KR100390338B1 - 과립구 군체 자극 인자의 결정화 방법 - Google Patents

과립구 군체 자극 인자의 결정화 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100390338B1
KR100390338B1 KR10-2001-7006530A KR20017006530A KR100390338B1 KR 100390338 B1 KR100390338 B1 KR 100390338B1 KR 20017006530 A KR20017006530 A KR 20017006530A KR 100390338 B1 KR100390338 B1 KR 100390338B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
csf
seq
type
dna
iii
Prior art date
Application number
KR10-2001-7006530A
Other languages
English (en)
Inventor
오스런드티모티디
Original Assignee
암겐 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21743861&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR100390338(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 암겐 인코포레이티드 filed Critical 암겐 인코포레이티드
Application granted granted Critical
Publication of KR100390338B1 publication Critical patent/KR100390338B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

본 발명은 다음 단계를 포함하는 단백질의 결정화 방법에 관한 것이다 :
(a) (ⅰ) 상이한 염 농도를 갖는 염 용액의 분취량 ; 또는 (ⅱ) 상이한 침전제 농도를 갖는 침전제 용액의 분취량과 상기 단백질의 수용액 분취량을 배합시키고 ;
(b) 예비결정체 형태가 형성되면 적어도 하나의 상기 배합된 분취량을 선택하나, 예비결정체 형태가 생성되지 않으면, 단백질의 상기 수용액 분취량의 단백질 출발 농도를 증가시킨 다음 (a) 단계를 반복하고 ;
(c) 상기 염이나 침전제 농도를 선택한 후, 상기 선택한 농도하에서 상기 미리 선택하지 않은 용액으로 (a) 단계를 반복하고 ; 및
(d) 원하는 투과성의 결정이 수득될 때까지 (b) 단계와 (a) 단계를 반복한다.

Description

과립구 군체 자극 인자의 결정화 방법 {METHOD FOR CRYSTALLIZATION OF GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR}
본 발명은 G-CSF 를 결정화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 G-CSF 유사체, 이러한 유사체를 제조하는 방법 및 관련 장치에 관한 것이다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 본 유사체를 암호화하는 핵산이나 관련 핵산, 관련 숙주세포 및 벡터에 관한 것이다. 또다른 양상에 있어서, 본 발명은 G-CSF 유사체 및 관련 조성물을 합리적으로 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 또다른 양상에 있어서, 본 발명은 본 G-CSF 유사체를 사용하는 치료방법에 관한 것이다.
조혈은 두 계에 의해 조절된다 : 골수 미세환경내의 세포와 성장인자. 군체 자극인자라고도 불리는 성장인자는 항원감작(committed) 선조세포를 자극하여 분화하는 혈구의 군체를 증식하고 형성한다. 이들 인자 중 하나는 본원에서 G-CSF 라 부르는 과립구 군체 자극인자로서, 호중구감소 상태에서 잠재적 사용을 나타내는 호중구의 성장과 발생을 우선적으로 자극한다[Welte 등의 PNAS - USA 82 : 1526 - 1530 (1985) ; Souza 등의 Science 232 : 61 - 65 (1986) 및 Gabrilove 의 J. Seminars in Hematology 26 : (2) 1 - 14 (1989) 참조].
인체에서 내인성 G-CSF 는 혈장에서 검출가능하다[Jones 등의 Bailliere's Clinical Hematology 2 (1) : 83 - 111 (1989) 참조]. G-CSF 는 섬유아세포, 대식세포, T 세포 영양아층, 내피세포 및 상피세포에 의해생성되며 17 번 염색체상에 위치한 4 개의 엑손과 5 개의 인트론으로 구성된 단일 복제 유전자의 발현 생성물이다. 이 유전자 위치의 전사는 상이하게 프로세싱된 mRNA 종, 결과적으로 G-CSF mRNA 의 두 가지 형태를 생성하는데, 하나의 형태는 177 아미노산의 단백질을 암호화하고 다른 형태는 174 아미노산의 단백질을 암호화하되[Nagata 등의 EMBO J 5 : 575 - 581 (1986) 참조], 174 아미노산으로 구성된 형태가 최대의 생체내 생물학적 비활성도를 갖는 것으로 밝혀졌다. G-CSF 는 교차반응하는 종으로서, 인체 G-CSF 를 마우스, 개 또는 원숭이와 같은 다른 포유동물에 투여하면, 지속적인 호중구 백혈구증가증이 유도된다[Moore 등의 PNAS - USA 84 : 7134 - 7138 (1987) 참조].
인체 G-CSF 는 다수의 원(source)으로부터 수득하여 정제할 수 있다. 천연 인체 G-CSF(nhG - CSF) 는 배양된 인체 종양 세포주의 상청액으로부터 분리할 수 있다. 재조합 DNA 기술의 개발[예를들어, 본원의 참고문헌으로 인용된 souza 의 미국 특허 제 4,810,643 호 참조]은 진핵 숙주세포 발현 생성물로서 글리코실화 형태의 G-CSF 및 원핵 숙주세포 발현 생성물로서 비-글리코실화 형태의 G-CSF 를 상업적 규모량으로 생산할 수 있게 하였다.
G-CSF 는 호중구를 증가시킬 필요가 있는 징후를 치료하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 예를들어 암 환자의 경우, G-CSF 는 화학요법이나 방사선 치료로 인한 조혈 결핍에 대한 보상물로 호중구 생성을 선택적으로 자극하는 수단으로서 유익하다. 다른 징후는 여러가지 감염성 질병 및 전형적으로 박테리아의 중간대사물질에 의해 유발되는 패혈증과 같은 관련 증상의 치료를 포함한다. G-CSF 는 단독으로도 유용하며, 또는 배양액내 골수 이식조직용 세포를 성장시키거나 팽창시키기 위해 다른 시토킨과 같은 그외의 화합물과 함께 사용해도 유용하다.
G-CSF 가 세포대사에 영향을 미치는 방법인 시그날 트랜스덕션은 현재는 완전하게 이해되지 않는다. G-CSF 는 특정 선조세포내의 변화를 개시하는 세포 - 표면 수용체에 결합하여 세포 분화를 초래한다.
여러가지 변형된 G-CSF 가 보고되어 있다. 일반적으로, 약물 제조에 있어 특정 변이가 특정 구조 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 예를들어, 하나의 시스테인을 삭제함으로써 보통 이황화물 다리에 의해 비변이 상태의 겹쳐진 분자를 펼쳐지게 할 수 있다. 단백질의 기능을 변화시키기 위하여 아미노산을 부가, 삭제 또는 치환하는 공지된 방법이 존재한다.
재조합 인체 G-CSF 돌연변이체가 제조되었으나, 제조방법이 전반적인 구조/기능에 관련된 정보를 포함하지는 않는다. 예를들어, Cys 18 의 돌연변이와 생화학적 변형은 보고되어 있다[Kuga 등의 Biochem. Biophy. Res. Comm 159 : 103 - 111 (1989) ; Lu 등의 Arch. Biochem. Biophys. 268 : 81 - 92 (1989) 참조].
발명의 명칭이 '다능성 과립구 군체 자극인자의 생성' 인, 미국 특허 제 4,810,643 호(상기와 같음)에는 G-CSF 의 폴리펩티드 유사체 및 펩티드 단편에 관해 일반적으로 기술되어 있다. 기술된 특이 G-CSF 유사체는 위치 17, 36, 42, 64 및 74 (174 아미노산 종 또는 부가 아미노산이 N-말단 메티오닌인 175 아미노산을 갖는 종의 위치)에서 시스테인을 갖는 G-CSF 및 첫째 (N-말단) 위치에서 알라닌을 갖는 G-CSF 를 포함한다.
발명의 명칭이 '변형된 인체 G-CSF' 인 제 EP 0 335 423 호는 hG-CSF 활성도를 갖는 폴리펩티드에서 적어도 하나의 아미노기의 변형을 기술하고 있다.
발명의 명칭이 '새로운 폴리펩티드' 인 제 EP 0 272 703 호는 N 말단에서나 N 말단의 '인접부위' 에서 치환되거나 삭제된 아미노산을 갖는 G-CSF 유도체에 관해 기술하고 있다.
발명의 명칭이 '폴리펩티드' 인 제 EP 0 459 630 호는 자연 발생적인 G-CSF 의 적어도 하나의 생물학적 성질 및 적어도 Cys17의 천연 시퀀스가 Ser17잔기로 치환되고 Asp27의 천연 시퀀스가 Ser27잔기로 치환된 유도체에서 적어도 5 mg/ml 에서 35 % 의 용액 안정성을 갖는 자연 발생적인 G-CSF 의 유도체에 관해 기술하고 있다.
발명의 명칭이 'G-CSF 의 발현과 그의 돌연변이 단백질 및 그의 용도' 인 제 EP 0 256 843 호는 단백질의 아미노산 시퀀스를 변화시키지 않고, 재조합 숙주세포에서 단백질의 발현을 증가시키기 위해 N-말단을 변형시킨, G-CSF 를 암호화하는 변형된 DNA 시퀀스에 관해 기술하고 있다.
발명의 명칭이 '인체 G-CSF 단백질 발현' 인 제 EP 0 243 153 호는 효모를 사용하는 재조합 생성법에서 수득율을 증가시키기 위해 적어도 하나의 효모 KEX2 프로테아제 프로세싱 부위를 불활성화하여 변형한 G-CSF 에 관해 기술하고 있다.
발명의 명칭이 '폴리펩티드의 부위-특이 균일 변형' 인 Shaw 의 미국 특허 제 4,904,584 호는 리신 변형 단백질에 관해 기술하고 있다.
제 WO 90/12874 호는 단백질의 시스테인 변형 변이체에 관해 기술하고 있다.
발명의 명칭이 '재조합 단백질의 증진된 활성화' 인 오스트레일리아 특허 출원서류 제 AU-A-10948/92 는 원핵 발현후 분자의 접힘을 촉진시키기 위하여 G-CSF 분자의 어느 쪽 말단에서든지 아미노산을 부가하는 것에 관하여 기술하고 있다.
발명의 명칭이 '과립구 군체 자극인자(G-CSF)의 돌연변이 단백질' 인 오스트레일리아 특허 출원 서류 제 AU-A-76380/91 호는 174 아미노산을 갖는 G-CSF 의 위치 50 - 56 및 177 아미노산을 갖는 G-CSF 의 위치 53 - 59 에서 시퀀스 Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile 의 과립구 자극인자 G-CSF 의 돌연변이 단백질 및/또는 174 아미노산을 갖는 성숙한 G-CSF 의 위치 43, 79, 156 및 170 또는 177 아미노산을 갖는 성숙한 G-CSF 의 위치 46, 82, 159 또는 173 에서 4 개의 히스티딘 잔기 중 적어도 하나의 과립구 자극인자 G-CSF 의 돌연변이 단백질에 관해 기술하고 있다.
발명의 명칭이 '합성 인체 과립구 군체 자극인자 유전자' 인 제 GB 2 213 821 호는 선택부위의 카세트(cassette) 돌연변이유발을 촉진시키기 위하여 제한부위를 도입한 합성 G-CSF-암호화 핵산 시퀀스 및 원하는 발현계 내로 유전자의 도입을 촉진시키기 위하여 제한부위를 측면으로 위치시킨 합성 G-CSF-암호화 핵산 시퀀스에 관해 기술하고 있다.
G-CSF 는 다소의 범위에서 결정화되어 있다고 보고되어 있고(예를들어, 제 EP 344 796 호 참조), 단지 전반적인 수준에 대하여만 G-CSF 의 전체 구조가 요약되어 있다[Bazan 의 Immunology Today 11 : 350 - 354 (1990) ; Parry 등의 J. Molecular Recognition 8 : 107 - 110 (1988) 참조]. 현재까지 G-CSF 의 전체 구조에 관한 보고가 없었으며, G-CSF 유사체의 체계적 제조에 필수적인, 상기 분자의 전체 구조와 기능의 관계에 관한 체계적인 연구도 없었다. 따라서, 이와 같은 G-CSF 유사체의 체계적 제조방법과 결과적으로 생성되는 조성물 및 단백질을 결정화하는 방법이 요구된다.
발명의 요약
G-CSF 의 3 차원 구조는 현재 원자 수준까지 결정되어 있다.현재로서는 이러한 3 차원 구조로부터 G-CSF 분자의 조성의 변화가 결과적으로 구조 변화를 초래할 수도 있다는 실질적인 확실성을 예상할 수 있다. 이와 같은 구조적 특징은 G-CSF 유사체를 제조하고 생성하기 위한 생물학적 활성도와 서로 관련이 있을 수도 있다.
비록 다른 연구자들이 G-CSF 의 3 차원 구조에 관하여 추측하였으나 [Bazan 의 Immunology Today 11 : 350 - 354 (1990) ; Parry 등의 J. Molecular Recognition 8 : 107 - 110 (1988) 참조], 이들 추측은 G-CSF 유사체를 제조하고자 하는 사람들에게 도움이 되지 못하였는데 그 이유는 추측한 구조가 부정확하고/하거나(Parry 등의 상기문헌 참조) 추측한 구조가 구성성분과 구조 사이의 상관관계를 상세히 제공하지 못하기 때문이다. 현재 원자 수준까지의 3 차원 구조의 결정은 지금까지는 단연히 가장 완전한 분석이며, G-CSF 유사체를 고안하고 제조하고자 하는 연구자들에게 중요한 정보를 제공한다. 예를들어, 현재의 3 차원 구조 분석으로부터 정확한 소수성 및 친수성 부분이 결정되었다.
상대적인 소수성은 분자의 안정도와 직접 관련되므로 중요하다. 일반적으로 수용액 환경에서 발견된 생물학적 분자는 외부적으로는 친수성이고 내부적으로는 소수성인데, 열역학의 제 2 법칙에 따르면, 이는 최저 에너지 상태이며 안정도를 제공한다. G-CSF 의 내부 코어는 소수성이고 바깥부분은 친수성일 것으로 추측할 수 있을지라도, 특이 소수성 부분 또는 특이 친수성 부분을 알 수 있는 방법은 없었다. 현재 제공된 소수성/친수성 부분에 관한 인식에도 불구하고, G-CSF 분자에 대한 변화가 분자의 전체 구조에 영향을 미칠 것이라는 실질적인 확실성을 예상할 수 있다.
일반적인 규칙에 따라, 전반적인 G-CSF 구조는 변화되지 않으나 변화가 생물학적 활성도(본원에서 사용한 '생물학적 활성도' 는 기능을 나타내는 가장 광범위한 의미이다)에 영향을 미치는 유사체를 고안하기 위해 소수성 및 친수성 부분의 위치에 대한 지식을 이용할 수도 있다. 생물학적 활성도와 구조를 서로 연관시킬 수도 있다. 구조가 변화되지 않고 돌연변이가 생물학적 활성도에 영향을 미치지 않는다면, 그 돌연변이는 생물학적 기능과 무관한 것이다. 그러나, 구조는 변화되지 않지만 돌연변이가 생물학적 활성도에 영향을 미친다면, 잔기(또는 원자)는 적어도 하나의 생물학적 기능에 필수적인 것이다. 본 실시예 중 일부는 전체 구조의 변화는 없으나, 생물학적 기능의 변화를 갖도록 고안되었다.
생물학적 활성도와 구조의 상호관계를 기초로 한 본 발명의 한 양상은 G-CSF 유사체에 관한 것이다. 이들 유사체는 G-CSF 아미노산시퀀스보다 더 많은 아미노산 잔기, 더 적은 아미노산 잔기, 상이하거나 변형된 아미노산 잔기를 갖는 분자이다. 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 부가, 치환 또는 삭제하여 변형시킬 수 있다. 변형은 펩티도미메틱스(peptidomimetics)나 변경된 곁기와 같은 변경된 성분을 지닌 아미노산과 같이, 아미노산 자체의 유사체의 부가 또는 치환을 포함한다. 비교하기 위한 기초로서 사용한 G-CSF 는 인체, 동물 또는 재조합 핵산 - 기술 기원일 수 있다(본원에서 기술한 실시예는 외측 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는, 인체 G-CSF 의 174 아미노산 종의 재조합 생성물에 기초한 것임). 유사체는 천연 인체 G-CSF 분자와 상이한 기능을 가지거나, 동일하거나 다소 동일한 기능을 나타낼 수도 있다. 예를들어, 유사체는 보다 높거나 낮은 생물학적 활성도를 가지거나, 보다 긴 보존기간이나 감소된 안정성을 가지거나, 보다 쉽게 제형화되거나 다른 성분과 혼합하기에 더 어렵도록 고안될 수 있다. 유사체는 조혈 활성도를 가지지 않을 수 있으며, 따라서 G-CSF 효과(예를들어, G-CSF 의 과잉생성)에 대한 길항제로서 유용할 수 있다. 본원에서는 종종 편의상 본 유사체를 단백질이나 펩티드라 언급하지만, 본원에서 의도하는 바는 펩티도미메틱스나 화학적으로 변형된 펩티드와 같은 다른 유형의 분자이다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 활성 성분으로서 G-CSF 유사체를 함유하는 관련 조성물에 관한 것이다. 본원에서 사용한 용어 '관련 조성물' 이란 일단 G-CSF 유사체의 동일성이 확인되면 수득할 수 있는 조성물을 의미한다(이를테면, 검출가능한 표지물로 표지한 G-CSF 유사체, 관련 수용체나 제약학적 조성물). 또한 관련 조성물은 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시킨 변형체와 같이, 화학적으로 변형된 G-CSF 유사체의 변형체이다.
예를들어, 형광, 화학발광이나 방사성 분자와 같은 검출가능한 표지가 부착되도록 G-CSF 유사체를 제조할 수 있다.
다른 예는 공지 물질[예를들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 Remington 의 Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 18042) pages 1435 - 1712 참조]을 사용하여 공지 기술에 의해 제제화할 수 있는 제약학적 조성물이다. 일반적으로, 제제형은 투여, 안정성, 생성관계 및 다른 인자와 같은 다양한 인자들에 좌우될 것이다. G-CSF 유사체는 주사로 투여하거나 흡입에 의한 폐 투여로 투여할 수도 있다. 장 투여 형태가 본 G-CSF 유사체 조성물에 유용하므로, 경구투여가 효과적이다. G-CSF 유사체는 운반을 위해 리포솜이나 다른 마이크로담체내에 삽입되며, 지속적인 방출을 위해겔이나 다른 조성물로 제제화될 수 있다. 바람직한 조성물은 일반적으로 천연 G-CSF 의 적어도 하나의 생물학적 활성도를 갖는 G-CSF 유사체의 용도에 따라 다양하기는 하지만, 바람직한 제약학적 조성물은 각 투여 유형에 대한 특정 제제형이 유사체의 특성에 따를지라도 피하주사용이나 흡입에 의한 폐 투여용으로 제조된 조성물이다.
관련 조성물의 다른 예는 본 유사체에 대한 수용체이다. 본원에서 사용한 바와 같이, 용어 '수용체' 는 본 유사체 분자에 선택적으로 결합하는 성분을 나타낸다. 예를들어, 항체 또는 그의 단편 또는 '재조합 항체' [Huse 등의 Science246: 1275 (1989) 참조]를 수용체로서 사용할 수 있다. 선택적 결합은 특이 결합만을 의미하지는 않지만(본원에서 결합 - 특이 수용체를 포함할지라도), 그 결합이 무작위적 결합은 아니다. 수용체는 세포 표면상이나 세포내 또는 세포외에 존재할 수 있으며, 본 유사체의 생물학적 활성도를 유효하게 하거나, 저해하거나 편재화하도록 작용할 수 있다. 수용체 결합은 유사체 자체와 간접적으로 관련된 활성도의 캐스케이드를 위한 기작을 개시할 수도 있다. 또한 본 발명은 핵산, 이러한 핵산을 함유하는 벡터 및 상기 수용체를 암호화하는 이러한 핵산을 함유하는 숙주세포를 포함한다.
관련 조성물의 또다른 예는 화학적 성분이 부착된 G-CSF 유사체이다. 일반적으로, 화학적 변형은 단백질의 생물학적 활성도나 항원성을 변경시키거나 다른 특징을 변경시킬 수 있으며, 이들 인자는 숙련된 기술자들에게 고려될 것이다. 상기한 바와 같이, 그러한 화학적 성분의 한 예는 폴리에틸렌 글리콜이다. 변형은 하나 또는 그 이상의 친수성 또는 소수성 중합체 분자, 지방산 분자나 다당류 분자의 부가를 포함한다. 화학적 변형 인자의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 알클폴리에틸렌 글리콜, DI-폴리 (아미노산), 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 피란 공중합체, 아세트산/아실화, 프로프리온산, 팔미틴산, 스테아린산, 덱스트란, 카르복시메틸 셀룰로스, 풀루란 또는 아가로스를 포함한다[Francis 의 Focus on Growth Factors3: 4 - 10 (1992. 5) 참조 (영국 런던 엔20 오엘디 프리에른 바네트 레인 마운트뷰 코오트 메디스크립트에서 발행]. 또한, 화학적 변형은 부가 단백질이나 그의 부분, 세포독성제나 항체의 사용을 포함할 수 있다. 레시틴 또한 화학적 변형에 포함된다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 상기 유사체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 핵산은 DNA 나 RNA 또는 그의 유도체이며, 전형적으로 고유의 조절 시퀀스를 함유하는 파아지나 플라스미드와 같은 벡터상에 클로닝되고 발현될 것이다. 예를들어, 핵산은 진단이나 예후 목적으로 표지될 수도 있다(방사성, 화학발광 또는 형광 표지를 사용함). 핵산 시퀀스는 박테리아 발현용으로 제조된 코돈을 함유하는 것과 같이, 발현을 위해 최적화될 수 있다. 원하는 유사체의 암호화를 방해하지 않는 핵산과 그의 상보가닥 및 그의 변형체도 본원에서 고려된다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 본 유사체를 암호화하는 상기 핵산을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 진핵이나 원핵일 수 있고, 발현계는 당 기의 부착(글리코실화)(또는 방지), 분자의 고유한 접힘, 리더 시퀀스나 재조합 발현에 흔히 존재하는 다른 인자의 부가 또는 결실과 관련된 별도의 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 상기 핵산 시퀀스의 발현 유형이나 양을 조절하거나 변형시키도록 작용하는 안티센스 핵산에 관한 것이다. 이들은 공지 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 양상에 있어서, 본 유사체를 암호화하는 핵산은 유전자 치료용으로 사용될 수 있으며, 그 예로는 수용주(recipient) 내에 유사체 - 암호화 시퀀스를 함유하는 벡터를 위치시켜서 핵산 자체가 유사체 조성물을 요구하는 수용주 내부에서 발현되도록 한다. 벡터는 우선 세포와 같은 담체에 위치한 다음 이 담체가 수용주 내에 위치하게 된다.그 밖의 담체는 리포솜이나 다른 마이크로담체 또는 입자와 같은 비-자연 발생적인 담체를 포함하며, 이 담체는 유전자를 수용주내로 이동시키는 매개작용을 한다.
또한 본 발명은 G-CSF 나 유사체의 3 차원 구조를 표현(이를테면, 영상 화면)하기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공하며, 더욱이 컴퓨터 프로그램은 G-CSF 분자의 각 구성 성분 및 그 구성 성분의 전체 구조 내부의 정확한 위치를 원자수준까지 표현한다. 현재 분자의 3 차원 구조를 표현하기 위한 많은 용이한 컴퓨터 프로그램이 존재한다. 일반적으로, 이들 프로그램은 분자의 3 차원 구조에 대한 좌표를 입력함으로써(예를들어, X, Y 및 Z 축에 따라 G-CSF 분자의 각 원자를 숫자로 할당함), 상기 좌표를 표현하고 상기 좌표를 변경하여 상기 변경된 좌표를 갖는 분자의 영상을 표현하고자 한다. 결정학적 정보를 프로그램으로 작성할 수 있다. 즉, 3 차원 공간에서 G-CSF 분자의 원자 위치 좌표(이러한 좌표는 상기 G-CSF 분자의 결정학적 분석으로부터 수득된다)를 상기 프로그램으로 바꾸어 G-CSF 의 3 차원 구조를 표현(예를들어, 영상화면)하기 위한 컴퓨터 프로그램을 생성한다. 따라서, G-CSF 유사체의 3 차원 구조를 표현하기 위한 컴퓨터 프로그램도 제공된다. 캘리포니아 샌 디에고 바이오심(Biosym)에서 입수할 수 있는, 도 5 입력에 제시된 좌표를 지닌 컴퓨터 프로그램 인사이트 Ⅱ, 버전 4 가 바람직하다. 바람직한 표현 수단은 결정 아이즈 유리(Crystal Eyes glasses) (실리콘 그래픽스에서 입수가능)를 지닌 실리콘 그래픽스 320 VGX 컴퓨터이며, 이는 G-CSF 분자나 그의 유사체를 입체적으로 보이게 한다. 택일적으로, 본 G-CSF 의 결정학적 좌표와 회절 데이타도 미국 뉴욕 119723 업톤 브룩해븐 내셔날 라보라토리 케미스트리 디파트먼트 프로테인 데이타 뱅크에 저장되어 있다. G-CSF 분자나 그의 유사체의 3 차원 구조를 표현하기 위한 다른 컴퓨터 프로그램을 제조하는데 이들 데이타를 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양상은 3 차원 구조의 G-CSF 분자를 표현하기 위한 컴퓨터 프로그램이다. 또한 3 차원 구조의 G-CSF 분자의 영상 화면을 위한 상기 컴퓨터 프로그램도 제공된다 ; 더욱이, 상기 프로그램은 그러한 영상 화면을 변경시키는 수단을 갖는다. 따라서 본원은 그러한 컴퓨터 프로그램을 표현하는데 유용한, 특히 상기 3 차원 구조의 G-CSF 분자나 그의 유사체의 컴퓨터 영상의 영상 화면을 위한 장치 뿐만 아니라 상기 컴퓨터 프로그램과 장치를 제조하기 위한 수단도 제공한다.
컴퓨터 프로그램은 G-CSF 유사체를 제조하는데 유용한데, 그 이유는 변형시키기 위한 G-CSF 분자의 특이부위를 선택하여 변형시킴으로써 G-CSF 분자의 전체 구조에 미치는 영향을 쉽게 확인할 수 있기 때문이다. 변형 부위의 선택은 G-CSF 유사체의 원하는 생물학적 특징에 달려 있다.만일 상기 G-CSF 분자(r-met-hu-G-CSF)를 무작위로 변화시킨다면 17520의 가능한 치환체 및 다중 변화, 부가나 삭제를 갖는 훨씬 더 많은 유사체가 존재할 것이다. 분자의 구조가 조성과 상호 연관성이 있으므로, 3 차원 구조를 조사함으로써 변형 부위의 선택에 있어서 더 이상 무작위적이지 않고 합리적으로 결정할 수 있다.
상기한 바와 같이, 각 구성성분을 원자수준까지 배치함을 포함하는, 3 차원 구조의 G-CSF 의 확인은 G-CSF 분자의 전체 구조를 유지하는데 필요한 성분에 관한 정보를 제공한다. 따라서 본 발명의 G-CSF 유사체를 제조할 때 G-CSF 분자의 전체 구조가 유지되는지, 또는 본 발명의 G-CSF 유사체를 제조할 때 G-CSF 분자의 전체 구조가 변화되는지의 여부(및 방법)를 선택할 수 있다. 임의로, 그러한 유사체가 일단 제조되면 원하는 특성에 대하여 그러한 유사체를 시험할 수 있다.
예를들어, 비 - 변형된 천연 G-CSF 분자나 재조합 G-CSF 분자에 의해 갖추어진 전체 구조를 유지하고자 노력할 것이다. 전체 구조는 도 2, 3 및 4 에 나타나 있으며 하기에 보다 상세히 기술되어 있다. 전체 구조를 유지함으로써 천연 G-CSF 의 조혈능력을 갖는 유사체의 필요한 특성인 수용체 결합을 안전하게 할 수 있다(만일 수용체 결합이 없다면, 유사체의 존재로부터 시그날 트랜스덕션이 발생되지 않는다). 한 부류의 G-CSF 유사체는 천연 또는 재조합(비 - 변형된 것) G-CSF 분자의 3 차원 코어 구조를 갖지만, 호중구를 선택적으로 자극하는 증가된 능력과 같은 다른 특성도 가질 것이라 예상된다. 다른 부류의 G-CSF 유사체는 G-CSF 수용체에 결합하는 G-CSF 유사체 분자의 능력을 감소시키고, 비-변형된 천연 또는 재조합 G-CSF 와 비교하여 호중구를 선택적으로 자극하는 감소된 능력을 갖는 상이한 전체 구조를 지닌 유사체이다.
예를들어, 현재 G-CSF 분자의 내부 부위내의 성분은 소수성이고, 대응적으로, G-CSF 분자의 외부 부위의 성분은 친수성이라고 알려져 있다. 전체 3 차원 구조에 관한 지식, 바람직하게 본원에서 제공한 원자수준에 대한 지식이 없었다면, 이와 같은 소수성 내부 영역내의 변형이 분자의 전반적인 구조 입체형태의 변화를 초래한다고 예상할 수 없었다. 전반적인 구조 변화는 결과적으로 수용체 결합의 결여, 예를들어 비 - 변형된 G-CSF 에서 발견된 생물학적 활성도의 감소와 같은 기능상 변화를 가져올 수 있었다. 또다른 부류의 G-CSF 유사체는 (비 - 변형된) 천연 또는 재조합 G-CSF 와 동일한 소수성을 갖는 G-CSF 유사체이다. 특히, 다른 부류의 G-CSF 유사체는 그의 내부 코어의 4 개의 나선형 다발 내부에 (비 - 변형된) 천연 또는 재조합 G-CSF 가 가지고 있는 소수성 성분과 동일한 소수성 성분을 가지나 상기 비 - 변형된 천연 또는 재조합G-CSF 와 상이한 조성을 갖는다.
또다른 예는 G-CSF 분자의 내부 코어(나선형)와 결합되어 있는 구조인 외부 루프(loop)에 관한 것이다. 3 차원 구조로부터 - 아미노산 잔기의 공간 구조와 관련된 정보를 포함하는 - 특정 루프의 특정 변화가 전체 입체형태 변화를 초래하지 않을 것이라고 예상할 수 있다. 따라서, 본원에서 제공한 또다른 부류의 G-CSF 유사체는 변경된 외부 루프를 가지나(비 - 변형된) 천연 또는 재조합 G-CSF 와 동일한 전체 구조를 갖는 유사체이다. 특히, 본원에서 제공한 또다른 부류의 G-CSF 유사체는 변경된 외부 루프를 갖는 유사체이되, 상기 루프는 나선 A 와 B 사이 ; 나선 B 와 C 사이 ; 나선 C 와 D 사이 ; 나선 D 와 A 사이에 존재하는 루프에서 선택한 것이며, 이들 루프와 나선은 본원에서 확인한 것이다. 특히, 상기 루프, 바람직하게는 AB 루프 및/또는 CD 루프가 변형되어 상기 루프를 안정시킴으로써 분자의 반감기를 증가시킨다. 그러한 안정화는 G-CSF(또는 유사체) 분자의 코어에서 발견된 알파 나선형 다발의 일부에 상기 루프(들)의 전부나 일부가 결합됨으로써 이루어질 수 있다. 그러한 결합은 베타 시트, 염교, 이황화물 결합, 소수성 상호작용이나 본 분야의 숙련자들에게 유용한 그 밖의 결합수단에 의해 이루어질 수 있으며, 그러한 결합수단은 상기 외부 루프나 루프들을 안정시키는 역할을 한다. 예를들어, 분자의 내부 부위내의 나선 중하나에 AB 루프를 결합시킴으로써 AB 나 CD 루프를 안정시킬 수 있다.
또한 G-CSF 분자의 전체 구조의 변화없이 N-말단을 변경시킬 수 있는데, 그 이유는 N-말단이 내부 나선의 구조적 안정성에 영향을 미치지 않으며 외부 루프가 변형에 바람직할지라도 상기와 동일한 일반적 설명이 N-말단에 적용되기 때문이다.
또한 그러한 외부 루프는 화학적 변형을 위한 부위(들)일 수도 있는데, 이는 (비 - 변형된) 천연 또는 재조합 G-CSF 내의 상기 루프가 비교적 구부러지기 쉽고 수용체 결합에 간섭하지 않는 경향이 있기 때문이다. 따라서, 직접 부착될 수 있는(또는 화학적 결합 수단으로서의 역할을 하는 다른 화학성분에 의해 간접적으로 부착될 수 있는)화학성분에 대한 부가 방(room)이 존재할 것이다. 화학성분은 G-CSF 분자의 하나 또는 그 이상의 기능을 변형시키는데 유용한 다양한 성분들 중에서 선택할 수 있다. 예를들어, 외부 루프는 폴리에틸렌 글리콜 분자와 같은, 혈청 반감기를 증가시키는 하나 또는 그 이상의 중합체를 부가시키기 위한 부위를 제공할 수 있다. 이 폴리에틸렌 글리콜 분자(들)는 이러한 폴리에틸렌 글리콜 성분이 부착될 수 있는 반응 곁기를 갖는 부가 리신을 포함하도록 변형된 상기 루프에 부가될 수 있다. 또한 다른 부류의 화학성분도 수용체, 다른 치료학적 단백질(이를테면 혼성화 분자를 발생시키는 다른 조혈인자), 또는 세포독성제(이를테면 디프테리아 독소)와 같은 다른 생물학적 활성 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 또는 그 이상의 외부 루프에 부착될 수 있다. 물론 이와 같은 목록은 완전하지 않다 ; 원하는 화학성분을 소유한 본 분야의 숙련된 기술자들은 원하는 외부 루프에 상기 원하는 성분을 부착시키는데 효과적인 수단을 가질 것이다. 따라서, 또다른 부류의 본 G-CSF 유사체는 외부 루프에 적어도 하나의 변형을 갖는 유사체를 포함하되, 상기 변형은 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자와 같은 화학성분의 부가를 제공한다.
분자를 분해하기 위해 단백질이 인식하는 부위를 삭제하는 것이 외부 루프에 효과적일 수도 있다. 이것은 분자의 반감기를 증가시키는 반면 G-CSF 수용체 결합과 시그날 트랜스덕션 능력(즉, 호중구의 성숙을 선택적으로 자극하는 능력)을 갖는 선택적 수단을 제공한다. 따라서, 또다른 부류의 본 G-CSF 유사체는 적어도 하나의 외부 루프의 변형을 갖는 유사체를 포함하되, 상기 변형은 프로테아제에 의한 상기 유사체의 대사회전(turnover)을 감소시킨다. 이러한 변형에 바람직한 루프는 AB 루프와 CD 루프이다. 외부 루프에서 발견된 아미노산 잔기의 일부를 삭제함으로써 단축된 G-CSF 분자를 제조할 수 있는데(하기에서 보다 상세히 확인됨), 상기 단축된 G-CSF 분자는 그것의 제조나 생물학적 기능에 있어서 부가적 이점을 가질 수 있다.
또다른 예는 서로 근접해 있는 아미노산 잔기 사이의 상대전하에 관한 것이다. 상기한 바와 같이, G-CSF 분자는 비교적 빽빽하게 채워진 4 개의 나선 다발을 함유한다. 나선면 상의 면 중 일부는 다른 나선이다. 나선이 다른 나선과 면하는 지점(이를테면 잔기)에서 서로 면해 있는 2 개의 아미노산 성분은 동일한 전하를 가질 수 있으며, 따라서 서로 반발하는 경향이 있어 전체 분자가 불안정하게 된다. 이것은 반발이 존재하지 않도록 아미노산 성분 중 하나 또는 둘다의 전하를 변화시킴으로써(역전하나 중성전하로) 제거될 수 있다. 따라서, 또다른 부류의 G-CSF 유사체는 전자 전하 위치와 같은 표면 상호작용으로 인한 불안정성이 변형되도록 변경시킨 G-CSF 유사체를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 G-CSF 유사체와 관련 조성물을 제조하는 방법 및 이와 같은 방법으로 제조된 생성물에 관한 것이다. 이 방법의 최종 생성물은 상기 정의한 바와 같은 G-CSF 유사체이거나 관련 조성물이다. 예를들어, 본원에서 기술한 실시예는 (a) G-CSF 구조에 대한 G-CSF 분자의 구성성분(즉, 화학성분) 변화의 효과 및 (b) 생물학적 기능에 대한 구조 변화의 효과를 입증한다. 따라서, 본질적으로 본 발명의 다른 양상은 다음 단계를 포함하는 G-CSF 유사체의 제조방법이다 :
(a) G-CSF 분자의 3 차원 구조를 전달하는 정보를 조사하되, 여기서 G-CSF 분자의 각 아미노산 잔기나 각 아미노산 잔기의 각 원자와 같은 화학성분은 상기 구조와 상호관련이 있고 ;
(b) 변형시킬 G-CSF 분자의 부위를 상기 정보로부터 선택하고 ;
(c) 그와 같이 변형된 G-CSF 유사체 분자를 제조하고 ; 및
(d) 임의적으로, 그러한 G-CSF 유사체 분자를 원하는 특성에 대해 시험한다.
G-CSF 유사체를 제조하기 위한 컴퓨터 - 기저 방법에 대해 본원에서 제공한 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 다른 양상은 다음 단계를 포함하는 G-CSF 유사체를 제조하기 위한 컴퓨터 - 기저 방법이다 :
(a) G-CSF 분자의 3 차원 구조를 컴퓨터 표현으로 제공하되, 여기서 G-CSF 분자의 화학성분, 이를테면 아미노산 잔기나 각 아미노산 잔기의 각 원자는 상기 구조와 상호관련이 있고 ;
(b) 변형시킬 G-CSF 분자의 부위를 상기 컴퓨터 표현으로부터 선택하고 ;
(c) 그와같이 변형된 G-CSF 분자를 제조하고 ; 및
(d) 임의적으로, 그러한 G-CSF 분자를 원하는 특성에 대해 시험한다.
특히, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 G-CSF 유사체를 제조하기 위한 방법을 제공한다 :
(a) 컴퓨터에 의한 G-CSF 분자의 3 차원 구조를 조사하되, 상기 컴퓨터는 (ⅰ) 3 차원 공간에 G-CSF 분자의 좌표를 표현하고 (ⅱ) 상기 G-CSF 표현을 변형시키기 위한 정보의 입력 및 그의 조사를 가능하게 하도록 프로그램을 작성해 놓은 것이고 ;
(b) 변형시키기 위한 상기 G-CSF 분자의 영상 상의 부위를 선택하고 ;
(c) 상기 변형 정보를 상기 컴퓨터에 입력하고 ;
(d) 상기 변형된 G-CSF 분자의 3 차원 구조를 상기 컴퓨터를 통하여 조사하고 ;
(e) 임의적으로 (a) - (e) 단계를 반복하고 ;
(f) 상기와 같이 변형된 G-CSF 유사체를 제조하고 ; 및
(g) 임의적으로 상기 G-CSF 유사체를 원하는 특성에 대해 시험한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 본 G-CSF 유사체와 관련 조성물을 사용하는 방법 및 조혈 질병의 치료에 있어서 단독으로 또는 다른 조혈인자나 약물과 함께 사용하는 포유동물의 치료방법 또는 보호방법에 관한 것이다. G-CSF 유사체를 제조하는 한 양상이 비 - 변형된 G-CSF 가 지니고 있는 특성을 증가시키거나 변형시킬 것이라 예상된다.
예를들어, 본 유사체는 증가되거나 변형된 활성도를 가질 것이며, 따라서 G-CSF 가 (예를들어) 호중구감소증의 치료에 유용할 경우 본 조성물과 방법은 그러한 용도를 가질 수도 있다.
다른 예는 조혈 질병의 치료에 있어서 특히 다른 인자와 함께 사용할 때 더욱 효과적으로 상호작용하도록 G-CSF 를 변형하는 것이다. 그러한 복합 용도의 한 예는 초기 - 작용 조혈 인자(즉, 비교적 미분화된 세포의 조혈 캐스케이드로 보다 일찍 작용하는 인자)를 사용하는 것이고 G-CSF 나 그의 유사체와 같은 후기 - 작용 조혈인자를 동시에 또는 차례로 사용하는 것이다(G-CSF 가 호중구를 선택적으로 자극하여 CFU-GM 계통에 영향을 끼치기 때문). 본 방법 및 조성물은 그러한 조성물이나 조혈 인자의 '칵테일' 을 포함하는 치료법에 유용할 것이다.
본 조성물과 방법은 또한 백혈구감소증, 골수성백혈병, 당원저장증, 점막염 및 다른 골수부전상태를 치료하는데 유용하다. 본 조성물과 방법은 화학요법이나 방사선 치료법으로 인한 결핍을 치료하는데 유용하다. 골수 이식의 성공이나 이식을 위한 말초 혈액 선조세포의 사용은 예를들어, 본 조성물(유전자 치료를 위한 단백질이나 핵산)과 방법을 적용함으로써 증가될 수 있다. 본 조성물과 방법은 감염성 질병, 예를들어 창상치유, 화상치료, 균혈증, 패혈증, 진균성 감염, 심내막염, 골신우염,복부외상과 관련된 감염, 항생제에 반응하지 않는 감염, 폐렴을 치료하는데 유용하며 박테리아 염증의 치료도 본 조성물 및 방법을 적용하면 유익하다. 또한 본 조성물 및 방법은 백혈병 세포를 분화시키는 공지된 능력에 기초한 백혈병 치료에 유용하다[Welte 등의 PNAS - USA82: 1526 - 1530 (1985) 참조]. 그 밖의 적용은 임의적으로 종양 세포에 결합하는 수용체(이를테면 항체)의 존재하에서 본 조성물 및 방법을 사용하는 종양 환자의 치료를 포함한다. 치료학적 적용에 대한 평론지는 Lieshhke 및 Burgess 의 N. Engl. J. Med.327: 28 - 34 및 99 - 106 (1992) 를참조하며, 둘다 본원의 참고문헌으로 인용한다.
본 조성물 및 방법은 또한 다른 성분의 생성에 있어 중간체로서 작용하는데 유용하다 ; 예를들어, G-CSF 는 다른 조혈 인자의 생성에 영향을 미친다고 보고되어 있으며 이와 같은 기능(만일 확실하다면)은 본 조성물 및/또는 방법에 의해 증가되거나 변형될 것이다.
수용체와 같은, 본 G-CSF 유사체와 관련된 조성물은 G-CSF 나 유사체의 활성화를 막는 길항제로서 유용하게 작용할 수 있다. 비 - 변형된 G-CSF 나 G-CSF 유사체의 활성도의 일부 또는 전부를 함유하는 조성물 및 이러한 G-CSF 나 유사체의 하나 또는 그 이상의 성질을 변형시키기 위해 하나 또는 그 이상의 화학성분을 부가할 수 있다. 3차원 입체형태를 인식하면, 그러한 화학적 변형을 위한 최상의 지리학적 위치를 예상할 수 있으며 원하는 효과를 얻을 수 있다.
화학적 변형의 일반 목적은 반감기의 증가(이를테면 신장, 면역학적 또는 세포 청소율의 감소), 생활성도의 변화(이를테면 효소 특성의 변화, 유기용매에서 생활성도나 활성도의 해리), 독성 감소(예를들어 잠복하고 있는 독성 에피토프, 구획화 및 선택적 생분포), 면역반응성의 변화(면역원성 감소, 항원성이나 보조제 작용의 감소), 또는 물리적 성질의 변화(이를테면 용해도 증가, 열안정성 증가, 기계적 안정성 증가 또는 입체형태적 안정화)를 포함한다[Francis 의 Focus on Growth Factors 3 : 4 - 10 (1992. 5) 참조 (영국 런던 N20 OLD 프리에른 바네트 레인 마운트뷰 코트 메디스크립트에서 발행)].
하기 실시예는 본 발명을 설명한 것이지 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 수정 및 변형이 가능함을 이해할 것이며, 첨부된 청구의 범위는 본 발명의 범위내의 그러한 모든 변형을 포함하고자 한다.
도 1 은 부가 N-말단 메티오닌을 갖는 174 개 아미노산 종의 과립구 군체 자극 인자(이하 "G-CSF" 라고도 함) 아미노산 시퀀스(Seq. ID No. : 1)(Seq. ID No. : 2)를 나타낸다.
도 2 는 G-CSF 뿐만 아니라 hGH, pGH, GM-CSF, INF-B, IL-2 및 IL-4 의 결정형 구조의 토폴로지 다이어그램이다. 이들 도면은 인용 참고문헌의 조사에 기초한 것이다. 2 차 구조요소의 길이는 잔기의 수에 비례하여 도시한 것이다. A, B, C 및 D 나선은 G-CSF 에 대하여 본원의 계획에 따라 표지한 것이다. INF-β 에 있어서, 나선의 본래 표지는 괄호안에 나타나 있다.
도 3 은 3 차원 구조의 G-CSF 의 '리본 다이어그램' 이다. 나선 A 는 아미노산 잔기 11 - 39 (상기 도 1 에 따라 번호를 매김), 나선 B 는 아미노산 잔기 72 - 91, 나선 C 는 아미노산 잔기 100 - 123 및나선 D 는 아미노산 잔기 143 - 173 이다. 상대적으로 짧은 310나선은 아미노산 잔기 45 - 48 이며, 알파 나선은 아미노산 잔기 48 - 53 이다. 잔기 93 - 95 는 거의 1 회전한 왼쪽으로 도는 나선을 형성한다.
도 4 는 3 차원 구조의 G-CSF '원통(barrel) 다이어그램' 이다. 회색의 여러가지 명암의 정도는 전체 원통 및 3 차원 구조의 G-CSF 에 대한 배향을 나타낸다. 숫자는 상기 도 1 에 따른 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다.
도 5 는 3 차원 구조의 G-CSF 의 컴퓨터 - 보조 영상 화면을 생성하는데 사용한 좌표 목록이다. 좌표는 하기에 도시되어 있다. 세로행은 각각의 필드에 해당한다 :
(ⅰ) 필드 1 (좌측으로부터)은 원자이고,
(ⅱ) 필드 2 는 지정 원자수이고,
(ⅲ) 필드 3 은 원자명이고(주기율표 표준 명명법에 따름, CB 는 탄소원자 베타, CG 는 탄소원자 감마 등),
(ⅳ) 필드 4 는 잔기 유형이고(예를들어, 책 뒷표지 안쪽의 Stryer 의 Biochemistry, 3d Ed., W.H. Freeman and Company, N.Y. 1998 에서 밝혀진아미노산에 대한 3 문자 명명법에 따름)
(ⅴ) 필드 5 - 7 은 원자의 x-축, y-축 및 z-축 위치이고,
(ⅵ) 필드 8 (종종 '1.00')은 그 위치에서의 점유를 나타내고,
(ⅶ) 필드 9 는 B-인자를 나타내고,
(ⅷ) 필드 10 은 분자 명칭을 나타낸다.
G-CSF 의 3 가지 분자(a, b 및 c 로 명명함)는 한 단위로서 함께 결정화된다. 명칭 a, b 또는 c 는 분자로부터의 좌표를 나타낸다. 문자 뒤의 숫자(1, 2 또는 3)는 지정 아미노산 잔기의 위치를 나타내며, 분자 A 는 지정위치 10 - 175 를 가지고 분자 B 는 지정위치 210 - 375 를 가지며 분자 C 는 지정위치 410 - 575 를 갖는다. 이들 위치는 함께 결정화된 3 개의 분자사이에 겹침이 없도록 명명한 것이다('W' 는 물을 나타낸다).
도 6 은 결정화와 관련된 변수들에 대한 결정화 행렬을 세분화함을 포함한 전략의 개략도이다. 결정화 행렬은 24 웰 조직배양물 평판 웰의 결정화 용액 성분(염, 완충용액 및 침전제)의 최종농도와 상응한다. 이들 농도는 미량역가 평판의 웰내로 적당한 부피의 저장 용액을 피펫팅하여 만든다. 행렬을 고안하기 위해, 결정학자는 성분의 상하 농도를 결정한다. 이 상하 농도는 열(예를들어, A1-A6, B1-B6, C1-C6 또는 D1-D6)을 따라서 또는 전체 트레이(tray)(A1-D6)를 따라서 피펫팅할 수 있다. 전자의 방법은 제한된 웰 수에 따라 단일 성분의 결정 성장의 재현성을 조사하는데 유용한 반면, 후자의 방법은 초기 스크리닝에 보다 유용하다. 결정화 행렬의 여러가지 세밀한 단계의 결과가 3 가지 평판으로 도시되어 있다. 어두워진 웰이 늘어나는 것은 결과적으로 최종 단계에서 양성 결정화로 X-선 투과 결정이 생성되지만 초기 단계에서는 기름방울, 과립침전물이나 약 0.05 mm 크기 이하의 작은 결정이 생성될 수 있음을 나타낸다. A 부분은 첫번째 웰(A1)과 마지막 웰(D6) 사이의 농도범위가 큰 하나의 변수의 초기 스크린을 나타내고 웰 사이의 농도 증가치는[{(A1 농도) - (D6 농도)}/23] 으로써 계산한다. B 부분은 A1 에서 D6 까지에 걸친 농도가 결정화 행렬 세분화의 더 나중 단계에서 감소되어 결과적으로 평판 당 더 많은 결정이 형성됨을 나타낸다. C 부분은 양질의 결정이 대부분의 평판 웰에서 발견되는 행렬 세분화의 최종 단계를 나타낸다.
본 발명은 G-CSF 의 3 차원 구조의 발견에서 시작한다. 이와같은 3 차원 구조는 입체화면을 위한 컴퓨터 프로그램을 통하여 표현되어 왔다. 이처럼 입체적으로 관찰함으로써, 구조 - 기능 관계를 확인하고 G-CSF 유사체를 고안하여 제조하였다.
G-CSF 의 전체 3 차원 구조
구조확인에 사용된 G-CSF 는 박테리아 발현에서 흔히 나타나는 외부 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 비-글리코실화 174 개 아미노산종이었다. 이 G-CSF 의 DNA 와 아미노산 시퀀스는 도 1 에 나타나 있다.
G-CSF 의 전체 3 차원 구조는 주로 나선형이며, 4-알파-나선형 다발을 형성하는 175 개 잔기 중 103 개를 갖는다. 다른 2 차 구조는 단지 4 개의 잔기 310나선뒤에 바로 6 개의 잔기 알파 나선이 따르는 첫 번째 2 개의 긴 나선사이의 루프에서 발견된다. 도 2 에 도시한 바와 같은 전체 구조를 다른 단백질에 대해 보고된 구조와 비교하였다 : 성장 호르몬[Abdel - Meguid 등의 PNAS - USA84: 6434 (1987) 및 Vos 등의 Science255: 305 - 312 (1992) 참조], 과립구 대식세포 군체 자극인자[Diederichs 등의 Science254: 1779 - 1782 (1991) 참조], 인터페론 -β[Senda 등의 EMBO J.11: 3193 - 3201 (1992) 참조], 인터루킨-2[Mckay 의 Science257: 1673 - 1677 (1992)] 및 인터루킨-4[Powers 등의 Science256: 1673 - 1677 (1992) 및 Smith 등의 J. Mol. Biol.224: 899 - 904 (1992) 참조]. 이들 성장인자 간의 구조 유사성은 그의 아미노산 시퀀스들이 유사하지 않음에도 불구하고 발생된다.
현재, 구조정보는 G-CSF 생화학과 상호관련이 있으며 이것은 다음과 같이 요약할 수 있다(시퀀스 위치 1 이 N-말단이다) :
이와 같이 항체 결합 연구[Layton 등의 Biochemistry266: 23815 - 23823 (1991) 참조]에서 모은 생화학 정보를 G-CSF 유사체를 제조하기 위해 3 차원 구조에 더하였다. 이러한 G-CSF 유사체의 고안, 제조 및 시험에 관하여는 하기 실시예 1 에 기술되어 있다.
실시예 1
본 실시예는 결정형 G-CSF 의 제조, 컴퓨터 - 생성 영상을 통한 3 차원 재조합 인체 G-CSF 의 영상화, 특정부위 돌연변이유발이나 핵산 증폭방법을 사용하는 유사체의 제조방법, G-CSF 유사체를 분석하는 데 사용된 생물학적 분석과 HPLC 분석 및 그 결과 전체 구조/기능 관계의 결정에 관해 기술한다. 예로 든 모든 간행물은 본원의 참고문헌으로 인용한 것이다.
A. 자동 결정화의 이용
재조합 인체 과립구 군체 자극인자(r-hu-G-CSF)의 3 차원 구조의 필요성 및 다량의 정제된 단백질의 유용성은 불완전한 계승 표본 추출과 시딩(seeding)에 의한 결정 성장 방법을 야기하였다. Jancarik 및 Kim 의 J. Appl. Crystallogr.24: 409 (1991) 문헌에 기술된 불완전한 계승 결정화의 실행을 착수하여 기름방울과 복굴절 집합체를 생성하는 용액조건을 확인하였다. 또한, 자동 피펫팅 시스템의 소프트웨어와 하드웨어를 수정하여 약 400 개의 다른 결정화 조건/일(day)을 만들어냈다[Weber 의 J. Appl. Crystallogr. 20 : 366 - 373 (1987) 참조]. 이와 같은 방법은 결과적으로 r-hu-G-CSF 결정을 생성하는 결정화 용액을 초래하였다.
결정의 크기, 재형성 및 투과성은 시딩 용액을 계대희석하여 '핵생성 개시 단위' 의 수를 추정하는 시딩 방법에 의해 증진되었다. 이와 같은 방법은 2.0 mm 의 r-hu-G-CSF 결정이 재현가능한 성장을 하도록 하였다. 이들 결정의 공간군은 a = 90 Å, b = 110 Å 및 c = 49 Å 의 세포부피를 갖는 P212121이며, 2.0 Å 의 분해로 회절한다.
1.전체 방법론
새로운 단백질의 결정화 조건을 조사하기 위한 Carter 및 Carter 의 J. Biol. Chem.254: 12219 - 12223 (1979) 문헌은 불완전한 계승법을 제안하였다. 그들은 무작위로 다수의 표본을 추출하였으나 결정화 조건이 단백질의 결정화를 생성하는 시약의 성공적인 배합을 유도할 수 있음을 제시하였다. 이와 같은 개념은 pH 범위, 염 및 침전제를 포함하는 초기 결정화 실험을 위한 32 개 용액에 관해 기술한 Jancarik 및 Kim [J. Appl. Crystallogr.24: 409 (1991) 참조]에 의해 실행되었다. 본원의 기술은 70 개 용액의 확대세트로 그들의 실행을 확대한 것이다. 용액 제조에 있어서 인간의 노력과 오차를 최소화하기 위해, 자동 피펫팅 기계에 관한 방법이 프로그램으로 작성되었다.
Weber 의 연속 자동 그리드 검색 (successive automated grid searching ; SAGS) 방법[J. Cryst. Growth90: 318 - 324 (1988) 참조]에 따라, 온도, pH, 염 및 침전제의 결정화 조건을 연속적으로 세분화한 일련의 용액을 생성하는데 로봇 시스템을 사용하였다. 이전에 결정을 재생가능하게 성장시킬 수 있는 용액이 결정되었고, 결정의 투과성을 상당히 증진시키는 시딩 기술이 개발되었다. 이들 방법을 결합하여 며칠내에 100 개의 회절 투과성 결정(적어도 약 2.5 Å 으로 회절하는 결정, 적어도 2 Å 이하로 회절하는 부분을 갖는 것이 바람직하며 약 1 Å 로 회절하는 부분을 갖는 것이 보다 바람직하다)이 생성되었다.
일반적으로, 결정화 방법은 결정화시키고자 하는 모든 단백질에 대하여 이용할 수 있으며 다음 단계를 포함한다 :
(a) 원하는 단백질의 수용액 분취량을 (ⅰ) 각각 상이한 염 농도를 갖는 염 용액 분취량 ; 또는 (ⅱ) 각각 상이한 침전제 농도를 갖는 침전제 용액의 분취량과 결합시키되, 임의적으로 각 결합 분취량은 pH 범위의 존재하에서 결합시킨 것이고 ;
(b) 예비결정체 제제형의 상기 배합 분취량을 관찰하고, 예비결정체 형태를 생성시키는데 유효한 상기 염이나 침전제 배합물 및 상기 pH 를 선택하거나, 예비결정체 형태가 그와 같이 생성되지 않을 경우에는 단백질의 상기 수용액 분취량의 단백질 출발 농도를 증가시키고 ;
(c) 상기 염이나 상기 침전제 농도를 선택한 후, 상기 선택한 농도의 존재하에서 상기 미리 선택하지 않은 용액으로 (a) 단계를 반복하고 ; 및
(d) 원하는 투과성을 갖는 결정이 수득될 때까지 (b) 단계와 (a) 단계를 반복한다.
상기 방법은 임의적으로 자동화될 수 있으며, 시간과 노력이 상당히 절약된다. 바람직한 단백질 출발 농도는 10 mg/ml 내지 20 mg/ml 이나, 이 출발 농도는 단백질에 따라 다양할 것이다(하기 G-CSF 는 33 mg/ml 를 사용하여 분석하였음). 분석을 시작하기 위한 바람직한 염 용액의 범위는 0 - 2.5 M (NaCl) 이다. 바람직한 침전제는 폴리에틸렌글리콜 8000 이지만, 다른 침전제는 유기 용매(에탄올), 500 - 20,000 범위의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 분자 및 본 분야에서 숙련된 기술자들에게 공지된 다른 침전제를 포함한다. 바람직한 pH 범위는 pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 및 9.0 이다. 예비결정화 형태는 기름, 복굴절 침전물, 작은 결정(< 약 0.05 mm), 중간 결정(약 0.5 내지 .5 mm) 및 큰 결정(> 약 0.5 mm)을 포함한다. 결정체 구조를 확인하는데 기다리는 시간은 48 시간이 바람직하며 매주 관찰도 바람직하나, 일반적으로 약 한 달 후에 상이한 단백질 농도가 이용된다(일반적으로 단백질 농도는 증가됨). 자동화를 수정할 때는 아큐플렉스(Accuflex) 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 자동화 변수들은 하기되어 있다.
일반적으로, 10 mg/ml 내지 20 mg/ml 의 농도를 갖는 단백질을 0 - 2.5 M 의 NaCl 용액 범위와 혼합시키되, 각 혼합은 상기 범위의 농도의 존재하에서 (각기) 수행하였다. 일단 예비결정화 구조가 관찰되면, 염 농도와 pH 범위는 원하는 결정투과성이 획득될 때까지 개별 시험에서 최적화된다. 그 다음, 다양한 수준의 pH 하에서 침전제 농도도 최적화된다. 둘다 최적화되면, 최적 조건이 동시에 충족되어 원하는 결과가 수득된다(도 6 의 다이어그램 참조).
a.자동 피펫팅 시스템 실행
적하액(drops)과 저장용액은 ASCⅡ 코드를 표준 직렬 인터페이스로 보내는 개인용 컴퓨터에 의해 제어되는 아큐플렉스 피펫팅 시스템(미국 캘리포니아 코스타 메사에 소재하는 아이시엔 파마슈티컬스에서 구입)으로 제조하였다. 회전밸브에 의해 6 개의 상이한 용액을 피펫터 시료로 만들고 X-Y 좌표계에서의 이동이 조절될 수 있는 평판상에 이들 용액을 피펫팅하였다. 액체를 나누고 회수할 수 있는 주사기로 좌표계의 수직성분을 조작한다.
아큐플렉스에 대한 소프트웨어는 Cox 및 Weber[J. Appl. Crystallogr.20: 366 - 373 (1987) 참조] 가 제안한 SAGS 방법을 기초로 하였다. 이 방법은 2 개의 주요 결정성 변수, pH 와 침전제 농도의 체계적 변형을 포함한다. 이러한 개념이 제안된 반면, 본원에서 사용한 소프트웨어는 자동 그리드 검색 전략에 사용된 결정화 용액을 고안하고 실행하는데 더 적응가능하다. 본 소프트웨어의 이와 같은 적응성의 결과로 더 많은 수의 상이한 용액이 만들어진다. 이것은 하기에 기술된 불완전한 계승법을 실행하는데 필수적이다.
자동 그리드 검색 전략의 속도와 고안을 증진시키기 위해, 아큐플렉스 피펫팅 시스템의 소프트웨어와 하드웨어의 수정이 필요하다. 하드웨어의 변경은 2 개의 상이한 미량역가 트레이의 사용을 허용하되, 하나는 현적법(hanging drop)을 사용하고 또 하나는 시팅적하법(sitting drop)을 사용하며, 24 개 부가 완충용액, 염 및 침전제 용액을 갖는 플렉시글라스 (Plexiglas) 트레이의 사용을 허용한다. 이들 부가용액은 조사할 수 있는 결정화 조건의 그리드를 확장시켰다.
수정된 하드웨어를 사용하기 위해 피펫팅 소프트웨어를 2 개의 서브루틴으로 기록하였다 ; 하나의 서브루틴은 결정학자가 성분의 농도에 기초하여 결정화 용액의 행렬을 고안한 것이고 두 번째 서브루틴은 용액의고유 부피를 결정화 트레이내에 피펫팅하는 컴퓨터 코드로 이들 농도를 번역한다. 농도 행렬은 2 개의 프로그램 중에서 선택하여 만들 수 있다. 첫 번째 프로그램(MRF, 캘리포니아 사우전드 오크스 암젠 인코포레이티드로부터 이용가능)은 결정학자가 제공한 저장 용액 농도의 리스트를 인용하여 지정 농도를 획득하기 위하여 피펫팅할 요구부피를 계산한다. 두 번째 방법이 바람직한데, 이는 침전제나 pH 의 구배를 좀 더 정교하게 만드는데 사용할 수 있는 전개 시트 프로그램(로투스)을 포함한다. 둘 중 하나의 프로그램으로 만든 농도 행렬은 제어 프로그램(SUX, 본래 아큐플렉스 피펫터에서 확인된 프로그램을 수정한 것이며 미국 캘리포니아 사우전드 오크스 소재 암젠 인코포레이티드로부터 이용가능함)에 의해 해석되며 그에 따라 웰이 채워진다.
b.불완전 계승법의 실행
여러가지 용액을 제조하기 위해 수정한 피펫팅 시스템은 확대된 불완전 계승법의 수행을 개선시키기에 편리하다. '임의의' 성분을 갖는 결정화 용액의 새로운 세트의 개발은 3 개의 변수 중의 하나의 인수에 관한 96 개의 무작위 조합을 포함하는 리스트를 생성하는 프로그램 INFAC [Carter 등의 J. Cryst. Growth90: 60 - 73 (1988) 참조] 을 사용하여 생성하였다. 침전제, 염 및 완충용액의 70 개의 개별 배합물은 남겨두고 즉시 침전되는 칼슘과 인산의 배합물을 제거하였다. 이들배합물을 자동 피펫터를 사용하여 제조하여 1 주일간 항온하였다. 혼합물을 제조하고 침전제가 형성된 용액을 다시 저농도의 성분으로 제조하였다. 모든 웰의 침전제가 제거될 때까지 이러한 과정을 반복하였다.
c.r-hu-G-CSF 의 결정화
X-선 투과 결정을 생성하는 용액을 발견하기 위해 여러가지 상이한 결정화 전략을 사용하였다. 이들 전략은 불완전 계승법, 연속 자동 그리드 검색(SAGS)을 이용한 결정화 조건 세분화, 시딩(seeding) 기술의 실행 및 밤동안 수백의 투과성 결정이 생성되는 결정생성 방법의 개발을 포함한다. 다른 방법으로 r-hu-G-CSF 결정의 스크리닝과 생성에 관한 언급이 없다면 현적 증기 확산법을 사용한다[Afinsen 등의, Physical principles of protein crystallization, In : Eisenberg(ed.), Advances in Protein Chemistry 41 : 1 - 33 (1991) 참조].
r-hu-G-CSF 의 결정화 조건을 위한 초기 스크리닝은 여러가지 용액이 '예비결정화' 결과물을 만드는 결과를 초래하는 불완전 계승법을 이용하였다[Jancarik 및 Kim 의 J. Appl. Crystallogr.24: 409 (1991) 참조]. 이 결과물은 복굴절 침전물, 기름 및 매우 작은 결정(< .05 mm)을 포함한다. 이 예비결정화 용액은 체계적 스크리닝의 출발점으로서의 역할을 한다.
스크리닝 과정은 결정화 행렬의 개발을 필요로 한다. 이 행렬은 결정화 용액내 성분의 농도에 상응하는 IBM-PC 기저 전개 시트 LotusTM을 사용하여 만들어지고 수정된 아큐플렉스 피페팅 시스템으로 실행하였다. 행렬을 고안하는 전략은 결정화 조건(이를테면, 염 농도)을 수정하는 반면 pH 및 침전제와 같은 다른 조건은 유지하는 것이다. 스크리닝을 시작할 때, 수정된 조건의 농도범위는 크지만 미량역가 트레이의 모든 웰이 동일한 결정 결과를 생성할 때까지 연속적으로 세분화하였다. 이러한 결과는 다음과 같이 기록되었다 : 결정, 복굴절 침전물, 과립형 침전물, 기름 방울 및 비결정성 물질. 결정화 변수의 농도가 최소한의 침전물을 생성하지 않는다면, 침전물이 형성될 때까지 그 변수의 농도를 증가시켰다. 각 트레이가 생성된 후, 최소한 2 일 동안 방해받지 않도록 내버려 둔 다음 결정의 성장을 관찰하였다. 이와 같은 초기 스크리닝 후, 트레이를 매주 관찰하였다.
이러한 스크리닝 과정으로부터, 동일한 pH 와 침전제를 갖지만 염(MgCl, LiSO4)이 다른 2 개의 개별 용액이 작은 (0.1 × 0.05 × 0.05 mm) 결정을 생성하는 것으로 확인되었다. 이들 결과를 기초로 하여,LiSO4를 MgCl 로 바꿨을 뿐 그밖의 결정화 변수 상수는 유지하는 새로운 일련의 농도 행렬을 생성하였다. 이러한 일련의 실험 결과 약 3 주 내에 회절 투과 결정(> 약 0.5 mm)이 생성되는 용액을 확인하였다. 이러한 결정화 성장 용액(100 mM Mes pH 5.8, 380 mM MgCl2, 220 mM LiSO4및 8 % PEG 8K)을 확인하기 위해 약 300 mg 의 단백질을 소모하는 대략 8,000 개 조건을 스크리닝하였다.
결정의 크기는 적하액당 형성되는 결정의 수에 달려 있다. 전형적으로 3 내지 5 개의 결정은 평균 크기(1.0 × 0.7 × 0.7 mm)로 형성되었다. 동일한 공간군(P212121)과 단위 세포 부피 a = 90.2, b = 110.2, c = 49.5 를 갖는 2 개의 형태가 시딩(하기참조)이 실행되는지의 여부에 따라 수득되었다. 시딩을 하지 않으면 r-hu-G-CSF 결정은 길고 평평한 표면과 둥근 가장자리를 갖는다.
시딩을 이용했을 때 날카로운 면을 지닌 결정이 4 - 6 시간 이내에 적하액에서 관찰되었다(0.05 × 0.05 × 0.05 mm). 24 시간 이내에 결정은 0.7 × 0.7 × 0.7 mm 로 성장하고 적하액에서 형성되는 결정의 수에 따라 2 mm 이상으로 성장한다.
d.핵생성 개시부위의 시딩 및 결정
결정을 시딩하기 위해 현재 제공된 방법은 사용한 각 개별 웰의 핵생성 개시 단위의 수를 입증한다(본원에서는 결정을 성장시키기 위한 최적화 조건을 결정한 후에 사용함). 본원의 방법은 '시드' 의 수가 결정의 질에 영향을 미치고, 다시 이것이 분해 정도에 영향을 미친다는 점에서 이롭다. 또한 본 시딩은 시딩을 하지 않으면 성장하는데 약 3 주가 걸리는 반면, 시딩을 하면 G-CSF 결정이 약 3 일내에 성장하는 이점을 갖는다.
일련의 생성 성장(방법 참조)에 있어서, 작지만 매우 뚜렷한 다수의 결정이 밤새 생성되었다(< 0.01 × 0.01 × 0.01 mm). 결정화 조건은 미리 사용한 피펫 팁을 재사용하는 것을 제외하고는 상기한 바에 따른다. 다수의 결정이 형성되는 효과는 사용된 팁에서 형성되고 결정의 핵생성 부위를 제공하는 작은 핵생성 단위에 의해 야기되는 것으로 생각된다. 표준 생성 성장 조건하에서 새로운 적하액에 다수의 결정을 함유하는 소량(0.5 ㎕)의 적하액을 부가하면 결과적으로 밤새 다수의 결정이 생성된다. 이러한 방법은 '시드 저장물' 이라 명명한 다수의 결정을 함유하는 여러가지 적하액 트레이를 생성하는데 사용하였다.
'시드 저장물' 적하액 내에 포함된 핵생성 개시단위의 수(NIU)를 r-hu-GCSF 결정의 재현성과 투과성을 증진시키기 위해 추정하였다. '시드 저장물' 내 NIU 의 수를 결정하기 위해, 적하액 분취량을 96 웰 미량역가 평판에 따라 계열희석 하였다. 미량역가 평판은 동일한 부피의 r-hu-G-CSF (33 mg/ml)를 포함하는 50 ㎕ 의 용액과 각 웰의 결정 성장 용액(상기와 같음)을 가하여 미량역가 평판을 제조하였다. '시드 저장물' 적하액 중 하나의 분취량(3 ㎕)을 미량역가 평판의 첫번째 웰로 옮겼다. 웰의 용액을 혼합한 다음 3 ㎕ 를 미량역가 평판 열에 따라 다음 웰로 옮겼다. 각 열의 미량역가 평판을 유사하게 제조하고 트레이를 플라스틱 테잎으로 봉했다. 밤새, 미량역가 평판의 웰 바닥에서 형성된 작은 결정과 웰내 결정의 수는 본래 '시드 저장물' 의 희석과 상호관계가 있다. 큰 단일 결정을 생성하기 위해, '시드 저장물' 적하액을 신선한 CGS 로 적절히 희석한 다음 NIU 를 함유하는 이 용액의 분취량을 적하액으로 옮겼다.
일단 결정화 조건이 최적화되면, 각 CGS 3 ml 와 r-hu-G-CSF (33 mg/ml)를 혼합하여 5 개의 트레이(각각 24 개의 웰을 가짐)를 만드는 생성방법으로 결정을 성장시켰다. 이 방법은 이러한 용액을 단백질과 혼합하고, 현적 트레이 또는 시팅적하 트레이 중 하나로 이 단백질/결정화 용액을 대체함으로써 리터량의 순화된 결정화 용액을 생성하는 것을포함한다. 전형적으로 이 과정에 의해 약 5 일내에 100 - 300 의 투과성 결정(> 0.5 mm)이 수득되었다.
e.실험방법
물질
결정학적 정보는 YM10 필터를 사용하여 75 psi 에서 아미콘 농축기로 농축한 약 3 mg/ml 용액의 농도에서 1.0 +/- 0.6 × 108u/mg 의 비활성도(주사용 물내에 함유된 pH 4.0 의 10 mM 아세트산 완충용액을 세포의 유사분열생성 분석으로 측정)를 지닌, 도 1 에서 제공한 아미노산 시퀀스를 갖는 r-hu-met-G-CSF 로 출발하여 수득하였다. 용액을 4 ℃ 에서 10 배 농축하여 여러달 동안 저장하였다.
초기 스크리닝
X-선 분석에 적합한 결정은 현적법을 사용하는 증기 - 확산 평형상태에 의해 수득하였다. 예비 스크리닝을 위해, 33 mg/ml 의 단백질 용액 7 ㎕ (상기 제조한 바와 같음)를 실리콘화된 유리 평판 상의 동부피의 웰 용액과 혼합하고, 린브로 조직배양 평판(버지니아 맥린 플로우 라보라토리스에서 구입)을 이용하는 웰 용액에 현탁하였다. 아큐플렉스 피펫터로 모두 다 피펫팅하였으나, 트레이는 웰 용액을 만들어 테이블 상단의 진탕기로 적어도 10 분간 완전히 혼합한 후에 자동 피펫터로부터 제거되었다. 그리고 나서 실리콘화된 커버슬립에 웰과 단백질 용액을 가한 피펫터로 되돌려 놓았다. 그런 다음 커버슬립을 전환시키고 실리콘 그리이스를 지닌 1 ml 의 웰 용액으로 봉하였다.
자동 결정화 시스템의 구성요소는 다음과 같다. PC - DOS 컴퓨터 시스템을 성분의 농도에 기초한 결정화 용액의 행렬을 고안하는데 사용하였다. 이 행렬은 로투스 전개 시트의 선택 MRF (상기한 바와 같음)로 생성하였다. 이 프로그램의 최종 산물은 데이타 파일이다. 이 파일은 행렬로 기재된 농도를 수득하기 위하여 적당 부피의 저장 용액을 피펫팅하는 SUX 프로그램에 필요한 정보를 포함한다. SUX 프로그램 정보를 직렬 I/O 포트에 통과시키고 저장 용액과 관련된 밸브의 위치, 검색할 용액의 양, 아큐플렉스 피펫팅 시스템 지시에 사용한 다음 미량역가 평판과 각 웰의 X - Y 위치(세로행/각 웰의 열)내로 피펫팅하였다. 또한 정보는 주사기가 충전되는 동안의 Z 위치(높이) 뿐만 아니라 다른 용액이 충전되는 사이에 주사기를 깨끗하게 하기 위해 시스템을 중단시키는 배수의 위치를 포함하는 피펫터로 전송되었다. 24 웰 미량역가 평판(린브로나 크리스켐 중 선택)과 커버슬립 홀더를 X - Y 면에서 이동된 평판 상에 위치시켰다. 평판의 이동은 피펫터가주사기를 웰 내로 피펫팅되도록 하는 위치를 허용하였다. 또한 이러한 기원으로부터 커버슬립과 바이알 및 추출용액의 위치를 정하였다. 피펫팅하기 전에 린브로 미량역가 평판은 웰 가장자리 둘레에 적용된 그리이스로 된 얇은 막을 갖는다. 결정화 용액을 웰 내에서 제조한 후 커버슬립으로 옮기기 전에 피펫팅 시스템으로부터 미량역가 평판을 제거하여, 10 분간 용액을 테이블 상단 진탕기 상에서 혼합하였다. 혼합한 후, 웰 용액을 커버슬립으로 옮기거나(현적 프로토콜의 경우) 웰의 중간 포스트로 옮겼다(시팅적하 프로토콜의 경우). 바이알로부터 단백질을 추출하여 웰 용액을 함유하는 커버슬립 적하액(또는 포스트)에 가하였다. 웰을 봉하기 위해 크리스켐 평판 상단에 플라스틱 테잎을 사용하였다.
생성 성장
일단 결정화를 위한 조건이 최적화되면, '생성' 방법을 사용하여 결정을 성장시켰다. 100 mM Mes pH 5.8, 380 mM MgCl2, 220 mM LiSO4및 8 % PEG 8K 를 함유하는 결정화 용액을 1 리터 양으로 제조하였다. 에핀도르프 주사기 피펫터를 사용하여 이 용액 1 ml 분취량을 린브로 평판의 각 웰 내로 피펫팅하였다. 이 용액의 50 % 와 50 % G-CSF (33 mg/ml)를 함유하는 용액을 혼합하고 실리콘화된 커버슬립에 피펫팅하였다. 이 적하액의 전형적인 부피는 50 내지 100 μ1 이며 이들 적하액의 크기가 크므로 커버슬립을 움직이거나 웰상의 적하액을 현탁시키는데 주의해야 한다.
데이타 수집
R-AXIS(텍사스 하우스톤에 소재하는 몰레큘라 스트럭쳐 코포레이션에서 구입) 영상 평판 검출기에 수집된 2.2 Å 데이타에 대한 X-PLOR (브루니거, X-PLOR 버전 3.0, 결정학 및 NMR 용 시스템, 미국 코네티컷 뉴 해븐에 소재하는 예일 유니버시티에서 수득)로 구조를 세분화하였다.
f.관찰
유효한 재조합 인체 치료법으로서, r-hu-G-CSF 를 대량 생성하고 구조분석에 유용하도록 그람수준으로 제조하였다. 본원에서 제공한 결정화 방법은 다른 목적 단백질을 입수할 수 있게 단백질에 대하여도 적용할 수 있을 것이다. 이 방법은 다량의 단백질(약 > 200 mg)에 대한 모든 결정학 연구과제에 적용될 수 있다. 본 분야의 숙련된 기술자들이 인식하는 바와 같이, 본 물질 및 방법은 수정될 수 있으며 이에 상당하는 물질 및 방법은 다른 단백질의 결정화에 유용할 수도 있다.
B.G-CSF 의 3 차원 구조를 영상화하기 위한 컴퓨터 프로그램
본원의 도면에 제시한 다이어그램이 G-CSF 의 3 차원 구조를 영상화하는데 유용하기는 하나, 분자를 입체적으로 영상화할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 이용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 입체적 조사나, 때때로 그것과 관련된 본 기술의 '가상실물' 은 고분자 구조에서 원자수준에까지, 광범위한 해상도의 모든 각으로부터 3 차원 형태의 구조를 영상화한다. 또한 본원에서 의도하는 컴퓨터 프로그램은 분자를 회전시킴에 따라 분자의 시각의 투시도를 변화시킬 수 있다. 또한 의도된 프로그램은 전체 아미노산 잔기, 또는 존재하거나 치환된 잔기에 화학성분을 부가함을 포함하는 하나 또는 그 이상의 원자 영상을 삭제, 부가 또는 치환하는 등의 변화를 반영할 뿐만 아니라 구조의 변화를 영상화한다.
다른 컴퓨터 기저 시스템을 사용할 수도 있다 ; 요소는 다음과 같다 : (a) 3 차원 구조의 G-CSF 의 직교좌표 또는 다른 숫자로 나타낸 좌표와 같은 정보를 입력하기 위한 수단 ; (b) 3 차원 구조를 조사할 수 있고, 아미노산 조성과 같은 G-CSF 분자의 조성과 상기 3 차원 구조를 관련시키기 위한 영상수단과 같은, 그러한 좌표를 표현하기 위한 수단 ; (c) 임의적으로, 표현된 G-CSF 분자의 조성을 수정하여 그러한 3 차원 구조의 영상이 수정된 조성을 나타내도록 하는 정보를 입력하기 위한 수단.
사용된 바람직한 컴퓨터 프로그램에 대한 좌표는 도 5 에 나타나 있다. 바람직한 컴퓨터 프로그램은 미국 캘리포니아 샌 디에고 소재 바이오심에서 입수가능한 인사이트 Ⅱ, 버전 4 이다. 원래의 결정학 구조에 있어서, 관찰된 회절 데이타의 강도('F - obs')와 직교좌표도 본원에서 참고로 인용한 미국 뉴욕 119723 업톤 브루크해븐 내셔날 라보라토리 케미스트리 디파트먼트 프로테인 데이타 뱅크에 저장되어 있다.
일단 좌표를 인사이트 Ⅱ 프로그램에 입력하면, 3 차원 G-CSF 분자 표시를 컴퓨터 스크린상에 용이하게 나타낼 수 있다. 디스플레이용으로 바람직한 컴퓨터 시스템은 실리콘 그래픽스 (Silicon Graphics) 320 VGX (캘리포니아 샌 디에고)이다. 입체적으로 조사하기 위해, 안경(크리스탈 아이스, 실리콘 그래픽스)을 착용할 수 있는데 이는 3 차원의 G-CSF 분자를 입체적으로 영상화하여 분자의 위치를 바꾸고 분자의 모양을 상상할 수 있도록 한다.
따라서 본 발명은 다음을 포함하는, 컴퓨터를 이용하여 G-CSF 유사체를 고안하고 제조하는 방법을 제공한다 :
(a) G-CSF 분자의 성분의 조성을 디스플레이하되, 각 아미노산의 3 차원 위치를 디스플레이하는 것이 바람직하며, G-CSF 분자의 각 원자의 3 차원 위치를 디스플레이하는 것이 더욱 바람직함을 포함하는 G-CSF 분자의3 차원 구조를 디스플레이하기 위한 수단을 갖춘 상기 컴퓨터를 제공하고 ;
(b) 상기 디스플레이를 조사하고 ;
(c) 상기 분자의 조성이나 성분의 위치를 변형시키기 위해 상기 디스플레이 상의 부위를 선택하고 ; 및
(d) 그와 같이 변형된 G-CSF 유사체를 제조한다.
변형은 최종 생성물 G-CSF 유사체의 원하는 구조적 특성에 기초하여 선택할 수 있으며, 이러한 고안을 위해 고려할 사항은 하기에 보다 상세히 기재되어 있다. 이러한 고려사항은 소수성 아미노산 잔기, 특히 G-CSF 분자의 나선구조의 내부에 있는 잔기의 위치와 조성을 포함하되, 이 잔기를 변형시키면 분자의 내부코어의 전체 구조가 변경되어 수용체 결합을 방해하는 반면 ; 외부 루프 구조의 위치와 조성의 변경은 G-CSF 분자의 전체 구조에 영향을 미치지 않는다.
도 2 내지 도 4 는 상이한 방법으로 전체 3 차원 입체형태를 나타낸 것이다. 토폴로지 다이어그램, 리본 다이어그램 및 원통 다이어그램 모두 G-CSF 의 입체형태의 양상을 설명한 것이다.
도 2 는 G-CSF 와 다른 분자들 사이의 비교를 나타낸 것이다. 이들 성장인자는 그들의 루프와 다발 기하학상의 위치적 입체형태가 다르더라도 구조상의 유사성은 존재한다. 이들 분자 6 개 모두의 아미노산 시퀀스가 상이함에도 불구하고 2 개의 긴 교차연결을 갖는 업-업-다운-다운(up-up-down-down) 토폴로지가 유지된다.
도 3 은 재조합 인체 G-CSF 의 2 차 구조를 보다 자세히 나타낸 것이다. 이 리본 다이어그램은 나선의 핸디드니스와 서로 관련된 그들의 위치를 나타낸다.
도 4 는 재조합 인체 G-CSF 의 입체형태를 다른 방법으로 나타낸 것이다. 이 '원통' 다이어그램은 재조합 인체 G-CSF 의 전체 구조를 나타낸다.
C.M13 돌연변이유발을 이용한 유사체의 제조방법
본 실시예는 PCT 출원 번호 제 WO 85/00817 호(본원의 참고문헌으로 인용한 Souza 등의 1985 년 2 월 28 일 공개)에서 공개된 방법에 따라, 단일가닥 박테리오파지 M13 을 포함하는 부위 특이 돌연변이유발 기술을 이용하는 G-CSF 유사체의 제조방법에 관한 것이다. 이 방법은 본질적으로 비 - 돌연변이유발된 시퀀스의 단일가닥 핵산 주형을 사용하여, 시퀀스에 원하는 변형을 포함하는 보다 작은 올리고뉴클레오티드를 그것에 결합시킴을 포함한다. 동일하지 않은 시퀀스가 혼성화되도록 혼성화 조건을 맞추고 잔류 시퀀스는 본래 주형과 동일하도록 채워진다. 이중가닥 분자로 된 것은 두 가닥 중 하나가 원하는 변화를 포함하는 것이다. 이러한 돌연변이유발된 단일가닥을 분리하여 그의 상보가닥에 대한 주형으로 사용한다. 이것은 원하는 변화를 수반한 이중가닥 분자를 생성한다. 사용된 원래의 G-CSF 핵산 시퀀스는 도 1 에 나타나 있고, 돌연변이유발된 핵산(들)을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 표 2 에 나타나 있다. 아미노산 잔기와 뉴클레오티드에 대해 본원에서 사용한 약자는 통상적인 것이다(Stryer 의 Biochemistry, 3d Ed., W.H. Freeman and Company, N.Y., N.Y. 1988, 뒷표지 안쪽).
우선, 원래의 G-CSF 핵산 시퀀스를 벡터 M13mp21 (메사츄세츠 비버릴에 소재하는 뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 수득) 내로 삽입하였다. 그리고 나서 원래의 G-CSF 시퀀스를 함유하는 단일 가닥 파아지 M13mp21 로부터 DNA 를 분리하여 물에 재현탁하였다. 각 반응을 위해, 이 DNA 200 ng 을 1.5 pmole 의 인산화 올리고뉴클레오티드(표 2)와 혼합하고 0.1 M 트리스, 0.01 M MgCl2, 0.005 M DTT, 0.1 mM ATP, pH 8.0 에 현탁하였다. DNA 를 65 ℃ 로 가열하고 실온에서 서서히 냉각시켜서 어닐링하였다.
일단 냉각되면, 0.5 mM 의 각 ATP, dATP, dCTP, dGTP, TTP, 1 단위의 T4 DNA 리가제 및 E. coli 폴리메라제 1 의 1 단위의 클레노우 단편을 0.1 M 트리스, 0.025 M NaCl, 0.01 M MgCl2, 0.01 M DTT, pH 7.5 내에 함유된 1 단위의 어닐링된 DNA 에 가하였다.
현재 이중가닥이고 폐쇄원형인 DNA 를 더 정제하지 않고서 E. coli 를 형질감염시키는데 사용하였다. 니트로셀룰로스 필터로 플라크를 옮기고 P32로 말단 표지한 단일가닥 DNA 로 55 - 60 ℃ 에서 1 시간 동안 필터를 혼성화함으로써 플라크를 스크리닝하였다. 혼성화 후, 올리고의 녹는 온도(A - T 일 경우 2 ℃, G - C 일경우 4 ℃) 이하인 0 - 3 ℃ 에서 필터를 세척하여 돌연변이된 시퀀스를 함유하는 파아지를 갖는 플라크에 상응하는 오토래디오그래피 시그날만 선택적으로 남도록 하였다. 시퀀싱에 의해 양성 클론을 확인하였다.
하기한 것은 M13 돌연변이유발 방법으로 제조한 각 G-CSF 유사체를 사용한 올리고뉴클레오티드이다. 명칭은 본래의 아미노산 잔기와 위치(예를들어, 위치 17 의 리신) 및 치환된 아미노산의 잔기와 위치(예를들어, 아르기닌 17)로 나타낸다. 하나 이상의 잔기를 포함하는 치환은 첨자기호, 기술한 위치 사이의 콤마 또는 다른 잔기를 나타내는 세미콜론으로 표기한다. 치환하지 않은 것은 삭제로 기술한다. M13 - 기저 돌연변이유발에 사용한 올리고뉴클레오티드 시퀀스는 다음에 나타나 있다 ; 이러한 올리고뉴클레오티드는 합성적으로 제조되고, 제조방법이 결정적이지는 않지만 어떤 핵산 합성법 및/또는 장치든지 사용할 수 있다. 또한 올리고의 길이도 나타나 있다. 상기한 바와 같이, 이들 올리고가 단일가닥 파아지 벡터와 결합하도록 둔 다음 완전한 G-CSF 유사체 핵산 시퀀스에 단일 뉴클레오티드를 가하였다.
D. DNA 증폭을 이용한 G-CSF 유사체의 제조
이 실시예는 DNA 증폭 기술을 이용하여 G-CSF 유사체를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 필수적으로, 각각의 유사체를 암호화하는 DNA 를 두 개의 분리 단편으로 증폭하고 결합시킨 다음 전체 시퀀스 자체를 증폭하였다. 본래의 G-CSF DNA 에서 원하는 변화가 일어나는 곳에 따라 변이를 도입하여 두 개의 분리 증폭 단편을 생성하는 데에 내부 프라이머를 사용하였다. 예를들어, 원하는 유사체 DNA 의 5' 말단을 증폭하기 위하여 5' 측면 프라이머(G-CSF 본래의 DNA 플라스미드 상류 시퀀스에 상보적)를 증폭하는 부위의 한쪽 말단에 사용하고, 원하는 변이를 함유하면서도 본래의 DNA 에 혼성화되는 내부 프라이머는 다른 쪽 말단을 프라이밍하기 위하여 사용하였다. 그 결과로 생성된 증폭 부위는 5' 측면 프라이머로부터 내부 프라이머까지 연장되었다. 3' 측면 프라이머(G-CSF 본래의 DNA 플라스미드 하류 시퀀스에 상보적) 및 의도된 돌연변이 부위에 상보적인 내부 프라이머를 사용하여 동일한 방법을 3' 말단에 대해 실시하였다. 일단 두 개의 '절반' (내부 프라이머의 위치에 따라 그 크기가 동일하거나 그렇지 않은)이 증폭되면, 두 개의 '절반'을 결합시켰다. 결합이 이루어지면, 5' 측면 프라이머 및 3' 측면 프라이머는 원하는 변이를 함유하는 전체 시퀀스를 증폭하는 데에 사용하였다.
하나 이상의 변이를 원한다면, 내부 프라이머 내로 변이를 도입하기 위하여 상기 과정을 변형시키거나 다른 내부 프라이머를 사용하여 과정을 반복할 수도 있다. 선택적으로, 유전자 증폭 과정은 상기한 파아지 기저 돌연변이유발과 같이 핵산 시퀀스 내에서 변이체를 제조하는 다른 방법과 함께 사용할 수 있다. 하나 이상의 변이를 수반하는 유사체의 제조방법의 예를 하기하였다.
하기 G-CSF 유사체를 제조하기 위하여, 도 1 의 시퀀스와 특정 측면 부위(G-CSF 암호화 부위를 포함하는 플라스미드로부터 수득함)를 주형 DNA 로 사용하였다. 이러한 측면 부위를 5' 및 3' 측면 프라이머로 사용하여 하기와 같이 착수한다. 증폭 반응은 pH 8.3, 20 ℃ 의 10 mM 트리스-HCl, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1 mg/ml 겔라틴-함유 40 μl 부피하에서 실시하였다. 또한 40 μl 반응물은 0.1 mM 의 각 dNTP, 10 pmoles 의 각 프라이머 및 1 ng 의 주형 DNA 를 함유하였다. 각각의 증폭을 15 주기 반복하였다. 각 주기는 94 ℃ 에서 0.5 분, 50 ℃ 에서 0.5 분 및 72 ℃ 에서 0.75 분으로 구성되어 있다. 측면 프라이머는 길이가 20 뉴클레오티드이고 내부 프라이머는 그 길이가 20 내지 25 뉴클레오티드였다. 이것이 원하는 G-CSF 유사체의 전방부 또는 후방부를 암호화하는 이중 가닥 DNA 의 다중 복제물을 생성하였다.
두 개의 '절반' 을 결합시키기 위하여, 두 반응 각각의 1/40 씩을 세 번째 DNA 증폭 반응에서 결합시켰다. 돌연변이에 관계된 말단이 상보적이므로 중합 반응의 주기에 이어 두 부분이 내부 프라이머 위치에 어닐링하도록 놓아 두어 전체 길이의 DNA 시퀀스가 되게 한다. 일단 어닐링이 일어나면 5' 및 3' 측면 프라이머를 사용하여 모든 유사체를 증폭하였다. 이러한 증폭 과정을 상기한 바와 같이 15 주기 반복하여 실시하였다.
완전히 증폭된 유사체 DNA 시퀀스를 XbaⅠ 및 XhoⅠ 제한 엔도 뉴클레아제로 절단하여 벡터 내로 삽입하기 위한 코히시브 말단을 형성하였다. 절단된 DNA 는 E. coli 를 형질전환시키기 위해 사용하는 플라스미드 벡터 내에 위치하게 하였다. 형질전환체에 50 ㎍/ml 의 가나마이신을 가하여 30 ℃ 에서 항온하였다. 전체 세포 용균액의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 G-CSF 유사체 단백질의 생성을 확인하였다. 분리 산물로부터 정제한 플라스미드의 DNA 시퀀스 분석에 의해 원하는 돌연변이의 존재를 확인하였다. 배양균을 성장시킨 다음 세포를 수확하고 G-CSF 유사체를 하기와 같이 정제하였다. 표 3 에 하기한 것은 유전자 증폭에 사용한 각 유사체의 특이 프라이머이다.
1.이중 돌연변이의 구성
G-CSF 유사체 Gln12, 21→ Glu12, 21을 제조하기 위하여, 각각의 두 DNA 증폭을 실시하여 두 개의 DNA 돌연변이를 생성하였다. 사용된 주형 DNA 는 도 1 에 나타나 있는 시퀀스와 특정 측면 부위(G-CSF 암호화 부위를 포함하는 플라스미드로부터 수득함)였다. 정확한 시퀀스는 하기하였다. 각각의 두 DNA 증폭 반응은 퍼킨 엘머/세투스 DNA 열 순환기를 사용하여 실시하였다. 40 μl 의 반응 혼합물은 1 X PCR 완충용액(세투스), 0.2 mM 의 각 4dXTP(세투스), 50 pmoles 의 각 프라이머 올리고뉴클레오티드, 2 ng 의 G-CSF 주형 DNA(플라스미드 벡터 상의) 및 1 단위의 표식 폴리메라제(세투스)로 구성하였다. 증폭 과정은 30 주기 실시하였다. 각 주기는 94 ℃ 에서 1 분, 50 ℃ 에서 2 분, 72 ℃ 에서 3 분으로 구성되어 있다.
DNA 증폭 'A' 는 다음의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다 :
DNA 증폭 'B' 는 다음의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다 :
DNA 증폭 'A' 후에 수득한 109 염기쌍의 이중 가닥 DNA 산물로부터 64 염기쌍의, DNA 돌연변이 Gln12→ Glu12를 함유하는 XbaⅠ 내지 HindⅢ DNA 단편을 절단하여 분리하였다. DNA 증폭 'B' 후에 수득한 509 염기쌍의 이중 가닥 DNA 산물로부터 197 염기쌍의, DNA 돌연변이 Gln21→ Glu21을 함유하는 HindⅢ 내지 BsmⅠ DNA 단편을 절단하여 분리하였다.
'A' 및 'B' 단편을 4.8 킬로 - 염기쌍의 XbaⅠ 내지 BsmⅠ DNA 플라스미드 벡터 단편과 결합시켰다. 결합 혼합물은 같은 몰의 DNA 제한 단편, 결합 완충용액(25 mM 트리스 - HCl pH 7.8, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.5 mM rATP 및 100 ㎍/ml BSA) 및 T4 DNA 리가아제로 구성하여 14 ℃ 에서 밤새 항온하였다. 결합한 DNA 는 바이오래드 진 펄사 기구(미국 캘리포니아 리치몬드에 소재하는 바이오래드에서 구입함)를 사용한 일렉트로포레이션에 의해 E. coli FM5 세포 내로 형질전환시켰다.클론을 분리하여 DNA 시퀀싱을 통해 플라스미드 구성물이 두 개의 돌연변이를 함유하고 있는지 확인하였다. 또한 이러한 '매개물' 벡터는 193 염기쌍의 BsmⅠ 내지 BsmⅠ DNA 단편이 삭제되어 있다. 최종 플라스미드 벡터를 결합에 의해 구성하고, 매개물 벡터로부터 2 킬로 - 염기쌍의 SstⅠ 내지 BamHⅠ DNA 단편, 플라스미드 벡터로부터 2.8 kbp 의 SstⅠ 내지 EcoRⅠ DNA 단편 및 플라스미드 벡터로부터 360 bp 의 BamHⅠ 내지 EcoRⅠ DNA 단편을 절단하여 분리함으로써 수득한 DNA 단편을 (상기한 바와 같이) 형질전환시켰다. G-CSF 유전자를 DNA 시퀀싱함으로써 최종 구성물을 확인하였다. 배양균을 성장시켜 세포를 수확한 다음 G-CSF 유사체를 아래에 설명하는 바와 같이 정제하였다.
상기한 바와 같이, 돌연변이유발 기술을 연합하여 하나 또는 그 이상의 변이를 갖는 G-CSF 유사체 핵산 (및 발현 산물)을 생성할 수도 있다. M13 - 기저 돌연변이유발 및 유전자 증폭 - 기저 돌연변이유발을 이용한 상기 두 예는 그것을 예증하는 것이다.
E.G-CSF 유사체 DNA 의 발현
G-CSF 유사체 DNA 를 플라스미드 벡터 내로 위치시킨 다음 E. coli 균주 FM5 (ATCC 번호 제 53911 호)를 형질전환시켰다. 플라스미드및 박테리아 숙주 세포에 함유되어 있는 본 G-CSF 유사체 DNA 는 미국 매릴랜드 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수할 수 있고, 등록 명칭은 하기하였다.
트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g 및 NaCl 5 g 을 함유하는 30 ℃ 의 용액에서 1 리터 배양균을 성장시켜 A600이 0.5 농도가 되도록 하여 그 점에서 42 ℃ 까지 급격히 가열하였다. 플라스크를 3 시간 동안 진탕되도록 놓아 두었다.
다른 박테리아 세포, 균주 또는 종, 배양액 내의 포유동물 세포(COS, CHO 또는 다른 형태), 곤충 세포 또는 다세포 기관이나 유기체, 식물 세포 또는 다세포 기관이나 유기체 같은 그 외의 원핵 또는 진핵 숙주 세포도 사용할 수 있으며, 숙련자들은 적당한 숙주를 인지하게 될 것이다. 또한 본 G-CSF 유사체 및 그에 관계된 조성물은 예를들어, 고체상 펩티드 합성 방법 또는 다른 화학적 제조 기술에 의하여 합성적으로 제조할 수 있다. 다른 클로닝 및 발현 계는 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다.
F.G-CSF 유사체 단백질의 정제
원심분리(10,000 x G, 20 분, 4 ℃)를 통해 세포를 수확하였다. 펠렛을(보통 5 g) 30 ml 의 1 mM DTT 에 재현탁하고 10,000 psi 의 프렌치 프레스 셀(French press cell)에 3 번 통과시켰다. 파쇄된 세포 현탁액을 10,000 x G 로 30 분간 원심분리하여 상청액을 제거한 다음, 30 - 40 ml 의 물에 펠렛을 재현탁하였다. 이것을 10,000 x G 로 30 분간 다시 원심분리하여 이 펠렛을 25 ml 의 20 % 사르코실 및 pH 8 의 50 mM 트리스에 용해하였다. 황산구리를 40 μM 농도가 되도록 가하고 혼합물을 15 - 25 ℃ 에서 최소한 15 시간 동안 교반하였다. 그런 다음 혼합물을 20,000 x G 로 30 분간 원심분리하였다. 그 결과로 생성된 가용화 단백질 혼합물을 pH 7.7 의 13 mM 트리스로 4 배 희석하고 사르코실을 제거한 다음, 상청액을 pH 7.7 의 20 mM 트리스로 평형화시킨 DEAE - 셀룰로오스(와트만 DE - 52) 컬럼에 가하였다. 적하한 후에 컬럼을 동일 완충용액으로 세척하고, 유사체를 pH 7.7 의 20 mM 트리스/NaCl (하기한 바와 같이, 유사체에 따라 35 mM 에서 100 mM 사이)로 용리하였다. 대부분의 유사체에 대해, DEAE 컬럼으로부터의 용리액을 50 % 아세트산으로 pH 5.4 로 맞추고, 5 mM 아세트산 나트륨, pH 5.4 로 필요한 만큼(적당한 전도율을 얻기 위하여) 희석하였다. 20 mM 아세트산 나트륨, pH 5.4 로 평형화시킨 CM - 세파로스 컬럼에 용액을 적하하였다. 그런 다음, 280 nm 에서의 흡광도가 거의 0 이 될 때까지 컬럼을 20 mM NaAc, pH 5.4 로 세척하였다. 그런 다음, 표 4 에 하기한 농도에서 G-CSF 유사체를 아세트산 나트륨/NaCl 로 용리하였다. CM - 세파로스 컬럼에 가하지 않은 이들 유사체에 대한 DEAE 컬럼 용리액을 10 mM NaAc, pH 4.0 완충용액으로 즉시 투석하였다. 시험관내 분석을 위하여 정제된 G-CSF 유사체를 적당히 분리하였다. 상기한 바와 같이, 염 농축액을 각각의 유사체 용리에 활용하였다. 아래에 DEAE 셀룰로오스 컬럼 및 CM - 세파로스 컬럼에 대한 염 농도를 기록한다 :
상기 정제 방법은 실례를 든 것이며, 본 G-CSF 유사체를 수득하기 위한 다른 방법도 유효하다는 것은 숙련자들에게 인지되어 있다.
G.생물학적 검정
본 G-CSF 유사체를 제조하기 위하여 어떠한 방법을 사용하였든 간에 유사체의 생물학적 활성도에 대한 검정을 실시하였다. 세포 분열의 정도를 확인하기 위하여 삼중수소화된 티미딘 검정을 실시하였다. 그러나 바람직한 활성도를 확인하기 위하여 다른 생물학적 검정을 사용할 수 있다.
마우스의 WEHI-3B (D+) 백혈병 세포주에서 말기 분화를 유도하는 능력에 대한 검정과 같은 생물학적 검정도 G-CSF 활성도를 표시해 준다[Nicola 등의 Blood54: 614 - 27 (1979) 참조]. 생물학적 활성도를 확인하는 데에 그 외의 시험관내 검정을 이용할 수 있다[Nicola, Annu. Rev. Biochem. 58 : 45 - 77 (1989) 참조]. 일반적으로, 생물학적 활성도에 대한 실험은 생물학적 활성도의 증가 또는 감소(비 - 변이 G-CSF 와 비교), 다른 생물학적 활성도(비 - 변이 G-CSF 와 비교), 수용체 친화도 분석 또는 혈청 반감기 분석과 같은 바람직한 분석 결과를 제공하였다. 이 목록은 불충분하며 본 분야의 숙련자들은 바람직한 결과를 위한 실험이 유용하다는 것을 인지할 것이다.
3H - 티미딘 검정을 표준 방법으로 실시하였다. 희생시킨 암컷 Balb C 마우스로부터 골수를 수득하였다. 간단히 골수 세포를 현탁하여 원심분리하고 성장 배지에서 재현탁하였다. 약 10,000 세포를 함유하는 160 μl 분취량을 96 웰 미량 - 역가 플레이트의 각 웰 내에 두었다. 정제된 G-CSF 유사체(상기 제조한 유사체)의 시료를 각 웰에 가하여 68 시간 동안 항온하였다. 삼중수소화된 티미딘을 웰에 가하여 부가적으로 5 시간 더 항온하였다. 5 시간 항온 후에, 세포를 수확하여 여과하고 철저히 세척하였다. 신틸레이션액을함유하는 바이알에 필터를 가하였다. 베타 방출을 계산하였다(LKB 베타플레이트 신틸레이션 카운터). 표준체 및 유사체를 삼중 분석하였고, 상기 또는 하기 표준 곡선에 실질적으로 맞지 않는 시료를 적당한 희석액으로 재검정하였다. 여기에서 보고된 결과는 변이되지 않은 재조합 인체 G-CSF 표준 결과에 관한 유사체의 삼중 분석 자료의 평균치이다.
H.HPLC 분석
유사체의 정제된 시료에 고압 액체 크로마토그래피를 실시하였다. 역상 HPLC 컬럼 상 피크 위치가 두 단백질 간의 구조적 유사성을 보여주는 결정적인 징후는 아니지만 유사한 보유 시간을 갖는 유사체는 비 - 변이 분자처럼 HPLC 컬럼과의 소수성 상호작용에 있어서 동일한 형태를 갖는다. 이것이 종합적인 유사 구조의 한 징후이다.
유사체 및 비 - 변이 재조합 인체 G-CSF 의 시료를 역상(0.46 x 25 cm) 바이닥 214TP54 컬럼(미국 캘리포니아 헤스페리아에 소재하는 세퍼레이션스 그룹, 인코포이티드에서 구입함) 상에서 분석하였다. 정제된 유사체 G-CSF 시료를 pH 5.2 에서 완충처리한 20 mM 아세테이트 및 40 mM NaCl 용액 내에서 제조하여, 유사체가 컬럼에서 실시되는 정도에 따라 최종 농도가 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml 가 되게 하였다. 1 % 이소프로판올, 52.8 % 아세토니트릴 및 0.38 % 트리플루오로 아세테이트(TFA)를 함유하는 수용액으로 평형화시킨 HPLC 컬럼에 양을 변화시켜 가면서(농도에 따라) 적하하였다. 시료를 0.86 %/분 아세토니트릴 및 0.002 % TFA 로 구배하였다.
Ⅰ.결과
아래에 나타나 있는 것은 상기 생물학적 검정 및 HPLC 분석의 결과이다. 생물학적 활성도는 삼중 분석 자료의 평균치이고 대조 기준(비 - 변이 G-CSF)의 백분율로 나타내었다. 상대적인 HPLC 피크의 위치는 대조 기준(비 - 변이 G-CSF) 피크와 관계된 유사체 G-CSF 의 위치이다. '+' 또는 '-' 기호는 유사체 HPLC 피크가 (1 분 내에) 대조 기준 피크의 앞 또는 뒤에 존재하는 지를 표시한다.
모든 변이체를 HPLC 피크와 비교하여 분석하는 것은 아니며 분석된 것들만 아래에 포함되어 있다. 또한 상기 제조한 바와 같이, 본 유사체의 핵산 해독을 함유하는 E. coli 숙주 세포에 대한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 명칭이 나타나 있다(본 미생물은 1993년 1월 15일자로 ATCC 에 기탁되었으며, 기탁 번호는 하기 표에 나타나 있음).
1.구조 - 기능 관계의 확인
본 유사체를 제조하기 위해 사용한 첫 단계는 어떤 부분이 G-CSF 분자의 구조 보존에 필요한 지를 결정하는 것이다. 원자 수준의 분석에서도 구할 수 있지만, 이것은 아미노산 잔기 수준에서 실시하였다. 구조 보전에 필요한 잔기의 변이는 G-CSF 분자의 종합적인 구조 변화를 초래한다. 이것은 제조하고자 하는 유사체에 따라 바람직할 수도 그렇지 않을 수도 있다. 여기에서 실시한 예는 G-CSF 수용체(본 항목에서 사용하는 바와 같이, 'G-CSF 수용체' 는 조혈 세포에서 발견되는 천연 G-CSF 수용체를 말함) 같은 유사체의 G-CSF 수용체 결합을 유지하기 위한 목적으로 G-CSF 분자의 종합적인 구조적 원상을 유지하기 위해 고안하였다. 상기 생물학적 검정에 의해 결정한 바와 같이, G-CSF 수용체 결합이 적어도 하나의 생물학적 활성도에 대한 필수 단계임을 본원의 연구에 의해 가정하고 확증하였다.
도면에 나타난 바와 같이, G-CSF(여기에서는 재조합 인체 met-G-CSF 를 말함)는 왼쪽으로 꼬이는 역평행 4 - 알파 나선형 다발이며, 전체 부피는 45 Å x 30 Å x 24 Å 이다. 다발 내의 4 개의 나선을 나선 A, B, C 및 D 라 하고, 그 연결 루프는 AB, BC 및 CD 루프로 공지되어 있다. 나선 교차각은 -167.5° 및 -159.4° 사이에서 변동한다.나선 A, B 및 C 는 곧은 반면, 나선 D 는 Gly 150 및 Ser 160(재조합 인체 met-G-CSF 의 경우)에 두 종류의 구조적 특징을 갖는다. 종합적으로, G-CSF 분자는 외부 루프에 의해 연속적으로 연결된 4 개의 나선 다발이다. 이러한 구조상의 정보는 공지된 기능상의 정보와 관계가 있다. 잔기(위치 1 의 메티오닌 포함) 47, 23, 24, 20, 21, 44, 53, 113, 110, 28 및 114 는 변형할 수 있고 생물학적 활성도에 미치는 영향이 상당하다는 것은 공지되어 있다.
생물학적 활성도를 저하시키는 단일 돌연변이의 대부분은 30 Å 정도 분리되고, 4 개의 나선 다발의 다른 면에 위치한 G-CSF 의 두 부위의 중심에 집중되어 있었다. 한 부위는 A 나선 및 D 나선 간의 상호작용을 초래한다. 이것은 다음과 같은 비 - 변이 분자에서 염다리의 존재에 의해 한층 더 확인된다 :
여기에서 보고된 거리는 도 5 에 지적한 바와 같이 분자 A 에 대해서였다(세 개의 G-CSF 분자를 합쳐서 결정화하고 A, B 및 C 라 명명하였다). 볼 수 있는 바와 같이, 나선 A 및 나선 D 사이에는 나선 A 구조를 안정시키기 위해 작용하는 염다리의 웹이 존재함으로써 G-CSF 분자의 전체적인 구조에 영향을 미친다.
잔기 Glu 20, Arg 23 및 Lys 24 가 중심에 집중되어 있는 영역을 A 나선의 친수면(잔기 20 - 37)에서 발견하였다. 위치 20 및 23 에 비 - 전하 알라닌 잔기를 갖는 잔기의 치환은 유사한 HPLC 보유 시간을 갖게 하는데, 이것은 구조상의 유사성을 나타내는 것이다. 이러한 부위의 변이는 생물학적 활성도를 변화시켰다(본 검정에서 나타나는 바와 같다). Lys 24 에서의 치환은 생물학적 활성도를 변화시켰지만, 다른 두 변화에서와 같이 유사한 HPLC 보유 시간을 갖게 하지는 않았다.
생물학적 활성도를 저하시키는 두 번째 부위는 AB 나선을 포함한다. 위치 47 의 글루타민을 알라닌으로 치환(상기 유사체 번호 19 번)하면 생물학적 활성도를 0 까지 감소시켰다(티미딘 흡수 검정에서 관찰됨). AB 나선은 아미노 및 카르복시 말단을 제외하고는 주로 소수성이다 ; 이것은 310나선의 회전을 포함한다. 각 말단(His 44 및 His 56)에 두 개의 히스타민이 존재하고, His 44 에 염다리를 이룰 가능성이 있는 잔기 46 에 부가적인 글루타메이트가 존재한다. 유사체의 푸리에 형질전환 적외선 스펙트럼 분광 사진 분석(FTIR)은 이 유사체가 비 - 변이 재조합 G-CSF 분자와 구조적으로 유사함을 제시한다. 또다른 시험에서는 이 유사체가 비 - 변이 재조합 분자처럼 동일한 조건하에서 결정화되지 않음을 보여주었다.
카르복시 말단(Gln 174, Arg 167 및 Arg 170)의 변이는 생물학적 활성도에 거의 영향을 끼치지 않는다. 대조적으로 최종 8 개의 잔기(167 - 175)를 삭제하면 생물학적 활성도가 저하되었다. 이러한 결과는 이 잔기를 삭제함으로써 돌연변이체가 G-CSF 수용체에 대한 적당한 결합(따라서 시그날 트랜스덕션을 시작하게 함)을 막아 종합적인 구조를 약화시킴을 지적하는 것이다.
일반적으로, G-CSF 내부 코어 -- 외부 루프가 결여된 4 개의 외부 나선 다발 -- 에 대한 소수성 내부 잔기는 구조 보존에 필수적이다. 예를들어, 나선 A 에서 내부 소수성 잔기(위치 1 에 존재하는 메티오닌을 수반)는 Phe 14, Cys 18, Val 22, Ile 25, Ile 32 및 Leu 36 이다.
일반적으로, G-CSF 내부 코어 -- 외부 루프가 결여된 4 개의 내부 나선 다발 -- 에 대한 소수성 내부 잔기는 구조 보존에 필수적이다. 예를들면, 나선 A 에서 내부 소수성 잔기(제 1 도와 같이 위치 1 에 존재하는 메티오닌을 수반)는 Phe 14, Cys 18, Val 22, Ile 25, Ile 32 및 Leu 36 이다. 그외의 소수성 잔기(위치 1 에 met 을 재수반)는 다음과 같다 : 나선 B, Ala 72, Leu 76, Leu 79, Leu 83, Tyr 86, Leu 90, Leu 93 ; 나선 C, Leu 104, Leu 107, Val 111, Ala 114, Ile 118, Met 122 ; 및 나선 D, Val 154, Val 158, Phe 161, Val 164, Val 168, Leu 172.
최근 제조한 G-CSF 유사체에서의 상기 생물학적 활성도 자료는 외부 루프의 변이가 G-CSF 의 종합적인 구조에 최소의 손상을 끼침을 설명한다. 유사체 제조에 있어서 바람직한 루프는 AB 루프와 CD 루프이다. 루프는 나선에 비해 상대적으로 유연하다. 루프는 분자의 가수분해에 영향을 미칠 수도 있다. 분자가 활동하는 목적은 선택적으로 호중구를 자극하는 것처럼 생물학적 침입에 대해 반응하게 하는 것이므로 G-CSF 는 상대적으로 생체내에서 빠르게 작용한다. G-CSF 의 회전 속도도 상대적으로 빠르다. 루프의 유연성은 분자에 결합하여 분자를 불활성화시키는 프로테아제에게 '핸들' 을 공급할 수 있다. 생물학적 활성도의 상실이 없으면서도(비 - 변이 G-CSF 의 종합적인 구조의보유에 의하여) 프로테아제의 분해를 방지하는 루프의 변이를 이룰 수 있다.
이러한 현상은 아마도 G-CSF 분자에만 제한되는 것이 아니라 제 2 도에 나타난 바와 같이 공지된 유사한 종합 구조를 가진 다른 분자에도 공통적일 것이다. 예를들어, hGH, 인터페론 B, IL-2, GM-CSF 및 IL-4 의 외부 루프의 변이는 종합적인 구조에 최소의 변화를 줄 것이다. GM-CSF 분자상의 외부 루프는 G-CSF 분자에서 발견되는 것들 만큼 유연하지 못하다. 또한 이것은 GM-CSF 의 더 광범위한 생물학적 활성에 양립되는 장기간의 혈청기를 말하는 것이기도 하다. 따라서 GM-CSF 의 외부 루프는 베타 - 시트 구조로부터 외부 루프를 방출시킴으로써 변형할 수 있는데, 더 유연한(G-CSF 의 그것과 유사) 루프를 만들어 프로테아제 분해에 더 민감한 분자가 된다(따라서 회전 속도도 증가한다).
이들 외부 루프의 변이는 하나 또는 그 이상의 내부 나선과 결합하여 루프를 안정화하는 결과를 초래할 것이다. 결합 방식은 베타 시트의 형성, 염다리, 이황화물 결합 또는 소수성 결합과 같이 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있으며, 다른 방식도 유효하다. 또한 외부 루프의 특정 부분을 제거하기 위하여 단축된 분자를 제조하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 또는 그것의 일부 같은 하나 또는 그이상의 일부분을 삭제할 수도 있다.
따라서 외부 루프, 바람직하게는 AB 루프(r-hu-met- G-CSF 의 아미노산 58 - 72) 또는 CD 루프(r-hu-met-G-CSF 의 아미노산 119 내지 145) 및 덜 바람직하게는 아미노 말단(아미노산 - 10)의 변이에 의하여 G-CSF 와 G-CSF 수용체의 결합을 제거하지 않고 생물학적 기능을 변형할 수 있다. 예를들어, (1) 혈청 또는 다른 반감기를 증가시키거나 항원성을 감소시키는 것처럼 상기한 바와 같은 G-CSF 분자의 일부 특징을 변화시키기 위하여 경구 제제형에 대한 장막 또는 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자가 작용하는 것처럼 G-CSF 분자 상에 작용하는 프로테아제의 능력을 감소시키거나 G-CSF 분자에 화학적 변이체를 가함으로써 G-CSF 분자의 반감기를 증가시킬(또는 경구 투여 형태를 제조) 수 있다 ; (2) G-CSF 와 G-CSF 수용체의 수송 메카니즘을 통하여 세포내로 유입하는 시그날 트랜스덕션을 야기하는 시토킨이나 그외의 단백질 같은 다른 단백질의 일부 또는 전부와 G-CSF 가 결합하는 혼성 분자를 제조할 수 있다. 또는 (3) 예를들어, 호중구를 선택적으로 자극하는 능력(비 - 변이 G-CSF 분자와 비교)을 증가시키는 것과 같이 생물학적 활성도를 증가시킬 수 있다. 이러한 목록은 상기 예를 제한하는 것은 아니다.
상기 자료에서 관찰되는 또다른 것은 안정하게 하는 표면의 상호작용이 생물학적 활성도에 영향을 미친다는 것이다. 이것은 유사체 23 및 40 에서 뚜렷이 나타난다. 유사체 23 은 위치 28 의 중성 - 전하 알라닌 잔기에 대한 전하 아스파라진 잔기로의 치환을 함유하며 그러한 치환은 생물학적 활성도(기술한 티미딘 흡수 검정에 의하여 측정하였음)를 50 % 증가시키는 결과를 초래하였다. 위치 28 의 아스파라진 잔기는 위치 113 의 아스파라진 잔기와 표면 상호작용을 한다 ; 두 잔기는 음전하이며, 불안정한 양이 어느 정도 존재한다(동일한 전하 부분의 반발로 인한 것임). 그러나 위치 113 의 아스파라진이 중성 - 전하 알라닌으로 대치되면, 생물학적 활성도는 0 까지 하락한다(본 검정 계에서 관찰됨). 이것은 위치 113 의 아스파라진이 생물학적 활성도에 결정적이며, 위치 28 의 아스파라진을 제거하면 위치 113 의 아스파라진이 주는 효과를 증진시킴을 말해 주는 것이다.
또한 G-CSF 수용체 결합에 필요한 도메인을 상기 제조된 유사체 및 G-CSF 구조를 근거로 하여 결정하였다. G-CSF 수용체 결합 도메인은 잔기(위치 1 에 존재하는 메티오닌을 수반) 11 - 57(A 와 AB 나선 사이) 및 110 - 118 (B 와 C 나선 사이)에 위치한다. G-CSF 수용체에 결합할 수 있는 단축 분자를 제조하고, 선택적으로 호중구를 자극하기 위하여 외부 루프 구조를 변화시키고 수용체 결합 도메인을 원상 그대로유지하게 함으로써 시그날 트랜스덕션을 시작하게 할 수도 있다.
생물학적 활성도 및 G-CSF 수용체 결합 또는 시그날 트랜스덕션에 필수적인 잔기는 확인되었을 것이다. 두 개의 서로 다른 부위는 2 차 구조의 다른 두 부위에 위치한다. 여기에서 '부위 A' 라 명명한 것은 염다리가 나선 다발의 두 개의 다른 부분 사이를 결합시킴으로써 굳어진 나선 상에 위치한다. 두 번째 부위인 '부위 B' 는 상대적으로 더 유연한 나선 AB 상에 위치한다. AB 나선은 아마도 카르복시 및 아미노 말단의 잔기 형태와 위치 때문에 국부적인 pH 변화에 더 민감할 것이다. 이러한 나선의 유연성의 기능적 중요성은 G-CSF 수용체에 결합하는 시기를 적합하게 유도하는 것이다. 직접적 돌연변이 및 간접적 비교 단백질 구조 분석에 의해 확인한 바와 같이, D 나선의 연장된 부분도 G-CSF 수용체 결합 도메인인 것으로 알려졌다. r-hu-met-G-CSF 의 카르복시 말단을 제거하면 hGH 에서 실시한 바와 같이 활성도를 저하시킨다[Cunningham 및 Wells, Science 244 : 1081 - 1084 (1989) 문헌 참조]. 유사한 토폴로지를 가질 것으로 예상되는 IL-6 및 GM-CSF 와 같이 서로 유사한 구조를 갖는 시토킨은 D 나선의 카르복시 말단을 따라 생물학적 활성도가 집중되어 있다[Bezan, Immunology Today 11 : 350 - 354 (1990) 문헌 참조].
G-CSF 및 hGH 의 G-CSF 수용체 결합 결정기의 구조 및 위치를 비교하면, 두 분자가 시그날 트랜스덕션에 대해 유사한 방식을 가짐을 알 수 있다. 두 개의 각각의 G-CSF 수용체 결합 부위를 hGH 에서 확인하였다[De Vos 등의 Science 255 : 306 - 32 (1991) 문헌 참조]. 이러한 결합 부위 중 하나('부위 Ⅰ' 이라 명명)는 hGH 의 나선 1 의 노출면, 나선 1 과 2 의 결합 부위 및 나선 4 의 잔기로 이루어진다. 두 번째 결합 부위('부위 Ⅱ' 라 명명)는 나선 1 및 나선 3 의 표면 잔기로 이루어진다.
G-CSF 에서 확인한 G-CSF 수용체 결합 결정기는 hGH 에서 확인한 것과 비교적 동일한 위치에 위치한다. AB 나선 상의 나선 A 와 B 의 결합 부위에 위치한 G-CSF 수용체 결합 부위(부위 A)는 hGH 나선의 일부 단편(잔기 38 - 47)에서 보고된 위치와 유사하다. G-CSF AB 나선의 단일 점돌연변이는 G-CSF 수용체 - 리간드 계면의 역할을 나타내는 생물학적 활성도(본 검정에서 관찰한 활성도)를 현저히 감소시킨다. G-CSF 수용체의 결합은 이 부위의 310나선형 성질을 불안정하게 하고 리간드/G-CSF 수용체 복합체의 결합 에너지를 증진시키는 입체형태의 변화를 유도할 수 있다.
hGH 수용체 복합체에서, 다발의 제 1 나선은 hGH 수용체를 이합화하기 위해 필요한 양 결합 부위에 잔기를 공여한다. G-CSF 의 대응 나선(나선 A)에 대한 돌연변이 분석으로 생물학적 활성도에 필수적인 세 개의 잔기를 확인하였다. 이들 세 개의 잔기 중 Glu 20 및 Arg 24 는 나선 C 나선 다발의 한 면에 위치하는 반면, Arg 23(비대칭 단위의 세 분자 중 두 개)의 곁사슬은 나선 D 다발에 면하고 있다. 이러한 생물학적으로 중요한 잔기의 곁사슬 위치는 hGH 와 유사한 G-CSF 가 나선 A 및 나선 C 사이의 계면을 따라 G-CSF 수용체의 두 번째 결합 부위를 가질 수 있다는 것을 말해준다. hGH 분자와는 대조를 이루는 G-CSF 의 아미노 말단은 초기 11 개 잔기의 삭제가 생물학적 활성도에 거의 영향을 끼치지 못하므로 제한된 생물학적 기능을 갖는다.
상기한 바와 같이(예를들어, 제 2 도 참조), G-CSF 는 다른 시토킨과 토폴로지 상의 유사성을 갖는다. hGH 수용체 복합체의 특이 잔기의 구조를 선행 생화학적 연구, 돌연변이 분석 및 직접 비교하여 얻은 상관관계는 G-CSF 가 2 개의 수용체 결합 부위를 가짐을 나타낸다. 부위 A 는 A 및 B 사이의 계면을 따라 위치하고 소량의 AB 나선 내의 잔기를 포함한다. 부위 B 는 A 나선 내의 잔기를 포함하지만 나선 A 및 C 사이의 계면을 따라 위치한다. G-CSF 와 hGH 사이의 생물학적으로 중요한 잔기의 구조 및 상대적 위치는 수용체가 두 지점에서 결합한다는 점에서 시그날 트랜스덕션의 일반적 방법의 한 예시이다. 따라서 변이된 G-CSF 수용체 결합 도메인을 갖는 G-CSF 유사체는 G-CSF 수용체 결합 부위(잔기 20 - 57 및 145 - 175)의 어느 한 쪽의 변이로 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
3 차원적 구조에 대한 이해 및 G-CSF 단백질 조성물의 상관관계는 G-CSF 유사체의 제조방법을 체계적이고 합리적이게 한다. 상기 실시예는 종합 구조가 변화되기 전에 구조의 코어내 곁사슬의 크기와 극성을 제한하는 것이 내성이 있는 분자를 얼마나 변화시키는가를 설명하였다.
본 발명의 효과는 상기 실시예를 통해 상세히 기술되어 있으며, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
서열 목록
(1) 일반적인 정보 :
(ⅰ) 출원인 : 암젠 인코포레이티드
(ⅱ) 발명의 명칭 : 단백질의 결정화 방법
(ⅲ) 시퀀수 수 : 110
(ⅳ) 통신 주소 :
(A) 수신인 : 암젠 인코포레이티드
(B) 가 : 암젠 센터, 디하빌랜드 드라이브 1840
(C) 시 : 사우전드 오크스
(D) 주 : 캘리포니아
(E) 국명 : 미국
(F) 우편번호 : 91320-1789
(ⅴ) 컴퓨터 입력 형태 :
(A) 매체형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 운용 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25
(ⅵ) 현재의 출원 자료 :
(A) 출원 번호 :
(B) 제출 일자 :
(C) 분류 :
(ⅷ) 대리인/중개인 정보 :
(A) 성명 : 페신, 캐롤
(B) 등록 번호 : 제 34,899 호
(ⅸ) 통신 정보 :
(A) 전화 : 805/499-5725
(B) 텔레팩스 : 805/499-8011
(2) SEQ ID NO : 1 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 565 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA (게놈)
(ⅸ) 특징 :
(A) 이름/약호 : CDS
(B) 위치 : 30..554
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 1 :
(2) SEQ ID NO : 2 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 2 :
(2) SEQ ID NO : 3 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 3 :
(2) SEQ ID NO : 4 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 4 :
(2) SEQ ID NO : 5 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 5 :
(2) SEQ ID NO : 6 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 6 :
(2) SEQ ID NO : 7 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 7 :
(2) SEQ ID NO : 8 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 8 :
(2) SEQ ID NO : 9 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 9 :
(2) SEQ ID NO : 10 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 10 :
(2) SEQ ID NO : 11 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 11 :
(2) SEQ ID NO : 12 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 12 :
(2) SEQ ID NO : 13 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 13 :
(2) SEQ ID NO : 14 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 14 :
(2) SEQ ID NO : 15 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 15 :
(2) SEQ ID NO : 16 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 16 :
(2) SEQ ID NO : 17 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 17 :
(2) SEQ ID NO : 18 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 18 :
(2) SEQ ID NO : 19 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 19 :
(2) SEQ ID NO : 20 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 20 :
(2) SEQ ID NO : 21 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 21 :
(2) SEQ ID NO : 22 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 22 :
(2) SEQ ID NO : 23 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 23 :
(2) SEQ ID NO : 24 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 24 :
(2) SEQ ID NO : 25 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 37 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 25 :
(2) SEQ ID NO : 26 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 26 :
(2) SEQ ID NO : 27 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 27 :
(2) SEQ ID NO : 28 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 28 :
(2) SEQ ID NO : 29 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 29 :
(2) SEQ ID NO : 30 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 25 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 30 :
(2) SEQ ID NO : 31 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 31 :
(2) SEQ ID NO : 32 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 32 :
(2) SEQ ID NO : 33 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 33 :
(2) SEQ ID NO : 34 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 34 :
(2) SEQ ID NO : 35 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 25 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 35 :
(2) SEQ ID NO : 36 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 36 :
(2) SEQ ID NO : 37 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 19 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 37 :
(2) SEQ ID NO : 38 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 38 :
(2) SEQ ID NO : 39 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 39 :
(2) SEQ ID NO : 40 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 40 :
(2) SEQ ID NO : 41 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 21 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 41 :
(2) SEQ ID NO : 42 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 42 :
(2) SEQ ID NO : 43 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 43 :
(2) SEQ ID NO : 44 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 44 :
(2) SEQ ID NO : 45 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 21 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 45 :
(2) SEQ ID NO : 46 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 46 :
(2) SEQ ID NO : 47 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 21 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 47 :
(2) SEQ ID NO : 48 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 48 :
(2) SEQ ID NO : 49 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 19 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 49 :
(2) SEQ ID NO : 50 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 50 :
(2) SEQ ID NO : 51 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 51 :
(2) SEQ ID NO : 52 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 52 :
(2) SEQ ID NO : 53 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 53 :
(2) SEQ ID NO : 54 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 54 :
(2) SEQ ID NO : 55 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 55 :
(2) SEQ ID NO : 56 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 25 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 56 :
(2) SEQ ID NO : 57 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 57 :
(2) SEQ ID NO : 58 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 25 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 58 :
(2) SEQ ID NO : 59 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 59 :
(2) SEQ ID NO : 60 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 60 :
(2) SEQ ID NO : 61 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 61 :
(2) SEQ ID NO : 62 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 19 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 62 :
(2) SEQ ID NO : 63 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 21 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 63 :
(2) SEQ ID NO : 64 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 64 :
(2) SEQ ID NO : 65 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 54 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 65 :
(2) SEQ ID NO : 66 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 59 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 형태 : 단일
(D) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : DNA
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 66 :
(2) SEQ ID NO : 67 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 67 :
(2) SEQ ID NO : 68 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 68 :
(2) SEQ ID NO : 69 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 69 :
(2) SEQ ID NO : 70 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 70 :
(2) SEQ ID NO : 71 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 71 :
(2) SEQ ID NO : 72 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 72 :
(2) SEQ ID NO : 73 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 73 :
(2) SEQ ID NO : 74 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 74 :
(2) SEQ ID NO : 75 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 75 :
(2) SEQ ID NO : 76 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 76 :
(2) SEQ ID NO : 77 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 77 :
(2) SEQ ID NO : 78 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 78 :
(2) SEQ ID NO : 79 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 79 :
(2) SEQ ID NO : 80 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 80 :
(2) SEQ ID NO : 81 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 81 :
(2) SEQ ID NO : 82 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 174 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 82 :
(2) SEQ ID NO : 83 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 83 :
(2) SEQ ID NO : 84 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 84 :
(2) SEQ ID NO : 85 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 85 :
(2) SEQ ID NO : 86 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 86 :
(2) SEQ ID NO : 87 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 87 :
(2) SEQ ID NO : 88 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 88 :
(2) SEQ ID NO : 89 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 89 :
(2) SEQ ID NO : 90 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 90 :
(2) SEQ ID NO : 91 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 91 :
(2) SEQ ID NO : 92 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 92 :
(2) SEQ ID NO : 93 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 93 :
(2) SEQ ID NO : 94 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 94 :
(2) SEQ ID NO : 95 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 95 :
(2) SEQ ID NO : 96 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 96 :
(2) SEQ ID NO : 97 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 97 :
(2) SEQ ID NO : 98 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 98 :
(2) SEQ ID NO : 99 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 99 :
(2) SEQ ID NO : 100 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 100 :
(2) SEQ ID NO : 101 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 101 :
(2) SEQ ID NO : 102 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 102 :
(2) SEQ ID NO : 103 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 103 :
(2) SEQ ID NO : 104 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 104 :
(2) SEQ ID NO : 105 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 105 :
(2) SEQ ID NO : 106 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 106 :
(2) SEQ ID NO : 107 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 107 :
(2) SEQ ID NO : 108 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 108 :
(2) SEQ ID NO : 109 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 109 :
(2) SEQ ID NO : 110 에 대한 정보 :
(ⅰ) 시퀀스 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직선형
(ⅱ) 분자 유형 : 단백질
(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 110 :

Claims (4)

  1. 다음 단계를 포함하는 과립구 군체 자극 인자(G-CSF)의 결정화 방법 :
    (a) (ⅰ) 상이한 염 농도를 갖는, 0 - 2.5 M 의 염 용액 분취량 ; 또는 (ⅱ) 상이한 침전제 농도를 갖는 침전제 용액의 분취량과 상기 G-CSF 의 수용액 분취량을 배합시키고 ;
    (b) 예비결정체 형태가 형성되면 적어도 하나의 상기 배합된 분취량을 선택하거나, 예비결정체 형태가 생성되지 않으면 G-CSF 의 상기 수용액 분취량의 단백질 출발 농도를 증가시킨 다음 (a) 단계를 반복하고 ;
    (c) 상기 염이나 침전제 농도를 선택한 후, 선택한 농도하에서 상기 미리 선택하지 않은 용액으로 (a) 단계를 반복하고 ;
    (d) 원하는 투과성의 결정이 수득될 때까지 (b) 단계와 (a) 단계를 반복한다.
  2. 제 1 항에 있어서, (a) 단계의 각 배합은 pH 4.5 - 9.0 범위에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, (a) 단계의 배합은 핵생성 개시 단위의 존재하에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, (a) 단계의 배합은 자동화 방법에 의해 수행함을 특징으로 하는 방법.
KR10-2001-7006530A 1993-01-28 1994-01-25 과립구 군체 자극 인자의 결정화 방법 KR100390338B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/010,099 US5581476A (en) 1993-01-28 1993-01-28 Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US?08/010,099? 1993-01-28
KR1019950703096A KR100375274B1 (ko) 1993-01-28 1994-01-25 G-csf유사체를제조하기위한컴퓨터기저방법및장치

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019950703096A Division KR100375274B1 (ko) 1993-01-28 1994-01-25 G-csf유사체를제조하기위한컴퓨터기저방법및장치

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100390338B1 true KR100390338B1 (ko) 2003-07-07

Family

ID=21743861

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019950703096A KR100375274B1 (ko) 1993-01-28 1994-01-25 G-csf유사체를제조하기위한컴퓨터기저방법및장치
KR10-2001-7006530A KR100390338B1 (ko) 1993-01-28 1994-01-25 과립구 군체 자극 인자의 결정화 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019950703096A KR100375274B1 (ko) 1993-01-28 1994-01-25 G-csf유사체를제조하기위한컴퓨터기저방법및장치

Country Status (22)

Country Link
US (6) US5581476A (ko)
EP (8) EP1482046B1 (ko)
JP (7) JPH08506018A (ko)
KR (2) KR100375274B1 (ko)
CN (3) CN1495197B (ko)
AT (2) ATE195552T1 (ko)
AU (2) AU697451B2 (ko)
CA (4) CA2711007C (ko)
DE (1) DE69425516T2 (ko)
DK (3) DK0612846T3 (ko)
ES (3) ES2422269T3 (ko)
FI (2) FI120769B (ko)
GR (1) GR3034745T3 (ko)
HK (2) HK1009288A1 (ko)
IL (6) IL124112A (ko)
LU (1) LU92265I2 (ko)
LV (1) LV12642B (ko)
NO (3) NO952974L (ko)
NZ (5) NZ332188A (ko)
PT (3) PT2345724E (ko)
WO (1) WO1994017185A1 (ko)
ZA (1) ZA94568B (ko)

Families Citing this family (141)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020177688A1 (en) * 1988-12-22 2002-11-28 Kirin-Amgen, Inc., Chemically-modified G-CSF
ATE135370T1 (de) * 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US20030053982A1 (en) * 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
JP3708151B2 (ja) * 1994-12-15 2005-10-19 協和醗酵工業株式会社 Ｐｅｇ化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法
JP2000501744A (ja) * 1996-01-22 2000-02-15 クリエイティブ バイオモレキゥルズ，インコーポレーテッド モルホゲン類似体およびその製法
US20030185792A1 (en) * 1996-01-22 2003-10-02 Curis, Inc. Morphogen analogs of bone morphogenic proteins
US5835382A (en) * 1996-04-26 1998-11-10 The Scripps Research Institute Small molecule mimetics of erythropoietin
US6128582A (en) * 1996-04-30 2000-10-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Molecules comprising an IMPDH-like binding pocket and encoded data storage medium capable of graphically displaying them
ES2297889T3 (es) * 1997-07-14 2008-05-01 Bolder Biotechnology, Inc. Derivados de hormona de crecimiento y proteinas relacionadas.
US20080076706A1 (en) 1997-07-14 2008-03-27 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof
US6753165B1 (en) 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US6017876A (en) 1997-08-15 2000-01-25 Amgen Inc. Chemical modification of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) bioactivity
CN1061992C (zh) * 1997-11-19 2001-02-14 蒋永平 新的重组人粒细胞集落刺激因子及其药物组合物
EP1073683B1 (en) * 1998-04-30 2005-12-28 Tanox, Inc. G-csf receptor agonist antibodies and screening method therefor
TWI242563B (en) * 1998-04-30 2005-11-01 Tanox Inc Monoclonal agonist antibodies which specifically bind to or interact with human G-CSF receptor
US6541033B1 (en) 1998-06-30 2003-04-01 Amgen Inc. Thermosensitive biodegradable hydrogels for sustained delivery of leptin
US6979442B1 (en) 1998-08-17 2005-12-27 Pfizer Inc. Stabilized protein compositions
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
US6245740B1 (en) 1998-12-23 2001-06-12 Amgen Inc. Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins
US6451346B1 (en) * 1998-12-23 2002-09-17 Amgen Inc Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents
US7208473B2 (en) * 1999-01-06 2007-04-24 Xencor, Inc. Nucleic acids and protein variants of hG-CSF with granulopoietic activity
JP4092081B2 (ja) * 1999-01-06 2008-05-28 ゼンコー・インコーポレイテッド 顆粒球形成活性を有するｇ−ｃｓｆ変異体相当核酸およびタンパク質
US8288126B2 (en) 1999-01-14 2012-10-16 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
HU228488B1 (en) * 1999-01-29 2013-03-28 Amgen Inc Gcsf conjugates
US6500418B1 (en) * 1999-02-12 2002-12-31 The Washington University Stimulating neutrophil function to treat inflammatory bowel disease
JP2000319298A (ja) * 1999-03-04 2000-11-21 Seibutsu Bunshi Kogaku Kenkyusho:Kk 蛋白質複合体の結晶、構造座標、及び構造座標の使用
US7244396B2 (en) 1999-04-06 2007-07-17 Uab Research Foundation Method for preparation of microarrays for screening of crystal growth conditions
US7247490B2 (en) 1999-04-06 2007-07-24 Uab Research Foundation Method for screening crystallization conditions in solution crystal growth
EP1181548B1 (en) * 1999-04-06 2007-03-21 The University of Alabama at Birmingham Research Foundation Method for screening crystallization conditions in solution crystal growth
US20030022383A1 (en) * 1999-04-06 2003-01-30 Uab Research Foundation Method for screening crystallization conditions in solution crystal growth
US7250305B2 (en) 2001-07-30 2007-07-31 Uab Research Foundation Use of dye to distinguish salt and protein crystals under microcrystallization conditions
US7214540B2 (en) * 1999-04-06 2007-05-08 Uab Research Foundation Method for screening crystallization conditions in solution crystal growth
WO2000068252A1 (en) * 1999-05-10 2000-11-16 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlled polypeptide synthesis
US6296673B1 (en) * 1999-06-18 2001-10-02 The Regents Of The University Of California Methods and apparatus for performing array microcrystallizations
US6630006B2 (en) * 1999-06-18 2003-10-07 The Regents Of The University Of California Method for screening microcrystallizations for crystal formation
US7058517B1 (en) 1999-06-25 2006-06-06 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Methods for obtaining and using haplotype data
EP1200124B1 (en) * 1999-07-13 2008-09-10 Bolder Biotechnology, Inc. Erythropoietin-immunoglobulin fusion proteins
US8106098B2 (en) * 1999-08-09 2012-01-31 The General Hospital Corporation Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biodegradable polymer
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
AR027509A1 (es) * 2000-01-10 2003-04-02 Maxygen Aps Conjugados g-csf
US6831158B2 (en) * 2000-01-10 2004-12-14 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6646110B2 (en) * 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
GB0008563D0 (en) * 2000-04-07 2000-05-24 Cambridge Discovery Chemistry Investigating different physical and/or chemical forms of materials
EP1043239B1 (en) * 2000-06-16 2004-02-04 VSI Holding A/S Container with collapsible sides
US6931326B1 (en) 2000-06-26 2005-08-16 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Methods for obtaining and using haplotype data
US7792645B2 (en) * 2000-08-30 2010-09-07 The Salk Institute For Biological Studies Three-dimensional structure of chalcone isomerase and methods of use thereof
AU2001288220A1 (en) * 2000-09-07 2002-03-22 Eli Lilly And Company Hyperglycosylated polypeptides
CA2421760A1 (en) * 2000-09-08 2002-03-14 Massachusetts Institute Of Technology G-csf analog compositions and methods
WO2002036626A1 (en) * 2000-11-02 2002-05-10 Maxygen Aps Single-chain multimeric polypeptides
CA2440467A1 (en) * 2001-03-12 2002-09-19 Board Of Regents, University Of Texas System Ensemble-based strategy for the design of protein pharmaceuticals
DE10112825A1 (de) * 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
US7670429B2 (en) 2001-04-05 2010-03-02 The California Institute Of Technology High throughput screening of crystallization of materials
US6998219B2 (en) * 2001-06-27 2006-02-14 University Of South Florida Maskless photolithography for etching and deposition
JP4444652B2 (ja) * 2001-07-11 2010-03-31 マキシゲン・ホールディングズ・リミテッド Ｇ−ｃｓｆ結合体
US20030104996A1 (en) * 2001-08-30 2003-06-05 Tiansheng Li L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations
US20040247562A1 (en) * 2001-09-28 2004-12-09 Sang Yup Lee Diagnostic method for cancer characterized in the detection of the deletion of g-csf exon 3
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
JP2006507562A (ja) * 2002-05-23 2006-03-02 ザ ボード オブ レジェンツ−ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム アンサンブルベースの構造エネルギーを使用した一塩基多型（ｓｎｐｓ）の意義の予測
WO2004005898A1 (en) * 2002-07-10 2004-01-15 Uab Research Foundation Method for distinguishing between biomolecule and non-biomolecule crystals
WO2004022593A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
BR0314107A (pt) * 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Método de produção de derivados de hidroxialquil amido
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
AU2003273413A1 (en) * 2002-10-08 2004-05-04 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
GEP20084486B (en) * 2002-12-26 2008-09-25 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
JP2006519170A (ja) * 2002-12-26 2006-08-24 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ポリペプチドホルモン、およびレセプター結合活性が保存されたそのアンタゴニストのポリマー結合体
US7695723B2 (en) 2002-12-31 2010-04-13 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
US7785601B2 (en) 2002-12-31 2010-08-31 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
AU2004263274B2 (en) 2003-07-21 2009-11-05 Transgene S.A. Novel multifunctional cytokines
BRPI0412671A (pt) * 2003-08-08 2006-10-03 Fresenius Kabi De Gmbh conjugados de um polìmero e uma proteìna ligados por um grupo de ligação de oxima
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
DK2441465T3 (da) * 2003-10-24 2014-04-14 Nora Therapeutics Inc Præparater og fremgangsmåder til en sund graviditet
US8338373B2 (en) * 2003-10-24 2012-12-25 Nora Therapeutics, Inc. Method for reducing the risk of spontaneous abortion in a human female subject
US20090226397A1 (en) 2003-10-24 2009-09-10 Nora Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing the likelihood of implantation failure or miscarriage in recipients of artificial insemination
US7220407B2 (en) * 2003-10-27 2007-05-22 Amgen Inc. G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction
US20060122784A1 (en) * 2004-12-03 2006-06-08 Ishikawa Muriel Y System and method for augmenting a humoral immune response
CA2552241C (en) 2003-12-30 2013-10-01 Durect Corporation Co-polymeric devices for controlled release of active agents
TW200603818A (en) * 2004-03-11 2006-02-01 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
AR048035A1 (es) 2004-03-11 2006-03-22 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxialquilo y una proteina, preparados por aminacion reductora
AU2005269527B2 (en) 2004-07-26 2011-12-01 Pfenex Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
EP1817047B1 (en) 2004-11-05 2012-02-08 Northwestern University Use of scf and g-csf in the treatment of cerebral ischemia and neurological disorders
WO2006063300A2 (en) * 2004-12-10 2006-06-15 Genentech, Inc. Crystal structure of hepatocyte growth factor activator complexed with kunitz domain inhibitor
WO2006067170A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Laboratoires Serono S.A. G-csf polypeptides and uses thereof
EP1858543B1 (en) 2005-01-10 2013-11-27 BioGeneriX AG Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
KR100657749B1 (ko) * 2005-04-13 2006-12-20 씨제이 주식회사 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 및 그 조성물
CN101193658B (zh) * 2005-06-01 2011-08-31 马克西根控股公司 聚乙二醇化g-csf多肽及其产生方法
KR100694994B1 (ko) * 2005-06-13 2007-03-14 씨제이 주식회사 사람 과립구 콜로니 형성인자 동종체
KR100735784B1 (ko) 2005-07-20 2007-07-06 재단법인 목암생명공학연구소 인간 과립구콜로니자극인자 변이체 및 이의 화학적 접합물
CA2618447C (en) * 2005-08-15 2015-06-02 Phares Pharmaceutical Research N.V. Crystal forms of astaxanthin
WO2007024940A2 (en) * 2005-08-22 2007-03-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Mitochondrial localization of muc1
US20070112804A1 (en) * 2005-11-07 2007-05-17 Desimas Bruce E Systems and methods for generating automated software workflows for biological testing
GB0605684D0 (en) * 2006-03-21 2006-05-03 Sicor Biotech Uab Method For Purifying Granulocyte-Colony Stimulating Factor
US8129345B2 (en) * 2006-07-20 2012-03-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. MUC1-IκB kinase complexes and their activities
US7972870B2 (en) 2007-02-02 2011-07-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of MUC1 by HSF1 and STAT3
WO2008097844A2 (en) * 2007-02-02 2008-08-14 Dana -Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of apoptosis by muc1 and bh3- containing proapoptotic proteins
JP4375412B2 (ja) * 2007-02-19 2009-12-02 株式会社デンソー 蒸発器ユニット
CA2685326A1 (en) 2007-04-27 2008-11-06 Dow Global Technologies Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
KR20110016430A (ko) 2007-07-03 2011-02-17 암젠 인코퍼레이티드 봉입체 건량을 이용한 단백질 측정
HUE037633T2 (hu) 2007-07-09 2018-09-28 Genentech Inc Diszulfidkötés redukciójának megelõzése polipeptidek rekombináns elõállítása során
EP2185689A2 (en) 2007-08-09 2010-05-19 Genzyme Corporation Method of treating autoimmune disease with mesenchymal stem cells
WO2009046015A2 (en) * 2007-09-30 2009-04-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Combination therapies for treating type 1 diabetes
US8570393B2 (en) * 2007-11-30 2013-10-29 Cognex Corporation System and method for processing image data relative to a focus of attention within the overall image
EP2070950A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2070951A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
CN103694337B (zh) 2008-02-08 2016-03-02 Ambrx公司 经修饰瘦素多肽和其用途
ES2523030T3 (es) 2008-02-18 2014-11-20 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Un conjugado del G-CSF modificado por un polímero hidrosoluble
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
JP5667565B2 (ja) 2008-07-22 2015-02-12 メノジェニックス， インコーポレイテッド 閉経期、ホルモン変動および関節炎と関連する症状を治療するための組成物および方法
UA118536C2 (uk) * 2008-07-23 2019-02-11 Амбркс, Інк. Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування
US9151289B2 (en) 2008-08-21 2015-10-06 Cummins Inc. Fuel pump
EA201990619A1 (ru) 2008-10-10 2019-07-31 Амген Инк. Fgf21 мутанты и их применение
AU2009305550B2 (en) 2008-10-17 2014-06-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. MUC-1 cytoplasmic domain peptides as inhibitors of cancer
US9189670B2 (en) * 2009-02-11 2015-11-17 Cognex Corporation System and method for capturing and detecting symbology features and parameters
UY32607A (es) 2009-05-05 2010-12-31 Amgen Inc Mutantes de fgf21 y usos del mismo
EP2427207B1 (en) 2009-05-05 2017-08-16 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
JP2012530493A (ja) * 2009-06-17 2012-12-06 アムジエン・インコーポレーテツド キメラポリペプチドおよびその使用
MX2012006397A (es) 2009-12-02 2012-11-30 Amgen Inc PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA.
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
CN107674121A (zh) 2009-12-21 2018-02-09 Ambrx 公司 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途
CN107056929A (zh) 2009-12-21 2017-08-18 Ambrx 公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途
WO2011115819A2 (en) 2010-03-15 2011-09-22 Genus Oncology, Llc Small molecule inhibitors of muc1 and methods of identifying the same
EP2550366B1 (en) 2010-03-23 2014-11-12 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Methods for identifying inhibitors of the type iii secretion system
CA2796055A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and .beta.-klotho binding proteins
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
PT2621519T (pt) 2010-09-28 2017-10-04 Aegerion Pharmaceuticals Inc Polipéptido de fusão de leptina-abd com duração de ação melhorada
US8889630B2 (en) 2011-12-23 2014-11-18 Carlos Lopez Method for hair regrowth using Granulocyte-Colony Stimulating Factor
WO2014045126A2 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Uti Limited Partnership Treatment of pain by inhibition of usp5 de-ubiquitinase
PL3524618T3 (pl) 2013-03-15 2023-07-10 GLAdiator Biosciences, Inc. Domeny gla jako środki ukierunkowujące
LT6161B (lt) 2013-09-27 2015-06-25 Uab Profarma Granuliocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus sulieti baltymai su kitais augimo faktoriais, optimaliai su kamieninių ląstelių faktoriumi, ir jų gavimo būdas
WO2015057724A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 Nora Therapeutics, Inc. Use of g-csf for treating or preventing villitis of unknown etiology in a human female
WO2016201448A2 (en) * 2015-06-11 2016-12-15 Prolong Pharmaceuticals, LLC Pegylated granulocyte colony stimulating factor (gcsf)
EP3365360A1 (en) * 2015-10-19 2018-08-29 Sandoz AG Improved coding sequence for human g-csf
EP3679129A1 (en) 2017-09-05 2020-07-15 GLAdiator Biosciences, Inc. A method of intracellular delivery
CN108384747A (zh) * 2018-03-05 2018-08-10 安徽省农业科学院园艺研究所 表达狂犬抗体的cho细胞无血清悬浮培养方法
CA3151471A1 (en) * 2019-10-08 2021-04-15 Gesa VOLKERS Modified extracellular domain of granulocyte colony-stimulating factor receptor (g-csfr) and cytokines binding same
US20230227520A1 (en) 2019-12-17 2023-07-20 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Novel g-csf mimics and their applications

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5109119A (en) * 1989-06-06 1992-04-28 Schering Corporation Crystalline r-h-gm-csf and method

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
WO1985000817A1 (en) * 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
JPS6263335A (ja) * 1985-09-13 1987-03-20 Fuji Photo Film Co Ltd 化学反応情報の処理方法
US4908773A (en) * 1987-04-06 1990-03-13 Genex Corporation Computer designed stabilized proteins and method for producing same
DK203187A (da) * 1986-04-22 1987-10-23 Immunex Corp Human g-csf proteinekspression
JPH01500483A (ja) * 1986-08-11 1989-02-23 シタス　コーポレイション Ｇ‐ｃｓｆ及びそのミューテインの発現
US4704692A (en) * 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
DK174044B1 (da) * 1986-12-23 2002-05-06 Kyowa Hakko Kogyo Kk Polypeptid afledt fra human granulocytkolonistimulerende faktor, og fremgangsmåde til fremstilling deraf, DNA kodende for nævnte polypeptid, rekombinant plasmid indeholdende nævnte DNA, og mikroorganismer indeholdende nævnte rekombinante plasmid.......
US4853871A (en) * 1987-04-06 1989-08-01 Genex Corporation Computer-based method for designing stablized proteins
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
GB2213821B (en) * 1987-12-23 1992-01-02 British Bio Technology Synthetic human granulocyte colony stimulating factor gene
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
CA1340810C (en) * 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
EP0344796B1 (en) * 1988-06-03 1994-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Crystalline human granulocyte colony stimulating factor and process for preparing the same
US5025388A (en) * 1988-08-26 1991-06-18 Cramer Richard D Iii Comparative molecular field analysis (CoMFA)
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5265030A (en) * 1990-04-24 1993-11-23 Scripps Clinic And Research Foundation System and method for determining three-dimensional structures of proteins
GB9107846D0 (en) * 1990-04-30 1991-05-29 Ici Plc Polypeptides
DE4014750A1 (de) 1990-05-08 1991-11-14 Boehringer Mannheim Gmbh Muteine des granulozyten-stimulierenden faktors (g-csf)
JP3249147B2 (ja) 1990-06-01 2002-01-21 キリン−アムジエン・インコーポレーテツド 生理活性蛋白含有経口製剤
IE912365A1 (en) 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
AU651152B2 (en) * 1990-08-29 1994-07-14 Genetics Institute, Llc Multidomain hematopoiesis stimulators
US5124297A (en) 1990-12-07 1992-06-23 Amoco Corporation Olefin polymerization and copolymerization catalyst
DE4105480A1 (de) 1991-02-21 1992-08-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verbesserte aktivierung von rekombinanten proteinen
WO1992016555A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5157736A (en) * 1991-04-19 1992-10-20 International Business Machines Corporation Apparatus and method for optical recognition of chemical graphics
US5386507A (en) * 1991-07-18 1995-01-31 Teig; Steven L. Computer graphics system for selectively modelling molecules and investigating the chemical and physical properties thereof
DE69227693T2 (de) * 1991-08-30 1999-07-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Wash. Hybride cytokine
JP2638359B2 (ja) * 1991-11-26 1997-08-06 富士通株式会社 分子動力学法の拘束条件作成装置
ATE195553T1 (de) * 1992-06-09 2000-09-15 Chiron Corp Kristallisierung von m-csf
US6057133A (en) 1992-11-24 2000-05-02 G. D. Searle Multivariant human IL-3 fusion proteins and their recombinant production
US6153183A (en) 1992-11-24 2000-11-28 G. D. Searle & Company Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF's or cytokines for multi-lineage hematopoietic cell production
US5738849A (en) 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
AU5670994A (en) 1992-11-24 1994-06-22 G.D. Searle & Co. Interleukin-3 (il-3) mutant polypeptides
US5772992A (en) 1992-11-24 1998-06-30 G.D. Searle & Co. Compositions for co-administration of interleukin-3 mutants and other cytokines and hematopoietic factors
US5424963A (en) * 1992-11-25 1995-06-13 Photon Research Associates, Inc. Molecular dynamics simulation method and apparatus
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5635599A (en) 1994-04-08 1997-06-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Fusion proteins comprising circularly permuted ligands
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
CA2212006A1 (en) 1995-02-03 1996-08-08 G.D. Searle & Co. Novel c-mpl ligands
US6017523A (en) 1995-06-06 2000-01-25 G.D. Searle & Co. Therapeutic methods employing mutant human interleukin-3 (IL-3) polypeptides
EP0870027A1 (en) 1995-10-05 1998-10-14 G.D. Searle & Co. Novel c-mpl receptor agonists
US6100070A (en) 1995-10-05 2000-08-08 G. D. Searle & Co. G-CSF receptor agonists
EP0859843A1 (en) 1995-10-05 1998-08-26 G.D. Searle & Co. Novel g-csf receptor agonists
US6066318A (en) 1995-10-05 2000-05-23 G.D. Searle & Co. Multi-functional hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged C-MPL receptor agonists and other hematopoietic factors
CN1590407A (zh) 1995-10-05 2005-03-09 G.D.瑟尔公司 多功能性造血受体激动剂
AU725547B2 (en) 1996-10-25 2000-10-12 G.D. Searle & Co. Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists
US6660257B1 (en) 1996-10-25 2003-12-09 Pharmacia Corporation Circular permuteins of flt3 ligand
US5969105A (en) 1996-10-25 1999-10-19 Feng; Yiqing Stem cell factor receptor agonists
JP2001527396A (ja) 1997-04-11 2001-12-25 ジー．ディー．サール アンド カンパニー ｆｌｔ３リガンドキメラタンパク質
AU6246599A (en) 1998-09-25 2000-04-17 G.D. Searle & Co. Method of producing permuteins by scanning permutagenesis
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
CN102180944A (zh) * 2001-10-10 2011-09-14 诺和诺德公司 肽的重构和糖缀合

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5109119A (en) * 1989-06-06 1992-04-28 Schering Corporation Crystalline r-h-gm-csf and method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Crystal Growth, Vol.90, p318-324 (1988) *

Also Published As

Publication number Publication date
IL145994A (en) 2010-12-30
DK1482046T3 (da) 2012-06-25
NZ504840A (en) 2001-11-30
FI953593A0 (fi) 1995-07-27
EP0965638A2 (en) 1999-12-22
JPH08506018A (ja) 1996-07-02
NO952974D0 (no) 1995-07-27
EP0965638A3 (en) 2000-02-23
EP1233065A1 (en) 2002-08-21
IL145994A0 (en) 2002-07-25
IL124112A (en) 2006-12-10
EP2345724A1 (en) 2011-07-20
ES2150951T3 (es) 2000-12-16
FI20090384A (fi) 2009-10-21
FI953593A (fi) 1995-07-27
PT612846E (pt) 2001-01-31
CN1495197B (zh) 2013-01-16
JP2004113243A (ja) 2004-04-15
DE69425516D1 (de) 2000-09-21
CN1970571A (zh) 2007-05-30
US6261550B1 (en) 2001-07-17
CA2381489C (en) 2010-10-19
IL108446A0 (en) 1994-04-12
GR3034745T3 (en) 2001-02-28
US20030171559A1 (en) 2003-09-11
US6632426B2 (en) 2003-10-14
IL125398A0 (en) 1999-03-12
CA2239360C (en) 2002-07-16
CA2153896A1 (en) 1994-08-04
JP2011207885A (ja) 2011-10-20
CA2381489A1 (en) 1994-08-04
ES2422269T3 (es) 2013-09-10
CA2711007C (en) 2012-10-02
DK0612846T3 (da) 2000-10-09
PT1482046E (pt) 2012-06-06
DE69425516T2 (de) 2001-06-13
DK2345724T3 (da) 2013-09-30
EP0890640A2 (en) 1999-01-13
ES2382927T3 (es) 2012-06-14
EP1482046A2 (en) 2004-12-01
WO1994017185A1 (en) 1994-08-04
CA2711007A1 (en) 1994-08-04
IL124111A (en) 2002-09-12
EP1482046A3 (en) 2005-01-05
EP1482046B1 (en) 2012-04-11
HK1107356A1 (en) 2008-04-03
US20050260154A1 (en) 2005-11-24
NO20031497D0 (no) 2003-04-02
EP1482045A2 (en) 2004-12-01
NO20031497L (no) 2003-04-02
AU6095794A (en) 1994-08-15
US5581476A (en) 1996-12-03
ZA94568B (en) 1994-09-12
US20010016191A1 (en) 2001-08-23
KR960700341A (ko) 1996-01-19
AU8197098A (en) 1998-10-15
KR100375274B1 (ko) 2003-06-11
JP2010059170A (ja) 2010-03-18
LV12642B (en) 2001-09-20
NZ513422A (en) 2002-09-27
PT2345724E (pt) 2013-08-22
US8058398B2 (en) 2011-11-15
JP2009057368A (ja) 2009-03-19
NO20093489L (no) 1995-09-28
NZ261765A (en) 1997-10-24
EP0612846B1 (en) 2000-08-16
IL108446A (en) 2003-01-12
HK1009288A1 (en) 1999-05-28
EP2345724B1 (en) 2013-07-03
EP1482045A3 (en) 2004-12-29
FI123078B (fi) 2012-10-31
CN1118572C (zh) 2003-08-20
ATE195552T1 (de) 2000-09-15
JP2006096762A (ja) 2006-04-13
CA2239360A1 (en) 1994-08-04
CN1495197A (zh) 2004-05-12
NZ314960A (en) 1999-01-28
LU92265I2 (fr) 2013-10-14
CN1970571B (zh) 2013-07-10
FI120769B (fi) 2010-02-26
NO952974L (no) 1995-09-28
EP0974655A2 (en) 2000-01-26
EP0890640A3 (en) 1999-03-24
NZ332188A (en) 2000-07-28
CN1132527A (zh) 1996-10-02
LV12642A (lv) 2001-04-20
AU697451B2 (en) 1998-10-08
ATE553199T1 (de) 2012-04-15
CA2153896C (en) 1999-01-12
US7381804B2 (en) 2008-06-03
EP0612846A1 (en) 1994-08-31
JP2006137762A (ja) 2006-06-01
EP0974655A3 (en) 2001-10-24
US5790421A (en) 1998-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100390338B1 (ko) 과립구 군체 자극 인자의 결정화 방법
AU2011201971B2 (en) G-CSF analog compositions
AU724260B2 (en) G-CSF analog compositions
AU3515001A (en) G-CSF analog compositions
AU2012201071A1 (en) G-CSF analog compositions

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120611

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130603

Year of fee payment: 11

EXPY Expiration of term