BG64582B1

BG64582B1 - Фармацевтичен състав за комбинирана терапия на остеопороза и използване

Info

Publication number: BG64582B1
Application number: BG102726A
Authority: BG
Inventors: Hua KE; David Thompson
Original assignee: Pfizer Inc.
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1998-08-26
Publication date: 2005-08-31
Also published as: HK1018210A1; NO20063853L; CZ297452B6; ATE405273T1; PT883404E; PL187219B1; SI0883404T1; HRP970118A2; IL154379A0; CN1515317A; BG102726A; EP1236475A2; EP1932543A3; CL2004000119A1; PE20011302A1; EP0883404A1; AR005987A1; CO4761063A1; AP9700934A0; US20010009920A1

Abstract

Изобретението се отнася до комбинирани фармацевтични състави, които съдържат някои агонисти/антагонисти на естроген и простагландини или агонисти/антагонисти на простагландини. Те намират приложение за лечение на костни увреждания, включително и остеопороза.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до фармацевтичен състав за комбинирана терапия на остеопороза. То се отнася до фармацевтична комбинация на агонисти/антагонисти на естроген със средства, които стимулират образуването на костно вещество и увеличаването на костна маса, и до използването на тези комбинации за лечение на заболявания, които са свързани с атрофия на костите (намаляване на костната маса) при бозайници и при хора.

Предшестващо състояние на техниката

Остеопорозата е систематично скелетно заболяване, свързано с атрофия на костите и увреждане на костната тъкан и като следствие повишаване чупливостта на костите, както и на податливостта им към фрактури. В САЩ това заболяване е засегнало повече от 25 млн. души и предизвиква над 1.3 млн. фрактури годишно, в това число 500 000 на гръбначния стълб, 250 000 на бедрото и 240 000 на китката. Най-сериозни са фрактурите на бедрото, като 5 - 20% от пациентите умират в продължение на една година и над 50% от преживелите са инвалидизирани.

При по-възрастните рискът от остеопороза е по-голям и следователно проблемът ще става по-сериозен с остаряване на населението. В световен мащаб прогнозата е, че фрактурите ще нараснат трикратно през следващите 60 години и едно изследване показва, че през 2050 г. в света ще има 4.5 млн. счупвания на тазобедрената става.

Жените са с по-голям риск от остеопороза от мъжете. При жените се наблюдава рязко ускоряване на загубата на костно вещество непосредствено след менопаузата. Другите фактори, които повишават загубата на костно вещество, водеща до остеопороза, включват пушене, привикване към алкохол, застоял начин на живот и малко поемане на калций.

Естрогенът е агентът, който е избран за предпазване от остеопороза или постменопаузната загуба на костно вещество при жените. В допълнение, Black et al., са докладвали в

ЕР 0605193А1, че естрогенът, особено когато е приеман орално, понижава плазмените нива на липопротеините с ниска плътност (LDL) и повишава това на благоприятните липопротеини с висока плътност (HDL). Обаче, продължителната терапия с естроген е причина за множество увреждания, включващи повишен риск от рак на матката, рак на ендометриума и възможно рак на гърдите, което от своя страна е причина повечето жени или да избягват това лечение, или да взимат лекарства само за кратък период от време. Въпреки че рискът от рак на ендометриума е понижен чрез конкурентно използване на прогестерон, все още съществува мнението за възможно повишен риск от рак на гърдата при приемане на естроген. Напоследък са предложени терапевтични режими, които са насочени към понижаване на риска от раково заболяване, чрез приемането на комбинации от прогестерон и естроген, но те са предизвикали при експерименталните пациенти неприемливо кървене. Освен това, комбинирането на прогестерон с естроген изглежда, че притъпява ефекта на естрогена за понижаване на серумния холестерол. Тези нежелани странични ефекти, свързани с естрогеновата терапия, потвърждават необходимостта от разработка на алтернативни терапии за остеопороза, притежаващи желан благоприятен ефект върху серумните LDL, но непредизвикващи нежелани странични ефекти.

Напоследък са предложени голям брой агонисти/антагонисти на естрогена за лечение на остеопороза. Докладвано е (Osteoporosis Conference Scrip No. 1812/13 April 16/20,1993, p. 20), че ралоксифенът, 6-хидрокси-2-(4-хидроксифенил)-3-[4-(2-пиперидиноетокси)бензоил]бензо[Ь]-тиофен имитира благоприятното действие на естрогена върху костите и липидите, но за разлика от естрогена, притежава минимален маточно стимулиращ ефект. [Black,

L. J. et al., Raloxifene (LY 139481 HCI) Prevents Bone Loss and ReducesSerum Cholesterol Without Causing Uterine Hypertrophy in Ovariectomized Rats, J. Clin. Invest., 1994, 93: 63-69.

Също така, тамоксифенът, 1 -(4-Р-диметиламиноетоксифенил)-1,2-дифенилбут-1 -ен, е антиестроген, който е предложен като остеопорозен агент, притежаващ палиативен ефект върху рака на гърдата, но е докладвано, че притежава известно естрогенно действие вър ху матката. Gill Sharma et al., J. Reproduction and Fertility (1993) 99, 395, докладва, че тамоксифенът при дози 200 и 400 mg/kg/ден намалява теглото на тестисите и потиска вторичните полови белези при мъжки плъхове.

В допълнение, US 5,254,594 (чието разкритие е включено за позоваване) описва използването на дролоксифен за лечението на костни заболявания, включително и остеопороза.

Агенти, като дролоксифена предпазват от загуба на костно вещество и по този начин намаляват опасността от фрактури, без страничните ефекти на естрогена. Обаче, очаква се, че само естрогенът и естрогеновите агонисти ще намалят риска от счупвания с около 50%, като остават приблизително 50% от жените с остеопороза все още с риск за остеопорозни фрактури.

Неестрогеновитеагонисти/антагонисти, като бифосфонатите, също така са предложени за лечението на остеопороза. Например фосамакс (Fosamax®) е бифосфонат, който обикновено се предписва за лечение на остеопороза. Други бифосфонати, които понастоящем се смятат като регулатори, включват ризедронат (risedronate), тилудронат (tiludronate) и ибандронат (ibandronate).

Frost et al., “Treatment of Osteoporosis by manipulation of Coherent Bone Gell Populations, Clinical Orthopedics and Related Research, 143, 227 (1979) описва теоретичен модел, който посочва, че би било възможно да се синхронизира действието и метаболизма на костните клетки, чрез приемането първо на агент, активиращ костните клетки, последван от агент, инхибиращ костната резорбция, след което е възможно да настъпи нормално образуване на костно вещество.

Tang et al., Restoring and Maintaining Bone in Osteogenic Female Rat Sceleton: I. Changes in Bone Mass and Structure, J. Bone Mineral Reserch 7 (9), p. 1093-1104, 1992 разкрива данни за концепцията „загуба, възстановяване и поддържане”, (ЗВП) (англ. LRM), един практически подход към реверсиране на съществуваща остеопороза. Тази концепция използва анаболитни агенти за възстановяване на костната маса и архитектура (+ фаза) и след това - преминаване към агент с установена способност за поддържане на костната маса, за запазване на новата кост (+/- фаза).

При изследването върху плъхове са използвани PGE₂ (простагландин Е₂) и ризедронат, бифосфонат, за да се покаже, че повечето от новите порести и корови кости, индуцирани от PGE₂, могат да бъдат поддържани в продължение на около 60 дни след прекъсване на PGE₂ чрез приемане на ризедронат.

Описани са комбинации на бифосфонати и простагландини за лечение на остеопороза. ЕР заявка 0 381 296 описва използването на комплекс, при който активиращият костта период или режим на лечение е последван от режим, инхибиращ костната резорбция. Примерите за съединения, активиращи костта, цитирани в този източник, включват паратироиден хормон (РТН), неорганичен фосфат, хормон на растежа, флуорид, тироиден хормон, (напр. тироксин), някои метаболити на витамин Д и простагландини (PDEj при дозировка 10 mg/kg дневно). Полифосфонатите са описани като агенти, инхибиращи костната резорбция.

Патентна заявка PCT/US1993/008529 описва едновременното доставяне на агент, активиращ костта, напр. някакъв простагландин, който е свързан химично със съединение, инхибиращо костната резорбция, което отделя селективно активиращия костта агент към желания участък. При постепенна хидролиза на новото съединение, хидролизните продукти могат да предизвикат инхибиращо действие (чрез биофосфонатите) върху костната резорбция, както и растеж на костта или стимулиращо действие (PGE₂).

Ефектът от комбинация на простагладнит Е2 и ризедронат (бифосфонат) е изследван от Lin et al., Effects of Prostaglandin E2 and Risedronate Administration on Cancellous Bone in Older Female Rats, Bone 15 (5), p. 489-496, 1994.

Qui et al., Experimental Study on Antiatherosclerotic Treatmnt by PGE₂ Combined With Vitamin E and Estradiol, Chines Medical Journal, 108 (1) p. 33-36, 1995 описва, че единична доза от PGE₂, комбинирана с витамин Е и с естрадиол, притежава по-координирано инхибиращо действие върху аортните и коронарни атеросклеротични връзки, както и върху агрегацията на плаките, пролиферацията на клетките на гладките мускули и пероксидацията на липидите, отколкото единичната доза PGEj.

Рефератът на “Nonhormonal Alternatives for Management of Eatly Menopause in Yonger

Women with Breast Cancer”, Monogr. Natl. Cancer Inst. (16), 161 - 167, 1994, твърди, че “използването на няколко неестрогенни подхода при профилактиката и лечението на остеопороза е обещаващо”. Традиционните препоръки за поддържане целостта на костната система като натоварващи упражнения, диета, богата на калций и ограничаваща консумацията на кофеин, алкохол и протеин; отказване от пушене и мерките за свеждане до минимум на травмите са разширени, за да включат и използването или изследванията на лекарства (самостоятелно или в комбинация). Тези лекарствени вещества включват прогестини, метаболити на витамин Д, назален или под формата на инжекции синтетичен сьомгов калцитонин, бифосфонати, натриев флуорид, паратироиден хормон, растежни фактори, тамоксифен и др.

ЕР 0 635 270 е насочен към комбинацията на ралоксифен и паратироиден хормон (РТН), фрагменти или аминокиселинни модифицирани техни производни при лечението на остеопороза. Описаното в ЕР 0 635 270 не се отнася до комбинацията на ралоксифен и всички анаболни средства. То е конкретно насочено към ралоксифен и не описва или не предполага комбинации на други естроген агонисти/ антагонисти и РТН. ЕР 0 635 270 също не описва комбинацията на естроген агонисти/антагонисти и простагландинов агонист/антагонист. Паратироидният хормон (РТН) не е еквивалентен на простагландин или на простагландинов агонист/антагонист. В допълнение на това, паратироидният хормон не е еквивалентен на секретагога на растежния хормон. Паратироидният хормон (РТН), с молекулно тегло приблизително 9,500, е регулаторен фактор в хомеостатичния контрол на калциевия и фосфатен метаболизъм, неговите главни места на активност са скелета, бъбреците и стомашно-чревния път (виж The Merck Index, 11^th Edition, 1989, стр. 1113 - 1114, публикуван от Merck & Co. Inc., Rahway, N. J., U.S.A.). PHT действа чрез PHT рецептора, докато простагландинът (простагландините) или простагландиновите агонисти/ антагонисти действат чрез простагландиновите (ЕР) рецептори (за дефиницията на простагландина (простагландините) виж The Merck Index, на страница 1251, също включена). В светлината на ЕР 0 635 270 не са очевидни неочаквани синергитични ефекти от комбинации.

Bone, Vol. 17, No. 2, 1995, стр. 23 - 29, с оглед на стр.23, колона 1, редове 38 - 40, описва, че “простагландин Е₂ увеличава периосталното и ендостално образува на кост, но може да увеличи кортикалната порьозност. Необходими са повече данни с оглед на тези растежни фактори, силиконови съединения, стронциеви соли и флавиноиди”. Твърди се също на стр. 27, колона 2, редове 35 - 38 в съобщението на Bone, че “други локални средства, за които е показано, че притежават анаболни ефекти върху костта, включват простагландин Е₂, който увеличава трабекуларната кост в медуларната област, но може да компрометира здравината на скелета чрез увеличаване на кортикалната порьозност”, поради което може да се направи заключението, че простагландин Е₂, въпреки че е анаболно средство, може да не е приложимо за лечение на остеопороза, тъй като може да компрометира здравината на скелета.

Следователно, въпреки че има голямо разнообразие от лечения на остеопорозата, съществува постоянната необходимост от изследвания в тази област за алтернативни терапии, поради ограничения успех на известните методи на лечение за снижаване броя на фрактурите, дължащи се на остеопороза.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се отнася до фармацевтичен състав, включващ агонисти/антагонисти на естрогена и анаболни средства и до използването на такива състави за лечение на заболявания, които се характеризират с атрофия на костите, включително остеопороза при бозайници (например човек, особено при жени).

Комбинацията включва терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е агонист/ антагонист на естрогена, и терапевтично ефективно количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е простагландин или агонист/антагонист на простагландина.

Предпочитани агонисти/антагонисти на естрогена включват дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен, 4-хидрокситамоксифен, цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

(-)-цис-6-фенил-3-[4-(2-пиролидин-1илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-ол;

цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 -илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2ол;

цис-1 -[6'-пиролидиноетокси-3'-пирид ил ] -2-фенил -6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

1-(4'-пиролидиноетоксифенил)-2-(4флуорофенил)-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин;

цис-6-(4-хидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 -илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол или

1-(4'- пиролидиноетоксифенил)-2фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин.

Предпочитаните анаболни средства включват PGD_p PGD₂, PGE₂, PGE_t, PGF₂, PGF_2a или 38-(3-хидрокси-4-фенилбутил)-2К[6-( 1 Н-тетразол-5-ил)хексил]циклопентанон.

Друга цел на изобретението е използването на фармацевтичния състав като лекарствено средство за лечение на бозайници със заболяване, което се проявява с атрофия на костите, като лечението включва даване на бозайника със заболяване, проявяващо се с атрофия на костите, на:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е агонист/антагонист на естрогена, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е простагландин или агонист/антагонист на простагландина.

При това използване предпочитани агонисти/антагонисти на естрогена включват дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен, 4-хидрокситамоксифен, цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2 -ол;

цис-1-[6'-пиролидиноетокси-3'-пиридил]-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

1-(4'-пиролидинолетоксифенил)-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин.

Предпочитаните анаболни средства включват PGDp PGD₂, PGE₂, PGE_p PGF₂, PGF_2a или 38-(3-хидрокси-4-фенилбутил)-21<[6-(1 Н-тетразол- 5-ил)хексил] цикл опентанон.

Използването се прилага с предпочитание при заболяване, което се представя с атрофия на костите и е остеопороза, като при лечението първото и второто съединение се приемат по принцип едновременно.

При използването второто съединение се приема за период от време от около три месеца до около три години.

Обикновено даването на второто съединение е последвано от даване на първото съединение за период от време от около три месеца до около три години, без приемането на второто съединение по време на втория период от около три месеца до около три години.

Съответно, приемането на второто съединение е последвано от приемане на първото съединение за период от време по-голям от около три години, без приемане на второто съединение по време на периода, които е по-голям от около три години.

Съставът съгласно изобретението, включващ:

а. количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е агонист/ антагониста на естрогена, и

б. количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е простагландин или агонист/антагонист на простагландина, има синергитичен ефект, при което количеството само от първото съединение и количеството само от второто съединение са недостатъчни, за да се постигнат терапевтични ефекти на стимулиране на образуването на костна маса и намаляване на костната резорбция, при приемането им едновременно обаче, комбинираният ефект от количествата на първото и второ съединение е по-голям от сумата на терапевтичните ефекти, които се постигат с отделните количества от първото и второ съеди нение и фармацевтично приемлив разредител или носител.

Този синергитичен състав се използва за лечение на бозайник със заболяване, което се проявява с атрофия на костите.

Друг аспект на изобретението се отнася до фармацевтичен състав, включващ:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение като споменатото първо съединение е дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен или идоксифен, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е натриев флуорид или N-[1(R)-[1,2дихидро-1-метансулфонилспиро[ЗН-индол3,4'-пиперидин]-1 '-ил)карбонил]-2-(фенил-метилокси)етил]-2-амино-2-метилпропанамид: МК-677.

Предпочитано изпълнение на този състав е, когато първото съединение е дролоксифен.

Друг аспект на изобретението се отнася до използването на фармацевтичен състав за получаване на лекарствено средство за лечение на бозайник със заболяване, което се проявява с атрофия на костите, който състав включва:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен или идоксифен, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение като споменатото второ съединение е натриев флуорид или N-[1(R)-[1,2дихидро-1 -метансулфонилспиро[ЗН-индол3,4'-пиперидин]-1 '-ил)карбонил]-2-(фенил-метилокси)етил]-2-амино-2-метилпропанамид: МК-677.

Предпочита се, когато първото съединение в този състав е дролоксифен.

Съставът се използва за получаване на лекарствено средство за лечение на заболяване, което се представя с атрофия на костите и е остеопороза. Приложението на лекарственото средство става с предпочитание, като първото и второто съединение се приемат по принцип едновременно. Може обаче приложението да се извършва, като второто съединение се приема за период от време от около три месеца до около три години или приемането на второто съединение да е последвано от даване на първото съединение за период от време от около три месеца до около три години, без приемане на второто съединение по време на периода от около три месеца до около три години или приемането на второто съединение да е последвано от приемане на първото съединение за период от време по-голям от около три години, без приемане на второто съединение по време на периода, който е по-голям от около три години.

Фармацевтичният състав, включващ:

а. количество от първо съединение, като споменатото първо съединение, което е дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен или идоксифен, и

б. количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е натриев флуорид или N-[l(R)-[l,2-flHXHflpo-l-MeTaHсулфонилспиро[ЗН-индол-3,4'-пиперидин]1'ил)карбонил]-2-(фенил-метилокси)етил]-2амино-2-метилпропанамид: МК-677, има синергитичен ефект, при което количеството само от първото съединение и количеството само от второто съединение са недостатъчни, за да се постигнат терапевтични ефекти на стимулиране на образуването на костна маса и намаляване на костната резорбция, при приемането им едновременно обаче, комбинираният ефект от количествата на първото и второ съединение е по-голям от сумата на терапевтичните ефекти, които се постигат с отделните количества от първото и второ съединение и фармацевтично приемлив разредител или носител.

Друг аспект на изобретението е фармацевтичен състав, включващ:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е:

цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 -илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-ол;

цис-1 -[6'-пиролидиноетокси-3'-пиридил]-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидро6 нафтален;

1-(4'-пиролидинолетоксифенил)-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е натриев флуорид, паратироиден хормон, хормон на растежа или секретагога на хормона на растежа.

Друг аспект на изобретението е използване на фармацевтичен състав за получаване на лекарствено средство за лечение на бозайник със заболяване, което се проявява с атрофия на костите, който състав включва:

(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-ол;

цис-1 -[6'-пиролидиноетокси-3'-пиридил]-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

Предпочитан аспект при използването е този, при който заболяването, характеризиращо се с атрофия на костите, е остеопороза.

Приложението на лекарственото средство става с предпочитание, като първото и второто съединение се приемат по принцип едновременно. Може обаче приложението да се извършва, като второто съединение се приема за период от време от около три месеца до около три години или приемането на второто съединение да е последвано от даване на първото съединение за период от време от около три месеца до около три години, без приемане на второто съединение по време на периода от около три месеца до около три години или приемането на второто съединение да е последвано от приемане на първото съединение за период от време по-голям от около три години, без приемане на второто съединение по време на периода, който е по-голям от около три години.

Фармацевтичният състав, включващ:

а. количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е:

1-(4'-пиролидиноетоксифенил)-2-(4флу орофенил)-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин;

б. количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е натриев флуорид, паратироиден хормон, хормон на растежа или секретагога на хормона на растежа, има синергитичен ефект, при което количеството само от първото съединение и количеството само от второто съединение са недостатъчни, за да се постигнат терапевтични ефекти на стимулиране на образуването на костна маса и намаляване на костната резорбция, при приемането им едновременно обаче, комбинираният ефект от количествата на първото и второ съединение е по-голям от сумата на терапевтичните ефекти, които се постигат с отделните количества от първото и второ съединение и фармацевтично приемлив разредител или носител.

Друг аспект на това изобретение е фармацевтичен състав, включващ:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е ралоксифен, тамоксифен или идоксифен, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е паратироиден хормон, хормон на растежа или секретагога на хормона на растежа, при условие, че когато първото съединение е ралоксифен, второто съединение не е паратироиден хормон.

Този състав може да се използва за получаването на лекарствено средство за лечение на заболяване, свързано с атрофия на костите.

За специалиста от тази област е ясно, че други антирезорбтивни средства (бисфосфонат, естроген, естрадиол, премарин, естрон, естриол или 17а - или 17β -етинил естрадиол) и други костни анаболни средства (андроген, андрогенен агонист/антагонист) могат да се използват заедно с всяко от средствата, описани в изобретението и по аналогичен начин. Например, антирезорбтивното средство дролоксифен може да се комбинира с отделно костно анаболно средство, какъвто е паратироидният хормон, хормонът на растежа или секретагогата на хормона на растежа.

Изразът “заболяване, характеризиращо се с атрофия на костите” се отнася до заболяване, при което нивото на костната маса е под нормалното за възрастта, според дефиницията в стандартите на Световната Здравна Организация: “Assessment! of Fracture Risk and Application to Scteening for Postmenopausal Osteoporosis (1994), Report of a World Health Organisation Study Group. World Health Organisation Technical Series 843”. (Оценка на опасността от фрактура и приложението й в скрининга за постменопаузна остеопороза (1994), Доклад на изследователска група на Световната здравна организация. Световна здравна организация Техническа серия 843 „). Също така са включени и детската идиопатия и първичната остеопороза. В лечението на остеопорозата е включена също така и профилактиката или атенюирането на дълготрайните усложнения като изкривяване на гръбначния стълб, загуба на височина, протезна хирургия и профилактика на смущения във функцията на простатата. Включена е също така и повишаване на скоростта на заздравяване на счупени кости и увеличаване степента на успешни костни трансплантати.

Изразът „заболяване (състояние), характеризиращо се с атрофия на костите” се отнася също така и до бозайник, за който е известно, че притежава значително по-висока от средната възможност за развитие на такива заболявания, както описаните по-горе, включително остеопороза (напр. постменопаузни жени, мъже над 60 години и лица, които са лекувани с лекарства, известни като предизвикващи остеопороза като страничен ефект (напр. глюкокортикоиди)).

За специалиста ще бъде ясно, че терминът костна маса в действителност се отнася до костна маса за единица площ, което понякога (въпреки, че не съвсем правилно) се отнася до костна минерална плътност.

Термините „лечение”, „лекувам” или „обработка”, както са използвани тук, включват превантивна (напр. профилактична) и палиативна терапия.

С хало се означават хлоро, бромо, йодо или флуоро.

С алкил се означава неразклонена или разклонена наситена въглеродна верига. Примерите за алкилови групи (приемайки, че обозначената дължина включва дадения пример) са: метил, етил, пропил, изопропил, бутил, вт.бутил, трет.бутил, пентил, изопентил, хексил и изохексил.

С алкокси е означен наситен алкил с неразклонена или разклонена верига, свързан с оксигрупа. Примерите за алкилови групи (приемайки, че обозначената дължина включва дадения пример) са: метокси, етокси, пропокси, изопропокси, бутокси, изобутокси, трит, бутокси, пентокси, изопентокси, хексокси и изохексокси.

Изразът „фармацевтично приемлива анионна сол” се отнася до нетоксични анионни соли, съдържащи такива аниони (без да са ограничаващи) като хлорид, бромид, йодид, сулфат, бисулфат, фосфат, ацетат, малеат, фумарат, оксалат, лактат, тартарат, цитрат, глюконатл, метансулфонат и 4-толуенсулфонат.

Изразът „фармацевтично приемлива катионна сол” се отнася до нетоксични катионни соли, съдържащи такива катиони (без да са ограничаващи), като натрий, калий, калций, магнезий, амоний или протониран бензатин (Ν,Ν’-дибензилетилендиамин), холин, етаноламин, диетаноламин, етилендиамин, мегламин (N-метилглюкамин), бенетамин (N-бензилфенетиламин), пиперазин или трометамин (2-амино-2-хидрокси-метил-1,3-пропандиол).

Плюсът или минусът, използвани в скоби в описаната номенклатура, означават посоката на въртене на поляризираната светлина от съответния стереоизомер.

Така, както са използвани тук, изразите „инертен спрямо реакцията разтворител” и „инертен разтворител”, се отнасят до разтворител, който не взаимодейства с изходните материали, реагенти, междинни съединения или продукти по начин, който би повлиял отрицателно върху добива на желания продукт.

Всеки химик ще забележи, че някои комбинации на заместители, съдържащи хетероатоми, изброени в изобретението, дефинират съединения, които ще бъдат по-малко стабилни при дадените физиологичните условия (напр. съдържащите ацетални или аминални връзки). Във връзка с това, такива съединения са помалко предпочитани.

Фармацевтичните състави на изобретението водят до по-бързо и по-голямо натрупване на костна маса, отколкото би се постигнало със същите дози само на агонисти/антагонисти на естрогена, както е описано преди или само с агент, стимулиращ повишаването на минералната костна плътност, също така описано преди. Ето защо тези състави притежават синергично действие, повишаващо костната маса и намаляващо броя на счупванията до по-висока степен от тази, която се постига с използването само на един или на друг агент. Изобретението прави значителен принос в тази област, давайки състави и методи, които повишават и поддържат костната маса, което води до предпазване, забавяне и/или регресия на остеопорозата и свързаните с нея костни нарушения.

Други характеристики и предимства на изобретението ще станат ясни от описание на изложението и патентните претенции.

Първото съединение от изобретението е агонист/антагонист на естроген от бозайник. Всеки агонист/антагонист на естрогена може да се използва като първо съединение на изобретението. Терминът агонист/антагонист на естрогена се отнася до съединения, които се свързват с рецептора на естрогена, инхибират костната промяна и предпазват от загуба на костно вещество. Тези дейности се определят лесно от специалистите в областта чрез стандартните тестове, включващи оценка на свързването на естрогенни рецептори (виж In vitro Estrogen Receptor Binding Assay, по-долу), със стандартни хистоморфометрични и денситометрични методи (виж Estrogen Agonist/ Antagonist Protocol, по-долу и Eriksen Е. F. et al., Bone Histomorphometry Raven Press, New York, 1994, pp. 1-74; Grier S. J. et al., The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry In Animals, Inv. Radiol., 1996,31(1): 50-62; Wahner

H. W. and Fogelman I., The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray

Absorptiometry in Clinical Practice, Martin Dunitz Ltd., London 1994, pp. 1-296). Голям брой от тези съединения са описани и сравнени по-долу, обаче на специалистите са известни и други агонисти/антагонисти на естрогена.

Предпочетен агонист/антагонист на естрогена е дролоксифенът: (Е)-3-[1-[4-[2-(диметиламино)етокси]фенил]-2-фенил-1-бутенил]фенол, и свързаните с него съединения, които са описани в US 5,047,431 (чието разкритие е включено тук за позоваване).

Друг предпочетен агонист/антагонист на естрогена е тамоксифен: (2)-2-[4-(1,2-дифенил-1 -бутенил)фенокси]-Н№диметилетанамин, 2-хидрокси-1,2,3-пропантрикарбоксилат (1:1) и свързаните съединения, които са описани в US 4,536,516 (чието разкритие е включено тук за позоваване). Друго свързано съединение е 4-хидрокситамоксифен, което е описано в US 4,623,660 (чието разкритие е включено тук за позоваване).

Друг предпочетен агонист/антагонист на естрогена е ралоксифен: [6-хидрокси-2-(4-хидроксифенил)бензо[Ь]тиен-3-ил][4-[2-(1пиперидинил)-етокси]фенил]метанон хидрохлорид и свързаните с него съединения, които са описани в US 4,418,068 (чието разкритие е вклю чено тук за позоваване).

Друг предпочетен агонист/антагонист на естрогена е торемифен: (Ζ)-2-[4-(4-χπορο-1,2дифенил-1 -бутенил)фенокси]-М,1Ч-диметилетанамин, 2-хидрокси-1,2,3-пропантрикарбоксилат (1:1) и свързаните съединения, които са описани в US 4,996,225 (чието разкритие е включено тук за позоваване).

Друг предпочетен агонист/антагонист на естрогена е сентхроман: 1-[2-[[4-(метокси-2,2диметил-3-фенилхроман-4-ил)фенокси]етил] пиролидин и свързаните с него съединения, които са описани в US 3,822,287 (чието разкритие е включено тук за позоваване).

Друг предпочетен агонист/антагонист на естрогена е йодоксифен: 1-[-[4-[[1-(4-йодофенил)-2-фенил-1 -бутенил]фенокси]етил]пиролидин и свързаните с него съединения, които са описани в US 4,839,155 (чието разкритие е включено тук за позоваване).

Други предпочетени агонисти/антагонисти на естрогена включват съединения с формула

в която А е подбран от СЦ и NR;

В, D и Е са подбрани независимо от СН nN;

Ye:

(а) фенил, евентуално заместен с 1-3 заместителя, независимо подбрани от R₄;

(б) нафтил, евентуално заместен с 1 -3 заместителя, независимо подбрани от R₄;

(в) С₃-С₈ циклоалкил, евентуално заместен с 1 -2 заместителя, независимо подбрани от (г) С₃-С₈ циклоалкенил, евентуално заместен с 1-2 заместителя, независимо подбрани от R₄;

(д) петатомен хетеропръстен, съдържащ до два хетероатома, подбрани от групата, съставена от -О-, -NR,- -S(O)_n-, евентуално заместен с 1-3 за местителя, независимо подбрани от R₄;

(е) шестатомен хетеропръстен, съдържащ до два хетероатома, подбрани от групата, съставена от -О-, -NIL,- -S(O)_n-, евентуално заместен с 1-3 заместителя, независимо подбрани от R₄, или (ж) двупръстенна система, състояща се от пет- или шестатомен хетероциклен пръстен, свързан с фенилов пръстен, като споменатият хетероциклен пръстен съдържа до два хетероатома, подбрани от групата, съставена от 0-, -NRj- -S(O)_n-, евентуално заместен с 1-3 заместителя, независимо подбрани от R₄;

Z,e:

(а) -(CH₂)W(CH₂)_q-;

(б) -O(CH₂)„CR₅R₆-;

(B)-O(CH₂)W(CH₂)_q-;

(r) -OCHRjCHRj-;

(д) -SCHR₂CHR₃-;

Ge:

(а) -NR^,;

(б) /(°¾\

-NZ ^X(CH₂)_n/ където n e 0, 1 или 2; m e 1, 2 или 3; Zj e -NH-, -O-, -S- или -СЦ-, евентуално свързани към съседни въглеродни атоми с един или два фенилови пръстена и, евентуално независимо заместени при въглеродния атом с един до три заместителя и, евентуално независимо заместени при азота с химично подходящ заместител, подбран от R₄, или (в) двупръстенен амин, съдържащ пет до дванадесет въглеродни атома, евентуално, свързани с мост или кондензирани и евентуално заместени с един до три заместителя, подбрани независимо от R₄, или

Z, и G задно могат да бъдат:

We:

(а) -СН₂-;

(б) -СН=СН-;

(в) -О-;

(г) -NR,-;

(Д) -S(0)„-;

(е)

О

- С (ж) -CR,(OH)-;

(з) -CONR,-;

(и) -NR,CO-;

(к) -ОС-;

R е водород или С₁-С₆ алкил;

R₂ и R₃ са независимо един от друг:

(а) водород или (б) С₍ С₄ алкил;

R₄e: ' (а) водород;

(б) халоген;

(в) Cj-C₆ алкил;

(г) С,-С₄ алкокси;

(д) С_ГС₄ ацилокси;

(е) С,-С₄ алкилтио;

(ж) С,-С₄ алкилсулфинил;

(з) С]-С₄ алкилсулфонил;

(и) хидроксиСС^С^алкил;

(й) арилСС^-С^алкил;

(к) -СО,Н;

(л) -CN;

(м) -CONHOR;

(н) -SO₂NHR;

(ο) -NH,;

(п) C_t-C₄ алкиламино;

(р) С,-С₄ диалкиламино;

(с) -NHSOjR;

(т) -NO,;

(у) арил или (ф) -ОН;

R, и означават независимо един от друг Cj-Cg алкил или заедно образуват С₃-С₁₀въглероден пръстен;

R₇ и R_g означават независимо един от 10 друг:

(а) фенил;

(б) С₃-С₁₀ въглероден пръстен, наситен или ненаситен;

(в) С₃-С₁₀ хетероциклен пръстен, съдър15 жащ до два хетероатома, подбрани от -0-, -Nи -S-;

(г) Н;

(д) Cj-Cf. алкил или (е) образуват 3- до 8-атомен азотсъдър20 жащ пръстен с R₅ или R₆;

R₇ и R_g са под формата на верига или пръстен и могат евентуално да бъдат заместени с до три заместителя, независимо подбрани от С₍-С₆ алкил, халоген, алкокси, хидрок25 си или карбокси;

пръстенът, образуван от R, и R_g, евентуално може да бъде кондензиран с фенилов пръстен, е е 0, 1 или 2;

ш е 1, 2 или 3;

η е 0, 1 или 2;

р е 0, 1,2 или 3;

q е 0, 1, 2 или 3, и оптичните им и геометрични изомери, както и нетоксичните им фармакологично приемливи киселини адитивни соли, N-окиси, естери и кватернерни амониев соли.

Предпочитани съединения от изобретението са тези с формула

в която G е:

и R₄ е Н, OH, F или Cl, а В и Е са подбрани независимо от СН и N.

Специално предпочитани съединения са: цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 -илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидинил-1 илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-ол;

цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидинил-1илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-ол;

цис-1 -[6'-пиролодиноетокси-3'-пиридил]-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

цис-6-(4-хидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол или

Дадените по-горе съединения от изобретението могат да се получат лесно съгласно дадените по-долу реакционни схеми.

Някои съединения с формула I се получават подходящо от ненаситеното междинно съединение

чрез хидрогениране с катализатор от благороден метал в инертен спрямо реакцията разтворител. Налягането и температурата не са критични и нормално хидрогенирането завършва след няколко часа при стайна температура и при налягане на водорода 20 - 80 psi (1.4 -

5.6 bar).

Хидрогенираният продукт се изолира, пречиства, ако е желателно и етерната група се отцепва с киселинен катализатор в инертна спрямо реакцията среда при температура между 0°С и 100°С, в зависимост от използвания киселинен катализатор. Установено е, че за тази реакция са подходящи бромоводород при повишени температури, борен трибромид и алуминиев хлорид при температури от 0°С до стайна температура.

Продуктът с формула I се изолира и пречиства по стандартните методи.

Междинните съединения с формула II, в които А е СН₂ и В, D и Е са СН, са описани в US 3,274,213; и. J. Med. Chem.. 10, 78 (1967); J. Med. Chem. 10,138 (1967) и J. Med. Chem. 12, 881 (1969), чието разкритие включено тук за позоваване. Те могат да бъдат получени също така и по описаните по-долу методи.

Получаването на съединенията с формула I, в която е=1, А=СН₂, Τ,_λ = ОСН₂СН₂, G = циклоалкиламин, В = СН, е показано на Схема 1. Съединенията 1-2, в които D и Е са СН, са получени чрез алкилиране на 4-бромофенол със съответния N-хлороетиламин, като е използван калиев карбонат като база в полярен, непротонен разтворител, като диметилформамид, при повишени температури. Предпочетената температура е 100°С. Съединенията 1 -2, в които D или Е или и двете са Ν, се синтезират, като се използва нуклеофилно заместване, проведено върху дибромидите (11) с използването на хидроксиетилциклоалкиламини при условия на фазов пренос, за да се получат бромоамините 1-2. Synthesis, 77, 573 (1980). Следвайки обмяна халоген-метал с използването на n-бутиллитий или метален магнезий, бромоамините (1-2) дават съответните литиеви или магнезиеви реагенти, които се оставят да реагират, при ниска температура, за предпочитане в присъствието на цезиев хлорид (реакцията протича също така и без наличието на цезиев хлорид), с 6-метокси-1-тетралон, за да се получат или карбинолите (1-3) или стирените (1-4), след обработка с киселина. Обработката на карбинолите (1-3) или на стирените (1-4) с бромиращ агент, като пиридиниев бромид пербромид, дава бромостирените (1-5). Арилови или хетероарилови цинкови хлориди или арилови или хетероарилови борни киселини реагират с бромидите (1-5) в присъствието на паладиев катализатор, като тетракистрифенилфосфин-паладий (0), за да се получат диарилстирените (1-6). [Pure and Applied Chem. 63,419, (1991) Bull. Chem. Soc. Jpn. 61, 3008-3010 (1988)]. За да се получат предпочетените съединения, в тази реакция се използват заместени фенилцинкови хлориди или заместени фенилборни киселини. Ариловите цинкови хлориди се получават чрез закаляване на съответния литиев реагент с безводен цинков хлорид. Ариловите борни киселини, които не са налице в търговската мрежа, се получават чрез закаляване на съответния ариллитиев реагент с триалкилборат, за предпочитане триметил- или триизопропилборат, последвано от обработка с водна киселина. Acta Chem. Scan. 47, 221-230 (1993). Литиевите реагенти, които не са търговско достъпни, се получават чрез реакция на халоген-метален обмен на съответния бромид или хапид с n-бутил- или трет.бутиллитий. Съответно, литиевият реагент се получава чрез хетероатомно подпомогнато литилиране, както е описано в Organic Reaction, Vol. 27, Capter 1. Каталитичното хидрогениране на 1 -6 в присъствието на паладиев хидроксид върху активен въглен, дава съответните дихидрометокси междинни съединения, които след това се деметилират с използването на борен трибромид при 0°С в метиленхлорид или на 48% бромоводород в оцетна киселина при 80-100°С, за да се получат структурите 1-7, които са цел на тази схема. Тези съединения са рацемични и могат да бъдат превърнати в енантиомери, чрез течна хроматография под високо налягане, като се използва колона с хирална неподвижна фаза, напр. колоните Chiracel OD. Съответно, може да се извърши оптично разделяне, чрез прекристализация на получените диастереомерни соли с оптичночисти киселини като 1,1'-бинафтил-2,2'-диилхидрогенфосфат.

Цис-съединенията (1-7) могат да се изомеризират до транс-съединенията при обработка с база.

Когато D и/или Е е азот, междинните съединения (формула II) и съединенията с формула I могат да се получат от съответните дихалопиридини или пиримидини, както е показано на Схема 1 .

Метиловият етер на съединението с формула I, в която е = 1, А = СЦ, Z] = ОСН₂СН₂, G = пиролидин, D, Е и В = CH, Y = Ph, могат да бъдат лесно получени, чрез първи етап на хидрогениране на нафоксидин (Upjohn & Co. 700 Portage Road Kalamazoo, MI 49001) в инертен спрямо реакцията разтворител в присъствието на катализатор от благороден метал. Налягането и температурата не са критични; обикновено реакцията се извършва в етанол при стайна температура за около 20 h при налягане на водорода 50 psi (ок. 3.5 bar).

Вторият етап е отцепване на метоксигрупата, което се извършва удобно при стайна температура с киселинен катализатор, като борен трибромид в инертен спрямо реакцията разтворител или при 80-100°С с бромоводород в оцетна киселина. След това продуктът се изолира с традиционни методи и се превръща в киселинна сол, ако е желателно.

СХЕМА 1

1.n-BuLi Ο

ArYnCI или АгВ(ОН)₂ , Pd (Ph₃P)₄

I

Съединенията с формула I, в която В е азот, се получават по методите, дадени на Схеми 2 и 3.

Синтезът на съединенията с формула I, в която В = N, е показан на Схема 2. Арилните 5 киселинни хлориди (2-1) при обработка с първични амини дават арилови вторични амиди (22), които се редуцират с литиевоалуминиев хидрид в етерни разтворители до получаването на вторичните амини (2-3). Последвалото ацилиране на 2-3 с ароилови киселинни хлориди води до третичните амиди (2-4), които циклизират в горещ фосфорен оксихлорид до дихидроизохинолинови соли (2-5). Редукцията с натриев борхидрид до алкокситетрахидроизохинолини, последвана от деметилиране с борен трибромид в метиленхлорид дава желаните съединения.

СХЕМА 2

YNH₂

RO

А(СН2)_еСОС1

A(CH2)_eCONHY

2-1

2-2

LiAIH₄

A(CH2)_eCH₂NY

A(CH2)_eCH₂NHY

1) (Η]

2) ВВгЗ

2-3

Съединение с формула I В = азот

Синтезът на съединенията с формула I, в която В = N, е описан също така в Схема 3, дадена по-долу. Вторичните амини (3-1) при ацилиране с бензилоксиароилхлориди (3-2) дават третичните амиди (3-3), които при цикли- 5 зиране с горещ фосфорен оксихлорид, дават дихидроизохинолинови соли (3-4). Редукция та на (3-4) с натриев борхидрид, последвана от дебензилиране с воден разтвор на солна киселина, дава изохинолините (3-5), които се алкилират със съответно функционализираните хлориди и деметилират с борен трибромид за получаване на желаните структури.

СХЕМА 3

A(CH2)eCH₂NHY

OCH₂CgH₅

3-4

Съединение с формула I

Други агонисти/антагонисти на естрогена са описани в US 4,133,814 (чието разкритие е включено тук за позоваване). US 4,133,814 описва производните на 2-фенил-З-ароилбензотиофен и 2-фенил-3-ароилбензотиофен-1 -оксид.

Lednicer et al., J. Med. Chem. 12, 881 (1969) описва антагонисти на естрогена със следната структура

в която R, е фенил или циклопентил и R. еН, / -ch₂ch₂-n

V-J или -СН₂СНОНСН₂ОН.

US 3,234,090 (чието разкритие е включено тук за позоваване) описва агонист/антагонист на естрогена с формула

Аг

Ph ;(θη^2η-2)

в която Ph е 1,2-фениленов радикал, Ат е моноциклена въглеродна арилова група, заместена с третичен амин-нисш алкил-окси, в който третичната аминочаст е разделена от оксичастта с най-малко два въглеродни атома, R е водород, алифатен радикал, карбоциклен арилов радикал, карбоциклен арилалифатен радикал, хетероциклен арилов радикал или хетероциклен арилалифатен радикал, групата с формула -(С_пН_{2п 2})- означава неразклонен алкиле нов радикал с три до 5 въглеродни атома и носещ групите Аг и R, соли, N-оксиди, соли на N-оксидите или кватернерните им амониеви съединения, както и метод за получаването на такива съединения.

US 3,277,106 (чието разкритие е включено тук за позоваване) описва базични етери с ефект на агонисти/антагонисти на естрогена, които са с формула ! Ph 1 (Сп^гп-г)

L..?4r в която Ph е 1,2-фениленов радикал, Аг е моноциклен арилов радикал, заместен с наймалко една амин - нисш алкил - оксигрупа, в която азотният атом е отделен от кислорода с най-малко два въглеродни атома, R е арилов радикал и частта -(СН_{2п 2})- означава нисш алкиден, образуващ с Ph шест- или седематомен пръстен, като два от въглеродните атома от пръстена носят групите Аг и R, соли, Nоксиди, соли на N-оксидите или кватернерните им амониеви съединения.

US 3,274,213 (чието разкритие е включено тук за позоваване), описва съединения агонисти/антагонисти на естрогена с формула

в която R, и R₂ са подбрани от класа съединения, съставен от нисш алкил и нисш алкил, свързани един с друг за образуването на 5- до 7-атомен наситен хетероциклен радикал.

Второто съединение от изобретението може да бъде всяко от описаните по-долу съединения, което увеличава костната маса до ниво, което е над праговата стойност за наличие на фрактура (както е описано подробно в изследването на Световната здравна органи зация „Assessment of Fracture Risk and ist Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Report of a WHO Study Group. World Health Organization Technical Series 843”).

Като второ съединение в изобретението може да се използва всеки простагландин или агонист/антагонист на простагландин. За специалиста е ясно, че могат да се използват също така и натриев флуорид, паратироиден хормон, активни фрагменти на паратироидния хормон, хормон на растежа и секретагоги на хормона на растежа. В следващите абзаци са описани с по-големи подробности примерни втори съединения на изобретението.

Като второ съединение в изобретението може да бъде използван всеки простагландин. Терминът простагландин се отнася до съединения, които са аналогични на естествените простагландини PGD_p PGD₂, PGE₂, PGE, и PGF_2a, които са полезни при лечението на остеопороза.Тези съединения се свързват с рецепторите за простагландините. Това свързване се определя лесно от специалистите по стандартните опити (напр. An S. et al., Cloning and Expression of the EP₂ Subtype of Human Receptors for Prostaglandin E₂, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993, 197(1): 263-270).

Простагландините са алициклени съединения, производни на основното съединение простаноева киселина. Въглеродните атоми на базовия простагландин се номерират последователно от карбоксилния въглероден атом през циклопентиловия пръстен до крайния въглероден атом на съседната странична верига. Наличието на оксогрупа при С-9 от циклопентиловата част е показателно за простаглрандин в Е-класа, докато PGEj съдържа транс-ненаситена двойна връзка при С_|3-С₁₄ и цис-двойна връзка на С₅-С₆ мястото.

По-долу са дадени и описани най-различни простагландини, но от специалистите се очаква да познават и други простагландини. Примерни простагландини са описани в US 4,171,331.

Norrdin et al., The Role of Prostaglandins in Bone In Vivo, Prostaglandins Leukotriene Essential Fatty Acids 41, 139-150, 1990 е преглед на костноактивните простагландини.

Като второ съединение в изобретението може да се използва всеки агонист/антагонист на простагландин. Терминът агонист/ антагонист на простагландин се отнася до съединения, които свързват простагландиновите рецептори (напр. An S. et al., Cloning and Expression of the EP₂ Subtype of Human Receptors for Prostaglandin E₂, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993, 197(1): 263270) и имитират действието на простагландин „на живо” (т.е. стимулират образуването на костно вещество и повишават костната маса). Тези действия се определят лесно от специалистите съгласно стандартните тестови процедури (виж напр. в Протокол анаболитен агент, описан по-долу, и Eriksen Е. F. et al., Bone Histomorphometry, Raven Press, New York, 1994, pp. 1-74; Grier S. J. et al., The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry In Animals, Inv. Radiol., 1996, 31(1): 50-62; Wahner H. W. and Fogelman I., The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clirical Practice., Martin Dunitz Ltd., London 1994, pp. 1-296). Голям брой от тези съединения са описани и цитирани по-долу, обаче на специалистите са известни и други агонисти/антагонисти на простагландина. Примерни агонисти/антагонисти на простагландините са описани подолу.

US 3,932,389 (чието разкритие е включено тук за позоваване) описва 2-декарбокси-2-(тетразол-5-ил)-11-дезокси-15заместени-омегапентанопростагландини, полезни с тяхното костнообразуващо действие.

US 4,018,892 (чието разкритие е включено тук за позоваване) описва р-бифенилови естери на ^-арил-^М-дихидро-РОЕ/ полезни с костнообразуващото си действие.

US 4,219,483 (чието разкритие е включено тук за позоваване) описва 2,3,6-заместени-4-пирони, полезни с костнообразуващото си действие.

US 4,132,847 (чието разкритие е включено тук за позоваване) описва 2,3,6-заместени-4-пирони, полезни с костнообразуващото си действие.

US 4,000,309 (чието разкритие е включено тук за позоваване) описва р-бифенилови естери на 16-арил-13,14-дихидро-РОЕ/ полезни с костнообразуващото си действие.

US 3,982,016 (чието разкритие е включено тук за позоваване) описва р-бифенилови естери на 16-арил-13,14-дихидро-РОЕ/, полезни с костнообразуващото си действие.

US 4,621,100 (чието разкритие е включено тук за позоваване) описва заместени циклопентани, полезни с костнообразуващото си действие.

US 5,216,183 (чието разкритие е включено тук за позоваване) описва циклопентанони, полезни с костнообразуващото си действие.

Като второ съединение в изобретението може да се използва натриев флуорид. Терминът натриев флуорид се отнася до натриев флуорид във всичките му форми (т.е. бавно освобождаващ натриев флуорид, постоянно освобождаващ натриев флуорид). Бавно освобождаващият натриев флуорид е описан в US 4,904,478 (чието разкритие е включено тук за позоваване). Действието на натриевия флуорид се определя лесно от специалистите съгласно биологичните протоколи (виж напр. Протокол анаболитен агент, описан по-долу и Eriksen Е. F. et al., Bone Histomorphometry, Raven Press,New York, 1994, pp. 1-74; Grier S. J. et al., The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry In Animals, inv. Radiol., 31(1): 50-62; Wahner H. W. and Fogelman I., The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice., Martin Dunitz Ltd., London 1994, pp. 1-296).

Като второ съединение в изобретението може да се използва всеки паратироиден хормон (РТН). Терминът паратироиден хормон се отнася до паратироиден хормон, до негови фрагменти или метаболити до структурните му аналози, които могат да стимулират образуване на кости и да доведат до увеличаване на костната маса. Това функционално действие се определя лесно от специалистите съгласно стандартните тестове (виж напр. Протокол анаболитен агент, описан по-долу, и Eriksen Е. F. et al., Bone Histomorphometry, Ravel Press, New York, 1994, pp. 1-74; Grier S. J. et al., The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry In Animals, Inv. Radiol., 1996,31(1): 50-62; Wahner H. W. and Fogelman I., The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice, Martin Dunitz Ltd., London 1994, pp. 1-296). Голям брой и различни такива съединения са описани и са дадени за позоваване по-долу, обаче на специалистите са познати и други паратироидни хормони. Примерни паратироидни хормони са включени в следните литературни източници: „ Human Parathyroid Peptide Treatment of Vertebral

Osteoporosis” Osteoporosis Int., 3 (Supp. 1): 199-203; „РТН 1-34 Treatment of Osteoporosis with Added Hormone Replacement Therapy: Biochemicl Kinetic and Histological Responses, Osteoporosis Int. 1: 162-170.

Като второ съединение в изобретението могат да бъдат използвани всякакви хормони на растежа или секретагоги на хормона на растежа. Терминът „секретагога на хормон на растежа” се отнася до съединения, стимулиращи освобождаването на хормон на растежа или имитиращи действието на хормона на растежа (напр. засилване образуването на кости, водещо до увеличаване на костната маса). Тези действия се оценяват лесно от специалистите съгласно стандартните методи за оценка (напр. както е описано по-нататък). Много от тези съединения са включени в следните публикувани патентни приложения: WO1995/ 014666; WO1995/013069; WO1994/019367; WO1994/013696 и WO1995/034311. Известни са и други хормони на растежа и секретагоги на хормона на растежа.

По-точно, предпочитана секретагога на хормона на растеж е №[1-(К)-[1,2-дихидро1-метансулфонилспиро[ЗН-индол-3,4'-пипфидин]-1 '-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)етил]-2-амино-2-метилпропанамид: МК-677.

Други предпочитани секретагоги на хормона на растеж включват:

2-амино-Н-[2-(За-(К)-бензил-2-метилЗ-оксо-2,3,3а,4,6,7-хексахидропиразоло-[4,3с]пиридин-5-ил)-1 -(К)-бензилоксиметил-2оксоетил]изобутирамид или неговата L-тартаратна сол;

2-aMHHO-N- {1 -(К)-бензилоксиметил-2[За-(К)-(4-флуоробензил)-2-метил-3-оксо2,3,3а,4,6,7-хексахидропиразоло[4,3-с]пиридин-5-ил] -2-оксоетил } -изобутирамид и

2-амино-^[2-(За-(К)-бензил-3-оксо2,3,3а,4,6,7-хексахидропиразоло-[4,3-с]пиридин-5-ил)-1-(К)-бензилоксиметил-2-оксоетил]изобутирамид.

По принцип, съединенията от изобретението могат да се получат по методи, включващи известните методи от химичната технология, особено в светлината на описанието, дадено тук.

Някои от методите за получаване, полезни при изработването на съединенията от изобретението, изискват защита на отдалечени функционални групи (напр. първичен амин, вторичен амин, карбоксил). Необходимостта от такава защита ще варира в зависимост от природата на отдалечената функционална група и условията на препаративния метод. Необходимостта от такава защита се определя лесно от специалиста в тази област. Използването на такива методи за защита и деблокиране също така са в областта на нормалните знания. За основно описание на защитните групи и тяхното използване виж Т. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991. Изходните материали и реагенти за съединенията от изобретението са също така лесно достъпни или могат бъдат лесно синтезирани от специалиста, като се използват традиционни методи от органичния синтез. Например, много от използваните тук съединения са свързани със или се получават от съединения, намиращи се в природата, към които има голям научен интерес и остра нужда в търговията и съгласно казаното много такива съединения са достъпни в търговската мрежа или са докладвани в литературата, или са лесни за получаване от други широко срещани субстанции, по методи, описани в литературата. Такива съединения включват напр. простагландини.

Някои от съединенията от изобретението притежават асиметричен въглероден атом и следователно са енантиомери или диастереомери. Диастереомерните смеси могат да бъдат разделени на отделните диастереомери на базата на физикохимичните им разлики по известни методи, напр. чрез хроматография и/ или фракционна кристализация. Енантиомерите могат да се разделят чрез превръщане на енантиомерната смес в диастереомерна смес чрез взаимодействие с подходящо оптичноактивно съединение (напр. алкохол), разделяне на диастереомерите и превръщане (напр. чрез хидролиза) на отделните диастереомери в съответните чисти енантиомери. Всички тези изомери, включително и диастереомерите, енантиомерите и смесите им се смятат за част от изобретението.

Въпреки че много от съединенията от изобретението не са йонизиращи се във физиологични условия, някои от тях са йонизиращи се при тези условия. Например, някои от съединенията на изобретението са с киселинен характер и образуват сол с фармацевтично приемлив катион. Всички тези соли влизат също така в обсега на действие на изобретението и могат да се получат по традиционни методи. Например те могат да бъдат получени просто, като се осъществи контакт между киселинните и базични части, обикновено в стехиометрично отношение, във водна, неводна или частично водна среда, както е най-подходящо. Солите се събират с филтруване, утаяване с неразтворител, последвано от филтруване, чрез изпаряване на разтворителя, или, в случая на водни разтвори, чрез лиофилизиране.

В допълнение, някои от съединенията на изобретението са базични и те образуват сол с фармацевтично приемлив анион. Всички тези соли влизат в обсега на действие на изобретението и могат да се получат по традиционните методи. Например те могат да бъдат получени просто, като се осъществи контакт между киселинните и базични части, обикновено в стехиометрично отношение, във водна, неводна или частично водна среда, както е най-подходящо. Солите се събират с филтруване, чрез утаяване с неразтворител, последвано от филтруване, чрез изпаряване на разтворителя, или, в случая на водни разтвори, чрез лиофилизиране.

В допълнение, когато съединенията от изобретението образуват хидрати или солвати, те също така влизат в обсега на действие на изобретението.

Фармацевтичните комбинации и методи от изобретението са пригодени за терапевтична употреба, като агенти, които активират обмяната на костите или предотвратяват костната резорбция, или засилват образуването на кости при бозайници, по-специално човека. Тъй като тези функции са тясно свързани с развитието на остеопорозата и нарушенията, свързани с костите, тези комбинации, по силата на действието им върху костите, предпазват, спират, регресират или реверсират остеопорозата.

Полезността на съединенията от изобретението като лекарствени агенти при лечение на състояния, свързани с атрофия на костите (напр. остеопороза) при бозайници (напр. хора, по-точно жени), се демонстрира чрез действието на съединенията от изобретението, при традиционни методи за изпитание in vitro и in vivo, описани по-долу (Протокол комбинация и последователна обработка; протокол агонист/ антагонист на естрогена; протокол анаболитен агент; in vitro оценка за свързване на рецептора за естроген и протокол за хормон на растежа/секретагога на хормон на растежа). Тези изпитания предоставят средство, чрез което въздействията на съединенията от изобретението могат да бъдат сравнени помежду си, както и с въздействията на други познати съединения. Резултатите от тези изследвания са полезни за определяне нивата на дозировките при бозайници и хора, с цел лечение на тези заболявания.

Протокол комбинация и последователна обработка

Разбира се, дадените по-долу протоколи могат да бъдат променяни от специалистите. Например могат да се използват интактни мъжки или женски плъхове, мъжки с хормонна недостатъчност (орхидектомия) или женски с такава недостатъчност (овариектомия). В допълнение, при тези изследвания могат да се използват мъжки или женски плъхове на различна възраст (напр. на 12 месечна възраст). Плъховете могат да бъдат интактни или кастрирани (овариектомирани или орхидектомирани), да им бъдат давани анаболитни агенти, като простагландин Е2 (PGE2) с различни дози (напр. 1, 3 или 6 mg/kg/ден) за известен период (напр. две седмици или два месеца), последвано от приемането на антирезорбтивен агент като дролоксифен с различни дози (напр. 1,5, 10 mg/kg/ ден) за известен период (две седмици до два дни). При кастрираните плъхове обработката може да започне на следващия ден след хирургичната намеса (с цел предпазване от загуба на костно вещество) или след време, когато вече е налице загуба на костно вещество (с цел възстановяване на костна маса).

Дадените по-долу протоколи са описани с използването на PGE₂ като костен анаболитен агент и дролоксифен като антирезорбтивен агент, но в този протокол могат да се тестват и други анаболитни и резорбтивни агенти.

Сто и четири женски плъха SpragueDawley (Charles River, Wilmington, МА) на 12 месечна възраст са симулирано оперирани или овариектомизирани (OVX) на месец 0. Три месеца след хирургичната намеса OVX-плъховете получават или простагландин Е₂ (PGE₂), известен анаболитен агент, при доза 3 mg/kg/ден (подкожна инжекция), или PGE^ при доза 3 mg/kg/ ден (подкожна инжекция), комбинирана с дро локсифен (DRO) при доза 10 mg/kg/ден (орално) в продължение на 2 месеца. След това обработката с PGE₂ прекъсва и плъховете се обработват или с носител (10% алкохол в солев разтвор) или с дролоксифен (10 mg/kg/ден, орално) в продължение на още един и половина месеца, като е описано по-долу.

Група I: Осем плъха се аутопсират на месец 0 като основни контроли.

Група II: Осем симулирано оперирани плъха се аутопсират на 3-ти месец като контроли преди обработка.

Група III: Осем симулирано оперирани плъха се обработват орално с носител (10% етанол в солев разтвор) от месеци 3 до 5 и се аутопсират на 5-ти месец.

Група IV: Осем симулирано оперирани плъха се обработват орално с носител (10% етанол в солев разтвор) от месеците 3 до 6.5 и се аутопсират на 6.5 месеца.

Група V: Осем OVX плъха се аутопсират на 3-ти месец като контроли преди обработката.

Група VI: Осем OVX плъха се обработват орално с носител (10 % етанол в солев разтвор) от месеци 3 до 5 и се аутопсират на

5-ти месец.

Група VII: Осем OVX плъха се обработват с носител (10% етанол в солев разтвор) от месеци 3 до 6.5 и се аутопсират на месец 6.5.

Група VIII: Осем OVX плъха се инжектират подкожно с 3 mg/kg/ден с PGEj от месеците 3 до 5 и се аутопсират на 5-ти месец.

Група IX: Осем OVX плъха се инжектират подкожно с 3 mg/kg/ден PGE; от месеците 3 до 5 и с носител от месец 5 до 6.5 и след това се аутопсират на месец 6.5.

Група X: Осем OVX плъха се инжектират подкожно с 3 mg/kg/ден PGE^ от месеци 3 до 5 и приемат 10 mg/kg/ден дролоксифен орално от месеци 5 до 6.5 и след това се аутопсират на месец 6.5.

Група XI: Осем OVX плъха се инжектират подкожно с 3 mg/kg/ден PGE_i и приемат 10 mg/kg/ден дролоксифен орално от месеци 3 до 5 и след това се аутопсират на месец 5.

Група XII: Осем OVX плъха се инжектират подкожно с 3 mg/kg/ден PGE, и приемат 10 mg/kg/ден дролоксифен орално от месеци 3 до 5 и носител от месеци 5 до 6.5 и след това се аутопсират на месец 6.5.

Група XIII: Осем OVX плъха се инжектират подкожно с 3 mg/kg/ден PGE^ и приемат 10 mg/kg/ден дролоксифен орално от месеци 3 до 5 и след това само дролоксифен от месец 5 до 6.5 и се аутопсират на месец 6.5.

И двата праха - PGE2 (Cayman Chemicals Co. Ann Arbor, MI) или дролоксифен (Pfizer Inc. Groton, CT), първоначално се разтварят в 100% етанол и след това се разреждат със солев разтвор до желаните концентрации (крайната концентрация на етанола е 10%). Разтворът от PGE се инжектира дневно в гърба при доза 1 mg/kg. Разтворът на дролоксифен се дава дневно, перорално при доза 1 ml/плъх. На всички плъхове се инжектира подкожно 10 mg/kg калцеин 12 и 2 дни преди умъртвяването (флуорохромен костен маркер, Sigma Chemical Co. St. Louis МО), за да се изследват динамичните промени в костната тъкан.

Плъховете се умъртвяват под анастезия с кетамин. Определят се следните крайни състояния:

Минерални измервания на бедрената кост: При аутопсията се отстранява дясната бедрена кост и се сканира, като се използва рентгенова абсорбциометрия с двойна енергия (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, МА), с програма “Regional High Resolution Scan” (Hologic Inc., Waltham, МА). Големината на сканиращото поле е 5.08 х 1.906 cm, разрешаващата способност е 0.0254 х 0.0127 cm и скоростта на сканиране е 7.25 mm/s. Изображенията от сканирането на бедрената кост се анализират и се определят: костно минерално съдържание (ВМС), костна минерална плътност (BMD) на цялата бедрена кост (WF), дистална феморална метафиза (DFM), феморалната кост (FS) и проксималната част на фемора (PF).

Костни минерални измервания на поясните прешлени: Използвана е рентгенова абсорбциометрия с двойна енергия (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, МА), с програма “Regional High Resolution Scan” (Hologic Inc., Waltham, МА) за определяне на костната площ, костното минерално съдържание (ВМС) и костната минерална плътност (BMD) на цялата поясна част на гръбначния стълб и на всеки от шестте поясни прешлена (LV1-6) на анестезирани плъхове. Плъховете се анестезират чрез инжектиране (парентерално) на 1 ml/kg смес от кетамин/ромпун (в отношение 4 към

3) и след това се поставят върху платформата за плъхове. Големината на сканиращото поле е 5.08 х 1.906 cm, разрешаващата способност е 0.0254 х 0.0127 cm и скоростта на сканиране е 7.25 mm/s. Получава се цялостно изображение на поясната част на гръбначния стълб, което се анализира. Определят се костната площ (ВА) и костното минерално съдържание (ВМС), а костната минерална плътност се изчислява (ВМС се разделя на ВА) за цялата поясна част и за всеки от шестте поясни прешлена (LV1-6).

Хистоморфометричен анализ на спонгиозното вещество на проксималната тибиална метафиза: Чрез аутопсия се отстранява дясната тибиа, освобождава се от мускули и се нарязва на три части. Проксималната част на тибията се фиксира в 70% етанол, дехидратира се в етанол с повишаваща се концентрация, обезмаслява се в ацетон, след това се включва в метилметакрилат (Eastman Organic Chemicals, Rochester, N.Y.). Правят се фронтални срезове на проксималната тибиална метафиза с дебелини 4 и 10 pm, с микротом на фирмата Reichert-Jung Polycut S. За хистоморфометрията на спонгиозното вещество се използват 1 срез от 4 цт и 1 срез от 10 pm от всеки плъх. Срезът от 4 pm се багри с модифицирано багрило на Masson’s Trichrome, докато 10 pm-овия срез остава необагрен.

За статичните и динамични хистоморфометрични измервания на вторичната спонгиоза на проксималната тибиална метафиза на разстояние от 1.2 и 3.6 mm дистално от прехода растежен хрущял - епифиза се използва хистоморфометричната система Bioquant OS/2 на фирмата (R & М. biometrics, Inc., Nashville, TN). Първите 1.2 mm от областта на тибиалната метафиза трябва да се пропуснат, с цел да се ограничат измерванията до вторичната спонгиоза. 4 pm-ови срезове са използвани за определяне на показателите, свързани с костния обем, структурата на костта, и резорбцията на костта, докато 10 pm-овите срезове са използвани за определяне на показателите, свързани с образуването на костта и промяната на костно вещество.

I. Измервания и изчисления, свързани с трабекуларния костен обем и структура:

1. Обща метафизна площ (TV, mm²): метафизната площ между 1.2 и 3.6 mm дистално от прехода растежен хрущял - епифиза.

2. Трабекуларна костна площ (ВV, mnf): общата площ на трабекулите в TV.

3. Трабекуларен костен периметър (BS, mm) дължината на общия периметър на трабекулите.

4. Трабекуларен костен обем (BT/TV, %): BV : TV х 100.

5. Трабекуларен костен брой (TBN, бр./ mm): 1.199 / 2 х BS / TV.

6. Трабекуларна костна дебелина (ТВТ, gm): (2000 / 1.199) х (BV / BS).

7. Трабекуларно костно разделяне (TBS, mm): (2000 х 1.199) - (TV - BV).

II. Измервания и изчисления, свързани с костната резорбция

1. Брой на остеокластите (OCN, бр.): общият брой на остеокластите в цялата метафизна област.

2. Периметър на остеокластите (ОСР, mm): дължината на трабекуларния периметър, покрит с остеокласт.

3. Брой на остеокласти/mm (OCN/mm, бр./mm): OCN/BS.

Процентен остеокластен периметър (%ОСР, %): ОСР / BS х 100

III. Измервания и изчисления, свързани с образуването на костите и костната промяна

1. Периметър с единично белязан калцеин (SLS, mm): общата дължина на трабекуларния периметър, маркиран с единично белязан калцеин.

2. Периметър с двойно белязан калцеин (DLS, mm): общата дължина на трабекуларния диаметър, маркиран с двойно белязан калце- ин.

3. Вътрешнобелязана ширина (ILW,g m): средното разстояние между два белязани калцеина.

4. Процентен минерализиран периметър (PMS, % ):(SLS/2 + DLS) / BS х 100.

5. Скорост на минерално отлагане (MAR, gm/ден): ILW/белязани интервали.

6. Скорост на образуване на костите/единица повърхност (BFR/BS, цт²/ден/ gm): (SLS/ 2 + DLS) х MAR/BS.

7. Скорост на обмяна на костите (BTR, %/у): (SLS/2 + DLS) х MAR / BV х 100.

Статистика

Статистическите данни могат да се изчислят, като се използва програмата StatView 4.0 (Abacus Concepts Inc., Berkeley, СА). За да се сравняват разликите между групите, е из ползван анализ на променливите (ANOVA) тест, последван от Fisher’s PLSD.

Протокол агонист/антагонист на естрогена

Агонистите/антагонисти на естрогена са клас съединения, които инхибират костното превръщане и предотвратяват загуба на костно вещество, предизвикана от недостатък на естроген. Широко е използван модел на загуба на костно вещество при овариектомирани плъхове като модел за постменопаузна костна загуба. Като се използва този модел, може да се тества ефикасността на съединенията агонисти/антагонисти на естрогена при предотвратяване на костни загуби и инхибиране на костната резорбция.

При тези изследвания са използвани плъхове Sprague-Dawley (Charles River, Wilmington, МА) на различна възраст (напр. 5-месечни). По време на експеримента плъховете се разполагат в отделни клетки с размери 20 cm х 32 cm х 20 cm. На всички плъхове се осигурява свободен достъп до вода и гранулирана храна (Agway ProLAb 3000, Agway County Food, Inc., Syracuse, N.Y.), съдържаща 0.97% калций, 0.85% фосфор и 1.05 IU/g витамин θ3·

Една група плъхове (8 до 10) са оперирани симулативно и са обработени перорално с носител (10% етанол и 90% солев разтвор, 1 ml/ден), докато останалите плъхове са билатерално овариектомизирани (OVX) и обработени или с носител (перорално), 17 β-естрадиол ( Sigma, Е-8876, Е2, 30 gg/kg, дневно, подкожна инжекция) или с агонисти/антагонисти на естрогена (като дролоксифен с дози 5, 10 или 20 mg/kg дневно перорално) за известен период от време (напр. 4 седмици). На всички плъхове е инжектирано подкожно 10 mg/kg калцеин (флуорохромен костен маркер) 12 и 2 дни преди умъртвяването им с цел да се изследват динамичните промени в костната тъкан. След 4 седмици обработка плъховете се аутопсират. Определени са следните параметри:

Повишаване на телесното тегло: телесното тегло при аутопсията минус телесното тегло при хирургичната намеса.

Тегло и хистология на матката: По време на аутопсията от всеки плъх се отстранява матката и веднага се претегля. След това матката се препарира за хистологични измерва ния, като площ на напречното сечение на тъканта на матката, дебелина на стромата и дебелина на епитела на лумена.

Общ серумен холестерол: Кръвта се получава чрез сърдечна пункция и се оставя да се съсири при 4°С, след това се центрофугира при 2 000 g за 10 min. Серумните образци се анализират за общ серумен холестерол, като се използва високочувствителен калориметричен анализ за холестерол (Boehringer Manngeim Biochemicals, Indianapolis, IN).

Минерални измервания на бедрената кост: При аутопсията се отстранява дясната бедрена кост от всеки плъх и се сканира, като се използва рентгенова абсорбциометрия с двойна енергия (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, МА), с програма “Regional High Resolution Scan” (Hologic Inc., Waltham, MA). Големината на сканиращото поле е 5.08 х 1.902 cm, разрешаващата способност е 0.0254 х 0.0127 cm и скоростта на сканиране е 7.25 mm/s. Изображенията от сканирането на бедрената кост се анализират и се определят: костно минерално съдържание (ВМС), костна минерална плътност (BMD) на цялата бедрена кост (WF), дистална феморална метафиза (DFM), феморалната кост (FS) и проксималната част на фемора (PF).

Хистоморфометричен анализ на спонгиозното вещество на проксималната тибиална метафиза: Чрез аутопсия се отстранява дясната тибия, освобождава се от мускули и се нарязва на три части. Проксималната част на тибията се фиксира в 70% етанол, дехидратира се в етанол с повишаваща се концентрация, обезмаслява се в ацетон, след това се включва в метилметакрилат (Eastman Organic Chemicals, Rochester, N.Y.). Правят се фронтални срезове на проксималната тибиална метафиза с дебелини 4 и 10 pm, с микротом на фирмата Reichert-Jung Polycut S. За хистоморфометрията на спонгиозното вещество се използват: 1 срез от 4 pm и 1 срез от 10 pm от всеки плъх. Срезът от 4 pm се багри с модифицирано багрило на Masson’s Trichrome, докато 10 pm-овия срез остава необагрен.

За статичните и динамични хистоморфометрични измервания на вторичната спонгиоза на проксималната тибиална метафиза на разстояние от 1.2 и 3.6 mm дистално от прехода растежен хрущял - епифиза се използва хистоморфометричната система Bioquant OS/2 на фирмата (R & М biometrics, Inc., Nashville, TN). Първият 1.2 mm от метафизалната област на тибията трябва да се пропусне, с цел да се ограничат измерванията до вторичната спонгиоза. 4 pm-ови срезове са използвани за определяне индексите, свързани с костния обем, структурата на костта, и резорбцията на костта, докато 10 pm-овите срезове са използвани за определяне индексите, свързани с образуването на костта и промяната на костно вещество.

2. Трабекуларна костна площ (В V, mrri²): общата площ на трабекулите в TV.

4. Трабекуларен костен обем (BT/TV, %): BV : TV х 100.

5. Трабекуларен костен брой (TBN, бр./mm): 1.199 / 2 х BS / TV.

6. Трабекуларна костна дебелина (ТВТ, pm): (2000 / 1.199) х (BV / BS).

3. Брой на остеокласти/mm (OCN/mm, бр./mm): OCN I BS.

4. Процентен остеокластен периметър (%ОСР, %): ОСР / BS х 100.

III. Измервания и изчисления, свързани с образуването на костите и костната обмяна

2. Периметър с двойно белязан калцеин (DLS, mm): общата дължина на трабекуларния диаметър, маркиран с двойно белязан калцеин.

3. Вътрешнобелязана ширина (ILW, pm):

средното разстояние между два белязани калцеина.

4. Процентен минерализиран периметър (PMS, %):(SLS/2 + DLS) / BS х 100.

5. Скорост на минерално отлагане (MAR, μπι/ден): ILW/белязани интервали.

6. Скорост на образуване на костите/единица повърхност (BFR/BS, μ т²/ден/р т): (SLS/ 2 + DLS) х MAR/BS.

7. Скорост на промяна на костите (BTR, %/у): (SLS/2 + DLS) х MAR / BV х 100.

Статистика

Статистическите данни могат да се изчислят, като се използва програмата StatView 40 (Abacus Concepts Inc., Berkeley, СА). За да се сравнят разликите между групите, е използван анализ на променливите (ANOVA) тест, последван от Fisher’s PLSD.

Протокол на анаболитния агент

Действието на анаболитните костни агенти при стимулиране образуването на костите и нарастването на костната маса може да се изследва при интактни мъжки или женски плъхове, при мъжки плъхове с недостиг на полов хормон (орхидектомия) или при женски плъхове с недостиг на полов хормон (овариектомия).

При това изследване са използвани мъжки или женски плъхове на различни възрасти (например тримесечни). Плъховете могат да бъдат интактни или кастрирани (овариектомирани или орхидектомирани), да им бъдат давани анаболитни агенти, като простагландин Е2 (PGE2) с различни дози (напр. 1, 3 или 6 mg/kg/ден) за известен период (напр. две седмици до два месеца). При кастрираните плъхове обработката може да започне на следващия ден след хирургичната намеса (с цел предпазване от загуба на костно вещество) или по време, когато вече е налице загуба на костна маса (с цел възстановяване на костна маса). По време на това изследване на всички плъхове се осигурява свободен достъп до вода и гранулирана храна (Teklad Rodent Diet # 8064, Harlan Teklad, Madison, WI), съдържаща 1.46% калций, 0.99% фосфор и 4.96 IU/g витамин D₃. На всички плъхове е инжектиран подкожно 10 mg/kg калцеин на 12 и 2 ден преди умъртвяването.

Плъховете се умъртвяват. Определят се следните показатели:

Минерални измервания на бедрената кост: При аутопсията се отстранява дясната бедрена кост от всеки плъх и се сканира, като се из ползва рентгенова абсорбциометрия с двойна енергия (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, МА), с програма “Regional High Resolution Scan” (Hologic Inc., Waltham, MA). Големината на сканиращото поле е 5.08 х 1.902 cm, разрешаващата способност е 0.0254 х 0.0127 cm и скоростта на сканиране е 7.25 mm/s. Изображенията от сканирането на бедрената кост се анализират и се определят: костно минерално съдържание (ВМС), костна минерална плътност (BMD) на цялата бедрена кост (WF), дисталната феморална метафиза (DFM), феморалната кост (FS) и проксималната част на фемора (PF).

Хистоморфометричен анализ на спонгиозното вещество на проксималната тибиална метафиза: Чрез аутопсия се отстранява дясната тибиа, освобождава се от мускули и се нарязва на три части. Проксималната тибия се фиксира в 70% етанол, дехидратира се в етанол с повишаваща се концентрация, обезмаслява се в ацетон, след това се включва в метилметакрилат (Eastman Organic Chemicals, Rochester, N.Y.). Правят се фронтални срезове на проксималната тибиална метафиза с дебелини 4 и 10 pm, с микротом на фирмата Reichert-Jung Polycut S. За хистоморфометрията на гъбестата кост се използват 1 срез от 4 pm и 1 срез от 10 pm от всеки плъх. Срезът от 4 pm се багри с модифицирано багрило на Masson’s Trichrome, докато 10 pm-овия срез остава необагрен.

За статичните и динамични хистоморфометрични измервания на вторичната спонгиоза на проксималната тибиална метафиза на разстояние от 1.2 и 3.6 mm дистално от прехода растежен хрущял - епифиза се използва хистоморфометричната система Bioquant OS/ 2 на фирмата (R & М biometrics, Inc., Nashville, TN). Първият 1.2 mm от метафизалната област на тибията трябва да се пропусне, с цел да се ограничат измерванията до вторичната спонгиоза. 4рт-ови срезове са използвани за определяне индексите, свързани с костния обем, структурата на костта, и резорбцията на костта, докато 10 рт-овите срезове са използвани за определяне индексите, свързани с образуването на костта и промяната на костно вещество.

1. Обща метафизна площ (TV, mni²):

метафизната площ между 1.2 и 3.6 mm дистално от прехода растежен хрущял - метафиза.

2. Трабекуларна костна площ (BV, mm²): общата площ на трабекулите в TV.

4. Трабекуларен костен обем (BT/TV, %): BV : TV х 100.

Ί. Трабекуларно костно разделяне (TBS, mm): (2000 х 1.199) - (TV - BV).

3. Брой на остеокласти/mm (OCN/mm, бр./mm): OCN / BS.

2. Периметър с двойно белязан калцеин (DLS, mm): общата дължина на трабекуларния диаметър, маркиран с двойнобелязан калцеин.

3. Вътрешнобелязана ширина (ILW, pm): средното разстояние между два белязани калцеина.

4. Процентен минерализиран периметър (PMS, % ):(SLS/2 + DLS) I BS x 100.

5. Скорост на минерално отлагане (MAR, pm/ден): ILWZ/белязани интервали.

6. Скорост на образуване на костите/единица повърхност (BFR/BS, рт²/ден/ pm): (SLS/ 2 + DLS) х MAR/BS.

Статистика

Статистическите данни могат да се изчислят, като се използва програмата Stat View

4.0 (Abacus Concepts Inc., Berkeley, СА). 3a да се сравнят разликите между групите, е използван анализ на променливите (ANOVA) тест, последван от Fisher’s PLSD.

Оценка за свързване in vitro на естрогеновия рецептор

За определяне на афинитета към свързване с рецептора на естрогена на съединенията от изобретението е използван in vitro тест за оценка на свързването на естрогенен рецептор, при който се измерва способността на съединенията агонисти/антагонисти на естрогена от представеното изобретение, да изместват [ЗН]-естрадиол от рецептор на човешки естроген, получен чрез рекомбинантни методи в дрожди. Използваните материали при това изследване са: (1) Буфер за изследването, TD0.3 (съдържащ 10 пМ (наномола) Трие, pH 7.6, 0.3 М калиев хлорид и 5 тМ дитиотреитол (DTT) (Sigma Co.), pH 7.6); (2) използваният радиолиганд е [ЗН]-естрадиол, получен от New England Nuclear; (3) използваният студен лиганд е естрадиол, получен от Sigma; (4) рекомбинантен човешки рецептор за естроген, hER.

Приготвя се разтвор на тестваното съединение в TD-0.3 с 4% диметилсулфоксид и 16% етанол. Триетилацетатен естрадиол се разтваря в TD-0.3, така че крайната концентрация при опита да бъде 5 пМ. hER се разтваря също в TD-0.3, така че във всяко опитно гнездо общото количество протеин да бъде 4-10 pg. Като се използват плочи за микротитруване, всеки инкубат получава 50 pl студен естрадиол (неспецифично свързване) или разтвор от съединението, 20 pl от стрития естрадиол и 30 pl разтвор на hER. Всяка плака съдържа трикратно общото свързване и съединението в променящи са концентрации. Плаките се инкубират една нощ при 4°С. След това реакцията на свързване се прекратява чрез прибавянето и смесването на 100 ml 3% хидроксилапатит в 10 тМ трис-буфер, pH 7.6 и инкубиране в продължение на 15 min при 4°С. Смесите се центрофугират и утайката се промива четирикратно с 1% тритон-Х 100 в 10 тМ трие, pH 7.6. Хидроксилапатитовите утайки се суспендират в Ecoscint А и радиоактивността се определя с бета сцинтиграфия. Определя се средната стойност от всички трикратни опита (импулса за минута). Специфичното свързване се изчислява, като се извади неспецифичните импулси за минута (дефинирани като импулси, които остават след разделяне на реакционната смес, съдържаща рекомбинантен рецептор, радиолиганд и излишък от немаркиран лиганд) от общия брой свързани импулси (дефинирани като импулси, които остават след разделянето на реакционната смес, съдържаща само рекомбинантен рецептор и радиолиганд). Способността на съединението се определя посредством IC50 определения (концентрацията от съединението, необходима за инхибиране на 50% от общата специфична триетилацетатно свързан естрадиол). Специфичното свързване в присъствието на съединение с променящи се концентрации се определя и изчислява като процентно специфично свързване от общото специфично радиолигандно свързване.

Данните са представени графично като процентно инхибиране на съединението (линеен мащаб) спрямо концентрацията на съединението (логаритмичен мащаб).

Протокол хормон на растежа/секретагога на хормона на растежа

С този протокол се идентифицират съединенията, които притежават способността да стимулират секрецията на хормон на растежа от култивирани клетки на хипофизната жлеза. Този тест е полезен също така за сравнение със стандарти, за определяне нивата на дозировите. От 6-седмични плъхове Wistar се изолират клетки от хипофизата. След обезглавяването, предните дялове на хипофизата се отстраняват в студен, стерилен балансиран солев разтвор на Hank (HBSS). Тъканите се нарязват фино, след това се подлагат на два цикъла механично подпомогнато ензимно диспергиране с използване на 10 ед./ml (U/ml) бактериална протеаза (ЕС 3.4.24.4, Sigma Р-6141) в HBSS. Тъканно-ензимната смес се разбърква в центрофужна колба при 30 об./min в 5%СО₂атмосфера при около 37°С за около 30 min, с ръчно стриване след около 15 min и след около 30 min с използване на 10-милилитрова пипета. Сместа се центрофугира при около 200 g за около 5 min. Прибавя се конски серум към супернатантата за неутрализиране на излишната протеаза. Утайката се ресуспендира в свежа протеаза, разбърква се около 30 min повече при горните условия и се стрива ръчно, накрая през игла 23 калибър. Отново се прибавя конски серум, след това клетките от двете смилания се събират, утаяват (200 g за около 15 min), промиват, ресуспендират в културална среда и се броят. Клетките се посяват в количество 6.0-6.5 х 10⁴ клетки на cm² в 48-гнездова плоча на Костар и се култивират в продължение на 3-4 дни в модифирана от Дулбеко среда на Йигъл (Dulbecco’s Modified Eagle Medium = D-MEM) c добавени 4.5 g/1 глюкоза, 10% конски серум, 2.5% серум от говежди зародиш, 1% неосновни аминокиселини, 100 ед./ml нистатин и 50 mg/ml гентамицин сулфат, преди изследване за секреция на хормон на растежа.

Точно преди опита, културалните гнезда се измиват двукратно, след това се уравновесяват за около 30 min в освобождаваща среда (D-MEM, буферирана с 25 mM Hepes, pH 7.4 и съдържаща 0.5% говежди серумен албумин при 37°С). Съединенията, които ще се тестват, се разтварят в диметилсулфоксид, след това се разреждат в предварително затоплена освобождаваща среда. Опитите се извършват четирикратно. Експериментите се инициират с прибавяне на 0.5 ml освобождаваща среда (с носител или с тествано съединение) към всяко културално гнездо. Провежда се инкубиране при около 37°С в продължение на 15 min, след това се прекратява чрез отстраняване на културалната среда, която се центрофугира при 2 000 g за около 15 min, за да се отстрани клетъчният материал. Концентрациите на хормона на растеж на плъхове в супранатантите се определя със стандартен радиоимунологичен метод с използване на сравнителен препарат за хормон на растеж на плъх (NIDDK-rGH-PR-2) и антисерум на хормон на растеж при плъх, произведен в маймуни (NIDDK-anti-rGH-S-5), получен от Dr. А. Parlow (Harbor-UCLA Medical Center, Torrence, СА). Допълнителен хормон на растеж на плъх (1.5 ед./mg, #G2414, Scripps Labs, San Diego, СА) е йодиран до специфична активност, приблизително 30 gCi/ gg по метода на хроламин Т за използване като индикатор. Имунни комплекси са получени чрез прибавяне на кози антисерум към маймунски IgG (Organon Teknika, Durham, NC), плюс полиетиленгликол, MW 10 000 - 20 000 до крайна концентрация 4.3%; събирането се извършва с центрофугиране. При този опит работните граници са 0.08 - 2.5 gg хормон на растеж на плъх за епруветка над основните нива. Активните съединения характерно стимулират осво27 бождаване на хормон на растежа по-голямо от

1.4 пъти.

Справка: Cheng, К., Chan, W.-S., Barreto, Jr., A., Convey, E.M., Smith, R.G. 1989.

Тест за екзогенно стимулирано освобождаване на хормон на растежа при плъхове след интравенозно приемане на тестваните съединения

Женски плъхове Sprague-Dawley (Charles River Laboratory, Wilmington, МА) на 21-дневна възраст се оставят да се аклиматизират към условията на местния вивариум (24°С, цикъл: 12 h светло, 12 h тъмно) в продължение на около 1 седмица преди тестване със съединенията. На всички плъхове е осигурена вода и гранулирана храна (Agway Country Food, Syracuse, NY) ad libitum.

В деня на експеримента тестовите съединения се разтварят в носител, съдържащ 1 % етанол, 1 тМ оцетна киселина и 0.1% албумин от говежди серум в солев разтвор. Всяко съединение е тествано трикратно. Плъховете се претеглят и анестезират чрез интрапарентерално инжектиране на натриев пентобарбитал (Nembutol, 50 mg/kg телесно тегло). 14 min след приемането на анестетика, се взема кръвна проба чрез убождане на върха на опашката, като кръвта се оставя да капе в микроцентрофужна епруветка (основна кръвна проба, приблизително 100 μΐ). 15 min след приемането на анестетика се подава тестваното съединение чрез инжектиране в опашната вена при общ инжекционен обем 1 ml/kg телесно тегло. От опашката се вземат допълнителни кръвни проби на 5, 10 и 15 минута след приемане на съединението. Кръвните проби се държат върху лед, преди отделяне на серума с центрофугиране (1430 g за 10 min при 10°С). Серумът се съхранява при -80°С, а определянето на серумния хормон на растежа се извършва радиоимунологично, както е описано по-горе и по-долу.

Оценка на освобождаването на екзогенно стимулиран хормон на растежа при куче след орално приемане

В деня на експеримента тестовото съединение се претегля, за определяне на съответната доза, и се разтваря във вода. Дозите се подават при обем 0.5 ml/kg през сонда на 4 кучета за всеки режим на дозиране. От югуларната вена се събират кръвни проби (2 ml) чрез директно пробиване на вената преди приемането и на 0.08, 0.17, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, и 8 h след приемането на дозата, като се използват 2 ml вакутейнери, съдържащи литиев хепарин. Получената плазма се съхранява при -20°С до анализа.

Измерване на заешки хормон на растеж Концентрациите на заешки хормон на растежа се определят по стандартния радиоимунологичен протокол, като се използва заешки хормон на растежа (антиген за йодирането и сравнителен препарат AFP-1983В) и заешки антисерум на хормона на растеж, получен в маймуни (AFP-21452578), получен от Dr. Parlow (Harbor-UCLA Medical Center, Torrence, СА). Трейсерът е получен чрез хлорамин Tйодиране на заешки хормон на растежа до специфична активност 20-40 pCi/pg. Имунните комплекси са получени чрез смесване на кози антисерум с IgG от маймуна (Organon Teknika, Durham, NC) плюс полетиленгликол, MW 10000 - 20000 до крайна концентрация 4.3%, събирането се извършва с центрофугиране. Опитът е с работни граници от 0.08 - 2.5 pg заешки хормон на растежа/епруветка.

Приемането на съединенията от изобретението може да се извърши по всеки метод, който доставя съединение от изобретението системично и/или местно. Тези методи включват орални, парентерални, интрадуоденални и други пътища на приемане. В основни линии, съединенията от изобретението се приемат орално, но може да се използва и парентерално приемане (напр. интравенозно, мускулно, подкожно или интрамедуларно) например там, където оралното приемане е неподходящо при дадения обект или когато пациентът не може да погълне лекарството. Двете различни съединения от изобретението могат да бъдат приемани едновременно или последователно, независимо от реда или може да се приеме фармацевтичен състав, включващ първото съединение, както е описано по-горе и второто, съединение, както е описано по-горе във фармацевтично приемлив носител.

Например костният анаболитен агент може да се използва самостоятелно или в комбинация с антирезорбтивен агент, в продължение на три месеца до три години, последвано от приемането само на антирезорбтивен агент, в продължение на три месеца до три години, последвано от евентуално повтаряне на пълния цикъл на лечение. Съответно, като пример, костният анаболитен агент може да се изпол зва самостоятелно или в комбинация с антирезорбтивен агент в продължение на три месеца до три години, последвано от приемане само на антирезорбтивен агент за останалата част от живота на пациента. Например, в един от предпочитаните начини на приемане, второто съединение, което е описано по-горе (напр. PGE₂), може да се приема веднъж дневно, а първото съединение, което е описано по-горе (напр. агонист/антагонист на естрогена), може да се приема дневно в единична или многократна дозировка. Съответно, като пример, в друг, предпочитан метод за приемане, двете съединения могат да се приемат последователно, докато второто съединение, както е описано по-горе (напр. PGE₂), може да се приема веднъж дневно за даден период време, достатъчен за повишаване на костната маса до ниво, което е над праговата стойност за фрактура на костите (World Health Organization Study “Assessment of Fracture Risk and ist Application to Screening for Postmenopuasal Osteoporosis (1994), Доклад на World Health Organization Study Group. World Health Organization Technical Series 843”), последвано от приемането на първото съединение, както е описано по-горе (напр. агонист/антагонист на естрогена), дневно, в единична или многократна дозировка. Предпочетено е, второто съединение, както е описано по-горе (напр. PGE₂), да се взема веднъж дневно под форма за бързо усвояване, например, форма за орално приемане (за предпочитане е форма, при която се постига постепенно отделяне на активната съставка, да се избягва).

Във всеки от случаите количеството и режимът на приемане на съединенията ще зависят, разбира се, от субекта, който ще се третира, от сериозността на засягането, от начина на приемане и от решението на предписващия терапевт. Поради различията от пациент до пациент, дадените по-долу дозировки трябва да се разглеждат като водещи, а терапевтът може да разделя дозите на лекарственото вещество, в зависимост от отделния пациент, за да постигне действието им (напр. увеличаване на костната маса). При уточняване на желаната степен на действие терапевтът трябва да балансира различни фактори, като стартово ниво на костната маса, възраст на пациента, наличие на съществуващи преди това заболявания, както и наличие на други заболявания (напр. сърдечносъдови). Например приемането на агонист/ антагонист на естрогена може да доведе до ползи за сърдечносъдовата система, особено при жени в постменопаузен период.

Количеството на антирезорбтивния агент, който ще се използва, се определя от неговото действие като инхибиращ агент на загубите на костно вещество. Това действие се определя посредством индивидуалната фармакокинетика на съединението и неговата минимална максимална доза при инхибиране на загубата на костна маса, като се използва протокол, както описания по-горе (Протокол агонист/антагонист на естрогена).

По принцип, ефективната дозировка за проявяване действието на изобретението, например за костно-резорбтивното действие на изобретението, за първото съединение от изобретението, е в границите от 0.01 до 200 mg/kg/ ден, за предпочитане от 0.5 до 100 mg/kg/ден.

По-точно, ефективната дозировка задролоксифен е в границите от 0.1 до 40 mg/kg/ден, за предпочитане от 0.1 до 5 mg/kg/ден.

По-точно, ефективната дозировка за ралоксифен е в границите от 0.1 до 100 mg/kg/ ден, за предпочитане, от 0.1 до 10 mg/kg/ден.

По-точно, ефективната дозировка за тамоксифен е в границите от 0.1 до 100 mg/kg/ ден, за предпочитане, от 0.1 до 5 mg/kg/ден.

По-точно, ефективната дозировка за: цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

цис-1 -[6’-пиролодиноетокси-3 ’-пиридил]-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

цис-6-(4-хидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 -илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол или

1-(4'-пиролидинолетоксифенил)-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетра-хидроизохинолин е в границите от 0.0001 до 100 mg/kg/ ден, за предпочитане от 0.001 до 10 mg/kg/ ден.

По-точно, ефективната дозировка за 4хидрокситамоксифен е в границите от 0.0001 до 100 mg/kg/ден, за предпочитане от 0.001 до 10 mg/kg/ден.

По принцип, костният анаболитен агент (напр. PGE₂) се използва в такова количество, което е достатъчно да увеличи костната маса до ниво, което е над праговата стойност за фрактура на костите (подробно описано в изследването на Световната здравна организация, цитирано по-горе).

По-точно, ефективната доза за PGEj е в границите от 0.001 до 1 mg/kg/ден, за предпочитане от 0.01 до 1 mg/kg/ден.

По-точно, ефективната дозировка за 3S(3-хидрокси-4-фенилбутил)-2К-[6-(2Н-тетразол-5-ил)хексил]циклопентанон е в границите от 0.001 до 20 mg/kg/ден, за предпочитане от 0.01 до 10 mg/kg/ден.

По-точно, ефективната дозировка за натриев флуорид е в границите от 0.01 до 50 mg/ kg/ден, за предпочитане от 0.2 до 10 mg/kg/ ден.

По-точно, ефективната дозировка за паратироиден хормон и метаболити, както и за техни фрагменти е в границите от 0.00001 mg/ kg/ден, за предпочитане от 0.001 до 0.5 mg/ kg/ден.

По-точно, ефективната доза за хормон на растежа или за секретагоги на хормон на растежа е в границите от 0.0001 до 100 mg/kg/ ден, за предпочитане от 0.1 до 5 mg/kg/ден.

По принцип, съединенията от изобретението се приемат под формата на фармацевтичен състав, включващ най-малко едно от съединенията от изобретението заедно с фармацевтично приемлив носител или разредител. По този начин, съединенията от изобретението могат да бъдат приемани отделно или заедно във всяка традиционна дозирана форма за орално, парентерално или трансдермално приемане.

За орално приемане фармацевтичният състав може да бъде под формата на разтвори, суспензии, таблети, хапчета, капсули, прахове и др. Таблетите, съдържащи различни ексципиенти, като натриев цитрат, калциев карбонат и калциев фосфат, се използват заедно с различни дезинтегратори, напр. нишесте, за предпочитане нишесте от картофи или маниока и някои комплексни силикати, заедно със свързващи агенти като поливинилпиролидон, захароза, желатин и акациева смола. Много често, в допълнение към горните ексципиенти, за целите на таблетирането са особено полезни смазващи агенти, като магнезиев стеарат, натриев лаурилсулфат и талк. Твърди състави от подобен тип се използват също така като пълнители в меко- и твърдонапълнени желатинови капсули; предпочитани материали в тази връзка са също така и лактоза или млечна захар, както и полиетиленгликоли с високомолекулно тегло. Когато за орално приемане са желателни водни суспензии и/или еликсири, съединенията от изобретението могат да бъдат комбинирани с различни подслаждащи агенти, както и с такива разредители, като вода, етанол, пропиленгликол, глицерин и други подобни.

За целите на парентерално приемане могат да се използват разтвори в сусамено или фъстъчено масло или във воден пропиленгликол, както и стерилни водни разтвори на съответните водоразтворими соли. Тези водни разтвори могат да бъдат подходящо буферирани, ако е необходимо, а течният разредител първо да бъде направен изотоничен с достатъчно солев разтвор или глюкоза. Тези водни разтвори са особено подходящи за интравенозни, интрамускулни, подкожни и интраперитонеални инжекции. В тази връзка, използваните стерилни водни среди се получават лесно по традиционните техники, добре известни на специалистите.

За целите на трансдермалното (напр. местно) приемане, се приготвят разредени стерилни, водни или частично водни разтвори (обикновено с концентрация от около 0.1% до 5%), подобни на описаните по-горе парентерални разтвори.

Методите за получаване на различни фармацевтични състави с известно количество активна съставка са известни на специалистите или ще станат ясни в хода на това описание. Например, виж Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 15^th Edition (1975).

Фармацевтичните състави съгласно изобретението могат да съдържат 0.1- 95% от съединението (-ята) на изобретението, за предпочитане - от 1 до 70%. Във всеки случай, съставът или лекарствената форма, които ще се приемат, ще съдържат количество от съединение (-я) съгласно изобретението в количество, ефективно да лекува заболяването/състоянието на третирания субект.

Тъй като изобретението се отнася до увеличаване и поддържане на костната маса чрез обработка с комбинация от активни съставки, които могат да се приемат отделно, изобретението се отнася също така и до комбиниране на отделните фармацевтични състави под формата на комплект. Комплектът включва два отделни фармацевтични състава: агонист/антагонист на естрогена и анаболитен агент. Комплектът включва контейнери (съдове) за съхранение на отделните състави, като отделни флакони или отделни пакетчета от фолио. Обикновено комплектът включва инструкции за приемането на отделните компоненти. Комплектът е особено подходящ, когато е препоръчително приемането на отделните съставки във вид на отделни дозировки (напр. орално и парентерално); когато се приемат на различни интервали от време или когато терапевтът, предписващ лекарството, желае титруване на отделните компоненти от комбинацията.

Пример за такъв комплект е т.нар. блистерна опаковка. Блистерните опаковки са добре известни в пакетиращата промишленост и са използвани нашироко за опаковка на фармацевтични единични дозировки (таблети, капсули и др.). Блистерните опаковки обикновено са съставени от лист от относително твърд материал, покрит с фолио от препоръчително прозрачен пластмасов материал. По време на опаковъчния процес в пластмасовото фолио се оформят гнезда. Гнездата имат размера и формата на таблетите или капсулите, които ще се опаковат. След това, таблетите или капсулите се поставят в гнездата и листът от сравнително твърдия материал се залепва към пластмасовото фолио, от страната на фолиото, която е противоположна на тази, в която се намират гнездата. В резултат таблетите или капсулите се затварят херметично в гнездата между пластмасовото фолио и листа. За предпочитане е якостта на листа да бъде такава, че таблетите или капсулите да могат да се изваждат от блистерната опаковка чрез прилагане на натиск с ръка върху гнездата, при което се получава отвор в листа на мястото на гнездото. Таблетата или капсулата могат да бъдат извадени през този отвор.

Желателно е върху картата да се осигури подсещащо средство, напр. под формата на цифри до таблетите или капсулите, като цифрите да отговарят на дните от режима, на които таблетите или капсулите трябва да се поглъщат. Друг пример за такова подсещащо средство е календар, отпечатан върху картата, напр. “първа седмица, понеделник, четвъртък и т.н. ...втора седмица, понеделник, четвъртък,... и т.н.” Известни са и други варианти за подсещане. “Дневна доза” може да бъде единична таблета или капсула или няколко хапчета или капсули, които трябва да се вземат в даден ден. Също така, дневната доза от костен анаболитен агент може да се състои от една таблета или капсула, докато дневната доза на антирезорбтивен агент може да се състои от няколко таблети или капсули. В подсещащото средство това трябва да бъде отбелязано.

В друго специфично изпълнение на изобретението се дава подаващо устройство, предназначено да подава дневните дози, веднъж дневно по реда на тяхното приемане. За предпочитане е подаващото устройство да бъде снабдено с подсещащо средство, което да улеснява още повече спазването на режима. Пример за такова подсещащо средство е механичен брояч, който показва броя на дневните дози, които вече са били подадени. Друг пример за такова подсещащо средство е микрочип с памет, захранван с батерия, свързан с екранче с течен кристал или със звуков напомнящ сигнал, на който например се изписва датата, на която е била взета последната дневна доза и/или напомня, когато трябва да се вземе следващата доза.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример. Сто и четири женски плъха Sprague-Dawley (Charles River, Wilmington, МА) на 12-месечна възраст са оперирани симулативно или са овариектомизирани (OVX) на месец 0. Три месеца след хирургичната намеса OVX-плъховете са обработени или с простагландин Е₂ (PGE₂), известен костен анаболитен агент с доза 3 mg/kg/ден (подкожна инжекция) или с PGE₂ с доза 3 mg/kg/ден (подкожна инжекция), кобниран с дролоксифен с доза 10 mg/kg/ден (орално) в продължение на два месеца. След това обработката с PGE₂ се прекратява и плъховете се обработват или с носител (10% алкохол в солев раз твор) или с дролоксифен (10 mg/kg/ден, орално) още един и половина месеца, както е описано по-долу:

Група I: Осем плъха са аутопсирани на месец 0 като основни контроли.

Група II: Осем симулативно оперирани плъха са аутопсирани на месец 3 като контроли преди лечението.

Група III: Осем симулативно оперирани плъха обработени орално с носител (10% етанол в солев разтвор) от месеци 3 до 5 и аутопсирани на месец 5.

Група IV: Осем симулативно оперирани плъха са обработени орално с носител (10% етанол в солев разтвор) от месец 3 до месец

6.5 и са аутопсирани на месец 6.5

Група V: Осем OVX плъха са аутопсирани на месец 3 като контроли преди обработка.

Група VI: Осем OVX плъха са обработени орално с носител (10% етанол в солев разтвор) от месец 3 до месец 5 и са аутопсирани на месец 5.

Група VII: Осем OVX плъха са обработени орално с носител (10% етанол в солев разтвор) от месеци 3 до 6.5 и са аутопсирани на месец 6.5.

Група VIII: Осем OVX плъха са инжектирани подкожно с 3 mg/kg/ден PGE, от месец 3 до 5 и са аутопсирани на месец 5.

Група IX: Осем OVX плъха са инжектирани подкожно с 3 mg/kg/ден PGE^ от месец 3 до 5 и с носител от месец 5 до месец 6.5 и след това са аутопсирани на месец 6.5.

Група X: Осем OVX плъха са инжектирани подкожно с 3 mg/kg/ден PGE, от месец 3 до месец 5 и са получавали 10 mg/kg/ден дролоксифен орално от 5 до 6.5 месеца и са аутопсирани на месец 6.5.

Група XI: Осем OVX плъха са инжектирани подкожно с 3 mg/kg/ден PGE, и са получавали 10 mg/kg/ден дролоксифен орално от месец 3 до месец 5 и са аутопсирани на месец 5.

Група XII: Осем OVX плъха са инжектирани подкожно с 3 mg/kg/ден PGE^ и са получавали 10 mg/kg/ден дролоксифен орално от месец 3 до месец 5 и носител от месец 5 до месец 6.5 и са аутопсирани на месец 6.5.

Група XIII: Осем OVX плъха са инжектирани подкожно с 3 mg/kg/ден PGEj и са получавали 10 mg/kg/ден дролоксифен орално от месец 3 до месец 5 и само дролоксифен от месец 5 до 6.5 и са аутопсирани на месец 6.5.

И двата праха PGE₂ (Cayman Chemical Co.,m Ann Arbor, MI) или дролоксифен (Pfizer Inc. Groton, CT) първо са разтворени в 100% етанол и след това са разредени със солев разтвор до желаните концентрации (крайната концентрация на етанол е 10%). Разтворът на PGEj се инжектира дневно, подкожно в гърба с доза 1 ml/kg. Разтворът на дролоксифен се дава дневно, перорално 1 ml/плъх.

Минерални измервания на поясните прешлени

Получава се и се анализира сканиращо изображение на цялата поясна част на гръбначния стълб. Определя се костната площ (ВА) и минералното съдържание на костта (ВМС), а костната минерална плътност (BMD) се изчислява (ВМС разделено на ВА) за цялата поясна част на гръбначния стълб и за всеки един от шестте поясни прешлена (LV 1-6).

На 3-ти, 5-ти и 6.5 месеца след операцията костното минерално съдържание и костната минерална плътност са намаляли значително - с 15 до 27% при овариектомизираните плъхове, в сравнение със симулативно оперираните контроли. Плъхове, 3 месеца след овариектомията, обработени или само с PGEj или в комбинация с дролоксифен, в продължение на 2 месеца са възстановили напълно костното минерално съдържание (ВМС) и плътност (BMD) до нивото на симулативно оперираните плъхове. Няма никаква разлика в ВМС и BMD при овариектомизираните плъхове, обработени само с PGE₂ или с PGE₂, комбинирано с дролоксифен, което показва, че дролоксифенът не притьпява анаболитните ефекти на PGE* При прекъсване на обработката с PGEj се наблюдава значително намаление на BMD на LV1, LV2 и LV3 и на ВМС на LV2. От друга страна, когато на тези OVX-плъхове се дава дролоксифен, след прекъсването на простагландин Е., възстановената от PGE₂ кост се запазва напълно. По подобен начин, прекъсването и на двата агента, PGE₂ и дролоксифен в продължение на 1.5 месеца води до значително понижение на BMD на LV3. Обаче, когато се прекъсне PGE₂, а обработката с дролоксифен продължи още 1.5 месеца, никаква загуба на костно вещество не е наблюдавано в поясната част на гръбначния стълб на тези овариектомизирани плъхове. Оттук заключихме, че дролоксифенът, който е антирезорбтивен агент, не притъ пява анаболитните ефекти на PGE, при остеогенни плъхове. Освен това, дролоксифенът е ефикасен при поддържане на възстановени с PGE₂ кости, след прекратяване на лечението с простагландин. Тези данни подкрепят стратегията на използване на анаболитен агент за възстановяване на костна маса при остеопорозни скелети, последван от обработка с антирезорбтивен агент за поддържане на възстановената костна маса.

Трябва да се разбира, че изобретението не се ограничава до специалните изпълнения, описани тук, но са възможни промени и видоизменения, без да се излиза от духа и обсега на действие на тази концепция, дефинирана с дадените по-долу претенции.

Claims

Патентни претенции

1. Фармацевтичен състав за комбинирана терапия на остеопороза, характеризиращ се с това, че включва:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е агонист/антагонист на естрогена, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е простагландин или агонист/антагонист на простагландина.
2. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва допълнително фармацевтичен носител.
3. Фармацевтичен състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че агонист/ антагонистът на естрогена е дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен, 4-хидрокситамоксифен, цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-ол;

цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 -илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2ол;

цис-1-[6'-пиролидиноетокси-3'пиридил]2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

1-(4’-пиролидиноетоксифенил)-2-(4флуорофенил)-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин;

цис-6-(4-хидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол или

1-(4'-пиролидинолетоксифенил)-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин.
4. Фармацевтичен състав съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че второто съединение е PGD₁₅ PGD₂, PGE₂, PGE,, PGF₂, PGF_2a или 38-(3-хидрокси-4-фенилбутил)-2К-[6-(1Н-тетразол-5-ил)хексил]циклопентанон.
5. Фармацевтичен състав съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че агонист/антагонистът на естрогена е дролоксифен.
6. Фармацевтичен състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че второто съединение е PGE₂.
7. Фармацевтичен състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че второто съединение е 38-(3-хидрокси-4-фенилбутил)-2И-[6-( 1 Н-тетразол-5-ил)хексил]циклопентанон.
8. Фармацевтичен състав съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че агонист/антагонистът на естрогена е цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-о л;

цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 -илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2ол;

цис-1 -[6'-пиролидиноетокси-3'пиридил]-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

1-(4'-пиролидиноетоксифенил)-2-(4флуорофенил)-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин;

цис-6-(4-хидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол или

1-(4'-пиролидинолетоксифенил)-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин.
9. Фармацевтичен състав съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че второто съединение е PGE₂.
10. Фармацевтичен състав съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че второто съединение е 38-(3-хидрокси-4-фенилбутил)-2И-[6-( 1 Н-тетразол-5-ил)хексил]циклопентанон.
11. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва агонист/антагонист на естрогена и секретагог на хормона на растежа.
12. Фармацевтичен състав съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че секретагога на хормона на растежа е 2-амино-М-[2(За-(Я)-бензил-2-метил-3-оксо-2,3,3а,4,6,7хексахидропиразоло-[4,3-с]-1-(1<)-бензилоксиметил-2-оксоетил]изобутирамид и/или негова L-тартаратна сол.
13. Фармацевтичен състав съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че агонист/антагонистът на естрогена е ралоксифен или негова фармацевтично приемлива сол.
14. Фармацевтичен състав съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че агонист/антагонистът на естрогена е (-)-цис-б-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 -илетокси)фенил]5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол или негова фармацевтично приемлива сол.
15. Използване на фармацевтичен състав съгласно претенция 11 за получаване на лекарствено средство за лечение на състояние, което се проявява с атрофия на костите.
16. Използване на фармацевтичен състав съгласно претенция 12 за получаване на лекарствено средство за лечение на състояние, което се проявява с атрофия на костите.
17. Използване на фармацевтичен състав съгласно претенция 13 за получаване на лекарствено средство за лечение на състояние, което се проявява с атрофия на костите.
18. Използване на фармацевтичен състав съгласно претенция 14 за получаване на лекарствено средство за лечение на състояние, което се проявява с атрофия на костите.
19. Използване съгласно претенция 15, при което състоянието е остеопороза.
20. Използване на фармацевтичен състав съгласно претенция 1 за получаване на лекарствено средство за лечение на бозайник със заболяване, което се проявява с атрофия на костите.
21. Използване на състав съгласно пре тенция 20, при което агонист/антагонистът на естрогена е дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен, 4-хидрокситамоксифен, идоксифен, центрахроман, цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 -илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-ол;

цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 -илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2ол;

цис-1 -[6'-пиролидиноетокси-3'-пиридил]-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

1-(4'-пиролидиноетоксифенил)-2-(4флуорофенил)-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин;

цис-6-(4-хидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 -илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол или

1-(4'-пиролидинолетоксифенил)-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин.
22. Използване на състав съгласно претенция 21, при което второто съединение е PGD,, PGD₂, PGE₂, PGE,, PGF₂, PGF_2o или 38-(3-хидрокси-4-фенилбутил)-21<-[6-(1Н-тетразол-5-ил)хексил]циклопентанон.
23. Използване съгласно претенция 21, при което агонист/антагонистът на естрагона е дролоксифен.
24. Използване съгласно претенция 23, при което второто съединение е PGE₂.
25. Използване съгласно претенция 23, при което второто съединение е 38-(3-хидрокси-4-фенилбутил)-21<-[6-(1Н-тетразол-5-ил) хексил]-циклопентанон.
26. Използване съгласно претенция 23, при което заболяването, проявяващо се с атрофия на костите, е остеопороза.
27. Използване съгласно претенция 22, при което агонист/антагонистът на естрагона е:

цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-ол;

цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 -илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2ол;

цис-1 -[6'-пиролидиноетокси-3'пиридил]2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

1-(4'-пиролидиноетоксифенил)-2-(4флуорофенил)-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин;

цис-6-(4-хидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 -илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол или

1-(4'-пиролидинолетоксифенил)-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин.
28. Използване съгласно претенция 27, при което второто съединение е PGE₂.
29. Използване съгласно претенция 27, при което второто съединение е 38-(3-хидрокси-4-фенилбутил)-2Я-[6-(1 Н-тетразол-5ил)хексил]-циклопентанон.
30. Използване съгласно претенция 27, при което заболяването, проявяващо се с атрофия на костите, е остеопороза.
31. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен или идоксифен, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е натриев флуорид или N-[1(R)-[1,2дихидро-1-метансулфонилспиро[ЗН-индол3,4'-пиперидин]-1'ил)карбонил]-2-(фенил-метилокси)етил]-2-амино-2-метилпропанамид: МК-677.
32. Фармацевтичен състав съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че включва допълнително фармацевтичен носител.
33. Използване на фармацевтичен състав съгласно претенция 31 за получаване на лекарствено средство за лечение на бозайник със заболяване, което се проявява с атрофия на костите.
34. Използване на състав съгласно претенция 33, при което заболяването, проявяващо се с атрофия на костите, е остеопороза.
35. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е:

цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 -илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-ол;

цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 -илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2ол;

цис-1 -[6'-пиролидиноетокси-3'пиридил]2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

1-(4'-пиролидиноетоксифенил)-2-(4флуорофенил)-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин;

цис-6-(4-хидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 -илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол или

1-(4'-пиролидинолетоксифенил)-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е натриев флуорид, паратироиден хормон, хормон на растежа или секретагога на хормона на растежа.
36. Фармацевтичен състав съгласно претенция 35, характеризиращ се с това, че включва допълнително фармацевтичен носител.
37. Фармацевтичен състав съгласно претенция 35, характеризиращ се с това, че второто съединение е натриев флуорид.
38. Фармацевтичен състав съгласно претенция 35, характеризиращ се с това, че второто съединение е паратироиден хормон.
39. Фармацевтичен състав съгласно претенция 35, характеризиращ се с това, че второто съединение е хормон на растежа.
40. Фармацевтичен състав съгласно претенция 35, характеризиращ се с това, че второто съединение е секретагога на хормона на растежа.
41. Използване на фармацевтичен състав съгласно претенция 35 за получаване на лекарствено средство за лечение на бозайник със заболяване, което се проявява с атрофия на костите, който състав включва:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е:

цис-6-(4-флуорофенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол;

(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален2-ол;

цис-6-фенил-5-[4-(2-пиролидин-1 -илетокси)фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2ол;

цис-1 -[6'-пиролидиноетокси-3'пиридил]2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидронафтален;

1-(4'-пиролидиноетоксифенил)-2-(4флуорофенил)-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин;

цис-6-(4-хидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илетокси)-фенил]-5,6,7,8-тетрахидронафтален-2-ол или

1-(4'-пиролидинолетоксифенил)-2-фенил-6-хидрокси-1,2,3,4-тетрахидроизохинолин, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е натриев флуорид, паратироиден хормон, хормон на растежа или секретагога на хормона на растежа.
42. Използване съгласно претенция 41, при което второто съединение е натриев флуорид.
43. Използване съгласно претенция 41, при което второто съединение е паратироиден хормон.
44. Използване съгласно претенция 41, при което второто съединение е хормон на растежа.
45. Използване съгласно претенция 41, при което второто съединение е секретагога на хормон на растежа.
46. Използване съгласно претенция 41, при което заболяването, проявяващо се с атрофия на костите, е остеопороза.
47. Фармацевтичен състав съгласно претенция 31, характеризиращо се с това, че първото съединение е дролоксифен.
48. Използване съгласно претенция 33, при което първото съединение е дролоксифен.
49. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е ралоксифен, тамоксифен или идоксифен, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение, като второто съединение е паратироиден хормон, хормон на растежа или секретагога на хормона на растежа, при условие, че когато първото съединение е ралоксифен, второто съединение е различно от паратироиден хормон.
50. Фармацевтичен състав съгласно претенция 49, характеризиращ се с това, че включва допълнително фармацевтичен носител.
51. Фармацевтичен състав съгласно претенция 49, характеризиращ се с това, че първото съединение е ралоксифен.
52. Фармацевтичен състав съгласно претенция 49, характеризиращ се с това, че второто съединение е паратироиден хормон.
53. Фармацевтичен състав съгласно претенция 49, характеризиращ се с това, че второто съединение е хормон на растежа.
54. Фармацевтичен състав съгласно претенция 49, характеризиращ се с това, че второто съединение е секретагога на хормона на растежа.
55. Използване на фармацевтичен състав съгласно претенция 49 за получаване на лекарствено средство за лечение на бозайник със заболяване, което се проявява с атрофия на костите, който състав включва:

а. терапевтично ефективно количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е ралоксифен, тамоксифен или идоксифен, и

б. терапевтично ефективно количество от второ съединение, като второто съединение е паратироиден хормон, хормон на растежа или секретагога на хормона на растежа, при условие, че когато първото съединение е ралоксифен, второто съединение е различно от паратироиден хормон.
56. Използване съгласно претенция 55, при което първото съединение е ралоксифен.
57. Използване съгласно претенция 55, при което второто съединение е паратироиден хормон.
58. Използване съгласно претенция 55, при което второто съединение е хормон на растежа.
59. Използване съгласно претенция 55, при което второто съединение е секретагога на хормона на растежа. 5
60. Използване съгласно претенция 55, при което заболяването, което се проявява с атрофия на костите, е остеопороза.