PL187962B1

PL187962B1 - Środek farmaceutyczny oraz zastosowanie kompozycji agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości

Info

Publication number: PL187962B1
Application number: PL35998796A
Authority: PL
Inventors: Hua Zhu Ke; David D. Thompson
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1996-12-23
Publication date: 2004-11-30
Also published as: CO4761063A1; HUP9904123A2; EP1932543A3; NO20063853L; DZ2186A1; RU2190395C2; UA69372C2; CN1242813C; AP9700934A0; CZ297452B6; OA10837A; NO983936D0; BG64582B1; AP2000001962A0; AP2002002661A0; JP2002308771A; TNSN97040A1; US20010009920A1; PL328831A1; AP975A

Abstract

1. Srodek farmaceutyczny zawierajacy kompozycje agonisty/antagonisty estro- genu i substancji oddzialywujacej na anabolizm kosci, oraz ewentualnie farmaceutyczny nosnik lub rozcienczalnik, znamienny tym, ze jako agoniste/antagoniste estrogenu zawie- ra (-)-cis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2- -ol, a jako substancje oddzialywujaca na anabolizm kosci zawiera hormon przytarczyc lub czynnik stymulujacy wydzielanie hormonu wzrostu, korzystnie 2-amino-N-[2-(3a- -(R)-benzylo-2-metylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo[4,3-c]pirydyn-5-ylo)-1-(R)- -benzyloksymetylo-2-okso-etylo]izobutyroamid lub jego sól z kwasem L-winowym. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są środek farmaceutyczny oraz zastosowanie kompozycji agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości.

Określenie „agonista/antagonista estrogenu” odnosi się do związków, które wiążą się z receptorem estrogenowym, hamują cykl metaboliczny kości i zapobiegają ubytkowi kości. Takie działanie specjalista może łatwo ustalić na podstawie standardowych testów obejmujących testy wiązania receptora estrogenowego oraz standardowe histomorfometryczne i densytometryczne pomiary kości (E. F. Eriksen i inni, Bone Histomorphometry, Raven Press, New York, 1994, str. 1-74; S. J. Grier i inni, The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry In Animals, Inv. Radiol., 1996, 31(1): 50-62; H. W. Wahner i I. Fogelman, The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice, Martin Dunitz Ltd., London 1994, str. 1-296).

Substancje oddziaływujące na anabolizm kości zwiększają masę kości do poziomu powyżej progu pękania kości (World Health Organization Study World Health Organization,

187 962 „Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Report of a WHO Study Group. World Health Organization Technical Series 843).

Osteoporoza jest ogólnoustrojową chorobą układu kostnego charakteryzującą się małą masą kości oraz degradacją tkanki kostnej, co powoduje zwiększoną kruchość kości i podatność na złamania. W Stanach Zjednoczonych Ameryki choroba ta dotyka ponad 25 milionów ludzi i powoduje ponad 1,3 miliona złamań rocznie, w tym 500000 złamań kręgosłupa, 250000 złamań biodra i 240000 złamań nadgarstka. Złamania biodra są najpoważniejsze, gdyż powodują 5-20% zgonów pacjentów w ciągu roku, a 50% przeżywających czynią niesprawnymi.

Największe ryzyko osteoporozy występuje u ludzi w podeszłym wieku, a ponadto przewiduje się, że problem znacznie wzrośnie wraz ze starzeniem się populacji. Przewiduje się także, że ogólnoświatowa częstotliwość występowania złamań kości potroi się w ciągu następnych 60 lat, a w jednym z badań oszacowano, że w 2050 r. będzie 4,5 miliona złamań biodra na świecie.

U kobiet występuje większe ryzyko pojawienia się osteoporozy niż u mężczyzn. Kobiety doświadczają nagłego przyspieszenia utraty kości zaraz po przejściu menopauzy. Inne czynniki zwiększające ubytek kości, a przez to prowadzące do osteoporozy, to palenie, nadużywanie alkoholu, siedzący tryb życia oraz przyjmowanie małych ilości wapnia.

U kobiet środkiem z wyboru w profilaktyce osteoporozy i utraty kości po przejściu menopauzy jest estrogen. Ponadto w EP nr 0605193Al doniesiono, że estrogen, szczególnie przyjmowany doustnie, obniża poziom LDL w osoczu oraz podwyższa poziom korzystnych lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL). Jednakże długookresowe leczenie estrogenem wiąże się z występowaniem wielu różnych zaburzeń, takich jak zwiększenie ryzyka raka macicy, raka endometrium i prawdopodobnie raka sutka, co spowodowało, iż wiele kobiet unika tego leczenia lub przyjmuje lek tylko przez krótki okres czasu. Pomimo iż uważa się, że ryzyko wystąpienia raka endometrium zmniejsza się przy równoczesnym przyjmowaniu progesteronu, nadal istnieje obawa, że przyjmowanie estrogenu może zwiększać ryzyko wystąpienia raka sutka. Ostatnio sugerowane sposoby leczenia, potencjalnie zmniejszające ryzyko raka, takie jak skojarzone przyjmowanie progestronu i estrogenu, powodują wystąpienie u pacjentów niedopuszczalnego krwawienia. Ponadto łączenie progesteronu z estrogenem wydaje się osłabiać wpływ estrogenu na zmniejszenie poziomu cholesterolu w surowicy przez estrogen. Występowanie znacznych niepożądanych skutków ubocznych związanych z leczeniem estrogenami potwierdza potrzebę znalezienia alternatywnego leczenia osteoporozy, mającego pożądany korzystny wpływ na poziom LDL w osoczu, ale nie powodującego niepożądanych skutków ubocznych.

Ostatnio zaproponowano zastosowanie kilku agonistów/antagonistów estrogenu w leczeniu osteoporozy. W Osteoporosis Conference Script nr 1812/13 kwietnia 16/20, 1993 r. na str. 29 podano, że raloksyfen, 6-hydroksy-2-(4-hydroksyfanylo)-3-[4-(2-piperydynoetoksy)benzoilo]benzo[b]tiofen, imituje korzystne działanie estrogenu na kości i lipidy, ale inaczej niż estrogen, w minimalnym stopniu wpływa na macicę [L. J. Black i inni, Raloxifene (LY139481 Hel) Prevents Bone Loss and Reduces Serum Cholesterol Without Causing Uterine Hypertrophy in Ovariectomized Rats, J. Clin. Invest, 1994, 93:63-69],

Tamoksyfen, 1-(4-3-dimetyloaminoetoksyfenylo))l ,2-difenylobut-1-en, jest antyestrogenem, który zaproponowano jako środek o łagodzącym działaniu na raka sutka, jednak stwierdzono, że wykazuje on pewną aktywność estrogenową w macicy. W J. Reproduction and Fertility (1993)99, 395, podano, że tamoksyfen w dawkach 200 i 400 mg/kg/dzień zmniejsza masę jąder 1 i drugorzędowych organów płciowych u samców szczura.

Ponadto w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5254594 ujawniono zastosowanie droloksyfenu w leczeniu chorób kości, włącznie z osteoporozą. Takie środki jak droloksyfen zapobiegają ubytkowi kości i tym samym zmniejszają ryzyko złamania, nie wywołując estrogenowych skutków ubocznych. Jednakże uważa się, że sam estrogen i jego agoniści zmniejszają ryzyko złamania tylko o 50%, a zatem pozostaje około 50% kobiet z osteopenią narażonych na ryzyko złamania związanego z osteoporozą..

187 962

W leczeniu osteoporozy proponuje się także stosowanie nieestrogenowych agonistów/antagonistów, takich jak bisfosfomany. Przykładowo bisfosfonianem przeznaczonym obecnie do leczenia osteoporozy jest Fosamax®. Inne fosfoniany, takie jak risedronat, tiludronat i ibandronat, są obecnie przedmiotem badań kontrolnych.

Frost i inni w „Treatment of Osteoporosis by Manipulation of Coherent Bone Cell Populations”, Chmcal (Orihopedics and Related Research, 143, 227 (1979) ujawniają teoretyczny model sugerujący, że powinno być możliwe zsynchronizowanie aktywności i metabolizmu komórek kości przez podanie najpierw środka aktywującego komórki kości, a następnie środka hamującego resorpcję kości, co umożliwi normalne tworzenie się kości.

Tang i inni w Restoring and Maintaining Bone in Osteogenic Female Rat Skeleton: I. Changes in Bone Mass and Structure, J. Bone Minerał Research 7(9), str. 1093-1104, 1992, ujawniają dane odnoszące się do koncepcji utraty, przywrócenia i utrzymania (LRM), która jest próbą praktycznego odwrócenia istniejącej osteoporozy. Według koncepcji LRM środków oddziaływujących na anabolizm używa się do odtworzenia masy i budowy kości (faza +), a następnie zmienia je na środek mający ustaloną zdolność utrzymywania masy kości tak, aby utrzymać nową kość (faza +/-). W badaniach na szczurach użyto PGE2 i risedronatu, bisfosfonianu, aby wykazać, że większość nowych kości gąbczastych i korowych indukowanych przez PGE2 można utrzymać, przez co najmniej 60 dni po przerwaniu podawanią PGE2 dzięki podawaniu risedronatu.

Ujawniono także kombinacje bisfosfonianów i prostaglandyn przeznaczone do leczenia osteoporozy. W zgłoszeniu patentowym EP nr 0381296 opisano zestaw, przy użyciu którego prowadzi się najpierw leczenie zapewniające aktywację wzrostu kości, a następnie leczenie środkami hamującymi resorpcję kości. Jako przykładowe związki aktywujące kości wymieniono hormon przytarczyc (PTH), fosforan nieorganiczny, hormon wzrostu, fluorek, hormon tarczycy (np. tyroksynę), pewne metabolity witaminy D oraz prostaglandyny (PGE2 w dawce 10 mg/kg na dzień). Jako środki hamujące resorpcję kości ujawniono polifosfoniany.

W PCT/US93/08529 ujawniono równoczesne podawanie środka aktywującego kość, takiego jak prostaglandyna, sprzężonego chemicznie ze związkiem hamującym resorpcję kości, który dostarcza środek aktywujący kość selektywnie do miejsca docelowego. W wyniku stopniowej hydrolizy nowego związku zhydrolizowane produkty mają zdolność hamowania resorpcji kości (poprzez bisfosfoniany) oraz stymulacji lub wzrostu kości (poprzez PGE2).

Skutki kombinacji prostaglandyny E2 z risedronatem (bis-fosfonianem) badali Lin i inni, Effects of Prostaglandin E2 and Risedronate Administration on Cancellous Bone in Older Female Rats, Bone 15(5), str. 489-496, 1994.

Qiu i inni w Experimental Study on Antiatherosclerotic Treatment by PGE2, Combined With Vitamin E and Estradiol, Chinese Medical Jouranal, 108(1) str. 33-36, ujawnili, że pojedyncza dawka PGE2 w połączeniu z witaminą E i z estradiolem hamowała koordynująco uszkodzenia aortalne i wieńcowe, a także agregację płytek, proliferację mięśni gładkich oraz peroksydację lipidów, w większym stopniu niż pojedyncza dawka PGE₂.

W abstrakcie „Nonhormonal Alternatives for the Management of Early Menopause in Younger Women with Breast Cancer”, Monogr. Natl. Cancer Insi. (16), 161-167, 1994, stwierdzono, że „Zastosowanie pewnych terapii nieestrogenowych w zapobieganiu i leczeniu osteoporozy dało obiecujące rezultaty. Tradycyjne zalecenia w celu utrzymania integralności szkieletu, takie jak ćwiczenia z ciężarkami, dieta bogata w wapń i z obniżonym spożyciem kofeiny, alkoholu i białka, unikanie palenia oraz przedsięwzięcia minimalizujące urazy rozszerzono o użycie lub badanie leków (pojedynczo lub w połączeniach). Do leków tych należą progestyny, metabolity witaminy D, dająca się wstrzykiwać lub donosowa syntetyczna kalcytonina łososiowa, bisfosfoniany, fluorek sodu, hormon przytarczyc, czynniki wzrostu, tamoksyfen itd.”

W europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP 0635270 ujawniono kompozycję farmaceutyczną raloksyfenu i hormonu przytarczyc (PTH) lub jego fragmentów i zmodyfikowanych pochodnych aminokwasowych, przeznaczoną do stosowania w leczeniu osteoporozy. Nie podano tam żadnych wzmianek o możliwości stosowania raloksyfenu wraz z innymi środkami anabolicznymi.

187 962

W artykule „Present and Future of Osteoporosis Therapy” opublikowanym w Bone, tom 17, nr 2, 1995 r. na str. 23S-29S ujawniono, że prostaglandyny oddziaływają na anabolizm kości. Jednak mimo że prostaglandyna E2 nasila okołookostnowe i śródkostne tworzenie się kości, może ona upośledzać wytrzymałość szkieletu poprzez zwiększenie porowatości warstwy korowej.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5281590 dotyczy sposobu leczenia osteoporozy u ssaka. W opisie tym ujawniono szereg podstawionych związków dibenzoksazepinowych wykazujących aktywność antagonistów prostaglandyny E2, jednak brak jest w nim wzmianek na temat możliwości łączenia tych związków z innymi środkami wpływającymi na tworzenie się kości.

Zatem, pomimo iż istnieje wiele różnych terapii chorób objawiających się małą masą kości, a zwłaszcza osteoporozy, nadal występuje potrzeba opracowania alternatywnych terapii, ponieważ obecne terapie w ograniczonym stopniu zmniejszają częstotliwość złamań związanych z osteoporozą.

Nieoczekiwanie okazało się, że taką terapię umożliwia środek farmaceutyczny według wynalazku, zawierający kompozycję agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości, oraz ewentualnie farmaceutyczny nośnik lub rozcieńczalnik, którego cechą jest to, że jako agonistę/antagonistę estrogenu zawiera (-)-cis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol, a jako substancję oddziaływującą na anabolizm kości zawiera hormon przytarczyc lub czynnik stymulujący wydzielanie hormonu wzrostu, korzystnie 2-amino-N-[2-(3a-(R)-benzylo-2-metylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-hHsahydropiiazolo[4.3wHiiydyn%-ylo)-1-(R.)--benzyloksynietylo-2-oksoetylojizobutyiOamid lub jego sól z kwasem L-winowym.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości, to jest kompozycji (-)-cis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu z hormonem przytarczyc lub czynnikiem stymulującym wydzielanie hormonu wzrostu, korzystnie 2-amino-N-[2-(3a-(R)-benzylo-2--metylom-okso-2,3,3a,4,6,7-hekkahydropiraaoio--4,3-c]pirydym5-yloE]-(R)-benzyloksymetylo-2-oksoetylo]izobutyroamidem lub jego solą z kwasem L-winowym, do wytwarzania leku do leczenia stanu objawiającego się małą masą kości u ssaków, zwłaszcza katekporozy.

Szczególnie korzystnym czynnikiem stymulującym wydzielanie hormonu wzrostu jest 2-amink-N-[2-(3a-(R)-betlzylo-2-metylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo[4,32c]pirydyn-5-ylk)2l 2(R)-benzylkksymktylo-2-kkskktylk]izkbutyroamid.

Określenie „hormon przytarczyc” odnosi się do hormonu przytarczyc, jego fragmentów lub metabolitów, oraz jego strukturalnych analogów, które mogą pobudzać tworzenie się kości i wzrost masy kości. Specjalista może łatwo ustalić takie działanie na podstawie standardowych testów (patrz np. E. F. Eriksen i inni, Bone Histomorphometry, Raven Press, New York, 1994, str. 1-74; S. J. Grier i inni, The Use of Dual-Energy X-Ray Abaorptiomktry Li Animals, Inv. Radiol, 1996, 31(1): 50-62; H. W. Wahner i I. Fogelman, The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice, Martin Dunitz Ltd., London 1994, str. 1-296). Przykłady hormonów przytarczyc ujawniono w „Human Parathyroid Peptide Treatment of Vertebral Ostkkpkrksis”, Osteoporosis Int., 3, (Supp. 1): 199-203 i w „PTH 1-34 Treatment of Ostekpkroais with Added Hormone Replacement Therapy: Biochemical, Kinetic and Histo^^al Rkaponsea”, Osteoporosis Int, 1: 162-170.

Określenie „czynnik stymulujący wydzielanie hormonu wzrostu” odnosi się do związków, które stymulują wydzielanie hormonu wzrostu lub naśladują działanie hormonu wzrostu (np. stymulując tworzenie się kości, co prowadzi do wzrostu masy kości). Takie działanie specjalista może łatwo ustalić na podstawie standardowych testów. Szereg takich związków ujawniono w następujących opublikowanych zgłoszeniach patentowych PCT: WO 95/14666, WO 95/13069, WO 94/19367, WO 94/13696 1 WO 95/34311.

Obok szczególnie korzystnego 22amink2N-[2-(3a2(R)-benzylo-2-metylk23-oksk-2,3,3a,4,6,7-eeksahydroplrazolo[4.3o !plrydyn-5o'lo)-]-(R.)-bknzydoksyrnetylo22-okakktylk]6

187 962 izobutyroamidu można korzystnie stosować takie czynniki stymulujące wydzielanie hormonu wzrostu jak:

N-[1(R)-[1,2-dihydro-1-metanosulfonylospiro[3H-indolo-3,4'-piperydyn]-1 '-ylo)karbonylo]-2-(fenylometyloksy)etylo]-2-amino-2-metylopropanoamid;.

2-amino-N-{1-(R)-benzyloksymetylo-2-[3a-(R)-(4-fluorobenzylo)-2-metylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo-[4,3-c]pirydyn-5-ylo]-2-oksoetylo}izobutyroamid; i

2-amino-N-[2-(3a-(R)-benzylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo-[4,3-c]pirydyn5-ylo)-1-(R)-benzyloksymetylo-2-oksoetylo]izobutyroamid.

Określenie „stan objawiający się małą masą kości” odnosi się do stanu chorobowego, w którym poziom masy kości jest mniejszy od właściwej dla wieku normalnej masy, określonej w normach Światowej Organizacji Zdrowia „Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994), Report of a World Health Organization Study Group, World Health Organization Technical Series 843. Obejmuje ono również samoistną osteoporozę dziecięcą i osteoporozę pierwotną. Leczenie osteoporozy obejmuje również zapobieganie lub zmniejszanie powikłań występujących przez dłuższy okres czasu, takich jak skrzywienie kręgosłupa i spadek wzrostu, unikanie konieczności stosowania protez chirurgicznych oraz zapobieganie nieprawidłowemu działaniu gruczołu krokowego. Obejmuje ono ponadto zwiększanie zrastania się pęknięć kości i zwiększanie powodzenia przeszczepów kostnych, a także leczenie chorób ozębnej i ubytków kości zębodołu.

Określenie „stan objawiający się małą masą kości” odnosi się także do ssaków, u których, występuje znacznie większe od przeciętnego prawdopodobieństwo rozwinięcia się chorób opisanych powyżej, takich jak osteoporoza (kobiety po klimakterium, mężczyźni w wieku ponad 60 lat i osoby leczone środkami znanymi z tego, że powodują osteoporozę jako działanie uboczne, takimi jak glukokortykoid).

Określenie „masa kości” w rzeczywistości odnosi się do masy kości na jednostkę powierzchni, zwanej czasem mineralną gęstością kości.

Określenia „leczenie” lub „leczyć” odnosi się również do działania zapobiegawczego (np. profilaktycznego) i łagodzącego.

Środek według wynalazku znajduje zastosowanie w sposobie leczenia ssaków z małą masą kości, korzystnie osteoporozy. Sposób ten polega na tym, że ssakowi, u którego występuje stan objawiający się małą masą kości, podaje się terapeutycznie skuteczną ilość wyżej zdefiniowanego agonisty/antagonisty estrogenu, oraz terapeutycznie skuteczną ilość wyżej zdefiniowanej substancji oddziaływującej na anabolizm kości.

Środek farmaceutyczny według wynalazku jest przydatny w zastosowaniach terapeutycznych jako środek oddziaływujący na cykl metaboliczny lub zapobiegający resorpcji kości albo przyspieszający tworzenie się kości u ssaków, zwłaszcza u ludzi. Zatem środek według wynalazku zwiększa lub utrzymuje masę kości, co zapobiega osteoporozie i pokrewnym zaburzeniom kostnym, albo powoduje ich zahamowanie ί/lub cofanie się. Środek ten zapewnia przyrost masy kostnej szybszy i większy od uzyskiwanego w przypadku takich samych dawek samego wyżej zdefiniowanego agonisty/antagonisty estrogenu lub takich samych dawek wyżej zdefiniowanych substancji oddziaływujących na anabolizm kości. Tak, więc wykazuje on działanie synergiczne, zwiększając masę kości i zmniejszając szybkość ich pękania w stopniu większym od uzyskiwanego w wyniku zastosowania osobno każdego z tych składników.

Poszczególne związki można podawać dowolnym sposobem zapewniającym ogólnoustrojowe i/lub miejscowe podanie danego związku. Można je więc podawać doustnie, pozajelitowe, dodwunastniczo itp. Zazwyczaj środek, według wynalazku podaje się doustnie, z tym, że można również stosować podawanie pozajelitowe (np. dożylne, domięśniowe, podskórne lub wewnątrzrdzeniowe), np. w przypadku, gdy podawanie doustne jest nieodpowiędnie z uwagi na założony cel, lub gdy pacjent nie może przełknąć leku. Dwa związki tworzące środek według wynalazku można podawać równocześnie lub kolejno, w dowolnej kolejności, korzystnie w postaci pojedynczego środka farmaceutycznego zawierającego te dwa związki w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.

Przykładowo substancję oddziaływującą na anabolizm kości, samą lub w połączeniu z agonistą/antagonistą estrogenu, można podawać przez okres od 3 miesięcy do 3 lat,

187 962 a następnie podawać samego agonistę/antagonistę estrogenu przez okres od 3 miesięcy do 3 lat i ewentualnie powtórzyć cały cykl leczenia. Alternatywnie można stosować substancję oddziaływującą na anabolizm kości, samą lub w połączeniu z agonistą/antagonistą estrogenu, przez okres od 3 miesięcy do 3 lat, a następnie podawać samego agonistę/antagonistę estrogenu do końca życia pacjenta. Substancję oddziaływującą na anabolizm kości można np. podawać raz dziennie, a agonistę/antagonistę estrogenu można podawać codziennie w jednej lub większej liczbie dawek. Alternatywnie oba związki można podawać kolejno, przy czym substancję oddziaływującą na anabolizm kości można podawać raz dziennie przez okres czasu wystarczający do powiększenia masy kości do poziomu powyżej progu pękania kości, a następnie podawać agonistę/antagonistę estrogenu) codziennie w jednej lub większej liczbie dawek.

Korzystnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości podaje się przez okres od około 3 miesięcy do około 3 lat i ewentualnie po tym okresie podawania tego związku podaje się agonistę/antagonistę estrogenu przez okres od około 3 miesięcy do około 3 lat, bez podawania w tym okresie substancji oddziaływującej na anabolizm kości.

Alternatywnie po podawaniu substancji oddziaływującej na anabolizm kości agonistę/antagonistę estrogenu podaje się przez okres powyżej około 3 lat, bez podawania w tym okresie substancji oddziaływującej na anabolizm kości.

Korzystnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości podaje się raz dziennie w postaci zapewniającej szybkie uwalnianie, korzystnie doustnej (to znaczy należy unikać postaci dawkowanych o przedłużonym uwalnianiu).

W każdym przypadku ilość i okres czasu podawania związków będą oczywiście zależne od leczonego osobnika, ostrości choroby, sposobu podawania i oceny lekarza przepisującego lek. Dlatego też, z uwagi na różnice pomiędzy poszczególnymi pacjentami, podane poniżej dawki stanowią jedynie wskazówki co do dawek pozwalających uzyskać aktywność (np. przyrost masy kostnej), którą uważa za odpowiednią dla danego pacjenta. Przy ustalaniu żądanego stopnia aktywności lekarz musi uwzględnić szereg czynników, takich jak wyjściowy poziom masy kości, wiek pacjenta, występowanie wcześniejszej choroby, a także występowanie innych chorób (np. sercowo-naczyniowych). Podawanie agonisty/antagonisty estrogenu może korzystnie wpływać na układ sercowo-naczyniowy, zwłaszcza u kobiet po przejściu menopauzy.

Stosowana ilość agonisty/antagonisty estrogenu jest określona jego aktywnością jako środka hamującego ubytek kości. Aktywność tą można określić na podstawie farmakokinetyki poszczególnych związków oraz minimalnej/maksymalnej dawki hamującej ubytek kości, z wykorzystaniem niżej opisanego „protokołu agonisty/antagonisty estrogenu”.

Ogólnie skuteczna dawka agonisty/antagonisty estrogenu wynosi 0,01-200 mg/kg/dzień, korzystnie 0,5-100 mg/kg/dzień.

W szczególności skuteczna dawka (-)-cis-6-fenyło-5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu wynosi 0,0001-100 mg/kg/dzień, a zwłaszcza 0,001-10 mg/kg/dzień.

Ogólnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości stosuje się w ilości wystarczającej do zwiększenia masy kości do poziomu powyżej progu pękania kości, (którego szczegóły podano w cytowanym powyżej World Health Organization Study).

Skuteczna dawka substancji oddziaływującej na anabolizm kości wynosi 0,001-100 mg/kg/dzień, korzystnie 0,1-10 mg/kg/dzień.

W szczególności skuteczna dawka hormonu przytarczyc oraz jego fragmentów i metabolitów wynosi 0,00001-1 mg/kg/dzień, korzystnie 0,001-0,5 mg/kg/dzień, a skuteczna dawka czynników stymulujących wydzielanie hormonu wzrostu wynosi 0,0001-100 mg/kg/dzień, a zwłaszcza 0,01-5 mg/kg/dzień.

W przypadku podawania doustnego środek farmaceutyczny może mieć postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, proszków itp. Tabletki dogodnie zawierają różne zarobki, takie jak cytrynian sodu, węglan wapnia i fosforan wapnia, stosowane wraz z różnymi środkami ułatwiającymi rozpad, takimi jak skrobia, korzystnie skrobia ziemniaczana lub tapiokowa, oraz pewne złożone krzemiany, wraz ze środkami wiążącymi, takimi

187 962 jak poliwinylopirolidon, sacharoza, żelatyna i guma arabska. Przy tabletkowaniu często są przydatne środki smarujące, takie jak stearynian magnezu, laurylosiarczan sodu i talk. Stałe kompozycje podobnego typu stosuje się również jako wypełnienie miękkich i twardych kapsułek żelatynowych, przy czym do korzystnych materiałów w takim zastosowaniu należy również laktoza, czyli cukier mleczny oraz glikole polietylenowe o wysokiej masie cząsteczkowej. Dla wytworzenia wodnych zawiesin i/lub eliksirów do podawania doustnego substancje czynne można łączyć z różnymi środkami słodzącymi, środkami aromatyzującymi, środkami barwiącymi, środkami emulgującymi i/lub środkami zawieszającymi, a także z rozcieńczalnikami, takimi jak woda, etanol, glikol propylenowy, gliceryna i różne ich kombinacje.

Do podawania pozajelitowego można stosować roztwory w oleju sezamowym lub arachidowym albo wodne roztwory glikolu propylenowego, a także sterylne wodne roztwory odpowiednich soli rozpuszczalnych w wodzie. Takie wodne roztwory w razie potrzeby można dogodnie buforować, a ciekłemu rozcieńczalnikowi można najpierw nadać izotoniczność za pomocą odpowiedniej ilości soli lub glukozy. Takie wodne roztwory są szczególnie przydatne do iniekcji dożylnej, domięśniowej, podskórnej i śródotrzewnowej. W takim przypadku wszystkie sterylne wodne ośrodki łatwo wytwarza się zwykłymi sposobami znanymi specjalistom.

Do podawania przezskómego (czyli miejscowego) wytwarza się rozcieńczone wodne, lub częściowo wodne roztwory (zazwyczaj o stężeniu około 0,1-5%), pod innymi względami podobne do wyżej opisanych roztworów do podawania pozajelitowego.

Sposoby wytwarzania różnych środków farmaceutycznych z określonymi ilościami substancji czynnej są znane lub będą dla specjalistów oczywiste (patrz np. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., wyd. 15. (1975)).

Środki farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać 0,1-95%, a korzystnie 1-70% substancji czynnej (substancji czynnych). W każdym przypadku podawany środek lub preparat będzie je zawierał w ilości skutecznie leczącej chorobę/stan leczonego pacjenta.

W związku z tym, że środek według wynalazku umożliwia zwiększanie i utrzymywanie masy kości poprzez zastosowanie kombinacji substancji czynnych, które można podawać osobno, może mieć on także postać zestawu zawierającego odrębne preparaty farmaceutyczne tych substancji czynnych. Zestaw zawiera zatem preparat agonisty/antagonisty estrogenu i preparat substancji oddziaływującej na anabolizm kości w odpowiednim pojemniku, takim jak podzielona butelka lub podzielony pakiecik foliowy. Zazwyczaj zestaw zawiera wskazówki odnośnie podawania odrębnych składników. Postać zestawu jest szczególnie dogodna, gdy odrębne składniki korzystnie podaje się w różnych postaciach dawkowanych (np. do podawania doustnego i pozajelitowego), gdy podaje się je w różnych odstępach czasu lub, gdy pożądane jest dopasowywanie poszczególnych składników kompozycji przez lekarza.

Przykład takiego zestawu stanowi tak zwane opakowanie listkowe. Opakowania listkowe są znane w przemyśle opakowań i są powszechnie stosowane do pakowania farmaceutycznych jednostkowych postaci dawkowanych (tabletek, kapsułek itp.).

Opakowanie listkowe zazwyczaj składa się z arkusika stosunkowo sztywnego materiału przykrytego folią, korzystnie z przezroczystego tworzywa. W czasie pakowania w folii tworzywowej formuje się zagłębienia. Zagłębienia mają kształt i wielkość pakowanych tabletek lub kapsułek. Następnie w zagłębieniach umieszcza się tabletki lub kapsułki i arkusz stosunkowo sztywnego materiału szczelnie łączy się z folią po stronie folii przeciwnej do kierunku, w którym wykonane zostały zagłębienia. W efekcie tabletki lub kapsułki są szczelnie zamknięte w zagłębieniach pomiędzy folią z tworzywa i arkuszem. Korzystnie wytrzymałość arkusza jest taka, ze tabletki lub kapsułki można wyjąć z listka naciskając ręcznie na zagłębienie, na skutek czego w arkuszu tworzy się otwór w miejscu zagłębienia. Tabletkę lub kapsułkę można następnie wyjąć przez ten otwór.

Pożądane jest umieszczenie instrukcji na karcie, np. w postaci liczb w sąsiedztwie tabletek lub kapsułek, które to liczby odpowiadają dniom cyklu, w których zaznaczone tabletki lub kapsułki powinny zostać połknięte. Inny przykład takiej instrukcji stanowi nadrukowany na karcie następujący kalendarz „pierwszy tydzień, poniedziałek, wtorek, itd... drugi tydzień.

187 962 poniedziałek, wtorek...” itp. Łatwo można sobie wyobrazić inne warianty instrukcji. „Dzienną dawkę” może stanowić pojedyncza tabletka lub kapsułka albo szereg pigułek lub kapsułek przeznaczonych na dany dzień. Ponadto dzienną dawkę substancji oddziaływującej na anabolizm kości może stanowić jedna tabletka lub kapsułka, a dzienna dawka agonisty/antagonisty estrogenu może składać się z szeregu tabletek lub kapsułek. Powinno to być odzwierciedlone na instrukcji.

Można też stosować dozownik przeznaczony do dozowania dziennych dawek, po jednej na raz, w kolejności ich przewidywanego stosowania. Korzystnie dozownik wyposażony jest w instrukcję, aby ułatwić postępowanie zgodnie z trybem leczenia. Przykład takiej instrukcji stanowi mechaniczny licznik wskazujący liczbę dozowanych dziennych dawek. Inny przykład takiej instrukcji stanowi zasilana z baterii pamięć mikroprocesorowa sprzężona z odczytem ciekłokrystalicznym, albo układ przypominający z sygnałem dźwiękowym, który np. odczytuje dane, że ostatnia dzienna dawka została pobrana i/lub przypomina pacjentowi, że należy wziąć następną dawkę.

Wraz z wyżej zdefiniowanymi substancjami czynnymi stanowiącymi składniki środka farmaceutycznego według wynalazku można stosować inne środki zapobiegające resorpcji (bisfosfonian, estrogen, estradiol, premarin, estron, estriol lub 17α-albo 17p-etynyloestradiol) oraz inne środki oddziaływujące na anabolizm kości (androgen, agonista/antagonista androgenu).

Przykładowo ze środkiem oddziaływującym na anabolizm kości, czyli hormonem przytarczyc lub czynnikiem stymulującym wydzielanie hormonu wzrostu można łączyć następujące środki zapobiegające resorpcji kości: droloksyfen ((E)-3-[1-[4-[2-(dimetyloamino)etoksy]fenylo]-2-fenylo-1-butenylo] fenol) oraz związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5047431); tamoksyfen (2-hydroksy-1,2,3-propanotrikarboksylan (1:1) (Z)-2-[4-(1,2-difenylo-1 -butenylojfenoksy] -N,N-dimetyloetanoaminy) oraz związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4536516; 4-hydroksytamoksyfen ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4623660; raloksyfen (chlorowodorek [6-hydroksy-2-(4-hydroksyfenylo)benzo[b]tien-3-ylo][4-[2-(1-piperydynylo)etoksy]fenylo]metanonu) i związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4418068; toremyfen (2-hydroksy-1,2,3-propanotrikarboksylan (1:1) (Z)-2-[4-(4-chloro- 1,2-difenylo-1 -butenylo)fenoksy]NN-dimetyloetanoaminy) oraz związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4996225; centchroman (1-[2-[[4-(metoksy-2,2-dimetylo-3-fenylochroman-4-ylo)fenoksy]etylo]pirolidyna) oraz związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3822287; i idoksyfen (1-[[4-[[1-(4-jodofenylo)-2lfenylι^^1lbuΐenylo|fenoksy]etylo]pirolidyna) oraz związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4839155.

Oprócz (-)-cis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo]l5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu można także stosować związki mu pokrewne, a mianowicie związki o ogólnym wzorze:

w którym A oznacza CH2 lub NR; B, D i E niezależnie oznaczają CH lub N; Y oznacza (a) fenyl ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R⁴;

(b) naftyl ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R4;

(c) Cj-Cjj cykloalkil ewentualnie podstawiony 1-2 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R4; (d) Cj-Cs cykloalkenyl ewentualnie podstawiony 1-2 podstawnikami niezależnie

187 962 wybranymi spośród R⁴; (e) pięcioczłonowy heterocyklil zawierający do 2 heteroatomów wybranych z grupy obejmującej- O-, -NR²- i -S(O)n-, ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R4; (f) sześcioczłonowy heterocyklil zawierający do 2 heteroatomów wybranych z grupy obejmującej -O-, -NR²- i -S(O)n ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R4; (g) bicykliczny układ pierścieniowy składający się z pięcio- lub sześcioczłonowego pierścienia heterocyklicznego skondensowanego z pierścieniem fenylowym, który to pierścień heterocykliczny zawiera do 2 heteroatomów wybranych z grupy obejmującej -O-, -NR2- i -S(O)n-, ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród r4; Z¹ oznacza (a) -(CH22pW(CH2)q; (b) -O(cH2)pCR⁵R⁶. (c) -O(CH2)pW(CH2)q; (d) -OCHR²CHR3; albo (e) -SCHR²CHR⁵; G oznacza (a) -NR⁷R, (b) /CH^-\ ₂ \ / (CH₂^gdzie n oznacza 0, 1 lub 2; m oznacza 1, 2 lub 3; Z oznacza -NH-, -O-, -S- lub -CH2-; ewentualnie skondensowany poprzez sąsiednie atomy węgla z jednym lub dwoma pierścieniami fenylowymi, oraz ewentualnie, niezależnie podstawiony przy atomach węgla 1-3 podstawnikami, a także, ewentualnie, niezależnie podstawiony przy atomie azotu odpowiednim pod względem chemicznym podstawnikiem wybranym spośród R.4; (c) ugrupowanie bicyklicznej aminy zawierające 5-12 atomów węgla, w układzie mostkowym lub skondensowanym, ewentualnie podstawione 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R4; albo Z i G mogą razem oznaczać

R

I •N —OCH,

()„

W oznacza (a) -CH₂-; (b) CH=CH-; (c) -O-; (d) -NR2-; (e) -S(O)n-: (f) -C(O)-; (g) -CR2OH)-; (h) -CONR²-;

\ ^s/ (i) -NR2CO-; (j) '-' ’ lub (k) -C=C-; R oznacza atom wodoru lub Ci-C6 alkil; r2 i R³ niezależnie oznaczają (a) atom wodoru lub (b) C1-C4 alkil; r4 oznacza (a) atom wodoru; (b) atom chlorowca; (c) C1-C6 alkil; (d) C1-C4 alkoksyl; (e) C1-C4 acyloksyl; (f) grupę C1-C4 alkilotio; (g) C1-C4 alkilosulfinyl; (h) C1-C4 alkilosulfonyl; (1) hydroksy-(C1-C4) alkil; (j) arylo-(C_rC4) alkil; (k) -CO₂H; (1) -CN; (m) -CONHOR;

(n) -SO2NHR; (o) -NH2; (p) grupę C1-C4 alkiloaminową; (q) grupę C1-C4 dialkiloaminową; (r) -NHSO₂R; (s) -NO₂; (t) aryl; lub (u) -OH; R⁵ i r6 niezależnie oznaczają CrCg alkil albo tworzą razem pierścień C3-C10 karbocykliczny; R7 i R⁸ niezależnie oznaczają (a) fenyl; (b) pierścień C3-C10 karbocykliczny. nasycony lub nienasycony; (c) pierścień C3-C10 heterocykliczny zawierający do dwóch heteroatomów wybranych spośród -O-. -N- i -S-; (d) H; (e) C1-C6 alkil; albo (i) tworzą razem z r5 i r6 3-8 członowy pierścień zawierający atom azotu; R ⁷ i R⁸ w postaci liniowej lub pierścieniowej mogą być ewentualnie podstawione podstawnikami. w liczbie do trzech. niezależnie wybranymi spośród C1-C6 alkilu. atomu chlorowca. alkoksylu. hydroksylu i karboksylu; pierścień utworzony przez R7 i R⁸ może być

187 962 ewentualnie skondensowany z pierścieniem fenylowym; e oznacza 0, 1 lub 2; m oznacza 1, 2 lub 3; n oznacza 0, 1 lub 2; p oznacza 0, 1, 2 lub 3; q oznacza 0, 1, 2 lub 3; oraz ich izomery optyczne i geometryczne, a także ich nietoksyczne farmakologicznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami, N-tlenki, estry i czwartorzędowe sole amoniowe.

Do korzystnych związków tego typu należą związki o wzorze:

lub albo

R⁴ oznacza H, OH, F lub Cl; a każdy spośród B i E niezależnie oznacza CH lub atom azotu.

Do szczególnie korzystnych związków należą:

cis-6-(4-ni^ioroif^ip^4o)-i^-['^-((^-{^ii^i^ir^y^iyi^-1-yloetoksy)-fenylo]-5,6,7,8-tctrahydronaftalen-2-ol;

ciS(6-fenylO(5-[4-(2-pirolidyn-1(yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2(Ol ; cis-1-(6'(pirolidynoetoksy-3^,-pilrydylo)-2-fenylo-6-hydroksy-1,2,3,4(tetra.hydronaftalen; 1[(4'-plrolldynoetoksyfenylo)-2-(4”-fluorofenylo)-6-hydroksy-1,2,3,4(tetrahydrolxochlnolina;

cis-6-(4-hydroksyfenylo)-5-[4-(2-piperydyn-1(yloatoksy)-fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol;

[(4'(plro]ldynoetoksyfel}y 1o)-2 - fenylo-6-hydroksy-1,2,3,4-tetrahydroizochinolina. Ponadto jako dodatkowych agonistów/antagonistów estrogenu można stosować pochodne 2(fenylo(3(aroilobenzotlofenu i 1-tlenku 2-fenylo-3-aroilobenz.otiofenu ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4133814; antagonistów estrogenu o wzorze

w którym R² oznacza fenyl lub cyklopentyl, a R³ oznacza H,

-CH₂CH₂—N

187 962 lub -CH2CHOHCH2OH (Lednicer i inni, J. Med. Chem, 12, 881 (1969); agonistów/antagonistów estrogenu o wzorze:

Ar

-4w którym Ph oznacza rodnik 1,2-fenylenowy, Ar oznacza monocykliczną arylową grupę karbocykliczną podstawioną grupą trzeciorzędowo-amino-niższoalkiloksylową, w której trzeciorzędowa grupa aminowa jest oddzielona od grupy oksy co najmniej dwoma atomami węgla, R oznacza atom wodoru, rodnik alifatyczny, karbocykliczny rodnik arylowy, rodnik karbocykliczno-arylo-alifatyczny, heterocykliczny rodnik arylowy lub rodnik heterocykliczno-arylo-alifatyczny, grupa -(CnH2n-2)- oznacza nierozgałęziony rodnik alkilenowy zawierający 3-5 atomów węgla, zawierający podstawniki Ar i R, ich sole, N-tlenki, sole N-tlenków lub czwartorzędowe związki amoniowe, ujawnionych w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3234090; zasadowe etery o działaniu agonistów/antagonistów estrogenu, o wzorze

Ph ^Ar ,(C₂H_2n.₂) w którym Ph oznacza rodnik 1,2-fenylenowy, Ar oznacza monocykliczną arylową grupę karbocykliczną podstawioną co najmniej jedną grupą ammo-niższoalkiloksylową, w której atom azotu jest oddzielony od atomu tlenu co najmniej dwoma atomami węgla, R oznacza rodnik arylowy, a grupa -(CnH2n-2)- oznacza niższy alkilen tworzący z Ph 6- lub 7-członowy pierścień, przy czym jego dwa atomy węgla w pierścieniu zawierają jako podstawniki grupy Ar i R, ich sole, N-tlenki, N-tlenki soli i czwartorzędowe związki amoniowe, ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3277106; oraz związki będące agonistami/antagonistami estrogenu, o wzorze

w którym Ri i R2 są wybrane z grupy obejmującej niższy alkil lub są połączone tworząc 5-7-członowy nasycony pierścień heterocykliczny, ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3274213.

Jako dodatkową substancję oddziaływującą na anabolizm kości można stosować prostaglandynę, agonistę/antagonistę prostaglandyny, fluorek sodu lub hormon wzrostu.

Określenie „prostaglandyna” odnosi się do związków będących analogami naturalnych prostaglandyn PGDi, PGD2, PGE2, PGE1 i PGF2 α, przydatnych w leczeniu osteoporozy.

187 962

Określenie „agonista/antagonista prostaglandyny” odnosi się do związków, które wiążą się z receptorami prostaglandyny (patrz np. S. An i inni, Cloning and Expression of the EP₂Subtype of Human Receptors for Prostaglandin E₂, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993, 197(l):263-270) naśladując działanie prostaglandyny in vivo (np. stymulując tworzenie się kości i wzrost masy kości).

Określenie „fluorek sodu” odnosi się do fluorku sodu we wszelkich postaciach (np. do fluorku sodu o powolnym uwalnianiu, fluorku sodu o przedłużonym uwalnianiu).

Jako dodatkową substancję oddziaływującą na anabolizm kości można zastosować dowolny hormon wzrostu.

Użyteczność środka farmaceutycznego według wynalazku w leczeniu stanów objawiających się niską masą kości, a zwłaszcza osteoporozy, u ssaków (tj. ludzi, w szczególności kobiet) można określić jako aktywność poszczególnych związków w znanych testach in vitro i in vivo opisanych poniżej. Testy te umożliwiają porównanie aktywności poszczególnych związków badanych i związków znanych. Wyniki tych testów porównawczych są użyteczne w określaniu poziomów dawek u ssaków, włącznie z człowiekiem, w leczeniu takich chorób.

Protokół leczenia skojarzonego i sekwencyjnego

Poniższe protokoły mogą być oczywiście zmieniane przez specjalistów. Na przykład mogą być użyte samce lub samice szczura bez uszkodzeń, samce z niedoborem hormonów płciowych (z wyciętymi jądrami) lub samice z niedoborem hormonów płciowych (z wyciętymi jajnikami). Ponadto w badaniach można stosować samce lub samice szczura w różnym wieku (np. 12 miesięcy). Szczury mogą być nietknięte lub wykastrowane (z wyciętymi jądrami lub jajnikami) i można im podawać substancję oddziaływującą na anabolizm kości przez pewien okres czasu, np. przez dwa tygodnie do dwóch miesięcy, a następnie podawać agonistę/antagonistę estrogenu w różnych dawkach przez pewien okres czasu, np. przez dwa tygodnie do dwóch miesięcy, lub stosować leczenie skojarzone substancją oddziaływującą na anabolizm kości i agonistą/antagonistą estrogenu w różnych dawkach przez pewien okres czasu, np. przez dwa tygodnie do dwóch miesięcy. U wykastrowanych szczurów leczenie można zacząć w dzień po operacji (w celu zapobieżenia utracie kości) lub w momencie, gdy wystąpiła już utrata kości (w celu przywrócenia masy kości).

Sto cztery samice szczurów Sprague-Dawley (Charles River, Wilmington, MA) w wieku 12 miesięcy poddaje się operacji sham lub pozbawiającej jajników (OVX) operacji w miesiącu 0. Trzy miesiące po operacji szczurom OVX podaje się przez 2 miesiące substancję oddziaływującą na anabolizm lub substancję oddziaływującą na anabolizm kości skojarzoną z agonistą/antagonistą estrogenu. Następnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości odstawia się z leczenia i szczurom podaje się nośnik (10% alkohol w roztworze soli) lub agonistę/antagonistę estrogenu przez następne półtora miesiąca, jak to opisano poniżej.

Grupa I: 8 szczurów, którym wykonano autopsję w miesiącu 0, wyjściowa grupa kontrolna.

Grupa II: 8 szczurów po operacji sham, którym wykonano autopsję w miesiącu 3, grupa kontrolna przed podawaniem leków·-.

Grupa III: 8 szczurów po operacji sham, którym podano doustnie nośnik (10% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 5.

Grupa IV: 8 szczurów po operacji sham, którym podano doustnie nośnik (10% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-6,5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa V: 8 szczurów OVX, którym wykonano autopsję w miesiącu 3, grupa kontrolna przed podawaniem leków·;

Grupa VI: 8 szczurów OVX, którym podano doustnie nośnik (10% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 5.

Grupa VII. 8 szczurów OVX, którym podano doustnie nośnik (10% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-6,5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa VIII: 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano podskórnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości przez miesiące 3-5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 5.

187 962

Grupa IX: 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano podskórnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości przez miesiące 3-5, a następnie nośnik przez miesiące 5-6,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa X: 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano podskórnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości przez miesiące 3-5, oraz podawano doustnie agonistę/antagonistę estrogenu przez miesiące 5-6,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa XI: 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano podskórnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości oraz podawano doustnie agonistę/antagonistę estrogenu przez miesiące 3-5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 5.

Grupa XII: 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano podskórnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości oraz podawano doustnie agonistę/antagonistę estrogenu przez miesiące 3-5, a następnie nośnik przez miesiące 5-6,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa XIII: 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano podskórnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości oraz podawano doustnie agonistę/antagonistę estrogenu przez miesiące 3-5, a następnie doustnie sam droloksyfen przez miesiące 5-6,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Badane substancje najpierw rozpuszcza się w 100% etanolu, a następnie rozcieńcza roztworem soli fizjologicznej do wymaganych stężeń (ostateczne stężenie etanolu wynosiło 10%). Roztwór substancję oddziaływującą na anabolizm kości wstrzykuje się podskórnie codziennie w grzbiet. Roztwór agonisty/antagonisty estrogenu podaje się doustnie codziennie. Wszystkim szczurom wstrzykuje się podskórnie 10 mg/kg kalceiny (fluorochromowy znacznik kości, Sigma Chemical Co. St. Louis MO) w 12 i 2 dniu przed śmiercią, aby zbadać dynamiczne zmiany w tkance kostnej.

Szczury zabija się przez uśpienie ketaminą. Ocenia się następujące cechy końcowe:

Pomiary mineralizacji kości udowej: Od każdego ze szczurów pobiera się podczas autopsji prawą kość udową i skanuje stosując absorpcjometrię rentgenowską z dwoistą energią (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, Ma) z oprogramowaniem „Regional High Resolution Scan” (Hologic Inc., Waltham, MA). Wielkość skanowanego obszaru wynosi 5,08 x 1,902 cm, rozdzielczość wynosi 0,0254 x 0,0127 cm, a prędkość skanowania wynosi 7,25 mm/s. Obrazy skanowanych kości udowych analizuje się i oznacza powierzchnię kości, zawartość mineralną kości (BMC) oraz gęstość mineralną kości (BMD) całej kości udowej (WF), dalszych przynasad kości udowej (DMF), trzonu kości udowej (FS) oraz bliższej kości udowej.

Pomiary mineralizacji kręgów lędźwiowych: Do oznaczenia powierzchni kości, zawartości mineralnej kości (BMC) oraz gęstość mineralną kości (BMD) całego kręgosłupa lędźwiowego i każdego z sześciu kręgów lędźwiowych (LY1-6) u uśpionych szczurów wykorzystuje się absorpcjometrię rentgenowską z dwoistą energią (QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, Ma) z oprogramowaniem „Regional High Resolution Scan” (Hologic Inc., Waltham, MA). Szczury usypia się wstrzykując (dootrzewnowo) 1 ml/kg mieszaniny ketamina/rompun (w stosunku od 4 do 3) i umieszcza na platformie dla szczurów. Wielkość skanowanego obszaru wynosi 6 x 1,9 cm, rozdzielczość wynosi 0,0254 x 0,0127 cm, a prędkość skanu wynosi 7,25 mm/s. Można uzyskać i zanalizować obraz skanu całego kręgosłupa lędźwiowego. Oznacza się powierzchnię kości (BA), zawartość mineralną kości (BMC) oraz wylicza się gęstość mineralną kości (BMC podzielone przez BA) dla całego kręgosłupa lędźwiowego i każdego z sześciu kręgów lędźwiowych (LY1-6).

Analiza histomorfometryczna kości gąbczastej bliższych przynasad kości piszczelowej: Prawą kość piszczelową usuwa się podczas autopsji, oddziela od mięśni i tnie na trzy części. Bliższą kość piszczelową utrwala się w 70% etanolu, odwadnia w roztworach o stopniowo zmieniających się stężeniach etanolu, odtłuszcza w acetonie i zatapia w metakrylanie metylu (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY). Czołowe części bliższych przynasad kości piszczelowej tnie się na kawałki o grubości 4 do 10 pm używając mikrotomu Reichert-Jung Polycut S. Jeden kawałek o grubości 4 pm i jeden o grubości 10 pm używa się do histomorfometrii kości gąbczastej. Kawałek 4 pm wybarwia się w modyfikowanym barwniku Masson's Trichrome, a kawałki 10 pm pozostają niewybarwione.

187 962

Do statycznych i dynamicznych pomiarów histomorfometrycznych wtórnej gąbczastości blizszych przynasad kości piszczelowej pomiędzy 1,2 a 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada używa się systemu histomorfometrycznego Bioquant OS/2 (R&M biometrics, Inc., Nashville, TN). Pierwszy region 1,2 mm przynasad kości piszczelowej należy pominąć, aby ograniczyć pomiary tylko do wtórnej gąbczastości. Kawałków 4 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do objętości kości, struktury kości oraz resorpcji kości, natomiast kawałków 10 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do tworzenia się i cyklu metabolicznego kości.

I. Pomiary i obliczenia odnoszące się do objętości i struktury kości beleczkowatej :

1. Całkowita powierzchnia przynasad (TV, mm²): powierzchnia przynasad pomiędzy

1,2 do 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada.

2. Powierzchnia beleczki (Bv, mm²): całkowita powierzchnia beleczki w obrębie TV.

3. Całkowity obwód kości beleczkowatej (BS, mm): długość całkowitego obwodu beleczki.

4. Objętość kości beleczkowatej (BV/TV, %) : BV/TV x 100

5. Liczba kości beleczkowatej (TBN, liczba/mm) : 1,199/2 x BS/TV

6. Grubość kości beleczkowatej (TBT, pm) : (2000/1,199) x (BV/BS)

7. Rozdzielenie kości beleczkowatej (TBS, pm) : (2000 x 1,199) x (TV-BV)

II. Pomiary i obliczenie resoropcji kości

1. Liczba osteoklastów (OCN, liczba) : całkowita liczba osteoklastów w całkowitym obszarze przynasad.

2. Obwód osteoklastu (OCP, mm) : długość obwodu beleczki pokrytej przez osteoklast.

3. Liczba osteoklastów/mm (OCN/mm, liczba/mm) : OCN/bS

4. Procentowy obwód osteoklastu (%OCP, %) : oCp/BS x 100

III. Pomiary i obliczenia odnoszące się do tworzenia się i cyklu metabolicznego kości:

1. Pojedynczo znakowany kalceiną obwód (SLS, mm) : całkowita długość obwodu beleczki pojedynczo znakowanej kalceiną.

2. Podwójnie znakowany kalceiną obwód (DLS, mm) : całkowita długość obwodu beleczki podwójnie znakowanej kalceiną.

3. Wewnętrznie znakowana szerokość (ILW, pm) : średnia odległość pomiędzy dwoma znacznikami kalceinowymi.

4. Procentowy obwód mineralizujący (PMS, %) : (SLS/2 + DLS)/BS x 100.

5. Szybkość odłożenia mineralnego (MAR, pm/dzień) : ILW/przerwę w znakowaniu.

6. Szybkość tworzenia się kości/powierzchnię (BFR7BS, pm2/d/pm) : (SLS/2+DLS) x xMAR/BS.

7. Szybkość cyklu metabolicznego kości (BTR, %/rok): (SLS/2+DLS) x MAR/BV x 100.

Statystyka

Obliczenia statystyczne można wykonać przy pomocy pakietu StatView 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Analizę testu zmienności (ANOVA) i następujący po niej Fisher's PLSD można wykorzystać do porównywania różnic pomiędzy grupami.

Protokół z agonistą/antagonistą. estrogenu

Agoniści/antagoniści estrogenu stanowią klasę związków hamujących cykl metaboliczny kości i zapobiegających utracie kości wywołanej niedoborami estrogenu. Model utraty kości u myszy z wyciętymi jajanikami jest powszechnie używany jako model pomenopauzalnej utraty kości. Przy użyciu tego modelu można przebadać skuteczność związków będących agonistami/antagonistami estrogenu w zapobieganiu utracie kości i hamowaniu resorpcji kości.

W badaniach używa się szczury Sprague-Dawley (Charles River, Wilmington, MA) w różnym wieku (np. 5 miesięcy). Podczas okresu badań szczury trzyma się pojedynczo w klatkach 20 cm x 32 cm x 20 cm. Wszystkie szczury mają swobodny dostęp do wody oraz pożywienia granulowanego dostępnego w handlu (Agway ProLab 3000, Agway County Food, Inc., Syracuse, NY) zawierającego 0,97% wapnia, 0,85% fosforu oraz 1,05 IU/g witaminy D3.

Grupę szczurów (8 do 10) poddaje się operacji sham i podaje doustnie nośnik (10% etanolu i 90% roztworu soli, 1 ml/dzień), natomiast inne szczury pozbawia się obustronnie jajników (OVX) i podaje albo nośnik (doustnie), albo Πβ-estradiol (Sigma, E-8876, E2, 30 pg/kg,

187 962 codziennie zastrzyk podskórny) lub agonistę/antagonistę estrogenu przez pewien okres czasu (np. przez 4 tygodnie). Wszystkim szczurom wstrzykuje się podskórnie 10 mg/kg kalceiny (fluorochromowy znacznik kości, Sigma Chemical Co. St. Louis MO) w 12 i 2 dniu przed śmiercią, aby zbadać dynamiczne zmiany w tkance kostnej. Po czterech tygodniach hodowli szczury poddaje się autopsji. Ocenia się następujące cechy końcowe:

Przyrost masy ciała: masa ciała w momencie autopsji minus masa ciała w momencie operacji.

Masa i histologia macicy: Macicę usuwa się z każdego ze szczurów podczas autopsji i natychmiast waży. Następnie macicę obrabia się do pomiarów histologicznych takich jak powierzchnia tkanki w przekroju, grubość zrębu oraz grubość nabłonka światła.

Całkowity poziom cholesterolu w osoczu: Krew uzyskuje się przez nakłucie serca i zostawia do skrzepnięcia w 4°C, następnie odwirowuje przy 2000 g przez 10 minut. W próbkach osocza oznacza się całkowity cholesterol osoczowy stosując test cholesterolowy kalorymetryczny o wysokiej czułości (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN).

Pomiary mineralizacji kości udowej: Od każdego ze szczurów pobiera się podczas autopsji prawą kość udową i skanuje używając absorpcjometrii rentgenowskiej z dwoistą energią (DEXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) z oprogramowaniem „Regional High Resolution Scan” (Hologic Inc., Waltham, MA). Wielkość skanowanego obszaru wynosi 5,08 x 1,902 cm, rozdzielczość wynosi 0,0254 x 0,0127 cm, a prędkość skanu wynosi 7,25 mm/s. Obrazy skanowanych kości udowych analizuje się i oznacza powierzchnię kości, zawartość mineralną kości (BMC) oraz gęstość mineralną kości (BMD) całej kości udowej (WF), dalszych przynasad kości udowej (DMF), trzonu kości udowej (FS) oraz bliższej kości udowej.

Do statycznych i dynamicznych pomiarów histomorfometrycznych wtórnej gąbczastości bliższych przynasad kości piszczelowej pomiędzy 1,2 a 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada używa się systemu histomorfometrycznego Bioquant OS/2 (R&M biometrics, Inc., Nashville, TN). Pierwszy region 1,2 mm przynasad kości piszczelowej pomija się, aby ograniczyć pomiary tylko do wtórnej gąbczastości. Kawałków 4 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do objętości kości, struktury kości oraz resorpcji kości, natomiast kawałków 10 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do tworzenia się i cyklu metabolicznego kości.

I. Pomiary i obliczenia odnoszące się do objętości i struktury kości beleczkowatej:

1. Całkowita powierzchnia przynasad (TV, miĄ powierzchnia przynasad pomiędzy

1,2 do 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada.

3. Obwód kości beleczkowatej (BS, mm): długość całkowitego obwodu beleczki.

4. Objętość kości beleczkowatej (BV/TV, %): BV/TV x 100.

5. Liczba kości beleczkowatej (TBN, liczba/mm): 1,199/2 x BS/TV.

6. Grubość kości beleczkowatej (TBT, pm): (2000/1,199) x (BY/BS).

7. Rozdzielenie kości beleczkowatej (TBS, pm) : (2000 x 1,199) x (TV-BV).

II. Pomiary i obliczanie resoropcji kości:

1. Liczba osteoklastów (OCN, liczba): całkowita liczba osteoklastów w całkowitym obszarze przynasad.

2. Obwód osteoklastu (OCP, mm): długość obwodu beleczki pokrytej przez osteoklast.

3. Liczba osteoklastów/mm (OCN/mm, liczba/mm): OCN/BS.

4. Procentowy obwód osteoklastu (%OCP, %) : OCP/BS x 100.

187 962

2. Podwójnie znakowany kalceiną obwód (DLS, mm) : całkowita długość obwodu beleczki podwójnie znakowanej kalceiną..

4. Procentowy obwód mineralizacyjny (PMS, %) : (SLS/2 + DLS)/BS x 100.

6. Szybkość tworzenia się kości/powierzchnię (BFR/BS, pm²/d/pm) : (SLS/2+DLS) x xM!AR/.BS.

7. Szybkość cyklu metabolicznego kości (BTR, %/rok): (SLS/2+DLS) X MAR/BV x x100.

Statystyka

Obliczenia statystyczne można wykonać przy pomocy pakietu StatView 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Analizę testu zmienności (ANÓVA) i następujący po niej Fisher's PLSD można wykorzystać do porównania różnic pomiędzy grupami.

Protokół ze środkiem oddziaływującym na anabolizm kości

Do badań aktywności środków oddziaływujących na anabolizm kości w stymulowaniu tworzenia się kości i zwiększania masy kości mogą być użyte samce lub samice szczura bez uszkodzeń, samce z niedoborem hormonów płciowych (z wyciętymi jądrami) lub samice z niedoborem hormonów płciowych (z wyciętymi jajnikami).

Do badań używa się samic lub samców szczura w różnym wieku (np. 3 miesięczne). Szczury mogą być nietknięte lub wykastrowane (z wyciętymi jądrami lub jajnikami) i można im podawać środki oddziaływujące na anabolizm przez pewien okres czasu (np. przez dwa tygodnie do dwóch miesięcy). U wykastrowanych szczurów leczenie zaczyna się w dzień po operacji (w celu zapobieżenia utracie kości) łub w momencie, gdy wystąpiła już utrata kości (w celu przywrócenia masy kości). Podczas badań wszystkie szczury mają swobodny dostęp do wody oraz pożywienia granulowanego dostępnego w handlu (Teklad Rodent Diet Iiczba8064, Harlan Teklad, Madison, WI) zawierającego 1,-46% wapnia, 0,99% fosforu oraz 4,96 IU/g witaminy D3. Wszystkim szczurom wykonuje się podskórny zastrzyk 10 mg/kg kalceiny w 12 i 2 dniu przed śmiercią..

Szczury zabija się. Ocenia się następujące cechy końcowe:

Pomiary mineralizacji kości udowej: Od każdego ze szczurów pobiera się podczas autopsji prawą kość udową i skanuje używając absorpcjometrii rentgenowskiej z dwoistą energią (DEKA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) z oprogramowaniem „Regional High Resolution Scan” (Hologic Inc., Waltham, MA). Wielkość skanowanego obszaru wynosi 5,08 x 1,902 cm, rozdzielczość wynosi 0,0254 x 0,0127 cm, a prędkość skanu wynosi 7,25 mm/s. Obrazy skanowanych kości udowych analizuje się i oznacza powierzchnię kości, zawartość mineralną kości (BMC) oraz gęstość mineralną kości (BMD) całej kości udowej (WF), dalszych przynasad kości udowej (DMF), trzonu kości udowej (FS) oraz bliższej kości udowej.

Do statycznych i dynamicznych pomiarów histomorfometrycznych wtórnej gąbczastości bliższych przynasad kości piszczelowej pomiędzy 1,2 a 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada używa się systemu histomorfometrycznego Bioquant OS/2 (R&M

187 962 biometrics, Inc., Nashville, TN). Pierwszy region 1,2 mm przynasad kości piszczelowej pomija się, aby ograniczyć pomiary tylko do wtórnej gąbczastości. Kawałków 4 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do objętości kości, struktury kości oraz resorpcji kości, natomiast kawałków 10 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do tworzenia się i cyklu metabolicznego kości.

1. Całkowita powierzchnia przynasad (TV, mm2) : powierzchnia przynasad pomiędzy

1,2 do 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada.

2. Powierzchnia beleczki (BV, mm⁷) : całkowita powierzchnia beleczki w obrębie TV.

4. Objętość kości beleczkowatej (BV/TV, %) : BV/TV x 100.

5. Liczba kości beleczkowatej (TBN, liczb^rmm): 1,199/2 x BS/TV.

6. Grubość kości beleczkowatej (TBT, pm): (2000/1,199) x (BV/BS).

7. Rozdzielenie kości beleczkowatej (TBS, pm): (2000 x 1,199) x (TV-BV).

II. Pomiary i obliczenie resoropcji kości:

3. Liczba osteoklastów/mm (OCN/mm, liczba/mm) : OCN/bS.

4. Procntowy obwód osteoklastu (%OCP, %): OCP/BS x 100.

1. Pojedynczo znakowany kalceiną obwód (SLS, mm): całkowita długość obwodu beleczki pojedynczo znakowanej kalceiną

3. Wewnętrznie znakowana szerokość (ILW, pm): średnia odległość pomiędzy dwoma znacznikami kalceinowymi.

4. Procentowy obwód minerałizowania (PMS, %) : (SLS/2 + DLS)/BS'x 100.

5. Szybkość odłożenia mineralnego (MAR, pm/dzień): ILW/przerwę w znakowaniu.

6. Szybkość tworzenia się kości/powierzchnię (BFR/BS, pm“/d/pm) : (SLS/2+DLS) x x MAR/BS.

7. Szybkość cyklu metabolicznego kości (BTR, %/rok): (SLS/2+DLS) x MAR/BV x x 100.

Statystyka

Obliczenia statystyczne można wykonać przy pomocy pakietu StatView 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Analizę testu zmienności (ANOVA) i następujący po niej Fisher's PLSD można wykorzystać do porównania różnic pomiędzy grupami.

Test wiązania receptora estrogenowego in vitro

Do oznaczenia powinowactwa wiązania poszczególnych związków kompozycji z receptorem estrogenowym używa się testu wiązania receptora estrogenowego in vitro, który mierzy zdolność związków będących agonistami/antagonistami estrogenu do usunięcia [3H]-estradiolu z ludzkiego receptora estrogenowego uzyskanego metodami rekombinacji w drożdżach. Materiały użyte w teście to: (1) bufor do testu, TD-0.3 (zawierający 10 nM Tris, pH 7,6, 0,3 M chlorek potasu i 5 mM Ditiotreitol (DTT)(Sigma Co.), pH 7,6); (2) radioligand - [3H]-estradiol uzyskany z New England Nuclear; (3) zimny ligand - estradiol uzyskany z Sigma; (4) rekombinowany ludzki receptor estrogenowy, hER.

Przygotowuje się roztwór badanego związku w TD-0.3 z 4% DMSO i 16% etanolu. Trytowany estradiol rozpuszcza się w TD-0.3 w takiej ilości, że jego ostateczne stężenie w teście jest 5 nM. HER również rozcieńcza się TD-0.3 tak, aby każda studzienka zawierała 4-10 pg całkowitego białka. Przy stosowaniu płytek do mikromiareczkowania do każdego inkubatu dodaje się 50 pil zimnego estradiolu (wiązanie niespecyficzne) lub roztworu związku, 20 pl trytowanego estradiolu i 30 g 1 roztworów hER. Na każdej płytce znajdują się 3 studzienki odpowiadające pełnemu wiązaniu oraz studzienki z badanym związkiem w różnych stężeniach. Płytki inkubuje się przez noc w 4°C. Reakcje wiązania następnie kończy się

187 962 w wyniku dodania i 100 ml 3% hydroksyapatytu w 10 mM tris o pH 7,6, zmieszania inkubacji przez 15 minut w 4°C. Mieszanki odwirowuje się i osad przemywa się 4 razy 1% Tritonem Χ-100 w 10 mM Tris o pH 7,6. Osad hydroksyapatytu zawiesza się w środku Ecoscint A i mierzy się radioaktywność metodą scyntygrafii (3. Wyznacza się średnią z wszystkich trzech punktów danych (zliczenia/minutę, cpm). Wiązanie specyficzne wylicza się odejmując niespecyficzne cpm (określone jako zliczenia pozostające po oddzieleniu mieszaniny reakcyjnej zawierającej zrekombinowany receptor, radikligand oraz nadmiar nieznaczonego ligandu) od całkowicie związanych cpm (określanych jako zliczenia pozostające po oddzieleniu mieszaniny reakcyjnej zawierającej tylko zrkkkmbinkwany receptor i radioligand). Skuteczność związku określa się wyznaczając IC50 (stężenie związku niezbędne do zahamowania o 50% całkowitego specyficznego wiązania trytowanego estradiolu). Wyznacza się wiązanie specyficzne w obecności związku w różnych stężeniach i wylicza jako procent specyficznego wiązania całkowicie związanego specyficznego radioligandu. Wyniki przedstawia się na wykresie jako procent hamowania przez związek (skala liniowa) w funkcji stężenia związku (skala logarytmiczna).

Protokół z czynnikiem stymulującym wydzielanie hormonu wzrostu

Związki wykazujące zdolność pobudzania wydzielania GH przez hodowane komórki przysadkowe szczura identyfikuje się wykorzystując następujący protokół. Test ten jest również przydatny do porównywania wzorców i określania poziomów dawkowania. Komórki pobiera się z przysadek mózgowych 62tygodniowych samców szczura Wistai:·. Po dekapitacji przednie płaty przysadkowe usuwa się i umieszcza w zimnym, sterylnym, zrównoważonym roztworze soli Hanksa bez wapnia lub magnezu (HBSS). Tkanki rozdrabnia się, a następnie poddaje dwóm cyklom enzymatycznego dyspergowania ze wspomaganiem mechanicznym, stosując 10 U/ml proteazy bakteryjnej (EC 3.4.24.4, Sigma P-6141) w HBSS. Mieszankę tkanki z enzymem miesza się w kolbie do wirowania z szybkością 30 obrotów/minutę w atmosferze z 5% CO2 w około 37°C przez około 30 minut, z ręcznym rozcieraniem po około 15 minutach i po około 30 minutach za pomocą 10-ml pipety. Mieszaninę odwirowuje się przy 200 x g przez około 5 minut. Do supematantu dodaje się surowicy końskiej w celu zobojętnienia nadmiaru proteazy. Osad ponownie zawiesza się w świeżej prktkatzrk, miesza dodatkowo przez około 30 minut w podanych uprzednio warunkach, oraz ręcznie rozciera się, na koniec przez igłę nr 23. Ponownie dodaje się surowicy końskiej i komórki z obydwu operacji trawienia łączy się, odwirowuje (200 x g przez około 15 minut), przemywa, zawiesza w ośrodku hodowli i zlicza. Komórki wysiewa się w ilości 6,0-6,5xl0⁴ komórek/cm² na 48-studzienkowyce szalkach Costar i prowadzi się hodowlę w ośrodku DulbeccoE Modiiiecl Eagle Medium (D-MEM) uzupełnionym 4,5 g/litr glukozy, 10% surowicy końskiej, 2,5% płodowej surowicy bydlęcej, 1% endogennych aminokwasów. 100 U/ml nystatyny i 50 mg/ml siarczanu gentamycyny, przed oznaczaniem wydzielania GH.

Tuż przed wykonaniem testu studzienki z hodowlą przemywa się dwukrotnie, po czym doprowadza się do równowagi przez około 30 minut w ośrodku uwalniania (D-MEM buforowany 25 mM Hepes o pH 7,4, zawierający 0,5% bydlęcej albuminy surowiczej, w 37°C). Badane związki rozpuszcza się w DMSO, a następnie rozcieńcza się podgrzanym ośrodkiem uwalniania. Testy wykonuje się z czterema powtórkami. Test inicjuje się dodając 0,5 ml ośrodka uwalniania (z nośnikiem lub badanym związkiem) do każdej studzienki z hodowlą. Inkubację prowadzi się w około 37°C przez około 15 minut, po czym kończy się ją usuwając ośrodek hodowli, który odwirowuje się przy 2000 x g przez około 15 minut w celu usunięcia materiału komórkowego. Stężenia szczurzego hormonu wzrostu w supematantach oznacza się zgodnie ze standardową procedurą testu radioimmunologicznego stosując szczurzy hormon wzrostu jako preparat wzorcowy (NIDDKorGH-RP-2) oraz przeciwciało szczurzego hormonu wzrostu wyhodowane w małpie (NlDDK-anti-rGH-S-5) uzyskane od dr A. Parlowa (Harbor-UCLA Medical Center, Torrence, CA). Dodatkowo szczurzy hormon wzrostu (1,5 U/mg, liczba G2414, Scripps Labs, San Diego, CA) joduje się do uzyskania aktywności właściwej około 30 pCi/ąg metodą z chloraminą T, do stosowania jako znacznik. Kompleksy immunologiczne uzyskuje się w wyniku dodania koziej przkciwaurowicy do małpiej IgG (Organon Teknika. Durham, NC) i glikolu polietylenowego o masie cząsteczkowej 10000-20000,

187 962 do uzyskania ostatecznego stężenia 4,3%; kompleks odzyskuje się przez wirowanie. Zakres roboczy w teście wynosi 0,08-2,5 pg szczurzego hormonu wzrostu/probówkę, powyżej poziomu podstawowego. Aktywne związki zazwyczaj stymulują ponad 1,4 krotnie wydzielanie hormonu wzrostu. Źródło: K. Cheng, W. S. Chan, A. Barreto, Jr., E. M. Convey, R. G. Smith, 1989.

Test egzogennie pobudzanego wydzielania hormonu wzrostu u szczura po dożylnym podaniu badanych związków

21-Dniowe samice szczura Sprague-Dawley (Charles River Laboratory, Wilmington, MA) aklimatyzuje się w warunkach lokalnej zwierzęciami (24°C, cykl 12 godzin na świetle, 12 godzin w ciemności) przez około 1 tydzień przed badaniem związków. Wszystkim szczurom zapewnia się swobodny dostęp do wody i granulowanej handlowej karmy (Agway Country Food, Syracuse, NY).

W dniu doświadczenia badane związki rozpuszcza się w nośniku zawierającym 1% etanolu, 1 mM kwas octowy i 0,1% bydlęcej albuminy surowiczej w roztworze soli. Każdy związek bada się z n = 3 powtórkami. Szczury waży się i znieczula wstrzykując śródotrzewnowo pentobarbital sodu (Nembutol, 50 mg/kg wagi ciała). W 14 minut po podaniu środka znieczulającego pobiera się próbkę krwi nakłuwając końcówkę ogona i zbiera się skapującą krew do probówki mikrowirówki (próbka krwi do oznaczania poziomu podstawowego, około 100 pl). W 15 minut po podaniu środka znieczulającego podaje się badany związek wstrzykując go dożylnie, do ż.yły ogonowej, przy czym całkowita wstrzykiwana objętość wynosi 1 ml/kg wagi ciała. Dodatkowe próbki krwi pobiera się z ogona po 5, 10 i 15 minutach po podaniu związku. Próbki krwi trzyma się w lodzie aż do oddzielenia surowicy przez wirowanie (1430 x g, przez 10 minut w 10°C). Surowicę przechowuje się w -80°C, aż do oznaczania hormonu wzrostu w surowicy metodą radioimmunologiczną, w sposób opisany powyżej i poniżej.

Ocena egzogennie pobudzanego wydzielania hormonu wzrostu u psa po podaniu doustnym.

W dniu wykonywania doświadczenia badany związek odważa się w celu uzyskania odpowiedniej dawki i rozpuszcza się w wodzie. Dawki podaje się w objętości 0,5 ml/kg przez sondę 4 psom dla każdego zakresu dawkowania. Próbki krwi (2 ml) pobiera się z żyły szyjnej przez bezpośrednie nakłucie żyły·, przed podaniem związku oraz w 0,08, 0,17, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6 i 8 godzin po podaniu, do 2-ml pojemników próżniowych zawierających sól litową heparyny. Preparowaną plazmę przechowuje się w -20°C aż do wykonania analizy.

Pomiar psiego hormonu wzrostu

Stężenia psiego hormonu wzrostu oznacza się zgodnie ze standardową procedurą testu radioimmunologicznego stosując psi hormon wzrostu (antygen do jodowania i jako preparat wzorcowy AFP-1983B) oraz przeciwciało psiego hormonu wzrostu wyhodowane w małpie (AFP-21452578) uzyskane od dr A. Parlowa (Harbor-UCLA Medical Center, Torrence, CA). Znacznik wytwarza się przez jodowanie z chloraminą T psiego hormonu wzrostu do uzyskania aktywności właściwej 20-40 pCi/pg. Kompleksy immunologiczne uzyskuje się w wyniku oddania koziej przeciwsurowicy do małpiej IgG (Organon Teknika, Durham, NC) i glikolu polietylenowego o masie cząsteczkowej 10000-20000, do uzyskania ostatecznego stężenia 4,3%; kompleks odzyskuje się przez wirowanie. Zakres roboczy w teście wynosi 0,08-2,5 pg psiego GT/probówkę.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Środek farmaceutyczny zawierający kompozycję agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości, oraz ewentualnie farmaceutyczny nośnik lub rozcieńczalnik, znamienny tym, że jako agonistę/antagonistę estrogenu zawiera (-)-cis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol, a jako substancję oddziaływującą na anabolizm kości zawiera hormon przytarczyc lub czynnik stymulujący wydzielanie hormonu wzrostu, korzystnie 2-amino-N-[2-(3a-(R)-benzyło-2-metylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo[4,3-c]pirydyn-5-ylo)-1-(R)-benzyloksymetylo-2-oksoetylo]izobutyroamid lub jego sól z kwasem L-winowym.
2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancję oddziaływującą na anabolizm kości zawiera hormon przytarczyc.
3. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancję oddziaływującą na anabolizm kości zawiera czynnik stymulujący wydzielanie hormonu wzrostu.
4. Środek według zastrz. 3, znamienny tym, że jako czynnik stymulujący wydzielanie hormonu wzrostu zawiera 2-amino-N-[2-(3a-(R)-benzylo-2-metylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo[4,3-c]pirydyn-5-ylo)-1-(R)-benzyloksymetylo-2-oksoetylo]izobutyroamid.
5. Zastosowanie kompozycji agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości, to jest kompozycji (-)-cis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu z hormonem przytarczyc lub czynnikiem stymulującym wydzielanie hormonu wzrostu, korzystnie 2-amino-N-[2-(3a-(R)-benzylo-2-metylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo[4,3-c]pirydyn-5-ylo)-1-(R)-benzyloksymetylo-2-oksoetylo]izobutyroamidem lub jego solą z kwasem L-winowym, do wytwarzania leku do leczenia stanu objawiającego się małą masą kości u ssaków, zwłaszcza osteoporozy.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym substancją oddziaływującą na anabolizm kości jest hormon przytarczyc.
7. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym substancją oddziaływującą na anabolizm kości jest czynnik stymulujący wydzielanie hormonu wzrostu.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, w którym czynnikiem stymulującym wydzielanie hormonu wzrostu jest 2-amino-N-[2-(3a-(R)-benzylo-2-metylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo[4,3-c]pirydyn-5-ylo)-1-(R)-benzyloksymetylo-2-oksoetylo]izobutyroamid.