PT612846E - Composicoes de analogos do fec-g e metodos - Google Patents

Description

Descrição “Composições de análogos do FEC-G e métodos*’

Campo da Invenção A presente invenção refere-se aos análogos do factor estimulador das colónias de granulócitos (FEC-G, o mesmo que G-CSF).

Antecedentes A hematopoiese é regulada por dois sistemas: as células contidas no microambiente da medula óssea e os factores de crescimento. Os factores de crescimento, também designados por factores estimuladores de colónias, estimulam as células progenitoras empenhadas no processo, levando-as a proliferarem e a formarem colónias de hematócitos que se vão diferenciar. Um destes factores é o factor estimulador de colónias de granulócitos, aqui designado por FEC-G, que estimula preferencialmente o crescimento e o desenvolvimento dos neutrófílos, o que significa que tem uma utilidade potencial em doenças neutropénicas. Welte et al, PMAS-USA 82: 1526-1530 (1985); Souza et al, ‘Science’ 232: 61-65 (1986) e Gabrilove, ‘J. Seminars in Hematology’ 26: (2) 1-14 (1989).

Nos seres humanos o FEC-G endógeno é detectável no plasma sanguíneo. Jones et al, ‘Bailliere's Clinicai Hematology’ 2 (1): 83-111 (1989). O FEC-G é produzido pelos fibro-blastos, macrófagos, trofoblastos das células T, células endoteliais e células epiteliais e é o produto das expressão de um gene de uma só cópia constituído por quatro exões e cinco intrões localizados no décimo sétimo cromossoma. A transcrição deste locus produz uma 2 espécie de ARNm que é modificado diferencialmente, dando origem a duas formas de ADNm do FEC-G, codificando uma das verdes uma proteína de 177 aminoácidos e codificando a outra versão uma proteína de 174 aminoácidos, Nagata, et αί, ΈΜΒΟ J’ 5: 575-581 (1986), tendo sido comprovado que a forma constituída pelos 174 aminoácidos possui a maior actividade biológica específica in vivo. O FEC-G é interreactivo entre espécies, de tal forma que ao ser administrado o FEC-G humano a um outro mamífero, tal como um murganho, um canino ou um macaco, é eduzida uma leucocitose persistente dos neutrófilos. Moore et ai, PNAS-USA 84: 7134-7138 (1987). O FEC-G humano pode ser obtido e purificado a partir de inúmeras fontes. O FEC-G humano natural (FEC-Ghn, o mesmo que nhG-CSF) pode ser isolado a partir dos sobrenadantes de linhagens de células tumorais humanas criadas em cultura. O desenvolvimento da tecnologia do ADN recombinante, conforme explicado, por exemplo, na patente de invenção norte--americana n° 4 810 643 (Souza), documento que aqui se considera incorporado por referência, veio permitir a produção, à escala comercial, de quantidades de FEC-G numa forma glicosilada enquanto produto da expressão de células de hospedeiros eucarióticos e a produção de FEC-G numa forma não glicosilada enquanto produto da expressão de células de hospedeiros pro-carióticos.

Verificou-se que o FEC-G é útil no tratamento de casos em que seja benéfico um aumento de neutrófilos. Por exemplo, no caso dos pacientes com cancro, o FEC-G é benéfico como meio para estimular de forma selectiva a produção de neutrófilos para compensar o défice hematopoiético resultante da quimioterapia ou da radioterapia. Também podem ser prescritos para o tratamento de diversas doenças infecciosas e estados patológicos congéneres, tais como a sépsis que é tipicamente provocada por um metabolito de origem bacteriana. O FEC-G também é útil quando utilizado por si só ou em combinação com outros compostos, tais como outras citoquinas, para induzir o crescimento ou a multiplicação de células em cultura, por exemplo, para o transplante de medula óssea A transdução de sinal, que é a via pela qual o FEC-G participa no metabolismo celular, não é ainda um processo perfeitamente conhecido. O FEC-G liga-se a um receptòr da superfície celular que inicia aparentemente as modificações dentro de células progenitoras particulares, levando à diferenciação celular. Foram já descritos diversos FEC-G modificados. De um modo geral, para a concepção de fármacos, sabe-se que há determinadas modificações que conferem determinados efeitos estruturais. Por exemplo, a supressão de uma cisterna poderia originar o desdobramento de uma molécula que no seu estado inalterado se encontra normalmente entrelaçada por uma ponte dissulfureto. Há outros métodos conhecidos para acrescentar, suprimir ou substituir aminoácidos com o intuito de se modificar a função de uma proteína.

Foram já produzidos mutantes dos FEC-G humanos recombinantes, mas o método para a sua preparação não inclui informação geral sobre a relação entre estrutura/função. Por exemplo, foram já descritas a mutação e a modificação bioquímica de Cis 18. Kuga et al., ‘Biochem. Biophy. Res. Comm.’ 159: 103-111 (1989); Lu et al., ‘Arch. Biochem. Biosphys.’ 268:81-92(1989).

Na patente de invenção norte-americana n° 4 810 643, com o título “Produção do Factor Estimulador de Colónias de Granulócitos Pluripotentes” (“Production of Pluripotent Granulocyte Colony Stimulating Factor”), (citada supra) são descritos genericamente análogos de polipeptidos e fragmentos peptídicos do FEC-G. Os análogos específicos do FEC-G descritos são aqueles em que os resíduos cisterna nas posições 17, 36,42,64 e 74 (das espécies de 174 aminoácidos ou daquelas que possuem 175 aminoácidos, sendo o aminoácido adicional o resíduo metionina do terminal N) são substituídos com outro aminoácido (tal como o resíduo serina) e ainda os FEC-G com um resíduo alanina na primeira posição (terminal N). O documento EP 0 335 423, com o título “FEC-G Humanos Modificados” (”Modified Human G-CSF’) descreve com rigor a modificação de um grupo amino pelo menos num polipeptido que possui actividade de FEC-Gh. O documento EP 0 272 703 com o título “Novos Polipeptidos” (“Novel Polypeptide”) descreve a preceito derivados de FEC-G que possuem um aminoácido substituído ou suprimido no terminal N ou “na sua vizinhança”. O documento EP 0 459 630, com o título “Polipeptidos” (“Polypeptides”) descreve com minúcia derivados de FEC-G que ocorrem naturalmente e que possuem pelo menos uma das propriedades biológicas dos FEC-G que ocorrem naturalmente e uma estabilidade em solução que é pelo menos de 35% para a concentração de 5 mg/mL, em que os derivados possuem pelo menos um resíduo Cis da sequência natural substituído por um resíduo Ser e possuem um resíduo Asp27 da sequência natural substituído por um resíduo Ser27. O documento EP 0 256 843, com o título “Expressão do FEC-G, Suas Muteínas e Suas Utilizações” (“Expression of G-CSF and Muteins Thereof and Their Uses”) descreve convenientemente uma sequência de ADN modificado que codifica o FEC-G, em que o terminal N é modificado para uma expressão destacada da proteína em células hospedeiras recombinante, sem nenhuma modificação da sequência de aminoácidos da proteína. O documento EP 0 243 153 com o título “Expressão das Proteínas do FEC-G Humano” (“Human G-CSF Protein Expression”) descreve adequadamente os FEC-G que irão ser modi- ficados inactivando pelo menos um local de transformação da protease de levedura KEX2 para que haja um aumento do rendimento na produção recombinante, utilizando levedura. A patente de invenção norte-americana n° 4 904 584 de Shaw, com o título “Modificação de Polipeptidos, Homogénea e Específica do Local” (“Site-Specific Homogeneous Modification of Polypeptides”) descreve perfeitamente proteínas modificadas pelo resíduo lisina. O documento WO/9012874 descreve adequadamente variantes de proteínas modificadas pelo resíduo cisteína. O pedido de patente de invenção australiana n° AU-A-10948/92, com o título “Activação Aperfeiçoada de Proteínas Recombinantes” (“Improved Activation of Recombinant Proteins”) descreve na perfeição a adição de aminoácidos a qualquer dos terminais da molécula de FSC-G com a finalidade de ajudar a entrelaçar a molécula após a expressão procariótica. O pedido de patente de invenção australiana n° AU-A-76380/91 com o título “Muteínas do Factor Estimulador de Colónias de Granulócitos (FEC-G)” (“Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)”) descreve convenientemente muteínas do factor estimulador de colónias de granulócitos (FEC-G) na sequência Leu-Gli-His-Ser-Leu-Gli-De na posição 50-56 do FEC-G com 174 aminoácidos e na posição 53-59 do FEC-G com 177 aminoácidos, e/ou pelo menos um dos quatro resíduos histidina nas posições 43, 79, 156 e 170 do FEC-G maduro (perfeitamente desenvolvido) com 174 aminoácidos ou nas posições 46, 82, 159 ou 173 do FEC-G maduro com 177 aminoácidos. O documento GB 2 213 821 com o título “Gene Sintético do Factor Estimulador de Colónias de Granulócitos Humanos” (“Synthetic Human Granulocyte Colony Stimulating Factor Gene”) descreve com minúcia uma sequência sintética de ácido nucleico que codifica o FEC-G que incorpora locais de restrição, para facilitar a mutagenese da cassete de regiões seleccionadas, e locais de restrição de flanqueamento, para facilitar a incorporação do gene num sistema desejado de expressão. Há um apontamento, v.g. no documento EP 344 796, que aborda o relativo grau de cristalização do FEC-G, tendo a estrutura global do FEC-G sido sujeita a conjecturas e inferida, mas apenas por alto. Bazan, ‘Immunology Today’ JJ_: 350-354 (1990): Pany et ai, ‘J. Molecular Recognition’ 8: 107-110 (1988). Até ao momento presente não houve mais nenhuma descrição sobre a estrutura geral do FEC-G nem foram realizados estudos sistemáticos sobre a relação entre a estrutura geral e a função da molécula, estudos esses que são essenciais para se conceber e projectar de forma sistemática análogos do FEC-G. Assim sendo, é necessário que haja um método para se conceber e projectar de foima sistemática análogos do FEC-G e para a preparação das composições resultantes.

Descrição abreviada da invenção A estrutura tridimensional do FEC-G foi agora determinada ao nível atómico. A partir desta estrutura tridimensional é possível agora antever com um grau de certeza substancial o modo como as alterações na composição de uma molécula de FEC-G podem dar origem a modificações estruturais. Estas características estruturais podem ser correlacionadas com a actividade biológica para efeitos de concepção e de produção de análogos de FEC-G.

Embora outros autores tivessem especulado a propósito da estrutura tridimensional do FEC-G, Bazan, ‘Immunology Today’, J_l: 350-354 (1990) e Pany et al., ‘J. Molecular Recognition’ 8: 107-110 (1988), tais especulações não serviram para nada àqueles que pretenderam preparar a análogos do FEC-G, ou porque a estrutura inferida por meio de conjecturas estivesse incorrecta (Pany et ai, supra) e/ou porque a estrutura inferida por meio de conjecturas não pormenorizava nenhuma correlação entre os radicais constituintes e a estrutura. A presente determinação da estrutura tridimensional ao nível atómico é, sem duvida alguma, a análise mais completa até hoje realizada e proporciona informação importante a todos quantos pretendam conceber e preparar análogos do FEC-G. Por exemplo, a partir da presente análise estrutural tridimensional foram determinadas as zonas exactas de hidrofobidade e de hidrofíhdade. A hidrofobidade relativa é importante, posto que diz respeito directamente à estabilidade da molécula. De um modo geral, as moléculas biológicas existentes em ambientes aquosos são extemamente hidrófilas e intemamente hidrófobas; de acordo com a segunda lei da termodinâmica, este é o estado energético mais baixo e que confere estabilidade. Embora se tenha especulado sobre a hipótese de núcleo interno do FEC-G poder ser hidrófobo e as zonas exteriores poderem ser hidrófilas, nunca houve forma de se conhecer zonas específicas hidrófobas ou hidrófilas. Munidos do conhecimento actual respeitante as zonas de hidrofobidade/hidrofilidade, é possível antever com um grau de certeza substancial quais as modificações da molécula do FEC-G que irão afectar a estrutura geral da molécula.

Como regra geral, é possível recorrer ao conhecimento da geografia das regiões hidrófobas e hidrófilas para conceber e projectar análogos em que a estrutura geral do FEC-G não é alterada, mas em que a modificação afecte realmente a actividade biológica (sendo a expressão “actividade biológica” aqui utilizada no seu sentido mais amplo para designar uma função). É possível correlacionar a actividade biológica com a estrutura. Se a estrutura não tiver sido modificada e se a mutação não tiver nenhum efeito sobre a actividade biológica, então a mutação não tem nenhuma função biológica. No entanto, se a estrutura não tiver sido modificada e se a mutação afectar realmente a actividade biológica, então o resíduo (ou átomo) é essencial, pelo menos para uma função biológica. Alguns dos presentes exemplos experimentais foram concebidos para que não houvesse nenhumas modificações na estrutura geral, se bem que houvesse uma modificação na função biológica.

Com base na correlação entre estrutura e actividade biológica, a presente invenção estuda e descreve análogos do FEC-G. Estes análogos são moléculas que possuem resíduos aminoácidos a mais, a menos, diferentes ou modificados, comparativamente com a sequência de aminoácidos do FEC-G. As modificações podem ser obtidas por adição, substituição ou supressão de um ou vários resíduos aminoácidos. A modificação pode ser uma adição ou uma substituição de análogos dos próprios aminoácidos, tais como peptidomiméticos ou aminoácidos com radicais modificados, tais como grupos laterais modificados. O FEC-G utilizado como base de comparação pode ser de origem humana ou animal ou obtido por meio da tecnologia do ácido nucleico recombinante (embora os exemplos experimentais aqui descritos tenham por base a produção recombinante das espécies de 174 aminoácidos do FEC-G humano, possuindo a mais um resíduo metionilo no terminal N). Os análogos podem ter funções diferentes das funções da molécula natural do FEC-G humano, ou podem ter as mesmas funções ou ainda graus variáveis das mesmas funções. Por exemplo, os análogos podem ser concebidos e projectados para terem uma actividade biológica mais elevada ou mais baixa, um período de armazenamento mais duradouro ou uma menor estabilidade, para serem de formulação mais fácil ou mais difíceis de serem combinados com outros ingredientes. Os análogos podem não ter nenhuma actividade hematopoiética e por esse motivo podem ser úteis como antagonistas contra o efeito do FEC-G (por exemplo, nos casos em que haja uma produção excessiva de FEC-G). De vez em quando, e por razões de conveniência, os análogos da presente invenção recebem aqui a designação de proteínas ou péptidos, mas também aqui estão contemplados outros tipos de moléculas, tais como moléculas peptido-miméticas ou péptidos modificados por via química. De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção descreve composições congéneres que contêm um análogo de FEC-G como ingrediente activo. A expressão “composição congénere”, tal como aqui utilizada, designa uma composição que pode ser obtida logo que confirmada a identidade do análogo do FEC-G (tal como um análogo de FEC-G marcado com um marcador detectável, um receptor conotado ou uma composição farmacêutica). Também se considera como composições congéneres as versões quimicamente modificadas dos análogos de FEC-G, tais como aqueles aos quais esteja acoplada pelo menos uma molécula de polietileno-glicol.

Por exemplo, é possível preparar um análogo de FEC-G ao qual é acoplado um marcador detectável, tal como uma molécula fluorescente, quimioluminescente ou radioactiva.

Outro exemplo é uma composição farmacêutica que pode ser formulada por meio de técnicas conhecidas, utilizando materiais conhecidos, ver v.g., ‘Remington’s Pharmaceutical Sciences’, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 18042), páginas 1435--1712, obra que aqui se considera incorporada por referência. De um modo geral, a formulação vai depender de inúmeros factores, tais como a via de administração, a estabilidade, os parâmetros de produção e outros. O análogo de FEC-G pode ser administrado por injecção ou pode ser administrado aos pulmões por inalação. Também são concebíveis formas de dosagem entéricas para as composições dos análogos de FEC-G da presente invenção e consequentemente a administração por via oral pode ser eficaz. Os análogos de FEC-G podem ser incorporados em lipossomas ou noutros microveículos para efeitos de administração e podem ser formulados em geles ou noutras composições de libertação prolongada. Embora as composições preferenciais possam variar em função da utilização que 10 10

lhes está destinada, no caso dos análogos de FEC-G que possuam pelo menos uma das actividades biológicas dos FEC-G naturais, as composições farmacêuticas preferidas são geralmente as preparadas para injecção subcutânea ou para administração pulmonar por inalação, embora as formulações particulares para cada tipo de administração dependam das características do análogo.

Outro exemplo de uma composição congénere é um receptor para um análogo da presente invenção. Tal como aqui utilizado, o termo “receptor” designa um radical que se bga de forma selectiva à molécula do análogo da presente invenção. Por exemplo, é possível

•I utilizar como receptores anticorpos ou os seus fragmentos ou “anticorpos recombinantes” (ver Huse et al, ‘Science’ 246: 1275 (1989)). A expressão ‘hgação selectiva’ significa não só uma bgação específica (embora aqui estejam contemplados os receptores específicos da Hgação), mas também significa que a Hgação não é um fenómeno aleatório. Os receptores podem estar sobre a superfície da célula ou podem ser intracelulares ou extracelulares e podem actuar de modo a realizarem, inibirem ou localizarem a actividade biológica dos análogos da presente invenção. A Hgação ao receptor também pode ser um mecanismo que desencadeie uma sequência de actividade em cascata indirectamente relacionada com o próprio análogo. A presente invenção contempla também os ácidos nucleicos, os vectores que contenham tais ácidos nucleicos e as células hospedeiras que contenham os ácidos nucleicos que codifiquem tais receptores.

Um outro exemplo de uma composição congénere é um análogo de FEC-G com um radical químico acoplado. De um modo geral, a modificação química pode alterar a actividade biológicã ou as propriedades antigénicas de uma proteína, ou pode alterar outras características, devendo tais factores ser tomados em consideração pelos especialistas na matéria. Conforme

11 se disse antes, um exemplo de um tal radical químico é o polietileno-glicol. A modificação pode ser a adição de uma ou várias células poliméricas hidrófilas ou hidrófobas, moléculas de ácidos gordos ou moléculas de polissacáridos. Como exemplos de modificadores químicos refere-se os seleccionados entre polietileno-glicol, alquil-propileno-glicóis, Dl-poliaminoácidos, polivinil-pirrolidona, álcool polivinílico, copolímeros de pirano, ácido acético/acilação, ácido propiónico, ácido palmítico, ácido esteárico, dextrano, carboximetil-celulose, polulano ou gelose. Ver, Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (Maio de 1992) (publicado por Mediscript, Mountview Court, Friem Barnet Lane, London N20 OLD, UK). A modificação química também pode compreender uma outra proteína ou uma sua parcela, a utilização de um agente citotóxico ou um anticorpo. A modificação química também pode compreender a lecitina.

De acordo com outro dos seus aspectos, o texto presente descreve ácidos nucleicos que codificam tais análogos. Os ácidos nucleicos podem ser os ADN ou os ARN ou os seus derivados e irão ser, de forma típica, clonados ou expressos num vector, tal como um fago ou plasmídeo que contenha sequências reguladoras adequadas. Os ácidos nucleicos podem ser marcados (por exemplo, utilizando um marcador radioactivo, quimioluminescente ou fluorescente), por exemplo, para fins de diagnóstico ou de prognóstico. A sequência de ácido nucleico pode ser optimizada para efeitos de expressão, por exemplo, pode conter codões preferenciais para efeitos de expressão bacteriana. Também estão contemplados o ácido nucleico e a sua cadeia complementar e ainda as suas modificações que não impeçam a codificação do análogo pretendido.

De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção refere-se às células hospedeiras que contenham os ácidos nucleicos referidos supra que codifiquem os análogos agora revelados. As células hospedeiras podem ser eucariótícas ou procaiiótícas e os sistemas de expressão podem compreender passos complementares referentes ao acoplamento (ou destinados a evitar) de grupos açúcar (ghcosilação), o entrelaçamento adequado da molécula, a adição ou a supressão de sequência líderes ou outros factores associados à expressão recombinante.

De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção refere-se aos ácidos nucleicos anti-sentido que sirvam para evitar ou modificar o tipo ou a quantidade de expressão de tais sequências de ácidos nucleicos. Podem ser preparados por métodos conhecidos.

De acordo com outro dos aspectos da presente invenção, os ácidos nucleicos que codifiquem uma análogo dos agora revelados podem ser utilizados para efeitos de terapia gémea, por exemplo, introduzindo num beneficiário um vector que contenha a sequência que codifica o análogo, de tal modo que o próprio ácido nucleico seja expresso dentro do beneficiário que esteja a necessitar da composição do análogo. O vector pode ser colocado em primeiro lugar num veículo, por exemplo, uma célula, e depois o veículo ira ser introduzido no beneficiário. Tal expressão pode ser localizada ou sistémica. Como exemplos de outros veículos refere-se aqueles que possam ocorrer de forma não natural, tais como hpossomas ou outros microveículos ou partículas com capacidade para mediarem a transferencia de genes para um beneficiário. A presente invenção também propicia programas informáticos para a expressão (por exemplo, para permitir visualizar) a estrutura tridimensional do FEC-G ou de um seu análogo, e também um programa informático que exprima a identidade de cada constituinte de uma molécula de FEC-G e a localização exacta desse constituinte dentro da estrutura global, indo até ao nível atómico. Apresenta-se mais adiante um exemplo de um desses programas.

Presentemente há disponíveis inúmeros programas informáticos para a expressão da estrutura tridimensional de uma molécula. De um modo geral, estes programas prevêem a introdução das coordenadas para a estrutura tridimensional de uma molécula (isto é, por exemplo, a atribuição de um valor numérico a cada átomo de uma molécula do FEC-G segundo os eixos coordenados x, y e z), meios para exprimir (por exemplo, mostrar visualmente) tais coordenadas, meios para alterar tais coordenadas e meios para exprimir uma imagem de uma molécula em que tais coordenadas tenham sido alteradas. É possível programar informação cristalográfica, isto é, as coordenadas da localização dos átomos de uma molécula de FEC-G no espaço tridimensional, em que tais coordenadas tenham sido obtidas por análise cristalográfica da referida molécula de FEC-G, segundo programas que permitam gerar uma aplicação informática para a expressão (por exemplo, para visualizar) da estrutura tridimensional do FEC-G. Assim a invenção proporciona também um programa informático para a expressão da estrutura tridimensional de um análogo do FEC-G. É preferível o programa informático ‘Insight Π’, versão 4, que pode ser obtido em “Biosym”, San Diego, Califórnia, com as coordenadas dadas a conhecer na figura 5. A melhor forma de visualização consiste em utilizar um computador ‘Silicon Graphics 320 VGX’, com óculos de tipo ‘Ciystal Eyes’ (também fornecidos por “Silicon Graphics”), que permitem observar estereoscopicamente a molécula de FEC-G ou o seu análogo. Em alternativa, as presentes coordenadas cristalográficas do FEC-G e os correspondentes valore numéricos de difiacção também estão depositados no banco de dados de proteínas do departamento de química do Laboratório Nacional de Brookhaven, Upton, Nova Iorque 119723, E.U.A.. Estes valores numéricos podem ser utilizados para a preparação de um programa informático diferente para traduzir a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G ou de um seu análogo. Assim sendo, de acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um programa informático para traduzir a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G. Também está previsto o referido programa informático para permitir visualizar a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G e o programa em causa ainda pode ter uma configuração que permita alterar tal visualização. A invenção proporciona também o aparelho útil para representar tal programa informático, em particular para visualizar a imagem da referida estrutura tridimensional, obtida por meio de um computador, de uma molécula de FEC-G ou de um seu análogo e proporciona ainda os meios para a preparação do referido programa informático e do referido aparelho. O programa informático é útil para a preparação dos análogos de FEC-G, uma vez que permite que se faça a selecção de locais específicos da molécula de FEC-G para efeitos de alteração e determinação imediata do efeito que tal alteração irá ter na estrutura global da molécula de FEC-G. A selecção do referido local, para efeitos de alteração, vai depender da característica biológica desejada do análogo de FEC-G. No caso de se pretender modificar aleatoriamente a referida molécula de FEC-G (FEC-G-hu-met-r, o mesmo que r-met-hu-G-CSF), seriam possíveis 17520 substituições e ainda seriam possíveis mais análogos em que houvesse modificações, adições ou supressões múltiplas. Graças ao facto de se ver a estrutura tridimensional que está correlacionada com a composição da molécula, a escolha dos locais de alteração deixa de ser um fenómeno aleatório, podendo os locais de alteração ser determinados racionalmente.

Conforme foi explicado antes, a identidade da estrutura tridimensional do FEC-G, incluindo a colocação de cada constituinte, de forma minuciosa, até ao nível atómico, veio agora proporcionar informação que permite concluir quais os radicais que são necessários para se manter a estrutura global da molécula de FEC-G. Assim, é possível escolher se se deve manter a estrutura global da molécula de FEC-G, ao preparar um análogo de FEC-G da presente invenção, ou se se deve modificar (e a forma de o fazer) a estrutura global da molécula de FEC-G ao preparar um análogo de FEC-G da presente invenção. De forma facultativa, uma vez preparado tal análogo, é possível testá-lo para se pesquisar uma características desejada.

Por exemplo, é possível procurar conservar a estrutura global de uma molécula FEC-G natural não alterada ou recombinante. A estrutura global está representada nas figuras 2, 3 e 4 e está descrita minuciosamente infra. A conservação da estrutura global pode garantir eventualmente a ligação ao receptor, que é uma característica interessante para um análogo que possua as aptidões hematopoiéticas do FEC-G natural (se não houver ligação ao receptor, não ha tradução do sinal em consequência da presença do análogo). Está previsto o caso em que uma das classes dos análogos de FEC-G possui a estrutura nuclear tridimensional de uma molécula de FEC-G natural ou recombinante (não alterado), se bem que possua características diferentes, tais como uma aptidão maior para estimular os neutrófilos selectivamente. Uma outra classe de análogos de FEC-G é constituída por aqueles que possuem uma estrutura global diferente que diminui a aptidão de uma molécula de um análogo do FEC-G para se ligar a um receptor do FEC-G e que possui uma menor aptidão para estimular os neutrófilos de forma selectiva, comparativamente com o FEC-G recombinante ou natural não alterado.

Por exemplo, sabe-se agora quais são os radicais existentes nas regiões internas de uma molécula de FEC-G que são hidrófobos e correspondentemente sabe-se quais são os radicais existentes na parte externa da molécula de FEC-G que são hidrófilos. Sem se conhecer a estrutura tridimensional global, de preferência ao nível atómico, tal como consta da presente invenção, não seria possível prever quais as alterações nessas zona interna hidrófoba que daria origem a uma modificação na conformação estrutural global da molécula. Uma modificação estrutural global pode dar origem a uma modificação funcional, por exemplo, falta de ligação ao receptor e consequentemente uma diminuição da actividade biológica, tal como existe no FEC-G não alterado. Uma outra classe de análogos de FEC-G é pois constituída pelos análogos de FEC-G que possuem a mesma hidrofobidade do FEC-G recombinante ou natural (não alterado). Mais particulaimente, há uma outra classe de análogos de FEC-G que possuem os mesmos radicais hidrófobos contidos nos quatro feixes helicoidais do seu núcleo interno correspondentes aos radicais hidrófobos existentes num FEC-G recombinante ou natural (não alterado), se bem que tenha uma composição diferente desse FEC-G recombinante ou natural não alterado.

Outro exemplo diz respeito às espiras externas que são estruturas que ligam o núcleo interno (hélices) da molécula do FEC-G. A partir a estrutura tridimensional - incluindo a informação respeitante à localização espacial dos resíduos aminoácidos - é possível prever que determinadas modificações em determinadas espiras não irão ter como resultado modificações conformacionais globais. Assim sendo, outra classe de análogos de FEC-G proporcionada pela presente invenção é aquela que possui as espiras externas modificadas, mas em que a estrutura global é igual à do FEC-G recombinante ou natural (não alterado). Mais particulaimente , uma outra classe de análogos de FEC-G proporcionada pela presente invenção é constituída pelos análogos que possuem espiras externas modificadas, sendo tais espiras escolhidas no conjunto constituído pelas que estão entre as hélices A e B, entre as hélices B e C, entre as hélices C e D e entre as hélices DeA, nos termos em que tais espiras e hélices são aqui identificados. Mais particularmente, as referidas espiras, de preferência a 17

V .·· ι. espira AB e/ou a espira CD são modificadas para aumentar o período de semi-vida da molécula, mediante a estabilização de tais espiras. Tal estabilização pode ser conseguida unindo a totalidade ou uma parte das referidas espiras a uma parte de um feixe helicoidal α existente no núcleo de uma molécula de FEC-G (ou de um seu análogo). Tal união pode ser realizada por meio de uma folha β, por ponte salina, por pontes dissulfureto, por interacção hidrófoba ou por qualquer outro meio de união conhecido pelos especialistas na matéria, servindo tais meios de união para estabilizar as referidas expiras externas. Por exemplo, é possível estabilizar as espiras AB ou CD unindo a espira AB a uma das hélices contidas na região interna da molécula. O terminal N também pode ser modificado sem alteração da estrutura global de uma molécula de FEC-G, uma vez que o terminal N não participa na estabilidade estrutural das hélices internas, aplicando-se os mesmos preceitos gerais ao terminal N, embora as espiras externas sejam preferíveis para efeitos de modificação.

Por outro lado, tais espiras externas podem ser os locais para a modificação química, uma vez que nos FEC-G recombinantes ou naturais (não alterados) tais espiras são relativamente flexíveis e têm tendência a não interferirem com a ligação ao receptor. Assim, poderia haver mais espaço para que um radical químico fosse acoplado directamente (ou acoplado indirectamente através de outro radical químico que sirva de meio químico de união). O radical químico pode ser seleccionado entre diversos radicais convenientes para a modificação de uma ou várias funções de uma molécula de FEC-G. Por exemplo, uma espira externa pode proporcionar locais para a adição de um ou vários polímeros, com a finalidade de se aumentar o período de semi-vida sérico, por exemplo, utilizando uma molécula de polietileno-glicol. É possível acrescentar tais moléculas de pohetileno-ghcol nos casos em 18 que a referida espira é alterada para conter mais resíduos lisina que possuem grupos secundários reactivos aos quais as moléculas de polietileno-glicol são capazes de se ligarem. Há outras classes de radicais químicos que também podem ser acoplados a uma ou várias espiras externas, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a ligação a outras moléculas biologicamente activas, tais como receptores, outras proteínas terapêuticas (tais como outros factores hematopoiéticos que poderiam dar origem a uma molécula híbrida) ou agentes citotóxicos (tais como a toxina da difteria). Como é evidente, esta listagem não é exaustiva; um especialista na matéria, tendo à sua disposição o radical químico desejado, sabe como realizar o acoplamento do referido radical desejado à espira externa desejada. Assim sendo, há uma outra classe de análogos de FEC-G da presente invenção, constituída por aqueles que em que há pelo menos uma alteração numa espira externa, em que a referida alteração consiste na adição de um radical químico, por exemplo, pelo menos uma molécula de polietileno-glicol.

Nas espiras externas também podem ser efectuadas supressões, tais como supressões de locais reconhecidos pelas proteínas para degradação da molécula. Isto proporciona meios alternativos para aumentar o período de semi-vida de uma molécula que de outra forma teria capacidade para se ligar ao receptor de FEC-G e para efectuar a transdução do sinal (isto é, potencial para estimular selectivamente a maturação dos neutrófilos). Posto isto, há uma outra classe de análogos de FEC-G da presente invenção, constituída por aqueles em que foi realizada pelo menos uma alteração numa espira externa, em que tal alteração faz diminuir a degradação desses análogos pela acção das proteases. As espiras preferidas para tais alterações são a espira ABea espira CD. É possível preparar uma molécula de FEC-G mais curta suprimindo uma parte dos resíduos aminoácidos existentes nas espiras externas (adiante 19 / identificados mais minuciosamente), podendo a referida molécula mais curta de FEC-G ter outras vantagens em termos de preparação ou de funções biológicas.

Outro exemplo diz respeito às cargas eléctricas relativas entre resíduos aminoácidos que estejam na vizinhança uns dos outros. Conforme se disse antes, a molécula de FEC-G contém um feixe de quatro hélices relativamente coeso. Algumas das faces das hélices estão voltadas para outras hélices. No ponto (por exemplo, um resíduo) em que uma hélice está voltada para outra hélice, os dois radicais aminoácidos que se encontram voltados um para o outro podem ter a mesma carga e por tal motivo repelir-se-ão mutuamente, o que confere instabilidade à molécula na sua totalidade. Isto pode ser eliminado modificando a carga eléctrica (passando-a para uma carga eléctrica oposta ou para uma carga neutra) de um ou dos dois radicais aminoácidos, por forma a que deixe de haver repulsão. Assim sendo, há outra classe de análogos de FEC-G constituída pelos análogos de FEC-G em que foram introduzidas alterações para modificar a instabilidade originada pelas interacções superficiais, tais como a localização da carga do electrão. A presente invenção também descreve métodos para conceber e projectar análogos de FEC-G e composições congéneres e ainda os produtos resultantes da aplicação de tais métodos. Os produtos finais obtidos por tais métodos podem ser os análogos de FEC-G definidos supra ou composições congéneres. Assim sendo, os exemplos aqui descritos demonstram: (a) o efeito de substituições nos constituintes (isto é, radicais químicos) da molécula do FEC-G na estrutura do FEC-G e (b) os efeitos de modificações na estrutura sobre as funções biológicas. Posto isto, em termos essenciais, um aspecto da presente invenção diz respeito a um método para a preparação de uma análogo de FEC-G, o qual compreende os passos seguintes:

*· 20 (a) procurar ao nível de um aminoácido ou ao nível atómico informação associada à estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, conforme ilustrado na figura 5, em que os radicais químicos, tais como cada um dos resíduos aminoácidos ou cada átomo de cada um dos resíduos aminoácidos, da molécula do FEC-G estejam correlacionados com a referida estrutura; (b) a partir da referida informação escolher um local numa molécula de FEC-G para sofrer uma alteração; (c) preparar uma molécula de um análogo de FEC-G que possua tal alteração; e (d) testar facultativamente tal molécula do análogo de FEC-G para pesquisar uma caractenstica desejada.

Para á preparação de um análogo de FEC-G é possível aplicar um método automático comandado e gerado por programas informáticos aqui apresentados. Assim sendo, outro aspecto da presente invenção diz respeito a um método para a preparação de um análogo de FEC-G, em conformidade com o método do parágrafo anterior, tendo por base a utilização de um computador, o qual compreende os passos seguintes: (a) procurar obter a expressão informática da estrutura tridimensional da molécula de FEC-G em que os radicais químicos, tais como cada um dos resíduos aminoácidos ou cada átomo de cada um dos resíduos aminoácidos da molécula de FEC-G, estejam correlacionados com a referida estrutura; (b) a partir da referida expressão informática escolher um local numa molécula de FEC-G para sofrer uma alteração; (c) preparar uma molécula de FEC-G que possua tal alteração; e (d) testar facultativamente tal molécula de FEC-G para pesquisar uma caracte-rística desejada. 21

Dito de forma mais concreta, a presente invenção proporciona um método para a preparação de um análogo de FEC-G, o qual compreende os passos seguintes: (a) procurar ao nível de um aminoácido ou ao nível atómico informação associada à estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, por meio de um computador, sendo tal computador programado (i) para exprimir as coordenadas de uma molécula de FEC-G no espaço tridimensional e (ii) para permitir a entrada de dados relativos à informação para a alteração da referida expressão do FEC-G e para permitir a sua visualização; (b) escolher um local na referida imagem visual da referida molécula de FEC-G para experimentar uma alteração; (c) introduzir no referido computador os dados respeitantes à informação para essa alteração; (d) observar a estrutura tridimensional da referida molécula alterada do FEC-G por meio do referido computador; (e) repetir facultativamente os passos (a) - (d); (f) preparar um análogo de FEC-G com a referida alteração; e (g) testar facultativamente o referido análogo de FEC-G para pesquisar uma característica desejada.

De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção descreve métodos para utilizar estes análogos de FEC-G e as composições congéneres e descreve também métodos para o tratamento ou para a protecção de mamíferos, quer por si sós quer combinados com outros fármacos ou factores hematopoiéticos, no tratamento de doenças hematopoiéticas. Prevê-se que um aspecto da concepção e projecto de análogos de FEC-G venha a ser o objectivo de aumentar ou modificar as características que se sabe que tem o FEC-G não modificado. é' > 22

Por exemplo, os análogos podem possuir actividades mais intensas ou modificadas, pelo que no caso de o FEC-G ser útil para o tratamento (por exemplo) de neutropenia, as composições e os métodos da presente invenção também podem ser utilizáveis.

Outro exemplo é a modificação do FEC-G com o objectivo de interactuar mais eficientemente quando utilizado em combinação com outros factores, em particular no tratamento de doenças de natureza hematopoiética. Um exemplo de uma tal utilização combinada consiste em recorrer a um factor hematopoiético de actuação precoce (isto é, um factor que actue em primeiro lugar na cascata da hematopoiese em células relativamente indiferenciadas) e em utilizar simultânea ou sequencialmente um factor hematopoiético que actue mais tarde, tal como o FEC-G ou um seu análogo (uma vez que o FEC-G actua sobre a linhagem de GM-UFC (o mesmo que CFU-GM) na estimulação selectiva dos neutrófilos). Os métodos e composições podem ser úteis em terapias que envolvam tais combinações ou “misturas” de factores hematopoiéticos.

As composições e métodos também podem ser úteis para o tratamento de leucopenia, leucemia mielogénica, neutropenia crónica grave, anemia aplásica, doença de armazenagem do glicogénio, mucossistite e outras doenças associadas à insuficiência de medula óssea. As composições e os métodos também podem ser úteis para o tratamento de défices hematopoiéticos resultantes de quimioterapia ou de radioterapia. O sucesso de uma transplantação de medula óssea ou a utilização, por exemplo, de células progenitoras do sangue periférico para transplantação são casos que podem ser melhorados mediante a aplicação dos métodos e das composições da presente invenção (proteínas ou ácidos nucleicos para terapia génica). As composições e os métodos também podem ser úteis para o tratamento de doenças infecciosas, tal como sucede no caso da cicatiização de ferimentos, tratamento de queimaduras, 23 bacteremia, septicemia, infecções fúngicas, endocardite, osteopielite, infecções associadas ao trauma abdominal, infecções que não respondam aos antibióticos e pneumonias, podendo ainda o tratamento de inflamações bacterianas beneficiar da aplicação das composições e dos métodos da presente invenção. Além disso, tais composições e métodos podem ser úteis para o tratamento de leucemia, devido à capacidade assinalada para a diferenciação das células leucémicas. Welte et al, ‘PNAS-USA’ 82: 1526-1530 (1985). Outras aplicações há que incluem o tratamento de indivíduos com tumores, utilizando as composições e os métodos referidos, facultativamente na presença de receptores (tais como anticorpos) que se liguem às células tumorais. Para leitura e estudo de artigos sobre aplicações terapêuticas veja-se Lieshhke e Burgess, ‘N. Engl. J. Med.’ 327: 28-34 e 99-106 (1992), estando ambos os documentos aqui incorporados por referência.

As composições e métodos também podem ser úteis para actuarem como intermediários para a produção de outros radicais; por exemplo, foi já assinalado que o FEC-G influencia a produção de outros factores hematopoiéticos e esta função (se confirmada) pode ser reforçada ou modificada através das composições e/ou dos métodos da presente invenção.

As composições relacionadas com os análogos de FEC-G da presente invenção, tais como os receptores, podem ser úteis para actuarem como antagonistas que impeçam a actividade do FEC-G ou de um seu análogo. É possível obter uma composição com a totalidade ou com uma parte da actividade do FEC-G não alterado ou de um análogo de FEC-G e acrescentar um ou vários radicais químicos para modificar uma ou várias propriedades de tal FEC-G ou de um seu análogo. Tendo conhecimento desta conformação tridimensional, um especialista pode antever qual a melhor localização geográfica para tal modificação química, de modo a obter o efeito pretendido.

Os objectivos gerais das modificações químicas podem ser a obtenção de um maior período de semi-vida (por exemplo, uma depuração renal, imunológica ou celular reduzida), uma bioactividade alterada (por exemplo, propriedades enzimáticas alteradas, bioactividades dissociadas ou actividade em solventes orgânicos), toxicidade reduzida (por exemplo, dissimulação de epítopos tóxicos, compartimentalização e biodistribuição selectiva), imunorreactividade modificada (imunogenicidade reduzida, antigenicidade reduzida ou acção adjuvante) ou propriedades físicas modificadas (por exemplo, maior solubilidade, maior estabilidade térmica, maior estabilidade mecânica ou estabilização conformacional). Ver Francis, Focus on Growth factors 3: 4-10 (Maio de 1992) (publicado por Mediscript, Mountview Court, Friem Bamet Lane, London N20 OLD, UK).

Os exemplos subsequentes ilustram a presente invenção sem contudo a limitarem. Faz-se observar que há variações e modificações que podem ocorrer aos especialistas na matéria, considerando-se abrangidas pela reivindicações anexas todas essas variantes equivalentes que estejam contidas no âmbito da invenção, tal como reivindicada.

Descrição minuciosa dos desenhos A figura 1 é uma ilustração da sequência de aminoácidos das espécie de FEC-G de 174 aminoácidos com mais um resíduo metionina no terminal N (Seq DD N° 1) (Seq ID N°: 2). A figura 2 é um diagrama topológico da estrutura cristalina do FEC-G e também de HCh, HCp, FEC-GM (o mesmo que respectivamente hGH, pGH, GM-CSF), INF-β, IL-2 e IL-4. Estas ilustrações têm por base os dados contidos nas referências citadas. O comprimento dos elementos estruturais secundários está traçado em proporção com o número de resíduos. As hélices A, B, C e D são marcadas em conformidade com o esquema aqui utilizado para o FEC-G. No caso do DSTF-β a marcação original das hélices está indicada entre parênteses. 25 A figura 3 é um “diagrama de serpentina” da estrutura tridimensional do FEC-G. A hélice A é constituída pelos resíduos aminoácidos 11-39 (numerados de acordo com a figura 1 supra), a hélice B é constituída pelos resíduos aminoácidos 72-91, a hélice C é constituída pelos resíduos aminoácidos 100-123 e a hélice D é constituída pelos resíduos aminoácidos 143-173. A hélice relativamente curta 310 está nos resíduos aminoácidos 45-48 e a hélice α está nos resíduos aminoácidos 48-53. Os resíduos 93-95 constituem quase uma volta completa de uma hélice levógjra.

A figura 4 é um “diagrama de cilindros” da estrutura tridimensional do FEC-G. Os cilindros completos e as suas orientações para a estrutura tridimensional do FEC-G estão ilustrados por meio de diversos tons de cinzento. Os números indicam a posição dos resíduos aminoácidos em conformidade com a figura 1 supra. A figura 5 é uma listagem das coordenadas utilizadas para se gerar uma imagem visual da estrutura tridimensional do FEC-G por meio de um computador. Tais coordenadas são explicitadas a seguir. As colunas correspondem a campos independentes: (i) o campo 1 (a partir do lado esquerdo) é o átomo,

(ii) o campo 2 é o numero atribuído ao átomo, (iii) o campo 3 é o nome do átomo (de acordo com a nomenclatura convencional do quadro periódico, sendo CB o átomo de carbono β, CG o átomo de carbono γ, etc.), (iv) o campo 4 é o tipo de resíduo (de acordo com a nomenclatura de três letras para os aminoácidos, por exemplo, conforme consta v.g. na obra de Stryer, ‘Biochemistiy’, 3a Ed., W.H. Freeman e Company, N. Y., 1988, no verso da contracapa; (v) os campos 5-7 são as posições do átomo no eixo dos x, no eixo dos y e no eixo dos z; 26 (vi) o campo 8 (frequentemente um “1.00”) designa uma ocupação nessa posição; (vii) o campo 9 designa o factor β; (viii) o campo 10 indica a designação da molécula. Há três moléculas (designadas por a, b e c) do FEC-G que cristalizaram conjuntamente, formando uma unidade. A designação a, b ou c indica quais as coordenadas pertencentes a cada molécula. O número a seguir à letra (1, 2 ou 3) indica a posição atribuída ao resíduo aminoácido, tendo sido atribuídas à molécula a as posições 10-175, à molécula b as posições 210-375 e à molécula c as posições 410-575. Estas posições foram assim definidas para que não houvesse nenhuma sobreposição entre as três moléculas que cristalizaram conjuntamente. (O símbolo “W” significa água). A figura 6 é uma representação esquemática da estratégia associada ao refinamento da matriz de cristalização para os parâmetros implicados na cristalização. A matriz de cristalização corresponde à concentração final dos componentes (sais, tampões e agentes precipitantes) das soluções de cristalização contidas nas cavidades de uma placa de 24 cavidades para cultura de tecidos. Estas concentrações são obtidas pipetando o volume adequado de soluções-mãe para dentro das cavidades da placa de microtitulação. Para conceber e arquitectar a matriz, um especialista em cristalografia decide-se sobre uma maior ou menor concentração do componente. Estas concentrações maiores ou menores podem ser obtidas por meio de uma pipeta, quer ao longo das diversas fileiras (linhas) (v.g. A1-A6, B1-B6, C1-C6 ou D1-D6), quer ao longo de todo o tabuleiro (A1-D6). O primeiro método é útil para confirmar a reprodutibilidade do crescimento cristalino de um único componente ao longo de um número limitado de cavidades, ao passo que o segundo método é mais útil na pesquisa inicial. Os resultados das diversas fases de refinamento da matriz de cristalização estão ilustrados por uma representação de três placas. O aumento dos tons de sombreado nas cavidades indica um resultado positivo de cristalização, podendo ser, nas fases finais, cristais de qualidade confirmada aos raios X, mas que nas fases iniciais poderiam ser gotículas de óleo, precipitados granulares ou pequenos cristais com dimensões sensivelmente inferiores a 0,05 mm. A parte A representa uma pesquisa inicial de um parâmetro em que o intervalo de concentração entre a primeira cavidade (Al) e a ultima cavidade (D6) é grande, sendo o aumento de concentração entre cavidades calculado pela expressão ((concentração em Al) -- (concentração em D6))/23). A parte B representa o facto de o refinamento da dispersão da concentração entre Al e D6, nas fases finais da matriz de cristalização, vir a ser reduzida e tendo pois por consequência a formação de mais cristais por placa. A parte C indica uma fase final do refinamento da matriz, em que são encontrados cristais de qualidade na maior parte das cavidades da placa.

Descrição Minuciosa da Invenção A presente invenção assenta na descoberta da estrutura tridimensional do FEC-G. Esta estrutura tridimensional foi expressa por meio de um programa informático para efeitos de visão estereoscópica. Ao efectuar tal observação estereoscopicamente, foram identificadas as relações entre estrutura e funções e foram concebidos, projectados e produzidos análogos de FEC-G.

Estrutura Tridimensional Geral do FEC-G O FEC-G utilizado para a determinação da estrutura foi uma espécie não glicosilada de 174 aminoácidos, que possui mais um resíduo metionina no terminal N, próprio para a 28 expressão bacteiiaiia. As sequências de ADN e de aminoácidos deste FEC-G estão ilustradas na figura 1.

Em termos gerais, a estrutura tridimensional do FEC-G é predominantemente helicoidal, com 103 dos 175 resíduos a formarem um feixe helicoidal 4α. A única estrutura secundária a mais está na espira entre as primeiras duas hélices compridas, em que uma hélice 310 de 4 resíduos é seguida imediatamente por uma hélice α de 100 resíduos. Conforme se observa na figura 2, comparou-se a estrutura geral com a estrutura atribuída a outras proteínas: hormona Φ do crescimento (Abdel-Meguid et al, ‘PNAS-USA’ 84: 6434 (1987) e Vos et al, ‘Science’ 255: 305-312 (1992)), factor estimulador das colónias de macrófagos granulócitos (Diederichs et al., ‘Science’ 254: 1779-1782 (1991), interferão β (Senda et al, ΈΜΒΟ J.’ 11: 3193-3201 (1992)), interleucina 2 (McKay, ‘Science’ 257: 1673-1677 (1992)) e interleucina 4 (Powers et al, ‘Science’ 256: 1673-1677 (1992) e Smith et al, ‘J. Mol. Biol.’ 224: 899-904 (1992)). Há uma similitude estrutural entre estes factores de crescimento, apesar da ausência de similitude nas suas sequências de aminoácidos. ^ A informação estrutural disponível era, no momento, a correlação da bioquímica do FEC-G e tal facto pode ser resumido conforme a seguir se indica (estando a posição 1 da sequência no terminal N): 29 s.

Posição da sequência 1-10

Cis 18 34 20-47 (inclusive) 20,23,24

Descrição da estrutura

Cadeia alargada

Parcialmente encoberto

Local alternativo de junção Hélice A, primeira ponte dissulfureto e parte da hélice AB

Hélice A

Análise A supressão não provoca nenhuma perda de actividade biológica

Reactivo com DTNB e ‘ThimersosoP, mas não com iodo-acetato A inserção reduz a actividade biológica A região prevista de ligação ao receptor tem por base dados de anticorpos neutralizantes A mutação de resíduos por um só resíduo alanina reduz a actividade biológica, ligação ao receptor previsível (local B) 165-175 (mdusve) terminal carboxi A supressão reduz a actividade biológica

Esta informação bioquímica, obtida a partir de estudos de ligação de anticorpos, ver Layton et d., ‘Biochemistry’ 266: 23815-23823 (1991), foi sobreposta à estrutura tridimensional com a finalidade de se conceber e projectar os análogos de FEC-G. A concepção, a preparação e a experimentação destes análogos de FEC-G está descrita no Exemplo 1 subsequente. EXEMPLO 1

Este exemplo descreve a preparação do FEC-G cristalino, a visualização da estrutura tridimensional do FEC-G humano recombinante por meio de imagens geradas por computador, a preparação de análogos, utilizando para tal a mutagenese dirigida ao local ou métodos de amplificação dos ácidos nucleicos, experiências biológicas e análises por CLER utilizadas para pesquisa e estudo dos análogos de FEC-G e a determinação resultante das relações gerais entre estrutura/funções. Todas as publicações citadas são consideradas aqui incorporadas por referência. A. Recurso à Cristalização Automatizada A necessidade de se encontrar uma estrutura tridimensional para o factor estimulador de colónias de granulócitos humanos recombinantes (FEC-G-hu-r, o mesmo que r-hu-G-CSF) e a disponibilidade de grandes quantidades de proteína purificada levaram à concepção de métodos de crescimento de cristais por amostragem factorial incompleta e inoculação. Começando com a implementação do processo de cristalização factorial incompleta, descrito por Jancarik e Kim, ‘J. Appl. Crystallogr.’ 24: 409 (1991), efectuou-se uma avaliação das condições da solução que produzissem gotículas de óleo e agregados birrefringentes. Além disso, efectuou-se também as necessárias modificações do equipamento e dos programas informáticos de um sistema de pipetagem automático para assim se produzir à volta de 400 condições de cristalização diferentes diariamente. Weber, ‘J. Appl. Ciystallogr.’ 20: 366-373 (1987). Este procedimento conduziu a uma solução de cristalização que produziu cristais de FEC-G-hu-r. O tamanho, a reprodutibilidade e a qualidade dos cristais são características que foram aperfeiçoadas por meio de um método de inoculação em que o número de “unidades iniciadoras da nucleação” foi estimado por diluição sequencial de razão constante de uma solução inoculante. Estes métodos proporcionaram o crescimento reproduzível de cristais de FEC-G-hu-r com 2,0 mm. O grupo espacial destes cristais é P2i2i2] com as dimensões celulares definidas por a = 90 A, b=l 10 Á e c=49 Á, difractando para uma resolução de 2,0 Â. 1. Metodologia Geral

Para pesquisar as condições de cristalização de uma nova proteína, Cárter e Cárter, ‘ J. Biol. Chem.’ 254: 122219-12223 (1979) propuseram o método factorial incompleto. Estes 31 31

autores sugeriram que uma amostragem de um grande número de condições de cristalização seleccionadas aleatoriamente, mas geralmente prováveis, pode conduzir a uma combinação bem sucedida de reagentes que produza a cristalização da proteína. Esta ideia foi levada à prática por Jancarik e Kim, £J. Appl. Crystallogr.’ 24: 409 (1991), que descreveram 32 soluções para as experiências iniciais de cristalização num intervalo de valore de pH e para um conjunto de sais e de agentes precipitantes. Descrevemos aqui uma extensão das suas experiências para um conjunto ampliado de 70 soluções. Para se minimizar o esforço e os erros humanos da preparação das soluções, programou-se o método para ser executado por uma máquina de pipetagem automática.

Seguindo o método de Weber de pesquisa sequencial automática do retículo (PSAR, o mesmo que SAGS), ‘J. Ciyst. Growth’ 90: 318-324 (1988), utilizou-se o sistema robótico para gerar um conjunto sequencial de soluções que permitiram refinar continuamente as condições de cristalização respeitantes a temperatura, valores de pH, sais e agentes precipitantes. Uma vez determinada uma solução que permitiu fazer crescer os cristais de forma reproduzível, desenvolveu-se então uma técnica de inoculação que permitiu aumentar bastante a qualidade dos cristais. A combinação destes dois métodos permitiu produzir em poucos dias centenas de cristais de qualidade difractiva (cristais que difractam pelo menos a cerca de 2,5 Angstrom, possuindo de preferência pelo menos parcelas que difractam abaixo de 2 Angstrom e mais preferencialmente a cerca de 1 Angstrom).

De um modo geral, o método de cristalização que é possível utilizar com qualquer proteína que se pretenda cristalizar compreende os passos seguintes: (a) combinar aliquotas aquosas da proteína desejada quer com (i) aliquotas de uma solução salina, possuindo cada aliquota uma concentração diferente de sal, quer com (ii) j®y ,-'—ί f/ 32.;: y" J> aliquotas de uma solução de agente precipitante, possuindo cada aliquota uma concentração diferente de agente precipitante, sendo a combinação das aliquotas efectuada facultativamente num intervalo de valores de pH;

(b) observar as referidas aliquotas combinadas para pesquisar formações pré--cristalinas e escolher a referida combinação de sal ou de agente precipitante e do referido valor de pH que seja eficaz para produzir as formas pré-cristalinas ou então, se assim não tiverem sido produzidas nenhumas formas pré-cristalinas, aumentar a concentração inicial da proteína das referidas aliquotas aquosas de proteína; (c) depois de seleccionada a concentração do referido sal ou do referido agente precipitante, repetir o passo (a) com a referia solução que anterioimente não foi seleccionada, agora na presença da referida concentração escolhida; e (d) repetir o passo (b) e o passo (a) até se obter um cristal com a qualidade pretendida. O método descrito supra pode ser facultativamente automatizado, o que permite poupar bastante tempo e trabalho. As concentrações preferidas para a proteína no início estão compreendidas entre 10 mg/mL e 20 mg/mL, mas esta concentração inicial irá variar em função da proteína em causa (o FEC-G infra foi analisado utilizando uma concentração de 33 mg/mL). Um intervalo preferido para a concentração da solução salina para começar a análise com NaCl está compreendidos entre 0-2,5 M. Um agente precipitante preferido é o polietileno-glicol 8000, havendo no entanto outros agentes precipitantes seleccionados entre solventes orgânicos (tais como o etanol), moléculas de polietileno-glicol com pesos moleculares compreendidos no intervalo entre 500 e 20 000 e ainda outros agentes precipitantes conhecidos pelos especialistas na matéria. O intervalo preferido de valores de pH é definido pela sequência de valores de pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 e 9,0. As formas de pré-cristalização podem ser óleos, agentes precipitantes birrefiingentes, cristais pequenos (com dimensões sensivelmente inferiores a 0,05 mm), cristais médios (com dimensões compreendidas aproximadamente entre 0,05 mm e 0,5 mm) e cristais grandes (com dimensões sensivelmente superiores a 0,5 mm). O período de espera preferido para se ver uma estrutura cristalina é de 48 horas, embora a observação semanal também seja preferida e ao fim de cerca de um mês, de um modo geral, passa-se a utilizar uma concentração diferente da proteína (normalmente aumenta-se a concentração da proteína). É preferível recorrer a um processo automático, utilizando para tal o sistema ‘Accuflex’ tal como foi modificado. Os parâmetros preferidos de automatização estão descritos mais adiante.

De um modo geral, combinou-se uma proteína com uma concentração compreendida entre 10 mg/mL e 20 mg/mL com soluções de NaCl com concentrações variáveis entre 0 e 2,5 M e cada uma dessas combinações foi realizada (separadamente) no intervalo de valores de concentrações definido supra. Uma vez observada uma estrutura de pré-cristalização, executa-se uma experiência independente para optimizar a concentração salina e o intervalo de valores de pH, até se conseguir obter um cristal com a qualidade desejada. A seguir optimiza-se também a concentração do agente precipitante para níveis variáveis de pH. Logo que estes parâmetros se encontrem optimizados, efectua-se um ensaio com as condições óptimas em simultaneidade para se conseguir obter o resultado pretendido (isto está ilustrado por meio de um diagrama na figura 6). a. Implementação de um sistema automático de pipetagem

Realizou-se a preparação de soluções de gotas e soluções-mãe recorrendo a um sistema de pipetagem ‘Accuflex’ (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) que é comandado

por um computador pessoal que envia códigos ‘ASCII’ através de um dispositivo interface sequencial convencional. O dispositivo de pipetagem retira amostras de seis soluções diferentes por meio de uma válvula rotativa e vai pipetar estas soluções numa placa cuja translação no sistema de coordenadas x - y é possível regular. O componente vertical do sistema manipula uma seringa que é capaz quer de fornecer quer de retirar liquido.

As aplicações informáticas fornecidas com o sistema ‘Accuflex’ tinham por base o método de PSAR (o mesmo que SAGS) sugerido por Cox e Weber, ‘J. Appl. Ciystaflogr.’ 20: 366-373 (1987). Este método implica a variação sistemática de dois parâmetros principais de cristalização, isto é, o valor do pH e a concentração do agente precipitante, com possibilidade de fazer variar outros dois. Assentes nestes conceitos, as aplicações informáticas aqui utilizadas conferiram maior flexibilidade à concepção e à implementação das soluções de cristalização utilizadas na estratégia de pesquisa automática sequencial do retículo (grelha). Devido a esta flexibilidade, as aplicações informáticas da presente invenção também criaram um número maior de soluções diferentes. Isto é essencial para a implementação do método factorial incompleto, tal como descrito mais adiante na correspondente secção.

Para aumentar a velocidade e melhorar a arquitectura da estratégia de pesquisa automática da grelha, é necessário introduzir modificações nas aplicações lógicas e no equipamento respeitantes ao sistema de pipetagem ‘Accuflex’. As modificações introduzidas ao nível do equipamento permitiram a utilização de dois tabuleiros diferentes de microtitulação, tendo um deles sido utilizado nas experiências com as gotas suspensas e o outro nas experiências com as gotas em repouso, e ainda um tabuleiro de ‘Plexiglas’ que continha mais 24 soluções de tampão, sais e precipitantes. Estas soluções complementares aumentaram a grelha de condições de cristalização que foi possível investigar. 35 & >

Para se utilizar as modificações realizadas no equipamento, as aplicações lógicas de pipetagem foram escritas em duas subrotinas: uma subrotina permite que o cristalógrafo desenhe uma matriz de soluções de cristalização baseadas nas concentrações dos seus componentes e a outra subrotina transforma estas concentrações num código informático que faz pipetar os volumes adequados das soluções nos tabuleiros de cristalização. As matrizes das concentrações podem ser geradas por um qualquer de dois programas. O primeiro programa (MRF, fornecido por Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA) faz referência a uma listagem de concentrações das soluções permanentes, fornecidas pelo cristalógrafo, e calcula o volume que é necessário pipetar para se conseguir a concentração pretendida. O segundo método, considerado preferível, incorpora um programa de folha de cálculo (Lotus) que pode ser utilizado para a produção de gradientes mais sofisticados de precipitantes ou de valores de pH. A matriz de concentrações criada por qualquer dos programas é interpretada pelo programa de controlo (SUX, uma modificação do programa que acompanha originariamente o pipetador ‘Accuflex’ e que pode ser adquirido a “Amgen, Inc. Thousand Oaks, CA”) sendo as cavidades preenchidas em conformidade. b. Implementação do Método Factorial Incompleto A conveniência do sistema de pipetagem modificado para a preparação das diversas soluções melhorou a implementação de um método factorial incompleto expandido. O desenvolvimento de um novo conjunto de soluções de cristalização, com componentes “aleatórios”, foi conseguido utilizando o programa INF AC, Cárter et al., ‘J. Ciyst. Growth’ 90: 60-73 (1988) que produziu uma listagem que continha 96 combinações aleatórias de um factor resultante de três variáveis. As combinações de cálcio e fosfato que precipitaram imediatamente foram eliminadas, ficando 70 combinações distintas de precipitantes, sais e tampões. Estas combinações foram preparadas utilizando o pipetador automático e ficaram a incubar durante uma semana. Realizou-se uma inspecção das misturas e preparou-se novamente as soluções que formaram precipitantes, com concentrações menores dos seus componentes. Repetiu-se este procedimento até deixar de haver precipitantes em todas as cavidades. c. Cristalização do FEC-G-hu-r (o mesmo que r-hu-G-CSF)

Foram utilizadas diversas estratégias diferentes de cristalização para se encontrar uma solução que produzisse cristais de qualidade observável aos raios X. Tais estratégias incluíram a utilização do método factorial incompleto, o refinamento das condições de cristalização recorrendo a pesquisas de grelha sucessivas e automáticas (PGSA), a implementação de uma técnica de inoculação e o desenvolvimento de um procedimento de produção de cristais que permitiu obter centenas de cristais excelentes de um dia para o outro. Salvo quando especificado de outro modo, para a pesquisa e para a produção dos cristais de FEC-G-hu-r utilizou-se o método de difusão a vapor de gotas suspensas. Afinsen et al., ‘Physical Principies of Protein CrystaUization’. In: Eisenberg (ed.), ‘Advanced in Protein Chemistiy’ 41: 1-33 (1991).

Para a pesquisa inicial das condições de cristalização do FEC-G-hu-r utilizou-se o método factorial incompleto de Jancarik e Kim, ‘J. Appl. Crystallogr.’ 24: 409 (1991), daí resultando diversas soluções que permitiram obter resultados de “pré-cristalização”. Estes resultados compreendem no seu conjunto precipitantes birrefringentes, óleos e cristais muito pequenos (< 0,05 mm). Estas soluções de pré-cristalização serviram depois como pontos de partida para uma pesquisa sistemática. 37 0 processo de pesquisa exigiu o desenvolvimento de matrizes de cristalização. Estas matrizes correspondiam à concentração dos componentes nas soluções de cristalização e foram criadas utilizando a folha de cálculo da aplicação Lotus™ para um PC da IBM, tendo sido implementadas com o sistema de pipetagem modificado da ‘Accuflex’. A estratégia para a produção das matrizes consistiu em fazer variar um parâmetro de cristalização (por exemplo, a concentração salina), mantendo constantes todos os outros parâmetros, por exemplo, o valor de pH e a concentração dos precipitantes. No início da pesquisa, o intervalo de concentrações dos parâmetros variáveis foi grande, mas tal intervalo de concentrações foi sendo sucessivamente refinado até ao ponto em que em todas as cavidades do tabuleiro de microtitulação foi obtido o mesmo resultado de cristalização. Estas resultados foram classificados do modo seguinte: cristais, precipitado birrefiingente, precipitado granular, gotículas oleosas e massa amorfa: Se a concentração de um determinado parâmetro de cristalização não produziu pelo menos um precipitante, fez-se aumentar a concentração desse parâmetro até se formar um precipitante. Depois de completado cada um dos tabuleiros, deixou-se ficar em repouso pelo menos durante dois dias e depois efectuou-se uma inspecção para investigar o crescimento dos cristais. Após esta pesquisa inicial, os tabuleiros passaram a ser inspeccionados semanalmente.

Graças a este processo de pesquisa foram identificadas duas soluções independentes, com os mesmos valores de pH e com os mesmos precipitantes, mas de sais diferentes (MgCl, L1SO4) que produziram cristais pequenos (0,1 mm x 0,05 mm x 0,05 mm). Com base nestes resultados produziu-se um novo conjunto de matrizes de concentração em que se fez variar a concentração do MgCl relativamente à do L1SO4, mantendo constantes todos os outros parâmetros de cristalização. Este conjunto de experiências permitiu identificar uma solução que produziu cristais de qualidade difiactiva (> a aproximadamente 0,5 mm) em cerca de três 38 semanas. Para se encontrar esta solução de crescimento dos cristais (SCC) (Mes 100 mM a pH 5,8, MgCE 380 mM, LiS04 220 mM e 8% de PEG 8k) foram pesquisadas aproximadamente 8 000 condições que consumiram cerca de 300 mg de proteína. O tamanho dos cristais dependeu do número de cristais que se formam por cada gota. De forma típica, foram-se entre 3 e 5 cristais com um tamanho médio de 1,0 mm x 0,7 mm x 0,7 mm. Foram obtidas duas morfologias que tinham um grupo espacial idêntico (P2i2x2{) e dimensões celulares por unidade centradas a a=90,2, b=l 10,2 e c=49,5, dependendo isso do facto de ter sido ou não implementada a inoculação (ver infra). Sem inoculação, os cristais de FEC-G-hu-r adquiriram uma superfície plana comprida e arestas arredondadas.

Quando se recorreu à inoculação foram obtidos cristais com faces bem pronunciadas e definidas na gota ao fim de 4 a 6 horas (0,05 mm x 0,05 mm x 0,05 mm). Em 24 horas òs cristais tinham crescido para 0,7 mm x 0,7 mm x 0,7 mm e continuaram a aumentar para além de 2 rara, dependendo tal facto do número de cristais em formação na gota. d. Inoculação e determinação dos locais de início da nucleação O método agora proposto para inocular cristais define o número de unidades de início da nucleação em cada cavidade utilizada (aqui, depois de terem sido determinadas as condições óptimas para os cristais crescerem). O método aqui descrito é vantajoso na medida em que o número de “inóculos” afecta a qualidade dos cristais e isto por sua vez afecta o grau de resolução. O método de inoculação da presente invenção também tem vantagens pelo facto de a inoculação fazer com que os cristais de FEC-G cresçam num período de cerca de 3 dias, ao passo que sem inoculação o período de crescimento passa a ser aproximadamente de 3 semanas. 39 . 39 .

Numa experiência de produção de cristais (ver os métodos) foram produzidas grandes quantidades destes, de um dia para o outro (<0,01 mm x 0,01 mm x 0,01 mm). Foram praticadas as condições de cristalização anteriormente descritas, com a excepção de se ter reutilizado uma ponta de pipeta já anteriormente utilizada. Presumivelmente, o efeito de grande produção de cristais foi originado por pequenas unidades de nucleação que se tinham formado na ponta utilizada e que constituíram locais de nucleação para os cristais. A adição de uma pequena quantidade (0,5 pL) de gotas que continham as grandes quantidades de cristais a uma nova gota, em condições convencionais para a produção de cristais, teve como consequência uma grande produção de cristais, de um dia para o outro. Este método foi utilizado para a produção de vários tabuleiros de gotas contendo grandes quantidades de cristais a que se atribuiu a designação de “reserva de inoculo”. O número de unidades de início da nucleação (UIN) contidas nas gotas de “reserva de inoculo” foi avaliado com a finalidade de se melhorar a reprodutibilidade e a qualidade dos cristais de FEC-G-hu-r. Para se determinar o número de UIN na “reserva de inoculo” diluiu-se sequencialmente uma aliquota da gota ao longo de uma placa de microtitulação de 96 cavidades. Preparou-se a placa de microtitulação juntando 50 pL de uma solução que continha volumes iguais de solução de FEC-G-hu-r (33 mg/mL) e de solução de crescimento dos cristais (descrita supra) em cada cavidade. Transferiu-se uma aliquota de 3 pL de uma das gotas de “reserva de inoculo” para a primeira cavidade da placa de microtitulação. Misturou-se bem a solução contida na cavidade e depois transferiu-se 3 pL para a cavidade seguinte ao longo da fileira da placa de microtitulação. Preparou-se de forma idêntica cada fileira da placa de microtitulação e vedou-se coirectamente o tabuleiro com uma fita de plástico. Formaram-se pequenos cristais, de um dia para o outro, no fundo das cavidades da 40, / ν.“ placa de microtitulação e estabeleceu-se uma correlação entre o número de cristais nas cavidades e a diluição da “reserva de inoculo” original. Para se produzir cristais individuais grandes, diluiu-se adequadamente a gota de “reserva de inoculo” em SCC recente e depois transferiu-se para uma gota uma aliquota desta solução que continha as UIN.

Uma vez optimizadas as condições de cristalização, deixou-se os cristais crescerem segundo um método de produção em que 3 mL de cada um dos produtos SCG e solução de FEC-G-hu-r (33 mg/mL) foi misturado para a preparação de 5 tabuleiros (possuindo cada um deles 24 cavidades). Este método incluiu a produção da solução de cristalização refinada em grandes quantidades, a mistura desta solução com a proteína e a colocação da solução de cristalização/proteína em tabuleiros de gotas suspensas ou em tabuleiros de gotas em repouso. Este processo permitiu obter de forma típica 100 a 300 cristais de qualidade (>0,5 mm) em cerca de 5 dias. e. Métodos Experimentais

Materiais

Obteve-se a informação cristalográfica começando com FEC-G-met-hu-r (o mesmo que r-hu-met-G-CSF) com a sequência de aminoáddos indicada na figura 1 com uma actividade especifica de 1,0 ± 0,6 x 108 U/mg (conforme medido pelo ensaio de mitogenese celular em tampão de acetato 10 mM a pH 4,0 (em água para injecção)) e com uma concentração de cerca de 3 mg/mL. Concentrou-se a solução com o concentrador de modelo ‘Amicon’ a 75 psi, utilizando um filtro ‘YM10’. De forma típica, concentrou-se a solução 10 vezes a 4°C e guardou-se durante vários meses.

Pesquisa Inicial

Os cristais adequados para análise por raios X foram obtidos por equilíbrio entre difusão - vapor, utilizando gotas suspensas. Para a pesquisa preliminar misturou-se 7 pL da solução de proteína na concentração de 33 mg/mL (tal como preparada anteriormente) com igual volume da solução da cavidade, colocou-se em placas de vidro tratadas com silicone e colocou-se em suspensão sobre a solução da cavidade, utilizando placas de cultura de tecidos de tipo ‘Linbro’ (Flow Laboratories, McLean, Va). A pipetagem foi sempre realizada com a pipetadora de modelo ‘Accuflex’, tendo no entanto os tabuleiros sido retirados da pipetadora automática depois de as soluções terem sido criadas nas cavidades e muito bem misturadas pelo menos durante 10 minutos com um mecanismo de agitação montado por cima da mesa. Depois recolocou-se os tabuleiros de tipo ‘Linbro’ na pipetadora que acrescentou as soluções das cavidades e de proteína às peças de cobertura tratadas com silicone. As peças de cobertura foram então invertidas e aplicadas estanquemente sobre 1 mL das soluções das cavidades, utilizando para tal massa lubrificante de silicone.

Os componentes do sistema automático de cristalização são os que a seguir se indica. Utilizou-se um computador individual de tipo ‘PC-DOS’ para se desenhar uma matriz de soluções de cristalização com base na concentração dos seus componentes. As matrizes foram obtidas com qualquer ‘MRF’ da folha de cálculo Lotus (referida supra). O produto final deste programa é um ficheiro de dados. O ficheiro contém a informação necessária ao programa ‘SUX’ para pipetar o volume conveniente das soluções de reserva para se obter as concentrações descritas nas matrizes. Fez-se passar a informação do programa ‘SUX’ através de uma porta sequencial de tipo E/S (o mesmo que I/O) e utilizou-se para indicar ao sistema de pipetagem ‘Accuflex’ a posição da válvula relativamente às soluções de reserva, a quantidade 42 de solução a recuperar, as instruções para pipetar nas cavidades das placas de microtitulação e a posição X-Y de cada cavidade (a intersecção coluna/linha (ou fileira) de cada cavidade).

Transmitiu-se informação complementar à pipetadora para lhe indicar a posição Z (altura) da seringa durante o enchimento e também a posição de um dreno onde o sistema pára momen-

taneamente para efectuar uma purga da seringa entre enchimentos de soluções diferentes. A placa de microtitulação de 24 cavidades (de tipo Linbro ou Cryschem) e o suporte das peças de cobertura foram colocados numa armadura que se movia no plano X-Y. O movimento da armadura da placa permitiu que a pipetadora colocasse a seringa de modo a pipetar para dentro das cavidades. Também colocou correctamente as peças de cobertura, os frascos e as soluções dos extractos destas fontes. Antes da pipetagem, as placas de microtitulação ‘Linbro’ tinham uma película delgada de massa consistente aplicada em tomo dos rebordos das cavidades. Depois de as soluções de cristalização terem sido preparadas nas cavidades, e

antes de terem sido transferidas para as peças de cobertura, retirou-se a placa de microtitulação do sistema de pipetagem e aguardou-se que as soluções se misturassem por acção de uma misturadora montada por cima da mesa, a trabalhar durante 10 minutos. Depois de realizada a mistura, transferiu-se as soluções das cavidades para as peças de cobertura (no caso do protocolo das gotas suspensas) ou fez-se a sua transferência para o suporte intermédio na cavidade (no caso do protocolo das gotas em repouso). Extraiu-se a proteína de um frasco e juntou-se à gota da peça de cobertura que continha a solução da cavidade (ou ao suporte). Aplicou-se uma fita de plástico na parte de cima da placa de tipo ‘Cryschem’ para fechar bem as cavidades.

Desenvolvimento da Produção

Uma vez estabilizadas as condições de cristalização, teve então lugar o crescimento dos cristais utilizando um método de “produção”. Preparou-se em quantidades de 1 litro a solução de cristalização contendo Mes 100 mM a pH 5,8, MgC^ 380 mM, L1SO4 220 mM e 8% de PEG 8k. Utilizando uma pipetadora de seringa de Eppindorf pipetou-se aliquotas de 1 mL desta solução para cada uma das cavidades da placa ‘Linbro’. Misturou-se uma solução que continha 50% desta solução e 50% de solução de FEC-G (33 mg/mL) sobre as peças de cobertura tratadas com silicone. Os volumes típicos destas gotas estavam compreendidos entre 50 pL e 100 pL e devido às grandes dimensões de tais gotas foi necessário tomar precauções ao encher as peças de cobertura e ao colocar as gotas em suspensão sobre as cavidades.

Recolha de Dados

Refinou-se a estrutura com ‘X-PLOR’ (Bruniger, versão 3.0 do X-PLOR, que é um sistema para cristalografia e RMN, Universidade de Yale, New Haven CT) em contraste com os dados a 2,2 À obtidos com um detector de imagens ‘R-AXIS’ de placas (Molecular Structure, Corp. Houston, TX). f. Observações

Produziu-se um FEC-G-hu-r terapêutico humano recombinante eficaz em grandes quantidades e foram facultados vários gramas para análise estrutural. Presume-se que os métodos de cristalização aqui descritos possam vir a ter outras aplicações a partir da altura em que estejam disponíveis outras proteínas relevantes. Este método pode ser aplicado a qualquer projecto cristalográfico em que estejam em jogo grandes quantidades de proteínas

44,/ ί'1' (aproximadamente para valores acima de 200 mg). Conforme é evidente para o especialista na matéria, os materiais e os métodos da presente invenção podem ser modificados e podem ser facultados materiais e métodos equivalentes para a cristalização de outras proteínas.

B. Programa Informático Para Visualizar A Estrutura Tridimensional do FEC-G

Embora os diagramas, tais como os ilustrados nas figuras anexas, sejam úteis para visualizar a estrutura tridimensional do FEC-G, considera-se preferível um programa informático que permita a representação estereoscópica da molécula. Esta representação estereoscópica ou “realidade virtual”, conforme é dito por vezes na gíria da especialidade, permite visualizar a estrutura na sua forma tridimensional, segundo qualquer ângulo, com uma resolução bastante minuciosa, desde a estrutura molecular até ao nível atómico. Os programas informáticos aqui previstos também permitem modificar a perspectiva do ângulo de observação da molécula, por exemplo, fazendo rodar a molécula. Os programas aqui previstos também permitem introduzir modificações tais como, por exemplo, supressão, adição ou substituição de uma ou várias imagens de átomos, incluindo resíduos aminoácidos inteiros, ou permitem acrescentar radicais químicos aos grupos existentes ou substituídos e permitem ainda visualizar as modificações introduzidas na estrutura. E possível utilizar outros sistemas assentes em meios informáticos, os quais devem possuir como elementos constituintes: (a) um dispositivo para permitir a introdução de informação, por exemplo, coordenadas ortogonais ou outras coordenadas de tipo numérico correspondentes à estrutura tridimensional da FEC-G; (b) um dispositivo para exprimir tais coordenadas, por exemplo, um órgão de visualização que permita observar a estrutura tridimensional e correlacionar tal estrutura tridimensional com a composição da molécula do 45 45

FEC-G, por exemplo, a composição de aminoácidos; (c) facultativamente um dispositivo para a introdução de informação que modifique a composição da molécula de FEC-G expressa, por forma a que a imagem de tal estrutura tridimensional revele a composição alterada.

As coordenadas para o programa informático preferido que se utiliza estão indicadas na figura 5. O programa informático preferido é a versão 4 de ‘Insight Π’, fornecido por “Biosym” em San Diego, CA. No que diz respeito à estrutura cristalografica bruta, as intensidades observadas respeitantes a dados de difracção (“F-obs”) e as coordenadas ortogonais também estão na base de dados sobre proteínas do Departamento de Química do Laboratório Nacional de Brookhaven, Upton, Nova Iorque 119723, EUA (Protein Data Bank, Chemistry Department, Brookhaven National Laboratory, Upton, New York 119723, USA), considerando--se tais dados aqui incorporados por referência.

Uma vez introduzidas as coordenadas no programa ‘Insight Π’, é então possível observar facilmente a representação tridimensional do FEC-G num ecrã de um computador. O sistema informático preferido para a visualização é o modelo ‘Silicon Graphics 320 BGX’ (San Diego, CA). Para uma observação estereoscópica é possível aplicar sobre os olhos um dispositivo óptico (Crystal Eyes, Silicon Graphics) que permite que qualquer pessoa visualize a molécula de FEC-G estereoscopicamente nas suas três dimensões, permitindo pois rodar a molécula e antever a arquitectura molecular.

Posto isto, a presente invenção proporciona um método para conceber e projectar ou para preparar um análogo de FEC-G com a ajuda de um computador, o qual compreende os passos seguintes: (a) dotar o referido computador de um dispositivo que permita obter uma imagem da estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, incluindo a imagem da composição 46 dos radicais da referida molécula de FEC-G, e que permita, de preferência, obter a imagem da localização tridimensional de cada aminoácido e mais preferencialmente permita obter a imagem da localização tridimensional de cada átomo de uma molécula de FEC-G; (b) observar a referida imagem; (c) seleccionar um local na referida imagem para alterar a composição da referida molécula ou a localização de um radical; e (d) preparar um análogo de FEC-G com tal alteração. A alteração pode ser escolhida com base nas características estruturais desejadas do produto final constituído pelo análogo de FEC-G, descrevendo-se adiante mais minuciosamente as particularidades para tal arquitectura. Tais particularidades compreendem: a localização e as composições de resíduos aminoácidos hidrofóbicos, em particular resíduos internos das estruturas helicoidais de uma molécula de FEC-G, alterando esses resíduos, quando modificados, a estrutura global do núcleo interno da molécula e podendo impedir a ligação ao receptor; a localização e as composições de estruturas espirais externas cuja alteração possa não afectar a estrutura global da molécula de FEC-G.

As figuras 2 a 4 ilustram a conformação tridimensional geral por vias diferentes. Temos pois o diagrama topológico, o diagrama de serpentina e o diagrama de cilindros, ilustrando todos eles aspectos da conformação do FEC-G. A figura 2 ilustra uma comparação entre a molécula de FEC-G e outras moléculas. Há uma determinada semelhança de arquitectura, emboras estes factores de crescimento sejam diferentes no que diz respeito às conformações locais das suas espiras e da geometria dos i feixes. No entanto, é conservada em todas estas seis moléculas comparadas a topologia ascendente - ascendente - descendente - descendente com duas ligações intermédias compridas, apesar da dissemelhança existente na sequência de aminoácidos. 47 A figura 3 ilustra mais minuciosamente a estrutura secundária da molécula de FEC-G humana recombinante. Este diagrama de serpentina ilustra o sentido de enrolamento das hélices e das suas posições relativas entre si. A figura 4 ilustra, de forma diferente, a conformação da molécula de FEC-G humana recombinante. Este diagrama de “cilindros” ilustra a arquitectura geral da molécula de FEC-G humana recombinante. C. Preparação de Análogos Utilizando a Mutagenese do M13 Este exemplo descreve a preparação de análogos de FEC-G utilizando técnicas de mutagenese dirigida ao local, envolvendo o bacteriófago M13 de cadeia única, em conformidade com os métodos publicados no pedido de patente de invenção PCT com o número WO 85/00817 (Souza et ai, publicado em 28 de Fevereiro de 1985, aqui incorporado por referência). Este método implica essencialmente a utilização de uma matriz de ácido nucleico de cadeia única da sequência não mutagenizada e a ligação que se lhe faz de um oligonucleótido mais pequeno que contém a desejada modificação na sequência. As condições de hibridação permitem que tenha lugar a hibridação de sequências não idênticas e a sequência restante é preenchida de modo a ficar idêntica à matriz original. Daqui resulta uma molécula de cadeia dupla em que uma das duas cadeias possui a modificação desejada. Esta cadeia única mutagenizada é separada e por sua vez utilizada como matriz para a sua cadeia complementar. Isto vai criar uma molécula de cadeia dupla com a modificação desejada. A sequência utilizada de ácido nucleico do FEC-G original está apresentada na figura 1 e os oligonucleótidos que contêm os ácidos nucleicos mutagenizados estão apresentados no quadro 2. As abreviaturas aqui utilizadas para os resíduos aminoácidos e para os nucleótidos 48 são as convencionais (ver Stryer, ‘Biochemistry’, 3a ed., W.H Freeman e Company, N.Y., N. Y. 1988, no verso da contracapa). A sequência do ácido nucleico do FEC-G original foi colocada em primeiro lugar dentro do vector M13mp21. Depois isolou-se e colocou-se novamente em suspensão em água o ADN do fago M13mp21 de cadeia singular que continha a sequência do FEC-G original. Para cada reacção misturou-se 200 ng deste ADN com 1,5 pmol de oligonucleótido fosforilado (quadro 2) e colocou-se em suspensão em meio constituído por Tris 0,1 M, Mg02 O, 01 M, DTT 0,005 M e ATP 0,1 mM a pH 8,0. A recombinação dos ADN teve lugar mediante aquecimento a 65°C e arrefecimento lento até à temperatura ambiente.

Depois de os ADN terem arrefecido acrescentou-se 0,5 mM de cada uma das substâncias ATP, dATP, dCTP, dGTP e TTP, 1 unidade de ligase do ADN das T4 e 1 unidade do fragmento de Klenow de polimerase 1 de E. coli a 1 unidade de ADN recombinado em meio constituído por Tris 0,1 M, NaCl 0,025 M, MgCl2 0,01 M e DTT 0,01 M a pH 7,5. O ADN circular fechado, agora de cadeia dupla, foi utilizado sem mais nenhuma purificação para transfectar E. coli. Efectuou-se uma pesquisa das placas efectuando a colheita com filtros de nitrocelulose e hibridando depois os filtros com ADN de cadeia única marcado na extremidade com 32P, durante 1 hora a 55-60°C. Depois a hibridação efectuou-se a lavagem dos filtros a uma temperatura de 0-3°C abaixo da temperatura de íúsão do oligonucleótido (2°C para o A-T e 4°C para o G-C) que emitiu selectivamente sinais autorradiográficos correspondentes às placas com o fago que continha a sequência mutacionada. Os clones positivos foram confirmados por sequenciação.

Seguidamente estão indicados os oligonucleótidos utilizados para cada análogo de FEC-G preparado pelo método e mutagenese do Ml3. A nomenclatura indica o resíduo e a 49 posição do aminoácido original (v.g., o resíduo lisina na posição 17) e o resíduo e a posição do aminoácido substituído (v.g., o resíduo arginina na posição 17). Uma substituição envolvendo mais do que um resíduo é indicada pelo mutação com sobrescrito, com vírgulas entre as posições assinaladas ou com um ponto e vírgula a indicar resíduos diferentes. As supressões sem nenhumas substituições não estão assinaladas.

Indica-se a seguir as sequências oligonucleotídicas para a mutagenese efectuada com base no M13; estes oligonucleótidos foram produzidos por via sintética, embora o método de preparação não seja crítico, podendo ser utilizado qualquer método e/ou equipamento de síntese de ácidos nucleicos. Também está indicado o comprimento do oligonucleótido. Conforme se disse antes, permitiu-se que estes oligonucleótidos contactassem com o vector bacteriófago de cadeia singular e depois foram acrescentados nucleótidos simples para completar a sequência de ácidos nucleicos do análogo de FEC-G. 50

Quadro 2 ANÁLOGOS DE FEC-G SEQUÊNCIAS Í5’->31 CauDiimento (nudeótido) Sea ID Lis17->Arg17 CIT TCT GCT GCG TTG TCT GGA ACA 24 3 Lis^Aig24 ACA GGT TCG TCG TAT CCA GGG TG 23 4 Lis35->Arg33 CAC TGC AAG AAC GTC TGT GCG CT 23 5 Lis41->Aig41 CGC TAC TTA CCG TCT GTG CCA TC 23 6 Lis,7W5->Aig,7W5 CIT TCT GCT GCG TTG TCT GGA ACA 24 7 ACA GGT TCG TCG TAT CCA GGG TG 23 8 CAC TGC AAG AAC GTC TGT GCG CT 23 9 Lis17’24,41->Aig17’34,41 CIT TCT GCT GCG TTG TCT GGA ACA 24 10 ACA GGT TCG TCG TAT CCA GGG TG 23 11 CGC TAC TTA CCG TCT GTC CCA TC 23 12 Lis17’35,41->Aig17’35’41 CIT TCT GCT GCG TTG TCT GGA ACA 24 13 CAC TGC AAG AAC GTC TGT GCG CT 23 14 CGC TAC TTA CCG TCT GIG CCA TC 23 15 Lis^^Arg2435·4' ACA GGT TCG TCG TAT OCA GGG TG 23 16 CAC TGC AAG AAC GTC TGT GCG CT 23 17 CGC TAC TTA CCG TCT GTG CCA TC 23 18 Lis,7,24,35,4.^^17,24,33,4, CTT TCT GCT GCG TTG TCT GGA ACA 24 19 ACA GGT TCG TCG TAT CCA GGG TG 23 20 CAC TGC AAG AAC GTC TGT GCG CT 23 21 CGC TAC TTA CCG TCT GTG CCA TC 23 22 Cis,8->Ala18 TCT GCT GAA AGC TCT GGA ACA GG 23 23 Gln68->Glu68 CIT GTC CAT CIG AAG CTC TTC AG 23 24 Cis37,43->Sei37,43 GAA AAA CIG TCC GCT ACT TAC AAA CIG TCC CAT CCG G 37 25 Gln^Ala26 TTC GTA AAA TCG CGG GIG AOG G 22 26 Gln174->Ala174 TCA TCT GGC TGC GCC GTA ATA G 22 26 Arg,7D->Ala170 CCG TGT TCT GGC TCA TCT GGC T 22 28 Arg167->Ala167 GAA GTA TCT TAC GCT GTT CIG CGT 24 29 Supressão 167 GAA GTA TCT TAC TAA GTT CIG CGT C 25 30 Lis41->Ala41 CGC TAC TTA CGC ACT GIG CCA T 22 31 His^Lis44 CAA ACT GIG CAA GCC GGA AGA G 22 32

Quadro 2 (continuação) ANÁLOGOS DE FEC-G SEQUÊNCIAS β’->3Ί Caiprimento Sea.ID (hudeótxb) Glu47->Ala47 CAT CCG GAA GCA CIG GTA CIG C 22 33 Aig^Ala23 GGA ACA GGT TGC TAA AAT CCA GG 23 34 Lis^Ala24 GAA CAG GTT CGT GCG ATC CAG GGT G 25 35 Glu^Ala20 GAA ATG TCT GGC ACA GGT TCG T 22 36 Asp28->Ala28 TCC AGG GTG CCG GIG CIG C 19 37 Met,27->Glu127 AAG AGC TCG GTG AGG CAC CAG CT 23 38 Met^-^lu13* CIC AAG GIG CIG AGC CGG CAT TC 23 39 Met127->Leu127 GAG CIC GGT CIG GCA CCA GC 20 40 Met138->Leu13* TCA AGG TGC TCT GCC GGC ATT 21 41 Ser13->Ala13 TCT GCC GCA AGC CIT TCT GCT GA 23 42 LisI7->Ala17 CIT TCT GCT GGC ATG TCT GGA ACA 24 43 Gln121->Ala121 CTA TTT GGC AAG CGA TGG AAG AGC 24 44 Glu124->Ala124 CAG ATG GAA GCG CIC GGT ATG 21 45 Met127,138->Leu127,138 GAG CFC GGT CIG GCA CCA GC 20 46 TCA AGG TGC TCT GCC GGC ATT 21 47 **Glu20->AJa20; GAA ATG TCT GGC ACA GGT TCG T 22 48 Ser13->Gli13 ** Este análogo apareceu durante a preparação do análogo Glu20—►Ala20 do FEC-G. Tendo sido sequenciados diversos clones para se identificar o análogo Gflu20-»Ala20, identificou-se o análogo Glu20—►Ala20; Ser13-»Gli13. Este mutante duplo resultou de um erro de reacção de Klenow in vitro com a polimerase de ADN. D. Preparação de Análogos de FEC-G Recorrendo à Amplificação do ADN Este exemplo descreve métodos para a produção de análogos de FEC-G utilizando a técnica de amplificação do ADN. Dito de forma prática, amplificou-se o ADN que codifica cada análogo em duas partes separadas, depois combinou-se e a seguir amplificou-se a própria sequência total. Dependendo da modificação desejada que se pretendia realizar no ADN do FEC-G original, assim foram utilizados iniciadores internos para incorporar a modificação e para gerar as duas partes amplificadas e separadas. Por exemplo, para a amplificação da extremidade 5’ do ADN do análogo desejado, utilizou-se um iniciador de flanqueamento em 5’ (complementar de uma sequência do plasmídeo a montante do ADN original do FEC-G) numa extremidade da região que se pretendia amplificar e utilizou-se um iniciador interno, capaz de hibridar com o ADN original, mas que incorporava a mudança desejada, para excitar a outra extremidade. A região amplificada resultante alongou-se desde o iniciador de flanqueamento em 5’, através do iniciador interno. Executou-se procedimento idêntico para o terminal 3’, utilizando um iniciador de flanqueamento em 3’ (complementar de uma sequência do plasmídeo a jusante do ADN original do FEC-G) e um iniciador interno complementar da região da mutação pretendida. A partir do momento em que as duas “metades” (que podem ter ou não um comprimento igual, dependendo isso da localização do iniciador interno) foram amplificadas, permitiu-se que essas “metades” se unissem entre si. Uma vez unidas, o iniciador de flanqueamento em 5’ e o iniciador de flanqueamento em 3’ foram utilizados para amplificar a sequência completa que continha a modificação pretendida.

No caso de se pretender realizar mais do que uma modificação, é possível alterar o processo descrito antes, de modo a incorporar a modificação no iniciador interno, ou então é possível repetir o processo utilizando um iniciador interno diferente. Em alternativa, é possível utilizar o processo de amplificação génica com outros métodos para produzir modificações na sequência do ácido nucleico, por exemplo, a técnica de mutagenese com base nos fagos, conforme descrito supra. Seguidamente efectua-se a descrição de exemplos do processo para a preparação de análogos com mais de uma modificação.

Para a criação dos análogos de FEC-G descritos adiante, o ADN matricial utilizado foi a sequência ilustrada na figura 1 mais determinadas regiões de flanqueamento (de um plasmídeo que continha a região de codificação do FEC-G). Estas regiões de flanqueamento foram utilizadas como iniciadores de flanqueamento em 5’ e 3’ e estão definidas adiante. As reacções de amplificação foram realizadas em volumes de 40 pL contendo Tris-HCl 10 mM, MgCl21,5 mM, KC1 50 mM, gelatina na concentração de 1,0 mg/mL a pH 8,3 e a 20°C. Os volumes de reacção de 40 pL também continham 0,1 mM de cada um dos dNTP, 10 pmoles de cada iniciador e 1 ng de ADN matricial. Repetiu-se cada amplificação durante 15 ciclos. Cada ciclo consistiu em trabalhar 0,5 minutos a 94°C, 0,5 minutos a 50°C e 0,75 minutos a 72°C. Os iniciadores de flanqueamento tinham um comprimento de 20 nucleótidos e os iniciadores internos tinham um comprimento entre 20 e 25 nucleótidos. Isto deu origem a cópias múltiplas do ADN de cadeia dupla codificando quer a parte anterior quer a parte posterior do análogo desejado de FEC-G.

Para efectuar a combinação das duas “metades”, combinou-se a quadragésima parte de cada uma das duas misturas de reacção com um terço da mistura de reacção de amplificação do ADN. Aguardou-se que tivesse lugar a recombinação das duas partes no local do iniciador interno, uma vez que as suas extremidades portadoras da mutação eram complementares, e a seguir a um ciclo de polimerização obteve-se uma sequência de ADN de comprimento completo. Uma vez assim recombinado, amplificou-se o análogo inteiro, utilizando os iniciadores de flanqueamento em 5’ e 3’. Repetiu-se este processo de amplificação durante 15 ciclos, conforme descrito antes. A sequência completa do ADN do análogo amplificado foi clivada com as endonucleases de restrição Xbal e Xhol para proporcionar extremidades coesivas para inserção num vector. Colocou-se o ADN clivado dentro de um vector plasmídico e utilizou-se esse vector para transformar E. coli. Os transformantes foram estimulados com canamicina na concentração de 50 pg/mL e subsequentemente incubados a 30°C. A produção da proteína análoga de FEC-G foi confirmada por electroforese em gel de poliacrilamida realizada com um lisado celular integral. A presença da mutação desejada foi confirmada pela análise da sequência de ADN do plasmídeo purificado a partir do isolado produzido. Depois deixou-se as culturas crescerem e efectuou-se uma colheita de células, tendo os análogos de FEC-G sido purificados conforme adiante se explica.

No quadro 3 subsequente estão indicados os iniciadores específicos utilizados para cada análogo feito com recurso à amplificação génica.

Quadro 3

Análogo Iniciador Interno (5 ’ ->3 ’) Sequência Π)

His44^ Ala44 iniciador em 5' TTCCGG AGCGC AC AGTTTG 49 iniciador em 3’CAAACTGTGGGCTCCGGAAGAGC 50

Thr117-> Ala117 iniciador em 5’ ATGCCAAATTGC AGT AGCAAAG 51 iniciador em 3’ CTTTGCTACTGCAATTTGGCAACA 52

Aspll0-> Ala110 iniciador em 5’ATCAGCTACTGCTAGCTGCAGA 53 iniciador em 3’ TCTGCAGCTAGCAGTAGCTGACT 54

Gln21-> Ala21 iniciador em 5’ TTACGAACCGCTTCCAGACATT 55 iniciador em 3’ AATGTCTGGAAGCGGTTCGTAAAAT 56

AspU3->Ala113 iniciador em 5’ GTAGCAAATGCAGCTACATCTA 57 iniciador em 3’ TAGATGTAGCTGCATTTGCTACTAC 58

Ms53-> Ala53 iniciador em 5’ CCAAGAGAAGCACCCAGCAG 59 iniciador em 3’ CTGCTGGGTGCTTCTCTTGGGA 60

Para cada análogo utilizou-se o seguinte iniciador de flanqueamento em 5’: 5 ’-CACTGGCGGTGATAATGAGC 61

Para cada análogo utilizou-se o seguinte iniciador de flanqueamento em 3’: 3’-GGTCATTACGGACCGGATC 62 55 1. Construção da Mutação Dupla

Para se obter o análogo Gln12,21-> Glu12,21 de FEC-G foram realizadas duas amplificações separadas de ADN para se criar as duas mutações de ADN. O ADN matricial utilizado tinha a sequência indicada na figura 1 mais determinadas regiões de fianqueamento (de um plasmídeo que continha a região de codificação do FEC-G). As sequências exactas estão indicadas adiante. Cada uma das duas reacções de amplificação do ADN foi realizada utilizando um aparelho ‘Perkin Elmer/Cetus DNA Thermal Cycler’. O volume de 40 pL da reacção era uma mistura constituída por tampão de RCP IX (Cetus), 0,2 mmol de cada um dos quartos dXTP (Cetus), 50 pmol de cada um dos oligonucleótidos iniciadores, 2 ng do ADN matricial de FEC-G (num vector plasmídico) e uma unidade de polimerase de Taq (Cetus). O processo de amplificação decorreu durante 30 ciclos. Cada ciclo consistiu em trabalhar durante 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 50°C e 3 minutos a 72°C.

Na amplificação “A” do ADN foram utilizados os oligonucleótidos: 5’ CCACTGGCGGTGATACTGAGC 3’ (Seq ID 63) e 5’ AGCAGAAAGCTTTCCGGCAGAGAAGAAGCAGGA 3’ (Seq ID 64)

Na amplificação “B” do ADN foram utilizados os oligonucleótidos: 5’ G(XGCAAAGCITTCTGCTGAAATGTCTGGAAGAGGrlTCGTAAAATXXAGGGrrGA 3 ’ (Seq ID 65) e 5’ CTGGAATGCAGAAGCAAATGCCGGCATAGCACCTTCAGrCGGTTGCAGAGCTGGTGCCA 3 ’ (SeqID66). A partir do produto de ADN de cadeia dupla de 109 pares de bases, obtido a seguir à amplificação “A” do ADN, cortou-se e isolou-se um fragmento de ADN de 64 pares de bases de Xbal para HindIII, o qual continha a mutação Gln12->Glu12 do ADN. A partir do produto de ADN de cadeia dupla de 509 pares de bases, obtido a seguir à amplificação “B” do ADN, cortou-se e isolou-se um fragmento de ADN de 197 pares de bases de HinHI para Bsml, o qual continha a mutação Gln21->Glu21 do ADN.

Os fragmentos “A” e “B” foram ligados conjuntamente com um segmento de Xbal de 4,8 mil pares de bases para o fragmento do vector plasmídico do ADN de Bsml. A mistura de ligação era constituída por fragmentos de restrição de ADN equimolares, tampão de ligação Tris-HCl 25 mM a pH 7,8, MgC^ 10 mM, DTT 2 mM, ATPr 0,5 mM, ASB na concentração de 100 pg/mL) e ligase do ADN das T4, tendo a incubação decorrido de um dia para o outro a 14°C. O ADN ligado foi então transformado dentro de células FM5 de E. coli por electro-poração, utilizando para tal um aparelho de modelo ‘Bio Rad Gene Pulsar’ (BioRad, Richmond, CA). Isolou-se um clone e comprovou-se por sequenciação do ADN que o arquétipo plasmídico continha as duas mutações. Neste vector ‘intermediário’ também havia uma supressão de um segmento de 193 pares de bases de de Bsml para o fragmento de ADN do Bsml. Construiu-se um vector plasmídico final por ligação e transformação (conforme descrito supra) dos fragmentos de ADN obtidos por corte e isolamento de um segmento de Sstl de 2 mil pares de bases para o fragmento de ADN do BamHI proveniente do vector intermediário, um segmento de Sstl de 2,8 kpb para o fragmento de ADN de EcoRI proveniente do vector plasmídico e um segmento de BamHI de 360 pb para o fragmento de ADN de EcoRI proveniente do vector plasmídico. Verificou-se o arquétipo final por sequenciação do ADN do gene do FEC-G. Depois de as culturas se terem desenvolvido, efectuou-se a colheita das células e realizou-se a purificação dos análogos de FEC-G como a seguir se descreve.

Conforme indicado antes, é possível utilizar qualquer combinação de técnicas de mutagenese para se gerar um ácido nucleico análogo de FEC-G (e o produto de expressão) em que haja uma ou mais dò que uma alteração. Os dois exemplos anteriores, utilizando a mutagenese à base de M13 e a mutagenese à base da amplificação gémea, são ilustrativos. E. Expressão de ADN de Análogos de FEC-G Introduziu-se seguidamente os ADN de análogos de FEC-G num vector plasmídico que foi utilizado para transformar a estirpe FM5 de E. coli (ATCC#53911). Estes ADN dos análogos de FEC-G, contidos nos plasmídeos e nas células hospedeiras bacterianas, podem ser obtidos na Colecção Americana de Culturas Tipo (American Type Culture Collection, Rockville, MD) cujos números de acesso são indicados a seguir.

Foram produzidas culturas de 1 L num caldo que continha 10 g de triptona, 5 g de extracto de levedura e 5 g de NaCl, à temperatura de 30°C, até se atingir uma densidade de 0,5 a A600, tendo então as culturas nessa altura sido aquecidas rapidamente para 42°C. A agitação dos balões prosseguiu durante 3 horas.

Também é possível utilizar outras células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, por exemplo, outras células, estirpes ou espécies bacterianas, células em cultura retiradas de mamíferos (COS, OCC (o mesmo que CHO) ou de outro tipo), células de insectos ou órgãos ou organismos multicelulares correspondentes, ou células de plantas ou órgãos ou organismos multicelulares correspondentes, sabendo os especialistas na matéria como identificar o hospedeiro conveniente. Os presentes análogos de FEC-G e as composições congéneres também podem ser preparados por via sintética, por exemplo, pelos métodos de síntese de péptidos em fase sólida, ou então por meio de outras técnicas de produção por via química. Há outros sistemas de clonagem e de expressão que são evidentes para os especialistas na matéria.

F. Purificação de Proteínas de Análogos de FEC-G Efectuou-se uma colheita de células por centrifugação (10 000 x g, 20 minutos, 4°C). Colocou-se a massa obtida (normalmente 5 g) novamente em suspensão em 30 mL de DTT lmM e fez-se passar três vezes por uma prensa continental à pressão de 10 000 psi. Esta suspensão de células desmembradas foi centrifugada a 10 000 x g durante 30 minutos, depois removeu-se o sobrenadante e com a massa obtida preparou-se nova suspensão em 30 - 40 mL de água. Centrifugou-se esta suspensão a 10 000 x g durante 30 minutos e a massa obtida foi depois dissolvida em 25 mL de ‘SarkosyT a 2% e Tris 50 mM a pH 8. Juntou-se sulfato de cobre até uma concentração de 40 μΜ e deixou-se a mistura sob agitação pelo menos durante 15 horas a 15-25°C. A seguir centrifugou-se a mistura a 20 000 x g durante 30 minutos. Diluiu-se a mistura proteica solubilizada resultante quatro vezes com Tris 13,3 mM a pH 7,7, removeu-se a substância ‘Sarkosyl’ e depois aplicou-se o sobrenadante a uma coluna de DEAE--celulose (Whatman DE-52) equilibrada com Tris 20 mM a pH 7,7. Depois de se ter carregado e lavado a coluna com o mesmo tampão, efectuou-se a eluição dos análogos com Tris 10 mM/ /NaCl (entre 35 mM e 100 mM, dependendo isso do análogo, conforme indicado adiante) a pH 7,7. Para a maioria dos análogos ajustou-se para 5,4 o valor do pH do eluente proveniente da coluna de DEAE, utilizando para tal ácido acético a 50%, diluído conforme necessário (para se obter uma condutividade correcta) com acetato de sódio 5 mM a pH 5,4. Depois introduziu-se a solução numa coluna de ‘CM-Sepharose’ equilibrada com acetato de sódio 20 mM a pH 5,4. A seguir lavou-se a coluna com NaAc 20 mM a pH 5,4, até a ábsorvência a 280 nm ser aproximadamente zero. Realizou-se depois a eluição do análogo de FEC-G com acetato de sódio/NaCl em concentrações indicadas no quadro 4 subsequente. Os eluentes da coluna de DEAE para esses análogos não aplicados à coluna de ‘CM-Sepharose’ foram dialisados directamente num tampão de NaAc 10 mM a pH 4,0. Os análogos de FEC-G purificados foram então isolados convenientemente para análise in vitro. As concentrações salinas praticadas para a eluição dos análogos variaram, conforme se disse antes. Seguidamente estão indicadas as concentrações para a coluna de DEAE-celulose e para a coluna de ‘CM-Sepharose’.

Quadro 4

Concentrações salinas

Análogo DEAE-celulose CM-Sepharose Lis17->Arg17 35mM 37,5mM Lis^Arg24 35mM 37,5mM Lis35->Arg35 , 35mM 37,5mM Lis41->Arg41 35mM 37,5mM Lis17,24’ 35->Arg17,24,35 35mM 37,5mM Lis17,35,41->Arg17,35,41 35mM 37,5mM Lis24,35,41->Arg24,35’41 35mM 37,5mM LiS17’24’35’41->Arg17’24,35’41 35mM 37,5mm Lis17,24’41->Arg17’24,41 35mM 37,5mM Gln68->Glu68 60mM 37,5mm Cis^Ser37’43 40mM 37,5mM Gln^Ala26 40mM 40mM Gln174->Ala174 40mM 40mM Argl70->Ala170 40mM 40mM Argl67->Ala167 4QmM 40mM Supressão 167* N/A N/A Lis41->Ala41 160mM 4Gmm His^Lis44 40mM 60mM Glu47->Ala47 40mM 40mM Arg^Ala23 40mM 40mM Lis^Ala24 120mM 40mM Glu^Ala20 40mM 60mM Asp^Ala28 40mM 80mM

60 Quadro 4 (continuação) Análoeo DEAE-celulose CM-Sepharose Met127->Glu127 80mM 40mM Met138->Glu138 80mM 40mM Met127->Leu127 40mM 40mM Met138->Leu138 40mM 40mM Cis18->Ala18 40mM 37,5mM Gln12-2,->Glu,2íl 60mM 37,5mM Gln12,21,68->Glu12,21’68 60mM 37,5mM Glu20->Ala20; Ser13->Gli13 40mM 80mM Met127’138->Leu127,138 40mM 40mM Ser,3->Ala13 40mM 40mM Lis17->Ala17 80mM 40mM Gln121->Ala121 40mM 60mM Gln21->Ala21 50mM Gradiente 0-150 mM His^Ala44** 40mM N/A His53->Ala53** 50mM N/A Asp110->Ala110*** 40mM N/A Asp113->Ala113*** 40mM N/A Thrm->Ala117** 50mM N/A Asp28->Ala28; 50mM N/A > *3 M W O Ala110** Glu124->Ala124** 40mM 4QmM 167 * Para a supressão não há dados disponíveis. ** Para estes análogos fez-se a purificação utilizando apenas a coluna de DEAE-celulose

Os métodos de purificação referidos antes são ilustrativos e qualquer especialista na matéria sabe identificar outros meios para a obtenção dos análogos de FEC-G da presente invenção. G. Ensaios Biológicos

Independentemente dos métodos utilizados para a criação dos análogos de FEC-G da presente invenção, tais análogos foram sujeitos a ensaios de pesquisa da actividade biológica. Foram realizadas experiências com timidina tritiada para se avaliar o grau de divisão celular. No entanto, é possível realizar outro tipo de ensaios biológicos para se determinar a actividade desejada. Os ensaios biológicos, tais como os que são efectuados para determinação da capacidade de indução da diferenciação terminal na linhagem de células leucémicas WEHI-3B (D+) do murganho, também proporcionam uma indicação sobre a actividade dos FEC-G. Ver Nicola, et αί, ‘Blood’ 54: 614-27 (1979). É possível recorrer a outros ensaios in vitro para avaliar a actividade biológica. Ver Nicola, Annu. Rev. Biochem. 58:45-77 (1989). De um modo geral, os testes de pesquisa da actividade biológica devem compreender a análise dos resultados desejados, por exemplo, aumento ou diminuição de actividade biológica (comparativamente com os FEC-G não modificados), actividade biológica diferente (comparativamente com os FEC-G não modificados), análises de afinidade com o receptor ou análises de período de semi-vida no soro. Esta enumeração é incompleta, sabendo os especialistas na matéria como identificar outros ensaios úteis para testar o resultado final desejado.

Realizou-se o ensaio com 3H-timidina utilizando métodos convencionais. A medula óssea foi retirada de fêmeas de murganho da estirpe Balb C, depois de sacrificadas. As células da medula óssea foram rapidamente colocadas em suspensão, centrifugadas e novamente 62 colocadas em suspensão num meio de crescimento. Em cada cavidade de uma placa de microtitulaçao de 96 cavidades introduziu-se uma aliquota de 160 pL que continha aproxi-madamente 10 000 células. Juntou-se a cada cavidade as amostras do análogo do FEC-G purificado (preparado conforme se disse antes) e manteve-se a incubar durante 68 horas. Juntou--se timidina tritiada a cada uma das cavidades e deixou-se incubar durante mais 5 horas. Decorrido o período de incubação de 5 horas efectuou-se a colheita das células, filtrou-se e enxaguou-se muito bem. Os filtros foram então colocados num frasco que continha fluido de cintilação. Efectuou-se a contagem da emissão β (contador de cintilação de modelo LKB Betaplate). Foram analisados em triplicado padrões e análogos e as amostras que ficaram bastante acima ou bastante abaixo da curva padrão foram novamente analisadas, utilizando a diluição adequada. Os resultados aqui indicados são a média dos dados em triplicado obtidos com os análogos, comparativamente com os resultados normais obtidos com o FEC-G humano recombinante inalterado.

H. Análise por CLER

As amostras de análogos purificados foram estudadas por cromatografia em liquido de elevada resolução. Embora a posição dos picos numa coluna de CLER de fase inversa não seja um indicador definitivo da semelhança estrutural entre duas proteínas, os análogos que têm tempos de retenção semelhantes podem ter com a coluna de CLER o mesmo de tipo de interacções hidrofóbicas da molécula inalterada. Isto é um indicador da existência de uma estrutura global semelhante.

Efectuou-se a análise de amostras do análogo e do FEC-G humano recombinante inalterado numa coluna de fase inversa de modelo ‘Vydac 214TP54’ (0,46 cm x 25 cm) 63 (Separations Group, Inc. Hesperia, CA). As amostras purificadas do análogo de FEC-G foram preparadas em acetato 20 mM e em solução de NaCl 40 mM tamponada a pH 5,2 até uma concentração final entre 0,1 mg/mL e 5 mg/mL, dependendo isso do comportamento do análogo na coluna. Carregou-se na coluna de CLER quantidades variáveis (dependendo da concentração), a qual havia sido equilibrada com uma solução aquosa que continha 1% de isopropanol, 52,8% de acetonitrilo e 0,38% de trifluoroacetato (TFA). Submeteu-se as amostras a um gradiente de acetonitrilo à razão de 0,86%/minuto e TFA a 0,002%. I. Resultados

Seguidamente são apresentados os resultados dos ensaios biológicos anteriores e das análises por CLER. A actividade biológica é a média de dados em triplicado e está indicada como percentagem relativamente ao padrão de contraprova (FEC-G inalterado). A posição relativa do pico na CLER é a posição do análogo de FEC-G relativamente ao pico do padrão de contraprova (FEC-G inalterado). Os símbolos “+” ou indicam se o pico do análogo na CLER estava avançado ou atrasado em relação ao pico do padrão de contraprova (em minutos). Nem todas as variantes haviam sido analisadas para pesquisa do pico relativo na CLER, apenas estando indicadas a seguir as que foram analisadas. Também estão indicadas as designações das células hospedeiras de E. coli existentes na Colecção Americana de Culturas Tipo (o mesmo que ATCC) que contêm os ácidos nucleícos que codificam os análogos da presente invenção, preparados conforme se disse antes. 64

Quadro 5

Seq.Id Variante Análogo Pico relativo naCLER ATCC N° Actividade do FEC-G (normal (%) 67 1 Lis17->Arg17 N/A 69184 N/A 68 2 Lis^Arg24 N/A 69185 N/A 69 3 Lis35->Arg35 N/A 69186 N/A 70 4 Lis41->Arg41 . N/A 69187 N/A 71 5 Lis^^Aig17’24’35 N/A 69189 N/A 72 6 Lisim41->ArgTO5’41 N/A 69192 N/A 73 7 Lis24’35’41->Arg24,35’41 N/A 69191 N/A 74 8 Lis^35,41_>Arg17,24,35,41 N/A 69193 N/A 75 9 Lislw,->Argn^41 N/A 69190 N/A 76 10 Gln68->Glu68 N/A 69196 N/A 77 11 Cis37,43->Ser37'43 N/A 69197 N/A 78 12 Gln^Ala26 +0,96 69201 51% 79 13 On,74->Ala174 +0,14 69202 100% 80 14 Arg170->Ala170 +0,78 69203 100% 81 15 Arg167->Ala167 +0,54 69204 110% 82 16 Supressão167 -0,99 69207 N/A 83 17 Lis41->Ala41 +0,25 69208 81% 84 18 His^Lis44 -1,53 69212 70% 85 19 Glu47->Ala47 +0,14 69205 0% 86 20 Arg^Ala23 -0,03 69206 31% 87 21 Lis^Ala24 +1,95 69213 0% 88 22 Gu20->Ala20 -0,07 69211 0% 89 23 Asp^Ala28 -0,30 69210 147% 90 24 Met127->Glu127 N/A 69223 N/A 91 25 MetB8->Glu138 N/A 69222 N/A 92 26 Metm->Leu127 N/A 69198 N/A 93 27 Met138->Leu138 N/A 69199 N/A 94 28 Cis18->Ala18 N/A 69188 N/A 95 29 Gln^-^lu1*21 N/A 69194 N/A 65

Quadro 5 (continuação)

Seq.Id Variante Análogo Pico relativo na CLER ATCC N° ActívidadedoEECG (normal (%) 96 30 Gln^-^Glu1^ N/A 69195 N/A 97 31 Glu^Ala20; Ser13->GM13 +1,74 69209 0% 98 32 Met^^Leu127’138 +1,43 69200 98 99 33 Ser13->Ala13 0 69221 110% 100 34 Us17->Ala17 +0,50 69226 70% 101 35 CHn121->Ala121 +2,7 69225 100% 102 36 Gln21->Ala21 +0,63 69217 9,6% 103 37 His^Ala44 +1,52 69215 10,8% 104 38 Hs53->Ala53 +0,99 69219 8,3% 105 39 AspU0->Ala110 +1,97 69216 29% 106 40 V^Ala'13 -0,34 69218 0% 107 41 Thr117->Ala117 +0,4 69214 9,7% 108 42 Asp^Ala28; Aspn0-> Ala110 +3,2 69220 20,6% 109 43 du^Ala124 40,16 69224 75% 110 44 Phe114->Val114, TU7->A117 ** +0,53 0% ** Este análogo foi aparentemente um resultado de um erro casual no oligo que foi utilizado para a preparação do número 41, indicado supra (Thr1I7->Ala117), e por isso foi preparado em conformidade com o processo utilizado para esse análogo “N/A” significa que os dados não estão disponíveis 1

Identificação de RelacÒes de Tipo Estrutura-Função O primeiro passo utilizado para a concepção dos análogos da presente invenção consistiu em determinar quais os radicais necessários para se manter a integridade estrutural da molécula de FEC-G. Isto foi feito ao nível dos resíduos aminoácidos, embora para efeitos de análise também seja possível trabalhar ao nível atómico. A modificação dos resíduos 66 necessários para se manter a integridade estrutural origina uma mudança na estrutura global da molécula de FEC-G. Isto pode ou não ser desejável, dependendo do análogo que se pretenda produzir. Os exemplos experimentais aqui descritos foram concebidos para se manter a integridade estrutural genérica da molécula de FEC-G, com a finalidade de manter a propriedade de ligação do análogo ao receptor de FEC-G (tal como utilizada a seguir nesta secção, a expressão “receptor de FEC-G” designa o receptor do FEC-G natural, existente nas células hematopoiéticas). Admitiu-se e confirmou-se pelos estudos aqui apresentados que a ligação ao receptor do FEC-G é um passo necessário para que haja pelo menos uma actividade biológica, conforme determinado pelos ensaios biológicos indicados supra.

Conforme se observa nas figuras, o FEC-G (neste caso, o met-FEC-G humano recom-binante) é um feixe helicoidal 4-a antiparalelo com torção levógira e com dimensões totais 45Â x 30Á x 24À. As quatro hélices do feixe são designadas por hélices A, B, C e D e as suas espiras de ligação são designadas por espiras AB, BC e CD. Os ângulos de desenvolvimento helicoidal variam entre -167,5° e -159,4°. As hélices A, B e C são contínuas, ao passo que a hélice D contém duas espécies de características estruturais, em Gli 150 e Ser 160 (do met--FEC-G humano recombinante). Acima de tudo, as moléculas de FEC-G são constituídas por um feixe de quatro hélices ligadas em série por espiras externas. Esta informação estrutural foi correlacionada depois com a informação funcional conhecida. Sabia-se que os resíduos (incluindo o resíduo metionina na posição 1) 47, 23, 24, 20, 21, 44, 53, 113, 110, 28 e 114 podiam ser modificados e que o efeito sobre a actividade biológica seria importante. A maior parte das mutações singulares que fazem diminuir a actividade biológica estava centrada em tomo de duas regiões do FEC-G que estão separadas por 30Â e estão localizadas em faces diferentes do feixe de 4 hélices. Uma região implica interacções entre a 67·*' 67·*'

hélice A e a hélice D. Isto também foi confirmado pelo presença de pontes salinas na molécula inalterada, conforme a seguir se indica: Átomo Hélice Átomo Hélice Distância Arg 170 NI D Tir 166 OH A 3,3 Tir 166 OH D Arg 23 N2 A 3,3 Glu 163 OE1 D Arg 23 NI A 2,8 Arg 23 NI A Gin 26 OE1 A 3,1 Gin 159 NE2 D Gin 26 0 A 3,3

As distâncias aqui assinaladas são para a molécula A, conforme indicado na figura 5 (em que três moléculas de FEC-G cristalizaram conjuntamente e foram designadas por A, B e C). Conforme se pode ver, há uma rede de pontes salinas entre a hélice A e a hélice D, que actuam no sentido de estabilizarem a estrutura da hélice A e consequentemente afectam a estrutura total da molécula de FEC-G. A área centrada em tomo dos resíduos Glu 20, Arg 23 e Lis 24 foi observada na face hidrofílica da hélice A (resíduos 20-37). A substituição dos resíduos com os resíduo alanina sem carga nas posições 20 e 23 originou tempos de retenção semelhantes na CLER, indicando isso similaridade estrutural. A alteração destes sítios modificou a actividade biológica (conforme indicado pelos estudos da presente invenção). A substituição em Lis modificou a actividade biológica, mas não proporcionou na CLER um tempo de retenção idêntico ao das outras duas alterações. O segundo local em que a alteração fez baixar a actividade biológica envolve a hélice AB. A troca de glutamina na posição 47 por alanina (análogo número 19, supra) reduziu a zero a actividade biológica (no ensaio de incorporação da timidina). A hélice AB é predominantemente hidrofóbica, excepto nos terminais amino e carboxi; contém uma espira de uma hélice 310. 68 68

Há dois resíduos histidina em cada terminal (His 44 e His 56) e mais um radical glutamato no resíduo 46 que tem o potencial de formar uma ponte salina para His 44. A análise espetrográfica de infravermelhos pela transformada de Fourier (TVFT) efectuada ao análogo sugere que este é estruturalmente semelhante à molécula inalterada do FEC-G recombinante. Experiências complementares comprovaram que este análogo poderia não cristalizar nas mesmas condições em que cristaliza a molécula recombinante inalterada.

As alterações no terminal carboxi (Gin 174, Arg 167 e Arg 170) tiveram um efeito diminuto sobre a actividade biológica. Pelo contrário, a supressão dos últimos 8 resíduos (167-175) fez baixar a actividade biológica. Estes resultados podem significar que a supressão desestabiliza a estrutura global, o que impede o mutante de se ligar convenientemente ao receptor do FEC-G (e consequentemente impede o início da transdução do sinal).

De um modo geral, para o núcleo interno do FEC-G, isto é, o feixe das quatros hélices internas a que faltam as espiras externas, os resíduos internos hidrofóbicos são essenciais para a sua integridade estrutural. Por exemplo, na hélice A, os resíduos hidrofóbicos internos são (estando a metionina na posição 1) Phe 14, Cis 18, Vai 22, Ile 25, Ile 32 e Leu 36. De um modo geral, para o núcleo interno do FEC-G, isto é, o feixe das quatros hélices internas a que faltam as espiras externas, os resíduos internos hidrofóbicos são essenciais para a integridade estrutural. Por exemplo, na hélice A, os resíduos hidrofóbicos internos são (estando a metionina na posição 1, tal como na figura 1) Phe 14, Cis 18, Vai 22, Ile 25, Ile 32 e Leu 36. Os outros resíduos hidrofóbicos (mais uma vez com o resíduo met (metionina) na posição 1) são: para a hélice B, Ala 72, Leu 76, Leu 79, Leu 83, Tir 86, Leu 90, Leu 93; para a hélice C, Leu 104, Leu 107, Vai 111, Ala 114, He 118, Met 122; e para a hélice D, Vai 154, Vai 158,

Phe 161, Vai 164, Vai 168 e Leu 172. 69

Os dados sobre actividade biológica anteriormente indicados, atribuídos aos análogos de FEC-G agora preparados, demonstram que a modificação das espiras externas interfere pelo menos com a estrutura global do FEC-G. As espiras preferidas para a preparação dos análogos são a espira AB e a espira CD. As espiras são estruturas relativamente flexíveis quando comparadas com as hélices. As espiras podem contribuir para a proteólise da molécula. O FEC-G actua de uma forma relativamente rápida in vivo, uma vez que a molécula tem a finalidade de gerar uma resposta a um estimulo biológico, isto é, estimular selectivamente os neutrófilos. O ritmo de substituição do FEC-G também é relativamente rápido. A flexibilidade das espiras pode dar uma “ajuda” às proteases para atacarem a molécula para a inactivarem. Pode ser efectuada a modificação das espiras para impedir a acção degradativas das proteases, mantendo mesmo assim a actividade biológica sem perdas nenhumas (mediante a retenção da estrutura global do FEC-G não modificado).

Este fenómeno não se limita provavelmente à molécula de FEC-G, podendo também ser comum a outras moléculas com estruturas globais semelhantes conhecidas, conforme indicado na figura 2. A alteração da espira externa, por exemplo, da HCh (o mesmo que hGH) do interferão B, da 1L-2, do FEC-MG (o mesmo que GM-CSF) e da IL-4 pode originar pelo menos uma modificação na estrutura global. As espiras externas da molécula do FEC-MG não são tão flexíveis como as da molécula do FEC-G e tal facto pode significar um período de vida mais longo no soro, consistente com a actividade biológica mais ampla do FEC-MG. Assim sendo, as espiras externas do FEC-MG podem ser modificadas libertando-as da estrutura da folha β, o que pode fazer com que as espiras fiquem mais flexíveis (de flexibilidade idêntica às do FEC-G) e fazer consequentemente com que a molécula fique mais sensível à acção degradativa das proteases (aumentando assim o ritmo de substituição). 70 A alteração destas espiras externas pode ser efectuada estabilizando-as por ligação a uma ou a várias das hélices internas. Os mecanismos de ligação são conhecidos na especialidade, por exemplo, mediante a formação de uma folha β, uma ponte salina, uma ponte dissulfureto ou por interacções hidrofóbicas e ainda por outros meios conhecidos. Além disso, também é possível efectuar a supressão de um ou vários resíduos, por exemplo, um ou vários resíduos aminoácidos ou partes suas, para se preparar uma molécula abreviada e consequentemente eliminar determinadas partes das espiras externas. (fl) Posto isto, mediante a alteração das espiras externas, de preferência a espira AB (os aminoácidos 58-72 do FEC-G-met-hu-r (o mesmo que r-hu-met-G-CSF) ou a espira CD (aminoácidos 119 a 145 de FEC-G-met-hu-r), e menos preferencialmente o terminal amino (aminoácidos 1 a 10), é possível pois modificar a actividade biológica sem se eliminar a ligação ao receptor FEC-G da molécula de FEC-G. Por exemplo, é possível fazer o seguinte: (1) aumentar o período de semi-vida (ou preparar, por exemplo, uma forma de dosagem oral) da molécula de FEC-G, fazendo baixar a capacidade que as protease têm para actuarem sobre a molécula de FEC-G ou introduzindo modificações químicas na molécula de FEC-G, por exemplo, acrescentar uma ou várias moléculas de pohetileno-ghcol ou aplicar revestimentos entéricos para formulação oral que iriam actuar no sentido de modificarem algumas das caracteristicas da molécula de FEC-G, anteriormente descritas, por exemplo, o aumento do período de semi-vida no soro ou noutros meios ou a diminuição da antigenicidade; (2) preparar uma molécula híbrida, por exemplo, combinando o FEC-G com uma parte ou com a totalidade de outra proteína, por exemplo, outra citoquina ou outra proteína que realize a transdução do sinal mediante a penetração na célula através de um mecanismo de transporte do receptor FEC-G da molécula de FEC-G; ou (3) aumentar a actividade biológica por 71 exemplo, tal como sucede com a capacidade para estimular selectivamente os neutrófilos (comparativamente com uma molécula de FEC-G não modificada). Esta listagem não se limita aos exemplares anteriores.

Outra conclusão a tirar dos dados anteriores é o facto de as interacções superficiais estabilizadoras poderem afectar a actividade biológica. Isto é evidente numa comparação entre os análogos 23 e 40. O análogo 23 contém uma substituição do resíduo asparagina, com carga, na posição 28 por troca o resíduo alanina com carga neutra nessa posição, tendo tal substituição originado um aumento de 50% da actividade biológica (medida pelos ensaios divulgados de incorporação da timidina). O resíduo asparagina na posição 28 tem uma interacção superficial com o resíduo asparagina na posição 113; estando os dois resíduos carregados negativamente, há um certo grau de instabilidade (devido à repulsão entre radicais com cargas iguais). No entanto, quando o resíduo asparagina na posição 113 é substituído com o resíduo alanina de carga neutra, a actividade biológica cai para zero (no sistema de ensaio presente). Isto indica que o resíduo asparagina na posição 113 é crítico para a actividade biológica e que a eliminação do resíduo asparagina na posição 28 serve para aumentar o efeito que possui o resíduo asparagina na posição 113.

Foram determinados também os domínios necessários para a ligação do receptor de FEC-G com base nos análogos anteriores preparados e na estrutura do FEC-G. O domínio de ligação do receptor de FEC-G está localizado nos resíduos (com o resíduo metionina na posição 1) 11 a 57 (entre as hélices A e AB) e 100 a 118 (entre as hélices B e C). Também é possível preparar moléculas abreviadas capazes de se ligarem a um receptor de FEC-G e de iniciarem a transdução do sinal para estimular os neutrófilos de forma selectiva, mediante a modificação da estrutura da espira externa e deixando ficar intactos os domínios de ligação ao receptor. 72 72

Foram identificados os resíduos essenciais responsáveis pela actividade biológica e presumivelmente pela ligação ao receptor de FEC-G ou pelo transdução do sinal. Há dois locais distintos localizados em duas regiões diferentes da estrutura secundária. O “local A”, tal como aqui designado, está situado numa hélice confinada por contactos de tipo ponte salina entre dois outros membros do feixe helicoidal. O segundo local, designado por “local B” está situado numa hélice relativamente mais flexível que é a hélice AB. A hélice AB é potencialmente mais sensível a variações locais do pH devido ao tipo de posição dos resíduos nos terminais carboxi e amino. A importância funcional desta hélice flexível pode ser relevante num ajustamento induzido conformacionahnente aquando da ligação ao receptor de FEC-G. Além do mais, a parte prolongada da hélice D também é tida como um domínio de ligação ao receptor de FEC-G, conforme determinado por análise da estrutura das proteínas por via mutacional directa e por via comparativa indirecta. A supressão da extremidade do terminal carboxi de FEC-G-met-hu-r reduz a actividade, tal como sucede com a HCh, ver Cunningham e Wells, ‘Science’ 244: 1081-1084 (1989). As citoquinas que possuem estruturas semelhantes, tais como a IL-6 e a FEC-MG, com topologia semelhante prevista, também centram a sua actividade biológica ao longo da extremidade carboxi da hélice D, ver Bazan, ‘hnmunology Today’ U: 350-354 (1990).

Uma comparação das estruturas e das posições dos determinante de ligação ao receptor de FEC-G, entre o FEC-G e a HCh, sugere que as duas moléculas possuem meios idênticos de transdução do sinal. Foram identificados dois locais separados de ligação ao receptor de FEC-G; ver De Vos et al., ‘Science’ 255: 306-32 (1991). Um destes locais de ligação (designado por “Local Γ) é formado por resíduos das faces expostas da hélice 1 da HCh, da região de ligação entre as hélices 1 e 2 e da hélice 4. Um segundo local de ligação (designado por “Local Π”) é formado pelos resíduos da superfície da hélice 1 e da hélice 3. 73^

Os determinantes da ligação ao receptor de FEC-G identificados no FEC-G estão localizados nas mesmas posições relativas às dos que foram identificados para a HCh. O local de ligação ao receptor de FEC-G situado na região de união entre as hélices A e B na hélice AB (local A) está numa posição semelhante à que foi assinalada para um pequeno fragmento de hélice (resíduos 38 a 47) da HCh. Uma única mutação pontual na hélice AB do FEC-G reduz de forma significativa a actividade biológica (conforme determinado nas experiências da presente invenção), indicando o papel que tem no interface ligando-receptor de FEC-G. A ligação ao receptor de FEC-G pode desestabilizar a natureza helicoidal 310 desta região e induzir uma modificação conformacional que melhore a energia de ligação do complexo ligando/receptor de FEC-G.

No complexo receptor de HCh, a primeira hélice do feixe fornece resíduos aos dois locais de ligação necessários para dimerizar o receptor de HCh. Numa analise mutacional da correspondente hélice de FEC-G (hélice A) foram identificados três resíduos que são necessários para a actividade biológica. Desses três resíduos, há dois, Glu 20 e Arg 24, que estão sobre uma face do feixe helicoidal voltada para a hélice C, ao passo que a cadeia lateral de Arg 23 ( em duas das três moléculas na unidade assimétrica) aponta para a face do feixe voltada para a hélice D. A posição das cadeias laterais destes resíduos biologicamente importantes indica que, tal como sucede com a HCh, também o FEC-G pode ter um segundo local de ligação ao receptor de FEC-G ao longo da interface entre a hélice A e a hélice C. Contrariamente ao que sucede com a molécula de HCh, o terminal amino da molécula de FEC-G tem um papel biológico limitado, na medida em que a supressão dos primeiros 11 resíduos tem um efeito diminuto sobre a actividade biológica. 74

Conforme se disse antes (ver, por exemplo, a figura 2), o FEC-G tem uma semelhança topológica com outras citoquinas. Uma correlação da estrutura com estudos bioquímicos anteriores, a analise mutacional e a comparação directa de resíduos específicos do complexo receptor de HCh indicam que o FEC-G tem dois locais de ligação ao receptòr. O local A fica situado ao longo da interface das hélices A e D e compreende os resíduos existentes na pequena hélice AB. O local B também compreende resíduos da hélice A, mas fica situado ao longo da. interface entre as hélices A e C. A conservação da estrutura e as posições relativas de resíduos biologicamente importantes entre as moléculas de FEC-G e HCh são uma indicação da existência de um método comum de transdução do sinal, na medida em que o receptor se encontra ligado em dois locais. Verificou-se consequentemente que os análogos de FEC-G que possuem domínios modificados de ligação ao receptor de FEC-G podem ser preparados por alteração de qualquer dos locais de ligação ao receptor de FEC-G (resíduos 20 a 57 e 145 a 175). O conhecimento da estrutura tridimensional e da correlação da composição da proteína FEC-G faz com que seja possível conceber um método sistemático e racional para a preparação de análogos de FEC-G. Os exemplos experimentais anteriormente descritos demonstraram que as limitações de tamanho e polaridade das cadeias laterais dentro do núcleo da estrutura determinam a quantidade de modificações que a molécula pode tolerar antes de a sua estrutura global ficar alterada.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Amgen Inc. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 110 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Amgen Inc. (B) RUA: Amgen Center, 1840 DeHavilland Drive (C) CIDADE: Thousand Oaks (D) ESTADO: Califórnia (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL: 91320-1789 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: CP compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 565 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADES:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 30 .554 76 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 1: TCTAõÃÀAAA ACCAAGGAGG TAATAAATA ÁIG ACT OCA ΤΓΑ GGT GCT GCT TCT 53 Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser 5 TCT CIG COG CAA AGC ΤΤΓ CIG CIG AAA TGT CIG GAA CAG GTT GGT AAA 101 Ser Leu Pio On Ser Phe Leu Leu Lis Gs Leu Glu Gin Vai Aig Lis 10 15 20 AIC CAG GGT GAC GGT GCT GCA CIG CAA GAA AAA CIG TGC GCT ACT TAC 149 He Gb Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu On Glu Tis Leu Cis Ala Thr Tír 25 30 35 40 AAA CIG TGC CAT COG GAA GAG CIG GTA CIG CIG GGT CAT TCT CIT GGG 197 Tis Leu Cis His Pro Ou Glu Leu Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi 45 50 55 AIC OOG TOG GCT COG CIG TCT TCT TGT OCA TCT CAA GCT CIT CAG CIG 245 De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser Cis Pro Ser Gin Ala Leu On Leu 60 65 70 GCT GGT TCT CIG TCT CAA CIG CAT TCT GGT CIG TIC CIG ΤΑΓ CAG GGT 293 Ala Gfi Gs Leu Ser Gin Leu His Ser Gfi Leu Phe Leu Ur Gin Gfi 75 80 85 CIT CIG CAA GCT CIG GAA GGT AIC TCT OOG GAA CIG GGT OOG ACT CIG 341 Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gfi Se Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu 90 95 100 GAC ACT CIG CAG CTA GAT GTA GCT GAC TTT GCT ACT ACT ATT TOG CAA 389 Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala Asp Phe Ala Thr Thr He Tip Gin 105 110 115 120 CAG ATG GAA GAG CIC GGT A3G GCA OCA GCT CIG CAA OOG ACT CAA GGT 437 On Met Glu Glu Leu Gfi Met Ala Pro Ala Leu Gin Piro Thr On Gfi 125 130 135 GCT AIG COG GCA TIC GCT TCT GCA TIC CAG GGT CGT GCA GGA GGT GTA 485 Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe On Arg Aig Ala Gfi Gfi Vai 140 145 150 CIG GTT GCT TCT CAT CIG CAA TCT TIC CIG GAA GEA TCT TAC OGT GTT 533 Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Vai Ser Tír Aig Vai 155 160 165 CIG CGT CAT CIG GCT CAG OOG TAATAGAATT C 565 Leu Aig His Leu Ala On Pro 170 175 77 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA. (A) COMPRIMENTO: 175 pares de bases (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met Thr Pro Leu Gli Pio Ala Ser Ser Leu Pro Gb Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 • Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis De Gb GE Asp GE Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Gb Lis Leu Os Ala Thr Tr Lis Leu Cis His Pro Gb Gb Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gi His Ser Leu Gli De Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gb Leu Ala GE Cis Leu Ser Gb Leu His 65 70 75 80 Ser Gti Leu Phe Leu Ttr Gb GE Leu Leu Gb Ala Leu Gb GE De 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gli Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gb Leu Asp Vai Ala 100 105 110 • Asp Phe Ala 115 Thr Thr De Trp Gb 120 Gb Met Gb Gb Leu 125 GE Met Ala Pro Ala Leu Gb Pro Thr Gb Gli Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gb Ser 145 150 155 160 Phe Leu Ou Vai Ser Tir Arg Vál Leu Arg His Leu Ala Gb Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:3: CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: ACAGGTTCGT CGTATCCAGG GTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO, simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: CACTGCAAGA ACGTCTGTGC GCT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: CGCTACTTAC CGTCTGTGCC ATC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: ACAGGTTCGT CGTATCCAGG GTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: ??CTGCAAGA ACGTCTGTGC GCT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA. ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO. 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: ACAGGTTCGT CGTATCCAGG GTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO. 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: CGCTACTTAC CGTCTGTCCC ATC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TEPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 14 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: ??CTGCAAGA ACGTCTGTGC GCT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: CGCTACTTAC CGTCTGTGCC ATC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 16 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 16: ACAGGTTCGT CGTATCCAGG GTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: CACTGCAAGA ACGTCTGTGC GCT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: CGCTACTTAC CGTCTGTGCC ATC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19: CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20: ??AGGTTCGT CGTATCCAGG GTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21: CACTGCAAGA ACGTCTGTGC GCT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22: CGCTACTTAC CGTCTGTGCC ATC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23: TCTGCTGAAA GCTCTGGAAC AGG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID N0.24: CTTGTCCATC TGAAGCTCTT CAG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ JD NO:25: ??AAAACTGT CCGCTACTTA CAAACTGTCC CATCCGG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26: TTCGTAAAAT CGCGGGTGAC GG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:27: TCATCTGGCT GCGCCGTAAT AG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28: CCGTGTTCTG GCTCATCTGG CT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29: GAAGTATCTT ACGCTGTTCT GCGT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:30 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:30: GAAGTATCTT ACTAAGTTCT GCGTC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 31 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 31: ??CTACTTAC GCACTGTGCC AT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:32 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID N0.32: CAAACTGTGC AAGCCGGAAG AG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:33: CATCCGGAAG CACTGGTACT GC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:34: GGAACAGGTT GCTAAAATCC AGG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 90 (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID N0.35: GAACAGGTTC GTGCGATCCA GGGTG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N0.36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:36: ??AATGTCTG GCACAGGTTC GT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N0.37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3 7: 19

TCCAGGGTGC CGGTGCTGC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N0.38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.38: AAGAGCTCGG TGAGGCACCA GCT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:39: CTCAAGGTGC TGAGCCGGCA TTC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:40: GAGCTCGGTC TGGCACCAGC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO; simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:41: TCAAGGTGCT CTGCCGGCAT T (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ED NO:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:42: ??TGCCGCAA GCCTTTCTGC TGA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:43: CTTTCTGCTG GCATGTCTGG AACA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 44 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.44: CTATTTGGCA AGCGATGGAA GAGC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:45 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.45:

CAGATGGAAG CGCTCGGTAT G (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:46: GAGCTCGGTC TGGCACCAGC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N0.47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:47: ??AAGGTGCT CTGCCGGCAT T (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:48: GAAATGTCTG GCACAGGTTC GT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:49: TTCCGGAGCG CACAGTTTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 50: CGAGAAGGCC TCGGGTGTCA AAC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 96 (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:51: ATGCCAAATT GCAGTAGCAA AG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 52: ACAACGGTTT AACGTCATCG TTTC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 53: 22 24

??CAGCTACT GCTAGCTGCA GA 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:54: TCAGTCGATG ACGATCGACG TCT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 55: TTACGAACCG CTTCCAGACA TT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ED NO: 56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:56: TAAAATGCTT GGCGAAGGTC TGTAA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.57: GTAGCAAATG CAGCTACATC TA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:58: ??TCATCGTT TACGTCGATG TAGAT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 99 (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 59: CCAAGAGAAG CACCCAGCAG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:60: AGGGTTCTCT TCGTGGGTCG TC 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:61: 20

CACTGGCGGT GATAATGCAGC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:62: CTAGGCCAGG CATTACTGG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:63: CCACTGGCGG TGATACTGAG C (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN 101 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:64: AGCAGAAAGC TTTCCGGCAG AGAAGAAGCA GGA 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples # (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:65: GCCGCAAAGC TTTCTGCTGA AATGTCTGGA AGAGGTTCGT AAAATCCAGG GTGA 54 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA JD NO:66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 59 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico φ (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:66: CTGGAATGCA GAAGCAAATG CCGGCATAGC ACCTTCAGIC GGTTGCAGAG CTGGTGCCA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 102 102

Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 10 15 De Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 25 30 Tis Leu Os His Pro Glu Glu Leu 45 De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 60 Ala Gli Os Leu Ser Gin Leu His 75 80 Leu Leu Gin Ala Leu Ou Gli De 90 95 Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 105 110 Gin Met Glu Qu Leu Gli Met Ala 125 Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 140 Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 155 160 Leu Aig His Leu Ala Gin Pro 170 175 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:67:

Met Thr Pro Leu GS Pro Ala Ser 1 5 Aig Os Leu Glu Gin Vai Aig Lis 20 Gin Gki Lis Leu Cis Ala Thr Tír 35 40 Vai Leu Leu Gli Hs Ser Leu Gli 50 55 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu 65 70 Ser Gti Leu Phe Leu Tír Gin Gli 85 Ser Pro Gki Leu GE Pro Thr Leu 100 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip Gin 115 120 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gli 130 135 Phe Gn Atg Aig Ala Gli Gli Vai 145 150 Phe Leu Glu Vai Ser Tír Aig Vai 165 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:68: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:68: 103 /y

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 lis Cis Leu Glu Gin Vai Aig Aig De Gin Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Ou Tis Leu Gs Ala Thr Tir lis Leu Gs His Pro Ou Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Oi De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gn Ala Leu Qn Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir Gin Gfi Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gfi De 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu On Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip Gin Gin Met Glu Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr On Oi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Arg Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Phe Leu Gb Vai Ser Tir Arg Vai Leu Aig His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ DD NO:69:

Met 1 Thr Pro Leu Oi 5 Pro Ala Ser Ser Leu 10 Pro On Ser Phe Leu 15 Leu lis Gs Leu Glu 20 On Vai Aig Lis De 25 Gin Gfi Asp Gfi Ala 30 Ala Lai Gin Glu Arg 35 Leu Cis Ala Thr Tir 40 Tis Leu Gs His Pro 45 Glu Ou Leu 104

Vai Leu Leu Oi His Ser Leu Gli Be Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser GF Leu Phe Leu Tn- Gb Gfi Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gfi Be 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Be Trp Gin Qn Met Glu Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Qn Arg Aig Ala Gfi Oi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Ur Aig Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:70:

Met 1 Thr Pro Leu Tis Cis Leu Glu 20 Gin Glu lis 35 Leu Vai Leu 50 Leu Gfi Cis 65 Pro Ser Qn

Gfi 5 Pro Ala Ser Qn Vai Aig Lis Cis Ala Thr Tir 40 His Ser Leu 55 Gli Ala Leu 70 Qn Leu

Ser Leu 10 Pro Qn Be 25 Qn Gfi Asp Arg Leu Cis His Be Pro Trp Ala 60 Ala Gli Cis 75 Leu

Ser Phe Leu 15 Leu Gfi Ala 30 Ala Leu Pro 45 Qu Qu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Qn Leu His 80 105

Ser Gfi Leu Phe Leu 85 Tir Qn Gli Ser Pro Qu Leu 100 Gli Pro Thr Leu Asp Phe Ala 115 Thr Thr De Tip Gin 120 Pro Ala 130 Leu Gin Pro Thr Gin 135 Gfi Phe 145 Gin Aig Aig Ala Gli 150 Gli Vai Phe Leu Ou Vai Ser 165 Tir Arg Vai

Leu Leu Gin Ala Leu Gu Gfi He 90 95 Asp Thr Leu Gin Lai Asp Vai Ala 105 110 Gin Met Glu Ou Leu Gfi Met Ala 125 Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 140 Leu Vai Ala Ser Hs Leu On Ser 155 160 Leu Arg Hs Leu Ala Gn Pro 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 71:

Ma Thr Pro Leu Gli Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gn Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Arg Gs Leu Ou Gn ,Val Arg Arg De Gn Gi Asp Gi Ala Ala Leu 20 25 30 Gn Ou Arg Leu Gs Ala Thr Tir Lis Leu Gs Hs Pro Gu Gu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Gs Pro Ser Gin Ala Leu Gn Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gn Leu Hs 65 70 75 80 Ser GE Leu Phe Leu Tir Gn Gli Leu Leu Gn Ala Leu Ou Gli De 85 90 95 Ser Pro Ou Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gn Leu Asp Vai Ala 100 105 110 106.

Asp Phe Ala 115 Thr Thr He Tip Gin 120 Gin Met Ou Ou Leu 125 GE Met Ala Pro Ala 130 Leu Gin Pro Thr Gin 135 GE Ala Met Pro Ala 140 Phe Ala Ser Ala Phe 145 On Arg Arg Ala Gi 150 Gfi Vai Leu Vai Ala 155 Ser His Leu Gin Ser 160 Phe Leu Ou Vai Ser 165 Tir Arg Vai Leu Arg 170 His Leu Ala Gin Pro 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 72:

Met Thr Pro Leu Gi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gn Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Arg Cis Leu Gu Gn Vai Arg Lis He Gn Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 • On Gu Arg 35 Leu Gs Ala Thr Tir 40 Arg Leu Gs His Pro 45 Gu Gu Leu Vai Leu Leu Gi His Ser Leu Gfi He Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Gs Pro Ser Gn Ala Leu Gn Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gn Leu His 65 70 75 80 Ser GE Leu Phe Leu Tr Gn Gfi Leu Leu Gn Ala Leu Qu Gfi He 85 90 95 Ser Pro Gu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gn Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr He Trp Gn Gn Met Gu Gu Leu Gi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gn Pro Thr Gn Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 107 £

Phe 145 Gin Arg Arg Ala Gh 150 GE Vai Leu Vai Ala 155 Ser Hs Leu Gin Phe Leu Ou Vai Ser 165 Tir Aig Vai Leu Aig 170 Hs Leu Ala Gin Pro 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO: 73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:73:

Met Thr Pro Leu GE Pro Ala Ser Ser Leu Pro On Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 lis Cis Leu GEi Gin Vai Arg Aig De Gin GE Asp GE Ala Ala Leu 20 25 30 Gh Glu Arg Leu Cis Ala Thr Tir Aig Leu Os Hs Pro Ou Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu GE Hs Ser Leu GE De Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala GE Cis Leu Ser Gin Leu Hs 65 70 75 , 80 Ser GE Leu Phe Leu Tir On GE Leu Leu On Ala Leu Glu GE De 85 90 95 Ser Pro Ou Leu GE Pro Thr Leu Asp Thr Leu On Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip On Qn Met Ou Glu Leu GE Met Ala 115 120 125 Pio Ala Leu Gin Pro Thr On GE Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Arg Ala GE GE Vai Leu Vai Ala Ser Hs Leu On Ser 145 150 155 160 Phe Leu Ou Vai Ser Tir Aig Vai Leu Arg Hs Leu Ala Gin Pro 165 170 175 108 108

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 74: Mà Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Arg Cis Leu Glu On Vai Arg Arg De Gin Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gbi Gb Arg Leu Os Ala Thr Tir Arg Leu Os His Pro Ou Gu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Oi His Ser Leu Gfi De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Os Pro Ser On Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir Gin Gfi Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gfi De 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gn Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Τφ Gin On Met Glu Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Arg Aig Ala GH Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu On Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tir Aig Vai Leu Aig His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:75:

Met 1 Thr Pro Leu Gfi 5 Pro Ala Ser Ser Leu 10 Pro Gin Ser Phe Leu 15 Leu Aig Cis Leu Ou 20 Gin Vai Aig Arg Be 25 Gin Gfi Asp Gfi Ala 30 Ala Leu Gin Gb Tis 35 Leu Cis Ala Thr Tír 40 Arg Leu Cis His Pro 45 Glu Gb Leu Vai Leu 50 Leu G» Eis Ser Leu 55 ca Be Pro Tip Ala 60 Pro Leu Ser Ser Cis 65 Pro Ser Gin Ala Leu 70 On Leu Ala Gfi Os 75 Leu Ser Gin Leu His 80 Ser Gfi Leu Phe Leu 85 Tir On Gfi Leu Leu 90 Gin Ala Leu Gb (a 95 Be Ser Pro Ou Leu 100 ca Pro Thr Leu Asp 105 Thr Leu Gin Leu Asp 110 Vai Ala Asp Phe Ala 115 Thr Thr Be Tip On 120 Gin Met Ou Ou Leu 125 Gfi Met Ala Pro Ala 130 Leu Gin Pro Thr On 135 Gfi Ala Met Pro Ala 140 Phe Ala Ser Ala Phe 145 Gb Aig Aig Ala GE 150 Gfi Vai Leu Vai Ala 155 Ser His Leu Gb Ser 160 Phe Leu Ou Vai Ser 165 Tir Arg Vai Leu Arg 170 His Leu Ala Gb Pro 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 76: 110

Met Thr Pro Leu GB Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gn Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Aig Lis Be Gin GB Asp Gi Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Tis Leu Cis Ala Thr Tir Lis Leu Cis Hs Pro Gu Gu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu GB Hs Ser Leu GB Be Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Glu Ala Leu Gin Leu Ala Gi Cis Leu Ser Gn Leu Hs 65 70 75 80 Ser GB Leu Phe Leu Tír On GB Leu Leu On Ala Leu Gu Gi Be 85 90 95 Ser Pro Glu Leu GB Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gn Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Be Tip On Gin Met Giu Gu Leu Gi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin GB Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Aig Ala GB GB Vai Leu Vai Ala Ser Hs Leu Gn Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tir Aig Vai Leu Arg Hs Leu Ala Gn Pro 165 170 175 φ (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:77: (i) C ARACTERÍ STIC AS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:77:

Met 1 Thr Pro Leu GB 5 Pro Ala Ser Ser Leu 10 Pro Gn Ser Phe Leu 15 Leu Lis Cis Leu Gu 20 Gn Vai Arg Lis Be 25 Gn GB Asp GB Ala 30 Ala Leu

Gin Glu Tis Leu Ser Ala Thr Tír Lis Leu Ser His Pro Gh Gh Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Gs Pro Ser Gh Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Cis Leu Ser Gh Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tír Gin GE Leu Leu Gh Ala Leu Gh Gfi De 85 90 95 Ser Pro Ou Leu Gli Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gh Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip Gh Gh Met Gh Gh Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gh Pro Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Aig Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gh Ser 145 150 155 160 Phe Leu Ou Vai Ser Tír Aig Vai Leu Aig His Leu Ala Gh Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:78:

Met 1 Thr Pro Leu Gfi 5 Pro Ala Ser Ser Leu 10 Pro Gh Ser Phe Leu 15 Leu Lis Cis Leu Gh 20 Gh Vai Aig Lis De 25 Ala Gfi Asp Gli Ala 30 Ala Leu Gh Gh Lis Leu Cis Ala Thr Tír Lis Leu Cis His Pro Gh Gh Leu 35 40 45 112

Vai Leu Leu GB His Ser Leu GB Be Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala GB Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser GE Leu Phe Leu Tír Gin GB Leu Leu On Ala Leu Glu GB Be 85 90 95 Ser Pro Ou Leu GB Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gín Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Be Tip Gin On Met Glu Glu Leu GB Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin GB Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Aig Ala GB GB Vai Leu Vai Ala Ser His Leu On Ser 145 150 155 160 Phe Leu Giu Vai Ser Tn- Aig Vai Leu Aig His Leu Ala On Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:79: (i)< CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii)’ TIPO DE MOLÉCULA: : proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ED NO:79: Met Thr Pro Leu GE Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gh Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Os Leu Glu Gin Vai Arg Lis Be On GB Asp GB Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Qu Lis Leu Cis Ala Thr Tn- Tis Leu Os His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu GB His Ser Leu GB Be Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Os Pro Ser Gin Ala Leu Gb Leu Ala C3i Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 113

Ser GE Leu Phe Leu Tk On GS Leu Leu Gin Ala Leu Gb GE Se 85 90 95 Ser Pro Ou Leu GE Pro Thr Leu Asp Thr Leu On Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Se Trp Gin Gin Met Gb Gb Leu GE Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gh GE Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gh Arg Ag Ala Gli GE Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gb Ser 145 150 155 160 Phe Leu Gb Vai Ser Tir Ag Vai Leu Ag His Leu Ala Gb Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 80:

Met Thr Pro Leu GE Pro Ala Sff Ser Leu Pro Gb Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Us Cis Leu Gb Gb Vai Ag Lis Be Gh GE Asp GE Ala Ala Leu 20 25 30 Gb Gb Tis Leu Cis Ala Thr Tir Lis Leu Cis His Pro Gb Gb Leu 35 40 45 Vai Leu Leu GE His Ser Leu GE Se Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gb Ala Leu Gb Leu Ala GE Os Leu Ser Gh Leu His 65 70 75 80 Ser GE Leu Phe Leu Tir Gb GE Leu Leu Gb Ala Leu Gb GE Se 85 90 95 Ser Pro Gb Leu GE Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gb Leu Asp Vai Ala 100 105 110 114

Asp Phe Ala 115 Thr Thr De Tip On 120 (3n Met Glu Glu Leu 125 Gfi Met Ala Pro Ala 130 Leu On Pro Thr Gin 135 Gfi Ala Met Pro Ala 140 Phe Ala Ser Ala Phe 145 Gin Aig Aig Ala Gfi 150 Gfi Vai Leu Vai Ala 155 Ser His Leu G3n Ser 160 Phe Leu Glu Vai Ser 165 Tir Aig Vai Leu Ala 170 His Leu Ala On Pro 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:81:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Se Leu Pro Gin Se Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Gs Leu Glu On Vai Aig Tis le Gin Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Tis Leu Gs Ala Thr Tir Lis Leu Gs His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Τφ Ala Pro Leu Se Se 50 55 60 Cis Pro Ser Qn Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Gs Leu Se Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir Gin Gfi Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gfi De 85 90 95 Ser Pro Ou Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gn Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip Gin On Met Glu Ou Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Se Ala 130 135 140 Phe On Aig Aig Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Se Tis Leu Gin Se 145 150 155 160 115

Phe Lai Gb Vai Ser Tír Ala Vai Lai Aig His Lai Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 174 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 82:

Ma Thr Pro Leu GH Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gb Vai Arg Lis He On GH Asp Oi Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Ou Lis Leu Cis Ala Thr Tír Lis Leu Cis Hs Pro Gb Gb Leu 35 40 45 Vai Leu Leu GH Hs Ser Leu GS He Pro Trp Ala Pro Leu Ser Sa 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala GH Cis Leu Ser Gb Leu Hs 65 70 75 80 Ser GS Leu Phe Leu Tír Gin GS Leu Leu On Ala Leu Gb GH He 85 90 95 Ser Pro Glu Leu GS Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Trp Gin Gh Ma Gb Gb Leu GH Ma Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin GH Ala Ma Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Arg Arg Ala Gli Gli Vai Leu Vai Ala Ser Hs Leu Gb Sa 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tir Vai Leu Arg His Leu Ala Gb Pro 165 170 174 116 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO: 83: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TEPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 83:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Ou On Vai Arg Lis Be On Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 On Glu Lis Leu Cis Ala Thr Tir Ala Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gti His Ser Leu Gfi Be Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pio Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir On Gfi Leu Leu Qn Ala Leu Ou Gfi Be 85 90 95 Ser Pro Ou Leu .GE Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Be Trp Gin Gin Met Ou Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pfò Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe On Arg Aig Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser Hs Leu Gin Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 117 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:84:

Met Thr Pro Leu GE Pro Ala Ser Ser Leu Pro On Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Aig Tis He Gin Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gn Glu Lis Leu Cis Ala Thr Tk Lis Leu Cis Lis Pro Gu Gu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gli De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gn Leu His 65 70 75 80 Ser Oi Leu Phe Leu Trr Gn Gli Leu Leu Gin Ala Leu Gu Gfi De 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu On Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr He Tip On Gin Met Glu Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pio Ala Leu Gin Pro Thr Gin Oi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Arg Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gn Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tir Aig Vai Leu Aig His Leu Ala Gn Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:85:

Met Ήf Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Cis Leu Glu Gin Vai Arg T is Ile Gin Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Ou Lis Leu Cis Ala Thr Ώ- Lis Leu Cis His Pro Glu Ala Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Cis Leu Ser Gn Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tír Gin Gfi Leu Leu Gin Ala Leu Gu Gfi He 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Ile Tip Qn Gin Met Ou Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pio Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gn Aig Arg Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gn Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tír Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gn Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 86: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:86:

Met 1 Thr Pro Leu Gfi 5 Pro Ala Ser Ser Leu 10 Pro Gn Ser Phe Leu 15 Leu Lis Cis Leu Gu 20 Gn Vai Ala Lis lie 25 Gn Gfi Asp Gfi Ala 30 Ala Leu Gn Gu Lis 35 Leu Cis Ala Thr Tír 40 Lis Leu Cis His Pro 45 Gu Gu Leu

Vai Leu Leu GB His Ser Leu Gfi De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gb Ala Leu Gb Leu Ala Gfi Cis Leu Ser Gb Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tír Gb Gfi Leu Leu Gb Ala Leu Gb Gfi De 85 90 95 Ser Pro Gb Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gb Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip Gb Gb Met Gb Gb Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gb Pro Thr Gb Gfi Ala Má Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Aig Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gb Ser 145 150 155 160 Phe Leu Gb Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gb Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:87: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 87:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gb Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Os Leu Gb Gb Vai Aig Ala De Gb Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gb Gb lis Leu Cis Ala Thr Tir Tis Leu Os His Pro Gb Gb Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Oi His Ser Leu Gfi De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gb Ala Leu Gb Leu Ala Gfi Os Leu Ser Gb Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir Gb Gfi Leu Leu Gb Ala Leu Gb Gfi De 85 90 95 120

Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip On On Met Glu Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu On Pro Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Fhe Gh Arg Arg Ala Gfi ca Vai Leu Vai Ala Ser His Leu On Se- 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tír Aig Vai Leu Arg Ffis Leu Ala Gin Pro 165 170 175 φ (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:88: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.88:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gh Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Gs Leu Ala Gh Vai Aig Tis De Gh Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gh Ou T is Leu Cis Ala Thr Tir Tis Leu Gs His Pro Gh Gh Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Gs Pro Ser Gh Ala Leu Gh Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gh Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Trr Gh Gfi Leu Leu Gh Ala Leu Gh Gfi De 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gh Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip Gh Gh Met Gh Gh Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gh Pro Thr Gh Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 121

Phe 145 Gin Arg Arg Ala Gti 150 Gli Vai Leu Vai Ala 155 Ser His Leu On Phe Leu Ghi Vai Ser 165 Tir Arg Vai Leu Aig 170 Hs Leu Ala Gin Pro 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUENCIAID NO:89: (i) C ARACTERÍ STIC AS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:89:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser 1 5 Lis Cis Leu Glu On Vai Aig Lis 20 Gin Ou Lis Leu Cis Ala Thr Er 35 40 Vai Leu Leu Gli Hs Ser Leu GE 50 55 Cis Pro Sct On Ala Leu On Leu 65 70 Ser Gfi Leu Phe Leu Ur Gin Gli 85 Ser Pro Ou Leu Gfi Piro Thr Leu 100 Asp Phe Ala Thr Thr De Trp Gin 115 120 Pro Ala Leu On Pro Thr On Gfi 130 135 Phe Gin Aig Arg Ala Gfi Gfi Vai 145 150 Phe Leu Glu Vai Sct Er Arg Vai

Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 10 15 De On Gfi Ala Gfi Ala Ala Leu 25 30 Lis Leu Cis Hs Pro Ou Glu Leu 45 De Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 60 Ala Gfi Gs Leu Ser On Leu Hs 75 80 Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gli De 90 95 Asp Thr Leu On Leu Asp Vai Ala 105 110 Gin Met Glu Glu Leu Gfi Met Ala 125 Ala Met Pro Ala Phe Ala Sct Ala 140 Leu Vai Ala Ser Hs Leu Gin Ser 155 160 Leu Arg Hs Leu Ala Gin Pro 170 175 165 122 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:90: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:90:

Met Thr Pro Leu Gli Pro Ala Ser Sa Leu Pro Gin Sa Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis He Gin Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Giu Lis Leu Gs Ala Thr Tir lis Leu Gs His Pro Gb Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Sa Leu Gfi He Pro Τφ Ala Pro Leu Sa Sa 50 55 60 Gs Pro Ser On Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Gs Leu Sa Gin Leu His 65 70 75 80 Sa Gfi Leu Phe Leu Tir On Gfi Leu Leu On Ala Leu Glu Gfi He 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Oi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr He Τφ On Gin Met Glu Ou Leu Gfi Gfiu Ala 115 120 125 Pro Ala Leu On Pro Thr Qn Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Sa Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Aig Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Sa His Leu Gin Sa 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tir Aig Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:91: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 123 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:91:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Sa Leu Pro On Se- Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Ou Gin Vai Aig Lis He On Gfi Asp Oi Ala Ala Leu 20 25 30 On Glu Lis Leu Gs Ala Thr Tir Lis Leu Gs His Pro Ou Ou Leu ' 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi Hs Ser Leu Gfi He Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu On Leu Ala Gfi Gs Leu Ser On Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir On Gfi Leu Leu On Ala Leu Ou Gfi He 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu On Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr lie Tip Gin On Met Ou Ou Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr On Gfi Ala Ou Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe On Arg Arg Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu On Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Aig His Leu Ala On Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:92: 124

Met Thr Pro Leu ca Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Gb Gin Vai Aig Lis De Gin ca Asp GS Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Gb Tis Leu Cis Ala Thr Tir Lis Leu Gs His Pro Gb Gb Leu 35 40 45 Vai Leu Leu ca His Ser Leu ca De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala ca Gs Leu Ser Gb Leu His 65 70 75 80 Ser ca Leu Phe Leu Τη* Gin ca Leu Leu Gin Ala Leu Gb GS De 85 90 95 Ser Pro Ou Leu ca Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip Gin cai Met Gb Gb Leu ca Leu Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin ca Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gb Aig Aig Ala ca ca Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gb Ser 145 150 155 160 Phe Leu Qu Vai Ser Tn- Aig Vai Leu Aig His Leu Ala Gb Pro 165 170 175

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 93: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:93:

Met 1 Thr Pro Leu ca 5 Pro Ala Ser Lis Cis Leu Gb 20 Gb Vai Arg Lis Gb Gb Lis 35 Leu Gs Ala Thr Tr 40

Ser Leu 10 Pro Gb Ser Phe Leu 15 Leu De Gb GS Asp GS Ala Ala Leu 25 30 Us Leu

Cis

His Pro Gb G8u Leu 45 125 :*7

Vai Leu Leu GE His Ser Leu Gli De Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gn Ala Leu Gin Leu Ala Gli Cis Leu Ser Gin Leu Hs 65 70 75 80 Ser cai Leu Phe Leu Trr Gin Gli Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gfi De 85 90 95 Ser Pro Qu Leu GE Pro Thr Leu Asp Thr Leu On Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip Gin Gin Met Glu Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu On Pro Thr Gin Gfi Ala Leu Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Aig Ala GE Oi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gn Ser 145 150 155 160 Phe Leu Ou Vai Ser Tir Aig Vai Leu Aig His Leu Ala Gn Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:94: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína # (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:94:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gn Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Ala Leu Gu Gn Vai Aig Lis De Gn Gfi Asp Gi Ala Ala Leu 20 25 30 Gn Gu 1 is Leu Gs Ala Thr Tir Lis Leu Cis His Pro Gu Gu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu Gfi De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gn Ala Leu Gn Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gn Leu His 65 70 75 80 Ser GE Leu Phe Leu Tr Gn Gi Leu Leu Gn Ala Leu Gu Gi De 85 90 95 126

Ser Pro Glu Leu 100 Asp Phe Ala 115 Thr Pro Ala 130 Leu Gin Phe 145 Gin Arg Arg Phe Leu Ou Vai

Gfi Pro Thr Leu Thr Be Trp On 120 Pro Thr Gin 135 Gfi Ala Gfi 150 Gfi Vai Ser 165 Trr Arg Vai

Asp 105 Thr Leu Gin On Met Ou Glu Ala Met Pro Ala 140 Leu Vai Ala 155 Sa Leu Arg 170 His Leu

Leu Asp 110 Vai Ala Leu 125 Gfi Met Ala Phe Ala Ser Ala His Leu Gin Sa 160 Ala Gin Pro 175 % (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ED NO:95: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:95:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gu Sa Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Gs Leu Gu Gu Vai Arg Lis Be Gn Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 G3n Gu Lis Leu Cis Ala Thr Trr Lis Leu Cis His Pro Gu Gu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi Be Pro Trp Ala Pro Leu Sa Sa 50 55 60 Cis Pro Sa Gn Ala Leu C3n Leu Ala Gfi Gs Leu Sa Gn Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Γη- Gn Gfi Leu Leu Gn Ala Leu Gu Gfi Be 85 90 95 Ser Pro Gu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gn Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Be Trp Gn Gn Ma Gu Gu Leu Gfi Ma Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gn Pro Thr Gn Gfi Ala Ma Pro Ala Phe Ala Sa Ala 130 135 140 127

Phe 145 Gb Aig Aig Ala Gli 150 Gfi Vai Leu Vai Ala 155 Ser His Leu Gin Phe Leu Giu Vai Sa 165 Tir Aig Vai Leu Arg 170 His Leu Ala Gb Pro 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUENCIAID NO:96: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:96:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser 1 5 Lis Cis Leu Gb Gb Vai Aig Lis 20 Gin Qu Lis Leu Cis Ala Thr Tir 35 40 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi 50 55 Cis Pro Ser Gb Ala Leu Gb Leu 65 70 Sa Gli Leu Phe Leu Tir Gb Gfi 85 Ser Pro Gb Leu Gfi Pro Thr Leu 100 Asp Phe Ala Thr Thr Be Trp Gb 115 120 Pro Ala Leu Gb Pro Thr Gb Gli 130 135 Phe Gin Arg Arg Ala Oí Gfi Vai 145 150 Phe Leu Gb Vai Ser Tir Aig Vai

Ser Leu Pro Gb Ser Phe Leu Leu 10 15 Be Gb Gfi Asp GE Ala Ala Leu 25 30 Tis Leu Os His Pro Gb Gb Leu 45 Be Pro Trp Ala Pro Leu Ser Sa 60 Ala Gfi Cis Leu Ser Gb Leu His 75 80 Leu Leu Gb Ala Leu Gb Gfi Be 90 95 Asp Thr Leu Gb Leu Asp Vai Ala 105 110 Gb Met Ou Gb Leu Gfi Met Ala 125 Ala Met Pro Ala Phe Ala Sa Ala 140 Leu Vai Ala Ser His Leu Gb Sa 155 160 Leu Arg His Leu Ala Gb Pro 170 175 165 128 ___ (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO:97: (i) C ARACTERÍ STIC AS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 97:

Met Thr Pro Leu GE Pro Ala Ser Ser Leu Pro On GE Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Ala Qn Vai Arg Lis De Gin GE Asp GE Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu T is Leu Cis Ala Thr Tír Lis Leu Cis His Pro Ou Gb Leu 35 40 45 Vai Leu Leu GE Hs Ser Leu GE De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala GE Os Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser ca Leu Phe Leu Ttr Gin GE Leu Leu Gin Ala Leu GEi GE De 85 90 95 Ser Pro Glu Leu GE Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Trp On Gin Met Glu Glu Leu GE Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin GE Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Arg Arg Ala GE GE Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Phe Leu Ou Vai Ser Tir Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gn Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:98: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido & 129 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TEPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:98:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Cis Leu Glu On Vai Aig Lis Be Gin Gli Asp Gli Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Gki Lis Leu Cis Ala Thr Tír Lis Leu Gs His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gli His Ser Leu GH Be Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gli Leu Phe Leu Tir Gin Gfi Leu Leu Gin Ala Leu Ou Gfi Be 85 90 95 Ser Pro Ou Leu Gli Piro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Be Tip On Gin Met Glu Glu Leu Gfi Leu Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gfi Ala Leu Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Aig Ala GH Gli Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tir Aig Vai Leu Aig His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:99: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:99: 130

Met Thr Pro Leu Oi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ala Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu C3n Vai Aig Tis Be Gin GE Asp GE Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lis Leu Cis Ala Thr Tir Lis Leu Gs His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu GE His Ser Leu GS Be Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Gs Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala GE Gs Leu Ser Gh Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir Gin GB Leu Leu Gh Ala Leu Ou Gfi Be 85 90 95 Ser Pro Ou Leu GH Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Be Trp Gin Gin Met Glu Ou Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr G3n GE Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Aig Ala CBffi GS Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tir Arg Vai Leu Aig His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 100: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 100:

Met 1 Thr Pro Leu Gfi 5 Pro Ala Ser Ala Gs Leu Gti 20 Gh Vai Aig Lis Gin Gh Lis 35 Leu Cis Ala Thr Tir 40

Ser Leu 10 Pro Gh Ser Phe Leu 15 Leu Be 25 Gin GE Asp Gfi Ala 30 Ala Leu Lis Leu Cis His Pro 45 Gh Gh Leu 131

Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Gs Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gb Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tír Gin Gfi Leu Leu On Ala Leu Gb Gfi De 85 90 95 Ser Pro Ou Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu On Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip Gin Gin Met Gb Gb Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Arg Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gb Ser 145 150 155 160 Phe Leu Gb Vai Ser Tir Arg Vai Leu Aig His Leu Ala Gb Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 101: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína # (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 101:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gb Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Gs Leu Gb Gb Vai Arg Lis De Gb Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gb Gb lis Leu Cis Ala Thr Tir Lis Leu Gs His Pro Gb Gb Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Gs Pro Ser Gb Ala Leu Gb Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gb Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir Gb Gfi Leu Leu Gb Ala Leu Gb Gfi De 85 90 95 132

Ser Pro Ou Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip On Ala Met Ou Ou Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr On Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Qn Aig Aig Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu On Sa- 145 150 155 160 Phe Leu Ou Vai Ser Tír Aig Vai Leu Aig His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 φ (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 102: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 102:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Qn Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Os Leu Ou Ala Vai Aig Lis De Qn Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 On Glu Lis Leu Os Ala Thr Tr Lis Leu Cis His Pro Qu Qu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Os Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Cis Leu Ser Qn Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tír On Gfi Leu Leu Qn Ala Leu Qu Gfi De 85 90 95 Ser Pro Ou Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Qn Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Trp Qn Qn Met Qu Qu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr On Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 133

Phe Gin Aig Aig Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tir Aig Vai Leu Arg His Leu Ala Gfn Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 103: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 103:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Cis Leu Glu Gin Vai Aig Lis De Gin Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Gb Lis Leu Cis Ala Thr Tir Lis Leu Cis Ala Pro Gb Gb Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser On Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gb Leu His 65 70 75 80 Sa Gfi Leu Phe Leu Tir Gin Gfi Leu Leu Gin Ala Leu Gb Gfi De 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr He Tip Gin Gin Met Glu Gb Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu On Pro Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Arg Arg Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gb Sa 145 150 155 160 Phe Leu Qu Vai Ser Tir Aig Vai Leu Arg His Leu Ala Gb Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 104: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 104:

Met Thr Pro Leu GE Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Glu Gin Vai Arg Lis De Gin GE Asp GE Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Ghx Lis Leu Cis Ala Thr Trr lis Leu Os His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu GH Ala Ser Leu GE De Pro Τφ Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser On Ala Leu Gin Leu Ala GE Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser ca Leu Phe Leu Tír Gin GE Leu Leu Gin Ala Leu GEi GE De 85 90 95 Ser Pro Glu Leu GE Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr De Tip Gin On Met Glu Glu Leu GE Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr On GE Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe On Aig Arg Ala GE GE Vai Leu Vai Ala Ser His Leu On Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Vai Ser Tír Arg Vai Leu Arg Hs Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 105: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 135 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 105:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gb Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Cis Leu Gb Gb Vai Arg Lis Se Gb Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Ou Tis Leu Cis Ala Thr Tír Lis Leu Gs His Pro Gb Gb Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi FEs Ser Leu Gfi Se Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gb Ala Leu Gb Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gb Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir Gb Gfi Leu Leu Gb Ala Leu Gb ca Be 85 90 95 Ser Pro Gb Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gb Leu Ala Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Se Trp Gb Gb Met Gb Gb Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gb Pro Thr Gb Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Aig Arg Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gb Ser 145 150 155 160 Phe Leu Gb Vai Ser Tir Aig Vai Leu Arg His Leu Ala Gb Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 106: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 106: 136

Met Thr Pro Leu Gti Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gn Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lis Cis Leu Ou Gn Vai Arg Lis Le Gn Gfi Asp GH Ala Ala Leu 20 25 30 Gn Glu Tis Leu Cis Ala Thr Tir T is Leu Os His Pro Gu Gu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu G3i His Ser Leu Gli Le Pro Τφ Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Os Pro Ser On Ala Leu On Leu Ala Gli Os Leu Ser Gn Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir On Oi Leu Leu Gn Ala Leu Gu Gfi Le 85 90 95 Ser Pio Glu Leu Gli Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gn Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Ala Phe Ala Thr Thr Le Τφ Gin Gn Met Gu Gu Leu Oi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr On Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe On Arg Aig Ala Gli Oi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gn Ser 145 150 155 160 Phe Leu Ou Vai Ser Tir Aig Vai Leu Arg His Leu Ala Gn Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 107: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 107:

Met Thr Pro Leu 1 Lis Cis Leu Gu 20 Gn Gu Lis Leu

Gfi Pro Ala Ser 5 Gn Vai Aig Lis Os Ala Thr Tir 40

Ser Leu 10 Pro Gn Le 25 Gn Gfi Asp Lis Leu Os His

Ser Phe Leu 15 Leu Gfi Ala 30 Ala Leu Pro 45 Gu Gu Leu 35 137

Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Qn Ala Leu Gin Leu Ala GD Cis Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tr Gin Gfi Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gfi De 85 90 95 Ser Pro Ou Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Ala De Tip Gin Gin Met Glu Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gn Pro Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Arg Aig Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser 145 150 155 160 Phe Leu Ou Vai Ser Tir Aig Vai Leu Aig His Leu Ala Gin Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 108: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 108:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Qs Leu Glu On Vai Arg Tis De Gin Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Ou Lis Leu Cis Ala Thr Tír Lis Leu Cis His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Cis Leu Ser On Leu Hs 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tir On Gfi Leu Leu On Ala Leu Glu Gfi De 85 90 95 138

Ser Pro Ou Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Ala Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Be Trp On On Met Gu Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe On Aig Aig Ala Gfi Gfi Vai Leu Vai Ala Ser His Leu G3n Ser 145 150 155 160 Phe Leu Giu Vai Ser Tír Aig Vai Leu Aig His Leu Ala On Pro 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 109: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO i:109: Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gn Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Cis Leu Gu Gn Vai Aig Lis He Gn Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gn Gu Us Leu Gs Ala Thr Tir Lis Leu Gs His Pro Gu Gu Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi He Pro Tip Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gn Ala Leu Gn Leu Ala Gfi Gs Leu Ser Gn Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tír Gn Gfi Leu Leu Gn Ala Leu Gu Gfi He 85 90 95 Ser Pro Gu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gn Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Ile Tip Gn Gn Met Gu Ala Leu Gfi Má Ala 115 120 125 139

Pro Ala 130 Leu Gin Pro Thr On 135 Gfi Ala Met Pro Ala 140 Phe Ala Se- Ala Phe 145 On Aig Aig Ala Gfi 150 Gfi Vai Leu Vai Ala 155 Ser His Leu Gin Ser 160 Phe Leu Ou Vai Ser 165 Tír Axg Vai Leu Arg 170 His Leu Ala On Pro 175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO: 110: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ DD NO: 110:

Met Thr Pro Leu Gfi Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tis Cis Leu Glu Gto Vai Aig Tis De Gin Gfi Asp Gfi Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Tis Leu Gs Ala Thr Tír Tis Leu Gs His Pro Ou Gb Leu 35 40 45 Vai Leu Leu Gfi His Ser Leu Gfi De Pro Τφ Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cis Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gfi Gs Leu Ser On Leu His 65 70 75 80 Ser Gfi Leu Phe Leu Tír Gin Gfi Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gfi De 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gfi Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 110 Asp Vai Ala Thr Ala De Trp On Gin Met Glu Glu Leu Gfi Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu On Pro Thr Gin Gfi Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 140

Phe 145 On Aig Arg Ala GS 150 GS Vai Phe Lai G3u Vai Ser 165 Tir Arg Vai

Leu Vai Ala 155 Ser His Leu Gin Leu Arg 170 His Leu Ala Gin Pro 175

Lisboa, 12 de Outubro de 2000

Claims (4)

1 - Reivindicações 1. Método para a preparação de um análogo de FEC-G, o qual compreende os passos seguintes: (a) examinar ao nível atómico ou dos aminoácidos a informação que toma conhecida a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, tal como explicitado na figura 5; (b) seleccionar entre essa informação examinada pelo menos um local da referida molécula de FEC-G para alteração; (c) preparar uma molécula de FEC-G que possua tal alteração; e (d) testar facultativamente tal molécula de FEC-G para pesquisar uma característica desejada.

2. Método para a preparação de um análogo de FEC-G de acordo com a reivindicação 1, recorrendo para isso ao auxilio de um computador, o qual compreende os passos seguintes: (a) obter expressão informática ao nível atómico ou dos aminoácidos da estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, tal como explicitado na figura 5; (b) seleccionar entre essa expressão informática pelo menos um local da referida molécula de FEC-G para alteração; (c) preparar uma molécula de FEC-G que possua tal alteração; e (d) testar facultativamente tal molécula de FEC-G para pesquisar uma característica desejada.

3. Método para a preparação de um análogo de FEC-G de acordo com a reivindicação 2, o qual compreende os passos seguintes: (a) dotar o computador utilizado com meios que permitam visualizar a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, incluindo a apresentação de imagens da composição dos radicais da referida molécula de FEC-G, mostrando de preferência a localização tridimensional de cada aminoácido e mais preferencialmente mostrando a localização tridimensional de cada átomo de uma molécula de FEC-G; (b) examinar as referidas imagens; (c) seleccionar o local dessas imagens para alteração da composição da referida molécula ou da localização de um radical; e (d) preparar um análogo de FEC-G com tal alteração.

4. Método auxiliado por computador para a preparação de um análogo de FEC-G de acordo com a reivindicação, o qual compreende os passos seguintes: (a) examinar ao nível atómico ou dos aminoácidos a estrutura tridimensional de uma molécula de FEC-G, tal como ilustrado na figura 5, por meio de um computador, em que esse computador foi previamente programado (i) para exprimir as coordenadas de uma molécula de FEC-G no espaço tridimensional e (ii) para permitir a entrada de informação para alteração da referida expressão da molécula de FEC-G e para a observar; (b) escolher um local na referida imagem visual dessa molécula de FEC-G para alteração; (c) introduzir no referido computador a informação para essa alteração; (d) examinar a estrutura tridimensional da referida molécula alterada de FEC-G por meio do referido computador; (e) repetir facultativamente os passos (a) - (e) enunciados antes; (f) preparar um análogo de FEC-G com a referida alteração; e 3 (g) testar taltativamente o referido análogo de FEC-G para pesquisa de uma caracteristica desejada. Lisboa, 12 de Outubro de 2000

1 Resumo “Composições de análogos do FEC-G e métodos”

A invenção proporciona análogos do factor estimulador das colónias de granulócitos (“FEC-G”), as composições que contêm tais análogos e composições congéneres. De acordo com outro dos seus aspectos, a invenção proporciona ácidos nucleicos que codificam os análogos da presente invenção ou ácidos nucleicos congéneres e células hospedeiras e vectores afins. Ainda de acordo com outro dos seus aspectos, a invenção proporciona programas informáticos e aparelhos para exprimir a estrutura tridimensional do FEC-G e dos seus análogos. Ainda de acordo com outro aspecto, a invenção proporciona métodos para conceber e projectar de forma racional análogos de FEC-G e composições congéneres. Ainda de acordo com outro dos seus aspectos, a ipvençqp proporciona métodos de tratamento em que são utilizados os análogos de FEC-G da preseqte iqyençáo.