CZ297452B6

CZ297452B6 - Farmaceutická kompozice, kombinace úcinných láteka kit pro lécení stavu, který se projevuje nízkoukostní hmotou

Info

Publication number: CZ297452B6
Application number: CZ0271898A
Authority: CZ
Inventors: Zhu Ke@Hua; D. Thompson@David
Original assignee: Pfizer Inc.
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1996-12-23
Publication date: 2006-12-13
Also published as: NO323648B1; AP9700934A0; CN1515258A; OA10837A; EP0883404A1; KR19990087337A; PT883404E; YU7797A; US20010009920A1; ATE405273T1; IS4812A; NO20063853L; HN1996000101A; DE69637651D1; IL125493A0; CN1515317A; DZ2186A1; CA2247420A1; WO1997031640A1; US7255984B2

Abstract

Farmaceutická kompozice, která zahrnuje terapeuticky úcinné mnozství první slouceniny, pricemz touto první slouceninou je agonista/antagonista estrogenu; a terapeuticky úcinné mnozství druhé slouceniny, pricemz touto druhou slouceninou je prostaglandin nebo agonista/antagonista prostaglandinu. Kombinace techto úcinných látek a kit zalozený na tétokompozici nebo kombinaci.

Description

Farmaceutická kompozice, kombinace účinných látek a kit pro léčení stavu, který se projevuje nízkou kostní hmotou

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutické kombinace agonistů/- antagonistů estrogenu a činidel, která stimulují tvorbu kosti a zvyšují kostní hmotu. Dále se vynález týká kitů zahrnujících takové kombinace a použití těchto kombinací pro léčbu stavů, které se projevují nízkou kostní hmotou, u savců, včetně člověka.

Dosavadní stav techniky

Osteoporóza je systemická kostní choroba, pro niž je charakteristická nízká kostní hmota a zhoršování kostní tkáně, v jejichž důsledku dochází ke zvýšení křehkosti kostí a náchylnosti ke zlomeninám. V USA tato choroba postihuje více než 25 milionů lidí a vyvolává každý rok více než 1,3 milionu zlomenin zahrnujících 500 000 zlomenin páteře, 250 000 zlomenin kyčle a 240 000 zlomenin zápěstí. Nejvážnější jsou zlomeniny kyčle, poněvadž 5 až 20 % pacientů s těmito zlomeninami umírá do jednoho roku a u více než 50 % přeživších zůstává invalidních.

Starší lidé jsou vystaveni největšímu riziku osteoporózy a předpokládá se, že se tento problém bude významně zvětšovat se stárnutím populace. Odhaduje se, že ve světovém měřítku dojde v průběhu následujících 60 let ke ztrojnásobení počtu zlomenin a podle jedné studie má dojít roku 2050 ve světě celkem ke 4,5 milionu zlomenin kyčle.

Zeny jsou ohroženy osteoporózou více než muži. U žen dochází k významnému urychlení ztráty kostní hmoty bezprostředně po menopauze. Zjiných faktorů, zvyšujících ztrátu kostní hmoty vedoucí k osteoporóze, je možno uvést kouření, abúsus alkoholu, sedavý životní styl a nízký příjem vápníku.

Při prevenci osteoporózy nebo při ztrátě kostní hmoty u žen po přechodu se jako léčiva první volby používá estrogenu. Kromě toho Black et al. oznámili v EP 0 605 193 Al, že estrogen, zejména když se podává orálně, snižuje hladinu LDL v plasmě a zvyšuje hladinu prospěšných lipoproteinů s vysokou hustotou (HDL). Dlouhodobá léčba estrogenem se však dává do souvislosti s různými poruchami včetně zvýšeného ohrožení rakovinou dělohy, rakovinou endometria a možná rakovina prsu, což vede mnoho žen k tomu, aby se takovému léčení vyhýbaly nebo braly léky jen po krátké období. Přestože se předpokládá, že riziko endometrální rakoviny je možno snížit současným podáváním progestogenu, obava z možného zvýšeného ohrožení rakovinou prsu při podávání estrogenu přetrvává. Nedávno navržené léčebné režimy zaměřené na snížení hrožení rakovinou, jako je podávání kombinací progesteronu a estrogenu, vyvolávají u pacientů nepřijatelné krvácení. Dále se má za to, že kombinace progesteronu s estrogenem zřejmě otupuje účinnost estrogenu na snižování cholesterolu v séru. Významné nežádoucí účinky spojené s léčením estrogenem potrhují nutnost vyvinout alternativní terapie osteoporózy, které by měly žádoucí příznivý vliv na hladinu LDL v séru, ale které by neměly nežádoucí vedlejší účinky.

Před nedávnou dobou byla pro léčení osteoporózy navržena řada agonistů/antagonistů estrogenu. Bylo oznámeno (Osteoporózis Conference, Scrip. No. 1812/13. dubna 16/20, 1993, str. 29), že raloxifen, 6-hydroxy-2-(4-hydroxyfenyl)-3-[4-(2-piperidinoethoxy)benzoyl]benzo[b]thiofen, napodobuje příznivý účinek estrogenu na kosti a lipidy, ale na rozdíl od estrogenu má minimální stimulační účinek na dělohu [Black, L. j. et al., Reloxifene (LKY139481 Hel) Prevents Bone Loss and Reduces Sérum Cholesterol Withiout Causing Uterine Hypertrophy in Ovariectomized Rats, J. Clin. Invest., 1994, 93:63 až 69].

Tamoxifen, l-(4-P-dimethylaminoethoxyfenyl)-l,2-difenylbut-l-en, je antiestrogen, který byl navržen jako léčivo osteoporózy. Tato látka má paliativní účinek na rakovinu prsu, ale bylo oznámeno, že má estrogenní účinnost v děloze. Gill-Sharma et al., J. Reproduction and Fertility (1993) 99, 395, uvádějí, že tamoxifen v dávce 200 až 400 mg/kg/den snižuje hmotnost varlat a sekundárních pohlavních orgánů u samců potkana.

V patentu US 5 254 594 (který je zde citován náhradou za přenesení celého jeho obsahu do tohoto textu) je popsáno použití droloxifenu pro léčbu chorob kostí, jako je osteoporóza.

Činidla jako droloxifen zabraňují ztrátě kostní hmoty, a tím snižují ohrožení frakturou, bez vedlejších účinků estrogenu. O estrogenu a agonistech estrogenu samotných se však předpokládá, že snižují riziko zlomenin jen o asi 50 %, a přibližně 50 % ostepenických žen stále zůstává ohroženo osteoporotickými frakturami.

Pro léčbu osteoporózy jsou také navrhovány neesterogenové agonisty/antagonisty, jako jsou bisfosfonáty. Bisfosfonátem pro léčení osteoporózy, který je v současné době na trhu je například Fosamax^(R). Jako jiné bisfosfonáty, které v současné době podstupují povolovací řízení, je možno uvést risedroná, tiludronát a ibandronát.

Frost et al. v „Treatment of Osteoporózis by Manipulation of Coherent Bone Cell Populations“, Clinical Orthopedics and Related Research, 143, 227 (1979) popisují teoretický model, v němž je navrženo, že by mělo být možné synchronizovat aktivitu a metabolismus kostních buněk tak, že se nejprve podá aktivační činidlo kostních buněk a poté inhibiční činidlo resorpce kosti, načež se nechá vytvořit normální kost.

Tang et all., Restoring and Maintaining Bone in Osteogenic Female Rat Skeleton: I. Changes in Bone Mass and Structure, J. Bone Minerál Research 7 (9), str. 1093 až 1104, 1992, uvádějí údaje o konceptu ztráty, obnovení a udržování (LRM konceptu ztráty, obnovení a udržování (LRM koncept = Lose, Restore and Maintain Concept), který představuje praktický přístup k reverzi existující osteoporózy. LRM koncept využívá pro obnovení kostní hmoty a architektury kosti (fáze +) anabolických činidel a poté za účelem zachování nové kostní hmoty (fáze +/-) přejde k činidlům s ověřenou schopností udržovat kostní hmotu. Při studii na potkanech bylo použito PGE₂ a residronátu (bisfosfonátu) a ukázalo se, že převážnou část nové spongiosní a kortikální kostní tkáně indukované PGE₂ je možné podáváním residronátu zachovat alespoň 60 dnů po přerušení podávání PGE₂.

Kombinace bisfosfonátů a prostaglandinů pro léčbu osteoporózy jsou známé. V patentové EP přihlášce 0 381 296 je popsáno použití kitu, při němž po období aktivace kosti či léčebného režimu následuje režim inhibice resorpce kosti. Jako příklady sloučenin aktivujících kostní tkáň jsou v tomto dokumentu uvedeny parathyroidní hormon (PTH), anorganické fosfáty, růstový hormon, fluorid, thyroidní hormon (například thyroxin), určité metabolity vitaminu D a prostaglandiny (PGE₂ pro dávkovém režimu 10 mg/kg/den). Jako činidla inhibující resorpci kosti jsou zde uvedeny polyfosfonáty.

Je již známá simultánní dodávka aktivačního činidla kostní tkáně, jako prostaglendinu, které je chemicky kopulováno ke sloučenině inhibující resorpci kosti, která selektivně dodává aktivační činidlo kosti do cílové oblasti. Hydrolytické produkty vzniklé postupnou hydrolýzou také nové sloučeniny jsou schopné zajistit inhibiční účinnost na resorpci kosti (působením bisfosfonátů) a růst kosti nebo stimulaci aktivity kosti (působením PGE₂).

Účinky kombinace prostaglandinů E2 a risedronátu (bisfosfonátu) jsou zkoumány ve studii Lin et al., Effects of Prostaglandin E2 and Risedronate Administration on Cencellous Bone in Older

Female Rats, Bone 15(5), str. 489 až 496, 1994.

-2CZ 297452 B6

Qiu et al. v Experimental Stude on Antiatherosclerotic Treament by PGE₂ Combined With Vitamin e and Estradiol, Chnese Mecidal Journal, 108(1), str. 33 až 36, 1995 uvádějí že jediná dávka

PGE₂ kombinovaná s vitaminem E a estrodilem vykazovaly lépe koordinovanou inhibicí v případě aortálních a koronárních atharosklerodických lézích, jakož i agregace destiček, proliferace buněk hladkého svalstva a peroxidace lipidů, než jediná dávka PGE₂.

V abstraktu publikace „Nonhormonal Altematives for the Management of Early Menopause in Younger Women with Breast Cancer“, Monogr. Nati. Cacnce Inst. (16), 161 až 167, 1994 se uvádí: „Používá několika neestrogenových přístupů při prevenci a léčení osteoporózy představuje příslib do budoucna. Tradiční doporučení pro zachování celistvosti kostry, jako jsou posilovači cvičení, svalstva bohatá na vápník a omezování kofeinu, alkoholu a proteinů; vystřihání se kouření; a opatření jak minimalizovat úrazy, se rozšiřují o použití nebo zkoumání léčiv (samotných nebo v kombinaci). Jako příklady takových léčiv je možno uvést progestiny, metabolity vitaminu D, injekčně nebo intranasálně podávaný syntetická lososí kalcitonin, bisfosfonáty, fluorid sodný, pyrothyroidní hormon, růstové faktory, tomoxifen atd.“.

Přestože již existují různé způsoby léčení osteoporózy, vzhledem kjen omezeným úspěchům současné medicíny při snižování osteoporotických fraktur, na tomto poli nadále přetrvává potřeba a hledání alternativních léčebných možností.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že zahrnuje

a. terapeuticky účinné množství první sloučeniny, přičemž touto první sloučeninou je agonista/antagonista estrogenu; a

b. terapeuticky účinné množství druhé sloučeniny, přičemž touto druhou sloučeninou je prostaglandin nebo agonista/antagonista prostaglandinu.

Farmaceutická kompozice podle vynálezu obvykle také přídavně obsahuje farmaceutický nosič.

Ve výhodném provedení je ve farmaceutické kompozici podle vynálezu agonistou/antagonistou estrogenu droloxifen, raloxifen, tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen, cis-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyridilin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-6-fenyl-5-[4-(2-pynOlidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-l-[6'-pyrrolidinoethoxy-3'-pyridyl]-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydronaftalen;

l-(4'-pyrrolidinoethoxyfenyl)-2-(4-fluorfenyl)-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin; cis-6-(4-hydroxyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol nebo l-(4'-pyrrolidinolethoxyfenyl)-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin.

V jiném výhodném provedení farmaceutické kompozice podle vynálezu je druhou sloučeninou PGD], PGD₂, PGE₂, PGEi, PGF₂, PGF₂a nebo 3S-(3-hydroxy^-fenylbutyl)-2R~[6-(lH-tetrazol-5-yl)hexyl]cyklopentanon.

Předmětem vynálezu je dále také kombinace účinných látek pro použití při léčení stavu, který se projevuje nízkou kostní hmotou, která zahrnuje první sloučeninu, kterou je agonista/antagonista

-3 CZ 297452 B6 estrogenu; a druhou sloučeninu, kterou je prostaglandin nebo agonista/antagonista prostaglandinu. Výhodná provedení kombinace podle vynálezu obsahují výše uvedené výhodné sloučeniny.

Předmětem vynálezu je dále také kit pro léčení stavu, který se projevuje nízkou kostní hmotou, jehož postata spočívá v tom, že obsahuje

a. terapeuticky účinné množství agonisty/antagonisty estrogenu a farmaceuticky vhodný nosič v první jednotkové dávkovači formě;

b. terapeuticky účinné množství účinné množství prostaglandinu nebo agonisty/antagonisty prostaglendinu a farmaceuticky vhodný nosič ve druhé jednotkové dávkovači formě; a

c. obalový prostředek pro první a druhou dávkovači formu.

Při všech aspektech vynálezu je stavem, který se projevuje nízkou kostní hmotou, zejména osteoporóza.

Farmaceutická kompozice, kombinace a kit podle vynálezu s výhodou zajišťují synergický účinek, tj. množství první sloučeniny samotné a množství druhé sloučeniny samotné nepostačuje pro dosažení terapeutických účinků, které spočívají ve zvýšení tvorby kostní hmoty a snížení resorpce kostní hmoty, jichž se dosáhne při současném podání a přičemž kombinovaný účinek množství první sloučeniny a množství druhé sloučeniny je větší než součet léčebných účinků dosažitelných za použití množství první sloučeniny a množství druhé sloučeniny jednotlivě.

Farmaceutická kompozice, kombinace a kit podle vynálezu mohou tedy být použity pro léčbu stavů, u nichž je přítomna ztráta kostní hmoty, jako je osteoporóza z savců (například lidí, zejména žen).

První sloučenina a druhá sloučenina se mohou přednostně podávat v podstatě současně.

Podle jiného přednostního provedení se při léčení nejprve druhá sloučenina podává po dobu asi 3 měsíců až asi 3 let a po podávání druhé sloučeniny následuje podávání první sloučeniny po dobu asi 3 měsíců až asi 3 let, přičemž druhá sloučenina se po dobu tohoto druhého období (asi 3 měsíců až asi 3 let) nepodává.

Alternativně se nejprve podává druhá sloučenina a potom následuje podávání první sloučeniny po dobu delší než asi 3 roky, přičemž druhá sloučenina se během tohoto více než tříletého období nepodává.

Pod pojmem „stav, který se projevuje nízkou kostní hmotou“ se rozumí stav, při němž je úroveň kostní hmoty pod normální hladinou specifickou pro věk, jak je definována ve standardech Světové zdravotnické organizace „Assesment of Fracture Risk and its Application to Screaning for postmenopausal Osteoporózis (1994), Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization technical Series 843“. Spadají sem také juvenilní idiopatické a primární osteoporózy. Do rozsahu léčby osteoporózy také spadá prevence nebo zmírňování dlouhodobých komplikací, jako je zakřivení páteře, ztráta výšky, protetická chirurgie a prevence dysfunkcí prostaty. Tato léčba také zahrnuje urychlování hojení zlomenin a urychlování přijetí kostních štěpů. Spadají sem také periodonální choroby a úbytek alveolámí kosti.

Pojem „stav, který se projevuje nízkou kostní hmotou“ se vztahuje také na savce, u nichž je pravděpodobnost vývoje některé z výše uvedených chorob, jako je osteoporóza, vyšší než průměrná [například ženy po přechodu, muži ad 60 let a osoby léčené léčivy, o nichž je známo, že jako vedlejší účinek vyvolávají osteoporózu (jako jsou glukokortikoidy)].

-4CZ 297452 B6

Odborníkům v tomto oboru bude zřejmé, že se pod pojmem „kostní hmota“ ve skutečnosti rozumí hmotnost kosti na jednotku plochy, která je někdy (ačkoliv ne zcela přesně) označována jako minerální hustota kosti.

Pojem „léčení“ nebo „léčba“, jak se ho používá v tomto textu, rovněž zahrnuje preventivní (například profylaktickou) a paliativní léčbu.

Pod pojmem halogen se rozumí chlor, brom, jod nebo fluor.

Pod pojmem „alkyl“ se rozumí nasycený uhlovodíkový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Jako příklady takových alkylskupin je možno uvést methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sek. butyl, terc.butyl, pentyl, isopentyl, hexyl a isohexyl.

Pod pojmem „alkoxy“ se rozumí nasycená alkylskupina s řetězcem přímým nebo rozvětveným, která je vázána přes atom kyslíku. Jako příklady takových alkoxyskupin je možno uvést methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, terb.butoxy, pentoxy, isopentoxy, hexoxy a isohexoxy.

Pod pojmem „soli s farmaceuticky vhodnými anionty“ se rozumějí soli s netoxickými anionty. Jako neomezující příklady takových solí je možno uvést chlorid, bromid, jodid, sulfát, hydrogensulfát, fosfát, acetát, maleát, fumarát, oxalát, laktát, tartrát, citrát, glukonát, methansulfonát a 4-toluensulfonát.

Pod pojmem „soli s farmaceuticky vhodnými kationty“ se rozumí soli s toxickými kationty. Jako neomezující příklady takových solí je možno uvést soli, které obsahují kationty sodíku, draslíku, vápníku, hořčíku, amonia nebo protonovaného benzathiu (N,N'-dibenzylethylendiaminu), cholinu, ethanolaminu, diethanolaminu, ethylendiaminu, megluminu (N-methylglukaminu), benethaminu (N-benzylfenylethylaminu), piperazinu nebo tromethaminu (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiolu).

Znaménka plus nebo minus umístěná v závorce, kterých se zde používá v chemických názvem, označují u konkrétního stereoisomeru směs otáčení roviny polarizovaného světla.

Pod pojmem „rozpouštědlo inertní vůči reakci“ nebo „inertní rozpouštědlo“ se v tomto textu rozumí rozpouštědlo, které neinteraguje s výchozími látkami, reakčními činidly, meziprodukty nebo produkty způsobem, který by měl nepříznivé účinky na výtěžek požadovaného produktu.

Odborníku v oboru chemie bude jasné, že určité sloučeniny podle tohoto vynálezu bude obsahovat jeden nebo více atomů, které mohou být ve zvláštních stereochemických nebo geometrických konfiguracích za vzniku stereoisomerů a konfiguračních isomerů. Všechny takové isomery a jejich směsi jsou předmětem tohoto vynálezu. Do jeho rozsahu také spadají hydráty sloučenin podle vynálezu.

Odborníku v tomto oboru bude zřejmé, že určité kombinace substituentů obsahujících heteroatomy, které jsou uvedeny v tomto popisu, definují sloučeniny, jež budou za fyziologických podmínek méně stabilní (například sloučeniny obsahující acetalové nebo aminalové vazby). Takovým sloučeninám se dává menší přednost.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu vedou k rychlejšímu a mohutnějšímu přírůstku kostní hmoty, než jakých se může dosáhnout za použití stejných dávek výše uvedeného agonisty/antagonisty estrogenu samotného nebo výše uvedeného činidla, které stimuluje zvýšení minerální hustoty kosti samotného. Tato kombinace tedy vykazuje synergický účinek, který spočívá ve zvyšování kostní hmoty a snižování četnosti zlomenin ve vyšší míře, než jaké by se dosáhlo za použití kterékoliv ze složek samotné. Tento vynález představuje významný příspěvek v tomto

-5CZ 297452 B6 oboru tím, že poskytuje kompozice a způsoby, které zvyšují a zachovávají kostní hmotu, což se projevuje prevencí, retardací a/nebo regresí osteoporózy a příbuzných kostních poruch.

Další znaky a výhody budou zřejmé z popisu a nároků tohoto vynálezu.

Následuje podrobnější popis vynálezu.

První sloučeninou podle tohoto vynálezu je agonista/antagonista savčího estrogenu. Jako první sloučeniny podle vynálezu je možno použít kteréhokoliv agonisty/antagonisty estrogenu. Pod pojmem agonista/antagonista estrogenu se rozumí sloučeniny, které jsou schopné se vázat k receptorů extrogenu, inhibovat obrat v kostech (tumover) a zabraňovat ztrátě kostní tkáně. Takové účinky odborník v tomto oboru snadno stanoví za použití standardních zkušebních postupů, jako jsou zkoušky vazby k receptorů estrogenu (viz „In vitro stanovení vazby k receptorům estrogenu“ dále), a standardních histomorfometrických a densitometrických metod (viz „Protokol o zkoušení agonistů/antagonistů estrogenu“ dále) a Eriksen E.F. et al., Bone Histomorphometry, Raven Press, New York, 1994, str. 1 až 74; Grier S. J. et al., The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry in Animals, Inv. Radiol., 1996, 31(1): 50 až 62; Wahner H.W. a Fogelman I., The Evaluation of Osteoporózis: Duál Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical practice, Martin Dunitz Lt., London, 1994, str. 1 až 296). Dále jsou uvedeny a popsány různé takové sloučeniny, ačkoliv odborníkům v tomto oboru budou známy ještě jiné agonisty/antagonity estrogenu.

Přednostním agonistou/antagonistou estrogenu je droloxifen ((E)-3-[l-[4-[2-(dimethylamino)ethoxy]fenyl]-2-fenyl-l-butenyl]fenol) a příbuzné sloučeniny, které jsou popsány v patentu US 5 047 431 (tento patent je zde citován náhradou za přenesení celého jeho obsahu do tohoto textu).

Dalším přednostním agonistou/antagonistou estrogenu je tamoxifen (2-hydroxy-l,2,3-propantrikarboxylát (Z)-2-[4-(l,2-difenyl-l-butenyl)fenoxy]-N,N-dimethyl]ethanaminu (1:1)) a příbuzné sloučeniny, které jsou popsány v patentu US 4 536 516. Další podobnou sloučeninou je 4hydroxytamoxifen, který je popsán v patentu US 4 613 660. (Oba tyto patenty jsou zde citovány náhradou za přenesení jejich celého obsahu do tohoto textu).

Dalším přednostním agonistou/antagonistou estrogenu je raloxifen (hydrochlorid [6-hydroxy-2(4-hydroxyfenyl)-benzo[b]thien-3-yl]-[4-[2-( 1 -piperidinyl)ethoxy]fenyl]methanolu a příbuzné sloučeniny, které jsou popsány v patentu US 4 418 068 (tento patent je zde citován náhradou za přenesení celého jeho obsahu do tohoto textu).

Dalším přednostním agonistou/antagonistou estrogenu je toremifen (2-hydroxy-l,2,3-propantrikarboxylát (Z)-2-[4-(4-chlor-l,2-difenyl-l-butenyI)fenoxy]-N,N-dimethylethanaminu (1:1)) a příbuzné sloučeniny, které jsou popsány v patentu 4 996 225 (tento patent je zde citován náhradou za přenesení celého jeho obsahu do tohoto textu).

Dalším přednostním agonistou/antagonistou estrogenu je centchroman (l-[2-[[4-(3,4-dihydro7-methoxy-2,2-dimethyl-3-fenyl-2íI-l-benzopyran-4-yl)fenoxy]ethyl]pyrrolidin) a příbuzné sloučeniny, které jsou popsány v patentu US 3 822 287 (tento patent je zde citován náhradou za přenesení celého jeho obsahu do tohoto textu).

Dalším přednostním agonistou/antagonistou estrogenu je idoxifen (1—[4—[[1—(4—jodfenyl)—2— fenyl-l-butenyl]fenoxy]ethyl]pyrrolidin) a příbuzné sloučeniny, které jsou popsány v patentu US 4 839 155 (tento patent je zde citován náhradou za přenesení celého jeho obsahu do tohoto textu).

Dalšími přednostními agonisty/antagonisty estrogenu jsou sloučeniny obecného vzorce I

-6CZ 297452 B6 (I),

kde

A představuje skupinu CH₂ nebo NR;

B, D a E představuje nezávisle vždy CH nebo N;

Y představuje (a) fenylskupinu, která je popřípadě substituována jedním až třemi substituenty nezávisle zvolenými z množiny substituentů ve významu R⁴;

(b) naftylskupinu, která je popřípadě substituována jedním až třemi substituenty nezávisle zvolenými z množiny substituentů ve významu R⁴;

(c) cykloalkylskupinu se 3 až 8 atomy uhlíku, která je popřípadě substituována jedním až dvěma substituenty nezávisle zvolenými z množiny substituentů ve významu R⁴;

(d) cykloalkenylskupinu se 3 až 8 atomy uhlíku, která je popřípadě substituována jedním až dvěma substituenty nezávisle zvolenými z množiny substituentů ve významu R⁴;

(e) pětičlennou heterocyklickou skupinu, která obsahuje až dva heteroatomy zvolené ze souboru skládajícího se z -0-, -NR²- a -S(O)_n- a která je popřípadě substituována jedním až třemi substituenty nezávisle zvolenými z množiny substituentů ve význaku R⁴;

(f) šestičlennou heterocyklickou skupinu, která obsahuje až dva heteroatomy zvolené ze souboru skládajícího se z -O-, -NR²-a -S(O)„- a která je popřípadě substituována jedním až třemi substituenty nezávisle zvolenými ze množiny substituentů ve významu R⁴; nebo (g) bicyklický kruhový systém, který je tvořen pěti- nebo šestičlenným heterocyklickým kruhem přikondenzovaným k fenylovému kruhu, přičemž tento heterocyklický kruh obsahuje až dva heteroatomy zvolené ze souboru skládajícího se z -O-, -NR²a -S(O)_n- a je popřípadě substituován jedním až třemi substituenty nezávisle zvolený z množiny substituentů ve významu R⁴;

Z¹ představuje skupinu obecného vzorce (a) -(CH₂)_pW(CH₂)_q-;

(b) -O(CH₂)_pCR⁵R⁶-;

(c) -O(CH₂)_pW(CH₂)_q-;

(d) -OCHR²CHR³-; nebo (e) -SCHR²CHR³-;

G představuje skupinu obecného vzorce (a) NR⁷R⁸;

(b), <ch₂>.^ —trz* \CH₂)nf kde n představuje číslo 0, 1 nebo 2, m představuje číslo 1, 2 nebo 3, Z² představuje -NH-, -0-, -S- nebo -CH₂-; která je popřípadě kondenzována prostřednictvím sousedních atomů uhlíku s jedním nebo dvěma fenylovými kruhy; a popřípadě nezávisle substituována na uhlíku jedním až třemi substituenty a popřípadě nezávisle substituována na dusíku chemicky vhodným substituentem zvoleným z množiny významů R⁴; nebo (c) bicyklický aminový zbytek s 5 až 12 atomy uhlíku, který je buď přemostěný, nebo kondenzovaný a je popřípadě substituován jedním až třemi substituenty nezávisle zvolenými z množiny významů R⁴; nebo

Z¹ a G dohromady představují skupinu obecného vzorce

-OCH

W představuje skupinu vzorce (a) _ch₂-;

(b) -CH=CH-;

(c) -O-;

(d) -NR²-;

(e) -S(O)_n-;

(f) (g) -CR²(OH)-;

(h) -CONR²-;

(i) -NR²CO-;

(j)

nebo

-8CZ 297452 B6 (k) -C=C-;

R představuje atom vodíku nebo alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku;

R² a R³ nezávisle představuje (a) atom vodíku nebo (b) alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku;

R⁴ představuje (a) atom vodíku;

(b) atom halogenu;

(c) alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku;

(d) alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku;

(e) acyloxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku;

(f) alkylthioskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku;

(g) alkylsulfinylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku;

(h) alkylsulfonylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku;

(i) hydroxyalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku;

(j) arylalkyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části;

(k) -CO₂H;

(l) -CN;

(m) -CONHOR;

(n) -SO₂NHR;

(o) -NH₂;

(p) alkylaminoskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku;

(q) dialkylaminoskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových částí;

(r) -NHSO₂R;

(s) -NO₂;

(t) arylskupinu; nebo (u) hydroxyskupinu;

R⁵ a R⁶ nezávisle představuje vždy alkylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku nebo dohromady tvoří karbocyklický kruh se 3 až 10 atomy uhlíku;

R⁷ a R⁸ představuje nezávisle vždy (a) fenylskupinu;

(b) nasycený nebo nenasycený karbocyklický kruh se 3 až 10 atomy uhlíku;

(c) heterocyklický kruh se 3 až 10 atomy uhlíku, který obsahuje až dva heteroatomy zvolené ze souboru sestávajícího z -O-, -N- a -S-;

(d) atom vodíku;

(e) alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku; nebo (f) R⁷ a R⁸ dohromady s R⁵ nebo R⁶ tvoří tří- až osmičlenný kruh, který obsahuje dusík;

R⁷ a R⁸ v lineární nebo kruhové formě jsou popřípadě substituovány až třemi substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z alkylskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, halogenu, alkoxyskupiny, hydroxyskupiny a karboxyskupiny;

kruh, který je tvořen R⁷ a R⁸ je popřípadě kondenzován k fenylovému kruhu;

e představuje číslo 0, 1 nebo 2;

-9CZ 297452 B6 m představuje číslo 1, 2 nebo 3;

n představuje číslo 0, 1 nebo 2;

p představuje číslo 0, 1, 2 nebo 3;

q představuje číslo 0, 1,2 nebo 3;

jejich optické a geometrické isomery, toxické farmakologicky vhodné adiční soli s kyselinami, N-oxidy, estery a kvartemí amoniové soli.

Přednostními sloučeninami podle vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce

kde G představuje skupinu vzorce

R⁴ představuje atom vodíku, hydroxyskupinu, atom fluoru nebo chloru a

B a E představuje nezávisle vždy CH nebo atom dusíku.

Zvláště přednostní sloučeniny jsou zvoleny ze souboru sestávajícího z cis-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu; (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu; cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu; cis-l-[6'-pyrrolidinoethoxy-3'-pyridyl]-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydronaftalenu; l-(4'-pyrrolidinoethoxyfenyl)-2-(4-fluorfenyl)-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolinu; cis-6-(4-hydroxyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu a l-(4'-pyrrolidinoethoxyfenyl)-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolinu.

Výše uvedené sloučeniny podle vynálezu se snadno představují reakcemi ilustrovanými v dále uvedených schématech.

-10CZ 297452 B6

Některé sloučeniny obecného vzorce I se účelně připravují z nenasycených meziproduktů obecného vzorce II

(II) hydrogenací za přítomnosti katalyzátoru na bázi ušlechtilého kovu v rozpouštědle, které je inertní vůči této reakci. Tlak a teplota nejsou kritickými parametry a hydrogenace se normálně provádí po dobu několika hodin při teplotě místnosti za tlaku vodíku v rozmezí od 137 kPa do 550 kPa.

Hydrogenovaný produkt se izoluje, popřípadě přečistí a etherová skupina se rozštěpí působením kyselého katalyzátoru v rozpouštědle inertním vůči reakci při teplotě v rozmezí od 0 do 100 °C v závislosti na použitém kyselém katalyzátoru. Zjistilo se, že pro tuto reakci se hodí bromovodík při zvýšených teplotách, jakož i bromid boritý a chlorid hlinitý při teplotách v rozmezí od 0 °C do teploty okolí.

Produkt obecného vzorce I se může izolovat a přečistit standardními postupy.

Meziprodukty obecného vzorce II, kde A představuje methylenskupinu a B, D a E představují skupiny vzorce CH, jsou popsány v patentu US 3 274 213; J. Med. Chem.10, 78 (1967); J. Med. Chem. 10, 138 (1967) aj. Med. Chem. 12, 881 (1969). Všechny výše i dále uvedené citace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Tyto sloučeniny lze také vyrobit postupy popsanými dále.

Výroba sloučenin obecného vzorce I, kde e - 1, A = CH₂, Z¹ = OCH₂CH₂, G = cykloalkylaminoskupina a B = CH, je znázorněna ve schématu 1. Sloučeniny 1-2, kde D a E představuje vždy skupinu CH, je možno připravit alkylací 4-bromfenolu odpovídajícím N-chlorethylaminem za použití uhličitanu draselného, jako báze, v polárním aprotickém rozpouštědle, jako je dimethylformamid, při zvýšených teplotách. Přednostní teplotou je 100 °C. Sloučeniny 1-2, kde D a/nebo E představuje atom dusíku, se syntetizují za použití nukleofílní vytěsňovací reakce. Při této reakci se na dibromidy (1-1) působí hydroxyethylcykloalkylaminy za podmínek fázového přenosu, a tím se získají brómované aminy (1-2) [Synthesis, 77, 573 (1980)]. Po výměně halogenu za kov, která se provádí působením n-butyllithia nebo kovového hořčíku, se brómované aminy (1-2) převedou na odpovídající organolithná nebo organohořečnatá reakční činidla, která se podrobí reakci při nízké teplotě přednostně za přítomnosti chloridu česného (bez chloridu česného tato reakce také probíhá) s 6-methoxy-l-tetralonem. Po kyselém zpracování reakční směsi se získají buď karbonily (1-3), nebo styreny (1-4). Reakcí karbinolů (1-3) nebo styrenů (14) s bromačním činidlem, jako je pyridiniumbromidperbromid, se získají brómované styreny (1-5). Bromidy (1-5) se nechají reagovat s aryl- nebo heteroarylzinkchloridy nebo aryl- nebo heteroarylboronovými kyselinami za přítomnosti katalyzátoru na bázi kovového palladia, jako je například tetrakis(trífenylfosfín)palladium(0), za vzniku diarylstyrenů (1-6) [Pure & Applied Chem. 63, 419 (1991) a Bull. Chem. Soc. Jpn. 61, 3008 a 3010 (1988)]. Pro přípravu přednostních sloučenin se při této reakci použije substituovaných fenylzinkochloridů nebo substituovaných fenylboronových kyselin. Arylzinkchloridy se připravují rozložením odpovídajícího lithovaného reakčního činidla bezvodým chloridem zinečnatým. Arylboronové kyseliny, které nejsou obchodně dostupné, se připravují rozkladem odpovídajícího aryllithia trialkylborátem, přednostně trimethyl- nebo triisopropylborátem, po němž následuje zpracování vodnou kyselinou (Acta Chemica Scan. 47, 221 až 230 (1993)). Lithiovaná reakční činidla, která nejsou obchodně dostupná se připravují výměnou halogenu za kov z odpovídajícího bromu nebo jiného halogenidu působením n-butyl- nebo terč, butyllithia. Alternativně je možno lithované reakční činidlo připravit lithiací usnadněnou přítomností heteroatomu; tento způsob je popsán v Organic Reactions, sv. 27, kapitola 1. Katalytickou hydrogenací sloučenin 1-6 za přítomnosti například hydroxidu palladnatého na aktivním uhlí, se získají odpovídající intermediámí dihydromethoxysloučeniny, které se následně demetrhylují působením bromidu boritého v methylenchloridu při 0 °C nebo působením 48% bromovodíku v kyselině octové při teplotě 80 až 100 °C, za vzniku cílových struktur 1-7. Získané sloučeniny jsou racemické a racemáty lze štěpit na enantiomery vysokotlakou kapalinovou chromatografíí za použití sloupce chirální stacionární fáze, jako jsou sloupce Chiralcel OD. Optické štěpení lze alternativně provést překrystalováním diastereomerických solí vytvořených s opticky čistými kyselinami, jako je například 1, l'-binaftyl-2,2'-diylhydrogenfosfát.

cis-Sloučeniny (1-7) je možno isomerizovat na trans-sloučeniny působením báze.

Pokud D a/nebo E představuje atom dusíku, mohou se meziprodukty obecného vzorce II a sloučeniny obecného vzorce I připravovat z odpovídajících dihalogenpyridinů nebo pyrimidinů způsobem ilustrovaným ve schématu 1.

Methylether sloučeniny obecného vzorce I, kde e = 1, A = CH₂, Z¹ = OCH₂CH₂, G = pyrrolidinyl, D, E a B = CH a Y = fenyl, je také možno účelně připravovat tak, že se v prvním stupni provede hydrogenace nafoxidinu (Upjohn & Co., 700 Portage Road, Kalamazzo, MI 49 001 USA) v rozpouštědle inertním vůči této reakci za přítomnosti katalyzátoru na bázi ušlechtilého kovu. Teplota a tlak nejsou kritickými parametry při této reakci. Reakce se účelně provádí v ethanolu při teplotě místnosti po dobu přibližně 20 hodin za tlaku 343 kPa.

Druhý stupeň spočívá v odštěpení methoxyskupiny, což se provádí účelně při teplotě místnosti za použití kyselého katalyzátoru, jako je bromid boritý, v rozpouštědle inertním vůči této reakce, při teplotě 80 až 100 °C působením bromovodíku a kyseliny octové. Vzniklý produkt se izoluje konvenčními metodami a popřípadě převede na sůl s kyselinou.

- 12CZ 297452 B6

Schéma 1

1-1 f^OH

Λ

C3^>ř! KOH — .1 »

18-croun-6

1. n-BuLi

1-5 1-3 CH₃O

1-4 flrZnC1 nebo PrB(OH)₂, Pd<Ph₃P)₄

1-6 1-?

- 13 CZ 297452 B6

Sloučeniny obecného vzorce I, kde B představuje dusík, se připravují postupy ilustrovanými ve schématech 2 a 3.

Syntéza sloučenin obecného vzorce I, kde B představuje dusík, je znázorněna ve schématu 2. Chloridy arylsubstituovaných kyselin (2-1) poskytnou při reakci s primárními aminy arylsubstituované sekundární amidy (2-2). Tyto sloučeniny se redukují lithiumaluminiumhydridem v etherovém rozpouštědle na sekundární aminy (2-3). Následující acylací sloučenin (2-3) aroylchloridy se získají terciární amidy (2-4), které se cyklizují v horkém oxychloridu fosforečnanem na dihydroisochinoliniové soli (2-5). Redukcí tetrahydroboritanem sodným se ze sloučenin (2-5) získají alkoxytetrahydroisochinoliny. Cílové struktury se získají z posledně uvedených sloučenin demethylací bromidem boritým v methylenchloridu.

Schéma 2

R(CH,)_C0NHY

CHJ Sloučenina obecného vzorce I

2) BBr₃ ^{8 = duslk}

2-5

Syntéza sloučenin obecného vzorce I, kde B představuje dusík, je také popsána ve schématu 3. Sekundární aminy (3-1) se acylací benzyloxyaroylchloridy (3-2) předvedou na terciární amidy (3-3), které cyklizací horkým oxychloridem fosforečným poskytnou soli dihydroisochinolinu (3-4). Redukcí sloučenin (3-4) tetrahydroboritanem sodným a následující debenzylací vodnou kyselinou chlorovodíkovou se získají isochinoliny (3-5), které se podrobí alkylaci vhodně funkcionalizovanými chloridy a demethylací bromidem boritým za vzniku požadovaných cílových struktur.

-14CZ 297452 B6

C0C1

Schéma 3

3-1 (CHp.CHgNHY

CH₂C₆H₅

POC1₃

3-6

Jiné agonisty/antagonisty estrogenu jsou popsány v patentu US 4 133 814 (který je zde citován náhradou za přenesení celého jeho popisu do tohoto textu). Předmětem patentu US 4 133 814 5 jsou deriváty 2—fenyl—3—aroylbenzothiofenu a 2—fenyl—3—aroylbenzothiofen—1—oxidu.

- 15 CZ 297452 B6

Lednicer et al., J. Med. Chem. 12, 881 (1969) popisují antagonisty estrogenu, které odpovídají obecnému vzorci

kde R² představuje fenylskupinu nebo cyklopentylskupinu a R³ představuje atom vodíku, skupinu vzorce

-CHjCHj-nQ nebo -CH₂CHOHCH₂OH.

V patentu US 3 234 090 jsou popsány agonisty/antagonisty estrogenu obecného vzorce

Pr /'Ή' tfh tC_nH_2n_₂>

''P

R kde Ph představuje 1,2-fenylenový zbytek, Ar představuje monocyklickou karbocyklickou arylskupinu, která je substituována terciární amino-nižší alkyloxyskupinou, v níž je terciární aminoskupina oddělena od oxyskupiny alespoň dvěma atomy uhlíku; R představuje atom vodíku, alifatický zbytek, karbocyklický arylový zbytek, karbocyklický aralifatický zbytek, heterocyklický arylový zbytek nebo heterocyklický aralifatický zbytek; skupina obecného vzorce -(C_nH_2n_₂)představuje nerozvětvený alkylenový zbytek se 3 až 5 atomy uhlíku nesoucí skupiny Ar a R; jejich soli, N-oxidy, soli jejich N-oxidů a kvartemí amoniové sloučeniny, jakož i způsob výroby těchto sloučenin.

V patentu US 3 277 106 jsou popsány bazické ethery, které vykazují estrogen agonistické/antagonistické účinky, které vykazují estrogen agonistické/antagonistické účinky, které odpovídají obecnému vzorci

kde Ph představuje 1,2-fenylenový zbytek, Ar představuje monocyklický arylový zbytek, který je substituován alespoň jednou amino-nižší alkyloxyskupinou, v níž je atom dusíku oddělen od atomu kyslíku alespoň dvěma atomy uhlíku; R představuje arylový zbytek a zbytek vzorce

-(C_nH_2n_₂)- představuje nižší alkylenskupinu, která spolu se zbytkem Ph tvoří šesti- nebo sedmi-16CZ 297452 B6 členný kruh, jehož dva kruhové atomy uhlíku nesou skupiny Ar a R, jejich soli, N-oxidy, soli jejich N-oxidů a kvartémí amoniové sloučeniny.

V patentu US 3 274 213 jsou popsány agonisty/antagonisty estrogenu obecného vzorce

kde R1 a R2 nezávisle představuje vždy nižší alkylskupinu nebo oba dohromady tvoří spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny pěti- až sedmičlenný nasycený heterocyklický zbytek.

Druhou sloučeninou podle vynálezu může být obecně kterákoliv z dále popsaných sloučenin, která rozmnožují kostní hmotu na úroveň, která je nad práhem kostní fraktury (což je podrobně popsáno v World Health Organization Study World Healthe Organization, „Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporózis (1994). Report of a WHO study Group. World Health Organization Technical Series 843“).

Jako druhou sloučeninu podle vynálezu je tedy možno použít jakýkoliv prostaglandinu nebo agonisty/antagonisty prostaglandinu. Odborníkům v tomto oboru bude zřejmé, že je rovněž možno použít fluoridu sodného, pyrathyroidního hormonu (PTH), aktivních fragmentů parathyroidního hormonu, růstového hormonu nebo sekretagogů růstového hormonu. V následujících odstavcích jsou podrobněji popsány příklady druhé sloučeniny ve smyslu rozsahu tohoto vynálezu.

Podle vynálezu je možno jako druhé sloučeniny použít jakékoliv prostaglandinu. Pod pojmem „prostaglandin“ se rozumí sloučeniny, které jsou analogy přírodních prostaglandinů PGDj, PGD₂, PGE₂ a PGF₂a, které jsou užitečné pro léčbu osteoporózy. Tyto sloučeniny se vážou k receptorům prostaglandinu. Tuto vazbu může odborník v tomto oboru snadno stanovit za použití standardních zkušebních postupů (například An S. et al., Clonint and Expression of the EP₂Subtype of Human Receptors for Prostagnandin E₂, Biochemical and Biophysical Research Communication, 1993, 197(1): 263 až 270).

Prostaglandiny jsou alicyklické sloučeniny odvozené od základní sloučeniny, kyseliny prostanové. Atomy uhlíku základního prostaglandinu se počítají od karboxylového uhlíku přes cyklopentylový kru k terminálnímu uhlíku na sousedním postranním řetězci. Normálně mají sousední vedlejší řetězce orientaci trans. Přítomnost oxoskupiny na uhlíku C9 cyklopentylového zbytku je charakteristická pro prostaglandiny ze třídy E, zatímco PGE₂ obsahuje trans nenasycenou dvojnou vazbu mezi uhlíky v polohách C13-C14 a cis dvojnou vazbu mezi uhlíky v polohách C₅-C₆.

V následujícím testu jsou popsány nebo uvedeny různé prostaglandiny. Odborníkům v tomto oboru však budou známy ještě další prostaglandiny. Příklady prostaglandinů jsou uvedeny v patentech US4 171 331 aUS3 927 197 (které jsou zde citovány náhradou za přenesení celého jejich textu do tohoto popisu).

Norrdin et al., The Role of Prostaglandins in Bone in Vivo, Prostaglandins Leukotriene Essential Fatty Acids 41, 139 až 150, 1990 podává přehled o prostaglandinech s účinkem na kostní tkáň.

Jako druhé sloučeniny podle vynálezu je možno použít jakékoliv agonisty/antagonisty prostaglandinu. Pod pojmem „agonista/antagonista prostaglandinu“ se rozumějí sloučeniny, které se vážou k receptorům prostaglandinu (například An S. et al., Cloning and Expression of the EP₂

- 17CZ 297452 B6

Subtype of Human Receptors for Prostaglandin E₂, Biochemical and Biophysical Research Communication, 1939, 197(1): 263 až 270) a napodobují účinek prostaglandinu in vivo (například stimulují tvorbu kosti a zvyšují kostní hmotu). Takové účinky odborník v tomto oboru snadno stanoví za použití standardních zkušebních postupů, (například „Protokol o zkoušení anabolických činidel“ uvedený dále; Eriksen E.F. et al., Bone Histomorphometry, Raven Press, New York, 1994, str. 1 až 74; Grier S. J. et al., The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry In Animals, Inv. Radiol., 1996, 31(1): 50 až 62; Wahner H. W. a Fogelman I., The Evaluation of Osteoporózis: Duál Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical practice, Martin Dunitz Ltd., London, 1994, str. 1 až 296). Příklady agonistů/antagonistů prostaglandinu jsou uvedeny dále, odborníkům v tomto oboru je však zřejmé, že existují i další agonisty/antagonisty prostaglandinu. Konkrétní příklady agonistů/antagonistů prostaglendinu lze například nalézt v dále uvedených dokumentech.

V patentu US 3 932 389 jsou popsány 2-deskarboxy-2-(tetrazol-5-yl)-l l-desoxy-15-substituované-omega-pentanorprostaglandiny, které jsou užitečné pro tvorbu kostní tkáně.

V patentu US 4 018 892 jsou popsány p-bifenylestery 16-aryl-13,14-dihydro-PGE₂, které jsou užitečné pro tvorbu kostní tkáně.

V patentu US 4 219 483 jsou popsány 2,3,6-substituované-4-pyrony, které jsou užitečné pro tvorbu kostní tkáně.

V patentu US 4 132 847 jsou popsány 2,3,6-substituované-4-pyrony které jsou užitečné pro tvorbu kostní tkáně.

V patentu US 4 000 309 jsou popsány p-bifenylestery 16-aryl-13,14-dihydro-PGE₂, které jsou užitečné pro tvorbu kostní tkáně.

V patentu US 3 982 016 jsou popsány p-bifenylestery 16-aryl-13,14-dihydro-PGE₂, které jsou užitečné pro tvorbu kostní tkáně.

V patentu US 4 621 100 jsou popsány substituované cyklopentany, které jsou užitečné pro tvorbu kostní tkáně.

V patentu US 5 216 183 jsou popsány cyklopentanony, které jsou užitečné pro tvorbu kostní tkáně.

Obecně lze sloučeniny podle vynálezu připravovat způsoby, které zahrnují postupy známé v oboru chemie, konkrétněji ve světle následujícího popisu.

Některé preparativní metody pro výrobu sloučenin podle vynálezu mohou vyžadovat chránění vzdálených funkčních skupin (tj. primárních a sekundárních aminoskupin a dále karboxyskupin). Potřeba takového chránění se může měnit v závislosti na druhu vzdálené funkční skupiny a podmínkách použitých při přípravě. Potřebu takového chránění může odborník v tomto oboru snadno určit. Používání metod zavádění/odštěpování chránících skupin leží v rozsahu zkušeností běžného odborníka. Obecný popis chránících skupina jejich používání je možno nalézt v publikaci T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, USA, 1991. Výchozí látky a reakční činidla pro výrobu sloučenin podle vynálezu jsou také snadno dostupné, neboje lze snadno syntetizovat běžnými metodami organické syntézy známými odborníkům v tomto oboru. Tak například mnohé používané sloučeniny jsou příbuzné přírodním sloučeninám nebo se jedná o jejich deriváty. Na látky tohoto typu se upírá značný vědecký zájem a existuje po nich značná obchodní poptávka, a v důsledku toho jsou mnohé z těchto meziproduktů obchodně dostupné nebojsou popsány v literatuře nebojsou snadno připravitelné z jiných běžně dostupných látek metodami citovanými v literatuře. Takovými sloučeninami jsou například prostaglandiny.

-18CZ 297452 B6

Některé sloučeniny podle vynálezu obsahují asymetrické atomy uhlíku, a proto se vyskytují ve formě enantiomerů nebo diastereomerů. Diastereomerické směsi je možno dělit na individuální diastereomery na základě jejich fyzikálně chemických odlišností o sobě známými metodami, například chromatografií a/nebo frakční krystalizaci. Enantiomery je možno dělit tak, že se enantiomerická směs převede na diastereomerickou směs reakcí s vhodnou opticky aktivní sloučeninou (například alkoholem), potom se oddělí diastereomery a jednotlivé diastereomery se převedou (například hydrolýzou) na odpovídající čisté enantiomery. Do rozsahu vynálezu spadají všechny takové isomery, včetně diastereomerů a enantiomerů, jakož i jejich směsi.

Přestože mnohé ze sloučenin podle vynálezu nejsou ionizovatelné za fyziologických podmínek, některé ze sloučenin podle vynálezu naopak ionizovatelné za fyziologických podmínek jsou. Tak například některé ze sloučenin podle vynálezu jsou kyselé a mohou tvořit soli s farmaceuticky vhodnými kationty. Všechny takové soli spadají do rozsahu tohoto vynálezu a je možno je připravovat konvenčními metodami. Tak například je možno je připravit jednoduše tak, že se kyselé a zásadité složky smíchají, obvykle ve stechiometrickém poměru, ve vodném, nevodném nebo zčásti vodném prostředí, podle toho, jak je to vhodné. Soli se izolují buď filtrací, nebo srážením nerozpouštědlem s následující filtrací, nebo odpařením rozpouštědla nebo v případě vodných roztoků také lyofilizaci, podle toho, jak je to vhodné.

Kromě toho, některé ze sloučenin podle vynálezu jsou bazické a mohou tvořit soli s farmaceuticky vhodným aniontem. Všechny takové soli spadají do rozsahu tohoto vynálezu a je možno je připravovat konvenčními metodami. Tak například je možno je připravit jednoduše tak, že se kyselé a zásadité složky smíchají, obvykle ve stechiometrickém poměru, ve vodném, nevodném nebo zčásti vodném prostředí, podle toho, jak je to vhodné. Soli se izolují buď filtrací, nebo srážením nerozpouštědlem s následující filtrací, nebo odpařením rozpouštědla nebo v případě vodných roztoků také lyofilizaci.

Některé ze sloučenin podle vynálezu také tvoří hydráty nebo solváty a také tyto formy spadají do rozsahu vynálezu.

Farmaceutické kombinace a postupy podle tohoto vynálezu jsou všechny přizpůsobeny pro léčebná použití jako činidla, která buď aktivují obrat kosti, nebo zabraňují resorpci kosti nebo zvyšují tvorbu kostní tkáně u savců, zejména lidí. Jelikož jsou tyto proces mají úzkou spojitost s vývojem osteoporózy a kostních chorob, kombinace podle vynálezu svým účinkem zabraňují osteoporóze nebojí zpomalují, potlačují nebo revertují.

Užitečnost sloučenin podle vynálezu jako léčiv vhodných pro léčení stavů, které jsou odprovázeny nízkou kostní hmotou (například osteoporózy) u savců, (například lidí, zejména u žen) je možno demonstrovat pomocí účinnost sloučenin podle vynálezu při konvenčních zkouškách a při zkouškách účinnosti in vitro a in vivo popsaných dále (Protokol o kombinační a postupné léčbě; Protokol o zkoušení agonistů/antagonistů estrogenu; Protokol o zkoušení anabolických činidel; In vitro stanovení vazby k receptorům estrogenu; a Protokol o zkoušení růstového hormonu/sekretagenů růstového hormonu). Tyto zkoušky představují rovněž prostředek umožňující porovnání účinnosti sloučenin podle vynálezu navzájem a s účinností jiných známých sloučenin.

Výsledky těchto srovnávacích zkoušek jsou užitečné pro určení úrovně dávkování u savců, včetně člověka, při léčení takových chorob.

Protokol o kombinační a postupné léčbě

Následující protokoly samozřejmě odborníci v tomto oboru mohou obměňovat. Tak je při studii například možno použít intaktních samců nebo samic potkana, potkaních samců nebo samic s deficiencí pohlavních hormonů (orchidektomizovaných nebo ovariektomizovaných). Kromě toho je pro zkoušky možno použít samců nebo samic potkana o různém stáří (jako asi

-19CZ 297452 B6 měsíců). Potkani mohou být buď intaktní, nebo kastrovaní (ovariektomií nebo orchidektomií), přičemž se jim podávají anabolická činidla, nebo prostaglandin E2 (PGE2) v různých dávkách (jako 1, 3 nebo 6 mg/kg/den) po určitou dobu (jako 2 týdny až 2 měsíce), načež se jim podává antiresorpční činidlo, jako droloxifem, v různých dávkách (jako 1,5, 10 mg/kg/den) po určitou dobu (jako 2 týdny až 2 měsíce). Alternativně se potkani mohou podrobit kombinačnímu ošetření anabolickým činidlem a antiresorpčním činidlem v různých dávkách po určitou dobu (jako 2 týdny až 2 měsíce). V případě kastrovaných potkanů může ošetření začít následující den po výkonu (pro účely zabránění ztrátě kostní tkáně) nebo v době, kdy již došlo ke ztrátě kostní tkáně (pro účely jejího znovuobnovení).

Dále jsou uvedeny protokoly o zkouškách za použití PGE2, jako kostního anabolického činidla, a droloxifenu, jako antiresorpčního činidla. Za použití tohoto protokolu je však možno zkoušet i jiná anabolická a antiresorpční činidla.

Stočtyři samic potkana Sprague-Dawley (Charles River, Wilmington, MA, USA) o stáří 12 měsíců se v měsíci 0 podrobí fiktivní operaci nebo se ovariektomizuje (OVX).

Tři měsíce po výkonu se ovariektomizovaných potkanů po dobu 2 měsíců podává buď prostaglandin E₂ (PGE₂), známé kostní anabolické činidlo, v dávce 3 mg/kg/den (subkutánní injekcí), nebo PGE₂ v dávce 3 mg/kg/den (subkutánní injekcí) v kombinaci s droloxifenem (DRO) v dávce 10 mg/kg/den (orálně). Poté se ošetřování PGE₂ přeruší a potkani se po dobu 1,5 měsíce ošetřují buď vehikulem (10% alkohol v solném roztoku), nebo DRO (10 mg/kg/den, orálně) tak, jakje popsáno dále.

Skupina I: Osm potkanů se obdukuje v čas 0 měsíců, jako základní kontrola.

Skupina II: Osm fiktivně operovaných potkanů se obdukuje v čas 3 měsíce, jako kontrola stavu před ošetřením.

Skupina III: Osmi fiktivně operovaných potkanů se v čase 3 až 5 měsíců orálně podává vehikulum (10% ethanol v solném roztoku) a v čase 5 měsíců se provede jejich obdukce.

Skupina IV: Osmi fiktivně operovaným potkanům se v čase 3 až 6,5 měsíce orálně podává vehikulum (10% ethanol v solném roztoku) a čase 6,5 měsíce se provede jejich obdukce.

Skupina V: Osm ovariektomizovaných potkanů se v čase 3 měsíce obdukuje, jako kontrola stavu před ošetřením.

Skupina VI: Osmi ovariektominovaných potkanů se v čase 3 až 5 měsíců orálně podává vehikulum (10% ethanol v solném roztoku) a v čase 5 měsíců se provede jejich obdukce.

Skupina VII: Osmi ovariektominovaných potkanů se v čase 3 až 6,5 měsíce orálně podává vehikulum (10% ethanol v solném roztoku) a v čase 6,5 měsíce se provede jejich obdukce.

Skupina VIII: Osmi ovariektominovaných potkanů se v čase 3 až 5 měsíce subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a v čase 5 měsíců se provede jejich obdukce.

Skupina IX: Osmi ovariektominovaných potkanů se v čase 3 až 5 měsíců subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a čase 5 až 6,5 měsíce vehikulum a v čase 6,5 měsíce se provede jejich obdukce.

Skupina X: Osmi ovariektominovaných potkanů se v čase 3 až 5 měsíců subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a v čase 5 až 6,5 měsíce orálně DRO v dávce 10 mg/kg/den, načež se v čase 6,5 měsíce provede jejich obdukce.

-20CZ 297452 B6

Skupina XI: Osmi ovariektominovaných potkanům se v čase 3 až 5 měsíců subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a orálně DRO v dávce 10 m/mg/den, načež se v čase měsíců provede jejich obdukce.

Skupina XII: Osmi ovariektominovaných potkanů se v čase 3 až 5 měsíců subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a orálně DRO v dávce 10 mg/kg/den a v čase 5 až 6,5 měsíce vehikulum, načež se v čase 6,5 měsíce provede jejich obdukce.

Skupina XIII: Osmi ovariektominovaných potkanů se v čase 3 až 5 měsíců subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a orální DRO v dávce 10 mg/kg/den a v čase 5 až 6,5 měsíce samotný DRO, načež se v čase 6,5 měsíce provede jejich obdukce.

PGE2 (Cayman, Chemical Co., Ann Arbor, MI, USA) a droloxifen (Pfizer lne. Groton, CT, USA) ve formě prášku se nejprve rozpustí ve 100% ethanolu. Ethanolické roztoky se dále zředí solným roztokem na požadovanou koncentraci (konečná koncentrace ethanolu je 10 %). Roztok PGE se podává denně subkutánními injekcemi do hřbetu v dávce 1 m/kg. Roztok droloxifenu se podává perorálně každý den v dávce 1 ml/potkan. Všem potkanům se subkutánními injekcemi dvanáct dnů a dva dny před usmrcením podá 10 mg/kg kalceinu (fluorchromového kostního markéru, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) za účelem zkoumání dynamických změn v kostní tkáni.

Potkani se usmrtí pod anastézí ketaminem. Na závěr zkoušky se provede následující měření:

Stanovení minerálů ve femuru

Při pitvě se každému potkanu vyjme pravý femur a podrobí skanování za použití zařízení pro rengenovou absorpciometrii při dvou energetických úrovních (duální fotonová rengenová technika, DXA, QDR 1000/W, Hologic lne., Waltham, MA, USA) vybaveného softwarem „Regional High Resolution Scan“ (Hologic lne., Waltham, MA, USA), přičemž velikost snímaného poleje

50,8 x 19,02 mm, rozlišení 0,254 x 0,127 mm a rychlost snímání 7,25 mm/s. Analyzují se skanové obrazce femuru a stanoví se kostní plocha, minerální obsah kosti (BMC) a minerální hustota kosti (BMD) celého femuru (WF), distální femorální metafýzy (DFM), dříku femuru (FS) a proximálního femuru (PF).

Stanovení minerálů v bederní páteři

Za použití zařízení pro rentgenovou absorpciometrii při dvou energetických úrovních (duální fotonová rentgenová technika, DXA, QDR 1000/W, Hologic lne., Waltham, MA, USA) vybaveného softwarem „Regional High Resolution Scan“ (Hologic lne., Waltham, MA, USA) se u anesterizovaných potkanů stanoví kostní plocha, minerální obsah kosti (BMC) a minerální hustota kosti (BMD) celé bederní páteře a každého ze šesti lumbálních obratlů (LVI až LV6). Potkani se anestetizují intraperitoneální injekcí 1 ml/kg směsi ketaminu a rompunu v poměru 4:3a poté umístí na desku pro potkany. Velikost snímaného pole je 60 x 19 mm, rozlišení 0,254 x 0,127 mm a rychlost snímání 7,25 mm/s. Získané skanové obrazce celé bederní páteře se analyzují. Stanoví se kostní plocha (BA) a minerální obsah kosti (BMC). Vypočítá se minerální hustota kosti (BMC děleno BA) pro celou bederní páteř a pro každý ze šesti lumbálních obratlů (LVI až LV6).

Histomorfometrická analýza spongiosy proximální metafýzy tibie

Při pitvě se vyjme pravá holenní kost, svaly se odpreparují a kost se nařeže na tři části. Proximální tibie se fixuje v 70% ethanolu, dehydruje ethanolem o odstupňované koncentraci, v acetonu zbaví tuku a poté uloží do methylmethakrylátu (Eastman Organic CHemical,

Rochester, NY, USA). Přední části proximální metafýzy tibie se za použití zařízení pro mikrotomy Reichert-jung Polycut S nařežou na tloušťku 4 a 10 pm. Pro histomorfometrii spongiosní

-21 CZ 297452 B6 kosti se použije jedno 4pm řezu a jednoho 10 μηι řezu od každého potkana. Řezy o tloušťce μιη se obarví modifikovaným Massonovým barvivém Trichrome, zatímco ΙΟμιη řezy se ponechají neobarvené.

Pro statická a dynamická histomorfometrická měření sekundární spongiosy proximální metafyzy tibie mezi 1,2 a 3,6 mm distálně k funkci růstové chrupavky a epifyzy se použije histomorfometrického systému Bioquant OS/2 (R&M biometrics, Inc., Nashville TN, USA). Prvních 1,2 mm metafyzové oblasti tibie je třeba vynechat, aby se měření omezilo na sekundární spongiosu. Pro stanovení ukazatelů objemu kosti, struktury kosti a resorpce kosti se použije 4pm řezů, zatímco pro stanovení ukazatelů tvorby kostní tkáně a obratu kosti se použije ΙΟμιη řezů.

I. Měření a výpočty objemu trámčiny kosti a struktury:

1. Celková plocha metafázy (TV, mm²); ploch metaiyzy mezi 1,2 a 3,6 mm distálně k funkci růstové chrupavky a epifázy.

2. Plocha trámčité kosti (BV, mm²): celková plocha trámčiny v TV.

3. Obvod trámčité kosti (BS, mm): délka celkového obvodu trámčité kosti.

4. Objem trámčité kosti (BV/TV, %): BV/TV x 100.

5. Krabekulámí kostní číslo (TBN, #/mm): l,199/2xBS/TV.

6. Tloušťka trámčité kosti (TBT, pm): (2000/1,199)x (BV/BS).

7. Trabekulámí kostní separace (TBS, pm): (2000x1,199)x(TV-BV).

II. Měření a výpočty resorpce kosti

1. Počet osteoklastů (OCN, #): celkový počet osteoklastů v celé oblasti metafyzy.

2. Obvod osteoklastů (OCP, mm): délka obvodu trámčiny pokryté osteoklasty.

3. Počet osteoklastů na mililitr (OCN/mm, #/mm): OCN/BS.

4. Procetický obvod osteoklastů (%OCP, %): OCP/BSxlOO.

III. Měření a výpočty tvorby kostní tkáně a obratu kosti

1. Obvod jednou značený kalceinem (SLS, mm): celková délka obvodu trámčité kosti s jednou kalceinovou značkou.

2. Obvod dvakrát značený kalceinem (DLS, mm): celková délka obvodu trámčité kosti se dvěma kalceinovými značkami.

3. Vzdálenost mezi značkami (ILW, pm): průměrná vzdálenost mezi dvěma kalceinovými značkami.

4. Procento mineralizovaného obvodu (PMS, %): (SLS/2 + DSL)/BSxl00.

5. Rychlost minerální apozice (MAR, pm/den): ILW/značkový interval.

6. Rychlost tvorby kosti/povrch ref. (BFR/BS, pm²/den/pm): (SLS/2+DSL)xMAR/BS.

7. Rychlost obratu kosti (BTR, %/rok): (SLS/2+DLS)xMAR/BVxl 00.

Statistické metody

Statistické údaje se vypočtou za použití balíčku StatView 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA, USA). Pro porovnání rozdílů mezi skupinami je možno použít analýzy variace (ANOVA) a poté Fisherovy PLSD.

Protokol o zkoušení agonistů/antagonistů estrogenu

Agonisté/antagonisté estrogenu představují třídu sloučenin, které inhibují obrat (tumover) kostí a zabraňují ztrátě kostní tkáně indukované nedostatkem estrogenu. Jako modelu postmenopausál-22CZ 297452 B6 ního úbytku kostní tkáně se často používá modelu s ovariektomizovanými potkany. Za použití tohoto modelu je možno zkouše schopnost agonisty/antagonisty estrogenu zabraňovat úbytky kostní tkáně a inhibovat resorpci kosti.

Pro studii se použije samic potkana Sprague-Dawley (Charler River, Wilmington, MA, USA) o různém stáří (například 5 měsíců). Potkani se během období zkoušky chovají jednotlivě v klecích 20 x 32 x 20 cm. Všem zvířatům se ponechá volný přístup k vodě a peletizované potravě dostupné na trhu (Agway ProLab 3000, Agway, County Food, lne., Syracuse, NY, USA) obsahující 0,97 % vápníku, 0,85 % fosforu a 1,05 IU/g vitaminu D₃.

Skupina potkanů (8 až 10) se podrobí fiktivní operaci a ošetřuje perorálním podáváním vehikula (10% ethanolu a 90 % solného roztoku, 1 ml/den), zatímco zbývající potkani se oboustranně ovariektomizují (OVX) a po určitou dobu (jako 4 týdnů) se jim podává buď vehikulum (perorálně) 17p-estradiol (Sigma, E-8876, E₂, 30 pg/kg, denně subkutánními injekcemi), nebo antagonisté/agonisté estrogenu (jako droloxifen v dávkách 5, 10 nebo 20 mg/kg, denně, perorálně). Za účelem sledování dynamických změn v kostní tkáni se 12 dnů a 2 dny před usmrcením všem potkanům subkutánními injekcemi podá 10 mg/kg kalceinu (fluorchromový kostní markér). Po 4 týdnech ošetřování se provede pitva. Na závěr zkoušky se provedou tato měření:

Přírůstek tělesné hmotnosti: tělesná hmotnost při obdukci minus tělesná hmotnost při chirurgickém výkonu.

Hmotnost a histologie dělohy: Během pitvy se každému potkanu vyjme děloha, která se ihned zváží. Poté se dělohy podrobí histologickým měřením, jako je měření plochy průřezu tkáně, tloušťky stromatu a luminální tloušťky epithelu.

Celkový obsah cholesterolu v séru: Krev získaná srdeční punkcí se nechá vysrážet při 4 °C a poté centrifuguje 10 minut při 2000 x g. Vzorky séra se analyzují na celkový sérový cholesterol za použití kalorimetrické vysoce výkonné zkoušky na cholesterol (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, USA).

Stanovení minerálů ve femuru

Při pitvě se každému potkanu vyjme pravý femur a podrobí skanování za použití zařízení pro rentgenovou absorpciometrii při dvou energetických úrovních (duální fotonová rentgenová technika, DXA, QDR 1000/W, Hologic lne., Waltham, MA, USA) vybaveného softwarem „Regional High Resolution Scan“ (Hologic lne., Waltham, MA, USA), přičemž velikost snímaného poleje

50,8 x 19,02 mm, rozlišení 0,254 x 0,127 mm a rychlost snímání 7,25 mm/s. Analyzují se skanové obrazce femuru a stanoví se kostní plocha, minerální obsah kosti (BMC) a minerální hustota kosti (BMD) celého femuru (WF), distální femorální metafyzy (DFM), dříku femuru (FS) a proximálního femuru (PF).

Histomorfometrická analýza spongiosy proximální metafyzy tibie

Při pitvě se vyjme pravá holenní kost, svaly se odpreparují a kost se nařeže natři části. Proximální tibie se fixuje v 70% ethanolu, dehydruje ethanolem o odstupňované koncentraci, v acetonu zbaví tuku a poté uloží do methylmethakrylátu (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY, USA). Přední části proximální metafyzy tibie se za použití zařízení pro mikrotomy Reichert-Jung Polycut S nařežou na tloušťku 4 a 10 pm. Pro histomorfometrii spongiosní kosti se použije jednoho 4pm řezu a jednoho lOpm řezu od každého potkana. Řezy o tloušťce 4 pm se obarví modifikovaným Massonovým barvivém Trichrome, zatímco 10pm řezy se ponechají neobarvené.

Pros tatická a dynamická histomorfometrická měření sekundární spongiosy proximální metafázy tibie mezi 1,2 a 3,6 mm distálně kjunkci růstové chrupavky a epifyzy se použije histomorfometrického systému Bioquant OS/2 (R&M, biometrics, lne., Nashville, TN, USA). Prvních

-23 CZ 297452 B6

1,2 mm metafázové oblasti tibie je třeba vynechat, aby se měření omezilo na sekundární spongiosu. Pro stanovení ukazatelů objemu kosti, struktury kosti a resorpce kosti se použije 4pm řezů, zatímco po stanovení ukazatelů tvorby kostní tkáně a obratu kosti se použije lOpm řezů.

I. Měření a výpočty objemu trámčiny kosti a struktury:

1. Celková plocha metafýzy (TV, mm²); plocha metafýzy mezi 1,2 a 3,6 mm distálně k junkci růstové chrupavky a epifyzy.

2. Plocha trámčité kosti (BV, mm²): celková plocha trámčiny v TV.

4. Objem trámčité kosti (BV/TV, %): BV/TV x 100.

5. Trabekulároí kostní číslo (TBN, #/tnm): 1,199/2xBS/TV.

6. Tloušťka trámčité kosti (TBT, pm): (2000/1,199)x(BV/BS).

7. Trabekulámí kostní separace (TBS, pm): (2000x1,199)x(TV-BV).

II. Měření a výpočty resorpce kosti

1. Počet osteoklastů (OCN, #): celkový počet osteoklastů v celé oblasti metafýzy.

2. Obvod osteoklastů (OCP, mm): délka obvodu trámčiny pokryté osteoklasty.

3. Počet osteokladů na milimetr (OCN/m, #/mm): OCN/BS.

4. Procetický obvod osteoklastů (%OCP, %): OCP/BSxlOO.

III. Měření a výpočty tvorby kostní tkáně a obratu kosti

4. Procento mineralizovaného obvodu (PMS, %): (SLS/2 + DLS)/BSxl00.

5. Rychlost minerální apozice (MAR, pm/den): ILW/značkový interval.

6. Rychlost tvorby kosti/povrch ref. (BFR/BS, pm²/den/pm): (SLS/2+DLS)xMAR/BS.

7. Rychlost obratu kosti (BTR, %/rok): (SLS/2+DLS)xMAR/BVxl00.

Statistické metody

Statistické údaje se vypočtou za použití balíčku StatView 4.0 (Abacus Concept, lne., Berkeley, CA, USA). Pro porovnání rozdílů mezi skupinami je možno použít analýzy variace (ANOVA) a poté Fisherovy PLSD.

Protokol o zkoušení anabolických činidel

Účinnost činidel s anabolickým účinkem na kosti při stimulaci tvorby kosti a zvyšování kostní hmoty je možno zkoušet na intaktních samcích nebo samicích potkana nebo na samcích nebo samicích potkana s deficiencí pohlavních hormonů (po orchidektomii nebo ovariektomii).

Pro studii se použije samců nebo samic potkana o různém stáří (jako 3 měsíců). Buď intaktní, nebo kastrovaní (ovariektomizovaní nebo orchidektomizovaní) potkani se po určitou dobu (jako týdnů až 2 měsíců) ošetřují subkutánní injekcemi nebo perorálně anabolickými činidly, jako prostaglandinem E2 (PGE2) v různých dávkách (jako 1, 3 nebo 6 mg/kg/den). V případě kastrovaných potkanů se ošetřování zahájí následující den po výkonu (pro účely zabránění ztrátě kostní

-24CZ 297452 B6 tkáně) nebo v době, kdy již došlo ke ztrátě kostní tkáně (pro účely jejího znovuobnovení). Všem zvířatům se během zkoušky ponechá volný přístup k vodě a peletizované potravě dostupné na trhu (Teklad Rodent Diet #8064, Harlan Teklad, Madison, WI, USA) obsahující 1,46 % vápníku,

0,99 % fosforu a 4,96 IU/g vitaminu D₃. 12 dnů a 2 dny před usmrcením se všem potkanům subkutánními injekcemi podá 10 mg/kg kalceinu (fluorchromový kostní markér).

Potkani se usmrtí a provedou se následující měření:

Stanovení minerálů ve femuru

Při pitvě se každému potkanu vyjme pravý femur a podrobí skanování za použití zařízení pro rentgenovou absorpciometrii při dvou energetických úrovních (duální fotonová rentgenová technika, DXA, QDR 1000/W, Hologic lne., Waltham, MA, USA) vybaveného softwarem „Regional Hith Resolution Scan“ (Hologic lne. Waltham, MA, USA), přičemž velikost snímaného pole je

Histomorfometrická analýza spongiosy proximální metafýzy tibie

Při pitvě se vyjme pravá holenní kost, svaly se odpreparují a kost se nařeže na tři části. Proximální tibie se fixuje v 70% ethanolu, dehydruje ethanolem o odstupňované koncentraci, v acetonu zbaví tuku a poté uloží do methylmethakrylátu (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY, USA). Přední části proximální metafýzy tibie se za použití zařízení pro mikrotomy Reichert-Jung Polycut S nařežou na tloušťku 4 a 10 pm. Pro histomorfometrii spongiosní kosti se použije jednoho 4pm řezu a jednoho 10pm řezu od každého potkana. Řezy o tloušťce 4 pm se obarví modifikovaným Massonovým barvivém Tricrome, zatímco lOpm řezy se ponechají neobarvené.

Pro statická a dynamická histomorfolmetrická měření sekundární spongiosy proximální metafýzy tibie mezi 1,2 a 3,6 mm distálně kjunkci růstové chrupavky a epifýzy se použije histomorfometrického systému Boquant OS/2 (R&M biometrics, lne., Nashville, TN, USA). Prvních 1,2 mm metafýzové oblasti tibie je třeba vynechat, aby se měření omezilo na sekundární spongiosu. Pro stanovení ukazatelů objemu kosti, struktury kosti a resorpce kosti se použije 4pm řezů, zatímco pro stanovení ukazatelů tvorby kostní tkáně a obratu kosti se použije lOpm řezů.

I. Měření a výpočty objemu trámčiny kosti a struktury:

1. Celková plocha metafýzy (TV, mm²); plocha metafýzy mezi 1,2 a 3,6 mm distálně kjunkci růstové chrupavky a epifýzy.

2. Plocha trámčité kosti (BV, mm²): celková plocha trámčiny v TV.

4. Objem trámčité kosti (BV/TV, %): BV/TV x 100.

5. Trabekulámí kostní číslo (TBN, #/mm): l,199/2xBS/TV.

6. Tloušťka trámčité kosti (TBT, pm): (2000/1,199)x(BV/BS).

7. Trabekulámí kostní separace (TBS, pm): (2000xl,199)x(TV-BV).

II. Měření a výpočty resorpce kosti

2. Obvod osteoklastů (OCP, mm): délka obvodu trámčiny pokryté osteoklasty.

3. Počet osteoklastů na milimetr (OCN/mm, #/mm): OCN/BS.

-25CZ 297452 B6

4. Procetický obvod osteoklastů (%OCP, %): OCP/BSxlOO.

III. Měření a výpočty tvorby kostní tkáně a obratu kosti

4. Procento mineralizovaného obvodu (PMS, %): (SLS/2 + DLS)/BSxl 00.

5. Rychlost minerální apozice (MAR, pm/den): ILW/značkový interval.

6. Rychlost tvorby kosti/povrch ref. (BFR/BS, pm²/den/pm): (SLS/2+DLS)xMAR/BS.

7. Rychlost obratu kosti (BTR, %/rok): (SLS/2+DLS)xMar/BVxl00.

Statistické metody

Statistické údaje se vypočtou za použití balíčku StatView 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA, USA). Pro porovnáni rozdílů mezi skupinami je možno použít analýzy variace (ANOVA) a poté Fisherovy PLSD.

In vitro stanovení vazby k receptorům estrogenu

Provede se vazebná zkouška in vitro, při níž se zjišťuje schopnost estrogen agonistických/antagonistických sloučenin podle vynálezu vytěsnit [ H]-estradiol z humánního receptoru estrogenu získaného rekombinantními metodami v kvasince, za účelem stanovení vazebné afinity sloučenin podle vynálezu k receptoru estrogenu. Při tomto stanovení se použije následujících látek:

1. zkouškového pufru TD-0,3 (obsahujícího lOnM Tris o pH 7,6, 0,3M chlorid draselný a 5mM DTT o pH 7,6);

2. [³H]-estradiolu, jako radioligandu (od firmy New England Nuclear);

3. estradiolu od firmy Sigma, jako studeného ligandu a

4. rekombinantního humánního receptoru estrogenu hER.

Vyrobí se roztok zkoušené sloučeniny v TD-0,3 s přísadou 4 % DMSO a 16 % ethanolu. Tritiovaný estradiol se rozpustí v TD-0,3 na konečnou koncentraci pro stanovení 5nM. Také hER se zředí TD-0,3 tak, aby v každé zkušební jamce bylo přítomno 4 až 10 pg proteinu celkem. Pracuje se s mikrotitrovými miskami a ke každému inkubátu se přidá 50 pl studeného estradiolu (nespecifická vazba) nebo roztoku sloučeniny, 20 pl roztoku tritiovaného estradiolu a 30 pl roztoku hER. V každé misce jsou obsaženy vždy tři replikace celkové vazebné a měnící se koncentrace sloučeniny. Misky se inkubují přes noc při 4 °C. Potom se vazebná reakce ukončí přídavkem a promícháním se 100 ml 3% hydroxylapatitu v lOmM Tris o pH 7,6. Inkubace se provádí 15 minut při 4 °C. Směsi se odstředí a pelety se 4 x promyjí vždy 1% roztokem smáčedla Triton XI00 v lOmM Tris o pH 7,6. Hydroxylapatitové pelety se suspendují v kapalině Ecoscint A a za použití β-scintografie se stanoví radioaktivita. U všech dat se vypočítá střední hodnota počtu radioaktivních impulzů za minutu (cpm), ze tří replikací. Specifická vazba se vypočítá odečtením nespecifického počtu radioaktivních impulsů za minutu (tento počet je definován jako cpm, které zbývají po oddělení reakční směsi obsahující rekombinantní receptor, radioligand a nadbytek neznačeného ligandu) od hodnoty cpm odpovídající celkové vazbě (tato hodnota je definována jako cpm, které zbývají po oddělení reakční směsi obsahující pouze rekombinantní receptor a radiligand). Účinnost (potence) sloučeniny se vyjádří hodnotu IC₅₀ (tato hodnota je definována jako koncentrace sloučeniny, které je zapotřebí pro 50% inhibici celkové specifické vazby tritiovaného estradiolu). Stanoví se specifická vazba za přítomnosti měnících se koncentrací

-26CZ 297452 B6 sloučeniny a vypočítá se procentický podíl specifické vazby v celkové specifické vazbě radioligandu. Data se vynesou do grafu jako inhibice sloučenou (%) (lineární stupnice) proti koncentraci sloučeniny (logaritmická stupnice).

Protokol o zkoušení růstového hormonu/sekretagogů růstového hormonu

Sloučeniny schopné stimulovat sekreci růstového hormonu u kultur buněk potkaní hypofyzy je možno identifikovat za použití následujícího protokolu. Tato zkouška je také užitečná pro porovnání se standardy při stanovování úrovně dávky. Buňky se izolují z podvěsků mozkových šestitýdenních samců potkana Wistar. Po dekapitaci se přední laloky hypofyzy umístí do chladného Hankova vyváženého solného roztoku, který neobsahuje vápník a hořčík (HBSS). Tkáně se jemně rozmělní, poté podrobí dvěma cyklům mechanicky podporované enzymatické dispergace za použití bakteriální proteázy (EC 3.4.24.4. Sigma P—6141) v HBSS v koncentraci 10 jednotek/ml. Směs tkáně a enzymu se míchá v rotující nádobě při frekvenci otáčení 30 min’¹v atmosféře 5% oxidu uhličitého při asi 37 °C po dobu asi 30 minut, po asi 15 minutách a asi 30 minutách ručně trituruje za použití lOml pipety. Výsledná směs se asi 5 minut centrifuguje při 200 x g. K supematantu se přidá koňské séru, aby se neutralizoval nadbytek proteázy. Peleta se resuspenduje v čerstvé proteáze a vzniklá suspenze se za výše uvedených podmínek přibližně 30 minut míchá a ručně trituruje, na závěr jehlou o velikosti 23. Přidá se znovu koňské sérum, načež se buňky zobou výluhů spojí, peletizují (200 x g po dobu asi 15 minut), promyjí, resuspendují v kultivačním médiu a spočítají. Buňky se navzorkují v množství asi 6,0 až 6,5 χ 10⁴ buněk/cm² do 48-jamkových misek Costar a 3 až 4 dny kultivují v Dulbeccem modifikovaném Eaglově médiu (D-MEM) doplněném 4,5 g/litr glukosy, 10% koňským sérem, 2,5% fetálním hovězím sérem, 1% neesenciálními aminokyselinami, lOOU/ml nystatinu a 50 mg/ml gentamycinsulfátu a poté zkoušejí na sekreci růstového hormonu.

Těsně před zkouškou se kultivační jamky dvakrát promyjí a poté ekvilibrují asi 30 minut v uvolňovacím médiu (D-MEM pufrovaném 25mM Hepes, pH 7,4 a obsahujícím 0,5% hovězí sérový albumin, při 37 °C). Zkoušené sloučeniny se rozpustí v dimethylsulfoxidu a roztok se zředí předehřátým uvolňovacím médiem. Zkoušky se provádějí se čtyřmi replikacemi. Zkouška se zahájí přídavkem 0,5 ml uvolňovacího média (obsahujícího vehikulum nebo zkoušenou sloučeninu) do každé kultivační jamky. Inkubace se provádí při asi 37 °C po dobu asi 15 minut a ukončí se odstraněním kultivačního média, které se centrifuguje při 2000 x g po dobu asi 15 minut, aby se odstranil buněčný materiál. Koncentrace potkaního růstového hormonu v supematantu se stanoví pomocí standardního protokolu radioimunoeseje za použití referenčních vzorků potkaního růstového hormonu (NIDDK-rGH-RP-2) a potkaního antiséra růstového hormonu vypěstovaného v opicích (NIDDK-anti-rGH-S-5) získaného do Dr. A. Parlowa (HarborUCLA Medical Center, Torrence, CA, USA). Další potkaní růstový hormon (1,5 jednotky/mg, č. G2414, Scripps, Labs, San Diego, CA, USA) se joduje na specifickou aktivitu přibližně 30 pCi/pg za použití metody s chloraminem T, jako značka. Imunokomplexy se získají přídavkem kozího antiséra k opilčímu IgG (Orgonon Teknika, Durham, NC, USA) a polyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 10 000 až 20 000 do konečné koncentrace 4,3%; izolace se provádí centrifugách Tato zkouška má rozmezí pracovních parametrů 0,08 až 2,5 pg potkaního růstového hormonu na zkumavku nad základními hladinami. Účinné sloučeniny typicky stimulují uvolňování růstového hormonu více než l,4krát. Odkaz: Cheng K., Chán W.-S., Barreto Jr. A., Convey Ε. M., Smith R. G., 1989.

Zkouška exogenně stimulovaného uvolňování růstového hormonu u potkanů po intravenosním podávání zkoušené sloučeniny.

Samice potkana Sprague-Dawley o stáří 21 dnů (Charles River Laboratory, Wilmington, MA,

USA) se nechají aklimatizovat na místní podmínky vivária (24 °C, s cyklem 12 hodin osvitu a 12 hodin tmy) po dobu asi 1 týdne před zkoušením. Všem potkanům se ponechá přístup k vodě a peletizované potravě dostupné na trhu (Agway Contry Food, Syracuse, NY, USA) ad libitum.

-27CZ 297452 B6

V den zkoušky se zkoušené sloučeniny rozpustí ve vehikulu obsahujícím 1% ethanol, lmM kyselinu octovou a 0,1% hovězí sérový albumin v solném roztoku. Každá sloučenina se zkouší při n = 3. Potkani se zváží a nanestetizují intraperitoneální injekcí solné soli pentobarbitalu (Nembuto, 50 mg/kg tělesné hmotnosti). 14 minut po podání anestetika se pro odběr krevních vzorků naříznou konce ocasů a krev se nechá nakapat do mikrocentrifugačních zkumavek (základní krevní vzorek, přibližně 100 μΐ). 15 minut po podání anestetika se intravenosními injekcemi do ocasní vény podají zkoušené sloučeniny, při celkovém objemu injekce 1 ml/kg tělesné hmotnosti. Další krevní vzorky se z ocasu odeberou 5, 10a 15 minut po podání sloučeniny. Krevní vzorky se udržují na ledu až do centrifugačního oddělení séra (1430 x g po dobu 10 minut při 10 °C. Sérum se skladuje při -80 °C až do stanovení růstového hormonu pomocí radioimunoeseje, jak je popsáno výše a dále.

Hodnocení exogenně stimulovaného uvolňování růstového hormonu u psů po orálním podáni.

V den 1 pokusu se naváží vhodná dávka zkoušené sloučeniny a rozpustí ve vodě. Vždy 4 psům pro každý dávkovači režim se podají žaludeční sondou dávky o objemu 0,5 ml/kg. Vzorky krve (2 ml) se odebírají zjugulámí vény přímou punkcí před podáním dávky a 0,08, 0,17, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6 a 8 hodin po podání za použití 2ml vakutainerů obsahujících lithiumheparin. Připravená plasma se až do analýzy skladuje při -20 °C.

Měření psího růstového hormonu

Koncentrace psího růstového hormonu se stanoví pomocí standardního protokolu radioimunoeseje za použití psího růstového hormonu (antigen pro jodaci a referenční vzorek AFP-1983B) a psího antiséra růstového hormonu vypěstovaného v opicích (AFP-21452578) získaného od Dr. A. Parlowa (Harbor-UCLA Medical Center, Torrence, CA, USA). Značka se získá chloramiin-T jodaci psího růstového hormonu na specifickou aktivitu 20 až 40 pCi/pg. Imunokomplexy se získají přídavkem kozího antiséra u opičího IgG (Organon Teknika, Durham, NC, USA) a polyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 10 000 až 20 000 do konečné koncentrace 4,3%; izolace se provádí centrifugací. Tato zkouška má rozmezí pracovních parametrů 0,08 až 2,5 pg psího růstového hormonu na zkumavku.

Sloučeniny podle vynálezu je možno podávat jakýmkoliv způsobem pro systematickou a/nebo místní dodávku sloučeniny podle vynálezu. Jako tyto způsoby je možno uvést orální podávání, parenterální podávání, intraduodenální podávání atd. Sloučeniny podle vynálezu se obvykle podávají orálně. Parenterálního podávání (intravenosního, intramuskulárního, subkutánního nebo intramedulámího) je však možnou využít například v případech, kdy je orální podávání nevhodné vzhledem ke zvolenému cíli nebo kdy je pacient neschopen pozřít léčivo. Dvě různé sloučeniny podle vynálezu mohou být spolu podávány simultánně nebo následně v jakémkoliv pořadí nebo může být podávána jediná farmaceutická kompozice, která zahrnuje první sloučeninu uvedenou výše a druhou sloučeninu uvedenou výše ve farmaceuticky vhodném nosiči.

Tak například kostní anabolické činidlo je možno používat samotné nebo v kombinaci s antiresorpčním činidlem po dobu tří měsíců až tří let, po níž následuje doba tří měsíců až tří let, po kterou se podává samotné antiresorpční činidlo a celý cyklus léčby je možno opakovat. Alternativně je například možno kostní anabolické činidlo podávat samotné nebo v kombinaci s antiresorpčním činidlem po dobu tří měsíců až tří let a poté se po zbytek pacientova života podává samotné antiresorpční činidlo. Tak například při jednom přednostním režimu podávání může být výše uvedená druhá sloučenina (například PGE₂) podávána jednou za den a výše uvedená první sloučenina (například agonista/antagonista estrogenu) může být podávána denně ve formě jedné nebo několika dávek. Alternativně při jiném přednostním režimu podávání je možno podávat dvě sloučeniny následně po sobě, přičemž výše uvedenou druhou sloučeninu (například PGE₂) lze podávat jednou za den po dobu dostatečnou pro zvýšení kostní hmoty na úroveň, která je nad práhem kostní fraktury (Health Organization Study „Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporózis (1994). Report of a WHO study

-28CZ 297452 B6

Group. World Health Organization Technical Series 843“), načež následuje denní podávání výše uvedené první sloučeniny (například agonisty/antagonisty estrogenu) ve formě jedné nebo většího počtu dávek. V přednostním provedení se výše uvedená druhá sloučenina (například PGE₂) podává jednou denně ve formě pro rychlou dodávku, například ve formě pro orální dodávku (přednostně je třeba se vyhnout například dávkovacím formám s přetrvávajícím uvolňováním).

Množství a doba podávání sloučenina v každém případě bude samozřejmě záviset na léčeném subjektu, závažnosti postižení, způsobu podávání a rozhodnutí předepisujícího lékaře. Vzhledem k odlišnostem mezi jednotlivými pacienty je nutno dále uvedené dávkování chápat pouze jako vodítko a ošetřující lékař může dávky léčiva modifikovat, aby se dosáhlo účinnosti (například zvýšení kostní hmoty, věk pacienta, předchozí chorobu, jakož i přítomnost jiných chorob (například kardiovaskulárních). Tak například podávání agonisty/antagonisty estrogenu může mít kladný vliv na kardiovaskulární systém, především u žen po přechodu. V následujících odstavcích jsou uvedeny přednostní rozmezí dávek pro různé složky podle vynálezu.

Množství antiresorpčního činidla, které se má použít, se stanoví na základě jeho účinnosti jako činidla inhibujícího ztrátu kostní hmoty. Tato účinnost se stanoví prostřednictvím fanmakokinetiky jednotlivých sloučenin a jejich minimální a maximální účinné dávky při inhibici ztráty kostní hmoty podle výše popsaného protokolu (protokol o zkoušení agonistů/antagonistů estrogenu).

Pro účely podle vynálezu, například pro účely inhibice resorpce kosti, leží účinná denní dávka první sloučeniny podle vynálezu obvykle v rozmezí od 0,01 až 200 mg/kg, přednostně od 0,5 do 100 mg/kg.

Účinná denní dávka droloxifenu konkrétně leží v rozmezí od 0,1 do 40 mg/kg, přednostně od 0,1 do 5 mg/kg.

Účinná denní dávka raloxifenu konkrétně leží v rozmezí od 0,1 do 100 mg/kg, přednostně od 0,1 do 10 mg/kg.

Účinná denní dávka tamoxifenu konkrétně leží v rozmezí od 0,1 do 100 mg/kg, přednostně od 0,1 do 5 mg/kg.

Účinná denní dávka cis-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu; (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu; cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu; cis-l-[6'-pyrrolidinoethoxy-3'-pyridyl]-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydronaftalenu; l-(4'-pyrrolidinoethoxyfenyl)-2-(4''-fluorfenyl)-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolinu; cis-6-(4-hydroxyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu nebo l-(4'-pyrrolidinolethoxyfenyl)-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolinu leží konkrétně v rozmezí od 0,0001 do 10 mg/kg, přednostně od 0,01 do 10 mg/kg.

Účinná denní dávka 4-hydroxytamoxifenu konkrétně leží v rozmezí od 0,0001 do 100 mg/kg, přednostně od 0,001 do 10 mg/kg.

Kostního anabolického činidla (například PGE₂) se obvykle používá v množství, které je dostatečné pro zvýšení kostní hmoty na úroveň, která je nad práhem kostní fraktury (podrobněji World

Health Organization Study citovaná výše).

-29CZ 297452 B6

Účinná denní dávka kostního anabolického činidla uvedeného výše obvykle leží v rozmezí od

0,001 do 100 mg/kg, přednostně od 0,1 do 10 mg/kg.

Účinná denní dávka PGE₂ leží konkrétně v rozmezí od 0,001 do 10 mg/kg, přednostně od 0,01 do 1 mg/kg.

Účinná denní dávka 3S-(3-hydroxy-4-fenylbutyl)-2R-[6-(l H-tetrazol-5-yl)hexyl]cyklopentanonu konkrétně leží v rozmezí od 0,001 do 20 mg/kg, přednostně od 0,01 do 10 mg/kg.

Účinná denní dávka fluoridu sodného konkrétně leží v rozmezí od 0,01 do 50 mg/kg, přednostně od 0,2 do 10 mg/kg.

Účinná denní dávka parathyroidního hormonu, jeho metabolitů a fragmentů konkrétně leží v rozmezí od 0,00001 mg/kg do 1 mg/kg, přednostně od 0,001 do 0,5 mg/kg.

Účinná denní dávka růstového hormonu nebo sekretagogů růstového hormonu konkrétně leží v rozmezí od 0,001 do 100 mg/kg, přednostně od 0,01 do 5 mg/kg.

Sloučeniny podle vynálezu se obvykle podávají ve formě farmaceutické kompozice, která obsahuje alespoň jednu ze sloučenin podle vynálezu spolu s farmaceuticky vhodným vehikulem nebo ředidlem. Sloučeniny podle vynálezu mohou být tedy podávány jednotlivě nebo společně v podobě kterékoliv z obvyklých orálních, patenterálních nebo transdermálních dávkovačích forem.

Pro orální podávání se může použít roztoků, suspenzí, tablet, pilulí, tobolek, prášků apod. Lze použít tablet obsahujících různé excipienty, jako je citran sodný, uhličitan vápenatý a fosforečnan vápenatý, spolu s různými bubřidly, jako je škrob (přednostně kukuřičný, bramborový nebo tapiokový škrob) a určité komplexní silikáty s granulačními pojivý, jako je polyvinylpyrrolidon, sacharosa, želatina a klovatina. Pro tabletovací účely mohou být přídavně přítomná lubrikační činidla, jako je stearan hořečnatý, natriumlaurylsulfát a mastek. Pevné prostředky podobného typu mohou být také přítomny jako náplně v měkkých nebo tvrdých želatinových tobolkách. V tomto případě obsahují použité prostředky přednostně také laktosu nebo vysokomolekulámí polyethylenglykoly. Při výrobě vodných suspenzí a/nebo elixírů, které se hodí pro orální podávání, se může účinná přísada mísit s různými sladidly nebo aromatizačními látkami, barvicími přísadami či barvivý a - pokud je to zapotřebí - emulgátory a/nebo suspenzními činidly a dále také takovými ředidly, jako je voda, ethanol, propylenglykol, glycerol a jejich různé kombinace.

Pro parenterální podávání se může použít roztoků buď v sezamovém, nebo arašídovém oleji nebo ve vodném propylenglykolu, jakož i sterilních vodných roztoků odpovídající vodorozpustné soli. Vodné roztoky by měly být účelně pufrovány (pokud je to nutné) a kapalné ředidlo by mělo být nejprve isotonizováno přidáním dostatečného množství solného roztoku nebo glukosy. Takové vodné roztoky se hodí pro intravenosní, intramuskulární, subkutánní a intraperotoneální injekční podávání. Výroba všech takových roztoků za sterilních podmínek se snadno provádí standardními farmaceutickými technologiemi, které jsou dobře známy odborníkům v tomto oboru.

Pro účely transdermálního (například topického) podávání se používá zředěných sterilních vodných nebo zčásti vodných roztoků (obvykle o koncentraci 0,1 až 0,5%), které se připravují podobným způsobem jako parenterální roztoky.

Způsoby výroby různých farmaceutických kompozic, které obsahují určité množství účinné složky jsou známé nebo budou odborníku v tomto oboru zřejmé z tohoto popisu (viz například

Remingtoďs Pharmaceutical Sciences, Marek Publishing Company, Easter, PA, 15. vydání (1975)).

-30CZ 297452 B6

Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou obsahovat 0,1 až 95 %, přednostně 1 až 70 %, sloučeniny nebo sloučenin podle vynálezu. V každém případě však podávaná kompozice nebo přípravek podle vynálezu bude obsahovat sloučeninu nebo sloučeniny podle vynálezu v množství účinném pro léčbu choroby/stavu léčeného subjektu.

Jelikož se vynález týká zvyšování a udržování kostní hmoty za použití kombinace účinných složek, které mohou být podávány odděleně, je předmětem vynálezu také kombinace oddělených farmaceutických kompozic ve formě kitu. Kit zahrnuje dvě oddělené farmaceutické kompozice: agonistu/antagonistu estragenu a anabolické činidlo. Kit zahrnuje kontejner pro oddělené kompozice, jako rozdělenou lahvičku nebo rozdělený foliový balíček. Kit obvykle zahrnuje pokyny pro podávání oddělených složek. Forma kitu je zvlášť výhodná, když se oddělené složky přednostně podávají v různých dávkovačích formách (například orálně a parenterálně), různých dávkových intervalech nebo když předepisující lékař vyžaduje odměřování jednotlivých složek kombinace.

Jako příklad takového kitu je možno uvést tzv. blistrová (protlačovací) balení. V obalovém průmyslu jsou blistry dobře známy a ve velkém měřítku se jich používá pro balení farmaceutických jednotkových dávkovačích forem (tablet, tobolek apod.). Blistry obvykle sestávají z listu relativně tuhého materiálu povlečeného fólií z přednostně transparentního plastického materiálu. Během balicího procesu se v plastické fólii vytvarují dvorce. Dvorce mají velikost a tvar balených tablet nebo tobolek. Poté se do dvorců umístí tablety nebo tobolky a na opačnou stranu (vzhledem ke směru v němž byly vytvořeny dvorce) plastické fólie se připevní list relativně tuhého materiálu. Výsledkem je, že tablety nebo tobolky jsou uzavřeny ve dvorcích mezi plastickou fólií a listem. Pevnost listuje přednostně taková, že tablety nebo tobolky je možno z blistru vyjímat tak, že se rukou zatlačí na dvorec, přičemž otvor v listu vznikne v místě dvorce. Tablety nebo tobolky je možno vyjímat výše popsaným postupem.

Do blízkosti tablet nebo tobolek je vhodné umístit pomůcku usnadňující kontrolu odebírání dávkových forem z balení. Tato pomůcka může mít podobu čísel, která odpovídají dnům režimu, v němž mají být tablety brány. Jako další příklad je možno uvést kalendář, jako „První týden, pondělí, úterý... atd., Druhý týden, pondělí, úterý ...“ atd. Další varianty takových pomůcek jsou zcela zřejmé. „Denní dávku“ je možno podávat ve formě jediné tablety nebo tobolky nebo ve formě několika pilulí nebo tobolek, které se berou v daný den. Denní dávka kostního anabolického činidla může sestávat z jedné tablety nebo tobolky, zatímco denní dávka antiresorpčního činidla může sestávat z několika tablet nebo tobolek. Tento případ by měl být zohledněn v pomůckách usnadňujících kontrolu odebírání dávkových forem z balení.

Podle jiného konkrétního provedení se používá dávkovače uzpůsobeného pro dávkování denních dávek v určitou dobu v zamýšleném pořadí. Dávkovač je přednostně vybaven pomůckou usnadňující odebírání dávkových forem, pokud to napomáhá zvyšování kompliance s režimem. Jako příklad pomůcky usnadňující kontrolu odebírání dávkových forem je možno uvést mechanické počítadlo oddělených denních dávek. Jiným příkladem takové pomůcky je mikročipová paměť napojená z baterie spojená s displejem s tekutými krystaly nebo zvukovým upomínacím signálem, který například ukazuje datum, kdy byla odebrána poslední dávka a/nebo připomíná kdy se má brát další dávka.

Příklady provedení vynálezu

Příklad

Stočtyři samic potkana Sprague-Dawley (Charles River, Wilmingon, MA, USA) o stáří 12 měsíců se v měsíci 0 podrobí fiktivní operaci nebo se overiektomizuje (OVX). Tři měsíce po výkonu se ovariektomizovaným potkanům po dobu 2 měsíců podává buď prostaglandin E₂ (PGE₂), známé kostní anabolické činidlo, v dávce 3 mg/kg/den (subkutánní injekcí), nebo PGE₂ v dávce 3

-31 CZ 297452 B6 mg/kg/den (subkutánní injekcí) v kombinaci s droloxifenen (DRO) v dávce lOmg/kg/den (orálně). Poté se ošetřování PGE₂ přeruší a potkani se po dobu 1,5 měsíce ošetřují buď vehikulem (10% alkohol v solném roztoku), nebo DRo (10 mg/kg/den, orálně) tak, jak je popsáno dále.

Skupina I: Osm potkanů se obdukuje v čase 0 měsíců, jako základní kontrola.

Skupina II: Osm fiktivně operovaných potkanů se obdukuje v čase 3 měsíce, jako kontrola stavu před ošetřením.

Skupina III: Osmi fiktivně operovaným potkanům se v čase 3 až 5 měsíců orálně podává vehikulum (10% ethanol v solném roztoku) a v čase 5 měsíců se provede jejich obdukce.

Skupina IV: Osmi fiktivně operovaným potkanům se v čase 3 až 6,5 měsíce orálně podává vehikulum (10 % ethanol v solném roztoku) v čase 6,5 měsíce se provede jejich obdukce.

Skupina VI: Osmi ovariektominovaným potkanům se v čase 3 až 5 měsíců orálně podává vehikulum (10% ethanol v solném roztoku) a v čase 5 měsíců se provede jejich obdukce.

Skupina VIII: Osmi ovariektominovaných potkanům se v čase 3 až 5 měsíce subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a v čase 5 měsíců se provede jejich obdukce.

Skupina IX: Osmi ovariektominovaných potkanům se v čase 3 až 5 měsíců subkutánní objekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a čase 5 až 6,5 měsíce vehikulum a v čase 6,5 měsíce se provede jejich obdukce.

Skupina X: Osmi ovariektominovaným potkanům se v čase 3 až 5 měsíců subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a v čase 5 až 6,5 měsíce orálně DRO v dávce 10 mg/kg/den, načas se v čase 6,5 měsíce provede jejich obdukce.

Skupina XI: Osmi ovariektominovaným potkanům se v čase 3 až 5 měsíců subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a orálně DRO v dávce lOmg/kg/den, načež se v čase 5 měsíců provede jejich obdukce.

Skupina XII: Osmi ovariektominovaným potkanům se v čase 3 až 5 měsíců subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a orálně DRO v dávce 10 mg/kg/den a v čase 5 až 6,5 měsíce vehikulum, načež se v čase 6,5 měsíce provede jejich obdukce.

Skupina XIII: Osmi ovariektominovaným potkanům se v čase 3 až 5 měsíců subkutánní injekcí podává PGE2 v dávce 3 mg/kg/den a orálně DRO v dávce 10 mg/kg/den a v čase 5 až 6,5 měsíce samotná DRO, načež se v čase 6,5 měsíce provede jejich obdukce.

PGE₂ (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, USA) a droloxifen (Pfizer lne. Groton, CT, USA) ve formě prášku se nejprve rozpustí ve 100% ethanolu. Ethanolické roztoky se dále zředí solným roztokem na požadovanou koncentraci (konečná koncentrace ethanolu je 10 %). Roztok PGE₂ se podává denně subkutánními injekcemi do hřbetu v dávce 1 ml/kg. Roztok droloxifenu se podává perorálně každý den v dávce 1 ml/potkan.

-32CZ 297452 B6

Stanovení minerálů v bederní páteři

Za použití zařízení pro rentgenovou absorpciometrii při dvou energetických úrovních (duální fotonová rentgenová technika, DXA, QDR 1000/W. Hologic lne., Waltham, MA, USA) vybaveného softwarem „Regional High Resolution Scan“ (Hologic lne., Waltham, MA, USA) se u anestetizovaných potkanů stanoví kostní plocha, minerální obsah kosti (BMC) a minerální hustota kosti (BMD) celé bederní páteře a každého ze šesti lumbálních obratlů (LVI až LV6). Potkani se anestetizují intraperitoneální injekcí 1 ml/kg směsi ketaminu a rompanu v poměru 4:3a poté umístí na desku pro potkany. Velikost snímaného pole je 60 x 19 mm, rozlišení 0,254 x 0,127 mm a rychlost snímání 7,25 mm/s. Získané skanové obrazce celé bederní páteře se analyzují. Stanoví se kostní plocha (BA) a minerální obsah kosti (BMC). Vypočítá se minerální hustota kosti (BMC děleno BA) pro celou bederní páteř a pro každý ze šesti lumbálních obratlů (LVI až LV6).

V době 3,5 nebo 6,5 měsíce po chirurgii je u ovariektomizovaných potkanů ve srovnání s fiktivně operovanými kontrolními zvířaty pozorováno významné snížení BMC a BMD celé bederní páteře i všech bederních obratlů, a to o 15 až 27 %. Potkani 3 měsíce po ovariektomii ošetřovaní buď samotným PGE₂, nebo kombinací s DRO po dobu 2 měsíců mají minerální obsah kosti (BMC) a minerální hustotu kosti (BMD) zcela obnoveny na úroveň fiktivně operovaných kontrolních zvířat. Nebyl zjištěn žádný rozdíl v BMC a BMD u ovariektomizovaných potkanů léčených PGE₂ samotných nebo PGE₂ v kombinaci s DRO, což ukazuje, že DRO neoslabuje anabolické účinky PGE₂. Po přerušení léčení PGE₂ bylo pozorováno významné snížení BMD LVI, LV2 a LV3 a BMC LV2. Oproti tomu, když těmto ovariektomizovaným potkanům byl po přerušení podávání PGE₂ podáván DRO, byla PGE₂-obnovená kostní tkáň zcela zachována. Podobně přerušení podávání jak PGE₂, tak DRO po dobu 1,5 měsíce vedlo k významnému snížení BMD LV3. Když se však přeruší podávání PGE₂ a v léčení DRO se pokračuje po dobu 1,5 měsíce, v bederní páteři ovariektomizovaných potkanů není zjištěna žádná ztráta kostní tkáně. Dospěli jsme k závěru, že DRO, antiresorpční činidlo, u osteogenických potkanů neoslabuje anabolické účinky PGE₂. Kromě toho jsme zjistili, že DRO je účinný pro zachování PGE₂-obnovené kostní tkáně po přerušené léčby PGE₂. Tato data podporují opodstatněnost přístupu, kteiý spočívá v tom, že se nejprve použije anabolického činidla, aby se v osteoporotické kostře obnovila kostní hmota a poté antiresorpčního činidla, aby se obnovená kostní hmota zachovala.

Vynález se neomezuje ne konkrétní popsaná provedení a může být obměňován nebo modifikován, aniž by to představovalo sklon od sucha vynálezu či jeho rozsahu, který je dán připojenými patentovými nároky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozice, v y z n a č u j í c í se tím, že zahrnuje

a. terapeuticky účinné množství první sloučeniny, přičemž touto první sloučeninou je agonista/antagonista estrogenu; a

b. terapeuticky účinné množství druhé sloučeniny, přičemž touto druhou sloučeninou je prostaglandin nebo agonista/antagonista prostaglandinu.
2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1,vyznačující se tím, že přídavně obsahuje farmaceutický nosič.

-33CZ 297452 B6
3. Farmaceutická kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že agonistou/antagonistou estrogenu je droloxifen, raloxifen, tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen, cis-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-oI;

(-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidilin-1-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-l-[6'-pyrrolidinoethoxy-3'-pyridyl]-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydronatalen;

l-(4'-pyrrolidinoethoxyfenyl)-2-(4-fluorfenyl)-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin; cis-6-(4-hydroxyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol nebo l-(4'-pyrrolidinolethoxyfenyl)-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin.
4. Farmaceutická kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že druhou sloučeninou je PGDj, PGD₂, PGE₂, PGE_b PGF₂, a PGF₂a nebo 3S-(3-hydroxy-4-fenylbutyl)2R-[6-( 1 H-tetrazol-5-yl)hexyl]cyklopentanon.
5. Farmaceutická kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že agonistou/antagonistou estrogenu je droloxifen.
6. Farmaceutická kompozice podle nároku 5, vy z n a č uj í c í se t í m , že druhou sloučeninou je PGE₂.
7. Farmaceutická kompozice podle nároku 5, vy značuj ící se tí m , že druhou sloučeninou je 3S-(3-hydroxy-4-fenylbutyl)-2R-[6-(lH-tetrazol-5-yl)hexyl]cyklopentanon.
8. Farmaceutická kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že agonistou/antagonistou estrogenu je cis-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; (-ý-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidilin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-l-[6'-pyrrolidinoethoxy-3'-pyridyl]-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydronatalen; l-(4'-pyrrolidinoethoxyfenyl)-2-(4-fluorfenyl)-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin; cis-6-(4-hydroxyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol nebo l-(4'-pyrrolidinolethoxyfenyl)-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin.
9. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vy z n a č uj í c í se t í m , že druhou sloučeninu je PGE₂.
10. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že druhou sloučeninou je 3S-(3-hydroxy-4-fenylbutyl)-2R-[6-( 1 H-tetrazol-5-yl)hexyl]-cyklopentanon.
11. Kombinace účinných látek pro použití při léčení stavu, který se projevuje nízkou kostní hmotou, vyznačující se tím, že zahrnuje první sloučeninu, kterou je agonista/antagonista estrogenu; a druhou sloučeninu, která je prostaglandin nebo agonista/antagonista prostaglandinu.
12. Kombinace podle nároku 11,vyznačující se tím, že agonistou/antagonistou estrogenu je droloxifen, raloxifen, tamoxifen, 4-hydroxytamoxien,

-34CZ 297452 B6 cis-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidilin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-l-[6'-pyrrolidinoethoxy-3'-pyridyl]-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydronatalen;

l-(4'-pyrrolidinoethoxyfenyl)-2-(4-fluorfenyl)-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin; cis-6-(4-hydroxyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol nebo

1 -(4'-pyrrolidinolethoxyfenyl)-2-fenyl-6-hydroxy-l ,2,3,4-tetrahydroisochinolin.
13. Kombinace podle nároku 12, vyznačující se tím, že druhou sloučeninou je PGD_bPGD₂, PGE₂, PGE₂, PGF₂, PGF₂a nebo 3S-(3-hydroxy-4-fenylbutyl)-2R-[6-(l H-tetrazol-5yl)hexyl]cyklopentanon.
14. Kombinace podle nároku 13,vyznačující se tím, že agonistou/antagonistou estrogenu je droloxifen.
15. Kombinace podle nároku 14, v y z n a č u j í c í se t í m , že druhou sloučeninou je PGE₂.
16. Kombinace podle nároku 14, vyznačující se tím, že druhou sloučeninou je

3 S-(3-hydroxy-4-fenylbutyl)-2R-[6-( 1 H-tetrazol-5-yl)hexyl]cyklopentanon.
17. Kombinace podle nároku 14, v y z n a č u j í c í se tím, že stavem, který se projevuje nízkou kostní hmotou, je osteoporóza.
18. Kombinace podle nároku 13, vyznačující se tím, že agonistou/antagonistou estrogenuje cis-6-(4-fluorfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidilin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-l-[6'-pyrrolidinoethoxy-3'-pyridyl]-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydronatalen; l-(4'-pyrrolidinoethoxyfenyl)-2-(4-fluorfenyl)-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin; cis-6-(4-hydroxyfenyl)-5-[4-(2-piperidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol nebo l-(4'-pyrrolidinolethoxyfenyl)-2-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin.
19. Kombinace podle nároku 18, vyznačující se tím, že druhou sloučeninou je PGE₂.
20. Kombinace podle nároku 18, vyznačující se tím, že druhou sloučeninou je

3 S-(3-hydroxy-4-fenylbutyl)-2R-[6-( 1 H-tetrazol-5-yl)hexyl]cyklopentanon.
21. Kombinace podle nároku 18, v y z n a č u j í c í se t í m , že se stavem, který se projevuje nízkou kostní hmotou, je osteoporóza.
22. Kombinace podle nároku 11 pro výrobu léčiva pro léčení stavu, který se projevuje nízkou kostní hmotou.
23. Farmaceutická kompozice podle nároku 1,vyznačující se tím, že zahrnuje

-35CZ 297452 B6

a. množství první sloučeniny, přičemž touto první sloučeninou je agonista/antagonista estrogenu; a

b. množství druhé sloučeniny, přičemž touto druhou sloučeninou je prostaglandin nebo agonista/antagonista prostaglandinu, přičemž množství první sloučeniny samotné a množství druhé sloučeniny samotné nepostačuje pro dosažení terapeutických účinků, které spočívají ve zvýšení tvorby kostní hmoty a snížení resorpce kostní hmoty, jichž se dosáhne při současném podání a přičemž kombinovaný účinek množství první sloučeniny a množství druhé sloučeniny je větší než součet léčebných účinků dosažitelných za použití množství první sloučeniny a množství druhé sloučeniny jednotlivě, a farmaceuticky vhodné ředidlo nebo nosič.
24. Kombinace účinných látek pro použití při léčení stavu, který se projevuje nízkou kostní hmotou, podle nároku 11,vyznačuj ící se tím, že zahrnuje první sloučeninu, kterou je agonista/antagonista estrogenu; a druhou sloučeninu, kterou je prostaglandin nebo agonista/antagonista prostaglandinu, přičemž množství první sloučeniny samotné a množství druhé sloučeniny samotné nepostačuje pro dosažení terapeutických účinků, které spočívají ve zvýšení tvorby kostní hmoty a snížení resorpce kostní hmoty, jichž se dosáhne při současném podání a přičemž kombinovaný účinek množství první sloučeniny a množství druhé sloučeniny je větší než součet léčebných účinků dosažitelných za použití množství první sloučeniny a množství druhé sloučeniny jednotlivě.
25. Kit pro léčení stavu, který je projevuje nízkou kostní hmotou, vyznačující se tím, že obsahuje

a. terapeuticky účinné množství agonisty/antagonisty estrogenu a farmaceuticky vhodný nosič v první jednotkové dávkovači formě;

b. terapeuticky účinné množství prostaglandinu nebo agonisty/antagonisty prostaglandinu a farmaceuticky vhodný nosič ve druhé jednotkové dávkovači formě; a

c. obalový prostředek pro první a druhou dávkovači formu.