NO323648B1

NO323648B1 - Farmasoytisk preparat inneholdende en ostrogenagonist/-antagonist og et prostaglandin eller en prostaglandinagonist/-antagonist, anvendelse av disse for fremstilling av et farmasoytisk preparat for behandling av en tilstand karakterisert ved lav benmasse og sett inneholdende samme.

Info

Publication number: NO323648B1
Application number: NO19983936A
Authority: NO
Inventors: Hua Zhu Ke; David D Thompson
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1998-08-27
Publication date: 2007-06-18
Also published as: HK1018210A1; NO20063853L; CZ297452B6; ATE405273T1; PT883404E; PL187219B1; SI0883404T1; HRP970118A2; IL154379A0; CN1515317A; BG102726A; EP1236475A2; EP1932543A3; CL2004000119A1; PE20011302A1; EP0883404A1; AR005987A1; CO4761063A1; AP9700934A0; US20010009920A1

Description

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår en farmasøytisk kombinasjon av østrogenagonister/antagonister og et prostaglandin eller en prostaglandinagonist/- antagonsist for å stimulere bendannelse og øke benmassen, anvendelsen av disse ved fremstilling av preparater for å behandle tilstander som er karakterisert ved lav benmasse i pattedyr, heri mennesker og sett som inneholder slike kombinasjoner.

Osteoporose er en systemisk skjelettsykdom karakterisert ved lav ben-

masse og svekkelse av benvevet og følgelig en økende bensprøhet og økende risiko for brudd. I De forente stater alene, er tilstanden til stede hos mer enn 25 millioner personer og forårsaker mer enn 1,3 millioner brudd hvert år, heri inngår 500.000 brudd på ryggsøylen, 250.000 brudd på hofter og 240.000 håndledds-

brudd hvert år. Hoftebruddene er de mest alvorlige, og hvor fra 5-20% av pasientene dør i løpet av ett år, og over 50% av de som overlever blir funksjons-hemmet.

Hos eldre er det en stor risiko for osteoporose, og det er anslått at problem-

et vil øke betydelig med en elding av befolkningen. På verdensbasis har det vært beregnet at bruddforekomsten vil øke tre ganger over de neste 60 år, og én undersøkelse antar at det vil bli ca. 4,5 millioner hoftebrudd i verden i år 2050.

Kvinner har større risiko for osteoporose enn menn. Hos kvinner skjer det

en skarp akselerasjon av bentap umiddelbart etter menopausen. Andre faktorer som øker bentapet og som fører til osteoporose, innbefatter røyking, alkohol-misbruk og en stillesittende livsstil og et lavt kalsiuminntak.

Østrogen er et meget brukt middel for å hindre osteoporose eller bentap

hos kvinner etter menopausen. I tillegg har Black et al. i EP 0605193A1, angitt at østrogen, når dette tas oralt, senker plasmanivået av LDL og hever de tilsvarende for de fordelaktige høytetthetslipoproteinene (HDL). Langtidsterapi med østrogen øker imidlertid risikoen for en rekke forskjellige sykdommer, blant annet risikoen for kreft i egglederen, endometrial kreft og muligens brystkreft, noe som gjør at mange kvinner enten unngår denne behandlingen eller bare tar medikamentet i korte tidsrom. Skjønt risikoen for endometrial kreft kan reduseres ved en samtidig bruk av progesteron, så er det stadig en bekymring om en mulig øket sjanse for

brystkreft ved bruken av østrogen. Nylig foreslåtte terapeutiske regimer som søker å minske sjansen for kreft, f.eks. ved at mån bruker kombinasjoner av progesteron og østrogen, kan gjøre at pasienten får for sterk og uakseptabel blødning. Videre har en kombinasjon av progesteron og østrogen vist seg å mot-virke de serumkolesterolsenkende av østrogen. Disse signifikante og uønskede sideeffektene som er forbundet med øsrogenterapi, har gjort at det er et behov for å utvikle alternative terapier for osteoporose som har en ønskelig fordelaktig effekt på serum-LDL, men som ikke frembringer uønskede sideeffekter.

Nylig er en rekke østrogenagonister/antagonister blitt foreslått for behandling av osteoporose. Det er blant annet angitt (Osteoporosis Conference Scrip. nr. 1812/13. april 16/20,1993, p. 29) at raloksifen, 6-hydroksy-2-(4-hydroksyfenyl)-3-[4-(2-piperidinoetpksy)benzoyl]benzo[b]tiofen, etteraper den gunstige virkningen av østrogen på ben og lipider, men i motsetning til østrogen, har minimal egglederstimulerende effekt. (Black, L.J. et al., Raloxifene (LY139481 Hel) Prevents Bone Loss and Reduces Serum Cholesterol Without Causing Uterine Hypertrophy in Ovariectomized Rats, J. Gin. InvesL, 1994, 93:63-69).

Også tamoksifen, 1-(4-p-dimetylaminoetoksyfenyl)-1,2-difenyl-but-1-en, er et antiøstrogen som er foreslått som et osteoporosemiddel som har en gunstig effekt på brystkreft, men som er rapportert å ha en viss østrogenisk aktivitet i livmoren. Gill-Sharma et al., J. Reoroduction and Fertilitv (1993) 99,395, beskriver at tamoksifen i doser på 200 og 400 mg/kg/dag reduserer vekten på testiklene og sekundære kjønnsorganer hos hannrotter.

I tillegg beskriver U.S. patent nr. 5.254.594 at bruken av droloksifen for behandling av bensykdommer og heri inngår osteo-porose.

Midler som droloksifen hindrer bentap og reduserer derved risikoen for brudd uten østrogenets sideeffekter. Østrogen og østrogenagonister alene reduserer imidlertid bruddrisikoen med bare ca. 50%, dvs. at ca. 50% av kvinner med osteoporose allikevel har høy risiko for brudd.

Ikke-østrogenagonister/antagonister som bisfosfonater, er også foreslått for behandlingen av osteoporose. F.eks., Fosamax® er et bisfosfonat som for tiden markedsføres for behandlingen av osteoporose. Andre bisfosfonater er for tiden underkastet regulerende undersøkelser, såsom risedronat, tiludronat og ibandronat.

Frost et al. I "Treatment of Osteoporosis by Manipulation of Coherent Bone Cell Populations", Clinical Ortho<p>edics and Realted Research. 143,227 (1979), beskriver en teoretisk modell som antyder at det skal være mulig å synkronisere aktiviteten og metabolismen i bencellene ved først å tilføre et bencelleaktiverende middel, fulgt av et middel for å hemme benresorpsjon, og så la det skje en normal bendannelse.

Tang et al., Restorina and Maintainina Bone in Osteoaenic Female Rat Skeleton: I. Chanaes in Bone Mass and Structure. J. Bone Mineral Research 7 (9), p. 1093.1104,1992, beskriver data for det såkalte løse, gjenskape dg opprettholde (LRM) konseptet, en praktisk fremgangsmåte for å reversere eksiterende osteoporose. LRM-konseptet bruker anabole midler for å gjenskape benmassen og arkitekturen (+ fasen) og går så over til et middel som etablerer evnen til å opprettholde benmassen og holde på det nye benet (+/- fasen). Rotteunder-søkelser hvor man har anvendt PGE2 og risedronat, et bisfosfonat, viser at meste-parten at de nye kanal- og barkbenceller som er redusert ved hjelp av PGE2, kan opprettholdes i minst 60 dager etter at man har avbrutt PGE2 ved å tilføre risedronat.

Kombinasjoner av bisfosfonater og prostaglandiner for behandlingen av osteoporose er også beskrevet. E.P. søknad nr. 0 381 296, beskriver bruken av et sett hvor en benaktiverende periode eller behandlingsregime følges av et ben-resorpsjonsinhiberende regime. Eksempler på benaktiverende forbindelser som er beskrevet i denne referansen, innbefatter paratyroidhormon (PTH), uorganisk fosfat, veksthormon, fluorid, tyroidhormon (f.eks. ty roks in), visse vitamin D-metabolitter og prostaglandiner (PGE2 i et doseregime på 10 mg/kg/dag). Poly-fosfonater er beskrevet som de benresorpsjonshemmende midlene.

PCT/US93/08529 beskriver samtidig tilførsel av et benaktiverende middel som f.eks. et prostaglandin, som er kjemisk koblet til en benresorpsjonshemmende forbindelse som selektivt tilfører det benaktiverende middel til mål-området. Ved en gradvis hydrolyse av den nye forbindelsen, vil de hydrolyserte produktene være i stand til å tilveiebringe en benresorpsjonshemmende aktivitet (via bisfosfonatene) og benvekst eller stimulerende aktivitet (via PGE2).

Effektene av en kombinasjon av prostaglandin E2 og risedronat (et bisfosfonat) er undersøkt i Lin et al., Effects of Prostaglandin E2 and Risedronate

Administration on Cancellous Bone in Older Female Rats. Bone 15 (5), p. 489-496,1994.

Qiu et al., Experimentai Studv on Antiatherosclerotic Tratment bv PGEg Combined With Vitamin E oa Estradiol. Chinese Medical Journal, 108 (1) p. 33-36, 1995, beskriver at en enkeltdose av PGE2 kombinert med vitamin E og med estradiol, hadde en mer koordinerende hemming av aorta og koronære atero-sklerotiske sår, så vel som på blodplatesammenklomping, oppformering av glatte muskelceller og lipid peroksidasjon enn en enkeltdose av PGE2.

Sammendraget for "Nonhormonal Alternatives for the Management of Early Menopause in Younger Women with Breast Cancer", Monogr. Nati. Cancer Inst. (16), 161-167,1994, angir "anvendelsen av fiere ikke-østrogene behandlingsveier for å hindre og behandle osteoporose har vært lovende. Tradisjonelle anbefaling-er for å opprettholde skjeiettintegritet, såsom fysisk aktivitet med vektløfting, en diett rik på kalsium og med begrenset inntak av koffein, alkohol og protein; unngå røyking og foreta justeringer for å minimalisere traume, har blitt utvidet og innbefatter bruken eller undersøkelser av forskjellige stoffer (enten alene eller i kombinasjon). Disse forbindelsene eller stoffene innbefatter progestiner, vitamin D-metabolitter, injiserbare og intranasalt syntetisk lakse-kalsitonin, bisfosfonater, natriumfluorid, paratyroidhormon, vekstfaktorer, tamoksifen, etc".

Skjønt det altså eksiterer en rekke forskjellige osteoporoseterapier, så er det et kontinuerlig behov og en kontinuerlig forskning i dette området for å utvikle alternative terapier på grunn av bare begrensede resultater av de foreliggende terapier med hensyn til å redusere osteoporosebrudd.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår et farmasøytisk preparat som innbefatter østrogenagonister/antagonister og et prostaglandin eller en prostaglandinagonist/- antagonist, anvendelsen av et slik preparat ved fremstilling av preparater for behandling av tilstander karakterisert ved lav benmasse, og heri inngår osteoporose i pattedyr (f.eks. mennesker, da spesielt kvinner) og sett som inneholder slike kombinasjoner av forbindelser.

Nevnte kombinasjonspreparat inneholder en terapeutisk effektiv mengde av en første forbindelse som er en østrogenagonist/antagonist; og en terapeutisk effektiv mengde av en annen forbindelse som er et prostaglandin eller en prosta-glandinagonist/antagonist.

Foretrukne østrogenagonist/antagonister innbefatter droloksifen, raloksifen, tamoksifen, 4-hydroksy-tamoksifen,

cis-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)-fenylJ-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol;

(0-cjs-6-fenyl-5-[4-{2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)-fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol;

cjs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)-fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol;

cis-1-[6'-pvrrolodinoetoksv-3'-pvridvn-2-fenvl-6-hydroksv-1.2.3.4-tetra-hydronaftalen;

1-(4'-pyrrolidinoetoksyfenyl)-2-(4"-fluorfenyl)-6-hydroksy-1,2,3,4-tetra-hydroisokinolin;

cjs-6-(4-hydroksyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetra-hydronaftalen-2-ol; og

1-(4'-pyrrolidinoletoksyfenyl)-2-fenyl-6-hydroksy-1,2,3,4-tetrahydro-isokinolin.

Foretrukne prostaglandiner eller prostaglandinagonist/antagonister innbefatter PGD1( PGD2, PGE2, PGEi, PGF2, PGF2aog 3S-(3-hydroksy-4-fenylbutyl)-2R-[6-(1H-tetrazol-5-yl)heksyl]cyklo-pentanon.

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av

a. en terapeutisk effektiv mengde av en første forbindelse som er en østrogenagonist/antagonist; og

b. en terapeutisk effektiv mengde av en annen forbindelse som er et prostaglandin eller en prostaglandinagonist/antagonist til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av et pattedyr med en tilstand karakterisert ved lav benmasse.

Foretrukne østrogenagonist/antagonister i denne anvendelsen, innbefatter droloksifen, raloksifen, tamoksifen, 4-hydroksytamoksifen, idoksifen, centrakroman,

cjs-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5i6J,8-tet naftalen-2-ol; (-)-cjs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6)7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol;

cis-6-fenvl-5-r4-f2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5.6.7.8-tetrahydronaftalen-2-ol;

cis-1-f6'-pyrrolodinoetoksy-3'-pyridyn-2-fenyl-6-hydroksy-1.2.3.4-tetra-hydronaftalen;

cjs-6-(4-hydroksyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6t7,8-tetra-hydronaftalen-2-ol; og

1-(4'-pyrroIidinoletoksyfenyl)-2-fenyl-6-hydroksy-1,2,3,4-tetrahydro-isoktnolin.

Foretrukne anabole midler i denne fremgangsmåten, innbefatter PGD,, PGD2, PGE2, PGEl PGF2, PGF2a og 3S-(3-hydroksy-4-fenylbutyl)-2R-[6-(1H-tetrazol-5-yl)heksyl]cyklopentanon.

Et foretrukket aspekt av denne anvendelsen, er ett hvor tilstanden med lav benmasse er osteoporose.

Et annet foretrukket aspekt av foreliggende fremgangsmåte, er ett hvor den første forbindelsen og den andre forbindelsen tilføres i alt vesentlig samtidig.

Et annet foretrukket aspekt av denne fremgangsmåten, er ett hvor den andre forbindelsen tilføres i et tidsrom fra ca. 3 måneder til ca. 3 år.

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse angår et synergistisk farmasøytisk preparat som inneholder: a. en mengde av en første forbindelse som er en østrogenagonistY-antagonist; og

b. en mengde av en annen forbindelse som er et prostaglandin eller en prostagladingagonist/antagonist,

hvor mengden av den første forbindelsen alene og hvor mengden av den andre forbindelsen alene er utilstrekkelig til å oppnå de terapeutiske effekter med hensyn til en økning i bendannelsen og en nedsatt benresorpsjon hvis de er brukt hver for seg, og hvor den samlede effekt av mengdene av de første og andre

forbindelser er større enn summen av de terapeutiske effekter som lar seg oppnå med de individuelle mengder av nevnte første og andre forbindelse, og et farma-søytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller en farmasøytisk akseptabel bærer.

Et annet aspekt av foreliggende.oppfinnelse angår anvendelse av et synergistisk farmasøytisk preparat som inneholder: a. en mengde av en første forbindelse som er en østrogenagonist/- antagonist; og

b. en mengde av en annen forbindelse som er et prostaglandin eller en prostaglandinagoirist/antagonist

og hvor mengden av den første forbindelsen alene og mengden av den andre forbindelsen alene er utilstrekkelig til å oppnå de terapeutiske effekter med hensyn til å øke bendannelsen og nedsette benresorpsjonen hvis de tilføres hver for seg, og hvor den samlede effekt av mengdene av de første og andre forbindelser er større enn summen av de terapeutiske effekter som lar seg oppnå med de individuelle mengder av den første og andre forbindelse, og et farma-søytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer til fremstilling av et farmasøytisk preparat for å behandle et pattedyr med en tilstand karakterisert ved lav benmasse.

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse angår et sett som inneholder en behandling for en tilstand som er karakterisert ved lav benmasse, karakterisert ved å innbefatte: a. en terapeutisk effektiv mengde av en østrogenagonist/antagonist og en farmasøytisk akseptabel bærer i en første enhetsdoseringsform; b. en terapeutisk effektiv mengde av et prostaglandin eller en prostaglandinagonist/antagonist og en farmasøytisk akseptabel bærer i en annen enhetsdoseringsform; og c. beholder anordninger som inneholder nevnte første og nevnte andre doseringsformer.

Begrepet "tilstand med lav benmasse" refererer seg til en tilstand hvor nivået av benmasse ligger under den aldersspesifikke normale mengde slik denne er definert i standarder av the World Health Organization "Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994), Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization Technical Series 843". Barndomsidiopati og primær osteoporose inngår også. I behandlingen av osteoporose inngår også at man hindrer eller lindrer langtids-komplikasjoner såsom bøying av ryggraden, tap av høyde, kirurgiske inngrep i forbindelse med proteser eller for å hindre dårlig funksjon av prostata. Videre inngår en økning av hastigheten med hensyn til heling av benbrudd og øke sannsynligheten for vellykket resultat i forbindelse med bentransplanteringer. Videre inngår forskjellige tannsykdommer og alveolart bentap.

Begrepet "tilstand med lav benmasse" refererer seg også til et pattedyr som har en betydelig høyere enn en middels sjanse til å utvikle slike sykdommer som er beskrevet ovenfor, og heri inngår osteoporose (f.eks. post-menoalt hos kvinner, menn over 60 år, og personer som blir behandlet med stoffer eller aktive bestanddeler som er kjent for å frembringe osteoporose som en sideeffekt (f.eks. glukokortikoide stoffer)).

Det er videre underforstått at begrepet benmasse refererer seg til benmasse pr. enhetsareal, noe som enkelte ganger (dog ikke helt korrekt) blir betegnet som benmineraltetthet.

Med begrepene "behandlende", "behandle" og "behandling" slik det brukes her, innbefatter både preventiv (f.eks. profylaktisk) og lindrende behandling.

Med halo forstås klor, brom, jod eller fluor.

Med alkyl forstås rette eller grenete hydrokarbongrupper. Eksempler på slike alkylgrupper (idet man antar at den angitte lengde innbefatter de spesifikke eksempler) er metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, sek-butyl, tertiær butyl, pentyl, isopentyl, heksyl og isoheksyl.

Med alkoksy forstås rette eller grenete, mettede alkylgrupper bundet gjennom en oksygruppe. Eksempler på slike alkoksygrupper (idet man antar at den angitte lengde innbefatter det spesielle eksempel) er metoksy, etoksy, propoksy, isopropoksy, butoksy, isobutoksy, tertiær butoksy, pentoksy, iso-pentoksy, heksoksy og isoheksoksy.

Med begrepet "farmasøytisk akseptabelt anionisk salt" forstås ikke-toksiske anioniske salter som inneholder anioner som klorid, bromid, jodid, sulfat, bisulfat, fosfat, acetat, maleat, fumarat, oksalat, laktat, tartrat, citrat, glukonat, metansulfonat og 4-toluensulfonat.

Med begrepet "farmasøytisk akseptabelt kationisk salt" forstås ikke-toksiske kationiske salter som natrium, kalium, kalsium, magnesium, ammonium eller protonert benzatin (N,N'-dibenzyl-etylendi-amin), kolin, etanotamin, dietanolamin, etylendiamin, meglamin, (N-metyl-glukamin), benetamin (N-benzylfenetylamin), piperazin eller trometamin {2-amino-2-hydroksymetyl-1,3-propandiol).

De negative og positive tegn som er gitt i parenteser, er her brukt i over-ensstemmelse med den nomenklatur som angir i hvilket retningsplan polarisert lys blir rotert av den spesielle stereoisomer som omtales.

Med begrepet "reaksjonsinert løsemiddel" og "inert løsemiddel" forstås et løsemiddel som ikke virker sammen med utgangsforbindelser, reagenser, mellomprodukter eller produkter på en slik måte at det skadelig påvirker utbyttet av det forønskede produkt.

Det er videre underforstått at visse forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse, vil inneholde ett eller flere atomer som kan ha en spesiell stereokjemisk eller geometrisk konfigurasjon, noe som gir opphav til stereoisomerer og geometriske isomerer. Alle slike isomerer og blandinger av slike inngår i foreliggende oppfinnelse. Hydrater av forbindelsene inngår også i oppfinnelsen.

Det er videre underforstått av visse kombinasjoner av heteroatomholdige substituenter som her er angitt, vil definere forbindelser som vil være mindre stabile under fysiologiske tilstander (f.eks. de som inneholder acetal eller aminal-bindinger). Følgelig er slike forbindelser mindre foretrukket.

De farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse resulterer i en raskere og bedre benmasseøkning enn det som lar seg oppnå med den samme dose av østrogenagonister/antagonister av den type som er beskrevet ovenfor, eller et middel som stimulerer en økning i benmineraltettheten slik dette er beskrevet ovenfor, alene. Disse kombinasjoner har således en synergistisk virkning ved at de øker benmassen og nedsetter bruddfrekvensen i større grad enn det som er mulig å oppnå ved å bruke hvert enkelt middel eller stoff alene. Foreliggende oppfinnelse bidrar således i betydelig grad til å tilveiebringe preparater og fremgangsmåter som øker og opprettholder benmassen, noe som vil resultere i at man hindrer, forsinker og/eller helbreder osteoporose og nær beslektede benlidelser.

Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse og krav.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Den første forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse er en pattedyr-østrogenagonist/antagonist. Med begrepet østrogen-agonist/antagonist forstås forbindelser som binder seg til østrogenreseptoren, hindrer utskiftning av ben og hindrer bentap. Slike aktiviteter kan lett bestemmes av fagpersoner ifølge standardprøver som innbefatter østrogenreseptorbindings-prøver (se in vitro østrogenreseptorbindingsprøve i det etterfølgende), standard benhistomorfometriske og densitometriske fremgansmåter (se østrogenagonist/antagonistprotokoll i det etterfølgende, og Eriksen E.F. et al., Bone Histomorpho-metry, Raven Press, New York, 1994, side 1-74; Grier S.J. et ai., The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry In Animals, Inv. Radiol., 1996,31(1):50-62; Wahner H.W. og Fogelman I., The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice., Martin Dunitz Ltd., London 1994, side 1-296). En rekke av disse forbindelsene er beskrevet og referert til i det etterfølgende, skjønt også andre østrogenagonister/antagonister vil være kjente for fagpersoner.

En foretrukket østrogenagonist/antagonist er droloksifen: (fenol, 3-[1 -[4-[2-(dimetylamino)etoksy]fenyl]-2-fenyl-1 -butenyl]-, (E)-) og assosierte forbindelser som er beskrevet i U.S. patent 5.047.431.

En annen foretrukket østrogenagonist/antagonist er raloksifen: (metanon, [6-hydroksy-2-(4-hydroksyfenyl)benzo[b]tien-3-yl][4-t2-(1-piperidinyl)etoksy]fenyl]-hydroklorid) og assosierte forbindelser som er beskrevet i U.S. patent 4.418.068.

En annen foretrukket østrogenagonist/antagonist er tamoksifen: (etanamin, 2-[4-(1,2-difenyl-1 -butenyl)fenoksy]-N,N-dimetyl, (2)-2-, 2-hydroksy-1,2,3-propantrikarboksylat (1:1)) og assosierte forbindelser som er beskrevet i U.S. patent 4.536.516. En annen beslektet forbindelse er 4-hydroksytamoksifen som er beskrevet i U.S. patent 4.623.660.

Én annen foretrukket østrogenagonist/antagonist for anvendelse ved fremstilling av preparater er idoksifen: pyrrolidin, 1*[-[4-Jf1-(4-jodfenyl)-2-fenyl-1-butenyl]fenoksy]etyl og beslektede forbindelser som er beskrevet i U.S. patent 4.839.155.

En annen foretrukket østrogenagonist/antagonist for anvendelse ved fremstilling av preparater er centkroman: 1 -[2-[[4-(metoksy-2,2-dimetyl-3-fenyl-kroman-4-yl)fenoksy]etyl]pyrrolidin og nær beslekt-ede forbindelser som er beskrevet i U.S. patent 3.822.287.

Videre foretrukne forbindelser er følgende: cjs-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; (-)-cjs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; cjs-6-fenyl-5-t4-{2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-1 -[6'-pyrrolodinoetoksy-3'-pyridyl]-2-fenyl-6-hydroksy-1,2,3,4-tetra-hydronaftalen; 1 -{4'-pyrroIidinoetoksyfenyl)-2-(4"-f luorfenyl)-6-hydroksy-1,2,3,4-tetra-hydroisokinolin;

cjs-6-{4-hydroksyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6I7,8-tetra-hydronaftalen-2-ol; og

1-(4'-pyrro!idirioletoksyfenyl)-2-fenyl-6-hydroksy-1,2,3,4-tetrahydro-isokinolin.

De ovennevnte forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse lar seg lett fremstille ved hjelp av de reaksjoner som er illustrert i de nedenfor angitte reaksjonsskjemaer.

Visse forbindelser med formel I kan hensiktsmessig fremstilles fra et umettet mellomprodukt:

ved hydrogenering med en edelmetallkatalysator i et reaksjonsinert løsemiddel. Trykk og temperatur er ikke kritisk og hydrogeneringen kan normalt utføres i løpet av et par timer ved romtemperatur ved et hydrogentrykk mellom 1,4 og 5,7 kg/cm<2>.

Det hydrogenene produktet kan isoleres, renses hvis dette er ønskelig, og eiergruppen kan spaltes med en syrekatalysator i et reaksjonsinert løsemiddel ved temperaturer mellom 0 til 100°C avhengig av den anvendte syrekatalysatoren. Hydrogenbromid ved forhøyede temperaturer, bortribromid og aluminiumklorid ved temperaturer mellom 0°C og romtemperatur, har vist seg å være effektive i denne reaksjonen.

Produktet med formet I lar seg isolere og rense ved hjelp av standard-metoder.

Mellomprodukter med formel li hvor A er CH2, og B, D og E er CH, er beskrevet i U.S. patent 3.274.213; J. Med. Chem. 10,78 (1967); J. Med. Chem. 10,138 (1967); og J. Med. Chem. 12, 881 (1969), og disse beskrivelsene inngår som her som referanser. De kan også fremstilles ved de fremgangsmåter som er beskrevet nedenfor.

Fremstillingen av forbindelsene med formel I hvor e er 1, A er CH2, Z<1> er OCH2CH2, G er cykloalkylamin, B er CH, er vist i reaksjonsskjema 1. Forbindelsene 1 -2, hvor D og E er CH, kan fremstilles ved å alkylere 4-bromfenoi med det tilsvarende N-kloretylaminet ved å bruke kaliumkarbonat som base, i et polart aprotisk løsemiddel som f.eks. dimetylformamid, ved forhøyede temperaturer. En foretrukket temperatur er 100°C. Forbindelsene 1-2 hvor D eller E eller begge er N, kan syntetiseres ved å bruke en nukleofilisk omleiringsreaksjon utført på dibromider (1-1), ved å bruke hydroksyetylcykloalkylaminer under faseoverførings-betingelser som gir bromaminer (1-2). Synthesis, 77, 573 (1980). Etter en halogenmetallutbytning ved å bruke n-butyllitium eller magnesiummetall, vil brom-aminene (1-2) gi de tilsvarende litium eller magnesiumreagensene som så kan omsettes ved lav temperatur i nærvær av cesiumklorid, fortrinnsvis (uten cesiumklorid vil også reaksjonen skje) med 6-metoksy-1-tetralon, som enten gir karbinoler (1 -3) eller styrener (1 -4) etter syreopparbeiding. Behandling av enten karbinolene (1-3) eller styrenene (1-4) med et bromineringsmiddel, f.eks. pyridiniumbromid-perbromid, gir bromstyrener (1-5). Aryl eller heteroarylsink-klorider eller aryl eller heteroarylbrosyrer reagerer med bromider (1-5) i nærvær av en palladiummetallkatalysator som f.eks. tetrakistrifenylfosfin-palladium(O), noe som gir diarylstyrener (1-6). (Pure & Applied Chem. 63,419 (1991) og Bull. Chem. Soc. Jpn. 61, 3008-3010, (1988)). For å fremstille de foretrukne forbindelser, blir substituerte fenylsinkklorider eller substituerte fenylborsyrer brukt i denne reaksjonen. Arylsinkkloridene kan fremstilles ved å nøytralisere den tilsvarende litiumreagensen med vannfritt sinkklorid. Arylborsyrene som ikke er kommersielt tilgjengelige, kan fremstilles ved å nøytralisere den tilsvarende aryl-litiumreagensen med et trialkylborat, fortrinnsvis trimetyl eller triisopropylboratet, fulgt av en vandig syreopparbeiding. Acta Chemica Sean. 47,221-230 (1993). Litiumreagensene som ikke er kommersielt tilgjengelige, kan fremstilles ved en halogenmetallutbytning av det tilsvarende bromid eller halogenid med n-butyl eller t-butyllitium. Alternativt kan litiumreagensen fremstilles ved en heteroatomlettet litiumbehandling som beskrevet i Organic Reactions, vol. 27, kap. 1. Katalytisk hydrogenering av 1-6 i nærvær av palladiumhydroksid på trekull, vil f.eks. gi de tilsvarende dihydrometoksymellomprodukter, som deretter kan demetyleres ved å bruke bortribromid ved 0°C i metylenklorid eller 48% hydrogenbromid i eddiksyre ved 80-100°C, noe som gir de forønskede strukturer (1-7). Disse forbindelsene er racemiske og kan oppløses i sine enantiomerer ved hjelp av høytrykksvæske-kromatografi ved å bruke en kolonne med en kiral stasjonær fase, f.eks. Chiracel OD-kolonne. Alternativt kan optisk oppløsning utføres ved en omkrystallisring av de diastereomere saltene fremstilt med optisk rene syrer som f.eks. 1,1'-binaftyl-2,2'-diylhydrogenfosfat.

CJs-forbindelsene (1-7) kan isomeriseres til trans-forbindelsene ved behandling med base.

Når D og/eller E er nitrogen, kan mellomproduktene med formel II og forbindelser med formel I fremstilles fra de tilsvarende dihalogenpyridinene eller pyrimidinene som vist i reaksjonsskjema 1.

Metyleteren av forbindelsen med formel I hvor e er 1, A er Cl-fe, Z<1> er OCH2CH2, G er pyrrolidin, D, E, B er CH og Y er Ph, kan hensiktsmessig fremstilles ved et første hydrogeneringstrinn av nafoksidin (Upjohn & Co., 700 Portage Road, Kaiamazoo, Ml 49001) i et reaksjonsinert løsemiddel i nærvær av en edelmetallkatalysator. Trykk og temperatur er ikke kritiske, og reaksjonen kan hensiktsmessig utføres i etanol ved romtemperatur og et hydrogentrykk fra ca. 1,4 til 3,5 kg/cm<2>.

Det annet trinn er spalting av metoksygruppen som hensiktsmessig kan utføres ved romtemperatur ved hjelp av en sur katalysator, f.eks. bortribromid i et reaksjonsinert løsemiddel, eller ved 80-100<*>0 med hydrogenbromid i eddiksyre. Produktet kan så isoleres ved hjelp av vanlig kjente fremgangsmåter og omdannes til et syresalt hvis dette er ønskelig.

Forbindelser med formel I hvor B er nitrogen, kan fremstilles ved hjelp av de fremgangsmåter som er vist i skjema 2 og 3.

Syntesen av forbindelser med formel I hvor B er N, er vist i skjema 2. Aryl-syrekloridene (2-1) vil ved behandling med primære aminer, gi arylsekundære amider (2-2), som så kan reduseres med litiumaluminiumhydrid i eterholdige løsemidler, noe som gir de sekundære aminene (2-3). En etterfølgende acylering av (2-3) med aroylsyreklorider, fører til tertiære amider (2-4), som så kan cykliseres i varm fosforoksyklorid, noe som gir dihydroisokinoliniumsalter (2-5). Reduksjon med natriumborhydrid til alkoksytetrahydroisokinoliner, fulgt av en bor-tribromiddemetylering i metylenklorid, gir de forønskede forbindelser.

Syntesen av forbindelsene med formel I hvor B er N, kan også utføres som beskrevet nedenfor i skjema 3. Sekundære aminer (3-1) vil ved en acylering med benzyloksyaroylklorider (3-2), gi tertiære amider (3-3) som ved cyklisering med varm fosforoksyklorid, gir dihydroisokinolinsalter (3-4). Natriumborhydrid-reduksjon av (3-4), fulgt av en debenzylering med vandig saltsyre, gir isokinoliner

(3-5), som så kan alkyleres med passende funksjonaliserte klorider og deretter demetyleres med bortribromid, noe som gir de forønskede forbindelsene.

Andre østrogenagonist/antagonister er beskrevet i U.S. patent 4.133.814. U.S.patent 4.133.814 beskriver derivater av 2-fenyl-3-aroylbenztiofen og 2-fenyl-3-aroylbenzotiofen-1 -oksid.

Lednicer, et al., J. Med. Chem.. 12,881 (1969) beskriver østrogenanta-gonister med følgende struktur: hvor R<2> er fenyl eller cyklopentyl, og R<3> er H,

eller -CH2CHOHCH2OH.

U.S. patent nr. 3.234.090 beskrivelser østrogenagonist/antagonister med følgende formel

hvor Ph er et 1,2-fenylenradikal, Ar er en monocyklisk karbocyklisk arylgruppe substituert med tertiær amino-lavere alkyloksy, hvor den tertiære aminogruppen er skilt fra oksygruppen med minst to karbonatomer, R er hydrogen, et alifatisk radikal, et karbocyklisk arylradikal, et karbocyklisk aryl-alifatisk radikal, et heterocyklisk arylradikal eller et heterocyklisk aryl-alifatisk radikal, og hvor gruppen med formel -(Cn-H2n.2)-, står for et ugrenet alkylenradikal med fra tre til fem karbonatomer og som bærer gruppene Ar og R, salter, N-oksider, salter av N-oksider

eller kvatemære ammoniumforbindelser av disse, så vel som en fremgangsmåte for fremstilling av slike forbindelser.

U.S. patent nr. 3.277.106 beskriver basiske etere med østrogenagonist/- antagonisteffekter og som har følgende formel

hvor Ph er et 1,2-fenylenradikal, Ar er et monocyklisk arylradikal substituert med minst én amino-lavere alkyloksygruppe hvor nitrogenatomet er skilt fra oksygen-atomet med minst to karbonatomer, R er et arylradikal, og delen -(Cn-H2n-2)- står for en lavere alkylengruppe som sammen med Ph danner en 6 eller 7-leddet ring, og hvor to av ringkarbonatomene bærer gruppene Ar og R, salter, N-oksider, salter av N-oksider og kvaternære ammoniumforbindelser av slike forbindelser. U.S. patent nr. 3.274.213 beskriver østrogenagonist/antagonistforbindelser med følgende formel

hvor Ri og R2 er valgt fra gruppen betående av lavere alkyl og lavere alkyl bundet sammen slik at de danner et 5 til 7-leddet mettet heterocyklisk radikal.

Den andre forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, er en forbindelse som er beskrevet nedenfor og som øker benmassen til et nivå som ligger over terskelnivå for benbrudd (som detaljert beskrevet i the World Health Organization Study World Health Organization, "Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Rapport fra WHO-studiegruppe, Verdens helseorganisasjon teknisk serie 843").

De følgende avsnitt beskriver eksempler på de nevnte andre forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse mer detaljert.

Begrepet prostaglandin refererer seg til forbindelser som er analoger til de naturlige prostaglandinene PGDi, PGD2, PGE2, PGEi og PGF2asom kan brukes for behandlingen av osteoporose. Disse forbindelsene binder seg til prostaglandinreseptorene. En slik binding kan lett bestemmes av fagfolk ved hjelp av standardprøver (se f.eks. An S. et al., Cloning and Expression of the EP2 Subtype of Human Receptors for Prostaglandin E2, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993,197(1 ):263-270).

Prostaglandiner er alicykliské forbindelser som er nærstående til den basiske forbindelsen prostansyre. Karbonatomene i det basiske prostaglandinet er tellet etter hverandre fra det karboksyliske karbonatomet gjennom cyklopentyl-ringen til det terminale karbonatomet i den tilstøtende sidekjeden. Normalt vil de tilstøtende sidekjedene være i trans-orienteringén. Nærværet av en oksogruppe ved C-9 i cyklopentylgruppen, er indikativ på et prostaglandin innenfor E-klassen, mens PGE2 inneholder en trans-umettet dobbeltbinding ved Ci3-C14 og en cis-dobbelbinding ved C5-C6-stillingen.

En rekke forskjellige prostaglandiner er beskrevet og referert nedenfor, men det er også andre kjente prostaglandiner i litteraturen. Eksempler på prostaglandiner er blant annet beskrevet i U.S. patent nr. 4.171.331 og 3.927.197.

Norrdin et al., The Role of Prostaalandins in Bone In Vivo. Prostaglandins Leukotriene Essential Farty Acids 41,139-150,1990, gir en oversikt over ben-aktive prostaglandiner.

Begrepet prostaglandinagonist/antagonist refererer seg til forbindelser som binder seg til prostaglandinreseptorer (f.eks. An S. et al., Cloning and Expression of the EP2 Subtype of Human Receptors for Prostaglandin E2, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993,197(1):263-270) og etterligner virkningen av prostaglandin in vivp (dvs. stimulerer bendannelse og økning av benmassen). Slike virkninger kan lett bestemmes av fagfolk ved hjelp av standardprøver (se den anaboliske stoffprotokollen som beskrevet i det etterfølgende, og Eriksen E.F. et al., Bone Histomorphometry, Raven Press, New York, 1994, s. 1 -74; Grier S.J. et al., The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry In Animals, Inv. Radiol., 1996, 31(1):50-62; Wahner H.W. og Fogelman I., The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice., Martin Dunitz Ltd., London 1994, side 1-296). En rekke av disse forbindelsene er beskrevet og referert nedenfor, men det er også kjent andre prostaglandinagonister/antagonister blant fagfolk og i litteratur-en. Eksempler på prostaglandinagonister/antagonister er beskrevet som følger.

U.S. patent 3.932.389 beskriver 2-deskarboksy-2-(tetrazol-5-yl)-11 - desoksy-15-substrtuerte-omega-pentanorprostaglandiner som kan brukes for bendannelsesaktivitet.

U.S. patent 4.018.892 beskriver 16-aryl-13,14-dihydro-PGE2 p-bifenylestere som kan brukes for ben-dannelsesaktivitet.

U.S. patent 4.219.483 beskriver 2,3,6-substituerte-4-pyroner som kan brukes for bendannelsesaktivitet.

U.S. patent 4.132.847 beskriver 2,3,6-substituerte-4-pyroner som kan brukes for bendannelsesaktivitet.

U.S. patent 4.000.309 beskriver 16-aryl-13,14-dihydro-PGE2 p-bifenylestere som kan brukes for ben-dannelsesaktivitet.

U.S. patent 3.982.016 beskriver 16-aryi-13,14-dihydro-PGE2 p-bifenylestere som kan brukes for ben-dannelsesaktivitet.

U.S. patent 4.621.100 beskriver substituerte cyklopentaner som kan brukes for bendannelsesaktivitet.

U.S. patent 5.216.183 beskriver cyklopentanoner som kan brukes for bendannelsesaktivitet.

Generelt kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, fremstilles ved fremgangsmåter som innbefatter fremgangsmåter som er kjent innen den organiske kjemi, spesielt på bakgrunn av de her foreliggende beskrivelser.

Enkelte av de fremstillingsmetoder som brukes for fremstilling av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan kreve en beskyttelse eller fjern funksjonalitet (f.eks. primært amin, sekundært amin, karboksyl). Behovet for slik beskyttelse vil være avhengig av typen av den fjerne funksjonaliteten og de betingelser som brukes under syntesene. Et eventuelt behov for en slik beskyttelse kan tett bestemmes av fagkjemikere. Bruken av slike beskyttelses/avbeskytt-elsesmetoder er også velkjente. For en generell beskrivelse av beskyttende grupper og dere anvendelse, se T.W. Greene, Protective Groups in Oraanic Svnthesis. John Wiley & Sons, New York, 1991. Utgangsforbindelsene og reagensene for forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, er også lett tilgjengelige eller kan lett syntetiseres ved hjelp av kjente fremgangsmåter innen den organiske kjemi. Mange av de forbindelser som f.eks. brukes her, er beslektet med eller er avledet fra forbindelser som finnes i naturen, og for hvilke det er en stor vitenskapelig interesse og kommersielt behov, og følgelig vil mange slike forbindelser være kommersielt tilgjengelige eller er beskrevet i litteraturen, eller kan lett fremstilles fra andre vanlige tilgjengelige stoffer ved hjelp av fremgangsmåter som er beskrevet i litteraturen. Slike forbindelser innbefatter f.eks. prostaglandiner.

Enkelte av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, har asymmetriske karbonatomer og kan derfor eksistere som enantiomerer eller diastereomerer. Diastereomere blandinger kan skilles i sine individuelle diastereomere former på basis av sine forskjellige fysiske eller kjemiske forskjeller ved hjelp av fremgangsmåter som i seg selv er kjente, f.eks. ved kromatografi og/eller fraksjonert ut-krystallisering. Enantiomerer kan skilles ved å omdanne den enantiomere blandingen til en diastereomer blanding ved en reaksjon med en passende optisk aktiv forbindelse (f.eks. alkohol), skille de diastereomere formene og omdanne disse (f.eks. ved hydrolyse) til de individuelle diastereomere former til de tilsvarende rene enantiomerene. Alle slike isomerer og her inngår diastereomerer, enantiomerer og blandinger av disse, anses å inngå som en del av oppfinnelsen.

Skjønt mange forbindelser ifølge oppfinnelsen ikke lar seg ionisere under fysiologiske tilstander, så kan enkelte forbindelser ifølge oppfinnelsen la seg ionisere under fysiologiske betingelser. Således er enkelte av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse av sur karakter, og de kan danne salter med farmasøytisk akseptable kationer. Alle slike salter inngår i foreliggende oppfinnelse og kan fremstilles på vanlig kjent måte. F.eks. kan de fremstilles enkelt ved man kontakter de sure og basiske forbindelsene, vanligvis i støkiometriske forhold, enten i et vandig, ikke-vandig eller delvis vandig medium, etter behov. Saltene kan innvinnes enten ved filtrering, ved utfelling med et ikke-løsemiddel, fulgt av filtrering, ved fordampning av løsemiddelet eller i forbindelse med vandige løsninger, ved frysetørking, etter behov.

I tillegg er enkelte av forbindelsene ifølge oppfinnelsen basiske, og de danner således salter med et farmasøytisk akseptabelt anion. Alle slike salter ligger innenfor oppfinnelsen og kan fremstilles ved hjelp av kjente fremgangsmåter. De kan f.eks. fremstilles ved at man ganske enkelt kontakter den sure og den basiske forbindelsen, vanligvis i et sto kio met risk forhold, enten i et vandig, ikke-vandig eller delvis vandig medium, etter behov. Saltene kan innvinnes enten ved filtrering, ved utfelling med et ikke-løsemiddel, fulgt av filtrering, ved fordampning av løsemiddelet eller i forbindelse med vandige løsninger, ved fryse-tørking, alt etter behov.

I tillegg, når forbindelsene ifølge oppfinnelsen danner hydrater og solvater, så ligger også disse innenfor oppfinnelsen.

De farmasøytiske kombinasjoner og anvendelser ifølge foreliggende oppfinnelse er alle tilpasset til terapeutisk anvendelse som midler som enten aktiverer benomsetningen eller hindrer benresorpsjon eller øker bendannelsen hos pattedyr, da spesielt mennesker. Etter som disse funksjoner er nært knyttet til utviklingen av osteoporose og benrelaterte sykdommer, så vil disse kombinasjoner ved hjelp av deres virkning på ben, kunne hindre, stoppe eller reversere osteo-porose.

Anvendelsen av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse ved fremstilling av medikamenter for behandling av tilstander som er karakterisert ved hjelp av benmasse (f.eks. osteoporose) hos pattedyr (f.eks. mennesker, da spesielt kvinner), er påvist ved aktiviteten for forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse i vanlig kjente prøver og de in vitro og in vivo-prøver som er beskrevet nedenfor (KOMBINASJON OG SEKVENSMESSIG BEHANDLINGSPROTOKOLL; ØSTROGENAGONIST/ANTAGONISTPROTOKOLL; ANABOL STOFF-PROTOKOLL; IN VITRO ØSTROGENRESEPTORBINDINGSPRØVE; OG VEKSTHORMON/VEKSTHORMONSTIMULERENDE MIDDELPROTOKOLL). Slike prøver tilveiebringer også muligheter for å kunne sammenligne aktiviteten for de foreliggende forbindelser og aktiviteten for andre kjente forbindelser. Resultatene av disse sammenligningene er brukbare for å kunne bestemme doseringsnivået i pattedyr, da spesielt mennesker, for behandling av de ovennevnte sykdommer.

KOMBINASJON OG SEKVENSMESSIG BEHANDLINGSPROTOKOLL

De følgende protokoller kan selvsalgt varieres av fagfolk. F.eks. kan man bruke både hannlige eller hunnlige roter, hannlige rotter med underskudd.på sekshormon (orkidektomi) eller hunnrotter (ovariektomi). I tillegg til dette, kan man bruke hann- og hunnrotter med forskjellig alder (f.eks. opp til 12 måneders alder) i disse undersøkelsene. Rottene kan enten være fertile eller kastrerte (hvor livmoren eller testiklene er fjernet, henholdsvis) og kan tilføres anabole stoffer som prostaglandin E2 (PEG2) i forskjellige doser (f.eks. 1,3 eller 6 mg/kg/døgn) i en viss periode (f.eks. 2 uker til 2 måneder), fulgt av en tilførsel av et anti-resorptivt middel som droloksifen, i forskjellige doser (1,5,10 mg/kg/dag) i en viss periode (f.eks. fra 2 uker til 2 måneder) eller en kombinasjonsbehandling med et anabolt middel og et anti-resorptivt middel i forskjellige doser i forskjellige tidsrom (f.eks. 2 uker til 2 måneder). I kastrerte rotter, kan behandlingen starte dagen etter det kirurgiske inngrep (for det formål å hindre bentap), eller på det tidspunkt da bentapet allerede har forekommet (for det formål å gjenskape benmassen).

De følgende protokoller er beskrevet ved anvendelse av PGE2 som det benanabole middel og droloksifen som det antiresorptive middel, men man kan også i denne protokollen undersøke andre anabole stoffer og midler og anti-resorptive midler.

104 hunnlige Spraque-Dawley rotter (Charles River, Wilmington, MA) med en alder på 12 måneder, ble enten operert uten videre inngrep eller fikk livmoren fjernet (OVX) ved måned 0. 3 måneder etter det kirurgiske inngrepet, fikk OVX-rottene enten prostaglandin E2 (PGE2), et kjent anabolsk benmiddel, i en dose på 3 mg/kg/dag (subkutanøs injeksjon), eller PGE2 i en dose på 3 mg/kg/dag (subkutanøs injeksjon), kombinert med droloksifen (DRO) i en dose på 10 mg/kg/- dag (oralt) i 2 måneder. Deretter ble PGE2-behandlingen avsluttet, og rottene ble enten behandlet med væske (10% alkohol i saltløsning) eller DRO (10 mg/kg/dag, oralt) i ytterligere 1,5 måneder som beskrevet i det følgende.

Gruppe I: 8 rotter ble obdusert ved begynnelsen av måned 0 som basal-kontroller.

Gruppe II: 8 jukseopererte rotter ble obdusert i slutten av måned 3 som for-behandlingskontroller.

Gruppe III: 8 jukseopererte rotter ble oralt behandlet med væske (10% etanol i saltløsning) fra måned 3 til 5, og deretter obdusert.

Gruppe IV: 8 jukseopererte rotter ble oralt behandlet med væske (10% etanol i saltløsning) fra måned 3 til 6,5, og deretter obdusert.

Gruppe V: 8 OVX-rotter ble obdusert ved måned 3 som forbehandlings-kontroller.

Gruppe VI: 8 OVX-rotter ble oralt behandlet med væske (10% etanol i saltløsning) fra måned 3 til 5, og så obdusert.

Gruppe VII: 8 OVX-rotter ble oralt behandlet med væske (10% etanol i saltløsning) fra måned 3 til 6,5, og så obdusert.

Gruppe VIII: 8 OVX-rotter ble subkutanøst injisert med 3 mg/kg/dag av PGE2 fra måned 3 til 5, og så obdusert.

Gruppe IX: 8 OVX-rotter ble subkutanøst injisert med 3 mg/kg/dag av PGE2 fra måned 3 til 5, og med væske fra måned 5 til 6,5, og så obdusert.

Gruppe X: 8 OVX-rotter ble subkutanøst injisert med 3 mg/kg/dag av PGE2 fra måned 3 til 5, og 10 mg/kg/dag av DRO oralt fra måned 5 til 6,5, og så obdusert.

Gruppe XI: 8 OVX-rotter ble subkutanøst injisert med 3 mg/kg/dag av PGE2 og 10 mg/kg/dag av DRO oralt fra måned 3 til 5, og så obdusert.

Gruppe XII: 8 OVX-rotter ble subkutanøst injisert med 3 mg/kg/dag av PGE2 og 10 mg/kg/dag av DRO oralt fra måned 3 til 5 og med væske fra måned 5 til 6,5, og deretter obdusert.

Gruppe XIII: 8 OVX-rotter ble subkutanøst injisert med 3 mg/kg/dag av PGE2 og 10 mg/kg/dag av DRO oralt fra måned 3 til 5, og så med DRO alene fra måned 5 til 6,5, og deretter obdusert.

Både PGE2 (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, Ml) og droloksifen (Pfizer Inc. Groton, CT) pulver ble først løst i 100% etanol og ytterligere fortynnet med saltløsning til de forønskede konsentrasjoner (sluttetanolkonsentrasjon var 10%). PGE-løsning ble daglig injisert subkutanøst på ryggen i en dose på 1 ml/kg. Droloksifenløsning blir gitt daglig p.o. i en mengde på 1 ml/rotte. Atle rotter ble gitt subkutanøse injeksjoner med 10 mg/kg kalcein (fluorkrombenmarkør, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) 12 og 2 dager før obduksjon for å undersøke dynamiske forandringer i benvevet.

Rottene ble drept ved hjelp av ketaminbedøvelsesmiddel. De følgende sluttpunkter ble bestemt: Lårbenmineralmålinaer: Det høyre lårbenet fra hver rotte ble fjernet ved autopsi og scannet ved hjelp av dobbeltenergi røntgenabsorptiometri (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) utstyrt med en "Regional High Resolution Sean" software (Hologic Inc., Waltham, MA). Scanningområdéts størrelse var 5,08 x 1,902 cm, oppløsning var 0,0254 x 0,0127 cm, og scanninghastigheten var 7,25 mm/sekund. Bildene av scanningen av lårbenet ble så analysert, og ben-areal, benmineralinnhold (BMC) og benmineraltetthet (BMD) av hele lårbenet (WF), distal lårmetafyse (DFM), lårhalsen (FS) og proksimalt lårben (PF) ble bestemt. Benmineralmålinaer i de lumbale rvaavirvler: Dobbeltenergi røntgenabsorptio-metri (QDR 1000/W, Hologic, Inc., Waltham, MA) utstyrt med en "Regional High Resolution Sean" software (Hologic Inc., Waltham, MA) ble brukt for å bestemme benareal, benmineralinhold (BMC) og benmineraltetthet (BMD) i hele den lumbale ryggraden og hver av de seks lumbale ryggvirvlene (LV1 - 6) i de bedøvede rottene. Rottene ble bedøvet ved injeksjon (i.p.) av 1 ml/kg av en blanding av ketamin/rompun (forhold 4 til 3), og så plassert på rotteplattformen. Scanningfeltets størrelse var 6 x 1,9 cm, oppløsningen var 0,0254 x 0,0127 cm og scanninghastigheten var 7,25 mm/sekund. Scanningbildet av hele lenderyggraden ble oppnådd og analysert. Benareal (BA) og benmineralinnhold (BMC) ble bestemt, og benmineraltettheten ble beregnet (MBC delt med BA) for hele den lumbale ryggraden og hver av de seks lumbale ryggvirvlene (LV1 - 6).

Proksimal skinnebenmetafvseal kanselløs benhistomofrometrisk analvse: Det høyre skinnebenet ble fjernet ved obduksjon, renset for muskler og skåret i tre deler. Det proksimale skinnebenet ble fiksert i 70% etanol, dehydrert i økende konsentrasjoner av etanol, så avfettet i aceton, deretter innleiret i metylmetakrylat (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY). Det ble så skåret frontsnitt av den proksimale skinnebenmetafysen i tykkelser på 4 og 10 um, ved å bruke en Reichert-Jung Polycut S mikrotom. Et 4 um og et 10 jim snitt fra hver rotte ble brukt for den kanselløse benhistomorfometrien. Snittene med tykkelse på 4 urn ble farget med modifisert Massor<V>s trikromfarging, mens snittene på 10 um ikke ble farget.

Et Bioquant OS/2 histomorfometrisystem (R & M biometrics, Inc., Nashville, TN) ble brukt for statistiske og dynamiske histomorfometriske målinger av den sekundære spongiosa i den proksimale skinnebensmetafysen mellom 1,2 og 3,6 mm distalt mellom vekstplaten og den epifyseale forbindelse. De første 1,2 mm av det skinnebensmetafyseale området må forkastes for å kunne begrense målingene til den sekundære spongiosa. Snittene på 4 u.m ble brukt for å bestemme indekser i forhold til benvolum, benstruktur og benresorpsjon, mens snittene på 10 um ble brukt for å bestemme indekser i forbindelse med bendannelse og benomsetning.

I. Målinger oa beregninger i forhold til trabekulært benvolum oa struktur:

1. Totalt metafysialt område (TV, mm<2>): metafysealt område mellom I. 2 og 3,6 mm distalt mellom vekstplaten og den epifyseale forbindelse. 2. Trabekulært benareal (BV, mm<2>): totalt areal av trabekula innen TV. 3. Trabekulært benperimeter (BS, mm): lengden av det totale perimeter av trabekula.

4. Trabekulært benvolum (BV/TV, %): BV/TVxIOO.

5. Trabekulært bentall (TBN, #/mm): 1,199/2 x BS/TV.

6. Trabekulær bentykkelse (TBT, um): (2000/1,199) x (BV/BS).

7. Trabekulær benseparasjon (TBS, um): (2000 x 1,199) x (TV - BV).

II. Målinger oa beregninger i forhold til benresorosion:

1. Osteoklasttall (OCN, #): totalt antall osteoklaster innenfor det totale metafyseale området. 2. Osteoklastperimeter (OCP, mm): lengde av det trabekulære perimeter som er dekket av osteoklast.

3. Osteoklasttall/mm (OCN/mm, #/mm): OCN/BS.

4. Prosent osteoklastperimeter (% OCP, %): OCP/BS x 100.

III. Målinger oa beregninger i forhold til bendannelse oo benomsetning:

1. Enkelt kalseinmerket perimeter (SLS, mm): total lengde av trabekulær perimeter merket med én kalseinmarkør. 2. Dobbelkalseinmerket perimeter (DLS, mm): total lengde av trabekulær perimeter merket med to kalseinmarkører. 3. Intermerket bredde (ILW, um): midlere distanse mellom to kalsein-markører. 4. Prosent mine raliseringspe rimete r (PMS, %): (SLS/2 + DLS)/BS x 100. 5. Miheralapposisjonshastighet (MAR, um/dag): ILW/markørintervall. 6. Bendannelseshastighet/overflateref. (BFR/BS, um2/d/um): (SLS/2 +

DLS) x MAR/BS.

7. Benomsetningshastighet (BRT, %/y): (SLS/2 + DLS) x MAR/BV x 100.

Statistikk

Statistiske verdier kan beregnes ved hjelp av StatView 4,0 pakker (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Analysen av varians (ANOVA) prøven, fulgt av Fisher^ PLSD kan brukes for å sammenligne forskjellene mellom gruppene.

ØSTROGENAGON1ST/ ANTAGONISTPROTOKOLL

Østrogenagonist/antagonister er en gruppe forbindelser som hemmer benomsetning og hindrer østrogenunderskuddsindusert bentap. Bentapmodellen med rotter hvor livmoren er fjernet, har vært meget anvendt som en modell på det bentap som oppstår etter menopausen. Ved å bruke denne modellen, kan en undersøke effekten av østrogenagonist/antagonistforbindelser for å hindre bentap og hemme benresorpsjon.

Sprague-Dawley hunnrotter (Charles River, Wilmington, MA) i forskjellig alder (f.eks. 5 måneders alder) ble brukt i disse undersøkelsene. Rottene ble oppbevart i enkle bur på 20 x 32 x 20 cm under eksperimentperioden. Alle rottene hadde fri adgang til vann og en pelletert kommersiell diett (Agway ProLab 3000, Agway County Food, Inc., Syracause, NY) som inneholdt 97% kalsium, 0,85% fosfor og 1,05 IU/g av vitamin D3.

En gruppe rotter (8 til 10) ble jukseoperert og behandlet p.o. med væske (10% etanol og 90% saltløsning, 1 ml/dag), mens de gjenværende rottene fikk fjernet livmoren på begge sider (OVX) og behandlet enten med væske (p.o.), 17(3-estradiol (Sigma, E-8876, E2, 30 ug/kg, daglig subkutanøs injeksjon), eller en østrogenagonist/antagonister (såsom droloksifen i en dose på 5,10 etler 20 mg/kg, daglig p.o.) i en viss periode (såsom 4 uker). Alle rotter ble gitt subkutanøse injeksjoner på 10 mg/kg kalsein (fluorkrombenmarkør) 12 og 2 dager før de bli obdusert for å undersøke dynamiske forandringer i benvevet. Etter 4 ukers behandling, ble rottene obdusert. De følgende sluttpunkter ble bestemt: Kro<pp>svekttilvekst: Kroppsvekten ved obduksjon minus kroppsvekten ved det kirurgiske inngrep.

•r»

Livmorvekt oa histologi: Livmoren ble fjernet fra hver rotte ved obduksjon og veiet umiddelbart. Deretter ble livmoren bearbeidet for histologiske målinger såsom livmorens tverrsnittsvevareal, stromal tykkelse og tykkelse på det luminale epitel.

Totalt serumkolesterol: Blod ble tatt ut ved hjertepunktering og ble hensatt for koagulering ved 4°C og så sentrifugert ved 2000 g i 10 minutter. Serumprøver bie analysert for totalt serumkolesterol ved å bruke en høykvalitets kolesterolkalori-metrisk prøve (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN).

Benmineralmålinaer i lårbenet: Det høyre lårbenet fra hver rotte ble fjernet ved obduksjonen og scannet ved å bruke dobbeltenergi røntgenabsorptiometri (DEXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) utstyrt med en "Regional High Resolution Sean" software (Hologic Inc., Waltham, MA). Størrelsen på scanning-feltet var .5,08 x 1,902 cm, oppløsningen var 0,0254 x 0,0127 cm og scanninghastigheten var 7,25 mm/sekund. Bildene av lårbenet ble analysert, og benareal, benmineralinnhold (BMC) og benmineraltetthet (BMD) for hele lårbenet (WF), de distalé lårmetafysene (DFM), lårhalsen (FS) og den proksimale femora (PF) ble målt.

Proksimal skinnebenmetafvseal kanselløs benhistomorfometriske analyser: Det høyre skinnebenet bie fjernet ved obduksjon, renset for muskler og skåret i tre deler. Det proksimale skinnebenet bie fiksert i 70% etanol, dehydrert med økende konsentrasjoner av etanol, avrettet i aceton, og så innleiret i metyl-metakrylat (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY). Det ble snittet front-snitt av de proksimale skinnebenmetafyser med en tykkelse på 4 og 10 um, ved hjelp av en Reichert-Jung Polycut S mikrotom. Et snitt på 4 um og et på 10 um fra hver rotte ble brukt for den kanselløse benhistomorfometrien. Snittene med tykkelse på 4 um ble farget med modifisert Masson's trikromfarge, mens snittene på 10 um ikke ble farget.

Et Bioquant OS/2 histomorfometrisystem (R & M biometrics, Inc., Nashville, TN) ble brukt for statistiske og dynamiske histomorfometriske målinger av den sekundære spongiosa i de proksimale skinnebensmetafyser mellom 1,2 og 3,6 mm distalt fra vekstptaten - den epifyseale forbindelse. De første 1,2 mm av skinnebenets metafyseale område ble utelatt for å begrense målingene til den sekundære spongiosa. Snittene på 4 um ble brukt for å bestemme indekser i forhold til benvolum, benstruktur og ben resorpsjon, mens snittene på 10 um ble brukt for å bestemme indekser i forhold til bendannelse og benomsetning.

I. Målin<g>er oa bere<g>nin<g>er i forhold til trabekulært benvolum oa struktur:

1. Totalt metafysialt område (TV, mm<2>): metafysealt område mellom I, 2 og 3,6 mm distalt mellom vekstplaten og den epifyseale forbindelse. 2. Trabekulært benareal (BV, mm<2>): totalt areal av trabekula innen TV. 3. Trabekulært benperimeter (BS, mm): lengden av det totale perimeter av trabekula.

4. Trabekulært benvolum (BV/TV, %): BV/TVx100.

5. Trabekulært bentall (TBN, #/mm): 1,199/2 x BS/TV.

6. Trabekulær bentykkelse (TBT, um): (2000/1,199) x (BV/BS).

7. Trabekulær benseparasjon (TBS, um): (2000 x 1,199) x (TV - BV).

II. Målinger oa beregninger i forhold til benresorosion:

3. Osteoklasttall/mm (OCN/mm, #/mm): OCN/BS.

4. Prosent osteoklastperimeter (% OCP, %): OCP/BS x 100.

Hl. Målinger oa beregninger i forhold til bendannelse oa benomsetning:

1. Enkelt kalseinmerket perimeter (SLS, mm): total lengde av trabekulær perimeter merket med én kalseinmarkør. 2. Dobbelkalseinmerket perimeter (DLS, mm): total lengde av trabekulær perimeter merket med to kalseinmarkører. 3. Intermerket bredde (ILW, um): midlere distanse mellom to kalsein-markører. 4. Prosent mineraliseringsperimeter (PMS, %): (SLS/2 + DLSVBS x 100. 5. Mineralapposisjonshastighet (MAR, jxm/dag): ILW/markørintervall. 6. Bendannelseshastighet/overflateref. (BFR/BS, um<2>/d/^m): (SLS/2 +

DLS) x MAR/BS.

7. Benomsetningshastighet (BRT, %/y): (SLS/2 + DLS) x MAR/BV x 100.

Statistikk

Statistiske verdier kan beregnes ved hjelp av StatView 4,0 pakker (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Analysen av varians (ANOVA) prøven, fulgt av Fisher<*>s PLSD kan brukes for å sammenligne forskjellene mellom gruppene.

ANABOL MIDDELKONTROLL

Aktiviteten av anabole benmidler for å stimulere bendannelse og øke benmassen, kan undersøkes i fertile hannlige eller hunnlige rotter, hannlige rotter med underskudd på kjønnshormon (orkidektomi) eller hunnrotter (ovariektomi).

Hann- og hunnrotter av forskjellig alder (f.eks. 3 måneder gamle) ble brukt i denne undersøkelsen. Rottene var enten fertile eller kastrerte (eggstokkene var fjernet elter testiklene var fjernet), og disse ble subkutanøst injisert eller oralt behandlet med anabole midler såsom prostaglandin E2 (PGE2) i forskjellige doser (f.eks. 1,3 eller 6 mg/kg/dag) i visse tidsrom (f.eks. 2 uker til 2 måneder). I de kastrerte rottene, ble behandlingen startet dagen etter det kirurgiske inngrep (for det formål å hindre bentap) eller på det tidspunkt da bentapet allerede hadde forekommet (for det formål å gjenskape benmassen). Under denne under-søkelsen, hadde alle rottene fri adgang til vann og en pelletert kommersiell diett (Teklad Rodent Diet #8064, Harlan Teklad, Madison, Wl) som inneholdt 1,46% kaslium, 0,99% fosfor og 4,96 IU/g av vitatmin D3. Alle rotter ble gitt en subkutan-øs injeksjon på 10 mg/kg kalsein på dag 12 og 2 før obduksjon.

Alle rottene ble obdusert og de følgende sluttpunkter ble bestemt: Benmineralmålinaer i lårbenet: Det høyre lårbenet fra hver rotte ble fjernet ved obduksjonen og scannet ved å bruke dobbeltenergi røntgenabsorptiometri (DEXA, QDR 10007W, Hologic inc, Waltham, MA) utstyrt med en "Regional High Resolution Sean" software (Hologic Inc., Waltham, MA). Størrelsen på scanning-feltet var 5,08 x 1,902 cm, oppløsning var 0,0254 x 0,0127 cm og scanninghastigheten var 7,25 mm/sekund. Bildene av scanningen av lårbenet ble analysert, og benareal, benmineralinnhold (BMC) og benmineraltetthet (BMD) for hele lårbenet (WF), de distale lårmetafysene (DFM), lårhalsen (FS) og den proksimale femora (PF) ble målt.

Proksimal skinnebenmetafvseal kanselløs benhistomorfometriske analyser: Det høyre skinnebenet ble fjernet ved obduksjon, renset for muskler og skåret i tre deler. Det proksimale skinnebenet ble fiksert i 70% etanol, dehydrert med økende konsentrasjoner av etanol, avrettet i aceton, og sår innleiret i metyl-metakrylat (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY). Det ble snittet front-snitt av de proksimale skinnebenmetafyser med en tykkelse på 4 og 10 fim, ved hjelp av en Reichert-Jung Polycut S mikrotom. Et snitt på 4 um og et 10 um fra hver rotte, ble brukt for den kanselløse benhistomorfometrien. Snittene med tykkelse på 4 um ble farget med modifisert Masson's trikromfarge, mens snittene på 10 um ikke ble farget.

Et Bioquant OS/2 histomorfometrisystem (R & M biometrics, Inc., Nashville, TN) ble brukt for statistiske og dynamiske histomorfometriske målinger av den sekundære spongiosa i de proksimale skinnebensmetafyser mellom 1,2 og 3,6 mm distalt fra vekstplaten - den epifyseale forbindelse. De første 1,2 mm av skinnebenets metafyseale område ble utelatt for å begrense målingene til den sekundære spongiosa. Snittene på 4 um ble brukt for å bestemme indekser i forhold til benvolum, benstruktur og benresorpsjon, mens snittene på 10 um ble brukt for å bestemme indekser i forhold til bendannelse og benomsetning.

I. Målinger oa beregninger i forhold til trabekulært benvolum oa struktur:

1. Totalt metafysialt område (TV, mm<2>): metafysealt område mellom 1,2 og 3,6 mm distalt mellom vekstplaten og den epifyseale forbindelse. 2. Trabekulært benareal (BV, mm<2>): totalt areal av trabekula innen TV. 3. Trabekulært benperimeter (BS, mm): lengden av det totale perimeter av trabekula.

4. Trabekulært benvolum (BV/TV, %): BWTVxIOO.

5. Trabekulært bentall (TBN, #/mm): 1,199/2 x BS/TV.

6. Trabekulær bentykkelse (TBT, um): (2000/1,199) x (BV/BS). 7. Trabekulær benseparasjon (TBS, um): (2000 x 1,199) x (TV - BV).

II. Målinger oa beregninger i forhold til benresorosion:

3. Osteoklasttall/mm (OCN/mm, #/mm): OCN/BS.

4. Prosent osteoklastperimeter (% OCP, %): OCP/BSx100.

III. Målinger oo beregninger i forhold til bendannelse oa benomsetning:

1. Enkelt kalseinmerket perimeter (SLS, mm): total lengde av trabekulær perimeter merket med én kalseinmarkør. 2. Dobbelkalseinmerket perimeter (DLS, mm): total lengde av trabekulær perimeter merket med to kalseinmarkører. 3. Intermerket bredde (ILW, fim): midlere distanse mellom to kalsein-markører. 4. Prosent mineraliseringsperimeter (PMS, %): (SLS/2 + DLS)/BS x 100. 5. Mineralapposisjonshastighet (MAR, fim/dag): ILW/markørintervall. 6. Bendannelseshastighet/overflateref. (BFR/BS, um<2>/d/um}: (SLS/2 +

DLS) x MAR/BS.

7. Benomsetntngshastighet (BRT, %/y): (SLS/2 + DLS) x MAR/BV x 100.

Statistikk

Statistiske verdier kan beregnes ved hjelp av StatView 4,0 pakker (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Analysen av varians (ANOVA) prøven, fulgt av Fisher's PLSD kan brukes for å sammenligne forskjellene mellom gruppene.

IN VITRO- ØSTROGENRESEPTORBINDINGSPRØVE

En in vitro-østrogenreseptorbindingsprøve som måler evnen til østrogen-agonist/antagonistforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse til å erstatte [3H]-estradiol fra den humane østrogenreseptoren oppnådd ved hjelp av rekombinante metoder i gjær, ble brukt for å bestemme østrogenreseptorbindingsaffiniteten for de foreliggende forbindelser. De forbindelser og stoffer som bie brukt i denne prøven er som følger: (1) prøvebuffer, TD-0,3 (inneholder 10 Nm Tris, pH 7,6, 0,3 M kaliumklorid og 5 mM ditiotreitol ( UTI) (Sigma Co.), pH 7,6); (2) den anvendte radioliganden er [3H]-estradiol fra New England Nuclear; (3) den kalde liganden som ble brukt, er estradiol fra Sigma; (4) rekombinant human østrogenreseptor, hER.

En løsning av den forbindelsen som skulle undersøkes, ble fremstilt i TD-0,3 med 4% DMSO og 16% etanol. Den radioaktive estradiolen ble løst i TD-0,3, slik at sluttkonsentrasjonen i prøven var 5 nM. Nevnte hER ble også fortynnet med TD-0,3, slik at i hver prøvebrønn var det totalt mellom 4 og 10 ug totalt protein. Ved å bruke mikrotitreringsplater, fikk hvert inkubat 50 uJ kald estradiol (ikke-spesifikk binding) eller løsningen med forbindelsen, 20 ul av den radioaktive estradiolen og 30 uJ av hER-løsningene. Hver plate inneholder i tre paralleller total binding og varierende konsentrasjoner av forbindelsen. Platene ble inkubert over natten ved 4°C. Bindingsreaksjonen ble avsluttet ved å tilsette og blande 100 ml 3% hydroksylapatitt i 10 mM Tris, pH 7,6 og foreta inkubering i 15 minutter ved 4°C. Blandingene ble så sentrifugert, og pellet ble vasket fire ganger med 1 % Triton-X100 i 10 mM tris, pH 7,6. Hydroksylapatittpellets ble så suspendert i Ecoscint A, og radioaktiviteten ble bestemt ved å bruke beta-scintigrafi. Middel-verdien for alle de tre parallellene (tellinger pr. minutt, cpn<V>er) ble så bestemt. Spesifikk binding ble beregnet ved å subtrahere ikke-spesifikke cpnVer (definert som tellinger som blir igjen etter å ha utskilt reaksjonsblandingen som inneholdt rekombinant reseptor, radioligand og overskudd av umerket ligand) fra totalt bundet cpm'er (definert som tellinger som ble igjen etter å ha utskilt reaksjonsblandingen inneholdende bare rekombinant reseptor, radioligand). Forbindelsens styrke ble bestemt ved hjelp av IC50-bestemmelser (den konsentrasjon av en forbindelse som er nødvendig for å hemme 50% av den totalt spesifikke bundne radioaktive estradiol). Spesifikk binding i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av forbindelsen, ble bestemt og beregnet som prosent spesifikk binding i forhold til totalt bundet spesifikk radioligand. Data ble avsatt som prosent inhibering av forbindelsen (lineær skala) i forhold til forbindelsens konsentrasjon (log skala).

PROTOKOLL FOR VEKSTHORMON OG

STOFF SOM STIMULERER SEKRESJON AV VEKSTHORMON

Forbindelser som har evnen til å stimulere veksthormonsekresjon fra dyrkede hypofyseceller fra rotter, ble identifisert ved hjelp av den følgende protokoll. Denne prøven kan også brukes for å sammenligne standarder slik at man kan bestemme doseringsnivåer. Cellene ble isolert fra hypofysen hos 6 uker gamle Wistar-rotter. Etter halshugging, ble de fremre hypofyselobene fjernet og plassert i kald, steril Hank's balanserte saltløsning uten kalsium eller magnesium (HBSS). Vevet ble så finmalt, og så underkastet to sykler av mekanisk hjulpet enzymatisk dispergering ved å bruke 10 enheter pr. ml bakteriell protease (EC 3.4.24.4, Sigma P-6141) i HBSS. Vevs-enzymblandingen ble rørt i en rotasjons-kolbe med 30 omdreininger pr. minutt i en 5% C02-atmosfære ved ca. 37°C i ca.

30 minutter, med manuell gnidning etter ca. 15 minutter og ca. 30 minutter, ved å bruke en 10 ml pipette. Blandingen ble så sentrifugert ved 200 x g i ca. 5 minutter. Hesteserum ble tilsatt supernatanten for å nøytralisere overskudd av protease. Pelleten ble resuspendert i frisk protease, rørt i ca. 30 minutter under nevnte tidligere betingelser, og så manulet gnidd og til slutt gjennom en 23-gauge nål. Igjen ble hesteserum tilsatt, og cellene fra begge nedbrytninger ble slått sammen, pelletert (200 x g i ca. 15 minutter), vasket, resuspendert i dyrknings-medium og så tellet. Cellene ble utplatet i en mengde fra 6,0 - 6,5 x 10<4> celler pr. cm<2> i 48-brønns Costar-plater og dyrket i fra 3 til 4 døgn i Dulbecco's modifiserte Eagle-medium (D-MEM), supplert med 4,5 g/liter glukose, 10% hesteserum, 2,5% storfefosterserum, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 100 enheter pr. ml nystatin og 50 mg/ml gentamycinsulfat før prøving for GH-sekresjon.

Like før prøven, ble dyrkningsbrønnene vasket to ganger, så ekvilibrert i ca. 30 minutter i frigjørende medium (D-MEM bufret med 25 mM Hepes, pH 7,4 og inneholdende 0,5% storfeserumalbumin ved 37°C). Prøveforbindelsene ble løst i DMSO og så fortynnet i forvarmet frigjøringsmedium. Alle prøver ble kjørt i fire paralleller. Prøven ble startet ved å tilsette 0,5 ml frigjøringsmedium (med væske eller prøveforbindelse) til hver dyrkningsbrønn. Inkubering ble utført ved ca. 37°C i ca. 15 minutter og så avsluttet ved å fjerne dyrkningsmediet, som så ble sentrifugert ved 2000 x g i ca. 15 minutter for å fjerne cellulært materiale. Konsentrasjoner av rotteveksthormon i supematantene ble bestemt ved en standard protokoll med hensyn til radioimmunoprøver og brukte et rottevekst-hormonreferansepreparat (NIDDK-rGH-RP-2) og et rotteveksthormonantiserum som var produsert i ape (NIDDK-anti-rGH-S-5) fra Dr. A. Parlow (Harbor-UCLA Medical Center, Torrence, CA). Ytterligere rotteveksthormon (1,5 enheter pr. mg, #G2414, Scripps Labs, San Diego, CA) ble jodinert til en spesifikk aktivitet på ca. 30 uCi/u.g ved hjelp av kloramin-T-metoden til bruk som spormarkør. Immunkompleksene ble fremstilt ved å tilsette geite-antiserum til ape IgG (Organon teknika, Durham, NC) pluss polyetylenglykol, molekylvekt 10.000 til 20.000 til en sluttkonsentrasjon på 4,3%, og innvinning ble utført ved sentrifugering. Denne prøven har et arbeidsområde fra 0,08 til 2,5 ug rotteveksthormon pr. rør over basisnivå. Aktive forbindelser vil typisk stimulere veksthormonfrigjøring med mer enn 1,4 ganger. Referanse: Cheng, K., Chan, W.-S., Barreto, Jr., A., Convey, E.M., Smith, R.G. 1989. Prøve for eksoaenstimulert veksthormonfriaiørina i rotter etter intravenøs tilførsel av prøveforbindelser 21 dager gamle hunnlige Sprague-Dawley rotter (Charles River Laboratory, Wilmington, MA) ble akklimatisert til lokale vivariumbetingelser (24°C, 12 timers lys, 12 timers mørkesyklus) i ca. 1 uke før testing med forbindelsene. Alle rottene hadde fri adgang til vann og en pelletert kommersiell diett (Agway Country Food, Syracuse NY) ad libitum.

Den dag eksperimentet skulle utføres, ble prøveforbindelsene løst i væsken inneholdende 1% etanol, 1 mM eddiksyre og 0,1% storfeserumalbumin i salt-løsning. Hver forbindelse ble undersøkt i tre paralleller. Rottene ble veiet og bedøvet via intraperitoneal injeksjon*av natriumpentobarbital (Nembutol, 50 mg/kg kroppsvekt). 14 minutter etter bedøvelsen, ble en blodprøve tatt ut ved å foreta et lite snitt på tuppen av halen og la blodet dryppe inn i et mikrosentrifugeringsrør (basis blodprøve, ca. 100 jxl). 15 minutter etter bedøvelsen var satt, ble prøve-forbindelsen tilført via intravenøs injeksjon i halevenen, med et totalt injeksjons-volum på 1 ml/kg kroppsvekt. Ytterligere blodprøver ble tatt fra halen 5,10 og 15 minutter etter tilførsel av forbindelsen. Blodprøvene ble holdt på is inntil serum-separasjon ble utført ved sentrifugering (1430 x g i 10 minutter ved 10°C). Serum ble lagret ved -80°C, inntil serumveksthormonbestemmelsen ble utført ved den radioimmunologiske prøven som er beskrevet ovenfor og i det etterfølgende.

Bedømmelse av eksoaenstimulert veksthormonfriajørina i hund etter oral tilførsel

På eksperimentdagen ble prøveforbindelsen veiet ut i passende doser og løst i vann. Dosene ble tilført i et volum på 0,5 ml/kg ved hjelp av en sprøyte til 4 hunder for hvert doseringsregime. Blodprøver på 2 ml ble oppsamlet fra lårvenen via en direkte venepunktering som var utført før dosering, og ved 0,08, 0,17, 0,25, 0,5,0,75,1,2,4, 6 og 8 timer etter dosering ved å bruke 2 ml vakumbeholdere inneholdnede litiumheparin. Det fremstilte plasma ble lagret ved -20°C inntil det ble analysert.

Måling av hunnveksthormon

Hunnveksthormonkonsentrasjoner ble bestemt ved en standard radio-immunologisk prøveprotokoll ved å bruke hunnveksthormon (antigen for jodinering og referansefremstilling AFP-1983B) og hunnveksthormonantiserum frembragt i ape (AFP-21452578) fra Dr. A. Parlow (Harbor-UCLA Medical Center, Torrence, CA). Spormarkører ble fremstilt ved en kloramin-T-jodinering av hunnveksthormon til en spesifikk aktivitet på 20 til 40 uCi/ug. Immunkompleksene ble fremstilt ved å tilsette geite-antiserum til ape IgG (Organon Teknika, Durham, NC) pluss polyetylenglykol, molekylvekt 10.000 til 20.000 til en sluttkonsentrasjon på 4,3%, innvinning ble utført ved sentrifugering. Denne prøven hår et arbeidsområde fra 0,08 til 2,5 ug. hunn-GH/rør.

Tilførselen av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan skje ved enhver fremgangsmåte som tilfører en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse systemisk og/eller lokalt. Disse fremgangsmåtene innbefatter orale veier, parenterale, intraduodenale veier, etc. Vanligvis vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen bli tilført oralt, men parenteral tilføreset (f.eks. intravenøs, intramuskulær, subkutanøs eller intramedullar) kan også anvendes, f.eks. når oral tilførsel ikke er passende for et spesifikt mål eller når pasienten er ute av stand til å svelge medikamentet eller preparatet. De to forskjellige forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan tilføres samtidig eller i enhver ønsket rekkefølge, eller et enkelt farmasøytisk preparat inneholdende en første forbindelse som beskrevet ovenfor, og en annen forbindelse som beskrevet ovenfor, i en farmasøytisk akseptabel bærer, kan så tilføres eller brukes.

F.eks. kan det benanabole middel brukes alene eller i kombinasjon med et anti-resorptivt middel i fra 3 måneder tii 3 år, fulgt av et anti-resorptivt middel alene i 3 måneder til 3 år, eventuelt med en gjentagelse av en full behandlings-syklus. Alternativt kan f.eks. det benanabole middelet brukes alene eller i kombinasjon med et anti-resorptivt middel i fra 3 måneder til 3 år, fulgt av det anti-resorptive middel alene for resten av pasientens liv. F.eks., i én foretrukket tilførselsvei, kan en annen forbindelse som beskrevet ovenfor (f.eks. PGE2), tilføres én gang daglig, og en første forbindelse som beskrevet ovenfor (f.eks. en østrogen-agonist/antagonist), tilføres daglig i enkle eller multiple doser. Alternativt, i en annen foretrukket tilførselsvei, kan f.eks. de to forbindelsene tilføres i rekkefølge hvor den andre forbindelsen som beskrevet ovenfor (f.eks. PGE2), tilføres én gang daglig i et tidsrom tilstrekkelig til å øke benmassen til et nivå som ligger over benbruddterskelen (World Health Organization "Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Rapport fra Verdens helseorganisasjonsstudiegruppe, World Health Organization teknisk serie 843"), fulgt av en tilførsel av den første forbindelsen som beskrevet ovenfor (f.eks. østrogenagonist/antagonist), daglig i enkie eller multiple doser. Det er foretrukket at den andre forbindelsen som beskrevet ovenfor (f.eks. PGE2), tilføres én gang daglig i en rask tilførselsform, f.eks. oralt (f.eks. vil vedvarende frigjøringstilførselsform fortrinnsvis bli unngått).

I ethvert tilfelle vil mengden og tidsregimet omkring tilførselen av forbindelsene selvsagt være avhengige av den pasient som behanides, graden av tilstanden som behandles og tilførselsveien, og dette skjer på basis av legens -vurdering. På grunn av variabilitet fra pasient til pasient, så er de doseringsområder som er gitt nedenfor, kun angitt som en veiledning, og legen kan titrere doser av den aktive bestanddel for å oppnå den aktivitet (f.eks. benmasseøkning) som legen anser å være passende for den individuelle pasient. Med hensyn til graden av den aktivitet som er ønskelig, må legen balansere en rekke faktorer såsom startnivå med hensyn til benmasse, pasientens alder, nærvær av tidligere sykdommer, så vel som nærvær av andre sykdommer (f.eks. kardiovaskuiære lidelser). F.eks. vil en tilførsel av en østrogenagonist/antagonist gi kardiovaskuiære fordeler, spesielt for post-menopausale kvinner. De følgende avsnitt gir foretrukne doseringsområder for de forskjellige komponentene ifølge oppfinnelsen.

Den mengde av det anti-resorptive middelet som skai brukes, er bestemt av dets aktivitet som et middel for å hindre bentap. Denne aktiviteten bestemmes ved hjelp av en individuell forbindelses farmakokinetikk og dets minimale - maksimale effektive dose for å hemme bentap ved å bruke den protokoll som er beskrevet ovenfor (ØSTROGENAGONIST/ANTAGONISTPROTOKOLL).

Generelt vil en effektiv dose for å oppnå aktiviteter ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. de benresorpsjonsaktiviteter som er beskrevet, for de første forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, ligge i området på 0,01 til 200 mg/kg/dag, fortrinnsvis 0,5 til 100 mg/kg/dag.

Mer spesielt vil en effektiv dose for droloksifen ligge i området fra 0,1 til 40 mg/kg/dag, fortrinnsvis 0,1 til 5 mg/kg/dag.

Mer spesielt vil en effektiv dose for raloksifen ligge i området fra 0,1 til 100 mg/kg/dag, fortrinnsvis 0,1 til 10 mg/kg/dag.

Mer spesielt vil en effektiv dose for tamoksifen ligge i området fra 0,1 til 100 mg/kg/dag, fortrinnsvis 0,1 til 5 mg/kg/dag.

Mer spesielt vil en effektiv dose for

cjs-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol;

(-)-cJs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-yi-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; cis-6-fenvl-5-r4-(2-pvrroli^ ol; cis-1 -[e-pyrrolodinoetoksy-S^pyridyll^-fenyl-e-hydroksy-l ,2,3,4-tetra-hydronaftalen; 1 -(4'-pyrrolidinoetoksyfenyl)-2-(4"-fluorfenyl)-6-hydroksy-1,2,3,4-tetra-hydroisokinolin;

cjs-6-(4-hydroksyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5I6,7,8-tetra-hydronaftalen-2-ol; eller

1-(4,-pyrrolidinoletoksyfenyl)-2-fenyl-6-hydroksy-1,2,3,4-tetrahydro-isokinolin ligge i området fra 0,0001 til 100 mg/kg/dag, fortrinnsvis 0,001 til 10 mg/kg/dag.

Mer spesielt vil en effektiv dose for 4-hydroksytamoksifen ligge i området fra 0,0001 til 100 mg/kg/dag, fortrinnsvis 0,001 til 10 mg/kg/dag.

Generelt vil en mengde av et benanabolt middel (f.eks. PGE2) bli brukt slik at det er tilstrekkelig til å øke benmassen til et nivå som ligger over benbruddterskelen (som detaljert beskrevet i the World Health Organization-undersøkelsen som er sitert tidligere).

Generelt vil en effektiv dose for de benanabole midler som er beskrevet ovenfor, ligge i området fra 0,001 til 100 mg/kg/dag, fortrinnsvis 0,1 til 10 mg/kg/dag.

Mer spesielt vil en effektiv dose for PGE2 ligge i området fra 0,001 til 10 mg/kg/dag, fortrinnsvis 0,01 til 1 mg/kg/dag.

Mer spesielt vil en effektiv dose for 3S-(3-hydroksy-4-fenylbutyl)-2R-[6-(2H-tetrazol-5-yl)heksyl]cyklopentanon ligge i området fra 0,001 til 20 mg/kg/dag, fortrinnsvis 0,01 til 10 mg/kg/dag.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, vil vanligvis bli brukt i form av et farmasøytisk preparat som inneholder minst én av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. Således kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen, tilføres individuelt eller sammen i enhver vanlig kjent oral, parenteral eller transdermal doseringsform.

For oral bruk kan et farmasøytisk preparat være i form av løsninger, suspensjoner, tabletter, piller, kapsler, pulvere og lignende. Tabletter som inneholder forskjellige tilsetningsstoffer såsom natriumcitrat, kalsiumkarbonat og kalsium-fosfat, kan brukes sammen med forskjellige nedbrytningsmidler som stivelse og fortrinnsvis potet eller tapiokastivelse og visse komplekse silikater, foruten binde-midler som polyvinylpyrrolidon, sukrose, gelatin og akacia. Videre vil smøremidler som magnesiumstearat, natriumlaurylsulfat og talkum, ofte være fordelaktige for fremstilling av tabletter. Faste preparater av lignende type kan også brukes som fyllstoff i harde eller myke gelatinkapsler, og foretrukne stoffer i denne forbindelse innbefatter også laktose eller melkesukker så vel som høy-molekylære polyetylen-glykoler. Når vandige suspensjoner og/eller safter er ønskelig for oral bruk, kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kombineres med forskjellige søtningsstoffer, smaksstoffer, fargestoffer, emulgeringsmidler og/eller suspenderingsmidler, så vel som fortynningsmidler som vann, etanol, propylen-glykol, glycerin og forskjellige kombinasjoner av disse.

For parenteral bruk, kan løsninger i sesamolje eller jordnøttolje eller vandig propylenglykoi brukes, så vel som sterile vandige løsninger av de tilsvarende vannløselige saltene. Slike vandige løsninger kan egnet buffres, hvis dette er nødvendig, og det flytende fortynningsmiddelet kan først gjøres isotonisk med tilstrekkelig saltløsning eller glukose. Disse vandige løsningene er spesielt godt egnet for intravenøse, intramuskulære, sukatanøse og intraperitoneale injeksjons-formål. I denne forbindelse, kan de sterile vandige media som brukes, alle lett fremstilles ved hjelp av standardteknikk.

For transdermal (f.eks. topikal) bruk, kan det fremstilles sterile, fortynnede, vandige eller delvis vandige løsninger (vanligvis i en konsentrasjon fra ca. 0,1 til 5%), og som ellers er som de ovenfor angitte parenterale løsninger.

Fremgangsmåter for fremstilling av forskjellige farmasøytiske preparater med en viss mengde av en aktiv bestanddel, er velkjente eller kan lett finnes i egnet litteratur, f.eks. Remingtor<V>s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 15. utgave (1975).

Farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan inneholde fra 0,1 til 95% av forbindelsene, fortrinnsvis 1 til 70%. I ethvert tilfelle vil preparatet som tilføres, inneholde en mengde av én eller flere forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse i en tilstrekkelig mengde til at en effektivt får behandlet sykdommen eller tilstanden i den pasienten som behandles.

Ettersom foreliggende oppfinnelse angår heving og opprettholdelse av benmasse ved behandling av en kombinasjon av aktive bestanddeler som kan tilføres separat, så angår foreliggende oppfinnelse også å kombinere separate farma-søytiske preparater i en settform. Et sett vil således inneholde to separate farma-søytiske preparater: en østrogenagonist/antagonist og et anabolt middel. Settet vil bestå av en beholder for de separate preparater, f.eks. i form av en oppdelt flaske eller en oppdelt foliepakke. Typisk vil settet ogsat det inneholder skriftlig ve-ledning for tilførsel av de separate komponentene. Et slikt sett vil være spesielt fordelaktig når separate komponenter fortrinnsvis blir tilført i forskjellige doseringsformer (f.eks. oralt eller parenteralt) i forskjellige doseringsnivåer eller inter-valler, eller når den foreskrevne lege ønsker å titrere de individuelle komponentene i kombinasjonen.

Et eksempel på et slikt sett er en såkalt blemmepakke. Blemmepakker er velkjente innen pakkeindustrien og er meget anvendt for pakking av farma-søytiske enhetsdoseringsformer (tabletter, kapsler og lignende). Blemmepakker består vanligvis av et ark av et relativt stivt materiale dekket med en folie, fortrinnsvis et transparent plastmateriale. Under pakkingen vil det bli dannet for-dypninger i plastfolien. Disse fordypningene har størrelse og form av de tabletter eller kapsler som skal pakkes. Deretter blir tablettene eller kapslene plassert i fordypningene, og arket med relativt stivt materiale, blir forseglet mot plastfolien på overflaten av dette som er motsatt den retningen i hvilke fordypningene er formet. Som et resultat av dette, vil tablettene eller kapslene være lukket inne i et hulrom mellom plastfolien og arket. Fortrinnsvis bør styrken på arket være slik at tablettene eller kapslene kan fjernes fra blemmepakken ved å bruke manuelt trykk på nevnte forsenkninger, hvorved det dannes en åpning i arket på det sted hvor fordypningen er utformet. Tabletten eller kapselen kan så fjernes via nevnte åpning.

Det er ønskelig å tilveiebringe en hukommelseshjelp på kortet, dvs. i form av tall som står inntil tablettene eller kapslene, slik at tallene tilsvarer dagene i det regime i hvilket tablettene eller kapslene skal brukes. Et annet eksempel på en slik hukommelseshjelp er en kalender som er trykket på kortet, f.eks. som følger, "første uke, mandag, tirsdag, etc, andre uke, mandag, tirsdag", etc Andre variasjoner med hensyn til slike hjelpemidler er kjente. En "daglig dose" kan være en enkelt tablett eller kapsel, eller man kan ta flere piller eller kapsler på en gitt dag. Også en daglig dose av et benanabolt middel kan bestå av én tablett eller kapsel, mens en daglig dose av et anti-resorptivt middel kan bestå av flere tabletter eller kapsler. Selve hukommelseshjelpemiddelet bør reflektere dette.

I en annen spesifikk utførelse av oppfinnelsen, er det utformet en leverings-anordning som leverer de daglige doser én om gangen i den rekkefølge de er påtenkt å skulle brukes. Fortrinnsvis vil også denne anordningen være utstyrt med en hukommelseshjelp slik at det vil være lett å følge det angitte doseringsregime. Et eksempel på en slik hukommelseshjelp er en mekanisk teller som angir det antall daglige doser som er blitt levert. Et annet eksempel på en slik hukommelseshjelp er en batteridrevet mikrochip-hukommelse koblet med en flytende krysta Uskjerm, et hørbart minnesignal som f.eks. leser ut den data når siste daglige dose var blitt tatt og/eller minner om at neste dose nå må tas.

EKSEMPEL

104 hunnlige Spraque-Dawley rotter (Charles River, Wilmington, MA) med en alder på12 måneder, ble enten operert uten videre inngrep eller fikk livmoren fjernet (OVX) ved måned 0. 3 måneder etter det kirurgiske inngrepet, fikk OVX-rottene enten prostaglandin E2 (PGE2), et kjent anabolsk benmiddel, i en dose på 3 mg/kg/dag (subkutanøs injeksjon), eller PGE2 i en dose på 3 mg/kg/dag

(subkutanøs injeksjon), kombinert med droloksifen (DRO) i en dose på 10 mg/kg/- dag (oralt) i 2 måneder. Deretter ble PGE2-behandlingen avsluttet, og rottene ble enten behandlet med væske (10% alkohol i saltløsning) eller DRO (10 mg/kg/dag, oralt) i ytterligere 1,5 måneder som beskrevet i det følgende.

Gruppe III: 8 jukseopererte rotter ble oralt behandlet med væske (10%

etanol i saltløsning) fra måned 3 til 5, og deretter obdusert.

Gruppe IV: 8 jukseopererte rotter ble oralt behandlet med væske (10%

etanol i saltløsning) fra måned 3 til 6,5, og deretter obdusert.

Gruppe V: 8 OVX-rotter ble obdusert ved måned 3 som forbehandlings-kontroller.

Både PGE2 (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, Ml) eller droloksifen (Pfizer Inc. Groton, CT) pulver ble først løst i 100% etanol og så fortynnet ytterligere med saltløsning til de forønskede konsentrasjoner (sluttkonsentrasjonen av etanol var 10%). En PGE2-løsning ble daglig injisert subkutanøst i ryggen på rottene i en dose på 1 ml/kg. En droloksifenløsning ble gitt daglig p.o. i en dose på 1 ml/rotte.

Benmineralmålinoer i den lumbale ryggrad

Dobbeltenergi røntgenabsorptio-metri (QDR 1000AV, Hologic, Inc., Waltham, MA) utstyrt med en "Regional High Resolution Sean" software (Hologic Inc., Waltham, MA) ble brukt for å bestemme benareal, benmineralinhold (BMC) og benmineraltetthet (BMD) i hele den lumbale ryggraden og hver av de seks lumbale ryggvirvlene (LV1 - 6) i de bedøvede rottene. Rottene ble bedøvet ved injeksjon (i.p.) av 1 ml/kg av en blanding av ketamin/rompun (forhold 4 til 3), og så plassert på rotteplattformen. Scanningfeltets størrelse var 6 x 1,9 cm, oppløsning-en var 0,0254 x 0,0127 cm og scanninghastigheten var 7,25 mm/sekund. Scanningbildet av hele lenderyggraden ble oppnådd bg analysert. Benareal (BA) og benmineralinnhold (BMC) ble bestemt, og benmineraltettheten ble beregnet (MBC delt med BA) for hele den lumbale ryggraden og hver av de seks lumbale ryggvirvlene (LV1 - 6).

Etter 3, 5 eller 6,5 måneder etter operasjon, var BMC og BMD i hele den lumbale ryggraden og hver av de lumbale ryggvirvlene signifikant nedsatt med fra 15 til 27% i OVX-rottene sammenlignet med kontrollene. Rotter 3 måneder etter OVX-behandlingen, behandlet enten med PGE2 alene eller kombinert med DRO i 2 måneder, var fullstendig restituert med hensyn til BMC og BMD i forhold til kontrollnivåene før operasjon. Det var ingen forskjell i BMC og BMD i OVX-rotter behandlet med PGE2 alene, eller PGE2 kombinert med DRO, noe som indikerer at DRO ikke svekker de anabole effektene av PGE2. Da behandlingen med PGE2 ble avsluttet, kunne man observere en signifikant senkning av BMD i LV1, LV2 og LV3, og av BMC i LV2. På den annen side, når DRO-behandlingen ble gitt til disse OVX-rottene etter avslutningen av behandlingen med PGE2, så ble de PGE2-restituerte bena fullstendig opprettholdt. På lignende måte ga et brudd i behandlingen med PGE2 og DRO i 1,5 måned, en signifikant nedsatt verdi av BMD i LV3. Når imidlertid PGE2 ble tatt ut og DRO-behandlingen ble fortsatt i ytterligere 1,5 måned, fant man intet bentap i den lumbale ryggraden i disse OVX-rottene. Ut fra dette kan man konkludere at DRO, et anti-resorptivt middel, ikke svekker de anabole effektene av PGE2 i osteogene rotter. Videre var DRO effektivt for å opprettholde PGE2-restituert ben etter at behandlingen med dette stoffet var avsluttet. Disse data understøtter strategien ved å bruke et anabolt middel for å gjenskape benmasse i et osteoporotisk skjelett, fulgt av et anti-resorptivt middel for å opprettholde den gjenskapte benmassen.

Claims

1. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder: a. en terapeutisk effektiv mengde av en første forbindelse som er en østrogenagonist/antagonist; og b. en terapeutisk effektiv mengde av en annen forbindelse som er et prostaglandin eller en prostaglandinagonist/antagonist.

2. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det dessuten inneholder en farmasøytisk bærer.

3. Farmasøytisk preparat ifølge krav 2, karakterisert ved at østrogenagonist/antagonisten er droloksifen, raloksifen, tamoksifen, 4-hydroksy-tamoksifen, cis-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; (-)-cjs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; cjs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-1>F6'-Pvrrolodinoetoksy-3'-pvridyl)-2-fenyl-6-hydroksy-1.2.3.4-tetra-hydronaftalen; 1-{4-pyrrolidinoetoksyfenyl)-2-(4"-fluorfenyl)-6-hydroksy-1,2,3,4-tetra-hydroisokinolin; cjs-6-(4-hydroksyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetra-hydronaftalen-2-ol; eller 1-(4'-pyrrolidinoletoksyfenyl)-2-fenyl-6-hydroksy-1,2,3,4-tetrahydro-isokinolin.

4. Farmasøytisk preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at den andre forbindelsen er PGDi, PGD2, PGE2, PGEi, PGF2, PGF2aog 3S-(3-hydroksy-4-fenylbutyl)-2R-[6-(1H-tetrazol-5-yl)-heksyl]cyklopentanon.

5. Farmasøytisk preparat rføIge krav 4, karakterisert ved at østrogenagonist/antagonisten er droloksifen.

6. Farmasøytisk preparat ifølge krav 5, karakterisert ved at den andre forbindelsen er PGE2.

7. Farmasøytisk preparat ifølge krav 5, karakterisert ved at den andre forbindelsen er 3S-(3-hydroksy-4-fenyl-butyl)-2R-[6-(2H-tetrazoi-5-yl)heksyi]cyklopentanon.

8. Farmasøytisk preparat ifølge krav 4, karakterisert ved at østrogenagonist/antagonisten er cjs-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; (-)-cjs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; cjs.-6-fenyl-544-{2-pyn-olidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,67t8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-1-r6'-Pvrrolodinoetoksv-3Vpvridvn-2-fenvl-6-hvdroksv-1.2.3.4-tetra-hydronaftalen; 1-{4l<->pyrrolidinoetoksyfenyl)-2-(4"-fluorfenyl)-6-hydroksy-1,2,3,4-tetra-hydroisokinolin; cjs-6-(4-hydroksyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenylJ-5,6,7,8-tetra-hydronaftalen-2-ol; eller l^-pyrrolidinoletoksyfenylJ^-fenyl-e-hydroksy-I^.S^-tetrahydro-isokinolin.

9. Farmasøytisk preparat ifølge krav 8, karakterisert ved at den andre forbindelsen er PGE2.

10. Farmasøytisk preparat ifø Ige krav 8, karakterisert ved at den andre forbindelsen er 3S-(3-hydroksy-4-fenyl-butyl)-2R-[6-(2H-tetrazol-5-yl)heksyl]cyklopentanon.

11. Anvendelse av a. en terapeutisk effektiv mengde av en første forbindelse som er en østrogenagonist/antagonist; og b. en terapeutisk effektiv mengde av en annen forbindelse som er et prostaglandin eller en prostagiandingagonist/antagonist til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av et pattedyr med en tilstand karakterisert ved lav benmasse.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvori østrogenagonist/antagonisten er droloksifen, raloksifen, tamoksifen, 4-hydroksy-tamoksifen, idoksifen, centrakroman, cjs-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6)7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; (-)-cjs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; cjs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-1 -r6'-Pvrrolodinoetoksv-3'-pvridyll-2-fenvl-6-hvdroksv-1,2.3.4-tetra-hydronaftalen; 1-(4,-pyrrolidinoetoksyfenyl)-2-(4"-fluorfenyl)-6-hydroksy-1,2,3l4-tetra-hydroisokinolin; cjs-6-(4-hydroksyfenyl)-5-[4-(2-pipeirdin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetra-hydronaftalen-2-ol; eller 1-(4'-pyrrolidinoletoksyfenyl)-2-fenyl-6-hydroksy-1,2,3,4-tetrahydro-isokinolin.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvori andre forbindelsen er PGDi, PGD2, PGE2, PGEi, PGF2, PGF2aog 3S-{3-hydroksy-4-fenylbutyl)-2R-[6-(1H-tetrazol-5-yl)-heksyl]cyklopentanon.

14. Anvendelse ifølge krav 13, hvori østrogenagonist/antagonisten er droloksifen.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvori den andre forbindelsen er PGE2.

16. Anvendelse ifølge krav 14, hvori den andre forbindelsen er 3S-(3-hydroksy-4-fenyl-butyl)-2R-[6-(1H-tetrazol-5-yl)heksyl]cyklopentanon.

17. Anvendelse ifølge krav 14, hvori tilstanden med lav benmasse er osteoporose.

18. Anvendelse ifølge krav 13, hvori østrogenagonist/antagonisten er cjs-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; (-)-cjs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-i -yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydro-naftalen-2-ol; cjs-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-1 -[e^pyrrolodinoetoksy-S-pyridyll^-fenyl-e-hydroksy-l ,2,3,4-tetra-hydronaftalen; 1-(4'-pyrrolidinoetoksyfenyl)-2-(4"-fluorfenyl)-6-hydroksy-1,2,3,4-tetra-hydroisokinolin; cjs-6-(4-hydroksyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-1-yl-etoksy)fenyl]-5,6,7,8-tetra-hydronaftalen-2-ol; eller 1-(4'-pyrrolidinoletoksyfenyl)-2-fenyl-6-hydroksy-1,2,3,4-tetrahydro-isokinolin.

19. Anvendelse ifølge krav 18, hvori den andre forbindelsen er PGE2.

20. Anvendelse ifølge krav 18, hvori den andre forbindelsen er 3S-(3-hydroksy-4-fenyl-butyl)-2R-[6-(1H-tetrazol-5-yl)heksyl]cyklopentanon.

21. Anvendelse ifølge krav 18, hvori tilstanden med lav benmasse er osteoporose.

22. Anvendelse av forbindelsene ifølge krav 14, for fremstilling av et medikament for behandling av et pattedyr med en tilstand karakterisert ved lav benmasse ved et administrasjonsforløp hvori den første forbindelsen og den andre forbindelsen i alt vesentlig tilføres samtidig.

23. Anvendelse av forbindelsene ifølge krav 14, for fremstilling av et medikament for behandling av et pattedyr med en tilstand karakterisert ved lav benmasse ved et administrasjonsforløp hvori den andre forbindelsen tilføres i en periode fra ca. 3 måneder til ca. 3 år.

24. Anvendelse av forbindelsene ifølge krav 18, for fremstilling av et medikament for behandling av et pattedyr med en tilstand karakterisert ved lav benmasse ved et administrasjonsforløp hvori den første forbindelsen og den andre forbindelsen tilføres i alt vesentlig samtidig.

25. Anvendelse av forbindelsene ifølge krav 18, for fremstilling av et medikament for behandling av et pattedyr med en tilstand karakterisert ved lav benmasse ved et administrasjonsforløp hvori den andre forbindelsen tilføres i en periode fra ca. 3 måneder til ca. 3 år.

26. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder: a. en mengde av en første forbindelse som er en østrogenagonist/- antagonist; og b. en mengde av en annen forbindelse som er et prostaglandin eller en prostagladinagonist/antagonist, hvor mengden av den første forbindelsen alene og mengden av den andre forbindelsen alene er utilstrekkelig til å oppnå de terapeutiske effekter med hensyn til økning i bendannelse og nedsatt benresorpsjon hvis de tilføres samtidig, og hvor den samlede effekt av mengdene av første og andre forbindelser er større enn summen av de terapeutiske effekter som lar seg oppnå med de individuelle mengder av første og andre forbindelse, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

27. Anvendelse av a. en mengde av en første forbindelse som er en østrogenagonist/- antagonist; og b. en mengde av en annen forbindelse som er et prostaglandin eller en prostaglandinagonist/antagonist hvor mengden av den første forbindelsen alene og mengden av den andre forbindelsen alene er utilstrekkelig til å oppnå de terapeutiske effekter med hensyn til å øke bendannelsen og nedsette benresorpsjonen hvis de tilføres hver for seg, og hvor den samlede effekt av mengdene av de første og andre forbindelser er større enn summen av de terapeutiske effekter som lar seg oppnå med de individuelle mengder av den første og andre forbindelse, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer, til fremstilling av et farmasøytisk preparat for å behandle et pattedyr med en tilstand karakterisert ved lav benmasse.

28. Sett inneholdende en behandling for en tilstand karakterisert ved lav benmasse, karakterisert ved at det inneholder: a. en terapeutisk effektiv mengde av en østrogenagonist/antagonist og en farmasøytisk akseptabel bærer i en første enhetsdoseringsform; b. en terapeutisk effektiv mengde av et prostaglandin eller en prostaglandinagonist/antagonist og en farmasøytisk akseptabel bærer i en annen enhetsdoseringsform; og c. en beholder for nevnte første og andre doseringsformer.