MXPA02006322A - Agonistas selectivos del receptor ep4 en el tratamiento de la osteoporosis. - Google Patents

Agonistas selectivos del receptor ep4 en el tratamiento de la osteoporosis.

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Abstract

Esta invencion se refiere a procedimientos para tratar trastornos que presentan una masa osea reducida, en particular osteoporosis, fragilidad, una fractura osteoporotica, un defecto oseo, perdida osea idiomatica de la infancia, perdida osea alveolar, perdida osea mandibular, fractura osea, osteotomia, perdida osea asociada a periodontitis o recrecimiento protesico, que comprenden administrar agonistas de prostaglandinas que son agonistas de prostaglandinas selectivos para el receptor EN. Esta invencion se refiere especialmente a los procedimientos en los que el agonista selectivo del receptor EP4 es un compuesto de Formula 1: (ver formula) en la que las variables son como se han definido en la memoria descriptiva.

Description

AGONISTAS SELECTIVOS DEL RECEPTOR EP4 EN EL TRATAMIENTO DE LA OSTEOPOROSIS ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta invención se refiere a procedimientos y a composiciones farmacéuticas que comprenden agonistas de prostaglandina que son útiles para prevenir la pérdida ósea o para restaurar o aumentar la masa ósea y para potenciar la curación ósea, incluyendo el tratamiento de trastornos que se presentan con una masa ósea reducida y/o defectos óseos en vertebrados, y en particular en mamíferos incluyendo seres humanos. Esta invención se refiere de forma específica a procedimientos y a composiciones farmacéuticas que comprenden agonistas de prostaglandinas selectivos para el receptor EP4. La osteoporosis es una enfermedad esqueletal sistémica, caracterizada por una masa ósea reducida y por el deterioro del tejido óseo, con un incremento consiguiente de la fragilidad del hueso y susceptibilidad a fracturas. En los Estados Unidos, el trastorno afecta a más de 25 millones de personas y provoca más de 1.3 millones de fracturas cada año, que anualmente incluyen 500.000 fracturas de columna vertebral, 250.000 de cadera y 240.000 de muñeca. Las fracturas de cadera son la consecuencia más grave de la osteoporosis, muriendo un 5-20% de paciente en un período de un año, y quedando más del 50% de los supervivientes físicamente impedidos. Los ancianos son los sujetos con un mayor riesgo de osteoporosis y, por tanto, puede predecirse que el problema aumente significativamente con el envejecimiento de la población. La incidencia de fractura en todo el mundo se prevé que aumente tres veces durante los próximos 60 años, y un estudio ha estimado que en el año 2050 serán 4.5 millones las fracturas de cadera en todo el mundo. Las mujeres tienen un mayor riesgo de osteoporosis que los varones. Las mujeres experimentan una brusca aceleración de la pérdida ósea durante los cinco años posteriores a la menopausia. Otros factores que incrementan el riesgo incluyen fumar, abuso de alcohol, un modo de vida sedentario y una ingesta baja de calcio. Actualmente existen dos tipos principales de terapias farmacéuticas para el tratamiento de la osteoporosis. El primero es el uso de compuestos antiresorción para reducir la resorción del tejido óseo. Los estrogenos son un ejemplo de un agente antiresorción. Es conocido que los estrógenos reducen las fracturas. Además, Black et al., en el documento EP 0605193A1 describen que los estrógenos, particularmente cuando se toman oralmente, disminuyen los niveles plasmáticos de LDL y elevan los de lipoproteínas de alta densidad (HDL) beneficiosas. Sin embargo, los estrógenos son incapaces de restablecer el hueso hasta los niveles de adultos jóvenes en el esqueleto ya osteoporótico. Además, la terapia de estrógenos a largo plazo se ha relacionado con una serie de trastornos que incluyen un incremento en el riesgo de cáncer de útero, cáncer endometrial y posiblemente cáncer de mama, provocando que muchas mujeres eviten este tratamiento. Los efectos secundarios significativos indeseables asociados a la terapia de estrógenos apoyan la necesidad de desarrollar terapias alternativas para la osteoporosis que tengan el efecto deseable sobre las LDL en suero pero que no provoquen efectos indeseables. Un segundo tipo de terapia farmacéutica para el tratamiento de la osteoporosis en el uso de agentes anabólicos para promover la formación de hueso e incrementar la masa ósea. Se espera que esta clase de agentes restablezca el hueso en el esqueleto ya osteoporótico. En los documentos de Gran Bretaña 1478281 , 1479156 y en las patentes de los Estados Unidos nos. 4.175.203, 4.055.596, 4.175.203, 3.987.091 y 3.991.106 se describen ciertos agonistas de prostaglandinas por ser útiles como, por ejemplo, vasodilatadores renales. La patente de los Estados Unidos n° 4.033.996 describe ciertas 8-aza-9-oxo(y d¡oxo)-tia-11 ,12-secoprostaglandinas que son útiles como vasodilatadores renales, para la prevención de la formación de trombos, para inducir la liberación de hormona del crecimiento y como reguladores de la respuesta inmune. La patente francesa n° 897.566 describe ciertos derivados de aminoácidos para el tratamiento de enfermedades neurológicas, mentales o cardiovasculares.
J. Org. Chem. 26; 1961 ; 1437 describe el ácido N-acetil-N-bencil-p-aminofenilmercaptoacético. La patente de los Estados Unidos n° 4.761.430 describe ciertos compuestos arilbencenosulfonamida como agentes para reducir los lípidos. La patente de los Estados Unidos n° 4.443.477 describe ciertos ácidos sulfonamidofenilcarboxílicos como agentes para reducir los lípidos. La patente de los Estados Unidos n° 3.528.961 describe ciertos derivados de e-caprolactama como colorantes. La patente de los Estados Unidos n° 3.780.095 describe ciertos ácidos anilinocarboxílicos acilados como coleréticos. La patente de los Estados Unidos n° 4.243.678 describe ciertos ácidos acilhidrocarbilaminoalcanoicos por tener utilidad en el tratamiento de úlceras gástricas, como inhibidores de la excreción de las glándulas sebáceas y para combatir la inflamación cutánea. La patente de los Estados Unidos n° 4.386.031 describe ciertos ácidos N-benzoil-co-anilinoalcanocarboxílicos como agentes antialérgicos, inhibidores de la agregación trombótica, agentes antiinflamatorios y agentes para reducir los lípidos. Además de osteoporosis, aproximadamente 20-25 millones de mujeres y un número en aumento de hombres sufren fracturas vertebrales detectables como consecuencia de una masa ósea reducida, con unas 250.000 fracturas de cadera adicionales anuales descritas solamente en los Estados Unidos. El caso anterior está asociado a una tasa de mortalidad del 12% en los dos primeros años y a una tasa del 30% de pacientes que requieren cuidados asistenciales a domicilio después de la fractura. Aunque esto es ya significativo, es de esperar que aumenten las consecuencias económicas y médicas de la convalecencia bebida a una curación lenta o imperfecta de estas fracturas de hueso, a causa del envejecimiento de la población general. Los estrogenos han demostrado (Bolander et al., 38th Annual Meeting Orthopedic Research Society, 1992) que mejoran la calidad de la curación de fracturas apendiculares. Por tanto, la terapia de sustitución de estrogenos podría ser procedimiento eficaz para el tratamiento de reparación de fracturas. Sin embargo, el cumplimiento del paciente con la terapia de estrogenos es relativamente malo debido a sus efectos secundarios, que incluyen la reaparición de la menstruación, mastodinia y un mayor riesgo de cáncer de útero, un mayor riesgo percibido de cáncer de mama, y el uso concomitante de progestinas. Además, los hombres son propensos a objetar el uso del tratamiento con estrogenos. Existe la necesidad de una terapia que sea beneficiosa para pacientes que han sufrido fracturas óseas debilitantes y que aumente el cumplimiento del paciente. Se ha demostrado que la prostaglandina E2 (PGE2) puede restaurar el hueso en un modelo de rata ovariectomizada (OVX), un modelo de osteoporosis postmenopáusica. Ke, H.Z., et al., Bone, 23:249-255, 1998. Sin embargo, existen graves efectos secundarios asociados con la PGE2. Jee., W.S.S. and Ma, Y.F. Bone 21 :297-304, 1997.
Aunque existen una serie de terapias para la osteoporosis, existe una continua necesidad y una búsqueda continua en este campo de la técnica de terapias alternativas para la osteoporosis. Por otro lado, existe una necesidad de terapias para la curación de las fracturas óseas. Además, existe una necesidad de terapias que puedan promover un nuevo crecimiento en áreas esqueletales en las que existan defectos tales como defectos provocados o producidos por, por ejemplo, tumores en el hueso. Además, existe una necesidad de terapias que puedan promover un nuevo crecimiento en las áreas esqueletales en las que están indicados injertos óseos.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Esta invención se refiere a procedimientos para tratar un trastorno que presenta una masa ósea reducida en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero un agonista selectivo del receptor EP4, uno de sus profármacos o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho agonista selectivo del receptor EP4 o de dicho profármaco. La invención se refiere en particular a dichos procedimientos en los que dicho trastorno es osteoporosis, fragilidad, una fractura osteoporótica, un defecto óseo, pérdida ósea idiopática de la niñez, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea mandibular, fractura ósea, osteotomía, pérdida ósea asociada a periodontitis o crecimiento interno protésico. En los procedimientos preferidos de esta invención, el agonista selectivo del receptor EP4 se administra por vía sistémica, por ejemplo, por vía oral, subcutánea, Intramuscular o por aerosol. En otros procedimientos preferidos de esta invención, el agonista de EP4 se administra localmente. Los procedimientos de esta invención son especialmente útiles cuando dicho trastorno es fragilidad. Los procedimientos de esta invención son especialmente útiles cuando dicho trastorno es osteoporosis. Los procedimientos de esta invención son especialmente útiles cuando dicho trastorno fractura ósea o fractura osteoporótica. Los agonistas selectivos de EP4 preferidos para usar en los procedimientos de esta invención incluyen los compuestos de Fórmula I: los profármacos de los mismos y las sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos o de dichos profármacos, en la que: Q es COOR3, CONHR4 o tetrazol-5-ilo; A es un enlace sencillo o cis-doble; B es un enlace sencillo o trans-doble; U es / ,, H OH , HO H ó HO H ; R2 es a-tienilo, fenilo, fenoxi, fenilo monosustituido y fenoxi monosustituido, siendo dichos sustituyentes cloro, fluoro, fenilo, metoxi, trifluorometilo o alquilo CrC3; R3 es hidrógeno, alquilo C1-C5, fenilo o p-bifenilo; R4 es COR5 o SO2R5; y R5 es fenilo o alquilo C1-C5. Un grupo preferido de agonistas selectivos del receptor EP4 de Fórmula I para usar en los procedimientos de esta invención son aquellos compuestos de Fórmula I en los que Q es 5-tetrazolilo y U es / H OH , que forman compuestos que tienen la fórmula IA, Los compuestos particulares preferidos dentro de este grupo incluyen 5S-(4-3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1 -(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona; 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona; 5R-(3S-hidroxi-4-fenil-but-1 -en¡l)-1 -[6-(1 H-tetrazol- 5-il)-hexii]-pirrolidin-2-ona; y 5S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-1-[6-(1 H-tetrazol-5-i!)-hexil]-pirrol¡d¡n-2-ona. Otro grupo preferido de agonistas selectivos del receptor EP4 de Fórmula I para usar en los procedimientos de esta invención son aquellos compuestos de Fórmula I en los que Q es COOH. Los compuestos particularmente preferidos dentro de este grupo incluyen el ácido 7-{2S-[3R-hidrox¡-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico; el ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifiuorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico; el ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico; el ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrol¡din-1-il)-heptanoico; y el ácido 7-[2R-(3S-hidroxi-4-fenil-but-1 -enil)-5-oxo-pirrolidin-1 -il]-heptanoico. Preferentemente, se tratan mujeres postmenopáusicas y hombres mayores de 60 años. También se prefieren individuos, independientemente de su edad, que tienen una masa ósea significativamente reducida, es decir, una desviación típica mayor o igual a 1.5 desviaciones estándares por debajo de los niveles de jóvenes normales. En los procedimientos de esta invención, los trastornos que presentan una masa ósea reducida incluyen trastornos tales como, por ejemplo, osteoporosis, pérdida ósea idiopática de la infancia, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea mandibular, fractura ósea, osteotomía, pérdida ósea asociada a periodontitis y crecimiento interno protésico. También se Incluyen procedimientos para tratar la "osteoporosis secundaria", dentro de los procedimientos de esta invención. "Osteoporosis secundaria" incluye osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteoporosis inducida por hipertiroidismo, osteoporosis inducida por inmovilización, osteoporosis inducida por heparina u osteoporosis inducida por inmunosupresores en un vertebrado, por ejemplo un mamífero (incluyendo a un ser humano). Estos procedimientos se llevan a cabo administrando a dicho vertebrado, por ejemplo un mamífero, una cantidad para tratar la "osteoporosis secundaria" de un agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4, uno de sus profármacos o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4 o de dicho profármaco. Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere a procedimiento para reforzar un injerto óseo, inducir sinóstosis vertebral, potenciar la extensión de los huesos largos, potenciar la curación ósea después de una reconstrucción facial, una reconstrucción maxilar y/o una reconstrucción mandibular en un vertebrado, por ejemplo un mamífero, (incluyendo a un ser humano) que comprende administrar a dicho vertebrado, por ejemplo un mamífero que se somete a reconstrucción maxilar, a reconstrucción facial o a reconstrucción mandibular, una cantidad potenciadora del hueso de un agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4, uno de sus profármacos, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4 o de dicho profármaco. Los agonistas de prostaglandina selectivos para el receptor EP4 de esta invención se puede aplicar de forma local en el lugar de la reconstrucción ósea o se pueden administrar por vía sistémica. Una dosis preferida varía de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 100 mg/kg/día de un agonista selectivo del receptor EP4, de uno de sus profármacos o de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o de dicho profármaco. Una dosis especialmente preferida varía de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10 mg/kg/día de un agonista selectivo del receptor EP4, de uno de sus profármacos o de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o de dicho profármaco. La frase ' rastorno(s) que presenta(n) una masa ósea reducida" se refiere a un trastorno en ef que el nivel de masa ósea s inferior al normal específico para la edad, como se define en las normas de la Organización Mundial de la Salud "Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization Techncial Series 843". En "trastorno(s) que presenta(n) una masa ósea reducida" se encuentra incluida la osteoporosis primaria y secundaria, tal y como se ha descrito antes. Además, se incluye enfermedad periodontal, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea por osteotomía y pérdida ósea idiopática de la infancia. La frase "trastorno(s) que presenta(n) una masa ósea reducida" también incluye las complicaciones a largo plazo de la osteoporosis como curvatura de la columna vertebral, pérdida de peso y cirugía protésica.
La frase "trastorno(s) que presenta(n) una masa ósea reducida" se refiere también a un vertebrado, por ejemplo un mamífero, conocido por tener una posibilidad significativamente mayor que la media de desarrollar las enfermedades que se describen anteriormente, incluyendo osteoporosis (por ejemplo, mujeres postmenopáusicas, hombres mayores de 50 años). Otros usos que aumenten o potencien la masa ósea incluyen la restauración ósea, incrementar la velocidad de curación de fracturas óseas, reemplazar la cirugía de injertos óseos totalmente, potenciar el índice de éxitos de los injertos óseos, la curación ósea después de una reconstrucción facial o una reconstrucción maxilar o una reconstrucción mandibular, el crecimiento interno protésico, la sinóstosis vertebral o la extensión de huesos largos. Los procedimientos de esta invención también pueden usarse combinados con dispositivos ortopédicos como estructuras de fusión espina, equipo de fusión espinal, dispositivos de fijación ósea internos y externos, tornillos y clavos. Los expertos en la técnica reconocerán que el término masa ósea se refiere realmente a la masa ósea por unidad de superficie, que en algunas ocasiones (aunque no de forma estrictamente correcta) se denomina densidad mineral del hueso. El término "tratar", "trato" o "tratamiento", tal como se usa en la presente, incluye el tratamiento preventivo (por ejemplo, profiláctico) y paliativo y curativo.
El término "farmacéuticamente aceptable" significa que el portador, vehículo, diluyente, excipientes y/o sal deben ser compatibles con el resto de ingredientes de la formulación, y no perjudicar al receptor de las mismas. La expresión "profármacos" se refiere a compuestos que son precursores farmacológicos que, después de la administración, liberan el fármaco in vivo a través de un procedimiento químico o fisiológico (por ejemplo, un profármaco que se lleva al pH fisiológico o por medio de la acción de una enzima se convierte en la forma farmacológica deseada). Los profármacos ejemplo liberan tras el corte el compuesto farmacológico activo correspondiente. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales aniónicas no tóxicas que contienen aniones tales como (pero no limitados a ello) cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bisulfato, fosfato, acetato, maleato, fumarato, oxalato, lactato, tartrato, citrato, gluconato, metanosulfonato y 4-toluenosulfonato. La expresión se refiere también a sales catiónicas no tóxicas tales como (pero no limitadas a ellas) sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio o benzatina protonada (?,?'-dibenciletilendiamina, colina, etanolamina, dietanolamina, etilendiamina, meglamina (N-metil-glucamina), benetamina (N-becilfenetilamina), piperazina o trometanina (2-amino-2-hidroximetil-1 ,3-propanodiol). Los procedimientos de la presente invención dan lugar a la formación de huesos, dando lugar a una disminución del número de fracturas.
Esta invención aporta una contribución significativa a la técnica proporcionando procedimientos que aumentan la formación de hueso, dando como resultado a la prevención, retraso y/o inversión de la osteoporosis y de los trastornos óseos relacionados. Esta invención se refiere también a compuestos seleccionados de ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico; 5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hex¡l)-pirrolidin-2-ona; ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1 -il)-heptanoico; ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico; y 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidiñ-2-ona. Esta invención se refiere también particularmente al ácido 7-{2S-[3R-hldroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico. Esta invención se refiere también particularmente a 5S(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2^ Esta invención se refiere también particularmente al ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1 -il)-heptanoico. Esta invención se refiere también particularmente al ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico. Esta invención se refiere también particularmente ea 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidm ona.
A partir de la memoria descriptiva y las reivindicaciones que describen la invención serán evidentes otras características y ventajas.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Como agonista selectivo del receptor EP4 de esta invención se puede usar cualquier agonista selectivo del receptor EP4. Los agonistas selectivos de EP4 son compuestos que tienen una IC50 en el receptor EP1 , EP2 y EP3 que es al menos 10 veces mayor que la IC50 en el subtipo de receptor EP4. Por ejemplo, el ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico es un agonista de PGE2 selectivo para el receptor EP4 con una IC50 de unión al receptor EP4 de 16 nM. En todos los demás subtipos de receptor EP, incluyendo los subtipos de receptor EP1 , EP2 y EP3, la IC50 para el ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico es mayor de 3200 nM. Los compuestos de Fórmula I se pueden preparar como se describe en el documento de los Estados Unidos 4.177.346, de cesión común y que se incorpora en la presente como referencia. Todos los agonistas selectivos del receptor EP4 usados en los procedimientos de esta invención están adaptados al uso terapéutico como agentes que estimulan la formación ósea y aumentan la masa ósea en vertebrados, por ejemplo mamíferos y en particular en seres humanos. Puesto que la formación ósea está muy relacionada con el desarrollo de osteoporosis y trastornos relacionados con los huesos, los agonistas usados en los procedimientos de esta invención, en virtud de su acción ósea, previenen, detienen y/o invierten la osteoporosis. La utilidad de los agonistas selectivos de EP4 usados en los procedimientos de la presente invención como agentes medicinales en el tratamiento de trastornos que presentan una masa ósea reducida (por ejemplo, osteoporosis) en vertebrados, por ejemplo mamíferos (por ejemplo, seres humanos, particularmente en la mujer) se demuestra por la actividad de estos agonistas en ensayos convencionales, incluyendo un ensayo de unión al receptor, un ensayo de AMP cíclico, un ensayo in vivo y el ensayo de curación de la fractura, todos los cualés se describen más adelante. Tales ensayos proporcionan también un medio mediante el cual comparar las actividades de los agonistas selectivos de EP4 entre sí y con las actividades de otros compuestos y composiciones conocidos. Los resultados de estas comparaciones son útiles para determinar los niveles de dosificación en vertebrados, por ejemplo mamíferos, incluyendo seres humanos, para el tratamiento de tales enfermedades.
ENSAYO IN VIVO La actividad de los agentes anabólicos óseos en la estimulación de la formación ósea y el aumento de la masa ósea se puede comprobar en ratas intactas macho o hembra, o ratas macho (orquidectomizadas) o hembra (ovariectomizadas) deficientes en hormonas sexuales. Se pueden utilizar en el estudio ratas macho o hembra de diferentes edades (tal como de tres meses de edad). Las ratas pueden estar intactas o bien castradas (ovariectomizadas u orquidectomizadas), y se inyectan subcutáneamente o se dosifican por sonda nasogástrica con agonistas de prostaglandina en diferentes dosis (tal como 1 , 3 ó 10 mg/kg/día) durante 30 días. En las ratas castradas, el tratamiento se comienza en el día posterior a la cirugía (con el propósito de prevenir la pérdida ósea) o en el momento en el que ya ser ha producido la pérdida ósea (con el propósito de recuperar la masa ósea). Durante el estudio, se permite el libre acceso de todas las ratas a agua y una dieta comercial en gránulos (Tekiad Rodent Diet N° 8064, Harían Tekiad, Madison, Wl) que contiene 1.46% de calcio, 0.99% de fósforo y 4.96 Ul/g de Vitamina D3. Todas las ratas reciben inyecciones subcutáneas de 10 mg/kg de calceína en los días 12 y 2 antes del sacrificio. Se sacrifican las ratas. Se determinan los siguientes parámetros: Medidas minerales en el hueso femoral: Se extirpa el fémur derecho de cada rata en autopsia y se explora utilizando absorciometría de rayos X de doble haz (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) equipado con el programa informático "Regional High Resolution Sean" (Hologic Inc., Waltham, MA). El tamaño del campo de exploración es de 5.08 x 1.902 cm, la resolución es de 0.0254 x 0.0127 cm y la velocidad de exploración es de 7.25 mm/seg. Se analizan las imágenes de la exploración femoral y se determina el área ósea, contenido mineral óseo (MBC) y densidad mineral ósea (BMD) del fémur completo (WF), metáfisis femoral distal (DFM), diáfisis femoral (FS) y fémur proximal (PF).
Análisis histomorfométrico del hueso tibial: Se extirpa la tibia derecha en la autopsia, se disecciona todo el músculo y se corta en tres partes. Se fijan la tibia proximal y la diáfisis tibial en etanol al 70%, se deshidrata en concentraciones graduadas de etanol, se desengrasa en acetona y después se introduce en metacrilato de metilo (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY). Se cortan las secciones frontales de la metáfisis tibial proximal con un espesor de 4 y 10 µp?, utilizando un microtomo Reichert-Jung Polycut S. Las secciones de 4 µ?t? se tiñen con tinte modificador Trichrome de Masson, mientras que las secciones de 10 µ?t? permanecen sin teñir. Se utilizan " una sección de 4 µ?? y una de 10 µ?t? de cada rata para histomorfometría de hueso canceloso. Se cortan las secciones transversales de la diáfisis tibial de 10 µ?? de espesor utilizando un microtomo Reichert-Jung Polycut S. Estas secciones se utilizan para análisis histomorfométrico del hueso cortical.
Histomorfometría de hueso canceloso: Se utiliza un sistema de histomorfometría Bioquant OS/2 (R& Biometrics, Inc., Nashville, TN) para las medidas histomorfométricas estáticas y dinámicas de la parte esponjosa secundaria de la metáfisis tibial proximal entre 1.2 y 3.6 mm dista a la unión de crecimiento placa-epifiseal. Los primeros 1.2 mm de la región metafiseal tibial necesitan ser omitidos para limitar las medidas a la parte esponjosa secundaria. Se utilizan las secciones de 4 µ?t? para determinar los índices relacionados con el volumen óseo, estructura ósea y resorción ósea, mientras que las secciones de 10 mm se utilizan para determinar los índices relacionados con la formación y regeneración del hueso.
I) Medidas y cálculos relacionados con el volumen y estructura óseo trabecular: (1 ) Area total metafiseal (TV, mm2): Area metafiseal entre 1.2 y 3.6 mm distal a la unión placa-epifiseal de crecimiento. (2) Area ósea trabecular (VB, mm2): Area total de trabécula en TV. (3) Perímetro óseo trabecular (BS, mm): La longitud del perímetro total de la trabécula. (4) Volumen óseo trabecular (BV/TV, %): BV/TV x 100. (5) Número óseo trabecular (TBN, N mm): 1.199/2 x BS TV. (6) Espesor óseo trabecular (TBT, µ??): (2.000/1.199) x (BV/BS). (7) Separación ósea trabecular (TBS, µG??): (2.000 x 1.199) x (TV-BV).
H) Medidas y cálculos relacionados con la resorción ósea: (1) Número de osteoclastos (OCN, N°): N° total de osteoclastos en el área metafiseal total. (2) Perímetro de osteolasto (OCP mm): longitud del perímetro trabecular cubierto por osteoclastos. (3) N mm de osteoclastos (OCN/mm, N mm): OCN/BS. (4) Perímetro porcentual cubierto por osteoclastos (%OCP, %): OCP/BS X 100.
III) Medidas y cálculos relacionados con la regeneración y formación ósea: (1) Perímetro con una marca de calceína (SLS, mm): longitud total del perímetro trabecular con una marca de calceína. (2) Perímetro con dos marcas de calceína (DLS, mm): Longitud total del perímetro trabecular con dos marcas de calceína. (3) Anchura entre marcas (ILW, µ??): Distancia promedio entre dos marcas de calceína. (4) Perímetro porcentual de mineralización (PMS, %): (SLS/2 + DLS) /BS% x 100. (5) Velocidad de depósito mineral (MAR, µ?t?/día): ILW/intervalo entre marcas. (6) Velocidad de formación de hueso/superficie de ref. (BFR/BS, µ?t?2?^/µ?t?): (SLS/2 + DLS) x MAR /BS. (7) Velocidad de regeneración ósea (BTR, %/y): (SLS/2 + DLS) x MAR /BV x 100.
Histomorfometría cortical ósea: Se utiliza un sistema histomorfométrico Bioquant OS/2 (R&M Biometrics, Inc., Nashville, TN) para las medidas histomorfométricas estáticas y dinámicas de la diáfisis tibial en las medidas del hueso cortical en la diáfisis tibial. Se mide el área tisular total, área de la cavidad de la médula, perímetro periosteal, perímetro endocortical, perímetro con una marca, perímetro con dos marcas y anchura entre marcas en ambas superficies periosteales y endocorticales, y se calculan el área ósea cortical (área tisular total - área de cavidad de la médula), área porcentual cortical ósea (área cortical/área del tejido total x 100), área porcentual de médula (área de cavidad de la médula/área del tejido total x 100), perímetro porcentual periosteal y endocortical marcado[(perímetro con una marca/2 + perímetro con 2 marcas)/perímetro total x 100] velocidad de depósito mineral (anchura entre marcas/intervalos) y velocidad de formación de hueso velocidad de depósito mineral x [(perímetro con una marca/2 + perímetro con dos marcas)/perímetro total].
Estadísticas Se pueden calcular los datos estadísticos utilizando paquetes Stat View 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Se utiliza la prueba de análisis de varianza (ANOVA) seguida de PLSD de Fisher (Stat View, Abacus Concepts Inc., 1918 Bonita Ave, Berkeley, CA 94704-1014) para comparar las diferencias entre grupos.
Determinación de la elevación del cAMP en líneas de células 293-S que sobreexoresan de forma estable los receptores humanos recombinantes EP4 Los cDNA, que representan los marcos de lectura abierta completa de los receptores humanos EP4, se generan por reacción en cadena con polimerasa de la transcriptasa inversa utilizando cebadores oligonucleótidos basado en secuencias publicadas (1) y RNA de células de pulmón humano primarias (EP4) como moldes. El cDNA se clona en el sitio de clonación múltiple de pcDNA3 (Invitrogen Corporation, 3985B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA 92121) y se usa para transfectar células de riñon de embrión humano 293-S por la vía de coprecipitación con fosfato de calcio. Las colonias resistentes a G418 se expanden y se analizan las uniones específicas [3H]PGE2. Las células transfectadas que muestran niveles altos de uniones específicas a [3H]PGE2 se caracterizan adicionalmente mediante análisis de Scatchard para determinar Bmax y Dks para PGE2. Las líneas seleccionadas para el rastreo de compuestos tienen aproximadamente 256.400 receptores por célula y un Kd = 2.9 nM para PGE2 (EP4). La expresión constitutiva del receptor en las células madre 293-S es insignificante. Las células se mantienen en RPMI suplementado con suero bovino fetal (10% final) y G418 (700 ug/ml final). Las respuestas de cAMP en las líneas 293-S/EP4 se determinan por separación de células de los matraces de cultivo en 1 mi de PBS deficiente en Ca++ y Mg++ por agitación vigorosa, añadiendo RPMI exento de suero hasta una concentración final de 1 x 106 células/ml y añadiendo 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) hasta una concentración final de 1 mM. Se toman inmediatamente alícuotas de 1 mi de la suspensión de células en tubos de microcentríguga con tapón de rosca de 2 mi y se incuban durante 10 minutos, destapados, a 37°C, con una humedad relativa del 95% y 5% de C02. El compuesto a analizar se añade a las células en diluciones 1 :100 de forma que las concentraciones finales de DMSO o etanol sean del 1%. Inmediatamente después de añadir el compuesto, se tapan los tubos, se mezclan invirtiéndolos 2 veces y se incuban a 37° durante 12 minutos. Las muestras son entonces lisadas por incubación a 100°C durante 10 minutos e inmediatamente enfriadas sobre hielo durante 5 minutos. Los restos celulares se sedimentan por centrifugación a 1.000 g durante 5 minutos, y los lisados aclarados se transfieren a tubos limpios. Las concentraciones de cAMP se determinan utilizando un estuche de radioinmunoensayo de cAMP disponible comercialmente (NEK-033, DuPont/NEN Research Products, 549 Albany St., Boston, MA 02118) después de diluir los lisados aclarados 1 :10 en solución tampón de análisis cAMP RIA (incluida en el estuche). Normalmente, se tratan las células con 6 a 8 concentraciones del compuesto a analizar en incrementos logarítmicos. Los cálculos de EC50 se realizan mediante una calculadora utilizando análisis de regresión lineal en la porción lineal de las curvas de respuesta a la dosis.
Referencias 1. Regan, J.W. Bailey, TJ. Pepperl, D.J. Pierce, K.L. Bogardus, A.M. Donello, J.E. Fairbairn, CE. Kedzie, K.M. Woodward, D.F. y Gil, D.W. 1994 Cloning of a Novel Human Prostaglandin Receptor with Characteristics of the Pharmacogically Defined EP2 Subtype. Mol. Pharmacology 46:213-220.
ENSAYO DE LA UNION A LOS RECEPTORES E2 DE LAS PROSTAGLANDINAS Preparación de la membrana: Todas las preparaciones se realizan a 4°C. Las células transfectadas que expresan receptores tipo 1 de prostaglandina E2 (EP-i), tipo 2 (EP2), tipo 3 (EP3) o tipo 4 (EP4) se recogen y suspenden hasta 2 millones de células por mi en solución tampón A (Tris-HCI 50 mM (pH 7.4), MgCI2 10 mM, EDTA 1 mM, péptido Pefabloc 1 MM, (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN), péptido Phosporamidon 10 uM (Sigma, St. Luis, MO), péptido Pepstatina A 1 uM (Sigma, St. Luis, MO), péptido Elastatinal 10 uM (Sigma, St. Luis, MO), péptido Antipaína 100 uM (Sigma St. Luis, MO]. Las células se lisan por sonicación con un sonicador Branson (modelo N° 250, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) en dos impactos de 15 segundos. Se eliminan las células no lisadas y los restos por centrifugación a 100 g durante 10 minutos. Las membranas se recogen entonces por centrifugación a 45.000 g durante 30 minutos. Las membranas sedimentadas se resuspenden hasta una concentración de 3 a 10 mg de proteína por mi, determinándose la concentración de proteína por el procedimiento de Bradford [Bradford, M., anal. Biochem., 72, 248 (1976)]. Las membranas resuspendidas se conservan congeladas a -80°C hasta su uso.
Ensayo de unión: Las membranas congeladas preparadas de la forma descrita anteriormente son descongeladas y diluidas hasta 0.5 mg/ml (para EP2 de rata) o 0.3 mg/ml (para EP4 de rata) en solución tampón A. Se combina un volumen de preparación de membrana con 0.05 volúmenes del compuesto de prueba o solución tampón y un volumen de 3H-prostaglandina E2 3 nM (N° TRK 431 , Amersham, Arlington Heights, IL) en solución tampón A. La mezcla (volumen total 205 µ?) se incuba durante una hora a 25°C. Las membranas se recuperan entonces por filtración en filtros de fibra de vidrio del tipo GF/C (n8 1205-401 , Wallac, Gaithersburg, MD) utilizando un recolector Tomtec (modelo Mach lt/96, Tomtec, Orange, CT). Las membranas con unión 3H-prostaglandina E2 quedan retenidas en el filtro, mientras que la solución tampón y la 3H-prostaglandina E2 no unida pasa por el filtro y se desecha. Cada una de las muestras se lava entonces tres veces con 3 mi de [Tris-HCI 50 mM (pH 7.4), MgCI2 10 mM, EDTA 1 mM]. Los filtros se secan entonces mediante calentamiento en un horno de microondas. Para determinar la cantidad de 3H-prostaglandina unida a las membranas, se colocan los filtros secos en bolsas de plástico con líquido de centelleo y se hace el recuento en un lector LKB 1205 Betapalte (Wallac, Gaithersburg, MD). Las IC50 se determinan a partir de la concentración del compuesto de ensayo necesaria para desplazar el 50% del enlace específico 3H-prostaglandina E2. Las células 293S que expresan los receptores E2 de las prostaglandinas EP2 o EP4 se generan conforme a procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. De forma típica, se preparan cebadores PCR (reacción en cadena con polimerasa), que corresponden a los extremos terminales 5' y 3' del receptor de longitud total publicado, conforme a procedimientos bien conocidos descritos anteriormente y se usan en una reacción RT-PCR usando el RNA total de riñón de rata para los receptores EP2 y EP4. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP2 de rata se prepara como se describe en Nemoto et al., Prostaglandins, 1997, 54, 713-725. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP4 de rata se prepara como se describe en Sando et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, 200, 1329-1333. Estos receptores de longitud completa se usan para preparar las células 293S que expresan los receptores EP2 y EP4. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP1 se prepara como se describe en Funk et al., Journal of Biological Chemistry, 1993, 268, 26767-26772. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP2 se prepara como se describe en Regan et al., Molecular Pharmacology, 1994, 46, 213-220. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP3 se prepara como se describe en Regan et al., British Journal of pharmacology, 1994, 112, 377-385. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP4 se prepara como se describe en Bastien, Journal of Biological Chemistry, 1994, 269, 11873-1 877. Estos receptores de longitud completa se usan para preparar las células 293S que expresan los receptores EP-i, EP2, EP3 y EP4. Las células 293S que expresan cualquiera de los receptores E2 de prostaglandina EPi, EP2, EP3 y EP4 humanos se generan conforme a procedimientos conocidos por los expertos en la materia. De forma típica, se preparan los cebadores por PCR (reacción en cadena con polimerasa), que corresponden a los extremos 5' y 3' del receptor de longitud completa publicados, conforme a procedimientos bien conocidos descritos antes y se usan en una reacción en cadena con polimerasa y transcriptasa inversa (RT-PCR) usando un RNA total de riñon humano (para EPi), de pulmón humano (para EP2), de pulmón humano (para EP3) o de linfocitos humanos (para EP4) como fuente. Los productos de PCR se clonan por el procedimiento TA con un saliente en pCR2.1 (Invitrogen, Carisbad, CA) y se confirma la identidad del receptor clonado por secuenciación de DNA. Las células 293S (Mayo, Dept. of Biochemistry, Northwestern Univ.) se transfectan con el receptor clonado en pcDNA3 por electroporación. Se establecen líneas de células estables que expresan el receptor después de seleccionar las células transfectadas con G418.
Las líneas de células clonadas que expresan el número máximo de receptores se eligen después de un ensayo de unión a 3H-PGE2 de células completas usando PGE2 no marcada como competidor.
ENSAYOS DE CURACION DE FRACTURAS ENSAYO DE LOS EFECTOS SOBRE LA CURACION DE FRACTURAS DESPUES DE LA ADMINISTRACION SISTEMICA Técnica de fractura: Se anestesian ratas Sprague-Dawley de 3 meses de edad con Ketamina. Se hace una incisión de 1 cm en la cara anteromedia de la parte proximal de la tibia o fémur derechos. A continuación se describe la técnica quirúrgica tibial. La incisión se realiza hasta alcanzar el hueso, y se perfora un orificio de 1 mm, 4 mm proximal a la cara distal de la tuberosidad tibial, 2 mm medial ai surco anterior. Se introducen agujas intramedulares mediante un tubo de acero inoxidable de 0.8 mm (carga máxima 36.3 N, rigidez máxima 6 .8 N/mm, comprobado bajo las mismas condiciones que los huesos). No se ensancha el canal medular. Se produce una fractura normalizada cerrada 2 mm por encima de la unión tibiofibular mediante curvatura en tres puntos utilizando fórceps ajustable, especialmente diseñado con mordazas romas. Para minimizar el daño al tejido blando, se debe tener precaución para no desplazar la fractura. La piel se cierra con suturas monofilamento de nylon. La operación se realiza bajo condiciones estériles. Se toman radiografías de todas las fracturas inmediatamente después de la inserción de las agujas, y las ratas con fracturas fuera del área diafiseal especificada o con agujas desplazadas, se excluyen. El resto de los animales se dividen aleatoriamente en los siguientes grupos con 10 a 12 animales por subgrupo para comprobar la curación de las fracturas. El primer grupo recibe administraciones por sonda nasogástrica diarias de vehículo (agua: 100% Etanol = 95:5) en un 1 ml/rata, mientras que los otros reciben administración diaria por sonda nasogástrica de 0.01 a 100 mg/kg/día del compuesto a analizar (1 ml/rata) durante 10, 20, 40 y 80 días. En los días 10, 20, 40 y 80, se anestesiaron 10 a 12 ratas de cada grupo con Ketamina y se sacrificaron por extracción sanguínea. Se extirpan ambos huesos tibiofibulares por disección y se elimina todo el tejido blando. Se conservaron los huesos de 5 a 6 ratas de cada grupo en etanol al 70% para análisis histológicos y los huesos de otras 5 a 6 ratas de cada grupo se conservaron en solución Ringer tamponada (+4°C, pH 7.4) para las radiografías y pruebas biomecánicas que se realizaron.
Análisis histológico: Los procedimientos para análisis histológico del hueso fracturado se han publicado previamente por Mosekilde y Bak (The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A histological Description. Bone, 14:19-27, 1993). Explicado brevemente, el lugar de la fractura se aserra 8 mm a cada lado de la línea de la fractura, se introduce descalcificado en metacrilato de metilo, y se cortan las secciones frontales con un microtomo Reichert-Jung Polycur con un espesor de 8 µ?t?. Las secciones medianas frontales teñidas con Masson-Trichrome (incluyendo ambas tibias y fíbulas) se utilizan para la visualización de la respuesta celular y tisular a la curación de la fractura con y sin tratamiento. Las secciones teñidas de rojo Sirius se utilizan para demostrar las características de la estructura callosa y para diferenciar entre el hueso entrelazado y el lamelar en el lugar de la fractura. Se realizan las siguientes medidas: (1) espacio de fractura - medido como la distancia más corta entre los extremos corticales del hueso en la fractura, (2) longitud y diámetro del callo, (3) área del volumen total óseo del callo, (4) tejido de hueso por área de tejido dentro del área callosa, (5) tejido fibrosos en el callo, (6) área de cartílago en el callo.
Análisis biomecánico: Los procedimientos de análisis biomecánico se han publicado previamént epor Bak y Andreassen (The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int 45:292-97, 1989). Explicado en forma resumida, se toman radiografías de todas las fracturas antes del ensayo biomecánico. Se analizan las propiedades mecánicas de las fracturas soldadas mediante un procedimiento destructivo de curvatura en tres o cuatro puntos. Se determina la carga máxima, rigidez, energía en carga máxima, desviación en la carga máxima y la tensión máxima.
ENSAYO DE LOS EFECTOS SOBRE LA CURACION DE FRACTURAS DESPUES DE ADMINISTRACION LOCAL Técnica de fractura: Se utilizan en este estudio perros Beagle macho o hembra de aproximadamente 2 años de edad bajo anestesia. Se producen fracturas radiales transversales por carga lenta continua doblándolo en tres puntos, tal como describen Lenhan et al (Lenehan, T.M.; Balligand, M.; Nunamaker, D.M.; Wood, F.E.: Effects of EHDP on Fracture Healing in Dogs. J. Orthop Res 3:499-507; 1985). Se arrastra el hilo a través del lugar de la fractura para asegurar la interrupción anatómica completa del hueso. Después, se consigue la liberación local de agonistas de prostaglandina en el lugar de la fractura mediante liberación lenta del compuesto suministrado por gránulos de liberación lenta o por la administración de los compuestos en una formulación adecuada como una solución o suspensión de gel en pasta durante 10, 15 o 20 semanas.
Análisis histológico: Los procedimientos de análisis histológico de huesos fracturados se han publicado anteriormente por Peter et al (Peter, CP.; Cook, W.O.; Nunamaker, D.M.; Provost, M.T.; Seedor, J.G.; Rodan, G.A. Effects of alendronate on fracture healing and bone remodeling in dogs. J. Orthop. Res. 14:74-70, 1996) y Mosekilde y Bak (The Effects of Growth Hormone on Fractue Healing in Rats: A Histological Description. Bone, 14:19-27, 1993). Explicado brevemente, después del sacrificio, se aserra el lugar de la fractura 3 cm a cada lado de la línea de la fractura, se introduce una vez descalcificado en metacrilato de metilo y se corta con un microtomo Reichert-Jung Polycut en secciones frontales de 8 µ?? de espesor. Se utilizan las secciones teñidas con Masson-Trichrome de la parte media frontal (incluyendo la tibia y la fíbula) para la visualización de la respuesta celular y tisular a la curación de la fractura con y sin tratamiento. Se utilizan las secciones teñidas con rojo Sirius para demostrar las características de la estructura del callo y para diferenciar entre el hueso entrelazado y el lamelar en el lugar de la fractura. Se realizan las siguientes medidas: (1) espacio de fractura - medido como la distancia más corta entre los extremos corticales del hueso en la fractura, (2) longitud y diámetro del callo, (3) área del volumen de hueso total del callo, (4) tejido de hueso por área de tejido dentro del área del callo, (5) tejido fibrosos en el callo, (6) área de cartílago en el callo.
Análisis biomecánico: Los procedimientos de análisis biomecánico se han publicado previamente por Bak y Andreassen (The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int 45:292-297, 1989) y Peter et al. (Peter, CP.; Cook, W.O.; Nunamaker, D.M.; Provost, M.T.; Seedor, J.G.; Rodan, G.A. Effects of Alendronate On Fracture Healing And Bone Remodeling In Dogs. J. Orthop. Res. 14:74-70, 1996). Explicado brevemente, se toman radiografías de todas las fracturas antes de los ensayos biomecánicos. Se analizan las propiedades mecánicas de las fracturas en curación por un procedimiento destructivo de curvatura en tres o cuatro puntos. Se determina la carga total, rigidez, energía en carga máxima, desviación en carga máxima y tensión máxima. La administración de agonistas selectivos del receptor EP4 conforme a los procedimientos de esta invención se puede realizar por cualquier modo que libere el agonista selectivo del receptor EP4 por vía sistémica y/o local (por ejemplo, en el lugar de la fractura ósea, osteotomía o cirugía ortopédica). Estos procedimientos incluyen las vías oral, parenteral, intraduodenal y similares. Por lo general, los compuestos de esta invención se administran oralmente, pero se puede utilizar la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, transdérmica subcutánea, rectal o intramedular), por ejemplo, cuando la administración oral sea inadecuada para el objeto deseado o cuando el paciente sea incapaz de ingerir el fármaco. Los procedimientos de esta invención se utilizan para el tratamiento y promoción de la curación de las fracturas óseas y osteotomías por aplicación local (por ejemplo, en los lugares de fracturas óseas u osteotomías) de los agonistas selectivos del receptor EP4. Los agonistas selectivos del receptor EP4 de esta invención se aplican a los lugares de fractura ósea u osteotomía, por ejemplo, por inyección del compuesto en un disolvente adecuado (por ejemplo, un disolvente oleoso tal como aceite de cacahuete) en la placa de crecimiento del cartílago o, en casos de cirugía abierta, por aplicación local de tales compuestos en un vehículo, portador o diluyente adecuado tal como cera para hueso, polvo de hueso desmlneralizado, cementos óseos poliméricos, selladores de hueso, etc. Como alternativa, se puede conseguir la aplicación local aplicando una solución o dispersión del compuesto en un portador o diluyente adecuado sobre su superficie, o incorporándolo en un implante sólido o semisólido usando convencionalmente en cirugía ortopédica, tal como malla de dacron, espumas de gel y hueso Kiel o prótesis. En cualquier caso, la cantidad y frecuencia de los compuestos administrados dependerá, por supuesto, del sujeto que se está tratando, de la gravedad de la enfermedad, de la forma de administración y del juicio del médico prescriptor. Así, debido a la variabilidad entre pacientes, las dosificaciones proporcionadas en la presente son una guía y el médico puede valorar la dosis del fármaco para conseguir el tratamiento (por ejemplo, aumento de la masa ósea) que el médico considere adecuada para el paciente. Al considerar el grado de tratamiento deseado, el médico debe valorar varios factores, tales como el nivel inicial de masa ósea, la edad del paciente, la presencia de enfermedad preexistente, así como la presencia de otras enfermedades (por ejemplo, enfermedad cardiovascular). En general, se usa una cantidad de agonista selectivo del receptor EP4 de esta invención que es suficiente para aumentar la masa ósea hasta un nivel superior al umbral de fractura ósea (tal como se detalla en el World Health organization Study citado anteriormente en la presente memoria).
Los agonistas selectivos del receptor EP4 usados en los procedimientos de la presente invención se administran generalmente en forma de una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de esta invención junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Así, el agonista selectivo del receptor EP4 de esta invención se puede administrar individualmente de forma local o sistémica en cualquier forma de dosificación convencional oral, intranasal, parenteral, rectal o transdérmica. Para administración oral la composición farmacéutica puede tomar la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos y similares. Los comprimidos que contienen diferentes excipientes, tales como citrato de sodio, carbonato de calcio y fosfato de calcio, se emplean junto con diferentes disgregantes, tales como almidón y preferiblemente almidón de patata o tapioca y ciertos silicatos complejos, junto con agentes ligantes tales como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y goma arábiga. Adicionalmente, los agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco son con frecuencia muy útiles para la elaboración de comprimidos. También se emplean composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina dura y blanda rellenas; los materiales preferidos para este fin incluyen también lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones y/o elixires acuosos para administración oral, los compuestos de esta invención se pueden combinar con diferentes agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes, agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión, así como diluyentes como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y diferentes combinaciones similares. Para administración parenteral, se pueden emplear soluciones en aceite de sésamo y de cacahuete o en propilenglicol acuoso, así como soluciones acuosas estériles de las correspondientes sales solubles en agua. tales soluciones acuosas pueden estar adecuadamente tamponadas, si es necesario, y el líquido diluyente se puede hacer primero isotónico con solución salina o glucosa suficiente. Estas soluciones acuosas son especialmente adecuadas para inyecciones intravenosas, intramusculares, subcutáneas e intraperitoneales. En relación a lo anterior, todos los medios acuosos estériles empleados son fácilmente obtenidos por técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la materia. Para administración transdérmica (por ejemplo, tópica) se preparan soluciones acuosas estériles diluidas o soluciones parcialmente acuosas (habitualmente en concentración aproximada de 0.1% a 5%), similares a las soluciones parenterales anteriores. Los procedimientos para preparar las diferentes composiciones farmacéuticas, con una cierta cantidad de ingrediente activo son conocidos, o serán evidentes a la luz de esta descripción, para los expertos en la materia.
Para ejemplos de procedimientos de preparación de composiciones farmacéuticas véase Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 19th Edición (1995).
PROTOCOLO DE ESTUDIO El objeto de este estudio es determinar si un agonista selectivo del receptor EP4 y, en especial, el ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico, puede restaurar la masa ósea en un modelo de rata OVX. Se ovariectomizaron (OVX) ratas Sprague-Dawley a los 3.5 meses de edad. Diez meses después de la OVX, las ratas se trataron por inyección subcutánea con vehículo o con ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico a 30 mg/kg/día durante 28 días. Las ratas se sometieron a autopsia. El fémur derecho se extirpa a cada rata en la autopsia y se explora usando absorciometría de rayos X de doble haz (DEXA, QDR 1000 W, Hologic, Inc., Waltham, MA) equipada con un programa informático "Regional High Resolution Sean" (Hologic, Inc., Waltham, MA). El tamaño de campo de exploración es de 5 x 1.902 cm, la resolución es de 0.0254 x 0.0127 cm, y la velocidad de exploración es de 7.25 mm/seg. Se analizan las imágenes exploradas femorales. Se determina el contenido mineral óseo (BMC) y se calcula la densidad mineral ósea (MBD) del fémur completo (WF), la metáfisis femoral distal (DFM) y la diáfisis femoral (FS) según el procedimiento descrito en H. Z. Et al., Droloxifene, a New Estrogen Antagonist/Agonist, Prevenís Bone Loss in Ovariectomized Rats. ENDOCRINOLOGY 136; 2435-2441 , 1995.
RESULTADOS DEL ESTUDIO Y DISCUSION Al comparar con las ratas OVX tratadas con vehículo, las ratas OVX tratadas con ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico mostraron un MBC femoral total un 17% mayor, una BMD femoral total un 13% mayor, un BMC femoral distal un 8% mayor, una BMD femoral distai un 13% mayor, un BMC de la diáfisis femoral un 20% mayor y una BMD de la diáfisis femoral un 18% mayor. No se apreciaron efectos secundarios similares a PGE2 en ratas tratadas con ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1 -il)-heptanoico. Estos datos muestran que el ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico, un agonista de PGE2 selectivo para ei receptor EP4, estimula la formación ósea y restaura el hueso en ratas OVX ya osteopénicas.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES GENERALES Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Varían Unity 400 (Varían Co., Palo alto, California) a aproximadamente 23°C a 400 MHz para la RMN de protón. Los desplazamientos químicos se expresan en partes por millón. La forma de los picos se denomina como sigue: s, singlete; d, doblete; t, triplete; q, cuatriplete; m, multiplete; bs=singlete ancho. Se obtuvo el espectro de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI) en un espectrofotómetro Fisons Platform II. Cuando se describe la intensidad de iones que contienen cloro o bromo, se observó la radiación de intensidad esperada (aproximadamente 3:1 para iones que contienen 35CI/37CI y 1 :1 para iones que contienen 79Br/8 Br) y se proporciona únicamente la intensidad del ion de masa inferior. La cromatografía de media presión se realizó usando un sistema de purificación Biotage, (Biotage, Dyax Corporation, Charlottesville, Virginia) en atmósfera de nitrógeno. La cromatografía ultrarrápida se realizó con gel de sílice Baker (40 µ??) (J.T. Baker, Phillilpsburg, N.J.) o gel de sílice 60 (EM Sciences, Gibbstown, N.J.) en columnas de vidrio a presión de nitrógeno reducida. Se realizó la cromatografía radial utilizando un Chromatotron® (modelo 7924T, Harrison Research). La cromatografía preparativa se realizó usando Gel de Sílice GF de Anaitech Uniplates (20 x 20 cm) (Analtech, Inc., Newark, DE). Los disolventes dimetilformamida (DMF), tetrahidrofurano (THF) y diclorometano (CH2CI2) usados como disolventes de la reacción eran de grado anhidro suministrados por Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin). El término "concentrado" se refiere a la eliminación del disolvente a presión de succión de agua en un evaporador rotatorio. La abreviatura "h" significa horas. El término "TBAF" se refiere a fluoruro de tetrabutilamonio. El término "DMAP" se refiere a dimetilaminopiridina. Los términos "diclorometano" y "cloruro de metileno" son sinónimos y se usan de forma indistinta en toda esta memoria descriptiva y en los Ejemplos y Preparaciones.
EJEMPLO 1 Acido 7-^2S-r4-f3-cloro-fenin-3R-hidroxi-butin-5-oxo-PirroHdm-1-il}- heptanoico Etapa A: Ester etílico del ácido 7-(2R-í4-83 :loro-feniO-3-oxo-but-1 -enil1-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico. Se añadió en varias porciones NaH (60% en peso en aceite, 426 mg, 10.7 mmol) en THF (35 mi) a una solución de éster dimetílico del ácido [3-(3-cloro-fenil)-2-oxo-propil]-fosfónico (2.66 g, 9.63 mmol) en THF (35 mi) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0°C y se añadió una solución de éster etílico del ácido 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico (se suponen 10.6 mmol, preparado conforme al procedimiento descrito en la Preparación 7, pero usando diferentes cantidades de reactivos) en THF y la reacción se agitó durante 18 horas. Se añadió AcOH y la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc. La solución orgánica se lavó de forma sucesiva con solución saturada de NaHC03 (2 veces), agua (1 vez) y salmuera (1 vez). La solución orgánica se secó (MgS04), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de media presión eluyendo con acetona al 15% en tolueno, proporcionando el éster etílico del ácido 7-{2R-[4-(3-c!oro-fenii)-3-oxo- but-1-en¡l]-5-oxo-pirrol¡din-1-¡l}-heptanoico (2.26 g). RMN de 1H (CDCI3) d 7.27-7.15 (m, 3H), 7.08 (m, 1 H), 6.66 (dd, 1 H), 6.20 (d, 1 H), 4.17 (m, 1 H), 4.11 (q, 2H), 3.82 (s, 2H), 3.55 (m, 1 H), 2.72 (m, 1 H), 2.46-2.23 (m, 5H), 1.79 (m, 1 H), 1.58 (m, 2H), 1.47-1.20 (m, 9H); EM 420.2 (M+1), 418.2 (M-1 ).
Etapa B: Ester etílico del ácido 7-(2R-r4-(3-cioro-fenilV3S-hidroxi-but-1 -enil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico. Se añadió (R)-2-metil-CBS-oxazaborol¡dina (1 M en tolueno, 5 mi, 5 mmol) a una solución del éster etílico del ácido 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (2.1 g, 5.0 mmol) en CH2CI2 anhidro (200 mi) y la solución se enfrió hasta -45°C. La mezcla de reacción se agitó durante 20 minutos y se añadió catecolborano (1 M en THF, 15 mi, 15 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 18 horas a -45°C. Se añadió HCI acuosos (1 N, 100 mi) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La capa acuosa ácida se separó y al solución orgánica se lavó con NaOH 1 N enfriada en hielo (2 veces), seguido por salmuera (1 vez). La solución orgánica se secó (MgSO- , se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión(EtOAc:hexanos 1 :1 hasta EtOAc al 80% en hexanos) proporcionó el éster etílico del ácido 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3S-hidroxi-but-1 -enil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico (800 mg) como una mezcla aproximadamente 6:1 de los diastereoisómeros alcohol 3S:3R por RMN de H RMN de 1H (CDCI3) d 7.23-7.17 (m, 3H), 7.06 (m, 1 H), 5.67 (dd, 1 H), 5.46 (dd, 1 H), 4.37 (m, 1 H), 4.08 (q, 2H), 4.00 (m, 1 H), 3.44 (m, 1 H), 2.80 (m, 2H), 2.67 (m, 1 H), 2.41-2.12 (m, 5H), 1.70-1.20 (m, 13H); EM 422.3 (M+1).
Etapa C: Ester etílico del ácido 7-(2S-í4-(3-cloro-fen¡n-3R-hidroxi-butill-5-oxo-pirolidin-1-il}-heptanoico. Se añadió paladio al 10% sobre carbono (80 mg) a una solución de éster etílico del ácido 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3S-hidroxi-but-1-en¡l]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (800 mg, 1.90 mmol) en EtOH (50 mi). La mezcla de reacción se sometió a hidrogenación en un agitador Parr a 3.10 x 105 Pa durante 4.5 horas. Se separó el catalizador por filtración a través de Celite® con la ayuda de EtOH. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1 :1 hasta EtOAc:hexanos 4:1) proporcionó el éster etílico del ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (625 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.27-7.21(m, 3H), 7.09 (m, 1 H), 1.10 (m, 2H), 3.84 (m, 1 H), 3.61 (m, 2H), 2.90 (m, 1 H), 2.78 (dd, 1 H), 2.68 (m, 1 H), 2.47-2.25 (m, 4H), 2.12 (m, 1 H), 1.92-1.22 (m, 17H); EM 424.3 (M+1).
Etapa D: Acido 7-(2S-r4-(3-cloro-feniD-R-hidroxi-butir]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico. Se añadió NaOH 2N (6 mi) a una solución del éster etílico del ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (595 mg, 1.40 mmol) en EtOH (25 mi). La reacción se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente y se concentró a vacío hasta aproximadamente tres cuartas partes del volumen original. Se añadió HC1 1 N acuoso para obtener un pH de aproximadamente 2. La solución acuosa se lavó con cloruro de metileno (3 veces). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua seguida de salmuera. La solución orgánica se secó (MgS04), se filtró y se concentró proporcionando el compuesto del Ejemplo 1 (500 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.26-7.18 (m, 3H), 7.08 (m, 1 H), 3.84 (m, 1 H), 3.58 (m, 2H), 2.90 (m, 1H), 2.77 (dd, 1 H), 2.68 (m, 1 H), 2.43-2.28 (m, 4H), 2.10 (m, 1 H), 1.78 (m, 1 H), 1.66-1.22 (m, 13H); EM 396.2 (M+1), 394.2 (M-1 ).
EJEMPLO 2 Acido 7-{2S-r3R-hidroxi-4-ftrifluorometil-fenií)-butin-5-oxo-pirrolidin-1-il> heptanoico Etapa A: Ester etílico del ácido 7-{2-oxo-5R-r3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil1-pirrolid¡n-1-il}-heptanoico. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1 , Etapa A, se hizo reaccionar el anión derivado del éster dimetílico del ácido [2-oxo-3-(3-trifluorometil-fenil)-propil]-fosfónico (4.16 g, 13.40 mmol) y NaH (60% en aceite, 590 mg, 14.7 mmol) con éster metílico del ácido 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico (se suponen 14.74 mmol) durante 24 horas. La purificación por cromatografía de media presión (gradiente de disolvente de EtOAc al 20% en hexanos hasta EtOAc) proporcionó el éster etílico del ácido 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico (4.29 g). RMN de 1H (CDCI3) d 7.52 (d, 1 H), 7.44 (m, 2H), 7.37 (d, 1 H), 6.67 (dd, 1 H), 6.22 (d, 1 H), 4.80 (m, 1 H), 4.08 (q, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.54 (m, 1H), 2.70 (m, 1 H), 2.37 (m, 2H), 2.24 (m, 3H), 1.78 (m, 1 H), 1.56 (m, 2H), 1.44-1.20 (m, 9H); EM 454.2 (M+1), 542.2 (M-1).
Etapa B: Ester etílico del ácido 7-{2R-r3S-hidrox¡-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico. Se añadió catecolborano (1 M en THF, 9.9 mi, 9.9 mmol), gota a gota, a una solución de éster etílico del ácido 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1.5 g, 3.31 mmol) y (R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina (1 M en tolueno, 0.5 mi, 0.5 mmol) en CH2CI2 (100 mi) a -45°C. La solución se agitó durante 24 horas a -45°C y se añadió HCI 1 N. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y se separaron las capas. La solución acuosa se lavó con CH2CI2 (2 veces) y las capas orgánicas reunidas se lavaron sucesivamente con NaOH 0.5N enfriada en hielo y salmuera (dos veces). La solución orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc al 50% en hexanos hasta EtOAc al 60% en hexanos hasta EtOAc al 80% en hexanos hasta EtOAc hasta MeOH al 5% en CH2CI2) proporcionó el éster etílico del ácido 7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)- but-1-enil]-5-oxo-p¡rrolid¡n-1-¡l}-heptanoico (1.23 g) como una mezcla aproximadamente 5.5:1 de los diastereoisómeros alcohol 3S:3R por análisis HPLC. RMN de 1H (CDCI3) d 7.51-7.35 (m, 4H), 5.72 (dd, 1 H), 5.50 (dd, 1 H), 4.44 (m, 1H), 4.09 (q, 2H), 4.01 (m, 1 H), 3.44 (m, 1 H), 2.90 (d, 2H), 2.71 (m, 1 H), 2.37-2.12 (m, 5H), 1.70-1.21 (m, 13H); EM 456.3 (M+1 ), 454.3 (M-1 ).
Etapa C: Ester etílico del ácido 7-f2S-r3R-hidrox¡-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil1-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico. Siguiendo ei procedimiento descrito para el Ejemplo 1 , Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de paladio al 10% sobre carbono (120 mg) de 2.75 x 105 a 3.10 x 105 Pa en un agitador Parr durante 24 horas una solución del éster etílico del ácido 7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1.18 g, 2.59 mmol) en EtOH (50 mi). La purificación mediante cromatografía de media presión (EtOAc al 50% en hexanos hasta EtOAc hasta MeOH al 1 % en CH2CI2 hasta MeOH al 3% en CH2CI2 hasta MeOH al 5% en CH2CI2 hasta MeOH al 10 % en CH2CI2) proporcionó el éster etílico del ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidín-1-il}-heptanoico (1.08 g). RMN de H (CDCI3) d 7.51-7.39 (m, 4H), 4.09 (q, 2H), 3.86 (m, 1 H), 3.60 (m, 2H), 2.89 (m, 2H), 2.76 (m, 1 H), 2.33 (m, 4H), 2.11 (m, 1 H), 1.80 (m, 1 H), 1.68-1.21 (m, 16H).
Etapa D: Acido 7-f2S-f3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenin-butil1-5-QXO-pirrolidin-1-ilVheptanoico. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1 , Etapa D, se hidrolizó el éster etílico del ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1.93 g, 4.22 mmol) con NaOH 6N (26 mi) en EtOH (52 mi) durante 24 horas. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc hasta MeOH al 1% en CH2CI2 hasta MeOH al 3% en CH2CI2 hasta MeOH al 5% en CH2CI2 hasta MeOH al 10% en CH2CI2) proporcionó el ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1.66 g). RMN de H (CDCI3) d 7.51-7.39 (m, 4H), 3.88 (m, 1H), 3.58 (m, 2H), 2.84 (m, 3H), 2.34 (m, 4H), 2.10 (m, 1 H), 1.80 (m, 1 H), 1.67-1.26 (m, 13H); EM 430.4 (M+1).
Etapa D: Sal sódica del ácido 7-{2S-f3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenin-butil1-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico. Se añadió NaHCO3 (325 mg, 3.87 mmol) en agua (3 mi) a una solución del ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1.66 g, 3.87 mmol) en EtOH (16 mi). La mezcla de reacción se agitó durante 5 horas y se concentró a vacío. El residuo se destiló azeotrópicamente con CH2CI2 (3 veces) proporcionando la sal sódica del compuesto del título del Ejemplo 2 (1.698 g). RMN de 1H (CD3OD) d 7.48 (m, 4H), 3.80 (m, 1 H), 3.69 (m, 1 H), 3.52 (m, 1 H), 2.94 (m, 1 H), 2.81 (m, 2H), 2.32 (m, 2H), 2.13 (m, 3H), 1.81 (m, 1 H), 1.69-1.26 (m, 13H); EM 430.3 (M-na+1 ), 428.2 (M-na-1 ).
EJEMPLO 3 5S-r4-(3-Cloro-fenin-3-hidroxi-butH^ 2-ona Etapa A: 7-{2R-[4-(3-Cloro-fenil)-3-oxo-but-1-en¡n-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1 , Etapa A, se hizo reaccionar con 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo (se supone 13.3 mmol) durante 18 horas el anión derivado del éster dimetílico del ácido [3-(3-cloro-fenil)-2-oxo-propil]-fosfónico (3.35 g, 12.12 mmol) y NaH (60% en aceite, 533 mg, 132.3 mmol). La purificación por medio de cromatografía de media presión (EtOAc al 20% en hexanos hasta EtOAc al 80% en hexanos) proporcionó el 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (1.52 g). RMN de H (CDCI3) d 7.24 (m, 2H), 7.17 (s, 1 H), 7.06 (m, 1 H), 6.64 (dd, 1 H), 6.20 (d, 1 H), 4.15 (m, 1 H), 3.80 (s, 2H), 3.50 (m, 1 H), 2.72 (m, 1 H), 2.46-2.20 (m, 5H), 1.78 (m, 1 H), 1.59 (m, 2H), 1.40 (m, 4H), 1.24 (m, 2H).
Etapa B. 7-f2S-r4-(3-Cloro-fenin-3-oxo-but¡l]-5-oxo-p¡rrolidin-1 -il}-heptanonitrilo. Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 , Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de palacio al 10% sobre carbono (86 mg) durante una hora 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (860 mg, 2.31 mmol) en MeOH (40 mi). La purificación por cromatografía radial (hexanos hasta EtOAc al 70% en hexanos) proporcionó el 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (730 mg).
Etapa C: 7-f2S-r4-(3-Cloro-fenin-3-hidrOxi-butill-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanonitrilo. Se añadió NaBH4 (35 mg, 0.921 mmol) a una solución de 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (730 mg, 1.87 mmol) en MeOH (30 mi) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 45 minutos y se añadió agua, los volátiles se eliminaron a vacío y la solución acuosa que quedó se diluyó con cloruro de metileno. La solución orgánica se lavó con agua y después con salmuera, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos: EtOAc 1 :1 hasta EtOAc hasta MeOH al 3% en CH2CI2) proporcionó el 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (730 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.22 (m, 3H), 7.07 (d, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.57 (m, 2H), 2.88 (m, 1 H), 2.78 (m, 1 H), 2.64 (m, 1 H), 2.31 (m, 4H), 2.10 (m, 1 H), 1.65-1.22 (m, 14H); EM 377.3 (M+1).
Etapa D: 5S-r4-(3-Cloro-fenin-3-hidroxi-butill-1 -i6-(2H-tetrazol-5-ilV-hexil]-pirrolidin-2-ona. Se calentó a reflujo durante 18 horas una solución de 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanon¡trilo (730 mg, 1.94 mmol), trimetilsililazida (0.63 mi, 1.94 mmol), trimetllsilllazida (0.63 mi, 0.475 mmol) y óxido de dibutilestaño (96 mg, 3.87 mmol) en tolueno (30 mi). Los volátiles se eliminaron a vacío y el residuo se diluyó con CH2CI2. La solución orgánica se lavó con HCI 1 N, seguido de salmuera. La solución orgánica se secó (MgS04), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de media presión eluyendo con EtOAc hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 7% en CH2CI2, dando el complejo en TMS. El residuo se diluyó con MeOH y se añadió HCI 2N y la solución se agitó durante 40 minutos. La solución se diluyó con CH2CI2 y la capa orgánica se lavó con agua y luego con salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de media presión eluyendo con EtOAc hasta MeOH al 7% en CH2CI2, proporcionando la 5S-[4-(3-cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona (521 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.23 (m, 3H), 7.09 (d, 1 H), 3.85 (m, 1 H), 3.66 (m, 1 H), 3.53 (m, 1 H), 2.96 (m, 3H), 2.81 (m, 1 H), 2.70 (m, 1 H), 2.44 (m, 2H), 2.18 (m, 1 H), 1.88-1.27 (m, 14H); EM 420.2 (M+1), 418.3 (M+1 ).
EJEMPLO 4 5S-r3R-Hidroxi-4-(3-trifluorometil-fem^ pirrolidin-2-ona Etapa A: 7-f2-Oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometii-fenin-but-1 -enill-pirrolidin-1-il>-heptanonitrilo. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1 , Etapa A, se hizo reaccionar el anión derivado de éster dimetílico del ácido [2-oxo-3-(3-trifluorometil-fenil)-propil]fosfónico (2.68 g, 8.64 mmol) y NaH (60% en aceite, 400 mg, 10 mmol) con 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo (se suponen 10 mmol) durante 18 horas. La purificación por medio de cromatografía de media presión (EtOAc al 30% en hexanos hasta EtOAc al 80% en hexanos) proporcionó el 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-p¡rrolidin-1-il}-heptanonítrilo (1.2 g). RMN de H (CDCI3) d 7.52 (m, 1 H), 7.45 (m, 2H), 7.37 (m, 1 H), 6.67 (dd, 1 H), 6.23 (d, 1 H), 4.18 (m, 1 H), 3.90 (s, 2H), 3.53 (m, 1 H), 2.73 (m, 1 H), 2.45-2.23 (m, 5H), 1.79 (m, 1 H), 1.60 (m, 2H), 1.41 (m, 4H), 1.24 (m, 2H); EM 407.2 (M+1 ), 405.3 (M-1 ).
Etapa B: 7-f2R-f3S-Hidroxi-4-(3-trifluorometil-feninbut-1 -eniH-5-QXO-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo. Se añadió catecolborano (1 M en THF, 8.4 mi, 8.4 mmol) gota a gota a una solución de 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifiuorometil-fenil)but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (1.14 g 2.81 mmol) y (R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina (1 M en tolueno, 0.42 mi, 0.42 mmol) en CH2CI2 (112 ML) A -45°C. La mezcla de reacción se agitó a -45°C durante 18 horas y se añadió HCI 1 N. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos y se separaron las capas. La solución orgánica se lavó con NaOH 1 N fría (3 veces). La solución orgánica se lavó secuencialmente con HCI 1 N, agua y salmuera. La solución orgánica se secó (MgS04), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1 :1 hasta EtOAc al 80% en hexanos) proporcionó 7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanon (820 mg) como una relación aproximadamente 2.5:1 de los diastereoisómeros alcohol 3S:3R por RMN de 1H (CDCI3) d 7.51-7.38 (m, 4H), 5.72 (dd, 1H), 5.49 (dd, 1 H), 4.45 (m, 1H), 4.02 (m, 1 H), 3.47 (m, 1 H), 2.90 (m, 2H), 2.71 (m, 1 H), 2.34 (m, 4H), 2.18 (m, 1 H), 1.66 (m, 4H), 1.44 (m, 4H), 1.27 (m, 2H); EM 409.2 (M+1 ).
Etapa C: 7-{2S-f3R-Hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenin-butin-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1 , Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de paladio al 10% sobre carbono (100 mg) a 3.45 x 105 Pa durante 18 horas en un agitador Parr el 7-{2R-[3S-h¡droxi-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (810 mg) en MeOH (40 mi). La purificación por medio de cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta MeOH al 3% en CH2CI2) proporcionó el 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (720 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.44 (m, 4H), 3.84 (m, 1 H), 3.58 (m, 2H), 2.88 (m, 2H), 2.73 (m, 1H), 2.32 (m, 4H), 2.11 (m, 1H), 1.78 (m, 1 H), 1.65-1.37 (m, 11 H), 1.30 (m, 2H); EM 411.2 (M+1 ).
Etapa D: 5S-r3R-Hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenin-butill-1 -G6-(2?-tetrazol-5-¡n-hexil]-pirrolidin-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 3, Etapa D, se hizo reaccionar 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanonitrilo (710 mg, 1.73 mmol) con azidotrimetilsilano (399 mg, 3.46 mmol) y óxido de dibutilestaño (43 mg, 1.7 mmol) en tolueno (25 mi) calentado a reflujo durante 18 horas. Los volátiles se eliminaron a vacío y el residuo se diluyó con CH2CI2. La solución orgánica se lavó sucesivamente con HCI 1 N (dos veces), agua (1 vez) y salmuera (1 vez). La solución orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de media presión eluyendo con EtOAc hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 8% en CH2CI2, proporcionando la 5S-[3R-hidroxi-4-(3-triflurometil-fenil)-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona (450 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.44 (m, 4H), 3.87 (m, 1 H), 3.65 (m, 1 H), 3.50 (m, 1 H), 3.01-2.73 (m, 5H), 2.42 (m, 2H), 2.16 (m, 1 H), 1.86-1.23 (m, 14H); EM 454.4 (M+1), 452.4 (M-1).
Etapa E: Sal sódica de la 5S-f3R-hidrox¡-4-(3-trifluorOmetil-fenin-but¡n-1-r6-(2H-tetrazol-5-in-hex¡n-Dirrolidin-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 2, Etapa E, el tratamiento de la 5S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona (428 mg, 0.944 mmol) con NaHC03 (79 mg, 0.94 mmol) proporcionó la sal sódica (430 mg). RMN de 1H (CD3OD) d 7.48 (m, 4H), 3.79 (m, 1 H), 3.67 (m, 1 H), 3.51 (m, 1 H), 2.86 (m, 5H), 2.30 (m, 2H), 2.12 (m, 1H), 1.84-1.27 (m. 14H); EM 454.4 (M-Na+1), 452.4 (M-Na-1).
EJEMPLO 5 5-f4-(4-Fluoro-fenin-3-hidrox¡-butill-1-r6-(2H-tetrazol-5-in-hexin-pirrolidin- 2-ona Etapa A: 7-f2-r3-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenin-butill-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo. Se añadió una solución de 5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona (150 mg, 0.41 mmol) en DMF (5 mi) a NaH (60% en peso en aceite, 16 mg, 0.41 mmol) en DMF (10 mi). Después de 1.5 horas, se añadió 7-bromoheptanonitrilo (78 mg, 0.41 mmol) en DMF (5 mi) y la mezcla de reacción se agitó a 90°C durante 2.5 horas. Se añadió agua (20 mi) y la solución acuosa se lavó con EtOAc (4 x 15 mi). Las soluciones orgánicas reunidas se lavaron con agua (2 x 15 mi), se secaron (MgSO- , se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1 :1), proporcionando el 7-{2-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (161 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.09 (m, 2H), 6.95 (m, 2H) 3.81 (m, 1 H), 3.54 (m, 2H), 2.86 (m, 1 H), 2.68 (m, 2H), 2.29 (m, 4H), 2.06 (m, 1 H), 1.74-1.23 (m, 13H), 0.85 (s, 9H), 0.04 (m, 3H), 0.19 (m, 3H); EM 475.1 (M+1 ).
Etapa B: 7-(2-r4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil1-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanonitrilo. Se añadió TBAF (1 M en THF, 0.50 mi, 0.50 mmol) a una solución de 7-{2-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (158 mg, 0.333 mmol) en THF (20 mi) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se añadió NaHCÜ3 acuoso saturado. Los volátiles se eliminaron a vacío. La solución acuosa que quedó se lavó con CHCI3 (4 X 5 mi) y las soluciones orgánicas reunidas se secaron (MgS04), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía de media presión (hexano:EtOAc 1 :1 hasta EtOAc) proporcioanndo 7-{2-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-herptanonitrilo (82 mg). RMN de H (CDCI3) d 7.15 (m, 2H), 7.00 (m, 2H), 3.77 (m, 1 H), 3.58 (m, 2H), 2.89 (m, 1 H), 2.79 (m, 1 H), 2.64 (m, 1 H), 2.34 (m, 4H), 2.12 (m, 1 H), 1.68-1.24 (m, 14H); EM 361.2 (M+1).
Etapa C: 5-f4-(4-Fluoro-fen¡n-3-hidroxi-butin-1 -r6-(2H-tetrazol-5-iP-hexil"|-pirrol¡din-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 3, Etapa D, se hizo reaccionar 3-{2-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (71 mg, 0.197 mmol) con azidotrimetilsilano (45 mg, 0.394 mmol) y óxido de dibutilestaño (5 mg, 0.394 mmol) y óxido de dibutilestaño (5 mg, 0.02 mmol) en tolueno (10 mi) calentado a reflujo durante 16 horas. Se añadieron cantidades adicionales de azidotrimetilsilano (200 mg) y de óxido de dibutilestaño (50 mg) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 5 horas. La mezcla de reacción se acidificó con HCI 1N hasta pH2 (5 mi) y la solución acuosa se lavó con EtOAc (4 x 10 mi). Las soluciones orgánicas reunidas se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc hasta EtOAc:MeOH 39:1 hasta EtOAc:MeOH 19:1) proporcionó el compuesto del título del Ejemplo 5A (39 mg). RMN de H (CDCI3) d 7.16 (m, 2H), 7.00 (m, 2H), 3.81 (m, 1 H), 3.68 (m, 1h), 3.53 (m, 1 H), 2.99 (m, 3H), 2.80 (m, 1 H), 2.68 (m, 1 H), 2.47 (m, 2H), 2.20 (m, 1 H), 1-88-1.22 (m, 14H); EM 404.3 (M+1), 402.3 (M-1).
EJEMPLO 6 5-f4-Bifen¡l-3-¡l-3-hidrox¡^ut¡l)-1-r6-(2H-tetrazol-5-¡l)-hex¡n-pirrolldin-2- ona Etapa A: 7-f2-r4-Bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxn-butin-5-Qxo-pirrolidin-1-il}-heptanonítrilo. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 5, Etapa A, se alquiló el anión derivado de 5-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona (239.1 mg, 0.564 mmol) y NaHMDS (1 M en THF, 0.67 mi), 0.67 mmol) con 7-bromoheptanonitrilo (118 mg, 0.620 mg) a 70°C durante 24 horas. La purificación por cromatografía de media presión (CH2CI2 hasta MeOH al 1 % en CH2CI2 hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 4% en CH2CI2) proporcionó 7-{2-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (187 mg). EM 533.3 (M+1).
Etapa B: 7-r2-(4-Bifenil-3-i[-3-hidroxi-but¡n-5-oxo-pirrolidin-1 -ill-heptanonitrilo. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 5, Etapa B, se desprotegió 7-{2-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-d¡metil-silan¡loxi)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (187 mg, 0.351 mmol) con TBAF (1 M en THF, 0.53 mi, 0.53 mmol). La adición se llevó a cabo a 0°C y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La purificación por cromatografía de media presión (CH2CI2 hasta MeOH al 1% en CH2CI2 hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 6% en CH2CI2 hasta MeOH al 10% en CH2CI2) proporcionó 7-[2-(4-bifenil-3-il-3-hidroxi-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo (85 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.58 (m, 1 H), 7.51-7.33 (m, 4H), 7.21-7.12 (m, 4H), 3.85 (m, 1 H), 3.60 (m, 2H), 2.90 (m, 1H), 2.83-2.60 (m, 2H), 2.45-2.30 (m, 4H), 2.14 (m, 1 H), 1.73-1.25 (m, 14H).
Etapa C: 5-(4-Bifenil-3-il-3-hdiroxi-butil)-1 -[6-(2H-tetrazol-5-in-hexil]-pirrolidin-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 3, Etapa D, se hizo reaccionar 7-[2-(4-bifenil-3-il-3-hidroxi-butil)-5-oxo-pirrolid¡n-1-il]-heptanonitrilo (109 mg, 0.260 mmol) con azidotrimetilsilano (0.69 mi, 0.52 mmol) y óxido de dibutilestaño (11 mg, 0.044 mmol) en tolueno (5.3 mi) calentado a reflujo durante 72 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se añadió agua. La mezcla se acidificó con HCI 1 N hasta pH 2 y la solución acuosa se lavó con MeOH al 5% en CH2CI2 (tres veces). Las soluciones orgánicas reunidas se secaron (MgS04), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 4% en CH2CI2 hasta MeOH al 8% en CH2CI2) proporcionó el compuesto del título del Ejemplo 6 (107 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.57 (m, 1 H), 7.51-7.32 (m, 4H), 7.25-7.13 (m, 4H), 3.91 (m, 1 H), 3.74-3.50 (m, 2H), 2.96 (m, 3H), 2.77 (m, 1 H), 2.50 (m, 2H), 2.22 (m, 1 H), 2.07 (m, 1 H), 1.90-1.22 (m, 14H); EM 462.2 (M+1 ), 460.1 (M-1 ).
EJEMPLO 7 5-f4-(3-Fluoro-fenin-3-hidroxi-butin-1-r6-(2H-tetrazol-5-ij hexill-p¡rrolidin- 2-ona Etapa A: 7-(2-r3-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fen¡l)-butin-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo. Siguiendo el procedimiento descrito par el Ejemplo 5, Etapa A, se alquiló el anión derivado de 5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil3-pirrolidin-2-ona (250 mg, 0.684 mmol) y NaHMDS (1 M en THF, 0.80 mi, 0.80 mol) con 7-bromoheptanonitrilo (152 mg, 0.748 mg) a 70°C durante 72 horas. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos: EtOAc 1 :1 hasta EtOAc hasta MeOH al 5% en CH2CI2) proporcionó el 7-{2-[3-(terc-butN-dimetil-silan¡lox¡)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1- il}-heptanon¡trilo (261.7 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.26 (m, 1 H), 6.892 (m, 3H), 3.89 (m, 1 H), 3.59 (m, 2H), 2.89 (m, 1 H), 2.75 (m, 2H), 2.36 (m, 4H), 2.11 (m, 1 H), 1.72-1.26 (m, 13H), 0.89 (s, 9H), 0.09 (s, 6H); EM 475.3 (M+1 ).
Etapa B: 7-{2-[4-(3-fluoro-fen¡n-3-hidroxi-butin-5-oxo-pirrolidin-1 - il}-heptanonitrilo. Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 5, Etapa B, se desprotegió con TBAF (1 M en THF, 0.83 mi, 0.83 mmol) el 7-{2-[3-(terc-butil- dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanonitrilo (261.7 mg, 0.551 mmol). La adición se llevó a cabo a 0°C y la mezcla de • reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La purificación por cromatografía de media presión (CH2CI2 hasta MeOH al 1% en CH2CI2 hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 4% en CH2CI2) proporcionó el 7- {2-[4-(3-fluorofenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (141 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.32 (m, 1 H), 6.98 (m, 3H), 3.86 (m, 1 H), 3.64 (m, 2H), 2.99-2.80 (m, 2H), 2.71 (m, 1 H), 2.38 (m, 4H), 2.16 (m, 1 H), 1.74-1.29 (m, 14H); EM 361.3 (M+1).
Etapa C: 5-r4-(3-Fluoro-fen¡n-3-hidroxi-butil-1 -r6-(2H-tetrazol-5- jQ-hexin-pirrolidin-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 6, Etapa C, se hizo reaccionar 7-{2-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}- heptanonitrilo (141.3 mg, 0.392 mmol) con azidotrimetilsilano (0.210 mi, 1.57 mmol) y óxido de dibutilestaño (29 mg, 0.116 mmol) en tolueno (8 mi) calentado a reflujo durante 72 horas. La purificación por cromatografía de media presión (CH2CI2 hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 4% en CH2CI2 hasta MeOH al 6% en CH2CI2) proporcionó el compuesto del título del Ejemplo 5C (101.5 mg). RMN de H (CDCI3) d 7.26 (m, 1 H), 6.94 (m, 3H), 3.87 (m, 1 H), 3.70 (m, 1 H), 3.52 (m, 1 H), 2.98 (m, 3H), 2.78 (m, 2H), 2.48 (m, 2H), 2.20 (m, 1 H), 1.89-1.24 (m, 14H); EM 404.2 (M+1), 401.9 (M+1 ).
EJEMPLO 8 5S-r4-(3-Cloro-fen¡l)-3f?-hidroxi-but¡ll-1-r6-(2H-tetrazol-5-¡n-hex¡n- pirrolidin-2-ona Etapa A: 7-(2R-f3S-hidroxi-4-(3-cloro-fen¡n-but-1-enil1-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanonitrilo. Se añadió (R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina (1 M en tolueno, 1.3 mi, 1.3 mmol) a una solución de 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-cloro-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (1.62 g, 4.34 mmol) en CH2CI2 (200 mi) a -45°C. Después de agitar durante 20 minutos, se añadió catecolborano (1 M en THF, 13 mi, 13 mmol) gota a gota. La reacción se agitó a -45°C durante 16 horas y se añadió HCI 1 N. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se separaron las capas. La solución orgánica se lavó con NaOH N (3 veces). La solución orgánica se lavó sucesivamente con HCI 1N, agua y salmuera. La solución orgánica se secó (MgS04), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1 :1 hasta MeOH al 20% en CH2CI2) proporcionó 7-{2 -[3S-hidroxi-4-(3-cloro-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (536 mg) como una mezcla 8.2:1 de los alcoholes 3S-2R. RMN de H (CDCI3) d 7.24.7.17 (m, 3H), 7.07 (m, 1 H), 5.69 (dd, 1 H), 5.46 (dd, 1 H), 4.40 (m, 1 H), 4.01 (m, 1 H), 3.46 (m, 1 H), 2.81 (m, 2H), 2.68 (m, 1 H), 2.42-2.28 (m, 4H), 2.20 (m, 1 H), 1.73-1.59 (m, 4H), 1.42 (m, 4H), 1.25 (m, 2H); EM 375 (M+1).
Etapa B: 7-{2S-f4-(3-cloro-fenil)-3f?-hidroxi-but¡n-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo. Siguiente el procedimiento descrito para el Ejemplo 4, Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de paladio al 10% sobre carbono (60 mg) durante 3.5 horas el 7-{2fi-[3S-hidroxi-4-(3-cloro-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanonitrilo (536 mg) en EtOH (30 ml). La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1 :1 hasta MeOH al 20% en CH2CI2 proporcionó el 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3f?-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (440 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.22 (m, 3H), 7.08 (m, 1 H), 3.83 (m, 1 H), 3.59 (m, 2H), 2.90 (m, 1 H), 2.77 (dd, 1 H), 2.66 (dd, 1 H), 2.39- 2.29 (m, 4H), 2.11 (m, 1 H), 1.78 (m, 1 H), 1.68-1.39 (m, 11 H), 1.29 (m, 2H); EM 377.2 (M+1).
Etapa C: S-r4-(3-Cloro-fenil)-3f?-hidroxi-butil]-1 -i6-(2H-tetrazol-5-iQ-hexill-pirrolidin-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 3, Etapa D, se calentó a reflujo durante 16 horas una mezcla de 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (420 mg, 1.114 mmol), trimetilsililazida (257 mg, 2.23 mmol) y óxido de dibutilestaño (56 mg) en tolueno (30 mi). Los volátiles se eliminaron a vacío y el residuo se disolvió en MeOH y se agitó con HCI 3N durante 3 horas. La reacción se diluyó con agua y CH2CI2 y se separaron las capas. La capa orgánica se lavó con agua seguida de salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 7% en CH2CI2) proporcionó la 5S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-1 -[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona (311 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.22 (m, 3H), 7.08 (m, 1 H), 3.86 (m, 1 H), 3.66 (m, 1 H), 3.52 (m, 1 H), 2.96 (m, 3H), 2.82-2.68 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 2.17 (m, 1 H), 1.88-1.22 (m, 14H); EM 420.2 (M+1), 418.3 (M-1).
EJEMPLO 9 Acido 7-{2 ?-r3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enin-5-oxo-p¡rrolídin-1-il> heptanoíco Etapa A: Ester etílico del ácido 7-(2-oxo-5ff-f3-oxo-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1 -enil]-pirrolidin-1 -il}-heptanoico. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1 , Etapa A, se hizo reaccionar el anión derivado de éter dimetílico del ácido [2-oxo-3-(3-fenoxi-fenil)-propil]-fosfónico (633 mg, 1.98 mmol) y NaH (60% en aceite, 70 mg, 1.74 mmol) con éster etílico del ácido 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico (se supone 1.58 mmol) durante 24 horas. La cromatografía de media presión (EtOAc) proporcionó el éster etílico del ácido 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico (215 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.28 (m, 3H), 7.08 (m, 1 H), 6.97 (m, 2H), 6.89 (m, 2H), 6.83 (m, 1h), 6.62 (dd, 1 H), 6.19 (d, 1 H), 4.13 (m, 1H), 4.08 (q, 2H), 3.79 (s, 2H), 3.51 (m, 1H), 2.68 (m, 1 H), 2.35 (m, 2H), 2.24 (m, 3H), 2.24 (m, 3H), 1.75 (m, 1 H), 1.54 (m, 2H), 1.43-1.20 (m, 9H).
Etapa B: Ester etílico del ácido 7~f2/:?-r3-h¡droxi-4-(3-fenox¡-fen¡n-but-1 -en¡n-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico. Siguiente el procedimiento descrito para el Ejemplo 3, Etapa C, se hizo reaccionar el éster etílico del ácido 7-{2-oxo-5 ?-[3-oxo-4-(3-fenox¡-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico (215 mg, 0.451 mmol) con NaBH4 (17 mg, 0.45 mmol) en EtOH (3 ml) a 0°C durante 4 horas. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc) proporcionó el éster etílico del ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-feoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (167 mg). RMN de H (CDCI3) d 7.33 (m, 2h), 7.25 (m, 1 H), 7.10 (m, 1 H), 6.99 (m, 2H), 6.93 (m, 1 H), 6.86 (m, 2H), 5.72 (m, 1 H), 5.45 (m, 1 H), 4.37 (m, 1 H), 4.10 (q, 2H), 3.47 (m, 1 H), 2.82 (m, 3H), 2.35 (m, 2H), 2.26 (t, 2H), 2.15 (m, 1 H), 1.70-1.21 (m, 13H).
Etapa C: Acido 7- 2 -r3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fen¡n-but-1-en¡n-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1 , Etapa D, se hidrolizó el éster etílico del ácido 7-{2f?-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (29 mg, 0.060 mmol) con NaOH 2M en EtOH (4.0 ml) a temperatura ambiente durante 24 horas, proporcionando el compuesto del título (20 mg). RMN de H (CDCI3) d 7.33-7.21 (m, 3H), 7.08 (m, 1 H), 6.98-6.84 (m, 5H), 5.70 (m, 1 H), 5.44 (m, 1 H), 4.36 (m, 1 H), 4.00 (m, 1 H), 3.44 (m, 1 H), 2.85-2.51 (m, 3H), 2.32 (m, 4H), 2.14 (m, 1 H), 1.68-1.18 (m, 10H).
EJEMPLO 10 Acido 7-{2S-r3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fen¡n-butin-5-oxo-pirrol¡din-1-il>- heptanoico Etapa A: Ester etílico del ácido 7-{2S-f3-hidroxi-4-(3-fenoxi-feniD- butin-5-oxo-pirrOlidin-1-il}-heptano¡co. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1 , Etapa C, se sometió a hidrogenacion en un agitador Parr a 3.45 x 105 Pa durante 18 horas una mezcla del éster etílico del ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)- but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (139 mg, 0.290 mmol), MeOH (30 mi) y paladio al 10% sobre carbono (14 mg). La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1 :1 ) proporcionó el éster etílico del ácido 7- {2S-[3-hidroxi-4-(-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico (86 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.35-7.24 (m, 3H), 7.10 (m, 1 H), 6.99 (m, 2H), 6.93 (m, 1 H), 6.87 (m, 2H), 4.09 (q, 2H), 3.80 (m, 1 H), 3.58 (m, 2H), 2.82 (m, 2H), 2.64 (m, 1 H), 2.42-2.24 (m, 4H), 2.10 (m, 1 H), 1.77 (m, 1 H), 1.66-1.21 (m, 16H).
Etapa B: Acido 7-{2S-r3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenin-butin-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico. Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1 , Etapa D, se hidrolizó el éster etílico del ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (86 mg, 1.79 mmol) con NaOH 2N en MeOH (4 mi) durante 18 horas, proporcionando el compuesto del título (62 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.33-7.23 (m, 3H), 7.09 (m, 1 H), 6.98 (m, 2H), 6.91 (m, 1H), 6.86 (m, 2H), 3.80 (m, 1 H), 3.56 (m, 2H), 2.88 (m, 1 H), 2.77 (m, 1 H), 2.64 (m, 1H), 2.38-2.28 (m, 4H), 2.09 (m, 1 H), 1.77 (m, 1 H), 1.64-1.21 (m, 13H).
PREPARACION 1 7-(2R-Hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo Etapa A: 7-[2R-(terc-Butil-dimetil-silan¡loxiemetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo. Se añadió una solución de 5R-(íerc-butil-dimetil-silaniloximetil)-pirrolidin-2-ona (Tetrahedron: Asymmetry, 1996, 7, 2113) (20.00 g, 87.19 mmol) en DMF (50 mi) a una mezcla de NaH (60% en aceite, 3.826 g, 0.0959 mmol, lavada con 20 mi de DMF) en DMF (250 mi). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas y se añadió una solución de 7-bromoheptanonitrilo (16.574 g, 87.19 mmol) en DMF (50 mi). La reacción se agitó a 90°C durante 3 horas. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadió agua (750 mi). La solución acuosa se lavo con EtOAc (4 x 250 mi). Las soluciones orgánicas reunidas se lavaron con agua (2 x 250 mi), se secaron (MgS04), se filtraron y s concentraron. La purificación por cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 9:1 hasta hexanos:EtOAc 7:3 hasta hexanos EtOAc 1 :1) proporcionó el 7-[2R-(terc-butil-dimetil-silanlloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo (22.46g). RMN de H (CDCI3) d 3.69-3.55 (m, 4H), 2.99 (m, 1 H), 2.42 (m, 1h), 2.34-2.24 (m, 3H), 2.05 (m, 1 H), 1.81 (m, 1H), 1.67-1.42 (m, 6H), 1.31 (m, 2H), 0.86 (s, 9H), 0.03 (s, 6H); EM 339.3 (M+1).
Etapa B: 7-(2/?-Hidrox¡metil-5-oxo-p¡rrolidin-1 -ih-heptanonitrilo. Se añadió lentamente una solución de fluoruro de tetrabutilamonio (1 M en THF, 100.0 mmol) a una solución de 7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo (22.39 g, 66.13 mmol) en THF (400 mi) a 0°C. La reacción se calentó hasta temperatura ambiente y se agitó durante 4 horas. Se añadió NaHC03 acuoso saturado (250 mi) y los volátiles se eliminaron a vacío. La solución acuosa que quedó se lavó con CHCI3 (4 x 200 mi). Las soluciones orgánicas reunidas se secaron (MgS04), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 9:1 hasta hexanos:EtOAc 4:1 hast anéxanos: EtOAc 7:3 hasta hexanos:EtOAc 6:4 hasta hexanos: EtOAc 1 :1 hasta EtOAc hasta EtOAc:MeOH 9:1) proporcionó el 7-(2f?-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo (14.922 g). RMN de 1H (CDCI3) d 3.78 (dd, H), 3.71-2.58 (m, 3H), 3.00 (m, 1H), 2.46 (m, H), 2.36- 2.27 (m, 3H), 2.08 (m, 1 H), 1.93 (m, 1 H), 1.77 (m, 1 H), 1.68-1.43 (m, 6H), 1.32 (m, 2H); EM 225.1 (M+1).
PREPARACION 2 Ester etílico del ácido 7-(2/?-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico Etapa A: Ester etílico del ácido 7-r2f?-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico. Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 1 , Etapa A, se hizo reaccionar con 7-bromoheptanoato de etilo (32.559 g, 137.3 mmol) durante 3 horas a 90°C el anión derivado de 5ft-(íerc-butil-dimetil-silaniloximetil)-pirrolidin-2-ona (30.00 g, 130.8 mmol) y NaH (60% en aceite, 5.756 g, 143, 9 mmol) en DMF (600 mi). La purificación por cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 9:1 hasta hexanos EtOAc 4:1 hasta hexanos: EtOAc 7:3 hasta hexanos:EtOAc 6:4) proporcionó el éster etílico del ácido 7-[2 ?-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico (39.46 g). RMN de 1H (CDCI3) d 4.10 (q, 2H), 3.62 (m, 4H), 2.95 (m, 1 H), 2.42 (m, 1 H), 2.27 (m, 3H), 2.04 (m, 1 H), 1.81 (m, 1 H), 1.65-1.26 (m, 8H), 1.23 (t, 3H), 0.86 (s, 9H), 0.03 (s, 6H), EM 386.2 (M+1).
Etapa B: Ester etílico del ácido 7-(2f?-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1 -il)-heptanoico. Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 1 , Etapa B, se desprotegió el éster etílico del ácido 7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirroiidin-1-il]-heptanoico (39.46 g, 102.3 mol) con TBAF (1 M en THF, 154.0 mi, 154.0 mmol) con un tiempo de reacción de 2.5 horas. La purificación por medio de cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de disolvente hexanos: EtOAc 1 :1 hasta EtOAc hasta EtOAc.MeOH 19:1 ) proporcionó el éter etílico del ácido 7-(2f?-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin1-il)-heptanoico (25.41 g). RMN de H (CDC½) d 4.10 (q, 2H), 3.77 (dd, 1H), 3.64 (m, 3H), 2.96 (m, 1 H), 2.46 (m, 1 H), 2.35-2.25 (m, 3H), 2.08 (m,1 H), 1.93 (m, 1H), 1.71 (m, 1H), 1.63-1.27 (m, 8H), 1.23 (t, 3H); EM 272.2 (M+1).
PREPARACION 3 Ester dimetílico del ácido [2-oxo-3-(3-trif1uorometil-fenil)-propin- fosfónico Etapa A: N-Metoxi-N-metil-2-(3-tr¡fluoromet¡l-fen¡n-acetam¡da. Se añadió trietilamina (2.25 mi) a una solución de clorhidrato de ?,?-dimetilhidroxilamina (1.577 g, 16.2 mmol) en DMF (25 mi) y CH2CI2 (25 mi) a 0°C. Después de agitar durante 5 minutos, se añadieron ácido 3-trifluorometilfenilacético (3.0 g, 14.7 mmol), HOBT (3.177 g, 23.5 mmol) y DEC (clorhidrato del cloruro de 2-dietilaminoetilo, 3.10 g, 16.2 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y se concentró a vacío. El residuo se diluyó con EtOAc y la solución orgánica se lavó sucesivamente con NaOH 1 N (2 veces), agua y salmuera. La solución orgánica se secó (MgS04), se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía de media presión (EtOAc al 20% en hexanos hasta EtOAc al 50% en hexanos) proporcionó la N-metoxi-N-metil-2-(3-trifluorometil-fenil)-acetamida.
Etapa B: Ester dimetílico del ácido f2-oxo-3-(3-trifluorometil-feni0-propil]-fosfónico. Se añadió lentamente n-BuLi (2.5M en hexanos, 28 mi, 70 mmol) a una solución de dimetiimetilfosfonato (9.4 g, 75.8 mmol) en tolueno (80 mi) a -78°C. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora y se añadió lentamente una solución de N-metoxi-N-metil-2-(3-trifluorometil-fenil)-acetamida (14.39 g) en tolueno (50 mi). La mezcla de reacción se agitó durante 2.5 horas y se añadió AcOH (40 mi). La mezcla de reacción se calentó hasta temperatura ambiente y se añadió agua. La capa orgánica se lavó con agua, seguido por salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía de media presión (CH2CI2 hasta MeOH al 2% en CH2CI2) proporcionó el compuesto del título de la Preparación 3 (9.37 g). RMN de 1H (CDCI3) d 7.52 (m, 1 H), 7.44 (m, 2H), 7.37 (m, 1 H), 3.96 (s, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.12 (d, 2H).
PREPARACION 4 Ester dimetílico del ácido r3-í3-cloro-fenH)-2-oxo-propin-fosfónico Sustituyendo los materiales apropiados, se preparó el compuesto del título de la Preparación 4 siguiendo un procedimiento análogo al descrito para la preparación 3.
PREPARACION 5 Ester dimetílico del ácido T3-(3-cloro-fenil)-2-oxo-prop¡n-fosfón¡co Se añadió lentamente n-Buü (2.5M, 64.2 mi, 160.6 mmol) a una solución de dimetilmetilfosfonato (17.93 g, 144 mmol) en THF (270 mi) a -78°C. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora y se añadió lentamente éster metílico del ácido (3-cloro-fenil)-acético (26.93 g, 146 mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 24 horas. Se añadió AcOH (15 mi) y los volátiles se eliminaron a vacío. El residuo se diluyó con ChbCfey la solución orgánica se lavó cuidadosamente con NaHC03 acuoso saturado (3 veces). La capa orgánica se secó (MgS04), se filtró y se concentró a vacío. La purificación por medio de cromatografía de media presión (EtOAc al 20% en hexanos hasta EtOAc) proporcionó el compuesto del título (9.28 g).
PREPARACION 6 Tetrahídro-pirrolizin-3.5-diona El compuesto del título de la Preparación 6 se preparó siguiendo el procedimiento descrito en la patente de los Estados Unidos número 4.663.464.
PREPARACION 7 Ester etílico del ácido 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico Se añadió clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropii)-3-etilcarbodümida (3.46 g, 18.03 mmol) y DMSO (1.5 ml, 24.04 mmol) a una solución de éster etílico del ácido 7-(2R-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico (1.63 g, 6.01 mmol) en benceno (50 ml). La solución se enfrió hasta 0°C y se añadió trifluoroacetato de piridinio (1.28 g, 6.61 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 15 minutos y luego a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución se decantó del residuo oleoso. El residuo se lavó con benceno (3 veces) y las aguas de lavado del benceno reunidas se concentraron a vacío proporcionando el éster etílico del ácido 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico, que se usó sin purificación posterior.
PREPARACION 8 Ester metílico del ácido 4-(3-{2-r4-bifenH-3-il-3-(terc-butil-dimetil- silaniloxi)-butil1-5-oxo-pirrolidin-1-il}-propil)-benzoico Etapa A: 5-(3-Bromo-3-oxo-butil)-pirrolidin-2-ona. Se añadió bromuro de 3-bromobencilmagnesio (0.25 M en Et2O, 155 mi, 38.8 mmol), gota a gota, a una solución de tetrahidropirrolizin-3,5-diona (5 g, 36 mmol) en CH2CI2 (320 mi) a 0°C. La solución se agitó a 0°C durante 2 horas y se inactivo con cloruro amónico acuoso saturado. Se añadió HCI 1 N acuoso para llegar a un pH de 3. Después de calentar hasta temperatura ambiente, la solución acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 veces). Los extractos orgánicos reunidos se secaron(MgS04), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1 :1 hasta EtOAc hasta MeOH al 5% en CH2CI2) proporcionó la 5-(3-bromo-3-oxo-butil)-pirrolidin-2-ona (7.84 g). R N de (CDCI3) d 7.41-7.1 1 (m, 4H), 6.24 (s ancho, 1 H), 3.67 (s, 2H), 3.60 (m, 1 H), 2.52 (t, 2H), 2.32 (m, 2H), 2.20 (m, 1 H), 1 .88-1 .60 (m, 3H).
Etapa B: 5-(3-Bromo-3-hidroxi-butil)-pirrolidin-2-ona. Se añadió NaBH4 (480 mg, 12.6 mmol) a una solución de 5-(3-bromo-3-oxo-butil)-pirrolidin-2-ona (7.84 g, 25.3 mmol) en EtOH (130 mi) y la reacción se agitó a 0°C durante 2.5 horas. La reacción se inactivo con cloruro amónico acuoso saturado. Se añadieron agua y CH2CI2. La capa acuosa se lavó con CH2CI2 (3 veces) y los extractos orgánicos reunidos se secaron (MgS04), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1 :1 hasta EtOAc hasta MeOH al 1% en CH2CI2 hasta MeOH al 3% en CH2CI2 hasta MeOH al 5% en CH2CI2 hasta MeOH al 8% en CH2CI2) proporcionó la 5-(3-bromo-3-hidroxi-butil)-pirrolidin-2-ona (6.76 g. RMN de H (CDCI3) d 7.36-7.09 (m, 4H), 6.27 (d, 1 H), 3.78 (m, 1 H), 3.63 (m, 1 H), 2.75 (m, 1 H), 2.62 (m, 1 H), 2.32-2.18 (m, 3H), 1.88 (m, 1 H), 1.73-1.42 (m, 5H); EM 312.2, 314.1 (M+).
Etapa C: 5-r3-Bromo 3-(terc-butil-dimetil-silan¡loxi)-butill-pirrolidin-2-ona.
Se añadió cloruro de ferc-butildimetilsililo (3.59 g, 23.8 mmol), seguido por imidazol (2.95 g, 43.3 mmol) y DMAP (264 mg, 2.16 mmol) a una solución de 5-(3-bromo-3-hidroxi-butil)-pirrolidin-2-ona (6.76 g, 21.6 mmol) en DMF (86 mi). La reacción se agitó durante 24 horas y se inactivo con cloruro amónico acuoso saturado. La solución acuosa se lavó con EtOAc (3 veces y los extractos orgánicos reunidos se secaron (MgSO- , se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (CH2CI2 hasta MeOH al 1% en CH2CI2 hasta MeOH al 3% en CH2CI2 hasta MeOH al 5% en CH2CI2 hasta MeOH al 8% en CH2CI2) proporcionó la 5-[3-bromo-3-(íerc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona (7.45 g). RMN de 1H (CDCI3) d 7.30 (m, 2H), 7.12 (m, 1 H), 7.04 (m, 1H), 5.71 (m, 1 H), 3.81 (m, 1 H), 3.56 (m, 1 H), 2.66 (m, 2H), 2.32-2.17 (m, 3H), 1.70-1 .35 (m, 5H), 0.82 (s, 9H), -0.06 (d, 3H), -0.24 (d, 3H); EM 426.2, 428.2 (M+).
Etapa D: 5-r4-Bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil1-pirrolidin-2-ona. Se añadió ácido fenilborónico (236 mg, 1 .93 mmol) a una solución de 5-[3-bromo-3-(ferc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona (750 mg, 1 .76 mmol) en DME (15 ml). Se añadieron acetato de paladio (26.8 mg, 0.088 mmol) y tri-o-tolilfosfina (39.5 mg, 0.176 mmol), seguido de una solución de Na2C03 (37.3 mg, 3.52 mmol) en agua (1.8 ml). La reacción se calentó a reflujo durante 24 horas. La reacción se enfrió y los volátiles se eliminaron a vacío. El residuo se diluyó con salmuera y EtOAc. La solución acuosa se lavó con EtOAc (3 veces y los extractos orgánicos reunidos se secaron (MgS04), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1 :1 hasta EtOAc hasta MeOH al 1 % en CH2CI2 hasta MeOH al 3% en CH2CI2 hasta MeOH al 5% en CH2CI2) proporcionó la 5-[4-bigenil-3-il-3-(ferc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona (717.3 mg). RMN de 1H (CDCI3) d 7.57 (m, 2H), 7.43 (m, 2H), 7.33 (m, 3H), 7.1 1 (m, 2H), 5.78 (m, 1 H), 3.91 (m, 1 H), 3.59 (m, 1 h), 2.76 (m, 2H), 2.27 (m, 3H), 1.73-1.38 (m, 5H), 0.83 (s, 9H), -0.03 (d, 3H), -0.16 (d, 3H); EM 424.3 (M+1 ).
PREPARACION 9 5-f3-(terc-But¡l-dimetH-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fen¡l)-butill-pirroiidin-2-ona Etapa A: 5-r4-(3-Fluoro-fenin-3-oxo-but¡l1-Dirrolidin-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa A, se hizo reaccionar tetrahidro-pirrolizin-3,5-diona (2 g, 14 mmol) con cloruro de 3-flurobencilmagnesio (0.25M en Et20, 62 mi, 15.5 mmol) durante 2.5 horas. La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1 :1 hasta EtOAc:hexanos 2:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 10% en CH2CI2) proporcionó la 5-[4-(3-fluoro-fenil9-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona (2.1730 g). RMN de 1H (CDCI3) d 7.32-7.27 (m, 1 H), 7.00-6.90 (m, 3H), 6.12 (s ancho, 1 H), 3.69 (s, 2H), 3.59 (m, 1 H), 2.52 (t, 2H), 2.30 (m, 2H), 2.19 (m, 1 H), 1.75 (m, 2H), 1.65 (m, 1 H).
Etapa B: 5- 4-(3-Fluoro-fenil)-3-hdiroxi-butin-pirrolidin-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa B, se redujo 5-[4-(3-fluoro-feniL)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona (2.17 g, 8.71 mmol) con NaBH4 (165 mg, 4.35 mmol). La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1 :1 hasta EtOAc hasta MeOH al 1% en CH2CI2 hasta MeOH al 35 en CH2CI2 hasta MeOH al 6% en CH2CI2) proporcionó la 5-[4-(3-fluro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-na (2.23 g). RMN de 1H (CDCI3) d 7.27 (m, 1 H), 6.94 (m, 3H), 6.38 (m, 1 H), 3.82 (m, 1 H), 3.66 (m, 1 H), 2.79 (m, 1 H), 2.67 (m, 1 H), 2.33-2.21 (m, 3H), 1.92 (d, J= 4.15 Hz, 1 H) 1.75-1.40 (m, 5H); EM 252.2 (M+1 ).
Etapa C: 5-f3-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluro-fenin-butil-pirrolidin-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa C, se hizo reaccionar al 5-[4-(3-fluoro-fenil-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona (2.23 g, 8.87 mmol) con cloruro de terc-butildimetilsililo (1 .47 g, 9.76 mmol). La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1 :1 hasta EtOAc hasta MeOH al 1 % en CH2CI2 hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 4% en CH2CI2) proporcionó la 5-[3-(ferc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona (2.84 g). RMN de 1H (CDCI3) d 7.23 (m, 1 H), 6.88 (m, 3H), 5.75 (m, 1 H), 3.85 (m, 1 H), 3.57 (m, 1 H), 2.71 (m, 2H), 2.30 (m, 2H), 2.25 (m, 1 H), 1 .70-1.38 (m, 5H), 0.84 (s. 9H), 0 (s, 3H), -0.02 (s, 3H).
PREPARACION 10 5-[3-(ferc-Butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-f1uoro-fenil9-butil]-pirrolidin-2-ona Etapa A: 5-[4-(4-Fluoro-fen¡l)-3-oxo-butill-pirrolidin-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa A, se hizo reaccionar tetrahidro-pirrolizin-3,5-diona (1 .41 g, 10.1 mmol) con cloruro de 4-fluorobencilmagnesio (0.25M en Et2O, 50 mi, 12.5 mmol) durante 5 horas. La purificación por cromatografía de media presión (MeOH al 2% en CH2CI2) proporcionó la 5-[4-(4-fluro-fenil-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona (2.64 g). RMN de 1H (CDCI3) d 7.18 (m, 2H), 7.03 (m, 2H), 6.34 (m, 1 H), 3.70 (s, 2H), 3.62 (m, 1 H), 2.54 (5, 2H), 2.34-2.15 (m, 3H), 1.82-1.61 (m, 3H).
Etapa B: 5-í4-(4-Fluoro-fenin-3-hidroxi-butill-pirrol¡din-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa B, se redujo 5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona (2.64 g, mmol) con NaBH4 (400 mg, mmol) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió más NaBH4 (150 mg) y la reacción se agitó durante 20 horas. La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (CH2CI2 hasta MeOH al 2% en CH2CI2 hasta MeOH al 4% en CH2CI2) proporcionó la 5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona (2.01 g). RMN de 1H (CDCI3) d 7.14 (m, 2H), 6.98 (m, 2H), 6.78 (m, 1H), 3.76 (m, 1 H), 3.65 (m, 1 H), 2.76 (m, 1 H), 2.64 (m, 1 H), 2.32-2.18 (m, 4H), 1.72-1.47 (m, 5H).
Etapa C; 5-|"3-(ferc-But¡l-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluro-fenil)-butil1-pirrolidin-2-ona. Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa C, se hizo reaccionar la 5-[4-(fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona (1.95 g, 7.79 mmol) con cloruro de íerc-butildimetilsililo (1.47 g, 9.76 mmol). La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (MeOH al 1% en CH2CI2) proporcionó la 5-[3-(terc-butil-dimetil- sílaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona. RMN de H (CDCI3) d 7.12 (m, 2H), 6.97 (m, 2h), 5.75 (m, 1 H), 3.83 (m, 1 H), 3.60 (m, 1 H), 2.71 (m, 2H), 2.36-2.24 (m, 3H), 1.70-1.38 (m, 5H), 0.84 (s, 9H), -0.05 (d, 3H), -0.2 (d, 3H).
PREPARACION 11 Ester dimetílico del ácido f2-oxo-3-(3-fenoxl-fenil)-propin-fosfón¡co El compuesto del título de la Preparación 1 se preparó de forma análoga a la descrita para el compuesto de la Preparación 5, sustituyendo los materiales apropiados. Habiendo descrito la invención como antecede, se declara como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (26)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1. - El uso de un agonista selectivo del receptor EP4, uno de sus profármacos, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho agonista selectivo del receptor EP4 o de dicho profármaco para preparar una composición farmacéutica para tratar un trastorno que presenta una masa ósea reducida en un mamífero. 2. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho trastorno es osteoporosis, fragilidad, una fractura osteoporótica, un defecto óseo, pérdida ósea idiopática de la infancia, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea mandibular, fractura ósea, osteotomía, pérdida ósea asociada a periodontitis o crecimiento protésico interno. 3. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde dicha composición es administrable por vía sistémica. 4. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde dicha composición es administrable por vía local. 5. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde dicho trastorno es fragilidad. 6. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde dicho trastorno es osteoporosis. 7. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde dicho trastorno es una fractura ósea o una fractura osteoporótica. 8. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho agonista selectivo de EP4 es un compuesto de Fórmula I: I uno de sus profármacos o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o de dicho profármaco, en la que: Q es COOR3, CONHR4 o tetrazol-5-ilo; A es un enlace sencillo o cis-doble; B es un enlace sencillo o trans-doble; U es / / H OH , HO H ó HO H ; R2 es a-tienilo, fenilo, fenoxi, fenilo monosustituido y fenoxi monosustituido, siendo drchos sustituyentes cloro, fiuoro, fenilo, metoxi, trifluorometilo o alquilo Ci-C3; R3 es hidrógeno, alquilo C1-C5, fenilo o p-bifenilo; R4 es COR5 o SO2R5; y R5 es fenilo o alquilo C C5. 9.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho agonista selectivo del receptor EP4 es un compuesto de Fórmula I, siendo Q un 5-tetrazolilo y U un / H OH , 10. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es 5R-(3S-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-1-[6-(1 H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona. 11. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es 5S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-1-[6-(1H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona. 12. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es 5S-(4-3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona. 13. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifIuorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona. 14.- El uso como se reclama en reivindicación 9, en donde dicho agonista selectivo del receptor EP4 es un compuesto de Fórmula I, siendo Q un COOH y U un / H OH , 15.- El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde dicho compuesto es ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico. 16. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde dicho compuesto es ácido 7-[2R-(3S-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico. 17. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde dicho compuesto es ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometoxi-fenil)-butil]-5-oxo-p¡rrolidin-1-il}-heptanoico. 18. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde dicho compuesto es ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico. 19.- El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde dicho compuesto es ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1 -il)-heptanoico. 20. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde dicho compuesto es ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hdiroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-ilJ-heptanoico. 21. - El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde dicho compuesto se selecciona de ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico; ácido 7-(2S-(3R-hidrox¡-4-(3-trifluorometil-íenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1 -il)-heptanoico; ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico; 5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1 -(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona; y 5S-(3R-hidrox¡-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1^ ona. 22. - Un compuesto seleccionado de ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico; ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolid¡n-1 -il)-heptanoico; ácido 7-{2S-[4-(3-cioro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico; 5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona; y 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidi ona. 23. - Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque es ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico. 24. - Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque es 5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona. 25. - Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque es ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico. 26. - Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque es ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirroIidin-1-il}-heptanoico. 27.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque es 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona.
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