PL185290B1

PL185290B1 - Monofosforanowe pochodne nukleozydu, sposób ich wytwarzania, środek farmaceutyczny i zastosowanie monofosforanowych pochodnych nukleozydu

Info

Publication number: PL185290B1
Application number: PL95317380A
Authority: PL
Inventors: Dieter Herrmann; Hans-Georg Opitz; Harald Zilch; Alfred Mertens
Original assignee: Heidelberg Pharma Holding Gmbh
Priority date: 1994-05-28
Filing date: 1996-11-21
Publication date: 2003-04-30
Also published as: IL113865A; FI964727A0; FI117673B; EP0763049B1; BR9507785A; PT763049E; KR970703354A; ATE236189T1; HU220336B; DE69531749D1; CA2190983A1; CN1168735C; WO1995032984A1; DE69530197T2; WO1995032984A8; MX9605809A; HUT75340A; ATE249472T1; UA45339C2; CA2190983C

Description

Wynalazek niniejszy obejmuje nowe monofosforanowe pochodne nukleozydu o ogólnym wzorze I, sposób ich wytwarzania, ich zastosowanie i środek farmaceutyczny zawierający nowe pochodne o wzorze I.

Wynaleziono nowe estry lipidowe monofosforanowych pochodnych nukleozydów o ogólnym wzorze I.

r¹-x-ch₂ _r2__y_ch O (I),

C H ₂—o—p—O—ę H₂ r ¹ ^0H

R³ R⁴ w którym:

R1 oznacza prosty lub rozgałęziony łańcuch alkilowy zawierający 1-20 atomów węgla,

R2 oznacza prosty, lub rozgałęziony, nasycony łańcuch alkilowy zawierający 1-20 atomów węgla,

185 290

R³ oznacza atom wodoru łub grupę hydroksylową;

R⁴ oznacza grupę hydroksylową;

R⁵ oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową;

X oznacza atom siarki,

Y oznacza atom tlenu;

B oznacza zasadę pur^i^oo^rą.i pirymidynową o wzorze IIIa i IIId

O

(IIIa)

(IIId) w którym:

R⁶ oznacza atom wodoru,

R⁶' oznacza atom wodoru,

R⁹ oznacza atom wodoru,

R¹⁰ oznacza grupę merkapto, pod warunkiem, że co najmniej jedna z reszt R³ lub R5 oznacza atom wodom;

oraz ich tautomery, fizjologicznie dopuszczalne sole z nieorganicznymi lub organicznymi kwasami i/lub zasadami, jak również sposoby ich wytwarzania, ich zastosowanie i środki farmaceutyczne zawierające takie związki.

Ponieważ związki o ogólnym wzorze I zawierają asymetryczne atomy węgla, wynalazek obejmuje również wszystkie optycznie czynne formy i mieszaniny racemiczne tych związków.

W J. Biol. Chem., 265. 6112 (1990) i EP 0,350,287 opisano wytwarzanie i stosowanie liponukleotydów jako środków przeciwwirusowych. W publikacjach tych jednakże opisano badanie i syntezę jedynie reszt dimirystoilofosfatydylowych i dipalmitoilofosfatydylowych sprzężonych ze znanymi nukleozydami, takimi jak AZT (azydotymidyna) i ddC (2',3'-dideoksycytydyna), w tym także strukturę ich estrów z kwasem tłuszczowym.

W J. Med. Chem., 33, 1380 (1990) opisano nukleozydowe koniugaty tioeterów lipidów z difosforanem cytydyny, które mają własności przeciwnowotworowe i mogą znaleźć zastosowanie w onkologii. W Chem. Pharm. Buli., 36, 209 (1988) opisano 5'-(3-sn-fosfatydylo)nukleozydy wykazujące działanie przeciwbiałaczkowe, jak również ich enzymatyczną syntezę z odpowiednich nukleozydów i fosfocholin w obecności fosfolipazy D o aktywności transferazy. Podobnie, w J. Med. Chem., 34, 1408 (1991) przedstawiono koniugaty nukleozydów o aktywności przeciwko HIV 1, które w części lipidowej są podstawione grupą metoksylową lub etoksylową w pozycji sn-2. Zgłoszenie patentowe WO 92/03462 ujawnia koniugaty tioeterów lipidów o aktywności przeciwwirusowej, zwłaszcza do leczenia zakażeń HIV.

Związki według niniejszego wynalazku mają cenne właściwości farmakologiczne. Są one szczególnie odpowiednie w leczeniu i profilaktyce guzów złośliwych, takich jak nowotwory, raki, mięsaki lub białaczki, w terapii rakowej. Ponadto, związki wykazują również działanie immunosupresyjne, a zatem mogą być stosowane w leczeniu chorób autoagresyjnych, narządowo swoistych lub uogólnionych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, układowy liszaj rumieniowaty, przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi, stwardnienie rozsiane, itd. lub w zapobieganiu odrzuceniu allogenicznego lub semiallogenicznego przeszczepu, np. nerek, wątroby, płuc, serca, itd. Związki wykazują także aktywność

185 290 przeciwwirusową, przeciwretrowirusową lub przeciwonkogenną i tym samym są również odpowiednie w profilaktyce i leczeniu chorób spowodowanych lub wywołanych przez czynniki wirusowe oraz onkogenne (takich jak AIDS itd.). W porównaniu ze związkami stosowanymi dotychczas w leczeniu nowotworów złośliwych, związki według wynalazku wykazują zwiększoną skuteczność lub mniejszą toksyczność, a więc mają szersze spektrum terapeutyczne. Są one bardziej korzystne i z tego względu, że podawanie środków zawierających takie związki może być prowadzone w sposób ciągły przez dłuższy czas, a więc można uniknąć odstawienia preparatu lub przerwy w jego podawaniu, co często było rutynowe przy dotychczas stosowanych środkach cytostatycznych ze względu na ich niepożądane skutki uboczne.

Związki według wynalazku są pozbawione powyższych wad. Wykazują one działanie immunosupresyjne lub przeciwwirusowe bez niespecyficznej cytotoksyczności w farmakologicznie odpowiednich dawkach.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zatem środek farmaceutyczny, charakteryzujący się tym, że zawiera związek o wzorze I, w którym Ri, R2, r3, R⁴, R⁵, X, Y, R6, r6', R9 , R>o mają powyżej podane znaczenia.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie monofosforanowych pochodnych nukleozydu o wzorze I do wytwarzania środków farmaceutycznych do leczenia, zwłaszcza nowotworów.

Związki według niniejszego wynalazku oraz ich kompozycje farmaceutyczne można stosować w kombinacji z innymi środkami do leczenia i profilaktyki wymienionych uprzednio chorób. Przykładami takich leków są środki takie jak, np. ihibitory mitozy, takie jak kolchicyna, mitopodozyd, winblastyna, alkilujące środki cytostatyczne, takie jak cyklofosfamid, melfalan, myleran i cisplatyna, antymetabolity, takie jak antagoniści kwasu foliowego (metotreksat) i antagoniści zasad purynowych i pirymidynowych (merkaptopuryna, 5-fluorourydyna, cytarabin), antybiotyki o aktywności cytostatycznej, takie jak antracykliny (np. doksorubicyna, daunorubicyna), hormony, takie jak fosfestrol, tamoksyfen, inne środki chemoterapeutyczne o aktywności cytostatycznej/cytotoksycznej oraz inne środki immunosupresyjne (takie jak cyklosporyny, FK 506, rapamycyny, dezoksysperkwalina, itd.).

Możliwymi do stosowania solami związków o wzorze ogólnym I są przede wszystkim sole z grupy fosforanów z metalami alkalicznymi, metalami ziem alkalicznych lub sole amonowe. Korzystnymi solami metali alkalicznych są sole litu, sodu i potasu. Jako sole metali ziem alkalicznych korzystne są zwłaszcza sole magnezu i wapnia. Zgodnie z wynalazkiem, za sole amonowe uważa się sole zawierające jon amonowy, który może być podstawiony do czterech razy resztami alkilowymi zawierającymi 1-4 atomów węgla, i/lub resztami aralkilowymi, korzystnie benzylowymi. Podstawniki mogą być takie same lub różne.

Związki o wzorze ogólnym I mogą zawierać grupy zasadowe, szczególnie aminowe, które z udziałem odpowiednich nieorganicznych lub organicznych kwasów można przeprowadzić w sole addycyjne z kwasami. Odpowiednie do stosowania tutaj są zwłaszcza takie kwasy, jak kwas solny, bromowodorowy, siarkowy, fosforowy, fumarowy, bursztynowy, winowy, cytrynowy, mlekowy, maleinowy lub metanosulfonowy.

W ogólnym wzorze I Ri korzystnie oznacza prostołańcuchową grupę Cg-C^alkilową, zwłaszcza grupę nonylową, decylowa^ undecylową, dodecylową, tridecylową lub tetradecylową.

Korzystnie R2 oznacza prostołańcuchową grupę Cg-C^alkilową zwłaszcza grupę oktylową, nonylową. decylową undecylową. dodecyIową, tridecylową lub tetradecylową.

W zasadach o wzorze ogólnym (III) reszty R6 i R6' oznaczają atom wodoru.

Szczególnie korzystne są związki o wzorze I, w których:

Ri oznacza prostołańcuchową grupę C9-Ci3alkilową

R2 oznacza prostołańcuchową grupę Cg-C_ualkilową

R3 oznacza resztę hydroksylową:

R4 oznacza resztę hydroksylową:

R5 oznacza atom wodoru;

185 290

R6 oznacza atom wodoru R6' oznacza atom wodoru; i R’0 oznacza grupę merkapto.

Do wytwarzania koniugatów lipid-nukleotyd o wzorze (I) korzystnie jako składniki sprzęgające odpowiednie są następujące nukleozydy:

6-merkaptopuryno-9-β-D-rybofuranozyd,

5-fluorourydyna.

Związki o ogólnym wzorze (I) wytworzyć można zgodnie z wynalazkiem przez:

1) reakcję związku o ogólnym wzorze V

RX—CH₉ ¹

R^Z-Y-CH

I ch₂

O ll •O—P—OH

I

OH (V), w którym R’, R2, X i Y mają wskazane uprzednio znaczenia, ze związkiem o ogólnym wzorze VI

(VI), w którym R3, R*, R5 i B mają wymienione powyżej znaczenia lub oznaczają grupę hydroksylową chronioną grupą ochronną dla tlenu, znaną specjalistom, w obecności aktywującego chlorku kwasowego, takiego jak chlorek kwasu 2,4,6-triizopropylobenzenosulfonowego, i trzeciorzędowej zasady azotowej, np. pirydyny lub lutydyny, w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak toluen, lub bezpośrednio w bezwodnej pirydynie, i ewentualnie, po hydrolizie, usunięcie grupy ochronnej dla tlenu, zgodnie z konwencjonalnymi sposobami stosowanymi w chemii nukleozydów, albo

2) przez reakcje związku o ogólnym wzorze VII rJ-x-ch₉ ^{1 2}

R^z-Y-CH O CHo

I + I ^ó

CH₂-O-P-O-CH₂-CH₂-N-CH₃ (V,,) o ch₃ w którym R’, R2, X i Y mają uprzednio podane znaczenia, ze związkiem o wzorze ogólnym VI, w którym R3, R*, r5 i B mają określone wyżej znaczenia, w obecności fosfolipazy D

185 290 ze Streptomyces, w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak chloroform, w obecności odpowiedniego buforu, i ewentualnie po tej reakcji usunięcie grupy ochronnej dla tlenu, zgodnie z konwencjonalnymi sposobami w chemii nukleozydów.

Wytwarzanie związków o ogólnym wzorze V i VII prowadzi się analogicznie do sposobu podanego w publikacjach Lipids 22, 947 (1987) oraz J. Med. Chem. 34, 1377 (1991).

Wytwarzanie związków o ogólnym wzorze VI opisano, na przykład, w EP-A-O,286,028 i WO 90/08147. Niektóre ze stosowanych nukleozydów są związkami dostępnymi na rynku.

W EP-A-0,350,287 opisano związki podobne do związków o wzorze I. Ujawniono tam odpowiadające im 1,2-diestry glicerolu.

Środki farmaceutyczne zawierające związki o wzorze I do leczenia zakażeń wirusowych stosować można w postaci ciekłej lub stałej do podawania drogą dojelitową lub pozajelitową. Stosować można zwykłe postaci użytkowe, takie jak tabletki, kapsułki, powlekane tabletki, syropy, roztwory lub zawiesiny. Korzystnie, jako podłoże do iniekcji stosuje się wodę, łącznie z innymi dodatkami, takimi jak stabilizatory, solubilizatory i bufory, odpowiednie do roztworów iniekcyjnych. Takimi dodatkami są. na przykład, bufory winianowe i cytrynianowe, etanol, środki kompleksujące, takie jak kwas etyleno-diaminotetraoctowy i jego nietoksyczne sole, polimery o wysokim ciężarze cząsteczkowym, takie jak ciekły politlenek etylenu do regulowania lepkości. Ciekłe nośniki do roztworów iniekcyjnych muszą być sterylne i korzystnie są one umieszczone w ampułkach. Stałymi nośnikami są, na przykład, skrobia, laktoza, mannitol, metyloceluloza, talk, wysoce zdyspergowane kwasy krzemowe, kwasy tłuszczowe o wysokim ciężarze cząsteczkowym takie jak kwas stearynowy, żelatyna, agar-agar, fosforan wapnia, stearynian magnezu, tłuszcze zwierzęce i roślinne, stałe polimery o wysokim ciężarze cząsteczkowym, takie jak glikol polietylenowy, itd. W razie potrzeby do preparatów do podawania doustnego włączyć można substancje smakowo-zapachowe i środki słodzące.

Dawkowanie zależeć może od różnych czynników, takich jak sposób i rodzaj stosowania, wiek lub indywidualny stan zdrowia. Zazwyczaj, związki według wynalazku stosuje się w ilości 0,1-100 mg, korzystnie 0,2-80 mg na kg wagi ciała dziennie. Korzystnie, dawkę dzienną dzieli się na 2-5 dawek, przy czym każdorazowo podaje się tabletkę zawierającą 0,5-500 mg składnika aktywnego. Podobnie, stosować można tabletki o przedłużonym uwalnianiu, redukując liczbę podawania do 1-3 dziennie. Zawartość składnika aktywnego w tabletkach o przedłużonym uwalnianiu wynosić może 2-1000 mg. Składnik aktywny podawać można również przez ciągłą infuzję, i wtedy wystarczające ilości wynoszą 5-1000 mg dziennie.

Zgodnie ze sposobami przedstawionymi w przykładach obok związków wymienionych w przykładach można również przez analogię wytworzyć inne, następujące związki:

1. Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (5-chlorourydyno)-5'-fosforowego

2. Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (5-trifluorometylourydyno)-5'-fosforowego

3. Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (6-merkaptopuryno-9-D-D-rybofuranozydo)-5'-fosforowego

4. Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (5-fluorourydyno)-5'-fosforowego

5. Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (5-prop-l-enylouryd>Tro)-5'-fosforowego

6. Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (5-etynylocytydyno)-5'-fosforowego

7. Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (2-amino-6-merkapto-P-D-rybofuranozydo)-5'-fosforowego

8. Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (2,6-diaminopuryno-9-D-D-rybofuranozydo)-5'-fosforowego

185 290

9. Ester (3-d(xlecylomercyptm2kcxyloksy)propylowy kwasu (5-prop-2-inrylo2rydyno)-5dfosforowego

10. Ester (y-do0ecylasulfonylo-2-0ecfloksf)prapflowf kwasu (5-fluoryulydyno)-5'-fosfarawrga

11. Ester (y-dodecylasulfonylo-2-decyloksf)prapylowf kwasu (5rchloryurydydo)-5'rfosr forowego

12. Ester (y-do0rcylasulfonylo-2-decyloksy)prapylowy kwasu (6-merkaptypuryny-9-β-D-r5r bofUradozfdy)r5'-fosfarowrgo

13. Ester (y-dodecyloksy-2-0ecflo5sy)propflowy kwasu (5rfluy-yu-yOfdo)r5'-fosforowego

14. Ester (y-dydecflaksy-2-0ycyloksy)p-opflawf kwasu (6-mer5aptOkurydar9rβrD--fr bofuranazfdy)r5'-fasfarowego

15. Ester (3-0(oOecylomerkaplco2-Oreylomy-kapto)p-opflawy kwasu (5rfluylΌury0yno)-5'-fbsforowega

16. Ester (3-uddecylomerkapto-2-undecfloksf)propylowf kwasu (5-fluorou-y0yno)-5'-fosr forowega

17. Ester (3-un0ecylame^kakto-2-ud0ecfloksy)k-apylywf kwasu (5-trifluorometflyury0yno)-5'-fosfo-awego

18. Ester (y-un0ecylomerkapty-2-undecyloksy)prapylowy kwasu (6rmerkaptopurfdo-9β-D-rfbafuI·anazyda)-5'-fbsfa-awego

19. Ester (y-decflamer5aptor2-dodecyloksf)p-apylawf kwasu (5-trifluyrametyloulydyr do)r5'-fasforowego

20. Ester (yrundecylomerkapto-2-0odecylyksy)p-opylawf kwasu (5-fluy-yu-yOfdo)r5'rfosr forowega

21. Ester (y-un0rcylamerkapty-2rdecyloksf)propflawf kwasu (5rtrifluo-ometflaurydyno)-5'-fasfarowegy

22. Ester (y-tetradecylomerkaptOr2r0ecflyksy)propylowy kwasu (6-merkaptopurynor9β-D-rybafuradozydo)-5'-fysforywego

23. Ester (3-tridecylomerkaptar2-decyloksy)p-apylowf kwasu (5rfluyrourf0yda)-5'-fasforowega

24. Ester (y-0odrcylamerkapto-2-0ecfloksy)propflowy kwasu (2rΠuoroadenozfdlo)-5'-ίysforowega

25. Ester (3-0o0rcylamrrkapto-2-0ecflyksy)propylowy kwasu (2-dezyksyr2-fluoroadenozfr no)-5'-fosfo-owega

26. Ester dadecylowf kwasu (6rmerkaptopuryna-9-β-Drlybofuranyzfdo)-5'rfosfarawega

27. Ester heksadecylowy kwasu (5-fluorourydyno)-5'-fosforowego

28. Ester ejkozylowy kwasu (5-t-ifluorometylourydfdo)-5'-fosforowego

29. Ester dodecylowy kwasu (5-fluyrourfdyno)r5'-fasforowegy

30. Ester dodecylywf kwasu (6-merkaktypuryno-9rβrD-rfbyfU-adyzf0y)-5'-fysforowego

Przykład 1

Ester (y-do0ecylomerkakty-2-0ecyloksy)propylowy kwasu (5-fiuy-oury0fno)-5'-fosforowego

3,6 g (6,1 mmola) estru (y-0adecylomerkapta-2-drcyloksy)propylowegy kwasu fosforowego potraktowano dwukrotnie 30 ml bezwodnej pi-fOyny i zatężono przez odparowanie. Pozostałość rozpuszczono w 30 ml bezwodnej pirydyny, pod azotem potraktowano 2,76 g (9,1 mmola) chlorku kwasu 2,4,6rt-iizopropylobedzenasulfonawego i mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie dodano 1,60 g (6,1 mmola) 5rfluorourfdfdy (Fluka) mieszaninę pozostawiono do odstania pod N2 na 24 godziny.

P-zrprawa0zada hydrolizę, stosując 15 ml wody, mieszaninę mieszano jeszcze przez godziny w temperaturze pokojowej, usunięto rozpuszczalnik pod próżnią i dwukrotnie odpędzono, stosując niewielką ilość toluenu. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej ΕιΟι-ό^Τ³ RP-18, stosując jako eluent liniowy gradient mieszaniny meta12

185 290 nol/woda 7/1 do metanolu. Wydajność wynosiła 3,1 g (69% ilości teoretycznej); olej. R_f = 0,24 (CH2Cl2/MeOH 8/2); R_f = 0,55 (C^C^/MeOH/^O 6,5/2,5/0,4) na płytkach do TLC Merck 5715, żel krzemionkowy 60 F.

Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu fosforowego wytworzono jak opisano w Wo 92/03462.

Przykład 2

Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (6-merkaptopuryno-9-3-D-rybofuranozydo)-5'-fosforowego

6,2 g (12,5 mmola) estru (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowego kwasu fosforowego potraktowano 5,7 g (18,75 mmola) chlorku kwasu 2,4,6-triizopropylobenzenosulfonowego, jak opisano w przykładzie 1, a następnie potraktowano 3,55g (11,25 mmola)

6-merkaptopuryno-P-D-rybofuranozydu i po 24 godzinach hydrolizowano wodą.

Następnie powoli wkroplono 2,85g octanu wapnia w 15 ml wody, wytrącając surową sól wapniową koniugatu. Po długim mieszaniu osadu z acetonem (1/10) otrzymano 6g amorficznego surowego produktu, zawierającego 72% obszaru zgodnie z HPLC.

Sól wapniową zawieszono w 350 ml metanolu, potraktowano 150g Amberlite IR 120 w postaci Na+ i mieszano przez 2 dni.

Następnie usunięto wymieniacz jonowy, przesącz odparowano, a pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej LiChroprep® RP-18 z liniowym gradientem 5/1 do 9/1 mieszaniny metanol/woda. Frakcje zawierające produkt odparowano pod próżnią, a pozostałość mieszano z acetonem i wysuszono. Wydajność 3,52g (41% ilości teoretycznej).

DC: R_f = 0,45 (izopropanol/octan butylu/stężony amoniak/woda 50/30/5/15).

Przykład 3

Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (6-merkaptopuryno-9-e-D-rybofuranozydo)-5'-fosforowego, sól sodowa

Analogicznie jak w przykładzie 2, 41,4 g estru (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowego kwasu fosforowego w 400 ml bezwodnej pirydyny poddano reakcji z 42,9 g chlorku kwasu 2,4,6-triizopropylobenzenosulfonowego, a następnie z 23,7 g 6-merkaptopuryno-9-P-D-rybofuranozydu. Surową sól wapniową, którą przesączono na filtrze próżniowym po hydrolizie w 160 ml wody i wytrąceniu 25 g octanu wapnia, rozdzielono pomiędzy 500 ml MTB i 250 ml 2N HC1 i mieszano aż do całkowitego rozpuszczenia w fazie organicznej. Fazę organiczną oddzielono, przemyto nasyconym roztworem chlorku sodu i zatężono w wyparce obrotowej. Pozostałość wprowadzono na 80 g kolumnę LiChroprep RP-18 (roztwór surowego produktu w MTB potraktowano RP-18, odparowano i wysuszono), rozdzielono porcjami w kolumnie wstępnej na RP-18. Za każdym razem jako eluent stosowano mieszaninę 3,7 1 metanolu, 400 ml wody, 3 ml lodowatego kwasu octowego i 2 g octanu sodu. Połączono frakcje zawierające produkt, wytrącono żądany związek dodatkiem 20 g octanu wapnia w 100 ml wody i odsączono przez filtr próżniowy. Wydajność: 32 g (43% ilości teoretycznej).

Sól wapniową zawieszono w 250 ml MTB, esktrahowano wytrząsając z 80 ml 2n hC1, a fazę organiczną przemyto dwukrotnie nasyconym roztworem chlorku sodu. Po usunięciu rozpuszczalnika, pozostałość rozpuszczono w 200 ml toluenu, pH doprowadzono do wartości 7 wobec elektrody Friscolyt, stosując 30% roztworu metylanu sodu. Wytrącono sól sodową, mieszając w 200 ml acetonu, przesączono przez filtr próżniowy i wysuszono w piecu próżniowym.

Wydajność: 29 g (37% ilości teoretycznej).

Wartość Rf 0,18 (żel krzemionkowy, eluent: izopropanol/octan butylu/woda/stężony amoniak 50/30/15/5).

Przykład 4

Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (6-merkaptopuryno-9*3-D-rybofuranozydo)-5'-fosforowego, sól sodowa

Analogicznie do przykładu 3, wytworzono surowy koniugat z 40 g 6-merkaptopuryno-9-P-D-rybofuranozydu. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej,

185 290 stosując za każdym razem 8 g, na kolumnie z fazą DIOL (średnicą 4 cm, długość 25 cm) (detekcja przy 254 nm; eluent: metanol/MTB 10/4). Stosowaną próbkę rozpuszczono dokładnie w eluencie.

Frakcje zawierające produkt z kilku różnych wyodrębnień połączono, odparowano i wytrącono w postaci soli sodowej z toluenu i acetonu, jak w przykładzie 3.

Wydajność : 64,5 g (51% ilości teoretycznej).

Wartość R_f: 0,85 (faza DIOL; eluent: metanol).

Przykład 5

Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (6-merkaptopuiymo-9-|3-D-rybofuranozydo)-5'-fosforowego, sól sodowa

Analogicznie do przykładu 1, 14,9g 6-merkaptopuryno-9-|3-D-rybofuranozydu (50 mmoli) poddano reakcji z mieszanym bezwodnikiem wytworzonym z 27,3 g estru (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowego kwasu fosforowego i 25 g chlorku kwasu 2,4,6-triizopropylobenzenosulfonowego w 250 ml bezwodnej pirydyny, zhydrolizowano i zatężono przez odparowanie. Analogicznie do przykładu 3, surowy produkt (HPLC: 67% obszar) oczyszczono chromatograficznie na RP-18, wytrącono w postaci soli wapniowej i przeprowadzono w sól sodową. Wydajność: 15,2 g (38% ilości teoretycznej).

Przykład 6

Ester (3-dodecylomerkapto-2-decyloksy)propylowy kwasu (5-fluorourydyno)-5'-fosforowego, sól sodowa

Analogicznie do przykładu 1, 50 g 5-fluorourydyny przeprowadzono w surowy koniugat, wytrącono w postaci soli wapnia, jak opisano w przykładzie, i następnie po konwersji do wolnego kwasu, oczyszczono jako surowy produkt na drodze chromatografii, analogicznie do przykładu 4, na fazie DIOL, stosując metanol/MTB 10/4 jako eluent. Wytworzoną zgodnie z przykładem 3 sól sodową wyodrębniono z wydajnością 69%.

Przykład 7

Wartości IC50 dla azatiopryny, 6-merkaptopuryny (6-MP), 6-merkaptopurynorybozydu, BM 92.0729 i doksorubicyny w testach CFU-E i CFU-GM

W poniższej tabeli przedstawiono wartości IC50 (g/ml) dla azatiopryny, 6-merkaptopuryny (6-MP) i 6-merkaptopurynorybozydu w porównaniu z koniugatem eteru lipidowego 6-merkaptopurynorybozvdu bM 92.0729 w badaniach cytoksyczności in vitro wobec komórek macierzystych mysiego szpiku kostnego, w tym z badaniem jednostek tworzących kolonie erytrocytów (CFU-E) i jednostek tworzących kolonie granulocytów/makrofagów (CFU-CM). Jako substancję odniesienia włączono również cytostatyczny/cytotoksyczny związek doksorubicynę. Wszystkie związki badano w 3-6 różnych stężeniach, inkubując przy przynajmniej dwukrotnym lub trzykrotnym powtórzeniu na badane stężenie.

Jak widać z wyników, po porównaniu z wszystkimi innymi badanymi związkami, a szczególnie w porównaniu z 6-merkaptopurynorybozydem, Bm 92.0729 jest lepiej tolerowany przez komórki macierzyste szpiku kostnego.

Wartości IC₅0 ((g/ml) dla azatiopryny, 6-merkaptopuryny (6-MP), 6-merkaptopurynorybozydu, BM 92 0729 i doksorubicyny w próbach na CFU-E i CFU-GM^a

Związek	C FU	.— CFU-GM
Azatiopryna	0,0004 ± 0,0001 (4)	0,0043 ±0,0019	(3)
6-MP	0,0003 ± 0,0001 (4)	0,0023 ± 0,00009	(3)
6-MP-Rybozyd	0,0003 ± 0,0001 (4)	0,0023 ±0,00013	(3)
BM 92.0729	0,056 ±0,013 (5)	0,247 ±01,04	(6)
Doksorubicyna	0,0017 ±0,0005 (4)	0,050 ±0,004	(4)

oznacza ± SEM (standardowe odchylenie), n = liczbę różnych badań.

185 290

Przykład 8

Toksyczność wobec szpiku kostnego BM 92.0729, 6-merkaptopuryny i 6-merkaptopurynorybozydu u samic myszy Balb/c: Dzień + 4 (Eksperyment 930740).

Exp. 930740 przedstawia toksyczność BM 92.0729, azatiopryny, 6-merkaptopuryny i 6-merkaptopurynorybozydu wobec szpiku kostnego in vivo u samic myszy Balb/c, którym raz dziennie podawano wymienione środki doustnie przez cztery kolejne dni (dzień 0-dzień +3). Zwierzęta zabito +4 dnia i oznaczono komórkowość szpiku kostnego (komórki/kość udowa). Wyniki wskazują, że nawet przy najwyższych podawanych dawkach, to jest 100 mg/kg/dzień, co odpowiada molowo 30 mg/kg/dzień 6-merkaptopurynorybozydu, nie stwierdzono toksyczności wobec szpiku kostnego dla koniugatu eteru 6-merkaptopurynorybozydu i lipidu BM 92.0729. 6-merkaptopurynorybozyd, w przeciwieństwie do koniugatu eteru i lipidu BM 92.0729, wykazuje wyraźnie w sposób zależny od dawki zmniejszenie komórkowości szpiku kostnego. To samo stwierdzono w przypadku innych substancji, łącznie z azatiopryną i 6-merkaptopuryny.

Toksyczność BM 92:0729, azatiopryny, 6-merkaptopuryny i 6-merkaptopurynorybozydu wobec szpiku kostnego samic myszy Balb/c: dzień +4 (Exp. 930740)

Związek	Dawka (mg/kg/ dzień)	Komórki/kość udowa (106)
Kontrola (0,5% Tylose)	-	15,9 ± 1,4	(8)^a
Azatiopryna	10	11,6 ±0,4	(9)*
Azatiopryna	30	9, 6 ± 0,9	(9)**
6-merkaptopuryna	10	13,0 ± 1,5	(8)
6-merkaptopuryna	30	6,5 ± 0,7	(9)**
6-merkaptopurynorybozyd	10	12, 6 ±0,5	(9)**
6-merkaptopurynorybozyd	30	9,3 ± 0,5	(9)**
BM 92.0729	30	15,4 ±0^9	(9)
BM 92.0729	100	13,0 ±0,6	(9)

^a średnio + SEM (standardowe odchylenie); Podawanie raz dziennie, p.o., dzień 0-dzień+3, zabicie dnia +4. * p < 0,05.

** p<0,01 test Mann-Whitney’a.

Przykład 9

Toksyczność BM 92.0729, azatiopryny, 6-merkaptopuryny, 6-merkaptopurynorybozydu i cyklosporyny A wobec szpiku kostnego samic myszy Balb/c: Dzień +4 (Eksperyment 940026)

Eksperyment 940026 jest badaniem, którego celem jest powtórzenie wyników uzyskanych w eksperymencie 930740 (przykład 8). Do badania tego jako związek porównawczy włączono również cyklosporynę A. Wynik eksperymentu 940026 potwierdza rezultaty uzyskane w eksperymencie 930740 in vivo.

185 290

Toksyczność BM 92.0729, azatiopryny, 6-merkaptopuryny, 6-merkaptopurynorybozydu i cyklosporyny A wobec szpiku kostnego samic myszy Balb/c: dzień +4 (eks. 940026)

Związek	Dawka (mg/kg/ dzień)	Komórki/kość udowa (10⁶)
Kontrola (0,5% Tylose)	-	15,6 ±0,8	(10) a
Azatiopryna	10	11,1 ±0,6	(10) **
Azatiopryna	30	9,1 ±0,5	(10) **
6-merkaptopuryna	10	10,9 ±0,9	(10)*
6-merkaptopuryna	30	6,2 ± 0,5	(10) **
6-merkaptopurynorybozyd	10	13,7 ± 1,4	(10)*
6-merkaptopurynorybozyd	30	8,4 ± 0,4	(10)**
BM 92.0729	30	14,3 ± 0,5	(10)
BM 92.0729	100	13,0 ±0,4	(10)
Cyklosporyna A	5	13,1 ±0,4	(10)
Cyklosporyna A	10	7,6 ± 1,4	(10)**

średnio + SEM (standardowe odchylenie); Podawanie raz dziennie, p.o., dzień 0-dzień +3, zabicie dnia +4. * p < 0,05.

** p < 0,01 test Mann-Whitney’a.

Przykład 10

Toksyczność wobec szpiku kostnego (pM) BM 92.0700 i 5-FU w testach CFU-E i CF-GM

W załączonej tabeli 4 przedstawiono średnie wartości IC50 dla 5-fluorourydyny (5-FU) i koniugatu eteru lipidowego 5 - fluorourydyny BM 92.0700 toksyczności wobec szpiku kostnego in vitro w testach CFU-E i CFU-GM. Warunki testu są takie, jak opisano w przykładzie 7.

Dane wykazują, że w porównaniu z samą 5-FU, koniugat eteru lipidowego 5-fluorourydyny BM 92.0700 jest 610 razy i 238 razy mniej toksyczny w stosunku do komórek macierzystych erytrocytów i granulocytów/makrofagów szpiku kostnego, odpowiednio.

Toksyczność wobec szpiku kostnego (μΜ) BM 92.0700 i 5-FU w testach CFU-E i CFU-GM

Związek	CFU-Ea	CFU-GMa
BM 92.0700	0,372 (3)	610 x
1,178 (7)	238 x
5-FU	0,00061 (3)	0,00496(10)

^a średnia n, liczba eskperymentów.

Przykład 11

Wpływ koniugatu eteru lipidowego BM 92.0700 (tj.5-FU-DMDOPE) (fig. 1), i 5-FU (fig. 2) na białaczkę L 1210 in vivo - czas przeżycia

Myszy inokulowano z komórkami białaczki L 1210 dnia 0 (n=10 zwierząt/grupę), a następnie raz dziennie i.p. podawano badane związki od dnia 0 (+1h) do dnia +41 (6 tygodni) w cyklach tygodniowych, przedstawionych na fig.1 i 2, odpowiednio.

Na podstawie krzywych przeżycia grupy kontrolnej i traktowanej badanym związkiem, przedstawionych na fig. 2, oczywiste jest, że 5-FU, o czym donosi literatura, ma bardzo

185 290 wąski profil skuteczności dawkowania, to znaczy, że zwiększenie dawki, na przykład z 2 x 10/5 x 0,1 mg/kg/dzień do 2 x 10/5 x 0,3 mg/kg/dzień, a nawet do wyższych dawek, prowadzi do zmniejszenia czasu przeżycia.

W przeciwieństwie do tego, koniugat eteru lipidowego 5-FU BM 92.0700 w sposób wyraźnie zależny od dawki zwiększa czas przeżycia, w porównaniu z wynikami otrzymanymi w próbach kontrolnych I i II (fig.1), co wskazuje, że równomolowe dawki BM 92.0700 są w widoczny sposób bardziej skuteczne w tym modelu białaczki w stosunku do standardowego związku 5-FU.

Biorąc pod uwagę, że BM 92.0700 jest bardziej skuteczny (fig.1 i 2) i znacznie mniej toksyczny w stosunku do komórek szpiku kostnego, stwierdzić należy, że ma on znacznie wyższy wskaźnik terapeutyczny w porównaniu ze standardowym cytostatycznym związkiem 5-FU.

Claims

Zastrzeżenia patentowe 1. Monofosforanowe pochodne nukleozydu o wzorze I

R¹

R² x-ch₂ •Y-CH O ch₉—o—p—o—ch₂1 ^>0 OH (i).

w którym:

R¹ oznacza prosty lub rozgałęziony łańcuch alkilowy zawierający 1-20 atomów węgla, R² oznacza prosty, lub rozgałęziony, nasycony łańcuch alkilowy zawierający 1-20 atomów węgla,

R³ oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową;

R⁴ oznacza grupę hydroksylową;

R⁵ oznacza atom wodoru, lub grupę hydroksylową;

X oznacza atom siarki,

Y oznacza atom tlenu;

B oznacza zasadę purynową i pirymidynową o wzorze IIIa i IIId (IIIa) (IIId) w którym:

R⁶ oznacza atom wodoru,

R⁶' oznacza atom wodoru,

R⁹ oznacza atom wodoru,

R¹⁰ oznacza grupę merkapto, pod warunkiem, że co najmniej jedna z reszt R3 lub R5 oznacza atom wodoru;

oraz ich tautomery, postaci optycznie aktywne i mieszaniny racemiczne, a także fizjologicznie dopuszczalne sole z nieorganicznymi i organicznymi kwasami i zasadami.

185 290

2. Monofosforanowe pochodne nukleozydu o wzorze I według zastrz. 1, w których R¹oznacza prostołańcuchową grupę C₈-C₁₅alkilową.

3. Monofosforanowe pochodne nukleozydu o wzorze I według zastrz. 1 albo 2, w których R² oznacza prostołańcuchową grupę C₈-C₁₅alkilową.

4. Monofosforanowe pochodne nukleozydu o wzorze I według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że

R1 oznacza prostołańcuchową grupę C^-C],alkilową.

R2 oznacza prostołańcuchową grupę C₈-C_Halkilową R³ oznacza resztę hydroksylową;

R⁴ oznacza resztę hydroksylową;

R5 oznacza atom wodoru;

R⁶ oznacza atom wodoru R⁶' oznacza atom wodoru; i R¹⁰ oznacza grupę merkapto.

5. Monofosforanowe pochodne nukleozydu o wzorze I według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że część nukleozydowa jest wybrana z następujących grup:

6-merkaptopuryno-9-p-D-rybofuranozyd, 5-fluorourydyna.

6. Sposób wytwarzania monofosforanowych pochodnych nukleozydu o wzorze I, w którym: R1 oznacza prosty lub rozgałęziony łańcuch alkilowy zawierający 1-20 atomów węgla, R2 oznacza prosty lub rozgałęziony nasycony łańcuch alkilowy zawierający 1-20 atomów węgla,

R³ oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową;

R4 oznacza grupę hydroksylową;

R5 oznacza atom wodoru, grupę hydroksylową;

X oznacza atom siarki,

Y oznacza atom tlenu;

B oznacza zasadę purynową i pirymidynową o wzorze IIIa i IIId, (IIIa) (IIId) w którym:

R6 oznacza atom wodoru,

R6 oznacza atom wodoru,

R9 oznacza atom wodoru,

R’0 oznacza atom wodoru, grupę merkapto, pod warunkiem, że co najmniej jedna z reszt R3 lub R5 oznacza atom wodoru;

oraz ich tautomerów, postaci optycznie aktywnych i mieszanin racemicznych, a także fizjologicznie dopuszczalnych soli z nieorganicznymi i organicznymi kwasami i zasadami, znamienny tym, że:

185 290 (V).

1) związek o ogólnym wzorze V

Τ-Χ-ΟΗ,

9 ¹

R/-Y-CH O

I li

CH₂-O-P-OH ^z I

OH w którym R¹, R², X i Y mają wskazane uprzednio znaczenia, poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze VI (VI), w którym R³, R⁴, R⁵ i B mają wyżej podane znaczenia, lub oznaczają grupę hydroksylową chronioną grupą ochronną dla tlenu, w obecności aktywującego chlorku kwasowego, takiego jak chlorek kwasu 2,4,6-triizopropylobenzenosulfonowego, i trzeciorzędowej zasady azotowej, korzystnie pirydyny lub lutydyny, w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak toluen, lub bezpośrednio w bezwodnej pirydynie, i ewentualnie po hydrolizie, usuwa się grupy ochronne dla tlenu, zgodnie z kowencjonalnymi sposobami w chemii nukleozydów, albo
2) związek o ogólnym wzorze VII

R^l-X-CH₂

R² —Y-CH O CHo

I + I ^ϋ

CH₂-O-P~O-CH₂—CH₂—N-CH₃ (Χ/Ι,), o ch₃ w którym Ri, R2, X i Y mają wyżej podane znaczenia, poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze VI, w którym R3, R4, R⁵ i B mają wyżej podane znaczenia, w obecności fosfolipazy D ze Streptomyces, w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak chloroform, w obecności odpowiedniego buforu, i ewentualnie, po tej reakcji, usuwa się grupy ochronne dla tlenu, zgodnie z konwencjonalnymi sposobami w chemii nukleozydów.

7. Środek farmaceutyczny, zwłaszcza do leczenia nowotworów, znamienny tym, że zawiera związek o wzorze I,

185 290

R ¹R² —X—CH?

I ² „ —Y-CH O

I II

CH₂-O-P-O-ęH₂OH (I).

H,

R³ R⁴ w którym:

R¹ oznacza prosty lub rozgałęziony łańcuch alkilowy zawierający 1-20 atomów węgla, R² oznacza prosty, lub rozgałęziony, nasycony łańcuch alkilowy zawierający 1-20 atomów węgla,

R³ oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową;

R⁴ oznacza grupę hydroksylową;

R⁵ oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową;

X oznacza atom siarki;

Y oznacza atom tlenu;

B oznacza zasadę purynową i pirymidynową o wzorze IIIa i IIId

O

H

O

R⁶ (IIIa) (IIId) w którym:

R⁶ oznacza atom wodoru,

R⁶’ oznacza atom wodoru,

R⁹ oznacza atom wodoru,

R¹⁰ oznacza grupę merkapto, pod warunkiem, że co najmniej jedna z reszt R3 lub R5 oznacza atom wodoru;

oraz ich tautomery, postaci optycznie aktywne i mieszaniny racemiczne, a także fizjologicznie dopuszczalne sole z nieorganicznymi i organicznymi kwasami i zasadami.

8. Zastosowanie monofosforanowych pochodnych nukleozydu o wzorze I r!-X-CH₂ _R2__y_ch O (1),

CHo—O-P—O-CH_{2 b}

1.. I i w którym: R R

Ri oznacza prosty lub rozgałęziony łańcuch alkilowy zawierający 1-20 atomów węgla,

185 290

R² oznacza prosty, lub rozgałęziony, nasycony łańcuch alkilowy zawierający 1-20 atomów węgla,

R³ oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową;

R⁴ oznacza grupę hydroksylową;

R⁵ oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową;

X oznacza atom siarki,

Y oznacza atom tlenu;

B oznacza zasadę purynową i pirymidynową o wzorze IIIa i IIId (IIIa) (IIId) w którym:

R⁶ oznacza atom wodoru,

R⁶' oznacza atom wodoru,

R9 oznacza atom wodoru,

R¹⁰ oznacza grupę merkapto, pod warunkiem, że co najmniej jedna z reszt R3 lub R5 oznacza atom wodoru;

oraz ich tautomery, postaci optycznie aktywne i mieszaniny racemiczne, a także fizjologicznie dopuszczalne sole z nieorganicznymi i organicznymi kwasami i zasadami, do wytwarzania środków farmaceutycznych do leczenia zwłaszcza nowotworów