JP2004113243A - G−csf類似体組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)類似体、該類似体をを含む組成物及び関連組成物を提供する。また、その類似体をコードする核酸又は関連核酸、関連宿主細胞及びベクターを提供する。別の態様では、G−CSF及びその類似体の三次元構造を表現するためのコンピュータープログラム及び装置を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明により、G−CSFの三次元構造は原子レベルまで決定されるに至った。この三次元構造から、G−CSF分子の組成がどのように変化すると構造変化を生じるかをかなり確実に予想することができる。これらの構造特性を生物活性と相関させると、G−CSF類似体を設計及び製造することができる。
(a)G−CSF分子の各アミノ酸残基又は各アミノ酸残基の各原子等の化学的部分を相関させたG−CSF分子の三次元構造を含む情報を観察する段階と、
(b)前記情報からG−CSF分子上の被改変部位を選択する段階と、
(c)このような改変を有するG−CSF類似体分子を製造する段階と、
(d)任意に、このようなG−CSF類似体分子が所望の特性を有するか否かを試験する段階と
を含むG−CSF類似体の製造方法である。
(a)G−CSF分子の各アミノ酸残基又は各アミノ酸残基の各原子等の化学的部分と相関させたG−CSF分子の三次元構造のコンピューター表現を提供する段階と、
(b)前記情報からG−CSF分子上の被改変部位を選択する段階と、
(c)このような改変を有するG−CSF分子を製造する段階と、
(d)任意に、このようなG−CSF分子が所望の特性を有するか否かを試験する段階と
を含む、コンピューターに基づくG−CSF類似体の製造方法である。
(a)(i)G−CSF分子の座標を三次元空間に表示し且つ(ii)前記G−CSF表現の変更及びその観察のための情報を入力できるようにプログラムされたコンピューターを介してG−CSF分子の三次元構造を観察する段階と、
(b)前記G−CSF分子の前記視覚画像上の被改変部位を選択する段階と、
(c)前記コンピューターに前記改変のための情報を入力する段階と、
(d)前記コンピューターを介して前記改変G−CSF分子の三次元構造を観察する段階と、
(e)任意に段階(a)〜(e)を繰り返す段階と、
(f)前記改変を有するG−CSF類似体を製造する段階と、
(g)任意に前記G−CSF類似体が所望の特性を有するか否かを試験する段階と
を含む、G−CSF類似体の製造方法を提供する。
本発明はG−CSFの三次元構造の知見に基づく。この三次元構造は立体的に観察するためのコンピュータープログラムにより表現された。これを立体的に観察することにより、構造−機能関係を認識し、G−CSF類似体を設計及び製造した。
G−CSFの三次元全体構造
構造を確認するために使用したG−CSFは、細菌発現に付随する付加的N末端メチオニン残基を有する非グリコシル化174アミノ酸種であった。このG−CSFのDNA及びアミノ酸配列を図1に示す。
組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子(r−hu−G−CSF)の三次元構造が必要であることと、大量の精製タンパク質が入手可能であることから、不完全階乗サンプリング及び接種による結晶成長法を実施した。JancarikとKim,J.Appl.Crystallogr.24: 409(1991)に記載されている不完全階乗結晶化の実施から出発して、油滴及び複屈折凝集体を生成する溶液条件を確認した。また、自動ピペッティングシステムのソフトウェア及びハードウェアを改造して毎日約400の異なる結晶化条件を設定した。Weber,J.Appl.Crystallogr.20: 366−373(1987)。この手順により、r−hu−G−CSF結晶を生成する結晶化溶液を調製した。
新規タンパク質の結晶化条件を探索するために、CarterとCarter,J.Biol.Chem.254: 122219−12223(1979)は不完全階乗法を提案した。同氏らによると、一般に有望であるとみなされるランダムに選択された多数の結晶化条件のサンプリングにより、タンパク質結晶化をもたらす好適な試薬組み合わせが得られる。このアイデアは、JancarikとKim,J.Appl.Crystallogr.24: 409(1991)により実現され、同氏らはpH範囲、塩及び沈殿剤を考慮した初期結晶化試験のための32種の溶液を記載した。本発明では同氏らの作業を拡張し、70種までの溶液を記載する。溶液調製の人的労力及び誤差を最小限にするために、自動ピペッティング機にあわせて手法をプログラムした。
(a)(i)異なる塩濃度を各々有する塩溶液のアリコート又は(ii)異なる沈殿剤濃度を各々有する沈殿剤溶液のアリコートと所望のタンパク質の水性アリコートとを一定範囲のpHの任意存在下で結合する段階と、
(b)こうして結合したアリコートの予備結晶形成を観察し、予備結晶形態の生成に有効な前記塩もしくは沈殿剤組み合わせ及び前記pHを選択するか、又は予備結晶形態が生成されない場合には、タンパク質の前記水性アリコートのタンパク質出発濃度を増加させる段階と、
(c)前記塩又は前記沈殿剤濃度を選択後、前記選択された濃度の存在下で前に選択しなかった前記溶液を用いて段階(a)を繰り返す段階と、
(d)所望の品質の結晶が得られるまで段階(b)及び段階(a)を繰り返す段階と
を含む。
標準シリアルインターフェースを介してASCIIコードを送信するパーソナルコンピューターにより制御されるAccuflexピペッティングシステム(ICN Pharmaceuticals,Costa Mesa,CA)により、液滴及び液溜溶液を調製した。ピペッターは回転バルブにより6種の異なる溶液をサンプリングし、xy座標系内の並進を制御可能なプレートにこれらの溶液をピペット分注する。座標系の鉛直成分は液体を分配及び回収することが可能な注射器を操作する。
改造ピペッティングシステムは種々の溶液を調製するのに便利であるため、拡張不完全階乗法の実施を改善することができた。3つの変数から1つの因子の96のランダムな組み合わせを含むリストを作成するプログラムINFAC(Carterら,J.Cryst.Growth 90: 60−73(1988))を使用して「ランダム」な成分を有する結晶化溶液の新しい組合わせを展開した。即座に沈殿したカルシウムとリン酸の組み合わせを除くと、沈殿剤、塩及び緩衝液の70種の異なる組み合わせが残った。自動ピペッターを使用してこれらの組み合わせを調製し、1週間インキュベートした。混合物を検査し、沈殿を形成した溶液をより低い成分濃度で再び調製した。全ウェルから沈殿が除去されるまでこれを繰り返した。
X線品質結晶を生成する溶液を見いだすために数種の異なる結晶化ストラテジーを使用した。これらのストラテジーは、不完全階乗法の使用、連続自動格子探索(SAGS)を使用した結晶化条件の最適化、接種技術の実施、及び数百の品質結晶を一晩で生成する結晶生成手順の開発を含むものであった。特に指定しない限り、スクリーニング及びr−hu−G−CSF結晶の生成は懸垂液滴蒸気拡散法を使用した。Afinsenら,Physical principles of protein crystallization.:Eisenberg(編),Advances in Protein Chemistry 41: 1−33(1991)。
本発明の結晶接種方法は、(ここでは最適結晶成長条件を決定後に)使用した各個ウェル中の核生成開始単位数を確定する。この方法は、「種晶」の数が結晶の品質に影響し、分解能に影響するという点で有利である。本発明の接種は更に、接種を実施しない場合には成長に約3週間を要するが、接種を実施すると、G−CSF結晶は約3日で成長するという利点がある。
材料
図1に示すアミノ酸配列と比活性1.0±0.6×108U/mg(pH4.0の10mM酢酸緩衝液中で細胞マイトジェン生成アッセイにより測定)を有する濃度約3mg/mlのr−hu−G−CSFから出発して結晶学的情報を得た。YM10フィルターを使用して75psiでAmicon濃縮器を使用して溶液を濃縮した。溶液を典型的には4℃で10倍に濃縮し、数カ月貯蔵した。
懸垂液滴を使用して蒸気拡散平衡によりX線分析に適した結晶を得た。予備スクリーニングのために、(上記のように調製した)33mg/mlタンパク質溶液7μlを等容量のウェル溶液と混合し、シリコンガラスプレートに載せ、Linbro組織培養プレート(McLean,Vaに所在のFlow Laboratories)を使用してウェル溶液上に懸垂させた。全ピペッティングはAccuflexピペッターを使用して実施したが、ウェル溶液の生成後はトレーを自動ピペッターから取り外し、卓上振盪機で少なくとも10分間十分に混合した。次にLinbroトレーを再びピペッターに取り付け、ウェル溶液及びタンパク質溶液をシリコンカバースリップに加えた。次にカバースリップを裏返し、ウェル溶液1mlをシリコン油脂で覆い、密封した。
結晶化条件が最適化されたら、「生成」法を使用して結晶成長を実施した。100mM Mes(pH5.8)、380mM MgCl2、220mM LiSO4及び8%PEG 8Kを含有する結晶化溶液1リットルを調製した。エッペンドルフ注射器ピペッターを使用してこの溶液の1mlアリコートをLinbroプレートのウェルの各々にピペット分注した。この溶液50%及びG−CSF(33mg/ml)50%を含有する混合溶液を調製し、シリコンカバースリップにピペット分注した。これらの液滴の典型量は50〜100μlであり、これらの液滴の寸法が大きいため、カバースリップのめくれ上がり及び液滴のウェル懸垂に細心の注意を払った。
R−AXIS(Houston,TXに所在のMolecular Structure,Corp.)イメージングプレートデテクターで収集した2.2Åデータに対してX−PLOR(Bruniger,X−PLOR version 3.0,結晶分析システム及びNMR,New Have CTに所在のイエール大学)を用いて構造を最適化させた。
有効な組換えヒト治療剤として、r−hu−G−CSFは大量生産され、構造分析のためにグラムレベルが入手可能になっている。他の該当タンパク質が入手可能になるにつれ、本発明の結晶化方法は他の用途にも利用可能である。この方法は、大量のタンパク質(>約200mg)を有する任意の結晶学的プロジェクトに適用することができる。当業者に認識される通り、本発明の材料及び手法は変形可能であり、等価材料及び手法が他のタンパク質の結晶化に使用可能である。
添付図に示すような図はG−CSFの三次元構造を可視化するために有用であるが、分子を立体的観察を可能にするコンピュータープログラムが好適であると予想される。この立体観察は当業者には「バーチャルリアリティー」とも呼称され、高分子構造から原子レベルまで広範囲の分解能で全角度から構造を三次元形態で可視化することができる。本発明のコンピュータープログラムにより、例えば分子を回転させることにより、分子の観察角度の透視図を変更することもできる。本発明のプログラムは更に変更に応答するので、例えば完全アミノ酸残基を含む1個以上の原子画像を削除、追加もしくは置換えることができ、又は存在する基もしくは置換された基に化学的部分を付加することができ、構造変化を可視化することができる。
(a)G−CSF分子の部分の組成の表示、好ましくは各アミノ酸の三次元配置の表示、より好ましくはG−CSF分子の各原子の三次元位置の表示を含めてG−CSF分子の三次元構造を表示するための手段を前記コンピューターに備える段階と、
(b)前記表示を観察する段階と、
(c)前記分子の組成又は部分の位置の改変のための部位を前記表示上で選択する段階と、
(d)前記改変を有するG−CSF類似体を製造する段階とを含む。
本実施例は、PCT出願公開第WO85/00817号(Souzaら,1985年2月28日公開、参考資料として本明細書の一部とする)に記載の方法に従って、1本鎖バクテリオファージM13を用いる部位特異的突然変異誘発技術を使用したG−CSF類似体の調製に関する。この方法は主に非突然変異誘発配列の1本鎖核酸鋳型を使用し、配列中に所望の改変を含むより小さいオリゴヌクレオチドを前記鋳型に結合することからなる。非同一配列をハイブリダイズさせるようなハイブリダイゼーション条件を使用し、残りの配列は最初の鋳型と同一になるように充填する。その結果、2本の鎖の一方が所望の改変を含むような2本鎖分子が生成される。この突然変異誘発した1本鎖を分離し、その相補鎖の鋳型として使用する。こうして所望の改変を含む2本鎖分子を生成する。
本実施例は、DNA増幅技術を用いたG−CSF類似体の製造方法に関する。主に、各類似体をコードするDNAを別個の2部分として増幅して結合した後、完全配列を増幅した。改変前のG−CSF DNAのどの場所に所望の改変を加えるべきかに依存して、内部プライマーを使用して改変を組み込み、2つの別個の増幅部分を生成した。例えば、所望の類似体DNAの5’末端を増幅するためには、増幅すべき領域の一端には(改変前のG−CSF DNAの上流のプラスミドの配列に相補的な)5’フランキングプライマーを使用し、他方の末端をプライムするためには、改変前のDNAとハイブリダイズすることが可能でありながら所望の改変を含み得る内部プライマーを使用した。得られた増幅領域は5’フランキングプライマーから内部プライマーに及ぶ領域であっだ。(改変前のG−CSF DNAの下流のプラスミドの配列に相補的な)3’フランキングプライマーと所期突然変異の領域に相補的な内部プライマーを使用して3’末端も同様に処理した。(内部プライマーの位置に依存して同一寸法でもよいし、同一寸法でなくてもよい)2つの「半部分」を増幅後、2つの「半部分」を結合した。結合後、5’フランキングプライマーと3’フランキングプライマーを使用して所望の改変を含む完全配列を増幅した。
G−CSF類似体Gln12.21→Glu12.21を製造するために、DNA増幅を2回別々に実施し、2つのDNA突然変異体を製造した。使用した鋳型DNAは図1の配列に(G−CSFコーディング領域を含むプラスミドからの)所定のフランキング領域を加えたものである。厳密な配列は下記の通りである。Perkin Elmer/Cetus DNA熱サイクラーを使用して2つのDNA増幅反応の各々を実施した。40μl反応混合物は、1×PCR緩衝液(Cetus)、4dXTP(Cetus)各0.2mM、各プライマーオリゴヌクレオチド50pmol、(プラスミドベクター上の)G−CSF鋳型DNA2ng及びTaqポリメラーゼ(Cetus)1単位から構成した。増幅プロセスは30サイクル実施した。各サイクルは94℃で1分間、50℃で2分間、72℃で3分間から構成した。
次にG−CSF類似体DNAをプラスミドベクターに挿入し、大腸菌株FM5(ATCC#53911)を形質転換させるために使用した。プラスミド上及び細菌宿主細胞中に含まれる本発明のG−CSF類似体DNAは、Rockville,MDに所在のAmerican Type Culture Collectionから入手可能であり、その受託番号は以下に示す。
遠心分離(10,000×G,20分間,4℃)により細胞を回収した。ペレット(通常は5g)を1mM DTT30mlに再懸濁し、10,000psiのフレンチプレスセルに3回通した。破壊した細胞懸濁液を10,000gで30分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを水30〜40mlに再懸濁した。これを10,000×Gで30分間再遠心分離し、このペレットを2% Sarkosyl及び50mM Tris(pH8)25mlに溶解させた。硫酸銅を濃度40μMまで加え、混合物を少なくとも15時間15〜25℃で撹拌した。次いで混合物を20,000×Gで30分間遠心分離した。得られた可溶化タンパク質混合物を13.3mM Tris(pH7.7)で4倍に希釈し、Sarkosylを除去した後、20mM Tris(pH7.7)で平衡化したDEAE−セルロース(Whatman DE−52)カラムに上清を充填した。カラム充填及び同一緩衝液でカラムを洗浄後、類似体を20mM Tris/NaCl(下記のように類似体に依存して35mM〜100mM)(pH7.7)で溶離した。類似体のほとんどはDEAEカラムからの溶出液を50%酢酸でpH5.4に調整し、必要に応じて(適正な導電率を得るために)5mM酢酸ナトリウム(pH5.4)で希釈した。次に20mM酢酸ナトリウム(pH5.4)で平衡化したCM−セファロースカラムに溶液を充填した。次いで280nmの吸光度がほぼ0になるまでカラムを20mM NaAc(pH5.4)で洗浄した。次いでG−CSF類似体を下表4に記載する濃度の酢酸ナトリウム/NaClで溶離した。CM−セファロースカラムに充填しなかった類似体のDEAEカラム溶出液を10mM NaAc(pH4.0)緩衝液で直接透析した。次いで精製G−CSF類似体をin vitro分析のために適宜単離した。類似体の溶離に使用した塩濃度は上述のように変化させた。DEAEセルロースカラム及びCM−セファロースカラムの濃度を下表に示す
**これらの類似体ではDEAEセルロースカラムを単独で精製に使用した。
本発明のG−CSF類似体をどの方法で製造したかに関係なく、類似体の生物活性をアッセイした。3H−チミジンアッセイを実施して細胞分裂度を確認した。他の生物アッセイを使用して所望の活性を確認することもできる。マウスWEHI−3B(D+)白血病細胞系に末端分化を誘導する能力をアッセイする等の生物アッセイによりG−CSF活性を得ることもできる。Nicolaら,Blood 54: 614−27(1979)参照。生物活性を確認するために他のin vitroアッセイも使用できる。Nicola,Annu.Rev.Biochem.58: 45−77(1989)参照。一般に、生物活性試験では(非改変G−CSFと比較した)生物活性の増加又は低下、(非改変G−CSFと比較した)生物活性の相違、レセプターアフィニティー分析又は血清半減期分析等の所望の結果を分析すべきである。これらの例に止まることなく、当業者は所望の最終結果の試験に有用な他のアッセイにも想到しよう。
類似体の精製サンプルで高圧液体クロマトグラフィーを実施した。逆相HPLCカラム上のピークの位置は2種のタンパク質間の構造類似を決定的に示すものではないが、類似の保持時間を有する類似体はHPLCカラムに対して非改変分子と同一型の疎水性相互作用を有し得る。これは全体構造の類似を示す1面である。
上記生物アッセイ及びHPLC分析の結果を以下に示す。生物活性は3回のデータの平均であり、対照標準(非改変G−CSF)の百分率として示す。相対HPLCピーク位置は対照標準(非改変G−CSF)ピークに対する類似体G−CSFの位置である。+又は−の記号は、類似体HPLCピークが対照標準ピークよりも(何分)先又は後に現れるかを示す。変異体の全部について相対HPLCピークを分析した訳ではなく、分析したもののみを下表に示す。上記のように調製した本発明の類似体をコードする核酸を含む大腸菌宿主細胞のAmerican Type Collection番号も示す。
本発明の類似体を設計するために使用した第1段階は、G−CSF分子の構造完全性にどの部分が必要であるかを決定することであった。これはアミノ酸残基レベルで実施したが、原子レベルも分析に利用できる。構造完全性に必要な残基を修飾すると、G−CSF分子の全体構造が変化する。これは製造しようとする類似体に依存して望ましい場合と望ましくない場合がある。本実施例は、G−CSFレセプター(本項で以下に記載する「G−CSFレセプター」は造血細胞に存在する天然G−CSFレセプターを意味する)への類似体のG−CSFレセプター結合を維持する目的で、G−CSF分子の全体構造完全性を維持するように設計した。G−CSFレセプター結合は上記生物アッセイにより決定されるような少なくとも1種の生物活性に必要な段階であると仮定され、本試験により確認された。
Claims (18)
- (a)図1のアミノ酸配列中の1以上のリジン残基が他のアミノ酸残基で置換されており、(b)αヘリックス間の1以上のループ領域が1以上のリジンを含むように改変されている点で図1のアミノ酸配列と相違するアミノ酸配列を有する生物学的に活性なG−CSF類似体。
- 第17位のリジンがアルギニンで置換されている請求項1に記載の生物学的に活性なG−CSF類似体。
- 第35位のリジンがアルギニンで置換されている請求項1または2に記載の生物学的に活性なG−CSF類似体。
- 第41位のリジンがアルギニンで置換されている請求項1、2または3に記載の生物学的に活性なG−CSF類似体。
- ABループが1以上のリジンを含むように改変されている請求項1、2、3または4に記載の生物学的に活性なG−CSF類似体。
- BCループが1以上のリジンを含むように改変されている請求項1、2、3、4または5に記載の生物学的に活性なG−CSF類似体。
- CDループが1以上のリジンを含むように改変されている請求項1、2、3、4、5または6に記載の生物学的に活性なG−CSF類似体。
- 前記改変が1つのアミノ酸をリジンに置換することを含む請求項5、6または7に記載の生物学的に活性なG−CSF類似体。
- ハイブリッドタンパク質であって、前記改変が他のタンパク質の一部または全部を含むことを特徴とする請求項5、6または7に記載の生物学的に活性なG−CSF類似体。
- 改変中のリジンが少なくとも1分子のポリエチレングリコール分子を含むことを特徴とする請求項5、6、7、8または9に記載の生物学的に活性なG−CSF類似体。
- 分子の三次元構造を表示するためのコンピューターに基づく装置であって、該分子の三次元構造のX線結晶座標を入力するためのコンピュータープログラムおよび該三次元構造を表示する手段を含み、G−CSF類似体の設計のためにG−CSF分子の三次元構造を該G−CSF分子の組成と相関させるための手段を含む前記装置。
- G−CSF部分とタンパク質部分を含むG−CSFハイブリッド分子であって、(a)該G−CSF部分が、(i)図4に示すヘリックスA、B、CおよびDのG−CSF内部核であって、該内部核へリックスが配列番号2に示す対応するアミノ酸残基を含むG−CSF内部核、(ii)配列番号2に示す対応するアミノ酸残基を含むへリックスAおよびB間の外部ループ、(iii)配列番号2に示す対応するアミノ酸残基を含むヘリックスBおよびC間の外部ループ、(iv)へリックスDおよびA間の外部ループ、および(v)N末端およびC末端であって、該N末端はヘリックスDに連結し、該C末端はヘリックスCに連結しており、該N末端とC末端はそれぞれ配列番号2のアミノ酸120−146の部分を含むN末端およびC末端を含み、(b)前記タンパク質部分が(v)のアミノ酸に連結していることを特徴とするG−CSFハイブリッド分子。
- 前記タンパク質部分がサイトカインまたは造血因子である請求項12に記載のG−CSFハイブリッド。
- サイトカインがインターロイキンである請求項13に記載のG−CSFハイブリッド。
- (b)のタンパク質部分が、リンカーを介して(v)のアミノ酸に連結している請求項12に記載のG−CSFハイブリッド。
- 前記ハイブリッド分子がN末端メチオニル残基を有する請求項12、13、14または15に記載のG−CSFハイブリッド。
- (i)の配列番号2の第18位のシステイン残基がセリンまたはアラニン残基に置換されている請求項12、13、14または15に記載のG−CSFハイブリッド。
- 請求項17に記載のG−CSFハイブリッド分子および医薬上許容される担体を含む組成物。
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