa informático para permitir visualizar a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G; e ainda, o referido programa pode ter uma configuração que pemita alterar tal visualização. 0 equipamento é útil para a expressão desses programas informáticos, em particular para visualizar, em computador, a imagem da referida estrutura tridimensional, de uma molécula de FEC-G ou de um seu análogo e proporciona ainda os meios para a preparação do referido programa informático e do referido equipamento. 0 programa informático é útil para a preparação de análogos de FEC-G, uma vez que permite que se faça a selecção de locais específicos da molécula de FEC-G para efeitos de alteração e determinação imediata do efeito que tal alteração irá ter na estrutura global da molécula de FEC-G. A selecção do referido local, para efeitos de alteração, vai depender da característica biológica desejada do análogo de FEC-G. No caso de se pretender modificar aleatoriamente a referida molécula de FEC-G (FEC-G-hu-met-r), seriam possíveis 17520 substituições e ainda seriam possíveis mais análogos em que houvesse modificações, adições ou supressões múltiplas. Graças ao facto de se ver a estrutura tridimensional em que a 16 referida estrutura está correlacionada com a composição da molécula, a escolha dos locais de alteração deixa de ser um fenómeno aleatório, podendo os locais de alteração ser determinados racionalmente.

Conforme foi explicado antes, a identidade da estrutura tridimensional do FEC-G, incluindo a colocação de cada constituinte, até ao nivel atómico, veio agora proporcionar informação que permite concluir quais os radicais que são necessários para se manter a estrutura global da molécula de FEC-G. Assim, é possível escolher se se deve manter a estrutura global da molécula de FEC-G, ao preparar um análogo de FEC-G da presente invenção ou se se deve modificar (e como) a estrutura global da molécula de FEC-G ao preparar um análogo de FEC-G da presente invenção. Eventualmente, uma vez preparado tal análogo, é possível ensaiá-lo para se pesquisar uma caracteristicas desejada.

Por exemplo, é possível procurar conservar a estrutura global de uma molécula de FEC-G natural não alterada ou recombinante. A estrutura global está representada nas figuras 2, 3 e 4 e está descrita com mais detalhe a seguir. A conservação da estrutura global pode garantir a ligação ao receptor, uma característica necessária para um análogo que possua as capacidades hematopoiéticas do FEC-G natural (se não houver ligação ao receptor, não há transdução do sinal em consequência da presença do análogo). Está considerado que uma das classes dos análogos de FEC-G possui a estrutura nuclear tridimensional de uma molécula de FEC-G natural ou recombinante (não alterada) , se bem que possua caracteristicas estruturais globais diferentes, tais como uma capacidade maior para estimular selectivamente os neutrófilos. Uma outra classe de análogos de FEC-G é constituída pelos que possuem uma estrutura global 17 diferente que diminui a capacidade de uma molécula de um análogo do FEC-G para se ligar a um receptor do FEC-G e que possui uma menor aptidão para estimular os neutrófilos de forma selectiva, comparativamente com o FEC-G recombinante ou natural não alterado.

Por exemplo, sabe-se agora quais são os radicais existentes nas regiões internas de uma molécula de FEC-G que são hidrofóbicos e, correspondentemente, sabe-se quais são os radicais existentes na parte externa das moléculas de FEC-G que são hidrófilas. Sem se conhecer a estrutura tridimensional global, de preferência ao nivel atómico, tal como consta da presente invenção, não seria possível prever quais as alterações nessas zona interna hidrófoba que daria origem a uma modificação da conformação estrutural global da molécula. Uma modificação estrutural global pode dar origem a uma modificação funcional, por exemplo, falta de ligação ao receptor e, consequentemente, por exemplo, uma diminuição da actividade biológica, tal como verificado no FEC-G não alterado. Uma outra classe de análogos de FEC-G é pois constituída pelos análogos de FEC-G que possuem a mesma hidrofobicidade do FEC-G recombinante ou natural (não alterado). Mais particularmente, há uma outra classe de análogos de FEC-G que possuem os mesmos radicais hidrofóbicos contidos nos quatro feixes helicoidais do seu núcleo interno, correspondentes aos radicais hidrofóbicos existentes num FEC-G recombinante ou natural (não alterado), se bem que tenha uma composição diferente da do referido FEC-G recombinante ou natural não alterado.

Outro exemplo diz respeito às espiras externas que são estruturas que ligam o núcleo interno (hélices) da molécula do FEC-G. A partir da estrutura tridimensional - incluindo a informação respeitante à localização espacial dos 18 resíduos de aminoácidos - é possível prever que determinadas modificações, em determinadas espiras, não irão ter como resultado modificações conformacionais globais. Assim sendo, outra classe de análogos de FEC-G aqui descrita é aquela que possui as espiras externas modificadas, mas a mesma estrutura global do FEC-G recombinante ou natural (não alterada). Mais particularmente, uma outra classe de análogos de FEC-G aqui descrita é constituída pelos análogos que possuem espiras externas modificadas, sendo tais espiras escolhidas no conjunto constituído pelas que estão entre as hélices A e B; entre as hélices B e C; entre as hélices C e D; e entre as hélices D e A, nos termos em que tais espiras e hélices estão aqui identificadas. Mais particularmente, as referidas espiras, de preferência a espira AB e/ou a espira CD são modificadas para aumentar o semi-periodo de vida da molécula, mediante a estabilização de tais espiras. Tal estabilização pode ser conseguida unindo a totalidade ou uma parte das referidas espiras a uma parte de um feixe helicoidal existente no núcleo de uma molécula de FEC-G (ou de um seu análogo) . Tal união pode ser realizada por meio de uma folha β, por ponte de sal, por pontes de dissulfureto, por interacção hidrofóbica ou por qualquer outro meio de união conhecido pelos especialistas na matéria, servindo tais meios de união para estabilizar as referidas expiras externas ou espiras. Por exemplo, é possível estabilizar as espiras AB ou CD unindo a espira AB a uma das hélices contidas na região interna da molécula. 0 terminal N também pode ser modificado sem alteração da estrutura global de uma molécula de FEC-G, uma vez que o terminal N não participa na estabilidade estrutural das hélices internas, aplicando-se os mesmos preceitos gerais 19 ao terminal N, embora as espiras externas sejam preferíveis para efeitos de modificação.

Por outro lado, tais espiras externas podem ser os locais para a modificação química, uma vez que nos FEC-G recombinantes ou naturais (não alterados) tais espiras são relativamente flexíveis e têm tendência a não interferirem com a ligação ao receptor. Assim, poderia haver mais espaço para que um radical químico fosse acoplado directamente (ou acoplado indirectamente através de outro radical químico que sirva de meio químico de união). 0 radical químico pode ser seleccionado entre diversos radicais convenientes para a modificação de uma ou várias funções de uma molécula de FEC-G. Por exemplo, uma espira externa pode proporcionar locais para a adição de um ou mais polímeros, com a finalidade de se aumentar o semi-período de vida sérico, por exemplo, utilizando uma molécula de polietileno-glicol. É possível adicionar tais moléculas de polietileno-glicol nos casos em que a referida espira é alterada para conter mais resíduos lisina que possuem grupos secundários reactivos aos quais as moléculas de polietileno-glicol são capazes de se ligarem. Há outras classes de radicais químicos que também podem ser acoplados a uma ou mais espiras externas, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a ligação a outras moléculas biologicamente activas, tais como receptores, outras proteínas terapêuticas (tal como outros factores hematopoiéticos que poderiam dar origem a uma molécula híbrida) ou agentes citotóxicos (tais como a toxina da difteria). Esta listagem não é exaustiva; um especialista na matéria, tendo à sua disposição o radical químico desejado, sabe como realizar o acoplamento do referido radical desejado à espira externa desejada. Assim sendo, há uma outra classe de análogos de FEC-G constituída por 20 aqueles que em que há pelo menos uma alteração numa espira externa, em que a referida alteração consiste na adição de um radical químico, por exemplo, pelo menos uma molécula de polietileno-glicol.

De acordo com isto, a presente invenção providencia um polipéptido de FEC-G modificado com uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO: 2 e uma preimeir aporção química ligada indirectamente, por via de uma segunda parte química, a uma espira externa; em que a primeira porção química é polietileno-glicol; e em que a metionina do terminal N, indicada na SEQ ID NO: 2, é opcional. Num aspecto, a segunda parte química é um polímero.

Também podem ser efectuadas, nas espiras externas, supressões, tais como supressões de locais reconhecidos pelas proteínas para degradação da molécula. Isto proporciona meios alternativos para aumentar o semi-período de vida de uma molécula que, de outra forma, teria capacidade para se ligar ao receptor de FEC-G e para efectuar a transdução do sinal (isto é, a capacidade para estimular selectivamente a maturação dos neutrófilos). Por isso, há uma outra classe de análogos de FEC-G aqui descritos, constituída por aqueles em que foi realizada pelo menos uma alteração numa espira externa, em que tal alteração faz diminuir a degradação desses referidos análogos pela acção das proteases. As espiras preferidas para tais alterações são a espira AB e a espira CD. É possível preparar uma molécula de FEC-G mais curta suprimindo uma parte dos resíduos aminoácidos existentes nas espiras externas (adiante identificados mais minuciosamente) , podendo a referida molécula mais curta de 21 FEC-G ter outras vantagens na preparação ou na função biológica.

Outro exemplo diz respeito às cargas eléctricas relativas entre os resíduos aminoácidos que estejam na proximidade uns dos outros. Conforme se disse antes, a molécula de FEC-G contem um feixe de quatro hélices relativamente coeso. Algumas das faces das hélices estão voltadas para as outras hélices. No ponto (por exemplo, um resíduo) em que uma hélice está voltada para a outra hélice, os dois radicais de aminoácidos que se encontram voltados um para o outro podem ter a mesma carga e, por tal motivo, tendem a repelir-se mutuamente, o que confere instabilidade à molécula na sua totalidade. Isto pode ser eliminado modificando a carga eléctrica (passando-a para uma carga eléctrica oposta ou para uma carga neutra) de um ou dos dois radicais de aminoácidos, por forma que deixe de haver repulsão. Por isso, há outra classe de análogos de FEC-G constituída pelos análogos de FEC-G em que foram introduzidas alterações para modificar a instabilidade originada pelas interacções superficiais, tais como a localização da carga do electrão. A presente invenção também tem por objecto processos para conceber análogos de FEC-G e composições congéneres e ainda os produtos resultantes da aplicação de tais processos. Os produtos finais obtidos por tais processos podem ser os análogos de FEC-G, tal definidos supra ou composições congéneres. Assim sendo, os exemplos aqui descritos demonstram: (a) os efeitos de substituições nos constituintes (isto é, radicais químicos) da molécula do FEC-G na estrutura do FEC-G e (b) os efeitos de modificações na estrutura e nas funções biológicas. 22

Essencialmente, um processo para a preparação de um análogo de FEC-G pode compreender as etapas seguintes: (a) pesquisar informação sobre a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, em que os radicais quimicos, tais como cada um dos resíduos de aminoácidos ou cada átomo de cada um dos resíduos de aminoácidos, da molécula do FEC-G, estejam correlacionados com a referida estrutura; (b) selecionar, da referida informação, um local numa molécula de FEC-G, para sofrer uma alteração; (c) preparar uma molécula de um análogo de FEC-G que possua tal alteração; e (d) eventualmente, analisar essa molécula do análogo de FEC-G em relação à característica desejada.

Pode-se utilizar os programas informáticos aqui descritos para um processo com base num computador, para a preparação de um análogo de FEC-G. 0 processo com base num computador, para a preparação de um análogo de FEC-G pode compreender as etapas de: (a) providenciar a expressão, por meio do computador, da estrutura tridimensional da molécula de FEC-G em que os radicais químicos, tais como cada um dos resíduos de aminoácidos ou cada átomo de cada um dos resíduos de aminoácidos da molécula de FEC-G, estejam correlacionados com a referida estrutura; (b) selecionar, da referida expressão feita por computador, um local numa molécula de FEC-G para sofrer uma alteração; (c) preparar uma molécula de FEC-G que possua tal alteração; e 23 (d) eventualmente analisar essa molécula de FEC-G em relação à característica desejada.

Mais especificamente, um processo para a preparação de um análogo de FEC-G pode compreender as etapas seguintes: (a) a visualização da estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, por meio de um computador, sendo tal computador programado (i) para expressar as coordenadas de uma molécula de FEC-G no espaço tridimensional e (ii) para permitir a entrada de informação para a alteração da referida expressão do FEC-G e a sua visualização; (b) escolha de um local na referida imagem visual da referida molécula de FEC-G para alteração; (c) introdução, no referido computador, da informação para a referida alteração; (d) visualização da estrutura tridimensional da referida molécula de FEC-G alterada por meio do referido computador; (e) eventualmente, repetição das etapas (a) - (d) ; (f) preparação de um análogo de FEC-G com a referida alteração; e (g) eventualmente, análise do referido análogo de FEC-G para pesquisar uma caracteristica desejada.

Também se descrevem processos para utilizar estes análogos de FEC-G e as composições congéneres e processos para o tratamento ou para a protecção de mamíferos, quer por si sós quer combinados com outros fármacos ou factores hematopoiéticos, no tratamento de distúrbios hematopoiéticos. Considera-se que um aspecto da concepção dos análogos de FEC-G venha a ser o objectivo de aumentar 24 ou modificar as caracteristicas não modificadas que se sabe que o FEC-G possui.

Por exemplo, os análogos aqui descritos podem possuir actividades mais intensas ou modificadas, pelo que, no caso de o FEC-G ser útil para o tratamento (por exemplo) de neutropénia, as composições e os processos aqui descritos podem também ser utilizados.

Outro exemplo é a modificação do FEC-G com o objectivo de interagir mais eficientemente quando utilizado em combinação com outros factores, em particular no tratamento de distúrbios de natureza hematopoiética. Um exemplo de uma utilização dessa combinação consiste em utilizar um factor hematopoiético de actuação precoce (isto e, um factor que actue precocemente na cascata da hematopoiése em células relativamente indiferenciadas) e em utilizar simultânea ou sequencialmente um factor hematopoiético que actue mais tarde, tal como o FEC-G ou um seu análogo (uma vez que o FEC-G actua sobre a linhagem de GMU-FC (o mesmo que CFU-GM) na estimulação selectiva dos neutrófilos). Os processos e as composições aqui descritos podem ser úteis em terapêuticas que envolvam tais combinações ou "misturas" de factores hematopoiéticos.

As composições e processos descritos também podem ser úteis para o tratamento de leucopénia, leucemia mielogénica, neutropénia crónica grave, anemia aplásica, doença de armazenagem do glicogénio, mucosistite e outras doenças associadas à insuficiência de medula óssea. As composições e os processos descritos também podem ser úteis para o tratamento de défices hematopoiéticos resultantes de quimioterapia ou de radioterapia. 0 sucesso de um transplante de medula óssea ou a utilização, por exemplo, 25 de células progenitoras do sangue periférico para transplante são situações que podem ser melhoradas mediante a aplicação dos processos e das composições descritos (proteinas ou ácidos nucleicos para terapêutica genética). As composições e os processos descritos também podem ser úteis para o tratamento de doenças infecciosas, tal como sucede no caso da cicatrização de ferimentos, no tratamento de queimaduras, na bacterémia, na septicémia, nas infeccoes fúngicas, na endocardite, na osteopielite, nas infecções associadas ao trauma abdominal, nas infecções que não respondem aos antibióticos e nas pneumonias e o tratamento de inflamações bacterianas que podem também beneficiar da aplicação das composições e dos processos descritos. Além disso, as composições e os processos descritos podem ser úteis para o tratamento de leucemia, devido à capacidade assinalada para a diferenciação das células leucémicas. Welte et al., PNAS-USA' 82: 1526-1530 (1985). Outras aplicações incluem o tratamento de indivíduos com tumores, utilizando as composições e os processos descritos, eventualmente na presença de receptores (tais como anticorpos) que se liguem as células tumorais. Para artigos de revisão sobre aplicações terapêuticas ver Lieshhke e Burgess, N. Engl. J. Med. 327: 28-34 e 99-106 (1992).

As composições e processos descritos também podem ser úteis para actuarem como produtos intermédios para a produção de outros radicais; por exemplo, foi já assinalado que o FEC-G influencia a produção de outros factores hematopoiéticos e esta função (se confirmada) pode ser reforçada ou modificada através das composições e/ou dos processos da presente descritos.

As composições relacionadas com os análogos de FEC-G descritos, tais como os receptores, podem ser úteis para 26 actuarem como antagonistas que impeçam a actividade do FEC-G ou de um seu análogo. É possível obter uma composição com a totalidade ou com uma parte da actividade do FEC-G não alterada ou de um análogo de FEC-G e acrescentar um ou vários radicais químicos para modificar uma ou várias propriedades de tal FEC-G ou de um seu análogo. Tendo conhecimento desta conformação tridimensional, um especialista pode prever qual a melhor localização geográfica para tal modificação química, de modo a obter o efeito pretendido.

Os objectivos gerais das modificações químicas podem incluir o aumento do semi-período de vida (por exemplo, uma depuração renal, imunológica ou celular reduzida), uma bioactividade alterada (por exemplo, propriedades enzimáticas alteradas, bioactividades dissociadas ou actividade em dissolventes orgânicos), toxicidade reduzida (por exemplo, eliminação de epítopos tóxicos, compartimentação e biodistribuição selectiva), imunor-reactividade modificada (imunogenicidade reduzida, antigenicidade reduzida ou acção adjuvante) ou propriedades físicas modificadas (por exemplo, maior solubilidade, maior estabilidade térmica, maior estabilidade mecânica ou estabilização conformacional). Ver, Francis, Focus on Growth factors 3: 4-10 (Maio de 1992) (publicado por Mediscript, Mountview Court, Friem Barnet Lane, London N20 OLD, RU).

Os exemplos que se seguem ilustram a presente invenção sem contudo a limitarem. Entende-se que há variações e modificações que podem ocorrer aos especialistas na matéria, e entende-se que as reivindicações anexas todas essas variantes equivalentes que estão contidas no âmbito da presente invenção, tal como reivindicada. 27

Descrição detalhada dos desenhos A figura 1 é uma ilustração da sequência de aminoácidos das 174 espécies de aminoácidos de FEC-G com mais uma metionina no terminal N (Seq ID N° 1) (Seq ID N°: 2) . A figura 2 é um diagrama topológico da estrutura cristalina do FEC-G e também de HCh, HCp, FEC-GM INF-β, IL-2 e IL 4. Estas ilustrações têm por base as referências citadas. 0 comprimento dos elementos estruturais secundários está desenhado na proporção do número de residuos. As hélices A, B, C e D são marcadas em conformidade com o esquema aqui utilizado para o FEC-G. No caso do INF-β a marcação original das hélices está indicada entre parenteses. A figura 3 e um "diagrama de serpentina" da estrutura tridimensional do FEC-G. A hélice A é constituída pelos resíduos aminoácidos 11-39 (numerados de acordo com a figura 1 supra), a hélice B é constituída pelos resíduos de aminoácidos 72-91, a hélice C é constituída pelos resíduos de aminoácidos 100-123 e a hélice D é constituída pelos resíduos de aminoácidos 143-173. A hélice relativamente curta 310 está nos resíduos de aminoácidos 45-48 e a hélice alfa está nos resíduos de aminoácidos 48-53. Os resíduos 93-95 constituem quase uma volta completa de uma hélice levógira. A figura 4 é um "diagrama de cilindros" da estrutura tridimensional do FEC-G. Os cilindros completos e as suas orientações para a estrutura tridimensional do FEC-G estão ilustrados por meio de diversos tons de cinzento. Os números indicam a posição dos resíduos de aminoácidos em conformidade com a figura 1 supra. A figura 5 é uma listagem das coordenadas utilizadas para se gerar uma imagem visual da estrutura tridimensional do FEC-G por meio de um computador. Tais 28 coordenadas estão explicitadas a seguir. As colunas correspondem a campos independentes: (i) Campo 1 (a partir do lado esquerdo) é o átomo, (ii) Campo 2 é o número atribuído ao átomo, (iii) Campo 3 é o nome do átomo (de acordo com a nomenclatura convencional da tabela periódica, sendo CB o átomo de carbono beta, CG o átomo de carbono gama; etc.), (iv) Campo 4 é o tipo de resíduo (de acordo com a nomenclatura de três letras para os aminoácidos, por exemplo, conforme consta, por exemplo, em Stryer, Biochemistry, 3a Ed., W.H. Freeman e

Company, N.Y., 1988, no verso da contracapa; (v) Campos 5-7 são as posições do átomo no eixo dos x, no eixo dos y e no eixo dos z; (vi) Campo 8 (frequentemente um "1.00") designa uma ocupação nessa posição; (vii) Campo 9 designa o factor B; (viii) Campo 10 indica a designação da molécula. Há três moléculas (designadas por a, b e c) do FEC-G que cristalizaram conjuntamente, formando uma unidade. A designação a, b ou c indica quais as coordenadas pertencentes a cada molécula. O número a seguir à letra (1, 2 ou 3) indica a posição atribuída ao resíduo de aminoácido, tendo sido atribuídas à molécula A as posições 10-175, à molécula B as posições 210-375 e à molécula C as posições 410-575. Estas posições foram assim definidas para que não houvesse nenhuma sobreposição entre as três moléculas que cristalizaram conjuntamente. (O símbolo "W" significa água). 29 A figura 6 é uma representação esquemática da estratégia associada ao refinamento da matriz de cristalização para os parâmetros implicados na cristalização. A matriz de cristalização corresponde à concentração final dos componentes (sais, tampões e agentes de precipitação) das soluções de cristalização contidas nas cavidades de uma placa de 24 cavidades para cultura de tecidos. Estas concentrações são obtidas pipetando o volume adequado de soluções-mãe para dentro das cavidades da placa de microtitulação. Para conceber a matriz, um especialista em cristalografia decide-se sobre uma maior ou menor concentração do componente. Estas concentrações maiores ou menores podem ser obtidas por meio de uma pipeta, quer ao longo das diversas fileiras (por exemplo, Al-A6, B1-B6, C1-C6 ou D1-D6) , quer ao longo de todo o tabuleiro (A1-D6) . 0 primeiro processo é útil para confirmar a reprodutibilidade do crescimento cristalino de um único componente ao longo de um número limitado de cavidades, enquanto o último processo é mais útil na pesquisa inicial. Os resultados das diversas fases de refinamento da matriz de cristalização estão ilustrados por uma representação de três placas. 0 aumento dos tons de sombreado nas cavidades indica um resultado positivo de cristalização, podendo ser, nas fases finais, cristais de qualidade confirmada por raios X, mas que, nas fases iniciais, poderiam ser goticulas de óleo, precipitados granulares ou pequenos cristais com dimensões sensivelmente inferiores a 0,05 mm. A parte A representa uma pesquisa inicial de um parâmetro em que o intervalo de concentração entre a primeira cavidade (Al) e a última cavidade (D6) é grande, sendo o aumento de concentração entre cavidades calculado pela expressão ((concentração em Al) - (concentração em 30 D6))/23). A parte B representa o facto de o refinamento da matriz de cristalização entre AI e D6, nas fases finais, vir a ser reduzido, o que resultaria na formação de mais cristais por placa. A parte C indica uma fase final do refinamento da matriz, em que são encontrados cristais de qualidade na maior parte das cavidades da placa.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção assenta na descoberta da estrutura tridimensional do FEC-G. Esta estrutura tridimensional foi expressa por meio de um proqrama informático para efeitos de visualização estereoscópica. Ao efectuar tal observação, estereoscopicamente, conceberam-se e produziram-se as relações entre estrutura e funções para os análogos de FEC-G.

Estrutura tridimensional geral do FEC-G 0 FEC-G utilizado para a determinação da estrutura foi uma espécie não glicosilada de 174 espécies de aminoácidos, com mais um residuo de metionina no terminal N, para a expressão bacteriana. As sequências de ADN e de aminoácidos deste FEC-G estão ilustradas na figura 1.

Em termos gerais, a estrutura tridimensional do FEC-G é predominantemente helicoidal, com 103 dos 175 resíduos a formarem um feixe helicoidal 4-alfa. A outra única estrutura secundária está na espira entre as primeiras duas hélices compridas, em que uma hélice 3 de 4 resíduos e seguida imediatamente por uma hélice alfa de 6 resíduos. Conforme se observa na figura 2, comparou-se a estrutura geral com a estrutura atribuída a outras proteínas: hormona 31 do crescimento (Abdel-Meguid et al., PNAS-USA 84: 6434 (1987) e Vos et al., Science 255: 305-312 (1992)), factor estimulador das colónias de macrófagos e granulócitos (Diederichs et al., Science 254: 1779-1782 (1991), interferão B (Senda et al., EMBO J. 11: 3193-3201 (1992)), interleucina 2 (McKay, Science 257: 1673-1677 (1992)) e interleucina 4 (Powers et al., Science 256: 1673-1677 (1992) e Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992)). Há uma similitude estrutural entre estes factores de crescimento, apesar da ausência de similitude nas suas sequências de aminoácidos. A informação estrutural disponível presentemente é a correlação da bioquímica do FEC-G e, tal facto, pode ser resumido conforme a seguir se indica (estando a posição 1 da sequência no terminal N):

Posição da sequência 1-10 Cis 18 34 20-47 (inclusive)

Descrição da estrutura

Análise A supressão não provoca nenhuma perda da actividade biológica Reactiva com DTNB e timersosol, mas não com acetato de iodo Local alternativo de junção A insersão reduz a actividade biológica Hélice A, primeira ponte A região de ligação prevista ao receptor com dissulfureto e parte da por base nos dados de anticorpos de hélice AB neutralização A mutação de uma única alanina dos resíduos

Cadeia alargda Parcialmente encoberta 20, 23, 24 165-175 (inclusive)

Hélice A

Terminal carboxi reduz a actividade biológica. A previsível ligação do receptor (local B) A supressão reduz a actividade biológica

Esta informação bioquímica, obtida a partir de estudos de ligação de anticorpos, ver Layton et aL, Biochemistry 266: 23815-23823 (1991), foi sobreposta à estrutura tridimensional com a finalidade de se conceber análogos de FEC-G. A concepção, preparação e a análise destes análogos de FEC-G está descrita no exemplo 1 que se segue. EXEMPLO 1 32

Este exemplo descreve a preparação do FEC-G cristalino, a visualização da estrutura tridimensional do FEC-G humano recombinante, por meio de imagens geradas por computador, a preparação de análogos, utilizando a mutagénese dirigida ao local ou processos de amplificação dos ácidos nucleicos, ensaios biológicos e análises por CLAR utilizadas para analisar os análogos de FEC-G e fazer a determinação resultante das relações gerais entre estrutura/funções. A. Utilização da cristalização automatizada A necessidade de se encontrar uma estrutura tridimensional para o factor estimulador de colónias de granulócitos humanos recombinantes (FEC-G-hu-r) e a disponibilidade de grandes quantidades de proteína purificada, levaram à concepção de processos de crescimento de cristais por amostragem factorial incompleta e inoculação. Começando com a implementação do processo de cristalização factorial incompleta, descrito por Jancarik e Kim, J. Appl. Crystallogr. 24: 409 (1991), efectuou-se uma avaliação das condições da solução que produzissem gotículas de óleo e agregados bi-refringentes. Além disso, efectuou-se também as necessárias modificações do equipamento e dos programas informáticos de um sistema de pipetagem automático para assim se produzir, diariamente, cerca de 400 condicoes de cristalização diferentes. Weber, J. Appl. Crystallogr. 20: 366-373 (1987). Este procedimento conduziu a uma solução de cristalização que produziu cristais de FEC-G-hu-r. O tamanho, a reprodutibilidade e a qualidade dos cristais são características que foram aperfeiçoadas por meio de um processo de inoculação em que o número de 33 "unidades iniciadoras da nucleação" foi estimado por diluição em série de uma solução inoculante. Estes processos proporcionaram o crescimento reprodutivel de cristais de FEC-G-hu-r com 2,0 mm. O grupo espacial destes cristais é Ρ2χ2ι2ι com as dimensões celulares definidas por a = 90 Â, b=110 Â e c=49 Â e difractando para uma resolução de 2,0 Ã. 1. Metodologia geral

Para pesquisar as condições de cristalização de uma nova proteina, Cárter e Cárter, J. Biol. Chem. 254: 122219-12223 (1979) propuseram o processo factorial incompleto. Sugeriram que uma amostragem de um grande número de condições de cristalização seleccionadas aleatoriamente, mas geralmente prováveis, pode conduzir a uma combinação bem sucedida de reagentes que produzem a cristalização da proteina. Esta ideia foi levada à prática por Jancarik e Kim, J. Appl. Crystallogr. 24: 409 (1991), que descreveram 32 soluções para as experiâncias iniciais de cristalização, num intervalo de valore de pH e para um conjunto de sais e de agentes de precipitação. Descreve-se aqui uma extensão das suas experiências para um conjunto alargado de 70 soluções. Para se minimizar o esforço e os erros humanos da preparação das soluções, programou-se o processo para ser executado por uma máquina de pipetagem automática.

Seguindo o processo de Weber de pesquisa sequencial automática da rede (PSAR, o mesmo que SAGS), J. Cryst. Growth 90: 318-324 (1988), utilizou-se o sistema robótico para gerar uma série de soluções que permitiram refinar continuamente as condições de cristalização respeitantes a temperatura, valores de pH, sais e agentes precipitantes. Uma vez determinada uma solução que permitiu fazer crescer 34 os cristais de forma reprodutivel, desenvolveu-se então uma técnica de inoculação que permitiu aumentar bastante a qualidade dos cristais. A combinação destes dois processos permitiu produzir, em poucos dias, centenas de cristais de qualidade difractiva (cristais que difractam pelo menos a cerca de 2,5 Angstrom, possuindo, de preferência, tendo pelo menos parcelas que difractam para abaixo de 2 Angstrom e, mais preferencialmente, a cerca de 1 Angstrom).

De um modo geral, o processo de cristalização, que é possivel utilizar com qualquer proteina que se pretenda cristalizar, compreende as etapas seguintes: (a) a combinação de aliquotas aquosas da proteina desejada quer com (i) aliquotas de uma solução salina, possuindo cada aliquota uma concentração diferente de agente precipitante possuindo cada aliquota uma concentração diferente de agente precipitante, sendo a combinação das aliquotas efectuada facultativamente num intervalo de valores de pH; (b) a observação das referidas aliquotas combinadas para pesquisar formações pré-cristalinas e escolher a referida combinação de sal ou de agente precipitante e do referido valor de pH que seja eficaz para produzir as formas pré-cristalinas ou então, se assim não tiverem sido produzidas nenhumas formas pré-cristalinas, aumentar a concentração inicial da proteina das referidas aliquotas aquosas de proteina; (c) depois a seleccão da concentração do referido sal ou do referido agente de precipitação, a repetição da etapa (a) com a referia solução que anteriormente não foi seleccionada, agora na presença da referida concentração escolhida; e 35 (d) a repetição da etapa (b) e da etapa (a) até se obter um cristal com a qualidade pretendida. 0 processo descrito supra pode ser eventualmente automatizado, o que permite poupar bastante tempo e trabalho. As concentrações preferidas para a proteina no inicio estão compreendidas entre 10 mg/mL e 20 mg/mL, mas esta concentração inicial ira variar em função da proteina em causa (o FEC-G infra foi analisado utilizando uma concentração de 33 mg/mL). Um intervalo preferido para a solução de sal para começar a análise com NaCl está compreendidos entre 0-2,5 M. Um agente precipitante preferido é o polietileno-glicol 8000, havendo no entanto outros agentes de precipitação seleccionados entre dissolventes orgânicos (tais como o etanol), moléculas de polietileno-glicol com pesos moleculares compreendidos no intervalo entre 500 e 20.000 e ainda outros agentes de precipitação conhecidos pelos especialistas na matéria. O intervalo preferido de valores de pH é definido pela sequência de valores de pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 e 9,0. As formas de pré-cristalização podem ser óleos, agentes de precipitação bi-refringentes, cristais pequenos (com dimensões sensivelmente inferiores a 0,05 mm), cristais médios (com dimensões compreendidas aproximadamente entre 0,05 mm e 0,5 mm) e cristais grandes (com dimensões sensivelmente superiores a 0,5 mm). O periodo de espera preferido para se ver uma estrutura cristalina é de 48 horas, embora a observação semanal também seja preferida e, geralmente, ao fim de cerca de um mes, passa-se a utilizar uma concentração diferente da proteina (normalmente aumenta-se a concentração da proteína). É preferível recorrer a um processo automático, utilizando para tal o sistema Accuflex tal como foi 36 modificado. Os parâmetros preferidos de automatização estão descritos mais adiante.

De um modo geral, combinou-se uma proteína, com uma concentração compreendida entre 10 mg/mL e 20 mg/mL, com soluções de NaCl com concentrações variáveis entre 0 e 2,5 M e cada uma dessas combinações foi realizada (separadamente) no intervalo de valores de concentrações definido supra. Uma vez observada uma estrutura de pré-cristalização, em que se optimizou a concentração do sal e o intervalo de pH, numa experiência separada, até se conseguir obter um cristal com a qualidade desejada. A seguir, optimiza-se também a concentraçãp do agente de precipitação para níveis variáveis de pH. Logo que estes parâmetros se encontrem ambos optimizados, põem-se em prática as condições óptimas em simultaneidade para se conseguir obter o resultado pretendido (isto está ilustrado no diagrama da figura 6). a. Implementação de um sistema automático de pipetagem

Prepararam-se soluções de gotas e soluções-mãe recorrendo a um sistema de pipetagem Accuflex (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) que é controlado por um computador pessoal que envia códigos ASCII através de uma interface de uma série-padrão. O dispositivo de pipetagem retira amostras de seis soluções diferentes por meio de uma válvula rotativa e vai pipetar estas soluções numa placa cuja translação no sistema de coordenadas x - y é possível regular. O componente vertical do sistema manipula uma seringa que é capaz tanto de fornecer como de retirar líquido. 37

As aplicações informáticas fornecidas com o sistema Accuflex tinham por base o processo de PSAR (o mesmo que SAGS) sugerido por Cox e Weber, J. Appl. Crystallogr. 20: 366-373 (1987) . Este processo implica a variação sistemática de dois parâmetros principais de cristalização, isto é, o valor do pH e a concentração do agente de precipitação, com possibilidade de fazer variar outros dois. Assentes nestes conceitos, as aplicações informáticas aqui utilizadas conferiram maior flexibilidade à concepção e à implementação das soluções de cristalização utilizadas na estratégia de pesquisa automática sequencial da rede (grelha). Devido a esta flexibilidade, as aplicações informáticas da presente invenção também criaram um número maior de soluções diferentes. Isto é essencial para a implementação do processo factorial incompleto, tal como descrito na secção seguinte.

Para aumentar a velocidade e melhorar a arquitectura da estratégia de pesquisa automática da grelha, é necessário introduzir modificações nas aplicações tanto no equipamento como no sistema informático de pipetagem Accuflex. As modificações introduzidas ao nivel do equipamento permitiram a utilização de dois tabuleiros de microtitulação diferentes, tendo um deles sido utilizado nas experiências com as gotas suspensas e o outro nas experiências com as gotas em repouso e ainda um tabuleiro de Plexiglas que continha mais 24 soluções tampão, sais e soluções de precipitação. Estas soluções complementares aumentaram a grelha de condições de cristalização que foi possível investigar.

Para se utilizar as modificações realizadas no equipamento, as aplicações informáticas de pipetagem foram escritas em duas sub-rotinas: uma sub-rotina permite que o 38 cristalógrafo desenhe uma matriz de soluções de cristalização baseadas nas concentrações dos seus componentes e a outra sub-rotina transforma estas concentrações num código informático que faz pipetar os volumes adequados das soluções nos tabuleiros de cristalização. As matrizes de concentrações podem ser geradas por um qualquer dos dois programas. 0 primeiro programa (MRF, disponível na Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA) faz referência a uma lista de concentrações das soluções de reserva, fornecidas pelo cristalógrafo, e calcula o volume que é necessário pipetar para se conseguir a concentração pretendida. 0 segundo processo, considerado preferível, incorpora um programa de folha de cálculo (Lotus) que pode ser utilizado para a produção de gradientes mais sofisticados de precipitação ou de pH. A matriz de concentrações criada por qualquer um dos programas é interpretada pelo programa de controlo (SUX, uma modificação do programa que acompanha originariamente o pipetador Accuflex e que pode ser adquirido a Amgen, Inc. Thousand Oaks, CA) sendo as cavidades preenchidas em conformidade. b. Implementação do processo factorial incompleto A conveniência do sistema de pipetagem modificado para a preparação das diversas soluções melhorou a implementação de um processo factorial incompleto expandido. 0 desenvolvimento de um novo conjunto de soluções de cristalização, com componentes "aleatórios", foi conseguido utilizando o programa INFAC, Cárter et al., J. Cryst. Growth 90: 60-73 (1988) que produziu uma lista que continha 96 combinações aleatórias de um factor resultante de três variáveis. As combinações de cálcio e fosfato que precipitaram imediatamente foram eliminadas, ficando 70 39 combinações distintas de agentes de precipitação, sais e tampões. Estas combinações foram preparadas utilizando o pipetador automático e ficaram a incubar durante 1 semana. Realizou-se uma inspecção das misturas e preparou-se novamente as soluções que formaram agentes de precipitação, com concentrações menores dos seus componentes. Repetiu-se este procedimento até deixar de haver precipitação em todas as cavidades. c. Cristalização do FEC-G-hu-r

Foram utilizadas diversas estratégias diferentes de cristalização para se encontrar uma solução que produzisse cristais de qualidade observável aos raios X. Tais estratégias incluíram a utilização do processo factorial incompleto, o refinamento das condições de cristalização recorrendo a pesquisas de grelha sucessivas e automáticas (PGSA), a implementação de uma técnica de inoculação e o desenvolvimento de um procedimento de produção de cristais que permitiu obter centenas de cristais excelentes de um dia para o outro. Salvo quando especificado de outro modo, a pesquisa e a produção dos cristais de FEC-G-hu-r utilizou o processo de difusão a vapor de gotas suspensas. Afinsen et al., Physical Principies of Protein Crystallization. In: Eisenberg (ed.), Advanced in Protein Chemistry 41: 1-33 (1991) .

Para a pesquisa inicial das condições de cristalização do FEC-G-hu-r utilizou-se o processo factorial incompleto de Jancarik e Kim, J. Appl. Crystallogr. 24: 409 (1991), dai resultando diversas soluções que permitiram obter resultados de "pré-cristalização". Estes resultados incluíram agentes de precipitação birrefringentes, óleos e cristais muito pequenos (< 0,05 mm). Estas soluções de pré- 40 cristalização serviram depois como pontos de partida para uma pesquisa sistemática. 0 processo de pesquisa exigiu o desenvolvimento de matrizes de cristalização. Estas matrizes correspondiam à concentração dos componentes nas soluções de cristalização e foram criadas utilizando a folha de cálculo da aplicação Lotus™ para um PC da IBM, tendo sido implementadas com o sistema de pipetagem modificado da Accuflex. A estratégia para a concepção das matrizes consistiu em fazer variar um parâmetro de cristalização (por exemplo, a concentração salina), mantendo constantes todos os outros parâmetros, por exemplo, o pH e a concentração dos agentes de precipitação. No inicio da pesquisa, o intervalo de concentrações dos parâmetros variáveis foi grande, mas tal intervalo de concentrações foi sendo sucessivamente refinado até ao ponto em que se obteve o mesmo resultado de cristalização em todas as cavidades do tabuleiro de microtitulação. Estes resultados foram classificados do modo seguinte: cristais, precipitado birrefringente, precipitado granular, gotículas oleosas e massa amorfa. Se a concentração de um determinado parâmetro de cristalização não produziu pelo menos um de precipitação, fez-se aumentar a concentração desse parâmetro até se formar um agente de precipitação. Depois de completado cada um dos tabuleiros, deixou-se ficar em repouso pelo menos durante dois dias e depois efectuou-se uma inspecção para investigar o crescimento dos cristais. Após esta pesquisa inicial, os tabuleiros passaram a ser inspeccionados semanalmente.

Graças a este processo de pesquisa, foram identificadas duas soluções independentes, com o mesmo pH e com os mesmos agentes de precipitação, mas diferindo nos sais (MgCl, LiS04) que produziram cristais pequenos (0,1 mm 41 χ 0,05 mm x 0,05 mm). Com base nestes resultados, produziu-se um novo conjunto de matrizes de concentração em que se fez variar a concentração do MgCl relativamente à do LiS04, mantendo constantes todos os outros parâmetros de cristalização. Este conjunto de experiências permitiu identificar uma solução que produziu cristais de qualidade difractiva (> aproximadamente 0,5 mm) em cerca de três semanas. Para se encontrar esta solução de crescimento dos cristais (Mes 100 mM, a pH 5,8, MgCl2 380 mM, L1SO4 220 mM e 8 % de PEG 8k) foram pesquisadas aproximadamente 8.000 condições que consumiram cerca de 300 mg de proteína. O tamanho dos cristais dependeu do número de cristais que se formam por cada gota. Normalmente, formam-se entre 3 e 5 cristais, com um tamanho médio de 1,0 mm x 0,7 mm x 0,7 mm. Foram obtidas duas morfologias que tinham um grupo espaçador idêntico (P2i2i2i) e dimensões celulares por unidade de a=90,2, b=110,2 e c=49,5, dependendo isso do facto de ter sido ou não feita a inoculação (ver infra) . Sem inoculação, os cristais de FEC-G-hu-r adquiriram uma superfície plana comprida e arestas arredondadas.

Quando se recorreu à inoculação, obtiveram-se cristais com faces bem pronunciadas e definidas na gota ao fim de 4 a 6 horas (0,05 mm x 0,05 mm x 0,05 mm) . Em 24 horas os cristais tinham crescido para 0,7 mm por 0,7 mm por 0,7 mm e continuaram a aumentar para além de 2 mm, dependendo tal facto do número de cristais em formação na gota. d. Inoculação e determinação dos locais de início da nucleação O processo agora proposto para inocular cristais define o número de unidades de início da nucleação em cada 42 cavidade individual utilizada (aqui, depois de terem sido determinadas as condições óptimas para os cristais crescerem). 0 processo aqui descrito é vantajoso na medida em que o número de "inóculos" afecta a qualidade dos cristais e isto por sua vez afecta o grau de resolução. 0 processo de inoculação da presente invenção também tem vantagens pelo facto de a inoculação fazer com que os cristais de FEC-G cresçam num periodo de cerca de 3 dias, enquanto sem inoculação o periodo de crescimento passa a ser de aproximadamente de 3 semanas.

Numa experiência de produção de cristais (ver os processos) foram produzidas grandes quantidades destes cristais pequenos (<0,01 mm x 0,01 mm x 0,01 mm), durante a noite. Foram praticadas as condições de cristalização anteriormente descritas, com a excepção de se ter reutilizado uma ponta de pipeta já anteriormente utilizada. Presumivelmente, o efeito de grande produção de cristais foi originado por pequenas unidades de nucleação que se tinham formado na ponta utilizada e que constituíram locais de nucleação para os cristais. A adição de uma pequena quantidade (0,5 yL) de gotas, que continham as grandes quantidades de cristais, a uma nova gota, em condições convencionais para a produção de cristais, teve como consequência uma grande produção de cristais, de um dia para o outro. Este processo foi utilizado para a produção de vários tabuleiros de gotas contendo grandes quantidades de cristais a que se atribuiu a designação de "reserva de inóculo".

O número de unidades de início da nucleação (UIN) contido nas gotas de "reserva de inóculo" foi estimado com a finalidade de melhorar a reprodutibilidade e a qualidade dos cristais de FEC-G-hu-r. Para determinar o número de UIN 43 na "reserva de inoculo" diluiu-se sequencialmente uma aliquota da qota ao lonqo de uma placa de microtitulação de 96 cavidades. Preparou-se a placa de microtitulação juntando 50 yL de uma solução que continha volumes iguais de solução de FEC-G-hu-r (33 mg/mL) e de solução de crescimento dos cristais (descrita supra) em cada cavidade. Transferiu-se uma aliquota (3 pL) de uma das gotas da "reserva de inoculo" para a primeira cavidade da placa de microtitulação. Misturou-se bem a solução contida na cavidade e depois transferiu-se 3 pL para a cavidade seguinte ao longo da fila da placa de microtitulação. Preparou-se de forma idêntica cada fila da placa de microtitulação e vedou-se correctamente o tabuleiro com uma fita de plástico. Formaram-se pequenos cristais, de um dia para o outro, no fundo das cavidades da placa de microtitulação e estabeleceu-se uma correlação entre o número de cristais nas cavidades e a diluição da "reserva de inoculo" original. Para se produzir cristais individuais grandes, diluiu-se adequadamente a gota de "reserva de inoculo" em SCC recente e depois transferiu-se para uma gota uma aliquota desta solução que continha as UIN.

Uma vez optimizadas as condições de cristalização, deixou-se os cristais crescerem segundo um processo de produção em que 3 mL de cada um dos produtos SCC e solução de FEC-G-hu-r (33 mg/mL) foi misturado para a preparação de 5 tabuleiros (possuindo cada um deles 24 cavidades). Este processo incluiu a produção da solução de cristalização refinada, em grandes quantidades, a mistura desta solução com a proteina e a colocação da solução de proteina/cristalização em tabuleiros de gotas suspensas ou em tabuleiros de gotas em repouso. Este processo permitiu obter normalmente 100 a 300 cristais de qualidade (> 0,5 mm) em cerca de 5 dias. 44 e.

Processos Experimentais

Materiais

Obteve-se a informação cristalográfica começando com FEC-G-met-hu-r com a sequência de aminoácidos indicada na figura 1 com uma actividade especifica de 1,0 ± 0,6 x 108 U/mg (conforme medido pelo ensaio de mitogénese celular em tampão de acetato 10 mM, a pH 4,0 (em água para injecção) e com uma concentração de cerca de 3 mg/mL. Concentrou-se a soluçãoo com o concentrador de modelo Amicon a 75 psi, utilizando um filtro YM10. Normalmente, concentra-se a solução 10 vezes, a 4°C, e guarda-se durante vários meses.

Pesquisa inicial

Os cristais adequados para análise por raios X foram obtidos por equilíbrio entre difusão - vapor, utilizando gotas suspensas. Para a pesquisa preliminar misturou-se 7 pL da solução de proteina, a uma concentração de 33 mg/mL (tal como preparada anteriormente) com igual volume da solução da cavidade, colocou-se em placas de vidro tratadas com silicone e colocou-se em suspensão sobre a solução da cavidade, utilizando placas de cultura de tecidos de tipo Linbro (Flow Laboratories, McLean, Va) . A pipetagem foi sempre realizada com a pipetadora de modelo Accuflex, tendo no entanto os tabuleiros sido retirados da pipetadora automática depois de as soluções terem sido criadas nas cavidades e muito bem misturadas pelo menos durante 10 minutos com um mecanismo de agitação montado por cima da mesa. Depois recolocaram-se os tabuleiros de tipo Linbro na pipetadora que acrescentou as soluções das cavidades e de proteina às pecas de cobertura tratadas com silicone. As peças de cobertura foram então invertidas e aplicadas 45 estanquemente sobre 1 mL das soluções das cavidades, utilizando para tal massa lubrificante de silicone.

Os componentes do sistema automático de cristalização são os que a seguir se indica. Utilizou-se um computador individual de tipo PC-DOS para se desenhar uma matriz de soluções de cristalização com base na concentração dos seus componentes. As matrizes foram obtidas com qualquer MRF da folha de cálculo Lotus (referida supra). 0 produto final deste programa é um ficheiro de dados. Este ficheiro contém a informação necessária ao programa SUX para pipetar o volume conveniente das soluções de reserva para se obter as concentrações descritas nas matrizes. Fez-se passar a informação do programa SUX através de uma porta sequencial de tipo E/S e utilizou-se para indicar ao sistema de pipetagem Accuflex a posição da válvula relativamente àss soluções de reserva, recuperando-se a quantidade de solução, e depois pipetando-se nas cavidades das placas de microtitulação e na posição X-Y de cada cavidade (a intersecção coluna/linha de cada cavidade). Transmitiu-se informação complementar para a pipetadora para lhe indicar a posição Z (altura) da seringa durante o enchimento e também a posição de um dreno onde o sistema pára momentaneamente para efectuar uma purga da seringa entre enchimentos de soluções diferentes. A placa de microtitulação de 24 cavidades (do tipo Linbro ou Cryschem) e o suporte das peças de cobertura foram colocados numa placa que se movia no plano X-Y. 0 movimento da placa permitiu que a pipetadora posicionasse a seringa de modo a pipetar para dentro das cavidades. Também colocou correctamente as peças de cobertura, os frascos e as soluções dos extractos destas fontes. Antes da pipetagem, as placas de microtitulação Linbro tinham uma película fina de massa consistente aplicada em torno dos rebordos das 46 cavidades. Depois de as soluções de cristalização terem sido preparadas nas cavidades e antes de terem sido transferidas para as peças de cobertura, retirou-se a placa de microtitulação do sistema de pipetagem e aguardou-se que as soluções se misturassem por acção de uma misturadora de mesa, a trabalhar durante dez minutos. Depois de realizada a mistura, transferiram-se as soluções das cavidades para as peças de cobertura (no caso do protocolo das gotas suspensas) ou fez-se a sua transferência para o suporte intermédio na cavidade (no caso do protocolo das gotas em repouso). Extraiu-se a proteína de um frasco e juntou-se à gota da peça de cobertura que continha a solução da cavidade (ou ao suporte) . Aplicou-se uma fita de plástico na parte de cima da placa de tipo Cryschem para fechar bem as cavidades.

Crescimento da Produção

Uma vez estabilizadas as condições de cristalização, teve então lugar o crescimento dos cristais utilizando um processo de "produção". Preparou-se, em quantidades de 1 litro, a solução de cristalização contendo Mes 100 mM, a pH 5,8, MgCl2 380 mM, LiS04 220 mM e 8 % de PEG 8k. Utilizando uma pipetadora de seringa de Eppindorf, pipetou-se alíquotas de 1 mL desta solução para cada uma das cavidades da placa Linbro. Misturou-se uma solução que continha 50 % desta solução e 50 % de uma solução de FEC-G (33 mg/mL) e pipetou-se para as peças de cobertura tratadas com silicone. Os volumes típicos destas gotas estavam compreendidos entre 50 e 100 yL e, devido às grandes dimensões de tais gotas, foi necessário tomar precauções ao encher as peças de cobertura e ao colocar as gotas em suspensão sobre as cavidades. 47

Recolha de Dados

Refinou-se a estrutura com X-PLOR (Bruniger, versão 3.0 do X-PLOR, um sistema para cristalografia e a RMN,

Universidade de Yale, New Haven CT) em contraste com os dados a 2,2 Â obtidos com um detector de imagens de placas R-AXIS (Molecular Structure, Corp. Houston, TX). f. Observações

Produziu-se um FEC-G-hu-r terapêutico humano recombinante, eficaz em grandes guantidades e foram facultados vários gramas para a análise estrutural.

Presume-se que os processos de cristalização aqui descritos possam vir a ter outras aplicações a partir da altura em que estejam disponíveis outras proteínas relevantes. Este processo pode ser aplicado a qualquer projecto cristalográfico em que estejam em jogo grandes quantidades de outras proteínas

B. Programa informático para visualizar a estrutura tridimensional do FEC-G

Embora os diagramas, tais como os ilustrados nas figurai anexas, sejam úteis para visualizar a estrutura tridimensional do FEC-G, considera-se preferível um programa informático que permita a visulização estereoscópica da molécula. Esta visualização estereoscópica ou "realidade virtual", conforme dito por vezes na técnica, permite visualizar a estrutura na sua forma tridimensional, segundo qualquer ângulo, com uma resolução bastante minuciosa, desde a estrutura molecular até ao nível atómico. Os programas informáticos aqui contemplados também permitem modificar a perspectiva do 48 ângulo de observação da molécula, por exemplo, fazendo rodar a molécula. Os programas contemplados também permitem responder a modificações de tal modo que se possa, por exemplo, suprimir, adicionar ou substituir de uma ou mais imagens de átomos, incluindo residuos inteiros de aminoácidos ou permitem acrescentar radicais quimicos aos grupos existentes ou substituídos e permitem ainda visualizar as modificações introduzidas na estrutura. É possivel utilizar outros sistemas à base de meios informáticos; que devem possuir como elementos constituintes: (a) um meio para permitir a introdução de informação, tal como coordenadas ortogonais ou outras coordenadas de tipo numérico da estrutura tridimensional do FEC-G; (b) um dispositivo para exprimir tais coordenadas, por exemplo, um meio de visualização que permita observar a estrutura tridimensional e correlacionar essa estrutura tridimensional com a composição da molécula do FEC-G, por exemplo, a composição de aminoácidos; (c) eventualmente, meios para a introdução de informação que modifique a composição da molécula de FEC-G expressa, por forma a que a imagem de tal estrutura tridimensional revele a composição alterada.

As coordenadas para o programa informático preferido que se utilizam estão indicadas na figura 5. 0 programa informático preferido é a versão 4 de Insight II, disponível na Biosym em San Diego, CA. No que diz respeito à estrutura cristalográfica bruta, as intensidades observadas respeitantes a dados de difracção ("F-obs") e as coordenadas ortogonais também estão no banco de dados de proteínas do Departamento de Química do Laboratório Nacional de Brookhaven, Upton, Nova Iorque 119723, EUA 49 (Protein Data Bank, Chemistry Department, Brookhaven National Laboratory, Upton, New York 119723, USA) .

Uma vez introduzidas as coordenadas no programa Insight II, é então possivel observar facilmente a representação tridimensional da molécula de FEC-G num ecrã de um computador. 0 sistema informático preferido para a visualização é o Silicon Graphics 320 BGX (San Diego, CA). Para uma observação estereoscópica é possivel aplicar sobre uma lente correctiva (Crystal Eyes, Silicon Graphics) que permite que qualquer pessoa visualize a molécula de FEC-G estereoscopicamente, nas suas três dimensões, permitindo assim rodar a molécula e antever a arquitectura molecular.

Assim, um processo para conceber ou para preparar um análogo de FEC-G com a ajuda de um computador, pode compreender as etapas seguintes: (a) dotar o referido computador de meios que permitam obter uma imagem da estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, incluindo a imagem da composição dos radicais da referida molécula de FEC-G e que permita, de preferência, obter a imagem da localização tridimensional de cada aminoácido e, mais preferencialmente, permita obter a imagem da localização tridimensional de cada átomo de uma molécula de FEC-G; (b) observar a referida imagem; (c) seleccionar um local na referida imagem para alterar a composição da referida molécula ou a localização de um radical; e (d) preparar um análogo de FEC-G com tal alteração. 50 A alteração pode ser escothida com base nas características estruturais desejadas do produto final constituído pelo análogo de FEC-G, descrevendo-se adiante, mais minuciosamente, as particularidades para tal arquitectura. Tais particularidades compreendem a localização e as composições dos residuos de aminoácidos hidrofóbicos, em particular residuos internos das estruturas helicoidais de uma molécula de FEC-G, quando alterada, alterar a estrutura global do núcleo interno da molécula e podendo impedir a ligação ao receptor; a localização e as composições das estruturas espirais externas cuja alteração possa não afectar a estrutura global da molécula de FEC-G.

As figuras 2-4 ilustram a conformação tridimensional geral por vias diferentes. Temos pois o diagrama topológico, o diagrama em serpentina e o diagrama de cilindros, ilustrando todos eles aspectos da conformação do FEC-G. A figura 2 ilustra uma comparação FEC-G e outras moléculas. Há uma determinada semelhança de arquitectura, emboras estes factores de crescimento sejam diferentes no que diz respeito às conformações locais das suas espiras e da geometria dos feixes. A topologia ascendente ascendente - descendente - descendente, com duas ligações cruzadas compridas está conservada entre as seis moléculas, apesar da dissemelhança existente na sequência de aminoácidos. A figura 3 ilustra mais minuciosamente a estrutura secundaria da molécula de FEC-G humano recombinante. Este diagrama de serpentina ilustra o sentido do enrolamento das hélices e as suas posições relativas entre si. 51 A figura 4 ilustra, de forma diferente, a conformação de FEC-G humana recombinante. Este diagrama de "cilindros" ilustra a arquitectura geral da molécula de FEC-G humana recombinante. C. Preparação de análogos utilizando a mutagénese do M13

Este exemplo descreve a preparação de análogos de FEC-G utilizando técnicas de mutagénese dirigida ao local, envolvendo o bacteriófago M13 de cadeia única, em conformidade com os processos publicados no pedido de patente de invenção PCT com o número WO 85/00817 (Souza et al., publicado em 28 de Fevereiro de 1985). Este processo implica essencialmente a utilização de uma matriz de ácido nucleico de cadeia única da sequência não mutagenizada e a sua ligação a um oligonucleótido mais pequeno que contém a desejada modificação na sequência. As condições de hibridação permitem que tenha lugar a hibridação de sequências não idênticas e a sequência remanescente é preenchida de modo a ficar idêntica à matriz original. Daqui resulta uma molécula de cadeia dupla em que uma das duas cadeias possui a modificação desejada. Esta cadeia única mutagenizada é separada e por sua vez utilizada como matriz para a sua cadeia complementar. Isto vai criar uma molécula de cadeia dupla com a modificação desejada. A sequência original de ácido nucleico do FEC-G utilizada está ilustrada na figura 1 e os oligonucleótidos que contêm os ácidos nucleicos mutagenizados estão apresentados no quadro 2. As abreviaturas aqui utilizadas para os resíduos aminoácidos e para os nucleótidos são as convencionais (ver Stryer, Biochemistry, 3a ed., W.H Freeman e Company, N.Y., 1988, no verso da contracapa). 52 A sequência original do ácido nucleico do FEC-G foi colocada em primeiro lugar dentro do vector M 13mp21. Depois isolou-se e colocou-se novamente em suspensão em água o ADN do fago Ml3mp21 de cadeia única que continha a sequência original do FEC-G. Para cada reacção misturou-se 200 ng deste ADN com 1,5 pmole de oligonucleótido fosforilado (quadro 2) e colocou-se em suspensão em meio constituido por Tris 0,1 M, MgCl2 0,01 M, DTT 0,005 M e ATP 0,1 mM, a pH 8,0. A recombinação dos ADN teve lugar mediante aquecimento, a 65 °C e arrefecimento lento até à temperatura ambiente.

Depois de os ADN terem arrefecido acrescentou-se 0,5 mM de cada uma das substâncias ATP, dATP, dCTP, dGTP e TTP, 1 unidade de liqase do ADN das T4 e 1 unidade do fragmento de Klenow de polimerase 1 de E. coli a 1 unidade de ADN recombinado em meio constituido por Tris 0,1 M, NaCl 0,025 M, MgCl2 0,01 M e DTT 0,01 M, a pH 7,5. O ADN circular, fechado, agora de cadeia dupla, foi utilizado sem mais nenhuma purificação para transfectar E. coli. Efectuou-se um rastreio das placas efectuando a colheita com filtros de nitrocelulose e hibridando depois os filtros com ADN de cadeia simples marcado na extremidade com 32P, durante 1 hora, a 55-60 °C. Depois da hibridação efectuou-se a lavagem dos filtros, a 0-3 °C, abaixo da temperatura de fusão do oligonucleótido (2°C para A-T, a 4°C para o G-C) que emitiu selectivamente sinais os autorradiográficos correspondentes às placas com o fago que continha a sequência mutacionada. Os clones positivos foram confirmados por sequenciação.

Seguidamente indicam-se os oligonucleótidos utilizados para cada análogo de FEC-G preparado pelo processo de 53 mutagénese do M13. A nomenclatura indica o resíduo e a posição do aminoácido original (por exemplo, o resíduo lisina na posição 17) e o resíduo e a posição do aminoácido substituído (por exemplo, o resíduo arginina na posição 17) . Uma substituição envolvendo mais do que um resíduo é indicada pelo notação com um índice, com vírgulas entre as posições assinaladas ou com um ponto e vírgula a indicar resíduos diferentes. As supressões sem nenhumas substituições não estão assinaladas.

Indicam-se a seguir as sequências oligonucleotídicas para a mutagénese efectuada com base no M13; estes oligonucleótidos foram produzidos por via sintética, embora o processo de preparação não seja crítico, podendo ser utilizado qualquer processo e/ou equipamento de síntese de ácidos nucleicos. Também está indicado o comprimento do oligonucleótido. Conforme se disse antes, permitiu-se que estes oligonucleótidos contactassem com o vector de fago de cadeia simples e depois foram acrescentados nucleótidos simples para completar a sequência de ácidos nucleicos do análogo de FEC-G.

Quadro 2 ANALOGOS DE FEC-G_ Lis1'->Arg1' Lis24->Arg24 Lis35->Arg35 SEQUÊNCIASS (51-> 3’ )

Comprimento Seq. (nucleótido)_ID

Lis ' ' Arg17'24'35

Lis Arg 17.24.41 17.24.41 ->

Lis Arg 17.35.41 17.35.41 ->

Lis24, 35,41_> Arq2A'35,41

CTT TCT GCT GCG TTG TCT GGA ACA ACA GGT TCG TCG TAT CCA GGG TG CAC TGC AAG AAC GTC TGT GCG CT GGG TAC TTA CCG TCT GTG CCA TC CTT TCT GCT GCG TTG TCT GGA ACA ACA GGT TCG TCG TAT CCA GGG TG CAC TGC AAG AAC GTC TGT GCG CT CTT TCT GCT GCG TTG TCT GGA ACA ACA GGT TCG TCG TAT CCA GGG TG CGC TAC TTA CCG TCT GTC CCA TC CTT TCT GCT GCG TTG TCT GGA ACA CAC TGC AAG AAC GTC TGT GCG CT CGC TAC TTA CCG TCT GTG CCA TC ACA GGT TCG TCG TAT CCA GGG TG CAC TGC AAG AAC GTC TGT GCG CT CGC TAC TTA CCG TCT GTG CCA TC 24 3 23 4 23 5 23 6 24 7 23 8 23 9 24 10 23 11 23 12 24 13 23 14 23 15 23 16 23 17 54

Lis Arg 17.29.35.41 17.24.35.41 ->

Cis18^Ala Gln68^Glu Cis37, 43-> 18 68

Ser 37, 43

CTT TCT GCT GCG TTC TCT GGA ACA ACA GGfT TCG TCG TAT CCA GGG TG CAC TGC AAG AAC GTC TGT GCG CT CSC TAC TTA CCG TCT GTG CCA TC TCT GCT GAA AGC TCT GGA ACA GG CTT GTC CAT CTG AAG CTC TTC AG GAA AAA CTG TCC GCT ACT TAC AAA CTG TCC CAT CC6 G 23 18 24 19 23 20 23 21 23 22 23 23 23 24 37 25

Gln26->Ala26 Gln174->Ala174

TTC GTAÍ AAA TCG CGG GTG ACG G TCA TCT GGC TGC GCC GTA ATA G 22 26 22 27

Arg170->Ala170 CCG TGT TCT GGC TCA TCT GGC T 22 28 Arg167->Ala167 GAA GTA TCT TAC GCT GTT CTG CGT 24 29 Deletion 167 GAA GTA TCT TAC TAA GTT CTG CGT C 25 30 Lis41->Ala41 CGC TAC TTA CGC ACT GTG CCA T 22 31 His44->Lis44 CAA ACT GTG CAA GCC GGA AGA G 22 32 Glu47->Ala47 CAT CCG GAA GCA CTG GTA CTG C 22 33 Arg23->Ala23 GGA ACA GGT TGC TAA AAT CCA GG 23 34 Lis24->Ala24 GAA CAG GTT CGT GCG ATC CAG GGT G 25 35 Glu20->Ala20 GAA ATG TCT GGC ACA GGT TCG T 22 36 Asp28->Ala28 TCC AGG GTG CCG GTG CTG C 19 37 Met127->Glu127 AAG AGC TCG GTG AGG CAC CAG CT 23 38 Met188->Glu188 CTC AAG GTG CTG AGC CGG CAT TC 23 39 Met127->Leu127 GAG CTC GGT CTG GCA CCA GC 20 40 Met138->Leu138 TCA AGG TGC TCT GCC GGC ATT 21 41 Ser13->Ala13 TCT GCC GCA AGC CTT TCT GCT GA 23 42 Lis17->Ala17 CTT TCT GCT GGC ATG TCT GGA ACA 24 43 Gln121_>Ala121 CTA TTT GGC AAG CGA TGG AAG AGC 24 44 Glu124->Ala124 CAG ATG GAA GCG CTC GGT ATG 21 45 Met127,138-> 20 46 Leu127'138 GAG CTC GGT CTG GCA CCA GC 21 47 TCA AGG TGC TÇT GCC GGC ATT **Glu20->Ala20; GAA ATG TCT GGC ACA GGT TCG T 22 48

Ser13->Gli13 ** Este análogo apareceu durante a preparação do análogo Glu20-*Ala2° do FEC-G. Tendo sido sequênciados diversos clones para se identificar o análogo Glu20—*Ala20, identificou-se o análogo Glu20 — *Ala20; Serl3-*Glil3. Este mutante duplo resultou de um erro de reacção de Klenow In vltro com a polimerase de ADN. D. Preparação de análogos de FEC-G recorrendo à

amplificação do ADN

Este exemplo descreve processos para a produção de análogos de FEC-G utilizando a técnica de amplificação do ADN. Essencialmente, amplificou-se o ADN que codifica cada análogo em duas partes separadas, depois combinou-se e a seguir amplificou-se a própria sequência total. Dependendo da modificação desejada que se pretendia realizar no ADN do FEC-G original, assim foram utilizados iniciadores internos para incorporar a modificação e para gerar as duas partes amplificadas e separadas. Por exemplo, para a amplificação da extremidade 5' do ADN do análogo desejado, utilizou-se 55 um iniciador de flanqueio em 5' (complementar de uma sequência do plasmido a montante do ADN original do FEC-G) numa extremidade da região que se pretendia amplificar e utilizou-se um iniciador interno, capaz de hibridar com o ADN original, mas que incorporava a mudança desejada, para iniciar a outra extremidade. A região amplificada resultante alongou-se desde o iniciador de flanqueio em 5', através do iniciador interno. Executou-se um procedimento idêntico para o terminal 3', utilizando um iniciador de flanqueio em 3' (complementar de uma sequência do plasmido a jusante do ADN original do FEC-G) e um iniciador interno complementar da região da mutação pretendida. A partir do momento em que as duas "metades" (que podem ter ou não um comprimento igual, dependendo isso da localização do iniciador interno) foram amplificadas, permitiu-se que essas "metades" se unissem entre si. Uma vez unidas, o iniciador de flanqueio em 5' e o iniciador de flanqueio em 3' foram utilizados para amplificar a sequência completa que continha a modificação pretendida.

No caso de se pretender realizar mais do que uma modificação, é possível alterar o processo descrito antes, de modo a incorporar a modificação no iniciador interno ou então é possível repetir o processo utilizando um iniciador interno diferente. Em alternativa, é possível utilizar o processo de amplificação génica com outros processos para produzir modificações na sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, a técnica de mutagénese com base nos fagos, conforme descrito supra. Seguidamente descrevem-se exemplos do processo para a preparação de análogos com mais de uma modificação.

Para a criação dos análogos de FEC-G descritos a seguir, o ADN matricial utilizado foi a sequência ilustrada 56 na figura 1 mais determinadas regiões de flanqueio (de um plasmido que continha a região de codificação do FEC-G). Estas regiões de flanqueio foram utilizadas como iniciadores de flanqueio em 5' e 3' e estão definidas adiante. As reacções de amplificação foram realizadas em volumes de 40 yL contendo Tris-HCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, gelatina na concentração de 1,0 mg/mL, a pH 8,3 e a 20 °C. Os volumes de reacção de 40 yL também continham 0,1 mM de cada um dos dNTP, 10 pmoles de cada iniciador e 1 ng de ADN matricial. Repetiu-se cada amplificação durante 15 ciclos. Cada ciclo consistiu em 0,5 minutos a 94 °C, 0,5 minutos a 50 °C e 0,75 minutos a 72 °C. Os iniciadores de flanqueio tinham um comprimento de 20 nucleótidos e os iniciadores internos tinham um comprimento entre 20 e 25 nucleótidos. Isto deu origem a cópias múltiplas do ADN de cadeia dupla codificando quer a parte anterior quer a parte posterior do análogo desejado de FEC-G.

Para efectuar a combinação das duas "metades", combinou-se a quadragésima parte de cada uma das duas misturas de reacção com um terço da mistura de reacção de amplificação do ADN. Aguardou-se que tivesse lugar a recombinação das duas partes no local do iniciador interno, uma vez que as suas extremidades, portadoras da notação, eram complementares e no seguimento de um ciclo de polimerização obteve-se uma sequência de ADN de comprimento completo. Uma vez assim recombinado, amplificou-se o análogo inteiro, utilizando os iniciadores de flanqueio em 5' e 3'. Repetiu-se este processo de amplificação durante 15 ciclos, conforme descrito antes. A sequência completa do ADN do análogo amplificado foi clivada com as endonucleases de restrição Xbal e Xhol para proporcionar extremidades coesas para inserção num vector. 57

Colocou-se o ADN clivado dentro de um vector plasmídico e utilizou-se esse vector para transformar E. coli. Os transformantes foram estimulados com canamicina, na concentração de 50 ug/mL e, subsequentemente, foram incubados a 30 °C. A produção da proteina análoga de FEC-G foi confirmada por electroforese em gel de poliacrilamida realizada com um lisado celular integral. A presença da mutação desejada foi confirmada pela análise da sequência de ADN do plasmido purificado a partir do isolado produzido. Depois deixou-se as culturas crescerem e efectuou-se uma colheita de células, tendo os análogos de FEC-G sido purificados conforme adiante se explica.

No quadro 3 subsequente estão indicados os iniciadores específicos utilizados para cada análogo produzido com recurso à amplificação génica.

Quadro 3

Seq. ID do análogo Iniciador interno (5'->3')

His44->Ala44 iniciador de 5' -TTCCGGAGCGCACAGTTTG 49 Iniciador de 3’ -CAAACTGTGGGCTCCGGAAGAGC 50 Tre117->Ala117 iniciador de 5' -ATGCCAAATTGCAGTAGCAAAG 51 Iniciador de 3 ' -CTTTGCTACTGCAATTTGGCAACA 52 Asp110->Ala110 iniciador de 5' -ATCAGCTACTGCTAGCTGCAGA 53 Iniciador de 3 ' -TCTGCAGCTAGCAGTAGCTGACT 54 Gln21->Ala21 iniciador de 5' -T TACGAACCGC T TCCAGACAT T 55 Iniciador de 3 ' -AATGTCTGGAAGCGGTTCGTAAAAT 56 Asp113->Ala113 iniciador de 5' -GTAGCAAATGCAGCTACATCTA 57 Iniciador de 3 ' -TAGATGTAGCTGCATTTGCTACTAC 58 His53->Ala53 iniciador de 5' -CCAAGAGAAGCACCCAGCAG 59 Iniciador de 3' -CTGCTGGGTGCTTCTCTTGGGA 60 Para cada análogo, utilizou-se O seguinte iniciador de flanqueio de 5 ' : 61 62

Para cada análogo, de

5'-CACTGGCGGTGATAATGAGC utilizou-se o seguinte iniciador de flanqueio 3'-GGTCATTACGGACCGGATC 1. Construção de uma mutação dupla 58

Para se obter o análogo de Gln12,21-> Glu12,21 de FEC-G realizaram-se duas amplificações separadas de ADN para se criar as duas mutações de ADN. 0 ADN matricial utilizado tinha a sequência indicada na figura 1 mais determinadas regiões de flanqueio (de um plasmido que continha a região de codificação do FEC-G). As sequências exactas estão indicadas a seguir. Cada uma das duas reacções de amplificação do ADN foi realizada utilizando um equipamento de realização de ciclos térmicos de ADN, Cetus, da Perkin Elmer. A mistura reaccional de 40 pL consistia em tampão de RCP IX (Cetus), 0,2 mM de cada um dos 4 dXTP (Cetus), 50 pmole de cada um dos oligonucleótidos iniciadores, 2 ng do ADN matricial de FEC-G (num vector plasmídico) e 1 unidade de polimerase de Taq (Cetus) . O processo de amplificação decorreu durante 30 ciclos. Cada ciclo consistiu em trabalhar 1 minuto a 94 °C, 2 minutos a 50 °C e 3 minutos a 72 °C.

Na amplificação "A" do ADN utilizaram-se os oligonucleótidos: 5' CCACTGGCGGTGATACTGAGC 3' (Seq ID 63) e 5' AGCAGAAAGCTTTCCGGCAGAGAAGAAGCAGGA 3' (Seq ID 64)

Na amplificação "B" do ADN foram utilizados os oligonucleótidos: 5' GCCGCAAAGCITICTGCTGAAATGTCTGGAAGAGGITCGTAAAATCCAGGGTGA 3' (Seq ID 65) e 5' CTGGAATGCAGAAGCAAATGCCGGCATAGCACCITCAGTCGGTTGCAGAGCTGGTGCCA3' (SEQ ID 66) 59 A partir do produto de ADN de cadeia dupla de 10 9 pares de bases, obtido a seguir à amplificação "A" do ADN, cortou-se e isolou-se um fragmento de ADN de 64 pares de bases de Xbal a HindIII, o qual continha a mutação Gin12 -►Glu12 do ADN. A partir do produto de ADN de cadeia dupla de 509 pares de bases, obtido a seguir à amplificação "B" do ADN, cortou-se e isolou-se um fragmento de ADN de 197 pares de bases de HindIII a Bsml, o qual continha a mutação do ADN Gln21->Glu21.

Os fragmentos "A" e "B" foram ligados conjuntamente com um segmento de Xbal de 4,8 mil pares de bases para o fragmento do vector plasmídico do ADN de Bsml. A mistura de ligação era constituída por fragmentos de restrição de ADN equimolares, tampão de ligação (Tris-HCl 25 mM, a pH 7,8, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, ATPr 0,5 mM, ASB na concentração de 100 yg/mL) e ligase do ADN das T4, tendo a incubacao decorrido de um dia para o outro, a 14°C. O ADN ligado foi então transformado dentro de células FM5 de E. coli por electroporação, utilizando para tal um equipamento do modelo Bio Rad Gene Pulsar' (BioRad, Richmond, CA). Isolou-se um clone e comprovou-se, por sequenciação do ADN, que o arquétipo plasmidico continha as duas mutações. Neste vector 'intermédio' também continha uma supressão de um segmento um fragmento de ADN, de 193 pares de bases de Bsml a Bsml. Construiu-se um vector plasmidico final por ligação e transformação (conforme descrito supra) dos fragmentos de ADN obtidos por corte e isolamento de um segmento de SstI a BamHI de 2 mil pares de bases para o fragmento de ADN do BamHl proveniente do vector intermédio, um segmento de Sstl de 2,8 kpb para o fragmento de ADN de EcoRI proveniente do vector plasmidico e um segmento de BamHI de 360 pb para o fragmento de ADN de EcoRI proveniente do vector plasmidico. Verificou-se o arquétipo final por sequenciação do ADN do 60 gene do FEC-G. Depois de as culturas se terem desenvolvido, efectuou-se a colheita das células e realizou-se a purificação dos análogos de FEC-G, como a seguir se descreve.

Conforme indicado antes, é possível utilizar qualquer combinação de técnicas de mutagénese para gerar um ácido nucleico análogo de FEC-G (e o produto de expressão) em que haja uma ou mais do que uma alteração. Os dois exemplos anteriores, utilizando a mutagénese à base de M13 e a mutagénese à base da amplificação génica, são ilustrativos.

E. Expressão de ADN de análogos de FEC-G

Introduziram-se seguidamente os ADN dos análogos de FEC-G num vector plasmídico que foi utilizado para transformar a estirpe FM5 de E. coli (ATCC#53911) . Estes ADN dos análogos de FEC-G, contidos nos plasmidos e nas células hospedeiras bacterianas, podem ser obtidos na Colecção americana de culturas tipo (American Type Culture Collection, Rockville, MD) cujos números de acesso estão indicados a seguir.

Foram produzidas culturas de 1 L num caldo que continha 10 g de triptona, 5 g de extracto de levedura e 5 g de NaCl, a 30 °C, até se atingir uma densidade de A600 de 0,5, tendo então as culturas nessa altura sido aquecidas rapidamente para 42 °C. A agitação dos balões prosseguiu durante três horas.

Também é possível utilizar outras células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, por exemplo, outras células, estirpes ou espécies bacterianas, células de mamíferos em cultura (COS, OHC (o mesmo que CHO) ou de outro tipo) , 61 células de insectos ou órgãos ou organismos multicelulares ou células de plantas ou órgãos ou organismos multicelulares, sabendo os especialistas na matéria como identificar o hospedeiro conveniente. Os presentes análogos de FEC-G e as composições congéneres também podem ser preparados por via sintética, por exemplo, pelos processos de sintese de péptidos em fase sólida ou então por meio de outras técnicas de produção por via quimica. Há outros sistemas de clonagem e de expressão que serão evidentes para os especialistas na matéria.

F. Purificação de proteínas de análogos de FEC-G

Efectuou-se uma colheita de células por centrifugação (10.000 x g, 20 minutos, 4 °C) . Colocou-se a massa obtida (normalmente 5 g) novamente em suspensão, em 30 mL de DTT 1 mM e fez-se passar, três vezes, por uma prensa prensa de células francesa, a 10.000 psi. Esta suspensão de células desmembradas foi centrifugada a 10.000 x g, durante 30 minutos, depois removeu-se o sobrenadante e com a massa obtida preparou-se nova suspensão em 30 - 40 mL de água. Centrifugou-se esta suspensão a 10.000 x g, durante 30 minutos e a massa obtida foi depois dissolvida em 25 mL de Sarkosyl a 2 % e Tris 50 mM, a pH 8. Juntou-se sulfato de cobre até a uma concentração de 40 uM e deixou-se a mistura em agitação pelo menos durante 15 horas, a 15-25 °C. A seguir centrifugou-se a mistura a 20.000 x g, durante 30 minutos. Diluiu-se a mistura proteica solubilizada resultante, quatro vezes, com Tris 13,3 mM, a pH 7,7, removeu-se o Sarkosyl e depois aplicou-se o sobrenadante a uma coluna de DEAF-celulose (Whatman DE-52) equilibrada com Tris 20 mM, a pH 7,7. Depois de se ter carregado e lavado a coluna com o mesmo tampão, efectuou-se a eluição dos análogos com Tris 10 mM/NaCl (entre 35 mM e 100 mM, 62 dependendo isso do análogo, conforme indicado adiante), a pH 7,7. Para a maioria dos análogos ajustou-se o pH do eluente da coluna de DEAE para 5,4 com ácido acético a 50 %, diluído conforme necessário (para se obter uma condutividade correcta) com acetato de sódio 5 mM, a pH 5,4. Depois introduziu-se a solução numa coluna de CM-Sepharose equilibrada com acetato de sódio 20 mM, a pH 5,4. A seguir lavou-se a coluna com NaAc 20 mM, a pH 5,4, até a absorvência, a 280 nm, ser aproximadamente zero. Realizou-se depois a eluição do análogo de FEC-G com acetato de sódio/NaCl nas concentrações indicadas no quadro 4 a seguir. Os eluentes da coluna de DEAE para esses análogos não aplicados à coluna de CM-Sepharose foram dialisados directamente num tampão de NaAc 10 mM, a pH 4,0. Os análogos de FEC-G purificados foram então isolados convenientemente para análise in vitro. As concentrações salinas praticadas para a eluição dos análogos variaram, conforme se disse antes. Seguidamente estão indicadas as concentrações para a coluna de DEAE-celulose e para a coluna de CM-Sepharose.

Quadro 4

Concentrações salinas

Análogo DEAE Celulose CM-Sepharose

Lis17->Arg17

35#M 35mM 35mM 35mM 35mM

37,5mM 37,5mM 37,5mM 37,5mM 37,5mM 63

Lis17'35'41^Arg17'35'41 35mM 37,5mM Lis24'35'41^Arg24'35'41 35mM 37,5mM Lis17,24'35'41^Arg17,24'35'41 35mM 37,5mM Lis17'24'41^Arg17'24'41 35mM 37,5mM Gln68^Glu68 60mM 37,5mM Cis37,43^Ser37'43 4 OmM 37,5mM Gln26^Ala26 4 OmM 4 OmM Gln174^Ala174 4 OmM 4 OmM Arg170^Ala170 4 OmM 4 OmM Arg167-^Ala167 4 OmM 4 OmM Eliminação 167* N/A N/A Lis41^Ala41 16 OmM 4 OmM His44^Lis44 4 OmM 6 OmM Glu47^Ala47 4 OmM 4 OmM Arg2^Ala23 4 OmM 4 OmM Lis24->Ala24 12 OmM 4 OmM Glu2CUAla20 4 OmM 6 OmM Asp28^Ala28 4 OmM 8 OmM Met127^Glu127 8 OmM 4 OmM Met138^Glu138 8 OmM 4 OmM Met127^Leu127 4 OmM 4 OmM Met138^Leu138 4 OmM 4 OmM Cis18^Ala18 4 OmM 37,5mM Gln12'21^Glu12'21 6 OmM 37,5mM Gin12'21'68 ->Glu12,21,68 6 OmM 37,5mM Glu20^Ala20; Ser13 -.Gli13 4 OmM 8 OmM Met127'138^Leu127'138 4 OmM 4 OmM Ser13^Ala13 4 OmM 4 OmM Lis17 ^Ala17 8 OmM 4 OmM Gln121^Ala121 4 OmM 6 OmM Gln21^Ala21 5 OmM Gradiente 0 -15OmM His44^Ala44** 4 OmM N/A His53^Ala53** 5 OmM N/A AspllcUAla110** 4 OmM N/A Asp113^Ala113** 4 OmM N/A Tre117^Ala117** 5 OmM N/A Asp28^Ala28; 5 OmM N/A Asp110 Ala110** Glu ->Ala 4 OmM 4 OmM * Para a supressão 16/' não há dados disponíveis. ** Para estes análogos utilizou-se apenas a coluna de DEAE- celulose para a purificação.

Os processos de purificação referidos antes são ilustrativos e qualquer especialista na matéria sabe identificar outros meios disponíveis para a obtenção dos análogos de FEC-G da presente invenção. 64 G. Ensaios biológicos

Independentemente dos processos utilizados para a criação dos análogos de FEC-G da presente invenção, estes análogos foram submetidos a ensaios de pesquisa da actividade biológica. Foram realizadas ensaios com timidina tritiada para se avaliar o grau de divisão celular. No entanto, é possível realizar outro tipo de ensaios biológicos para se determinar a actividade desejada. Os ensaios biológicos, tais como os que são efectuados para a determinação da capacidade de indução da diferenciação terminal na linhagem de células leucémicas WEHI-3B (D+) de murganho, também proporcionam uma indicação sobre a actividade dos FEC-G. Ver Nicola, et al., Blood 54: 614-27 (1979). É possível recorrer a outros ensaios in vitro para avaliar a actividade biológica. Ver Nicola, Annu. Rev. Biochem. 58: 45-77 (1989). De um modo geral, os ensaios de pesquisa da actividade biológica devem compreender a análise dos resultados desejados, por exemplo, aumento ou diminuição de actividade biológica (comparativamente com os FEC-G não modificados), actividade biológica diferente (comparativamente com os FEC-G não modificados), análises de afinidade com o receptor ou análises do semi-período de vida no soro. Esta lista está incompleta, sabendo os especialistas na matéria como identificar outros ensaios úteis para avaliar o resultado final desejado.

Realizou-se o ensaio com 3H-timidina utilizando processos convencionais. A medula óssea foi retirada de fêmeas de murganhos, da estirpe Balb C, depois de sacrificadas. As células da medula óssea foram rapidamente colocadas em suspensão, centrifugadas e novamente colocadas em suspensão num meio de crescimento. Em cada cavidade de 65 uma placa de microtitulação de 96 cavidades introduziu-se uma aliquota de 160 yL que continha aproximadamente 10.000 células. Juntou-se a cada cavidade amostras do análogo do FEC-G purificado (preparado conforme se disse antes) e manteve-se em incubação durante 68 horas. Juntou-se timidina tritiada a cada uma das cavidades e deixou-se incubar durante mais 5 horas. Decorrido o periodo de incubação de 5 horas, efectuou-se a colheita das células, filtrou-se e enxaguou-se muito bem. Os filtros foram então colocados num frasco que continha fluido de cintilação. Efectuou-se a contagem das emissões beta (contador de cintilação de modelo LKB da Betaplate). Analisaram-se, em triplicado, padrões e análogos e as amostras que ficaram bastante acima ou bastante abaixo da curva padrão foram novamente analisadas, utilizando a diluição adequada. Os resultados aqui indicados são a média dos dados, em triplicado, obtidos com os análogos, comparativamente com os resultados normais obtidos com o FEC-G humano recombinante inalterado.

H. Análise por CLAR

As amostras de análogos purificados foram estudadas por cromatografia em liquido de alta resolução. Embora a posição dos picos numa coluna de CLAR de fase inversa não seja um indicador definitivo da semelhança estrutural entre duas proteínas, os análogos que têm tempos de retenção semelhantes podem ter com a coluna de CLAR o mesmo de tipo de interacções hidrofóbicas da molécula inalterada. Isto é um indicador da existência de uma estrutura global semelhante.

Efectuou-se a análise de amostras do análogo e do FEC-G humano recombinante inalterado numa coluna de fase inversa de modelo Vydac 214TP54 (0,46 cm x 25 cm) 66

As amostras (Separations Group, Inc. Hesperia, CA), purificadas do análogo de FEC-G foram preparadas em acetato 20 mM e em solução de NaCl 40 mM tamponada, a pH 5,2, até a uma concentração final entre 0,1 mg/mL e 5 mg/mL, dependendo do comportamento do análogo na coluna. Carregou-se na coluna de CLAR quantidades variáveis (dependendo da concentração), tendo a coluna sido equilibrada com uma solução aquosa que continha 1 % de isopropanol, 52,8 % de acetonitrilo e 0,38 % de trifluoroacetato (TFA).

Submeteram-se as amostras a um gradiente de acetonitrilo à razao de 0,86 %/minuto e TFA a 0,002 %. I. Resultados

Seguidamente apresentam-se os resultados dos ensaios biológicos anteriores e das análises por CLAR. A actividade biológica é a média de dados em triplicado e está indicada como percentagem relativamente ao padrão de contraprova (FEC-G inalterado). A posição relativa do pico na CLAR é a posição do análogo de FEC-G relativamente ao pico do padrão de contraprova (FEC-G inalterado). Os símbolos "+" ou indicam se o pico do análogo na CLER estava avançado ou atrasado em relação ao pico do padrão da contraprova (em minutos). Nem todas as variantes tinham sido analisadas quanto à pesquisa do pico relativo na CLAR, apenas estando indicadas a seguir as que foram analisadas. Também estão indicadas as designações das células hospedeiras de E. coli existentes na Colecção Americana de Culturas Tipo que contém os ácidos nucleicos que codificam os análogos da presente invenção, preparados conforme se disse antes.

Quadro 5

Seq. ID Variante Análogo

Pico relativo da % de actividade normal 1 θ' θ' -L *J G . η -i—i -i—i

CLAR de FEC-G 67 67 1 Lis17->Arg17 N/A 69184 N/A 68 2 Lis24->Arg24 N/A 69185 N/A 69 3 Lis35->Arg35 N/A 69186 N/A 70 4 Lis41->Arg41 N/A 69187 N/A 71 5 Lisn,24,35_>Arg17,24,35 N/A 69189 N/A 72 6 Lis17,35'41->Arg17'35'41 N/A 69192 N/A 73 7 Lis24, 35,41_>Arg24,35,« N/A 69191 N/A 74 8 Lis17, 24,35, 41 ->Arg17'24'35'41 N/A 69193 N/A 75 9 Lislt24,41_>Arg17,24,41 N/A 69190 N/A 76 10 Gln68->Glu68 N/A 69196 N/A 77 11 69197 N/A 78 12 Gln26->Ala26 + ,96 69201 51% 79 13 69202 100% 80 14 69203 100% 81 15 69204 110% 82 16 Eliminação 167 99 69207 N/A 83 17 Lis41->Ala41 + ,25 69208 81 % 84 18 His44->Lis44 -1,53 69212 70 % 85 19 Glu47->Ala47 + , 14 69205 0 % 86 20 Arg23->Ala23 -, 03 6 9206 31 % 87 21 Lis24->Ala24 + 1, 95 69213 0 % 88 22 Glu20->Ala20 -0, 07 69211 0 % 89 23 Asp28->Ala28 -, 30 69210 147 % 90 24 Met127->Glu127 N/A 69223 N/A 91 25 Met138->Glu138 N/A 69222 N/A 92 26 Met127->Leu127 N/A 69198 N/A 93 27 Met138->Leu138 N/A 69199 N/A 94 28 Cis18->Ala18 N/A 69188 N/A 95 29 69194 N/A 96 30 Gln12,21,68_>Glu12,21,68 N/A 69195 N/A 97 31 Glu20->Ala20; Ser13 + 1, 74 69209 0 % 98 32 ->Gli13 Met127,138- >Leu127,138 + 1,43 69200 98 % 99 33 Ser13->Ala13 0 69221 110 % 100 34 Lis17->Ala17 + ,50 69226 70 % 101 35 69225 100% 102 36 Gln21->Ala21 + 0, 63 69217 9, 6 % 103 37 His44->Ala44 + 1,52 69215 10,8 % 104 38 His53->Ala53 + O 69219 8,3 % 105 39 Asp110->Ala110 + 1, 97 69216 29 % 106 40 Asp113->Ala113 -0,34 69218 0 % 107 41 69214 9, 7% 108 42 Asp28->Ala28; Asp110 Ala110 +3,2 69220 20, 6 % 109 43 Glu124->Ala124 + 0,16 69224 75 % 110 Fen114->Val 114, T117- 0 % 44 >A117** + U , 5 5 ' Este análogo foi aparentemente um resultado de um erro casual no oligómero .ilizado para a preparação do número 41, indicado supra (Trell7 — Alall7) e por preparado em conformidade com o processo utilizado para este análogo "N/A" significa que os dados não estão disponíveis. 1 Identificação de relações do tipo estrutura-função A primeira etapa utilizada para a concepção dos análogos da presente invenção consistiu em determinar quais os radicais necessários para se manter a integridade estrutural da molécula de FEC-G. Isto foi feito ao nivel dos residuos aminoácidos, embora para efeitos de análise também seja possivel trabalhar ao nivel atómico. A modificação dos residuos, necessária para se manter a 68 integridade estrutural, origina uma mudança na estrutura global da molécula de FEC-G. Isto pode ou não ser desejável, dependendo do análogo que se pretenda produzir. Os exemplos experimentais aqui descritos foram concebidos para se manter a integridade estrutural genérica da molécula de FEC-G, com a finalidade de manter a propriedade da ligação do análogo ao receptor de FEC-G (tal como utilizada a seguir nesta secção, a expressão "receptor de FEC-G" designa o receptor do FEC-G natural, existente nas células hematopoiéticas) . Admitiu-se e confirmou-se, pelos estudos aqui apresentados, que a ligação ao receptor do FEC-G é uma etapa necessária para que haja pelo menos uma actividade biológica, conforme determinado pelos ensaios biológicos indicados supra.

Conforme se observa nas figuras, o FEC-G (neste caso, o met-FEC-G humano recombinante) é um feixe helicoidal 4-alfa antiparalelo com uma torção levógira e com dimensões totais de 45 Â x 30 Â x 24 Â. As quatro hélices do feixe são designadas por hélices A, B, C e D e as suas espiras de ligação são conhecidas como espiras AB, BC e CD. Os ângulos de desenvolvimento helicoidal variam entre -167,5 ° e -159,4 °. As hélices A, B e C são continuas, enquanto a hélice D contém duas espécies de características estruturais, em Gli 150 e Ser 160 (do met-FEC-G humano recombinante). Acima de tudo, as moléculas de FEC-G são constituídas por um feixe de quatro hélices, ligadas em série por espiras externas. Esta informação estrutural foi correlacionada depois com a informação funcional conhecida. Sabia-se que os resíduos (incluindo a metionina na posição 1) 47, 23, 24, 20, 21, 44, 53, 113, 110, 28 e 114 podem ser modificados e que o efeito na actividade biológica seria importante. 69 A maior parte das mutações singulares, que fazem diminuir a actividade biológica, estava centrada em torno de duas regiões do FEC-G que estão separadas por 30 Â e estão localizadas em faces diferentes do feixe de quatro hélices. Uma região envolve interacções entre a hélice A e a hélice D. Isto também foi confirmado pela presença de pontes salinas na molécula inalterada, conforme a seguir se indica:

Átomo Hélice Átomo Hélice Distância Arg 170 NI D Tir 166 i OH A Tir 166 OH D Arg 23 N2 A Glu 163 OE1 D Arg 23 NI A Arg 23 1 Hl A Gin 26 OE1 A Gin 159 NE 2 D Gin 26 0 A 3, 3 3, 3 2,8 3,1 3, 3

As distâncias aqui assinaladas são para a molécula A, conforme indicado na figura 5 (em que três moléculas de FEC-G cristalizaram conjuntamente e foram designadas por A, B e C). Conforme se pode ver, há uma rede de pontes salinas entre a hélice A e a hélice D, que actuam no sentido de estabilizarem a estrutura da hélice A e, consequentemente, afectam a estrutura total da molécula de FEC-G. A área centrada em torno dos resíduos Glu 20, Arg 23 e Lis 24 foi observada na face hidrofílica da hélice A (resíduos 20-37) . A substituição dos resíduos com o resíduo de alanina sem carga nas posições 20 e 23 originou tempos de retenção semelhantes, na CLAR, indicando isso similaridade estrutural. A alteração destes sítios modificou a actividade biológica (conforme indicado pelos ensaios da presente invenção) . A substituição em Lis 24 modificou a actividade biológica, mas não proporcionou na 70 CLER um tempo de retenção idêntico ao das outras duas alterações. 0 segundo local em que a alteração fez baixar a actividade biológica envolve a hélice AB. A troca de glutamina na posição 47 por alanina (análogo número 19, supra) reduziu actividade biológica para zero (no ensaio de incorporação da timidina). A hélice AB é predominantemente hidrofóbica, excepto nos terminais amino e carboxi; contém uma espira de uma hélice 310. Há dois residuos de histidina em cada terminal (His 44 e His 56) e mais um radical glutamato no resíduo 4 6 que tem o potencial de formar uma ponte salina para His 44. A análise espetrográf ica de infravermelhos pela transformada de Fourier (IVFT) efectuada ao análogo sugere que este é estruturalmente semelhante à molécula inalterada do FEC-G recombinante. Experiências complementares comprovaram que este análogo poderia não cristalizar nas mesmas condições em que cristaliza a molécula recombinante inalterada.

As alterações no terminal carboxi (Gin 174, Arg 167 e Arg 170) tiveram um efeito diminuto na actividade biológica. Pelo contrário, a supressão dos últimos oito resíduos (167-175) fez baixar a actividade biológica. Estes resultados podem significar que a supressão desestabiliza a estrutura global, o que impede o mutante de se ligar convenientemente ao receptor do FEC-G (e consequentemente impede o início da transdução do sinal).

De um modo geral, para o núcleo interno do FEC-G, isto é, o feixe das quatros hélices internas a que faltam as espiras externas, os resíduos internos hidrofóbicos são essenciais para a sua integridade estrutural. Por exemplo, na hélice A, os resíduos hidrofóbicos internos são (estando 71 a metionina na posição 1) Fen 14, Cis 18, Vai 22, Ile 25, Ile 32 e Leu 36. De um modo geral, para o núcleo interno do FEC-G, isto é, o feixe das quatros hélices internas a que faltam as espiras externas, os resíduos internos hidrofóbicos são essenciais para a integridade estrutural. Por exemplo, na hélice A, os resíduos hidrofóbicos internos são (estando a metionina na posição 1, tal como na figura 1) Fen 14, Cis 18, Vai 22, Ile 25, Ile 32 e Leu 36. Os outros resíduos hidrofóbicos (mais uma vez com o resíduo met na posição 1) são: para a hélice B, Ala 72, Leu 76, Leu 79, Leu 83, Tir 86, Leu 90, Leu 93; para a hélice C, Leu 104, Leu 107, Vai 111, Ala 114, Ile 118, Met 122; e para a hélice D, Vai 154, Vai 158, Fen 161, Vai 164, Vai 168 e Leu 172 .

Os dados sobre actividade biológica anteriormente indicados, atribuídos aos análogos de FEC-G agora preparados, demonstram que a modificação das espiras externas interfere pelo menos com a estrutura global do FEC-G. As espiras preferidas para a preparação dos análogos são a espira AB e a espira CD. As espiras são estruturas relativamente flexíveis quando comparadas com as hélices. As espiras podem contribuir para a proteólise da molécula. O FEC-G actua de uma forma relativamente rápida in vivo, uma vez que a molécula tem a finalidade de gerar uma resposta a um estímulo biológico, isto é, estimular selectivamente os neutrófilos. O ritmo de substituição do FEC-G também é relativamente rápido. A flexibilidade das espiras pode dar uma "ajuda" às proteases para se ligarem à molécula para a inactivarem. Pode ser efectuada a modificação das espiras para impedir a acção degradativa das proteases, mantendo mesmo assim a actividade biológica sem perdas nenhumas (mediante a retenção da estrutura global do FEC-G não modificada). 72

Este fenómeno não se limita provavelmente a molécula de FEC-G, podendo também ser comum a outras moléculas com estruturas globais semelhantes conhecidas, conforme indicado na figura 2. A alteração da espira externa, por exemplo, da HCh (o mesmo que hGH) do interferão B, da IL-2, do FEC-MG e da IL-4 pode originar pelo menos uma modificação na estrutura global. As espiras externas da molécula do FEC-MG não são tão flexíveis como as da molécula do FEC-G e tal facto pode significar um período de vida mais longo no soro, consistente com a actividade biológica mais ampla do FEC-MG. Assim, as espiras externas do FEC-MG podem ser modificadas, libertando-as da estrutura em folha beta, o que pode fazer com que as espiras fiquem mais flexíveis (de flexibilidade idêntica às do FEC-G) e consequentemente fazem com que a molécula fique mais sensível à acção degradativa das proteases (aumentando assim o ritmo de substituição). A alteração destas espiras externas pode ser efectuada estabilizando-as por ligação a uma ou a mais das hélices internas. Os mecanismos de ligação são conhecidos na técnica, por exemplo, mediante a formação de uma folha beta, uma ponte salina, uma ponte de dissulfureto ou por interacções hidrofóbicas e ainda por outros meios conhecidos. Além disso, também é possível efectuar a supressão de um ou mais resíduos, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos ou porções deles, para se preparar uma molécula abreviada e consequentemente eliminar determinadas partes das espiras externas.

Assim, mediante a alteração das espiras externas, de preferência a espira AB (aminoácidos 58-72 do FEC-G-met-hu-r ou a espira CD (aminoácidos 119 a 145 de FEC-G-met-hu-r) 73 e, menos preferencialmente o terminal amino (aminoácidos 1 a 10), é possivel modificar a actividade biológica sem se eliminar a ligação ao receptor de FEC-G da molécula de FEC-G. Por exemplo, é possivel fazer o seguinte: (1) aumentar o semi-periodo de vida (ou preparar, por exemplo, uma forma de dosagem oral) da molécula de FEC-G, fazendo baixar, por exemplo, a capacidade que as protease têm para actuarem sobre a molécula de FEC-G ou introduzindo modificações quimicas na molécula de FEC-G, por exemplo, acrescentar uma ou várias moléculas de polietileno-glicol ou aplicar revestimentos entéricos para formulação oral, que iriam actuar no sentido de modificarem algumas das caracteristicas da molécula de FEC-G, anteriormente descritas, por exemplo, o aumento do semi-periodo de vida no soro ou noutros meios ou a diminuição da antigenicidade; (2) preparar uma molécula híbrida, por exemplo, combinando o FEC-G com uma parte ou com a totalidade de outra proteína, por exemplo, tal como outra citocina ou outra proteína que realize a transdução do sinal mediante a penetração na célula através de um mecanismo de transporte do receptor de FEC-G da molécula de FEC-G; ou (3) aumentar a actividade biológica, por exemplo, tal como sucede com a capacidade para estimular selectivamente os neutrófilos (comparativamente com uma molécula de FEC-G não modificada). Esta listagem não se limita aos exemplos anteriores.

Outro aspecto observado dos dados anteriores é o facto de as interacções superficiais estabilizadoras poderem afectar a actividade biológica. Isto é evidente numa comparação entre os análogos 23 e 40. O análogo 23 contém uma substituição do resíduo de asparagina com carga, na posição 28, por um resíduo alanina de carga neutra, nessa posição, tendo tal substituição originado um aumento de 50 74 % da actividade biológica (medida pelos ensaios divulgados de incorporação da timidina). 0 residuo asparagina, na posição 28, tem uma interacção superficial com o residuo de asparagina na posição 113; estando os dois residuos carregados negativamente, há um certo grau de instabilidade (devido à repulsão entre radicais com cargas iguais) . No entanto, quando o residuo de asparagina na posição 113 é substituído pelo residuo de alanina de carga neutra, a actividade biológica cai para zero (no sistema de ensaio presente) . Isto indica que o residuo de asparagina, na posição 113, é critico para a actividade biológica e que a eliminação da asparagina, na posição 28, serve para aumentar o efeito que a asparagina possui na posição 113.

Foram determinados também os dominios necessários para a ligação do receptor de FEC-G, com base nos análogos anteriores preparados e na estrutura do FEC-G. 0 dominio de ligação do receptor de FEC-G está localizado nos residuos (com o residuo de metionina na posição 1) 11-57 (entre as hélices A e AB) e 100-118 (entre as hélices B e C) . Também é possivel preparar moléculas abreviadas capazes de se ligarem a um receptor de FEC-G e de iniciarem a transdução do sinal para estimular os neutrófilos de forma selectiva, mediante a modificação da estrutura da espira externa e deixando ficar intactos os dominios de ligação ao receptor.

Foram identificados os residuos essenciais responsáveis pela actividade biológica e presumivelmente pela ligação ao receptor de FEC-G ou pelo transdução do sinal. Há dois locais distintos localizados em duas regiões diferentes da estrutura secundária. O "local A", tal como aqui designado, está situado numa hélice confinada por contactos de tipo ponte salia entre dois outros membros do feixe helicoidal. O segundo local, "local B" está situado 75 numa hélice relativamente mais flexível que á a hélice AB. A hélice AB é potencialmente mais sensível a variações locais do pH devido ao tipo e posição dos resíduos nos terminais carboxi e amino. A importância funcional desta hélice flexível pode ser relevante num ajustamento induzido conformacionalmente aquando da ligação ao receptor de FEC-G. Além disso, a parte prolongada da hélice D também é indicada como sendo um domínino de ligação ao receptor de FEC-G, conforme determinado por análise da estrutura das proteínas por via mutacional directa e por via comparativa indirecta. A supressão da extremidade do terminal carboxi de FEC-G-met-hu-r reduz a actividade, tal como sucede com a HCh, ver, Cunningham e Wells, Science 244: 1081-1084 (1989). As citocinas que possuem estruturas semelhantes, tais como a IL-6 e a FEC-MG, com topologia semelhante prevista, também centram a sua actividade biológica ao longo da extremidade carboxi da hélice D, ver, Bazan, Immunology Today 11: 350-354 (1990).

Uma comparação das estruturas e das posições dos determinantes de ligação ao receptor de FEC-G, entre o FEC-G e a HCh, sugere que as duas moléculas possuem meios idênticos de transdução do sinal. Foram identificados dois locais separados de ligação ao receptor de FEC-G para hCH; De Vos et al., Science 255: 306-32 (1991). Um destes locais de ligação (designado por "Local I") é formado por resíduos das faces expostas da hélice 1 da HCh, da região de ligação entre as hélices 1 e 2 e da hélice 4. Um segundo local de ligação (designado por "Local II") é formado pelos residuos da superfície da hélice 1 e da hélice 3.

Os determinantes da ligação ao receptor de FEC-G identificados no FEC-G estão localizados nas mesmas posições relativas dos que foram identificados para a HCh. 76 0 local de ligação ao receptor de FEC-G situado na região de união entre as hélices A e B na hélice AB (local A) está numa posição semelhante à que foi assinalada para um pequeno fragmento de hélice (residuos 38-47) da HCh. Uma única mutação pontual na hélice AB do FEC-G reduz, de forma significativa, a actividade biológica (conforme determinado nos ensaios da presente invenção), indicando o papel que tem no interface ligando-receptor de FEC-G. A ligação do receptor de FEC-G pode desestabilizar a natureza helicoidal de 310 desta região e induzir uma modificação conformacional que melhore a energia de ligação do complexo ligando/receptor de FEC-G.

No complexo receptor de HCh, a primeira hélice do feixe fornece residuos aos dois locais de ligação necessários para dimerizar o receptor de HCh. Numa análise mutacional da correspondente hélice de FEC-G (hélice A) foram identificados tees residuos que são necessários para a actividade biológica. Desses três residuos, há dois, Glu 20 e Arg 24, que estão sobre uma face do feixe helicoidal voltada para a hélice C, enquanto a cadeia lateral de Arg 23 (em duas das três moléculas na unidade assimétrica) aponta para a face do feixe voltada para a hélice D. A posição das cadeias laterais destes residuos biologicamente importantes indica que, tal como sucede com a HCh, também o FEC-G pode ter um segundo local de ligação ao receptor de FEC-G, ao longo da interface entre a hélice A e a hélice C. Contrariamente ao que sucede com a molécula de HCh, o terminal amino da molécula de FEC-G tem um papel biológico limitado, na medida em que a supressão dos primeiros 11 residuos tem um efeito diminuto sobre a actividade biológica. 77

Conforme indicado antes (ver, por exemplo, a figura 2), o FEC-G tem uma semelhança topológica com outras citocinas. Uma correlação da estrutura com estudos bioquímicos anteriores, a análise mutacional e a comparação directa de resíduos específicos do compledo do receptor de HCh indicam que o FEC-G tem dois locais de ligação ao receptor. 0 local A fica situado ao longo da interface das hélices A e D e compreende os resíduos existentes na pequena hélice AB. 0 local B também compreende resíduos da hélice A, mas fica situado ao longo da interface entre as hélices A e C. A conservação da estrutura e as posições relativas de resíduos biologicamente importantes entre as moléculas de FEC-G e HCh são uma indicação da existência de um processo comum de transdução do sinal, na medida em que o receptor se encontra ligado em dois locais. Verificou-se, consequentemente, que os análogos de FEC-G, que possuem domínios modificados de ligação ao receptor de FEC-G, podem ser preparados por alteração de qualquer dos locais de ligação ao receptor de FEC-G (resíduos 20-57 e 145-175). O conhecimento da estrutura tridimensional e da correlação da composição da proteína FEC-G faz com que seja possível conceber um processo sistemático e racional para a preparação de análogos de FEC-G. Os exemplos experimentais anteriormente descritos demonstraram que as limitações de tamanho e de polaridade das cadeias laterais, dentro do núcleo da estrutura, determinam a quantidade de modificações que a molécula pode tolerar antes de a sua estrutura global ficar alterada.

A SEGUIR DESCREVEM-SE CARACTERÍSTICAS DA PRESENTE INVENÇÃO 1. Um processo para a preparação de um análogo de FEC-G que compreende as etapas de: 78 (a) visualização da informação que comporta a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G; (b) selecção, a partir da referida informação visualizada, de pelo menos um sitio na referida molécula de FEC-G para a alteração; (c) preparação de uma molécula de FEC-G tendo tal alteração; e (d) eventualmente, análise dessa molécula de FEC-G em relação a uma caracteristica desejada. 2. Um processo, à base de computador, para a preparação de um análogo de FEC-G que compreende as etapas de: (a) providenciar a expressão em computador da estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G; (b) seleccionar, a partir da referida expressão em computador, pelo menos um sitio na referida molécula de FEC-G para a alteração; (c) preparação de uma molécula de FEC-G tendo tal alteração; e (d) eventualmente, análise dessa molécula de FEC-G em relação a uma caracteristica desejada. 3. Um processo para a preparação de um análogo de FEC-G com a ajuda de um computador que compreende: (a) proporcionar o referido computador com os meios para exibir a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G incluindo a visualização da composição de porções da referida molécula de FEC-G, de preferência exibindo a localização tridimensional de cada aminoácido e, mais preferencialmente, exibindo a localização tridimensional de cada átomo de uma molécula de FEC-G; (b) visualizar o referido visor; 79 (c) seleccionar um local no referido visor para a alteração na composição da referida molécula ou a localização de uma parte dela; e (d) preparar um análogo de FEC-G com essa alteração. 4. Um processo, à base de computador, para a preparação de um análogo de FEC-G que compreende as etapas de: (a) visualizar a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, através de um computador, tendo sido o referido computador previamente programado (i) para expressar as coordenadas de uma molécula de FEC-G no espaço tridimensional e (ii) para permitir a entrada de informação para a alteração da referida expressão de FEC-G e a sua visualização; (b) seleccionar um local na referida imagem visual da referida molécula de FEC-G para a alteração; (c) inserir a informação para a referida alteração no referido computador; (d) visualizar uma estrutura tridimensional da referida molécula de FEC-G modificada por via do referido computador; (e) eventualmente repetir as etapas(a) - (e) anteriores; (f) preparar um análogo de FEC-G com essa alteração; e (g) eventualmente analisar o referido análogo de FEC-G em relação a uma característica desejada. 5. Num equipamento à base de um computador para exibir a estrutura tridimensional de uma molécula, a melhoria que compreende meios para correlacionar a referida estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G com a composição da referida molécula de FEC-G. 80 6. Um processo para a cristalização de uma proteina que compreender as etapas de: (a) a combinação, eventualmente por meios automáticos, de alíquotas aquosas da referida proteína, quer com (i) alíquotas de uma solução de sal, cada alíquota com uma concentração diferente de sal; ou (ii) alíquotas de uma solução de precipitação, cada alíquota tendo uma concentração diferente de agente de precipitante; (b) a selecção de pelo menos uma das referidas alíquotas combinadas, baseando-se a referida selecção na formação de formas pré-cristalinas ou, se não houver formas pré-cristalinas assim produzidas, aumentando a concentração inicial de proteína das referidas alíquotas aquosas de proteína e repetindo a etapa (a) ; (c) após a selecção da concentração do referido sal ou do referido agente de precipitação, a repetição da etapa (a) com a referida solução, não selecionada previamente, não selecionada, na presença da referida concentração seleccionada; e (d) a repetição da etapa (b) e da etapa (a) até se obter um cristal com a qualidade desejada. 7. Um processo da caracteristica 6, em que cada combinação, em conformidade com a etapa (a), é realizada numa determinada gama de pH. 8. Um processo da caracteristica 6 em que a referida combinação da etapa (a) é feita na presença de uma unidade de iniciação da nucleação. 9. Um análogo de FEC-G possuindo uma sequência de aminoácidos diferente da da figura 1 em que: (a) a metionina do terminal N é opcional; e (b) um ou mais dos aminoácidos 58-72 (i) está substituído com um ou mais aminoácidos diferentes ou (ii) são eliminados ou (iii) são quimicamente modificados. 81 10. Um análogo de FEC-G da característica 9, em que o referido análogo é mais resistente à proteólise do que uma molécula de FEC-G da figura 1. 11. Um análogo de FEC-G da caracteristica 10 em que pelo menos um dos referidos aminoácidos está quimicamente modificado pela adição de uma molécula de polietileno-glicol. 12. Um análogo de FEC-G possuindo uma sequência de aminoácidos diferente da da figura 1 em que: (a) a metionina do terminal N é opcional; e (b) um ou mais dos aminoácidos 119-125 (i) está substituído com um ou mais aminoácidos diferentes ou (ii) estão eliminados ou (i i i) foram quimicamente modificados. 13. Um análogo de FEC-G da caracteristica 12 em que o referido análogo é mais resistente à proteólise do que uma molécula de FEC-G da figura 1. 14. Um análogo de FEC-G da caracteristica 12 em que pelo menos um dos referidos aminoácidos está quimicamente modificado pela adição de uma molécula de polietileno-glicol. 15. Uma molécula de FEC-G com a espira AB estabilizada através da ligação dessa espira a uma ou mais das hélices A, B, C ou D. 16. Uma molécula de FEC-G com a espira CD estabilizada através da ligação dessa espira a uma ou mais das hélices A, B, C ou D. 17. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veículo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Lis17 -> Arg17 e o terminal N da metionina serem opcionais. 18. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veículo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo 82 facto de Lis35 -> Arg35 e o terminal N da metionina serem opcionais. 19. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Lis41 -> Arg41 e o terminal N da metionina serem opcionais. 20. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Lis17,24,35^Arg17'24'35 e o terminal N da metionina serem opcionais. 21. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Lis17'35,41 Arg17,35'41 e o terminal N da metionina serem opcionais. 22. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Lis24,35'41 Arg24'35,41 e o terminal N da metionina serem opcionais. 23. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Lis17'24,35,41 ->· Arg17,24'35,41 e o terminal N da metionina serem opcionais. 24. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Lis17'24'41 -► Arg17'24'41 e o terminal N da metionina serem opcionais. 25. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz, sob o ponto de vista farmacêutico, em que a 83 sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Gin68 ->· Glu68 e o terminal N da metionina serem opcionais. 26. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequencia de aminoácidos facto de Cis37'43 - Ser37'4 serem opcionais. 27. Um análogo de FEC-eficaz sob o ponto de sequência de aminoácidos facto de Gin26 -► Ala26 e o opcionais. 28. Um análogo de FEC-eficaz sob o ponto de sequência de aminoácidos facto de Gin174 -► Ala174 e opcionais. 29. Um análogo de FEC eficaz sob o ponto de sequência de aminoácido: facto de Arg170 ->· Ala170 e opcionais. 30. Um análogo de FEC eficaz sob o ponto de sequência de aminoácido: facto de Arg167 ->· Ala167 e opcionais. 31. Um análogo de FEC eficaz sob o ponto de sequência de aminoácido: facto de haver uma el terminal N da metionina s difere da da figura 1 pelo e o terminal N da metionina •G, eventualmente num veiculo vista farmacêutico, em que a difere da da figura 1 pelo terminal N da metionina serem G, eventualmente num veiculo vista farmacêutico, em que a difere da da figura 1 pelo 3 terminal N da metionina serem G, eventualmente num veiculo vista farmacêutico, em que a difere da da figura 1 pelo o terminal N da metionina serem -G, eventualmente num veiculo vista farmacêutico, em que a 3 difere da da figura 1 pelo o terminal N da metionina serem -G, eventualmente num veiculo vista farmacêutico, em que a 3 difere da da figura 1 pelo iminação na posição 167 e o er opcional. 84 32. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veículo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Lis41 -► Ala41 e o terminal N da metionina serem opcionais. 33. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veículo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de His44 -► Lis44 e o terminal N da metionina serem opcionais. 34. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veículo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Glu47 -► Ala47 e o terminal N da metionina serem opcionais. 35. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veículo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Arg23 Ala23 e o terminal N da metionina serem opcionais. 36. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veículo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Lis24 -► Ala24 e o terminal N da metionina serem opcionais. 37. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veículo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Glu20 -► Ala20 e o terminal N da metionina serem opcionais. 38. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veículo eficaz, sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo 85 28

Ala^8 e o terminal N da metionina serem facto de Asp^ opcionais. 39. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo .127

Glu 127 e o terminal N da metionina serem facto de Met opcionais. 40. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo . 138

Glu 138 e o terminal N da metionina serem facto de Met opcionais. 41. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo . 127

Leu 127 e o terminal N da metionina serem facto de Met opcionais. 42. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Met 138

Leu 138 e o terminal N da metionina serem opcionais. 43. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Cis18 -► Ala18 e o terminal N da metionina serem opcionais. 44. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Gin 12,21

Glu 12,21 e o terminal N da metionina serem opcionais. 45. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a 86 sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Gin12,21'68 -► Glu12,21'68 e o terminal N da metionina serem opcionais. 46. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Glu20 -> Ala20; Ser13 -► Gli13 e o terminal N da metionina serem opcionais. 47. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Met127'138 Leu127'138 e o terminal N da metionina serem opcionais. 48. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Ser13 -> Ala13 e o terminal N da metionina serem opcionais. 49. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Lis17 ->· Ala17 e o terminal N da metionina serem opcionais. 50. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Gin121 -> Ala121 e o terminal N da metionina serem opcionais. 51. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Gin21 -> Ala21 e o terminal N da metionina serem opcionais. 87 52. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de His44 ->· Ala44 e o terminal N da metionina serem opcionais. 53. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a referida sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de His53 ->· Ala53 e o terminal N da metionina serem opcionais. 54. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Asp110 -► Ala110 e o terminal N da metionina serem opcionais. 55. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Asp113 -> Ala113 e o terminal N da metionina serem opcionais. 56. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Tre117 -► Ala1317 e o terminal N da metionina serem opcionais. 57. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Asp28 -► Ala28; Asp110 -► Ala110 e o terminal N da metionina serem opcionais. 58. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Glu124 -► Ala124 e o terminal N da metionina serem opcionais. 59. Um análogo de FEC-G, eventualmente num veiculo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico, em que a sequência de aminoácidos difere da da figura 1 pelo facto de Fen114 -► Vai114, Tre117 -► A117 e o terminal N da metionina serem opcionais. 60. Plasmidos contendo o ADN do análogo de FEC-G e células hospedeiras bacterianas por eles transformadas, disponíveis na American Type Culture Collection com os números de acesso da ATCC 69184, 69185, 69186, 69187, 69188, 69189, 69190, 69191, 69192, 69193, 69194, 69195, 69196, 69197, 69198, 69199, 69200, 69201, 69202, 69203, 69204, 69205, 69206, 69207, 69208, 69209, 69210, 69211, 69212, 69213, 69214, 69215, 69216, 69217, 69218, 69219, 69220, 69221, 69222, 69223, 69224, 69225 e 69226.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Amgen Inc.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: COMPOSIÇÕES DE ANÁLOGOS DE FEC-G E RESPECTIVOS PROCESSOS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 110 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREcO: Amgen Inc. (B) RUA: Amgen Center, 1840 DeHavilland Drive (C) CIDADE: Thousand Oaks (D) ESTADO: Califórnia 89 (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL: 91320-1789 (iv) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC da IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 565 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADES:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) Localização: 30..554 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

TCTAGAAAAA ACCAAGGAGG TAATAAATA ATG ACT CCA TTA GGT GCT GCT TCT

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser 1 5 TCT CTG CCG CAA AGC TTT CTG CTG AAA TGT CTG GAA CAG GTT TGT AAA Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis 10 15 20

ATC CAG GGT CAC GGT GCT GCA CTG CAA GAA AAA CTG TGC GCT ACT TAC 53 101 149 90

Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir 25 30 35 40 AAA CTG TGC CAT CCG GAA GAG CTG GTA CTG CTG GGT CAT TCT CTT GGG 197 Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli 45 50 55 ATC CCG TGG GCT CCG CTG TCT TCT TGT CCA TCT CAA GCT CTT CAG CTG 245 Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu 60 65 70 GCT GGT TGT CTG TCT CAA CTG CAT TCT GGT CTG TTC CTG TAT CAG GGT 293 Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli 75 80 85 CTT CTG CAA GCT CTG GAA GCT ATC TCT CCG GAA CTG GGT CCG ACT CTG 341 Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu 90 95 100 GAC ACT CTG CAG CTA GAT GTA GCT CAC TTT GCT ACT ACT ATT TGG CAA 389 Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin 105 110 115 120 CAG ATG GAA GAG CTC GGT ATG GCA CCA GCT CTG CAA CCG ACT CAA GCT 437 Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala Pro Ala Lau Gin Pro Tre Gin Gli 125 130 135 GCT ATG CCG GCA TTC GCT TCT GCA TTC CAG CGT CGT GCA GGA GGT GTA 485 Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai 140 145 150 CTG GTT GCT TCT CAT CTG CAA TCT TTC CTG GAA GTA TCT TAC CGT GTT 533 Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai 155 160 165 CTG CGT CAT CTG GCT CAG CCG TAATAGAATT C 565 Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: 91 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin MetGlu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 92 (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4 ACAGGTTCGT CGTATCCAGG GTG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5 CACTGCAAGA ACGTCTGTGC GCT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRI1MENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: CGCTACTTAC CGTCTGTGCC ATC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPOO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear 94 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8 ACAGGTTCGT CGTATCCAGG GTG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nuccleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: CACTGCAAGA ACGTCTGTGC GCT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1 CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPOO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: ACAGGTTCGT CGTATCCAGG GTG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: CGCTACTTAC CGTCTGTCCC ATC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 13:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA 24 96 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: CACTGCAAGA ACGTCTGTGC GCT 23 (2)INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: CGCTACTTAC CGTCTGTGCC ATC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear 97

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: ACAGGTTCGT CGTATCCAGG GTG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃAO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: CACTGCAAGA ACGTCTGTGC GCT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: CGCTACTTAC CGTCTGTGCC ATC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 98 (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19: CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucLeuco (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20: ACAGGTTCGT CGTATCCAGG GTG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21: CACTGCAAGA ACGTCTGTGC GCT 23 99 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22: CGCTACTTAC CGTCTGTGCC ATC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23: TCTGCTGAAA GCTCTGGAAC AGG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear 100

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIQAO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24: CTTGTCCATC TGAAGCTCTT CAG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25: GAAAAACTGT CCGCTACTTA CAAACTGTCC CATCCGG 37 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26: TTCGTAAAAT CGCGGGTGAC GG 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 101 (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 27: TCATCTGGCT GCGCCGTAAT AG 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nuccleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 28: CCGTGTTCTG GCTCATCTGG CT 22 (2) Informação PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 29: GAAGTATCTT ACGCTGTTCT GCGT 24 102 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nuccleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 30: GAAGTATCTT ACTAAGTTCT GCGTC 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 31: CGCTACTTAC GCACTGTGCC AT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear 103

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 32: CAAACTGTGC AAGCCGGAAG AG 22 (2) Informação PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 33: CATCCGGAAG CACTGGTACT GC 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 34: GGAACAGGTT GCTAAAATCC AGG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 104 (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 35: GAACAGGTTC GTGCGATCCA GGGTG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 36: GAAATGTCTG GCACAGGTTC GT 22 (2) INFORMAQAO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 37: TCCAGGGTGC CGGTGCTGC 19 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 38: AAGAGCTCGG TGAGGCACCA GCT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 39: CTCAAGGTGC TGAGCCGGCA TTC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear 106

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIQAO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 40 GAGCTCGGTC TGGCACCAGC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:41 TCAAGGTGCT CTGCCGGCAT T 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 42 TCTGCCGCAA GCCTTTCTGC TGA 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 43: CTTTCTGCTG GCATGTCTGG AACA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 44: CTATTTGGCA AGCGATGGAA GAGC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 45: CAGATGGAAG CGCTCGGTAT G 21 108 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 46: GAGCTCGGTC TGGCACCAGC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 47: TCAAGGTGCT CTGCCGGCAT T 21 (2) INFORMAQAO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear 109

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 48: GAAATGTCTG GCACAGGTTC GT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 49: TTCCGGAGCG CACAGTTTG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 50: CGAGAAGGCC TCGGGTGTCA AAC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 110 (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 51: ATGCCAAATT GCAGTAGCAA AG 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 52: ACAACGGTTT AACGTCATCG TTTC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 53: ATCAGCTACT GCTAGCTGCA GA 22 111 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 54: TCAGTCGATG ACGATCGACG TCT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 55: TTACGAACCG CTTCCAGACA TT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear 112

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 56: TAAAATGCTT GGCGAAGGTC TGTAA 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 57: GTAGCAAATG CAGCTACATC TA 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 58: CATCATCGTT TACGTCGATG TAGAT 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 113 (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 59: CCAAGAGAAG CACCCAGCAG 2 0 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 60: AGGGTTCTCT TCGTGGGTCG TC 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 61: CACTGGCGGT GATAATGCAGC 20 114 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 62: CTAGGCCAGG CATTACTGG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 63: CCACTGGCGG TGATACTGAG C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear 115

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO :64: AGCAGAAAGC TTTCCGGCAG AGAAGAAGCA GGA 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TRPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 65: GCCGCAAAGC TTTCTGCTGA AATGTCTGGA AGAGGTTCGT AAAATCCAGG GTGA 54 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 59 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 66: CTGGAATGCA GAAGCAAATG CCGGCATAGC ACCITCAGTC GGITGCAGAG CTGGTGCCA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos 116 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 67:

Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pco Gin Ser Phe Leu Leu 1 S 10 IS

Arg Cys Leu Glu Gin Vai Arg Lys Xle Gin Gly hep Gly Ala Ala Leu 20 25 30

Gin Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 35 40 45

Vai Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser SO J55 60

Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His €5 70 75 80

Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile 85 90 95

Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gl» Leu Asp Vai Ala 100 105 110

Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 115 120 125

Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140

Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160

Phe Leu Glu Vai Ser Tyr Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) Informação PARA A SEQUÊNCIA ID N0: 68: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0: 68: 117

Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 S 10 15

Lys Cye Leu Glu Gin Vai Arg Arg Xle Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lys 15 Leu Cye Ala Thr Tyr 40 Lye Leu Cye His Pro 45 Glu Glu Leu Vai Leu 50 Leu Gly ais Ser Leu 55 Gly lie Pro Trp Ala 60 Pro Leu Ser Ser Cys Pro 65 ser Gin Ala Leu 70 Gin Leu Ala Gly Qrs 7$ Leu Ser Gin Leu His 80 Ser Gly Leu Phe Leu 85 Tyr Gin Gly Leu Leu 90 Gin Ala Leu Glu Gly 95 Ile Ser Pro Glu Leu 100 Gly Pro Thr Leu Asp 105 Thr Leu Gin Leu Asp Val 110 Ala Asp Phe Ala 115 Thr Thr xle Trp Gin 120 Gin Met Glu Glu Leu 125 Gly Met Ala Pro Ala 130 Leu Gin Pro Thr Gin 13$ Gly Ala Met Pro Ala 140 Phe Ala Ser Ala Phe Gin 14$ Arg Arg Ala Gly ISO Gly vai Leu Val Ala 155 Ser His Leu Gin Ser 160 Phe Leu Glu Vai Ser 165 Tyr Arg vai Leu Arg 170 ais Leu Ala Gin Pro 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 69: 118

Mac Tftr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 S 10 IS

Lys Cye Leu Glu Gin Vai Arg Lys lie Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu 20 25 30

Gin Glu Arg Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cye His Pro Glu Glu Leu 35 40 45

Vai Leu Leu Gly His Ser Leu Gly lie Pro Ttp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60

Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His €5 70 75 80

Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile 85 90 95 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 70: 119

Met Thr 1 Pro Leu Gly 5 Pro Ala Ser ser Leu 10 pro Gin Ser Phe Leu 15 Leu Lys Cys teu Glu 20 Gla Vai Arg Lys Ile 25 Gin Gly Asp Gly Ala Ala 30 Leu Gin Glu l.ys 35 Leu Cys Ala Thr Tyr 40 Arg Leu Cys Bis Pro 45 Glu Glu Leu Vai Leu 50 Leu Gly 8ÍS Ser Leu 55 Gly Ile Pro Trp Ma 60 Pro Leu Ser Ser Cys Pro $5 Ser Gin Ala Leu Gin W Leu Ma Gly Cys 75 Leu Ser Gla Leu Sis SO Ser Gly Leu Phe Leu ss Tyr Gin Gly Leu Leu 90 Gla Ma Leu Glu Gly Ile 95 Ser Pro Glu Leu 100 Gly Pro Thr Leu Asp 105 Thr Leu Gin Leu Asp Vai 110 Ma Asp Phe Ala 115 Thr Thr Ile Trp Gin 120 Gin Met Glu Glu Leu 125 Gly mt Ma Pro Ala 130 Leu Gin Pro Thr Gin 135 Gly Ala Met Pro Ala 140 Phe Ala Ser Ala Phe Gin 145 Arg Arg AI a Gly Gly ISO vai Leu vai Ala 155 Ser Bis Leu Gin Ser 160 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 71: 120

Met 1 Thr Pro Leu eiy 5 Pr© Ala Ser Ser Leu 10 Pro Gin ser Phe Leu 15 Leu Arg Cys Leu Glu 20 Gin val Arg Arg Xle 25 Gin Gly Asp Gly Ala Ala 30 Leu Gin Glu Arg 35 Leu Cys Ala Thr TVr 40 Lys Leu cys His pro 45 Glu Glu Leu Vai Leu Leu 50 «y His Ser Leu 55 Gly Ile Pro Trp Ala 60 Pro Leu Ser Ser Cys 6$ Pro Ser Gin Ala Leu 70 Gin Leu Ala Gly Cys 75 Leu Ser Gin Leu His 80 Ser Gly Leu Phe Leu 85 Tyr Gin Gly Leu Leu §0 Gin Ala Leu Glu Gly 9S Ile Ser Pro Glu Leu 100 Gly Pr© Thr Leu Asp 105 Thr Leu Gin Leu Asp Val 110 Ala Asp Phe Ala 115 Thr Thr Xle Trp Gin 120 Gin Met Glu Glu Leu 125 Gly Met Ala Pr© Ala Leu 130 Gin Pro Thr Gin 135 Gly Ala Met Pro Ala 140 Phe Ala Ser Ala Phe 14S Glu Arg Arg Ala Gly ISO Gly Val Leu Val Ala 155 Ser His Leu Gin Ser 160 Phe Leu Glu val Ser 165 Tyr Arg val Leu Arg 170 His Leu Ala Gin Pro 175 (2) INFORMAÃOO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TRPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 72: 121

Ket Thr 1 Pro Leu Gly 5 Pro Ala Ser Ser Leu 10 pro Gin Ser Phe Leu 15 Leu Arg Cys Leu Glu 20 Gin Vai Arg Lys Ile 25 Gin Gly Asp Gly Ala Ala 30 Leu Gin Glu Arg 35 Leu Cys Ala Thr tyr 40 Arg Leu Cys Bis Pro 45 Glu Glu Leu Vai Leu 50 Leu Gly Kis Ser Leu 55 Gly Ile Pro Trp Ala 60 Pro Leu Ser Ser Cys Pto 65 Ser Gin Ala Leu 70 Gin Leu Ala Gly Cys 75 Leu Ser Gin Leu His 80 Ser Gly Leu Phe leu 85 Tyr Gin Gly Leu Leu 50 Gin Ala Leu Glu Gly 95 ile Ser Pro Glu Leu 100 Gly Pro Thr Leu Asp X05 Thr Leu Gin Leu Asp Vai 110 Ala Asp Phe Ala 115 Thr Thr ile Trp Gin 120 Gin Met Glu Glu Leu 125 Gly Met Ala Pro Ala 130 Leu Gin Pro Thr Gin 135 Gly Ala Met Pro Ala 140 Phe Ala Ser Ala Phe Gin 145 Arg Arg Ala Gly 150 Gly Vai Leu Vai Ala 155 Ser His Leu Gltt Ser 160 Phe Leu Glu Vai Ser 165 tyr Arg Vai Leu Arg 170 His Leu Ala Gin Pro 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TRPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TRPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:73:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Arg Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Lex 20 25 30 Gin Glu Arg Leu Cis Ala Tre Tir Arg Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 122

Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:74:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 15 10 15

Arg Cis Leu Glu Gin Vai Arg Arg Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30

Gin Glu Arg Leu Gs Ala Tre Tir Arg Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45

Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 123

Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala . Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:75:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 15 10 15

Arg Cis Leu Glu Gin Vai Arg Arg Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30

Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Arg Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45

Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60

Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 124

Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Gin Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Gin Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 76: Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin , Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Gin Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Glu Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 125

Ser Pro Gli Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Gin Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 77: Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Ser Ala Tre Tir Lis Leu Ser His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gal Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 126

Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125

Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140

Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160

Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 78:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Ala Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 127

Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140

Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160

Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAQAO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:79 : Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin , Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Gin Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Gin Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Lau Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala . Fen Ala Ser Ala 130 135 140 128

Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160

Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 80: Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Las Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Gin Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 129

Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Ala His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO 81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 81: Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin l Ser Fen Leu Le 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Gin Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Gin Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala . Fen Ala Ser AI 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Ala Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 130 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 174 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 82:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Gin Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Asp Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gin Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 174 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 83: 131 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: arninoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 83:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Ala Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His ; Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 132 (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 84:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis Lis Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Gin Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 133 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 85:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu . Pro ' Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Leu Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Ala Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tir Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tir Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tir Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2)INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:86: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 134 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:86:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Ala Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp ) Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Gin Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:87: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:87: 135

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Ala Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro ' Ala Fen Ala Ser Αίε 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leun Gin Sei 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 88: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 88:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 15 10 15 136

Lis Cis Leu Ala Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tre Gin Gli Leu Leu Gn Ala ; Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Gin Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 121 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 89: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 89:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 15 10 15 137

Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Ala Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tir Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala . Fen Ala Ser Ais 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser ' His Leu Gin Sei 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:90: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 90:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 15 10 15

Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 138

Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Glu Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 91: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 91:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 15 10 15

Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30

Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 139

Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Glu Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160

Fen Leu Glu Vai Ser Tir rg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 92:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 15 10 15

Lis Ciss Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30

Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Gli Leu 35 40 45

Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 140

Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Lau Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Leu Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 93: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 93:

Met Tre Pro Lau Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Gin Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 141

Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Leu Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 94: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 94: Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Ala Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Ciss Ala Tre Tir Lis í Leu . Cis His Pro Glu l Glu . Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 142

Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 95: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 95:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Glu Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Glu Vai Arg Las Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Gin Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 143

Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125

Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140

Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160

Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 96: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 96:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Glu Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Glu Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Gin Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Glu Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Lea His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 144

Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140

Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Glu Ser 145 150 155 160

Fen Leu Gin Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 97: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ : ID NO: 97: Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Gli Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Ala Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Os Ala Tre Tir Lis Leu Cis ! His Pro i Glu ( Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Lee His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tr Gin Gli Leu Leu Gin , Ala Lev i Glu ( Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Gin Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Lev Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 145

Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160

Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 98: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 98:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre CU 1-1 H Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Leu Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Leu Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 146

Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Lau Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 99: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 anunoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 99:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin . Ala Fen Leu Lei; 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Gin Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Gin Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala . Fen Ala Ser Ais 130 135 140 Fen Gin Arg AT Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Sei 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 147 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 100: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 100:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu . Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 1 5 Ala Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 101: 148 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 101: Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gi Ile Pro Trp Ala Pro Leu ; Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Ala Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala . Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 102: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 149 (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 102:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser 1 5 Lis Cis Leu Glu Ala Vai Arg Lis 20 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir 35 40 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli 50 55 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu 65 70 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli 85 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu 100 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin 115 120 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli 130 135 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai 145 150 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai 165

Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 10 15 Ile Gin GE Asp i Gli Ala Ala : Leu 25 30 Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 45 Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 60 Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 75 80 Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 90 95 Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 105 110 Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 125 Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 140 Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 155 160 Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 103: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 150 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 103:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis Ala Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 104: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 151 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ : ID NO: 104: Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu as Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Gin Gin Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli Ala Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu an Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Lau Gli Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 105: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) Descrição DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 105: 152

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin . Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu AIa Gli Cis Leu . Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Ala Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tr Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 106: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 106:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 15 10 15 153

Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Gin Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Ala Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140

Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser Hs Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Gin Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 107: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIM1ENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: anunoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:107:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 15 10 15

Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 154

Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Gin Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Ala Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 108: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 108

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 15 10 15

Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30

Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 155

Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Gin Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Ala Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Gin Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 109: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 109:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 156

Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Fen Ala Tre Tre Ile Trp Gin Gin Met Glu Ala Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 110: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 110:

Met Tre Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Fen Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis Ile Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Tre Tir Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 157

Ser Gli Leu Fen Leu Tir Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli Ile 85 90 95 Ser Pro Gin Leu Gli Pro Tre Leu Asp Tre Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Vai Ala Tre Ala Ile Trp Gin Gin Met Glu Gin Leu Gli Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Tre Gin Gli Ala Met Pro Ala Fen Ala Ser Ala 130 135 140 Fen Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Fen Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175

Lisboa, 31 de Maio de 2012 158

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido de FEC-G modificado, caracterizado pelo facto de compreender a sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO: 2 e uma primeira entidade quimica ligada indirectamente, por via de uma segunda entidade quimica, a uma espira externa; em que a espira externa é a espira CD situada ao nivel dos aminoácidos n° 119 a 145 ou a espira AB situada ao nivel dos aminoácidos n° 58 a 72; em que a primeira entidade quimica é polietileno-glicol; e em que o residuo de metionina de terminal N, tal como ilustrado na SEQ ID NO: 2, é opcional.
2. 2. Polipéptido de FEC-G modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a segunda entidade quimica ser um polímero.
3. 3. Polipéptido de FEC-G modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a espira externa ser a espira CD.
4. 4. Polipéptido de FEC-G modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a espira externa ser a espira AB. Lisboa, 31 de Maio de 2012. 1