NO339595B1

NO339595B1 - Anti-nervevekstfaktor (NGF) antagonist antistoff eller antigenbindende fragment derav for anvendelse ved behandling av osteoartritt-smerte i et individ samt for anvendelse ved fremstilling av et medikament for behandling av osteoartritt-smerte i et individ.

Info

Publication number: NO339595B1
Application number: NO20150469A
Authority: NO
Inventors: David L Shelton; Arnon Rosenthal; Jaume Pons
Original assignee: Rinat Neuroscience Corp
Priority date: 2002-12-24
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2017-01-09
Also published as: CA2936742A1; CN101014364A; US9708398B2; IL218087B; KR20120128699A; JP2008148710A; HK1177754A1; PL380679A1; AU2003299898B2; ATE553128T1; EP2263692B1; EP3539569A1; BR0317738A; KR20050096101A; EP1575517A2; NO336655B1; JP4336728B2; SI1575517T1; ES2564752T3; CA2936742C

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder anti-NGF-antistoffer (for eksempel antagonistiske anti-NGF-antistoffer). Oppfinnelsen gjelder videre anvendelse av slike antistoffer ved behandling av smerte forbundet med osteoartritt.

Oppfinnelsens bakgrunn

Nerve vektsfaktor (NGF) var det første neurotrofin som ble påvist, og faktorens rolle for utvikling og overlevelse av både perifere og sentrale neuroner er godtkarakterisert. NGF har blitt vist å være en avgjørende overlevelses- og vedlikeholdsfaktor for utvikling av perifere sympatiske og embryonale sanseneuroner og for cholinerge neuroner i den basale forhjerne. Smeyne et al., Nature 368:246-249 (1994) og Crowley et al., Cell 76:1001-1011

(1994). NGF oppregulerer ekspresjonen av neuropeptider i sanseneuroner (Lindsay og Harmer, Nature 337:362-364 (1989)) og aktiviteten formidles via to forskjellige membranbundne reseptorer, TrkA-reseptoren og den vanlige neurotrofinreseptor p75 (noen ganger betegnet "høyaffinitets" henholdsvis "lavaffinitets"-NGF-reseptoren). Chao et al., Science 232:518-521 (1986). For en oversikt vedrørende NGF, se Huang et al., Annu. Rev. Neurosci. 24:677-736 (2001); Bibel et al., Genes Dev. 14:2919-2937 (2000). Krystallstrukturen til NGF og NGF i kompleks med trkA-reseptoren er bestemt. Se Nature 254:411 (1991); Nature 401:184-188 (1996). Nerve vekstfaktor (NGF) var den første neurotrofin som ble påvist, og faktorens rolle for utvikling og overlevelse av både perifere og sentrale neuroner er godtkarakterisert. NGF har blitt vist å være en avgjørende overlevelses- og vedlikeholdsfaktor for utvikling av perifere sympatiske og embryonale sanseneuroner og for cholinerge neuroner i den basale forhjerne (Smeyne et al., Nature 368:246-249 (1994) og Crowley et al., Cell 76:1001-1011

(1994)). NGF oppregulerer ekspresjonen av neuropeptider i sanseneuroner (Lindsay et al., Nature 337:362-364 (1989)) og aktiviteten formidles via to forskjellige membranbundne reseptorer, tyrosinkinase reseptoren trkA og p75-reseptoren, som er strukturelt beslektet med andre medlemmer av tumornekrosefaktor reseptorfamilien (Chao et al., Science 232:518-521 (1986)). I tillegg til virkningene i nervesystemet har NGF i stadig større grad blitt implisert i prosesser utenfor nervesystemet. NGF har for eksempel blitt vist å forhøye den vaskulære permeabilitet (Otten et al., Eur J Pharmacol. 106:199-201 (1984)), forsterke T- og B-celle immunresponser (Otten et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:10059-10063 (1989)), indusere lymfocytt differensiering og mastcelle proliferasjon og i frigjøring av løselige biologiske signaler fra mastceller (Matsuda et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:6508-6512

(1988); Pearce et al., J. Physiol. 372:379-393 (1986); Bischoff et al., Blood 79:2662-2669

(1992); Horigome et al., J. Biol. Chem. 268:14881-14887 (1993)). Selv om eksogent tilsatt

NGF har blitt vist å kunne ha alle disse virkningene er det viktig å merke seg at det bare sjelden har blitt vist blant endogen NGF er viktig i noen av disse prosessene in vivo (Torcia et al., Cell 85(3):345-56 (1996)). Det er derfor ikke klart hvilken virkning, om noen, inhibering av bioaktiviteten av endogen NGF kan ha.

NGF produseres av en rekke celletyper, innbefattet mastceller (Leon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:3739-3743 (1994)), B-lymfocytter (Torcia et al., Cell 85:345-356

(1996), keratinocytter (Di Marco et al., J. Biol. Chem. 268:22838-22846)), glatte muskel-celler (Ueyama et al., J. Hypertens. 11:1061-1065 (1993)), fibroblaster (Lindholm et al., Eur. J. Neurosci. 2:795-801 (1990)), bronkiale epitelceller (Kassel et al., Clin. Exp. Allergy 31:1432-40 (2001)), mesangiale celler i nyrer (Steiner et al., Am. J. Physiol. 261:F792-798

(1991)) og myotubuli i skjellettmuskel (Schwartz et al., J Photochem. Photobiol. B66:195-200 (2002)). NGF-reseptorer har blitt funnet på en rekke celletyper utenfor nervesystemet. TrkA har for eksempel blitt funnet på humane monocytter, T- og B-lymfocytter og mastceller. En sammenheng mellom forhøyet NGF-nivå og en rekke betennelsestilstander har blitt observert hos humane pasienter, så vel som i flere dyremodeller. Disse omfatter systemisk lupus erytematosus (Bracci-Laudiero et al., Neuroreport 4:563-565 (1993)), multiple sklerose (Bracci-Leudiero et al., Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), psoriasis (Raychaudhuri et al., Acta Derm. 1'enereol. 78:84-86 (1998)), artritt (Falcim et al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), interstitiel cystitt (Okragly et al., J. Urology 161:438-441

(1999)) og astma (Braun et al., Eur. J Immunol. 28:3240-3251 (1998)).

Gjennomgående er et forhøyet NGF-nivå i perifere vev forbundet med hyperalgesi og betennelse og har blitt observert i en rekke artritt former. Synovium hos pasienter som lider av reumatoid artritt uttrykker NGF i høyt nivå, mens NGF har blitt rapportert til ikke å kunne påvises i ikke-betent synovium (Aloe et al., Arch. Rheum. 35:351-355 (1992)). Tilsvarende resultater ble observert hos rotter med eksperimentelt indusert reumatoid artritt (Aloe et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204 (1992)). Forhøyet NGF-nivå har blitt rapportert hos transgene artritt-mus, sammen med et økt antall mastceller (Aloe et al., Int. J. Tissue Reactions-Exp.Clin.Aspects 15:139-143 (1993)). PCT-patentskrift WO 02/096458 beskriver anvendelse av anti-NGF-antistoffer med visse egenskaper for behandling av forskjellige NGF-assosierte forstyrrelser, f.eks. betennelsestilstander (foreksempel reumatoid artritt). Det har blitt rapportert at et renset anti-NGF-antistoff injisert i transgene artritt-mus som bar genet for human tumornekrosefaktor-a (TNF-a) ga et redusert antall mastceller, så vel som redusert nivå av histamin og substans P i synovium hos artritt-musene (Aloe et al., Rheumatol. Int. 14:249-252 (1995)). Det har blitt vist at eksogen administrering av et NGF-antistoff reduserte det forhøyde TNF-a-nivå som opptrer hos artrittmus (Manni et al., Rheumatol. Ing. 18:97-102 (1998)).

Videre ble forhøyet ekspresjon av NGF og høyaffinitets-NGF-reseptor (TrkA) observert i humane chondrocytter fra osteroartritt pasienter (Iannone et al., Rheumatology 41:1413-1418 (2002)).

Woolf et al Neuroscience 62(2): 327-331 (1994) beskriver injeksjon av Freunds komplett adjuvans som resulterer i mekanisk og termisk hyperalgesi som ble inhibert av anti-NGF antiserum. Theodosiou et al Pain 81(3): 245-255 (1999) beskriver at en nerveskade forårsaket av transeksjon og mekanisk og termisk hyperalgesi lettet ved hjelp av anti-NGF antiserum. Leem et al Abstracts of the annual meeting of Society for Neuroscience 26(1/02)

(November 2000) beskriver at et anti-NGF antistoff er i stand til å lindre smerte forårsaket av ryggmargsskade. Lewin et al The European Journal of Neuroscience 6(12): 1903-1912 (1994) beskriver administrering av en enkel bolus av NGF som fører til termisk og mekanisk hyperalgesi hos rotter, og at en anti-NGF-behandling inhiberer termisk-hyperalgesi, Gould et al Brain Research 854(1-2): 19-29 (2000) beskriver at administrering av NGF oppregulerer natriumkanal-ekspresjon i sensoriske nevroner og at denne oppreguleringen faller sammen med utvikling av termisk og mekanisk hyperalgesi. Djouhri et al The Journal of Neuroscience 21(22): 8722-8733

(2001) beskriver at NGF regulerer betennelse-indusert reduksjon i varigheten av sensorisk nervecelle aksjonspotensialer, øker nevron avfyring hastighet og spontan aktivitet. Ma et al Neuroreport 8(4): 807-810 (1997) beskriver at Freunds adjuvans medierte perifer betennelse og taktil overfølsomhet/hyperalgesi som følge av dette er direkte forårsaket av NGF. Tanaka Tomohiro et al Environmental Medicine 44(2): 72-74 (2000), viser at anti-NGF antistoffterapi er ineffektiv mot adjuvant-indusert arthritis. Antagonistiske anti-NGF-antistoffer fra gnagere har blitt rapportert. Se for eksempel Hongo et al., Hybridoma (2000) 190(3):215-227; Ruberti et al. (1993) Cell. Molec. Neurobiol. 13(5):559-568. Dersom gnagerantistoffer anvendes terapeutisk i mennesker utvikles imidlertid en human anti-museantistoff respons i et signifikant antall av de behandlede individer. I tillegg har effektorfunksjonene til mu sea nti stoffe r vist seg å være mindre effektive i en human sammenheng. Det foreligger således et stort behov for antagonistiske anti-NGF-antistoffer, innbefattet humaniserte antagonistiske anti-NGF-antistoffer.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen som beskrevet her vedrører antistoffer mot nervevekstfaktor.

I ett aspekt er oppfinnelsen et anti-nervevekstfaktor (NGF) antagonist antistoff eller antigenbindende fragment derav for anvendelse ved behandling av osteoartritt-smerte i et individ. I et annet aspekt vedrører oppfinnelsen anvendelsen av et anti-nervevekstfaktor (NGF) antagonist antistoff eller antigenbindende fragment derav til fremstilling av et medikament for behandling av osteo-artritt-smerte i et individ.

I et annet aspekt er antistoffet et humaniserte og affinitetsmodnet antistoff, E3, som spesifikt binder nervevekstfaktor ("NGF") fra menneske og gnagere. Aminosyre-sekvensene til tungkjedens og lettkjedens variable område i E3 er vist i figurene IA (SEKV. ID. NR.l) henholdsvis IB (SEKV. ID. NR.2). CDR-områdene i antistoff E3 (innbefattet Chothia- og Kabat-CDR) er vist skjematisk i Figurene IA og IB. Aminosyresekvensen til tungkjeden og lettkjeden i E3 samt for de enkelte utvidede CDR er også vist nedenfor (se "antistoff sekvenser" nedenfor).

I et annet aspekt omfatter antistoffet et fragment eller område fra antistoff E3 (også betegnet "E3" her). I én utførelsesform er fragmentet en lettkjede fra antistoff E3 som vist i Figur IB. I en annen utførelsesform er fragmentet en tungkjede fra antistoff E3 som vist i Figur IA. I ytterligere en utførelsesform inneholder fragmentet ett eller flere variable områder fra en lettkjede og/eller en tungkjede fra antistoff E3. I ytterligere en utførelsesform inneholder fragmentet ett eller flere komplementaritetsbestemmende områder (CDR) fra en lettkjede og/eller en tungkjede fra antistoff E3 som vist i Figurene IA og IB.

I et annet aspekt omfatter antistoffet en lettkjede som kodes av et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4893 eller PTA-4894. I et annet aspekt omfatter antistoffet en tungkjede som kodes av et polynukleotid som dannet av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4895. I et annet aspekt omfatter antistoffet (a) en lettkjede som kodes av et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4894 eller PTA-4893, og (b) en tung-kjede som kodes av et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4895 (for enkelthets skyld her angis polynukleotidet eller polynukleotidene som dannes av en deponert vertscelle å ha et ATCC-depotnummer PTA-4894, PTA-4893 eller PTA-4895). I et annet aspekt omfatter antistoffet ett lettkjede variabelt domene fra en lettkjede som kodes av et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4894 eller PTA-4893. I et annet aspekt omfatter antistoffet et variabelt tungkjede domene fra en tungkjede som kodes av et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4895. I et annet aspekt omfatter antistoffet (a) et variabelt lettkjede domene fra en lettkjede som kodes av et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4894 eller PTA-4893, og (b) et tungkjede variabelt område fra en tungkjede som kodes av et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4895. I ytterligere et aspekt omfatter antistoffet én eller flere CDR som kodes av (a) et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4894 og/eller (b) en tungkjede som kodes av et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4895.

I noen utførelsesformer omfatter antistoffet det konstante området fra human tungkjede IgG 2A. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet det konstante området fra human lettkjede k. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet et modifisert konstant område, slik som et konstant område som er immunologisk inert, f. eks. utløser ikke komplement mediert lysis eller stimulerer ikke antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC). I andre utførelsesformer er det konstante området modifisert som beskrevet i Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; PCT-patentsøkand WO 99/58572. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter antistoffet et konstant område fra en human tungkjede IgG 2A omfattende følgende mutasjoner: A330P331 til S330S331 (aminosyrenummerering med referanse til villtype-IgG 2A-sekvensen. Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624.

I et annet aspekt omfatter antistoffet én eller flere av følgende: a) én eller flere CDR fra antistoff E3, vist i Figurene IA og IB, b) CDR H3 fra tungkjeden i antistoff E3, vist i

Figur IA, c) CDR L3 fra lettkjeden i antistoff E3, vist i Figur IB, d) tre CDR fra lettkjeden i antistoff E3, vist i Figur IB, e) tre CDR fra tungkjeden i antistoff E3, vist i Figur IA, og f) tre CDR fra lettkjeden og tre CDR fra tungkjeden i antistoff E3, vist i Figurene IA og IB. Oppfinnelsen tilveiebringer videre et antistoff som omfatter én eller flere av følgende: a) én eller flere (én, to, tre, fire, fem eller seks) CDR avledet fra antistoff E3, vist i Figurene IA og IB, b) en CDR avledet fra CDR H3 fra tungkjeden i antistoff E3, vist i Figur IA, og/eller c) en CDR avledet fra CDR L3 fra lettkjeden i antistoff E3, vist i Figur IB. I noen utførelses-former kan disse CDR være Kabat-CDR, Chothia-CDR eller en kombinasjon av Kabat- og Chothia-CDR (her betegnet "utvidede" eller "kombinerte" CDR).

I noen utførelsesformer binder antistoffer NGF (slik som humant NGF). I noen utførelsesformer omfatter antistoffene et hvilke som helst av CDF-konfigurasjonene (innbefattet kombinasjoner, varianter osv.) som beskrevet her.

I ett aspekt omfatter antistoffene et tungkjede variabelt område som omfatter SEKV. ID. NR.9, hvor 134 er S, L, V, A eller I; og N35 er erstattet med N, T eller S. For enkelhets skyld her referer "substituert" eller "er" i denne forbindelse eller referanse til en aminosyre til valg av aminosyre(r) i en gitt posisjon. Så klart kan substitusjonen eller valget være den aminosyre som er gjengitt i en Sekv. Id. eller Figur.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et tungkjede variabelt område som omfatter SEKV. ID. NR.10, hvor M50 er M, I, G, Q, S eller L; A62 er A eller S og L63 er L eller V.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et tungkjede variabelt område som omfatter SEKV. ID. NR.ll, hvor Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er D, N eller G og Y110 er Y, K, S, R eller T.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et tungkjede variabelt område som omfatter SEKV. ID. NR.ll, hvor Y 100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D, N, T eller G og Y110 er hvilken som helst aminosyre.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et tungkjede variabelt område som omfatter SEKV. ID. NR.ll, hvor G98 er G, S, A, C, V, N, D eller T, G99 er G, S, A, C, V, N, D eller T, Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D, N, T eller G og Y110 er hvilken som helst aminosyre.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et lettkjede variabelt område som omfatter SEKV. ID. NR.12, hvor S26 er S eller F, D28 er D, S, A eller Y og H32 er H, N eller Q.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et lettkjede variabelt område som omfatter SEKV. ID. NR.13, hvor 151 er I, T, V eller A og S56 er S eller T.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et lettkjede variabelt område som omfatter SEKV. ID. NR.14, hvor S91 er S eller E, K92 er K, H, R eller S og Y96 er Y eller R.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et lettkjede variabelt område som omfatter SEKV. ID. NR.14, hvor S91 er S eller E, K92 er hvilken som helst aminosyre, T93 er hvilken som helst aminosyre og Y96 er Y eller R.

I ett aspekt omfatter antistoffene en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.9, hvor 134 er S, L, V, A eller I og N35 er N, T eller S.

I et annet aspekt omfatter antistoffene en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR. 10, hvor M50 er M, I, G, Q, S eller L, A62 er A eller S og L63 er L eller V.

I et annet aspekt omfatter antistoffene en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.ll, hvor Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller, D109 er D, N eller G og Yl 10 er Y, K, S, R eller T.

I et annet aspekt omfatter antistoffene en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.ll, hvor Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D, N, T eller G og Y110 er hvilken som helst aminosyre.

I et annet aspekt omfatter antistoffene en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.ll, hvor G98 er G, S, A, C, V; N, D eller T, G99 er G, S, A, C; V; N, D eller T, Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D; N, T eller G og Y110 er hvilken som helst aminosyre.

I et annet aspekt omfatter antistoffene en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.12, hvor S26 er S eller F, D28 er D, S, A eller Y og H32 er H, N eller Q.

I et annet aspekt omfatter antistoffene en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.13, hvor 151 er I, T, V eller A og S56 er S eller T.

I et annet aspekt omfatter antistoffene en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.14, hvor S91 er S eller E, K92 er K, H, R eller S og Y96 er Y eller R.

I et annet aspekt omfatter antistoffene en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.14, hvor S91 er S eller E, K92 er hvilken som helst aminosyre, T93 er hvilken som helst aminosyre og Y96 er Y eller R.

I et annet aspekt omfatter antistoffene (innbefattet humaniserte antistoffer) et tungkjede variabelt område som omfatter CDRl-området fra SEKV. ID. NR.9, hvor 134 er S, L, V, A eller I og N35 er N, T eller S, CDR2-området fra SEKV. ID. NR. 10, hvor M50 er M, I, G, Q, S eller L, A62 er A eller S og L63 er L eller V, og CDR3-området fra SEKV. ID. NR.ll, hvor Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er D, N eller G og Y110 erY, K, S, R eller T. I noen utførelsesformer omfatter tungkjedens variable område CDR3-området fra SEKV. ID. NR.ll, hvor Y100 erY, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G; D, N, T eller G og Y110 er hvilken som helst aminosyre. I andre utførelsesformer omfatter tungkjedens variable område CDR3-området fra SEKV. ID. NR.ll, hvor G98 er G, S, A, C, V; N, D eller T, G99 er G, S, A, C, V, N, D eller T, Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D, N, T eller G og Y110 er hvilken som helst aminosyre. I noen utførelsesformer omfatter

antistoffet videre et lettkjede variabelt område fra et antistoff.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et lettkjede variabelt område som omfatter CDRl-området fra SEKV. ID. NR.12, hvor S26 er S eller F, D28 er D, S, A eller Y og H32 er H, N eller Q, CDR2-området fra SEKV. ID. NR.13 hvor 151 er I, T, V eller A og S56 er S eller T og CDR3-området fra SEKV. ID. NR.14 hvor S91 er S eller E, K92 er K, H, R eller S og Y96 er Y eller R. I noen utførelsesformer omfatter lettkjedens variable område CDR3-området fra SEKV. ID. NR.14 hvor S91 er S eller E, K92 er hvilken som helst aminosyre, T93 er hvilken som helst aminosyre og Y96 erY eller R. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet videre en tungkjede fra et antistoff.

I et annet aspekt omfatter antistoffene (a) et tungkjede variabelt område som omfatter CDRl-området fra SEKV. ID. NR.9 hvor 134 er S, L, V, A eller I og N35 er N, T eller S, CDR2-området fra SEKV. ID. NR. 10 hvor M50 er M, I, G, Q, S eller L, A62 er A eller S og L63 er L eller V, og CDR3-området fra SEKV. ID. NR.ll hvor Y100 erY, L eller R, Y101 erY eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller ", D109 er D, N eller G og Yl 10 er Y, K, S, R eller T og (b) et lettkjede variabelt område som omfatter CDRl-området fra SEKV. ID. NR.12 hvor S26 er S eller F, D28 er D, S, A eller Y og H32 er H, N eller Q, CDR2-området fra SEKV. ID. NR. 13 hvor 151 er I, T, V eller A og S56 er S eller T og CDR3-området fra SEKV. ID. NR.14 hvor S91 er S eller E, K92 er K, H, R eller S og Y96 er Y eller R. I noen utførelsesformer omfatter lettkjedens variable område CDR3-området fra SEKV. ID. NR.14 hvor S91 er S eller E, K92 er hvilken som helst aminosyre, T93 er hvilken som helst aminosyre og Y96 er Y eller R. I noen utførelsesformer omfatter tungkjedens variable område CDR3-området fra SEKV. ID. NR.ll hvor Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D, N, T eller G og Yl 10 er hvilken som helst aminosyre. I andre utførelsesformer omfatter tungkjedens variable område CDR3-området fra SEKV. ID. NR.ll hvor G98 er G, S, A, C, V, N, D eller T, G99 er G, S; A, C, V; N, D eller T, Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D, N, T eller G og Y110 er hvilken som helst aminosyre. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet en lettkjede fra et antistoff.

I et annet aspekt omfatter antistoffene (inbefattet et humanisert antistoff) en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.9 hvor 134 er S, L, V, A eller I og N35 er N, T eller S, en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR. 10 hvor M50 er M, I, G, Q, S eller L, A62 er A eller S og L63 er L eller V, og en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.ll hvor Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er D, N eller G og Y110 erY, K, S, R eller T. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyre-sekvens som vist i SEKV. ID. NR.ll hvor Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D, N, T eller G og Y110 er hvilken som helst aminosyre. I andre utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.ll hvor G98 er G, S, A, C, V, N, D eller T, G99 er G, S, A, C, V, N, D eller T, Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D, N, T eller G og Y110 er hvilken som helst aminosyre. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet videre et lettkjede variabelt område fra et antistoff.

I et annet aspekt omfatter antistoffene en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.12, hvor S26 er S eller F, D28 er D, S, A eller Y og H32 er H, N eller Q, en aminosyre-sekvens som vist i SEKV. ID. NR. 13 hvor 151 er I, T, V eller A og S56 er S eller T og en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.14 hvor S91 er S eller E, K92 er K, H, R eller S og Y96 erY eller R. I noen utførelsesformer omfatter polypeptider en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.14 hvor S91 er S eller E, K92 er hvilken som helst aminosyre, T93 er hvilken som helst aminosyre og Y96 er Y eller R. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet videre et tungkjede variabelt område fra et antistoff.

I et annet aspekt omfatter antistoffene (a) en aminosyresekvens som vist i SEKV.

ID. NR.9 hvor 134 er S, L, V, A eller I og N35 er N, T eller S, en aminosyresekvens som vist

i SEKV. ID. NR. 10 hvor M50 er M, I, G, Q, S eller L, A62 er A eller S og L63 er L eller V og en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.ll hvorYlOO erY, L eller R, Y101 erY eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er D, N eller G Y110 er Y, K, S, R eller T, og (b)

en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.12 hvor S26 er S eller F, D28 er D, S, A eller Y og H32 er H, N eller Q, en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.13 hvor 151 er I, T, V eller A og S56 er S eller T, og en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.14 hvor S91 er S eller E, K92 er K, H, R eller S og Y96 er Y eller R. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.14 hvor S91 er S eller E, K92 er hvilken som helst aminosyre, T93 er hvilken som helst aminosyre og Y96 er Y eller R. I

noen utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.ll hvor Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D, N, T eller G og Yl 10 er hvilken som helst aminosyre. I andre utførelsesformer omfatter

polypeptider en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID. NR.ll hvor G98 er G, S, A, C, V, N, D eller T, G99 er G, S, A, C, V, N, D eller T, Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er S, A, C, G, D, N, T eller G og Y110 er hvilken som helst aminosyre. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet et lettkjede variabelt område fra et antistoff.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et tungkjede variabelt område som omfatter: (a) et CDRl-område fra SEKV. ID. NR.9 hvor 134 er S, L, V, A eller I, og N35 er substituert med N, T eller S, (b) et CDR2-område fra SEKV. ID. NR. 10 hvor M50 er I, G, Q, S eller L, A62 er A eller S og L63 er L eller V, og (c) et CDR3-område fra SEKV. ID. NR.ll hvor Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er D, N eller G og Yl 10 er Y, K, S, R eller T, hvor antistoffet bindes til NGF.

I et annet aspekt omfatter antistoffene et lettkjede variabelt område som omfatter: (a) et CDRl-område fra SEKV. ID. NR.12 hvor S26 er S eler F, D28 er D, S, A eller Y og H32 er H, N eller Q, (b) et CDR2-område fra SEKV. ID. NR.13 hvor 151 er I, T, V aller A og S56 er S eller T og (c) et CDR3-område fra SEKV. ID. NR.14 hvor K92 er K, H, R eller S og Y96 er Y eller R, hvor antistoffet bindes til NGF.

I et annet aspekt omfatter antistoffene: (a) et tungkjede variabelt område som omfatter: (i) et CDRl-område fra SEKV. ID. NR.9 hvor 134 er subtituert mee S, L, V, A eller I og N35 er substituert med N, T eller S, (ii) et CDR2-område fra SEKV. ID. NR. 10 hvor M50 er I, G, Q, S eller L, A62 er A eller S og L63 er I eller V, og (iii) et CDR3-område fra SEKV. ID. NR.ll hvor Y100 er Y, L eller R, Y101 er Y eller W, G103 er G, A eller S, T104 er T eller S, S105 er S, A eller T, Y106 er Y, R, T eller M, Y107 er Y eller F, F108 er F eller W, D109 er D, N eller G og Y110 er K, K, S, R eller T, og (b) et lettkjede variabelt område som omfatter: (i) et CDRl-område fra SEKV. ID. NR.12 hvor S26 er S eller F, D28 er D, S, A eller Y og H32 er H, N eller Q, (ii) et CDR2-område fra SEKV. ID. NR.13 hvor 151 er I, T, V eller A og S56 er S eller T, og (iii) et CDR3-område fra SEKV. ID. NR.14 hvor S91 er S eller E, K92 er K, H eller S og Y96 er Y eller R, hvor antistoffet bindes til NGF.

Dersom ikke annet er angitt er valg (f. eks. substitusjon) av en aminosyre i én posisjon valgt uavhengig av valg av aminosyre i hvilken som helst annen posisjon.

I noen utførelsesformer bindes antistoffene til NGF (slik som humant NGF). I noen utførelsesformer omfatter antistoffene hvilke som helst av CDR-konfigurasjonene (innbefattet kombinasjoner, variasjoner osv.) beskrevet her.

Som det fremgår av beskrivelsen her er nummereringen av det variable området som anvendes her sekvensiell nummerering. En fagperson vil være klar over at en rekke antistoff nummereringssystemer foreligger (for eksempel Kabat- og Chothia-nummerering) og vite hvordan sekvensiell nummerering kan overføres til ethvert annet nummererings-system, for eksempel Kabat-nummerering eller Chothia-nummerering.

I et annet aspekt omfatter antistoffet en aminosyresekvens (slik som en CDR3-sekvens) som er valgt fra SEKV. ID. NR.46 eller 50. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter antistoffet én eller flere av aminosyresekvensene som er vist i SEKV. ID. NR.3, 4, 5, 6, 7 og 8. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter antistoffet én eller flere av aminosyresekvensene som er vist i SEKV. ID. NR.9, 10, 11, 12, 13, 14 og 15.

I et annet aspekt omfatter antistoffet en aminosyresekvens (slik som et CDR-område, for eksempel et CDRH1- og/eller CDRH2-område) valgt blant (a) SEKV. ID. NR.28 og/eller 29, (b) SEKV. ID. NR.30 og/eller 31, (c) SEKV. ID. NR.32 og/eller 33, (d) SEKV. ID. NR.34 og/eller 35, (e) SEKV. ID. NR.36 og/eller 37, (f) SEKV. ID. NR.38 og/eller 39 og (g) SEKV. ID. NR.40 og 41. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyresekvens (slik som et CDR Hl-område) valgt blant SEKV. ID. NR.28, 30, 32, 34, 36, 38 og 40). I noen utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyresekvens (slik som et CDR H2-område) valgt blant SEKV. ID. NR.29, 31, 33, 35, 37, 39 og 41. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter antistoffet én eller flere av aminosyresekvensene som er vist i SEKV. ID. NR.3, 4, 5, 6, 7 og 8. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter antistoffet én eller flere av aminosyre-sekvensene som er vist i SEKV. ID. NR.9, 10, 11, 12, 13, 14 og 15.

I et annet aspekt omfatter antistoffet en aminosyresekvens (slik som et CDR-område, for eksempel et CDR LI- og/eller CDR L2-område), valgt blant (a) SEKV. ID. NR. 18 og/eller 19, (b) SEKV. ID. NR.20 og/eller 21 og (c) SEKV. ID. NR.22 og/eller 23. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyresekvens (slik som et CDR Ll-område) valgt blant SEKV. ID. NR. 18, 20 og 22. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyresekvens (slik som et CDR L2-område) valgt blant SEKV. ID. NR. 19, 21 og 23. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter antistoffet én eller flere av aminosyre-sekvensene som er vist i SEKV. ID. NR.3, 4, 5, 6, 7 og 8. I ytterligere andre utførelses-former omfatter antistoffet én eller flere av aminosyresekvensene som er vist i SEKV. ID. NR.9, 10, 11, 12, 13, 14 og 15.

I et annet aspekt omfatter antistoffet en aminosyresekvens, (slik som et CDR-område, slik som et CDR L3- og/eller CDR H3-område) valgt blant (a) SEKV. ID. NR.51 og/eller 52, (b) SEKV. ID. NR.55 og/eller 56, (c) SEKV. ID. NR.57 og/eller 58, (d) SEKV. ID. NR.59 og/eller 60, (e) SEKV. ID. NR.61 og/eller 62, og (f) SEKV. ID. NR.63 og/eller 64. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyresekvens (slik som et CDR L3-område) valgt blant SEKV. ID. NR.51, 55, 57, 59, 61 og 63. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyresekvens (slik som et CDR H3-område) valgt blant SEKV. ID. NR.52, 56, 58, 60, 62 og 64. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter antistoffet en aminosyresekvens som vist i én eller flere av SEKV. ID. NR.18, 19, 30 og 31. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter antistoffet én eller flere av aminosyre-sekvensene som er vist i SEKV. ID. NR.3, 4, 5, 6, 7 og 8. I ytterligere andre utførelses-former omfatter antistoffet én eller flere av aminosyresekvensene som er vist i SEKV. ID. NR.9, 10, 11, 12, 13, 14 og 15.

I et annet aspekt omfatter antistoffet én eller flere av en aminosyresekvens (slik som et CDR-område) som er vist i SEKV. ID. NR.61, 63, 18, 19, 30 og 31.

I ett aspekt binder anti-NGF antagonist antistoffet (slik som humant NGF) med høy affinitet. I noen utførelsesformer er høy affinitet (a) binding av NGF med en KDsom er lavere enn omtrent 2 nm (for eksempel hvilken som helst av omtrent 1 nm, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM eller lavere) og/eller Koffsom er lavere ann omtrent 6 x IO"<5>S"<1>, og/eller (b) inhiberer (reduserer og/eller blokkerer) humant NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 (i nærvær av omtrent 15 pM NGF) på omtrent hvilken som helst av 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM eller lavere, og/eller (c) inhiberer (reduserer og/eller blokkerer) humant NGF-avhengig overlevelse av de trigeminale muse-neuronene E13.5 med en IC50 ( i nærvær av en omtrent 1,5 pM NGF) på omtrent hvilken som helst av 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM eller lavere og/eller (d) inhiberer (reduserer og/eller blokkerer) rotte-NGF-avhengig overlevelse av de trigeminale muse-neuronene E13.5 med en IC50 (i nærvær av omtrent 15 pM NGF) på omtrent hvilken som helst av 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM eller lavere og/eller (e) inhiberer (reduserer og/eller blokkerer) rotte-NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 (i nærvær av omtrent 1,5 pM NGF) på omtrent hvilken som helst av 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM eller lavere og/eller (f) og/eller binder NGF med høyere affinitet enn TrkA-reseptoren gjør.

I et annet aspekt vil antistoffene (a) binde NGF (slik som humant NGF) med en KDpå mindre enn omtrent 2 nM (for eksempel hvilken som helst av omtrent 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM eller lavere) og/eller en K0ffsom er lavere enn omtrent 6 x IO"<5>S"<1>), og/eller (b) inhibere humant NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 (i nærvær av omtrent 15 pM NGF) på omtrent hvilken som helst av 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM eller lavere, og/eller (c) inhibere humant NGF-avhengig over-levelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 (i nærvær av omtrent 1,5 pM NGF) på omtrent hvilken som helst av 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM eller lavere, og/eller binder NGF med høyere affinitet enn TrkA-reseptoren gjør. I noen utførelsesformer vil antistoffene (a) binde NGF med en Kdsom er lavere enn omtrent 2 nM, og/eller (b) inhibere humant NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 på omtrent 100 pM eller lavere, hvor IC50 er målt i nærvær av omtrent 15 pM NGF og/eller (c) inhibere humant NGF-avhengig overlevelse av de trigeminale muse-neuronene E13.5 med en IC50 på omtrent 10 pM eller lavere, hvor IC50 er målt i nærvær av omtrent 1,5 pM NGF, hvor IC50 er målt i nærvær av omtrent 15 pM NGF. I noen utførelsesformer vil antistoffene (a) binde NGF med en Kdsom er lavere enn omtrent 100 pM, og/eller (b) inhibere humant NGF-avhengig overlevelse av de trigeminale muse-neuronene E13.5 med en IC50 på omtrent 20 pM eller lavere, hvor IC50 er målt i nærvær av omtrent 15 pM NGF og/eller (c) inhibere humant NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 på omtrent 2 pM eller lavere, hvor IC50 er målt i nærvær av omtrent 1,5 pM NGF.

Som det fremgår av beskrivelsen her er polypeptid-utførelsesformer som består av en aminosyresekvens som er identisk med aminosyresekvensen til det monoklonale muse-antistoff 911 spesifikt ekskludert fra oppfinnelsen. De utvidede CDR-sekvensene i Mab 911 er vist i Figurene IA og IB og i SEKV. ID. NR.9-14.

I noen utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen hvilket som helst av de ovenfor beskrevne antistoffer, hvor antistoff videre er isolert. I noen utførelsesformer er antistoffet i det vesentlige rent. I ytterligere andre utførelsesformer er antistoffet affinitetsmodnet. I andre utførelsesformer er antistoffet et antagonistisk antistoff. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet humane rammeverks sekvenser. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter antistoffet én eller flere ikke-humane rammeverkts aminosyrerester. I noen utførelsesformer bindes antistoffet til NGF (slik som humant NGF) med en KDpå 2 nM eller lavere. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet én eller flere (slik som 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 eller flere) humane aminosyresubstitusjoner relativt til en ikke-human aminosyre-sekvens (slik som en sekvens for et variabelt område, slik som en CDR-sekvens, slik som en rammeverks-sekvens). I noen utførelsesformer omfatter antistoffet minst 1, minst 2 eller flere, slik som minst 3, 4, 5, 6 eller flere aminosyresubstitusjoner relativt til aminosyre-sekvensen til et utgangspolypeptid (slik som en aminosyresekvens fra antistoff 911, slik som én eller flere av SEKV. ID. NR.9-14). I noen utførelsesformer har antistoffets bindingsaffinitet blitt endret (i noen utførelsesformer forhøyet) sammenlignet med affiniteten til et utgangsantistoff (slik som Mab 911). I ytterligere andre utførelsesformer er antistoffets bind i ngsaffi nitet lavere enn TrkA-reseptorens bindingsaffinitet for NGF (slik som humant NGF). I noen utførelsesformer er antistoffene humane antistoffer. I andre utførelsesformer er antistoffene humaniserte antistoffer. I ytterligere andre utførelsesformer er antistoffene monoklonale antistoffer. I noen utførelsesformer er antistoffet et affinitetsmodnet antistoff.

Beskrivelsen omtaler polynukleotider (innbefattet isolerte polynukleotider) som omfatter polynukleotider som koder for hvilken som helst av utførelsesformene ovenfor.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen et isolert polynukleotid som omfatter et polynukleotid som koder for et fragment eller et område fra antistoff E3 (her også betegnet "E3"). I én utførelsesform er fragmentet en lettkjede fra antistoff E3, som vist i Figur IB. I en annen utførelsesform er fragmentet en tungkjede fra antistoff E3, som vist i Figur IA. I ytterligere en annen utførelsesform inneholder fragmentet ett eller flere variable områder fra en lettkjede og/eller en tungkjede fra antistoff E3. I ytterligere andre utførelsesformer inneholder fragmentet ett eller flere komplementaritetsbestemmende områder (CDR) fra en lettkjede og/eller en tungkjede fra antistoff E3, som vist i Figurene IA og IB.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen et isolert polynukleotid som omfatter et polynukleotid som koder for antistoff E3. I noen utførelsesformer omfatter polynukleotidet ett av eller begge polynukleotider som er vist i figurene 2 og 3.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen et isolert polynukleotid som koder for en E3-lettkjede med ATCC depotnummer PTA-4893 eller PTA-4894. I et annet aspekt omtaler beskrivelsen et isolert polynukleotid som koder for en E3-tungkjede med ATCC depotnummer PTA-4895. I ytterligere et aspekt omtaler beskrivelsen et isolert polynukleotid som omfatter (a) et variabelt område som kodes i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4893 eller PTA-4894, og (b) et variabelt område som kodes i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4895. I et annet aspekt omtaler beskrivelsen et isolert polynukleotid som omfatter (a) én eller flere CDR som kodes i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4893 eller PTA-4894, og/eller (b) én eller flere CDR som kodes i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4895.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen polynukleotider som koder for hvilket som helst av antistoffene (innbefattet antistoff-fragmentene) eller polypeptidene som beskrevet her.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen vektorer (innbefattet ekspresjonsvektorer og kloningsvektorer) og vertsceller som omfatter hvilket som helst av polynukleotidene som beskrevet her.

Som det vil fremgå av beskrivelsen her er polynukleotidutførelsesformer som består av en polynukleotidsekvens som er identisk med en polynukleotidsekvens for det monoklonale museantistoff 911 spesifikt ekskludert fra oppfinnelsen. De utvidede CDR-sekvenser fra Mab 911 er vist i Figurene IA og IB og SEKV. ID. NR.9-14.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen en vertscelle som omfatter et polynukleotid som koder for E3-lettkjede og et polynukleotid som koder for E3-tungkjede, hvor polynukleotidet eller polynukleotidene som koder for E3-lettkjede har ATCC depotnummer PTA 4893 og/eller PTA-4894 og polynukleotidet som koder for E3-tungkjede har ATCC depotnummer PTA-4895. I noen utførelsesformer omfatter vertscellen polynukleotid som omfatter (a) et variabelt område som kodet i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4893 eller PTA-4894, og/eller (b) et variabelt område som kodes i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4895. I noen utførelsesformer omfatter vertscellen et polynukleotid som koder for (a) én eller flere CDR som kodes i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4893 eller PTA-4894, og/eller (b) én eller flere CDR som kodes i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4895. I noen utførelsesformer er vertscellen en pattedyrscelle.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen et kompleks av NGF bundet til antistoff E3. I et annet aspekt er komplekset isolert. I et annet aspekt er komplekset i det vesentlige rent.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen et kompleks av NGF bundet til hvilket som helst av antistoffene eller polypeptidene som beskrevet her. I et annet aspekt er komplekset isolert. I et annet aspekt er komplekset i det vesentlige rent.

I et annet aspekt er oppfinnelsen et farmasøytisk preparat som omfatter hvilket som helst antistoff, slik som antistoff E3 eller polynukleotidene som beskrevet her, slik som farmasøytiske preparater som omfatter antistoff E3 eller et antistoff som omfatter et fragment av antistoff E3 og en farmasøytisk aksepterbar eksipient for anvendelse ved behandling av smerte forbundet med osteoartritt.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen en fremgangsmåte for fremstilling av antistoff E3 som omfatter fremstilling av en vertscelle som omfatter en ekspresjonsvektor som koder for antistoff E3, dyrking av vertscellen eller dens avkom under betingelser som tillater dannelse av antistoff E3 og rensing av antistoff E3. I noen utførelsesformer omfatter ekspresjonsvektoren en eller begge av polynukleotidsekvensene som er vist i Figurene 2 og 3.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen en fremgangsmåte for fremstilling av antistoff E3 som omfatter ekspresjon av et polynukleotid som koder for E3-lettkjede og et polynukleotid som koder for E3-tungkjede i en egnet celle, hvor polynukleotidet som koder for E3-lettkjede har ATCC depotnummer PTA-4893 og/eller PTA 4894 og polynukleotidet som koder for E3-tungkjede har ATCC depotnummer PTA-4895, generelt fulgt av gjenvinning og/eller isolering av antistoffet.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen fremgangsmåter for fremstilling av hvilket som helst av polypeptidene (slik som antistoffene) som beskrevet her ved å uttrykke ett eller flere polynukleotider som koder for antistoffet (som kan uttrykkes separat som en enkelt lettkjede eller tungkjede, eller hvor både en lettkjede og en tungkjede kan uttrykkes fra én vektor) i en egnet celle, generelt fulgt av gjenvinning og/eller isolering av antistoffet eller polypeptidene av interesse.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen en fremgangsmåte for antagonisering av biologisk aktivitet forbundet med NGF (slik som humant NGF) ved anvendelse av hvilket som helst av polypeptidene (innbefattet antistoffer, slik som antistoff E3) som beskrevet her. I én utførelsesform omfatter fremgangsmåten å sette human nervevekstfaktor i forbindelse med hvilket som helst av polypeptidene (innbefattet antistoff E3) som beskrevet her, hvorved NGF-aktivitet (slik som human nervevekstfaktor aktivitet) antagoniseres, reduseres, blokkeres eller undertrykkes.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen en fremgangsmåte for påvisning av NGF ved anvendelse av hvilket som helst av polypeptidene (innbefattet antistoffer, slik som antistoff E3) som beskrevet her. Nærvær av NGF påvises ved å påvise et kompleks mellom NGF og hvilket som helst av polypeptidene som beskrevet her (slik som antistoff E3). Begrepet "påvisning" som anvendt her omfatter kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning (måling av nivåer), med eller uten referanse til en kontroll.

I et annet aspekt er oppfinnelsen en effektiv mengde av et preparat som omfatter antistoff E3 eller hvilket som helst antistoff-utførelsesform som beskrevet herfor anvendelse ved behandling av smerte forbundet med osteoartritt..

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen en fremgangsmåte for forebyggelse eller behandling av smerte forbundet med reumatoid artritt i et individ ved å tilføre en effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff til individet. Det har i samsvar med beskrivelsen blitt vist at et antagonistisk anti-NGF-antistoff kan inhibere eller blokkere smerten som er forbundet med reumatoid artritt. I noen utførelsesformer lindres smerten i løpet av omtrent 24 timer etter administrering av det antagonistiske anti-NGF-antistoff. I noen utførelsesformer lindres smerten i løpet av omtrent 4 dager etter administrering av det antagonistiske anti-NGF-antistoff. I noen utførelsesformer lindres smerten før man kan observere eller i fravær av en indikasjon på en forbedring av betennelsestilstanden i individet.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen fremgangsmåter for reduksjon av forekomsten av smerte ved reumatoid artritt, lindring av smerte forbundet med reumatoid artritt, undertrykkelse av smerte forbundet med reumatoid artritt, døyving av smerte forbundet med reumatoid artritt og/eller forsinkelse av fremkomst, utvikling eller progresjon av smerte forbundet med reumatoid artritt i et individ, hvor fremgangsmåten omfatter administrering av en effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff til individet.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen forebyggelse eller behandling av smerte forbundet med osteoartritt i et individ ved administrering av en effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff til individet.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen fremgangsmåter for behandling av inflammatorisk kakeksi (vekttap) forbundet med reumatoid artritt i et individ som omfatter administrering av en effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen reduksjon av forekomsten av smerte ved osteoartritt, lindring av smerte forbundet med osteoartritt, undertrykkelse av smerte forbundet med osteoartritt, døyving av smerte forbundet med osteoartritt og/eller forsinkelse av fremkomst, utvikling eller progresjon av smerte forbundet med osteoartritt i et individ ved administrering av en effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff til individet.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen sett og preparater som omfatter én eller flere av sammensetningene som beskrevet her. Disse settene, som generelt foreligger i egnet innpakning og er forsynt med egnede instruksjoner, er anvendbare for hvilke som helst av fremgangsmåtene som beskrevet her.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en hvilken som helst av de sammensetninger og sett som beskrevet her, enten i i forbindelse med anvendelse som medikament og/eller anvendelse for fremstilling av et medikament for behandling av smerte ved osteoartritt i et individ.

Kort beskrivelse av figurene

Figur IA viser aminosyresekvensen til tungkjedens variable område i antistoff E3 (merket "6" og "5 + affinitetsmodnet H3"). Chothia-CDR og Kabat-CDR er vist ved under-streket tekst, henholdsvis uthevet tekst i kursiv. Figur IA viser også sammenstillingen mellom følgende tungkjede variable område-aminosyresekvenser: (1) CDRs Hl (SEKV. ID. NR.9), H2 (SEKV. ID. NR.10) og H3 (SEKV. ID. NR.ll) av muse-antistoff 911, (2) human kimcellelinje-akseptorsekvens ved VH4-59 (merket "VH4-59" eller "2") (SEKV. ID. NR.69); (3) akseptorsekvensene podet med det forlengede CDR fra museantistoff 911 (merket "CDR-podet" eller "3") (SEKV. ID. NR.70); (4) akseptorsekvensene med podede CDR, omfattende V71K-substitusjonen (merket "3 + en rammeverks-mutasjon" eller "4") (SEKV.

ID. NR.71); (5) klonen som inneholder affinitetsmodnede CDR Hl og H2 (merket " 5" eller "4 + affinitetsmodnet Hl, H2") (SEKV. ID. NR. 72) og antistoff E3 (som beskrevet ovenfor)

(SEKV. ID. NR.l).

Figur IB viser aminosyresekvensen til det lettkjedens variable område i antistoff E3 (merket " 5" eller "4 + affinitetsmodnet L3"). Chothia-CDR og Kabat-CDR er vist ved under-streket tekst, henholdsvis uthevet tekst i kursiv. Figur IB viser også sammenstillingen med følgende lettkjede variable område-aminosyresekvenser: (1) CDRs LI (SEKV. ID. NR.12),

L2 (SEKV. ID. NR.13) og L3 (SEKV. ID. NR.14) av muse-antistoff 911; (2) human kimcellelinje-akseptorsekvens 08 (merket "08" eller "2") (SEKV. ID. NR.73); (3) akseptorsekvensene med podete forlengede CDR fra muse-antistoff 911 (merket "CDR-podet" eller "3") (SEKV. ID. NR.74); (4) akseptorsekvensene med podete CDR (merket "3 + affinitets modnet LI, L2" eller "4") (SEKV. ID. NR.75); (5) klonen som inneholder affinitetsmodnede CDR LI og L2 (merket " 5" eller "4 + affinintetsmodnet L3"); og antistoff E3 (som beskrevet ovenfor) (SEKV. ID. NR.2). Figur 2 viser et polynukleotid som omfatter en polynukleotidsekvens (SEKV. ID. NR.76) som koder for tungkjedens variable område i antistoff E3. Figur 3 viser et polynukleotid som omfatter en polynukleotidsekvens (SEKV. ID. NR.77) som koder for lettkjedens variable område i antistoff E3. Figur 4 er en kurve som viser NGF-avhengig overlevelse av E13.5-neuroner i nærvær av varierende konsentrasjoner av NGF fra menneske og rotte. X-aksen tilsvarer NGF-konsentrasjonen (ng/ml), mens Y-aksen tilsvarer antall neuroner. Figur 5 er en kurve som sammenligner NGF-blokkerende virkning av forskjellige Fab i nærvær av enten 0,04 ng/ml humant NGF (omtrent 1,5 pM, vist i nedre felt) eller 0,4 ng/ml humant NGF (omtrent 15 pM, vist i øvre felt). Overlevelsen av trigeminus museneuronene E13.5 i forskjellige konsentrasjoner av Fab E3, muse-Fab 911, Fab H19-L129 og Fab 8L2-6D5 ble anslått. IC50 (i pM) ble beregnet for hvert Fab for hver NGF-konsentrasjon og er vist i Tabell 9. Fab E3 blokkerte kraftig humant NGF-avhengig over-levelse av trigeminus neuroner, med en IC50 på omtrent 21 pM i nærvær av 15 pM humant NGF og en IC50 på omtrent 1,2 pM i nærvær av 1,5 pM humant NGF. Fab 3C og Fab H19-L129 blokkerte også kraftig humant NGF-avhengig overlevelse av trigeminus neuroner. I begge felt tilsvarerer X-aksen antistoffkonsentrasjonen (nM), mens Y-aksen tilsvarer antall neuroner. 1,5 pM NGF ligger rundt IC50, mens 15 pM representerer en mettende konsentrasjon av NGF. Figur 6 er en kurve som sammenligner den NGF-blokkerende evne til forskjellige Fab i nærvær av enten 0,04 ng/ml rotte-NGF (omtrent 1,5 pM, vist i nedre felt) eller 0,4 ng/ml rotte-NGF (omtrent 15 pM, vist i øvre felt). Overlevelse av de trigeminale muse-neuronene E13.5 i forskjellige konsentrasjoner av Fab E3, muse-Fab 911, Fab H19-L129 og 8L2-6D5 ble anslått som beskrevet ovenfor. IC50 (i pM) ble beregnet for hvert Fab for hver NGF-konsentrasjon og er vist i Tabell 9. Fab E3 blokkerte kraftig humant NGF-avhengig overlevelse av trigeminus neuroner, med en IC50 på omtrent 31,6 pM i nærvær av 15 pM rotte-NGF og en IC50 på omtrent 1,3 pM i nærvær av 1,5 pM rotte-NGF. Fab 3C og Fab H19-L129 blokkerte også kraftig rotte-NGF-avhengig overlevelse av trigeminus neuroner. 1,5 pM NGF ligger rundt IC50, mens 15 pM representerer en mettende konsentrasjon av NGF. I begge felt tilsvarer X-aksen antistoffkonsentrasjonen (nM), mens Y-aksen tilsvarer antall neuroner. Figur 7 er en kurve som viser hvilesmerte vurdert 24 timer etter kirurgisk inngrep og viser at behandling med 0,02 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,6 mg/kg eller 1 mg/kg anti-NGF-antistoff E3 reduserte smerten. "<*>" angir en statistisk signifikant forskjell (p<0,5) sammen-lignet med den negative kontroll. Figur 8 er en kurve som viser hvilesmerte anslått 24 timer etter kirurgisk inngrep og viser at behandling med 0,5 mg/kg anti-NGF-antistoff E3 i signifikant grad (p<0,005) reduserte hvilesmerten ved injeksjon to timer etter det kirurgiske inngrep. Figur 9 er en kurve som viser resultatene fra BIAcore-analyse av bindingsaffiniteten av humant NGF ovenfor museantistoff 911 (Fab). Museantistoff 911 bandt NGF med en KDpå 3,7 nM, koffpå 8,4 x 10"5s 1 og kon på 2,2 x 104Ms 1. Figur 10 er en kurve som viser resultatene av BIAcore-analyse av bindings-affiniteten av humant NGF ovenfor antistoff E3 (Fab) (betegnet "3E Fab"). E3 bandt humant NGF med en KDpå omtrent 0,07 nM (og med en kon på omtrent 6,0 x 10<5>M_<1>s_1ogk<off>på omtrent 4,2 x lO V1). Figur 11 er en kurve som viser at antistoff E3 blokkerer interaksjonen mellom NGF og reseptorene, trkA og p75, anslått som prosent binding påvist mellom NGF og trkA (vist med sorte sirkler) og NGF og p75 (vist som åpne firkanter). X-aksen tilsvarer konsentrasjonen av antistoff 3E (Fab) mens Y-aksen tilsvarer NGF-binding (prosent av maksimal RU). Økende konsentrasjoner av Fab E3 blokkerte interaksjonen mellom NGF og både p75 og trkA, som vist ved redusert signal (målt i RU). Når antistoff E3 (Fab)-konsentrasjonen var lik NGF-konsentrasjonen kunne ingen NGF-binding observeres (som vist ved et signal på 0). Figur 12 er en kurve som viser en humant NGF-blokkerende evne til intakt antistoff E3 og Fab E3. Overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 i nærvær av humant NGF og forskjellige konsentrasjoner av Fab E3 og antistoff E3 ble anslått. X-aksen tilsvarer NGF-bindingsseter (nM) mens Y-aksen tilsvarer det normaliserte antall trigeminale (TG) neuroner. Intakt antistoff E3 og Fab E3 viste tilsvarende inhiberingsnivåer av NGF-avhengig overlevelse av trigeminus neuroner når konsentrasjonen av intakte antistoff og Fab ble normalisert til antall NGF-bindingsseter (Fab har et bindingssete, mens intakt antistoff har to bindingsseter). Figur 13 er en kurve som viser evnen til forskjellige konsentrasjoner (20, 4, 0,8, 0,16, 0, 032, 0,00064, 0,00128 og 0,0 nM) av antistoff E3 (fylte trekanter, betegnet "3E"), antistoff 911 (fylte sirkler) og et trkA-reseptorimmunadhesin (skraverte firkanter, betegnet "trkA-Fc") til å inhibere NGF-avhengig overlevelse av trigeminus neuronene i E13.5 i nærvær av 0,4 ng/ml humant NGF (mettende betingelser). X-aksen tilsvarer antistoff konsentrasjonen (nM), mens Y-aksen tilsvarer antall neuroner. Disse resultatene viste at antistoff E3 blokkerte NGF signifikant bedre enn både det monoklonale anti-NGF-antistoff 911 og trkA-immunadhesinet. Figur 14 er en kurve som viser at det antagonistiske anti-NGF-antistoff E3 (betegnet "3E i figuren") eller Fab 911 ikke inhiberte neuronal overlevelse fremmet av NT3, NT4/5 og MSP, selv ved antistoffkonsentrasjoner på opp til 200 nM. Resultatene representerer gjennomsnittlig prosent overlevelse etter 48 timer i kultur (+. middelverdiens standardfeil, n=3 for hvert datapunkt), sammenlignet med overlevelsen observert i den positive kontroll for hvert eksperiment (100 % overlevelse av trigeminus neuroner dyrket i nærvær av en mettende NGF-konsentrasjon). Forskjellige konsentrasjoner (20 nM, 2 nM eller 0,2 nM) av E3 Fab (betegnet "3E i figuren") og museantistoff 911 Fab ble anvendt i nærvær av intet tilsatt neurotrofin (betegnet "kontroll"), 400 pM NGF (betegnet "NGF-400 pM), 10 nM NT3 (betegnet "NT3-10 nM) eller 600 pM MSP (betegnet "MSP-600 pM"). Figur 15 er en kurve som viser at det antagonistiske anti-NGF-antistoff E3 (Fab eller intakt antistoff) (betegnet "3E i figuren") eller museantistoff 911 (Fab eller intakt antistoff) ikke inhiberte neuronal overlevelse fremmet av NT3, NT4/5 og MSP, selv ved antistoffkonsentrasjoner på opp til 200 nM. Forskjellige konsentrasjoner (200 nM og 80 nM) av E3 Fab og intakt antistoff og museantistoff 911 intakt antistoff og Fab ble anvendt uten tilsatte neurotrofiner (betegnet "ingen faktor") og i nærvær av 400 pM NGF (betegnet "NGF-400 pM), 10 nM NT3 (betegnet "NT3-10 nM") eller 600 pM MSP (betegnet "MSP-600 mP"). Figur 16 er en kurve som viser det antagonistiske anti-NGF-antistoff E3 eller Fab E3 som ikke inhiberte overlevelse av de nodale neuronene E17 fremmet av BDNF, NT 4/5 eller LIF. Anti-NGF-antagonistantistoff 911 fra mus ble også testet og lignende resultater ble observert. Forskjellige konsentrasjoner (200 nM eller 80 nM) av fullt antistoff E# (betegnet "3E i figuren"), Fab E3, fullt antistoff 911 eller Fab 911 ble analysert uten tilsatte neurotrofiner (betegnet "ingen faktorer"), 400 pM BDNF (betegnet "BDNF-400 pM), 400 pM NT 4/5 (betegnet "NT 4/5-400 pM") eller 2,5 nM LIF (betegnet "LIF-2,5 nM"). Figur 17 er en kurve som viser at det antagonistiske anti-NGF-antistoff E3 eller Fab E3 som ikke inhiberte overlevelse av de nodale neuronene E17 fremmet av BDNF, NT4/5 eller LIF. Forskjellige konsentrasjoner (200 nM, 20 nM, 2 nM) av Fab E3 (betegnet "3E i figuren") eller Fab 911 ble analysert uten tilsatte neurotrofiner (beregnet "kontroll") og i nærvær av 400 pM BDNF (betegnet "BDNF-400 pM"), 400 pM NT4/5 (betegnet ("NT4/5-400 pM") eller 2,5 nM LIF (beregnet "LIF-2,5 nM"). Figur 18 er en kurve som viser nociseptiv respons hos artrittiske rotter (modell for reumatoid artritt) etter administrering av anti-NGF-antistoffer (E3 og 911) på D14 og D19. E3 (1 mg/kg i.v. på dag 14 og dag 19), 911 (10 mg/kg i.v. på dag 14 og dag 19) eller indo (indometacin 3 mg/kg p.o. daglig over 10 dager) ble tilført til artrittiske mus. Vokaliserings intensitetsverdiene er uttrykt i mV som middelverdi±s.e.m. Figur 19 er en kurve som viser virkninger av anti-NGF-antistoffer på kroppsvekt ved artritt hos rotter (modell for reumatoid artritt) etter administrering av anti-NGF-antistoffer på D14 og D19. E3 (1 mg/kg i.v. på dag 14 og dag 19), 911 (10 mg/kg i.v. på dag 14 og dag 19) eller indo (indometacin 3 mg/kg p.o. daglig over 10 dager) ble tilført til artrittiske mus. Kroppsvekten er uttrykt i gram som middelverdi +. s.e.m. Figur 20 er en kurve som viser nociseptiv respons hos artrittiske rotter (modell for reumatoid artritt) etter administrering av forskjellige doser av anti-NGF-antistoff E3 (0,003

mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg og 5 mg/kg) på D14 og D18.

Vokaliseringsintensitetsverdiene er uttrykt i mV som middelverdi + s.e.m.

Figur 21 er en kurve som viser virkninger av anti-NGF-antistoff E3 på kroppsvekt som prosent av kroppsvekten på dag 14 (normalisert til Dag 14) for artrittiske rotter (modell for reumatoid artritt) etter administrering av forskjellige doser av anti-NGF-antistoff E3 (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg og 5 mg/kg) på D14 og D18. Figur 22 er en kurve som viser virkninger av anti-NGF-antistoff E3 på vekttap hos artrittiske rotter (modell for reumatoid artritt) etter administrering av forskjellige doser av anti-NGF-antistoff E3 (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg og 5 mg/kg) på D14 og D18. Kroppsvekten ble normalisert til Dag 0. Figur 23 viser aminosyresekvensen til E3-tungkjedens variable område (Figur 23A) og lettkjedens variable område (Figur 23B), nummerert ved anvendelse av sekvensiell nummerering, Kabat-nummerering og Chothia-nummerering.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den her beskrevne oppfinnelse tilveiebringer antagonistiske anti-NGF-antistoffer for anvendelse ved behandling av smerter ved osteoartritt. Antistoffene kan bindes til NGF (slik som humant NGF) med høy affinitet. Oppfinnelsen tilveiebringer videre antistoffer avledet fra E3 som bindes til NGF, og beskriver fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av disse antistoffene. I noen utførelsesformer er antistoffet et humanisert antistoff, E3, som bindes til nervevekstfaktor ("NGF"). Beskrivelsen omtaler også E3-polypeptider som bindes til NGF og polynukleotider som koder for E3-antistoff og/eller polypeptid.

Den her beskrevne oppfinnelse tilveiebringer også behandling av smerte forbundet med osteoartritt i et individ ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff.

Beskrivelsen omtaler også fremgangsmåter for forebyggelse og/eller behandling av smerte forbundet med reumatoid artritt i et individ ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff.

Beskrivelsen omtaler også fremgangsmåter for justering av affiniteten til et antistoff og fremgangsmåter for karakterisering av et CDR-område.

Generelle teknikker

Utførelsesformn av foreliggende oppfinnelse vil dersom ikke annet er angitt benytte konvensjonelle teknikker innen molekylær biologi (innbefattet rekombinante teknikker), mikrobiologi, cellebiologi, biokjemi og immunologi som ligger innenfor teknikkens stand. Slike teknikker er fult ut forklart i litteraturen, slik som i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, red., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, red., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, red., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather og P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths og D.G. Newell, red., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir og CC. Blackwell, red.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller og M.P. Calos, red., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., red., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., red., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., red., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) ; Immunobiology (CA. Janeway og P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty, red., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd og C. Dean, red., Oxford University Press, 2000) ; Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow og D. Lane (Cold Spring harbour Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti og J.D. Capra, red., Harwood Academic Publishers, 1995) og Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., red., J.B. Lippincott Company, 1993).

Definisjoner

Et "antistoff" er et immunglobulin molekyl som spesifikt kan bindes til et mål, for eksempel et karbohydrat, et polynukleotid, et lipid, et polypeptid osv., via minst et antigengjenkjennelsessete, som er lokalisert i immunglobulinmolekylets variable område. Som anvendt her omfatter begrepet ikke bare intakte polyklonale eller monoklonale antistoffer, men også fragmenter av disse (slik som Fab, Fab', (F(ab')2, Fv), enkeltkjede antistoffer (ScFv), mutanter derav, fusjonsproteiner som omfatter en antistoff del og enhver annen modifisert konfigurasjon av immunglobulin molekylet som omfatter et antigengjenkjennelsessete. Et antistoff omfatter et antistoff av enhver klasse, for eksempel IgG, IgA eller IgM (eller underklasser av disse), og antistoffet må ikke tilhøre en bestemt klasse. Avhengig av aminosyresekvensen i det konstante domenet i antistoffets tungkjeder kan immunglobuliner tilskrives forskjellige klasser. Det finnes fem hovedklasser av immunglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, og flere av disse kan oppdeles videre i underklasser (isotpyer), foreksempel IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl og IgA2. Tungkjedenes konstante domener som tilsvarer de forskjellige immunglobulinklassene betegnes a, 5, e, y henholdsvis \ i. Subenhet-strukturen og den tredimensjonelle konfigurasjon av forksjellige immun-globulinklasser er velkjent.

"Fv" er et antistoffragment som inneholder et komplett antigengjenkjennelses- og - bindingssete. I et tokjedet Fv-molekyl består dette området av en dimer av ett tungkjede og ett lettkjede variabelt domene i tett, ikke-kovalent assosiasjon. I et enkeltkjedet Fv-molekyl kan ett tungkjede og ett lettkjede variabelt domene være kovalent sammenbundet via en fleksibel peptidlinker, slik at tungkjeden og lettkjeden kan assosiere i en dimer struktur som tilsvarer strukturen av et tokjedet Fv-molekyl. Det er i denne konfigurasjonen at de tre CDR i hvert variabelt domene interagerer slik at en antigenbindende spesifisitet defineres på overflaten av VH-VL-dimeren. Imidlertid har selv et enkelt variabelt domene (eller halvparten av et Fv, omfattende kun tre CDR som er spesifikke for et antigen) evnen til å gjenkjenne og binde til antigen, om enn generelt med lavere affinitet enn det intakte bindingssetet.

Fab-fragmentet inneholder også lettkjedens konstante domene og tungkjedens første konstante domene (CH1). Fab'-fragmenter skiller seg fra Fab-fragmenter ved at de i tillegg omfatter noen få aminosyrerester i karboksyenden av tungkjedens CHl-domene, innbefattet én eller flere cyste in reste r fra antistoffets hengselområder.

Et "monoklonalt antistoff" viser til en homogen antistoffpopulasjon hvor det monoklonale antistoff består av aminosyrer (naturlig forekommende og ikke naturlig forekommende) som deltar i selektiv binding av et antigen. En populasjon av monoklonale antistoffer er svært spesifikk og rettet mot et enkelt antigenisk sete. Begrepet "monoklonalt antistoff" omfatter ikke bare intakte monoklonale antistoffer og fullengde monoklonale antistoffer, men også fragmenter av disse (slik som Fab, Fab', F(ab')2, Fv), enkeltkjede antistoffer (ScFv), mutanter av disse, fusjonsproteiner som omfatter en antistoff del og enhver annen modifisert konfigurasjon av immunglobulin molekylet som omfatter et antigengjenkjennelsessete med den nødvendige spesifisitet og evne til å bindes til et antigen. Begrepet er ikke ment å være begrenset når det gjelder kilden for antistoffet eller måten antistoffet er fremstilt på (slik som ved hybridomer, bakteriofag seleksjon, rekombinant ekspresjon, transgene dyr osv.).

Som anvendt her betyr "humant antistoff" et antistoff med en aminosyresekvens som tilsvarer sekvensen til et antistoff dannet av et menneske og/eller fremstilt ved anvendelse av hvilken som helst av teknikkene for fremstilling av humane antistoffer som er kjente innen faget eller som beskrevet her. Denne definisjonen av et humant antistoff omfatter antistoffer som omfatter minst ett humant tungkjede polypeptid eller minst ett humant lettkjede polypeptid. Et slikt eksempel er et antistoff som omfatter muse-lettkjede polypeptider og humane tungkjede polypeptider. Humane antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av forskjellige teknikker som er kjente innen faget. I én utførelsesform er det humane antistoff valgt fra et bakteriofagbibliotek, hvor bakteriofagbiblioteket uttrykker humane antistoffer (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom og Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Humane antistoffer kan også fremstilles ved å innføre humane immunglobulin-loci i transgene dyr, f. eks. mus i hvilke de endogene immunglobulin-genene har blitt delvis eller fullstendig inaktivert. Denne tilnærmingen beskrives i U.S. patentskrifter nr. 5 545 807, 5 545 806, 5 569 825, 5 625 126, 5 633 425 og 5 661 016. Alternativt kan det humane antistoffet fremstilles ved å immortalisere humane B-lymfocytter som danner et antistoff rettet mot et målantigen (slike B-lymfocytter kan være gjenvunnet fra et individ, eller de kan ha blitt immunisert in vitro). Se f. eks. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, s. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147 (l):86-95 og US patentskrift nr. 5 750 373.

"Kimere antistoffer" viser til de antistoffer hvor én del av hver av aminosyre-sekvensene til tung- og lettkjeden er homolog med tilsvarende sekvenser i antistoffer avledet fra en gitt art eller tilhørende en gitt klasse, mens den gjenværende del av kjedene er homolog med tilsvarende sekvenser i en annen art eller en annen klasse. I disse kimere antistoffene etterligner typisk de variable områdene i både lett- og tungkjeden de variable områdene i antistoffer avledet fra en pattedyreart, mens de konstante delene er homologe med sekvenser i antistoffer avledet fra en annen art. En klar fordel med slike kimere former er for eksempel at de variable områdene enkelt kan avledes fra allerede kjente kilder ved anvendelse av lett tilgjengelige hybridomer eller B-celler fra ikke-humane vertsorganismer, i kombinasjon med konstante områder avledet fra for eksempel humane cellepreparater. Mens det variable området har fordelen av enkel fremstilling og at spesifisiteten ikke påvirkes av dets kilde, at det konstante område er humant gjør det mindre tilbøyelig til å

utløse en immunrespons i et humant individ når antistoffene injiseres, enn dersom det konstante området var fra en ikke-human kilde.

Et "funksjonelt Fc-område" besitter minst én effektorfunksjon forbundet med et Fc-område med nativ sekvens. Eksempler på "effektorfunksjoner" omfatter Clq-binding, komplementavhengig cytotoksisitet (CDC), Fc-reseptorbinding, antistoff-avhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC), fagocytose, nedregulering av celleoverflate reseptorer (f. eks. B-cellereseptor, BCR) osv. Slike effektorfunksjoner krever vanligvis at Fc-området er kombinert med et bindingsdomene (f. eks. et variabelt antistoff domene), og de kan anslås ved anvendelse av forskjellige analyser som er kjente innen faget for evaluering av slike antistoff effektorfunksjoner.

Et "Fc-område med nativ sekvens" omfatter en aminosyresekvens som er identisk med aminosyresekvensen til et Fc-område som finnes i naturen. En "Fc-områdevariant" omfatter en aminosyresekvens som avviker fra sekvensen til et nativt Fc-område grunnet minst én aminosyremodifikasjon, men varianten bibeholder likevel minst én effektorfunksjon forbundet med den native Fc-områdesekvens. Fc-områdevarianter har fortrinnsvis minst én aminosyresubstitusjon sammenlignet med en nativ Fc-områdesekvens eller med Fc-området i et utgangspolypeptid, for eksempel fra omtrent 1 til omtrent 10 aminosyresubstitusjoner, fortrinnsvis fra omtrent 1 til omtrent 5 aminosyresubstitusjoner i en nativ Fc-områdesekvens eller i Fc-området i utgangspolypeptidet. Fc-områdevarianten vil her fortrinnsvis vise minst omtrent 80 % sekvensidentitet med en nativ Fc-område-sekvens og/eller med et Fc-område i et utgangspolypeptid, og mes foretrukket minst omtrent 90 % sekvensidentitet, mer foretrukket minst omtrent 95 % sekvensidentitet.

"Som anvendt her viser "antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet" og "ADCC" til en cellemediert reaksjon i hvilken uspesifikke cytotoksiske celler som uttrykket Fc-reseptorer (FcR) (slik som naturlige dreperceller (NK)-celler, neutrofile celler og makro-fager) gjenkjenner bundet antigen på en målcelle og deretter får målcellen til å lysere. ADCC-aktiviteten til et molekyl av interesse kan anslås ved anvendelse av en in vitro ADCC-analyse, foreksempel analysen som beskrives i U.S. patentskrift nr. 5 500 362 eller 5 821 337. Anvedbare effektorceller for slike analyser omfatter mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) og NK-celler. Alternativt eller i tillegg kan ADCC-aktiviteten til molekylet av interesse anslås in vivo, for eksempel i en dyremodell som den som beskrives i Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

Som anvendt her beskriver "Fc-reseptor" og "FcR" en reseptor som bindes til et antistoff Fc-område. Den foretrukne FcR er en human FcR med nativ sekvens. Videre er en foretrukket FcR en FcR som binder et IgG-antistoff (en y-reseptor) og omfatter reseptorer av underklassene FcyRI, RcyRII og FcyRIII, innbefattet alleliske varianter og alternativt spleisede former av disse reseptorene. FcyRII-reseptorer omfatter FcyRIIA (en "aktiverende reseptor") og FcyRIIB (en "inhiberende reseptor"), som har aminosyresekvenser som ligner hverandre og som hovedsakelig er forskjellige i de cytoplasmatiske domenene. En oversikt over FcR vist i Ravetch og Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34 og de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" omfatter også den neonatale reseptor, FcRn, som er ansvarlig for overføring av IgG fra mor til foster (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587 og Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

"Komplementavhengig cytotoksisitet" og "CDC" viser til lysis av en målcelle i nærvær av komplement. Komplementaktiverings reaksjonsveien innledes ved binding av komplementsystemets første bestanddel (Clq) til et molekyl (f. eks. et antistoff) i kompleks med et tilsvarende antigen. For vurdering av komplementaktivering kan en CDC-analyse, f. eks. som beskrevet i Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996) utføres.

Som anvendt her anvendes begrepene "E3", "3E" og "antistoff E3" om hverandre for å vise til et antistoff som omfatter aminosyresekvensen til tungkjedens og lettkjedens variable områder som er vist i Figurene IA (SEKV. ID. NR.l) henholdsvis IB (SEKV. ID. NR.2). CDR-områdene i antistoff E3 (innbefattet Chothia- og Kabat-CDR) er vist skjematisk i figurene IA og IB. Figurene 2 og 3 viser polynukleotider som koder for tungkjeder henholdsvis lettkjeder som omfatter tungkjedens og lettkjedens variable områder som er vist i Figurene IA henholdsvis IB. Fremstilling og karakterisering av E3 er beskrevet i eksemplene. Forskjellige biologiske fraksjoner er forbundet med E3, innbefattet evnen til å binde til NGF og inhibere biologisk aktivitet forbundet med NGF og/eller én eller flere nedstrøms reaksjonsveier som formidles ved NGF-signalisering, og evnen til å inhibere NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5. Som diskutert her kan antistoffer ifølge oppfinnelsen ha hvilken eller hvilke som helst av disse egenskapene. I noen utførelsesformer viser begrepet "E3" til immunglobulin som kodes av (a) et polynukleotid som koder for E3-lettkjede og som har ATCC depotnummer PTA-4893 eller PTA-4894, og (b) et polynukleotid som koder for E3-tungkjeden og som har ATCC depotnummer PTA-4895.

Som anvendt her viser "immunspesifikk" binding av antistoffer til den antigen-spesifikke bindingsinteraksjon som opptrer mellom et antistoff antigenbindende sete og det spesifikke antigen som gjenkjennes av antistoffet (dvs. at antistoffet reagerer med proteinet i en ELISA eller en annen immunanalyse og ikke i påvisbar grad reagerer med ubeslektede proteiner).

En epitop som "spesifikt bindes" eller "fortrinnsvis bindes" (benyttet om hverandre her) til et antistoff eller et polypeptid er et begrep som er godt forstått innen faget, og fremgangsmåte for bestemmelse av slik spesifikk eller selektiv binding er også velkjente innen faget. Et molekyl sies å vise "spesifikk binding" eller "selektiv binding" dersom det reagerer eller assosierer hyppigere, hurtigere, med lengre varighet og/eller med høyere affinitet enn en gitt celle eller forbindelse enn med alternative celler eller forbindelser. Et antistoff "bindes spesifikt" eller "bindes preferensielt" til et mål dersom det bindes med høyere affinitet, aviditet, lettere og/eller med lengre varighet enn det bindes til andre forbindelser. For eksempel er et antistoff som spesifikt eller fortrinnsvis bindes til en NGF-epitop et antistoff som bindes til denne epitopen med høyere affinitet, høyere aviditet, lettere og/eller med lengre varighet enn det bindes til andre NGF-epitoper eller ikke-NGF-epitoper. Ved gjennomlesing av denne definisjonen vil det også forstås at et antistoff (eller en gruppe eller en epitop) som for eksempel spesifikt eller fortrinnsvis bindes til et første mål kan bindes spesifikt eller preferensielt til et andre mål, men må ikke gjøre det. Således krever "spesifikk binding" eller "selektiv binding" ikke nødvendigvis eksklusiv binding (selv om begrepene kan omfatte dette). Vanligvis, men ikke nødvendigvis, betyr henvisning til binding, selektiv binding.

Begrepene "polypeptid", "oligopeptid", "peptid" og "protein" anvendes om hverandre her for å vise til aminosyrepolymerer med hvilken som helst lengde. Polymeren kan være uforgrenet eller forgrenet, den kan omfatte modifiserte aminosyrer og den kan være avbrutt av ikke-aminosyrer. Begrepene omfatter også en aminosyrepolymer som har blitt modifisert naturlig eller ved inngrep, for eksempel ved dannelse av disulfid-bindinger, med glykosylering, lipidering, acetylering, fosforylering eller enhver annen form for manipulering eller modifikasjon, slik som konjugering til en markøre. Også omfattet av denne definisjonen er for eksempel polypeptider som inneholder én eller flere analoger av en aminosyre (innbefattet for eksempel ikke-naturlig forekommende aminosyrer osv.), så vel som andre modifikasjoner som er kjente innen faget. Det vil forstås at siden polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse bygger på et antistoff, kan polypeptidene foreligge som enkeltkjeder eller som forbunede kjeder.

"Polynukleotid" eller "nukleinsyre", som anvendes om hverandre her, viser til nukleotidpolymerer av enhver lengde og omfatter DNA og RNA. Nukleotidene kan være deoksyribonukleotider, ribonukleotider, modifiserte nukleotider eller baser og/eller analoger derav, eller ethvert substrat som kan innføres i en polymer med DNA- eller RNA-polymerase. Et polynukleotid kan omfatte modifiserte nukleotider, slik som metylerte nukleotider og nukleotidanaloger. Dersom modifikasjoner foreligger kan disse være innført før eller etter oppbyggingen av polymeren. Nukleotidsekvensen kan være avbrutt av ikke-nukleotidbestanddeler. Et polynukleotid kan være ytterligere modifisert etter polymeri-seringen, slik som ved konjugering til en merkingsbestanddel. Andre typer av modifikasjoner omfatter for eksempel "caps", substitusjon av ett eller flere av de naturlig forekommende nukleotidene med en analog, internukleotid modifikasjoner slik som modifikasjoner med uladede bindinger (f. eks. metylfosfonater, fosfotriestere, fosfo-amidater, karbamater osv.) og med ladede bindinger (f. eks. fosforotioater, fosforoditioater osv), modifikasjoner som inneholder påhengende grupper, slik som for eksempel proteiner (f. eks. nukleaser, toksiner, antistoffer, signalpeptider, poly-L-lysin osv.), modifikasjoner

med interkalatorer (f. eks. akridin, psoralen osv.), modifikasjoner som inneholder chelatorer (f. eks. metaller, radioaktive metaller, bor, oksidative metaller osv.), modifikasjoner som inneholder alkylatorer, modifikasjoner med modifiserte bindinger (f. eks. a-anomeriske nukleinsyrer osv.), så vel som ikke-modifiserte former av polynukleotidet eller polynukleotidene. Videre kan hvilken som helst av hydroksylgruppene som vanligvis foreligger i sukkerne være erstattet, for eksempel med fosfonatgrupper eller fosfatgrupper, beskyttet med standard beskyttelsesgrupper eller aktivert for fremstilling av ytterligere bindinger til ekstra nukleotider, eller de kan være konjugert til faste støttemidler. OH-gruppen i 5' og 3' ende kan være fosforylert eller substituert med aminer eller organiske grupper med fra 1 til 20 karbonatomer. Andre hydroksylgrupper kan også være derivatiserte med standard beskyttelsesgrupper. Polynukleotider kan også inneholde analoge former av ribose- eller deoksyribosesukkere som generelt er kjente innen faget, innbefattet for eksempel 2'-0-metyl-, 2'-0-allyl, 2'-fluor- eller 2'-azido-ribose, karbosykliske sukkeranaloger, a-anomere sukkere, epimere sukkere som arabinose, xyloser eller lyksoser, pyranosesukkere, furanosesukkere, sedoheptuloser, asykliske analoger og abasiske nukleosidanaloger, for eksempel metylribosid. Én eller flere fosfodiesterbindinger kan være erstattet med alternative koblingsgrupper. Disse alternative koblingsgruppene omfatter utførelsesformer hvor fosfat er erstattet med P(0)S("tioat"), P(S)S ("ditioat"), "(0)NR2("amidat"), P(0)R, P(0)OR', Co eller CH2("formacetal"), hvor hver R eller R' uavhengig av det andre er H eller substituert eller ikke-substituert alkyl (1-20 C), om ønskelig inneholdende en eter (-O-)-binding, aryl, alkenyl, sykloalkyl, sykloalkenyl eller araldyl. Ikke alle bindinger i et polynukleotid må være identiske. Beskrivelsen ovenfor gjelder alle polynukleotider som det vises til her, innbefattet RNA og DNA.

Et "variabelt område" i et antistoff viser til det variable området i antistoffets lettkjede eller det variable området i antistoffets tungkjede, enten hver for seg eller i kombinasjon. De variable områdene i tungkjeden og lettkjeden består hvert av fire rammeverksområder (FR) som er sammenbundet av tre komplementaritetsbestemmende områder (CDR), også betegnet hypervariable områder. CDR i hver kjede holdes nær hverandre av FR og bidrar sammen med CDR fra den andre kjeden til dannelsen av antistoffenes antigenbindende sete. Det finnes minst to teknikker for bestemmelse av CDR: (1) en tilnærming basert på sekvensvariabilitet mellom arter (dvs. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5. utgave, 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); og (2) en tilnærming basert på krystallografiske undersøkelser av antigen-antistoff komplekser (Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Som anvendt her kan en CDR vise til CDR definert ved hvilken som helst av disse tilnærmingene eller ved en kombinasjon av de to tilnærmingene.

Et "konstant område" i et antistoff viser til det konstante området i antistoffets lettkjede eller det konstante området i antistoffets tungkjede, enten hver for seg eller i kombinasjon.

Som anvendt her viser begrepene "nervevekstfaktor" og "NGF" til nervevekstfaktor og varianter derav som bibeholder i det minste en del av den biologiske aktivitet til NGF. Som anvendt her omfatter NGF NGF med nativ sekvens fra alle pattedyrsarter, innbefattet menneske, hund, katt, hest og storfe.

"NGF-reseptor" viser til et polypeptid som bindes av eller aktiveres av NGF. NGF-reseptorer omfatter TrkA-reseptoren og p75-reseptoren fra enhver pattedyrsart, innbefattet menneske, hund, katt, hest, primat eller storfe.

Som anvendt her viser et "antagonistisk anti-NGF-antistoff" (benyttet om hverandre med "anti-NGF-antistoff") til et antistoff som kan bindes til NGF og inhibere biologisk aktivitet forbundet med NGF og/eller én eller flere nedstrøms reaksjonsveier som formidles ved NGF-signalisering. Et antagonistisk anti-NGF-antistoff omfatter antistoffer som blokkerer, antagoniserer, undertrykker eller reduserer (innbefattet i signifikant grad) biologisk aktivitet forbundet med NGF, innbefattet nedstrøms reaksjonsveier som formidles ved NGF-signalisering, for eksempel reseptorbinding og/eller utløsning av en cellulær respons på NGF. For formålet til den foreliggende oppfinnelse vil det eksplisitt forstås at begrepet "antagonistisk anti-NGF-antistoff" omfatter alle de allerede beskrevne begreper, titler og funksjonelle tilstander og egenskaper ved hvilke NGF selv, en biologisk aktivitet forbundet med NGF (innbefattet evnen til å formidle ethvert aspekt ved smerte etter kirurgiske inngrep) eller følgende av den biologiske aktivitet i vesentlig grad er fjernet, redusert eller nøytralisert i enhver meningsfull grad. I noen utførelsesformer bindes et antagonistisk anti-NGF-antistoff til NGF og forhindrer NGF-dimerisering og/eller binding til en NGF-reseptor (slik som p75 og/eller trkA). I andre utførelsesformer bindes et anti-NGF-antistoff til NGF og forhindrer trkA-reseptordimerisering og/eller trkA-autofosforylering. Eksempler på antagonistiske anti-NGF-antistoffer gis her.

"Biologisk aktivitet" forbundet med NGF viser vanligvis til evnen til å bindes til NGF-reseptorer og/eller aktivere NGF-reseptorens signalveier. En biologisk aktivitet omfatter én eller flere av følgende: evnen til å bindes til en NGF-reseptor (slik som p75 og/eller trkA), evnen til å fremme trkA-reseptordimerisering og/eller -autofosforylering, evnen til å aktivere en NGF-reseptors signalvei, evnen til å fremme celledifferensiering, celle-proliferasjon, celleoverlevelse, cellevekst og andre endringer i cellens fysiologi, innbefattet (når det gjelder neuroner innbefattet perifere og sentrale neuroner) endringer i neuronal morfologi, synaptogenese, synapsefunksjon, frigjøring av neurotransmitter og/eller neuro-peptid og regenerering etter skader, evnen til å fremme overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 og evnen til å formidle smerte, innbefattet smerte etter kirurgiske inngrep.

Som anvendt her viser "i det vesentlige ren" til materialer som er minst 50 % rent (dvs. fritt for kontaminanter), mer foretrukket minst 90 % rent, mer foretrukket minst 95 % rent, mer foretrukket minst 98 % rent, og mer foretrukket minst 99 % rent.

En "vertscelle" omfatter en enkeltcelle eller en cellekultur som kan eller har vært mottaker for vektor(er) for inkorporering av innsatt polynukleotid. Vertsceller omfatter avkom fra en enkelt vertscelle, og avkommet må ikke nødvendigvis være fullstendig identisk (når det gjelder morfologi eller genomisk DNA-komplement) med den opprinnelige utgangscelle grunnet naturlig, tilfeldig eller bevist mutasjon. En vertscelle omfatter celler som er transfektert in vivo med ett eller flere polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse.

Som anvendt her er "behandling" en tilnærming for å oppnå gunstige eller ønskede kliniske resultater. For formålet til den foreliggende oppfinnelse omfatter gunstige eller ønskede kliniske resultater én eller flere av følgende: forbedring eller lindring av ethvert aspekt ved smerte, innbefattet akutt smerte, kronisk smerte, inflammatorisk smerte, neuropatisk smerte, smerte etter kirurgiske inngrep, smerte forbundet med reumatoid artritt og smerte forbundet med osteoartritt. For formålet til den foreliggende oppfinnelse omfatter gunstige eller ønskede kliniske resultater én eller flere av følgende: redusert omfang, lindring av ett eller flere symptomer forbundet med smerte, innbefattet ethvert aspekt ved smerte (slik som redusert varighet av smerte, reduksjon av smertesensisitivet eller smertefølelse).

En "effektiv mengde" av et legemiddel, en forbindelse eller et farmasøytisk preparat er en mengde som er tilstrekkelig til å gi gunstige eller ønskede resultater, innbefattet kliniske resultater som lindret eller redusert smertefølelse. En effektiv mengde kan aministreres ved én eller flere administrereinger. For formålet til den foreliggende oppfinnelse er en effektiv mengde av et legemiddel, en forbindelse eller et farmasøytisk preparat en mengde som er tilstrekkelig til å behandle, lindre, redusere intensiteten av og/eller forebygge smerte, innbefattet smerte etter kirurgiske inngrep, smerte forbundet med reumatoid artritt og/eller smerte forbundet med osteoartritt. I noen utførelsesformer kan den "effektiv mengden" redusere smerten ved hvile (hvilesmerten) eller mekanisk indusert smerte (innbefattet smerte etter bevegelse) eller begge, og den kan tilføres før, under eller etter et inngrep, et kutt, en rift eller en skade og/eller før, under eller etter et smertefult stimulus. Som det vil forstås i klinisk sammenheng kan en effektiv mengde av et legemiddel, en forbindelse eller et farmasøytisk preparat oppnås i forbindelse med et annet medikament, en annen forbindelse eller et annet farmasøytisk preparat, men må ikke gjøre det. Således kan en "effektiv mengde" ses i forbindelse med administrering av ett eller flere terapeutiske midler, og et enkelt middel kan anses å være gitt i en effektiv mengde dersom et ønsket resultat kan oppnås eller oppnås i forbindelse med ett eller flere andre midler.

"Reduksjon av forekomsten" av smerte betyr reduksjon av smerteomfanget (som kan omfatte redusert behov for og/eller mengde av (f. eks. eksponering ovenfor) andre legemidler og/eller behandlingsformer som generelt anvendes for disse tilstandene, for eksempel opiater), varighet og/eller frekvens (innbefattet for eksempel forsinket smerte eller forlenget tid til smerten oppstår etter kirurgiske inngrep i et individ). Som fagfolk vil forså kan individer variere når det gjelder respons på behandling, og følgelig gjenspeiler for eksempel en "fremgangsmåte for reduksjon av forekomsten av smerte forbundet med reumatoid artritt eller smerte forbundet med osteoartritt i et individ" administrering av det antagonistiske anti-NGF-antistoff basert på en rimelig forventelse av at slik administrering sannsynligvis vil gi en slik reduksjon av forekomsten i det angjeldende individ.

"Lindring" av en smerte eller ett eller flere symptomer på smerte (slik som smerte forbundet med reumatoid artritt eller osteoartritt) betyr en reduksjon eller forbedring av ett eller flere symptomer på smerte, sammenlignet med det å ikke tilføre et antagonistisk anti-NGF-antistoff. "Lindring" omfatter også avkortet eller redusert varighet av et symptom.

"Døyving" av en smerte eller ett eller flere symptomer på smerte (slik som smerte forbundet med reumatoid artritt eller osteoartritt) betyr å redusere omfanget av én eller flere uønskede, kliniske manifestasjoner på smerte etter kirurgiske inngrep i et individ eller en populasjon av individer som behandles med et antagonistisk anti-NGF-antistoff i samsvar med oppfinnelsen.

Som anvendt her betyr "forsinkelse" at utviklingen av smerte og blokkere, hindre, redusere hastigheten av, retardere, stabilisere og/eller utsette utviklingen av smerte, slik som smerte etter kirurgiske inngrep, smerte forbundet med reumatoid artritt og smerte forbundet med osteoartritt. Denne forsinkelsen kan være av forskjellig varighet avhengig av sykdomshistorien og/eller individene som behandles. Som det er åpenbart for en fagperson, kan en tilstrekkelig eller signifikant forsinkelse, i praksis omfatte forebygging, ved at individet ikke utvikler smerte. En fremgangsmåte som "forsinker" utviklingen av symptomet er en fremgangsmåte som reduserer sannsynligheten for at symptomet utvikles i løpet av et gitt tidsrom og/eller som reduserer omfanget av symptomene innen et gitt tidsrom, sammenlignet med å ikke anvende fremgangsmåten. Slike sammenligninger er typisk basert på kliniske studier hvor det anvendes et stastistisk signifikant antall individer.

"Smerte" som anvendt her viser til smerte av ethvert opphav, innbefattet akutt og kronisk smerte, og enhver smerte med en inflammatorisk komponent. Eksempler på smerte omfatter smerte etter kirurgiske inngrep, smerte etter operasjoner (innbefattet tannpine), migrene, hodepine og trigeminal neuralgi, smerte forbundet med brannsår, sår eller nyre-stein, smerte forbundet med traumer (innbefattet traumatiske hodeskader), neuropatisk smerte, smerte forbundet med muskel-skelettforstyrrelser som reumatoid artritt, osteo-artritt, ankyloserende spondylitt, sero-negative (ikke reumatoide) artropatier, ikke-artikulær reumatisme og peri-artikulære forstyrrelser, og smerte forbundet med kreft (innbefattet

"break-through pain"og smerte forbundet med terminal kreft), perifer neuropati og post-herpetisk neuralgi. Eksempler på smerte med en inflammatorisk komponent (i tillegg til noen av dem som er beskrevet ovenfor) omfatter reumatisk smerte, smerte forbundet med mykositt og dysmenorre.

"Smerte etter kirurgiske inngrep" (også betegnet "smerte etter operasjoner" eller "post-traumatisk smerte") viser til smerte som oppstår eller skyldes et ytre traume, for eksempel et kutt, et stikk, et inngrep, en rift eller et sår i et vev hos et individ (innbefattet skader grunnet alle former for kirurgiske fremgangsmåter, både invasive og ikke-invasive). Som anvendt her omfatter smerte etter kirurgiske inngrep ikke smerte som oppstår (fremkommer eller fremstår) uten et ytre fysisk traume. I noen utførelsesformer er smerte etter kirurgiske inngrep indre eller ytre (innbefattet perifer) smerte, og såret, kuttet, traumet, riften eller inngrepet kan ha oppstått tilfeldig (som ved et traumatisk sår) eller med vilje (som ved et kirurgisk inngrep). Som anvendt her omfatter "smerte" nocisepsjon og smertefølelse, og smerten kan anslås objektivt og subjektivt ved anvendelse av smertepoeng og andre fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Som anvendt her omfatter smerte etter kirurgiske inngrep allodyni (dvs. forsterket respons på et normalt uskadelig stimulus) og hyperalgesi (dvs. forsterket respons på et normalt skadelig eller ubehagelig stimulus), og dette kan i sin tur være varmebasert eller mekanisk (taktilt) av natur. I noen utførelsesformer særpreges smerten ved varmesensitivitet, mekanisk sensitivitet og/eller hvilesmerte. I noen utførelsesformer omfatter smerten etter kirurgiske inngrep mekanisk indusert smerte eller hvilesmerte. I andre utførelsesformer omfatter smerten etter kirurgiske inngrep hvilesmerte. Smerten kan være primær eller sekundær smerte, som er kjent innen faget.

En "biologisk prøve" omfatter en rekke prøvetyper fremskaffet fra et individ og kan anvendes i en diagnostisk analyse eller en kontrollerende analyse. Definisjonen omfatter blodet og andre væskeprøver av biologisk opphav, faste vevsprøver, slik som biopsi prøver, vevskulturer eller celler avledet fra slike, samt avkommet derav. Definisjonen omfatter også prøver som har blitt manipulert på en eller annen måte etter fremskaffelsen, slik som ved behandling med reagenser, solubilisering eller anriking av visse bestanddeler, slik som proteiner eller polynukleotider, eller innstøping i et halvfast eller fast matriks med det formål å fremstille snitt. Begrepet "biologisk prøve" omfatter en klinisk prøve, og omfatter også celler i kultur, cellesupernatanter, cellelysater, serum, plasma, biologiske væsker og vevsprøver.

Et "individ" er en virveldyr, fortrinnvis et pattedyr, mer foretrukket et menneske. Pattedyr omfatter husdyr (slik som kyr), sportsdyr, kjeledyr (slik som katter, hunder og hester), primater, mus og rotter.

Som anvendt her betyr "vektor" en konstruksjon som kan tilføre, og fortrinnsvis uttrykke ett eller flere gener eller sekvenser av interesse i en vertscelle. Eksempler på vektorer omfatter v i ru sve kto re r, nakne DNA- eller RNA-ekspresjonsvektorer, plasmid-, kosmid- eller bakteriofag vektorer, DNA- eller RNA-ekspresjonsvektorer forbundet med kationiske kondensasjonsmidler, DNA- eller RNA-ekspresjonsvektorer som er innkapslet i liposomer og visse eukaryote celler, slik som produsentceller.

Som anvendt her betyr "ekspresjonskontrollsekvens" en nukleinsyresekvens som styrer transkripsjonen av en nukleinsyre. En ekspresjonskontrollsekvens kan være en promoter, for eksempel en konstitutiv eller induserbar promoter, eller en enhancer. Ekspresjonskontrollsekvensen er operativt koblet til nukleinsyresekvensen som skal transkriberes.

Som anvendt her omfatter "farmasøytisk aksepterbart bærestoff" ethvert materiale som ved sammenblanding med en aktiv bestanddel tillater bestanddelen å bibeholde sin biologiske aktivitet og som ikke reagerer med individets immunsystem. Eksempler omfatter hvilke som helst av standard farmasøytiske bærestoffer slik som fosfatbufret saltløsning, vann, emulsjoner, for eksempel olje/vannemulsjon og forskjellige typer fuktningsmidler. Foretrukne fortynningsmidler for aerosoltilførsel eller parenteral tilførsel er fosfatbufret saltvann eller normalt (0,9 %) saltvann. Preparater som omfatter slike bærestoffer utformes ved velkjente, konvensjonelle fremgangsmåter (se for eksempel Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, A. Gennaro, red., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20. utgave, Mack Publishing, 2000).

Begrepet "Koff" som anvendt her er ment å vise til "av"-hastighetskonstanten for dissosiasjon av et antistoff fra antistoff/antigen komplekset.

Begrepet "Kd" som anvendt her er ment å vise til dissosiasjonskonstanten for en antistoff-antigen interaksjon.

Antistoff E3, E3-avledede antistoffer, preparter og fremgangsmåter for anvendelse derav

E3- Preparater, E3- avledede preparater og fremgangsmåter for fremstilling av preparatene

Foreliggende oppfinnelse omfatter preparater, innbefattet farmasøytiske preparater, som omfatter et E3-antistoff eller -polypeptid og polynukleotider som omfatter sekvenser som koder for et E3-antistoff eller -polypeptid. Som anvendt her omfatter preparater ett eller flere antistoffer eller polypeptider (som kan, men ikke må være antistoffer) som bindes til NGF og/eller ett eller flere polynukleotider som omfatter sekvenser som koder for ett eller flere antistoffer eller polypeptider som bindes til NGF. Disse preparatene kan videre omfatte egnede eksipienser, slik som farmasøytisk aksepterbare eksipienser, innbefattet buffere, som er velkjente innen faget.

Oppfinnelsen omfatter også isolert antistoff, polypeptid og polynukleotid. Oppfinnelsen omfatter i det vesentlige rent antistoff, polypeptid og polynukleotid.

Antistoffene og polypeptidene ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved hvilke som helst (én eller flere) av følgende egenskaper: (a)evnen til å bindes til NGF, (b) evnen til å redusere og/eller inhibere biologisk aktivitet forbundet med NGF og/eller én eller flere nedstrøms reaksjonsveier som formidles ved NGF-signalisering, (c) evnen til å redusere og/eller inhibere NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5, (d) fravær av signifikant kryssreaktivitet med NT3, NT4/5 og/eller BDNF, (e) evnen til å behandle og/eller forebygge smerte (innbefattet smerte etter kirurgiske inngrep) (f) evnen til å øke clearance for NGF, (g) evnen til å redusere eller inhibere aktivering av trkA-reseptoren, for eksempel påvist ved anvendelse av en kinasereseptor-aktiveringsanalyse (KIRA) (se U.S. patentskrift nr. 6 027 927).

Bindingsegenskapene til antistoff E3, som binder humant NGF med høy affinitet og lav dissosiasjonskinetikk sammenlignet med utgangsantistoffet, det monoklonale anti-NGF-muse-antistoff 911, er oppsummert nedenfor. E3 bindes til humant NGF med omtrent 50 ganger høyere bind i ngsaffi nitet enn utgangsantistoffet, muse-antistoff 911.

E3-antistoffet og beslektede antistoffer viser også en kraftig evne til å antagonisere humant NGF, som testet i in wfro-analyser (se Eksemplene 2 og 3). For eksempel antagoniserer antistoff E3 NGF-avhengig overlevelse av de tregeminale museneuronene E13 med en IC50på omtrent 21 pM i nærvær av 15 pM humant NGF og omtrent 1,2 pM i nærvær av 1,5 pM humant NGF.

Følgelig er i et annet aspekt antistoffene og polypeptidene ifølge oppfinnelsen ytterligere identifisert ogkarakterisert ved: (h) høyaffinitetsbinding til humant NGF med lav dissosiasjonskinetikk (i noen utførelsesformer med en KDpå mindre enn omtrent 2 nM og en Kofflavere enn omtrent 6 x 10"5s_1) og/eller (i) evne til å inhibere (blokkere) NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50på omtrent 100 pM eller lavere ved omtrent 15 pM NGF (i noen utførelsesformer humant NGF) og/eller en IC50på omtrent 20 pM eller lavere ved omtrent 1,5 pM NGF.

I noen utførelsesformer binder antistoffet humant NGF uten i signifikant grad å binde NGF fra en annen virveldyrart (i noen utførelsesformer pattedyr). I noen utførelses-former binder antistoffet humant NGF, så vel som én eller flere NGF fra en annen virveldyrart (i noen utførelsesformer pattedyr). I ytterligere andre utførelsesformer binder antistoffet NGF uten i signifikant grad å kryssreagere med andre neurotrofiner (slik som de beslektede neurtrofinene NT3, NT4/5 og/eller BDNF). I noen utførelsesformer binder antistoffet NGF, så vel som minst et annet neurotrofin. I noen utførelsesformer bindes antistoffet til et pattedyrs utgave av NGF, slik som hest eller hund, uten i signifikant grad å bindes til NGF fra andre pattedyrarter.

I noen utførelsesformer er oppfinnelsen et antistoff som omfatter en lettkjede som kodes av et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC-depotnummer PTA-4893 eller PTA-4894. I et annet aspekt omfatter antistoffet en tungkjede som kodes av et polynukleotid som dannes av en vertscelle med ATCC depotnummer PTA-4895. Foreliggende oppfinnelse omfatter også forskjellige formuleringer av E3 og ekvivalente antistoff-fragmenter (f. eks. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc osv.), enkeltkjede antistoff (ScFv), mutanter derav, fusjonsproteiner som omfatter en antistoffdel og enhver annen modifisert konfigurasjon av E3 som omfatter et antigen (NGF)-gjenkjennelsessete med den nødvendige spesifisitet. Antistoffer som er ekvivalenter av E3, innbefattet antistoff- og polypeptid-fragmenter (som kan, men ikke må være antistoffer) av E3 og polypeptider som omfatter polypeptid-fragmenter av E3 påvises og karakteriseres ved hvilke som helst (ett eller flere) av kriteriene som er beskrevet ovenfor.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen hvilke som helst av følgende, eller preparater (innbefattet farmasøytiske preparater) som omfatter hvilke som helst av følgende:(a) antistoff E3, (b) et fragment eller et område fra antistoff E3, (c) en lettkjede av antistoff E3 som vist i Figur IB, (c) en tungkjede av antistoff E3 som vist i Figur IA, (d) ett eller flere variable områder fra en lettkjede og/eller en tungkjede fra antistoff E3, (e) én eller flere CDR (én, to, tre, fire, fem eller seks CDR) fra antistoff E3, vist i Figurene IA og IB, (f) CDR H3 fra tungkjeden i antistoff E3, vist i Figur IA, (g) CDR L3 fra lettkjeden i antistoff E3, vist

i Figur IB, (h) tre CDR fra lettkjeden i antistoff E3, vist i Figur IB, (i) tre CDR fra tungkjeden i antistoff E3, vist i Figur IA, (j) tre CDR fra lettkjeden og tre CDR fra tungkjeden i antistoff E3, vist i Figurene IA og IB, og (k) et antistoff som omfatter hvilke som helst av (b) til (j). Som åpenbart fra beskrivelsen her er polypeptid utførelsesformer som består av en aminosyresekvens som er identisk med aminosyresekvensen til det monoklonale muse-antistoff 911 spesifikt ekskludert fra oppfinnelsen. De utvidede CDR-sekvensene i Mab 911 er vist i Figurene IA og IB og i SEKV. ID. NR.9-14.

CDR-områdene i antistoff E3 (innbefattet Chothia- og Kabat-CDR) er vist skjematisk i Figurene IA og IB og består av følgende aminosyresekvenser: (a) tungkjede CDR 1 ("CDR Hl") GFSLIGYDLN (SEKV. ID. NR. 3), (b) tungkjede CDR 2 ("CDR H2") IIWGDGTTDYNSAVKS (SEKV. ID. NR. 4), (c) tungkjede CDR 3 ("CDR H3") GGYWYATSTTFDY (SEKV. ID. NR. 5), (d) lettkjede CDR 1("CDR LI") RASQSISNNLN (SEKV. ID. NR. 6), (e) lettkjede CDR 2 ("CDR L2") YTSRFHS (SEKV. ID. NR. 7), og (f) lettkjede CDR 3 ("CDR L3") QQEHTLPYT (SEKV. ID. NR. 8). Fastsettelse av CDR-områder ligger godt innenfor teknikkens stand. Det vil forstås at i noen utførelsesformer kan CDR være en kombinasjon av Kabat- og Chothia-CDR (også betegnet "kombinerte CDR" eller "utvidede CDR"). I noen utførelsesformer omfatter CDR Kabat-CDR. I andre utførelsesformer er CDR Chothia-CDR.

I noen utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som omfatter minst én CDR som i det vesentlige er homolog med minst én CDR, minst to, minst tre, minst fire, minst fem CDR fra E3 (eller i noen utførelsesformer i det vesentlige homolog med alle seks CDR i E3 eller avledet fra E3). Andre utførelsesformer omfatter antistoffer som har minst to, tre, fire, fem eller seks CDR som i det vesentlige er homologe med minst to, tre, fire, fem eller seks CDR fra E3 eller avledet fra E3. Det vil forstås at for formålet til den foreliggende oppfinnelse er bindingsspesifisitet og/eller total aktivitet (som kan dreie seg om å behandle og/eller forebygge smerte eller inhibere NGF-avhengig overlevelse av de trigeminale muse-neuronene E13.5) generelt bibeholdt, selv om aktivitetsgraden kan variere sammenlignet med E3 (være høyere eller lavere).

Oppfinnelsen tilveiebringer også et polypeptid (som kan, men ikke må være et antistoff) som omfatter en aminosyresekvens fra E3 (vist i Figurene IA og IB) som omfatter hvilke som helst av følgende: minst 5 sammenhengende aminosyrer, minst 8 sammenhengende aminosyrer, minst omtrent 10 sammenhengende aminosyrer, minst omtrent 15 sammenhengende aminosyrer, minst omtrent 20 sammenhengende aminosyrer, minst omtrent 25 sammenhengende aminosyrer, minst omtrent 30 sammenhengende aminosyrer fra en sekevns i E3, hvor minst tre av aminosyrene er fra et variabelt område i E3, idet det vil forstås at utførelsesformer som består av en aminosyresekvens som er identisk med en aminosyresekvens i det monoklonale museantistoff 911 spesifikt er ekskludert. De utvidede CDR-sekvensene i Mab 911 er vist i Figurene IA og IB samt i SEKV. ID. NR. 9-14. I én utførelsesform er det variable området fra en lettkjede fra E3. I en annen utførelsesform er det variable området fra en tungkjede fra E3. I en annen utførelsesform er de frem (eller flere) sammenhengende aminosyrene fra et komplementaritetsbestemmende område (CDR) i E3 vist i Figurene IA og IB.

I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens fra E3 som har hvilke som helst av følgende elementer: minst 5 sammenhengende aminosyrer, minst 8 sammenhengende aminosyrer, minst omtrent 10 sammenhengende aminosyrer, minst omtrent 15 sammenhengende aminosyrer, minst omtrent 20 sammenhengende aminosyrer, minst omtrent 25 sammenhengende aminosyrer, minst omtrent 30 sammenhengende aminosyrer fra en sekvens i E3, hvor E3-sekvensen omfatter én eller flere av følgende: aminosyrerest L29 i CDRH1, 150 i CDRH2, W101 i CDRH3 og/eller A103 i CDRH3, og/eller aminosyrerest S28 i CDRL1, N32 i CDRL1, T51 i CDRL2, 91E i CDRL3 og/eller H92 i CDRL3, idet det vil forstås at utførelsesformer som består av en aminosyresekvens som er identisk med en aminosyresekvens i det monoklonale museantistoff 911 spesifikt er ekskludert.

Som det fremgår gjennom hele denne beskrivelsen så benyttes et sekvensielt aminosyrenummereringsskjema for henvisning til aminosyrerester i de variable områdene (dvs. at aminosyrerestene i hvert variabelt område er nummerert i sekvens). Som velkjent innen faget er Kabat- og/eller Chothia-nummereringssystemet anvendbart for sammenligning av to antistoffer eller polypeptider, slik som et E3-antistoff og en E3-variant (eller et polypeptid som mistenkes for å være en E3-variant). Det er godt forstått innen faget hvordan sekvensiell nummerering kan overføres til Chothia- og/eller Kabat-nummerering om ønskelig, for eksempel for anvendelse ved sammenligninger mellom E3 og et annet polypeptid. Figur 23 viser de variable områdene i E3, nummerert ved anvendelse av sekvensiell nummerering, Chothia-nummerering og Kabat-nummerering. I tillegg, for å lette sammenligningen er det vanligvis forstått at rammeverks aminosyrerester i sin alminnelighet, men ikke alltid, har omtrent det samme antall rester. CDR kan imidlertid variere i størrelse (dvs. at det er mulig å ha insersjon og/eller delesjon av én eller flere aminosyrerester). Ved sammenligning av et E3-antistoff og en E3-variant kandidat (for eksempel som i tilfellet av et CDR-område fra en kandidatsekvens som er lenger i sekvensen i antistoff E3, med hvilken den er sammenstilt), kan man følge de følgende trinn (selv om andre fremgangsmåter er kjente innen faget): kandidat antistoffsekvensen sammenstilles med de tungkjede- og lettkjede variable områdene fra antistoff E3. Sammenstillingen kan gjøres for hånd eller ved hjelp av datamaskiner som benytter alminnelig aksepterte datamaskinprogrammer. Sammenstillingen kan lettes ved å anvende noen aminosyrerester som er felles for de fleste Fab-sekvenser. For eksempel har både lettkjeden og tungkjeden typisk to cysteiner, som ofte foreligger i en konservert posisjon. Det vil forstås at aminosyresekvensen til en antistoff-variantkandidat kan være lengre (dvs. ha innsatte aminosyrerester) eller kortere (ha deleterte aminosyrerester). Suffikser kan adderes til aminosyrerestnummeret for å angi insersjon av ytterligere aminosyrerester, f. eks. aminosyrerest 34 abc. For kandidatsekvenser som, for eksempel, sammenstilles med en E3-sekvens for f. eks. aminosyrerest 33 og 35, men som ikke har noen aminosyrerest mellom dem som kan sammenstilles med aminosyrerest 35, tilordnes rett og slett ikke aminosyrerest 35 til noen aminosyrerest. I en annen tilnærming er det vanligvis velkjent at sammenligninger kan gjøres mellom strukturelt ekvivalente (f.eks. samme posisjon i antigen-antistoffkomplekset) aminosyrer ved sammenligning av CDR av forskjellige lengder. For eksempel plasserer Chothia-nummereringen (Al-Lazikani et al, supra) vanligvis (men ikke alltid) insersjoner og delesjoner i de strukturelt korrekte posisjoner. Strukturell ekvivalens kan også utledes eller påvises ved anvendelse av røntgen krystallografi eller syklus-analyse av dobbeltmutanter (se Pons et al. (1999) Prot. Sei. 8:958-968).

Bindingsaffiniteten for et anti-NGF-antistoff til NGF (slik som hNGF) kan være fra omtrent 0,10 til omtrent 0,80 nM, fra omtrent 0,15 til omtrent 0,75 nM og fra omtrent 0,18 til omtrent 0,72 nM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 2 pM, omtrent 5 pM, omtrent 10 pM, omtrent 15 pM, omtrent 20 pM, omtrent 40 pM eller høyere enn omtrent 40 pM. I én utførelsesform er bindingsaffiniteten på mellom omtrent 2 pM og 22 pM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten lavere enn omtrent 10 nM, omtrent 5 nM, omtrent 4 nM, omtrent 3,5 nM, omtrent 3 nM, omtrent 2,5 nM, omtrent 2 nM, omtrent 1,5 nM, omtrent 1 nM, omtrent 900 pM, omtrent 800 pM, omtrent 700 pM, omtrent 600 pM, omtrent 500 pM, omtrent 400 pM, omtrent 300 pM, omtrent 200 pM, omtrent 150 pM, omtrent 100 pM, omtrent 90 pM, omtrent 80 pM, omtrent 70 pM, omtrent 60 pM, omtrent 50 pM, omtrent 40 pM, omtrent 30 pM eller omtrent 10 pM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 10 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten mindre enn omtrent 10 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 0,1 nM eller omtrent 0,07 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten lavere enn omtrent 0,1 nM eller lavere enn omtrent 0,07 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten hvilken som helst av fra omtrent 10 nM, omtrent 5 nM, omtrent 4 nM, omtrent 3,5 nM, omtrent 3 nM, omtrent 2,5 nM, omtrent 2 nM, omtrent 1,5 nM, omtrent 1 nM, omtrent 900 pM, omtrent 800 pM, omtrent 700 pM, omtrent 600 pM, omtrent 500 pM, omtrent 400 pM, omtrent 300 pM, omtrent 200 pM, omtrent 150 pM, omtrent 100 pM, omtrent 90 pM, omtrent 80 pM, omtrent 70 pM, omtrent 60 pM, omtrent 50 pM, omtrent 40 pM, omtrent 30 pM eller omtrent 10 pM til hvilken som helst av omtrent 2 pM, omtrent 5 pM, omtrent 10 pM, omtrent 15 pM, omtrent 20 pM eller omtrent 40 pM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten hvilken som helst av omtrent 10 nM, omtrent 5 nM, omtrent 4 nM, tilænrmet 3,5 nM, omtrent 3 nM, omtrent 2,5 nM, omtrent 2 nM, omtrent 1,5 nM, omtrent 1 nM, omtrent 900 pM, omtrent 800 pM, omtrent 700 pM, omtrent 600 pM, omtrent 500 pM, omtrent 400 pM, omtrent 300 pM, omtrent 200 pM, omtrent 150 pM, omtrent 100 pM, omtrent 90 pM, omtrent 80 pM, omtrent 70 pM, omtrent 60 pM, omtrent 50 pM, omtrent 40 pM, omtrent 30 pM og omtrent 10 pM. I ytterligere andre utførelsesformer er bindings-affiniteten omtrent 2 pM, omtrent 5 pM, omtrent 10 pM, omtrent 15 pM, omtrent 20 pM, omtrent 40 pM eller høyere enn omtrent 40 pM.

Antistoffets bindingsaffinitet ovenfor NGF kan bestemmes ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente innen faget. En måte å bestemme antistoffets bindingsaffinitet ovenfor NGF på er ved å måle affiniteten av monofunksjonelle Fab-fragmenter av antistoffet, som beskrevet i eksemplene. For å få monofunksjonelle Fab-fragmenter kan et antistoff (slik som IgG) kløyves med papain eller uttrykkes rekombinant. Affiniteten av et anti-NGF-Fab-fragment av et antistoff kan bestemmes ved overflate plasmonressonans (BIAcore 3000 overflate plasmonressonans (SPR)-system, BIAcore, INC, Piscaway NJ) som beskrevet i eksemplene. Denne fremgangsmåten er egnet for anvendelse ved bestemmelse av bindingsaffiniteten til et antistoff ovenfor NGF fra enhver art, innbefattet humant NGF, NGF fra et annet virveldyr (i noen utførelsesformer pattedyr) (slik som muse-NGF, rotte-NGF, primat-NGF), så vel som for bruk med andre neurotrofiner, for eksempel de beslektede neurotrofinene NT3, NT4/5 og/eller BDNF.

I noen utførelsesformer kan antistoffene eller peptidene ifølge oppfinnelsen inhibere (redusere og/eller blokkere) humant NGF-avhengig overlevelse av de trigeminale muse- neuronene E13.5 med en IC50 (i nærvær av omtrent 15 pM NGF) på hvilken som helst av omtrent 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM eller lavere. I noen utførelsesformer kan antistoffene eller peptidene ifølge oppfinnelsen inhibere (redusere og/eller blokkere) humant NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 (i nærvær av omtrent 1,5 pM NGF) på hvilken som helst av omtrent 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM eller lavere. I noen utførelses-former kan antistoffene eller peptidene ifølge oppfinnelsen inhibere (redusere og/eller blokkere) rotte-NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 (i nærvær av omtrent 15 pM NGF) på hvilken som helst av omtrent 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM eller lavere. I noen utførelses-former kan antistoffene eller peptidene ifølge oppfinnelsen inhibere (redusere og/eller blokkere) rotte-NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 (i nærvær av omtrent 1,5 pM NGF) på hvilken som helst av omtrent 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM eller lavere. Fremgangsmåter for måling av NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13 er kjente innen faget og beskrives for eksempel i Eksempel 2.

Beskrivelsen omtaler også fremgangsmåter for fremstilling av hvilke som helst av disse antistoffene eller polypeptidene. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelsen kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innen faget, av hvilke noen er illustrert i eksemplene. Polypeptidene kan fremstilles ved proteolyttisk eller annen form for degradering av antistoffene, ved rekombinante fremgangsmåter (dvs. enkle eller fusjonspolypeptider) som beskrevet ovenfor eller ved kjemisk syntese. Polypeptider fra antistoffer, særlig kortere polypeptider med opp til 50 aminosyrer, kan enkelt fremstilles ved kjemisk syntese. Fremgangsmåter for kjemisk syntese er kjente innen faget og er kommersielt tilgjengelige. For eksempel kan et E3-antistoff fremstilles med et automatisert polypeptidsyntese instrument som benytter fastfase-fremgangsmåten. Se også U.S. patentskrift nr. 5 807 715, 4816 567 og 6 331 415. Kimere antistoffer eller hybrid antistoffer kan også fremstilles in vitro ved anvendelse av kjente fremgangsmåter innen syntetisk proteinkjemi, innbefattet fremgangsmåter som omfatter kryssbindingsmidler. For eksempel kan immuntoksiner fremstilles ved anvendelse av en disulfid utbytningsreaksjon eller ved dannelse av en tioeterbinding. Eksempler på egnede reagenser for dette formål omfatter iminotiolat og metyl-4-merkaptobutyrimidat.

I et annet alternativ kan antistoffene fremstilles rekombinant ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente innen faget. I én utførelsesform klones et polynukleotid som omfatter en sekvens som koder for lettkjedens variable områder i antistoff E3 (vist i figurene IA og IB) inn i en vektor for ekspresjon eller oppformering i en vertscelle (slik som CHO-celler). I en annen utførelsesform klones polynukleotidsekvensene som er vist i figurene 2 og 3 inn i én eller flere vektorer for ekspresjon eller oppformering. Sekvensen som koder for antistoffet av interesse kan opprettholdes i en vektor i en vertscelle, og vertscellen kan så ekspanderes og nedfryses for fremtidig anvendelse. Vektorer (innbefattet ekspresjonsvektorer) og vertsceller beskrives videre her. Fremgangsmåter for rekombinant ekspresjon av antistoffer i planter eller melk er beskrevet. Se for eksempel Peeters et a.

(2001) Vaccine 19:2756, Lonberg, N. og D. Huszar (1995) Int. Rev. Immunol 13:65 og Pollock et al. (1999) j Immunol Methods 231:147. Fremgangsmåter for fremstilling av derivater av antistoffer, f. eks. humaniserte antistoffer, enkeltkjede antistoffer osv., er kjente innen faget. Oppfinnelsen omfatter også enkeltkjede fragmenter av variable områder ("scFv") fra antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, slik som E3. Enkeltkjede fragmenter av det variable området fremstilles ved å sammenkoble lettkjede- og/eller tungkjede variable områder ved anvendelse av et kort linkerpeptid. Bird et al. (1988) Science 242:423-426). Et eksempel på et linkerpeptid er (GGGGS)3(SEKV. ID. NR. 15), som danner en omtrent 3,5 nM lang bro mellom karboksyenden av ett variabelt område og aminoenden av det andre variable området. Linkere med andre sekvenser har blitt utformet og anvendt (Bird et al. (1988)). Linkere kan i sin tur være modifisert for ytterligere funksjoner, slik som feste av legemidler eller feste til faste bærere. Enkeltkjede variantene kan enten fremstilles rekombinant eller syntetisk. For syntetisk fremstilling av scFv kan et automatisert syntese-instrument anvendes. For rekombinant fremstilling av scFv kan et egnet plasmid som inneholder polynukleotide som koder for det angjeldende scFv innføres i en egnet vertscelle, enten eukaryot, slik som gjær, planteceller, insektceller eller pattedyrceller, eller prokaryot slik som E. coli. Polynukleotider som koder for det angjeldende scFv kan fremstilles ved rutinemessige manipulasjoner, slik som ligering av polynukleotider. Det resulterende scFv kan isoleres ved anvendelse av standard teknikker for proteinrensing som er kjente innen faget. Andre former for enkeltkjede antistoffer, for eksempel diastoffer, omfattes også. Diastoffer er bivalente, bispesifikke antistoffer hvor VH- og VL-domener uttrykkes i en enkelt polypeptidkjede, men hvor det anvendes en linker som er for kort til å tillate parring mellom de to domenene i samme kjede, for derved å tvinge domenene til å parres med komplementære domener i en annen kjede og skape to antigenbindende seter (se for eksempel Holliger, P. et al. (1993) Proe. Nati. Acad Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123). Antistoffet kan være et bispesifikt antistoff, et monoklonalt antistoff som har bindingsspesifisitet for minst to forskjellige antigener. Et bispesifikt antistoff kan fremstilles ved anvendelse av antistoffene som beskrevet her. Fremgangsmåter for fremstilling av bispesifikke antistoffer er kjente innen faget (se for eksempel Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210). Tradisjonelt bygge rekombinant fremstilling av bispesifikke antistoffer på samtidig ekspresjon av to immunglobulin-tunkjede-lettkjede par, hvor de to tungkjedene hadde forskjellig spesifisitet (Millstein og Cuello, 1983, Nature 305, 537-539). Ifølge én tilnærming for fremstilling av bispesifikke antistoffer fusjoneres variable antistoffdomener med den ønskede bindingsspesifisitet (antistoff-antigenbindingsseter) til konstant domenesekvenser fra et immunglobulin. Fusjonen skjer fortrinnsvis med et tungkjede konstant domene fra et immunglobulin som omfatter i det minste en del av hengselområdet, CH2-området og CH3-området. Det foretrekkes å ha det første tungkjede konstant område (CH1), som inneholder setet som er nødvendig for binding av lettkjeden, til stede i minst én av fusjonene. DNA som koder for immunglobulin tungkjede-fusjonene og, om ønskelig, immunglobulinets lettkjede innføres i separete ekspresjonsvektorer og kotransfekteres inn i en egnet vertsorganisme. Dette gir stor fleksibilitet når det gjelder justering av mengdeforholdet mellom de tre polypeptidfragmentene i utførelsesformer hvor ulike mengder av de tre polypeptidkjedene som anvendes i konstruksjonen vil gi optimalt utbytte. Det er imidlertid mulig å innføre de kodende sekvensene for to eller alle tre polypeptidkjedene i én ekspresjonsvektor når ekspresjon av minst to polypeptidkjeder i samme mengde fører til høyt utbytte, eller når ratioen ikke er av spesiell betydning. I en tilnærming består de bispesifikke antistoffene av en hybrid immunglobulin-2-kjede med en første bindingsspesifisitet i én arm og et hybrid immunglobulin-tungkjede-lettkjede par (som tilveiebringer en andre bindingsspesifisitet) i den andre armen. Denne asymmetriske strukturen med en immunglobulin-lettkjede i bare én halvpart av det bispesifikke molekylet letter separasjon av den ønskede, bispesifikke forbindelsen fra unøskede immunglobulinkjede kombinasjoner. Denne tilnærmingen er beskrevet i PCT-patentskrift WO 94/04690, publisert 3. mars, 1994. Heterokonjugat antistoffer som omfatter to kovalent sammenbundne antistoffer ligger også innenfor oppfinnelsens område. Slike antistoffer har blitt anvendt for styring av immunsystemceller til uønskede celler (U.S. patentskrift nr. 4 676 980) og for behandling av HIV-infeksjon (PCT-patentsøknad WO 91/00360 og WO 92/200373, EP 03089). Heterokonjugat antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av hvilke som helst egnede kryss-bindings-fremgangsmåter. Egnede kryssbindingsmidler og teknikker er velkjente innen faget og er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4 676 980. Antistoffet kan for eksempel være et humanisert antistoff, som kjent innen faget og som beskrevet her. Antistoffer kan være modifiserte som beskrevet i PCT-patentskrift WO 99/58572, publisert 18. november, 1999. Disse antistoffene omfatter i tillegg til et bindingsdomene rettet mot målmolekylet et effektordomene med en aminosyresekvens som i det vesentlige er homolog med hele eller en del av et konstant domene fra tungkjeden fra et humant immunglobulin. Disse antistoffene kan binde målmolekylet uten å utløse signifikant komplementavhengig lysis eller cellemediert ødeleggelse av målet. Effektordomenet er fortrinnsvis i stand til spesifikt å binde FcRn og/eller FcyRIIB. Disse er typisk basert på kimere domener avledet fra to eller flere CH2-domener fra tungkjeden i humane immunglobuliner. Antistoffer som er modifisert på denne måten foretrekkes for anvendelse ved kronisk antistoffterapi, for å unngå inflammatoriske og andre uønskede reaksjoner på konvensjonell antistoffterapi. Oppfinnelsen omfatter modifikasjoner av antistoff E3, innbefattet funksjonelt ekvivalente antistoffer som ikke i vesentlig grad har endrede egenskaper og varianter som har forhøyet eller redusert aktivitet. Modifikasjon av polypeptider er rutinemessig innen faget og ytterligere eksempler gis i eksemplene. Eksempler på modifiserte polypeptider omfatter polypeptider med substitusjoner (innbefattet konservative substitusjoner) av aminosyrerester eller én eller flere delesjoner eller addisjoner av aminosyrerester som ikke i vesentlig grad har uheldig virkning på den funksjonelle aktivitet, eller anvendelse av kjemiske analoger. En polypeptid-"variant" som anvendt her er et polypeptid som avviker fra et utgangsprotein ved én eller flere substitusjoner, delesjoner, addisjoner og/eller insersjoner, slik at polypeptidets immunreaktivitet ikke i vesentlig grad er redusert. Med andre ord kan en variants evne til spesifikt å binde antigen være forhøyet eller uendret relativt til det native protein, eller den kan være redusert med mindre enn 50 %, fortrinnsvis mindre enn 20 %, relativt til det native protein. Polypeptidvarianter viser fortrinnsvis minst omtrent 80 %, mer foretrukket minst omtrent 90 % og mest foretrukket omtrent 95 % identitet (bestemt som beskrevet her) med de identifiserte polypeptider. Aminosyresekvensvarianter av antistoffene kan fremstilles ved å innføre egnede nukleotidendringer i antistoff-DNA eller ved peptidsyntese. Slike varianter omfatter for eksempel delesjoner fra og/eller insersjoner i og/eller substitusjoner av aminosyrerester i aminosyresekvensene ifølge SEKV. ID. NR. 1 eller 2 som beskrevet her. Enhver kombinasjon av delesjoner, insersjoner og substitusjoner innføres for å nå fram til den endelige konstruksjon, forutsatt at den endelige konstruksjonen innehar de ønskede egenskaper. Aminosyre endringene kan også endre posttranslasjonelle prosesser i antistoffet, slik som endring av antallet eller posisjonen til glykosyleringsseter. En nyttig fremgangsmåte for påvisning av visse aminosyrerester eller områder i antistoffet som er foretrukne seter for mutagenese eller modifikasjon betegnes "alanin-skanning mutagenese" og beskrives av Cunningham og Wells, 1989, Science, 244:1081-1085. En aminosyrerest eller en gruppe med målaminosyrerester påvises (f. eks. ladede aminosyrerester som arg, asp, his, lys og glu) og erstattes med en nøytral eller negativt ladet aminosyre (mest foretrukket alanin eller polyalanin) for å påvirke interaksjonen av aminosyrene med antigen. De aminosyre steder som viser funksjonell følsomhet ovenfor substitusjonene foredles så ved å innføre ytterligere eller andre varianter ved eller på setene for substitusjonen. Selv om setet for innføring av en aminosyre-sekvensvariasjon er bestemt på forhånd, så behøver ikke mutasjonens natur i seg selv bestemmes på forhånd. For for eksempel å analysere virkningen av en mutasjon i et gitt sete utføres alanin-skanning eller tilfeldig mutagenese i målkodonet eller -området, og de uttrykte antistoff-variantene analyseres for den ønskede aktiviteten. Bibliotekskannings mutagenese som beskrevet her kan også anvendes for å påvise seter i et antistoff som er egnede for mutagenese eller modifikasjon. Aminosyresekvens insersjoner omfatter amino- og/eller karboksylterminale fusjoner som varierer i lengde fra en aminosyrerest til polypeptider som omfatter 100 eller flere aminosyrerester, så vel som insersjoner i sekvensen av enkeltvise eller flere aminosyrerester. Eksempler på terminale insersjoner omfatter et antistoff med en N-terminal metionylrest eller antistoffet fusjonert til en epitop tag. Andre insersjonsvarianter av antistoff molekylet omfatter fusjon av antistoffets N- eller C-ende til et enzym eller et polypeptid som forlenger antistoffets halveringstid i serum. I substitusjonsvarianter er minst én aminosyrerest i antistoff molekylet fjernet og en annen aminosyrerest innsatt i dens sted. Setene av høyest interesse for substitusjons-mutagenese omfatter de hypervariable områdene, men FR-endringer omfattes også. Konservative substitusjoner er vist i Tabell 1 under overskriften "konservative substitusjoner". Dersom slike substitusjoner fører til endret biologisk aktivitet kan mer omfattende endringer, betegnet "eksempler på substitusjoner" i Tabell 1, eller som beskrevet videre nedenfor med henvisning til aminosyreklasser innføres og produktene analyseres. Vesentlige endringer i de biologiske egenskapene til antistoffet oppnås ved å velge substitusjoner som avviker signifikant i sin virkning på opprettholdelse av (a) polypeptid ryggraden i området for substitusjonen, for eksempel som en plate- eller heliks-konformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten til molekylet i målsetet, eller (c) omfanget av sidekjeden. Naturlig forekommende aminosyrerester kan oppdeles i grupper basert på felles sidekjede egenskaper: (1) Hydrofobe: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) Nøytrale hydrofiler: Cys, Ser, Thr; (3) Sure: Asp, Glu; (4) Basiske: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

(5) Aminosyrerester som påvirker kjedeorienteringen: Gly, Pro; og

(6) Aromatiske: Trp, Tyr, Phe.

Ikke konservative substitusjoner innføres ved å bytte ut et medlem av én av disse klassene med en annen klasse.

Enhver cysteinrest som ikke deltar i opprettholdelse av antistoffets korrekte konformasjon kan også substitueres, generelt med serin, for å forbedre molekylets oksidative stabilitet og forhindre avvikende kryssbinding. Omvendt kan én eller flere cysteinbindinger innføres i antistoffet for å forbedre stabiliteten, særlig dersom antistoffet er et antistoffragment, for eksempel et Fv-fragment.

Aminosyremodifikasjoner kan variere fra endring eller modifisering av én eller flere aminosyrer til fullstendig omforming av et område, slik som et variabelt område. Endringer i det variable området kan endre bindingsaffinitet og/eller spesifisitet. I noen utførelses-former innføres ikke mer enn fra én til fem konservative aminosyresubstitusjoner i et CDR-område. I andre utførelsesformer innføres ikke mer enn fra én til tre konservative aminosyresubstitusjoner i et CDR3-domene. I ytterligere andre utførelsesformer er CDR-domenet CDRH3 og/eller CDR L3.

Modifikasjoner omfatter også glykosylerte og ikke-glykosylerte polypeptider, så vel som polypeptider med andre posttranslasjonelle modifikasjoner, slik som, for eksempel glykosylering med forskjellige sukkere, acetylering og fosforylering. Antistoffer er glykosylerte i konserverte posisjoner i de konstante områder (Jeffris og Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright og Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Oligosakkarid sidekjedene i immunglobulinene påvirker proteinets funksjon (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe og Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) og den intramolekylære interaksjon mellom deler av glykoproteinet, som kan påvirke konformasjonen og den presenterte tredimensjonale overflaten til glykoproteinet (Hefferis og Lund, supra; Wyss og Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Oligosakkarider kan også bidra til å målrette et gitt glykoprotein til visse molekyler basert på spesifikke gjenkjenningsstrukturer. Glykosylering av antistoffer har også blitt rapportert å påvirke antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Nærmere bestemt ble CHO-celler med tetrasyklinregulert ekspresjon av P(l,4)-N-acetylglukosaminyltransferase III (GnTIII), en glykosyltransferase som katalyserer dannelsen av halvert GIcNAc, rapportert å ha forbedret ADCC-aktivitet (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).

Glykosylering av antistoffer er typisk enten N-bundet eller O-bundet. N-bundet viser til bindingen av ka rbohyd raten heten til sidekjeden i en asparaginrest. Tripeptid-sekvensene asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin, hvor X er hvilken som helst aminosyre bortsett fra prolin, er gjenkjenningssekvensene for enzymatisk binding av karbohydrat-enheten til asparagin sidekjeden. Således skaper tilstedeværelse av en av disse tripeptid-sekvensene i et polypeptid et mulig glykosyleringssete. O-bundet glykosylering viser til bindingen av én av sukkerne N-acetylgalaktosamin, galaktose eller xylose til en hydroksy-aminosyre, vanligvis serin eller treonin, selv om 5-hydroksyprolin eller 5-hydroksylysin også kan anvendes.

Innføring av glykosyleringsseter i antistoffet oppnås hensiktsmessig ved å endre aminosyre-sekvensen slik at den inneholder én eller flere av de ovenfor nevnte tripeptid-sekvensene (for N-bunden glykosyleringsseter). Endringen kan også gjøres ved addering, eller substituering av én eller flere serin- eller treoninrester i sekvensen av det opprinnelige antistoffet (for O-koblede glykosyleringsseter).

Glykosyleringsmønsteret til antistoffer kan også endres uten å endre den under-liggende nukleotidsekvens. Glykosylering avhenger hovedsakelig av vertscellen som anvendes for ekspresjon av antistoffet. Siden celletypen som anvendes for ekspresjon av rekombinante glykoproteiner, f. eks. antistoffer, som mulige terapeutiske midler sjelden er den native cellen, kan variasjoner i glykosyleringsmønsteret til antistoffene forventes (se f. eks. Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).

I tillegg til valget av vertsceller inkluderer faktorer som påvirker glykosylering under rekombinant fremstilling av antistoffer vekstmodus, medie-formulering, dyrknings-tetthet, oksygenering, pH, rensingsskjemaer og lignende. Forskjellige fremgangsmåter har blitt foreslått for å endre glykosyleringsmønsteret som oppnås i en bestemt vertsorganisme, innbefattet innføring eller overekspresjon av visse enzymer som er involvert i oligosakkarid-dannelsen (U.S. patentskrifter nr. 5 047 335, 5 510 261 og 5 278 299). Glykosylering eller visse former for glykosylering kan fjernes enzymatisk fra glykoproteinet, for eksempel ved anvendelse av endoglykosidase H (Endo H). I tillegg kan den rekombinante vertscellen være genmodifisert slik at den er defekt i å prosessere visse typer av polysakkarider. Disse og lignende teknikker er velkjente innen faget.

Andre fremgangsmåter for modifisering omfatter anvendelse av koblingsteknikker som er kjente innen faget, innbefattet enzymatiske midler, oksidativ substitusjon og chelatering. Modifikasjoner kan anvendes for eksempel for binding av markører for immunanalyse. Modifiserte E3-polypeptider fremstilles ved anvendelse av etablerte prosedyrer innen faget og kan screenes ved anvendelse av standard analyser som er kjent innen faget, av hvilke noen beskrives nedenfor og i eksemplene.

Andre antistoff modifikasjoner omfatter antistoffer som er modifisert som beskrevet i PCT-patentskrift WO 99/58572, publisert 18. november 1999. Disse antistoffene omfatter i tillegg til et bindingsdomene rettet mot målmolekylet et effektordomene som har en aminosyresekvens som i det vesentlige er homolog med hele eller en del av et konstant domene fra en humant immunglobulins tungkjede. Disse antistoffene er i stand til å binde målmolekylet uten å utløse signifikant komplementavhengig lysis eller cellemediert ødeleggelse av målet. I noen utførelsesformer er effektordomenet i stand til spesifikt å binde FcRn og/eller FcyRIIb. Disse er typisk basert på kimere domener avledet fra to eller flere CH2-domener fra tungkjeden i humant immunglobulin. Antistoffer som er modifiserte på denne måten er spesielt godt egnet for anvendelse i kronisk antistoff terapi, for å unngå inflammatoriske og andre uønskede reaksjoner på konvensjonell antistoff terapi.

Oppfinnelsen omfatter også fusjonsproteiner som omfatter ett eller flere fragmenter eller områder fra antistoffene (slik som E3) eller polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. I én utførelsesform tilveiebringes et fusjonspolypeptid som omfatter minst 10 sammenhengende aminosyrer fra lettkjedens variable område som er vist i Figur IB og/eller minst 10 aminosyrer fra tungkjedens variable område som er vist i Figur IA. I en annen utførelsesform omfatter fusjonspolypeptidet et lettkjede variabelt område og/eller tungkjede variabelt område fra E3, som vist i Figurene IA og IB. I en annen utførelsesform omfatter fusjonspolypeptidet én eller flere CDR fra E3. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter fusjonspolypeptidet CDR H3 og/eller CDR L3 fra antistoff E3. I en annen utførelsesform omfatter fusjonspolypeptidet én eller flere av: aminosyrerest L29 i CDRH1, 150 i CDRH2, W101 i CDRH3 og/eller A103 i CDRH3, og/eller aminosyrerest S28 i CDRL1, N32 i CDRL1, T51 i CDRL2, 91E i CDRL3 og/eller H92 i CDRL3. For formålet til foreliggende oppfinnelse inneholder et E3-fusjonsprotein ett eller flere E3-antistoffer og en annen aminosyresekvens som det ikke er bundet til i det native molekyl, for eksempel en heterolog sekvens eller en homolog sekvens fra et annet område. Eksempler på heterologe sekvenser omfatter en "tag", for eksempel en FLAG-tag eller en 6His-tag. Tagger er velkjente innen faget.

Et E3-fusjonspolypeptid kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innen faget, for eksempel syntetisk eller rekombinant. Typisk fremstilles E3-fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse ved å fremstille og uttrykke et polynukleotid som koder for dem ved anvendelse av rekombinante fremgangsmåter som beskrevet her, selv om de også kan fremstilles ved andre midler som er kjente innen faget, innbefattet for eksempel kjemisk syntese.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også preparater som omfatter E3-antistoffer eller -polypeptider som er konjugert (for eksempel koblet) til et middel som letter kobling til et fast bærer (slik som biotin eller avidin). For enkelthets skyld vil det generelt henvises til E3 eller antistoffer, den den forståelse at disse fremgangsmåtene gjelder for hvilke som helst av de NGF-bindende utførelsesformer som er beskrevet her. Konjugasjon referer vanligvis til sammenkobling av disse bestanddelene som beskrevet her. Sammenkoblingen (som vanligvis fikserer disse bestanddelene i nær assosiasjon, i det minste for administrering) kan oppnås på en rekke måter. For eksempel er en direkte reaksjon mellom et middel og et antistoff mulig når hver besitter en substituent som er istand til å reagere med den andre. For eksempel kan en nukleofil gruppe, slik som en aminogruppe eller sulfhydrylgruppe, på én være istand til å reagere med en karbonylholdig gruppe, slik som et anhydrid eller syrehalid, eller med en alkylgruppe som inneholder en god forlatende gruppe (f. eks. et halid) på den andre.

Et antistoff eller polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan kobles til et markørmiddel (alternativt betegnet "markør"), slik som et fluorescerende molekyl, et radioaktivt molekyl eller andre markører som er kjente innen faget. Markører som generelt gir (enten direkte eller indirekte) et signal er kjente innen faget. Oppfinnelsen omfatter følgelig merkede antistoffer og polypeptider.

Evnen til antistoffene og polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse slik som binding til NGF, redusering eller inhibering av en biologisk aktivitet forbundet med NGF og redusering og/eller blokkering av NGF-indusert overlevelse av de trigeminale muse-neuronene E13.5, kan testes ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjente innen faget og av hvilke noen er beskrevet i eksemplene.

Oppfinnelsen tilveiebringer også preparter (innbefattet farmasøytiske preparater) og sett som omfatter antistoff E3 og, som denne beskrivelse gjør klart, hvilket som helst av eller alle de antistoffer og/eller polypeptider beskrevet her.

Polynukleotider, vektorer og vertsceller

Beskrivelsen omtaler også isolerte polynukleotider som koder for antistoffene og polypeptidene ifølge oppfinnelsen (innbefattet et antistoff som omfatter de polypeptid-sekvensene i lettkjedens og tungkjedens variable områder som er vist i figurene IA og IB), samt vektorer og vertsceller som omfatter polynukleotidet.

Følgelig omtaler beskrivelsen polynukleotider (eller preparater, innbefattet farma-søytiske preparater) som omfatter polynukleotider som koder for hvilket som helst av følgende: (a) antistoff E3, (b) et fragment eller et område fra antistoff E3, (c) en lettkjede fra antistoff E3 som vist i Figur IB, (d) en tungkjede fra antistoff E3 som vist i Figur IA, (e) ett eller flere variable områder fra en lettkjede og/eller en tungkjede fra antistoff E3, (f) én eller flere CDR (én, to, tre, fire, fem eller seks CDR) fra antistoff E3, vist i Figurene IA og IB, (g) CDR H3 fra tungkjeden i antistoff E3, vist i Figur IA, (h) CDR L3 fra lettkjeden i antistoff E3, vist i Figur IB, (i) tre CDR fra lettkjeden i antistoff E3, vist i Figur IB, (j)tre CDR fra tungkjeden i antistoff E3, vist i Figur IA, (k) tre CDR fra lettkjeden og tre CDR fra tungkjeden i antistoff E3, vist i Figurene IA og IB, eller (I) et antistoff som omfatter hvilke som helst av (b) til (k). I noen utførelsesformer omfatter polynukleotidet enten ett eller begge polynukleotidene som er vist i Figurene 2 og 3.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen et isolert polynukleotid som koder for en E3-lettkjede og som har ATCC depotnummer PTA-4893 eller PTA-4894. I et annet aspekt omtaler beskrivelsen et isolert polynukleotid som koder for en E3-tungkjede og som har ATCC depotnummer PTA-4895. I ytterligere et aspekt omtaler beskrivelsen et isolert polynukleotid som omfatter (a) et variabelt område som kodes i polynukleotider med ATCC depotnummer PTA-4894 og (b) et variabelt område som kodes i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4895. I et annet aspekt omtaler beskrivelsen et isolert polynukleotid som omfatter: (a) én eller flere CDR som kodes i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4894, og/eller (b) én eller flere CDR som kodes i polynukleotidet med ATCC depotnummer PTA-4895.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen polynukleotider som koder for hvilke som helst av antistoffene (innbefattet antistoffragmentene) og polypeptidene som beskrevet her. Polynukleotider kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innen faget.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen preparater (slik som farmasøytiske preparater) som omfatter hvilke som helst av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen. I noen utførelsesformer omfatter preparatet en ekspresjonsvektor som omfatter et polynukleotid som koder for E3-antistoffet som beskrevet her. I andre utførelsesformer omfatter preparatet en ekspresjonsvektor som omfatter et polynukleotid som koder for hvilket som helst av antistoffene eller polypeptidene som beskrevet her. I ytterligere andre utførelses-former omfatter preparatet ett av eller begge polynukleotidene som er vist i Figurene 2 og 3. Ekspresjonsvektorer og administrering av polynukleotid preparater er videre beskrevet her.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen en fremgangsmåte for fremstilling av hvilket som helst av polynukleotidene som beskrevet her.

Polynukleotider som er komplementære til slike sekvenser omfattes også av foreliggende oppfinnelse. Polynukleotider kan være enkelttrådede (kodende eller antisense) eller dobbelttrådede og de kan være DNA- (genomisk, cDNA eller syntetisk) eller RNA-molekyler. RNA-molekyler omfatter HnRNA-molekyler som inneholder introner og som tilsvarer et DNA-molekyl på en én-til-én måte, og mRNA-molekyler som ikke inneholder introner. Ytterligere kodende eller ikke-kodende sekvenser kan, men behøver ikke, foreligge i et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse, og et polynukleotid kan, men behøver ikke være koblet til andre molekyler og/eller støttematerialer.

Polynukleotider kan omfatte en nativ sekvens (dvs. en endogen sekvens som koder for et antistoff eller en del derav) eller de kan omfatte en variant av en slik sekvens. Polynukleotidvarianter inneholder én eller flere substitusjoner, addisjoner, delesjoner og/eller insersjoner slik at immunreaktiviteten til det kodede polypeptid ikke er redusert sammenlignet med et nativt immunreaktivt molekyl. Virkningen på immunreaktiviteten til det kodede polypeptid kan generelt anslås som beskrevet her. Varianter viser fortrinnsvis minst omtrent 70 % identitet, mer foretrukket minst omtrent 80 % identitet og mest foretrukket minst omtrent 90 % identitet med en polynukleotidsekvens som koder for et nativt antistoff eller en del derav.

To polynukleotid- eller polypeptidsekvenser sies å være "identiske" dersom sekvensen av nukleotider eller aminosyrer i de to sekvensene er den samme når sekvensene sammenstilles for maksimal overensstemmelse som beskrevet nedenfor. Sammenligninger mellom to sekvenser utføres typisk ved å sammenligne sekvensene over et sammenligningsvindu for å påvise og sammenligne lokale områder med sekvenslikhet. Et "sammenligningsvindu" som anvendt her viser til et segment med minst omtrent 20 sammenhengende posisjoner, vanligvis fra 30 til omtrent 75, 40 til omtrent 50, innen hvilket en sekvens kan sammenlignes med en referansesekvens med det samme antall sammenhengende posisjoner etter optimal sammenstilling av de to sekvensene.

Optimal sammenstilling av sekvenser for sammenligning kan utføres ved anvendelse av programmet Megalign i Lasergenet-pakket av bioinformatikk programvare (DNASTAR, Inc., Madison, WI) ved anvendelse av standardparametere. Dette programmet omfatter flere sammenstillingsskjemaer som er beskrevet i følgende referanser: Dayhoff, M.O. (1978) A modell of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. I Dayhoff, M.O. (red.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, bind 5, suppl. 3, s. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes, s. 626-645 Methods in Enzymology, bind 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. og Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. og Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N.; Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. og Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. og Lipman, D.J., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:726-730.

Fortrinnsvis bestemmes "prosent sekvensidentitet" ved å sammenligne to optimalt sammenstilte sekvenser over et sammenligningsvindu omfattende minst 20 posisjoner, hvor den del av polynukleotid- eller polypeptidsekvensen som foreligger i sammenligningsvinduet kan omfatte addisjoner eller delesjoner (dvs. gap) som utgjør 20 % eller mindre, vanligvis fra 5 til 15 % eller fra 10 til 12 %, sammenlignet med referansesekvensene (som ikke omfatter addisjoner eller delesjoner) for optimal sammenstilling av de to sekvensene. Prosentandelen beregnes ved å bestemme antall posisjoner i hvilke identiske nukleinsyre-baser eller aminosyrerester foreligger i de to sekvensene, slik at antall identiske posisjoner erholdes, dividere antallet identiske posisjoner med det totale antall posisjoner i referanse-sekvensen (dvs. vindusstørrelsen) og multiplisere resultatene med 100 for å få prosent sekvensidentitet.

Varianter kan også eller alternativt være i det vesentlige homologe med et nativt gen eller en del eller et komplement derav. Slike polynukleotidvarianter kan hybridisere under moderat stringente betingelser til en naturlig forekommende DNA-sekvens som koder for et nativt antistoff (eller en komplementær sekvens).

Egnede "moderat stringente betingelser" omfatter forvask med en løsning inneholdende 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), hybridisering ved 50°C-65°C, 5 x SSC over natten, fulgt av to gangers vask med 65°C i 20 minutter med 2X, 0,5X og 0,2X SSC tilsatt 0,1 % SDS.

Som anvendt her er "svært stringente betingelser" eller "betingelser med høy stringens" betingelser som: (1) benytter lav ionestyrke og høy temperatur for vask, for eksempel 0,015 M natriumklorid/0,0015 M natriumcitrat/0,1 % natriumdodecylsulfat ved 50°C, (2) benytter et denatureringsmiddel, slik som formamid, under hybridiseringen, for eksempel 50 % (vol/vol) formamid med 0,1 % bovint serumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % polyvinylpyrrolidon/50 mM natriumfosfatbuffer med pH 6,5 med 750 mM natriumklorid, 75 mM natriumcitrat ved 42°C, eller (3) benytter 50 % formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCI, 0,075 M natriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 6,8), 0,1 % natriumpyrofosfat, 5 x Denhardts løsning, ultralydbehandlet laksemelke-DNA (50 ^ig/rnl), 0,1 % SDS og 10 % dekstransulfat ved 42°C, med vask ved 42°C i 0,2 x SSC (natriumklorid/natriumcitrat) og 50 % formamid ved 55°C, fulgt av en høystringent vask omfattende 0,1 x SSC tilsatt EDTA ved 55°C. Den erfarne fagperson vil vite hvordan temperatur, ionestyrke osv. kan justeres etter behov for tilpasning til faktorer som probelengde og lignende.

Gjennomsnitts fagfolk vil forstå at som en følge av degenerertheten til den genetiske koden er det mange nukleotidsekvenser som koder for et polypeptid som beskrevet her. Noen av disse polynukleotidene har minimal homologi med nukleotidsekvensen til et nativt gen. Ikke desto mindre omfattes polynukleotider som varierer grunnet forskjeller i kodonbruk spesifikt av foreliggende oppfinnelse. Videre ligger alleler av genene som omfatter polynukleotidsekvensene som tilveiebringes her innenfor foreliggende oppfinnelses område. Alleler er endogene gener som er endret som en følge av én eller flere mutasjoner, slik som delesjoner, addisjoner og/eller substitusjoner av nukleotider. Det resulterende mRNA og protein kan, men behøver ikke ha endret struktur eller funksjon. Alleler kan påvises ved anvendelse av standard teknikker (slik som hybridisering, amplifisering og/eller database sekvenssammenligning).

Polynukleotidene ifølge denne beskrivelsen kan fremskaffes ved anvendelse av kjemisk syntese, rekombinante fremgangsmåter eller PCR. Fremgangsmåter for kjemisk polynukleotidsyntese er velkjente innen faget, og det er unødvendig å beskrive dem i detalj her. En fagperson kan anvende sekvensene som tilveiebringes her og et kommersielt DNA-synteseinstrument for fremstilling av en ønsket DNA-sekvens.

For fremstilling av polynukleotider ved anvendelse av rekombinante fremgangsmåter kan et polynukleotid som omfatter en ønsket sekvens settes inn i en egnet vektor, hvoretter vektoren innføres i en egnet vertscelle for replikasjon og amplifisering som diskutert videre her. Polynukleotider kan innføres i vertsceller ved hvilke som helst midler som er kjente innen faget. Celler transformeres ved å innføre et eksogent polynukleotid ved direkte opptak, endocytose, transfeksjon, F-paring eller elektroporering. Når det eksogene polynukleotid først er innført kan det opprettholdes i cellen som en ikke-integrert vektor (slik som et plasmid) eller integreres i vertscellegenomet. Det således amplifiserte polynukleotid kan isoleres fra vertscellen med fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Se for eksempel Sambrook et al. (1989).

Alternativt tillater PCR reproduksjon av DNA-sekvenser. PCR-teknologi er velkjent innen faget og er beskrevet i U.S. patentskrifter nr. 4 683 195, 4 800 159, 4 754 065 og 4 683 202 så vel som i PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., red., Birkauswer Press, Boston (1994).

RNA kan fremskaffes ved å anvende det isolerte DNA i en egnet vektor og innføre denne i en egnet vertscelle. Når cellen replikeres og DNA transkriberes til RNA kan RNA så isoleres ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente innen faget, for eksempel som beskrevet i Sambrook et al., (1989).

Egnede kloningsvektorer kan konstrueres ifølge standardteknikker, eller de kan velges fra et stort antall kloningsvektorer som er tilgjengelige innen faget. Selv om den valgte kloningsvektor kan variere ut fra den påtenkte vertscelle, vil anvendbare kloningsvektorer generelt ha evnen til å replikere seg selv, de kan besitte et enkelt mål for en gitt restriksjonsendonuklease og/eller bære gener for en markør som kan anvendes for seleksjon av kloner som inneholder vektoren. Egnede eksempler omfatter plasmider og bakterielle virus, f. eks. pUC18, pUC19, Bluescript (slik som pBS SK<+>) og derivater derav, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl, RP4, bakteriofag-DNA og skyttelvektorer som pSA3 og pAT28. Disse og mange andre kloningsvektorer er tilgjengelige fra kommersielle leverandører som BioRAd, Stratagene og Invitrogen.

Ekspresjonsvektorer er vanligvis repliserbare polynukleotid konstruksjoner som inneholder et polynukleotid ifølge oppfinnelsen. En ekspresjonsvektor må implisitt kunne replikeres i vertscellene, enten som episomer eller som en integrert del av det kromosomale DNA. Egnede ekspresjonsvektorer omfatter plasmider, virusvektorer, innbefattet adenovirus, adenoassosiert virus, retrovirus, kosmider og én eller flere ekspresjonsvektorer som er beskrevet i PCT-patentskrift WO 87/04462. Vektorens bestanddeler kan vanligvis omfatte én eller flere av følgende: en signalsekvens, et replikasjonsorigo, ett eller flere markørgener og egnede transkripsjons kontrollelementer (slik som promotere, enhancere og teminatorer). For ekspresjon (dvs. translasjon) er vanligvis ett eller flere translasjons kontrollelementer også nødvendige, slik som ribosombindingsseter, translasjonsinitierings-seter og stoppkodoner.

Vektorene som inneholder polynukleotidene av interesse kan innføres i vertscellen ved hvilken som helst av en rekke egnede midler, innbefattet elektroporering, transfeksjon ved benyttelse av kalsiumklorid, rubidiumklorid, kalsiumfosfat, DEAE-dekstran eller andre forbindelser, mikroprosjektil bombardering, lipofeksjon og infeksjon (f. eks. dersom vektoren er et infeksiøst middel slik som vaccinia-virus). Den valgte måten for innføring av vektorer eller polynukleotider vil ofte avhenge av egenskapene til vertscellen.

Beskrivelsen omtaler også vertsceller som omfatter hvilke som helst av polynukleotidene som beskrevet her. Enhver vertscelle som kan overuttrykke heterologt DNA kan anvendes for det formål å isolere genene som koder for antistoffet, polypeptidet eller proteinet av interesse. Eksempler på pattedyrs vertsceller omfatter COS-celler, HeLa-celler og CHO-celler. Se også PCT-patentskrift WO 87/04462. Egnede vertsceller som ikke stammer fra pattedyr omfatter prokaryoter (slik som E. coli eller B. subtilis) og gjær (slik som S. cerevisiae, S. pombe eller K. lactis). Vertscellene uttrykker fortrinnsvis cDNA i et nivå som er omtrent 5 ganger høyere, mer foretrukket 10 ganger høyere, enda mer foretrukket 20 ganger høyere enn det tilsvarende endogene antistoffet eller proteinet av interesse, dersom dette foreligger i vertscellen. Analyse av vertscellene for spesifikk binding til NGF utføres ved en immunanalyse eller FACS. En celle som overuttrykker antistoffet eller proteinet av interesse kan identifiseres.

Fremgangsmåter som anvender E3 og E3- avledede antistoffer

Antistoff E3 som binder NGF kan anvendes for å identifisere eller påvise nærvær eller fravær av NGF. For enkelthets skyld vil det her vanligvis vises til E3 eller antistoffer, idet det vil forstås at disse fremgangsmåtene kan anvendes for hvilke som helst av de NGF-bindende utførelsesformene (slik som polypeptider) som er beskrevet her. Påvisning omfatter vanligvis å sette en biologisk prøve i forbindelse med et antistoff som beskrevet her som bindes til NGF, fulgt av dannelse av et kompleks mellom NGF og et antistoff (f. eks. E3) som spesifikt bindes til NGF. Dannelsen av et slikt kompleks kan skje in vitro eller in vivo. Begrepet "påvisning" som anvendt her omfatter kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning (måling av nivået), med eller uten sammenligning med en kontroll.

Hvilken som helst av en rekke kjente fremgangsmåter kan anvendes for påvisningen innbefattet immunanalyser, anvendelse av antistoff som bindes til polypeptidet, f. eks. ved enzymkoblet immunadsorbsjonsanalyse (ELISA), radioimmunanalyse (RIA) og lignende, og funksjonelle analyser for det kodede polypeptid, f. eks. bindingsaktivitet eller enzymatisk analyse. I noen utførelsesformer er antistoffet merket på en påvisbar måte.

Diagnostiske anvendelser av E3 og derivater derav

Antistoffer og polypeptider ifølge oppfinnelsen kan anvendes for påvisning, diagnose eller kontroll av en sykdom, tilstand eller forstyrrelse forbundet med endret eller avvikende NGF-ekspresjon (i noen utførelsesformer forhøyet eller redusert NGF-ekspresjon (relativt til en normal prøve) og/eller uønsket ekspresjon, slik som forekomst av ekspresjon i ett eller flere vev og/eller celler som normalt mangler NGF-ekspresjon, eller fravær av NGF-ekspresjon i ett eller flere vev eller celler som normalt har NGF-ekspresjon). Antistoffene og polypeptidene ifølge oppfinnelsen er videre nyttige for påvisning av NGF-ekspresjon, for eksempel i en sykdom forbundet med endret eller avvikende følsomhet eller responsivitet ovenfor NGF. I noen utførelsesformer påvises NGF-ekspresjon i en prøve fra et individ som mistenkes for å ha en sykdom eller forstyrrelse som omfatter eller er forbundet med endret eller avvikende følsomhet eller responsivitet ovenfor NGF-ekspresjon (f. eks. en kreftform hvor NGF fremmer vekst og/eller metastase).

I noen utførelsesformer omtaler således beskrivelsen fremgangsmåter som omfatter å sette en prøve (et uttak) fra et individ som mistenkes for å ha endret eller avvikende NGF-ekspresjon i kontakt med et antistoff eller polypeptid ifølge oppfinnelsen, og fastslå hvorvidt NGF-nivået avviker fra nivået i en kontroll- eller en sammenligningsprøve. I noen utførelsesformer har individet hjertearrytmi, Alzheimers sykdom og/eller autonom dysfunksjon.

I andre utførelsesformer omtaler beskrivelsen fremgangsmåter som omfatter å sette en prøve (et uttak) fra et individ i kontakt med et antistoff eller polypeptid ifølge oppfinnelsen og bestemme nivået av NGF-ekspresjon. I noen utførelsesformer mistenkes individet for å ha en sykdom eller forstyrrelse som omfatter eller er forbundet med endret eller avvikende følsomhet eller responsivitet ovenfor NGF-ekspresjon. I noen utførelses-former har individet småcellet lungekreft, brystkreft, bukspyttkjertelkreft, prostatakreft, ovariekarsinom, hepatocellulært karsinom eller melanom.

For diagnostiske anvendelser vil antistoffet typisk være merket med en påvisbar enhet, innbefattet radioaktive isotoper, fluorescerende markører og forskjellige enzym-substratmarkører. Fremgangsmåter for konjugering av markører til et antistoff er kjente innen faget. I andre utførelsesformer av oppfinnelsen må antistoffene ifølge oppfinnelsen ikke være merkede, og nærvær av dem kan påvises ved anvendelse av et merket antistoff som bindes til antistoffene ifølge oppfinnelsen.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes i enhver kjent analyse-fremgangsmåte, slik som kompetitive bindingsanalyser, direkte eller indirekte "sandwich"-analyser og immunutfellings analyser. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, s. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Antistoffene kan også anvendes for diagnostiske analyser in vivo, slik som ved in wVo-billeddannelse. Vanligvis er antistoffet merket med en radioaktiv isotop (slik som mIn, "Tc,<1>4C,131I,<125>I eller 3H), slik at cellene eller vevet av interesse kan lokaliseres ved anvendelse av immunscintiografi.

Antistoffet kan også anvendes som et fargingsreagens innen patologi ved å følge teknikker som er velkjente innen faget.

Fremgangsmåter for anvendelse av E3 og derivater derav for terapeutiske formål

Antistoff E3 er nyttig for reduksjon og/eller blokkering av den biologiske aktivitet til NGF. Denne antagonistiske aktiviteten antas å være nyttig ved behandling av patologiske tilstander forbundet med endogen NGF-produksjon, slik som smerte. I disse utførelses-formene tilføres vanligvis en effektiv mengde til et individ. I ett aspekt tilveiebringer følgelig oppfinnelsen en fremgangsmåte for antagonisering av biologisk aktivitet forbundet med humant NGF ved anvendelse av hvilket som helst av polypeptidene (innbefattet antistoffer som antistoff E3) som beskrevet her.

I én utførelsesform omfatter fremgangsmåten å sette human nervevekstfaktor i forbindelse med hvilket som helst av polypeptidene (innbefattet antistoff E3) som beskrevet her, hvorved human nervevekstfaktoraktivitet antagoniseres, reduseres, blokkeres eller undertrykkes. I nok en utførelsesform behandles et individ med smerte (slik som smerte etter kirurgiske inngrep eller smerte forbundet med reumatoid artritt) med E3.

For enkelthets skyld vil det her vanligvis vises til E3 eller antistoff, idet det vil forstås at disse fremgangsmåtene kan anvendes for hvilke som helst av E3-antistoff-variantene og polypeptidene som beskrevet her.

Forskjellige formuleringer av E3 eller fragmenter av E3 (slik som Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc osv.), slik som enkeltkjedet antistoff (ScFv), mutanter derav, fusjonsproteiner som omfatter en antistoffdel og enhver annen modifisert konfigurasjon av E3 som omfatter et antigen NGF-gjenkjennelsessete med den nødvendige spesifisitet, kan anvendes for administrering. I noen utførelsesformer kan E3-antistoffer eller forskjellige formuleringer av E3 administreres i ren tilstand. I andre utførelsesformer administreres E3 eller forskjellige formuleringer av E3 (innbefattet hvilken som helst preparatutførelsesform som beskrevet her) og en farmasøytisk aksepterbar eksipiens, og disse kan foreligge i forskjellige formuleringer. Farmasøytisk aksepterbare eksipienser er kjente innen faget og er relativt inerte forbindelser som letter administreringen av en farmakologisk effektiv forbindelse. For eksempel kan en eksipiens gi form eller konsistens, eller virke som et fortynningsmiddel. Egnede eksipienser omfatter stabilisatorer, fuktningsmidler og emulsjonsmidler, salter for variering av osmolariteten, innkapslingsmidler, buffere og forbindelser som fremmer penetrasjon av hud. Eksispienser samt formuleringer for parenteral og ikke-parenteral administrering av medikamenter beskrives i Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20. utgave, Mack Publishing (2000).

I noen utførelsesformer er disse midlene utformet for administrering ved injeksjon (f. eks. intraperitoneal, intravenøs, subkutan, intramuskulær osv.), selv om andre former for administrering (f. eks. oral, mukosal, via inhalering, sublingual osv.) også kan anvendes. Følgelig er E3-antistoff og ekvivalenter derav fortrinnsvis kombinert med farmasøytisk aksepterbare bærestoffer som saltvann, Ringers løsning, dekstroseløsning og lignende. Det angjeldende doseringsskjema, dvs. dosering, tidspunkt og gjentagelse, vil avhenge av individet som behandles og dettes medisinske historie. Generelt kan hvilken som helst av følgende doser anvendes: en dose på minst omtrent 50 mg/kg kroppsvekt, minst omtrent 10 mg/kg kroppsvekt, minst omtrent 3 mg/kg kroppsvekt, minst omtrent 1 mg/kg kroppsvekt, minst omtrent 750^g/kg kroppsvekt, minst omtrent 500^g/kg kroppsvekt, minst omtrent 250^ig/kg kroppsvekt, minst omtrent 100^ig/kg kroppsvekt, minst omtrent 50^g/kg kroppsvekt, minst omtrent 10^ig/kg kroppsvekt, minst omtrent 1^ig/kg kroppsvekt eller mindre tilføres. For gjentatt administrering over flere dager eller mer fortsettes behandlingen, avhengig av tilstanden, inntil en ønsket undertrykkelse av sykdomssymptomene opptrer. Et eksempel på et doseringsskjema omfatter administrering av en innledende dose på omtrent 2 mg/kg, fulgt av en ukentlig vedlikeholdsdose på omtrent 1 mg/kg av anti-NGF-antistoffet eller fulgt av en vedlikeholdsdose på omtrent 1 mg/kg annenhver uke. Andre doseringsskjema kan imidlertid også være anvendbare, avhengig av det mønster for farmakokinetisk nedbrytning som utøveren ønsket å oppnås. Empiriske betraktninger, slik som halveringstiden, vil generelt bidra til bestemmelse av dosen. Forløpet av denne behandlingen kan lett følges ved konvensjonelle teknikker og analyser.

I noen individer kan mer enn en dose være nødvendig. Frekvensen av administrering kan bestemmes og justeres i løpet av behandlingen. For eksempel kan frekvensen av administrering bestemmes eller justeres basert på type og omfang av smerten som skal behandles, hvorvidt middelet administreres for forebyggende eller terapeutiske formål, tidligere behandling, pasientens kliniske historie og respons på middelet, og den behandlende leges vurderinger. Typisk vil klinikeren administrere et antagonistisk anti-NGF-antistoff (slik som E3) inntil man når en dose som gir det ønskede resultat. I noen tilfeller kan formuleringer av E3-antistoffer for vedvarende, kontinuerlig frigjøring være egnede. Forskjellige formuleringer og innretninger for å oppnå vedvarende frigjøring er kjente innen faget.

I én utførelsesform kan doser av E3-antistoffer (eller polypeptider) bestemmes empirisk i individer som har blitt gitt én eller flere administreringer. Individer gis økende doser av E3. For å anslå virkningen av E3 eller et ekvivalent antistoff kan markører på sykdomssymptomene (slik som smerte) følges.

Administreringen av et antistoff (slik som E3) eller polypeptid i samsvar med fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse kan være kontinuerlig eller intermitterende, avhengig av for eksempel mottagerens fysiologiske tilstand, hvorvidt formålet med administreringen er terapeutisk eller profylaktisk og andre faktorer som er kjente blant erfarne utøvere. Administreringen av et antistoff kan i det vesentlige være kontinuerlig over et på forhånd valgt tidsrom eller foregå som en serie av doser med avstand i tid, f. eks. enten før, under eller etter utvikling av smerte, før, under, før og etter, under og etter, eller før, under og etter utvikling av smerte. Administreringen kan være før, under og/eller etter sår, inngrep, traumer, kirurgisk behandling og enhver annen begivenhet som sannsynligvis vil gi opphav til postkirurgisk smerte.

Andre formuleringer omfatter egnede tilførselsformer som er kjente innen faget, innbefattet bærere som liposomer. Se for eksempel Nahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Liposompreparater omfatter cytofektiner, multi-lamellære vesikler og uni-lamellære vesikler.

I noen utførelsesformer kan mer enn ett antistoff eller polypeptid foreligge. Antistoffene kan være monoklonale eller polyklonale. Slike preparater kan inneholde minst ett, minst to, minst tre, minst fire eller minst fem forskjellige antistoffer. En blanding av antistoffer, som de ofte betegnes innen faget, kan være spesielt nyttig for behandling av et bredere utvalg av en populasjon av individer.

Et polynukleotid som koder for hvilket som helst av antistoffene eller polypeptidene ifølge oppfinnelsen (slik som antistoff E3) kan også anvendes for tilførsel og ekspresjon av hvilket som helst av antistoffene eller polypeptidene ifølge oppfinnelsen (slik som antistoff E3) i en ønsket celle. Det er åpenbart at en ekspresjonsvektor kan anvendes for å styre ekspresjonen av et E3-antistoff eller -polypeptid. Ekspresjonsvektoren kan administreres med hvilket som helst middel som er kjent innen faget, for eksempel intraperitonealt, intravenøst, intramuskulært, subkutant, intratekalt, intraventrikulært, oralt, enteralt, parenteralt, intranasalt, dermalt, sublingualt eller ved inhalering. For eksempel omfatter administrering av ekspresjonsvektorer lokal eller systemisk administrering, innbefattet injeksjon, oral tilførsel, administrering med en partikkel pistol eller ved kateter, og topisk administrering. En fagperson kjenner til administrering av ekspresjonsvektorer for å oppnå ekspresjon av et eksogent protein in vivo. Se f. eks. U.S. patentskrifter nr. 6 436 908, 6 413 942 og 6 376 471.

Målstyrt tilførsel av terapeutiske preparater som omfatter et polynukleotid som koder for hvilket som helst av antistoffene eller polypeptidene ifølge oppfinnelsen (slik som antistoff E3) kan også anvendes. Teknikker for reseptorformidlet DNA-tilførsel er for eksempel beskrevet i Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, red.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263-621; Wu et al., J. Biol. CHem. (1994) 269-542; Zenke et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Terapeutiske preparater som inneholder et polynukleotid administreres i et utvalg på fra omtrent 100 ng til omtrent 200 mg DNA for lokal administrering ifølge en genterapi protokol. Konsentrasjonsnivåer på fra omtrent 500 ng til omtrent 50 mg, fra omtrent 1^g til omtrent 2 mg, fra omtrent 5^g til omtrent 500^g og fra omtrent 20^g til omtrent 100^g DNA kan også anvendes ifølge en genterapi protokol. De terapeutiske polynukleotidene og polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilføres ved anvendelse av gen-tilførselsbærere. Gentilførselsbærere kan være av viralt eller ikke-viralt opphav (se generelt Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185 og Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Ekspresjon av slike kodende sekvenser kan induseres ved anvendelse av endogene pattedyrspromotere eller heterologe promotere. Ekspresjonen av den kodende sekvens kan enten være konstitutiv eller regulert.

Virusbaserte vektorer for tilførsel av et ønsket polynukleotid og ekspresjon i en ønsket celle er velkjente innen faget. Eksempler på virusbaserte bærere omfatter rekombinante retrovirus (se for eksempel PCT-patentskriftene WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, U.S. patentskrifter nr. 5 219 740, 4 777 127, britisk patentskrift nr. 2 200 651 og EP-patentskrift nr.

0 345 242), a-virusbaserte vektorer (slik som Sindbis-virusvektorer, Semliki forest-virusvektorer (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), Ross River-virusvektorer (ATCC VR-373, ATCC VR-1246) og Venezuelsk equine encefalitt-virus (ATCC VR-923, ATCC VR-1250, ATCC VR 1249, ATCC VR-532)) og adenoassosiert virus (AAV)-vektorer (se f. eks. PCT-patentskriftene WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984 og WO 95/00655). Administrering av DNA bundet til drept adenovirus som beskrevet i Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147 kan også benyttes.

Ikke-virale tilførselsbærere og fremgangsmåter kan også benyttes, innbefattet polykationisk kondensert DNA koblet eller ikke koblet til drept adenovirus alene (se f. eks. Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147), ligandbundet DNA (se f. eks. Wu, J. Biol. Chem.

(1989) 264:16985), tilførselsbærere basert på eukaryote celler (se f. eks. U.S. patentskrift nr. 5 814 482, PCT-patentskriftene WO 95/07994, WO 96/17072, WO 95/30763 og WO 97/42338) og kjerneladnings-nøytralisering eller fusjon med cellemembraner. Nakent DNA kan også benyttes. Eksempler på fremgangsmåter for innføring av nakent DNA beskrives i PCT-patentskrift WO 90/11092 og U.S. patentskrift nr. 5 580 859. Liposomer som kan fungere som gentilførselsbærere er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5 422 120, PCT-patentskriftene WO 95/13796, WO 94/23697 og WO 91/14445, og EP patentskrift nr. 0 524 968. Ytterligere tilnærminger er beskrevet i Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 og Woffendin, Proe. Nati. Acad. Sei. (1994) 91:1581. Når det gjelder alle fremgangsmåter som beskrevet her omfatter henvisning til antagonistiske anti-NGF-antistoffer også preparater som omfatter ett eller flere av disse midlene. Disse preparatene kan videre omfattede egnede eksipienser, slik som farmasøytisk aksepterbare eksipienser, innbefattet buffere, som er velkjente innen faget. Foreliggende oppfinnelse kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre konvensjonelle behandlings-måter.

Fremgangsmåter for anvendelse av antagonistisk anti-NGF-antistoff for behandling eller forebyggelse av smerte forbundet med reumatoid artritt

I noen aspekter omtaler beskrivelsen fremgangsmåter for behandling og/eller forebyggelse av smerte forbundet med reumatoid artritt hos individer, innbefattet pattedyr, både mennesker og ikke mennesker. I ett aspekt omtaler følgelig beskrivelsen fremgangsmåter for behandling av smerte forbundet med reumatoid artritt hos et individ, som omfatter administrering av en effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff. Antagonistiske anti-NGF-antistoffer er kjente innen faget og beskrevet her.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen fremgangsmåter for reduksjon av forekomsten av, lindring, undertrykkelse, døyving og/eller forsinket fremkomst av, utvikling av eller forløp av smerte forbundet med reumatoid artritt hos et individ. I noen utførelsesformer administreres således det antagonistiske anti-NGF-antistoff før utvikling av smerte eller en smerteepisode hos et individ med reumatoid artritt.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen fremgangsmåter for behandling av inflammatorisk kakeksi (vekttap) forbundet med reumatoid artritt i et individ, som omfatter administrering av en effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff (Roubenoff et al., Arthritis Rheum. 40(3):534-9 (1997); Roubenoff et al., J. Clin. Invest. 93(6):2379-86

(1994)).

Diagnose eller vurdering av smerte forbundet med reumatoid artritt er veletablert innen faget. Vurderingen kan utføres basert på målinger som er kjente innen faget, slik som pasientens karakterisering av smerte, ved anvendelse av forskjellige smerteskalaer. Se f. eks. Katz et al, Surg Clin North Am. (1999) 79 (2):231-52; Caraceni et al. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55. Det finnes også vanlig anvendte skalaer for måling av sykdomstilstand, for eksempel American College of Rheumatology (ACR) (Felson et al., Arthritis and Rheumatism (1993) 36(6):729-740), the Health Assessment Questionnaire (HAQ) (Fries et al., (1982) J. Rheumatol. 9:789-793), The Paulus Scale (Paulus et al., Arthritis and Rheumatism (1990) 33:477-484) og Arhtritis Impact Measure Scale (AIMS)

(Meenam et al., Arthritis and Rheumatology (1982) 25:1048-1053). Anti-NGF-antistoff kan

administreres til et individ via enhver egnet tilførselsvei. Eksempler på forskjellige administrasjonsveier er beskrevet her.

Smertelindring kan karakteriseres ved tidsforløpet til lindringen. I noen utførelses-former observeres følgelig smertelindring i løpet av omtrent 24 timer etter administrering av et antagonistisk anti-NGF-antistoff. I andre utførelsesformer observeres smertelindring i løpet av omtrent 36, 48, 60, 72 timer eller 4 dager etter administrering av et antagonistisk anti-NGF-antistoff. I ytterligere andre utførelsesformer observeres smertelindring før en indikasjon på forbedring av betennelsestilstanden forbundet med reumatoid artritt kan observeres. I noen utførelsesformer reduseres hyppigheten og/eller intensiteten av smerten og/eller livskvaliteten til dem som lider av sykdommen forhøyes.

Fremstilling og anvendelse av anti-NGF-antistoffer for disse fremgangsmåtene er beskrevet i seksjoner nedenfor ("antagonistisk anti-NGF-antistoff"; "Påvisning av antagonistiske anti-NGF-antistoffer", "Administrering av et antagonistisk anti-NGF-antistoff").

Antagonistisk anti-NGF-antistoff for anvendelse ved behandling av smerte forbundet med osteoartritt

I noen aspekter tilveiebringer oppfinnelsen behandling av smerte forbundet med osteoartritt i individer, innbefattet pattedyr, både mennesker og ikke-mennesker. I ett aspekt tilveiebringer følgelig oppfinnelsen en effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff eller et antigenbindende fragment derav for anvendelse ved behandling av smerte forbundet med osteoartritt i et individ. Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelsen av et antagonistisk anti-NGF-antistoff eller et antigenbindende fragment derav i fremstillingen av et medikament for behandling av smerte forbundet med osteoartritt i et individ. Antagonistiske anti-NGF-antistoffer er kjente innen faget og beskrevet her.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antagonistisk anti-NGF-antistoff for anvendelse for redusering av forekomsten av, lindring, undertrykkelse, døyving og/eller forsinking av fremkomst av, utvikling av eller et forløp av smerte forbundet med osteoartritt hos et individ. I noen utførelsesformer administreres således det antagonistiske anti-NGF-antistoff før utvikling av smerte eller en smerteepisode hos et individ med osteoartritt.

Diagnose eller vurdering av smerte forbundet med osteoartritt er veletablert innen faget. Vurderingen kan utføres basert på målinger som er kjente innen faget, slik som pasientens karakterisering av smerten ved anvendelse av forskjellige smerteskalaer. Se f. eks. Katz et al, Surg Clin North Am. (1999) 79 (2):231-52; Caraceni et al. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55. Foreksempel kan WOMAC Ambulation Pain Scale (innbefattet smerte, stivhet og fysisk funksjon) og 100 mm Visual Analogue Scale (VAS) benyttes for å vurdere smerte og evaluere responsen på behandlingen.

Antagonistisk anti-NGF-antistoff kan administreres til et individ via enhver egnet tilførselsvei. Eksempler på forskjellige administreringsveier beskrives her.

Smertelindring kan karakteriseres ved tidsforløpet til lindringen. I noen utførelses-former observeres følgelig smertelindring i løpet av omtrent 24 timer etter administrering av antagonistisk anti-NGF-antistoff. I andre utførelsesformer observeres smertelindring i løpet av omtrent 36, 40, 60, 72 timer eller 4 dager etter administrering av antagonistisk anti-NGF-antistoff. I noen utførelsesformer reduseres smertens hyppighet og/eller intensitet og/eller livskvaliteten til den som lider av sykdommen forbedres.

Fremstilling og anvendelse av anti-NGF-antistoffer for disse fremgangsmåtene er beskrevet i seksjoner nedenfor ("antagonistisk anti-NGF-antistoff", "Påvisning av antagonistiske anti-NGF-antistoffer", "Administrering av et antagonistisk anti-NGF-antistoff").

Anta<g>onistisk anti- NGF- antistoff

Anvendelsen av oppfinnelsen (vedrørende smerte forbundet med osteoartritt) anvender et antagonistisk anti-NGF-antistoff, som viser til ethvert antistoffmolekyl som blokkerer, undertrykker eller reduserer (innbefattet i signifikant grad) biologisk aktivitet forbundet med NGF, innbefattet nedstrøms reaksjonsveier som formidles ved NGF-signalisering, slik som reseptorbinding og/eller utløsning av en cellulær respons på NGF.

Et antagonistisk anti-NGF-antistoff bør besitte én eller flere av følgende egenskaper: (a) bindes til NGF og inhibere biologisk aktivitet forbundet med NGF eller nedstrøms reaksjonsveier som formidles ved NGF-signalfunksjoner, (b)forebygge, lindre eller behandle hvilket som helst aspekt ved smerte forbundet med reumatoid artitt eller osteoartritt, (c) blokkere eller redusere NGF-reseptoraktivering (innbefattet TrkA-reseptor-dimerisering og/eller -autofosforylering), (d) øke clearance av NGF, (e) inhibere (redusere) NGF-syntese, -produksjon eller -frigjøring. Antagonistiske anti-NGF-antistoffer er kjente innen faget, se f. eks. PCT-patentskriftene WO 01/78698, WO 01/64247, U.S. patentskrifter nr. 5 844 092, 5 877 016 og 6 153 189, Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000), Cell. Molec. Biol. 13:559-568 (1993), Genbank aksesjonsbnummer U39608, U39609, L17078 eller L17077.

For formålet til foreliggende oppfinnelse reagerer antistoffet med NGF på en måte som inhiberer NGF og/eller nedstrøms reaksjonsveier som formidles ved NGF-signalfunksjoner. I andre utførelsesformer gjenkjenner det antagonistiske anti-NGF-antistoff humant NGF. I ytterligere andre utførelsesformer bindes det antagonistiske anti-NGF-antistoff spesifikt til humant NGF. I noen utførelsesformer bindes det antagonistiske anti-NGF-antistoff ikke i vesentlig grad til beslektede neurotrofiner som NT-2, NT 4/5 og/eller BDNF. I ytterligere andre utførelsesformer kan anti-NGF-antistoffet bindes til NGF og effektivt inhibere binding av NGF til TrkA og/eller p75-reseptoren in vivo og/eller effektivt inhibere NGF fra å aktivere TrkA- og/eller p75-reseptoren. I ytterligere andre utførelsesformer er det antagonistiske anti-NGF-antistoff et monoklonalt antistoff. I ytterligere andre utførelsesformer er anti-NGF-antistoffet humanisert (slik som antistoff E3 som beskrevet her). I noen utførelsesformer er anti-NGF-antistoffet humant. I én utførelsesform er antistoffet et humant antistoff som gjenkjenner én eller flere epitoper på humant NGF. I en annen utførelsesform er antistoffet et muse- eller rotte antistoff som gjenkjenner én eller flere epitoper på humant NGF. I en annen utførelsesform gjenkjenner antistoffet én eller flere epitoper på en NGF valgt fra gruppen som består av NGF fra primater, hunder, katter, hester og storfe. I ytterligere andre utførelsesformer binder det antagonistiske anti-NGF-antistoff i det vesentlige den samme NGF-epitop som et antistoff valgt blant én eller flere av følgende: MAb 911, MAb 912 og MAb 938 (se Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). I andre utførelsesformer binder antistoffet den samme epitopen som Mab 911. I en annen utførelsesform omfatter antistoffet et konstant område som er immunologisk inert (f. eks. ikke utløser komplement-mediert lysis eller antistoff-avhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC)). ADCC-aktivitet kan vurderes ved anvendelse av fremgangsmåter som beskrives i U.S. patentskrift nr. 5 500 362. I noen utførelsesformer er det konstante området modifisert som beskrevet i Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; PCT-patentsøknad PCT/GB99/01441 og/eller britisk patentsøknad nr. 9809951.8.

I noen utførelsesformer er det antagonistiske anti-NGF-antistoffet humanisert monoklonalt anti-NGF-antistoff fra mus som betegnes antistoff "E3", hvilket som helst av de E3-beslektede antistoffene som er beskrevet her eller hvilke som helst fragmenter derav, som er NGF-antagonister.

Antistoffene som er nyttige i foreliggende oppfinnelse kan omfatte monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, antistoffragmenter (slik som Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc osv.), kimere antistoffer, bispesifikke antistoffer, heterokonjugat antistoffer, enkeltkjede antistoffer (ScFv), mutanter derav, fusjonsproteiner som omfatter en antistoffdel, humaniserte antistoffer og hvilken som helst annen modifisert konfigurasjon av immunglobulin molekylet som omfatter et antigengjenkjennelsessete med den nødvendige spesifisitet, innbefattet glykosyleringsvarianter av antistoffer, aminosyresekvens varianter av antistoffer og kovalent modifiserte antistoffer. Antistoffene kan være fra mus, rotter, menneske eller ethvert annet opphav (innbefattet kimere eller humaniserte antistoffer).

Bindingsaffiniteten av et antagonistisk anti-NGF-antistoff ovenfor NGF (slik som hNGF) kan være fra omtrent 0,10 til omtrent 0,80 nM, fra omtrent 0,15 til omtrent 0,75 nM og fra omtrent 0,18 til omtrent 0,72 nM. I én utførelsesform er bindings-affiniteten mellom omtrent 2 pM og 22 pM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 10 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten lavere enn omtrent 10 nM. I andre utførelses-former er bindingsaffiniteten omtrent 0,1 nM eller omtrent 0,07 nM. I andre utførelses-former er bindingsaffiniteten lavere enn omtrent 0,1 nM eller lavere enn omtrent 0,07 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten fra hvilken som helst av omtrent 100 nM, omtrent 50 nM, omtrent 10 nM, omtrent 1 nM, omtrent 500 pM, omtrent 100 pM eller omtrent 50 pM til hvilken som helst av omtrent 2 pM, omtrent 5 pM, omtrent 10 pM, omtrent 15 pM, omtrent 20 pM eller omtrent 40 pM. I noen utførelsesformer er bindings- affiniteten hvilken som helst av omtrent 100 nM, omtrent 50 nM, omtrent 10 nM, omtrent 1 nM, omtrent 500 pM, omtrent 100 pM eller omtrent 50 pM, eller lavere enn omtrent 50 pM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten lavere enn hvilken som helst av omtrent 100 nM, omtrent 50 nM, omtrent 10 nM, omtrent 1 nM, omtrent 500 pM, omtrent 100 pM eller omtrent 50 pM. I ytterligere andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 2 pM, omtrent 5 pM, omtrent 10 pM, omtrent 15 pM, omtrent 20 pM, omtrent 40 pM eller høyere enn omtrent 40 pM.

Én måte å bestemme antistoffers bindingsaffinitet ovenfor NGF er ved å måle bindingsaffiniteten av monofunksjonelle Fab-fragmenter av antistoffet. For å fremskaffe av monofunksjonelle Fab-fragmenter kan et antistoff (slik som IgG) kløyves med papain eller uttrykkes rekombinant. Affiniteten av et Fab-fragment fra et anti-NGF-antistoff kan bestemmes ved overflate plasmonresonans ("BIAcore 3000" overflate plasmonresonans (SPR)-system, BIAcore, Inc., Piscawy, NJ). CM5-brikker kan aktiveres med N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid-hydroklorid (EDC) og N-hydroksysuksinimid (NHS) ifølge leverandørens instruksjoner. Humant NGF (eller enhver annen NGF) kan fortynnes med 10 mM natriumacetat pH 4,0 og injiseres over den aktiverte brikken i en konsentrasjon på 0,005 mg/ml. Ved å variere gjennomstrømmingstiden over de enkelte brikkekanalene kan to områder med antigen tetthet oppnås: 100-200 responsenheter (RU) for detaljerte, kinetiske undersøkelser og 500-600 RU for gjennomsøkningsanalyser. Brikker kan blokkeres med etanolamin. Regnereringsundersøkelser har vist at en blanding av Pierce-elueringsbuffer (produkt nr. 21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) og 4 M NaCI (2:1) effektivt fjernes bundet Fab, samtidig som aktiviteten av nNGF på brikken bevares for mer enn 200 injeksjoner. HBS-EP-buffer (0,01M Hepes, pH 7,4, 0,15 NaCI, 3 mM EDTA, 0,005 % Surfaktant P29) anvendes som elueringsbuffer for BIAcore-analysene. Seriefortynninger (0,1-10 x anslått KD) av rensede Fab-prøver injiseres i 1 minutt med 100^l/min, og dissosiasjonstider på opp til 2 timer tillates. Konsentrasjonen av Fab-proteinene bestemmes ved ELISA og/eller SDS-PAGE-elektroforese ved anvendelse av et Fab med kjent konsentrasjon (bestemt ved aminosyreanalyser) som standard. Kinetiske assosiasjonshastigheter (kon) og dissosiasjonshastigheter (koff) erholdes samtidig ved å tilpasse måleverdiene 1:1 Langmuir bindingsmodell (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6, 99-110) ved anvendelse av programmet BIAevaluation. Likevektsdissosiasjonskonstant (KD)-verdier beregnes om koff/kon. Denne fremgangsmåten er egnet for anvendelse ved bestemmelse av bindingsaffiniteten til et antistoff ovenfor enhver NGF, innbefattet humant NGF, NGF fra en annen vertebrat (i noen utførelsesformer, pattedyr) (slik som muse-NGF, rotte-NGF, primat-NGF), så vel som for anvendelse med andre neurotrofiner, slik som de beslektede neurotrofinene NT3, NT 4/5 og/eller BDNF.

I noen utførelsesformer binder antistoffet humant NGF uten i signifikant grad å binde en NGF fra en annen vertebrat-art (i noen utførelsesformer pattedyr). I noen utførelsesformer binder antistoffet humant NGF, så vel som én eller flere NGF fra en annen virveldyrart (i noen utførelsesformer pattedyr). I ytterligere andre utførelsesformer binder antistoffet NGF uten i signifikant grad å kryssreagere med andre neurotrofiner (slik som de beslektede neurotrofinene NT3, NT 4/5 og/eller BDNF). I noen utførelsesformer binder antistoffet NGF, så vel som minst et annet neurotrofin. I noen utførelsesformer bindes antistoffet til en pattedyrsutgave av NGF, slik som fra hest eller hund, uten i signifikant grad å bindes til NGF fra en annen pattedyreart.

Epitopen eller epitopene kan være kontinuerlige eller diskontinuerlige. I én utførelsesform binder antistoffet i det vesentlige de samme hNGF-epitoper som et antistoff valgt fra gruppen som består av MAb 911, MAb 912 og MAb 938, som er beskrevet i Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000). I en annen utførelsesform binder antistoffet i det vesentlige den samme hNGF-epitop som MAb 911. I ytterligere en annen utførelsesform binder antistoffet i det vesentlige den samme epitop som MAb 909. Hongo et al., supra. Epitopen kan foreksempel omfatte én eller flere av: aminosyrerestene K32, K34 og E35 i variabelt område 1 (aminosyrene 23-35) i hNGF, aminosyrerestene F79 og T81 i variabelt område 4 (aminosyrene 81-88) i hNGF, aminosyrerestene H84 og K88 i variabelt område 4, aminosyrerest R103 mellom variabelt område 5 (aminosyrene 94-98) i hNGF og C-enden (aminosyrene 111-118) i hNGF, aminosyrerest Ell i prevariabelt område 1 (aminosyrene 10-23) i hNGF, Y52 mellom variabelt område 2 (aminosyrene 40-49) i hNGF og variabelt område 3 (aminosyrene 59-66) i hNGF, aminosyrerestene LI 12 og Sl 13 i C-enden av hNGF, aminosyrerestene R59 og R69 i variabelt område 3 i hNGF eller aminosyrerestene V18, V20 og G23 i prevariabelt område 1 i hNGF. I tillegg kan en epitop omfatte én eller flere av variabelt område 1, variabelt område 3, variabelt område 4, variabelt område 5, N-endeområdet og/eller C-enden av hNGF. I ytterligere en annen utførelsesform reduserer antistoffet i signifikant grad løsemiddeltilgjengeligheten av aminosyrerest R103 i hNGF. Det vil forstås at selv om epitopene som er beskrevet ovenfor gjelder humant NGF, kan en gjennomsnitts fagperson sammenstille strukturen til humant NGF med NGF fra andre arter og påvise sannsynlige motstykker til disse epitopene.

I ett aspekt kan antistoffer (f. eks. humane, humaniserte, muse-antistoffer, kimerer) som kan inhibere NGF fremstilles ved anvendelse av immunogener som uttrykker fullengde-NGF eller en delsekvens derav. I et annet aspekt til et immunogen som omfatter en celle som overuttrykker NGF anvendes. Et annet eksempel på et immunogen som kan anvendes er NGF-protein som inneholder fullengde-NGF eller en del av NGF-proteinet.

De antagonistiske anti-NGF-antistoffene kan fremstilles ved enhver fremgangsmåte som er kjent innen faget. Tilførselsvei og skjema for immunisering av vertsdyret er generelt i samsvar med etablerte og konvensjonelle teknikker for antistoffstimulering og -produksjon, som er beskrevet videre her. Generelle teknikker for fremstilling av humane antistoffer og museantistoffer er kjente innen faget og beskrevet her.

Man tenker seg at ethvert pattedyr, innbefattet menneske, eller antistoff-produserende celler derfra kan manipuleres for å fungere som grunnlag for produksjon av hybridom cellelinjer fra pattedyret, innbefattet mennesket. Vertsdyret inokuleres typisk intraperitonealt, intramuskulært, oralt, subkutant, intraplantart og/eller intradermalt med en mengde immunogen, innbefattet som beskrevet her.

Hybridomer kan fremstilles fra lymfocytter og immortaliserte myelomceller ved anvendelse av den generelle somatiske cellehybridiseringsteknikk til Kohler B., og Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 eller som modifisert av Buck, D.W. et al., In vitro, 18:377-381 (1982). Tilgjengelige myelomlinjer, innbefattet X63-Ag8.653 og cellelinjene fra Stalk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, kan anvendes i hybridiseringen. Generelt omfatter teknikken en fusjon mellom myelomceller og lymfoide celler ved anvendelse av et fusogen som polyetylenglykol eller ved elektriske midler som er velkjente blant fagfolk. Etter fusjonen separeres cellene fra fusjonsmediet og dyrkes i et selektivt dyrkningsmedium, slik som hypoxantin-aminopterin-tymidin (HAT)-medium, for fjerning av ikke-hybridiserte utgangsceller. Hvilket som helst av mediene som er beskrevet her, enten tilsatt serum eller ikke, kan anvendes for dyrking av hybridomer som utskiller monoklonale antistoffer. Som et annet alternativ til cellefusjonsteknikken kan EBV-immortaliserte B-celler anvendes for fremstilling av de monoklonale anti-NGF-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse. Hybridomene ekspanderes og subklones, om ønskelig, og supernatanter analyseres for anti-immunogen aktivitet ved konvensjonelle fremgangsmåter for immunanalyse (f. eks. radioimmun analyse, enzymimmun analyse eller fluorescens immunanalyse).

Hybridomer som kan anvendes som kilde for antistoffer omfatter alle derivater og avkom fra utgangshybridomene som danner monoklonale antistoffer som er spesifikke for NGF eller en del derav.

Hybridomer som danner slike antistoffer kan dyrkes in vitro eller in vivo ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. De monoklonale antistoffene kan isoleres fra dyrkningsmedium eller kroppsvæsker ved konvensjonelle rensefremgangsmåter for immunglobuliner, slik som ammoniumsulfat utfelling, gel elektroforese, dialyse, kromatografi og om ønskelig, ultrafiltrering. Dersom uønsket aktivitet foreligger kan denne for eksempel fjernes ved å sende preparatet over absorpsjonsmidler fremstilt av immunogener koblet til en fast fase og eluering eller frigjøring av de ønskede antistoffer fra immunogenet. Immunisering av et vertsdyr med en humant NGF eller et fragment som inneholder målaminosyresekvensen konjugert til et protein som er immunogent i arten som skal immuniseres, f. eks. hemocyanin fra albueskjell, serumalbumin, tyroglobulin fra storfe eller trypsininhibitor fra soyabønne, ved anvendelse av et bifunksjonelt middel eller derivatiseringsmiddel, for eksempel maleimidobenzoylsulfosuksinimidester (konjugering via cyste in rester), N-hydroksysuksinimid (via lysinrester), glutaraldehyd, ravsyreanhydrid, SOCI2eller RiN=C=NR, hvor R og Ri er forskjellige alkylgrupper, kan gi en populasjon av antistoffer (f. eks. monoklonale antistoffer).

Om ønskelig kan det antagonistiske anti-NGF-antistoff (monoklonalt eller polyklonalt) av interesse sekvenseres, hvoretter polynukleotidsekvensen kan klones inn i en vektor for ekspresjon eller oppformering. Sekvensen som koder for antistoffet av interesse kan bibeholdes i en vektor i en vertscelle, og vertscellen kan så ekspanderes og nedfryses for fremtidig bruk. I et alternativ kan polynukleotidsekvensen anvendes for genetisk manipulering for "humanisering" av antistoffet eller for å forbedre affiniteten eller andre egenskaper ved antistoffet. For eksempel kan det konstante området modifiseres slik at det i større grad ligner humane konstante områder, for å unngå immunrespons dersom antistoffet anvendes i kliniske forsøk og for behandling av mennesker. Det kan være ønskelig å manipulere antistoffsekvensen genetisk for å oppnå høyere affinitet ovenfor NGF og større virkning når det gjelder inhibering av NGF. Det vil være åpenbart for en fagperson at én eller flere polynukleotidendringer kan innføres i det antagonistiske anti-NGF-antistoff, mens evnen til å binde NGF fortsatt bibeholdes.

Humanisering av et monoklonalt antistoff omfatter fire generelle trinn. Disse er: (1) bestemmelse av nukleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens for utgangs-antistoffets variable lettkjede- og tungkjede domener, (2) utforming av det humaniserte antistoff, dvs. å bestemme hvilke antistoff-rammeverksområder som skal benyttes under humaniseringsprosessen, (3) de faktiske humaniseringsmetodologier/teknikker og (4) transfeksjon og ekspresjon av det humaniserte antistoff. Se for ekssempel U.S. patentskrifter nr. 4 816 567, 5 807 715, 5 866 692, 6 331 415, 5 530 101, 5 693 761, 5 693 762, 5 585 089 og 6 180 370.

En rekke "humaniserte" antistoffmolekyler som omfatter et antigenbindende sete avledet fra et ikke-humant immunglobulin er beskrevet, innbefattet kimere antistoffer med gnager-V-områder eller modifiserte gnager-V-områder og deres assosierte komplementaritetsbestemmende områder (CDR) fusjonert til humane konstante domener. Se for eksempel Winter et al., Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987) og Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987). Andre referanser beskriver gnager-CDR podet inn i et humant understøttende rammeverksområde (FR) før fusjon med et konstant domene fra et egnet humant antistoff. Se for eksempel Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988) og Jones et al. Nature 321:522-525

(1986). En annen referanse beskriver gnager-CDR understøttet av rekombinant verniserte rammeverksområder fra gnager. Se f. eks. europeisk patentskrift nr. 0519596. Disse "humaniserte" molekylene er utformet for minimalisering av uønskede immunologiske responser mot anti-humane antistoffmolekyler fra gnagere som begrenser varigheten og virkningen av terapeutiske anvendelser av disse gruppene i humane mottagere. For eksempel kan antistoffets konstante område modifiseres slik at det er immunologisk inert (slik som ikke utløser komplement lysis). Se f. eks. PCT-patentskrift PCT/GP99/01441, britisk patentsøknad nr. 9809951.8. Andre fremgangsmåter for humanisering av antistoffer som også kan benyttes er beskrevet av Daugherty et al., Nucl. Acids Rres. 19:2471-2476

(1991) og i U.S. patentskrifter nr. 6 180 377, 6 054 297, 5 997 867, 5 866 692, 6 210 671 og 6 350 861 og i PCT-patentskrift WO 01/27160.

I nok et alternativ kan fult ut humane antistoffer fremskaffes ved å anvende kommersielt tilgjengelige mus som har blitt modifisert slik at de uttrykker spesifikt humane immunglobulin proteiner. Transgene dyr som er utformet slik at de gir en mer ønskelig (f. eks. fult ut humane antistoffer) eller mer robust immunrespons kan også anvendes for frembringelse av humaniserte eller humane antistoffer. Eksempler på slik teknologi er "Xenomouse" fra Abgenix, Inc. (Fremont, CA) og "HuMAb-Mouse" og 'TC Mouse" fra Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

I et alternativ kan antistoffer fremstilles rekombinant og uttrykkes ved anvendelse av enhver fremgangsmåte som er kjent innen faget. I et annet alternativ kan antistoffer fremstilles rekombinant ved bakteriofag fremvisningsteknologi. Se foreksempel U.S. patentskrifter nr. 5 565 332, 5 580 717, 5 733 743 og 6 265 150, og Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Alternativt kan bakteriofag fremvisningsteknologi (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) anvendes for fremstilling av humane antistoffer og antistoffragmenter in vitro fra repertoarer av variable (V) immunglobulin domenegener fra ikke-immuniserte donorer. Ifølge denne teknikken klones antistoff-V-domenegener med opprettholdt leseramme inn i enten et hovedkappeproteingen eller et sjeldnere kappeproteingen i en filamentøs bakteriofag, foreksempel M13 ellerfd og fremvises som funksjonelle antistoffragmenter på bakteriofagpartikkelens overflate. Siden den filamentøse partikkelen inneholderen enkelttrådet DNA-kopi av bakteriofaggenomet, fører seleksjon basert på antistoffets funksjonelle egenskaper også til seleksjon av genet som koder for antistoffet som viser disse egenskapene. Bakteriofagen etterligner således noen av B-cellens egenskaper. Bakteriofag fremvisning kan utføres i en rekke formater, for en oversikt se f. eks. Johnson, Kevin S. og Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Flere kilder for V-gensegmenter kan anvendes for bakteriofag fremvisning. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) isolerte et bredt utvalg av anti-oksazolon antistoffer fra et lite, tilfeldig, kombinatorisk bibliotek av V-gener avledet fra milten fra immuniserte mus. Et repertoar av V-gener fra ikke-immuniserte, humane donorer kan fremstilles, og antistoffer mot et bredt valgt av antigener (innbefattet selv-antigener) kan isoleres ved i det vesentlige å følge teknikkene som er beskrevet av Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) eller Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). I en naturlig immunrespons akkumulerer antistoffgener mutasjoner med høy frekvens (somatisk hypermutasjon). Noen av endringene som innføres vil gi høyere affinitet, og B-celler som fremviser immunglobulin med høy affinitet på overflaten vil preferensielt replikeres og differensiere under påfølgende eksponering ovenfor antigen. Denne naturlige prosessen kan etterlignes ved å benytte teknikken som betegnes "kjedestokking". Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). I denne fremgangsmåten kan affiniteten til "primære" humane antistoffer erholdt ved bakteriofag fremvisning forbedres ved sekvensielt å erstatte tungkjedens og lettkjedens V-områdegener med repertoarer av naturlig forekommende varianter (repertoarer) av V-domenegener fremskaffet fra ikke-immuniserte donorer. Denne teknikken tillater fremstilling av antistoffer og antistoffragmenter med affiniteter i pM-nM-området. En strategi for fremstilling av svært store bakteriofag antistoff-repertoarer (også kjent som "alles mor-biblioteker") er beskrevet av Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). Genstokking kan også anvendes for å avledet humane antistoffer fra gnagerantistoffer, hvor det humane antistoff har en tilsvarende affinitet og spesifisitet som utgangs-gnagerantistoffet. Ifølge denne fremgangsmåten, som også betegnes "epitop imprinting", erstattes tungkjedens eller lettkjedens V-domenegen i gnagerantistoffer erholdt ved bakteriofag fremvisningsteknikken med et repertoar av humane V-domenegener, slik at gnager-menneskekimerer dannes. Seleksjon mot antigen fører til isolasjon av humane, variable områder som kan gjenskape et funksjonelt antigenbindende sete, dvs. at epitopen styrer (imprinter) partnervalget. Når prosessen gjentas for å erstatte det gjenværende gnager-V-domenet erholdes et humant antistoff (se PCT-patentskrift WO 93/06213, publisert 1. april 1993). I motsetning til tradisjonell humanisering av gnagerantistoffer ved CDR-transplantering gir denne teknikken fult ut humane antistoffer, uten rammeverks- eller CDR-aminosyrerester av gnageropphav.

Det vil være åpenbart at selv om diskusjonen ovenfor gjelder humaniserte antistoffer kan de generelle prinsippene som diskuteres anvendes for skreddersying av antistoffer for anvendelse i for eksempel hunder, katter, primater, hest og storfe. Det er videre åpenbart at ett eller flere aspekter ved humanisering av et antistoff som beskrevet her kan kombineres, for eksempel CDR-transplantering, rammeverksmutasjon og CDR-mutasjon.

Antistoffer kan fremstilles rekombinant ved først å isolere antistoffene og antistoff-produserende celler fra vertsdyr, erholde gensekvensen og anvende gensekvensen for rekombinant ekspresjon av antistoffet i vertsceller (f.eks. CHO-celler). En annen fremgangsmåte som kan benyttes er å uttrykke antistoffsekvensen i planter (f.eks. tobakk) eller transgen melk. Fremgangsmåter for rekombinant ekspresjon av antistoffer i planter eller melk er beskrevet. Se for eksempel. Peeters et al. Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N og D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65 (1995) og Pollock et al., J Immunol Methods 231:147

(1999). Fremgangsmåter for fremstilling av antistoffderivater, f.eks. humaniserte antistoffer, enkeltkjede antistoffer osv., er kjente innen faget. Immunanalyser og "flow"-cytometriske sorteringsteknikker slik som fluorescens-aktivert cellesortering (FACS), kan også benyttes for isolering av antistoffer som er spesifikke for NGF. Antistoffene kan bindes til mange forskjellige bærere. Bærerene kan være aktive og/eller inerte. Eksempler på velkjente bærere omfatter polypropylen, polystyren, poly-etylen, dekstran, nylon, amylaser, glass, naturlige og modifiserte celluloser, polyakryl-amider, agaroser og magnetitt. Bæreren kan av natur enten være løselig eller uløselig for oppfinnelsens formål. Fagfolk vil kjenne til andre egnede bærere for binding av antistoffer eller vil kunne sikre slike ved anvendelse av rutinemessig eksperimentering. I noen utførelsesformer omfatter bæreren en gruppe som styrer bæreren til myokard. DNA som koder for de monoklonale antistoffene kan lett isoleres og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter (f. eks. ved å benytte oligonukleotid prober som kan bindes spesifikt til gener som koder for de monoklonale antistoffenes tungkjede og lettkjede). Hybridomcellene fungerer som en foretrukket kilde for slik DNA. Når dette DNA først er isolert kan det plassers i ekspresjonsvektorer (slik som ekspresjons-vektorene som beskrives i PCT-patentskrift WO 87/04462), som så transfekteres inn i vertsceller slik som E. coli-celler eller ape-COS-celler, kinesisk hamster ovarie (CHO)-celler eller myelomceller som ellers ikke danner immunglobulinprotein, for å oppnå syntese av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertscellene. Se f. eks. PCT-patentskrift WO 87/04462. DNA kan også modifiseres, for eksempel ved å innføre den kodende sekvens for humane, konstante tungkjede- og lettkjededomener i stedet for de homologe muse-sekvensene, Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 81:6851 (1984), eller ved kovalent kobling til den immunglobulinkodende sekvens av hele eller en del av den kodende sekvens for et ikke-immunglobulin polypeptid. På denne måten kan det fremstilles "kimere" eller "hybride" antistoffer med bindingsspesifisiteten til et monoklonalt anti-NGF-antistoff som beskrevet her. Antagonistiske anti-NGF-antistoffer kan karakteriseres ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente innen faget. For eksempel er en fremgangsmåte å identifisere epitopen som antistoffet bindes til, eller "epitop kartlegging". Det er mange fremgangsmåter som er kjente innen faget for kartlegging og karakterisering av epitopers plassering på proteiner, innbefattet å løse krystallstrukturen til et antistoff-antigen kompleks, konkurranseanalyser, genfragment ekspresjonsanalyser og analyser basert på syntetiske peptider, som beskrevet for eksempel i kapitel 11 i Harlow og Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. I nok et eksempel kan epitop-kartlegging anvendes for å bestemme sekvensen som et antagonistisk anti-NGF-antistoff bindes til. Epitop-kartlegging er kommersielt tilgjengelig fra forskjellige kilder, for eksempel Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Nederland). Epitopen kan være en lineær epitop, dvs. at den foreligger i et enkelt strekk av aminosyrer, eller en konformasjonsepitop dannet ved tredimensjonell interaksjon mellom aminosyrer som ikke nødvendigvis må foreligge i et enkelt strekk. Peptider av forskjellige lengder (f. eks. minst 4-6 aminosyrer lange) kan isoleres eller syntetiseres (f. eks. rekombinant) og anvendes for bindingsanalyser med et antagonistisk anti-NGF-antistoff. I et annet eksempel kan epitopen som det antagonistiske anti-NGF-antistoff bindes til bestemmes i et systematisk søk ved anvendelse av overlappende peptider avledet fra NGF-sekvensen og bestemme bindingen til det antagonistiske anti-NGF-antistoff. Ifølge genfragment ekspresjonsanalysene fragmenteres den åpne leseramme som koder for NGF, enten tilfeldig eller ved spesifikke, genetiske konstruksjoner, og evnen til de uttrykte NGF-fragmentene til å reagere med antistoffet som skal analyseres bestemmes. Genfragmentene kan for eksempel fremstilles ved PCR og så transkriberes og translateres til protein in vitro, i nærvær av radioaktive aminosyrer. Binding av antistoffet til de radioaktivt merkede NGF-fragmentene bestemmes så ved immunutfelling og gel elektroforese. Visse epitoper kan også påvises ved anvendelse av store biblioteker av tilfeldige peptidsekvenser fremstilt på overflaten av bakteriofagpartikler (bakteriofag biblioteker). Alternativt kan et definert bibliotek av overlappende peptidfragmenter analyseres for binding til antistoffet som skal analyseres i enkle bindingsanalyser. I nok et eksempel kan mutagenese av et antigenbindende domene, domeneutbyttings eksperimenter og alanin-skanning mutagenese utføres for å identifisere aminosyrerester som er påkrevde, tilstrekkelige og/eller nødvendige for epitopbinding. For eksempel kan domeneutbyttings eksperimenter utføres ved anvendelse av en mutant NGF hvor forskjellige fragmenter av NGF-polypeptidet er erstattet (utbyttet) med sekvenser fra nær beslektede, men antigenisk forskjellige proteiner (slik som et annet medlem av neurotrofinprotein familien). Ved å anslå bindingen av antistoffet til den mutante NGF kan betydningen av det angjeldende NGF-fragment for antigenbindingen vurderes. Nok en fremgangsmåte som kan anvendes for å karakterisere et antagonistisk anti-NGF-antistoff er å benytte konkurranseanalyser med andre antistoffer som vites å bindes til det samme antigen, dvs. forskjellige NGF-fragmenter, for å fastslå hvorvidt det antagonistiske anti-NGF-antistoff bindes til den samme epitop som andre antistoffer. Konkurranseanalyser er velkjente blant fagfolk. Eksempler på antistoffer som kan anvendes i konkurranseanalysene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter MAb 911, 912 og 938, som beskrevet i Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000). En ekspresjonsvektor kan anvendes for å styre ekspresjonen av et antagonistisk anti-NGF-antistoff. En fagperson kjenner til administrering av ekspresjonsvektorer for å oppnå ekspresjon av et eksogent protein in vivo. Se f. eks. U.S. patentskrifter nr.

6 436 908, 6 413 942 og 6 376 471. Administrering av ekspresjonsvektorer omfatter lokal eller systemisk administrering, innbefattet injeksjon, oral administrering, administrering med en partikkel pistol eller ved et kateter, og topisk administrering. I en annen utførelses- form administreres ekspresjonsvektoren direkte til den sympatiske stammen eller ganglionet, eller inn i en kransarterie, et forkammer, et hjertekammer eller hjerteposen.

Målstyrt tilførsel av terapeutiske preparater som inneholder en ekspresjonsvektor eller subgenomiske polynukleotider kan også anvendes. Teknikker for reseptorformidlet DNA-tilførsel beskrives for eksempel i Findeis et al., Trens Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of direct Gene Transfer (J.A. Wolff, red.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem.

(1991) 266:338. Terapeutiske preparater som inneholder et polynukleotid administreres i en mengde på fra omtrent 100 ng til omtrent 200 ng DNA for lokal tilførsel etter en genterapi protokoll. Konsentrasjonsområder fra omtrent 500 ng til omtrent 50 mg, fra omtrent 1^g til omtrent 2 mg, fra omtrent 5^g til omtrent 500^g og fra omtrent 20^g til omtrent 100^g DNA kan også anvendes etter en genterapi protokoll. De terapeutiske polynukleotidene og polypeptidene kan tilføres ved anvendelse av gentilførselsbærere. Gentilførselsbæreren kan være av viralt eller ikke-viralt opphav (se generelt Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51, Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185 og Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148. Ekspresjon av slike kodende sekvenser kan induseres ved anvendelse av endogene pattedyrspromotere eller heterologe promotere. Ekspresjonen av den kodende sekvens kan være enten konstitutiv eller regulert. Virusbaserte vektorer for administrering av et ønsket polynukleotid og ekspresjon i en ønsket celle er velkjente innen faget. Eksempler på virusbaserte bærere omfatter rekombinante retrovirus (se f. eks. PCT-patentskriftene WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, U.S. patentskrift nr.

5 219 740 og 4 777 127, britisk patentskrift nr. 2 200 651 og EP patentskrift nr.

0 345 242), a-virusbaserte vektorer (f. eks. Sindbis-virusvektorer, Semliki forest-virusvektorer (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), Ross River-virusvektorer (ATCC VR-373, ATCC VR-1246) og Venezuelsk equine encefalitt-virusvektorer (ATCC VR-923, ATCC VR-1250, ATCC VR-1249, ATCC VR-532)) og adenoassosiert virus (AAV)-vektorer (se f. eks. PCT-patent-skriftene WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984 og WO 95/00655). Administrering av DNA koblet til drept adenovirus som beskrevet i Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147 kan også benyttes.

Ikke-virale tilførselsbærere og fremgangsmåter kan også benyttes, innbefattet polykationisk kondensert DNA koblet eller ikke koblet til drept adenovirus alene (se f. eks. Curiel, Hum. Gen. Ther. (1992) 3:147), ligandbundet DNA (se f. eks. Wu, J. Biol. CHem.

(1989) 264:16985), tilførselsbærere basert på eukaryote celler (se f. eks. U.S. patentskrift nr. 5 814 482, PCT-patentskriftene WO 95/07994, WO 96/17072, WO 95/30763 og WO 97/42338) og kjerneladnings nøytralisering eller fusjon med cellemembraner. Nakent DNA kan også benyttes. Eksempler på innføringsfremgangsmåter for nakent DNA beskrives i PCT patentskrift WO 90/11092 og U.S. patentskrift nr. 5 580 859. Liposomer som kan fungere som gentilførselsbærere beskrives i U.S. patentskrift nr. 5 422 120, PCT-patentskriftene WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 og EP 0524968. Ytterligere tilnærminger beskrives i Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 og i Woffendin, Proe. Nati. Acad. Sei (1994) 91:1581.

Identifisering av anta<g>onistiske anti- NGF- antistoffer

Antagonistiske anti-NGF-antistoffer kan identifiseres eller karakteriseres ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjente innen faget, hvorved reduksjon, lindring eller nøytralisering av en biologisk aktivitet forbundet med NGF påvises og/eller måles. For eksempel kan en kinasereseptoraktiverings (KIRA)-analyse som beskrevet i U.S. patentskrifter nr. 5 766 863 og 5 891 650 anvendes for påvisning av anti-NGF-midler. Denne analysen av ELISA-type er egnet for kvalitativ eller kvantitativ måling av kinaseaktivering ved måling av autofosforyleringen av kinasedomenet i en reseptor-proteintyrosinkinase (i det påfølgende betegnet "rPTK"), for eksempel TrkA-reseptoren, så vel som for påvisning og karakterisering av mulige antagonister av en valgt rPTK, for eksempel TrkA. Det første stadium av analysen omfatter fosforylering av kinasedomenet i en kinasereseptor, for eksempel en TrkA-reseptor, hvor reseptoren foreligger i cellemembranen hos en eukaryot celle. Reseptoren kan være en endogen reseptor, eller nukleinsyrer som koder for reseptoren eller en reseptorkonstruksjon kan transformeres inn i cellen. Typisk belegges en første fast fase (f. eks. en brønn i en første analyseplate) med en i det vesentlige homogen populasjon av slike celler (vanligvis en pattedyrs cellelinje), slik at cellene adhererer til den faste fase. Cellene er ofte adherente og adherer derfor naturlig til den første faste fase. Dersom en "reseptorkonstruksjon" anvendes omfatter denne vanligvis en fusjon mellom en kinasereseptor og et flagg-polypeptid. Flagg-polypeptidet gjenkjennes av innfangingsmiddelet, ofte et innfangings antistoff, i ELISA-delen av analysen. En analytt, for eksempel en kandidat til et antagonistisk anti-NGF-antistoff, tilsettes så sammen med NGF til brønnene med de adherente cellene, slik at tyrosinkinase-reseptoren (slik som TrkA-reseptoren) eksponeres ovenfor (eller settes i kontakt med) NGF og analytten. Denne analysen tillater påvisning av antistoffer som inhiberer aktivering av TrkA ved liganden NGF. Etter eksponering ovenfor NGF og analytten solubiliseres de adherende cellene ved anvendelse av en lyseringsbuffer (som har en solubiliserende detergent i seg) og forsiktig agitasjon, hvorved det frigjøres cellelysat som kan gjennomgå ELISA-delen av analysen direkte uten behov for oppkonsentrering eller klaring av cellelysatet.

Det således fremstilte cellelysat er nå klart for å gjennomgå ELISA-stadiet av analysen. Som et første trinn i ELISA-stadiet belegges en andre fastfase (vanligvis en brønn i en ELISA-mikrotiterplate) med et innfangingsmiddel (ofte et innfangings antistoff) som bindes spesifikt til tyrosinkinase-reseptoren, eller når det gjelder en reseptorkonstruksjon, til flagg-polypeptidet. Belegningen av den andre faste fasen utføres slik at innfangingsmiddelet adhererer til den andre faste fase. Innfangingsmiddelet er generelt et monoklonalt antistoff, men som beskrevet i eksemplene her kan polyklonale antistoffer også anvendes. Det erholdte cellelysat eksponeres så ovenfor eller settes i forbindelse med det adhererende innfangingsmiddel slik at reseptoren eller reseptor-konstruksjonen adhererer til (eller innfanges i) den andre faste fasen. Et vasketrinn utføres så for fjerning av ubundet cellelysat, slik at innfanget reseptor eller reseptorkonstruksjon blir tilbake. Den adhererende eller innfangede reseptor eller reseptorkonstruksjon eksponeres så ovenfor eller settes i forbindelse med et anti-fosfotyrosin antistoff som påviser fosforylerte tyrosinrester i tyrosinkinase-reseptoren. I én utførelsesform er anti-fosfotyrosin antistoffet konjugert (direkte eller indirekte) til et enzym som katalyserer en fargeendring av et ikke-radioaktivt fargereagens. Følgelig kan fosforylering av reseptoren måles ved en påfølgende fargeendring av reagenset. Enzymet kan være direkte bundet til anti-fosfotyrosin antistoffet, eller et konjugerende molekyl (f. eks. biotin) kan være konjugert til anti-fosfotyrosin antistoffet og enzymet deretter bindes til anti-fosfotyrosin antistoffet via det konjugerende molekyl. Endelig kan binding av anti-fosfotyrosin antistoffet til den innfangede reseptor eller reseptorkonstruksjon måles, foreksempel ved fargeendringen i fargereagenset.

Det antagonistiske anti-NGF-antistoff kan også påvises ved å innkubere et kandidatmiddel med NGF og måle én eller flere av følgende egenskaper: (a) binding til NGF og inhibering av biologisk aktivitet forbundet med NGF eller nedstrøms reaksjonsveier som formidles ved NGF-signalfunksjoner, (b) inhibering, blokking eller reduksjon av NGF-reseptoraktivering (innbefattet TrkA-dimerisering og/eller -autofosforylering), (c) økt clearance av NGF, (d) behandling eller forebyggelse av hvilket som helst aspekt ved smerte forbundet med reumatoid artritt eller osteoartritt, (e) inhibering (reduksjon) av NGF-syntese, -dannelse eller -frigjøring. I noen utførelsesformer påvises et antagonistisk anti-NGF-antistoff ved å innkubere et kandidatmiddel med NGF og måle binding og/eller med-følgende reduksjon eller nøytralisering av en biologisk aktivitet forbundet med NGF. Bindingsanalysen kan utføres med ett eller flere rensede NGF-polypeptider eller med celler som naturlig uttrykker eller er transfektert til å uttrykke ett eller flere NGF-polypeptider. I én utførelsesform er bindingsanalysen en kompetitiv bindingsanalyse, hvor evnen til et kandidat-antistoff til å konkurrere med en kjent anti-NGF-antagonist om NGF-binding evalueres. Analysen kan utføres i forskjellige formater, innbefattet ELISA-formatet. I andre utførelsesformer påvises et antagonistisk anti-NGF-antistoff ved å innkubere et kandidatmiddel med NGF og måle binding og påfølgende inhibering av trkA-reseptordimerisering og/eller -autofosforylering.

Etter den innledende identifiseringen kan aktiviteten til en kandidat for et antagonistisk anti-NGF-antistoff videre bekreftes og forfines ved bioanalyser som måles i de ønskede biologiske aktiviteter. Alternativt kan bioanalyser anvendes for direkte gjennom- søking av kandidater. For eksempel fremmer NGF en rekke morfologisk gjenkjennbare endringer i responderende celler. Disse omfatter fremmet differensiering av PC12-celler og fremmet vekst av neuritter fra disse cellene (Greene et al., Proe Nati Acad Sei USA 73(7):2424-8, 1976), fremmet neuritt-utvekst fra eksplantater av responderende sensoriske og sympatiske ganglier (Levi-Montalcini, R. og Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48:534-569, 1968) og fremmet overlevelse av NGF-avhengige neuroner, slik som neuroner fra embryonal dorsalrot ganglion, trigeminal ganglion eller sympatisk ganglion (se f. eks. Chun & Patterson, Dv. Biol. 75:705-711 (1977); Buchman & Davies, Development 118:989-1001 (1993). Således omfatter analysen for inhibering av biologisk aktivitet forbundet med NGF dyrking av NGF-responderende celler med NGF pluss en analytt, slik som en kandidat til et antagonistisk anti-NGF-antistoff. Etter et egnet tidsrom vil celleresponsen analyseres (celledifferensiering, neurittutvekst eller celleoverlevelse).

Evnen til en kandidat til et antagonistisk anti-NGF-antistoff til å blokkere eller nøytralisere en biologisk aktivitet forbundet med NGF kan også anslås ved å måle kandidat-middelets evne til å inhibere NGF-formidlet overlevelse i bioanalysen av overlevelse av embryonale rotte-dorsalrot ganglier som beskrevet i Hongo et al., Hybridoma 19:215-227

(2000).

Administrering av et antagonistisk anti- NGF- antistoff

Det antagonistiske anti-NGF-antistoff kan administreres til et individ (for reumatoid artritt og osteoartritt) via enhver egnet tilførselsvei. En fagperson vil forstå at eksemplene som er beskrevet her kun er illustrerende for de tilgjengelige teknikker. I noen utførelses-former administreres følgelig det antagonistiske anti-NGF-antistoff til et individ i samsvar med kjente fremgangsmåter, for eksempel ved intravenøs administrereing, f. eks. som en bolusinjeksjon eller ved kontinuerlig infusjon over et tidsrom, intra-muskulært, intraperitonealt, intracerebrospinalt, subkutant, intraartikulært, sublingualt, intrasynovialt, ved insufflasjon, intratekalt, oralt, ved inhalering eller topisk. Administreringen kan være systemisk, f. eks. intravenøs administrering, eller lokalisert. Kommersielt tilgjengelige nebulisatorer for væskepreparater, innbefattet jet-nebulisatorer og ultralyd nebulisatorer er anvendbare for administrering. Flytende preparater kan direkte nebuliseres, og frysetørket pulver kan nebuliseres etter rekonstituering. Alternativt kan antagonistisk anti-NGF-antistoff overføres til en aerosol ved anvendelse av et fluorkarbonpreparat og en inhalator for utmålte doser, eller inhaleres som et frysetørket og malt pulver.

I én utførelsesform administreres et antagonistisk anti-NGF-antistoff ved setespesifikke eller målstyrte teknikker for lokal tilførsel. Eksempler på teknikker for sete-spesifikk eller målstyrt lokal tilførsel omfatter forskjellige implanterbare deponeringskilder for det antagonistiske anti-NGF-antistoff eller kateter for lokal tilførsel, slik som infusjons-kateteret, iboende kateter eller et kanyle kateter, syntetiske transplantater, adventitium omslag, shunter, stent eller andre implanterbare innretninger, setespesifikke bærere, direkte injeksjon eller direkte påføring. Se f. eks. PCT-patentskrift WO 00/53211 og U.S. patentskrift 5 981 568.

Forskjellige formuleringer av et antagonistisk anti-NGF-antistoff kan anvendes for administreringen. I noen utførelsesformer kan det antagonistiske anti-NGF-antistoff administreres i ren form. I noen utførelsesformer kan antagonistisk anti-NGF-antistoff og en farmasøytisk aksepterbar ekspiens foreligge i forskjellige formuleringer. Farmasøytisk aksepterbare eksipienser er kjente innen faget og er relativt inerte forbindelser som letter administreringen av en farmakologisk effektiv forbindelse. En eksipiens kan for eksempel gi form eller konsistens, eller fungere som et fortynningsmiddel. Egnede eksipienser omfatter stabilisatorer, fuktnings- og emulsjonsmidler, salter for variering av osmolariteten, innkapslingsmidler, buffere og midler som fremmer penetrering av hud. Eksipienser som formuleringer for parenteral og ikke-parenteral legemiddel tilførsel beskrives i Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20. utgave Mack Publishing (2000).

I noen utførelsesformer utformes disse midlene for administrering ved injeksjon (f. eks. intraperitonealt, intravenøst, subkutant, intramuskulært osv.). Følgelig kan disse midlene kombineres med farmasøytisk aksepterbare bærestoffer som saltvann, Ringers løsning, dekstroseløsning og lignende. Det faktiske doseringsskjema, dvs. dosering, tidspunkt og gjentagelse vil avhenge av individet som skal behandles og dets medisinske historie.

Et anti-NGF-antistoff kan administreres ved anvendelse av enhver egnet fremgangsmåte, innbefattet ved injeksjon (f. eks. intraperitonealt, intravenøst, subkutant, intramuskulært osv.). Anti-NGF-antistoffer kan også tilføres ved inhalering, som beskrevet her. For administrering av anti-NGF-antistoffer kan generelt en innledende utgangsdose være omtrent 2 mg/kg. For formålet til den foreliggende oppfinnelse kan en typisk daglig dose variere fra omtrent hvilken som helst av 1^ig/kg til 3ug/kg til 30^ig/kg til 300^ig/kg til 3 mg/kg til 30 mg/kg til 100 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene som er nevnt ovenfor. For eksempel kan et anti-NGF-antistoff tilføres i en mengde på omtrent 1^ig/kg, omtrent 10 ug/kg, omtrent 20 ug/kg, omtrent 50 ug/kg, omtrent 100^ig/kg, omtrent 200^g/kg, omtrent 500^ig/kg, omtrent 1 mg/kg eller omtrent 2 mg/kg. For gjentatt administrering over flere dager eller mer fortsettes behandlingen, avhengig av tilstanden, inntil en ønsket undertrykkelse av symptomene opptrer eller inntil et terapeutisk nivå som er tilstrekkelig til å redusere smerte oppnås. Et eksempel på et doseringsskjema omfatter administrering av en innledende dose på omtrent 2 mg/kg, fulgt av en ukentlig vedlikeholdsdose på omtrent 1 mg/kg av anti-NGF-antistoffet, eller fulgt av en vedlikeholdsdose på omtrent 1 mg/kg annenhver uke. Imidlertid kan andre doseringsskjemaer være anvendbare, avhengig av mønsteret for farmakokinetisk nedbrytning som den utøvende lege ønsker å oppnå. I noen utførelsesformer omfatter for eksempel dosering fra en til fire ganger ukentlig. Behandlingens forløp kan lett følges ved konvensjonelle teknikker og analyser. Doseringsskjemaet (innbefattet hvilken eller hvilke NGF-antagonister som anvendes) kan variere over tid.

For formålet til den foreliggende oppfinnelse vil den egnede dose av et antagonistisk anti-NGF-antistoff avhenge av det benyttede antagonistiske anti-NGF-antistoff (eller preparater derav), type og omfang av smerten som skal behandles, hvorvidt middelet administreres for forebyggende eller terapeutiske formål, tidligere behandling, pasientens kliniske historie og respons på middelet, og den behandlende leges vurderinger. Klinikeren vil typisk tilføre et antagonistisk anti-NGF-antistoff inntil man når en dose som gir det ønskede resultat. Dose og/eller hyppighet kan variere over behandlingsforløpet.

Empiriske betraktninger, for eksempel halveringstiden, vil vanligvis bidra til bestemmelse av dosen. For eksempel kan antistoffer som er forenelige med det humane immunsystem, slik som humaniserte antistoffer eller fult ut humane antistoffer, anvendes for å forlenge antistoffets halveringstid og for å forhindre at antistoffet angripes av vertens immunsystem. Frekvensen av administrering kan bestemmes og justeres i løpet av behandlingen og er vanligvis, men ikke nødvendigvis, bygd på behandling og/eller undertrykkelse og/eller lindring og/eller forsinkelse av smerte. Alternativt kan formuleringer for vedvarende, kontinuerlig frigjøring av antagonistiske anti-NGF-antistoffer være egnede. Forskjellige formuleringer og innretninger for å oppnå vedvarende frigjøring er kjente innen faget.

I én utførelsesform kan dosering av et antagonistisk anti-NGF-antistoff bestemmes empirisk i individer som har blitt gitt én eller flere administrerin(er) av et antagonistisk anti-NGF-antistoff. Individer gis økende doser av et antagonistisk anti-NGF-antistoff. For å anslå virkningen av et antagonistisk anti-NGF-antistoff kan en smerteindikator følges.

Administrering av et antagonistisk anti-NGF-antistoff i samsvar med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan være kontinuerlig eller intermitterende, avhengig av for eksempel mottagerens fysiologiske tilstand, hvorvidt formålet med administreringen er terapeutisk eller profylaktisk og andre faktorer som er kjente blant erfarne utøvere. Administreringen av et antagonistisk anti-NGF-antistoff kan være i det vesentlige kontinuerlig over et på forhånd valgt tidsrom, eller den kan skje i en serie av doser adskilt i tid, for eksempel enten før, under eller etter utvikling av smerte, før, under, før og etter, under og etter, før og under eller før, under og etter utvikling av smerte.

I noen utførelsesformer kan mer enn et antagonistisk anti-NGF-antistoff foreligge. Minst ett, minst to, minst tre, minst fire, minst fem forskjellige eller flere antagonistiske anti-NGF-antistoffer kan foreligge. Vanligvis har disse antagonistiske anti-NGF-antistoffene komplementerende aktiviteter som ikke på uønsket måte påvirker hverandre.

Terapeutiske formuleringer av det antagonistiske anti-NGF-antistoff som anvendes i samsvar med foreliggende oppfinnelse fremstilles for lagring ved å blande et antistoff med den ønskede renhetsgrad med om ønskelig farmasøytisk aksepterbare bærestoffer, eksipienser eller stabilisatorer (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20. utgave, Mack Publishing (2000)), i form av frysetørkede formuleringer eller vandige løsninger. Aksepterbare bærestoffer, eksipienser eller stabilisatorer er ikke-toksiske for mottageren i de benyttede doser og konsentrasjoner og kan omfatte buffere som fosfat, citrat og andre organiske syrer, salter som natriumklorid, antioksidanter, innbefattet askorbinsyre og metionin, konserveringsmidler (slik som oktadecyldimetylbenzyl-ammoniumklorid, heksametoniumklorid, benzalkoniumklorid, benzetioniumklorid, fenol, butyl- eller benzylalkohol, alkylparabener, slik som metyl- eller propylparaben, katechol, resorcinol, sykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol), lavmolekylære polypeptider (med mindre enn omtrent 10 aminosyrerester), proteiner, foreksempel serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer som polyvinylpyrrolidon, aminosyrer som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater, innbefattet glukose, mannose eller dekstriner, chelateringsmidler som EDTA, sukkere som sukkrose, mannitol, trehalose eller sorbitol, saltdannende motioner som natrium, metallkomplekser (f. eks. Zn-proteinkomplekser) og/eller ikke-ioniske overflateaktive midler som "Tween", "Pluronics" eller polyetylenglykol (PEG).

Liposomer som inneholder det antagonistiske anti-NGF-antistoff fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innen faget, slik som beskrevet i Epstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:2577 (1985); Hwang et al., Proe. Nati Acad. Sei. USA 77:4030 (1980) og U.S. patentskrifter nr. 4 485 045 og 4 544 545. Liposomer med forlenget sirkulasjonstid beskrives i U.S. patentskrift nr. 5 013 556. Spesielt anvendbare liposomer kan fremstilles ved reversfase-inndampingsfremgangsmåten med et lipidpreparat som omfatter fosfatidy I - cholin, kolsterol og PEG-derivatisert fosfatidyletanolamin (PEG-PE). Liposomer ekstruderes gjennom filtere med definert porestørrelse for erholdelse av liposomer med den ønskede diameter.

De aktive bestanddelene kan også innfanges i mikrokapsler, for eksempel fremstilt ved koacervasjonsteknikker eller ved interfase polymerisering, for eksempel hydroksymetyl-cellulose- eller gelatin-mikrokapsler, henholdsvis poly(metylakrylat)-mikrokapsler i kolloidale medikamenttilførselssystemer (foreksempel liposomer, albuminmikrokuler, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker beskrives i Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20. utgave Mack Publishing

(2000).

Preparater for vedvarende frigjøring kan fremstilles. Egnede eksempler på preparater for vedvarende frigjøring omfatter semipermable støttemidler av faste, hydrofobe polymerer som inneholder antistoffet, hvor støttemidlene foreligger i form av utformede artikler, for eksempel filmer, deler mikrokapsler. Eksempler å støttemidler for vedvarende frigjøring omfatter polyestere, hydrogeler (slik som poly(2-hydroksyetyl- metakrylat) eller poly(vinylalkohol)), polylaktider (U.S. patentskrift nr. 3 773 919), kopolymerer av L-glutaminsyre og 7-etyl-L-glutamat, ikke-degraderbar etylen-vinylacetat, degraderbare melkesyre-glykolsyre kopolymerer som "Lupron Depot" (injiserbare mikro-kuler bestående av melkesyre-glykolsyre-kopolymer og leuprolidacetat), sukkroseacetat-isobutyrat og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre.

Formuleringen som skal anvendes for in wVo-tilførsel må være sterile. Dette oppnås lett ved for eksempel filtrering gjennom sterile filtreringsmembraner. Terapeutiske preparater av antagonistisk anti-NGF-antistoff plasseres generelt i en beholder med en steril tilgangsåpning, for eksempel en pose for intravenøs løsning eller en ampulle med en kork som kan gjennomtrenges av en injeksjonskanyle).

Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan foreligge i en enhetsdose form, slik som som tabletter, piller, kapsler, pulvere, granulater, løsninger eller suspensjoner, eller som stikkpiller, for oral, parenteral eller rektal administrering eller for administrering ved inhalering eller insufflasjon.

For fremstilling av faste preparater som tabletter blandes den aktive hovedbestand-del med et farmasøytisk bærestoff, f. eks. konvensjonelle tabletteringsbestanddeler slik som maisstivelse, laktose, sukkrose, sorbitol, talkum, stearinsyre, magnesiumstearat, dikalsium-fosfat eller gummier, eller andre farmasøytiske fortynningsmidler, f. eks. vann, slik at det dannes et fast preformuleringsspreparat som omfatter en homogen blanding av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse eller et ikke-toksisk, farmasøytisk aksepterbart salt derav. Når disse preformuleringspreparatene beskrives som homogene, menes at den aktive bestanddel er jevnt fordelt gjennom preparatet slik at preparatet lett kan oppdeles i enhetsdoseformer med samme effektivitet, slik som tabletter, piller og kapsler. Dette faste preformuleringspreparatet deles så opp i enhetsdoseformer av typene beskrevet ovenfor inneholdende fra 0,1 til omtrent 500 mg aktiv bestanddel ifølge foreliggende oppfinnelse. Tablettene eller pillene av det nye preparat kan belegges eller på annet vis settes sammen slik at det fremskaffes en doseringsform som gir fordelene forbundet med forlenget virkning. For eksempel kan tabletten eller pillen omfatte en indre doseringsbestanddel og en ytre doseringsbestanddel, hvor den siste foreligger som en slags kappe over den første. De to bestanddelene kan være adskilt av et enterisk lag som bidrar til å motstå disintegrasjon i magen og gjør at den indre bestanddel kan passere intakt inn i tolvfingertarmen eller slik at frigjøringen forsinkes. En rekke materialer kan anvendes for slike enteriske lag eller belegg, blant annet en rekke polymere syrer og blandinger av polymere syrer med materialer som skjellakk, cetylalkohol og celluloseacetat.

Egnede overflateaktive midler omfatter spesielt ikke-ioniske midler, slik som poly-oksyetylensorbitaner (slik som "Tween" 20, 40, 60, 80 eller 85) og andre sorbitaner (f. eks. "Span" 20, 40, 60, 80 eller 85). Preparater med et overflateaktivt middel vil med fordel omfatte mellom 0,05 og 5 % overflateaktivt middel og kan inneholde mellom 0,1 og 2,5 %. Det vil forstås at andre bestanddeler kan tilsettes om nødvendig, for eksempel mannitol eller andre farmasøytisk aksepterbare bærestoffer.

Egnede emulsjoner kan fremstilles ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige fettemulsjoner, for eksempel "Intralipid", "Liposyn", "Infonutrol", "Lipofundin" og "Lipiphysan". Den aktive bestanddel kan enten oppløses i et ferdigblandet emulsjons-preparat eller alternativt oppløses i en olje (f. eks. soyabønne olje, safrantistel olje, bomullsfrø olje, sesamolje, maisolje eller mandelolje) og en emulsjon dannes ved blanding med et fosfolipid (f. eks. eggfosfolipier, soyabønne fosfolipider eller soyabønne lecitin) og vann. Det vil forstås at andre bestanddeler kan tilsettes, for eksempel glyserol eller glukose, for å justere emulsjonens tonisitet. Egnede emulsjoner vil typisk inneholde opp til 20 % olje, for eksempel mellom 5 og 20 %. Fettemulsjonen kan omfatte fettdråper på mellom 0,1 og 1,0^m, fortrinnsvis 0,1 og 0,5^m, og ha en pH i området mellom 5,5 og 8,0.

Emulsjonspreparatene kan være preparater fremstilt ved å blande et nervevekstfaktor antistoff med "Intralipid" eller dettes bestanddeler (soyabønne olje, eggfosfolipider, glyserol og vann).

Preparater for inhalasjon eller insufflasjon omfatter løsninger og suspensjoner i farmasøytisk aksepterbare, vandige eller organiske løsemidler eller blandinger derav, og pulvere. De flytende eller faste preparatene kan inneholde egnede farmasøytisk aksepterbare eksipienser som beskrevet ovenfor. I noen utførelsesformer administreres preparatene ved den orale eller nasale respiratoriske vei for lokal eller systemisk virkning. Preparater i fortrinnsvis sterile, farmasøytisk aksepterbare løsemidler kan nebuliseres ved anvendelse av gasser. Nebuliserte løsninger kan innåndes direkte fra nebuliseringsinnretningen, eller nebuliseringsinnretningen kan være koblet til en ansiktsmaske, et telt eller en innåndings-maskin med periodisk positivt trykk. Preparater i løsning, suspensjon eller pulvere kan administreres, fortrinnsvis oralt eller nasalt, innretninger som leverer utformingen på en egnet måte.

Behandlingens virkning kan anslås ved fremgangsmåter som er velkjente innen faget.

Sett omfattende antistoffer og polynukleotider ifølge oppfinnelsen

Oppfinnelsen tilveiebringer også sett som omfatter antistoffer eller polypeptider for anvendelse i påvisning og/eller behandling. I noen utførelsesformer omfatter settene følgelig et antistoff E3. I noen utførelsesformer omfatter settet ethvert antistoff eller polypeptid som er beskrevet her.

I andre aspekter kan settene anvendes for hvilke som helst av fremgangsmåtene som er beskrevet her, innbefattet for eksempel å behandle et individ med smerte forbundet med osteoartritt. Settene ifølge foreliggende oppfinnelse foreligger i egnet innpakning og kan om ønskelig omfatte ytterligere bestanddeler, slik som buffere og instruksjoner for anvendelse av antistoffet i hvilke som helst av fremgangsmåtene som er beskrevet her. I noen utførelsesformer omfatter settene instruksjoner for behandling av smerte. I noen utførelsesformer omfatter settet et antagonistisk anti-NGF-antistoff som beskrevet her og instruksjoner for behandling og/eller forebyggelse av smerte forbundet med osteoartritt i et individ. I noen av utførelsesformene er det antagonistiske anti-NGF-antistoff antistoff E3.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen sett som omfatter et polynukleotid som koder for et E3-polypeptid som beskrevet her. I noen utførelsesformer omfatter settene videre instruksjoner for anvendelse av polynukleotidet i hvilke som helst av fremgangsmåtene som er beskrevet her.

Fremgangsmåter for justering av affiniteten til et antistoff og fremgangsmåter for karakterisering av en CDR

Vi har utviklet en ny fremgangsmåte for karakterisering av en CDR i et antistoff og/eller for endring (slik som forbedring) av bindingsaffiniteten til et polypeptid, slik som et antistoff, som betegnes "bibliotekskannings-mutagenese". Vanligvis fungerer bibliotekskannings-mutagenese som følger: Én eller flere aminosyreposisjoner i CDRen erstattes med to eller flere (slik som 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20) aminosyrer ved anvendelse av fremgangsmåter som er anerkjente innen faget. Dette gir små biblioteker av kloner (i noen utførelsesformer en klon for hver analyserte aminosyreposisjon), alle med en kompleksitet på to eller flere medlemmer (dersom to eller flere aminosyrer innføres i hver posisjon). Vanligvis omfatter biblioteket også en klon som omfatter den native (ikke substituerte) aminosyre. Et lite antall kloner (f.eks. omtrent 20-80 kloner (avhengig av kompleksiteten til biblioteket), fra hvert bibliotek analyseres for bindingsaffinitet til målpolypeptidet, og kandidater med forhøyet, lik, redusert eller ingen binding påvises. Fremgangsmåter for bestemmelse av bindingsaffinitet er velkjente innen faget. I noen utførelsesformer bestemmes bindingsaffiniteten ved anvendelse av BIAcore overflateplasmon resonansanalyse, som påviser forskjeller i bindingsaffinitet på omtrent 2-fold eller mer. BIAcore er spesielt nyttig dersom utgangsantistoffet allerede bindes med relativt høy affinitet, for eksempel en KDpå omtrent 10 nM eller lavere. Analyse ved anvendelse av BIAcore overflateplasmon resonans er beskrevet i eksemplene her.

I andre utførelsesformer bestemmes bindingsaffinitet ved anvendelse av Kinexa Biocensor, scintillasjons proksimitetsanalyser, ELISA, ORIGEN immunanalyse (IGEN), fluorescensblokkering, fluorescensoverføring og/eller gjærfremvisning. I andre utførelses-former analyseres bindingsaffinitet ved anvendelse av en egnet bioanalyse.

I noen utførelsesformer erstattes hver aminosyreposisjon i en CDR (i noen utførelsesformer, én om gangen) med alle de 20 naturlig aminosyrene ved anvendelse av mutagenesefremgangsmåter som er anerkjente innen faget (av hvilke noen er beskrevet her). Dette gir små biblioteker av kloner (i noen utførelsesformer én for hver aminosyre posisjon som analyseres), hver med en kompleksitet på 20 medlemmer (dersom alle 20 aminosyrer innføres i hver posisjon).

I noen utførelsesformer omfatter biblioteket som skal gjennomsøkes substitusjoner i to eller flere posisjoner, som kan være i samme CDR eller i to eller flere CDRer. I noen utførelsesformer omfatter således biblioteket substitusjoner i to eller flere posisjoner i én CDR. I andre utførelsesformer omfatter biblioteket substitusjoner i to eller flere posisjoner i to eller flere CDRer. I ytterligere andre utførelsesformer omfatter biblioteket substitusjon i 3, 4, 5 eller flere posisjoner, hvor disse posisjonene foreligger i to, tre, fire, fem eller seks CDRer. I noen utførelsesformer innføres substitusjonen ved anvendelse av kodoner med lav grad av degenererthet. Se f. eks. Tabell 2 i Balint et al., (1993) Gene 137(1): 109-18).

I noen utførelsesformer er den angjeldende CDR CDRH3 og/eller CDRL3. I andre utførelsesformer er den angjeldende CDR én eller flere av CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 og/eller CDRH3. I noen utførelsesformer er den angjeldende CDRen en Kabat-CDR, en Chothia-CDR eller en utvidet CDR.

Kandidater med forbedret binding kan sekvenseres, hvorved det identifiseres en CDR-substitusjonsmutant som fører til forbedret affinitet (også betegnet en "forbedret" substitusjon). For eksempel tillot, som påvist i Eksempel 1, anvendelse av denne fremgangsmåten påvisning av en enkelt substitusjon som forbedret bindingen, selv når anslagsvis 18 andre substitusjoner i samme aminosyreposisjon førte til ingen binding (dvs. tap av antistoffunksjonen). Kandidater som bindes kan også sekvenseres, hvorved det påvises en CDR-substitusjon som gir bibeholdt binding.

I noen utførelsesformer gjennomføres flere runder med gjennomsøking. For eksempel er kandidater (alle omfatter en aminosyresubstitusjon i én eller flere posisjoner i én eller flere CDRer) med forbedret binding også nyttige for utforming av et andre bibliotek som inneholder minst den opprinnelige og substituerte aminosyre i hver forbedrede CDR-posisjon (dvs. aminosyreposisjonen i den angjeldende CDR hvor en substitusjonsmutant viste forbedret binding). Fremstilling av, gjennomsøking av eller seleksjon i dette bibliotek er diskutert videre nedenfor.

Bibliotekskannings-mutagenese gir også et middel for karakterisering av en CDR, i den grad hyppigheten av kloner med forbedret binding, samme binding, redusert binding eller ingen binding også gir informasjon vedrørende betydningen av hver aminosyreposisjon for stabiliteten av antistoff-antigen komplekset. Hvis for eksempel en posisjon i den angjeldende CDR gir bibeholdt binding når den endres til alle de 20 aminosyrene, er denne posisjonen påvist som en posisjon som sannsynligvis ikke er nødvendig for antigenbinding. Omvendt, hvis en posisjon i den angjeldende CDR gir bibeholdt binding i kun en lav prosentandel av substitusjonene, er denne posisjon påvist som en posisjon som er viktig for CDR-funksjonen. Fremgangsmåtene forbundet med bibliotekskannings-mutagenese gir derfor informasjon vedrørende posisjonene i de angjeldende CDRer som kan endres til mange forskjellige aminosyrer (innbefattet alle 20 aminosyrer), og posisjoner i de angjeldende CDRer som ikke kan endres eller som kun kan endres til noen få aminosyrer. Dette aspekt diskuteres og eksemplifiseres i Eksempel 1.

I noen utførelsesformer kombineres kandidater med forbedret affinitet i et andre bibliotek som omfatter den forbedrede aminosyren, den opprinnelige aminosyre i den angjeldende posisjon og som videre kan omfatte ytterligere substitusjoner i denne posisjon, avhengig av den ønskede kompleksitet av biblioteket, eller tillatt ved anvendelse av den ønskede gjennomsøkings- eller seleksjonsfremgangsmåte. I tillegg kan, om ønskelig, nabo-aminosyreposisjoner randomiseres til minst to eller flere aminosyrer. Randomisering av nabo-aminosyrer kan tillate ytterligere konformasjonsfleksibilitet i den mutante CDRen, noe som i sin tur kan tillate eller lette innføring av et større antall forbedrende mutasjoner. I noen utførelsesformer omfatter biblioteket også substitusjon i posisjoner som ikke viste forbedret affinitet i første gjennomsøkingsrunde.

Det andre bibliotek gjennomsøkes eller selekteres for biblioteksmedlemmer med forbedret og/eller endret bindingsaffinitet ved anvendelse av hvilken som helst fremgangsmåte som er kjent innen faget, innbefattet gjennomsøking ved anvendelse av BIAcore overflateplasmon resonansanalyse og seleksjon ved anvendelse av hvilken som helst fremgangsmåte som er kjent innen faget for seleksjon, innbefattet bakteriofag fremvisning, gjær fremvisning og ribosom fremvisning.

Fordeler ved fremgangsmåtene for justering av affiniteten til et antistoff og karakterisering av en CDR

Fremgangsmåtene er anvendbare for pre-analyse av CDR-aminosyreposisjoner for påvisning av aminosyresubstitusjoner som gir forbedret binding eller bibeholdt binding. Pre-identifisering av viktige aminosyrerester, substitusjoner som gir forbedret binding og/eller substitusjoner som bibeholder antistoffunksjonen tillater effektiv utforming og gjennom-søking av et affinitetsmodningsbibliotek.

Foreliggende fremgangsmåte er også nyttig for karakterisering av en CDR og gir omfattende informasjon vedrørende betydningen av hver aminosyreposisjon i en CDR for binding til antigen. Den foreliggende fremgangsmåte kan også anvendes for påvisning av substitusjoner som gir forbedret binding.

Bruk av små biblioteker i hvilke hver posisjon kan være randomisert (i noen utførelsesformer, én om gangen) tillater søk etter substitusjonsmutanter ved anvendelse av følsomme fremgangsmåter, for eksempel BIAcore, som gir detaljert kinetisk informasjon. Gjennomsøkingsfremgangsmåter er generelt lite praktiske dersom store biblioteker gjennomsøkes. I stedet benyttes vanligvis seleksjonsfremgangsmåter, slik som bakteriofag fremvisning, gjær fremvisning og ribosom fremvisning, for påvisning av kloner som gir bibeholdt binding. Bakteriofag fremvisning og ELISA-analyser kan i stor grad avhenge av konsentrasjonen av proteinprøven som fremstilles fra klonen, og har således en tendens til i stor grad å gi kloner med forbedret ekspresjon, forbedret stabilitet eller redusert toksisitet, snarere enn påvisning av kloner med forbedret bindingsaffinitet. I tillegg kan forskjeller i klonenens ekspresjonsnivå maskere små forbedringer i bindingsaffiniteten. Disse ulempene er spesielt akutte dersom et antistoff med høy bindingsaffinitet anvendes som utgangs-materiale, siden svært lave antigennivåer må anvendes for at gjennomsøkningen skal være tilstrekkelig stringent.

I motsetning til dette tillater fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, slik som randomisering i hver posisjon (i noen utførelsesformer én posisjon om gangen), innføring og karakterisering av virkningen av substitusjonen, for eksempel alle 20 aminosyrer i en gitt posisjon. Denne analysen gir informasjon vedrørende hvor mange substitusjoner som tolereres i en gitt posisjon (dvs. gir bibeholdt antistoffbinding), noe som i sin tur gir informasjon vedrørende betydningen av hver aminosyre for antistoffunksjonen. Videre kan substitusjoner som fører til forbedret binding påvises, selv under omstendigheter hvor mange eller de fleste substitusjoner i en gitt posisjon gir ikke-funksjonelle (ikke-bindende) antistoffer. I motsetning til dette gir alaninskannings-mutagenese, som hyppig anvendes for påvisning av viktige CDR-posisjoner, informasjon vedrørende hvorvidt substitusjon av alanin tillater eller forhindrer binding. Generelt fjernes posisjoner i hvilke en alaninsubstitusjon forhindrer binding fra affinitetsmodningsbilioteket. I mange tilfeller kan imidlertid alanin være en dårlig substitutt i CDR-posisjonen.

De foreliggende fremgangsmåtene tillater også påvisning og karakterisering av virkningen av enkeltvise CDR-mutasjoner. I motsetning til dette innfører og selekterer fremgangsmåter som bakteriofag fremvisning mange mutasjoner samtidig, noe som kan øke risikoen for at positive mutasjoner vil maskeres grunnet nærvær av en skadelig mutasjon som foreligger i en gitt klon.

De foreliggende fremgangsmåtene er også anvendbare for forbedring av affiniteten, samtidig som bindingsspesifisiteten til det opprinnelige utgangsantistoff bevares, i den grad som de foreliggende fremgangsmåter tillater påvisning av et lite antall mutasjoner (f. eks. 1, 2, 3, 4 eller 5 mutasjoner i en enkelt CDR) som fører til forbedret bindingsaffinitet. I motsetning til dette forbedrer fremgangsmåter som bakteriofag fremvisning typisk bindingsaffiniteten ved anvendelse av flere samtidige mutasjoner, noe som kan føre til at antistoffets spesifisitet forskyves og/eller at uønsket kryssreaktivitet forhøyes.

De påfølgende eksempler gis for å illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Humanisering og affinitetsmodning av det antagonistiske anti-NGF-antistoff 911 fra mus

A. Generelle fremgangsmåter

Følgende generelle fremgangsmåter ble anvendt i dette eksempel.

Fremstilling av bibliotek

Biblioteker ble fremstilt ved PCR-kassettmutagenese med degenererte oligonukleotider som beskrevet i Kay et al. (1996), Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press (se s. 277-291). Kodonet NNK ble anvendt for randomisering av en aminosyreposisjon slik at den omfattet 20 mulige aminosyrer. For randomisering av en aminosyreposisjon slik at den kun omfattet en undergruppe av aminosyrer med spesifikke egenskaper ble kodoner anvendt som beskrevet i Balint et al., (1993) Gene 137(1): 109-18. Setestyrt mutagenese ble utført ved anvendelse av rekombinant PCR som beskrevet i Innis et al., (1990) PCR protocols: A guide to methods and applications (se s. 177-183).

Fab-fremstilling i liten skala

Ekspresjon i liten skala i 96-brønners plater ble optimalisert for gjennomsøking av Fab-biblioteker. Med utgangspunkt i E. coli transformert med et Fab-bibliotek ble kolonier plukket for inokulering av både en hovedplate (agar LB + ampicillin (50 ng/ml) + 2 % glukose) og en arbeidsplate (2 ml/brønn, 96 brønner/plate inneholdende 1,5 ml LB + ampicillin (50 ng/ml) + 2 % glukose). Begge plater ble dyrket ved 30°C i 8-12 timer. Hovedplaten ble lagret ved 4°C, og cellene fra arbeidsplaten ble nedsentrifugert ved 5000 rpm og resuspendert i 1 ml LB + ampicillin (50ng/ml) + 1 mM IPTG for induksjon av Fab-ekspresjon. Cellene ble høstet ved sentrifugering etter 5 timers ekspresjon ved 30°C og så resuspendert i 50 ni buffer HBS-EP (100 mM HEPES-buffer, pH 7,4, 150 mM NaCI, 0,005 % P20, 3 mM EDTA). Lysering av HBS-EP-resuspenderte celler ble oppnådd ved en syklus med frysing (-80°C) og tining ved 37°C. Cellelysatene ble sentrifugert ved 5 000 rpm i 30 minutter for å skille cellerester fra Fab-holdige supernatanter. Supernatantene ble så injisert inn i BIAcore plasmonresonans apparatet for fremskaffelse av affinitetsinformasjon for hvert Fab. Kloner som uttrykte Fab ble gjenvunnet fra hovedplaten for sekvensering av DNA og for produksjon i stor skala og detaljert karakterisering av Fab som beskrevet nedenfor.

Fremstilling av Fab i stor skala

For å oppnå detaljerte kinetiske parametere ble Fab uttrykt og renset fra store kulturer. Erlenmeyer-kolber inneholdende 200 ml LB + ampicillin (50^g/ml) + 2 % glukose ble inokulert med 5 ml av over natt-kultur av en valgt Fab-uttrykkende E. co//'-klon. Klonene ble inkubert ved 30°C inntil en OD55onmpå 1,0 ble oppnådd, og så indusert ved å erstatte mediet med 200 ml LB + ampicillin (50ng/ml) + 1 mM IPTG. Etter 5 timers ekspresjon ved 30°C ble cellene nedsentrifugert og resuspendert i 10 ml PBS (pH 8). Cellene ble lysert ved to fryse/tine sykluser (ved henholdsvis -80°C og 37°C). Supernatant fra cellelysatene ble satt på Ni-NTA superflow Sefarose (Qiagen, Valencia, CA)-kolonner ekvilibrert med PBS,

pH 8, og så vasket med 5 kolonnevolumer PBS, pH 8. Individuelle Fab'er ble eluert i forskjellige fraksjoner med PBS (pH 8) + 300 mM imidazol. Fab-holdige fraksjoner ble slått sammen og dialysert med PBS, og så kvantifisert ved ELISA før affinitetskarakterisering.

Fremstilling av intakt antistoff

For ekspresjon av intakte antistoffer ble lettkjedens og tungkjedens variable områder klonet i to pattedyrs ekspresjonsvektorer (Eb.911.E3 eller Eb.pur.911.3E for lettkjeden og Db.911.3E for tungkjeden, beskrevet her) og transfektert inn i HEK 293-celler ved anvendelse av lipofektamin for transient ekspresjon. Antistoffene ble renset ved anvendelse av protein A og standard fremgangsmåter.

Biacore-analyse

Affiniteten av anti-NGF-Fab og monoklonale antistoffer ble bestemt ved anvendelse av "BIAcore 3000" overflateplasmonresonans (SPR)-systemet (BIACore, Inc., Piscaway, NJ). CM5-brikker ble aktivert med N-etyl-(n'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid-hydroklorid (EDC) og N-hydroksysuksinimid (NHS) ifølge leverandørens instruksjoner. Humant NGF ble fortynnet med 10 mM natriumacetat pH 4,0 og injisert over den aktiverte brikken i en konsentrasjon på 0,005 mg/ml. Ved å variere strømningstiden over de enkelte kanalene i brikken ble to områder med antigentetthet oppnådd: 100-200 responsenheter (RU) for detaljerte kinetiske undersøkelser og 500-600 RU for gjennomsøkingsanalyser. Brikken ble blokkert med etanolamin. Regenereringsstudier viste at en blanding av Pierce elueringsbuffer (produkt nr. 21004, Pierce Biotechnology, Reockford, IL) og 4M NaCI (2:1) effektivt fjernet bundet Fab mens aktiviteten av hNGF ble bibeholdt på brikken for mer enn 200 injeksjoner. HBS-EP-buffer (0,01M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCI, 3 mM EDTA, 0,005 % surfaktant P29) ble anvendt som elueringsbuffer for alle BIAcore-analysene.

Gjennomsøkingsanalyse

En BIAcore-gjennomsøkingsanalyse ble optimalisert for å bestemme affiniteten av Fab-kloner fra biblioteket. Supernatanter fra lysater av små kulturer ble injisert ved 50 nl/min i 2 minutter. Dissosiasjonstider på 10 til 15 minutter ble anvendt for bestemmelse av en enkelt eksponentiell dissosiasjonshastighet (kofT) ved anvendelse av programvaren BIAevaluation. Prøver som viste kofrhastigheter i det samme området som templatet som ble anvendt for fremstilling av biblioteket (klon 8L2-6D5, koff= 1x10 V1) ble injisert for bekreftelse, og dissosiasjonstider på opp til 45 minutter ble tillatt for frembringelse av bedre koff-verdier. Kloner som viste forbedrede (langsommere) k0ff-verdier ble uttrykt i stor skala, og fulle kinetiske parametere, kon og koffble bestemt for renset protein. Analysene kunne påvise affinitetsforskjeller som var omtrent 2-fold eller høyere.

Affinitet bestemmelsesanalyse

Seriefortynninger (0,l-10x forventet KD) for rensede Fab-prøver ble injisert over et tidsrom på 1 min med 100^l/min, og dissosiasjonstider på opp til 2 timer ble tillatt. Konsentrasjonen av Fab-proteine ble bestemt ved ELISA og/eller SDS-PAGE-elektroforese ved anvendelse av et Fab med kjent konsentrasjon (bestemt ved aminosyreanalyse) som standard. Kinetiske assosiasjonshastigheter (kon) og dissosiasjonshastigheter (kofT) ble frembragt samtidig ved å tilpasse målverdiene en 1:1 Langmuir-bindingsmodell (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) ved anvendelse av programmet BIAevaluation. Likevektsdissosiasjonskonstant (KD)-verdier ble beregnet som koff/kon-

B. Humanisering og affinitetsmodning av antagonistisk anti- NGF- antistoff 911 fra mus

Det antagonistiske anti-NGF-antistoff 911 fra mus (se Hongo et al., (2000) Hybridoma 19(3):215-227) ble valgt for humanisering og affinitetsmodning. Mab 911 binder NGF fra menneske og rotte med høy affinitet og viser ingen signifikant kryssreaktivitet med neurotrofinene NT3, NT4/5 eller BDNF. Se Hongo, id. Affiniteten av papainavspaltet Fab-fragment fra muse-Mab 911 ble bestemt ved anvendelse av BIAcore-analyse som beskrevet ovenfor. Det papainavspaltede Fab-fragmentet fra muse-Mab 911 bandt humant NGF med en KDpå omtrent 10 nM.

Humanisering og affinitetsmodning ble utført i flere trinn som følger:

(1) Fremstilling av templat med podete CDR. I utvidede CDR fra lettkjeden i antistoff 911 (dvs. innbefattende både Kabat- og Chothia-CDR-områdene) ble podet inn i de humane kimcellelinje-akseptorsekvensene 08 med JK2, mens de utvidede tungkjede-CDR fra antistoff 911 ble podet inn i den humane kimcellelinje-akseptorsekvens VH4-59 med JH4. Aminosyresekvensene til de humane kimcellelinje-akseptorsekvensene er vist i

Figurene IA og IB. Aminosyrenummereringen er sekvensiell. Ved anvendelse av protein-rammeverkene som er angitt ovenfor ble det utformet DNA-sekvenser for syntetiske gener som koder for humant rammeverk med de angitte muse-CDR. Disse humaniserte variable tungkjede- og lettkjede domenene ble betegnet hVH henholdsvis hVL. Kodoner ble optimalisert for anvendelse i E. coli og hamster. Flere overraskende oligonukleotider (69-90 baser lange) som strakk seg over hele lengden av hVL og hVH med to korte flankerende primere for hver kjede ble anvendt for separat syntese av de to genene ved gjentatt PCR, i det vesentlige som beskrevet i Prodromou et al. (1992) Protein Eng 5(8): 827-9. De resulterende DNA-fragmentene med korrekt lengde ble gelrenset og så klonet inn i et bicistronisk E. coli-ekspresjonsplasmid (ampicillin-resistent). Ekspresjonen av antistoffene var under kontroll av en IPTG-induserbar lacZ-promoter som tilsvarer den beskrevet i Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (se vektor pComb3X, på s. 2.10), imidlertid modifisert ved innføring og ekspresjon av følgende tilleggsdomener: det konstante domenet fra human k-lettkjede (se GenBank aksesjonsbetegnelse CAA09181) og det konstante CHI-domenet fra humant IgG2a-immunglobulin (GenBank aksesjonsbetegnelse P01859).

Aminosyresekvensene til de variable områdene i antistoffet med podet CDR (også betegnet "templatet"), betegnet 8L2-4D5, er også vist i Figurene IA og IB. Affiniteten av 8L2-4D5 ble bestemt ved anvendelse av BIAcore-analysen som beskrevet ovenfor. 8L2-4D5 bandt humant NGF med en KDpå omtrent 38 nM. (2) Innføring av en punktmutasjon i rammeverkssekvensen. Substitusjonen V71K ble innført i tungkjeden med podete CDR ved anvendelse av rekombinant PCR-setestyrt mutagenese som beskrevet i Innis et al., (1995) PCR strategies, San Diego, Academic Press. Denne substitusjonen erstattet den humane rammeverks aminosyrerest med den tilsvarende aminosyrerest fra muserammeverket. Det resulterende antistoff ble betegnet 8L2-6F5, og aminosyresekvensen til tungkjedens variable område i 8L2-6D5 er vist i Figur IA. Affiniteten av 8L2-6D5 ble bestemt ved anvendelse av BIAcore-analysen som beskrevet ovenfor. Fab-fragmentet av 8L2-6D5 bandt humant NGF med en KDpå omtrent 15 nM. 8L2-6D5 ble valgt som templat for affinitetsmodning. (3) Humanisering og affinitetsmodning av CDR LI, L2, Hl og H2. CDR LI, L2, Hl og H2 ble utsatt for humanisering og affinitetsmodning. Aminosyreposisjoner som ikke er essensielle for strukturen av den angjeldende CDR, basert på den kanoniske Chothia-struktur (se Al-Lazikani et al (1997) J. Mol. Biol. 273(4):927-48); ble påvist og utsatt for randomisering som følger: To biblioteker som inneholdt lettkjede mutasjoner eller tungkjede mutasjonene som er vist i Tabell 2 og de podete CDR L3 henholdsvis CDR H3 fra mus ble fremstilt med anvendelse av PCR-kassettmutagenese med degenererte oligonukleotider som beskrevet i Kay et al. (1996), Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press, ved anvendelse av de genererte kodoner som beskrevet I Balint et al, (1993) Gene 137(1): 109-18). Generelt ble aminosyrerestene endret til aminosyrerester som er vandligere i humane antistoffer, basert på sammen-stillinger av antistoff 911-lettkjede- og -tungkjede-aminosyresekvenser med humane kimcellelinje-antistoffsekvenser. Villtype-aminosyreresten (ikke-substituert) forelå også i biblioteket, bortsett fra aminosyrerest 50 i CDR H2, en metionin, hvor viltype-metionin-resten ikke forelå i biblioteket. Metioninrester er utsatt for oksidasjon, erstatning av denne aminosyreresten ble derfor forventet å forbedre stabiliteten av det resulterende antistoff. Fab-bibliotekene ble klonet inn i vektor pComb3X sammen med det humane CH1- og Ck-området som beskrevet ovenfor.

For affinintetsgjennomsøkingseksperimentene ble hvert bibliotek videre parret med den tilsvarende CDR-podede lettkjede eller tungkjede (for eksempel ble Hl/H2-biblioteket parret med CDR-podede lettkjede), antistoffet ble uttrykt og affiniteten av de enkelte klonene overfor humant NGF ble analysert ved anvendelse av BIAcore overflateplasmonresonans (SPR)-systemet (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) ifølge produsentens instruksjoner og som beskrevet ovenfor. KofT, kon og KDble bestemt. Antistoffklonene ble rangert basert på k0ff-hastig heter, siden hovedvariasjonen i affinitet generelt observeres i k0ff-hastigheter og videre siden k0ff-hastigheter er uavhengige av antistoffkonsentrasjonen.

Sekvensen til kloner som bandt ble bestemt, og sekvensen til kloner som bandt er vist i Tabell 3.

CDR inneholdende følgende substitusjoner beholdt bindingen:

CDR- H1

134: S, L, V, I og A bandt

N35: N, T og S bandt.

CDR- H2

M50: M, I, G, Q, S og L bandt

A62: A og S bandt

L63: L og V bandt.

CDR- L1

S26: S og F bandt

D28: D, S, A og Y bandt

H32: H, N og Q bandt.

CDR- L2

Y50: Y bandt

151: I, T, V og A bandt

F54: F bandt

S56: S og T bandt.

CDR inneholdende følgende substitusjoner ble valgt, vanligvis basert på bindings-affiniteten og kombinert i en enkelt klon betegnet H19-L129:

CDR- H1: I34L, N35N (ingen endring)

CDR- H2: M50I, A62A (ingen endring), L63V

CDR- L1: S26S (ingen endring), D28S, H32N

CDR- L2: Y50Y (ingen endring), I51T, F54F (ingen endring), S56S (ingen endring).

Disse mutasjonene ble kombinert (ved å amplifisere H- og L-kjeden med PCR, kutte PCR-produktene og vektor (pRN8) med restriksjonsenzym og utføre en 3-fragment ligering) i en enkelt klon, betegnet H19-L129, som også omfattet de podede CDR H3 og L3. Sekvensen til tungkjedens og lettkjedens variable område i H19-L129 er vist i Figurene IA og IB, og Tabell 4 viser aminosyresekvensen til CDR LI, L2, Hl og H2. H19-L129 bandt NGF med en KDpå omtrent 1 nM, bestemt ved BIAcore-analysen som beskrevet her. (4) Affinintetsmodning av CDR H3 og L3. Affinintetsmodning av CDR H3 og L3 ble utført i to trinn. Først ble hver aminosyrerest i H3 og L3 i en prosess betegnet "bibliotekskannings-mutagenese", analysert hver for seg for å påvise aminosyreposisjoner for hvilke en mutasjon førte til forhøyet bindingsaffinitet til humant NGF. Basert på resultatene fra den bibliotekskannings-mutagenese (også betegnet "randomiserende analyse av små biblioteker") ble en undergruppe av aminosyreposisjoner i H3 og L3 valgt for fremstilling av affinitetsmodningsbiblioteket og affinitetsmodningsbiblioteket ble gjennomsøkt for affinitet ovenfor humant NGF ved anvendelse av BIAcore-analyse som beskrevet her. Det vil forstås at disse teknikkene kan vanligvis benyttes.

(a) Bibliotekskannings-mutagenese

Hver aminosyreposisjon i CDR H3 og L3 ble analysert enkeltvis for substitusjoner som førte til forhøyet bindingsaffinitet til humant NGF. Hyppigheten av aminosyresubstitusjoner i en gitt posisjon som førte til forbedret binding, den samme binding, dårligere binding eller ingen binding ga informasjon vedrørende posisjoner i den angjeldende CDR som kan endres til mange forskjellige aminosyrer (innbefattet alle 20 aminosyrer) og posisjoner i den angjeldende CDR som ikke kan endres eller som kun kan endres til noen få aminosyrer. Aminosyresubstitusjonen som fører til forhøyet bindingsaffinitet ble også påvist. Basert på resultatene kan denne analysen ble en undergruppe av aminosyreposisjoner i CDR H3 og L3 valgt for fremstilling av et affinitetsmodningsbibliotek.

Individuelle Fab-biblioteker hvor hver aminosyre i CDR L3 og H3 var randomisert til alle 20 aminosyrer, én om gangen, ble fremstilt, noe som førte til flere små biblioteker (5 biblioteker for lettkjeden og 13 biblioteker for tungkjeden), hvert med en kompleksitet på 20 aminosyrebiblioteker for hver aminosyreposisjon. I alle tilfeller forelå den native (dvs. uendrede) aminosyren i biblioteket. Bibliotekene ble fremstilt ved PCR-kassettmutagenese med degenererte oligonukleotider som beskrevet i Kay et al. (1996), Phage display of Peptides and Proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press, ved anvendelse av det degenererte kodon NNK for randomisering av én aminosyreposisjon slik at den omfattet 20 mulige aminosyrer. Antistoff 8L2-6F5 (antistoffet med podete CDR og med ramme-verksmutasjonen V71K) fungerte som templat for bibliotekfremstillingen, siden den lavere affinitet av antistoffet med podede CDR tillot enklere påvisning av forskjeller i affinitet for H3- og L3-mutanter eller analyser. Således inneholdt hvert medlem av et bibliotek en CDR3 (enten H3 eller L3) med en aminosyresubstitusjon og 5 podete CDR.

20-80 kloner fra hvert av de små bibliotekene ble analysert ved anvendelse av av BIAcore-analyse som beskrevet her. Prøvene ble samtidig analysert ved BIAcore for bindingsaffinitet ovenfor NGF i en kanal i BIAcore brikken og for nærvær av Fab ved binding til et penta-his-tag antistoff i en annen kanal i sensorbrikken, for påvisning av his-taggen i tungkjedens C-ende. Kloner som uttrykte protein ble klassifisert til å ha samme affinitet, dårligere affinitet, bedre affinitet eller ingen binding, basert på k0ff. Resultatene fra denne analysen er vist i Tabell 5.

Sekvensen til alle kloner med forbedret affinitet ble bestemt, noe som avslørte hyppigheten og identiteten av aminosyresubstitusjoner som fører til forhøyet affinitet. I tillegg ble noen små kloner som bevarte en affinitet som tilsvarte affiniteten til 8I2-6D5-klonen valgt fra hvert bibliotek for å sikre aminosyresekvenssubstitusjoner som var tillatt i en gitt posisjon, selv om substitusjonen ikke nødvendigvis ga forhøyet bindingsaffinitet. Resultatene fra denne analysen er oppsummert i Tabell 6.

Flere mutasjoner førte til forhøyet bindingsaffinitet. I allefall de følgende mutasjonene førte til signifikant forhøyet bindingsaffinitet, sammenlignet med 8L2-6D5-templatet: (H_Y101W (CDR-sekvens GGYWYGTSYYFDY (SEKV. ID. NR. 46)), H_S105A (CDR-sekvens GGYYYGTAYYFDY (SEKV. ID. NR. 47)), H_S105T (CDR-sekvens GGYYYGTTYYFDY (SEKV. ID. NR. 48)), H_G103A (CDR-sekvens GGYYYATSYYFDY (SEKV. ID. NR. 49) og L_S91E (CDR-sekvens QQEKTLPYT (SEKV. ID. NR. 50)).

Resultatene fra dette eksperiment ble anvendt for å styre valget av aminosyreposisjoner for fremstilling av affinintetsmodningsbibliotekene.

Dette eksperimentet ga også informasjon vedrørende hyppigheten av aminosyresubstitusjoner i en gitt posisjon som førte til forbedret binding, samme binding, dårligere binding eller ingen binding, som vist i Tabell 15. Denne informasjonen tillot påvisning av aminosyreposisjoner i de angjeldende CDR som kunne endres til mange forskjellige aminosyrer (innbefattet alle 20 aminosyrer) og posisjoner i de angjeldende CDR som kunne endres til noen få aminosyrer eller svært få aminosyrer (i noen utførelsesformer ingen aminosyrer). Disse resultatene påviste også aminosyresubstitusjoner som ga forhøyet bindingsaffinitet.

(b) Affinitetsmodning

Deretter ble resultatene fra randomiseringsanalysen av de små bibliotekene (ovenfor) anvendt for valg av aminosyrerester for fremstilling av H3- og L3-bibliotekene for affinitetsmodning av CDR H3 og L3. Aminosyrerest Y101 og G103 i CDR H3 og aminosyrerest S91 og K92 i CDR L3 ble valgt for fremstilling av H3- og L3-bibliotenene for affinitetsmodning av CDR H3 og L3.

Dette biblioteket kombinerte mutasjoner i H3 og L3 samtidig i CDR-podet klon 8L2-6D5, og hver for seg i en bakgrunn av H19-L129, og hadde en diversitet på 80 forskjellige kloner. Tabell 7 viser aminosyrerestene som ble valgt for substitusjon og aminosyrene som var substituert i hver posisjon.

Tabell 7. Aminosyrerester i H3 og L3 valgt for substitusjon og aminosyrene som ble substituert i hver posisjon.

CDR-H3:

Y101 ble endret til Y og W, C. (Merk at C ble inkludert, fordi anvendelse av kodon TRS i ett degenerert oligonukleotid også ga kodon C).

G103 ble endret til A, P eller S.

CDR-L3:

S91 ble endret til E.

K92 ble endret til alle de 20 aminosyrene, A, R, K og H bandt.

Hvert polypeptid ble uttrykt som et Fab, og affiniteten ovenfor humant NGF av 96 individuelle kloner ble analysert for hvert bibliotek ved anvendelse av BIAcore-analyse ifølge produsentens instruksjoner og som beskrevet ovenfor. Resultatene fra denne analysen er vist i Tabell 8.

Basert på bindingsaffiniteten ble de beste klonene, E3 (også betegnet "3E") og 3C, valgt for ytterligere karakterisering. E3 omfattet følgende CDR-substitusjoner: CDR- H3: Y101W, G103A og CDR- L3: S91E, K92H, som ble kombinert i en enkelt klon som også omfattet følgende LI-, L2-, Hl- og H2-mutasjoner:

CDR- H1: I34L,

CDR- H2: M50I, L63V,

CDR- L1: D28S, H32N,

CDR- L2: 15 IT.

Sekvensen til tungkjedens og lettkjedens variable områder i E3 er vist i figurene IA og IB. 3C omfattet følgende CDR-substitusjoner: CDR- L3: S91E, K92R, CDR- H3: Y101W, G103A, som ble kombinert i en enkelt klon som også omfattet LI-, L2-, Hl- og H2-mutasjonene som er beskrevet for klon 3E.

3E- og 3C-sekvensene ble klonet inn i pattedyrs ekspresjonsvektorer for fremstilling av Fab og intakt antistoff, og uttrykt i HEK293-celler og renset ved anvendelse av Ni-NTA-eller protein-A-kromatografi. Rent protein ble kvantifisert nøyaktig ved aminosyreanalyse.

Bindingsaffiniteten ovenfor humant NGF av Fab E3 og 3C ble målt ved anvendelse av BIAcore-analyse ifølge produsentens instruksjoner og som beskrevet ovenfor, bortsett fra 100 RU NGF ble anvendt på brikken for å forhindre en gjenbindingseffekt. Kort beskrevet ble flere konsentrasjoner av antistoffer (Fab) injisert over et tidsrom på 2 minutter over en CM5-brikke med 100 RU immobilisert humant NGF, og tillatt å dissosiere i 1800 sekunder. Muse-antistoff 911 (Fab) ble analysert som kontroll. Resultatene ble analysert ved anvendelse av programvaren BIAevaluation ifølge produsentens instruksjoner. Resultatene fra analysen av antistoff E3 og 911 er vist i Figurene 9 og 10. E3 bandt humant NGF med en KDpå omtrent 0,07 nM (og med en kon på omtrent 6,0e5 M"re 1 og en k0ffpå omtrent 4,2e-5 s3C bandt humant NGF med en KDpå omtrent 0,35 nm (med en k0ffpå omtrent l,4E-5). I motsetning til dette bandt muse-antistoff 911 NGF med en KDpå 3,7 nM,

k0ffpå 8#4xl0"5s<_1>og kon på 2,2xl0<4>Ms"<1>.

Antistoff E3 (også betegnet 3E) ble valgt for videre analyse basert på den høye bindingsaffiniteten. For å analysere evnen til E3 til å forhindre interaksjonen mellom NGF og NGF-reseptorene trkA og p75 ble 2,5 nM humant NGF sammenblandet med 0 til 50 nM anti stoff E3 (Fab) og inkubert i 1 time. Etter inkubasjonen ble prøvene injisert med 10 nl/min over en BIAcore CM5-brikke inneholdende 260 RU p75 (kanal 2) og 600 RU trkA (kanal 3) og prosent binding ble bestemt. Resultatene fra denne analysen er vist i Figur 11. Økende konsentrasjoner av Fab E3 blokkerte interaksjonen mellom NGF og både p75 og trkA, vist ved et redusert signal (målt i RU), noe som viser at Fab E3 blokker interaksjonen mellom humant NGF og både trkA og p75. Når antistoff E3 (Fab)-konsentrasjonen var lik NGF-konsentrasjonen (ved omtrent 2,5 nM NGF-konsentrasjon) ble ingen NGF-binding observert (vist ved et signal på 0). Det faktum at 0 % NGF-reseptorbinding opptrådte når konsentrasjonen av NGF var lik antistoff E3-konsentrasjonen antydet at 2,5 nM NGF var minst 10 ganger høyere enn KDav E3 for NGF og ved likevekt.

Eksempel 2: Evaluering av NGF-blokkerende evne til anti-NGF-antistoffer ved analyse av overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5

Evnen til Fab E3 eller intakt antistoff E3 til å blokkere NGF-aktivitet ble evaluert ved å måle antistoffets evne til å inhibere NGF-avhengig overlevelse av de trigeminale muse-neuronene E13.5 in vitro. Det trigeminale ganglion består av kutane sanseneuroner som innerverer ansiktsområdet. Overlevelse av de trigeminale muse-neuronene E13.5 er en følsom analyse for evaluering av antagonistiske anti-NGF-antistoffer NGF-blokkerende aktivitet, siden NGF er nødvendig for å understøtte overlevelse av disse neuronene. Ved for eksempel mettende konsentrasjoner av NGF er overlevelsen nær 100 % ved 48 timers dyrking. I motsetning til dette overlever mindre enn 5 % av neuronene i løpet av 48 timer i fravær av NGF.

Overlevelsesanalysen ble utført som følger: tidstilpassede drektige Swiss Webster-hunnmus ble avlivet ved C02-inhalering. Livmorhornene ble fjernet og embryoer i embryonisk statium E13,5 tatt ut og halshugget. Trigeminusgangliene ble dissekert ved anvendelse av elektrolytisk spissede wolfram-nåler. Gangliene ble så trypsinert, mekanisk dissosiert og platet ut med en tetthet på 200-300 celler per brønn i definert, serumfritt medium i 96-brønners plater belagt med poly-L-ornitin og laminin.

Den blokkerende aktivitet av anti-NGF-Fab eller -antistoffer ble anslått ved å tilsette til trigeminus neuronene forskjellige doser av anti-NGF-antistoffene Mab 911 (Fab), 8L2-6D5, H19-L129, E3 og 3C, og humant NGF eller rotte-NGF i følgende konsentrasjoner: 0,4 ng/ml (~15 pM, denne konsentrasjonen representerte en mettende konsentrasjon av NGF for overlevelse) og 0,04 ng/ml (~1,5 pM, denne konsentrasjonen ligger rundt IC50). Etter 48 timer i kultur ble cellene analysert ved en automatisert immuncytokjemisk fremgangsmåte utført i en Biomek FX arbeidsstasjon for væske-manipulering (Beckman Coulter) som følger: fiksering ved anvendelse av 4 % formaldehyd, 5 % sukkrose og PBS, permeabilisering ved anvendelse av 0,3 % triton-X-100 i PBS), blokkering av uspesifikke bindingsseter ved anvendelse av 5 % normalt geiteserum, 0,11 % BSA i PBS og inkubering med primære, fulgt av sekundære antistoffer for påvisning av neuroner. Primærantistoffet var polyklonalt antistoff fra kanin mot protein-genproduktet 89.5 (PGP9.5, Chemicon), en etablert markør for den neuronale fenotypen. Sekundær-antistoffet var Alexa fluor 488-merket anti-kanin-antistoff fra geit (Molecular Probes), sammen med kjernefargestoffet Hoechst 33342 (Molecular Probes) for merking av kjernen i alle celler som forelå i kulturen. Billedfremskaffelse og billedanalyse ble utført i en Discovery-I/GenII Imager (Universal Imaging Corporation). Bildene ble automatisk fremskaffet ved to bølgelengder for Alexa Fluor 488 og Hoechst 33342, hvor kjernefargingen ble anvendt som referansepunkt for systemets billedbaserte autofokuseringssystem, siden kjernefarging foreligger i alle brønner. Egnede objektiver og antall områder synliggjort per brønn ble valgt for å dekke hele overflaten i hver brønn. Automatisert billedanalyse ble satt opp for telling av antall neuroner som forelå i hver brønn etter 48 timer i kultur, basert på spesifikk farging med anti-PGP9.5-antistoffet. Nøye terskelinnstilling av bildet og anvendelse av morfologi og fluorescensintensitet basert selektivitetsfilter resulterte i et nøyaktig tall for neuroner per brønn.

Resultatene fra dette eksperimentet viste at Fab E3 blokkerte NGF-aktivitet med høy affinitet. Resultatene er vist i Figurene 4-6 og Tabell 9. Figur 4 er en kurve som viser NGF-avhengig overlevelse av E13.5-neuroner i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av NGF fra menneske og rotte. Figur 5 er en kurve som sammenligner den NGF-blokkerende virkning av forskjellige Fab i nærvær av enten 0,04 ng/ml humant NGF (omtrent 1,5 pM, vist i nedre felt) eller 0,4 ng/ml humant NGF (omtrent 15 pM, vist i øvre felt). 1,5 pM NGF ligger rundt EC50 for NGF-fremmet overlevelse, mens 15 pM representerte en mettende konsentrasjon av NGF. Overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 i forskjellige konsentrasjoner av Fab E3, muse-Fab 911, Fab H19-L129 og Fab 8L2-6D5 ble anslått som beskrevet ovenfor. IC50 (i pM) ble beregnet for hvert Fab ved hver NGF-konsentrasjon og er vist i Tabell 9. Fab E3 blokkerte kraftig humant NGF-avhengig overlevelse av trigeminus neuroner, med en IC50 på omtrent 21 pM i nærvær av 15 pM humant NGF og en IC50 på omtrent 1,2 pM i nærvær av 1,5 pM humant NGF. FAb 3C og Fab H19-L129 blokkerte også kraftig humant NGF-avhengig overlevelse av trigeminus neuroner. Figur 6 er en kurve som viser den NGF-blokkerende virkning av forskjellige Fab i nærvær av enten 0,04 ng/ml rotte-NGF (omtrent 1,5 pM, vist i nedre felt) eller 0,4 ng/ml rotte-NGF (omtrent 15 pM, vist i øvre felt). 1,5 pM NGF litter rundt EC50, mens 15 pM representerte en mettende konsentrasjon av NGF. Overlevelse av trigeminus muse-neuronene E13.5 i forskjellige konsentrasjoner av Fab E3, muse-Fab 911, Fab H19-L129 og 8L2-6D5 ble anslått som beskrevet ovenfor. EC50 (i pM) ble beregnet for hver Fab ved hver NGF-konsentrasjon og er vist i Tabell 9. Fab E3 blokkerte kraftig humant NGF-avhengig overlevelse av trigeminus neuroner med en IC50 på omtrent 31,6 pM i nærvær av 15 pM rotte-NGF og en IC50 på omtrent 1,3 pM i nærvær av en 1,5 pM rotte-NGF. Fab 3C og Fab H19-L129 blokkerte også kraftig rotte-NGF-avhengig overlevelse av trigeminus neuroner.

I et annet eksperiment sammenlignet vi evnen til intakt antistoff E3 og Fab 3E til å inhibere NGF-avhengig overlevelse av E13.5-neuroner i nærvær av 0,4 ng/ml (mettende konsentrasjon) av humant NGF. Resultatene fra denne analysen er vist i Figur 12. Intakt antistoff E3 og Fab 3E viste tilsvarende nivå av inhibering av NGF-avhengig overlevelse før konsentrasjonen av intakt antistoff og Fab var normalisert til antall NGF-bindingsseter (Fab har et bindingssete og intakt antistoff to bindingsseter). Disse resultatene viste at det ikke var noen aviditetsvirkning grunnet binding av et intakt antistoff til NGF-dimeren.

I et annet eksperiment sammenlignet vi evnen til forskjellige konsentrasjoner (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 og 0,0 nM) av antistoff E3, antistoff 911 og et trkA-reseptor immunadhesin (bestående av det ekstracellulære domenet fra NGF-reseptoren trkA fusjonert til immunglobulin-Fc-domenet, CH2-CH3) til å inhibere NGF-avhengig overlevelse av E13.5-neuroner i nærvær av 0,4 ng/ml (mettende betingelser). Disse resultatene er vist i Figur 13. Disse resultatene viste at antistoff E3 blokkerte NGF bedre enn både antistoff 911 og trkA-immunadhesinet.

Eksempel 3: Evaluering av spesifisiteten til anti-NGF-antistoff E3 ved anvendelse av overlevelsesanalyser for trigeminus museneuroner og nodale neuroner

Evnen til antistoff E3 til spesifikt å blokkere NGF-aktivitet ble evaluert ved å måle antistoffets evne til å inhibere overlevelse av E17/18 trigeminus museneuroner in vitro i nærvær av mettende konsentrasjoner av NGF, det NGF-beslektede neurotrofin NT3 eller den ikke-NGF-beslektede neurotrofiske faktor, makrofagstimulerende protein (MSP). Overlevelse av E17/18 trigeminus museneuroner er en følsom analyse for evaluering av antagonistiske anti-NGF-antistoffers NGF-blokkerende evne, siden NGF er nødvendig for å understøtte overlevelse av disse neuronene i høyere konsentrasjoner enn det nivå av NGF som er nødvendig for å understøtte overlevelse av E13.5-TG-neuroner). Overlevelse av disse neuronene understøttes også av NT3 eller MSP, overlevelse av disse neuronene er derfor også en følsom analyse for å evaluere hvorvidt det antagonistiske anti-NGF-antistoff også blokkerte NT3 eller MSP.

Evnen til antistoff E3 til spesifikt å blokkere NGF-aktivitet ble også evaluert ved å måle antistoffets evne til å inhibere overlevelse av E17 nodale museneuroner i nærvær av mettende konsentrasjoner av BDNF eller NT4/5. Overlevelse av nodale neuroner understøttes av BDNF eller NT4/5, overlevelse av disse neuronene er således en følsom analyse for å evaluere det antagonistiske anti-NGF-antistoffs evne til å blokkere BDNF eller NT4/5.

Overlevelsesanalysen ble utført som følger: tidstilpassede, drektige Swiss Webster-hunnmus ble avlivet ved C02-inhalering. Livmorhornene ble fjernet og embryoene (ved embryodag 17 eller 18) tatt ut og halshugget. Trigeminusgangliene og de nodale ganglier ble tatt ut og renset. Gangliene ble så trypsinert, mekanisk dissosiert og platet us ved en tetthet på 100-300 celler per brønn i definert, serumfritt medium i 4-brønners plater (Greiner) belagt med poly-L-ornitin og laminin.

E17/18 trigeminus neuroner ble dyrket enten uten tilsatte neurotrofiske faktorer (negativ kontroll) eller i nærvær av mettende konsentrasjoner av humant NGF (400 pM og 15 pM) (positiv kontroll), NT3 (400 pM) eller MSP (600 pM). Duplikatkulturer ble satt opp som omfattet forskjellige konsentrasjoner av Fab E3 og Fab 911 samt intakte antistoffer. Konsentrasjonen av Fab og intakte antistoffer er gitt som bindingssetekonsentrasjoner (slik som inneholder et intakt antistoff to bindingsseter, mens et Fab inneholder et bindingssete).

E17 nodale neuroner ble dyrket enten i fravær av tilsatte neurotrofiske faktorer (negativ kontroll) eller med mettende konsentrasjoner av BDNF (400 pM) (positiv kontroll) eller NT4/5 (400 pM) eller den ikke-NGF-beslektede vektsfaktor ILF (interleukininhiberende faktor). Høye konsentrasjoner av neurotrofiner ble anvendt siden målet med dette eksperimentet var å analysere antistoffenes spesifisitet. Det ble satt opp duplikatkulturer som omfattet variasjoner, med og uten tilsetning av antistoff E3 og 911. Etter 48 timer i kultur ble det totale antall neuroner som overlevde i hver brønn for hver betingelse anslått ved manuell telling og anvendelse av et fasekontrastmikroskop.

Resultatene fra disse eksperimentene viste at antistoff E3 og antistoff 911 fullstendig blokkerte de overlevelsesfremmende virkningene av NGF på E18 trigeminus neuroner. I motsetning til dette hadde antistoff E3 og antistoff 911 ingen virkning på overlevelse av trigeminus neuroner fremmet av NT3 eller MSP, og heller ikke på overlevelse av nodale neuroner fremmet av BDNF, NT4/5 eller LIF. Disse resultatene viste at antistoff E3 hadde selektiv spesifisitet ovenfor NGF, siden det ikke kunne påvises interaksjoner mellom disse antistoffene og andre NGF-beslektede neurotrofiner (NT3, NT4/5, BDNF) i konsentrasjoner som var 1000 til 10 000 ganger høyere enn den effektive konsentrasjon for NGF-blokkering. Videre viste disse resultatene at den neurondød som observeres for NGF-avhengige neuroner i kulturer tilsatt NGF etter tilsetning av antistoff E3 eller Fab E3 skyldes en spesifikk interaksjon mellom disse antistoffene og NGF, og ikke en generell toksisk virkning. Det antagonistiske anti-NGF-muse-antistoff 911 ble også analysert, og lignende resultater ble observert. Bemerk at grunnet den høye neurotrofin-konsentrasjon som ble benyttet er både antistoff E3 og antistoff 911 svært nær sine titreringsbetingelser og var forventet å binde til NGF i tilsvarende grad, siden forskjeller mellom disse antistoffenes bindingsaffinitet ovenfor NGF ville være mindre åpenbare under disse betingelsene.

Resultatene fra disse eksperimentene er vist i figurene 14, 15, 16 og 17. Resultatene viste gjennomsnittlig prosent overlevelse etter 48 timer i kultur (± middelverdiens standardfeil, n=3 for hvert datapunkt), relativt til overlevelsen observert i den positive kontroll for hvert eksperiment (slik som 100 % overlevelse av trigeminus neuroner virket i nærvær av mettende NGF-konsentrasjon, henholdsvis 100 % overlevelse av nodale neuroner dyrket i nærvær av en mettende BDNF-konsentrasjon). Figurene 14-15 er kurver som viser at det antagonistiske anti-NGF-antistoff E3 eller Fab E3 ikke inhiberte overlevelsen som fremmes av NT3 og MSP, selv ved antistoffkonsentrasjoner på opp til 200 nM. I motsetning til dette blokkerte 20 nM antistoff E3 eller Fab 3E og Fab 911 fullstendig NGF-fremmet overlevelse. Det antagonistiske anti-NGF-muse-antistoff 911 ble også analysert, og tilsvarende resultater ble observert. Nærmere bestemt er Figur 14 en kurve som viser en sammenligning av virkningen av forskjellige konsentrasjoner (20 nM, 2 mN eller 0,2 nM) av E3 Fab (betegnet "3E" i figuren) og muse-antistoff 911 Fab på overlevelsen av E18 trigeminus neuroner i nærvær av intet tilsatt neurotrofin (betegnet "kontroll"), 400 pM NGF (betegnet "NGF-400 pM"), 10 nM NT3 (betegnet "NT3-10nM") eller 600 pM MSP (betegnet "MSP-600 pM"). Figur 15 er en kurve som viser en sammenligning mellom virkningen av forskjellige konsentrasjoner (200 nM og 80 nM) av E3 Fab og intakt antistoff og muse-antistoff 911 intakt antistoff og Fab på overlevelse av E17 trigeminus neuroner i nærvær av intet tilsatt neurotrofin (betegnet "ingen faktor"), 400 pM NGF (betegnet "NGF-400 pM"), 10 nM NT3 (betegnet "NT3-10 nM") eller 600 pM MSP (betegnet "MSP-600 pM").

Figur 16-17 er kurver som viser at det antagonistiske anti-NGF-antistoff E3 eller Fab E3 ikke inhiberte overlevelse av E17 nodale neuroner fremmet av BDNF, NT4/5 eller

LIF. Det antagonistiske anti-NGF-muse-antistoff 911 ble også analysert, og tilsvarende resultater ble observert. Nærmere bestemt er Figur 16 en kurve som viser en sammenligning av virkningen av forskjellige konsentrasjoner (200 nM eller 80 nM) av intakt antistoff E3 (betegnet "3E i figuren"), Fab E3, intakt antistoff 911 eller Fab 911 på overlevelse av E17 nodale neuroner i nærvær av intet tilsatt neurotrofin (betegnet "ingen faktorer"), 400 pM BDNF (betegnet "BDNF-400 pM"), 400 pM NT4/5 (betegnet "NT4/5-400 pM") eller 2,5 nM LIF (betegnet "LIP-2,5 nM"). Figur 17 er en kurve som viser en sammenligning mellom virkningen av forskjellige konsentrasjoner (200 nM, 20 nM, 2 nM) av Fab E3 (betegnet "3E i figuren") eller Fab 911 på overlevelse av E17 nodale neuroner i nærvær av intet tilsatt neurotrofin (betegnet "kontroll"), 400 pM BDNF (betegnet "BDNF-400 pM"), 400 pM NT4/5 (betegnet "NT4/5-400 pM") eller 2,5 nM LIF (betegnet "LIP-2,5 nM").

Eksempel 5: Fremstilling av pattedyrsekspresjonsvektorer og ekspresjon av antistoff E3 i pattedyrsceller

Tre pattedyrsekspresjonsvektorer ble utformet og konstruert for anvendelse ved ekspresjon av antistoff E3 i pattedyrsceller.

Vektor Db.911.3E er en ekspresjonsvektor som omfatter tungkjedens variable område fra antistoff E3 og det humane, konstante IgG2a-området, og er egnet for transient eller stabil ekspresjon av tungkjeden. Db.911.3D består av nukleotidsekvenser som tilsvarer følgende områder: promoterområdet fra muse-cytomegalovirus (nukleotidene 1-612), et syntetisk intron (nukleotidene 619-1507), DHFR-kodende område (nukleotidene 707-1267), humant veksthormon signalpeptid (nukleotidene 1525-1602), variabelt område fra antistoff 3E-tungkjede (nukleotidene 1603-1965), konstant område fra humant IgG2a-tungkjeden inneholdende følgende mutasjoner: A330P331 til S330S331 (aminosyrenummerering med henvisning til villtype-IgG2a-sekvensen, se Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624), det sene polyadenyleringssignalet fra SV40 (nukleotidene 2974-3217), SV40-enhancerområdet (nukleotidene 3218-3463), bakteriofag fl-område (nukleotidene 3551-4006) og p-laktamase (AmpR)-kodende område (nukleotidene 4443-5300). Db.911.3E ble deponert hos ATCC 8. januar 2003 og gitt ATCC-aksesjonsbetegnelsen PTA-4895.

Vektor Eb.911.3E er en ekspresjonsvektor som omfatter lettkjedens variable område fra antistoff E3 og det humane, konstante K-kjedeområdet og er egnet for forbigående ekspresjon av lettkjeden. Eb.911.3E består av nukleotidsekvenser som tilsvarer følgende områder: promoterområdet fra muse-cytomegalovirus (nukleotidene 1-612), humant EF-l-intron (nukleotidene 619-1142), humant veksthormon signalpeptid (nukleotidene 1173-1150), det variable området fra antistoff E3-lettkjede (nukleotidene 1251-1571), konstant område fra humant K-kjede (nukleotidene 1572-1892), det sene polyadenyleringssignalet fra SV40 (nukleotidene 1910-2153), SV40-enhancerområdet

(nukleotidene 2154-2399), bakteriofag fl-område (nukleotidene 2487-2942) og p-laktamase (AmpR)-kodende område (nukleotidene 3379-4236). Eb.911.3E ble deponert hos ATCC 8. januar 2003 og gitt ATCC-aksesjonsbetegnelsen PTA-4893.

Vektor Eb.pur.911.3E er en ekspresjonsvektor som omfatter lettkjedens variable område fra antistoff E3 og det humane, konstante K-området og er egnet for stabil ekspresjon av lettkjeden. Eb.pur.911.3E består av nukleotidsekvenser som tilsvarer følgende områder: promoterområde fra muse-cytomegalovirus (nukleotidene 1-612), humant EF-l-intron (nukleotidene 619-1758), pac-gen (puromycinR)-kodende område (nukleotidene 739-1235), humant hsp70 5'UTR-område (nukleotidene 1771-1973), humant veksthormonsignalpeptid (nukleotidene 1985-2062), variabelt område fra antistoff E3-lettkjede (nukleotidene 2063-2383), konstant område fra human K-kjede (nukleotidene 2384-2704), det sene polyadenyleringssignalet fra SV40 (nukleotidene 2722-2965), SV40-enhancerområde (nukleotidene 2966-3211), fakteriofag fl-område (nukleotidene 3299-3654) og p-laktamase (AmpR)-kodende område (nukleotidene 4191-5048). Eb.pur.911.E3 ble deponert hos ATCC 8. januar, 2003 og gitt ATCC-aksesjonsbetegnelsen PTA-4894.

Transient ekspresjon i celler ble utført som følger: CHO- og HEK293T-celler i 150 mm skåler ble transient kotransfektert med 25 \ ig av hvert plasmid (dvs. et plasmid inneholdende tungkjeden og et plasmid inneholdende lettkjeden). DNA ble blandet med 100 \ i\ lipofektamin 2000 (Invitrogen) ifølge produsentens instruksjoner. DNA-lipidkompleksene ble satt i forbindelse med cellene i DMEM/F12-medium uten serum eller antibiotika i 5 timer. Etter denne inkubasjonen ble mediet endret til Opti-MEM (Invitrogen) uten tilsetningsstoffer i to dager for ekspresjon. Antistoffholdige cellesupernatanter ble høstet sekvensielt opp til fire ganger med påfølgende erstatning av mediet. Supernatantene ble renset ved affinitets-kromatografi ved anvendelse av MapSelect protein A-resin (Amersham Biosciences 17-5199-02). Antistoff ble bundet til protein A-resin i 0,3 M glysin, 0,6 M NaCI-buffer ved pH 8 og så eluert med 0,1 M citratbuffer ved pH 3. Antistoffholdige fraksjoner ble øyeblikkelig nøytralisert med IM Tris-buffer med pH 8,0, og antistoffraksjonene ble så dialysert og konsentrert i PBS.

Eksempel 6: Anti-NGF-antistoff E3 er effektivt for behandling av smerte etter kirurgiske inngrep

Vi anvendte en smertemodell som etterligner smerte etter kirurgiske inngrep for å anslå virkningen av behandling med antistoff E3. Antistoff E3 omfattet det konstante området fra human tungkjede IgG2a inneholdende følgende mutasjoner: A330P331 til S330S331 (aminosyrenummerering ved henvisning til villtype-IgG2a-sekvensen, se Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624), det konstante området fra human lettkjede k og de variable tungkjede- og lettkjedeområdene som er vist i Tabellene IA og IB.

Dyr. Sprague-Dawley-hannrotter med kroppsvekt mellom 220-240 gram ble fremskaffet fra Harlan (Wisconsin) og tilvennet til dyrestallen i 1 uke før det kirurgiske inngrep.

Kirurgisk behandling. Behandlingen bygget på fremgangsmåten som er beskrevet av Brennan et al. Pain 64:493-501 (1996). Dyrene ble bedøvet med 2 % isofluran i luft, tilført under det kirurgiske inngrep via en nesemaske. Høyre bakpotes plantare overflate ble behandlet med en povidon-jod-pute og et 1 cm sentralt, longitudinelt innsnitt ble utført gjennom hud og bindevev med start 0,5 cm fra kanten av helen og fremover mot tærne. Målinger ble utført med en linjal mens foten ble holdt i bøyd posisjon. Plantaris-muskelen ble løftet opp med en bøyd pinsett og kuttet longitudinelt. Kuttet ble innført gjennom muskelens fulle dybde mellom muskelutspringet og muskelfestet. Blødningen ble kontrollert gjennom inngrepet ved trykk påført gjennom en gasspute. Såret ble lukket med to madrassuturer (5-0 etilon sort monofilament). Suturene ble knyttet 5-6 ganger, hvor den første knuten var løst knyttet. Sårsetet ble vasket med bacitracin-løsning. Dyrene fikk komme seg og hvile i rene bur i 2 timer eller mer før adferdsanalysen begynte.

Evaluering av hvilesmerte. En kumulativ smerteskala ble anvendt for å anslå smerten forbundet med vektbelastning. Dyrene ble plassert på et plastnett (rutestørrelse 8 mm<2>) i klare plastbur som var opphøyet på en plattform (høyde 45 cm) som tillot inspeksjon av potenes underside. Etter 20 minutters akklimatisering ble vektbelastningen anslått på en skala fra 0 til 2. 0 poeng ble gitt dersom poten var blek eller ble presset mot nettet, noe som viser full vektbelastning. 1 poeng ble gitt dersom poten ble favorisert slik at huden bare berørte nettet, uten blekning eller innpressing av huden. 2 poeng ble gitt dersom poten ble holdt fullstendig borte fra nettet. Tilbaketrekking av poten ble ansett som 2 poeng dersom rotten fortsatt var hvilende. Hvert dyr ble observert i 1 minutt hvert 5. minutt i 30 minutter. Summen av 6 poeng (0-12) erholdt i løpet av 1-2 timer ble anvendt for å anslå smerten i foten med innsnittet. Hyppigheten av forekomsten av 2 poeng ble også beregnet og anvendt for å anslå forekomsten av alvorlig smerte eller fullstendig beskyttelse av poten. Hvert dyr ble analysert 24 timer før inngrepet (basalnivå) og 2 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer etter inngrepet. Resultatene fra dette eksperiment er vist i Figur 1, som viser kumulative hvilesmerte poeng observert hos dyr behandlet med 35 mg/kg anti-NGF-muse-antistoff 911. Disse resultatene viste at behandling med anti-NGF-antistoff i signifikant grad reduserte hvilesmerten etter kirurgisk behandling. Vektbelastning korrelerte godt med hvor villig dyret var til å anvende lemmet og var derfor et effektivt mål på smertelindring.

Antistoff E3 ble injisert intraperitonealt (i.p.) i forskjellige antistoff konsentrasjoner (0,004, 0,01, 0,02, 0,1, 0,6 og 1 mg/kg kroppsvekt) 15 timer før inngrepet. Den negative kontrollgruppen ble ikke tilført antistoff, men ble injisert i.p. med en saltløsning. Fentanyl i en konsentrasjon på 0,01 mg/kg ble injisert i.p. som positiv kontroll 30 minutter før analysen 24 timer etter det kirurgiske inngrep. Hvert eksperiment omfattet 8 dyr (n=8 per gruppe) for hver behandling, mens kontrollgruppen hadde 56 dyr. Det kirurgiske inngrep ble utført og kumulative smertepoeng målt som beskrevet ovenfor. Hvilesmerten ble evaluert 24 timer etter det kirurgiske inngrep.

Som vist i Figur 7 reduserte det humaniserte anti-NGF-antistoff E3 i signifikant grad hvilesmerten (p<0,05) etter kirurgisk inngrep ved tilførsel i en dose på fra 0,02 mg/kg til 1 mg/kg. En "<*>" angir en signifikant forskjell fra kontrollen (p<0,05). Behandling med 0,02 mg/kg lindret smerteadferden minst like effektivt som behandling med 0,01 mg/kg fentanyl. Denne fentanyldosen er 10 ganger høyere enn den normale dosen for mennesker av dette kraftige opioid.

I et annet eksperiment ble virkningen av antistoff E3 når det gjelder reduksjon av smerte etter kirurgisk inngrep ved tilførsel etter inngrepet analysert. Antistoff E3 (0,5 mg/kg) ble injisert intravenøst (i.v.) to timer etter inngrepet. Kontrollgruppen ble ikke tilført antistoff, men ble injisert i.v. med en saltløsning. Inngrepet ble utført og hvilesmerten uttrykt som kumulative smertepoeng, anslått 24 timer etter inngrepet. Som vist i Figur 8 reduserte behandling med anti-NGF-antistoff i signifikant grad (p<0,05) hvilesmerten 24 timer etter inngrepet dersom antistoffet ble tilført 2 timer etter inngrepet. Disse resultatene viste at antistoff E3 effektivt lindret smerte etter kirurgiske inngrep ved tilførsel etter inngrepet.

Eksempel 7: Vurdering av de analgetiske virkningene av det antagonistiske anti-NGF-antistoff 911 i en rottemodell for reumatoid artritt

De analgetiske virkningene av anti-NGF-antistoff 911 (se Hongo et al., Hybridoma 19(3):215-227 (2000)) i komplett Freund's adjuvans (CFA)-indusert kronisk artritt hos rotter ble undersøkt ved anvendelse av vokaliseringsanalysen ved sammenligning med indometasin, anvendt som referanseforbindelse.

Femti (50) Lewis-hann rotter (Lewis LEW/Crl Ico) (Charles River, Belgia) med en kroppsvekt 150 til 200 g ved den eksperimentelle fases begynnelse inngikk i undersøkelsen. Alle dyr ble oppstallet i minst 5 dager før eksperimentet og ble huset i et rom med kontrollert temperatur (19,5-24,5°C), relativ fuktighet (45-65 %) og en 12-timers lys/mørke syklus med ad //fc/fum-tilgang på filtrert springvann og standard pelletert laboratoriefor (U.A.R., Frankrike) gjennom hele undersøkelsen. Dyrene var individuelt merket på halen.

På dag 0 (DO) ble artritt indusert i rotter ved intradermal injeksjon i halen av 0,05 ml av en Mycobacterium butyricum (Difco, USA)-suspensjon i mineralolje (10 mg/ml). På dag 14 (D14) ble artrittiske rotter innbefattet i undersøkelsen ut fra deres evne til å vokalisere ved forsiktig bøying av bakpoten og ut fra deres artrittpoeng, evaluert ved anvendelse av betennelsespoeng for hver bakpote og forpote (se Kuzuna et al., Chem.

Pharm. Bull. (Tokyo) 23:1184-1191 (1975); Pearson et al., Arthritis Rheum. 2:440-459

(1959)). Dyrene ble vurdert basert på følgende kriterier: 0 poeng, normalt utseende, 1 poeng: erytem, 2 poeng: erytem med svak ødem, 3 poeng: kraftig betennelse uten ankylose, 4 poeng: ankylose. Kun dyr som kunne vokalisere ved forsiktig bøying og med 2 eller 3 poeng inngikk i undersøkelsen. Fire grupper, hver med 10 rotter, inngikk i undersøkelsen. For gruppe 1 (bærestoff) ble rottene på dag 14 (D14) etter velgelsen tilført bærestoff (saltvann) intravenøst. På dag 18 (D18) ble smerteintensiteten evaluert ved forsiktig bøying av bakpoten, og intensiteten av lydnivået ble målt for hvert dyr. For gruppe 2 (4 dager) ble rottene på dag 14 etter seleksjonen tilført 911 (10 mg/kg) intravenøst. På dag 18 (D18) ble smerteintensiteten evaluert ved forsiktig bøying av bakpoten, og lydintensiteten ble målt for hvert dyr. For gruppe 3 (24 timer) ble rottene på dag 17 etter injeksjon av CFA tilført 911 (10 mg/kg) intravenøst. Smerteintensiteten ble evaluert ved forsiktig bøying av bakpoten 24 timer senere, og lydintensiteten ble målt for hvert dyr. For gruppe 4 (indometasin) ble smerteintensiteten evaluert på Dag 18 (D18) ved forsiktig bøying av bakpoten 1 time etter oral administrering av indometasin (10 mg/kg). Lydintensiteten ble også målt for hvert dyr. Analyseforbindelsene ble tilført på en blind og tilfeldig måte intravenøst i et volum på 5 ml/kg, mens indometasin ble tilført oralt i et volum på 10 ml/kg. De analgetiske virkningene av anti-NGF-antistoff 911 er vist i Tabell 10. Resultatene er uttrykket for hver gruppe som nociceptiv intensitert, vurdert ut fra intensiteten på vokaliseringe målt for hvert dyr i mV (middelverdi + S.E.M) og prosent variasjon av nociceptiv intensitert, beregnet ut fra middelverdien for den bærestoffbehandlede gruppe. Statistisk signifikans mellom behandlingsgruppene og bærestoff-gruppen ble bestemt med en Dunnetts test ved anvendelse av restvariansen etter en enveis variansanalyse (P<0,05).

Resultatene er gitt som middelverdi +, sem

n = 10 rotter per gruppe

Dag 0 (DO): Induksjon av kronisk artritt ved administrering av CFA

Bærestoff: saltvann

911 (10 mg/kg) ble tilført intravenøst på D14 eller D17, og smertemålingen ble utført på D18. Indometasin (10 mg/kg) ble tilført oralt på D18, og smertemålingen ble utført 1 time etter doseringen. Dunnetts test:<*>angir en signifikant forskjell sammenlignet med den bærestoffbehandlede gruppe for P<0,05.

Som vist i Tabell 10 reduserte anti-NGF-antistoff 911 i signifikant grad smerten i en rottemodell for reumatoid artritt 24 timer eller 4 dager etter en enkelt administrering av antistoffet.

Eksempel 8: Farmakologiske virkninger av de antagonistiske anti-NGF-antistoffene E3 og 911 i en rottemodell for reumatoid artritt

Farmakologiske virkninger (anti-inflammatoriske og analgetiske virkninger) av de antagonistiske anti-NGF-antistoffene E3 og 911 ble undersøkt i en modell med komplett Freunds adjuvans (CFA)-indusert kronisk artritt i rotter, sammenlignet med indometasin anvendt som en intern, positiv kontroll-forbindelse. De analgetiske virkningene av E3 og 911 ble evaluert ved måling av smerteresponsen. De anti-inflammatoriske virkningene ble evaluert ut fra potevolum, artrittmål (inflammasjonspoeng), kroppsvekt og bakpote vekt. Måling av cytokinnivå i poten (IL-6, IL-ip, TNF-a og TGF-pi), sirkulerende TGF-pi i serum, plasmakonsentrasjonen av E3 og 911, biologiske parametere og røntgenundersøkelser ble utført ved eksperimentets avslutning.

Eksperimentell fremgangsmåte

1. Undersøkelsens utforming

80 Lewis-hannrotter (Lewis Lew/Ico) (Charles River Laboratories, Belgia) med alder 5 uker inngikk i undersøkelsen. Rottene ble oppstallet i et rom med kontrollert temperatur (19,5-24,5°C) og relativ fuktighet (45-65 %) med en 12 timers lys/mørke syklus, med ad libitum tilgang på filtrert springvann og standard pelletert laboratoriefor (SAFE, Frankrike) gjennom hele undersøkelsen. Ved mottagelsen i dyrestallen ble de oppstallet med 5 dyr per bur, og en 10-dagers akklimatiseringsperiode ble observert før analysene. Dyrene ble merket individuelt på halen.

Fem grupper bestående av 10 dyr (5 uker gamle Lewis-hannrotter-Lewis Lew/Ico fra Charles River Laboratories, Belgia) inngikk i undersøkelsen: Gruppe 1: ikke-artrittiske rotter/saltvann (bærestoff) i.v. bolus, n=10, Gruppe 2: artrittiske rotter/saltvann (bærestoff) i.v. bolus, n=10, Gruppe 3: artrittiske rotter/indometasin, 3 mg/kg p.o. daglig over 10 dager, n = 10, Gruppe 4: artrittiske rotter/E3, 1 mg/kg i.v. bolus, n = 10; Gruppe 5: artrittiske rotter/911, 10 mg/kg i.v. bolus, n=10. Dosene er angitt som fri aktiv forbindelse (mg/kg). E3 og 911 ble tatt ut av lagerløsningen og fortynnet med saltvann etter behov til den ønskede konsentrasjon. 1 mg/kg E3: 3,41 ml av lagerløsningen (0,88 mg/ml) justert til 15 ml med saltvann. 10 mg/kg 911: 12 ml lagerløsning (2,5 mg/ml) justert til 15 ml med saltvann. Alle fortynnede løsninger (før i.v. injeksjon) ble sterilisert ved anvendelse av en steril filterenhet med porestørrelse 0,20 \ im. De fortynnede løsningenes pH og osmolaritet ble målt før hver i.v. injeksjon. Før første i.v. injeksjon var osmolariteten (mosm/L) for saltvann, E3 og 911 278, 269 henholdsvis 308, pH for saltvann, E3 og 911 var 5,93, 6,76 henholdsvis 6,71. Før andre i.v. injeksjon var osmolariteten (mosm/L) for saltvann, E3 og 911 280, 270 henholdsvis 309, pH for saltvann, E3 og 911 var 5,86, 6,72 henholdsvis 6,59.

E3, 911 eller saltvann ble tilført ved i.v. bolusinjeksjon på dag 14 og dag 19 etter artrittinduksjonen på en kodet og tilfeldig måte i et volum på 5 ml/kg. Ikke-artrittgruppen ble tilført 1 i.v. bolusinjeksjon av saltvann på dag 14 og dag 19 med et volum på 5 ml/kg. Indometasin ble løst i 1 % metylcellulose etter behov. Indometasin ble tilført oralt (p.o.) en gang daglig over 10 dager fra dag 14 til dag 23 etter artrittinduksjonen på en kodet og tilfeldig måte i et volum på 10 ml/kg.

2. Induksjon av artritt

På Dag 0 (DO) ble artritt indusert i 70 rotter ved intradermal injeksjon i halen av 0,05 ml av en Mycobacterium butyricum-suspensjon. En gruppe på 10 rotter ble ikke gitt en intradermal injeksjon (ikke artrittiske rotter). På Dag 14 (D14) ble de artrittiske rottene opptatt i undersøkelsen basert på følgende kriterier: alle omfattet rotter som fremviste et økt gjennomsnittlig potevolum (gjennomsnittet av venstre og høyre potevolum) på minst 0,30 ml, sammenlignet med det gjennomsnittlige potevolum (gjennomsnitt av venstre og høyre potevolum) i ikke-artritt gruppen (potevolum målt som beskrevet nedenfor), alle omfattet grupper som fremviste vokalisering ved forsiktig bøying (smerteresponsmåling som beskrevet nedenfor), og alle omfattet rotter som artritt indekspoeng på 2-3 for hver bakpote (artrittindeksmåling som beskrevet nedenfor) (dyrene med 0, 1 eller 4 poeng ble fjernet).

3^Kroppsvekt

Dyrene ble veid en gang daglig fra Dag 0 til Dag 24 (bortsett fra helgen dagene før behandlingen: Dl, D2, D8, D9, D10). Alle målinger ble utført mellom 9:00 og 12:00 på formiddagen, bortsett fra på D14 (7:30-9:00 på formiddagen) og D24 (7:30-8,00 på formiddagen).

3^Potevolum måling

Volumet av høyre og venstre bakpote på hver rotte (artrittiske og ikke-artrittiske rotter) ble målt ved anvendelse av et pletysmometer. Målingene ble utført på følgende tidspunkter (etter induksjon av artritt): Dag 14 (før i.v. bolustilførsel eller p.o. tilførsel) og Dag 24 (5 dager etter siste i.v. bolusinjeksjon eller 24 timer etter siste p.o. tilførsel). Alle målinger ble utført mellom 9:00 og 12:00 på formiddagen. Alle resultater ble oppsamlet og lagret i programvaren WinDas.

4. Artritt indeks

Artritt indeksen ble evaluert ved anvendelse av betennelsespoeng for hver bakpote og forpote (artrittiske rotter): 0 Poeng: normalt utseende, 1 Poeng: etyrem, 2 Poeng: erytem med svak ødem, 3 Poeng: kraftig betennelse uten ankylose; 4 Poeng ankylose. Denne evalueringen ble utført på følgende tidspunkter (etter induksjon av artritt): Dag 14 (før i.v. bolusinjeksjon eller p.o. tilførsel) og Dag 24 (5 dager etter siste i.v. bolusinjeksjon eller 24 timer etter siste p.o. tilførsel). Alle målinger ble utført mellom 2:00 og 3:00 på ettermiddagen (D14), 8:00 og 9:00 på formiddagen (D24). Alle måleverdier ble oppsamlet og lagret i programvaren WinDas.

5.Måling av smerterespons fVokaliserinasanalvse)

Smerteresponsen ble evaluert ved forsiktig bøying av venstre og høyre bakpote, gjentatt to ganger med 4 til 5 sekunders mellomrom, med en finger (artrittiske rotter). Lydintensiteten ble målt for hvert dyr og for hver bakpote (2 ganger: for høyre bakpote: Sl og S3, 2 ganger: for venstre bakpote: S2 og S4). Denne evalueringen ble utført på følgende tidspunkter (etter induksjon av artritt): Dag 14 (før i.v. bolusinjeksjon eller p.o. tilførsel), Dag 18 (før andre i.v. bolusinjeksjon eller 1 time etter p.o. tilførsel) og Dag 24 (5 dager etter siste i.v. bolusinjeksjon eller 24 timer etter siste p.o. tilførsel). Alle målinger ble utført mellom 9:00 og 12:00 på formiddagen, bortsett fra D14 (7:30-9:00 på formiddagen) og D24 (7:30-9:00 på formiddagen).

6. Oppsamling av blod for måling av E3- eller 911- konsentrasionen, sirkulerende TFB-Bl og hematologiske parametere

På Dag 24 (etter måling av potevolum og artrittindeks samt lokaliseringstest), under generell bedøvelse ved anvendelse av isofluran (i en blanding med oksygen og nitrogenoksid) ble blodprøvene (omtrent 800-1000^1) oppsamlet ved kapillær virkning med en mikropipette fra den retroorbitale sinus.

Måling av E3- eller 911-konsentrasjonen (gruppene 2, 4 og 5): En del av blod-prøven ble oppsamlet i rør inneholdende Li-heparin (inkubert på is) og sentrifugert ved 2500-3000 g i 10 min. Plasmaprøver (minst 100^1) ble erholdt, nedfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80°C. En prøve hadde svak hemolyse (bærestoffbehandlet, artrittisk rotte nr. 36).

Måling avTGF-01 i sirkulasjonen (gruppene 1-2-3-4-5): Et uttak av blodprøven ble oppsamlet i mikrosentrifugerør for fremstilling av serum ved romtemperatur. Etter prøve- oppsamlingen ble blodet blandet og fikk koagulere i 30 minutter før sentrifugeringen. Rørene ble sentrifugert ved omtrent 6000 g i 3 minutter. Hver serumprøve (minst 100 ni, bortsett fra for rotte nr. 52 og nr. 53) ble alikvotert og lagret ved -20°C inntil prøve-aktivering for TGF-pi-analyse. Disse alikvotene (50 rør) ble lagret over et tidsrom på 6 måneder, med start ved undersøkelsens avslutning. Noen prøver hadde svak hemolyse (bærestoffbehandlet ikke-artrittisk rotte nr. 2, nr. 5, nr. 9 og nr. 10, bærestoffbehandlet artrittisk rotte nr. 53 og nr. 63, E3-behandlet artrittisk rotte nr. 31 og nr. 51, 911-behandlet artrittisk rotte nr. 52, nr. 62 og nr. 64). TGF-pi-nivået ble målt ved anvendelse av et ELISA-sett for human TGF-pi (ref. DB100, porsjon 212258 og 213610, R&D Systems, Frankrike).

Oppsamling av blod for hematologiske parametere (gruppene 1-2-3-4-5, 50 ampuller): En del av blodprøven ble oppsamlet i rør tilsatt K3-EDTA (minst 100 n')-Bestemmelsen av parameterne ble utført på oppsamlingsdagen, og prøvene ble ikke lagret. De hematologiske parameterne, innbefattet røde blodceller, hvite blodceller, blodplater, hemoglobin og hematokritt ble målt med en hematologisk celleteller (D24). Noen hematologiske parametere ble ikke målt grunnet koagulerte prøver (bærestoffbehandlet, ikke-artrittisk rotte nr. 10, E3-behandlet artrittiske rotter nr. 59 og nr. 67, 911-behandlet artrittisk rotte nr. 16).

!_. Cvtokinnivå i poten

På Dag 24 (5 dager etter siste i.v. bolusinjeksjon eller 24 timer etter siste p.o. tilførsel) (etter røntgenundersøkelse) ble hvert dyrs bakpoter (artrittiske og ikke-artrittiske rotter) veid og oppsamlet i en merket polyetylenampulle. Vevsprøvene ble nedfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80°C.

Fremstilling av ledd-homogenater: Nedfrosne bakpoter ble pulverisert ved anvendelse av en Bio-Pulverizer. De pulveriserte bakpotene ble så plassert i et 50 ml konisk sentrifugerør inneholdende 3 ml PBS tilsatt 50 \ i\ anti-proteaseblanding og homogenisert på is ved anvendelse av en Ultra-Turrax homogenisator (50 % av maksimal hastighet). Homogenatene ble så sentrifugert ved 2000 x g i 15 minutter ved 4°C, og supernatantene ble filtrert gjennom 0,2 nm Sartorius-filtere, alikvotert og lagret ved -80°C inntil de skulle brukes.

Måling av cytokinnivå: Nivået av cytokinene TNF-a(ELISA-sett for rotte-TNF-a, ref. RTA00, porsjon 213718, R&D Systems, Frankrike), ELISA-sett for IL-ip fra rotte, ref. RLB00, porsjon 212435, R&D Systems, Frankrike, ELISA-sett for IL-6 fra rotte, ref. R6000, porsjon 211773, 214008 og 214362, R&D Systems, Frankrike og ELISA-sett for human TGB-pi, ref. DB100, porsjon 212258 og 213610, R&D Systems, Frankrike ble bestemt i duplikat ifølge produsentens fremgangsmåter. Alikvoter av bakpotehomogenatene ble lagret ved -80°C.

8. Røntaenanalvse

Pa Dag 24 etter oppsamlingen av blod ble dyrene avlivet, og røntgenbilder (av bakpotene) ble erholdt for vurdering av leddlesjoner. Røntgenanalysen fokuserte på artikulære erosjoner, artikulær rom og periosteum-unormaliteter i begge bakpoter. Alle røntgenbilder ble analysert ved å se på syv forskjellige punkter: skade i mykt vev, deformitet, avmineralisering, lettrom, erosjoner, osteogenese og periostal reaksjon. For hvert dyr ble de seks første punktene analysert uavhengig ved å se på den verste bakpoten. Periostalreaksjonen ble analysert ved å se på halen. For hvert punkt går poengene fra 0 (normal) til 4 (maksimal skade). Totalpoengene går følgelig fra 0 til 28. Den radiografiske tolkningen ble utført av samme avleser uten kjennskap til noe vedrørende dyrene (behandlede eller ikke-behandlede).

9. Observasjoner

Et dyr (nr. 65) døde på D23 etter administrering av indometasin (før tilførsel på D23) av ukjente grunner.

10. Analyse oa uttrykk av resultatene

Alle resultater ble angitt som middelverdi + S.E.M. for 10 rotter i hver gruppe og for hvert tidspunkt. Potevolumet ble uttrykt i ml, beregnet fra middelverdien for høyre og venstre potevolum. Artrittindeksen ble beregnet ut fra poengsummen erholdt for hver av de fire potene. Smerteresponsen ble evaluert ut fra lydnivået målt for hvert dyr (gjennomsnitt av 4 verdier: 2 ganger/pote) i mV. Prosent inhibering av smerteresponsen ble beregnet ut fra gjennomsnittsverdien for den bærestoffbehandlede artrittiske gruppen [(gjennomsnittsverdi for bærestoffbehandlet artrittisk gruppe - gjennomsnittsverdi for behandlet artrittisk gruppe/gjennomsnittsverdi for bærestoffbehandlet artrittisk gruppe)<*>100]. Kroppsvekten ble uttrykt i gram. Vekten av bakpotene (venstre og høyre) ble uttrykt i gram. Cytokinnivået (IL-6, IL-ip, TNF-a og TGF-pi) i hver bakpote ble uttrykt i pg/ml. Nivået i sirkulasjonen av TGF-pi ble uttrykt i pg/ml. Den radiologiske indeks for hver parameter (avmineralisering, erosjoner, periostal reaksjon, skader på mykt vev, leddrom, osteogenese, deformasjon) og total radiologisk indeks (total poeng) ble beregnet ut fra summen av poengene erholdt for hver parameter. Signifikansen mellom gruppene når det gjelder forskjeller mellom verdiene for bærestoffbehandlet gruppe (artrittiske rotter) og bærestoffbehandlet gruppe (ikke-artrittiske rotter) ble anslått ved Student t-test eller Mann-Whitney Rank Sum Test dersom test av lik varians eller normalitet sviktet. Signifikansen mellom gruppene når det gjelder forskjeller mellom verdiene for bærestoffbehandlet gruppe (artrittiske rotter) og E3-, 911- og indometasinbehandlede grupper ble anslått ved enveis variansanalyse ANOVA, fulgt av uparet Dunnett t-test. En sannsynlighet på P<0,05 ble ansett som signifikant. All statistisk analyse ble utført med programvaren "Sigmastat".

Resultater

1. Smerterespons fvokaliserinasanalvse)

Som vist i Tabell 11 og Figur 19 var smerteresponsen på D14 4147 +_ 331, 4386 +_ 235, 4644 +_ 367 og 4468 +_ 143 i den bærestoffbehandiede, artrittiske gruppe, den indometasinbehandlede, artrittiske gruppe, den E3-behandlede, artrittiske gruppe henholdsvis den 911-behandlede artrittiske gruppe. Indometasin reduserte kraftig og i signifikant grad smerteresponsen etter 3 mg/kg/dag p.o. (i 10 dager) med omtrent, 3768 mV (71 % inhibering) henholdsvis -4353 mV (74 % inhibering) på D18, henholdsvis D24, sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppe (D18: 1511 + 398 sammenlignet med 5279 +_ 326 mV, D24: 1552 +_ 508 sammenlignet med 5905 +_ 345 mV). E3 (1 mg/kg i.v. på Dag 14 og Dag 19) reduserte kraftig og i signifikant grad smerteresponsen med omtrent -4167 mV (79 % inhibering) og -5905 mV (100 % inhibering) på D18 henholdsvis D24 sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppe (D18: 1112 + 401 sammenlignet med 5279 + 326 mV, D24: 0 + 0 sammenlignet med 5905 + 345 mV). 911 (10 mg/kg i.v. 2 dager, på D14 og D19) reduserte kraftig og i signifikant grad smerteresponsen med omtrent -3932 (74 % inhibering) og -5358 mV (91 % inhibering) på D18 henholdsvis D24, sammenlignet med den bærestoffbehandlede artrittiske gruppe (D18: 1347 + 492 sammenlignet med 5279 + 329 mV, D24: 547 + 307 sammenlignet med 5905 + 345 mV).

Verdiene er uttrykt i mV som middelverdi +_ S.E.M.

n = 10 dyr per gruppe, bortsett fra D24 for indometasin (n=9)

Dunnett t-test:<*>P<.0,05 sammenlignet med bærestoffbehandlede artrittiske rotter.

2. Kroppsvekt

Som vist i Tabell 12 og Figur 19 ble en markant reduksjon av kroppsvekt økningen observert hos artrittiske rotter sammenlignet med ikke-artrittiske rotter fra DO ti D14, grunnet etablering av artritt. Pa D14 (velgelsesdagen) viste de artrittiske rottene en signifikant vektreduksjon sammenlignet med de ikke-artrittiske rottene (289 +_ 2 sammen-lignet med 217 +_ 4 g) (Student t-test P<0,05). Imidlertid ble ingen signifikant forskjell i kroppsvekten (D14) observert i noen av de artrittiske gruppene (Dunnett t-test P>0,05). Kroppsvekten økte moderat og signifikant i den indometasinbehandlede gruppe (3 mg/kg/dag i 10 dager) fra D17 til D24, med en maksimal økning på omtrent 43 g på D24, sammenlignet med den bærestoffbehandlede artrittiske gruppen (261 +_ 5 sammenlignet med 218 +_ 3 g). Etter E3-behandling (1 mg/kg i.v. på D14 og D19) økte kroppsvekten moderat og signifikant fra D17 til D24 med et maksimum på omtrent 46 g på D24, sammen-lignet med den bærestoffbehandlede artrittiske gruppen (265 +_ 5 g sammenlignet med 218 +_ 3 g). Etter 911-behandling (10 mg/kg i.v. på D14 og D19) økte kroppsvekten moderat og signifikant fra D18 til D24 med et maksimum på omtrent 47 g på D24, sammenlignet med den bærestoffbehandlede artrittiske gruppen (265 +_ 7 sammenlignet med 218 + 3g).

Verdier er uttrykt i gram som middelverdi+_ S.E.M.

n = 10 dyr per gruppe, bortsett fra D23 og D24 (n=9) for indometasin Dunnet t-test:<*>P<0,05 sammenlignet med bærestoffbehandlede, artrittiske rotter.

3. Potevolum

Pa D14 ble en randomisering utført for erholdelse av homogene grupper når det gjaldt potevolum. Som vist i Tabell 13 var potevolumet på D14 (gjennomsnittsverdi for høyre og venstre potevolum) signifikant høyere i artrittgruppen enn i ikke-artrittgruppen (2,10 + 0,05 sammenlignet med 1,44 + 0,02 ml (Student t-test P<0,05)). Indometasin (3 mg/kg/dag p.o. i 10 dager) reduserte i signifikant grad potevolumet med omtrent -0,75 ml (D24), sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen (1,59 +_ 0,03 ml sammenlignet med 2,34 +_ 0,08 ml). E3 (1 mg/kg i.v. på D14 og D19) forhøyet potevolumet svakt og signifikant med omtrent 0,37 ml, sammenlignet med den bærestoffbehandlede artrittiske gruppen (2,71 +_ 0,09 ml sammenlignet med 2,34 +_ 0,08 ml). 911 (10 mg/kg i.v. på D14 og D19) forhøyet potevolumet svakt og signifikant med omtrent 0,36 ml, sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen (2,70 +_ 0,11 ml sammenlignet med 2,34 +_ 0,08 ml).

Verdiene er angitt i ml som middelverdi +_ S.E.M.

n = 10 dyr per gruppe, bortsett fra D24 for indometasin (n=9)

Dunnet t-test:<*>P<0,05 sammenlignet med bærestoffbehandlede, artrittiske rotter.

4. Artrittindeks

Som vist i Tabell 14 var artrittindeksen på D14 10,1 + 0,8, 8,7 + 0,6, 10,2 + 0,4 og 9,4 +_ 0,7 hos bærestoffbehandlede, indometasinbehandlende, E3-behandlede henholdsvis 911-behandlede artrittiske grupper. Indometasin reduserte kraftig og signifikant artrittindeksen etter 3 mg/kg/dag p.o. (i 10 dager) med et maksimum på~-8,0, sammenlignet med den bærestoffbehandlede artrittiske gruppen (2,7 +_ 0,7 sammenlignet med 10,7 +_ 0,6). E3 (1 mg/kg i.v. på D14 og D19) påvirket ikke artrittindeksen, sammenlignet med den bærestoffbehandlede artrittiske gruppen (11,4 +_ 0,4 sammenlignet med 10,7 +_ 0,6). 911 (10 mg/kg i.v. på D14 og D19) påvirket ikke artrittindeksen sammenlignet med den bærestoffbehandlede artrittiske gruppen (10,9 +_ 0,7 sammenlignet med 10,7 + 0,6).

Verdiene er uttrykt som middelverdi +_ S.E.M. (poeng)

n = 10 dyr per gruppe, bortsett fra for indometasin (n=9)

5. Cvtokinnivåer i pote

Som vist i Tabell 15 var cytokinnivået i høyre og venstre pote på D24 forhøyet hos den artrittiske, bærestoffbehandlede gruppe med et maksimum på til og med 3,5 (IL-ip), 4 (TNF-a) og 1,8 (TGF-pi) ganger, sammenlignet med den ikke-artrittiske, bærestoffbehandlede gruppe. Ingen signifikant forskjell ble observert for IL-6-nivået i høyre og venstre pote mellom de to gruppene. Cytokinnivået i artrittgruppen var likt i høyre og venstre pote: 259,7 +_ 38,5 sammenlignet med 219,2 +_ 32,4, 4802,8 +_ 365,5 sammen-lignet med 4007,1 + 380,4, 17,8 + 1,6 sammenlignet med 18,6 + 1,9 og 9735,0 + 1219,8 sammenlignet med 9161,4 + 846,1 pg/ml for IL-6, IL-ip, TNF-a henholdsvis TGF-pi. Indometasin reduserte svakt, men signifikant, TGF-pi-nivået i høyre pote etter 3 mg/kg/dag p.o. (i 10 dager) med omtrent 1,3 ganger, sammenlignet med den bærestoffbehandlede artrittiske gruppe (7057,4 +_ 335,6 sammenlignet med 9161,4 +_ 846,1), mens forbindelsen ikke modifiserte nivået av IL-6, TNF-a eller IL-ip. En lignende, men ikke signifikant virkning ble observert i venstre pote. E3 (1 mg/kg i.v. på D14 og D19) påvirket ikke nivået av IL-6, IL-ip, TNF-a eller TGF-pi i noen av potene, sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen. 911 (10 mg/kg i.v. på D14 og D19) ga forhøyet IL-ip-nivå i høyre pote sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen (6215,3 +_ 666,7 sammenlignet med 4007,1 +_ 380,4). Antistoffet hadde ingen virkning på nivået av andre cytokiner i noen av potene.

Verdiene er uttrykt i pg/ml, som middelverdi +_ S.E.M.

n = 10 dyr per gruppe, bortsett fra ikke-artrittisk/bærestoff (høyre pote), artrittisk/bærestoff (venstre pote) og indometasin (n=9)

6. Måling av TGF- PI i sirkulasjonen

Som vist i Tabell 16 var TGF-pi-nivået i serum på D24 forhøyet i den artrittiske bærestoffbehandlede gruppe sammenlignet med den ikke-artrittiske bærestoffbehandlede

gruppe (81715,7 +_ 1984,1 sammenlignet med 60269,9 +_ 2142,8). Indometasin reduserte i signifikant grad TGF-pi-nivået i serum etter 3 mg/kg/dag p.o. (i 10 dager) med omtrent 1,5 ganger, sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppe (57222,2 +_ 3194,1 sammenlignet med 81715,7 + 1984,1). E3 (1 mg/kg i.v. på D14 og D19) og 911 (10 mg/kg i.v. på D14 og D19) reduserte i signifikant grad nivået av TGF-pi i serum, slik at cytokinnivået i de E3- og 911-behandlede gruppene var sammenlignbart med nivået observert i den bærestoffbehandlede, ikke-artrittiske gruppen (69408,8±3926,7 henholdsvis 67214,5 + 3649,4 sammenlignet med 60269,9 + 2142,8).

Verdiene er uttrykt i pg/ml, som middelverdi +_ S.E.M.

!_. Hematologiske parametere

Som vist i Tabell 17 har de hematologiske parameterne som hvite blodceller og blodplater forhøyet hos bærestoffbehandlede, artrittiske rotter sammenlignet med bærestoffbehandlede, ikke-artrittiske rotter (Student t-test P<0,05), mens røde blodceller, hemoglobin og hematokrit (Student t-test P>0,05) var uendrede. Indometasin påvirket ikke blodparameterne etter 3 mg/kg/dag p.o (i 10 dager), sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen. E3 (1 mg/kg i.v. på D14 og D19) påvirket ikke blodparameterne, sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen. 911 (10 mg/kg i.v. på D14 og D19) påvirket ikke blodparameterne, sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen.

Verdiene er uttrykt som middelverdi +_ S.E.M.

Anova: P>0,05 sammenlignet med bærestoffbehandlede artrittiske rotter.

!_. Bakpote vekt

Som vist i Tabell 18 var vekten av høyre og venstre bakpote høyere hos bærestoffbehandlede, artrittiske rotter enn hos bærestoffbehandlede ikke-artrittiske rotter (3,43+_ 0,11 sammenlignet med 1,98 +_ 0/01 henholdsvis 3,32 +_ 0,12 sammenlignet med 1,99 + 0,02 g) (Student t-test eller Mann-Withney P<0,05). Indometasin reduserte i signifikant grad vekten av bakpotene etter 3 mg/kg/dag p.o. (i 10 dager) sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen (venstre bakpote: 2,23 +_ 0,04 sammenlignet med 3,43 +_ 0,11 g, høyre bakpote: 2,20 +_ 0,05 sammenlignet med 3,43 +_ 0,12 g). E3 (1 mg/kg i.v. på D14 og D19) økte kun vekten av venstre bakpote i signifikant grad sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen (venstre bakpote:

3,86 +_ 0,14 sammenlignet med 3,43 +_ 0,11 g, høyre bakpote: 3,72 +_ 0,13 sammenlignet med 3,32 +_ 0,12 g). 911 (10 mg/kg i.v. på D14 og D19) økte kun vekten av høyre bakpote i signifikant grad sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen (venstre bakpote: 3,73 +_ 0,12 sammenlignet med 3,43 +_ 0,11 g, høyre bakpote: 3,83 +_ 0,15 sammenlignet med 3,32 +_ 0,12 g).

Verdier er uttrykt i gram som middelverdi +_ S.E.M.

n = 10 dyr per gruppe, bortsett fra for indometasin (n=9)

Dunnett t-test:<*>P<0,05 sammenlignet med bærestoffbehandlede, artrittiske rotter.

8. Røntqenanalvse

Som vist i Tabell 19 ble en total poengsum på 0,0 +_ 0,0 observert hos bærestoffbehandlede, ikke-artrittiske rotter. De bærestoffbehandlede, artrittiske rottene har en total poengsum på 15,1 +_ 1,3, med høye poeng for avmineralisering (2,4 +_ 0,3), erosjoner (2,7 + 0,3), skader på myke vev (3,1 +_ 0,2) og leddrom (3,3 + 0,2), moderate poeng for periostal reaksjon (1,0 +_ 0,3), osteogenese (0,8 +_ 0,2) og deformasjon (1,8 +_ 0,2). Indometasin (3 mg/kg/dag p.o. i 10 dager) ga en kraftig og signifikant reduksjon av den totale poengsum på omtrent 10,7 sammenlignet med bærestoffbehandlede, artrittiske rotter (4,4 +_ 0,9 sammenlignet med 15,1 +_ 1,3). E3 (1 mg/kg i.v. på D14 og D19) påvirket ikke den totale poengsum, sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppen (14,2 +_ 1,3 sammenlignet med 15,1 +_ 1,3). 911 (10 mg/kg i.v. på D14 og D19) påvirket ikke den totale poengsum, sammenlignet med den bærestoffbehandlede, artrittiske gruppe (15,4 +_ 1,0 sammenlignet med 15,1 +_ 1,3).

Verdier er uttrykt som middelverdi +_ S.E.M. (poeng).

n = 10 dyr per gruppe, bortsett fra for indometasin (n=9)

Konklusjon

Under de eksperimentelle betingelsene som er beskrevet ovenfor viste E3 (1 mg/kg i.v. 2 dager: D14-D19) og 911 (10 mg/kg i.v. 2 dager: D14-D19) kraftige analgetiske virkninger, men viste innen signifikante anti-inflammatoriske virkninger i denne artrittmodellen.

Eksempel 9. Virkninger av forskjellige doser av anti-NGF-antistoff E3 i en rottemodell for reumatoid artritt

Evnen til E3 til å gi en reduksjon av smerten hos artrittiske rotter ble undersøkt videre ved å undersøke dose-responssammenhengen mellom E3-tilførsel og smerte-reduksjon. Rotter ble behandlet med adjuvans for induksjon av artritt som beskrevet ovenfor. Ti rotter som ikke ble injisert med adjuvans ble benyttet som ikke-artrittiske kontroller. Fjorten dager etter adjuvansinjeksjonen ble dyrene tatt opp i undersøkelsen basert på kriteriene som er angitt ovenfor, randomisert i 8 grupper med 10 rotter i hver gruppe og analysert for vokaliseringsresponsintensitet. De ble så dosert på Dag 14 med saltvann eller 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg eller 5 mg/kg av E3-antistoff som beskrevet ovenfor. Dyrene ble analysert for vokaliserings-respons på dagene 16, 18, 20 og 24. Dyrene ble igjen tilført saltvann eller den samme dose av E3 på Dag 18 etter vokaliseringsanalysen. Dyrene ble også veid hver dag med start på Dag 14. Dyrene ble således dosert to ganger med en gitt dose av antistoff eller saltvann på dagene 14 og 18 og analysert for smerte fem ganger, på dagene 14, 16, 18, 20 og 24. Resultatene er vist i Tabellene 20-22 og Figurene 20-22.

Virkningen av å behandle dyrene med forskjellige doser av anti-NGF-antistoff E3 på smerteindusert vokalisering (resultater vist i Tabell 20) ble analysert statistisk ved anvendelse av toveis ANOVA for å sammenligne resultatene oppnådd parvis mellom artrittiske dyr behandlet med bærestoff og dyr behandlet med en gitt dose av antistoff E3. Det var en svært signifikant virkning ved alle de analyserte E3-nivåene (p<0,0001). Selv ved den laveste analyserte dose (0,003 mg/kg E3) var forskjellen i vokalisering signifikant (p<0,0001).

Som vist i Tabell 20 og Figur 20 ga behandling med antistoff E3 i en konsentrasjon på 1 mg/kg en hurtig og robust smertelindring, i samsvar med eksperimentene ovenfor. I løpet av 2 dager (det tidligste analyserte tidspunkt) falt vokaliseringsintensiteten med 90 %. Behandling med lavere E3-konsentrasjoner ga også robust smertelindring, selv om smertelindringen ved lavere doser tok noe lenger tid på å manifestere seg. Sannsynligvis skyldes den tilsynelatende reduksjon i virkningen på Dag 24 for alle analyserte doser bortsett fra de høyeste en reduksjon i det faktiske E3-nivå i plasma, sekundært til en immunrespons hos de angjeldende rottene. Det er åpenbart at doser ned til 0,003 mg/kg ga i det minste delvis smertelindring i denne modellen.

Virkningen på kroppsvekten av å behandle dyrene med forskjellige doser av anti-NGF-antistoff E3 ble analysert statistisk ved anvendelse av toveis ANOVA for sammenligning av resultatene erholdt parvis mellom artrittiske dyr behandlet med bærestoff og dyr behandlet med en gitt dose av antistoff E3. Ved å anvende resultater normalisert til vekten på Dag 14 (Tabell 21) førte doser på 0,03 mg/kg E3 til en signifikant endring i kroppsvekten (p<0,005). Ved alle høyere doser av E3 var forskjellen mellom behandlede og ubehandlede artrittiske dyr signifikant (p=eller <0,0001). Ved anvendelse av resultater normalisert til vekten på dag 0 (Tabell 22) førte en dose på 0,03 mg/kg E3 til en signifikant endring i kroppsvekten (p<0,002). Ved alle høyere doser av E3 var forskjellen mellom de behandlede og de ubehandlede artrittiske dyrene signifikant (p<0,0001).

Igjen i samsvar med tidligere undersøkelser viste rotter behandlet med E3 mindre tilsynelatende vekttap enn saltvannsbehandlede artrittiske rotter (Tabell 22 og Figur 22). Faktisk gjenvant rotter behandlet med høye doser av antistoff E3 den tidligere tapte vekt og økte faktisk vekten hurtigere enn sine ikke-artrittiske slektninger (Tabell 21 og Figur 21).

Deponering av biologisk materiale

Følgende materialer har blitt deponert hos American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA (ATCC):

Vektor Eb.911.3E er et polynukleotid som koder for E3-lettkjedens variable område, vektor Eb.pur.911.3E er et polynukleotid som koder for E3-lettkjedens variable område og vektor Db.911.3E er et polynukleotid som koder for E3-tungkjedens variable område.

Denne deponering ble gjort under betingelsene i Budapest Konvensjonene vedrørende internasjonal anerkjennelse av deponering av mikroorganismer for patent-messige formål og forordningene i denne (Budapest Konvensjonen). Dette sikrer vedlikehold av en levedyktig kultur av deponeringen i 30 år fra deponeringsdatoen. Deponeringen vil bli gjort tilgjengelig av ATCC under betingelsene i Budapest Konvensjonene og ifølge en avtale mellom Rinat Neuroscience Corp. og ATCC som sikrer offentligheten permanent og ubegrenset tilgjengelighet av avkom fra deponeringskulturen etter tildeling av det angjeldende U.S.-patent eller etter offentliggjøring av enhver U.S.-patentsøknad eller utenlandsk patentsøknad, hva som måtte skje først, og sikrer tilgjenglighet til avkommet for en som U.S. Commissioner of Patents and Trademarks har funnet å ha rett til dette ifølge 35 USC seksjon 122 og kommisjonærens regler vedrørende dette (innbefattet 37 CFR seksjon 1.14, med spesiell henvisning til 886 OG 638).

Overtager av foreliggende patentsøknad har gått med på at dersom en kultur av de deponerte materialer skulle død, gå tapt eller ødelegges under dyrking under egnede betingelser, vil materialene umiddelbart erstattes med en av de samme etter at det er gitt beskjed. Tilgjengeligheten av det deponerte materiale skal ikke omfattes som en lisens til å utføre oppfinnelsen i strid med de rettigheter som gis under enhver statlig autoritet i samsvar med dens patentlover.

Claims

1. Anti-nervevekstfaktor (NGF) antagonist antistoff eller antigenbindende fragment derav for anvendelse ved behandling av osteoartritt-smerte i et individ.

2. Antistoff eller antigenbindende fragment derav, for anvendelse i følge krav 1, hvor antistoffet eller det antigenbindende fragment derav binder seg til en NGF-epitop hvor den omfatter en eller flere av: rester K32, K34 og E35 for human NGF; rester Y79 og T81 av human NGF; rester H84 og K88 av human NGF; rest R103 av human NGF; rest Ell av human NGF; Y52 av human NGF; rester L112 og S113 av human NGF; rester R59 og R69 av human NGF; eller rester V18, V20 og G23 av human NGF.

3. Anti-nervevekstfaktor (NGF)-antistoff, eller antigenbindende fragment derav, for anvendelse i følge krav 1, hvor antistoffet eller det antigenbindende fragment derav: (a) binder NGF med en KDpå lavere enn tilnærmet 2 nM; (b) inhiberer human NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 på 100 pM eller lavere, hvor IC50 måles i nærvær av 15 pM human NGF, og (c) inhiberer human NGF-avhengig overlevelse av trigeminus museneuronene E13.5 med en IC50 på 10 pM eller lavere, hvor IC50 måles i nærvær av 1,5 pM human NGF.

4. Antistoff eller antigenbindende fragment derav, for anvendelse ifølge krav 1, omfattende (a) tre CDR fra en tungkjede variabel region med SEKV ID NO: 1; og (b) tre CDR fra en lettkjede variabel region av SEKV ID NO: 2; hvor CDR'ene er Kabat CDR'er, Chothia CDR'er eller en kombinasjon av Kabat og Chothia CDR'ene.

5. Antistoff eller antigenbindende fragment derav, for anvendelse ifølge krav 4, hvor antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter et tungkjede variabel region som omfatter: (a) et CDRl-område som vist i SEKV. ID. NR. 3, (b) et CDR2-område som vist i SEKV. ID. NR. 4, og (c) et CDR3-område som vist i SEKV. ID. NR. 5, og en lettkjede variabel region som omfatter: (d) et CDRl-område som vist i SEKV. ID. NR. 6, (e) et CDR2-område som vist i SEKV. ID. NR. 7, og (4) et CDR3-område som vist i SEKV. ID. NR. 8.

6. Antistoff for anvendelse ifølge krav 4 eller 5, hvor antistoffet videre omfatter en human tungkjede IgG2a konstant region.

7. Antistoff for anvendelse ifølge krav 6, hvor antistoffet omfatter videre en human lettkjede kappa konstant region.

8. Antistoff for anvendelse ifølge krav 6 eller 7, hvor den humane tungkjede IgG2a konstante regionen er modifisert.

9. Antistoff for anvendelse ifølge krav 8, hvor den humane tungkjede IgG2a konstante regionen omfatter mutasjonene A330P331 til S330S331, aminosyre-nummerering med henvisning til villtype-IgG2a-sekvensen.

10. Antistoff eller antigenbindende fragment derav, for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 4 til 9, hvor antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter en tungkjede variabel region som omfatter sekvensen vist i SEQ ID NO: 1 og en lettkjede variabel region omfatter sekvensen vist i SEQ ID NO: 2.

11. Antistoff for anvendelse ifølge krav 10, hvor antistoffet omfatter en tungkjede omfattende aminosyresekvensen som er vist i SEKV. ID. NR. 16, og en lettkjede omfattende aminosyresekvensen som er vist i SEKV. ID. NR. 17.

12. Antistoff eller antigenbindende fragment derav, for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, hvor antistoffet eller det antigenbindende fragment derav binder den samme humane NGF epitopen som et antistoff som angitt i krav 10 eller 11.

13. Antistoff eller antigenbindende fragment derav, for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12, hvor det antigenbindende fragmentet er et Fab, Fab', F(ab')2, Fv, eller ScFv.

14. Anvendelse av en effektiv mengde av et antagonistisk anti-NGF-antistoff for fremstilling av et medikament for behandling av osteoartritt-smerte i et individ.