KR100419681B1 - 골다공증 치료용 이피4 수용체 선택성 작용제 - Google Patents

골다공증 치료용 이피4 수용체 선택성 작용제 Download PDF

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Abstract

본 발명은, EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제인 프로스타글란딘 작용제를 투여함을 포함하는, 낮은 골 질량을 나타내는 증상, 구체적으로 골다공증, 골의 무름(frailty), 골다공성 골절, 골 결함, 유년기 특발성 골 손실, 치조(齒槽) 골 손실, 하악골 손실, 골절, 골절단, 치주염 관련된 골 손실, 또는 보철의 파고듦(prosthetic ingrowth)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 EP4수용체 선택성 작용제가 하기 화학식 1의 화합물인 상기 방법에 관한 것이다:
상기 식에서,
Q는 COOR3, CONHR4또는 테트라졸-5-일이고,
A는 단일 결합 또는 시스형 이중 결합이고,
B는 단일 결합 또는 트랜스형 이중 결합이고;
U는이고;
R2는 α-티에닐, 페닐, 페녹시, 일치환된 페닐 또는 일치환된 페녹시(여기서, 치환체는 클로로, 플루오로, 페닐, 메톡시, 트리플루오로메틸 또는 (C1-C3)알킬이다)이고,
R3는 수소, (C1-C5)알킬, 페닐 또는 p-비페닐이고,
R4는 COR5또는 SO2R5이고,
R5은 페닐 또는 (C1-C5)알킬이다.

Description

골다공증 치료용 이피4 수용체 선택성 작용제{EP4 RECEPTOR SELECTIVE AGONISTS IN THE TREATMENT OF OSTEOPOROSIS}
본 발명은 척추동물, 특히 인간을 비롯한 포유동물에서 골 손실을 방지하고, 골 질량을 복구하거나 증대시키며, 낮은 골 질량 및/또는 골 결함을 나타내는 증상을 치료함을 포함하는 골의 치유를 증진시키는데 유용한 프로스타글란딘 작용제를 포함하는 약학 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제를 포함하는 약학 조성물 및 방법에 관한 것이다.
골다공증은 골 질량 감소 및 골 조직 악화로 인해 결과적으로 골 무름을 증가시켜 쉽게 골절을 일으킴을 특징으로 하는 전신 골격 질환이다. 미국에서는, 2500만명이 넘는 골다공증 환자들이 있으며, 이로 인해 연간 척추 골절 500,000명, 고관절 골절 250,000명 및 허리 골절 240,000명을 포함하여 매년 130만명이 넘는 골절 환자들이 발생한다. 그중에서도 고관절 골절이 가장 심각한데, 환자의 5 내지 20%가 1년내에 사망하며 생존자의 50% 이상이 불구가 된다.
중년을 지나면 골다공증의 위험이 가장 커지므로 인구의 노령화에 따라 문제가 상당히 커지리라 예상된다. 골절은 전세계적으로 다음 60년이 지나면 3배 이상 증가할 것으로 예상되고, 한 연구에 따르면, 2050년이 되면 전세계적으로 고관절 골절 환자가 450만명에 이를 것으로 추산된다.
여성은 남성에 비해서 골다공증의 위험이 더 크다. 여성은 폐경 이후 5년 동안 골격 손실이 급격히 촉진되는 것을 경험한다. 이러한 위험을 증가시키는 다른 요인으로는 흡연, 알콜 중독, 좌식 생활방식 및 칼슘 섭취량의 부족을 들 수 있다.
현재 골다공증의 치료를 위한 두가지 주된 유형의 약학적 치료법이 있다. 첫 번째로, 골 조직의 재흡수를 감소시키는 항-재흡수성 화합물을 사용하는 것이다.
에스트로겐은 항-재흡수제로서의 한 예이다. 에스트로겐이 골절을 감소시킴은 공지되어 있다. 또한, 블랙(Black) 등의 유럽 특허 제 0605193A1 호에는 에스트로겐이 특히 경구로 투여되는 경우 LDL의 혈장 농도를 감소시키고 유리한 고밀도 지단백질(HDL)의 혈장 농도를 증가시킨다고 보고되어 있다. 그러나, 에스트로겐은 이미 확립된 골다공성 골격에서 젊은 성인의 수준으로 골을 복구시키지는 못한다. 또한, 장기간의 에스트로겐 치료는 자궁암, 자궁내막암 및 유방암의 위험 증가를 비롯한 다양한 질병과 연루되어, 다수의 여성으로 하여금 이러한 치료를 회피하게 한다. 에스트로겐 치료와 관련된 바람직하지 못한 심각한 영향은, 혈청 LDL에 대해서는 바람직한 효과를 나타내지만 바람직하지 못한 효과는 유발하지 않는 골다공증에 대한 대체 치료법의 개발을 요구한다.
골다공증 치료를 위한 약학적 치료법의 두 번째 유형은 골 생성을 촉진시키고 골 질량을 증가시키기 위한 동화제를 사용하는 것이다. 이러한 부류의 제제는 이미 확립된 골다공성 골격에 골을 복구시킬 것으로 기대된다.
특정 프로스타글란딘 작용제가, 예를 들면 신장 혈관확장제로서 유용한 것으로 GB 제 1478281호, GB 제 1479156호, 및 USP 제 4,175,203호, 제 4,055,596호, 제 4,175,203호, 제 3,987,091호 및 제 3,991,106호에 개시되어 있다.
미국 특허 제 4,033,996호에는 성장 호르몬 방출을 유도하기 위해 혈전 형성을 방지하기 위한 신장 혈관팽창제 및 면역 반응 조절제로서 유용한 특정 8-아자-9-옥소(및 디옥소)-티아-11,12-세코프로스타글란딘이 개시되어 있다.
프랑스 특허 제 897,566호에는 신경질환, 정신질환 또는 심장혈관 질환의 치료를 위한 특정 아미노산 유도체가 개시되어 있다.
문헌[J. Org. Chem. 26; 1961; 1473]에는 N-아세틸-N-벤질-p-아미노페닐머캅토아세트산이 개시되어 있다.
미국 특허 제 4,761,430호에는 지질 저하제로서의 특정 아릴벤젠설폰아미드 화합물이 개시되어 있다.
미국 특허 제 4,443,477호에는 지질 저하제로서의 특정 설폰아미도페닐카복실산이 개시되어 있다.
미국 특허 제 3,528,961호에는 염료로서의 특정 ε-카프로락탐 유도체가 개시되어 있다.
미국 특허 제 3,780,095호에는 담즙 분비제로서의 특정 아실화된 아닐리노카복실산이 개시되어 있다.
미국 특허 제 4,243,678호에는 위궤양의 치료에 유용하고, 피지선 분비 저해제로서 유용하며 피부 염증에 대처하기에 유용한 것으로서 특정 아실하이드로카빌아미노알카노산이 개시되어 있다.
미국 특허 제 4,386,031호에는 항알러지제, 혈전증 응집 억제제, 항염증제 및 지질 저하제로서의 특정 N-벤조일-ω-아닐리노알칸카복실산이 개시되어 있다.
골다공증 뿐만 아니라, 약 2천 내지 2천5백만 여성 및 증가하는 수의 남성이 골 질량 감소의 결과로서 감지할만한 척추 골절을 겪고 있고, 추가로 미국에서만 연간 250,000 건의 고관절 골절이 발생한 것으로 보고되었다. 고관절 골절의 경우는 초기 2년내에 12%의 치사율을 나타내었고, 골절후 집에서 간호를 필요로 하는 환자가 30%이다. 이는 이미 심각하지만, 인구의 노령화로 인해, 이러한 골절 치유의 둔화 또는 불완전함에 기인하여 요양을 해야하는 경제적이고 의학적인 문제가 증가할 것으로 예상된다.
에스트로겐은 부속기관의 골절의 치유의 질을 증진시키는 것으로 제시되었다. 볼란더(Bolander) 등의 문헌[38th Annual Meeting Orthopedic Research Society, 1992"] 참조. 따라서, 에스트로겐 대체 치료법은 골절 손상의 치료 방법으로서 효과적이어야 한다. 그러나, 에스트로겐 치료법에 대한 환자의 순응성은 생리의 재개, 유방통, 증가된 자궁암 발병 위험, 증가된 지각적 유방암 발병 위험, 및 프로제스틴의 부수적 사용을 비롯한 부작용 때문에 비교적 불량하다. 또한, 남성들은 에스트로겐 치료의 사용에 대해 저항감을 갖기 쉽다. 약화된 골절을 겪는 환자에게 유리하고 환자의 순응성을 증가시키는 치료법이 요구된다.
프로스타글란딘 E2(PGE2)가 난소적출된(OVX) 래트 모델(폐경후의 골다공증에 대한 모델)에서 손실된 골을 복구시킬 수 있음이 입증되었다. 케(Ke, H.Z) 등의 문헌[Bone, 23:249-255, 1998] 참조. 그러나, PGE2와 관련된 심각한 부작용이 있다. 지(Jee, W.S.S.) 및 마(Ma, Y.F)의 문헌[Bone, 21:297-304, 1997] 참조.
다양한 골다공증 치료법이 있지만, 당 분야에서는 대안적인 골다공증 치료법이 지속적으로 요구되고 연구되고 있다. 또한, 골절 치유 치료법이 요구된다. 또한, 예를 들면 골의 종양에 의해 야기되거나 생성되는 결함 등이 존재하는 골격 영역으로의 골의 재성장을 촉진시킬 수 있는 치료법이 요구된다. 또한, 골 이식이 지시되는 골격 영역으로의 골의 재성장을 촉진시킬 수 있는 치료법이 요구된다.
본 발명에서는 부작용을 일으키지 않으면서 낮은 골 질량을 나타내는 증상을 치료할 수 있는 신규 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 EP4수용체 선택성 작용제, 이의 전구약물 또는 이들 EP4수용체 선택성 작용제 또는 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 낮은 골 질량을 나타내는 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 상기 증상이 골다공증, 골의 무름(frailty), 골다공성 골절, 골 결함, 유년기 특발성 골 손실, 치조(齒槽) 골 손실, 하악골 손실, 골절, 골절단, 치주염 관련된 골 손실, 또는 보철의 파고듦(prosthetic ingrowth)인 상기 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 방법에서, EP4수용체 선택성 작용제는 전신적으로, 예컨대 경구적으로, 피하로 또는 근육내로 투여되거나 에어로졸(aerosol)을 통해 투여된다. 본 발명의 바람직한 다른 방법에서는, EP4작용제는 국부적으로 투여된다.
본 발명의 방법은 상기 증상이 골의 무름인 경우 특히 유용하다.
본 발명의 방법은 또한 상기 증상이 골다공증인 경우 특히 유용하다.
본 발명의 방법은 또한 상기 증상이 골절 또는 골다공성 골절인 경우 특히 유용하다.
본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 EP4선택성 작용제는 하기 화학식 1의 화합물, 이의 전구약물 및 이들 화합물 또는 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다:
화학식 1
상기 식에서,
Q는 COOR3, CONHR4또는 테트라졸-5-일이고,
A는 단일 결합 또는 시스형 이중 결합이고,
B는 단일 결합 또는 트랜스형 이중 결합이고;
U는이고;
R2는 α-티에닐, 페닐, 페녹시, 일치환된 페닐 또는 일치환된 페녹시(여기서, 치환체는 클로로, 플루오로, 페닐, 메톡시, 트리플루오로메틸 또는 (C1-C3)알킬이다)이고,
R3는 수소, (C1-C5)알킬, 페닐 또는 p-비페닐이고,
R4는 COR5또는 SO2R5이고,
R5은 페닐 또는 (C1-C5)알킬이다.
화학식 1의 EP4수용체 선택성 작용제중 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 군은 Q가 5-테트라졸릴이고, U가이어서 하기 화학식 1a의 화합물을 형성하는 화학식 1의 화합물이다:
이 군에 속하는 특히 바람직한 화합물로는 5S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온; 5S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온; 5R-(3S-하이드록시-4-페닐-부트-1-에닐)-1-[6-(1H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온; 및 5S-(3R-하이드록시-4-페닐-부틸)-1-[6-(1H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온이 포함된다.
화학식 1의 EP4수용체 선택성 작용제중 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 또 다른 군은 Q가 COOH인 화학식 1의 화합물이다. 이 군에 속하는 특히 바람직한 화합물로는 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1일]-헵타노산; 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1일]-헵타노산; 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1일]-헵타노산; 7-[2S-(3R-하이드록시-4-페닐-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1일]-헵타노산; 및 7-[2R-(3S-하이드록시-4-페닐-부트-1-에닐)-5-옥소-피롤리딘-1일]-헵타노산이 포함된다.
바람직하게는 60세 이상의 폐경후 여성 및 남성이 치료된다. 또한, 연령과 무관하게 상당히 감소된 골 질량, 즉 젊은 정상인 수준에 비해 1.5 표준 편차 이상 감소된 골 질량을 갖는 사람이 바람직하다.
본 발명의 방법에서, 낮은 골 질량을 나타내는 증상으로는 예를 들면 골다공증, 유년기 특발성 골 손실, 치조 골 손실, 하악골 손실, 골절, 골절단, 치주염 관련 골 손실, 및 보철의 파고듦과 같은 증상이 포함된다.
"2차 골다공증"의 치료 방법이 또한 본 발명의 방법에 포함된다. "2차 골다공증"이란 척추동물, 예컨대 포유동물(인간 포함)에서 글루코코르티코이드-유도된 골다공증, 갑상선항진증-유도된 골다공증, 부동화-유도된 골다공증, 헤파린-유도된 골다공증 및 면역억제-유도된 골다공증이 포함된다. 이들 방법은 상기 척추동물, 예컨대 포유동물에게 "2차 골다공증" 치료량의 EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제, 이의 전구약물 또는 이들 EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제 또는 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염을 투여함으로써 수행된다.
본 발명의 또다른 양태는 안면 재건, 상악골 재건 또는 하악골 재건이 필요한 척추동물, 예컨대 포유동물(인간 포함)에게 골 증진량의 EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제, 이의 전구약물 또는 이들 EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제 또는 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염을 투여함을 포함하는, 골 이식편을 강화시키고, 척추 유착을 유도하며, 장골 연장을 증진시키고, 안면 재건, 상악골 재건 및/또는 하악골 재건을 수반하는 골 치유를 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 활성 EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제는 골 재건 부위에 국부적으로 투여될 수 있거나, 전신적으로 투여될 수 있다.
바람직한 투여량은 EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제, 이의 전구약물 또는 이들 EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제 또는 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염 약 0.001 내지 약 100mg/kg/일이다. 특히 바람직한 투여량은 EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제, 이의 전구약물 또는 이들 EP4수용체 선택성 프로스타글란딘 작용제 또는 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염 약 0.01 내지 약 10mg/kg/일이다.
"낮은 골 질량을 나타내는 증상(들)"이란 문구는, 골 질량의 수준이 세계 보건 기구(World Health Organization)의 보고 "폐경후 골다공증에 대한 골절 위험 및 이의 선별 적용 평가(Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis(1994); Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization Technical Series 843"에 의해 표준적으로 정의된 바와 같은 연령별 특정 기준치보다 낮은 증상을 말한다."낮은 골 질량을 나타내는 증상(들)"에는 1차 골다공증 및 상술된 바와 같은 2차 골다공증이 포함된다. 또한, 치주 질환, 치조 골 손실, 골절단 및 유년기 특발성 골 손실이 포함된다. "낮은 골 질량을 나타내는 증상(들)"이란 문구는 또한 척추골의 휨, 신장 단축 및 보철 수술 등의 골다공증의 장기적인 합병증을 포함한다.
"낮은 골 질량을 나타내는 증상(들)"이란 문구는 골다공증을 비롯한 상술된 바와 같은 질환이 발생될 평균 기회보다 매우 높은 기회를 갖는 것으로 알려진 척추동물, 예컨대 포유동물에 관련된다. 다른 골 질량 증대 또는 증진은 골 복구, 골절 치유율 증가, 골 이식 수술의 전체적인 대체, 성공적인 골 이식률의 증진, 안면 재건 또는 상악골 재건 또는 하악골 재건을 수반하는 골 치유, 보철의 파고듦, 척추 유착 또는 장골의 연장을 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 척추골 융합 케이지(cage), 척추골 융합 하드웨어(hardware), 내부 및 외부 골 고정 장치, 스크류(screw) 및 핀(pin)과 같은 척추용 장치와 함께 사용될 수 있다.
당 분야의 숙련가라면 "골 질량"이란 용어가 실제로 단위 면적당 골 질량을 말하고, 이는 때때로(비록 엄격하게 정확한 것은 아니지만) 골 무기질 밀도를 지칭함을 잘 알 것이다.
본원에 사용된 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 방지(예컨대, 예방), 경감 및 회복적인 치료를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한"이란 담체, 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 염이 배합물의 다른 성분과 상용가능해야 하나 이를 투여받는 자에게 해롭지 않아야 함을 의미한다.
"전구약물"이란 표현은 투여된 후 생체내에서 몇몇 화학적 또는 생리학적 과정을 통해 약물을 방출하는 약물 전구체인 화합물을 말한다(예컨대, 생리적 pH가 되거나 효소 활성에 의해 전구약물이 원하는 약물 형태로 전환된다). 전구약물은 절단되어 상응하는 약물 화합물을 방출한다.
"약학적으로 허용가능한 염"이란 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 설페이트, 비설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 말레이트, 푸마레이트, 옥살레이트, 락테이트, 타르트레이트, 시트레이트, 글루코네이트, 메탄설포네이트 및 4-톨루엔-설포네이트 등(이에 한정되지 않음)과 같은 음이온-함유 무독성 음이온염을 말한다. 이 표현은 또한 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 또는 양성자화된 벤자틴(N,N'-디벤질에틸렌디아민), 콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글라민(N-메틸-글루카민), 베네타민(N-벤질페네틸아민), 피페라진 또는 트로메타민(2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판디올) 등(이에 한정되지 않음)의 무독성 양이온 염을 말한다.
본 발명의 방법은 골을 생성하여 골절율을 감소시킨다. 본 발명은 골 생성을 증진시켜 골다공증 및 관련된 골 질환을 예방하고, 지연시키고/시키거나 감소시키는 방법을 제공함으로써 당 분야에 크게 기여한다.
본 발명은 또한 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산; 5S-(4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸)-1-(6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실-피롤리딘-2-온; 7-(2S-(3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵타노산; 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산; 및 5S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온으로부터 선택된 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부틸]-5-옥 소-피롤리딘-1-일]-헵타노산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 5S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥 소-피롤리딘-1-일]-헵타노산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 5S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부 틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온에 관한 것이다.
다른 특징 및 이점은 본 발명을 설명하는 명세서 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
임의의 EP4수용체 선택성 작용제가 본 발명의 EP4수용체 선택성 작용제로서 사용될 수 있다. EP4선택성 작용제는 EP4수용체 서브타입에서의 IC50에 비해 10배 이상 더 큰 EP1, EP2및 EP3수용체에서의 IC50을 갖는 화합물이다. 예를 들면, 7-[2-(3-하이드록시-4-페닐-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산은 16nM의 EP4수용체 결합 IC50을 갖는 EP4수용체 선택성 PGE2작용제이다. EP1, EP2및 EP3수용체 서브타입을 비롯한 모든 다른 EP 수용체 서브타입에서 7-[2-(3-하이드록시-4-페닐-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산에 대한 IC50은 3200nM보다 크다.
화학식 1의 화합물은 본원에 참고로 인용된 통상 양도된 미국 특허 제 4,177,346호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 EP4수용체 선택성 작용제는 척추동물, 예컨대 포유동물 및 특히 인간에서 골 생성을 자극하고 골 질량을 증가시키는 제제로서 치료적 용도에 모두 적용된다. 골 생성은 골다공증 및 골 관련된 질환의 진행과 매우 관련되므로, 본 발명의 방법에 사용된 작용제는 골에 대한 이들의 작용에 의해 골다공증을 예방하고, 저지하고/하거나 감소시킨다.
척추동물, 예컨대 포유동물(특히 인간 및 구체적으로 여성)에서 낮은 골 질량을 나타내는 증상(예: 골다공증)을 치료하는 약제로서의 본 발명의 방법에 사용된 EP4선택성 작용제의 이용성은, 수용체 결합 검정, 환형 AMP 검정, 생체내 검정 및 골절 치유 검정 등의 통상의 검정(이들 모두는 후술됨)에서 이들 작용제의 활성에 의해 입증된다. 이러한 검정은 또한 EP4선택성 작용제의 활성이 서로 비교될 수 있고 다른 공지 화합물 및 조성물의 활성과도 비교될 수 있는 기술수단을 제공한다. 이들 비교 결과는 척추동물, 예컨대 인간을 포함하는 포유동물에서 투여량수준을 결정하고, 이러한 질환을 치료하기에 유용하다.
생체내 검정
골 생성을 자극하고 골 질량을 증가시키는 골 동화제의 활성을, 손상되지 않은 수컷 래트 또는 암컷 래트, 및 성호르몬 결핍된 수컷 래트(정소적출) 또는 암컷 래트(난소적출)에서 시험할 수 있다.
다양한 연령의(예컨대, 3개월 자란) 수컷 또는 암컷 래트를 연구에 사용할 수 있다. 래트를 손상시키지 않거나 거세(난소적출 또는 정소적출)할 수 있고, 30일 동안 상이한 투여량(예컨대, 1, 3 또는 10mg/kg/일)으로 프로스타글란딘 작용제를 피하 주사하거나 위관공급할 수 있다. 거세된 래트에서, 수술후 다음날(골 손실을 방지하기 위해) 또는 골 손실이 이미 발생된 때(골 질량 복구를 위해) 치료를 시작한다. 연구 동안에, 모든 래트는 물, 및 1.46% 칼슘, 0.99% 인 및 4.96IU/g의 비타민 D3를 함유한 펠렛화된 시판용 규정식[테클라드 로덴트 다이어트(Teklad Rodent Diet) #8064; 위스콘신주 매디슨 소재의 할란 테클라드(Harlan Teklad) 제품]을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 래트를 죽이기 12일 및 2일 전에 모든 래트에게 10mg/kg 칼세인을 피하 주사한다. 래트를 죽인다. 하기 종점이 결정된다:
대퇴부 골 무기질 측정:
부검시 각 래트로부터 우측 대퇴부를 제거하고, "부분적 고해상 스캔(Regional High Resolution Scan)" 소프트웨어[매사추세츠주 왈탐 소재의 홀로직 인코포레이티드(Hologic Inc.)의 제품]가 구비된 이중 에너지 X-선 흡광분석계(DXA, QDR 1000/W; 매사추세츠주 왈탐 소재의 홀로직 인코포레이티드의 제품)를 사용하여 스캐닝한다. 스캔 필드 크기는 5.08×1.902cm이고, 해상도는 0.0254×0.0127cm이며, 스캔 속도는 7.25mm/초이다. 대퇴부 스캔 영상을 분석하고 전체 대퇴부(WF), 원위 대퇴부 골간단(骨幹端)(DFM), 대퇴부 골간(骨幹)(FS) 및 근위 대퇴부(PF)의 골 면적, 골 무기질 함량(BMC) 및 골 무기질 밀도(BMD)를 결정한다.
경골(脛骨) 조직형태분석:
부검시 우측 경골을 제거하고, 근육을 절개해 내고, 세 부분으로 절단한다. 근위 경골 및 경골 골간을 70% 에탄올에 고정시키고, 에탄올의 농도 경사로 탈수시키고, 아세톤에서 탈지한 후, 메틸 메타크릴레이트중에 함침시킨다[뉴욕주 로체스터 소재의 이스트만 오가닉 케미칼스(Eastman Organic Chemicals) 제품].
라이처트-중 폴리컷 에스 마이크로톰(Reichert-Jung Polycut S microtome)을 사용하여 근위 경골의 전방 부분을 4 ㎛ 및 10㎛ 두께로 절단한다. 4㎛ 부분은 변형된 매슨의 트리크롬(Masson's Trichrome) 염색약으로 염색하고, 10㎛ 부분은 염색하지 않은채로 둔다. 각 래트로부터의 하나의 4㎛ 부분과 하나의 10㎛ 부분을 해면질의 골 조직형태분석에 사용한다.
10㎛ 두께의 경골 골간의 단면을 라이처트-중 폴리컷 마이크로톰을 사용하여 절단한다. 이 부분을 피질의 골 조직형태분석에 사용한다.
해면질의 골 조직형태분석:
바이오퀀트(Bioquant) OS/2 조직형태분석 시스템[테네시주 나쉬빌 소재의 알 앤드 엠 바이오메트릭스 인코포레이티드(RM Biometrics, Inc.) 제품]을 성장판-골단 결합부에서 1.2 및 3.6mm 떨어진 부분 사이의 근위 경골 골간단의 제 2 해면상의 정적 및 동적 조직형태분석 측정에 사용한다. 경골 골간단의 최초 1.2mm 영역은 제 2 해면상에 대한 측정을 제한하기 위해 생략될 필요가 있다. 4㎛ 부분은 골 부피, 골 구조 및 골 복구에 관한 지수를 결정하기 위해 사용되고, 10㎛ 부분은 골 생성 및 골 교체(turnover)에 관한 지수를 결정하기 위해 사용된다.
I) 소주(小柱)의 골 부피 및 구조에 관한 측정 및 계산:
(1) 총 골단간 면적(TV, mm2): 성장판-골단 결합부로부터 1.2 및 3.6mm 떨어진 부분 사이의 골간단 면적. (2) 소주의 골 면적(BV, mm2): TV내의 소주의 총 면적. (3) 소주의 골 둘레(BS, mm): 소주의 총 둘레의 길이. (4) 소주의 골 부피(BV/TV, %): BV/TV×100. (5) 소주의 골 수(TBN, #/mm): 1.199/2×BS/TV. (6) 소주의 골 두께(TBT, ㎛): (2000/1.199)×(BV/BS). (7) 소주의 골 분리(TBS, ㎛): (2000×1.199)×(TV-BV).
II) 골 재흡수에 관한 측정 및 계산:
(1)파골세포 수(OCN, #): 총 골간단 영역내의 파골세포의 총 수. (2) 파골세포 둘레(OCP, mm): 파골세포에 의해 덮힌 소주의 둘레의 길이. (3) 파골세포 수/mm(OCN/mm, #/mm): OCN/BS. (4) 파골세포 둘레율(%OCP, %): OCP/BS×100.
III) 골 생성 및 교체에 관한 측정 및 계산:
(1) 단일-칼세인 라벨링된 둘레(SLS, mm): 하나의 칼세인 라벨로 라벨링된 소주 둘레의 총 길이. (2) 이중-칼세인 라벨링된 둘레(DLS, mm): 두 개의 칼레인 라벨로 라벨링된 소주의 둘레의 총 길이. (3)내부-라벨링된 폭(ILW, ㎛): 두 개의 칼세인 라벨 사이의 평균 거리. (4) 무기질화 둘레율(PMS, %): (SLS/2+DLS)/BS×100. (5) 무기질 부가 속도(MAR, ㎛/일): ILW/라벨 간격. (6) 골 생성 속도/기준 표면(BFR/BS, ㎛2/d/㎛): (SLS/S+DLS)×MAR/BS. (7) 골 교체 속도(BTR, %/y: (SLS/2+DLS)×MAR/BV×100.
피질성 골 조직형태분석:
바이오퀀트 OS/2 조직형태분석 시스템(테네시주 나쉬빌 소재의 알 앤드 엠 바이오메트릭스 제품)을 경골 골간 피질성 골의 정적 및 동적 조직형태분석 측정에 사용한다. 총 조직 면적, 골수 강 면적, 골막 둘레, 내피질 둘레, 단일 라벨링된 둘레, 이중 라벨링된 둘레 및 골막과 내피질 표면상의 인터라벨링된 (interlabelled) 폭을 측정하고, 피질성 골 면적(총 조직 면적-골수 강 면적), 피질성 골 면적율(피질 면적/총 조직 면적×100), 골수 면적율(골수 강 면적/총 조직 면적×100), 골막 및 내피질의 라벨링된 둘레율[(단일 라벨링된 둘레/2+이중 라벨링된 둘레)/총 둘레×100], 무기질 부가 속도(인터라벨링된 폭/간격), 및 골 생성 속도[무기질 부가 속도×[(단일 라벨링된 둘레/2+이중 라벨링된 둘레)/총 둘레]를 계산한다.
통계
스태트뷰 4.0 패키지(StatView 4.0)[캘리포니아주 94704-1014 버클리 보니타 아베 1918 소재의 아바쿠스 컨셉츠 인코포레이티드(Abacus Concepts, Inc.) 제품]를 사용하여 통계를 계산할 수 있다. 편차(ANOVA) 테스트 분석 후 피셔의 PLSD(스태트뷰, 캘리포니아주 94704-1014 버클리 보니타 아베 1918 소재의 아바쿠스 컨셉츠 인코포레이티드 제품)를 수행하여 군들간의 차이를 비교하였다.
재조합 인간 EP 4 수용체를 안정하게 과발현하는 293-S 세포주중 cAMP 상승에 대한 결정
주형으로서 주요 인간 폐 세포(EP4)로부터의 RNA 및 공개된 서열(1)을 기초한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 역전사효소 폴리머레이즈 쇄 반응에 의해 인간 EP4수용체의 완전한 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 나타내는 cDNA를 생성한다. cDNA를 pcDNA3[캘리포니아주 92121 산디에고 소렌토 발리 불러바드 3985 B 소재의 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation) 제품]의 다중 클로닝 부위로 클로닝하고, 칼슘 포스페이트 동시 침전을 통해 293-S 인간 배(胚) 신장 세포를 형질감염시키는데 사용한다. G418-내성 콜로니가 만들어 지고, 이를 특이적 [3H]PGE2결합에 대해 시험한다. 높은 수준의 특이적 [3H]PGE2결합을 나타내는 형질감염체는 추가로 스카챠드 분석으로 특징지워져 PGE2에 대한 Bmax 및 Kds를 결정한다. 화합물 선별에 선택된 세포주들은 세포당 약 256,400개의 수용체를 갖고, PGE2(EP4)에 대한 Kd는 2.9nM이다. 293-S 모세포에서 수용체의 구성적 발현은 무시할 수 있다. 세포는 소태아 혈청(최종 농도 10%) 및 G418(최종 농도 700μg/ml)로 보충된 RPMI에 유지된다.
293-S/EP4세포주중 cAMP 반응은, 격렬히 흔들어 세포를 배양 플라스크로부터 분리시켜 1ml의 Ca2+및 Mg2+결핍 PBS에 옮기고, 무혈청 RPMI를 1×106세포/ml의 최종 농도로 첨가하고, 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX)를 1mM의 최종 농도로 첨가함으로써 결정된다. 1ml의 세포 현탁액을 즉시 별도의 2ml 스크류캡 미세원심분리기로 분취하고, 37℃, 5%의 CO2, 및 95%의 상대 습도하에 뚜껑을 닫지 않고 10분간 보온시킨다. 이어, 시험될 화합물을 세포에 1:100의 희석율로 첨가하여 최종 DMSO 또는 에탄올 농도가 1%가 되도록 한다. 화합물 첨가 직후, 튜브를 닫고, 2시간 동안 역전시켜 혼합하고, 37℃에서 12분 동안 보온시킨다. 샘플을 100℃에서 10분 동안 가온하여 분해하고, 즉시 5분 동안 얼음위에서 냉각시킨다. 세포 찌꺼기를 1000×g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화시키고, 투명한 분해물을 새로운 튜브에 옮긴다. 투명한 분해물을 cAMP RIA 검정 완충액(키트에 포함됨)에 1:10으로 희석시킨 후 시판되는 cAMP 방사선면역검정 키트 RIA[NEK-033; 매사추세츠주 02118 보스턴 알바니 스트리트 549 소재의 듀퐁/엔이엔 리써치 프로덕츠(DuPont/NEN Research Products) 제품]를 사용하여 cAMP 농도를 결정한다. 전형적으로, 세포는 1log 증분으로 시험되도록 화합물의 6 내지 8배 농도로 시험된다. 용량 반응 곡선의 선형 부분에 대해 선형 회귀 분석을 사용하여 계산기상에서 EC50계산을 수행한다.
참조문헌
1. 레간(Regan, J.W.), 바일리(Bailey, T.J.), 페펄(Pepperl, D.J.), 피어스(Pierce, K.L.), 보가더스(Bogardus, A.M.), 도넬로(Donello, J.E.), 페어베이른(Fairbairn, C.E.), 케드지에(Kedzie, K.M.), 우드워드(Woodward, D.F.) 및 길(Gil, D.W.)의 문헌 "Cloning of a Novel Human Prostaglandin Receptor with Characteristics of the Pharmacologically Defined EP2Subtype. Mol. Pharmacology 46: 213-220".
프로스타글란딘 E 2 수용체로의 결합에 대한 검정
막 제조:
모든 조작은 4℃에서 수행한다. 프로스타글란딘 E2타입 1 수용체(EP1), 타입 2(EP2), 타입 3(EP3) 또는 타입 4(EP4) 수용체를 발현시키는 형질감염된 세포를 수거하고, 완충액 A[50mM 트리스-HCl(pH 7.4), 10mM MgCl2, 1mM EDTA, 1mM 페파블록(Pefabloc) 펩타이드(인디아나주 인디아나폴리스 소재의 베링거 만하임 코포레이션(Beehringer Mannheim Corp.) 제품), 10μM 포스포라미돈(Phosporamidon) 펩타이드(미조리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma) 제품), 1μM 펩스타틴 A 펩타이드(미조리주 세인트 루이스 소재의 시그마 제품), 10μM 엘라스타티날 펩타이드(미조리주 세인트 루이스 소재의 시그마 제품), 100μM 안티페인 펩타이드(미조리주 세인트 루이스 소재의 시그마 제품)]에 1ml당 2백만개 세포가 되도록 현탁시킨다. 세포를 브란손 소니파이어(Branson Sonifier)[Model #250; 코넥티컷주 단베리 소재의 브란손 울트라소닉스 코포레이션(Baranson Ultrasonics Corporation) 제품]를 사용하여 2회의 15초간 파열로 음파처리하여 분해시킨다. 미분해된 세포 및 찌꺼기를 100×g에서 10분 동안 원심분리하여 제거한다. 이어서, 막을 45,000×g에서 30분 동안 원심분리하여 수거한다. 펠렛화된 막을 완충액 A의 1ml당 3 내지 10mg의 단백질로 재현탁시키고, 단백질 농도를 브라포드(Braford, M.)의 방법[브라포드의 문헌 "Anal. Biochem., 72, 248(1976)]에 의해 결정한다. 이어서, 재현탁된 막을 사용할 때까지 -80℃에서 동결 저장한다.
결합 검정:
상술된 바와 같이 제조된 동결된 막을 녹이고 상기 완충액 A에 0.5mg/ml(래트 EP2에 대하여) 또는 0.3mg/ml(래트 EP4에 대하여)로 희석시킨다. 1부피의 막 제조물을 0.05부피의 시험 화합물 또는 완충액 및 1부피의 3nM3H-프로스타글란딘 E2(완충액 A중)(#TRK 431, 일리노이주 애링턴 하이츠 소재의 아머샴(Amersham) 제품)과 합한다. 혼합물(205㎕ 총 부피)을 1시간 동안 25℃에서 보온한다. 톰텍(Tomtec) 수거기[모델 마치(Model Mach) II/96, 코넥티컷주 오렌지 소재의 톰텍 제품]를 사용하여 GF/C 유리 섬유 여과기[#1205-401, 매릴랜드주 가이터스버그 소재의 왈락(Wallac) 제품]를 통해 여과시켜 막을 회수한다.3H-프로스타글란딘 E2결합된 막은 여과기로 붙잡히고, 완충액 및 미결합된3H-프로스타글란딘 E2는 여과기를 통해 폐기장치로 들어간다. 이어서, 각 샘플을 3ml의 50mM 트리스-HCl(pH 7.4), 10mM MgCl2및 1mM EDTA로 3회 세척한다. 이어서, 여과기를 마이크로파 오븐에서 가열하여 건조시킨다. 막에 결합된3H-프로스타글란딘의 양을 결정하기 위해, 건조된 여과기를 섬광 유체를 갖는 플라스틱 백내에 넣고, LKB 1205 베타플레이트(Betaplate) 판독기(미들랜드주 가이터스버그 소재의 왈락 제품)에서 계수한다. 특이적으로 결합된3H-프로스타글란딘 E2의 50%를 대체시키는데 필요한 시험 화합물의 농도로부터 IC50을 결정한다.
래트 EP2또는 EP4프로스타글란딘 E2수용체를 발현하는 293S 세포를 당 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 생성시킨다. 전형적으로, 공개된 전 길이의 수용체의 5'- 및 3'-말단에 상응하는 PCR(폴리머레이즈 쇄 반응) 프라이머를 상기 개시된 공지 방법에 따라 제조하고, EP2및 EP4수용체를 위해 래트 신장으로부터의 총 RNA를 사용하여 RT-PCR 반응에 사용한다.
래트 EP2수용체에 대한 전 길이의 코딩 서열을 네모토(Nemoto) 등의 문헌[Prostaglandins, 1997, 54, 713-725]에 개시된 바와 같이 제조한다. 래트 EP4수용체에 대한 전 길이의 코딩 서열을 산도(Sando) 등의 문헌[Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, 200, 1329-1333]에 개시된 바와 같이 제조한다. 이들 전 길이의 수용체는 EP2및 EP4수용체를 발현하는 293S 세포를 제조하기 위해 사용된다.
EP1수용체에 대한 전 길이의 코딩 서열을 펑크(Funk) 등의 문헌[Journal of Biological Chemistry, 1993, 268, 26767-26772]에 개시된 바와 같이 제조한다. EP2수용체에 대한 전 길이의 코딩 서열을 레간(Regan) 등의 문헌[Molecular Pharmacology, 1994, 46, 213-220]에 개시된 바와 같이 제조한다. EP3수용체에 대한 전 길이의 코딩 서열을 레간 등의 문헌[British Journal of Pharmacology, 1994, 112, 377-385]에 개시된 바와 같이 제조한다. EP4수용체에 대한 전 길이의 코딩 서열을 바스티엔(Bastien) 등의 문헌[Journal of Biological Chemistry, 1994, 269, 11873-11877]에 개시된 바와 같이 제조한다. 이들 전 길이의 수용체는 EP1, EP2, EP3및 EP4수용체를 발현하는 293S 세포를 제조하기 위해 사용된다.
인간 EP1, EP2, EP3또는 EP4프로스타글란딘 E2수용체를 발현하는 293S 세포는 당 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 생성된다. 전형적으로, 공개된 전 길이의 수용체의 5' 및 3'-말단에 상응하는 PCR(폴리머레이즈 쇄 반응) 프라이머는 상술된 공지 방법에 따라 제조되고, 원천으로서 인간 신장(EP1을 위해), 인간 폐(EP2을 위해), 인간 폐(EP3을 위해) 또는 인간 림프구(EP4을 위해)로부터의 총 RNA를 사용하여 RT-PCR 반응에 사용된다. PCR 생성물을 TA 오버행(overhang) 방법에 의해 pCR2.1[캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen) 제품]로 클로닝하고, 클로닝된 수용체의 동정을 DNA 서열화로 확인한다.
293S 세포[노쓰웨스턴 유니버서티(Northwestern Univ.)의 생화학과(Mayo)]를pcDNA3중 클로닝된 수용체로 엘렉트로포레이션(electroporation)에 의해 형질감염시킨다. G418로 형질감염된 세포를 선택하여 수용체를 발현하는 안정한 세포주를 확립한다.
라벨링되지 않은 PGE2를 경쟁체로 사용하여 전체 세포3H-PGE2결합 검정을 수행하여 최대수의 수용체를 발현하는 클론 세포주를 선택한다.
골절 치유 검정
전신 투여후 골절 치유에 미치는 효과에 대한 검정
골절 기법:
3개월 자란 스프라그-돌리(Sprage-Dawley) 래트를 케타민으로 마취시킨다. 우측 경골 또는 대퇴골의 근위 부분의 전방 내측쪽을 1cm 크기로 절개한다. 이후 경골 수술 기법을 설명한다. 골을 절개하고, 경골 조면(粗面)의 원위로부터 4mm 근처에 내부 융선의 2mm 내측까지 1mm 구멍을 뚫는다. 0.8mm 스테인레스 스틸 튜브로 골수내의 못고정(nailing)을 수행한다(36.3N의 최대 하중, 61.8N/mm의 최대 강성, 골과 동일한 조건하에 시험됨). 골수관의 천공은 수행하지 않는다. 표준화된 폐쇄 골절은 굵은 조우(jaw)가 달린 특정 표시된 조절가능한 핀셋을 사용하여 3점 굽힘으로 경비골 결합부 2mm 위에서 시행한다. 연질 조직의 손상을 최소화하기 위해 골절이 다른 위치로 벗어나지 않도록 주의한다. 피부를 단사(monofilament) 나일론 봉합사로 꿰맨다. 멸균 조건하에 수술을 수행한다. 못고정을 수행한 후 즉시 모든 골절부에 대한 방사선사진촬영을 수행하고, 특정화된 골간 영역 이외의부위가 골절되거나 못이 다른 위치에 고정된 래트는 제외시킨다. 남은 동물을 골절 치유 시험 시간마다 각 하위 군당 10 내지 12마리씩 무작위로 다음과 같은 군으로 나눈다. 제 1 군에는 래트 1마리당 1ml 비히클(물:100% 에탄올=95:5)을 매일 위관 공급하는 반면, 다른 군에는 10, 20, 40 및 80일 동안 시험될 화합물(래트 1마리당 1ml)을 0.01 내지 100mg/kg/일의 용량으로 매일 위관 공급한다.
10, 20, 40 및 80일째, 각 군으로부터의 10 내지 12마리의 래트를 케타민으로 마취하고, 방혈시켜 죽인다. 절개하여 경비골 둘다를 떼어내고, 모든 연질 조직을 제거한다. 각 군의 5 내지 6마리 래트로부터의 골은 조직학적 분석을 위해 70% 에탄올에 저장하고, 각 군의 또다른 5 내지 6마리의 래트로부터의 골은 수행될 방사선사진촬영 및 생물기계적 시험을 위해 완충된 링거(Ringer) 용액(+4℃, pH 7.4)에 저장한다.
조직학적 분석:
골절된 골의 조직학적 분석 방법은 모세킬드(Mosekilde) 및 백(Bak)에 의해 이미 공개되어 있다[The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A Histological Description. Bone, 14: 19-27, 1993]. 간단히, 골절 부위를 골절 선의 양쪽으로 8mm 위치에서 톱으로 자르고, 메틸메타크릴레이트에 칼슘을 제거하지 않은 채로 함침시키고, 라이처트-중 폴리컷 마이크로톰 상에서 정단면을 8㎛ 두께로 자른다. 매슨-트리크롬 염색된 정중앙 단면(경골과 비골 둘다 포함)을 사용하여 처리하고 처리하지 않은 채로 골절 치유에 대한 세포 및 조직의 반응을 육안으로 검사한다. 시리우스 레드(Sirius red) 염색된 부분을 사용하여 가골(假骨)구조의 특징을 입증하고 골절 부위에서 무층(無層) 골 및 층판상 골을 차별화한다. 하기 측정을 수행한다: (1) 골절 갭(gap)-골절시 피질성 골 단부 사이의 최단 거리로서 측정됨, (2) 가골 길이 및 가골 직경, (3) 가골의 총 골 부피 면적, (4) 가골 영역내의 조직 면적당 골질의 조직, (5) 가골내의 섬유상 조직, 및 (6) 가골내의 연골 면적.
생물기계적 분석:
생물기계적 분석 방법은 백 및 안드레아센(Andreassen)에 의해 이미 공개되었다(The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int 45:292-297, 1989). 요약하면, 생물기계적 시험 전에 모든 골절부의 방사선사진 촬영을 한다. 골절 치유의 기계적 특성을 파괴적인 3점 또는 4점 굽힘 과정에 의해 분석한다. 최대 하중, 강성, 최대 하중에서의 에너지, 최대 하중에서의 편향성 및 최대 응력을 결정한다.
국부 투여후의 골절 치유에 미치는 효과에 대한 검정
골절 기법:
대략 2년 자란 암컷 또는 수컷 비이글(beagle) 개를 마취하에 연구에 사용한다. 레네한(Lenehan, T. M.), 발리간드(Balligand, M), 누나메이커(Nunamaker, D.M) 및 우드(Wood, F.E) 등의 문헌[Effects of EHDP on Fracture Healing in Dogs. J. Orthop. Res. 3: 499-507; 1985]에 기술된 바와 같이 3점 굽힘에서의 느린 연속 하중에 의해 횡단 방사상 골절을 수행한다. 와이어를 골절 부위를 통해 잡아당겨 골의 완전한 해부학적 파열을 확보한다. 이후, 10주, 15주 또는 20주 동안 서방성 펠렛에 의해 전달되는 화합물의 느린 방출에 의해, 및 적합한 제형, 예컨대 페이스트 겔 용액 또는 현탁액중의 화합물의 투여에 의해 프로스타글란딘 작용제를 골절 부위에 국부적으로 전달시킨다.
조직학적 분석:
골절된 골의 조직학적 분석 방법은 피터(Peter, C.P.), 쿡(Cook, W.O.), 누나메이커, 프로보스트(Provost, M.T.), 시더(Seedor, J.G.), 로단(Rodan, G.A.)의 문헌[Effects of Alendronate on Fracture Healing and Bone Remodeling in Dogs. J. Orthop. Res. 14:74-70, 1996] 및 모세킬드 및 백의 문헌[The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A Histological Description. Bone, 14: 19-27, 1993]에 이미 공개되어 있다. 요약하면, 시험체를 죽인 후, 골절 부위를 골절 선의 양쪽으로 8mm 위치에서 톱으로 자르고, 메틸메타크릴레이트에 칼슘을 제거하지 않은 채로 함침시키고, 라이처트-중 폴리컷 마이크로톰 상에서 정단면으로 8㎛ 두께로 자른다. 매슨-트리크롬 염색된 정중앙 단면(경골과 비골 둘다 포함)을 사용하여 처리하고 처리하지 않은채로 골절 치유에 대한 세포 및 조직의 반응을 육안으로 검사한다. 시리우스 레드 염색된 부분을 사용하여 가골(假骨) 구조의 특징을 입증하고 골절 부위에서 무층 골 및 층판상 골을 차별화한다. 하기 측정을 수행한다: (1) 골절 갭-골절시 피질성 골 단부 사이의 최단 거리로서 측정됨, (2) 가골 길이 및 가골 직경, (3) 가골의 총 골 부피 면적, (4) 가골 영역내의 조직 면적당 골질의 조직, (5) 가골내의 섬유상 조직, 및 (6) 가골내의 연골 면적.
생물기계적 분석:
생물기계적 분석 방법은 백 및 안드레아센의 문헌[The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int 45:292-297, 1989] 및 피터, 쿡, 누나메이커, 프로보스트, 시더 및 로단의 문헌[Effects of Alendronate on Fracture Healing and Bone Remodeling in Dogs. J. Orthop. Res. 14:74-70, 1996]에 이미 공개되어 있다. 요약하면, 생물기계적 시험 전에 모든 골절부의 방사선사진 촬영을 한다. 골절 치유의 기계적 특성을 파괴적인 3점 또는 4점 굽힘 과정에 의해 분석한다. 최대 하중, 강성, 최대 하중에서의 에너지, 최대 하중에서의 편향성 및 최대 응력을 결정한다.
EP4수용체 선택성 작용제를 전신적으로 및/또는 국부적으로(예를 들면 골절 부위, 골절단 부위 또는 정형외과 수술부위) 전달하는 임의의 방식으로 본 발명의 방법에 따른 EP4수용체 선택성 작용제를 투여할 수 있다. 이들 방법은 경구적 경로, 비경구적 경로, 십이지장관내 경로 등을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 화합물은 경구적으로 투여되나, 비경구적 투여(예: 정맥내, 근육내, 경피적, 피하적, 직장내 또는 십이지장내)가 이용될 수 있는데, 예를 들면 경구 투여가 타겟에 비적합하거나 환자가 약물을 섭취할 수 없는 경우이다.
본 발명의 방법은 EP4수용체 선택성 작용제의 국부적 적용(예: 골절단의 골절 부위에)에 의해 골절 및 골절단을 치료하고 치유를 촉진시키기 위해 사용된다. 본 발명의 EP4수용체 선택성 작용제는 예를 들면 적합한 용매(예: 낙화생유 등의 오일성 용매)중의 화합물을 연골 성장판에 주입하거나, 또는 개방 수술의 경우, 적합한 비히클, 담체 또는 희석제(예: 골-왁스, 무기질제거된 골 분말, 중합체성 골 시멘트, 골 밀봉제 등)중의 화합물을 국부적으로 적용함으로써 골절 또는 골절단 부위에 적용된다. 다르게는, 국부 적용은 적합한 담체 또는 희석제중의 화합물의 용액 또는 분산액을 표면에 적용하거나, 통상 정형외과에서 사용되는 고체 또는 반고체 이식물[예: 다크론-메쉬(darcron-mesh), 겔-포움 및 키엘 골(kiel bone) 또는 보철]에 화합물을 혼입함으로써 달성될 수 있다.
임의의 경우, 투여되는 화합물의 양 및 시간은 물론 치료될 대상, 고통의 위중성, 투여 방식 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 따라서, 환자들간의 다양성 때문에, 본원에 제시된 투여량은 기준선이고, 담당의사는 환자에 대해 적절하다고 고려되는 치료를 달성하기 위한(예컨대, 골 질량을 증대시키기 위한) 약물 화합물의 용량을 적정할 수 있다. 원하는 치료 정도를 고려하여, 담당의사는 다양한 요인, 예를 들면 골질량 출발 수준, 환자의 연령, 이미 갖고 있는 질환의 존재 뿐만 아니라 기타 질환의 존재(예컨대, 심혈관계 질환)의 균형을 맞춰야 한다.
일반적으로, 골 질량을 상기 골절 역치(앞서 인용된 세계 보건 기구 연구에서 자세히 설명된 바와 같다)로 증대시키기에 충분한 EP4수용체 선택성 작용제의 양이 사용된다.
본 발명의 방법에 사용된 EP4수용체 선택성 작용제 화합물은 일반적으로 하나 이상의 본 발명의 화합물을 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 희석제와 함께 포함하는 약학 조성물의 형태로 투여된다. 따라서 EP4수용체 선택성 작용제 화합물은 임의의 통상의 경구적, 비강내, 비경구적, 직장내 또는 경피적 투여 형태로 개별적으로 투여될 수 있다.
경구적 투여를 위해, 약학 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 파우더 등의 형태를 취할 수 있다. 다양한 부형제(예: 시트르산 나트륨, 탄산 칼슘 및 인산 칼슘)를 함유하는 정제는 다양한 붕해제(예: 전분, 바람직하게는 감자 전분 또는 타피오카 전분 및 특정 복합 실리케이트) 및 결합제(예: 폴리비닐피롤리돈, 수크로즈, 젤라틴 및 아카시아)와 함께 사용될 수 있다. 추가로, 윤활제(예; 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 활석)가 종종 정제화(tabletting) 목적에 매우 유용하다. 유사한 유형의 고체 조성물 또한 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용되고, 이와 관련하여 바람직한 물질로는 락토즈 또는 밀크 슈가(milk sugar) 뿐만 아니라 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르제가 경구적 투여에 요구될 경우, 본 발명의 조성물은 다양한 감미제, 방향제, 착색제, 유화제 및/또는 현탁제 뿐만 아니라, 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 및 이의 다양한 유사 배합물이 혼합될 수 있다.
비경구적 투여를 위해, 호마유 또는 피넛유 또는 수성 프로필렌 글리콜중의 용액 뿐만 아니라 상응하는 수용성 염의 멸균 수용액이 사용될 수 있다. 이러한 수용액은 필요할 경우 적합하게 완충될 수 있는데, 액체 희석제는 우선 충분한 염분 또는 글루코스로 등장화된다. 이들 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 주사 목적에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용된 멸균 수성 매질은 모두 당 분야의 숙련가에게 잘 알려진 표준 기법에 의해 쉽게 얻을 수 있다.
경피적(예: 국부적) 투여를 위해, 희석된 멸균 수성 용액 또는 부분적으로 수성인 용액(일반적으로 약 0.1 내지 5% 농도), 다르게는 상기 비경구적 용액과 유사한 용액이 제조된다.
특정량의 활성 성분을 갖는 다양한 약학적 조성물을 제조하는 방법은 당 분야의 숙련가에게 공지되어 있거나, 본 개시내용에 비추어 명백할 것이다. 약학 조성물의 제조 방법의 예는 문헌[Remington's Pharmceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 제 19 판(1995)]을 참조한다.
연구 프로토콜
본 연구의 목적은 EP4수용체 선택성 작용제, 구체적으로 7-[2-(3-하이드록시-4-페닐-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산이 OVX 래트 모델에서 골 질량을 복구할 수 있는지를 결정하는 것이다.
스프라그-돌리 수컷 래트를 3.5개월 자랐을 때 난소적출하였다(OVX). OVX후 10개월째, 래트에 비히클 또는 7-[2-(3-하이드록시-4-페닐-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산을 28일동안 30mg/kg/일로 피하 주사하였다. 래트를 부검하였다. 부검시 각 래트로부터 우측 대퇴골을 제거하고, "부분적 고해상 스캔" 소프트웨어(매사추세츠주 왈탐 소재의 홀로직 인코포레이티드)가 장착된 이중 에너지 x-선 흡광분석계(DEXA, QDR 1000/W; 매사추세츠주 왈탐 소재의 홀로직 인코포레이티드)를 사용하여 스캐닝하였다. 스캔 필드 크기는 5.08×1.902cm이고, 해상도는 0.0254×0.0127cm이며, 스캔 속도는 7.25mm/초이다. 대퇴부 스캔 영상을 분석하였다. 총 대퇴골(WF), 원위 대퇴부 골간단(骨幹端)(DFM) 및 대퇴부 골간(FS)의 골 무기질 함량(BMC) 및 골 무기질 밀도(BMD)를 케(H.Z. Ke) 등의 문헌[Droloxifene, a New Estrogen Antagonist/Agonist, Prevents Bone Loss in Ovariectomized Rats. ENDOCRINOLOGY 136; 2435-2441, 1995]에 기술된 방법에 따라 결정하였다.
연구 결과 및 논의
비히클 처리된 OVX 래트와 7-[2-(3-하이드록시-4-페닐-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 처리된 OVX 래트를 비교한 결과, 총 대퇴부 BMC는 17% 증가하였고, 총 대퇴골 BMD는 13% 증가하였으며, 원위 대퇴골 BMC는 8% 증가하였고, 원위 대퇴골 BMD는 8% 증가하였으며, 대퇴골 골간 BMC는 20% 증가하였고, 대퇴부 골간 BMD는 18% 증가함을 알 수 있었다. 7-[2-(3-하이드록시-4-페닐-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 처리된 래트에서 PGE2-유사 부작용은 관찰되지 않았다.
이 테이터로부터 7-[2-(3-하이드록시-4-페닐-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산, 즉 EP4수용체 선택성 PGE2작용제는 이미 확립된 골감소증 OVX 래트에서 골 생성을 자극하고 골을 복구시킴을 알 수 있었다.
일반적 실험 과정
양성자 핵에 대해 400MHz에서 약 23℃하에 베리언 유니티(Varian Unity) 400 분광계[캘리포니아주 팔로 알토 소재의 베리언 코포레이션(Varian Co.) 제품] 상에 NMR 스펙트럼을 기록하였다. 화학적 전이는 ppm으로 표시된다. 피크 형태를 하기와 같이 표시한다: s, 단일선; d, 이중선; t, 삼중선; q, 4중선; m, 다중선; bs,넓은 단일선. 대기압하의 화학적 이온화(APCI) 질량 스펙트럼을 피슨스 플랫폼(Fisons Platform) II 분광계상에서 수득하였다. 염소 또는 브롬-함유 이온의 세기가 기재된 경우, 예상되는 세기 비율이 관찰되었고(35Cl/37Cl-함유 이온에 대해 약 3:1 및79Br/81Br-함유 이온에 대해 1:1), 단지 보다 낮은 질량 이온의 세기가 제시된다.
바이오티지(Biotage) 정제 시스템[버지니아주 찰로테스빌 소재의 바이오티지, 디악스 코포레이션(Biotage, Dyax Corporation) 제품]을 질소압하에 사용하여 중간 압력 크로마토그래피를 수행하였다. 낮은 질소압하에 유리 칼럼중 베이커 실리카 겔(40m)[뉴저지주 필립스버그 소재의 제이 티 베이커(J.T. Baker) 제품] 또는 실리카 겔 60[뉴저지주 깁스타운 소재의 이엠 사이언시즈(EM Sciences) 제품]을 사용하여 플래쉬 크로마토그래피를 수행하였다. 크로마토트론(Chromatotron)[모델 7924T, 해리슨 리서치(Harison Research) 제품]을 사용하여 방사 크로마토그래피를 수행하였다. 애널텍 유니플레이츠 실리카 겔 GF(Analtech Uniplates Silica Gel GF)(20×20cm)[델라웨어주 뉴웍 소재의 애널텍 인코포레이티드(Analtech, Inc.)]를 사용하여 제조용 크로마토그래피를 수행하였다. 반응 용매로서 사용된 디메틸포름아미드(DMF), 테트라하이드로푸란(THF) 및 디클로로메탄(CH2Cl2)은 알드리치 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Company)(위스콘신주 밀와우키 소재)에 의해 공급된 무수 등급이었다. "농축된"이란 용어는 회전 증발기상의 수흡입기 압력하에 용매를 제거함을 말한다. "h"란 약자는 시간을 나타낸다. "TBAF"란 용어는 테트라부틸암모늄 플루오라이드를 말한다. "DMAP"란 용어는 디메틸아미노피리딘을 말한다. "디클로로메탄" 및 "메틸렌 클로라이드"란 용어들은 동의어로서, 본 명세서 및 실시예와 제조예 전반에 걸쳐 교호적으로 사용된다.
실시예 1
7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산
단계 A: 7-[2R-[4-(3-클로로-페닐)-3-옥소-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르
0℃에서 THF(35ml)중 [3-(3-클로로-페닐)-2-옥소-프로필]-포스폰산 디메틸 에스테르(2.66g, 9.63밀리몰) 용액에 NaH(오일중 60중량%, 426mg, 10.7밀리몰)를 일부분씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, THF중 7-(2R-포밀-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵타노산 에틸 에스테르(약 10.6밀리몰, 상이한 양의 시약을 사용함을 제외하고 제조예 7에 기술된 방법에 따라 제조됨) 용액을 첨가하고, 반응물을 18시간 동안 교반하였다. AcOH를 첨가하고, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하였다. 유기 용액을 포화 NaHCO3용액(2회), 물(1회) 및 염수(1회)로 연속적으로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을 톨루엔중 15% 아세톤으로 용출시키면서 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 7-[2R-[4-(3-클로로-페닐)-3-옥소-부 트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(2.26g)를 제공하였다.
단계 B: 7-[2R-[4-(3-클로로-페닐)-3S-하이드록시-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르
무수 CH2Cl2(200ml)중 7-[2R-[4-(3-클로로-페닐)-3-옥소-부트-1-에닐]-5-옥 소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(2.1g, 5.0밀리몰) 용액에 (R)-2-메틸-CBS-옥사자보롤리딘(톨루엔중 1M, 5ml, 5밀리몰)을 첨가하고, 용액을 -45℃로 냉각하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하고, 카테콜보란(THF중 1M, 15ml, 15밀리몰)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 -45℃에서 교반하였다. 수성 HCl(1N, 100ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 18시간 동안 실온에서 교반하였다. 산성 수성 층을 분리하고, 유기 용액을 빙냉된 1N NaOH(2회)로 세척하고, 이어서 염수(1회)로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 1:1 EtOAc:헥산-헥산중 80% EtOAc)로 정제하여 3S:3R 알콜 부분입체이성체의 약 6:1 혼합물로서 7-[2R-[4-(3-클로로-페닐)-3S-하이드록시-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(800mg)를제공하였다.
단계 C: 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르
EtOH(50ml)중 7-[2R-[4-(3-클로로-페닐)-3S-하이드록시-부트-1-에닐]-5-옥 소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(800mg, 1.90밀리몰)의 용액에 탄소상 10% 팔라듐(80mg)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 45psi에서 4.5시간 동안 파르 쉐이커(Parr shaker)상에서 수소처리하였다. 촉매를 EtOH의 보조하에 셀라이트(Celite; 등록상표)를 통해 여과하여 제거하였다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 1:1 헥산:EtOAc-4:1 EtOAc:헥산)로 정제하여 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(625mg)를 제공하였다.
단계 D: 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산
EtOH(25ml)중 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(595mg, 1.40밀리몰)의 용액에 2N NaOH(6ml)를 첨가하였다. 반응물을 24시간 동안 실온에서 교반하고, 진공하에 초기 부피의 약 3/4로 농축시켰다. 수성 1N HCl을 첨가하여 pH를 약 2로 하였다. 수용액을 메틸렌 클로라이드로 3회 세척하였다. 합쳐진 유기 층을 물로 세척한 후 염수로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켜 실시예 1의 표제 화합물(500mg)을 제공하였다.
실시예 2
7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산
단계 A: 7-[2-옥소-5R-[3-옥소-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르
실시예 1, 단계 A에 대해 기술된 과정에 따라서, [2-옥소-3-(3-트리플루오로메틸-페닐)-프로필]-포스폰산 디메틸 에스테르(4.16g, 13.40밀리몰) 및 NaH(오일중 60%, 590mg, 14.7밀리몰)로부터 유도된 음이온을 7-(2R-포밀-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵타노산 에틸 에스테르(약 14.74밀리몰)와 24시간 이상 반응시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 헥산중 20% EtOAc-EtOAc)로 정제하여 7-[2-옥소-5R-[3-옥소-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(4.29g)를 제공하였다.
단계 B: 7-[2R-[3S-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르
-45℃에서 CH2Cl2(100ml)중 7-[2-옥소-5R-[3-옥소-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(1.5g, 3.31밀리몰) 및 (R)-2-메틸-CBS-옥사자보롤리딘(톨루엔중 1M, 0.5ml, 0.55밀리몰)의 용액에 카테콜보란(THF중 1M, 9.9ml, 9.9밀리몰)을 적가하였다. 용액을 24시간 동안 -45℃에서 교반하고, 1N HCl을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하고, 층을 분리하였다. 수용액을 CH2Cl2(2회)로 세척하고, 합쳐진 유기 층을 빙냉된 0.5N NaOH 및 염수(2회)로 연속적으로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 헥산중 50% EtOAc-헥산중 60% EtOAc-헥산중 80% EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중 5% MeOH)로 정제하여, HPLC 분석에 의해 3S:3R 알콜 부분입체이성체의 약 5.5:1 혼합물로서7-[2R-[3S-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(1.23g)를 제공하였다.
단계 C: 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르
실시예 1, 단계 C에 대해 기술된 과정에 따라서, EtOH(50ml)중 7-[2R-[3S-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(1.18g, 2.59밀리몰)의 용액을 탄소상 10% 팔라듐(120mg)의 존재하에 40 내지 45psi에서 파르 쉐이커 상에서 24시간 동안 수소처리하였다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 헥산중 50% EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중 1% MeOH-CH2Cl2중 3% MeOH-CH2Cl2중 5% MeOH-CH2Cl2중 10% MeOH)로 정제하여 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(1.08g)를 제공하였다.
단계 D: 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산
실시예 1, 단계 D에 대하여 기술된 과정에 따라서, 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(1.93g, 4.22밀리몰)를 EtOH(52ml)중 6N NaOH(26ml)로 24시간 이상 가수분해하였다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: EtOAc-CH2Cl2중 1% MeOH-CH2Cl2중 3% MeOH-CH2Cl2중 5% MeOH-CH2Cl2중 10% MeOH)로 정제하여 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산(1.66g)을 제공하였다.
단계 E: 7-[2S-[3S-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산의 나트륨 염
EtOH(16ml)중 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산(1.66g, 3.87밀리몰)의 용액에 수(3ml)중 NaHCO3(325mg, 3.87밀리몰)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 5시간 동안 교반하고, 진공하에 농축시켰다. 잔여물을 CH2Cl2(3회)로 공비시켜 실시예 2의 표제 화합물의 나트륨 염(1.698g)을 제공하였다.
실시예 3
5S-[4-(3-클로로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
단계 A: 7-[2R-[4-(3-클로로-페닐)-3-옥소-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
실시예 1, 단계 A에 대해 기술된 과정에 따라서, [3-(3-클로로-페닐)-2-옥 소-프로필]-포스폰산 디메틸 에스테르(3.35g, 12.12밀리몰) 및 NaH(오일중 60%, 533mg, 13.3밀리몰)로부터 유도된 음이온을 7-(2R-포밀-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵탄니트릴(약 13.3밀리몰)과 18시간 이상 반응시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 헥산중 20% EtOAc-헥산중 80% EtOAc)로 정제하여 7-[2R-[4-(3-클로로-페닐)-3-옥소-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(1.52g)을 제공하였다.
단계 B: 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3-옥소-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
실시예 1, 단계 C에 대해 기술된 과정에 따라서, MeOH(40ml)중 7-[2R-[4-(3-클로로-페닐)-3-옥소-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(860mg, 2.31밀리몰)을 탄소상 10% 팔라듐(86mg)의 존재하에 1시간 동안 수소처리하였다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 헥산-헥산중 20% EtOAc-헥산중 70% EtOAc)로 정제하여 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3-옥소-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴 (730mg)을 제공하였다.
단계 C: 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
0℃에서 MeOH(30ml)중 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3-옥소-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(730mg, 1.87밀리몰)의 용액에 NaBH4(35mg, 0.921밀리몰)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 45분 동안 교반하고, 물을 첨가하였다. 휘발물을 진공하에 제거하고, 남은 수용액을 메틸렌 클로라이드로 희석하였다. 유기 용액을 물 및 이어서 염수로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중 3% MeOH)로 정제하여 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(730mg)을 제공하였다.
단계 D: 5S-[4-(3-클로로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
톨루엔(30ml)중 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(730mg, 1.94밀리몰), 트리메틸실릴아지드(0.63ml, 0.475밀리몰) 및 디부틸틴 옥사이드(96mg, 3.87밀리몰)의 용액을 환류하에 18시간 동안 가열시켰다. 휘발물을 진공하에 제거하고, 잔여물을 CH2Cl2로 희석시켰다. 유기 용액을 1N HCl 및 이어서 염수로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: EtOAc-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 7% MeOH)로 정제하여 TMS 착체를 제공하였다. 잔여물을 MeOH로 희석시키고, 2N HCl을 첨가하고, 용액을 40분 동안 교반하였다. 용액을 CH2Cl2로 희석시키고, 유기 층을 물 및 이어서 염수로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: EtOAc-CH2Cl2중 7% MeOH)로 정제하여 5S-[4-(3-클로로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온(521mg)을 제공하였다.
실시예 4
5S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
단계 A: 7-[2-옥소-5R-[3-옥소-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
실시예 1, 단계 A에 대해 기술된 과정에 따라서, [2-옥소-3-(3-트리플루오로메틸-페닐)-프로필]-포스폰산 디메틸 에스테르(2.68g, 8.64밀리몰) 및 NaH(오일중 60중량%, 400mg, 10밀리몰)로부터 유도된 음이온을 7-(2R-포밀-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵탄니트릴(약 10밀리몰)과 18시간 이상 반응시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 헥산중 30% EtOAc-헥산중 80% EtOAc)로 정제하여 7-[2-옥소-5R-[3-옥소-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(1.2g)을 제공하였다.
단계 B: 7-[2R-[3S-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
-45℃에서 CH2Cl2(112ml)중 7-[2-옥소-5R-[3-옥소-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(1.14g, 2.81밀리몰) 및 (R)-2-메틸-CBS-옥사자보롤리딘(톨루엔중 1M, 0.42ml, 0.42밀리몰)의 용액에 카테콜보란(THF중 1M, 8.4ml, 8.4밀리몰)을 적가하였다. 용액을 18시간 동안 -45℃에서 교반하고, 1N HCl을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40분 동안 실온에서 교반하고, 층을 분리하였다. 유기 용액을 차가운 1N NaOH(3회)로 세척하였다. 이어서, 유기 용액을 1N HCl, 물 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 1:1의 헥산:EtOAc-헥산중 80% EtOAc)로 정제하여,1H NMR 분석에 의해 3S:3R 알콜 부분입체이성체의 약 2.5:1 비율의 혼합물로서 7-[2R-[3S-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부 트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(820mg)을 제공하였다.
단계 C: 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
실시예 1, 단계 C에 대해 기술된 과정에 따라서, MeOH(40ml)중 7-[2R-[3S-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(810mg)을 탄소상 10% 팔라듐(100mg)의 존재하에 50psi에서 파르 쉐이커 상에서 18시간 동안 수소처리하였다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중 3% MeOH)로 정제하여 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(720mg)을 제공하였다.
단계 D: 5S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-1-[6-(2H-테트라 졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
실시예 3, 단계 D에 대하여 기술된 과정에 따라서, 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(710mg, 1.73밀리몰)을 톨루엔(25ml)중 아지도트리메틸실란(399mg, 3.46밀리몰) 및 디부틸틴 옥사이드(43mg, 1.7밀리몰)와 반응시키고, 18시간 동안 환류하에 18시간 동안 가열시켰다. 휘발물을 진공하에 제거하고, 잔여물을 CH2Cl2로 희석시켰다. 유기 용액을 1N HCl(2회), 물(1회) 및 염수(1회)로 연속적으로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고,(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: EtOAc-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 8% MeOH)로 정제하여 5S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온(450mg)을 제공하였다.
단계 E: 5S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-1-[6-(2H-테트라 졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온의 나트륨 염
실시예 2, 단계 E에 대해 기술된 과정에 따라서, 5S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온(428mg, 0.944밀리몰)을 NaHCO3(79mg, 0.94밀리몰)로 처리하여 나트륨 염(430mg)을 제공하였다.
실시예 5
5-[4-(4-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
단계 A: 7-[2-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(4-플루오로-페닐)-부틸]-5-옥 소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
DMF(5ml)중 5-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(4-플루오로-페닐)-부틸]-피롤리딘-2-온(150mg, 0.41밀리몰)의 용액을 DMF(10ml)중 NaH(오일중 60중량%, 16mg, 0.41밀리몰)에 첨가하였다. 1.5시간 후, DMF(5ml)중 7-브로모헵탄니트릴 (78mg, 0.41밀리몰)을 첨가하고, 반응 혼합물을 90℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 물(20ml)를 첨가하고, 수용액을 EtOAc(15ml로 4회)로 세척하였다. 합쳐진 유기 용액을 물(15ml로 2회)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을 중간 압력 크로마토그래피(1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 7-[2-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(4-플루오로-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(161mg)을 제공하였다.
단계 B: 7-[2-[4-(4-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
0℃에서 THF(20ml)중 7-[2-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(4-플루오로-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(158mg, 0.333밀리몰)의 용액에 TBAF(THF중 1M, 0.50ml, 0.50밀리몰)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, 포화된 수성 NaHCO3를 첨가하였다. 휘발물을 진공하에 제거하였다. 남은 수용액을 CHCl3(5ml로 4회)로 세척하고, 합쳐진 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 1:1의 헥산:EtOAc-EtOAc)로 정제하여 7-[2-[4-(4-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(82mg)을 제공하였다.
단계 C: 5-[4-(4-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
실시예 3, 단계 D에 대해 기술된 과정에 따라서, 7-[2-[4-(4-플루오로-페 닐)-3-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴을 톨루엔(10ml)중 아지도트리메틸실란(45mg, 0.394밀리몰) 및 디부틸틴 옥사이드(5mg, 0.02밀리몰)과 반응시키고, 16시간 동안 환류하에 가열시켰다. 추가의 아지도트리메틸실란(200mg) 및 디부틸틴 옥사이드(50mg)를 첨가하고, 반응 혼합물을 5시간 동안 환류하에 가열시켰다. 반응 혼합물을 1N HCl(5ml)로 pH 2까지 산성화시키고, 수용액을EtOAc(10ml로 4회)로 세척하였다. 합쳐진 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: EtOAc-39:1 EtOAc:MeOH-19:1 EtOAc:MeOH)로 정제하여 실시예 5A의 표제 화합물(39mg)을 제공하였다.
실시예 6
5-(4-비페닐-3-일-3-하이드록시-부틸)-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
단계 A: 7-[2-[4-비페닐-3-일-3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
실시예 5, 단계 A에 대해 기술된 과정에 따라서, 5-[4-비페닐-3-일-3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부틸]-피롤리딘-2-온(239.1mg, 0.564밀리몰) 및 NaHMDS(THF중 1M, 0.67ml, 0.67밀리몰)로부터 유도된 음이온을 7-브로모헵탄니트릴 (118mg, 0.620밀리몰)로 70℃에서 24시간 동안 알킬화시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: CH2Cl2-CH2Cl2중 1% MeOH-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 4% MeOH)로정제하여 7-[2-[4-비페닐-3-일-3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(187mg)을 제공하였다. MS 533.3(M+1).
단계 B: 7-[2-(4-비페닐-3-일-3-하이드록시-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
실시예 5, 단계 B에 기술된 과정에 따라서, 7-[2-[4-비페닐-3-일-3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(187mg, 0.351밀리몰)을 TBAF(THF중 1M, 0.53ml, 0.53밀리몰)로 보호제거하였다. 0℃에서 첨가를 수행하고, 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: CH2Cl2-CH2Cl2중 1% MeOH-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 6% MeOH-CH2Cl2중 10% MeOH)로 정제하여 7-[2-(4-비페닐-3-일-3-하이드록시-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(85mg)을 제공하였다.
단계 C: 5-(4-비페닐-3-일-3-하이드록시-부틸)-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
실시예 3, 단계 D에 대해 기술된 과정에 따라서, 7-[2-(4-비페닐-3-일-3-하이드록시-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(109mg, 0.260밀리몰)을 톨루엔 (5.3ml)중 아지도트리메틸실란(0.69ml, 0.52밀리몰) 및 디부틸틴 옥사이드(11mg, 0.044밀리몰)와 반응시키고, 72시간 동안 환류하에 가열시켰다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 물을 첨가하였다. 혼합물을 1N HCl로 pH 2까지 산성화시키고, 수용액을 CH2Cl2중 5% MeOH(3회)로 세척하였다. 합쳐진 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 4% MeOH-CH2Cl2중 8% MeOH)로 정제하여 실시예 6의 표제 화합물(107mg)을 제공하였다.
실시예 7
5-[4-(3-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
단계 A: 7-[2-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(3-플루오로-페닐)-부틸]-5-옥 소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
실시예 5, 단계 A에 대해 기술된 과정에 따라서, 5-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(3-플루오로-페닐)-부틸]-피롤리딘-2-온(250mg, 0.684밀리몰) 및 NaHMDS(THF중 1M, 0.80ml, 0.80밀리몰)로부터 유도된 음이온을 7-브로모헵탄니트릴(142mg, 0.748밀리몰)로 70℃에서 24시간 동안 알킬화시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중 5% MeOH)로 정제하여 7-[2-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(3-플루오로-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(261.7mg)을 제공하였다.
단계 B: 7-[2-[4-(3-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
실시예 5, 단계 B에 대해 기술된 과정에 따라서, 7-[2-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(3-플루오로-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴((261.7mg, 0.551밀리몰)을 TBAF(THF중 1M, 0.83ml, 0.83밀리몰)로 보호제거하였다. 0℃에서 첨가를 수행하고, 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: CH2Cl2-CH2Cl2중 1% MeOH-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 4% MeOH)로 정제하여 7-[2-[4-(3-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(141mg)을 제공하였다.
단계 C: 5-[4-(3-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
실시예 6, 단계 C에 대해 기술된 과정에 따라서, 7-[2-[4-(3-플루오로-페 닐)-3-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(141.3mg, 0.392밀리몰)을 톨루엔(8ml)중 아지도트리메틸실란(0.210ml, 1.57밀리몰) 및 디부틸틴 옥사이드(29mg, 0.116밀리몰)와 반응시키고, 72시간 동안 환류하에 가열시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: CH2Cl2-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 4% MeOH-CH2Cl2중 6% MeOH)로 정제하여 실시예 5C의 표제 화합물(101.5mg)을 제공하였다.
실시예 8
5S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
단계 A: 7-[2R-[3S-하이드록시-4-(3-클로로-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
-45℃에서 CH2Cl2(200ml)중 7-[2-옥소-5R-[3-옥소-4-(3-클로로-페닐)-부트-1-에닐]-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(1.62g, 4.34밀리몰)의 용액에 (R)-2-메틸-CBS-옥사자보롤리딘(톨루엔중 1M, 1.3ml, 1.3밀리몰)을 첨가하였다. 20분 동안 교반한 후, 카테콜보란(THF중 1M, 13ml, 13밀리몰)을 적가하였다. 반응물을 -45℃에서 16시간 동안 교반하고, 1N HCl을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하여 층을 분리시켰다. 유기 용액을 차가운 1N NaOH(3회)로 세척하였다. 유기 용액을 1N HCl, 물 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 1:1 헥산:EtOAc-CH2Cl2중 20% MeOH)로 정제하여, HPLC에 의해 3S:2R 알콜의 8.2:1의 혼합물로서 7-[2R-[3S-하이드록시-4-(3-클로로-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(536mg)을 제공하였다.
단계 B: 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
실시예 4, 단계 C에 대해 기술된 과정에 따라서, EtOH(30ml)중 7-[2R-[3S-하이드록시-4-(3-클로로-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(536mg)을 탄소상 10% 팔라듐(60mg)의 존재하에 3.5시간 동안 수소처리하였다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 1:1 헥산:EtOAc-CH2Cl2중 20% MeOH)로 정제하여 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(440mg)을 제공하였다.
단계 C: 5S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온
실시예 3, 단계 D에 대해 기술된 과정에 따라서, 톨루엔(30ml)중 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(420mg, 1.114밀리몰), 트리메틸실릴아지드(257mg, 2.23밀리몰) 및 디부틸틴 옥사이드(56mg)의 혼합물을 16시간 동안 환류하에 가열시켰다. 휘발물을 진공하에 제거하고, 잔여물을 MeOH에 용해시키고, 3N HCl과 함께 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 물 및 CH2Cl2로 희석시키고, 층을 분리하였다. 유기 층을 물 및 이어서 염수로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: EtOAc-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 7% MeOH)로 정제하여 5S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온(311mg)을 제공하였다.
실시예 9
7-[2R-[3-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산
단계 A: 7-[2-옥소-5R-[3-옥소-4-(3-페녹시-페닐)-부트-1-에닐]-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르
실시예 1, 단계 A에 대해 기술된 과정에 따라서, [2-옥소-3-(3-페녹시-페 닐)-프로필]-포스폰산 디메틸 에스테르(633mg, 1.98밀리몰) 및 NaH(오일중 60%, 70mg, 1.74밀리몰)로부터 유도된 음이온을 7-(2R-포밀-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵타노산 에틸 에스테르(약 1.58밀리몰)과 24시간 이상 반응시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(EtOAc)로 정제하여 7-[2-옥소-5R-[3-옥소-4-(3-페녹시-페닐)-부트-1-에닐]-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(215mg)를 제공하였다.
단계 B: 7-[2R-[3-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르
실시예 3, 단계 C에 대해 기술된 과정에 따라서, 7-[2-옥소-5R-[3-옥소-4-(3-페녹시-페닐)-부트-1-에닐]-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(215mg, 0.451밀리몰)를 0℃에서 4시간 이상 EtOH(3ml)중 NaBH4(17mg, 0.45밀리몰)과 반응시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(EtOAc)로 정제하여 7-[2R-[3-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(167mg)를 제공하였다.
단계 C: 7-[2R-[3-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산
실시예 1, 단계 D에 대해 기술된 과정에 따라서, 7-[2R-[3-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(29mg, 0.060밀리몰)를 실온에서 24시간 이상 EtOH(4.0ml)중 2M NaOH로 가수분해시켜 표제 화합물(20mg)을 제공하였다.
실시예 10
7-[2S-[3-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산
단계 A: 7-[2S-[3-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르
실시예 1, 단계 C에 대해 기술된 과정에 따라서, 7-[2R-[3-하이드록시-(4-3-페녹시-페닐)-부트-1-에닐]-5-옥소-피롤리딘-1일]-헵타노산 에틸 에스테르(139mg, 0.290밀리몰), MeOH(30ml) 및 탄소상 10% 팔라듐(14mg)의 혼합물을 18시간 동안 50psi에서 파르 쉐이커 상에서 수소처리하였다. 중간 압력 크로마토그래피(1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 7-[2S-[3-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(86mg)를 제공하였다.
단계 B: 7-[2S-[3-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산
실시예 1, 단계 D에 대해 기술된 과정에 따라서, 7-[2S-[3-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(86mg, 1.79밀리몰)를 18시간 이상 MeOH중 2N NaOH(4ml)로 가수분해시켜 표제 화합물(62mg)을 제공하였다.
제조예 1
7-(2R-하이드록시메틸-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵탄니트릴
단계 A: 7-[2R-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시메틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴
DMF(250ml)중 NaH(오일중 60%, 3.836g, 0.0959밀리몰, 25ml의 DMF로 세척함)의 혼합물에 DMF(50ml)중 5R-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시메틸)-피롤리딘-2-온 (Tetrahedron: Asymmetry, 1996, 7, 2113)(20.00g, 87.19밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하고, DMF(50ml)중 7-브로모헵타노니트릴(16.574g, 87.19밀리몰) 용액을 첨가하였다. 반응물을 90℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 물(750ml)을 첨가하였다. 수용액을 EtOAc(250ml로 4회)로 세척하였다. 합쳐진 유기 용액을 물(250ml로 2회)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 용매 구배(9:1 헥산:EtOAc-7:3 헥산:EtOAc-1:1 헥산:EtOAc)로 용출하면서 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 7-[2R-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시메틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(22.46g)을 제공하였다.
단계 B: 7-(2R-하이드록시메틸-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵탄니트릴
테트라부틸암모늄 플루오라이드의 용액(THF중 1M, 100.0ml, 100.0밀리몰)을 0℃에서 THF(400ml)중 7-[2R-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시메틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵탄니트릴(22.39g, 66.13밀리몰)의 용액에 천천히 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 4시간 동안 교반하였다. 포화 수성 NaHCO3(250ml)을 첨가하고, 휘발물을 진공하에 제거하였다. 남은 수용액을 CHCl3(200ml로 4회)로 세척하였다. 합쳐진 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 용매 구배(9:1 헥산:EtOAc-4:1 헥산:EtOAc-7:3 헥산:EtOAc-6:4 헥산:EtOAc-1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-9:1 EtOAc:MeOH)로 용출하면서 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 7-(2R-하이드록시메틸-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵탄니트릴(14.922g)을 제공하였다.
제조예 2
7-(2R-하이드록시메틸-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵타노산 에틸 에스테르
단계 A: 7-[2R-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시메틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르
제조예 1, 단계 A에 대해 기술된 과정에 따라서, DMF(600ml)중 5R-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시메틸)-피롤리딘-2-온(30.000g, 130.8밀리몰) 및 NaH(오일중 60%, 5.756g, 143.9밀리몰)로부터 유도된 음이온을 3시간 동안 90℃에서 에틸 7-브로모헵타노에이트(32.559g, 137.3밀리몰)와 반응시켰다. 용매 구배(9:1 헥산:EtOAc-4:1 헥산:EtOAc-7:3 헥산:EtOAc-6:4 헥산:EtOAc)로 용출하면서 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 7-[2R-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시메 틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(39.46g)를 제공하였다.
단계 B: 7-(2R-하이드록시메틸-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵타노산 에틸 에스테르
제조예 1, 단계 B에 대해 기술된 과정에 따라서, 7-[2R-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시메틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산 에틸 에스테르(36.46g, 102.3밀리몰)을 TBAF(THF중 1M, 154.0ml, 154.0밀리몰)로 2.5 시간 동안 보호제거하였다. 용매 구배(9:1 헥산:EtOAc-6:4 헥산:EtOAc-1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-19:1 EtOAc:MeOH)로 용출하면서 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 7-(2R-하이드록시메틸-5-옥 소-피롤리딘-1-일)-헵타노산 에틸 에스테르(25.41g)을 제공하였다.
제조예 3
[2-옥소-3-(3-트리플루오로메틸-페닐)-프로필]-포스폰산 디메틸 에스테르
단계 A: N-메톡시-N-메틸-2-(3-트리플루오로메틸-페닐)-아세트아미드
0℃에서 DMF(25ml) 및 CH2Cl2(25ml)중 N,O-디메틸하이드록시아민 하이드로클로라이드(1.577g, 16.2밀리몰)의 용액에 트리에틸아민(2.25ml)을 첨가하였다. 5분 동안 교반한 후, 3-트리플루오로메틸페닐 아세트산(3.0g, 14.7밀리몰), HOBT(3.177g, 23.5밀리몰) 및 DEC(2-디에틸아미노에틸 클로라이드 하이드로클로라이드; 3.10g, 16.2밀리몰)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하고, 진공하에 농축시켰다. 잔여물을 EtOAc로 희석하고, 유기 용액을 1N NaOH(2회), 물 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 진공하에 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 헥산중 20% EtOAc-헥산중 50% EtOAc)하여 N-메톡시-N-메틸-2-(3-트리플루오로메틸-페닐)-아세트아미드를 제공하였다.
단계 B: [2-옥소-3-(3-트리플루오로메틸-페닐)-프로필]-포스폰산 디메틸 에스테르
-78℃에서 톨루엔(80ml)중 디메틸 메틸포스포네이트(9.4g, 75.8밀리몰)의 용액에 n-BuLi(헥산중 2.5M, 28ml, 70밀리몰)을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 톨루엔(50ml)중 N-메톡시-N-메틸-2-(3-트리플루오로메틸-페닐)-아세트아미드(14.39g)의 용액을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 2.5시간 동안 교반하고 AcOH(40ml)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에 첨가하고, 물을 첨가하였다. 유기 층을 물로 세척하고, 이어서 염수로 세척하였다. 유기 용액을건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 진공하에 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: CH2Cl2-CH2Cl2중 2% MeOH)로 정제하여 제조예 3의 표제 화합물(9.37g)을 제공하였다.
제조예 4
[3-(3-클로로-페닐)-2-옥소-프로필]-포스폰산 디메틸 에스테르
적절한 출발 물질을 대체하여 제조예 3에 대해 기술된 과정과 유사한 과정에 따라 제조예 4의 표제 화합물을 제조하였다.
제조예 5
[3-(3-클로로-페닐)-2-옥소-프로필]-포스폰산 디메틸 에스테르
-78℃에서 THF(270ml)중 디메틸 메틸포스포네이트(17.93g, 144밀리몰)의 용액에 n-BuLi(2.5M, 64.2ml, 160.6밀리몰)을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하고, (3-클로로-페닐)-아세트산 메틸 에스테르(26.93g, 146밀리몰)를 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온하고, 24시간 동안 교반하였다. AcOH(15ml)를 첨가하고, 휘발물을 진공하에 제거하였다. 잔여물을 CH2Cl2로 희석시키고, 유기 용액을 포화 수성 NaHCO3(3회)로 주의깊게 세척하였다. 유기 층을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 진공하에 농축시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(용매 구배: 헥산중 20% EtOAc-EtOAc)로 정제하여 표제 화합물(9.28g)을 제공하였다.
제조예 6
테트라하이드로-피롤리진-3,5-디온
제조예 6의 표제 화합물을 미국 특허 제 4,663,464호에 기술된 과정에 따라 제조하였다.
제조예 7
7-(2R-포밀-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵타노산 에틸 에스테르
벤젠(50ml)중 7-(2R-하이드록시메틸-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵타노산 에틸 에스테르(1.63g, 6.01밀리몰)의 용액에 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(3.46g, 18.03밀리몰) 및 DMSO(1.5ml, 24.04밀리몰)를 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각하고, 피리디늄 트리플루오로아세테이트(1.28g, 6.61밀리몰)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하고, 이어 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 오일성 잔여물로부터 따라 부어내었다. 잔여물을 벤젠(3회)으로 세척하고, 합쳐진 벤젠 세척액을 진공하에 농축시켜 7-(2R-포밀-5-옥소-피롤리딘-1-일)-헵타노산 에틸 에스테르를 제공하였고, 이는 추가의 정제없이 사용되었다.
제조예 8
4-(3-[2-[4-비페닐-3-일-3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-프로필)-벤조산 메틸 에스테르
단계 A: 5-(3-브로모-3-옥소-부틸)-피롤리딘-2-온
0℃에서 CH2Cl2(320ml)중 테트라하이드로-피롤리진-3,5-디온(5g, 36밀리몰)의 용액에 3-브로모벤질마그네슘 브로마이드(Et2O중 0.25M, 155ml, 38.8밀리몰)를 적가하였다. 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반하고, 포화 수성 암모늄 클로라이드로 급냉시켰다. 수성 1N HCl을 첨가하여 pH 3에 도달되도록 하였다. 실온으로 가온시킨 후, 수용액을 CH2Cl2(3회)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 용매 구배(1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중 5% MeOH)를 사용하여 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 5-(3-브로모-3-옥소-부틸)-피롤리딘-2-온(7.84g)을 제공하였다.
단계 B: 5-(3-브로모-3-하이드록시-부틸)-피롤리딘-2-온
0℃에서 EtOH(130ml)중 5-(3-브로모-3-옥소-부틸)-피롤리딘-2-온(7.84g, 25.3밀리몰)의 용액에 NaBH4(480mg, 12.6밀리몰)을 첨가하고, 반응물을 0℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 포화 수성 암모늄 클로라이드로 반응물을 급냉시켰다. 물 및 CH2Cl2을 첨가하였다. 수성 층을 CH2Cl2(3회)로 세척하고, 합쳐진 유기 추출물을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 용매 구배(1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중 1% MeOH-CH2Cl2중 3% MeOH-CH2Cl2중 5% MeOH-CH2Cl2중 8% MeOH)를 사용하여 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 5-(3-브로모-3-하이드록시-부틸)-피롤리딘-2-온(6.76g)을 제공하였다.
단계 C: 5-[3-브로모-3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부틸]-피롤리딘-2-온
DMF(86ml)중 5-(3-브로모-3-하이드록시-부틸)-피롤리딘-2-온(6.76g, 21.6밀리몰)의 용액에 3급-부틸디메틸실릴 클로라이드(3.59g, 23.8밀리몰)를 첨가한 후, 이미다졸(2.95g, 43.4밀리몰) 및 DMAP(264mg, 2.16밀리몰)를 첨가하였다. 반응물을 24시간 동안 교반하고, 포화 수성 암모늄 클로라이드로 급냉시켰다. 수용액을 EtOAc(3회)로 세척하고, 합쳐진 유기 추출물을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 용매 구배(CH2Cl2-CH2Cl2중 1% MeOH-CH2Cl2중 3% MeOH-CH2Cl2중 5% MeOH-CH2Cl2중 8% MeOH)를 사용하여 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 5-[3-브로모-3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부틸]-피롤리딘-2-온(7.45g)을 제공하였다.
단계 D: 5-[4-비페닐-3-일-3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부틸]-피롤리딘-2-온
DME(15ml)중 5-[3-브로모-3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부틸]-피롤리딘-2-온의 용액에 페닐보론산(236mg, 1.93밀리몰)을 첨가하였다. 팔라듐 아세테이트(26.8mg, 0.088밀리몰) 및 트리-o-톨릴포스핀(39.5mg, 0.176밀리몰)을 첨가한 후, 수(1.8ml)중 Na2CO3(37.3mg, 3.52밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 환류하에 24시간 동안 가열시켰다. 반응물을 냉각시키고, 휘발물을 진공하게 제거하였다. 잔여물을 염수 및 EtOAc로 희석시켰다. 수용액을 EtOAc(3회)로 세척하고, 합쳐진 유기 추출물을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고, 농축시켰다. 용매 구배(1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중 1% MeOH-CH2Cl2중 3% MeOH-CH2Cl2중 5% MeOH)를 사용하여 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 5-[4-비페닐-3-일-3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부틸]-피롤리딘-2-온(717.3mg)을 제공하였다.
제조예 9
5-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(3-플루오로-페닐)-부틸]-피롤리딘-2-온 단계: 5-[4-(3-플루오로-페닐)-3-옥소-부틸]-피롤리딘-2-온
제조예 8, 단계 A에 대해 기술된 과정에 따라서, 테트라하이드로-피롤리진-3,5-디온(2g 14밀리몰)을 3-플루오로벤질마그네슘 클로라이드(Et2O중 0.25M, 62ml, 15.5밀리몰)과 2.5시간 이상 반응시켰다. 용매 구배(1:1 헥산:EtOAc-2:1 EtOAc:헥산-EtOAc-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 10% MeOH)를 사용하여 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 5-[4-(3-플루오로-페닐부틸)-3-옥소-부틸]-피롤리딘-2-온(2.1730g)을 제공하였다.
단계 B: 5-[4-(3-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-피롤리딘-2-온
제조예 8, 단계 B에 대해 기술된 과정에 따라서, 5-[4-(3-플루오로-페닐)-3-옥소-부틸]-피롤리딘-2-온(2.17g, 8.71밀리몰)을 NaBH4(165mg, 4.35밀리몰)로 환원시켰다. 용매 구배(1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중 1% MeOH-CH2Cl2중 3% MeOH-CH2Cl2중 6% MeOH)를 사용하여 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 5-[4-(3-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-피롤리딘-2-온(2.23g)을 제공하였다.
단계 C: 5-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(3-플루오로-페닐)-부틸]-피롤리딘-2-온
제조예 8, 단계 C 대해 기술된 과정에 따라서, 5-[4-(3-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-피롤리딘-2-온(2.23g, 8.87밀리몰)을 3급-부틸디메틸실릴 클로라이드(1.47g, 9.76밀리몰)와 반응시켰다. 용매 구배(1:1 헥산:EtOAc-EtOAc-CH2Cl2중1% MeOH-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 4% MeOH)를 사용하여 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 5-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(3-플루오로-페닐)-부틸]-피롤리딘-2-온(2.84g)을 제공하였다.
제조예 10
5-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(4-플루오로-페닐)-부틸]-피롤리딘-2-온 단계 A: 5-[4-(4-플루오로-페닐)-3-옥소-부틸]-피롤리딘-2-온
제조예 8, 단계 A에 대해 기술된 과정에 따라서, 테트라하이드로-피롤리진-3,5-디온(1.41g, 10.1밀리몰)을 4-플루오로벤질마그네슘 클로라이드(Et2O중 0.25M, 50ml, 12.5밀리몰)과 5시간 이상 반응시켰다. 중간 압력 크로마토그래피로 정제(CH2Cl2중 2% MeOH)하여 5-[4-(4-플루오로-페닐)-3-옥소-부틸]-피롤리딘-2-온 (2.64g)을 제공하였다.
단계 B: 5-[4-(4-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-피롤리딘-2-온
제조예 8, 단계 B에 대해 기술된 과정에 따라서, 5-[4-(4-플루오로-페닐부틸)-3-옥소-부틸]-피롤리딘-2-온(2.64g, 밀리몰)을 NaBH4(400mg, 밀리몰)로 1시간 동안 실온에서 환원시켰다. 추가의 NaBH4(150mg)를 첨가하고, 반응물을 20시간 교반하였다. 용매 구배(CH2Cl2-CH2Cl2중 2% MeOH-CH2Cl2중 4% MeOH)를 사용하여 중간 압력 크로마토그래피로 정제하여 5-[4-(4-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-피롤리딘-2-온(2.01g)을 제공하였다.
단계 C: 5-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(4-플루오로-페닐)-부틸]-피롤리딘-2-온
제조예 8, 단계 C 대해 기술된 과정에 따라서, 5-[4-(4-플루오로-페닐)-3-하이드록시-부틸]-피롤리딘-2-온(1.95g, 7.79밀리몰)을 3급-부틸디메틸실릴 클로라이드(1.47g, 9.76밀리몰)와 반응시켰다. 중간 압력 크로마토그래피(CH2Cl2중 1% MeOH)로 정제하여 5-[3-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-4-(4-플루오로-페닐)-부틸]-피롤리딘-2-온을 제공하였다.
제조예 11
[2-옥소-3-(3-페녹시-페닐)-프로필]-포스폰산 디메틸 에스테르
적절한 출발 물질을 대체하여, 제조예 5의 화합물에 대해 기술된 방식과 유사한 방식으로 제조예 11의 표제 화합물을 제조하였다.
본 발명에 따라서, EP4수용체 선택성 작용제, 이의 전구약물 또는 이들 EP4수용체 선택성 작용제 또는 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 사용하여 포유동물에서 낮은 골 질량을 나타내는 증상을 부작용 없이 효과적으로 치료할 수 있었다.

Claims (29)

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  8. 낮은 골 질량을 나타내는 증상을 치료하기 위한 하기 화학식 1의 EP4선택성 작용제 또는 이들 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물:
    화학식 1
    상기 식에서,
    Q는 COOR3, CONHR4또는 테트라졸-5-일이고,
    A는 단일 결합 또는 시스형 이중 결합이고,
    B는 단일 결합 또는 트랜스형 이중 결합이고;
    U는이고;
    R2는 α-티에닐, 페닐, 페녹시, 일치환된 페닐 또는 일치환된 페녹시(여기서, 치환체는 클로로, 플루오로, 페닐, 페녹시, 메톡시, 트리플루오로메틸 또는 (C1-C3)알킬이다)이고,
    R3는 수소, (C1-C5)알킬, 페닐 또는 p-비페닐이고,
    R4는 COR5또는 SO2R5이고,
    R5은 페닐 또는 (C1-C5)알킬이다.
  9. 제 8 항에 있어서,
    EP4수용체 선택성 작용제가, Q가 5-테트라졸릴이고, U가인 화학식 1의 화합물인 약학 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    화합물이 5R-(3S-하이드록시-4-페닐-부트-1-에닐)-1-[6-(1H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온, 5S-[3R-하이드록시-4-페닐-부틸)-1-[6-(1H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온, 5S-[4-[3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온, 또는 5S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온인 약학 조성물.
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  14. 제 8 항에 있어서,
    EP4수용체 선택성 작용제가, Q가 COOH이고 U가인 화학식 1의 화합물인 약학 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    화합물이 7-[2S-(3R-하이드록시-4-페닐-부틸)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산, 7-[2R-(3S-하이드록시-4-페닐-부트-1-에닐)-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산, 7-[2S-(3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메톡시-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산, 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산, 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산, 또는 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산인 약학 조성물.
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  22. 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-페녹시-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산, 7-[2S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산; 7-[2S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-5-옥소-피롤리딘-1-일]-헵타노산; 5S-[4-(3-클로로-페닐)-3R-하이드록시-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온; 및 5S-[3R-하이드록시-4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-부틸]-1-[6-(2H-테트라졸-5-일)-헥실]-피롤리딘-2-온으로부터 선택되는 화합물.
  23. 삭제
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  27. 삭제
  28. 제 8 항 내지 제 10 항, 제 14 항 및 제 15 항중 어느 한 항에 있어서,
    증상이 골다공증, 골의 무름(frailty), 골다공성 골절, 골 결함, 유년기 특발성 골 손실, 치조(齒槽) 골 손실, 하악골 손실, 골절, 골절단, 치주염 관련된 골 손실, 또는 보철의 파고듦(prosthetic ingrowth)인 약학 조성물.
  29. 제 8 항 내지 제 10 항, 제 14 항 및 제 15 항중 어느 한 항에 있어서,
    전신 투여 또는 국소 투여를 하기 위한 약학 조성물.
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