DE60005471T2 - EP4 Rezeptor selektive Agonisten zur Behandlung der Osteoporose - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter Verbindungen, die Prostaglandinagonisten darstellen, zur Herstellung eines Arzneimittels, das verwendbar ist, um Knochenverlust zu verhindern, Knochenmasse wiederaufzubauen oder zu vermehren und um die Knochenheilung zu verbessern, einschließlich Behandlung von Zuständen, die bei Knochenmasseverlust und/oder Knochendefekten bei Vertebraten und insbesondere Säugern, einschließlich Menschen, vorliegen. Diese Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von bestimmten EP4-Rezeptor-selektiven Prostaglandinagonisten.
  • Osteoporose ist eine systemische Skeletterkrankung, die sich durch niedrige Knochenmasse und Verschlechterung des Knochengewebes auszeichnet, mit einer anschließenden Erhöhung der Knochenbrüchigkeit und Anfälligkeit für Frakturen. In den USA betrifft der Zustand mehr als 25 Millionen Menschen und verursacht mehr als 1,3 Millionen Brüche jedes Jahr, einschließlich 500000 der Wirbelsäule, 250000 der Hüfte und 240000 Gelenkfrakturen jährlich. Hüftfrakturen sind die schwerste Folge von Osteoporose, wobei 5–20% der Patienten innerhalb eines Jahres sterben und über 50% der Überlebenden behindert bleiben.
  • Die älteren Menschen haben das größte Osteoporoserisiko und es wird deshalb vorausgesagt, dass sich das Problem mit dem Altern der Bevölkerung wesentlich erhöht. Es wird weiter vorausgesagt, dass sich das Auftreten von Brüchen innerhalb der nächsten 60 Jahre weltweit auf das Dreifache erhöhen wird, und eine Studie hat geschätzt, dass es im Jahre 2050 weltweit 4,5 Millionen Hüftfrakturen geben wird.
  • Frauen haben ein größeres Risiko für Osteoporose als Männer. Frauen erfahren eine starke Beschleunigung des Knochenverlusts während der fünf Jahre, die nach der Menopause folgen. Andere Faktoren, die das Risiko erhöhen, schließen Rauchen, Alkoholgenuss, eine sitzende Lebensweise und eine geringe Calciumaufnahme ein.
  • Es gibt gegenwärtig zwei Hauptarten von pharmazeutischer Therapie für die Behandlung von Osteoporose. Die erste ist die Verwendung von antiresorptiven Verbindungen zur Verminderung der Resorption von Knochengewebe.
  • Östrogen ist ein Beispiel eines antiresorptiven Mittels. Es ist bekannt, dass Östrogen Frakturen vermindert. Außerdem berichten Black et al. in EP 0605193A1, dass Östrogen, insbesondere wenn oral aufgenommen, Plasmaspiegel von LDL senkt und jene der vorteilhaften hochdichten Lipoproteine (HDL) erhöht. Östrogen kann allerdings bei ausgebildetem osteoporotischem Skelett den Knochen nicht zurück auf den Wert eines jungen Erwachsenen wiederherstellen. Weiterhin wurde festgestellt, dass eine Langzeit-Östrogentherapie mit einer Vielzahl von Störungen, einschließlich einer Erhöhung des Risikos für Uteruskrebs, endometrialen Krebs und der Möglichkeit für Brustkrebs einhergehen kann, wodurch viele Frauen diese Behandlung meiden. Die deutlich unerwünschten Wirkungen, die mit der Östrogentherapie verbunden sind, stützen den Bedarf, alternative Therapien für Osteoporose zu entwickeln, die die gewünschte Wirkung hinsichtlich Serum-LDL aufweisen, jedoch keine unerwünschten Wirkungen verursachen.
  • Eine zweite Art von pharmazeutischer Therapie für die Behandlung von Osteoporose ist die Verwendung von anabolischen Mitteln, um die Knochenbildung zu fördern und die Knochenmasse zu erhöhen. Es wird von dieser Klasse von Mitteln erwartet, dass sie für ein ausgebildetes osteoporotische Skelett den Knochen wiederherstellen.
  • Bestimmte Prostaglandinagonisten werden in GB 1478281, GB 1479156 und US-Pat. Nrn. 4 175 203, 4 055 596, 4 175 203, 3 987 091 und 3 991 106 offenbart, die z. B. als renale Vasodilatatoren verwendbar sind.
  • US-Pat. Nr. 4 033 996 offenbart bestimmte 8-Aza-9-oxo(und dioxo)-thia-11,12-secoprostaglandine, die als renale Vasodilatatoren verwendbar sind, zur Verhinderung von Thrombusbildung, um das Wachstum von Hormonfreisetzung zu induzieren, und als Regulatoren von Immunreaktion.
  • Das französische Patent Nr. 897 566 offenbart bestimmte Aminosäurederivate zur Behandlung von neurologischer, mentaler oder cardiovaskulärer Erkrankung.
  • J. Org. Chem. 26; 1961; 1437 offenbart N-Acetyl-N-benzyl-p-aminophenylmercaptoessigsäure.
  • US-Pat. Nr. 4 761 430 offenbart bestimmte Arylbenzolsulfonamid-Verbindungen als lipidsenkende Mittel.
  • US-Pat. Nr. 4 443 477 offenbart bestimmte Sulfonamidophenylcarbonsäuren als lipidsenkende Mittel.
  • US-Pat. Nr. 3 528 961 offenbart bestimmte ε-Caprolactamderivate als Farbstoffe.
  • US-Pat. Nr. 3 780 095 offenbart bestimmte acylierte Anilinocarbonsäuren als Choleretika.
  • US-Pat. Nr. 4 243 678 offenbart bestimmte Acylkohlenwasserstoffaminoalkansäuren mit Anwendbarkeit bei der Behandlung von Magengeschwüren als Talgdrüsenexkretionsinhibitoren und zum Lindern von Hautendzündung.
  • US-Pat. Nr. 4 386 031 offenbart bestimmte N-Benzoyl-ω-anilinoalkancarbonsäuren als antiallergische Mittel, thrombotische Aggregationsinhibitoren, entzündungshemmende Mittel und lipidsenkende Mittel.
  • Zusätzlich zu Osteoporose haben ungefähr 20–25 Millionen Frauen und eine wachsende Anzahl an Männern nachweisbare Wirbelsäulenfrakturen als Folge von verminderter Knochenmasse und außerdem werden allein in Amerika jährlich 250000 Hüftfrakturen mitgeteilt. Der letztere Fall ist mit einer 12%igen Mortalitätsrate innerhalb der ersten zwei Jahre behaftet und 30% der Patienten bedarf nach der Fraktur einer häuslichen Pflege durch Pflegepersonal. Obwohl dies schon kritisch genug ist, wird erwartet, dass sich die wirtschaftlichen und medizinischen Folgen von Konvaleszenz aufgrund von langsamem und unperfektem Heilen von diesen Knochenfrakturen aufgrund des Alterns der Gesamtbevölkerung erhöht.
  • Von Östrogenen wurde gezeigt (Bolander et al., 38. Annual Meeting Orthopedic Research Society, 1992), dass sie die Qualität der Heilung von appendikulären Frakturen verbessern. Deshalb sollte die Östrogenersatztherapie als ein Verfahren zur Behandlung von Frakturheilungsvorgängen wirksam sein. Die Befolgung der Patienten ist bei Östrogentherapie aufgrund ihrer Nebenwirkungen, einschließlich des Wiederauftretens von Mensen, Mastodynie, eines erhöhten Risikos für Uteruskrebs, eines deutlich erhöhten Risikos, Brustkrebs zu bekommen und der gleichzeitigen Verwendung von Progestinen allerdings relativ schlecht. Außerdem neigen die Menschen dazu, die Verwendung der Östrogenbehandlung zu beanstanden. Es besteht Bedarf für eine Therapie für Patienten, die schwächende Knochenfrakturen erlitten haben und welche die Patientenbefolgung verbessern würde.
  • Es wurde gezeigt, dass Prostaglandin E2 (PGE2) verlorenen Knochenmasse in einem ovariorektomisierten (OVX) Rattenmodell, welches ein Modell für postmenopausale Osteoporose darstellt, wiederherstellen kann. Ke, H. Z., et al., Bone, 23: 249–255, 1998. Jedoch gibt es starke Nebenwirkungen, die mit PGE2 verbunden sind. Jee, W. S. S. und Ma, Y. F., Bone, 21: 297–304, 1997.
  • Obwohl es eine Vielzahl von Osteoporosetherapien gibt, gibt es einen ständigen Bedarf und eine fortgesetzte Suche auf diesem Fachgebiet für alternative Osteoporosetherapien. Außerdem gibt es einen Bedarf für Knochenfraktur-Heilungstherapien. Ebenso gibt es einen Bedarf für eine Therapie, die Knochenwiederaufbau in Skelettbereichen fördern kann, wo Defekte vorliegen, wie Defekte, die beispielsweise durch Tumore im Knochen verursacht oder gefördert werden. Weiterhin gibt es einen Bedarf für eine Therapie, die den Knochenwiederaufbau in Skelettbereichen fördern kann, wenn Knochentransplantate angezeigt sind.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung ist auf die Verwendung eines EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten der Formel I:
    Figure 00050001
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes der Verbindung gerichtet, worin:
    Q COOR3, CONHR4 oder Tetrazol-5-yl darstellt;
    A eine Einfach- oder cis-Doppelbindung darstellt;
    B eine Einfach- oder trans-Doppelbindung darstellt;
    Figure 00050002
    R2 α-Thienyl, Phenyl, Phenoxy, monosubstituiertes Phenyl oder monosubstituiertes Phenoxy darstellt, wobei die Substituenten Chlor, Fluor, Phenyl, Methoxy, Trifluormethyl oder (C1-C3)Alkyl darstellen;
    R3 Wasserstoff, (C1-C5)Alkyl, Phenyl oder p-Biphenyl darstellt;
    R4 COR5 oder SO2R5 darstellt; und
    R5 Phenyl oder (C1-C5)Alkyl darstellt;
    oder von 7-{2R-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxyphenyl)-but-1-enyl]-5-oxopyrrolidin-1-yl}-heptansäure oder 7-{2S-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxyphenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure; zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustands, der sich durch eine niedrige Knochenmasse äußert.
  • Diese Erfindung ist insbesondere auf eine solche Verwendung gerichtet, worin der Zustand Osteoporose, Gebrechlichkeit, eine osteoporotische Fraktur, ein Knochendefekt, kindheitsidiopathischer Knochenverlust, alveolarer Knochenverlust, mandibulärer Knochenverlust, Knochenfraktur, Osteo tomie, Knochenverlust, verbunden mit Periodontose, oder prothetisches Einwachsen ist. Vorzugsweise wird der EP4-Rezeptor-selektive Agonist systemisch, beispielsweise oral, subcutan, intramuskulär oder über Aerosol verabreicht. In einem weiteren bevorzugten Aspekt wird der EP4-Agonist lokal verabreicht.
  • Die Verwendung dieser Erfindung ist besonders nützlich, wenn der Zustand Gebrechlichkeit ist.
  • Die Verwendung dieser Erfindung ist auch besonders nützlich, wenn der Zustand Osteoporose ist.
  • Die Verwendung dieser Erfindung ist auch insbesondere nützlich, wenn der Zustand Knochenfraktur oder osteoporotische Fraktur ist.
  • Eine bevorzugte Gruppe von EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten der Formel I ist jene, worin Q 5-Tetrazolyl darstellt und =U
    Figure 00060001
    darstellt unter Bildung von Verbindungen der Formel IA
  • Figure 00060002
  • Besonders bevorzugte Verbindungen innerhalb dieser Gruppe schließen SS-(4-(3-Chlorphenyl)-3R-hydroxy-butyl)-1-(6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl-pyrrolidin-2-on, SS-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-1-(6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl)pyrrolidin-2-on, 5R-(3S-Hydroxy-4-phenyl-but-1-enyl)-1-[6-(1H-tetrazol-5-yl)hexyl]pyrrolidin-2-on und 5S-(3R-Hydroxy-4-phenyl-butyl)-1-[6-(1H-tetrazol-5-yl)-hexyl]pyrrolidin-2-on ein.
  • Eine weitere bevorzugte Gruppe von EP4-Rezeptorselektiven Agonisten der Formel I ist jene, worin Q COOH darstellt. Besonders bevorzugte Verbindungen innerhalb dieser Gruppe schließen 7-{25-[3R-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure; 7-(2S-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure; 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure; 7-(2S-(3R-Hydroxy-4-phenyl-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure; und 7-[2R-(3S-Hydroxy-4-phenyl-but-1-enyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl]-heptansäure ein.
  • Die Erfindung schließt auch eine Verbindung, ausgewählt aus 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure; 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure; 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure; 5S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxybutyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on; und 5S-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-1-(6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl)-pyrrolidin-2-on; pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine solche Verbindung enthalten, und eine solche Verbindung zur Verwendung als ein Arzneimittel, ein.
  • Vorzugsweise werden postmenopausale Frauen und Männer mit einem Alter über 60 Jahren behandelt. Auch bevorzugt sind Patienten ungeachtet des Alters, die eine wesentlich verminderte Knochenmasse aufweisen, d. h. größer als oder gleich 1,5 Standardabweichungen unter dem Maß für normale junge Menschen.
  • In dieser Erfindung schließen Zustände, die mit niedriger Knochenmasse vorliegen, solche Zustände, wie z. B. Osteoporose, kindheitsidiopathischen Knochenverlust, alveolaren Knochenverlust, mandibulären Knochenverlust, Knochenfraktur, Osteotomie, Knochenverlust, verbunden mit Periodontose, und prothetischen Einwuchs ein.
  • Verfahren zum Behandeln von "Sekundärosteoporose" sind auch in die Verfahren dieser Erfindung eingeschlossen. "Sekundärosteoporose" schließt Glucocorticoid-induzierte Osteoporose, Hyperthyriodismus-induzierte Osteoporose, Immobilisierungs-induzierte Osteoporose, Heparin-induzierte Osteo porose und immunosuppressiv-induzierte Osteoporose bei einem Vertebraten, beispielsweise Säuger (einschließlich eines Menschen), ein. Diese Verfahren werden durch Verabreichen an den Vertebraten, beispielsweise einen Säuger, einer "Sekundärosteoporose" behandelnden Menge eines EP4-Rezeptor-selektiven Prostaglandinagonisten, einem Prodrug davon oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz von dem EP4-Rezeptor-selektiven Prostaglandinagonisten oder von dem Prodrug ausgeführt.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist außerdem auf Verfahren zum Verfestigen eines Knochenimplantats, einschließlich vertebraler Synostose, Verstärken der Knochenlängsausdehnung, Verstärken der Knochenheilung nach Gesichtsrekonstruktion, Kieferrekonstruktion und/oder mandibulärer Rekonstruktion bei einem Vertebraten, beispielsweise einem Säuger (einschließlich eines Menschen), gerichtet, umfassend Verabreichen an den Vertebraten, beispielsweise einen Säuger, an dem Gesichtsrekonstruktion, Kieferrekonstruktion und mandibuläre Rekonstruktion vorgenommen wurde, einer knochenverstärkenden Menge eines EP4-Rezeptor-selektiven Prostaglandinagonisten eines Prodrugs davon oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes des EP4-Rezeptor-selektiven Prostaglandinagonisten oder von dem Prodrug. Die wirksamen EP4-Rezeptor-selektiven Prostaglandinagonisten dieser Erfindung können lokal auf den Ort von Knochenrekonstruktion angewendet werden oder können systemisch verabreicht werden.
  • Eine bevorzugte Dosierung ist etwa 0,001 bis etwa 100 mg/kg/Tag eines EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten, eines Prodrugs davon oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes der Verbindung oder des Prodrugs. Eine besonders bevorzugte Dosierung ist etwa 0,01 bis etwa 10 mg/kg/Tag für einen EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten, eines Prodrugs davon oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes der Verbindung oder des Prodrugs.
  • Das Begriff "Zustand (Zustände), der/die eine niedrige Knochenmasse verhindern" bezieht sich auf einen Zustand, bei dem der Anteil an Knochenmasse unterhalb des altersspezi fischen Normalwerts liegt, wie in Standards der Weltgesundheitsorganisation "Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994) Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization Technical Series 843", definiert. Eingeschlossen in "Zustand (Zustände), der/die niedrige Knochenmasse verhindern", sind Primär- und Sekundärosteoporose, wie vorstehend beschrieben. Ebenso eingeschlossen sind Periodontalerkrankung, alveolarer Knochenverlust, Postosteomie und kindheitsidiopathischer Knochenverlust. Der Begriff "Zustand (Zustände), der/die niedrige Knochenmasse verhindern" schließt auch Langzeitkomplikationen von Osteoporose, wie Krümmung der Wirbelsäule, Größenverlust und prothetische Chirurgie, ein.
  • Der Begriff "Zustand (Zustände), der/die niedrige Knochenmasse verhindern" bezieht sich auch auf einen Vertebraten, beispielsweise einen Säuger, von dem bekannt ist, dass er eine wesentlich höhere als durchschnittliche Veränderung beim Entwickeln solcher Krankheiten, wie vorstehend beschrieben, aufweist, einschließlich Osteoporose (beispielsweise postmenopausale Frauen, Männer im Alter über 50). Andere Knochenmasse vergrößernde oder verstärkende Anwendungen schließen Knochenwiederherstellung, Erhöhung der Knochenfraktur-Heilungsrate, vollständiger Ersetzen von Knochenimplantat-Chirurgie, Erhöhen der Rate von erfolgreichen Knochentransplantaten, Knochenheilung nach Gesichtsrekonstruktion oder Kieferrekonstruktion und mandibuläre Rekonstruktion, prothetischen Einwuchs, vertebrale Synostosis und Knochenlängsausdehnung, ein.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch in Verbindung mit orthopädischen Vorrichtungen, wie Wirbelsäulen-Assimilationskäfigen, Wirbelsäulen-Assimilationsgerätschaften, inneren und äußeren Knochenfixierungsvorrichtungen, Schrauben und Nägeln verwendet werden.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass sich der Begriff Knochenmasse tatsächlich auf Knochenmasse pro Einheitsfläche bezieht, die manchmal (obwohl nicht ganz korrekt) auch als Knochenmineraldichte bezeichnet wird.
  • Der Begriff "Behandeln", "behandelt" oder "Behandlung", wie hierin verwendet, schließt präventive (beispielsweise prophylaktische), lindernde und heilende Behandlung ein.
  • "Pharmazeutisch verträglich" bedeutet, dass der Träger, das Vehikel, das Verdünnungsmittel, die Exzipienten und/oder das Salz mit anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel sein muss und seinen Rezipienten nicht beeinträchtigen darf.
  • Der Begriff "pharmazeutisch verträgliches Salz" bezieht sich auf nicht-toxische, anionische Salze, die Anionen enthalten, wie (jedoch nicht begrenzt auf) Chlorid, Bromid, Jodid, Sulfat, Bisulfat, Phosphat, Acetat, Maleat, Fumarat, Oxalat, Lactat, Tartrat, Citrat, Gluconat, Methansulfonat und 4-Toluolsulfonat. Der Begriff bezieht sich auch auf nichttoxische Kationensalze, wie (jedoch nicht begrenzt auf) Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Ammonium oder protoniertes Banzathin (N,N'-Dibenzylethylendiamin), Cholin, Ethanolamin, Diethanolamin, Ethylendiamin, Meglamin (N-Methylglucamin), Benethamin (N-Benzylphenethylamin), Piperazin oder Tromethamin (2-Amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol).
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben eine Knochenbildung, die zu verminderten Frakturraten führt. Diese Erfindung stellt einen wesentlichen Beitrag auf dem Fachgebiet dar, indem Verfahren bereitgestellt werden, die die Knochenbildung erhöhen, wodurch Prävention, Verzögerung und/oder Zurückgehen von Osteoporose und verwandten Knochenstörungen erzielt werden.
  • Diese Erfindung ist auch auf Verbindungen gerichtet, ausgewählt aus 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure; 5S-(4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl)-1-(6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl-pyrrolidin-2-on; 7-(2S-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure; 7-(2S-[4-(3-Chlor-phenyl)- 3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure, und 5S-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-1-(6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl)-pyrrolidin-2-on.
  • Diese Erfindung ist insbesondere gerichtet auf 7-{2S-L3R-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure.
  • Diese Erfindung ist insbesondere auch gerichtet auf 5S-(4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl)-1-(6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl-pyrrolidin-2-on.
  • Diese Erfindung ist insbesondere auch gerichtet auf 7-(2S-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure.
  • Diese Erfindung ist insbesondere auch gerichtet auf 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure.
  • Diese Erfindung ist insbesondere auch gerichtet auf 5S-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-1-(6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl)-pyrrolidin-2-on.
  • Andere Merkmale und Vorteile werden aus der Beschreibung und den Ansprüchen, die die Erfindung beschreiben, deutlich.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN
  • Jeder EP4-Rezeptor-selektive Agonist kann als der EP4-Rezeptor-selektive Agonist dieser Erfindung verwendet werden. EP4-selektive Agonisten sind Verbindungen, die einen IC50 an dem EP1-, EP2- und EP3-Rezeptor aufweisen, der mindestens 10fach größer als der IC50 an dem EP4-Rezeptor-Untertyp ist. Beispielsweise ist 7-(2-(3-Hydroxy-4-phenylbutyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure ein EP4-Rezeptorselektiver PGE2-Agonist mit einem EP4-Rezeptorbinden von IC50 von 16 nM. Bei allen anderen EP-Rezeptoruntertypen, einschließlich Rezeptoruntertypen EP1, EP2 und EP3, ist der IC50 für 7-(2-(3-Hydroxy-4-phenyl-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure größer als 3200 nM.
  • Die Verbindungen der Formel I können, wie in der gemeinsam übertragenen US 4 177 346 offenbart, welche hierin durch Hinweis einbezogen ist, hergestellt werden.
  • Die EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind alle zur therapeutischen Verwendung als Mittel, die die Knochenbildung stimulieren und die Knochenmasse bei Vertebraten, beispielsweise Säugern und insbesondere Menschen, erhöhen, angepasst. Da Knochenbildung eng verwandt ist mit der Entwicklung von Osteoporose und knochenverwandten Störungen, verhindern, sperren oder beschränken die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Agonisten tatsächlich deren Wirkung auf den Knochen von Osteoporose.
  • Die Verwendbarkeit von EP4-selektiven Agonisten, die in den erfindungsgemäßen Verfahren als Arzneimittel bei der Behandlung von Zuständen, die mit niedriger Knochenmasse (beispielsweise Osteoporose) bei Vertebraten, beispielsweise Säuger (insbesondere Menschen und ganz besonders weibliche Menschen) vorliegen, wird durch die Wirkung dieser Agonisten in herkömmlichen Assays, einschließlich einem Rezeptorbindungsassay, einem zyklischen AMP-Assay, einem in vitro-Assay und einem Bruchheilungsassay gezeigt, wobei alle davon nachstehend beschrieben werden. Solche Assays stellen auch ein Mittel bereit, wobei die Aktivitäten der EP4-selektiven Agonisten miteinander und mit den Aktivitäten anderer bekannter Verbindungen und Zusammensetzungen verglichen werden können. Die Ergebnisse von diesen Vergleichen sind zum Bestimmen der Dosierungsspiegel in einem Vertebraten, beispielsweise Säuger, einschließlich Menschen, für die Behandlung von solchen Erkrankungen verwendbar.
  • In vitro-Assay
  • Die Wirkung von anabolischen Knochenmitteln beim Stimulieren der Knochenbildung und Erhöhung der Knochenmasse kann an intakten männlichen oder weiblichen Ratten, Ge schlechtshormon-mangelnden männlichen (Orchidektomie) oder weiblichen (Ovariorektomie) Ratten getestet werden.
  • Männliche oder weibliche Ratten bei verschiedenem Alter (wie im Alter von 3 Monaten) können in dieser Studie verwendet werden. Die Ratten sind entweder intakt oder kastriert (ovariektomisiert oder orchidektomisiert) und werden mit Prostaglandinagonisten bei verschiedenen Dosen (wie 1, 3 oder 10 mg/kg/Tag) für 30 Tage subcutan injiziert oder verarbreicht. Bei kastrierten Ratten wird die Behandlung am nächsten Tag nach einer Operation (für den Zweck des Verhinderns von Knochenverlust) oder zu dem Zeitpunkt, wo der Knochenverlust bereits stattgefunden hat (für den Zweck des Wiederaufbaus von Knochenmasse), begonnen. Während der Studie hatten alle Ratten freien Zugang zu Wasser und pelletisierter handelsüblicher Nahrung (Teklad Rodent Diet #8064, Harlan, Teklad, Madison, WI), enthaltend 1,46% Calcium, 0,99% Phosphor und 4,96 IU/g Vitamin D3. Allen Ratten wurden subcutan Injektionen von 10 mg/kg Calcein an Tagen 12 und 2 vor dem Opfern verabreicht. Die Ratten werden geopfert. Die nachstehenden Endpunkte werden bestimmt:
  • Weibliche Knochenmineralmessungen:
  • Der rechte Oberschenkel von jeder Ratte wurde durch Autopsie entfernt und unter Verwendung von dualer Energie-Röntgenabsorptiometrie (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA), ausgestattet mit "Regional High Resolution Scan" Software, (Hologic Inc., Waltham, MA), gescannt. Die Scangebietgröße ist 5,08 × 1,902 cm, Auftrennung ist 0,0254 × 0,0127 cm und Scangeschwindigkeit ist 7,25 mm/Sekunde. Die Oberschenkelscanbilder werden analysiert und Knochenfläche, Knochenmineralgehalt (BMC) und Knochenmineraldichte (BMD) von weiblichen Oberschenkeln (WF), distalen Oberschenkelmetaphysen (DFM), Oberschenkelschaft (FS) und proximalen Oberschenkeln (PF) werden bestimmt.
  • Schienbeinknochen-histomorphometrische Analysen:
  • Das rechte Schienbein wird mit Autopsie entfernt, freie Muskeln disseziert und in drei Teile geschnitten. Das proximale Schienbein und der Schienbeinschaft werden in 70% Ethanol fixiert, in ansteigenden Konzentrationen von Ethanol entwässert, in Aceton entfettet, dann in Methacrylsäuremethylester eingebettet (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY).
  • Fröntalschnitte von proximalen Schienbeinmetaphysen mit 4 und 10 μm Dicke werden unter Verwendung eines Reichert-Jung Polycut S Mikrotoms geschnitten. Die 4 μm Sektionen werden mit modifizierter Masson's Trickrom-Färbung angefärbt, während die 10 μm-Schnitte ungefärbt bleiben. Ein 4 μm und ein 10 μm-Schnitt von jeder Ratte werden als gitterförmige Knochenhistomorphometrie verwendet.
  • Knochenschnitte von Schienbeinschaft mit einer Dicke von 10 μm werden unter Verwendung eines Reichert-Jung Polycut S Mikrotoms geschnitten. Diese Schnitte werden für histomorphometrische Kortikalknochen-Analyse verwendet.
  • Gitterförmige Knochenhistomorphometrie:
  • Ein Bioquant OS/2 Histomorphometriesystem (R&M Biometrics, Inc., Nashville, TN) wird für die statischen und dynamischen histomorphometrischen Messungen der Sekundärspongiosa der proximalen Schienbeinmetaphysen zwischen 1,2 und 3,6 mm distal zu dem Wuchs der Platten-epiphysialen Verbindung verwendet. Die ersten 1,2 mm des Schienbein-metaphysealen Schnitts müssen weggelassen werden, um die Messungen der Sekundärsponginosa zu beschränken. Die 4 μm-Schnitte werden verwendet, um Hinweise bezüglich Knochenvolumen, Knochenstruktur und Knochenresorption zu bestimmen, während 10 μm-Schnitte verwendet werden, um Hinweise bezüglich Knochenbildung und Knochen-Turnover zu bestimmen.
  • I) Messungen und Berechnungen bezüglich trabekulärem Knochenvolumen und Struktur: (1) gesamtmetaphyseale Fläche (TV, mm2): metaphyseale Fläche zwischen 1,2 und 3,6 mm distal zu der Wachstumsplatten-epiphysealen Verbindung. (2) Trabekuläre Knochenfläche (Bv, mm2): Gesamtfläche von Trabekulae innerhalb TV. (3) Trabekulärer Knochenperimeter (BS, mm): die Länge des gesamten Perimeters von Trabekulae. (4) Trabikularknochenvolumen (BV/TV, %): BV/TV × 100. (5) Trabekuläre Knochenzahl (TBN, #/mm): 1,199/2 × BS/TV. (6) Trabikuläre Knochendicke (TBT, μm): (2000/1, 199) × (BV/BS). (7) Trabikuläre Knochenseparation (TBS, μm): (2000 × 1, 199) × (TV-BV).
  • II) Messungen und Berechnungen bezüglich Knochenresorption: (1) Osteoklastenzahl (OCN, #): Gesamtanzahl an Osteoklasten innerhalb gesamtmetaphysealer Fläche. (2) Osteoklastenperimeter (OCP, mm): Länge des trabekulären Perimeters, bedeckt durch Osteoklast. (3) Osteoklastenzahl/mm (OCN/mm, #/mm): OCN/BS. (4) Prozent Osteoklastenperimeter (%OCP, %): OCP/BS × 100.
  • III) Messungen und Berechnungen bezüglich Knochenbildung und Umkehr: (1) Einzel-Calcein-markierter Perimeter (SLS, mm): Gesamtlänge von trabekulärem Perimeter, markiert mit einer Calceinmarkierung. (2) Doppel-Calcein-markierter Perimeter (DLS, mm): Gesamtlänge von trabekulärem Perimeter, markiert mit zwei Calceinmarkierungen. (3) Intermarkierte Breite (ILW, μm): mittlerer Abstand zwischen zwei Calceinmarkierungen. (4) Prozent mineralisierendes Perimeter (PMS, %): (SLS/2 + DLS)/BS × 100. (5) Mineralappositionsrate (MAR, μm/Tag): ILW/Markierungsintervall. (6) Knochenbildungsrate/Oberflächenbezug (BFR/BS, μm2/d/μm) : (SLS/2 + DLS) × MAR/BS. (7) Knochen-Turnover-Rate (BRT, %/y) : (SLS/2 + DLS) × MAR/BV × 100.
  • Corticale Knochenhistomorphometrie: A Bioquant OS/2 Histomorphometriesystem (R&M Biometrics, Inc., Nashville, TN) wird für die statischen und dynamischen histomorphometrischen Messungen von Schienbeinschaft-Corticalknochen verwendet. Ge samtgewebsfläche, Markhohlraumfläche, periostealer Perimeter, endocorticaler Perimeter, einzelmarkierter Perimeter, doppelmarkierter Perimeter und intermarkierte Breite von sowohl periostealer als auch endocorticaler Oberfläche werden gemessen und die Corticalknochenfläche (Gesamtgewebsfläche – Markhohlraumfläche), Prozent corticaler Knochenfläche (Corticalfläche/Gesamtgewebsfläche × 100), Prozent Markfläche (Markhohlraumfläche/Gesamtgewebsfläche × 100), Prozent periostealer und endocorticaler markierter Perimeter [(einzelmarkierter Perimeter/2 + doppelmarkierter Perimeter)/Gesamtperimeter × 100], Mineralappositionsrate (intermarkierte Breite/Intervalle) und Knochenbildungsrate [Mineralappositionsrate × [(einzelmarkierter Perimeter/2 + doppelmarkierter Perimeter)/Gesamtperimeter] werden berechnet.
  • Statistik
  • Die Statistik kann unter Verwendung des Softwarepakets StatView 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) berechnet werden. Der Varianzanalysentest (ANOVA), gefolgt von Fisher's PLSD (Stat View, Abacus Concepts Inc., 1918 Bonita Ave, Berkeley, CA 94704-1014) wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen Gruppen zu vergleichen.
  • Bestimmung von CAMP-Erhöhung in 293-S Zelllinien, die stabil rekombinante Human-EP4-Rezeptoren überexprimieren
  • cDNA, die vollständige offene Leseraster der Human-EP4-Rezeptoren wiedergeben, werden durch Umkehrtranskriptasepolymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonucleotidprimern, basierend auf veröffentlichten Sequenzen (1) und RNA aus primären humanen Lungenzellen (EP4) als Template, erzeugt. cDNA werden in die multiple Klonstelle von pcDNA3 (Invitrogen Corporation, 3985B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA 92121) geklont und verwendet, um 293-5 humane Embryonennierenzellen über Calciumphosphat-Coausfällung zu transfizieren. G418-resistente Kolonien werden ausgedehnt und auf spezifisches [3H]PGE2-Binden getestet. Transfizierte, die ho he Anteile von spezifischem [3H]PGE2-Binden zeigen, werden durch Scatchard-Analyse zum Bestimmen von Bmax und Kds für PGE2 weiter charakterisiert. Die Linien, ausgewählt für Verbindungsscreening, haben ungefähr 256400 Rezeptoren pro Zelle und einen Kd = 2,9 nM für PGE2 (EP4). Konstitutive Expression des Rezeptors in parenteralen 293-S-Zellen ist vernachlässigbar. Die Zellen werden in RPMI, ergänzt mit fötalem Rinderserum (10% am Ende) und G418 (700 μg/ml am Ende), gehalten.
  • CAMP-Reaktionen in den 293-S/EP4-Linien werden durch Abtrennen der Zellen aus Kulturkolben in 1 ml Ca++ und Mg++ Mangel-PBS durch heftiges Klopfen, Zugeben von serumfreiem RPMI zu einer Endkonzentration von 1 × 106 Zellen/ml und Zugeben von 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) zu einer Endkonzentration von 1 mM bestimmt. Ein Milliliter Zellsuspension wird sofort in aliquote Mengen in eine einzelne 2 ml-Schneckenbecher-Mikrozentrifuge gegeben und 10 Minuten unbedeckt bei 37°C, 5% CO2, 95% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die zu testende Verbindung wird dann zu Zellen bei Verdünnungen von 1 : 100 gegeben, sodass End-DMSO und Ethanolkonzentrationen 1% ist. Sofort nach Zugabe der Verbindung werden die Röhren bedeckt, durch Umkehren zweimal vermischt und bei 37°C 12 Minuten inkubiert. Die Proben werden dann durch Inkubation bei 100°C für 10 Minuten lysiert und sofort auf Eis für 5 Minuten gekühlt. Zelldebris wird durch Zentrifugierung bei 1000 × g für 5 Minuten pelletisiert und geklärte Lysate werden zu frischen Röhrchen überführt. cAMP-Konzentrationen werden unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren cAMP-Radioimmunoassaykits RIA (NEK-033, Du-Pont/NEN Research Products, 549 Albany St., Boston, MA 02118) nach Verdünnen geklärter Lysate 1 : 10 in cAMP-RIA-Assaypuffer (eingeschlossen in Kit) bestimmt. Typischerweise werden die Zellen mit 6–8 Konzentrationen der zu testenden Verbindung in 1-Logarithmus-Inkrementen behandelt. EC50-Berechnungen werden an einem Berechner unter Verwendung von linearer Regressionsanalyse an dem linearen Teil der Dosisreaktionskurven durchgeführt.
  • Literaturstellen
    • 1. Regan, J. W. Bailey, T. J. Pepperl, D. J. Pierce, K. L. Bogardus, A. M. Donello, J. E. Fairbairn, C. E. Kedzie, K. M. Woodward, D. F. und Gil, D. W. 1994 Cloning of a Novel Huamn Prostaglandin Receptor with Characteristics of the Pharmacologically Defined EP2 Subtype. Mol. Pharmacology 46: 213– 220.
  • Assay zum Binden an Prostaglandin-E2-Rezeptoren
  • Membranzubereitung: Alle Vorgänge werden bei 4°C ausgeführt. Transfizierte Zellen exprimierende Prostaglandin E2 Typ 1 Rezeptoren (EP1), Typ 2 (EP2), Typ 3 (EP3) oder Typ 4 (EP4) Rezeptoren werden geerntet und in 2 Millionen Zellen pro ml Puffer A [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM Pefablocpeptid, (Boehringer Mannheim Corp. Indianapolis, IN), 10 μM Phosphoramidonpeptid (Sigma, St. Louis, MO), 1 μM Pepstatin A Peptid (Sigma, St. Louis, MO), 10 μM Elastatinalpeptid (Sigma, St. Louis, MO), 100 μM Antipainpeptid (Sigma, St. Louis, MO)] suspendiert. Die Zellen werden durch Beschallung mit einem Branson-Sonifier (Modell #250, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) in 2 fünfzehn Sekunden Bursts lysiert. Unlysierte Zellen und Debris werden durch Zentrifugieren bei 100 × g für 10 min. entfernt. Pelletierte Membranen werden dann durch Zentrifugieren bei 45000 × g für 30 Minuten geerntet. Pelletisierte Membranen werden mit 3–10 mg Protein pro ml Puffer A resuspendiert, wobei die Proteinkonzentration durch das Verfahren von Bradford [Bradford, M., Anal. Biochem., 72, 248 (1976)] bestimmt wird. Resuspendierte Membranen werden dann bei –80°C bis zur Verwendung gefroren gelagert.
  • Bindungsassay: Wie vorstehend hergestellte gefrorene Membranen werden aufgetaut und auf 0,5 mg/ml (für Ratten EP2) oder 0,3 mg/ml (für Ratten EP4) in Puffer A vorstehend verdünnt. Wie vorstehend hergestellte gefrorene Membranen werden aufgetaut und auf 0,5 mg/ml (für Ratten EP2) oder 0,3 mg/ml (für Ratten EP4) in Puffer A vorstehend verdünnt. Ein Volumen der Membranpräparation wird mit 0,05 Volumen Testverbindung oder Puffer oder einem Volumen 3 nM 3H-Prostaglandin E2 (#TRK 431, Amersham, Arlington Heights, IL) in Puffer A vereinigt. Das Gemisch (205 μl Gesamtvolumen) wird 1 Stunde bei 25°C inkubiert. Die Membranen werden dann durch Filtration durch Typ GF/C-Glasfaserfilter (#1205-401, Wallac, Gaithersburg, MD) unter Verwendung eines Tomtec-Ernters (Model Mach II/96, Tomtec, Orange, CT) gewonnen. Die Membranen mit gebundenem 3H-Prostaglandin E2 werden durch das Filter gesammelt, während der Puffer und ungebundenes 3H-Prostaglandin E2 durch das Filter in den Abfall gelangt. Jede Probe wird dann 3-mal mit 3 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA gewaschen. Die Filter werden dann durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen getrocknet. Um die Menge an 3H-Prostaglandin, gebunden an Membranen, zu bestimmen, werden die getrockneten Filter in Kunststoffbeuteln mit Szintillationsflüssigkeit angeordnet und in einem LKB 1205-Betaplattenleser (Wallac, Gaithersburg, MD) gezählt. IC50s werden aus der Konzentration der erforderlichen Testverbindung um 50% des spezifisch gebundenen 3H-Prostaglandin E2 zu verdrängen, bestimmt.
  • 293S-Zellen, die entweder die Ratten-EP2- oder -EP4-Prostaglandin-E2-Rezeptoren exprimieren, werden gemäß den dem Fachmann bekannten Verfahren erzeugt. Typischerweise werden PCR (Polymerasekettenreaktions-) Primer entsprechend den 5'- und 3'-Enden des veröffentlichten Ganzlängen-Rezeptors gemäß gut bekannten vorstehend offenbarten Verfahren hergestellt und werden in einer RT-PCR-Reaktion unter Anwenden von Gesamt-RNA aus Rattenniere für sowohl EP2- als auch EP4-Rezeptoren verwendet.
  • Die die vollständige Länge (Ganzlänge) codierende Sequenz für den Ratten-EP2-Rezeptor wird, wie offenbart in Nemoto et al., Prostaglandins, 1997, 54, 713–725, hergestellt. Die vollständige Länge codierende Sequenz für den Ratten-EP4-Rezeptor wird, wie in Sando et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, 200, 1329–1333, offenbart, hergestellt. Diese vollständigen Längenrezeptoren werden verwendet, um 2935-Zellen, die EP2- und EP4-Rezeptoren exprimieren, herzustellen.
  • Die die vollständige Länge codierende Sequenz für den EP1-Rezeptor wird, wie in Funk et al., Journal of Biological Chemistry, 1993, 268, 26767–26772, offenbart, hergestellt. Die vollständige Länge codierende Sequenz für den EP2-Rezeptor wird, wie in Regan et al., Molecular Pharmacology, 1994, 46, 213–220, offenbart, hergestellt. Die die vollständige Länge codierende Sequenz für den EP3-Rezeptor wird, wie in Regan et al., British Journal of Pharmacology, 1994, 112, 377–385, offenbart, hergestellt. Die vollständige Länge codierende Sequenz für den EP4-Rezeptor wird, wie in Bastien, Journal of Biological Chemistry, 1994, 269, 11873–11877, offenbart, hergestellt. Diese Ganzlängenrezeptoren werden verwendet, um 293S-Zellen-Exprimieren der EP1-, EP2-, EP3- und EP4-Rezep-toren herzustellen.
  • 293S-Zellen, die entweder der humanen EP1-, EP2-, EP3- oder EP4-Prostaglandin-E2-Rezeptoren exprimieren, werden gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren erzeugt. Typischerweise werden PCR (Polymerasekettenreaktions-) Primer entsprechend den 5'- und 3'-Enden des veröffentlichten Ganzlängen-Rezeptors gemäß vorstehend offenbarten gut bekannten Verfahren hergestellt und werden in einer RT-PCR-Reaktion unter Verwendung der gesamten RNA aus Humanniere (für EP1), Humanlunge (für EP2), Humanlunge (für EP3) oder Humanlymphozyten (für EP4) als eine Quelle verwendet. PCR-Produkte werden durch das TA-Überhangverfahren in pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) geklont und die Identität des geklonten Rezeptors wird durch DNA-Sequenzieren bestätigt.
  • 293S-Zellen (Mayo, Dept. of Biochemistry, Northwestern Univ.) werden mit dem geklonten Rezeptor in pcDNA3 durch Elektroporation transfiziert. Stabile Zeltlinien, die den Rezeptor exprimieren, werden nach Auswahl von transfizierten Zellen mit G418 hergestellt.
  • Klonale Zelllinien, die die maximale Anzahl an Rezeptoren exprimieren, werden gemäß einem Gesamtzellen-3H-PGE2-Bindungsassay unter Verwendung von unmarkiertem PGE2 als einen Kompetitor ausgewählt.
  • FRAKTURHEILUNGSASSAYS ASSAY AUF DIE WIRKUNGEN VON FRAKTURHEILEN NACH SYSTEMISCHER VERABREICHUNG
  • Frakturtechnik: Sprage-Dawley-Ratten mit einem Alter von 3 Monaten werden mit Ketamin anästhetisiert. Eine 1 cm Incision wird an dem anteromedialen Aspekt des proximalen Teils von dem rechten Schienbein oder Oberschenkel ausgeführt. Das Nachstehende beschreibt die Schienbeinoperationstechnik. Die Incision wird durch den Knochen ausgeführt und ein 1 mm-Loch wird 4 mm proximal zu dem distalen Aspekt der Schienbeintuberosität 2 mm medial zu dem vorderen Rücken gebohrt. Intrameduläres Nageln wird mit einem 0,8 mm-Edelstahlrohr (maximale Last 36,3 N, maximale Steifigkeit 61,8 N/mm, getestet unter den gleichen Bedingungen wie die Knochen) ausgeführt. Kein Nachbohren des medulären Kanals wird ausgeführt. Eine standardisierte geschlossene Fraktur wird 2 mm oberhalb der tibiofibulären Verbindung durch Drei-Punkt-Binden unter Verwendung von speziell aufgebauten einstellbaren Pinzetten mit stumpfen Klemmbacken erzeugt. Um Weichgewebsschädigung zu minimieren, lässt man Vorsicht walten, um die Fraktur nicht zu verschieben. Die Haut wird mit Monofilament-Nylonschnüren verschlossen. Die Operation wird unter sterilen Bedingungen ausgeführt. Radiographien von allen Frakturen werden unmittelbar nach dem Nageln genommen und die Ratten mit Frakturen außerhalb des ausgewiesenen diaphysealen Bereichs oder mit verschobenen Nägeln werden ausgeschlossen. Die verbleibenden Tiere werden statistisch in die nachstehenden Gruppen mit 10–12 Tieren pro jeder Untergruppe pro Zeitpunkt zum Testen des Frakturheilens geteilt. Die erste Gruppe empfängt eine tägliche Gabe von Träger (Wasser : 100% Ethanol = 95 : 5) mit 1 ml/Ratte, während die andere eine täg liche Gabe von 0,01 bis 100 mg/kg/Tag der zu testenden Verbindung (1 mg/Ratte) für 10, 20, 40 und 80 Tage empfing.
  • Bei 10, 20, 40 und 80 Tagen werden 10–12 Ratten von jeder Gruppe mit Ketamin anästhetisiert und durch Exsanguination geopfert. Beide tibiofibulären Knochen werden durch Dissektion entfernt und das gesamte Weichgewebe abgestreift. Knochen von 5–6 Ratten von jeder Gruppe werden in 70%igem Ethanol für die histologische Analyse gelagert und Knochen von weiteren 5–6 Ratten von jeder Gruppe werden in gepufferter Ringer s-Lösung (+4°C, pH 7,4) für Radiographien und auszuführendes biomechanisches Testen gelagert.
  • Histologische Analyse: Diese Verfahren für histologische Analyse von gebrochenem Knochen wurden vorher von Mosekilde und Bak (The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A Histological Description. Bone, 14: 19–27, 1993) veröffentlicht. Die Frakturstelle wird 8 mm an jeder Seite der Frakturlinie gesägt, eingebettet in Methacrylsäuremethylester, undecalcifiziert und von Frontalschnitten an einem Reichert-Jung-Polycut-Mikrotour in 8 μm Dicke geschnitten. Masson-Trichrome-angefärbte mittelfrontale Schnitte (einschließlich beide Schienbeine und Oberschenkel) werden auf Visualisierung der zellulären und Gewebsreaktion auf Frakturheilen mit und ohne Behandlung verwendet. Siriusrot-gefärbte Schnitte werden verwendet, um die Charakteristika der Callusstruktur zu zeigen und um zwischen Knochengewebe und lamellarem Knochen an der Frakturstelle zu unterscheiden. Die nachstehenden Messungen werden ausgeführt: (1) Frakturspalt gemessen als der kürzeste Abstand zwischen den corticalen Knochenenden in der Fraktur, (2) Calluslänge und Callusdurchmesser, (3) Gesamtknochenvolumenfläche von Callus, (4) Knochengewebe pro Gewebsfläche in der Callusfläche, (5) fibröses Gewebe in dem Callus, und (6) Cartilagefläche in dem Callus.
  • Biomechanische Analyse: Die Verfahren zur biomechanischen Analyse wurden vorher von Bak und Andreassen (The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int 45: 292–297, 1989) veröffentlicht. Radiographien werden von allen Frakturen vor dem biomechanischen Test aufgenommen. Die mechanischen Eigenschaften der heilenden Frakturen werden durch ein destruktives Drei- oder Vier-Punkt-Biegeverfahren analysiert. Maximale Last, Steifigkeit, Energie bei maximaler Last, Deflexion bei maximaler Last und maximale Belastung werden bestimmt.
  • ASSAY FÜR DIE WIRKUNGEN AUF FRAKTURHEILEN NACH LOKALER VERRBREICHUNG
  • Frakturtechnik: Weibliche oder männliche Beaglehunde mit einem Alter von ungefähr 2 Jahren werden unter Anästhesie in der Studie verwendet. Transverse radiale Frakturen werden durch langsames kontinuierliches Belasten bei Drei-Punkt-Binden, wie von Lenehan et al. (Lenehan, T. M.; Balligand, M.; Nunamaker, D. M.; Wood, F. E.: Effects of EHDP on Fracture Healing in Dogs. J Orthop Res 3: 499–507; 1985) beschrieben, erzeugt. Ein Draht wird durch die Frakturstelle geschoben, um vollständige anatomische Unterbrechung des Knochens zu sichern. Anschließend wird lokale Abgabe von Prostaglandinagonisten an der Frakturstelle durch langsame Freisetzung von Verbindung, abgegeben durch langsam freisetzende Pellets oder durch Verabreichung der Verbindungen in einer geeigneten Formulierung, wie einer Paste, Gellösung oder Suspension, für 10, 15 oder 20 Wochen erreicht.
  • Histologische Analyse: Die Verfahren zur histologischen Analyse von Frakturknochen wurden vorher von Peter et al. (Peter, C. P.; Cook, W. O.; Nunamaker D. M.; Provost, M. T.; Seedor, J. G.; Rodan, G. A. Effects of alendronate on fracture healing and bone remodeling in dogs. J. Orthop. Res. 14: 74– 70, 1996) und Mosekilde und Bak (The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A Histological Description. Bone, 14: 19–27, 1993) veröffentlicht. Nach Opfern wurde die Frakturstelle 3 cm an jeder Stelle der Frakturlinie gesägt, in undecalcifizierten Methacrylsäuremethylester eingebettet und an einem Reichert-Jung-Polycut-Mikrotour in 8 μm dicke frontale Schnitte geschnitten. Masson-Trichrome-angefärbten mittelfrontalen Schnitte (einschließlich beide Schienbeine und Oberschenkel) werden zur Visualisierung der zellulären und Gewebsreaktion auf Frakturheilung mit und ohne Behandlung verwendet. Siriusrot-angefärbte Schnitte werden verwendet, um die Eigenschaften der Callusstruktur zu zeigen und um zwischen Gewebeknochen und lamellaren Knochen an der Frakturstelle zu unterscheiden. Die nachstehenden Messungen werden ausgeführt: (1) Frakturspalt – gemessen an dem kürzesten Abstand zwischen den corticalen Knochenenden in der Fraktur, (2) Calluslänge und Callusdurchmesser, (3) Gesamtknochenvolumenfläche von Callus, (4) Knochengewebe pro Gewebefläche in der Callusfläche, (5) fibröses Gewebe in dem Callus, (6) Cartilagefläche in dem Callus.
  • Biomechanische Analyse: Die Verfahren zur biomechanischen Analyse wurden vorher von Bak und Andreassen (The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int 45: 292–297, 1989) und Peter et al. (Peter, C. P.; Cook, W. O.; Nunamaker, D. M.; Provost, M. T.; Seedor, J. G.; Rodan, G. A. Effects of Alendronate On Fracture Healing And Bond Remodeling in Dogs. J. Orthop. Res. 14: 74–70, 1996) veröffentlicht. Kurz werden Radiographen von allen Frakturen vor dem biomechanischen Test genommen. Die mechanischen Eigenschaften der heilenden Frakturen werden durch destruktive Drei- oder Vier-Punkt-Biegeverfahren analysiert. Maximale Last, Steifigkeit, Energie bei maximaler Last, Deflexion bei maximaler Last und maximale Belastung werden bestimmt.
  • Verabreichung von EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren kann über jede Art, die den EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten systemisch und/oder lokal (beispielsweise an der Stelle der Knochenfraktur, Osteo tomie oder orthopädische Operation) freisetzt, sein. Diese Verfahren schließen orale Wege, parenterale, intraduodenale Wege usw. sein. Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen oral verabreicht, jedoch parenterale Verabreichung (beispielsweise intravenös, intramuskulär, transdermal, subcutan, rektal oder intramedulär) können beispielsweise, wenn orale Verabreichung für das Ziel unpassend ist, oder wenn der Patient nicht in der Lage ist, das Arzneimittel zu schlucken, angewendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren werden für die Behandlung und Förderung des Heilens von Knochenfrakturen und Osteotomien durch die lokale Applikation (beispielsweise die Stellen der Knochenfrakturen von Osteotomien) von EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten verwendet. Die erfindungsgemäßen EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten werden auf die Stellen der Knochenfrakturen oder Osteotomien beispielsweise entweder durch Injektion der Verbindungen in einem geeigneten Lösungsmittel (beispielsweise ein öliges Lösungsmittel, wie Arachisöl) zu der Cartilage-Wachstumsplatte oder in Fällen von offener Chirurgie durch lokale Applikation darauf der Verbindung in einem geeigneten Vehikel, Träger oder Verdünnungsmittel, wie Knochenwachs, entmineralisiertem Knochenpulver, polymeren Knochenzementen, Knochenversiegelungsmitteln usw., verabreicht. Alternativ kann lokale Verabreichung durch Auftragen einer Lösung oder Dispersion der Verbindung in einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel auf die Oberfläche von oder Einarbeiten derselben in feste oder halbfeste Implantate, die üblicherweise in der orthopädischen Chirurgie angewendet werden, wie Dacrongewebe, Gelschaum und Kielknochen oder Prothesen, erreicht.
  • In jedem Fall werden die Menge und der Zeitpunkt für verabreichte Verbindungen natürlich von dem zu behandelnden Patienten, der Schwere des Befalls, der Art der Verabreichung und der Einschätzung des behandelnden Arztes abhängen. Somit sind aufgrund der Variabilität von Patient zu Patient die hierin gegebenen Dosierungen eine Richtlinie und der Arzt kann Dosen der Arzneimittelverbindung zum Erreichen der Behandlung (beispielsweise Knochenmassenvermehrung) einstellen, die der Arzt als für den Patienten geeignet ansieht. Beim Betrachten des erwünschten Behandlungsgrades muss der Arzt eine Vielzahl von Faktoren, wie Knochenmassenausgangsniveau, Alter des Patienten, Vorliegen von vorher vorliegenden Erkrankungen sowie Vorliegen von anderen Erkrankungen (beispielsweise cardiovaskuläre Erkrankung), ausgleichen.
  • Im Allgemeinen wird eine Menge von EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten verwendet, die ausreichend ist, um die Knochenmasse auf ein Niveau zu erhöhen, welches oberhalb des Knochenfrakturschwellenwerts liegt (wie im Einzelnen von der vorher hierin zitierten Studie der Weltgesundheitsorganisation angeführt).
  • Die in den Verfahren dieser Erfindung verwendeten EP4-Rezeptor-selektiven Agonistenverbindungen werden im Allgemeinen in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel oder Verdünnungsmittel umfasst. Somit kann der EP4-Rezeptor-selektive Agonist einzeln in jeder herkömmlichen oralen, intranasalen, parenteralen, rektalen oder transdermalen Dosierungsform verabreicht werden.
  • Zur oralen Verabreichung kann die pharmazeutische Zusammensetzung die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern und dergleichen annehmen. Tabletten, die verschiedene Exzipienten, wie Natriumcitrat, Calciumcarbonat und Calciumphosphat, enthalten, werden zusammen mit verschiedenen Sprengmitteln, wie Stärke und vorzugsweise Kartoffel- oder Tapiocastärke, und bestimmten Komplexsilikaten, zusammen mit Bindemitteln, wie Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatine und Acacia, angewendet. Zusätzlich sind häufig Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talkum, für Tablettierungszwecke sehr verwendbar. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs werden auch als Füllstoffe in weich- und hartgefüllten Gelatinekapseln angewen det; wobei bevorzugte Materialien in diesem Zusammenhang auch Lactose oder Milchzucker sowie Polyethylenglycole mit hohem Molekulargewicht einschließen. Wenn wässerige Suspensionen und/oder Elixiere zur oralen Verabreichung erwünscht sind, können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mit verschiedenen Süßungsmitteln, Geschmacksmitteln, färbenden Mitteln, emulgierenden Mitteln und/oder suspendierenden Mitteln sowie als solche Verdünnungsmittel, wie Wasser, Ethanol, Propylenglycol, Glycerin und verschiedenen ähnlichen Kombinationen davon, kombiniert werden.
  • Für die Zwecke der parenteralen Verabreichung können Lösungen in Sesam- oder Erdnussöl oder in wässerigem Propylenglycol angewendet werden, sowie sterile wässerige Lösungen der entsprechenden in Wasser löslichen Salze. Solche wässerigen Lösungen können, falls erforderlich, geeignet gepuffert sein und das flüssige Verdünnungsmittel zuerst mit ausreichend Salzlösung oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese wässerigen Lösungen sind besonders für intravenöse, intramuskuläre, subcutane und intraperitoneale Injektionszwecke geeignet. In diesem Zusammenhang sind die angewendeten sterilen, wässerigen Medien alle durch dem Fachmann gut bekannte Standardtechniken leicht erhältlich.
  • Zur transdermalen (beispielsweise örtlichen) Verabreichung werden verdünnte sterile, wässerige oder teilweise wässerige Lösungen (gewöhnlich in etwa 0,1% bis 5% Konzentration), ansonsten ähnlich zu den vorstehenden parenteralen Lösungen, hergestellt.
  • Verfahren zur Herstellung verschiedener pharmazeutischer Zusammensetzungen mit einer bestimmten Menge an Wirkstoff sind bekannt oder werden im Lichte dieser Offenbarung dem Fachmann deutlich. Beispielsweise siehe für Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing, Company, Easton, Pa., 19. Ausgabe (1995).
  • Untersuchungsprotokoll
  • Der Zweck dieser Studie ist es, zu bestimmen, ob ein EP4-Rezeptor-selektiver Agonist und insbesondere 7-(2-(3-Hydroxy-4-phenyl-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure die Knochenmasse in einem OVX-Rattenmodell aufbauen kann.
  • Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden mit einem Alter von 3,5 Monaten ovariorektomisiert (OVX). Zehn Monate nach OVX wurden die Ratten mit subcutaner Injektion mit Träger oder 7-(2-(3-Hydroxy-4-phenyl-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure bei 30 mg/kg/Tag für 28 Tage behandelt. Die Ratten wurden autopsiert. Der rechte Oberschenkel von jeder Ratte wurde bei der Autopsie entfernt und unter Verwendung von dualer Energie-Röntgenstrahl-Absorptiometrie (DEXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA), ausgestattet mit "Regional High Resolution Scan" Software (Hologic Inc., Waltham, MA), gescannt. Die Scangebietsgröße war 5,08 × 1,902 cm, Auftrennung ist 0,0254 × 0,0127 cm und die Scangeschwindigkeit war 7,25 mm/Sekunde. Die fernoralen Scanbilder wurden analysiert. Knochenmineralgehalt (BMC) und Knochenmineraldichte (BMD) des gesamten Oberschenkels (WF), distale fernorale Metaphyse (DFM) und fernoraler Schaft (FS) wurden gemäß dem Verfahren, beschrieben in H. Z. Ke et al., Droloxifene, a New Estrogen Antagonist/Agonist, Prevents Bone Loss in Ovariectomized Rats, ENDOCRINOLOGY 136; 2435–2441, 1995, bestimmt.
  • Untersuchungsergebnisse und Erörterung
  • Verglichen mit OVX-Ratten, behandelt mit Träger, zeigten OVX-Ratten, behandelt mit 7-(2-(3-Hydroxy-4-phenylbutyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure, gesamtfemorale BMC, erhöht um 17%, gesamtfemorale BMD, erhöht um 13%, distale fernorale BMC, erhöht um 8%, distale fernorale BMD, erhöht um 8%, fernoraler Schaft BMC, erhöht um 20% und fernoraler Schaft BMD, erhöht um 18%. Keine PGE2-ähnlichen Nebenwirkungen wurden bei Ratten, behandelt mit 7-(2-(3-Hydroxy-4-phenyl-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure, beobachtet.
  • Diese Daten zeigen, dass 7-(2-(3-Hydroxy-4-phenylbutyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure, ein EP4-Rezeptorselektiver PGE2-Agonist, Knochenbildung stimuliert und Knochen in ausgebildet osteopenischen OVX-Ratten wieder aufbaut.
  • Allgemeine Versuchsverfahren
  • NMR-Spektren wurden an einem Varian Unity 400 Spektrometer (Varian Co., Palo Alto, Kalifornien) bei etwa 23°C bei 400 MHz für Protonenkerne aufgezeichnet. Chemische Verschiebungen sind ausgedrückt in parts per million. Die Peakformen werden wie nachstehend bezeichnet: s, Singulett; d, Dublett; t, Triplett; q, Quartett; m, Multiplett; bs-breites Singulett. Atmosphärendruck chemische Ionisationsmassenspektren (APCI) wurden an einem Fisons Plattform II Spektrometer erhalten. Wenn die Intensität von Chlor oder Brom enthaltenden Ionen beschrieben werden, wurde das erwartete Intensitätsverhältnis beobachtet (ungefähr 3 : 1 für 25Cl/37Cl enthaltende Ionen) und 1 : 1 für 79Br/81Br enthaltende Ionen) und nur die Intensität für das niedrigere Massenion wird angegeben.
  • Mitteldruck-Chromatographie wurde unter Verwendung eines Biotage-Reinigungssystems (Biotage, Dyax Corporation, Charlottesville, Virginia) unter Stickstoffdruck ausgeführt. Flashchromatographie wurde entweder an Baker-Kieselgel (40 m) (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) oder Kieselgel 60 (EM Sciences, Gibbstown, N. J.) in Glassäulen unter niedrigem Stickstoffdruck durchgeführt. Radialchromatographie wurde unter Verwendung eines Chromatotron (Modell 7924T, Harrison Research) durchgeführt. Präparative Chromatographie wurde unter Verwendung von Analtech Uniplates Kieselgel GF (20 × 20 cm) (Analtech, Inc. Newark, DE) durchgeführt. Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF) und Dichlormethan (CH2Cl2), die als Reaktionslösungsmittel verwendet wurden, waren die wasserfreie Qualität, die von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin) bezogen wurde. Der Begriff "auf konzentriert" bezieht sich auf das Entfernen von Lösungsmittel bei Wasser strahldruck an einem Rotationsverdampfer. Die Abkürzung "h" steht für Stunden. Der Begriff "TBAF" bezieht sich auf Tetrabutylammoniumfluorid. Der Begriff "DMAP" bezieht sich auf Dimethylaminopyridin. Die Begriffe "Dichlormethan" und "Methylenchlorid" sind synonym und werden in dieser Beschreibung und in den Beispielen und Herstellungen untereinander austauschbar verwendet.
  • Beispiel 1 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure
    Figure 00300001
  • Schritt A: 7-{2R-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-oxo-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester. Zu einer Lösung von [3-(3-Chlor-phenyl)-2-oxo-propyl]-phosphonsäuredimethylester (2, 66 g, 9, 63 mMol) in THF (35 ml) bei 0°C wurde NaH (60% auf das Gewicht in Öl, 426 mg, 10,7 mMol) portionsweise gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0°C gekühlt und eine Lösung von 7-(2R-Formyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäureethylester (zusammengefasst 10,6 mMol, hergestellt gemäß dem Verfahren, beschrieben in Herstellung 7, jedoch unter Verwendung verschiedener Mengen Reagenzien) in THF wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 18 h gerührt. AcOH wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch mit EtOAc verdünnt. Die organische Lösung wurde nacheinander mit gesättigter NaHCO3-Lösung (2x), Wasser (1x) und Salzlösung (1x) gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Der Rückstand wurde durch Mitteldruck-Chromatographie durch Elution mit 15% Aceton in Toluol gereinigt unter Bereitstellung von 7-{2R-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-oxo-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (2,26 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,27–7,15 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 6,66 (dd, 1H), 6,20 (d, 1H), 4,17 (m, 1H), 4,11 (q, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,55 (m, 1H), 2,72 (m, 1H), 2,46–2,23 (m, 5H), 1,79 (m, 1H), 1,58 (m, 2H), 1,47–1,20 (m, 9H); MS 420,2 (M + 1), 418,2 (M – 1).
  • Schritt B: 7-{2R-[4-(3-Chlor-phenyl)-3S-hydroxy-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester. Zu einer Lösung von 7-{2R-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-oxo-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (2,1 g, 5,0 mMol) in wasserfreiem CH2Cl2 (200 ml) wurde (R)-2-Methyl-CBS-oxazaborolidin (1 M in Toluol, 5 ml, 5 mMol) gegeben und die Lösung auf –45°C gekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten gerührt und Catecholboran (1 M in THF, 15 ml, 15 mMol) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 18 h bei –45°C gerührt. Wässerige HCl (1 N, 100 ml) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Die saure wässerige Schicht wurde abgetrennt und die organische Lösung wurde mit eiskalter 1 N NaOH (2x), gefolgt von Salzlösung (1x), gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und aufkonzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 EtOAc : Hexanen bis 80% EtOAc in Hexanen) lieferte 7-{2R-[4-(3-Chlor-phenyl)-3S-hydroxy-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (800 mg) als ein geeignetes 6 : 1-Gemisch von 3S : 3R-Alkoholdiastereomeren laut 1H-NMR. 1H-NMR (CDCl3) δ 7,23–7,17 (m, 3H), 7,06 (m, 1H), 5,67 (dd, 1H), 5,46 (dd, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,08 (q, 2H), 4,00 (m, 1H), 3,44 (m, 1H), 2,80 (m, 2H), 2,67 (m, 1H), 2,41–2,12 (m, 5H), 1,70–1,20 (m, 13H); MS 422,3 (M + 1).
  • Schritt C: 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxybutyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester. Zu einer Lösung von 7-{2R-[4-(3-Chlor-phenyl)-3S-hydroxy-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (800 mg, 1,90 mMol) in EtOH (50 ml) wurde 10%iges Palladium auf Kohlenstoff (80 mg) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde an einem Parr-Schüttler bei 45 psi für 4,5 h hydriert. Der Katalysator wur de über Filtration durch Celite® mit Hilfe von EtOH entfernt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc bis 4 : 1 EtOAc : Hexane) lieferte 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (625 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,27–7,21 (m, 3H), 7,09 (m, 1H), 4,10 (m, 2H), 3,84 (m, 1H), 3,61 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,78 (dd, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,47–2,25 (m, 4H), 2,12 (m, 1H), 1,92–1,22 (m, 17H); MS 424,3 (M + 1).
  • Schritt D: 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxybutyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure. Zu einer Lösung von 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (595 mg, 1,40 mMol) in EtOH (25 ml) wurde 2 N NaOH (6 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt und wurde im Vakuum auf etwa ¾ des Ursprungsvolumens aufkonzentriert. Wässerige 1 N HCl wurde zugegeben, um einen pH-Wert von etwa 2 zu erhalten. Die wässerige Lösung wurde mit Methylenchlorid (3x) gewaschen. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, gefolgt von Salzlösung, gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und aufkonzentriert unter Bereitstellung der Titelverbindung von Beispiel 1 (500 mg). 1H (CDCl3) δ 7,26–7,18 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 3,84 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,77 (dd, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,43–2,28 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,66–1,22 (m, 13H); MS 396,2 (M + 1), 394,2 (M – 1).
  • Beispiel 2 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure
    Figure 00320001
  • Schritt A: 7-{2-Oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluormethylphenyl)-but-1-enyl]-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt A, beschriebenen Verfahren wurde das Anion, abgeleitet von [2-Oxo-3-(3-trifluormethylphenyl)-propyl]-phosphonsäuredimethylester (4,16 g, 13,40 mMol) und NaH (60% in Öl, 590 mg, 14,7 mMol), mit 7-(2R-Formyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäureethylester (zusammengefasst 14,74 mMol) innerhalb 24 h umgesetzt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (Lösungsmittelgradient 20% EtOAc in Hexanen bis EtOAc) lieferte 7-{2-Oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-but-1-enyl]-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (4,29 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,52 (d, 1H), 7,44 (m, 2H), 7,37 (d, 1H), 6,67 (dd, 1H), 6,22 (d, 1H), 4,80 (m, 1H), 4,08 (q, 2H), 3,90 (s, 2H), 3,54 (m, 1H), 2,70 (m, 1H), 2,37 (m, 2H), 2,24 (m, 3H), 1,78 (m, 1H), 1,56 (m, 2H), 1,44– 1,20 (m, 9H); MS 454,2 (M + 1), 452,2 (M – 1).
  • Schritt B: 7-{2R-[3S-Hydroxy-4-(3-trifluormethylphenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester. Zu einer Lösung von 7-{2-Oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-but-1-enyl]-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (1,5 g, 3,31 mMol) und (R)-2-Methyl-CBS-oxazaborolidin (1 M in Toluol, 0,5 ml, 0,5 mMol) in CH2Cl2 (100 ml) wurde tropfenweise bei –45°C Catecholboran (1 M in THF, 9,9 ml, 9,9 mMol) gegeben. Die Lösung wurde 24 h bei –45°C gerührt und 1 N HCl wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und die Schichten wurden getrennt. Die wässerige Lösung wurde mit CH2Cl2 (2x) gewaschen und die vereinigten organischen Schichten wurden nacheinander mit eiskalter 0,5 N NaOH und Salzlösung (zweimal) gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und aufkonzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (50% EtOAc in Hexanen bis 60% EtOAc in Hexanen bis 80% EtOAc in Hexanen bis EtOAc bis 5% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-{2R-[3S-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (1,23 g) als ein ge eignetes 5,5 : 1-Gemisch von 3S : 3R-Alkoholdiastereomeren laut HPLC-Analyse. 1H NMR (CDCl3) δ 7,51–7,35 (m, 4H), 5,72 (dd, 1H), 5,50 (dd, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,09 (q, 2H), 4,01 (m, 1H), 3,44 (m, 1H), 2,90 (d, 2H), 2,71 (m, 1H), 2,37–2,12 (m, 5H), 1,70–1,21 (m, 13H); MS 456,3 (M + 1), 454,3 (M – 1).
  • Schritt C: 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethylphenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester. Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt C, beschriebenen Verfahren wurde eine Lösung von 7-{2R-[3S-Hydroxy-4-(3-trifluormethylphenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (1,18 g, 2,59 mMol) in EtOH (50 ml) in Gegenwart von 10% Palladium auf Kohlenstoff (120 mg) bei 40–45 psi an einem Parr-Schüttler für 24 h hydriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (50% EtOAc in Hexanen bis EtOAc bis 1% McOH in CH2Cl2 bis 3% McOH in CH2Cl2 bis 5% McOH in CH2Cl2 bis 10% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (1,08 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,51–7,39 (m, 4H), 4,09 (q, 2H), 3,86 (m, 1H), 3,60 (m, 2H), 2,89 (m, 2H), 2,76 (m, 1H), 2,33 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 1,68–1,21 (m, 16H).
  • Schritt D: 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethylphenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure. Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt D, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (1,93 g, 4,22 mMol) mit 6 N NaOH (26 ml) in EtOH (52 ml) innerhalb 24 h hydrolysiert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (EtOAc bis 1% McOH in CH2Cl2 bis 3% McOH in CH2Cl2 bis 5% McOH in CH2Cl2 bis 10% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-{2S- [3R-Hydroxy-4- (3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure (1,66 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,51–7,39 (m, 4H), 3,88 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,84 (m, 3H), 2,34 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 1,67–1,26 (m, 13H); MS 430,4 (M + 1).
  • Schritt E: Natriumsalz von 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure. Zu einer Lösung von 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure (1,66 g, 3,87 mMol) in EtOH (16 ml) wurde NaHCO3 (325 mg, 3,87 mMol) in Wasser (3 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h gerührt und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit CH2Cl2 (3x) azeotrop behandelt, um das Natriumsalz der Titelverbindung von Beispiel 2 (1,698 g) bereitzustellen. 1H NMR (CD3OD) δ 7,48 (m, 4H), 3,80 (m, 1H), 3,69 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,81 (m, 2H), 2,32 (m, 2H), 2,13 (m, 3H), 1,81 (m, 1H), 1,69–1,26 (m, 13H); MS 430,3 (M – Na + 1), 428,2 (M – Na – 1).
  • Beispiel 3 5S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on
    Figure 00350001
  • Schritt A: 7-{2R-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-oxo-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt A, beschriebenen Verfahren wurde das Anion, abgeleitet von [3-(3-Chlor-phenyl)-2-oxo-propyl]-phosphonsäuredimethylester (3,35 g, 12,12 mMol) und NaH (60% in Öl, 533 mg, 13,3 mMol) mit 7-(2R-Formyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptannitril (zusammengefasst 13,3 mMol) innerhalb 18 h umgesetzt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (20% EtOAc in Hexanen bis 80% EtOAc in Hexanen) lieferte 7-{2R-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-oxo-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (1,52 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,24 (m, 2H), 7,17 (s, 1H), 7,06 (m, 1H), 6,64 (dd, 1H), 6,20 (d, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,80 (s, 2H), 3,50 (m, 1H), 2,72 (m, 1H), 2,46–2,20 (m, 5H), 1,78 (m, 1H), 1,59 (m, 2H), 1,40 (m, 4H), 1,24 (m, 2H).
  • Schritt B: 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-oxo-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt C, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2R-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-oxo-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (860 mg, 2,31 mMol) in McOH (40 ml) in Gegenwart von 10% Palladium auf Kohlenstoff (86 mg) für 1 h hydriert. Reinigung durch Radialchromatographie (Hexane bis 20% EtOAc in Hexanen bis 70% EtOAc in Hexanen) lieferte 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-oxo-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (730 mg).
  • Schritt C: 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Zu einer Lösung von 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-oxo-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (730 mg, 1,87 mMol) in McOH (30 ml) wurde bei 0°C NaBH4 (35 mg, 0,921 mMol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 45 Minuten bei 0°C gerührt und Wasser wurde zugegeben. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt und die verbleibende wässerige Lösung wurde mit Methylenchlorid verdünnt. Die organische Lösung wurde mit Wasser, gefolgt von Salzlösung, gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und aufkonzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 3% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (730 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,22 (m, 3H), 7,07 (d, 1H), 3,80 (m, 1H), 3,57 (m, 2H), 2,88 (m, 1H), 2,78 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,31 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,65–1,22 (m, 14H); MS 377,3 (M + 1).
  • Schritt D: 5S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on. Eine Lösung von 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (730 mg, 1,94 mMol), Trimethylsilylazid (0,63 ml, 0,475 mMol) und Dibutylzinnoxid (96 mg, 3,87 mMol) in Toluol (30 ml) wurde 18 h unter Rückfluss erhitzt. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit CH2Cl2 verdünnt. Die organische Lösung wurde mit 1 N HCl, gefolgt von Salzlösung, gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Der Rückstand wurde durch Mitteldruck-Chromatographie durch Elution mit EtOAc bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 7% McOH in CH2Cl2 gereinigt unter Gewinnung des TMS-Komplexes. Der Rückstand wurde mit McOH verdünnt und 2 N HCl wurde zugegeben und die Lösung wurde 40 Minuten gerührt. Die Lösung wurde mit CH2Cl2 verdünnt und die organische Schicht wurde mit Wasser, gefolgt von Salzlösung, gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Der Rückstand wurde durch Mitteldruck-Chromatographie durch Elution mit EtOAc bis 7% McOH in CH2Cl2 gereinigt unter Bereitstellung von 5S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on (521 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,23 (m, 3H), 7,09 (d, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 3,53 (m, 1H), 2,96 (m, 3H), 2,81 (m, 1H), 2,70 (m, 1H), 2,44 (m, 2H), 2,18 (m, 1H), 1,88–1,27 (m, 14H); MS 420,2 (M + 1), 418,3 (M – 1).
  • Beispiel 4 5S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on
    Figure 00370001
  • Schritt A: 7-{2-Oxo-SR-[3-oxo-4-(3-trifluormethylphenyl)-but-1-enyl]-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt A, beschriebenen Verfahren wurde das Anion, abgeleitet von [2-Oxo-3-(3-trifluormethyl-phenyl)-propyl]-phosphonsäuredimethylester (2,68 g, 8,64 mMol) und NaH (60% in Öl, 400 mg, 10 mMol) mit 7-(2R-Formyl-5-oxo- pyrrolidin-1-yl)-heptannitril (zusammengefasst 10 mMol) innerhalb 18 h umgesetzt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (30% EtOAc in Hexanen bis 80% EtOAc in Hexanen) lieferte 7-{2-Oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-but-1-enyl]-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (1,2 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,52 (m, 1H), 7,45 (m, 2H), 7,37 (m, 1H), 6,67 (dd, 1H), 6,23 (d, 1H), 4,18 (m, 1H), 3,90 (s, 2H), 3,53 (m, 1H), 2,73 (m, 1H), 2,45–2,23 (m, 5H), 1,79 (m, 1H), 1,60 (m, 2H), 1,41 (m, 4H), 1,24 (m, 2H); MS 407,2 (M + 1), 405,3 (M – 1).
  • Schritt B: 7-{2R-[3S-Hydroxy-4-(3-trifluormethylphenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Zu einer Lösung von 7-{2-Oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-but-1-enyl]-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (1,14 g, 2,81 mMol) und (R)-2-Methyl-CBS-oxazaborolidin (1 M in Toluol, 0,42 ml, 0,42 mMol) in CH2Cl2 (112 ml) wurde tropfenweise bei –45°C Catecholboran (1 M in THF, 8,4 ml, 8,4 mMol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 18 h bei –45°C gerührt und 1 N HCl wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und die Schichten wurden getrennt. Die organische Lösung wurde mit eiskalter 1 N NaOH (3-mal) gewaschen. Die organische Lösung wurde nacheinander mit 1 N HCl, Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und aufkonzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc bis 80% EtOAc in Hexanen) lieferte 7-{2R-[3S-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (820 mg) als ein ungefähres 2,5 : 1-Verhältnis von 3S : 3R-Alkoholdiastereomeren laut 1H NMR. 1H NMR (CDCl3) δ 7,51–7,38 (m, 4H), 5,72 (dd, 1H), 5,49 (dd, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,02 (m, 1H), 3,47 (m, 1H), 2,90 (m, 2H), 2,71 (m, 1H), 2,34 (m, 4H), 2,18 (m, 1H), 1,66 (m, 4H), 1,44 (m, 4H), 1,27 (m, 2H); MS 409, 2 (M + 1).
  • Schritt C: 7-e2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethylphenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt C, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2R-[3S-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (810 mg) in McOH (40 ml) in Gegenwart von 10% Palladium auf Kohlenstoff (100 mg) bei 50 psi für 18 h in einem Parr-Schüttler hydriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 3% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (720 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,44 (m, 4H), 3,84 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,88 (m, 2H), 2,73 (m, 1H), 2,32 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,65–1,37 (m, 11H), 1,30 (m, 2H); MS 411,2 (M + 1).
  • Schritt D: 5S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethylphenyl)-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Beispiel 3, Schritt D, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (710 mg, 1,73 mMol) mit Azidotrimethylsilan (399 mg, 3,46 mMol) und Dibutylzinnoxid (43 mg, 1, 7 mMol) in Toluol (25 ml) erhitzt unter Rückfluss für 18 h umgesetzt. Die flüchtigen Stoffe wurden im vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit CH2Cl2 verdünnt. Die organische Lösung wurde nacheinander mit 1 N HCl (2-mal), Wasser (1-mal) und Salzlösung (1-mal) gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Mitteldruck-Chromatographie durch Elution mit EtOAc bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 8% McOH in CH2Cl2 gereinigt unter Bereitstellung von 5S- [3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on (450 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,44 (m, 4H), 3,87 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,01–2,73 (m, 5H), 2,42 (m, 2H), 2,16 (m, 1H), 1,86–1,23 (m, 14H); MS 454,4 (M + 1), 452,4 (M – 1).
  • Schritt E: Natriumsalz von SS-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-1)-hexyl]-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Beispiel 2, Schritt E, beschriebenen Verfahren lieferte Behandlung von 5S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on (428 mg, 0,944 mMol) mit NaHCO3 (79 mg, 0,94 mMol) das Natriumsalz (430 mg). 1H NMR (CD3OD) δ 7,48 (m, 4H), 3,79 (m, 1H), 3,67 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 2,86 (m, 5H), 2,30 (m, 2H), 2,12 (m, 1H), 1,84–1,27 (m, 14H); MS 454,4 (M – Na + 1), 452,4 (M – Na – 1).
  • Beispiel 5 5-[4-(4-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on
    Figure 00400001
  • Schritt A: 7-{2-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(4-fluor-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Eine Lösung von 5-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(4-fluor-phenyl)-butyl]-pyrrolidin-2-on (150 mg, 0,41 mMol) in DMF (5 ml) wurde zu NaH (60% auf das Gewicht in Öl, 16 mg, 0,41 mMol) in DMF (10 ml) gegeben. Nach 1,5 h wurde 7-Bromheptannitril (78 mg, 0,41 mMol) in DMF (5 ml) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 2,5 h bei 90°C gerührt. Wasser (20 ml) wurde zugegeben und die wässerige Lösung wurde mit EtOAc (4 × 15 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Lösungen wurden mit Wasser (2 × 15 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc) gereinigt, lieferte 7-{2-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(4-fluor-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (161 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,09 (m, 2H), 6,95 (m, 2H), 3,81 (m, 1H), 3,54 (m, 2H), 2,86 (m, 1H), 2,68 (m, 2H), 2,29 (m, 4H), 2,06 (m, 1H), 1,74–1,23 (m, 13H), 0,85 (s, 9H), 0,04 (m, 3H), 0,19 (m, 3H); MS 475,1 (M + 1).
  • Schritt B: 7-{2-[4-(4-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Zu einer Lösung von 7-{2-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(4-fluor-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (158 mg, 0,333 mMol) in THF (20 ml) wurde bei 0°C TBAF (1 M in THF, 0,50 ml, 0,50 mMol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt und gesättigte wässerige NaHCO3 wurde zugegeben. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt. Die verbleibende wässerige Lösung wurde mit CHCl3 (4 × 5 ml) gewaschen und die vereinigten organischen Lösungen wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Der Rückstand wurde durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc bis EtOAc) gereinigt unter Bereitstellung von 7-{2-[4-(4-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (82 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,15 (m, 2H), 7,00 (m, 2H), 3,77 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,89 (m, 1H), 2,79 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,34 (m, 4H), 2,12 (m, 1H), 1,68–1,24 (m, 14H); MS 361,2 (M + 1).
  • Schritt C: 5-[4-(4-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Beispiel 3, Schritt D, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2-[4-(4-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (71 mg, 0,197 mMol) mit Azidotrimethylsilan (45 mg, 0,394 mMol) und Dibutylzinnoxid (5 mg, 0,02 mMol) in Toluol (10 ml) erhitzt unter Rückfluss für 16 h umgesetzt. Zusätzliches Azidotrimethylsilan (200 mg) und Dibutylzinnoxid (50 mg) wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 5 h unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 N HCl auf pH = 2 (5 ml) angesäuert und die wässerige Lösung wurde mit EtOAc (4 × 10 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Lösungen wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (EtOAc bis 39 : 1 EtOAc : MeOH bis 19 : 1 EtOAc : MeOH) lieferte die Titelverbindung von Beispiel 5A (39 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,16 (m, 2H), 7,00 (m, 2H), 3,81 (m, 1H), 3,68 (m, 1H), 3,53 (m, 1H), 2,99 (m, 3H), 2,80 (m, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,47 (m, 2H), 2,20 (m, 1H), 1,88–1,22 (m, 14H); MS 404,3 (M + 1); 402,3 (M – 1).
  • Beispiel 6 5-(4-Biphenyl-3-yl-3-hydroxy-butyl)-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on
    Figure 00420001
  • Schritt A: 7-{2-[4-Biphenyl-3-yl-3-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Gemäß dem in Beispiel 5, Schritt A, beschriebenen Verfahren wurde das Anion, abgeleitet von 5-[4-Biphenyl-3-yl-3-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)-butyl]-pyrrolidin-2-on (239, 1 mg, 0, 564 mMol) und NaHMDS (1 M in THF, 0, 67 ml, 0, 67 mMol) mit 7-Bromheptannitril (118 mg, 0,620 mMol) bei 70°C 24 h alkyliert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (CH2Cl2 bis 1% McOH in CH2Cl2 bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 4% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-{2-[4-Biphenyl-3-yl-3-(tert-butyldimethyl-silanyloxy)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (187 mg). MS 533, 3 (M + 1).
  • Schritt B: 7-[2-(4-Biphenyl-3-yl-3-hydroxy-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl]-heptannitril. Gemäß dem in Beispiel 5, Schritt B, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2-[4-Biphenyl-3-yl-3-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (187 mg, 0,351 mMol) mit TBAF (1 M in THF, 0,53 ml, 0,53 mMol) von den Schutzgruppen befreit. Die Zugabe wurde bei 0°C ausgeführt und das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (CH2Cl2 bis 1% McOH in CH2Cl2 bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 6% McOH in CH2Cl2 bis 10% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-[2-(4-Biphenyl-3-yl-3-hydroxy-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl]-heptannitril (85 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,58 (m, 1H), 7,51–7,33 (m, 4H), 7,21–7,12 (m, 4H), 3,85 (m, 1H), 3,60 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,83–2,60 (m, 2H), 2,45–2,30 (m, 4H), 2,14 (m, 1H), 1,73–1,25 (m, 14H).
  • Schritt C: 5-(4-Biphenyl-3-yl-3-hydroxy-butyl)-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Beispiel 3, Schritt D, beschriebenen Verfahren wurde 7-[2-(4-Biphenyl-3-yl-3-hydroxy-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl]-heptannitril (109 mg, 0,260 mMol) mit Azidotrimethylsilan (0,69 ml, 0,52 mMol) und Dibutylzinnoxid (11 mg, 0,044 mMol) in Toluol (5,3 ml) erhitzt unter Rückfluss für 72 h umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und Wasser wurde zugegeben. Das Gemisch wurde mit 1 N HCl auf pH = 2 angesäuert und die wässerige Lösung wurde mit 5% McOH in CH2Cl2 (3-mal) gewaschen. Die vereinigten organischen Lösungen wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 4% McOH in CH2Cl2 bis 8% McOH in CH2Cl2) lieferte die Titelverbindung von Beispiel 6 (107 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,57 (m, 1H), 7,51–7,32 (m, 4H), 7,25–7,13 (m, 4H), 3,91 (m, 1H), 3,74–3,50 (m, 2H), 2,96 (m, 3H), 2,77 (m, 1H), 2,50 (m, 2H), 2,22 (m, 1H), 2,07 (m, 1H), 1,90–1,22 (m, 14H); MS 462,2 (M + 1), 460,1 (M – 1).
  • Beispiel 7 5-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on
    Figure 00430001
  • Schritt A: 7-{2-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(3-fluor-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Gemäß dem in Beispiel 5, Schritt A, beschriebenen Verfahren wurde das Anion, abgeleitet von 5-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(3-fluor-phenyl)-butyl]-pyrrolidin-2-on (250 mg, 0,684 mMol), und NaHMDS (1 M in THF, 0,80 ml, 0,80 mMol) mit 7-Bromheptannitril (142 mg, 0,748 mMol) bei 70°C für 72 h alkyliert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 5% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-{2-[3-tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(3-fluorphenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (261,7 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,26 (m, 1H), 6,92 (m, 3H), 3,89 (m, 1H), 3,59 (m, 2H), 2,89 (m, 1H), 2,75 (m, 2H), 2,36 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,72–1,26 (m, 13H), 0,89 (s, 9H), 0,09 (s, 6H); MS 475,3 (M + 1).
  • Schritt B: 7-{2-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Gemäß dem in Beispiel 5, Schritt B, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(3-fluor-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (261,7 mg, 0,551 mMol) mit TBAF (1 M in THF, 0,83 ml, 0,83 mMol) von den Schutzgruppen befreit. Die Zugabe wurde bei 0°C ausgeführt und das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (CH2Cl2 bis 1% McOH in CH2Cl2 bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 4% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-{2-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (141 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,32 (m, 1H), 6,98 (m, 3H), 3,86 (m, 1H), 3,64 (m, 2H), 2,99–2,80 (m, 2H), 2,71 (m, 1H), 2,38 (m, 4H), 2,16 (m, 1H), 1,74–1,29 (m, 14H); MS 361,3 (M + 1).
  • Schritt C: 5-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Beispiel 6, Schritt C, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-hep tannitril (141,3 mg, 0,392 mMol) mit Azidotrimethylsilan (0,210 ml, 1,57 mMol) und Dibutylzinnoxid (29 mg, 0,116 mMol) in Toluol (8 ml) erhitzt für 72 h unter Rückfluss umgesetzt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (CH2Cl2 bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 4% McOH in CH2Cl2 bis 6% McOH in CH2Cl2) lieferte die Titelverbindung von Beispiel 5C (101,5 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,26 (m, 1H), 6,94 (m, 3H), 3,87 (m, 1H), 3,70 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 2,98 (m, 3H), 2,78 (m, 2H), 2,48 (m, 2H), 2,20 (m, 1H), 1,89–1,24 (m, 14H); MS 404,2 (M + 1), 401,9 (M – 1).
  • Beispiel 8 5S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on
    Figure 00450001
  • Schritt A: 7-{2R-[3S-Hydroxy-4-(3-chlor-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril. Zu einer Lösung von 7-{2-Oxo-SR-[3-oxo-4-(3-chlor-phenyl)-but-1-enyl]-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (1,62 g, 4,34 mMol) in CH2Cl2 (200 ml) wurde bei –45°C (R)-2-Methyl-CBS-oxazaborolidin (1 M in Toluol, 1,3 ml, 1,3 mMol) gegeben. Nach Rühren für 20 Minuten wurde Catecholboran (1 M in THF, 13 ml, 13 mMol) tropfenweise zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 16 h bei –45°C gerührt und 1 N HCl wurde zugegeben. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen lassen und die Schichten wurden getrennt. Die organische Lösung wurde mit kalter 1 N NaOH (3-mal) gewaschen. Die organische Lösung wurde nacheinander mit 1 N HCl, Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc bis 20% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-{2R-[3S-Hydroxy-4-(3-chlor-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (536 mg) als 8,2 : 1-Gemisch von 3S : 2R-Alkohol laut HPLC. 1H NMR (CDCl3) δ 7,24–7,17 (m, 3H), 7,07 (m, 1H), 5,69 (dd, 1H), 5,46 (dd, 1H), 4, 40 (m, 1H), 4,01 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 2, 81 (m, 2H), 2,68 (m, 1H), 2,42–2,28 (m, 4H), 2,20 (m, 1H), 1,73–1,59 (m, 4H), 1,42 (m, 4H), 1,25 (m, 2H); MS 375 (M + 1).
  • Schritt B: 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxybutyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril Gemäß dem in Beispiel 4, Schritt C, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2R-[3S-Hydroxy-4-(3-chlor-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (536 mg) in EtOH (30 ml) in Gegenwart von 10%igem Palladium auf Kohlenstoff (60 mg) für 3,5 h hydriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc bis 20% McOH in CH2Cl2) lieferte 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (440 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,22 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 3,59 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,77 (dd, 1H), 2,66 (dd, 1H), 2,39–2,29 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,68–1,39 (m, 11H), 1,29 (m, 2H); MS 377,2 (M + 1).
  • Schritt C: S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on Gemäß dem in Beispiel 3, Schritt D, beschriebenen Verfahren wurde ein Gemisch von 7-{25-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptannitril (420 mg, 1,114 mMol), Trimethylsilylazid (257 mg, 2,23 mMol) und Dibutylzinnoxid (56 mg) in Toluol (30 ml) 16 h unter Rückfluss erhitzt. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in McOH gelöst und mit 3 N HCl 3 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser und CH2Cl2 verdünnt und die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit Wasser, gefolgt von Salzlösung, gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (EtOAc bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 7% McOH in CH2Cl2) lieferte 5S-[4-(3-Chlorphenyl)-3R-hydroxy-butyl)-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]- pyrrolidin-2-on (311 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,22 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 3,86 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 2,96 (m, 3H), 2,82–2,68 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,17 (m, 1H), 1,88–1,22 (m, 14H); MS 420,2 (M + 1), 418,3 (M – 1).
  • Beispiel 9 7-{2R-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure
    Figure 00470001
  • Schritt A: 7-{2-Oxo-5R-[3-oxo-4-(3-phenoxy-phenyl)-but-1-enyl]-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester. Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt A, beschriebenen Verfahren wurde das Anion, abgeleitet von [2-Oxo-3-(3-phenoxy-phenyl)-propyl]-phosphonsäuredimethylester (633 mg, 1,98 mMol), und NaH (60% in Öl, 70 mg, 1,74 mMol) mit 7-(2R-Formyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäureethylester (zusammengefasst 1,58 mMol) innerhalb 24 h umgesetzt. Mitteldruck-Chromatographie (EtOAc) lieferte 7-{2-Oxo-SR-[3-oxo-4-(3-phenoxy-phenyl)-but-1-enyl]-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (215 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,28 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 6,97 (m, 2H), 6,89 (m, 2H), 6,83 (m, 1H), 6,62 (dd, 1H), 6,19 (d, 1H), 4,13 (m, 1H), 4,08 (q, 2H), 3,79 (s, 2H), 3,51 (m, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,35 (m, 2H), 2,24 (m, 3H), 2,24 (m, 3H), 1,75 (m, 1H), 1,54 (m, 2H), 1,43–1,20 (m, 9H).
  • Schritt B: 7-{2R-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester. Gemäß dem in Beispiel 3, Schritt C, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2-Oxo-5R-[3-oxo-4-(3-phenoxy-phenyl)-but-1-enyl]-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (215 mg, 0,451 mMol) mit NaBH4 (17 mg, 0,45 mMol) in EtOH (3 ml) 4 h bei 0°C umgesetzt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (EtOAc) lieferte 7-{2R-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (167 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,33 (m, 2H), 7,25 (m, 1H), 7,10 (m, 1H), 6,99 (m, 2H), 6,93 (m, 1H), 6,86 (m, 2H), 5,72 (m, 1H), 5,45 (m, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,10 (q, 2H), 3,47 (m, 1H), 2,82 (m, 3H), 2,35 (m, 2H), 2,26 (t, 2H), 2,15 (m, 1H), 1,70–1,21 (m, 13H).
  • Schritt C: 7-{2R-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure. Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt D, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2R-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (29 mg, 0,060 mMol) mit 2 M NaOH in EtOH (4,0 ml) bei Raumtemperatur innerhalb 24 h hydrolysiert unter Bereitstellung der Titelverbindung (20 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,33–7,21 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 6,98–6,84 (m, 5H), 5,70 (m, 1H), 5,44 (m, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,00 (m, 1H), 3,44 (m, 1H), 2,85–2,51 (m, 3H), 2,32 (m, 4H), 2,14 (m, 1H), 1,68– 1,18 (m, 10H).
  • Beispiel 10 7-{2S-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure
    Figure 00480001
  • Schritt A: 7-{2S-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester. Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt C, beschriebenen Verfahren wurde ein Gemisch von 7-{2R-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-but-1-enyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (139 mg, 0,290 mMol), McOH (30 ml) und 10%igem Palladium auf Kohlenstoff (14 mg) an einem Parr-Schüttler bei 50 psi für 18 h hydriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1 : 1 Hexane : EtOAc) lieferte 7-{2S-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)- butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (86 mg). 1H (CDCl3) δ 7,35–7,24 (m, 3H), 7,10 (m, 1H), 6,99 (m, 2H), 6,93 (m, 1H), 6,87 (m, 2H), 4,09 (q, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,82 (m, 2H), 2,64 (m, 1H), 2,42-2,24 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,66–1,21 (m, 16H).
  • Schritt B: 7-{2S-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure. Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt D, beschriebenen Verfahren wurde 7-{2S-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäureethylester (86 mg, 1,79 mMol) mit 2 N NaOH in McOH (4 ml) innerhalb 18 h hydrolysiert unter Bereitstellung der Titelverbindung (62 mg). 1H NMR (CDCl3) δ 7,33–7,23 (m, 3H), 7,09 (m, 1H), 6,98 (m, 2H), 6,91 (m, 1H), 6,86 (m, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,56 (m, 2H), 2,88 (m, 1H), 2,77 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,38–2,28 (m, 4H), 2,09 (m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,64–1,21 (m, 13H).
  • Herstellung 1
  • 7-(2R-Hydroxymethyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptannitril
  • Schritt A: 7-[2R-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxymethyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptannitril. Zu einem Gemisch von NaH (60% in Öl, 3,836 g, 0,0959 mMol, gewaschen mit 25 ml DMF) in DMF (250 ml) wurde eine Lösung von 5R-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxymethyl)-pyrrolidin-2-on (Tetrahedron: Asymmetry, 1996, 7, 2113) (20,00 g, 87,19 mMol) in DMF (50 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt und eine Lösung von 7-Bromheptannitril (16,574 g, 87,19 mMol) in DMF (50 ml) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 90°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt und Wasser (750 ml) wurde zugegeben. Die wässerige Lösung wurde mit EtOAc (4 × 250 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Lösungen wurden mit Wasser (2 × 250 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und aufkonzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie durch Elution mit einem Lösungsmittelgradienten (9 : 1 Hexa ne : EtOAc bis 7 : 3 Hexane : EtOAc bis 1 : 1 Hexane : EtOAc) lieferte 7-[2R-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxymethyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl]-heptannitril (22, 46 g). 1H NMR (CDCl3) δ 3,69–3,55 (m, 4H), 2,99 (m, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,34–2,24 (m, 3H), 2,05 (m, 1H), 1,81 (m, 1H), 1,67–1,42 (m, 6H), 1,31 (m, 2H), 0,86 (s, 9H), 0,03 (s, 6H); MS 339,3 (M + 1).
  • Schritt B: 7-(2R-Hydroxymethyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptannitril. Eine Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (1 M in THF, 100,0 ml, 100,0 mMol) wurde langsam zu einer Lösung von 7-[2R-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxymethyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl]-heptannitril (22,39 g, 66,13 mMol) in THF (400 ml) bei 0°C gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und wurde 4 h gerührt. Gesättigte wässerige NaHCO3 (250 ml) wurde zugegeben und die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt. Die verbleibende wässerige Lösung wurde mit CHCl3 (4 × 200 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Lösungen wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie durch Elution mit einem Lösungsmittelgradienten (9 : 1 Hexane : EtOAc bis 4 : 1 Hexane : EtOAc bis 7:3 Hexane : EtOAc bis 6 : 4 Hexane : EtOAc bis 1:1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 9 : 1 EtOAc : MeOH) lieferte 7-(2R-Hydroxymethyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptannitril (14,922 g). 1H NMR (CDCl3) δ 3,78 (dd, 1H), 3,71–3,58 (m, 3H), 3,00 (m, 1H), 2,46 (m, 1H), 2,36–2,27 (m, 3H), 2,08 (m, 1H), 1,93 (m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,68–1,43 (m, 6H), 1,32 (m, 2H); MS 225,1 (M + 1).
  • Herstellung 2
  • 7-(2R-Hydroxymethyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäureethylester
  • Schritt A: 7-[2R-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxymethyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl]-heptansäureethylester. Gemäß dem für Herstellung 1, Schritt A, beschriebenen Verfahren wurde das Anion, abgeleitet von 5R-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxymethyl)-pyrrolidin-2-on (30,000 g, 130,8 mMol) und NaH (60% in Öl, 5,756 g, 143,9 mMol) in DMF (600 ml) mit 7-Bromheptansäureethylester (32,559 g, 137,3 mMol) für 3 h bei 90°C umgesetzt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie durch Elution mit einem Lösungsmittelgradienten (9 : 1 Hexane : EtOAc bis 4 : 1 Hexane : EtOAc bis 7:3 Hexane : EtOAc bis 6 : 4 Hexane : EtOAc) lieferte 7-[2R-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxymethyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl]-heptansäureethylester (39,46 g). 1H NMR (CDCl3) δ 4,10 (q, 2H), 3,62 (m, 4H), 2,95 (m, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,27 (m, 3H), 2,04 (m, 1H), 1,81 (m, 1H), 1,65–1,26 (m, 8H), 1,23 (t, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,03 (s, 6H); MS 386,2 (M + 1).
  • Schritt B: 7-(2R-Hydroxymethyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäureethylester. Gemäß dem in Herstellung 1, Schritt B, beschriebenen Verfahren wurde 7-[2R-(tert-Butyldimethyl-silanyloxymethyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl]-heptansäureethylester (39,46 g, 102,3 mMol) mit TBAF (1 M in THF, 154,0 ml, 154,0 mMol) in einer Reaktionszeit von 2,5 h von den Schutzgruppen befreit. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie durch Elution mit einem Lösungsmittelgradienten (9 : 1 Hexane : EtOAc bis 6 : 4 Hexane : EtOAc bis 1:1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 19 : 1 EtOAc : MeOH) lieferte 7-(2R-Hydroxymethyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäureethylester (25,41 g). 1H NMR (CDCl3) δ 4,10 (q, 2H), 3,77 (dd, 1H), 3,64 (m, 3H), 2,96 (m, 1H), 2,46 (m, 1H), 2,35–2,25 (m, 3H), 2,08 (m, 1H), 1,93 (m, 1H), 1,71 (m, 1H), 1,63–1,27 (m, 8H), 1,23 (t, 3H); MS 272,2 (M + 1).
  • Herstellung 3
  • [2-Oxo-3-(3-trifluormethyl-phenyl)-propyl]-phosphonsäuredimethylester
  • Schritt A: N-Methoxy-N-methyl-2-(3-trifluormethyl-phenyl)-acetamid. Zu einer Lösung von N,O-Dimethylhydroxylaminhydrochlorid (1,577 g, 16,2 mMol) in DMF (25 ml) und CH2Cl2 (25 ml) wurde bei 0°C Triethylamin (2, 25 ml) gegeben. Nach Rühren für 5 Minuten wurden 3-Trifluormethylphenyl- essigsäure (3,0 g, 14,7 mMol), HOBT (3,177 g, 23,5 mMol) und DEC (2-Diethylaminoethylchloridhydrochlorid, 3,10 g, 16,2 mMol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 18 h bei Raumtemperatur gerührt und wurde im Vakuum auf konzentriert. Der Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt und die organische Lösung wurde nacheinander mit 1 N NaOH (2-mal), Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und im Vakuum auf konzentriert. Mitteldruck-Chromatographie (20% EtOAc in Hexanen bis 50% EtOAc in Hexanen) lieferte N-Methoxy-N-methyl-2-(3-trifluormethyl-phenyl)-acetamid.
  • Schritt B: [2-Oxo-3-(3-trifluormethyl-phenyl)-propyl]-phosphonsäuredimethylester. Zu einer Lösung von Dimethylmethylphosphonat (9,4 g, 75,8 mMol) in Toluol (80 ml) wurde bei –78°C langsam n-BuLi (2,5 M in Hexanen, 28 ml, 70 mMol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h gerührt und eine Lösung von N-Methoxy-N-methyl-2-(3-trifluormethyl-phenyl)-acetamid (14,39 g) in Toluol (50 ml) wurde langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2,5 h gerührt und AcOH (40 ml) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und Wasser wurde zugegeben. Die organische Schicht wurde mit Wasser, gefolgt von Salzlösung, gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und im Vakuum aufkonzentriert. Mitteldruck-Chromatographie (CH2Cl2 bis 2% McOH in CH2Cl2) lieferte die Titelverbindung von Herstellung 3 (9,37 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,52 (m, 1H), 7,44 (m, 2H), 7,37 (m, 1H), 3,96 (s, 2H), 3,87 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,12 (d, 2H).
  • Herstellung 4
  • [3-(3-Chlor-phenyl)-2-oxo-propyl]-phosphonsäuredimethylester
  • Unter Austauschen der geeigneten Materialien wurde die Titelverbindung von Herstellung 4 gemäß einem analogen Verfahren zu jenem, beschrieben in Herstellung 3, hergestellt.
  • Herstellung 5
  • [3-(3-Chlor-phenyl)-2-oxo-propyl]-phosphonsäuredimethylester
  • Zu einer Lösung von Dimethylmethylphosphonat (17,93 g, 144 mMol) in THF (270 ml) wurde bei –78°C langsam n-BuLi (2,5 M, 64,2 ml, 160,6 mMol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h gerührt und (3-Chlor-phenyl)essigsäuremethylester (26,93 g, 146 mMol) wurde langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen lassen und 24 h gerührt. AcOH (15 ml) wurde zugegeben und die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit CH2Cl2 verdünnt und die organische Lösung wurde vorsichtig mit gesättigter wässeriger NaHCO3 (3-mal) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und im Vakuum aufkonzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (20% EtOAc in Hexanen bis EtOAc) lieferte die Titelverbindung (9,28 g).
  • Herstellung 6
  • Tetrahydro-pyrrolizin-3,5-dion
  • Die Titelverbindung von Herstellung 6 wurde gemäß dem in US-Patent Nr. 4 663 464 beschriebenen Verfahren hergestellt.
  • Herstellung 7
  • 7-(2R-Formyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäureethylester
  • Zu einer Lösung von 7-(2R-Hydroxymethyl-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäureethylester (1,63 g, 6,01 mMol) in Benzol (50 ml) wurde 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (3,46 g, 18,03 mMol) und DMSO (1,5 ml, 24,04 mMol) gegeben. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt und Pyridiniumtrifluoracetat (1,28 g, 6,61 mMol) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei 0°C und dann 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde von dem öligen Rückstand abdekantiert. Der Rückstand wurde mit Benzol (3x) gewaschen und die vereinigten Benzolwaschungen wurden im Vakuum aufkonzentriert unter Bereitstellung von 7-(2R-Formyl-5- oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäureethylester, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
  • Herstellung 8
  • 4-(3-{2-[4-Biphenyl-3-yl-3-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-propyl)-benzoesäuremethylester
  • Schritt A: 5-(3-Brom-3-oxo-butyl)-pyrrolidin-2-on. Zu einer Lösung von Tetrahydropyrrolizin-3,5-dion (5 g, 36 mMol) in CH2Cl2 (320 ml) wurde bei 0°C 3-Brombenzylmagnesi-umbromid (0,25 M in Et2O, 155 ml, 38,8 mMol) tropfenweise gegeben. Die Lösung wurde 2 h bei 0°C gerührt und wurde mit gesättigtem wässerigem Ammoniumchlorid gestoppt. Wässerige 1 N HCl wurde zugegeben, um einen pH = 3 zu erreichen. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur wurde die wässerige Lösung mit CH2Cl2 (3x) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten (1 : 1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 5% McOH in CH2Cl2) lieferte 5-(3-Brom-3-oxo-butyl)-pyrrolidin-2-on (7, 84 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,41–7,11 (m, 4H), 6,24 (bs, 1H), 3,67 (s, 2H), 3,60 (m, 1H), 2,52 (t, 2H), 2,32 (m, 2H), 2,20 (m, 1H), 1,88–1,60 (m, 3H).
  • Schritt B: 5-(3-Brom-3-hydroxy-butyl)-pyrrolidin-2-on Zu einer Lösung von 5-(3-Brom-3-oxo-butyl)-pyrrolidin-2-on (7,84 g, 25,3 mMol) in EtOH (130 ml) wurde bei 0°C NaBH4 (480 mg, 12,6 mMol) gegeben und das Reaktionsgemisch 2,5 h bei 0°C gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter wässeriger Ammoniumchloridlösung gestoppt. Wasser und CH2Cl2 wurden zugegeben. Die wässerige Schicht wurde mit CH2Cl2 (3x) gewaschen und die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und aufkonzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten (1 : 1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 1% McOH in CH2Cl2 bis 3% McOH in CH2Cl2 bis 5% McOH in CH2Cl2 bis 8% McOH in CH2Cl2) lieferte 5-(3-Brom-3-hydroxy-butyl)-pyrrolidin-2- on (6,76 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,36–7,09 (m, 4H), 6,27 (d, 1H), 3,78 (m, 1H), 3,63 (m, 1H), 2,75 (m, 1H), 2,62 (m, 1H), 2,32–2,18 (m, 3H), 1,88 (m, 1H), 1,73–1,42 (m, 5H); MS 312,2, 314,1 (M+).
  • Schritt C: 5-[3-Brom-3-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)-butyl]-pyrrolidin-2-on. Zu einer Lösung von 5-(3-Brom-3-hydroxy-butyl)-pyrrolidin-2-on (6,76 g, 21,6 mMol) in DMF (86 ml) wurde tert-Butyldimethylsilylchlorid (3,59 g, 23,8 mMol), gefolgt von Imidazol (2,95 g, 43,3 mMol) und DMAP (264 mg, 2,16 mMol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h gerührt und wurde mit gesättigter wässeriger Ammoniumchloridlösung gestoppt. Die wässerige Lösung wurde mit EtOAc (3x) gewaschen und die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten (CH2Cl2 bis 1% McOH in CH2Cl2 bis 3% McOH in CHZCl2 bis 5% McOH in CH2Cl2 bis 8% McOH in CH2Cl2) lieferte 5-[3-Brom-3-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)-butylj-pyrrolidin-2-on (7,45 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,30 (m, 2H), 7,12 (m, 1H), 7,04 (m, 1H), 5,71 (m, 1H), 3,81 (m, 1H), 3,56 (m, 1H), 2,66 (m, 2H), 2,32–2,17 (m, 3H), 1,70–1,35 (m, 5H), 0,82 (s, 9H), –0,06 (d, 3H), –0,24 (d, 3N); MS 426,2, 428,2 (M+).
  • Schritt D: 5-[4-Biphenyl-3-yl-3-(tert-butyl-dimethylsilanyloxy)-butyl)-pyrrolidin-2-on. Zu einer Lösung von 5-[3-Brom-3-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)-butyl]-pyrrolidin-2-on (750 mg, 1,76 mMol) in DME (15 ml) wurde Phenylboronsäure (236 mg, 1,93 mMol) gegeben. Palladiumacetat (26,8 mg, 0,088 mMol) und Tri-o-tolylphosphin (39,5 mg, 0,176 mMol) wurden zugegeben, gefolgt von einer Lösung von Na2CO3 (37,3 mg, 3,52 mMol) in Wasser (1,8 ml). Das Reaktionsgemisch wurde 24 h unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Salzlösung und EtOAc verdünnt. Die wässerige Lösung wurde mit EtOAc (3x) gewaschen und die vereinigten or panischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und auf konzentriert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie durch Elution mit einem Lösungsmittelgradienten (1 : 1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 1% McOH in CH2Cl2 bis 3% McOH in CH2Cl2 bis 5% McOH in CH2Cl2) lieferte 5-[4-Biphenyl-3-yl-3-(tertbutyl-dimethyl-silanyloxy)-butyl]-pyrrolidin-2-on (717,3 mg). 1H (CDCl3) δ 7,57 (m, 2H), 7,43 (m, 2H), 7,33 (m, 3H), 7,11 (m, 2H), 5,78 (m, 1H), 3,91 (m, 1H), 3,59 (m, 1H), 2,76 (m, 2H), 2,27 (m, 3H), 1,73–1,38 (m, 5H), 0,83 (s, 9H), –0,03 (d, 3H), –0,16 (d, 3H); MS 424,3 (M + 1).
  • Herstellung 9
  • 5-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(3-fluor-phenyl)-butyl]-pyrrolidin-2-on
  • Schritt A: 5-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-oxo-butylJ-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Herstellung 8, Schritt A, beschriebenen Verfahren wurde Tetrahydro-pyrrolizin-3,5-dion (2 g, 14 mMol) mit 3-Fluorbenzylmagnesiumchlorid (0,25 M in Et2O, 62 ml, 15,5 mMol) innerhalb 2,5 h umgesetzt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten (1 : 1 Hexane : EtOAc bis 2 : 1 EtOAc : Hexane bis EtOAc bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 10% McOH in CH2Cl2) lieferte 5-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-oxo-butyl]-pyrrolidin-2-on (2,1730 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,32–7,27 (m, 1H), 7,00–6,90 (m, 3H), 6,12 (bs, 1H), 3,69 (s, 2H), 3,59 (m, 1H), 2,52 (t, 2H), 2,30 (m, 2H), 2,19 (m, 1H), 1 75 (m, 2H), 1,65 (m, 1H).
  • Schritt B: 5-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Herstellung 8, Schritt B, beschriebenen Verfahren wurde 5-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-oxo-butyl)-pyrrolidin-2-on (2,17 g, 8,71 mMol) mit NaBH4 (165 mg, 4,35 mMol) reduziert. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten (1 : 1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 1% McOH in CH2Cl2 bis 3% McOH in CH2Cl2 bis 6% McOH in CH2Cl2) lieferte 5-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl)-pyrrolidin-2-on (2,23 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,27 (m, 1H), 6,94 (m, 3H), 6,38 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 2,79 (m, 1H), 2,67 (m, 1H), 2,33–2,21 (m, 3H), 1,92 (d, J = 4,15 Hz, 1H), 1,75–1,40 (m, 5H); MS 252,2 (M + 1).
  • Schritt C: 5-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(3-fluor-phenyl)-butyl]-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Herstellung 8, Schritt C, beschriebenen Verfahren wurde 5-[4-(3-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-pyrrolidin-2-on (2,23 g, 8,87 mMol) mit tert-Butyldimethylsilylchlorid (1,47 g, 9,76 mMol) umgesetzt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten (1:1 Hexane : EtOAc bis EtOAc bis 1% McOH in CH2Cl2 bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 4% McOH in CH2Cl2) lieferte 5-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(3-fluor-phenyl)-butyl]-pyrrolidin-2-on (2, 84 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,23 (m, 1H), 6,88 (m, 3H), 5,75 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,57 (m, 1H), 2,71 (m, 2H), 2,30 (m, 2H), 2,25 (m, 1H), 1,70–1,38 (m, 5H), 0,84 (s, 9H), 0 (s, 3H), –0,2 (s, 3H).
  • Herstellung 10
  • 5-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(4-fluor-phenyl)-butyl]-pyrrolidin-2-on
  • Schritt A: 5-[4-(4-Fluor-phenyl)-3-oxo-butyl]-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Herstellung 8, Schritt A, beschriebenen Verfahren wurde Tetrahydro-pyrrolizin-3,5-dion (1,41 g, 10,1 mMol) mit 4-Fluorbenzylmagnesiumchlorid (0,25 M in Et2O, 50 ml, 12,5 mMol) innerhalb 5 h umgesetzt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (2% McOH in CH2Cl2) lieferte 5-[4-(4-Fluor-phenyl)-3-oxo-butyl]-pyrrolidin-2-on (2,64 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,18 (m, 2H), 7,03 (m, 2H), 6,34 (m, 1H), 3,70 (s, 2H), 3,62 (m, 1H), 2,54 (t, 2H), 2,34–2,15 (m, 3H), 1,82– 1, 61 (m, 3H).
  • Schritt B: 5-[4-(4-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Herstellung 8, Schritt B, beschriebenen Verfahren wurde 5-[4-(4-Fluor-phenyl)-3-oxo- butyl]-pyrrolidin-2-on (2,64 g, mMol) mit NaBH4 (400 mg, mMol) bei Raumtemperatur 1 h reduziert. Zusätzliches NaBH4 (150 mg) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 20 h gerührt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten (CH2Cl2 bis 2% McOH in CH2Cl2 bis 4% McOH in CH2Cl2) lieferte 5- [4- (4-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-pyrrolidin-2-on (2,01 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,14 (m, 2H), 6,98 (m, 2H), 6,78 (m, 1H), 3,76 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 2,76 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,32–2,18 (m, 4H), 1,72–1,47 (m, 5H).
  • Schritt C: 5-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(4-fluor-phenyl)-butyl]-pyrrolidin-2-on. Gemäß dem in Herstellung 8, Schritt C, beschriebenen Verfahren wurde 5-[4-(4-Fluor-phenyl)-3-hydroxy-butyl]-pyrrolidin-2-on (1,95 9, 7,79 mMol) mit tert-Butyldimethylsilylchlorid (1,47 g, 9,76 mMol) umgesetzt. Reinigung durch Mitteldruck-Chromatographie (1% McOH in CH2Cl2) lieferte 5-[3-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-4-(4-fluor-phenyl)-butyl]-pyrrolidin-2-on. 1H NMR (CDCl3) δ 7,12 (m, 2H), 6,97 (m, 2H), 5,75 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 3,60 (m, 1H), 2,71 (m, 2H), 2,36–2,24 (m, 3H), 1,70–1,38 (m, 5H), 0,84 (s, 9H), –0,05 (d, 3H), –0,2 (d, 3H).
  • Herstellung 11
  • [2-Oxo-3-(3-phenoxy-phenyl)-propyl]-phosphonsäuredimethylester
  • Unter Austauschen der geeigneten Ausgangsmaterialien wurde die Titelverbindung von Herstellung 11 in einer analogen Weise zu jener, beschrieben für die Verbindung von Herstellung 5, hergestellt.

Claims (10)

  1. Verwendung eines EP4-Rezeptor-selektiven Agonisten der Formel I:
    Figure 00590001
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes der Verbindung, worin: Q COOR3, CONHR4 oder Tetrazol-5-yl darstellt; A eine Einfach- oder cis-Doppelbindung darstellt; B eine Einfach- oder trans-Doppelbindung darstellt;
    Figure 00590002
    R2 α-Thienyl, Phenyl, Phenoxy, monosubstituiertes Phenyl oder monosubstituiertes Phenoxy darstellt, wobei die Substituenten Chlor, Fluor, Phenyl, Methoxy, Trifluormethyl oder (C1-C3)Alkyl darstellen; R3 Wasserstoff, (C1-C5)Alkyl, Phenyl oder p-Biphenyl darstellt; R4 COR5 oder SO2R5 darstellt; und R5 Phenyl oder (C1-C5)Alkyl darstellt; oder von 7-{2R-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxyphenyl)-but-1-enyl]-5-oxopyrrolidin-1-yl}-heptansäure oder 7-{2S-[3-Hydroxy-4-(3-phenoxyphenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure; zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustands, der sich durch eine niedrige Knochenmasse äußert.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei Q 5-Tetrazolyl darstellt
    Figure 00590003
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung der Formel I 5R-(3S-Hydroxy-4-phenyl-but)-1-enyl)-1-[6-(1H-tetrazol-5-yl)hexyl]pyrrolidin-2-on, 5S-(3R-Hydroxy-4-phenyl-butyl)-1-[6-(1H-tetrazol-5-yl)-hexyl]pyrrolidin-2-on, 5S-(4-(3-Chlorphenyl)-3R-hydroxy-butyl)-1-(6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl-pyrrolidin-2-on oder 5S-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-1-(6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl)pyrrolidin-2-on darstellt.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der EP4-Rezeptorselektive Agonist eine Verbindung der Formel I ist, worin Q COON darstellt und =U
    Figure 00600001
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Verbindung 7-(2S-(3R-Hydroxy-4-phenyl-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure, 7-[2R-(3S-Hydroxy-4-phenyl-but-1-enyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl]-heptansäure, 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure, 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-phenoxy-phenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure, 7-(2S-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure oder 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure darstellt.
  6. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Zustand Osteoporose, Gebrechlichkeit, eine osteoporotische Fraktur, einen Knochendefekt, kindheitsidiopathischer Knochenverlust, alveolaren Knochenverlust, mandibularen Knochenverlust, Knochenfraktur, Osteotomie, Knochenverlust, verbunden mit Periodontitis, oder prothetisches Einwachsen darstellt.
  7. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Arzneimittel zur systemischen oder örtlichen Verabreichung vorgesehen ist.
  8. Verbindung, ausgewählt aus 7-{2S-[3R-Hydroxy-4-(3-phenoxyphenyl)-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure; 7-(2S-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-5-oxo-pyrrolidin-1-yl)-heptansäure; 7-{2S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-5-oxo-pyrrolidin-1-yl}-heptansäure; 5S-[4-(3-Chlor-phenyl)-3R-hydroxy-butyl]-1-[6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl]-pyrrolidin-2-on; und 5S-(3R-Hydroxy-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-butyl)-1-(6-(2H-tetrazol-5-yl)-hexyl)-pyrrolidin-2-on.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 8 und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungs- oder Trägermittel.
  10. Verbindung nach Anspruch 8 zur Verwendung als Arzneimittel.
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