ES2204458T3 - Agonista selectivos del receptor ep4 en el tratamiento de la osteoporisis. - Google Patents
Agonista selectivos del receptor ep4 en el tratamiento de la osteoporisis.Info
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Abstract
Uso de un agonista selectivo del receptor EP4 de Fórmula I: o de una de las sales farmacéuticamente aceptables de dicho compuesto, en la que: Q es COOR3, CONHR4 o tetrazol-5-ilo; A es un enlace sencillo o cis-doble; B es un enlace sencillo o trans-doble; =U es R2 es á-tienilo, fenilo, fenoxi, fenilo monosustituido o fenoxi monosustituido, siendo dichos sustituyentes cloro, fluoro, fenilo, metoxi, trifluorometilo o alquilo C1-C3; R3 es hidrógeno, alquilo C1-C5, fenilo o p-bifenilo; R4 es COR5 o SO2R5; y R5 es fenilo o alquilo C1-C5; o de ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)but-1-enil]-5- oxopirrolidin-1-il}-heptanoico o ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4- (3-fenoxifenil)butil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico; para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno que cursa con masa ósea reducida.
Description
Agonistas selectivos del receptor EP4 en el
tratamiento de la osteoporosis.
Esta invención se refiere a ciertos compuestos
que son agonistas de prostaglandina para la fabricación de un
medicamento que es útil para prevenir la pérdida ósea, restaurar o
aumentar la masa ósea y potenciar la curación ósea, incluyendo el
tratamiento de trastornos que se presentan con una masa ósea
reducida y/o defectos óseos en vertebrados, y en particular en
mamíferos, incluyendo seres humanos. Esta invención se refiere de
forma específica al uso de ciertos agonistas de prostaglandinas
selectivos para el receptor EP4.
La osteoporosis es una enfermedad esqueletal
sistémica, caracterizada por una masa ósea reducida y por el
deterioro del tejido óseo, con un incremento consiguiente de la
fragilidad del hueso y susceptibilidad a fracturas. En los Estados
Unidos, el trastorno afecta a más de 25 millones de personas y
provoca más de 1,3 millones de fracturas cada año, que anualmente
incluyen 500.000 fracturas vertebrales, 250.000 de cadera y 240.000
de muñeca. Las fracturas de cadera son la consecuencia más grave de
la osteoporosis, muriendo un 5-20% de pacientes en
un período de un año, y quedando más del 50% de los supervivientes
físicamente impedidos.
Los ancianos son los sujetos con un mayor riesgo
de osteoporosis y, por tanto, puede predecirse que el problema
aumente significativamente con el envejecimiento de la población. La
incidencia de fractura en todo el mundo se prevé que aumente tres
veces durante los próximos 60 años, y un estudio ha estimado que en
el año 2050 serán 4,5 millones las fracturas de cadera en todo el
mundo.
Las mujeres tienen un mayor riesgo de
osteoporosis que los varones. Las mujeres experimentan una brusca
aceleración de la pérdida ósea durante los cinco años posteriores a
la menopausia. Otros factores que incrementan el riesgo incluyen
fumar, abuso de alcohol, un modo de vida sedentario y una ingesta
baja de calcio.
Actualmente existen dos tipos principales de
terapias farmacéuticas para el tratamiento de la osteoporosis. El
primero es el uso de compuestos antiresorción para reducir la
resorción del tejido óseo.
Los estrógenos son un ejemplo de un agente
antiresorción. Es conocido que los estrógenos reducen las fracturas.
Además, Black et al., en el documento EP 0605193A1 describen
que los estrógenos, particularmente cuando se toman oralmente,
disminuyen los niveles plasmáticos de LDL y elevan los de
lipoproteínas de alta densidad (HDL) beneficiosas. Sin embargo, los
estrógenos son incapaces de restablecer el hueso hasta los niveles
de adultos jóvenes en el esqueleto ya osteoporótico. Además, la
terapia de estrógenos a largo plazo se ha relacionado con una serie
de trastornos que incluyen un incremento en el riesgo de cáncer de
útero, cáncer endometrial y posiblemente cáncer de mama, provocando
que muchas mujeres eviten este tratamiento. Los efectos secundarios
significativos indeseables asociados a la terapia de estrógenos
apoyan la necesidad de desarrollar terapias alternativas para la
osteoporosis que tengan el efecto deseable sobre las LDL en suero
pero que no provoquen efectos indeseables.
Un segundo tipo de terapia farmacéutica para el
tratamiento de la osteoporosis es el uso de agentes anabólicos para
promover la formación de hueso e incrementar la masa ósea. Se espera
que esta clase de agentes restablezca el hueso en el esqueleto ya
osteoporótico.
En los documentos de Gran Bretaña 1478281,
1479156 y en las patentes de Estados Unidos n^{os}. 4.175.203,
4.055.596, 4,175.203, 3.987.091 y 3.991.106 se describen ciertos
agonistas de prostaglandinas por ser útiles como, por ejemplo,
vasodilatadores renales.
La patente de Estados Unidos nº 4.033.996
describe ciertas
8-aza-9-oxo(y
dioxo)-tia-11,12-secoprostaglandinas
que son útiles como vasodilatadores renales, para la prevención de
la formación de trombos, para inducir la liberación de hormona del
crecimiento y como reguladores de la respuesta inmune.
La patente francesa nº 897.566 describe ciertos
derivados de aminoácidos para el tratamiento de enfermedades
neurológicas, mentales o cardiovasculares.
J. Org. Chem. 26; 1961; 1437 describe el ácido
N-acetil-N-bencil-p-aminofenilmercaptoacético.
La patente de Estados Unidos nº 4.761.430
describe ciertos compuestos de arilbencenosulfonamida como agentes
hipolipidemiantes.
La patente de Estados Unidos nº 4.443.477
describe ciertos ácidos sulfonamidofenilcarboxílicos como agentes
hipolipidemiantes.
La patente de Estados Unidos nº 3.528.961
describe ciertos derivados de \varepsilon -caprolactama como
colorantes.
La patente de Estados Unidos nº 3.780.095
describe ciertos ácidos anilinocarboxílicos acilados como
coleréticos.
\newpage
La patente de Estados Unidos nº 4.243.678
describe ciertos ácidos acilhidrocarbilaminoalcanoicos por tener
utilidad en el tratamiento de úlceras gástricas, como inhibidores de
la excreción de las glándulas sebáceas y para combatir la
inflamación cutánea.
La patente de Estados Unidos nº 4.386.031
describe ciertos ácidos
N-benzoil-\omega-anilinoalcanocarboxílicos
como agentes antialérgicos, inhibidores de la agregación
trombótica, agentes antiinflamatorios y agentes
hipolipidemiantes.
Además de osteoporosis, aproximadamente
20-25 millones de mujeres y un número en aumento de
hombres sufren fracturas vertebrales detectables como consecuencia
de una masa ósea reducida, con unas 250.000 fracturas de cadera
adicionales anuales descritas solamente en los Estados Unidos. El
caso anterior está asociado a una tasa de mortalidad del 12% en los
dos primeros años y a una tasa del 30% de pacientes que requieren
cuidados asistenciales a domicilio después de la fractura. Aunque
esto es ya significativo, es de esperar que aumenten las
consecuencias económicas y médicas de la convalecencia debida a una
curación lenta o imperfecta de estas fracturas de hueso, a causa del
envejecimiento de la población general.
Los estrógenos han demostrado (Bolander et
al., 38th Annual Meeting Orthopedic Research Society, 1992) que
mejoran la calidad de la curación de fracturas apendiculares. Por
tanto, la terapia de sustitución de estrógenos podría ser
procedimiento eficaz para el tratamiento de reparación de fracturas.
Sin embargo, el cumplimiento farmacéutico del paciente con la
terapia de estrógenos es relativamente malo debido a sus efectos
secundarios, que incluyen la reaparición de la menstruación,
mastodinia y un mayor riesgo de cáncer de útero, un mayor riesgo
percibido de cáncer de mama, y el uso concomitante de progestinas.
Además, los hombres son propensos a objetar el uso del tratamiento
con estrógenos. Existe la necesidad de una terapia que sea
beneficiosa para pacientes que han sufrido fracturas óseas
debilitantes y que aumente el cumplimiento farmacéutico del
paciente.
Se ha demostrado que la prostaglandina E2 (PGE2)
puede restaurar el hueso en un modelo de rata ovariectomizada
(OVX), un modelo de osteoporosis postmenopáusica. Ke, H.Z., et
al., Bone, 23:249-255, 1998. Sin embargo,
existen graves efectos secundarios asociados con la PGE2. Jee.,
W.S.S. and Ma, Y.F. Bone 21:297-304, 1997.
Aunque existen una serie de terapias para la
osteoporosis, existe una continua necesidad y una búsqueda continua
en este campo de la técnica de terapias alternativas para la
osteoporosis. Por otro lado, existe una necesidad de terapias para
la curación de las fracturas óseas. Además, existe una necesidad de
terapias que puedan promover un nuevo crecimiento en áreas
esqueletales en las que existan defectos tales como defectos
provocados o producidos por, por ejemplo, tumores en el hueso.
Además, existe una necesidad de terapias que puedan promover un
nuevo crecimiento en las áreas esqueletales en las que están
indicados injertos óseos.
Esta invención se refiere al uso de un agonista
selectivo del receptor EP4 de Fórmula I:
o las sales farmacéuticamente aceptables de
dichos compuestos, en la
que:
Q es COOR^{3}, CONHR^{4} o
tetrazol-5-ilo;
A es un enlace sencillo o
cis-doble;
B es un enlace sencillo o
trans-doble;
=U es
R^{2} es \alpha-tienilo,
fenilo, fenoxi, fenilo monosustituido y fenoxi monosustituido,
siendo dichos sustituyentes cloro, fluoro, fenilo, metoxi,
trifluorometilo o alquilo C_{1}-C_{3};
R^{3} es hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, fenilo o
p-bifenilo;
R^{4} es COR^{5} o SO_{2}R^{5}; y
R^{5} es fenilo o alquilo
C_{1}-C_{5};
o de ácido
7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)but-1-enil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico
o ácido
7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)butil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico;
para la fabricación de un medicamento para tratar
un trastorno que cursa con una masa ósea reducida.
Esta invención se refiere en particular a dicho
uso en el que dicho trastorno es osteoporosis, fragilidad, una
fractura osteoporótica, un defecto óseo, pérdida ósea idiopática de
la infancia, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea mandibular,
fractura ósea, osteotomía, pérdida ósea asociada con periodontitis
o recrecimiento protésico. Con preferencia, el agonista selectivo
del receptor EP4 se administra por vía sistémica, por ejemplo, por
vía oral, subcutánea, intramuscular o por aerosol. En otro aspecto
preferido, el agonista de EP4 se administra localmente.
El uso de esta invención es especialmente útil
cuando dicho trastorno es fragilidad.
El uso de esta invención es también especialmente
útil cuando dicho trastorno es osteoporosis.
El uso de esta invención es también especialmente
útil cuando dicho trastorno es fractura ósea o fractura
osteoporótica.
Un grupo preferido de agonistas selectivos del
receptor EP4 de Fórmula I es aquel en el que Q es
5-tetrazolilo y =U es
que forman compuestos que tienen la fórmula
I^{A},
Los compuestos particularmente preferidos dentro
de este grupo incluyen
5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil-pirrolidin-2-ona;
5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona;
5R-(3S-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-1-[6-(1H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona;
y
5S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-1-[6-(1H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona.
Otro grupo preferido de agonistas selectivos del
receptor EP4 de Fórmula I para usar en los procedimientos de esta
invención son los compuestos de Fórmula I en los que Q es COOH. Los
compuestos particularmente preferidos dentro de este grupo incluyen
el ácido
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico;
el ácido
7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico;
el ácido
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico;
el ácido
7-(2S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico;
y el ácido
7-[2R-(3S-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico.
La invención también incluye un compuesto
seleccionado de ácido
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)butil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico;
ácido
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometilfenil)butil]-5-oxopirrolidin-1-il}-hepta-
noico; ácido 7-{2S-[4-(3-clorofenil)-3R-hidroxibutil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico; 5S-[4-(3-clorofenil)-3R-hi-
droxibutil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)hexil]-pirrolidin-2-ona; y 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometilfenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona; composiciones farmacéuticas que contienen dicho compuesto; y dicho compuesto para uso como medicamento.
noico; ácido 7-{2S-[4-(3-clorofenil)-3R-hidroxibutil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico; 5S-[4-(3-clorofenil)-3R-hi-
droxibutil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)hexil]-pirrolidin-2-ona; y 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometilfenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona; composiciones farmacéuticas que contienen dicho compuesto; y dicho compuesto para uso como medicamento.
Preferiblemente, se tratan mujeres
postmenopáusicas y hombres mayores de 60 años. También se prefieren
individuos, independientemente de su edad, que tienen una masa ósea
significativamente reducida, es decir, una desviación típica mayor o
igual a 1,5 por debajo de los niveles de jóvenes normales.
En esta invención, los trastornos que cursan con
una masa ósea reducida incluyen trastornos tales como, por ejemplo,
osteoporosis, pérdida ósea idiopática de la infancia, pérdida ósea
alveolar, pérdida ósea mandibular, fractura ósea, osteotomía,
pérdida ósea asociada a periodontitis y crecimiento interno
protésico.
También se incluyen procedimientos para tratar la
"osteoporosis secundaria", dentro de los procedimientos de esta
invención. "Osteoporosis secundaria" incluye osteoporosis
inducida por glucocorticoides, osteoporosis inducida por
hipertiroidismo, osteoporosis inducida por inmovilización,
osteoporosis inducida por heparina u osteoporosis inducida por
inmunosupresores en un vertebrado, por ejemplo un mamífero
(incluyendo a un ser humano). Estos procedimientos se llevan a cabo
administrando a dicho vertebrado, por ejemplo un mamífero, una
cantidad para tratar la "osteoporosis secundaria" de un
agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4, uno de
sus profármacos o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho
agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4 o de
dicho profármaco.
Otro aspecto más de la presente invención se
refiere a procedimientos para reforzar un injerto óseo, inducir
sinóstosis vertebral, potenciar la extensión de los huesos largos,
potenciar la curación ósea después de una reconstrucción facial,
una reconstrucción maxilar y/o una reconstrucción mandibular en un
vertebrado, por ejemplo un mamífero, (incluyendo a un ser humano)
que comprende administrar a dicho vertebrado, por ejemplo un
mamífero que se somete a reconstrucción maxilar, a reconstrucción
facial o a reconstrucción mandibular, una cantidad potenciadora del
hueso de un agonista de prostaglandina selectivo para el receptor
EP4, uno de sus profármacos, o una sal farmacéuticamente aceptable
de dicho agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4
o de dicho profármaco. Los agonistas de prostaglandina selectivos
para el receptor EP4 activos de esta invención se pueden aplicar de
forma local en el lugar de la reconstrucción ósea o se pueden
administrar por vía sistémica.
Una dosis preferida varía de aproximadamente
0,001 a aproximadamente 100 mg/kg/día de un agonista selectivo del
receptor EP4, de uno de sus profármacos o de una sal
farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o de dicho
profármaco. Una dosis especialmente preferida varía de
aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg/día de un agonista
selectivo del receptor EP4, de uno de sus profármacos o de una sal
farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o de dicho
profármaco.
La frase "trastorno(s) que
cursa(n) con masa ósea reducida" se refiere a un
trastorno en el que el nivel de masa ósea es inferior al normal
específico para la edad, como se define en las normas de la
Organización Mundial de la Salud "Assessment of Fracture Risk and
its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis
(1994). Report of a World Health Organization Study Group. World
Health Organization Technical Series 843". En
"trastorno(s) que cursa(n) con masa ósea
reducida" se encuentra incluida la osteoporosis primaria y
secundaria, tal y como se han descrito antes. Además, se incluye
enfermedad periodontal, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea por
osteotomía y pérdida ósea idiopática de la infancia. La frase
"trastorno(s) que cursa(n) con masa ósea
reducida" también incluye las complicaciones a largo plazo de la
osteoporosis como curvatura de la columna vertebral, pérdida de
peso y cirugía protésica.
La frase "trastorno(s) que
cursa(n) con masa ósea reducida" se refiere también a un
vertebrado, por ejemplo un mamífero, conocido por tener una
posibilidad significativamente mayor que la media de desarrollar las
enfermedades que se describen anteriormente, incluyendo
osteoporosis (por ejemplo, mujeres postmenopáusicas, hombres
mayores de 50 años). Otros usos que aumenten o potencien la masa
ósea incluyen la restauración ósea, incrementar la velocidad de
curación de fracturas óseas, reemplazar la cirugía de injertos
óseos totalmente, potenciar el índice de éxitos de los injertos
óseos, la curación ósea después de una reconstrucción facial o una
reconstrucción maxilar o una reconstrucción mandibular, el
crecimiento interno protésico, la sinóstosis vertebral o la
extensión de huesos largos.
Los procedimientos de esta invención también
pueden usarse combinados con dispositivos ortopédicos como
estructuras de fusión espinal, equipo de fusión espinal,
dispositivos de fijación ósea internos y externos, tornillos y
clavos.
Los expertos en la técnica reconocerán que el
término masa ósea se refiere realmente a la masa ósea por unidad de
superficie, que en algunas ocasiones (aunque no de forma
estrictamente correcta) se denomina densidad mineral del hueso.
El término "tratar", "trato" o
"tratamiento", tal como se usa en la presente, incluye el
tratamiento preventivo (por ejemplo, profiláctico) y paliativo y
curativo.
El término "farmacéuticamente aceptable"
significa que el portador, vehículo, diluyente, excipientes y/o sal
deben ser compatibles con el resto de ingredientes de la
formulación, y no perjudicar al receptor de las mismas.
La expresión "sal farmacéuticamente
aceptable" se refiere a sales aniónicas no tóxicas que contienen
aniones tales como (pero no limitados a los mismos) cloruro,
bromuro, yoduro, sulfato, bisulfato, fosfato, acetato, maleato,
fumarato, oxalato, lactato, tartrato, citrato, gluconato,
metanosulfonato y 4-toluenosulfonato. La expresión
se refiere también a sales catiónicas no tóxicas tales como (pero
no limitadas a las mismas) sales de sodio, potasio, calcio,
magnesio, amonio o benzatina protonada
(N,N'-dibenciletilendiamina), colina, etanolamina,
dietanolamina, etilendiamina, meglumina
(N-metil-glucamina), benetamina
(N-bencilfenetilamina), piperazina o trometamina
(2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol).
Los procedimientos de la presente invención dan
lugar a la formación de hueso, dando lugar a una disminución del
número de fracturas. Esta invención hace una contribución
significativa a la técnica proporcionando procedimientos que
aumentan la formación de hueso, dando como resultado la prevención,
retraso y/o reversión de la osteoporosis y de los trastornos óseos
relacionados.
Esta invención se refiere también a compuestos
seleccionados de ácido
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico;
5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil-pirrolidin-2-ona;
ácido
7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico;
ácido
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico;
y
5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona.
Esta invención se refiere también particularmente
al ácido
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico.
Esta invención se refiere también particularmente
a
5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil-pirrolidin-2-ona.
Esta invención se refiere también particularmente
al ácido
7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico.
Esta invención se refiere también particularmente
al ácido
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico.
Esta invención se refiere también particularmente
a
5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona.
A partir de la memoria descriptiva y las
reivindicaciones que describen la invención serán evidentes otras
características y ventajas.
Como agonista selectivo del receptor EP4 de esta
invención se puede usar cualquier agonista selectivo del receptor
EP4. Los agonistas selectivos de EP4 son compuestos que tienen una
CI_{50} en el receptor EP1, EP2 y EP3 que es al menos 10 veces
mayor que la CI_{50} en el subtipo de receptor EP4. Por ejemplo,
el ácido
7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
es un agonista de PGE_{2} selectivo para el receptor EP4 con una
CI_{50} de unión al receptor EP4 de 16 nM. En todos los demás
subtipos de receptor EP, incluyendo los subtipos de receptor EP1,
EP2 y EP3, la CI_{50} para el ácido
7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
es mayor de 3200 nM.
Los compuestos de Fórmula I se pueden preparar
como se describe en el documento de Estados Unidos 4.177.346, de
cesión común y que se incorpora en la presente memoria como
referencia.
Todos los agonistas selectivos del receptor EP4
usados en los procedimientos de esta invención están adaptados al
uso terapéutico como agentes que estimulan la formación ósea y
aumentan la masa ósea en vertebrados, por ejemplo mamíferos y en
particular en seres humanos. Puesto que la formación ósea está muy
relacionada con el desarrollo de osteoporosis y trastornos
relacionados con los huesos, los agonistas usados en los
procedimientos de esta invención, en virtud de su acción ósea,
previenen, detienen y/o revierten la osteoporosis.
La utilidad de los agonistas selectivos de EP4
usados en los procedimientos de la presente invención como agentes
medicinales en el tratamiento de trastornos que cursan con una masa
ósea reducida (por ejemplo, osteoporosis) en vertebrados, por
ejemplo mamíferos (por ejemplo, seres humanos, particularmente en la
mujer) se demuestra por la actividad de estos agonistas en ensayos
convencionales, incluyendo un ensayo de unión al receptor, un ensayo
de AMP cíclico, un ensayo in vivo y el ensayo de curación de
la fractura, todos los cuales se describen más adelante. Tales
ensayos proporcionan también un medio mediante el cual comparar las
actividades de los agonistas selectivos de EP4 entre sí y con las
actividades de otros compuestos y composiciones conocidos. Los
resultados de estas comparaciones son útiles para determinar los
niveles de dosificación en vertebrados, por ejemplo mamíferos,
incluyendo seres humanos, para el tratamiento de tales
enfermedades.
\newpage
La actividad de los agentes anabólicos óseos en
la estimulación de la formación ósea y el aumento de la masa ósea se
puede ensayar en ratas intactas macho o hembra, o ratas macho
(orquidectomizadas) o hembra (ovariectomizadas) con deficiencias en
hormonas sexuales.
Se pueden utilizar en el estudio ratas macho o
hembra de diferentes edades (tal como de tres meses de edad). Las
ratas pueden estar intactas o bien castradas (ovariectomizadas u
orquidectomizadas), y se inyectan subcutáneamente o se dosifican por
sonda gástrica con agonistas de prostaglandina en diferentes dosis
(tal como 1, 3 ó 10 mg/kg/día) durante 30 días. En las ratas
castradas, el tratamiento se comienza en el día posterior a la
cirugía (con el propósito de prevenir la pérdida ósea) o en el
momento en el que ya se ha producido la pérdida ósea (con el
propósito de recuperar la masa ósea). Durante el estudio, se
permite el libre acceso de todas las ratas a agua y una dieta
comercial en gránulos (Teklad Rodent Diet Nº8064, Harlan Teklad,
Madison, WI) que contiene 1,46% de calcio, 0,99% de fósforo y 4,96
UI/g de Vitamina D_{3}. Todas las ratas reciben inyecciones
subcutáneas de 10 mg/kg de calceína en los días 12 y 2 antes del
sacrificio. Se sacrifican las ratas. Se determinan los siguientes
parámetros:
Se extirpa el fémur derecho de cada rata en
autopsia y se explora utilizando absorciometría de rayos X de doble
haz (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) equipado con el
programa informático "WRegional High Resolution Scan" (Hologic
Inc., Waltham, MA). El tamaño del campo de exploración es de 5,08 x
1,902 cm, la resolución es de 0,0254 x 0,0127 cm y la velocidad de
exploración es de 7,25 mm/seg. Se analizan las imágenes de la
exploración femoral y se determina el área ósea, contenido mineral
óseo (BMC) y densidad mineral ósea (BMD) del fémur completo (WF),
metáfisis femoral distal (DFM), diáfisis femoral (FS) y fémur
proximal (PF).
Se extirpa la tibia derecha en la autopsia, se
disecciona todo el músculo y se corta en tres partes. Se fijan la
tibia proximal y la diáfisis tibial en etanol al 70%, se deshidrata
en concentraciones graduadas de etanol, se desengrasa en acetona y
después se introduce en metacrilato de metilo (Eastman Organic
Chemicals, Rochester, NY).
Se cortan las secciones frontales de la metáfisis
tibial proximal con un espesor de 4 y 10 \mum, utilizando un
microtomo Reichert-Jung Polycut S. Las secciones de
4 \mum se tiñen con tinte modificado Trichrome de Masson,
mientras que las secciones de 10 \mum permanecen sin teñir. Se
utilizan una sección de 4 \mum y una de 10 \mum de cada rata
para histomorfometría de hueso canceloso.
Se cortan las secciones transversales de la
diáfisis tibial de 10 \mum de espesor utilizando un microtomo
Reichert-Jung Polycut S. Estas secciones se
utilizan para análisis histomorfométrico del hueso cortical.
Se utiliza un sistema de histomorfometría
Bioquant OS/2 (R&M Biometrics, Inc., Nashville, TN) para las
medidas histomorfométricas estáticas y dinámicas de la parte
esponjosa secundaria de la metáfisis tibial proximal entre 1,2 y 3,6
mm distal a la unión de crecimiento
placa-epifiseal. Los primeros 1,2 mm de la región
metafiseal tibial necesitan ser omitidos para limitar las medidas a
la parte esponjosa secundaria. Se utilizan las secciones de 4
\mum para determinar los índices relacionados con el volumen
óseo, estructura ósea y resorción ósea, mientras que las secciones
de 10 mm se utilizan para determinar los índices relacionados con
la formación y regeneración del hueso.
(1) Área total metafiseal (TV, mm^{2}): Área
metafiseal entre 1,2 y 3,6 mm distal a la unión
placa-epifiseal de crecimiento. (2) Área ósea
trabecular (BV, mm^{2}): Área total de trabécula en TV. (3)
Perímetro óseo trabecular (BS, mm): La longitud del perímetro total
de la trabécula. (4) Volumen óseo trabecular (BV/TV,%): BV/TV x
100. (5) Número óseo trabecular (TBN, Nº/mm): 1,199/2 x BS/TV. (6)
Espesor óseo trabecular (TBT, \mum): (2.000/1,199) x (BV/BS). (7)
Separación ósea trabecular (TBS, \mum): (2.000 x 1,199) x (TV-
BV).
(1) Número de osteoclastos (OCN, Nº): Nº total de
osteoclastos en el área metafiseal total. (2) Perímetro de
osteoclasto (OCP mm): longitud del perímetro trabecular cubierto
por osteoclastos. (3) Nº/mm de osteoclastos (OCN/mm, Nº/mm):
OCN/BS. (4) Perímetro porcentual cubierto por osteoclastos (%OCP,
%): OCP/BS x 100.
(1) Perímetro con una marca de calceína (SLS,
mm): longitud total del perímetro trabecular con una marca de
calceína. (2) Perímetro con dos marcas de calceína (DLS, mm):
Longitud total del perímetro trabecular con dos marcas de calceína.
(3) Anchura entre marcas (ILW, \mum): Distancia promedio entre dos
marcas de calceína. (4) Perímetro porcentual de mineralización (PMS,
%): (SLS/2 + DLS)/BS% x 100. (5) Velocidad de depósito mineral (MAR,
\mum/día): ILW/intervalo entre marcas. (6) Velocidad de formación
de hueso/superficie de ref. (BFR/BS, \mum^{2}/d/\mum): (SLS/2
+ DLS) x MAR /BS. (7) Velocidad de regeneración ósea (BTR,%/y):
(SLS/2 + DLS) x MAR /BV x 100.
Se utiliza un sistema histomorfométrico Bioquant
OS/2 (R&M Biometrics, Inc., Nashville, TN) para las medidas
histomorfométricas estáticas y dinámicas de la diáfisis tibial en
las medidas del hueso cortical en la diáfisis tibial. Se mide el
área tisular total, área de la cavidad de la médula, perímetro
periosteal, perímetro endocortical, perímetro con una marca,
perímetro con dos marcas y anchura entre marcas en ambas
superficies periosteales y endocorticales, y se calculan el área
ósea cortical (área tisular total - área de cavidad de la médula),
área porcentual cortical ósea (área cortical/área del tejido total
x 100), área porcentual de médula (área de cavidad de la
médula/área del tejido total x 100), perímetro porcentual
periosteal y endocortical marcado [(perímetro con una marca/2 +
perímetro con 2 marcas)/perímetro total x 100] velocidad de
depósito mineral (anchura entre marcas/intervalos) y velocidad de
formación de hueso [velocidad de depósito mineral x [(perímetro con
una marca/2 + perímetro con dos marcas)/perímetro total].
Se pueden calcular los datos estadísticos
utilizando paquetes Stat View 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley,
CA). Se utiliza la prueba de análisis de varianza (ANOVA) seguida
de PLSD de Fisher (Stat View, Abacus Concepts Inc., 1918 Bonita
Ave, Berkeley, CA 94704-1014) para comparar las
diferencias entre grupos.
Los cDNA, que representan los marcos de lectura
abierta completa de los receptores humanos EP_{4}, se generan por
reacción en cadena con polimerasa de la transcriptasa inversa
utilizando cebadores oligonucleótidos basados en secuencias
publicadas (1) y RNA de células de pulmón humano primarias
(EP_{4}) como moldes. El cDNA se clona en el sitio de clonación
múltiple de pcDNA3 (Invitrogen Corporation, 3985B Sorrento Valley
Blvd., San Diego, CA 92121) y se usa para transfectar células de
riñón de embrión humano 293-S por la vía de
coprecipitación con fosfato de calcio. Las colonias resistentes a
G418 se expanden y se analizan las uniones específicas
[^{3}H]PGE_{2}. Las células transfectadas que muestran
niveles altos de uniones específicas a [^{3}H]PGE_{2} se
caracterizan adicionalmente mediante análisis de Scatchard para
determinar Bmax y Kds para PGE_{2}. Las líneas seleccionadas para
el rastreo de compuestos tienen aproximadamente 256.400 receptores
por célula y un Kd = 2,9 nM para PGE_{2} (EP_{4}). La expresión
constitutiva del receptor en las células madre
293-S es insignificante. Las células se mantienen en
RPMI suplementado con suero bovino fetal (10% final) y G418 (700
ug/ml final).
Las respuestas de cAMP en las líneas
293-S/EP_{4} se determinan por separación de
células de los matraces de cultivo en 1 ml de PBS deficiente en
Ca^{++} y Mg^{++} por agitación vigorosa, añadiendo RPMI exento
de suero hasta una concentración final de 1 x 10^{6} células/ml y
añadiendo
3-isobutil-1-metilxantina
(IBMX) hasta una concentración final de 1 mM. Se toman
inmediatamente alícuotas de 1 ml de la suspensión de células en
tubos de microcentrífuga con tapón de rosca de 2 ml y se incuban
durante 10 minutos, destapados, a 37ºC, con una humedad relativa
del 95% y 5% de CO_{2}. El compuesto a analizar se añade a las
células en diluciones 1:100 de forma que las concentraciones
finales de DMSO o etanol sean del 1%. Inmediatamente después de
añadir el compuesto, se tapan los tubos, se mezclan invirtiéndolos 2
veces y se incuban a 37º durante 12 minutos. Las muestras son
entonces lisadas por incubación a 100ºC durante 10 minutos e
inmediatamente enfriadas sobre hielo durante 5 minutos. Los restos
celulares se sedimentan por centrifugación a 1.000 g durante 5
minutos, y los lisados aclarados se transfieren a tubos limpios. Las
concentraciones de cAMP se determinan utilizando un estuche de
radioinmunoensayo de cAMP disponible comercialmente
(NEK-033, DuPont/NEN Research Products, 549 Albany
St., Boston, MA 02118) después de diluir los lisados aclarados 1:10
en solución tampón de análisis cAMP RIA (incluida en el estuche).
Normalmente, se tratan las células con 6 a 8 concentraciones del
compuesto a analizar en incrementos logarítmicos. Los cálculos de
CE_{50} se realizan mediante una calculadora utilizando análisis
de regresión lineal en la porción lineal de las curvas de respuesta
a la dosis.
1. Regan, J.W. Bailey, T.J.
Pepperl, D.J. Pierce, K.L. Bogardus, A.M.
Donello, J.E. Fairbairn, C.E. Kedzie, K.M.
Woodward, D.F. y Gil, D.W. 1994 Cloning of a
Novel Human Prostaglandin Receptor with Characteristics of the
Pharmacogically Defined EP_{2} Subtype. Mol. Pharmacology
46:213-220.
Todas las preparaciones se realizan a 4ºC. Las
células transfectadas que expresan receptores tipo 1 de
prostaglandina E_{2} (EP_{1}), tipo 2 (EP_{2}), tipo 3
(EP_{3}) o tipo 4 (EP_{4}) se recogen y suspenden hasta 2
millones de células por ml en solución tampón A
[Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1
mM, péptido Pefabloc 1 mM, (Boehringer Mannheim Corp.,
Indianapolis, IN), péptido Phosporamidon 10 uM (Sigma, St. Luis,
MO), péptido Pepstatina A 1 uM (Sigma, St. Luis, MO), péptido
Elastatinal 10 uM (Sigma, St. Luis, MO), péptido Antipaína 100 uM
(Sigma, St. Luis, MO)]. Las células se lisan por sonicación con un
aparato de ultrasonidos Branson (modelo Nº 250, Branson Ultrasonics
Corporation, Danbury, CT) en dos impactos de 15 segundos. Se
eliminan las células no lisadas y los restos por centrifugación a
100 g durante 10 minutos. Las membranas se recogen entonces por
centrifugación a 45.000 g durante 30 minutos. Las membranas
sedimentadas se resuspenden hasta una concentración de 3 a 10 mg de
proteína por ml, determinándose la concentración de proteína por el
procedimiento de Bradford [Bradford, M., Anal. Biochem., 72, 248
(1976)]. Las membranas resuspendidas se conservan congeladas a -80ºC
hasta su uso.
Las membranas congeladas preparadas de la forma
descrita anteriormente son descongeladas y diluidas hasta 0,5 mg/ml
(para EP2 de rata) o 0,3 mg/ml (para EP4 de rata) en solución tampón
A. Se combina un volumen de preparación de membrana con 0,05
volúmenes del compuesto de ensayo o solución tampón y un volumen de
^{3}H-prostaglandina E_{2} 3 nM (Nº TRK 431,
Amersham, Arlington Heights, IL) en solución tampón A. La mezcla
(volumen total 205 \mul) se incuba durante una hora a 25ºC. Las
membranas se recuperan entonces por filtración en filtros de fibra
de vidrio del tipo GF/C (Nº 1205-401, Wallac,
Gaithersburg, MD) utilizando un recolector Tomtec (modelo Mach
II/96, Tomtec, Orange, CT). Las membranas con unión
^{3}H-prostaglandina E_{2} quedan retenidas en
el filtro, mientras que la solución tampón y la
^{3}H-prostaglandina E_{2} no unida pasa por el
filtro y se desecha. Cada una de las muestras se lava entonces tres
veces con 3 ml de [Tris-HCl 50 mM (pH 7,4),
MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM]. Los filtros se secan entonces mediante
calentamiento en un horno de microondas. Para determinar la
cantidad de ^{3}H-prostaglandina unida a las
membranas, se colocan los filtros secos en bolsas de plástico con
líquido de centelleo y se hace el recuento en un lector LKB 1205
Betaplate (Wallac, Gaithersburg, MD). Las CI_{50} se determinan a
partir de la concentración del compuesto de ensayo necesaria para
desplazar el 50% ^{3}H-prostaglandina E_{2}
unida de forma específica.
Las células 293S que expresan los receptores
E_{2} de las prostaglandinas EP_{2} o EP_{4} se generan
conforme a procedimientos bien conocidos por los expertos en la
técnica. De forma típica, se preparan cebadores PCR (reacción en
cadena con polimerasa), que corresponden a los extremos terminales
5' y 3' del receptor de longitud total publicado, conforme a
procedimientos bien conocidos descritos anteriormente y se usan en
una reacción RT-PCR usando el RNA total de riñón de
rata para los receptores EP_{2} y EP_{4}.
La secuencia de codificación de longitud completa
para el receptor EP2 de rata se prepara como se describe en Nemoto
et al., Prostaglandins, 1997, 54,
713-725. La secuencia de codificación de longitud
completa para el receptor EP4 de rata se prepara como se describe
en Sando et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994,
200, 1329-1333. Estos receptores de longitud
completa se usan para preparar las células 293S que expresan los
receptores EP2 y EP4.
La secuencia de codificación de longitud completa
para el receptor EP1 se prepara como se describe en Funk et
al., Journal of Biological Chemistry, 1993, 268,
26767-26772. La secuencia de codificación de
longitud completa para el receptor EP2 se prepara como se describe
en Regan et al., Molecular Pharmacology, 1994,
46, 213-220. La secuencia de codificación de
longitud completa para el receptor EP3 se prepara como se describe
en Regan et al., British Journal of Pharmacology,
1994, 112, 377-385. La secuencia de
codificación de longitud completa para el receptor EP4 se prepara
como se describe en Bastien, Journal of Biological Chemistry,
1994, 269, 11873-11877. Estos
receptores de longitud completa se usan para preparar las células
293S que expresan los receptores EP_{1}, EP_{2}, EP_{3} y
EP_{4}.
Las células 293S que expresan cualquiera de los
receptores E_{2} de prostaglandina EP_{1}, EP_{2}, EP_{3} y
EP_{4} humanos se generan conforme a procedimientos conocidos por
los expertos en la materia. De forma típica, se preparan los
cebadores por PCR (reacción en cadena con polimerasa), que
corresponden a los extremos 5' y 3' del receptor de longitud
completa publicados, conforme a procedimientos bien conocidos
descritos antes y se usan en una reacción en cadena con polimerasa
y transcriptasa inversa (RT-PCR) usando un RNA
total de riñón humano (para EP_{1}), de pulmón humano (para
EP_{2}), de pulmón humano (para EP_{3}) o de linfocitos humanos
(para EP_{4}) como fuente. Los productos de PCR se clonan por el
procedimiento TA con un saliente en pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad,
CA) y se confirma la identidad del receptor clonado por
secuenciación de DNA.
Las células 293S (Mayo, Dept. of Biochemistry,
Northwestern Univ.) se transfectan con el receptor clonado en pcDNA3
por electroporación. Se establecen líneas de células estables que
expresan el receptor después de seleccionar las células
transfectadas con G418.
Las línea de células clonadas que expresan el
número máximo de receptores se eligen después de un ensayo de unión
a ^{3}H-PGE_{2} de células completas usando
PGE_{2} no marcada como competidor.
Se anestesian ratas
Sprague-Dawley de 3 meses de edad con Ketamina. Se
hace una incisión de 1 cm en la cara anteromedia de la parte
proximal de la tibia o fémur derechos. A continuación se describe la
técnica quirúrgica tibial. La incisión se realiza hasta alcanzar el
hueso, y se perfora un orificio de 1 mm, 4 mm proximal a la cara
distal de la tuberosidad tibial, 2 mm medial al surco anterior. Se
introducen agujas intramedulares mediante un tubo de acero
inoxidable de 0,8 mm (carga máxima 36,3 N, rigidez máxima 61,8
N/mm, comprobado bajo las mismas condiciones que los huesos). No se
ensancha el canal medular. Se produce una fractura normalizada
cerrada 2 mm por encima de la unión tibiofibular mediante curvatura
en tres puntos utilizando fórceps ajustable, especialmente diseñado
con mordazas romas. Para minimizar el daño al tejido blando, se
debe tener precaución para no desplazar la fractura. La piel se
cierra con suturas monofilamento de nylon. La operación se realiza
bajo condiciones estériles. Se toman radiografías de todas las
fracturas inmediatamente después de la inserción de las agujas, y
las ratas con fracturas fuera del área diafiseal especificada o con
agujas desplazadas, se excluyen. El resto de los animales se
dividen aleatoriamente en los siguientes grupos con 10 a 12
animales por subgrupo para comprobar la curación de las fracturas.
El primer grupo recibe administraciones por sonda gástrica diarias
de vehículo (agua: 100% Etanol = 95:5) en un 1 ml/rata, mientras
que los otros reciben administración diaria por sonda nasogástrica
de 0,01 a 100 mg/kg/día del compuesto a analizar (1 ml/rata)
durante 10, 20, 40 y 80 días.
En los días 10, 20, 40 y 80, se anestesiaron 10 a
12 ratas de cada grupo con Ketamina y se sacrificaron por extracción
sanguínea. Se extirpan ambos huesos tibiofibulares por disección y
se elimina todo el tejido blando. Se conservaron los huesos de 5 a 6
ratas de cada grupo en etanol al 70% para análisis histológicos y
los huesos de otras 5 a 6 ratas de cada grupo se conservaron en
solución de Ringer tamponada (+4ºC, pH 7,4) para las radiografías y
ensayos biomecánicos que se realizaron.
Los procedimientos para análisis histológico del
hueso fracturado se han publicado previamente por Mosekilde y Bak
(The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A
histological Description. Bone, 14:19-27, 1993).
Explicado brevemente, el lugar de la fractura se aserra 8 mm a cada
lado de la línea de la fractura, se introduce descalcificado en
metacrilato de metilo, y se cortan las secciones frontales con un
microtomo Reichert-Jung Polycut con un espesor de 8
\mum. Las secciones medianas frontales teñidas con
Masson-Trichrome (incluyendo ambas tibias y fíbulas)
se utilizan para la visualización de la respuesta celular y tisular
a la curación de la fractura con y sin tratamiento. Las secciones
teñidas de rojo Sirius se utilizan para demostrar las
características de la estructura callosa y para diferenciar entre
el hueso entrelazado y el lamelar en el lugar de la fractura. Se
realizan las siguientes medidas: (1) espacio de fractura - medido
como la distancia más corta entre los extremos corticales del hueso
en la fractura, (2) longitud y diámetro del callo, (3) área del
volumen total óseo del callo, (4) tejido de hueso por área de
tejido dentro del área callosa, (5) tejido fibroso en el callo, (6)
área de cartílago en el callo.
Los procedimientos de análisis biomecánico se han
publicado previamente por Bak y Andreassen (The Effects of Aging on
Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int
45:292-97, 1989). Explicado en forma resumida, se
toman radiografías de todas las fracturas antes del ensayo
biomecánico. Se analizan las propiedades mecánicas de las fracturas
soldadas mediante un procedimiento destructivo de curvatura en tres
o cuatro puntos. Se determina la carga máxima, rigidez, energía en
carga máxima, desviación en la carga máxima y esfuerzo máximo.
Se utilizan en este estudio perros Beagle macho o
hembra de aproximadamente 2 años de edad bajo anestesia. Se producen
fracturas radiales transversales por carga lenta continua doblándolo
en tres puntos, tal como describen Lenehan et al (Lenehan, T.M.;
Balligand, M.; Nunamaker, D.M.; Wood, F.E.: Effects of EHDP on
Fracture Healing in Dogs. J. Orthop Res 3:499-507;
1985). Se arrastra el hilo a través del lugar de la fractura para
asegurar la interrupción anatómica completa del hueso. Después, se
consigue la liberación local de agonistas de prostaglandina en el
lugar de la fractura mediante liberación lenta del compuesto
suministrado por gránulos de liberación lenta o por la
administración de los compuestos en una formulación adecuada como
una solución o suspensión de gel en pasta durante 10, 15 o 20
semanas.
Los procedimientos de análisis histológico de
huesos fracturados se han publicado anteriormente por Peter et
al (Peter, C.P.; Cook, W.O.; Nunamaker, D.M.; Provost, M.T.;
Seedor, J.G.; Rodan, G.A. Effects of alendronate on fracture healing
and bone remodeling in dogs. J. Orthop. Res.
14:74-70, 1996) y Mosekilde y Bak (The Effects of
Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A Histological
Description. Bone, 14:19-27, 1993). Explicado
brevemente, después del sacrificio, se aserra el lugar de la
fractura 3 cm a cada lado de la línea de la fractura, se introduce
una vez descalcificado en metacrilato de metilo y se corta con un
microtomo Reichert-Jung Polycut en secciones
frontales de 8 \mum de espesor. Se utilizan las secciones teñidas
con Masson-Trichrome de la parte media frontal
(incluyendo la tibia y la fíbula) para la visualización de la
respuesta celular y tisular a la curación de la fractura con y sin
tratamiento. Se utilizan las secciones teñidas con rojo Sirius para
demostrar las características de la estructura del callo y para
diferenciar entre el hueso entrelazado y el lamelar en el lugar de
la fractura. Se realizan las siguientes medidas: (1) espacio de
fractura - medido como la distancia más corta entre los extremos
corticales del hueso en la fractura, (2) longitud y diámetro del
callo, (3) área del volumen de hueso total del callo, (4) tejido de
hueso por área de tejido dentro del área del callo, (5) tejido
fibroso en el callo, (6) área de cartílago en el callo.
Los procedimientos de análisis biomecánico se han
publicado previamente por Bak y Andreassen (The Effects of Aging on
Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int
45:292-297, 1989) y Peter et al. (Peter,
C.P.; Cook, W.O.; Nunamaker, D.M.; Provost, M.T.; Seedor, J.G.;
Rodan, G.A. Effects of Alendronate On Fracture Healing And Bone
Remodeling In Dogs. J. Orthop. Res. 14:74-70,
1996). Explicado brevemente, se toman radiografías de todas las
fracturas antes de los ensayos biomecánicos. Se analizan las
propiedades mecánicas de las fracturas en curación por un
procedimiento destructivo de curvatura en tres o cuatro puntos. Se
determina la carga total, rigidez, energía en carga máxima,
desviación en carga máxima y tensión máxima.
La administración de agonistas selectivos del
receptor EP4 conforme a los procedimientos de esta invención se
puede realizar por cualquier modo que libere el agonista selectivo
del receptor EP4 por vía sistémica y/o local (por ejemplo, en el
lugar de la fractura ósea, osteotomía o cirugía ortopédica). Estos
procedimientos incluyen las vías oral, parenteral, intraduodenal y
similares. Por lo general, los compuestos de esta invención se
administran oralmente, pero se puede utilizar la administración
parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, transdérmica,
subcutánea, rectal o intramedular), por ejemplo, cuando la
administración oral sea inadecuada para el objeto deseado o cuando
el paciente sea incapaz de ingerir el fármaco.
Los procedimientos de esta invención se utilizan
para el tratamiento y promoción de la curación de las fracturas
óseas y osteotomías por aplicación local (por ejemplo, en los
lugares de fracturas óseas u osteotomías) de los agonistas
selectivos del receptor EP4. Los agonistas selectivos del receptor
EP4 de esta invención se aplican a los lugares de fractura ósea u
osteotomía, por ejemplo, por inyección del compuesto en un
disolvente adecuado (por ejemplo, un disolvente oleoso tal como
aceite de cacahuete) en la placa de crecimiento del cartílago o, en
casos de cirugía abierta, por aplicación local de tales compuestos
en un vehículo, portador o diluyente adecuado tal como cera para
hueso, polvo de hueso desmineralizado, cementos óseos poliméricos,
selladores de hueso, etc. Como alternativa, se puede conseguir la
aplicación local aplicando una solución o dispersión del compuesto
en un portador o diluyente adecuado sobre su superficie, o
incorporándolo en un implante sólido o semisólido usado
convencionalmente en cirugía ortopédica, tal como malla de dacron,
espumas de gel y hueso Kiel o prótesis.
En cualquier caso, la cantidad y frecuencia de
los compuestos administrados dependerá, por supuesto, del sujeto que
se está tratando, de la gravedad de la enfermedad, de la forma de
administración y del criterio del médico encargado. Así, debido a la
variabilidad entre pacientes, las dosificaciones proporcionadas en
la presente son una guía y el médico puede valorar la dosis del
fármaco para conseguir el tratamiento (por ejemplo, aumento de la
masa ósea) que el médico considere adecuada para el paciente. Al
considerar el grado de tratamiento deseado, el médico debe valorar
varios factores, tales como el nivel inicial de masa ósea, la edad
del paciente, la presencia de enfermedad preexistente, así como la
presencia de otras enfermedades (por ejemplo, enfermedad
cardiovascular).
En general, se usa una cantidad de agonista
selectivo del receptor EP4 de esta invención que es suficiente para
aumentar la masa ósea hasta un nivel superior al umbral de fractura
ósea (tal como se detalla en el World Health Organization Study
citado anteriormente en la presente memoria).
Los agonistas selectivos del receptor EP4 usados
en los procedimientos de la presente invención se administran
generalmente en forma de una composición farmacéutica que comprende
al menos uno de los compuestos de esta invención junto con un
vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Así, el agonista
selectivo del receptor EP4 de esta invención se puede administrar
individualmente en cualquier forma de dosificación convencional
oral, intranasal, parenteral, rectal o transdérmica.
Para administración oral la composición
farmacéutica puede adoptar la forma de soluciones, suspensiones,
comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos y similares. Los
comprimidos que contienen diferentes excipientes, tales como citrato
de sodio, carbonato de calcio y fosfato de calcio, se emplean junto
con diferentes disgregantes, tales como almidón y preferiblemente
almidón de patata o tapioca y ciertos silicatos complejos, junto con
agentes ligantes tales como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina
y goma arábiga. Adicionalmente, agentes lubricantes tales como
estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco son con
frecuencia muy útiles para la elaboración de comprimidos. También se
emplean composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en
cápsulas de gelatina dura y blanda rellenas; los materiales
preferidos para este fin incluyen también lactosa o azúcar de la
leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando
se desean suspensiones y/o elixires acuosos para administración
oral, los compuestos de esta invención se pueden combinar con
diferentes agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes
colorantes, agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión, así
como diluyentes como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y
diferentes combinaciones similares de los mismos.
Para administración parenteral, se pueden emplear
soluciones en aceite de sésamo y de cacahuete o en propilenglicol
acuoso, así como soluciones acuosas estériles de las
correspondientes sales solubles en agua. Tales soluciones acuosas
pueden estar adecuadamente tamponadas, si es necesario, y el líquido
diluyente se puede hacer primero isotónico con solución salina o
glucosa suficiente. Estas soluciones acuosas son especialmente
adecuadas para inyecciones intravenosas, intramusculares,
subcutáneas e intraperitoneales. En este sentido, todos los medios
acuosos estériles empleados son fácilmente obtenibles por técnicas
convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica.
\newpage
Para administración transdérmica (por ejemplo,
tópica) se preparan soluciones acuosas estériles diluidas o
soluciones parcialmente acuosas (habitualmente en concentración
aproximada de 0,1% a 5%), similares a las soluciones parenterales
anteriores.
Los procedimientos para preparar las diferentes
composiciones farmacéuticas, con una cierta cantidad de ingrediente
activo son conocidos, o serán evidentes a la luz de esta
descripción, para los expertos en la técnica. Para ejemplos de
procedimientos de preparación de composiciones farmacéuticas véase
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,
Easton, Pa., 19th Edición (1995).
El objeto de este estudio es determinar si un
agonista selectivo del receptor EP4 y, en especial, el ácido
7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico,
puede restaurar la masa ósea en un modelo de rata OVX.
Se ovariectomizaron (OVX) ratas
Sprague-Dawley a los 3,5 meses de edad. Diez meses
después de la OVX, las ratas se trataron por inyección subcutánea
con vehículo o con ácido
7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
a 30 mg/kg/día durante 28 días. Las ratas se sometieron a autopsia.
El fémur derecho se extirpa a cada rata en la autopsia y se explora
usando absorciometría de rayos X de doble haz (DEXA, QDR 1000/W,
Hologic, Inc., Waltham, MA) equipada con un programa informático
"WRegional High Resolution Scan" (Hologic, Inc., Waltham, MA).
El tamaño de campo de exploración es de 5 x 1,902 cm, la resolución
es de 0,0254 x 0,0127 cm, y la velocidad de exploración es de 7,25
mm/seg. Se analizan las imágenes exploradas femorales. Se determina
el contenido mineral óseo (BMC) y se calcula la densidad mineral
ósea (MBD) del fémur completo (WF), la metáfisis femoral distal
(DFM) y la diáfisis femoral (FS) según el procedimiento descrito en
H. Z. et al., Droloxifene, a New Estrogen
Antagonist/Agonist, Prevents Bone Loss in Ovariectomized Rats.
ENDOCRINOLOGY 136; 2435-2441, 1995.
Al comparar con las ratas OVX tratadas con
vehículo, las ratas OVX tratadas con ácido
7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
mostraron un BMC femoral total un 17% mayor, una BMD femoral total
un 8% mayor, un BMC femoral distal un 8% mayor, una BMD femoral
distal un 13% mayor, un BMC de la diáfisis femoral un 20% mayor y
una BMD de la diáfisis femoral un 18% mayor. No se apreciaron
efectos secundarios similares a PGE2 en ratas tratadas con ácido
7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico.
Estos datos muestran que el ácido
7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico,
un agonista de PGE2 selectivo para el receptor EP4 estimula la
formación ósea y restaura el hueso en ratas OVX ya osteopénicas.
Los espectros de RMN se registraron en un
espectrómetro Varian Unity 400 (Varian Co., Palo Alto, California) a
aproximadamente 23ºC a 400 MHz para la RMN de protón. Los
desplazamientos químicos se expresan en partes por millón. La forma
de los picos se denomina como sigue: s, singlete; d, doblete; t,
triplete; q, cuatriplete; m, multiplete; bs=singlete ancho. Se
obtuvo el espectro de masas de ionización química a presión
atmosférica (APCI) en un espectrofotómetro Fisons Platform II.
Cuando se describe la intensidad de iones que contienen cloro o
bromo, se observó la relación de intensidad esperada
(aproximadamente 3:1 para iones que contienen ^{35}Cl/^{37}Cl y
1:1 para iones que contienen ^{79}Br/^{81}Br) y se proporciona
únicamente la intensidad del ion de masa inferior.
La cromatografía de media presión se realizó
usando un sistema de purificación Biotage (Biotage, Dyax
Corporation, Charlottesville, Virginia) en atmósfera de nitrógeno.
La cromatografía ultrarrápida se realizó con gel de sílice Baker
(40 m) (J.T. Baker, Phillilpsburg, N.J.) o gel de sílice 60 (EM
Sciences, Gibbstown, N.J.) en columnas de vidrio a presión de
nitrógeno reducida. Se realizó la cromatografía radial utilizando
un Chromatotron® (modelo 7924T, Harrison Research). La
cromatografía preparativa se realizó usando Gel de Sílice GF de
Analtech Uniplates (20 x 20 cm) (Analtech, Inc., Newark, DE). Los
disolventes dimetilformamida (DMF), tetrahidrofurano (THF) y
diclorometano (CH_{2}Cl_{2}) usados como disolventes de la
reacción eran de calidad anhidra suministrados por Aldrich Chemical
Company (Milwaukee, Wisconsin). El término "concentrado" se
refiere a la eliminación del disolvente a presión de succión de
agua en un evaporador rotatorio. La abreviatura "h" significa
horas. El término "TBAF" se refiere a fluoruro de
tetrabutilamonio. El término "DMAP" se refiere a
dimetilaminopiridina. Los términos "diclorometano" y "cloruro
de metileno" son sinónimos y se usan de forma indistinta en toda
esta memoria descriptiva y en los Ejemplos y Preparaciones.
Etapa
A
Se añadió en varias porciones NaH (60% en peso en
aceite, 426 mg, 10,7 mmol) a una solución de éster dimetílico del
ácido
[3-(3-cloro-fenil)-2-oxo-propil]-fosfónico
(2,66 g, 9,63 mmol) en THF (35 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción se
agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. La mezcla de
reacción se enfrió hasta 0ºC y se añadió una solución de éster
etílico del ácido
7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
(se suponen 10,6 mmol, preparado conforme al procedimiento descrito
en la Preparación 7, pero usando diferentes cantidades de
reactivos) en THF y la reacción se agitó durante 18 horas. Se
añadió AcOH y la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc. La solución
orgánica se lavó de forma sucesiva con solución saturada de
NaHCO_{3} (2 veces), agua (1 vez) y salmuera (1 vez). La solución
orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El residuo
se purificó por cromatografía de media presión eluyendo con acetona
al 15% en tolueno, proporcionando éster etílico del ácido
7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(2,26 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
7,27-7,15 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 6,66 (dd, 1H),
6,20 (d, 1H), 4,17 (m, 1H), 4,11 (q, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,55 (m,
1H), 2,72 (m, 1H), 2,46-2,23 (m, 5H), 1,79 (m, 1H),
1,58 (m, 2H), 1,47-1,20 (m, 9H); EM 420,2 (M+1),
418,2 (M-1).
Etapa
B
Se añadió
(R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina
(1M en tolueno, 5 ml, 5 mmol) a una solución del éster etílico del
ácido
7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(2,1 g, 5,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (200 ml) y la
solución se enfrió hasta -45ºC. La mezcla de reacción se agitó
durante 20 minutos y se añadió catecolborano (1M en THF, 15 ml, 15
mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 18 horas a -45ºC. Se
añadió HCl acuoso (1N, 100 ml) y la mezcla de reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 18 horas. La fase acuosa ácida se
separó y la solución orgánica se lavó con NaOH 1N enfriada en hielo
(2 veces), seguido por salmuera (1 vez). La solución orgánica se
secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La purificación por
cromatografía de media presión (EtOAc:hexanos 1:1 hasta EtOAc al 80%
en hexanos) proporcionó éster etílico del ácido
7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3S-hidroxi-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(800 mg) como una mezcla aproximadamente 6:1 de los
diastereoisómeros alcohol 3S:3R por RMN de ^{1}H. RMN de ^{1}H
(CDCl_{3}) \delta 7,23-7,17 (m, 3H), 7,06 (m,
1H), 5,67 (dd, 1H), 5,46 (dd, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,08 (q, 2H), 4,00
(m, 1H), 3,44 (m, 1H), 2,80 (m, 2H), 2,67 (m, 1H),
2,41-2,12 (m, 5H), 1,70-1,20 (m,
13H); EM 422,3 (M+1).
Etapa
C
Se añadió paladio al 10% sobre carbón (80 mg) a
una solución de éster etílico del ácido
7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3S-hidroxi-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(800 mg, 1,90 mmol) en EtOH (50 ml). La mezcla de reacción se
sometió a hidrogenación en un agitador de Parr a 3,10x10^{5} Pa
durante 4,5 horas. Se separó el catalizador por filtración a través
de Celite® con la ayuda de EtOH. La purificación por cromatografía
de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc:hexanos 4:1)
proporcionó éster etílico del ácido
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(625 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
7,27-7,21 (m, 3H), 7,09 (m, 1H), 4,10 (m,2H), 3,84
(m, 1H), 3,61 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,78 (dd, 1H), 2,68 (m, 1H),
2,47-2,25 (m, 4H), 2,12 (m, 1H),
1,92-1,22 (m, 17H); EM 424,3 (M+1).
\newpage
Etapa
D
Se añadió NaOH 2N (6 ml) a una solución del éster
etílico del ácido
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(595 mg, 1,40 mmol) en EtOH (25 ml). La reacción se agitó durante
24 horas a temperatura ambiente y se concentró a vacío hasta
aproximadamente tres cuartas partes del volumen original. Se añadió
HCl 1N acuoso para obtener un pH de aproximadamente 2. La solución
acuosa se lavó con cloruro de metileno (3 veces). Las fases
orgánicas reunidas se lavaron con agua seguido de salmuera. La
solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró
proporcionando el compuesto del Ejemplo 1 (500 mg). RMN de ^{1}H
(CDCl_{3}) \delta 7,26-7,18 (m, 3H), 7,08 (m,
1H), 3,84 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,77 (dd, 1H), 2,68
(m, 1H), 2,43-2,28 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,78 (m,
1H), 1,66-1,22 (m, 13H); EM 396,2 (M+1), 394,2
(M-1).
Etapa
A
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 1, Etapa A, se hizo reaccionar el anión derivado del éster
dimetílico del ácido
[2-oxo-3-(3-trifluorometil-fenil)-propil]-fosfónico
(4,16 g, 13,40 mmol) y NaH (60% en aceite, 590 mg, 14,7 mmol) con
éster etílico del ácido
7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
(se suponen 14,74 mmol) durante 24 horas. La purificación por
cromatografía de media presión (gradiente de disolvente de EtOAc al
20% en hexanos hasta EtOAC) proporcionó éster etílico del ácido
7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1
il}-heptanoico (4,29 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,52
(d, 1H), 7,44 (m, 2H), 7,37 (d, 1H), 6,67 (dd, 1H), 6,22 (d, 1H),
4,80 (m, 1H), 4,08 (q, 2H), 3,90 (s, 2H), 3,54 (m, 1H), 2,70 (m,
1H), 2,37 (m, 2H), 2,24 (m, 3H), 1,78 (m, 1H), 1,56 (m, 2H),
1,44-1,20 (m, 9H); EM 454,2 (M+1), 452,2
(M-1).
Etapa
B
Se añadió catecolborano (1M en THF, 9,9 ml, 9,9
mmol), gota a gota, a una solución de éster etílico del ácido
7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(1,5 g, 3,31 mmol) y
(R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina
(1M en tolueno, 0,5 ml, 0,5 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) a
-45ºC. La solución se agitó durante 24 horas a -45ºC y se añadió
HCl 1N. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente
durante 1 hora y se separaron las fases. La solución acuosa se lavó
con CH_{2}Cl_{2} (2 veces) y las fases orgánicas reunidas se
lavaron sucesivamente con NaOH 0,5N enfriada en hielo y salmuera
(dos veces). La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y
se concentró. La purificación por cromatografía de media presión
(EtOAc al 50% en hexanos hasta EtOAc al 60% en hexanos hasta EtOAc
al 80% en hexanos hasta EtOAc hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2})
proporcionó éster etílico del ácido
7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(1,23 g) como una mezcla aproximadamente 5,5:1 de los
diastereoisómeros alcohol 3S:3R por análisis HPLC. RMN de ^{1}H
(CDCl_{3}) \delta 7,51-7,35 (m, 4H), 5,72 (dd,
1H), 5,50 (dd, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,09 (q, 2H), 4,01 (m, 1H), 3,44
(m, 1H), 2,90 (d, 2H), 2,71 (m, 1H), 2,37-2,12 (m,
5H), 1,70-1,21 (m, 13H); EM 456,3 (M+1), 454,3
(M-1).
Etapa
C
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 1, Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de
paladio al 10% sobre carbón (120 mg) de 2,75 x 10^{5} a 3,10 x
10^{5} Pa en un agitador de Parr durante 24 horas una solución
del éster etílico del ácido
7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(1,18 g, 2,59 mmol) en EtOH (50 ml). La purificación mediante
cromatografía de media presión (EtOAc al 50% en hexanos hasta EtOAc
hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en
CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al
10% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó éster etílico del ácido
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-
fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(1,08 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
7,51-7,39 (m, 4H), 4,09 (q, 2H), 3,86 (m, 1H), 3,60
(m, 2H), 2,89 (m, 2H), 2,76 (m, 1H), 2,33 (m, 4H), 2,11 (m, 1H),
1,80 (m, 1H), 1,68-1,21 (m, 16H).
Etapa
D
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 1, Etapa D, se hidrolizó el éster etílico del ácido
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(1,93 g, 4,22 mmol) con NaOH 6N (26 ml) en EtOH (52 ml) durante 24
horas. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc
hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en
CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al
10% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó ácido
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(1,66 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
7,51-7,39 (m, 4H), 3,88 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,84
(m, 3H), 2,34 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,80 (m, 1H),
1,67-1,26 (m, 13H); EM 430,4 (M+1).
Etapa
E
Se añadió NaHCO_{3} (325 mg, 3,87 mmol) en agua
(3 ml) a una solución del ácido
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(1,66 g, 3,87 mmol) en EtOH (16 ml). La mezcla de reacción se agitó
durante 5 horas y se concentró a vacío. El residuo se destiló
azeotrópicamente con CH_{2}Cl_{2} (3 veces) proporcionando la
sal sódica del compuesto del epígrafe del Ejemplo 2 (1,698 g). RMN
de ^{1}H (CD_{3}OD) \delta 7,48 (m, 4H), 3,80 (m, 1H), 3,69
(m, 1H), 3,52 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,81 (m, 2H), 2,32 (m, 2H),
2,13 (m, 3H), 1,81 (m, 1H), 1,69-1,26 (m, 13H); EM
430,3 (M-Na+1), 428,2
(M-Na-1).
Etapa
A
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 1, Etapa A, se hizo reaccionar con
7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo
(se suponen 13,3 mmol) durante 18 horas con el anión derivado del
éster dimetílico del ácido
[3-(3-cloro-fenil)-2-oxo-propil]-fosfónico
(3,35 g, 12,12 mmol) y NaH (60% en aceite, 533 mg, 13,3 mmol). La
purificación por medio de cromatografía de media presión (EtOAc al
20% en hexanos hasta EtOAc al 80% en hexanos) proporcionó
7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(1,52 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,24 (m, 2H), 7,17
(s, 1H), 7,06 (m, 1H), 6,64 (dd, 1H), 6,20 (d, 1H), 4,15 (m, 1H),
3,80 (s, 2H), 3,50 (m, 1H), 2,72 (m, 1H), 2,46-2,20
(m, 5H), 1,78 (m, 1H), 1,59 (m, 2H), 1,40 (m, 4H), 1,24 (m,
2H).
Etapa
B
Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo
1, Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de paladio al
10% sobre carbón (86 mg) durante una hora
7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(860 mg, 2,31 mmol) en MeOH (40 ml). La purificación por
cromatografía radial (hexanos hasta EtOAc al 20% en hexanos hasta
EtOAc al 70% en hexanos) proporcionó
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(730 mg).
\newpage
Etapa
C
Se añadió NaBH_{4} (35 mg, 0,921 mmol) a una
solución de
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(730 mg, 1,87 mmol) en MeOH (30 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción se
agitó a 0ºC durante 45 minutos y se añadió agua. Los volátiles se
eliminaron a vacío y la solución acuosa que quedó se diluyó con
cloruro de metileno. La solución orgánica se lavó con agua y después
con salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La
purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1
hasta EtOAc hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(730 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,22 (m, 3H), 7,07
(d, 1H), 3,80 (m, 1H), 3,57 (m, 2H), 2,88 (m, 1H), 2,78 (m, 1H),
2,64 (m, 1H), 2,31 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,65-1,22
(m, 14H); EM 377,3 (M+1).
Etapa
D
Se calentó a reflujo durante 18 horas una
solución de
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(730 mg, 1,94 mmol), trimetilsililazida (0,63 ml, 0,475 mmol) y
óxido de dibutilestaño (96 mg, 3,87 mmol) en tolueno (30 ml). Los
volátiles se eliminaron a vacío y el residuo se diluyó con
CH_{2}Cl_{2}. La solución orgánica se lavó con HCl 1N, seguido
de salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y
se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de media
presión eluyendo con EtOAc hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2}
hasta MeOH al 7% en CH_{2}Cl_{2}, dando el complejo en TMS. El
residuo se diluyó con MeOH y se añadió HCl 2N y la solución se
agitó durante 40 minutos. La solución se diluyó con CH_{2}Cl_{2}
y la fase orgánica se lavó con agua y luego con salmuera. La
solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró.
El residuo se purificó por cromatografía de media presión eluyendo
con EtOAc hasta MeOH al 7% en CH_{2}Cl_{2}, proporcionando la
5S-[4-(3-cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
(521 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,23 (m, 3H), 7,09
(d, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 3,53 (m, 1H), 2,96 (m, 3H),
2,81 (m, 1H), 2,70 (m, 1H), 2,44 (m, 2H), 2,18 (m, 1H),
1,88-1,27 (m, 14H); EM 420,2 (M+1), 418,3
(M-1).
Etapa
A
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 1, Etapa A, se hizo reaccionar el anión derivado de éster
dimetílico del ácido
[2-oxo-3-(3-trifluorometil-fenil)-propil]fosfónico
(2,68 g, 8,64 mmol) y NaH (60% en aceite, 400 mg, 10 mmol) con
7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo
(se suponen 10 mmol) durante 18 horas. La purificación por medio de
cromatografía de media presión (EtOAc al 30% en hexanos hasta EtOAc
al 80% en hexanos) proporcionó
7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(1,2 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,52 (m, 1H), 7,45
(m, 2H), 7,37 (m, 1H), 6,67 (dd, 1H), 6,23 (d, 1H), 4,18 (m, 1H),
3,90 (s, 2H), 3,53 (m, 1H), 2,73 (m, 1H), 2,45-2,23
(m, 5H), 1,79 (m, 1H), 1,60 (m, 2H), 1,41 (m, 4H), 1,24 (m, 2H); EM
407,2 (M+1), 405,3 (M-1).
Etapa
B
Se añadió catecolborano (1M en THF, 8,4 ml, 8,4
mmol) gota a gota a una solución de
7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(1,14 g, 2,81 mmol) y
(R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina
(1M en tolueno, 0,42 ml, 0,42 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (112 ml) a
-45ºC. La mezcla de reacción se agitó a -45ºC durante 18 horas y se
añadió HCl 1N. La mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 40 minutos y se separaron las fases. La solución
orgánica se lavó con NaOH 1N frío (3 veces). La solución orgánica se
lavó secuencialmente con HCl 1N, agua y salmuera. La solución
orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La
purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1
hasta EtOAc al 80% en hexanos) proporcionó
7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(820 mg) como una relación aproximadamente 2,5:1 de los
diastereoisómeros alcohol 3S:3R por RMN de ^{1}H. RMN de ^{1}H
(CDCl_{3}) \delta 7,51-7,38 (m, 4H), 5,72 (dd,
1H), 5,49 (dd, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,02 (m, 1H), 3,47 (m, 1H), 2,90
(m, 2H), 2,71 (m, 1H), 2,34 (m, 4H), 2,18 (m, 1H), 1,66 (m, 4H),
1,44 (m, 4H), 1,27 (m, 2H); EM 409,2 (M+1).
Etapa
C
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 1, Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de
paladio al 10% sobre carbón (100 mg) a 3,45 x 10^{5} Pa durante 18
horas en un agitador de Parr
7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(810 mg) en MeOH (40 ml). La purificación por medio de
cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta MeOH al 3%
en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(720 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,44 (m, 4H), 3,84
(m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,88 (m, 2H), 2,73 (m, 1H), 2,32 (m, 4H),
2,11 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,65-1,37 (m, 11H),
1,30 (m, 2H); EM411,2 (M+1).
Etapa
D
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 3, Etapa D, se hizo reaccionar
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(710 mg, 1,73 mmol) con azidotrimetilsilano (399 mg, 3,46 mmol) y
óxido de dibutilestaño (43 mg, 1,7 mmol) en tolueno (25 ml)
calentado a reflujo durante 18 horas. Los volátiles se eliminaron a
vacío y el residuo se diluyó con CH_{2}Cl_{2}. La solución
orgánica se lavó sucesivamente con HCl 1N (dos veces), agua (1 vez)
y salmuera (1 vez). La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se
filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de
media presión eluyendo con EtOAc hasta MeOH al 2% en
CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 8% en CH_{2}Cl_{2},
proporcionando la
5S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
(450 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,44 (m, 4H), 3,87
(m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,01-2,73 (m,
5H), 2,42 (m, 2H), 2,16 (m, 1H), 1,86-1,23 (m, 14H);
EM 454,4 (M+1), 452,4 (M-1).
Etapa
E
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 2, Etapa E, el tratamiento de la
5S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
(428 mg, 0,944 mmol) con NaHCO_{3} (79 mg, 0,94 mmol) proporcionó
la sal sódica (430 mg). RMN de ^{1}H (CD_{3}OD) \delta 7,48
(m, 4H), 3,79 (m, 1H), 3,67 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 2,86 (m, 5H),
2,30 (m, 2H), 2,12 (m, 1H), 1,84-1,27 (m, 14H); EM
454,4 (M-Na+1), 452,4
(M-Na-1).
Etapa
A
Se añadió una solución de
5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona
(150 mg, 0,41 mmol) en DMF (5 ml) a NaH (60% en peso en aceite, 16
mg, 0,41 mmol) en DMF (10 ml). Después de 1,5 horas, se añadió
7-bromoheptanonitrilo (78 mg, 0,41 mmol) en DMF (5
ml) y la mezcla de reacción se agitó a 90ºC durante 2,5 horas. Se
añadió agua (20 ml) y la solución acuosa se lavó con EtOAc (4 x 15
ml). Las soluciones orgánicas reunidas se lavaron con agua (2 x 15
ml), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. El
residuo se purificó por cromatografía de media presión
(hexanos:EtOAc 1:1), proporcionando
7-{2-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(161 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,09 (m, 2H), 6,95
(m, 2H), 3,81 (m, 1H), 3,54 (m, 2H), 2,86 (m, 1H), 2,68 (m, 2H),
2,29 (m, 4H), 2,06 (m, 1H), 1,74-1,23 (m, 13H),
0,85 (s, 9H), 0,04 (m, 3H), 0,19 (m, 3H); EM 475,1 (M+1).
Etapa
B
Se añadió TBAF (1M en THF, 0,50 ml, 0,50 mmol) a
una solución de
7-{2-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(158 mg, 0,333 mmol) en THF (20 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción se
agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se añadió NaHCO_{3}
acuoso saturado. Los volátiles se eliminaron a vacío. La solución
acuosa que quedó se lavó con CHCl_{3} (4 x 5 ml) y las soluciones
orgánicas reunidas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se
concentraron. El residuo se purificó por cromatografía de media
presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc) proporcionando
7-{2-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(82 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,15 (m, 2H), 7,00
(m, 2H), 3,77 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,89 (m, 1H), 2,79 (m, 1H),
2,64 (m, 1H), 2,34 (m, 4H), 2,12 (m, 1H), 1,68-1,24
(m, 14H); EM 361,2 (M+1).
Etapa
C
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 3, Etapa D, se hizo reaccionar
7-{2-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(71 mg, 0,197 mmol) con azidotrimetilsilano (45 mg, 0,394 mmol) y
óxido de dibutilestaño (5 mg, 0,02 mmol) en tolueno (10 ml)
calentado a reflujo durante 16 horas. Se añadieron cantidades
adicionales de azidotrimetilsilano (200 mg) y de óxido de
dibutilestaño (50 mg) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo
durante 5 horas. La mezcla de reacción se acidificó con HCl 1N
hasta pH 2 (5 ml) y la solución acuosa se lavó con EtOAc (4 x 10
ml). Las soluciones orgánicas reunidas se secaron (MgSO_{4}), se
filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de
media presión (EtOAc hasta EtOAc:MeOH 39:1 hasta EtOAc:MeOH 19:1)
proporcionó el compuesto del epígrafe del Ejemplo 5A (39 mg). RMN
de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,16 (m, 2H), 7,00 (m, 2H), 3,81
(m, 1H), 3,68 (m, 1H), 3,53 (m, 1H), 2,99 (m, 3H), 2,80 (m, 1H),
2,68 (m, 1H), 2,47 (m, 2H), 2,20 (m, 1H), 1,88-1,22
(m, 14H); EM 404,3 (M+1), 402,3 (M-1).
Etapa
A
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 5, Etapa A, se alquiló el anión derivado de
5-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona
(239,1 mg, 0,564 mmol) y NaHMDS (1M en THF, 0,67 ml, 0,67 mmol) con
7-bromoheptanonitrilo (118 mg, 0,620 mg) a 70ºC
durante 24 horas. La purificación por cromatografía de media
presión (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2}
hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en
CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
7-{2-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(187 mg). EM 533,3 (M+1).
Etapa
B
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 5, Etapa B, se desprotegió
7-{2-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(187 mg, 0,351 mmol) con TBAF (1M en THF, 0,53 ml, 0,53 mmol). La
adición se llevó a cabo a 0ºC y la mezcla de reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 24 horas. La purificación por
cromatografía de media presión (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 1%
en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH
al 6% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 10% en CH_{2}Cl_{2})
proporcionó
7-[2-(4-bifenil-3-il-3-hidroxi-butil)-5-oxo-
pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo
(85 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,58 (m, 1H),
7,51-7,33 (m, 4H), 7,21-7,12 (m,
4H), 3,85 (m, 1H), 3,60 (m, 2H), 2,90 (m, 1H),
2,83-2,60 (m, 2H), 2,45-2,30 (m,
4H), 2,14 (m, 1H), 1,73-1,25 (m, 14H).
Etapa
C
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 3, Etapa D, se hizo reaccionar
7-[2-(4-bifenil-3-il-3-hidroxi-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo
(109 mg, 0,260 mmol) con azidotrimetilsilano (0,69 ml, 0,52 mmol) y
óxido de dibutilestaño (11 mg, 0,044 mmol) en tolueno (5,3 ml)
calentado a reflujo durante 72 horas. La mezcla de reacción se
enfrió y se añadió agua. La mezcla se acidificó con HCl 1N hasta pH
2 y la solución acuosa se lavó con MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2}
(tres veces). Las soluciones orgánicas reunidas se secaron
(MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación por
cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta
MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2}
hasta MeOH al 8% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó el compuesto del
epígrafe del Ejemplo 6 (107 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 7,57 (m, 1H), 7,51-7,32 (m, 4H),
7,25-7,13 (m, 4H), 3,91 (m, 1H),
3,74-3,50 (m, 2H), 2,96 (m, 3H), 2,77 (m, 1H), 2,50
(m, 2H), 2,22 (m, 1H), 2,07 (m, 1H), 1,90-1,22 (m,
14H); EM 462,2 (M+1), 460,1 (M- 1).
Etapa
A
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 5, Etapa A, se alquiló el anión derivado de
5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona
(250 mg, 0,684 mmol) y NaHMDS (1M en THF, 0,80 ml, 0,80 mml) con
7-bromoheptanonitrilo (142 mg, 0,748 mg) a 70ºC
durante 72 horas. La purificación por cromatografía de media presión
(hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 5% en
CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
7-{2-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(261,7 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,26 (m, 1H), 6,92
(m, 3H), 3,89 (m, 1H), 3,59 (m, 2H), 2,89 (m, 1H), 2,75 (m, 2H),
2,36 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,72-1,26 (m, 13H), 0,89
(s, 9H), 0,09 (s, 6H); EM 475,3 (M+1).
Etapa
B
Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo
5, Etapa B, se desprotegió con TBAF (1M en THF, 0,83 ml, 0,83 mmol)
7-{2-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(261,7 mg, 0,551 mmol). La adición se llevó a cabo a 0ºC y la
mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24
horas. La purificación por cromatografía de media presión
(CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH
al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2})
proporcionó
7-{2-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(141 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,32 (m, 1H), 6,98
(m, 3H), 3,86 (m, 1H), 3,64 (m, 2H), 2,99-2,80 (m,
2H), 2,71 (m, 1H), 2,38 (m, 4H), 2,16 (m, 1H),
1,74-1,29 (m, 14H); EM 361,3 (M+1).
Etapa
C
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 6, Etapa C, se hizo reaccionar
7-{2-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(141,3 mg, 0,392 mmol) con azidotrimetilsilano (0,210 ml, 1,57
mmol) y óxido de dibutilestaño (29 mg, 0,116 mmol) en tolueno (8 ml)
calentado a reflujo durante 72 horas. La purificación por
cromatografía de media presión (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2%
en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH
al 6% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó el compuesto del epígrafe
del Ejemplo 5C (101,5 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
7,26 (m, 1H), 6,94 (m, 3H), 3,87 (m, 1H), 3,70 (m, 1H), 3,52 (m,
1H), 2,98 (m, 3H), 2,78 (m, 2H), 2,48 (m, 2H), 2,20 (m, 1H),
1,89-1,24 (m, 14H); EM 404,2 (M+1), 401,9
(M-1).
Etapa
A
Se añadió
(R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina
(1M en tolueno, 1,3 ml, 1,3 mmol) a una solución de
7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-cloro-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(1,62 g, 4,34 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (200 ml) a -45ºC. Después
de agitar durante 20 minutos, se añadió catecolborano (1M en THF,
13 ml, 13 mmol) gota a gota. La reacción se agitó a -45ºC durante 16
horas y se añadió HCl 1N. La mezcla se calentó a temperatura
ambiente y se separaron las fases. La solución orgánica se lavó con
NaOH 1N (3 veces) frío. La solución orgánica se lavó sucesivamente
con HCl 1N, agua y salmuera. La solución orgánica se secó
(MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La purificación por
cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta MeOH al 20%
en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-cloro-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(536 mg) como una mezcla 8,2:1 de los alcoholes 3S:2R. RMN de
^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,24-7,17 (m, 3H),
7,07 (m, 1H), 5,69 (dd, 1H), 5,46 (dd, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,01 (m,
1H), 3,46 (m, 1H), 2,81 (m, 2H), 2,68 (m, 1H),
2,42-2,28 (m, 4H), 2,20 (m, 1H),
1,73-1,59 (m, 4H), 1,42 (m, 4H), 1,25 (m, 2H); EM
375 (M+1).
Etapa
B
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 4, Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de
paladio al 10% sobre carbón (60 mg) durante 3,5 horas el
7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-cloro-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(536 mg) en EtOH (30 ml). La purificación por cromatografía de
media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta MeOH al 20% en
CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(440 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,22 (m, 3H), 7,08
(m, 1H), 3,83 (m, 1H), 3,59 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,77 (dd, 1H),
2,66 (dd, 1H), 2,39-2,29 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,78
(m, 1H), 1,68-1,39 (m, 11H), 1,29 (m, 2H); EM 377,2
(M+1).
Etapa
C
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 3, Etapa D, se calentó a reflujo durante 16 horas una mezcla
de
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
(420 mg, 1,114 mmol), trimetilsililazida (257 mg, 2,23 mmol) y
óxido de dibutilestaño (56 mg) en tolueno (30 ml). Los volátiles se
eliminaron a vacío y el residuo se disolvió en MeOH y se agitó con
HCl 3N durante 3 horas. La reacción se diluyó con agua y
CH_{2}Cl_{2} y se separaron las fases. La fase orgánica se lavó
con agua seguida de salmuera. La solución orgánica se secó
(MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La purificación por
cromatografía de media presión (EtOAc hasta MeOH al 2% en
CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 7% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
5S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
(311 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,22 (m, 3H), 7,08
(m, 1H), 3,86 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 2,96 (m, 3H),
2,82-2,68 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,17 (m, 1H),
1,88-1,22 (m, 14H); EM 420,2 (M+1), 418,3
(M-1).
Etapa
A
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 1, Etapa A, se hizo reaccionar el anión derivado de éster
dimetílico del ácido
[2-oxo-3-(3-fenoxi-fenil)-propil]-fosfónico
(633 mg, 1,98 mmol) y NaH (60% en aceite, 70 mg, 1,74 mmol) con
éster etílico del ácido
7-(2R-formil-5-oxo-
pirrolidin-1-il)-heptanoico
(se supone 1,58 mmol) durante 24 horas. La cromatografía de media
presión (EtOAc) proporcionó éster etílico del ácido
7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(215 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,28 (m, 3H), 7,08
(m, 1H), 6,97 (m, 2H), 6,89 (m, 2H), 6,83 (m, 1H), 6,62 (dd, 1H),
6,19 (d, 1H), 4,13 (m, 1H), 4,08 (q, 2H), 3,79 (s, 2H), 3,51 (m,
1H), 2,68 (m, 1H), 2,35 (m, 2H), 2,24 (m, 3H), 2,24 (m, 3H), 1,75
(m, 1H), 1,54 (m, 2H), 1,43-1,20 (m, 9H).
Etapa
B
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 3, Etapa C, se hizo reaccionar el éster etílico del ácido
7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(215 mg, 0,451 mmol) con NaBH_{4} (17 mg, 0,45 mmol) en EtOH (3
ml) a 0ºC durante 4 horas. La purificación por cromatografía de
media presión (EtOAc) proporcionó éster etílico del ácido
7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(167 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,33 (m, 2H), 7,25
(m, 1H), 7,10 (m, 1H), 6,99 (m, 2H), 6,93 (m, 1H), 6,86 (m, 2H),
5,72 (m, 1H), 5,45 (m, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,10 (q, 2H), 3,47 (m,
1H), 2,82 (m, 3H), 2,35 (m, 2H), 2,26 (t, 2H), 2,15 (m, 1H),
1,70-1,21 (m, 13H).
Etapa
C
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 1, Etapa D, se hidrolizó el éster etílico del ácido
7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(29 mg, 0,060 mmol) con NaOH 2M en EtOH (4,0 ml) a temperatura
ambiente durante 24 horas, proporcionando el compuesto del epígrafe
(20 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
7,33-7,21 (m, 3H), 7,08 (m, 1H),
6,98-6,84 (m, 5H), 5,70 (m, 1H), 5,44 (m, 1H), 4,36
(m, 1H), 4,00 (m, 1H), 3,44 (m, 1H), 2,85-2,51 (m,
3H), 2,32 (m, 4H), 2,14 (m, 1H), 1,68-1,18 (m,
10H).
\newpage
Etapa
A
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 1, Etapa C, se sometió a hidrogenación en un agitador de
Parr a 3,45 x 10^{5} Pa durante 18 horas una mezcla del éster
etílico del ácido
7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(139 mg, 0,290 mmol), MeOH (30 ml) y paladio al 10% sobre carbón (14
mg). La purificación por cromatografía de media presión
(hexanos:EtOAc 1:1) proporcionó éster etílico del ácido
7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(86 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
7,35-7,24 (m, 3H), 7,10 (m, 1H), 6,99 (m, 2H), 6,93
(m, 1H), 6,87 (m, 2H), 4,09 (q, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,58 (m, 2H),
2,82 (m, 2H), 2,64 (m, 1H), 2,42-2,24 (m, 4H), 2,10
(m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,66-1,21 (m, 16H).
Etapa
B
Siguiendo el procedimiento descrito para el
Ejemplo 1, Etapa D, se hidrolizó el éster etílico del ácido
7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
(86 mg, 1,79 mmol) con NaOH 2N en MeOH (4 ml) durante 18 horas,
proporcionando el compuesto del epígrafe (62 mg). RMN de ^{1}H
(CDCl_{3}) \delta 7,33-7,23 (m, 3H), 7,09 (m,
1H), 6,98 (m, 2H), 6,91 (m, 1H), 6,86 (m, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,56
(m, 2H), 2,88 (m, 1H), 2,77 (m, 1H), 2,64 (m, 1H),
2,38-2,28 (m, 4H), 2,09 (m, 1H), 1,77 (m, 1H),
1,64-1,21 (m, 13H).
Etapa
A
Se añadió una solución de
5R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-pirrolidin-2-ona
(Tetrahedron: Asymmetry, 1996, 7, 2113) (20,00
g, 87,19 mmol) en DMF (50 ml) a una mezcla de NaH (60% en aceite,
3,836 g, 0,0959 mmol, lavada con 20 ml de DMF) en DMF (50 ml). La
reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas y se
añadió una solución de 7-bromoheptanonitrilo (16,574
g, 87,19 mmol) en DMF (50 ml). La reacción se agitó a 90ºC durante
3 horas. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se
añadió agua (750 ml). La solución acuosa se lavó con EtOAc (4x250
ml). Las soluciones orgánicas reunidas se lavaron con agua (2x250
ml), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La
purificación por cromatografía de media presión eluyendo con un
gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 9:1 hasta hexanos:EtOAc 7:3
hasta hexanos EtOAc 1:1) proporcionó
7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo
(22,46 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
3,69-3,55 (m, 4H), 2,99 (m, 1H), 2,42 (m, 1H),
2,34-2,24 (m, 3H), 2,05 (m, 1H), 1,81 (m, 1H),
1,67-1,42 (m, 6H), 1,31 (m, 2H), 0,86 (s, 9H), 0,03
(s, 6H); EM 339,3 (M+1).
Etapa
B
Se añadió lentamente una solución de fluoruro de
tetrabutilamonio (1M en THF, 100,0 ml, 100,0 mmol) a una solución
de
7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo
(22,39 g, 66,13 mmol) en THF (400 ml) a 0ºC. La reacción se calentó
hasta temperatura ambiente y se agitó durante 4 horas. Se añadió
NaHCO_{3} acuoso saturado (250 ml) y los volátiles se eliminaron
a vacío. La solución acuosa que quedó se lavó con CHCl_{3} (4x200
ml). Las soluciones orgánicas reunidas se secaron (MgSO_{4}), se
filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de
media presión eluyendo con un gradiente de disolvente
(hexanos:EtOAc 9:1 hasta hexanos:EtOAc 4:1 hasta hexanos:EtOAc 7:3
hasta hexanos:EtOAc 6:4 hasta hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta
EtOAc:MeOH 9:1) proporcionó
7-(2R-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo
(14,922 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 3,78 (dd, 1H),
3,71-3,58 (m, 3H), 3,00 (m, 1H), 2,46 (m, 1H),
2,36-2,27 (m, 3H), 2,08 (m, 1), 1,93 (m, 1H), 1,77
(m, 1H), 1,68-1,43 (m, 6H), 1,32 (m, 2H); EM 225,1
(M+1).
Etapa
A
Siguiendo el procedimiento descrito para la
Preparación 1, Etapa A, se hizo reaccionar con
7-bromoheptanoato de etilo (32,559 g, 137,3 mmol)
durante 3 horas a 90ºC el anión derivado de
5R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-pirrolidin-2-ona
(30,000 g, 130,8 mmol) y NaH (60% en aceite, 5,756 g, 143,9 mmol) en
DMF (600 ml). La purificación por cromatografía de media presión
eluyendo con un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 9:1 hasta
hexanos EtOAc 4:1 hasta hexanos:EtOAc 7:3 hasta hexanos:EtOAc 6:4)
proporcionó éster etílico del ácido
7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico
(39,46 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 4,10 (q, 2H), 3,62
(m, 4H), 2,95 (m, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,27 (m, 3H), 2,04 (m, 1H),
1,81 (m, 1H), 1,65-1,26 (m, 8H), 1,23 (t, 3H), 0,86
(s, 9H), 0,03 (s, 6H); EM 386,2 (M+1).
Etapa
B
Siguiendo el procedimiento descrito para la
Preparación 1, Etapa B, se desprotegió el éster etílico del ácido
7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico
(39,46 g, 102,3 mmol) con TBAF (1M en THF, 154,0 ml, 154,0 mmol)
con un tiempo de reacción de 2,5 horas. La purificación por medio
de cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de
disolvente (hexanos:EtOAc 9:1 hasta hexanos:EtOAc 6:4 hasta
hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta EtOAc:MeOH 19:1) proporcionó
éster etílico del ácido
7-(2R-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
(25,41 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 4,10 (q, 2H), 3,77
(dd, 1H), 3,64 (m, 3H), 2,96 (m, 1H), 2,46 (m, 1H),
2,35-2,25 (m, 3H), 2,08 (m, 1H), 1,93 (m, 1H), 1,71
(m, 1H), 1,63-1,27 (m, 8H), 1,23 (t, 3H); EM 272,2
(M+1).
Etapa
A
Se añadió trietilamina (2,25 ml) a una solución
de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (1,577
g, 16,2 mmol) en DMF (25 ml) y CH_{2}Cl_{2} (25 ml) a 0ºC.
Después de agitar durante 5 minutos, se añadieron ácido 3-
trifluorometilfenilacético (3,0 g, 14,7 mmol), HOBT (3,177 g, 23,5
mmol) y DEC (clorhidrato del cloruro de
2-dietilaminoetilo, 3,10 g, 16,2 mmol). La mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y se
concentró a vacío. El residuo se diluyó con EtOAc y la solución
orgánica se lavó sucesivamente con NaOH 1N (2 veces), agua y
salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se
concentró a vacío. La cromatografía de media presión (EtOAc al 20%
en hexanos hasta EtOAc al 50% en hexanos) proporcionó
N-metoxi-N-metil-2-(3-trifluorometil-fenil)-acetamida.
Etapa
B
Se añadió lentamente n-BuLi (2,5M
en hexanos, 28 ml, 70 mmol) a una solución de metilfosfonato de
dimetilo (9,4 g, 75,8 mmol) en tolueno (80 ml) a -78ºC. La mezcla de
reacción se agitó durante 1 hora y se añadió lentamente una solución
de
N-metoxi-N-metil-2-(3-trifluorometil-fenil)-acetamida
(14,39 g) en tolueno (50 ml). La mezcla de reacción se agitó
durante 2,5 horas y se añadió AcOH (40 ml). La mezcla de reacción
se calentó hasta temperatura ambiente y se añadió agua. La fase
orgánica se lavó con agua, seguido por salmuera. La solución
orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró a vacío. La
cromatografía de media presión (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2% en
CH_{2}Cl_{2}) proporcionó el compuesto del epígrafe de la
Preparación 3 (9,37 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,52
(m, 1H), 7,44 (m, 2H), 7,37 (m, 1H), 3,96 (s, 2H), 3,87 (s, 3H),
3,76 (s, 3H), 3,12 (d, 2H).
Sustituyendo los materiales apropiados, se
preparó el compuesto del epígrafe de la Preparación 4 siguiendo un
procedimiento análogo al descrito para la Preparación 3.
Se añadió lentamente n-BuLi
(2,5M, 64,2 ml, 160,6 mmol) a una solución de metilfosfonato de
dimetilo (17,93 g, 144 mmol) en THF (270 ml) a -78ºC. La mezcla de
reacción se agitó durante 1 hora y se añadió lentamente éster
metílico del ácido
(3-cloro-fenil)-acético
(26,93 g, 146 mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta
temperatura ambiente y se agitó durante 24 horas. Se añadió AcOH (15
ml) y los volátiles se eliminaron a vacío. El residuo se diluyó con
CH_{2}Cl_{2} y la solución orgánica se lavó cuidadosamente con
NaHCO_{3} acuoso saturado (3 veces). La fase orgánica se secó
(MgSO_{4}), se filtró y se concentró a vacío. La purificación por
medio de cromatografía de media presión (EtOAc al 20% en hexanos
hasta EtOAc) proporcionó el compuesto del epígrafe (9,28 g).
El compuesto del epígrafe de la Preparación 6 se
preparó siguiendo el procedimiento descrito en la patente de Estados
Unidos número 4.663.464.
Se añadió clorhidrato de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(3,46 g, 18,03 mmol) y DMSO (1,5 ml, 24,04 mmol) a una solución de
éster etílico del ácido
7-(2R-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
(1,63 g, 6,01 mmol) en benceno (50 ml). La solución se enfrió hasta
0ºC y se añadió trifluoroacetato de piridinio (1,28 g, 6,61 mmol).
La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 15 minutos y luego a
temperatura ambiente durante 2 horas. La solución se decantó del
residuo oleoso. El residuo se lavó con benceno (3 veces) y las aguas
de lavado del benceno reunidas se concentraron a vacío
proporcionando el éster etílico del ácido
7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico,
que se usó sin purificación posterior.
Etapa
A
Se añadió bromuro de
3-bromobencilmagnesio (0,25 M en Et_{2}O, 155 ml,
38,8 mmol), gota a gota, a una solución de
tetrahidropirrolizin-3,5-diona (5 g,
36 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (320 ml) a 0ºC. La solución se agitó a
0ºC durante 2 horas y se inactivó con cloruro amónico acuoso
saturado. Se añadió HCl 1N acuoso para llegar a un pH de 3. Después
de calentar hasta temperatura ambiente, la solución acuosa se
extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 veces). Los extractos orgánicos
reunidos se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron.
La purificación por cromatografía de media presión usando un
gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH
al 5% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
5-(3-bromo-3-oxo-butil)
-pirrolidin-2-ona (7,84 g). RMN de
^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,41-7,11 (m, 4H),
6,24 (s ancho, 1H), 3,67 (s, 2H), 3,60 (m, 1H), 2,52 (t, 2H), 2,32
(m, 2H), 2,20 (m, 1H), 1,88-1,60 (m, 3H).
Etapa
B
Se añadió NaBH_{4} (480 mg, 12,6 mmol) a una
solución de
5-(3-bromo-3-oxo-butil)-pirrolidin-2-ona
(7,84 g, 25,3 mmol) en EtOH (130 ml) a 0ºC y la reacción se agitó a
0ºC durante 2,5 horas. La reacción se inactivó con cloruro amónico
acuoso saturado. Se añadieron agua y CH_{2}Cl_{2}. La fase
acuosa se lavó con CH_{2}Cl_{2} (3 veces) y los extractos
orgánicos reunidos se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se
concentraron. La purificación por cromatografía de media presión
usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc
hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en
CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al
8% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
5-(3-bromo-3-hidroxi-butil)-pirrolidin-2-ona
(6,76 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
7,36-7,09 (m, 4H), 6,27 (d, 1H), 3,78 (m, 1H), 3,63
(m, 1H), 2,75 (m, 1H), 2,62 (m, 1H), 2,32- 2,18 (m, 3H), 1,88 (m,
1H), 1,73-1,42 (m, 5H); EM 312,2, 314,1 (M+).
Etapa
C
Se añadió cloruro de
terc-butildimetilsililo (3,59 g, 23,8 mmol), seguido por
imidazol (2,95 g, 43,3 mmol) y DMAP (264 mg, 2,16 mmol) a una
solución de
5-(3-bromo-3-hidroxi-butil)-pirrolidin-2-ona
(6,76 g, 21,6 mmol) en DMF (86 ml). La reacción se agitó durante 24
horas y se inactivó con cloruro amónico acuoso saturado. La
solución acuosa se lavó con EtOAc (3 veces) y los extractos
orgánicos reunidos se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se
concentraron. La purificación por cromatografía de media presión
usando un gradiente de disolvente (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al
1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2} hasta
MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 8% en
CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
5-[3-bromo-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-
butil]-pirrolidin-2-ona
(7,45 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,30 (m, 2H), 7,12
(m, 1H), 7,04 (m, 1H), 5,71 (m, 1H), 3,81 (m, 1h), 3,56 (m, 1H),
2,66 (m, 2H), 2,32-2,17 (m, 3H),
1,70-1,35 (m, 5H), 0,82 (s, 9H), -0,06 (d, 3H), -
0,24 (d, 3H); EM 426,2, 428,2 (M+).
\newpage
Etapa
D
Se añadió ácido fenilborónico (236 mg, 1,93 mmol)
a una solución de
5-[3-bromo-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona
(750 mg, 1,76 mmol) en DME (15 ml). Se añadieron acetato de paladio
(26,8 mg, 0,088 mmol) y
tri-o-tolilfosfina (39,5 mg, 0,176
mmol), seguido de una solución de Na_{2}CO_{3} (37,3 mg, 3,52
mmol) en agua (1,8 ml). La reacción se calentó a reflujo durante 24
horas. La reacción se enfrió y los volátiles se eliminaron a vacío.
El residuo se diluyó con salmuera y EtOAc. La solución acuosa se
lavó con EtOAc (3 veces) y los extractos orgánicos reunidos se
secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La
purificación por cromatografía de media presión eluyendo con un
gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al
1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2} hasta
MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
5-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona
(717,3 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,57 (m, 2H), 7,43
(m, 2H), 7,33 (m, 3H), 7,11 (m, 2H), 5,78 (m, 1H), 3,91 (m, 1H),
3,59 (m, 1H), 2,76 (m, 2H), 2,27 (m, 3H), 1,73-1,38
(m, 5H), 0,83 (s, 9H), -0,03 (d, 3H), -0,16 (d, 3H); EM 424,3
(M+1).
Etapa
A
Siguiendo el procedimiento descrito para la
Preparación 8, Etapa A, se hizo reaccionar
tetrahidro-pirrolizin-3,5-diona
(2 g, 14 mmol) con cloruro de
3-fluorobencilmagnesio (0,25M en Et_{2}O, 62 ml,
15,5 mmol) durante 2,5 horas. La purificación por cromatografía de
media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1
hasta EtOAc:hexanos 2:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 2% en
CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 10% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
5-[4-(3-fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona
(2,1730 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
7,32-7,27 (m, 1H), 7,00-6,90 (m,
3H), 6,12 (s ancho, 1H), 3,69 (s, 2H), 3,59 (m, 1H), 2,52 (t, 2H),
2,30 (m, 2H), 2,19 (m, 1H), 1,75 (m, 2H), 1,65 (m, 1H).
Etapa
B
Siguiendo el procedimiento descrito para la
Preparación 8, Etapa B, se redujo
5-[4-(3-fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona
(2,17 g, 8,71 mmol) con NaBH_{4} (165 mg, 4,35 mmol). La
purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente
de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 1% en
CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al
6% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
5-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona
(2,23 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,27 (m, 1H), 6,94
(m, 3H), 6,38 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 2,79 (m, 1H),
2,67 (m, 1H), 2,33-2,21 (m, 3H), 1,92 (d, J=4,15
Hz, 1H), 1,75-1,40 (m, 5H); EM 252,2 (M+1).
Etapa
C
Siguiendo el procedimiento descrito para la
Preparación 8, Etapa C, se hizo reaccionar la
5-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona
(2,23 g, 8,87 mmol) con cloruro de terc-butildimetilsililo
(1,47 g, 9,76 mmol). La purificación por cromatografía de media
presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta
EtOAc hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2% en
CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona
(2,84 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,23 (m, 1H), 6,88
(m, 3H), 5,75 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,57 (m, 1H), 2,71 (m, 2H),
2,30 (m, 2H), 2,25 (m, 1H), 1,70-1,38 (m, 5H), 0,84
(s, 9H), 0 (s, 3H), -0,2 (s, 3H).
Etapa
A
Siguiendo el procedimiento descrito para la
Preparación 8, Etapa A, se hizo reaccionar
tetrahidro-pirrolizin-3,5-diona
(1,41 g, 10,1 mmol) con cloruro de
4-fluorobencilmagnesio (0,25M en Et_{2}O, 50 ml,
12,5 mmol) durante 5 horas. La purificación por cromatografía de
media presión (MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona
(2,64 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,18 (m, 2H), 7,03
(m, 2H), 6,34 (m, 1H), 3,70 (s, 2H), 3,62 (m, 1H), 2,54 (t, 2H),
2,34-2,15 (m, 3H), 1,82-1,61 (m,
3H).
Etapa
B
Siguiendo el procedimiento descrito para la
Preparación 8, Etapa B, se redujo
5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona
(2,64 g, mmol) con NaBH_{4} (400 mg, mmol) a temperatura ambiente
durante 1 hora. Se añadió más NaBH_{4} (150 mg) y la reacción se
agitó durante 20 horas. La purificación por cromatografía de media
presión usando un gradiente de disolvente (CH_{2}Cl_{2} hasta
MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2})
proporcionó
5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona
(2,01 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,14 (m, 2H), 6,98
(m, 2H), 6,78 (m, 1H), 3,76 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 2,76 (m, 1H),
2,64 (m, 1H), 2,32-2,18 (m, 4H),
1,72-1,47 (m, 5H).
Etapa
C
Siguiendo el procedimiento descrito para la
Preparación 8, Etapa C, se hizo reaccionar la
5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona
(1,95 g, 7,79 mmol) con cloruro de terc-butildimetilsililo
(1,47 g, 9,76 mmol). La purificación por cromatografía de media
presión usando un gradiente de disolvente (MeOH al 1% en
CH_{2}Cl_{2}) proporcionó
5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona.
RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,12 (m, 2H), 6,97 (m, 2H),
5,75 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 3,60 (m, 1H), 2,71 (m, 2H),
2,36-2,24 (m, 3H), 1,70-1,38 (m,
5H), 0,84 (s, 9H), -0,05 (d, 3H), -0,2 (d, 3H).
El compuesto del epígrafe de la Preparación 11 se
preparó de forma análoga a la descrita para el compuesto de la
Preparación 5, sustituyendo los materiales apropiados.
Claims (10)
1. Uso de un agonista selectivo del receptor EP4
de Fórmula I:
o de una de las sales farmacéuticamente
aceptables de dicho compuesto, en la
que:
Q es COOR^{3}, CONHR^{4} o
tetrazol-5-ilo;
A es un enlace sencillo o
cis-doble;
B es un enlace sencillo o
trans-doble;
=U es
R^{2} es \alpha -tienilo, fenilo, fenoxi,
fenilo monosustituido o fenoxi monosustituido, siendo dichos
sustituyentes cloro, fluoro, fenilo, metoxi, trifluorometilo o
alquilo C_{1}-C_{3};
R^{3} es hidrógeno, alquilo
C1-C5, fenilo o p-bifenilo;
R^{4} es COR^{5} o SO_{2} R^{5}; y
R^{5} es fenilo o alquilo
C_{1}-C_{5};
o de ácido
7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)but-1-enil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico
o ácido
7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)butil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico;
para la fabricación de un medicamento para tratar
un trastorno que cursa con masa ósea reducida.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que Q es
5-tetrazolilo y =U es
3. Uso según la reivindicación 2, en el que el
compuesto de Fórmula I es
5R-(3S-hidroxi-4-fenil-but)-1-enil)-1-[6-(1H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona,
5S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-1-[6-(1H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona,
5S-(4-(3-clorofenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil-pirrolidin-2-ona
o
5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona.
4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho
agonista selectivo del receptor EP4 es un compuesto de Fórmula I,
siendo Q COOH y =U es
5. Uso según la reivindicación 4, en el que dicho
compuesto es ácido
7-(2S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico,
ácido
7-[2R-(3S-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico,
ácido 7-{2S-
[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico, ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico, ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico o ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico.
[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico, ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico, ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico o ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho trastorno es
osteoporosis, fragilidad, una fractura osteoporótica, un defecto
óseo, pérdida ósea idiopática de la infancia, pérdida ósea alveolar,
pérdida ósea mandibular, fractura ósea, osteotomía, pérdida ósea
asociada con periodontitis o recrecimiento protésico.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el medicamento está destinado
a la administración local o sistémica.
8. Un compuesto seleccionado de ácido
7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-hepta-
noico; ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico; ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico; 5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona; y 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-
pirrolidin-2-ona.
noico; ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico; ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico; 5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona; y 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-
pirrolidin-2-ona.
9. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto según la reivindicación 8 y un diluyente o vehículo
farmacéuticamente aceptable.
10. Un compuesto según la reivindicación 8 para
su uso como medicamento.
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