PL215171B1

PL215171B1 - Przeciwcialo przeciw czynnikowi wzrostu nerwów (NGF) lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zestaw, sposób wytwarzania przeciwciala lub jego fragmentu, zastosowanie skutecznej ilosci antagonistycznego przeciwciala anty-NGF lub jego fragmentu, zastosowanie antagonistycznego przeciwciala anty-NGF lub jego fragmentu, izolowany polinukleotyd zawierajacy sekwencje nukleotydowa kodujaca przeciwcialo lub jego fragment, wektor oraz komórka gospodarza zawierajaca polinukleotyd

Info

Publication number: PL215171B1
Application number: PL380679A
Authority: PL
Inventors: David L. Shelton; Jaume Pons; Arnon Rosenthal
Original assignee: Rinat Neuroscience Corp
Priority date: 2002-12-24
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2013-10-31
Also published as: JP4134170B2; ES2697876T3; CA2936742A1; SI2270048T1; EP2270048A3; CA2921578C; PL380679A1; EP2263692A1; EA200501043A1; HK1076251A1; NO336655B1; CN101014364B; DK2263692T3; CA2511598A1; US9708398B2; NZ540730A; IL263573A; HUE026089T2; JP2008148710A; NZ587852A

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało przeciw czynnikowi wzrostu nerwów (NGF) lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zestaw, sposób wytwarzania przeciwciała lub jego fragmentu, zastosowanie skutecznej ilości antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragmentu, zastosowanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragmentu, izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment, wektor oraz komórka gospodarza zawierająca polinukleotydy. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy przeciwciał anty-NGF (takich jak przeciwciała skierowane przeciwko NGF). Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania takich przeciwciał w leczeniu i/lub zapobieganiu bólowi, obejmującemu ból pooperacyjny, ból towarzyszący reumatoidalnemu zapaleniu stawów, i ból towarzyszący zapaleniu kości i stawów.

Niniejszy wynalazek opracowano przy wsparciu rządu USA zgodnie z kontraktem nr DAAD19-03-C-0006, przyznanym przez DAJRPA. Rządowi USA mogą przysługiwać pewne prawa do tego wynalazku.

Czynnik wzrostu nerwów (NGF) był pierwszą zidentyfikowaną neurotrofiną, i jego rola w rozwoju i przeżywaniu neuronów zarówno obwodowych jak i ośrodkowych została dobrze scharakteryzowana. Wykazano, że NGF jest krytycznym czynnikiem decydującym o przeżyciu i prawidłowym funkcjonowaniu w rozwoju obwodowych współczulnych i embrionalnych neuronów czuciowych i neuronów cholinergicznych podstawy mózgu w obrębie przodomózgowia. Smeyne i in., Nature 368:246-249 (1994) i Crowley i in., Cell 76:1001-1011 (1994). NGF zwiększa produkcję neuropeptydów w neuronach czuciowych (Lindsay i Harmer, Nature 337:362-364 (1989)), a w jego działaniu pośredniczą dwa różne receptory błonowe, receptor TrkA i wspólny receptor dla neurotrofin p75 (czasem określane odpowiednio jako receptory NGF „o wysokim powinowactwie i „o niskim powinowactwie). Chao i in., Science 232:518-521 (1986). Więcej informacji na temat NGF patrz Huang i in., Annu. Rev. Neurosci. 24:677-736 (2001); Bibel i in., Genes Dev. 14:2919-2937 (2000). Określono strukturę krystalograficzną NGF i NGF w kompleksie z receptorem trkA. Patrz Nature 254:411 (1991); Nature 401:184-188 (1996).

Czynnik wzrostu nerwów (NGF) był pierwszą zidentyfikowaną neurotrofiną i dokładnie zbadano jego rolę w rozwoju i przeżyciu zarówno obwodowych jak i ośrodkowych neuronów. Wykazano, że NGF jest krytycznym czynnikiem decydującym o przeżyciu i prawidłowym funkcjonowaniu w rozwoju obwodowych współczulnych i embrionalnych neuronów czuciowych i neuronów cholinergicznych podstawy mózgu w obrębie przodomózgowia (Smeyne, i in., Nature 368:246-249 (1994) i Crowley, i in., Cell 76:1001-1011 (1994)). NGF zwiększa produkcję neuropeptydów w neuronach czuciowych (Lindsay, i in., Nature 337:362-364 (1989)), a w jego działaniu pośredniczą dwa różne receptory błonowe, receptor TrkA o aktywności kinazy tyrozynej i receptor p75 który jest strukturalnie spokrewniony z innymi członkami rodziny receptorów czynnika martwicy nowotworów (Chao, i in., Science 232:518-521 (1986)).

Oprócz wpływu na układ nerwowy, stwierdza się coraz większy udział NGF w procesach poza układem nerwowym. Wykazano np., że NGF zwiększa przepuszczalność naczyń (Otten, i in., Eur J Pharmacol. 106:199-201 (1984)), zwiększa odpowiedź immunologiczną limfocytów T i B (Otten, i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059-10063 (1989)), indukuje różnicowanie limfocytów i proliferację komórek tucznych i powoduje uwalnianie rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych przez komórki tuczne (Matsuda, i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6508-6512 (1988); Pearce, i in., J. Physiol. 372:379-393 (1986); Bischoff, i in., Krew 79:2662-2669 (1992); Horigome, i in., J. Biol. Chem. 268:14881-14887 (1993)). Chociaż wykazano, że egzogennie podawany NGF jest zdolny do wywołania wszystkich tych efektów, należy zauważyć, że jedynie rzadko wykazywano, że endogenny NGF jest ma istotne znaczenie w którymkolwiek z tych procesów in vivo (Torcia, i in., Cell. 85(3):345-56 (1996)). Zatem nie jest jasne, jaki skutek, jeśli w ogóle, wywoła hamowanie bioaktywności endogennego NGF.

NGF wytwarzany jest przez kilka typów komórek obejmujących komórki tuczne (Leon, i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3739-3743 (1994)), limfocyty B (Torcia, i in., Cell 85:345-356 (1996), keratynocyty (Di Marco, i in., J. Biol. Chem. 268:22838-22846)), komórki mięśni gładkich (Ueyama, i in., J. Hypertens. 11:1061-1065 (1993)), fibroblasty (Lindholm, i in., Eur. J. Neurosci. 2:795-801 (1990)), komórki nabłonka oskrzeli (Kassel, i in., Clin, Exp. Allergy 31:1432-40 (2001)), komórki mezangium kłębuszków nerkowych (Steiner, i in., Am. J. Physiol. 261:F792-798 (1991)) i miotuby mięśni szkieletowych (Schwartz, i in., J Photochem. Photobiol. B66:195-200 (2002)). Receptory NGF znalePL 215 171 B1 ziono w różnych typach komórek poza układem nerwowym. Na przykład TrkA stwierdzono na ludzkich monocytach, limfocytach T i B i komórkach tucznych.

Zaobserwowano związek pomiędzy zwiększonym poziomem NGF i różnymi stanami zapalnymi u pacjentów, jak również w kilku modelach zwierzęcych. Obejmują one toczeń rumieniowaty układowy (Bracci-Laudiero, i in., Neuroreport 4:563-565 (1993)), stwardnienie rozsiane (Bracci-Laudiero, i in., Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), łuszczycę (Raychaudhuri, i in., Acta Derm. l'enereol. 78:84-86 (1998)), zapalenie stawów (Falcim, i in., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), śródmiąższowe zapalenie pęcherza (Okragly, i in., J. Urology 161:438-441 (1999)) i astmę (Braun, i in., Eur. J Immunol 28:3240-3251 (1998)).

Zgodnie z tym, podwyższony poziom NGF w tkankach obwodowych jest związany z przeczulicą bólową oraz zapaleniem i obserwowano go w wielu postaciach zapalenia stawów. Błona maziowa pacjentów dotkniętych reumatoidalnym zapaleniem stawów wykazuje wysoki poziom NGF podczas gdy stwierdzono, że w nieobjętej zapaleniem błonie maziowej NGF jest niewykrywalny (Aloe, i in., Arch Rheum. 35:351-355 (1992)). Podobne wyniki zaobserwowano u szczurów z doświadczalnie wywołanym reumatoidalnym zapaleniem stawów (Aloe, i in., Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204 (1992)). Podwyższony poziom NGF opisano u transgenicznych myszy z zapaleniem stawów wraz ze zwiększeniem liczby komórek tucznych (Aloe, i in., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143 (1993)). Zgłoszenie PCT nr WO 02/096458 ujawnia zastosowanie przeciwciał anty-NGF o pewnych właściwościach w leczeniu różnych zaburzeń związanych z NGF, takich jak stan zapalny (np. reumatoidalne zapalenie stawów). Doniesiono, że oczyszczone przeciwciało anty-NGF podawane w formie zastrzyku transgenicznym myszom z zapaleniem stawów posiadającym ludzki gen na czynnik martwicy nowotworu-α (TNF-α) powodowało zmniejszenie liczby komórek tucznych, jak również obniżenie poziomów histaminy i substancji P w błonie maziowej u myszy z zapaleniem stawów (Aloe i in., Rheumatol. Int. 14: 249-252 (1995)). Wykazano, że egzogenne podawanie przeciwciała skierowanego przeciwko NGF obniżało podwyższony poziom TNF-α występujący u myszy z zapaleniem stawów (Manni i in., Rheumatol. Int. 18: 97-102 (1998)).

Zwiększenie ekspresji NGF i receptora NGF o wysokim powinowactwie (TrkA) obserwowano także w ludzkich chondrocytach przy zapaleniu kości i stawów (Iannone i in., Rheumatology 41:1413-1418 (2002)).

Opisano także przeciwciała anty-NGF pochodzące od gryzoni. Patrz np. Hongo i in., Hybridoma (2000) 19(3):215-227; Ruberti i in. (1993) Cell. Molec.

Neurobiol. 13(5): 559-568. Jednakże, gdy przeciwciała pochodzące od gryzoni stosuje się terapeutycznie u ludzi, u znaczącej liczby traktowanych osób rozwija się odpowiedź skierowana przeciw mysim przeciwciałom. Ponadto dowiedziono, że funkcje efektorowe mysich przeciwciał są mniej skuteczne u ludzi. Tak więc występuje znaczące zapotrzebowanie na antagonistyczne przeciwciała anty-NGF, w tym humanizowane antagonistyczne przeciwciała anty-NGF.

Wszystkie ujawnione tu odsyłacze literaturowe, publikacje, i zgłoszenia patentowe załącza się w całości na zasadzie odsyłacza.

Opisany tu wynalazek dotyczy przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikowi wzrostu nerwów.

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało przeciw czynnikowi wzrostu nerwów (NGF) lub jego fragment, charakteryzujące się tym, że przeciwciało lub jego fragment:

(a) wiąże się z NGF z KD poniżej około 2 nanomoli;

(b) hamuje zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 około 100 pikomoli lub mniej, przy czym IC50 mierzy się w obecności około 15 pikomoli ludzkiego NGF; i (c) hamuje zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 około 10 pikomoli lub mniej, przy czym IC50 mierzy się w obecności około 1,5 pikomola ludzkiego NGF.

Korzystnie, gdy przeciwciało lub jego fragment jest przeciwciałem humanizowanym.

Korzystnie, gdy przeciwciało jest przeciwciałem o dojrzałym powinowactwie.

Korzystnie, gdy przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

Korzystnie, gdy przeciwciało jest wyizolowane.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało lub jego fragment zawierające rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący:

(a) rejon CDR1 o SEQ ID nr: 9, w którym aminokwasem w pozycji 9 w SEQ ID nr 9 jest S, L, V, A, lub I; i aminokwasem w pozycji 10 SEQ ID nr 9 jest N, T lub S;

PL 215 171 B1 (b) rejon CDR2 o SEQ ID nr 10, w którym aminokwasem w pozycji 1 w SEQ ID nr 10 jest M, I, G, Q, S, lub L; aminokwasem w pozycji 13 w SEQ ID nr 10 jest A, lub S; i aminokwasem w pozycji 14 w SEQ ID nr 10 jest L lub V; i (c) rejon CDR3 o SEQ ID nr: 11, w którym aminokwasem w pozycji 3 w SEQ ID nr 11 jest Y, L, lub R; aminokwasem w pozycji 4 w SEQ ID nr 11 jest Y lub W; aminokwasem w pozycji 6 w SEQ ID nr 11 jest G, A, lub S; aminokwasem w pozycji 7 w SEQ ID nr 11 jest T lub S; aminokwasem w pozycji 8 w SEQ ID nr 11 jest S, A, lub T; aminokwasem w pozycji 9 w SEQ ID nr 11 jest Y, R, T, lub M; aminokwasem w pozycji 10 w SEQ ID nr 11 jest Y lub F; aminokwasem w pozycji 11 w SEQ ID nr 11 jest F lub W; aminokwasem w pozycji 12 w SEQ ID nr 11 jest D, N lub G; i aminokwasem w pozycji 13 w SEQ ID nr 11 jest Y, K, S, R lub T;

przy czym przeciwciało wiąże NGF;

oraz przeciwciało nie jest przeciwciałem zawierającym rejon zmienny ciężkiego łańcucha zawierający rejon CDR1 przedstawiony w SEQ ID nr 9, rejon CDR2 przedstawiony w SEQ ID nr 10 i rejon CDR3 przedstawiony w SEQ ID nr 11 i rejon zmienny łańcucha lekkiego zawierający region CDR1 przedstawiony w SEQ ID nr 12, rejon CDR2 przedstawiony w SEQ ID nr 13 i rejon CDR3 przedstawiony w SEQ ID nr 14.

Korzystnie, gdy przeciwciało lub jego fragment zawiera ponadto rejon zmienny łańcucha lekkiego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało lub jego fragment zawierające rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący:

(a) rejon CDR1 o SEQ ID nr 12, w którym aminokwasem w pozycji 3 w SEQ ID nr 12 jest S lub F; aminokwasem w pozycji 5 w SEQ ID nr 12 jest D, S, A, lub Y; i aminokwasem w pozycji 9 w SEQ ID nr 12 jest H, N lub Q;

(b) rejon CDR2 o SEQ ID nr 13, w którym aminokwasem w pozycji 2 w SEQ ID nr 13 jest I, T, V lub A; i aminokwasem w pozycji 7 w SEQ ID nr 13 jest S lub T; i (c) rejon CDR3 o SEQ ID nr 14, w którym aminokwasem w pozycji 3 w SEQ ID nr 14 jest S lub E; aminokwasem w pozycji 4 w SEQ ID nr 14 jest K, H, R, lub S; i aminokwasem w pozycji 8 w SEQ ID nr 14 jest Y lub R;

przy czym przeciwciało wiąże NGF, oraz przeciwciało nie jest przeciwciałem zawierającym rejon zmienny ciężkiego łańcucha zawierający rejon CDR1 przedstawiony w SEQ ID nr 9, rejon CDR2 przedstawiony w SEQ ID nr 10 i rejon CDR3 przedstawiony w SEQ ID nr 11 i rejon zmienny łańcucha lekkiego zawierający rejon CDR1 przedstawiony w SEQ ID nr 12, rejon CDR2 przedstawiony w SEQ ID nr 13 i rejon CDR3 przedstawiony w SEQ ID nr 14.

Korzystnie, gdy przeciwciało lub jego fragment zawiera ponadto rejon zmienny łańcucha ciężkiego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało lub jego fragment zawierające (a) rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący:

(i) rejon CDR1 o SEQ ID nr 9, w którym aminokwasem w pozycji 9 SEQ ID nr 9 jest S, L, V, A, lub I; i aminokwasem w pozycji 10 SEQ ID nr 9 jest N, T lub S;

(ii) rejon CDR2 o SEQ ID nr 10, w którym aminokwasem w pozycji 1I SEQ ID nr 10 jest M, I, G, Q, S, lub L; aminokwasem w pozycji 13 SEQ ID nr 10 jest A, lub S; i aminokwasem w pozycji 14 SEQ ID nr 10 jest L lub V; i (iii) rejon CDR3 o SEQ ID nr: 11, w którym aminokwasem w pozycji 3 SEQ ID nr 11 jest Y, L, lub R; aminokwasem w pozycji 4 SEQ ID nr 11 jest Y lub W; aminokwasem w pozycji 6 SEQ ID nr 11 jest G, A, lub S; aminokwasem w pozycji 7 SEQ ID nr 11 jest T lub S; aminokwasem w pozycji 8 SEQ ID nr 11 jest S, A, lub T; aminokwasem w pozycji 9 SEQ ID nr 11 jest Y, R, T, lub M; aminokwasem w pozycji 10 SEQ ID nr 11 jest Y lub F; aminokwasem w pozycji 11 SEQ ID nr 11 jest F lub W; aminokwasem w pozycji 12 SEQ ID nr 11 jest D, N lub G; aminokwasem w pozycji 13 SEQ ID nr 11 jest Y, K, S, R lub T; i (b) rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący:

(i) rejon CDR1 o SEQ ID nr: 12, w którym aminokwasem w pozycji 3 SEQ ID nr 12 jest S lub F; aminokwasem w pozycji 5 SEQ ID nr 12 jest D, S, A, lub Y; i aminokwasem w pozycji 9 SEQ ID nr 12 jest Η, N, lub Q;

(ii) rejon CDR2 o SEQ ID nr: 13, w którym aminokwasem w pozycji 2 SEQ ID nr 13 jest I, T, V lub A; i aminokwasem w pozycji 7 SEQ ID nr 13 jest S lub T; i

PL 215 171 B1 (iii) rejon CDR3 o SEQ ID nr: 14, w którym aminokwasem w pozycji 3 SEQ ID nr 14 jest S lub E; aminokwasem w pozycji 4 SEQ ID nr 14 jest K, H, R, lub S; i aminokwasem w pozycji 8 SEQ ID nr 14 jest Y lub R;

Korzystnie, gdy przeciwciało wiąże ludzki NGF.

Korzystnie, gdy przeciwciało ponadto wiąże NGF gryzoni.

Korzystnie, gdy przeciwciało lub jego fragment opisane powyżej jest przeciwciałem monoklonalnym.

Korzystnie, gdy przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym.

Korzystnie, gdy przeciwciało wiąże NGF z KD około 2 nanomoli lub mniej.

Korzystnie, gdy KD wynosi około 100 pikomoli lub mniej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało anty-NGF lub jego fragment, charakteryzujące się tym, że zawiera:

a) trzy CDR-y ze zmiennego rejonu łańcucha ciężkiego sekwencji SEQ ID nr 1; i b) trzy CDR-y ze zmiennego rejonu łańcucha lekkiego sekwencji SEQ ID nr 2.

(a) rejon CDR1 przedstawiony jako SEQ ID nr: 3;

(b) rejon CDR2 przedstawiony jako SEQ ID nr: 4; i (c) rejon CDR3 przedstawiony jako SEQ ID nr: 5; przy czym przeciwciało wiąże NGF.

(a) rejon CDR1 przedstawiony jako SEQ ID nr: 6;

(b) rejon CDR2 przedstawiony jako SEQ ID nr: 7; i (c) rejon CDR3 przedstawiony jako SEQ ID nr: 8; przy czym przeciwciało wiąże NGF.

Korzystnie, gdy zawiera ponadto rejon zmienny łańcucha ciężkiego.

Korzystnie, gdy zawiera ponadto rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący:

(a) rejon CDR1 przedstawiony jako SEQ ID nr: 3;

(b) rejon CDR2 przedstawiony jako SEQ ID nr: 4; i (c) rejon CDR3 przedstawiony jako SEQ ID nr: 5.

Korzystnie, gdy rejon zmienny łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję przedstawioną jako SEQ

ID nr: 1.

Korzystnie, gdy rejon zmienny łańcucha lekkiego zawiera sekwencję przedstawioną jako SEQ ID nr: 2.

Korzystnie, gdy łańcuch ciężki składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako SEQ ID nr: 16.

Korzystnie, gdy łańcuch lekki składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako SEQ ID nr: 17.

Korzystnie, gdy przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym.

Korzystnie, gdy przeciwciało jest przeciwciałem o dojrzałym powinowactwie.

Korzystnie, gdy przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca (a) przeciwciało lub jego fragment opisane powyżej oraz (b) farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.

PL 215 171 B1

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kolejna kompozycja farmaceutyczna zawierająca (a) przeciwciało lub jego fragment określone powyżej, oraz (b) farmaceutycznie dopuszczalną farmaceutyczną zaróbkę.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kolejna kompozycja farmaceutyczna zawierająca (a) przeciwciało lub jego fragment opisane powyżej, oraz (b) farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw, charakteryzujący się tym, że zawiera przeciwciało lub jego fragment opisane powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kolejny zestaw, charakteryzujący się tym, że zawiera przeciwciałom lub jego fragment opisane powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kolejny zestaw, charakteryzujący się tym, że zawiera przeciwciało lub jego fragment określony powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania przeciwciała lub jego fragmentu określonego powyżej, znamienny tym, że polinukleotyd kodujący przeciwciało lub jego fragment eksprymuje się w komórce gospodarza.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kolejny sposób wytwarzania przeciwciała lub jego fragmentu określonego powyżej, charakteryzujący się tym, że polinukleotyd kodujący przeciwciało lub jego fragment eksprymuje się w komórce gospodarza.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie skutecznej ilości antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragmentu do wytwarzania leku do leczenia bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów u pacjenta.

Korzystnie, gdy ból ulega złagodzeniu w przeciągu około 24 godzin po podaniu antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragment pacjentowi.

Korzystnie, gdy ból ulega złagodzeniu w przeciągu około czterech dni po podaniu antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragmentu.

Korzystnie, gdy antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment specyficznie wiąże się z ludzkim NGF.

Korzystnie, gdy antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment jest przeciwciałem zawierającym sekwencje aminokwasowe przedstawione jako SEQ ID nr: 1 i 2.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie skutecznej ilości antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragmentu do wytwarzania leku do leczenia kacheksji wywołanej stanem zapalnym związanym z reumatoidalnym zapaleniem stawów u pacjenta.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragmentu do leczenia bólu.

Korzystnie, gdy antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment wiąże się specyficznie z NGF.

Korzystnie, gdy antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment stanowi przeciwciało zawierające sekwencję aminokwasową opisaną sekwencjami SEQ. ID nr 1 i 2.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie skutecznej ilości antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragment do wytwarzania leku do leczenia bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów u pacjenta.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment określony powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kolejny izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment opisany powyżej.

PL 215 171 B1

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kolejny izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment określony powyżej.

Korzystnie, gdy polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 65.

Korzystnie, gdy polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 66.

Korzystnie, gdy polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 67.

Korzystnie, gdy polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 68.

Korzystnie, gdy polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 66 i sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 68.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment określone powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kolejny wektor zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment określone powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza zawierająca polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment określone powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kolejna komórka gospodarza zawierająca polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment określone powyżej.

Wynalazek dotyczy przeciwciała E3 humanizowanego i o dojrzałym powinowactwie, które swoiście wiąże się z ludzkim i pochodzącym od gryzoni czynnikiem wzrostu nerwów („NGF). Sekwencje aminokwasowe rejonów zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciała E3 przedstawiono odpowiednio na fig. 1A (SEQ ID nr: 1) i 1B (SEQ ID nr: 2). Części CDR przeciwciała E3 (obejmujące rejony CDR Chotia i Kabat) schematycznie przedstawiono na fig. 1A i 1B. Poniżej przedstawiono także sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkich i lekkich E3, oraz poszczególnych wydłużonych CDR (patrz „sekwencje przeciwciał, poniżej).

Wynalazek dotyczy też przeciwciała zawierającego fragment lub rejon przeciwciała E3 (oznaczanego tu także jako „E3”). W jednym rozwiązaniu, fragment oznacza łańcuch lekki przeciwciała E3 jak pokazano na fig. 1B. W innym rozwiązaniu, fragment oznacza łańcuch ciężki przeciwciała E3 jak przedstawiono na fig. 1A. W jeszcze innym rozwiązaniu, fragment zawiera jeden lub więcej rejonów zmiennych łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przeciwciała E3. W jeszcze innym rozwiązaniu, fragment zawiera jeden lub więcej rejonów determinujących dopasowanie (CDR) łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 jak pokazano na fig. 1A i 1B.

Wynalazek dotyczy też przeciwciała zawierającego łańcuch lekki kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza numer depozytowy ATCC PTA-4893 lub ATCC PTA-4894. Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy przeciwciała zawierającego łańcuch ciężki kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza numer depozytowy ATCC PTA-4895. Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy przeciwciała zawierającego (a) łańcuch lekki kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza numer depozytowy ATCC PTA-4894 lub ATCC PTA-4893; i (b) łańcuch ciężki kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza numer depozytowy ATCC PTA-4895 (dla wygody, polinukleotyd(y) wytwarzany(e) przez zdeponowane komórki gospodarzy określa się tu jako mające numery depozytowe ATCC PTA-4894, PTA-4893 i PTA-4895). Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy przeciwciała zawierającego rejon zmienny łańcucha lekkiego, kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza numer depozytowy ATCC PTA-4894 lub ATCC PTA-4893. Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy przeciwciała zawierającego rejon zmienny łańcucha ciężkiego kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza numer depozytowy ATCC PTA-4895. Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy przeciwciała zawierającego (a) rejon zmienny łańcucha lekkiego kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza numer depozytowy ATCC PTA-4894 lub ATCC PTA-4893, i (b) rejon zmienny łańcucha ciężkiego, kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza numer depozytowy ATCC PTA-4895. W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy przeciwciała zawierającego jeden lub więcej rejonów CDR kodowanych przez (a) polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza numer depozytowy ATCC PTA-4894; i/lub (b) łańcuch ciężki kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza numer depozytowy ATCC PTA-4895.

PL 215 171 B1

W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało zawiera rejon stały łańcucha ciężkiego IgG2a pochodzenia ludzkiego. W pewnych rozwiązaniach przeciwciało zawiera rejon stały łańcucha lekkiego kappa pochodzenia ludzkiego, w pewnych rozwiązaniach, przeciwciało zawiera zmodyfikowany rejon stały, taki jak rejon stały, będący obojętny immunologicznie, np. nie uruchamiający Iizy z udziałem dopełniacza, lub nie stymulujący cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). W innych rozwiązaniach, rejon stały jest zmodyfikowany jak opisano w Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; zgłoszeniu PCT nr PCT/GB99/01441; i/lub brytyjskim zgłoszeniu patentowym nr 9809951.8. W jeszcze innych rozwiązaniach, przeciwciało zawiera rejon stały łańcucha ciężkiego IgG2a pochodzenia ludzkiego zawierający następujące mutacje: A330P331 na S330S331 (numeracja aminokwasów w odniesieniu do sekwencji IgG2a typu dzikiego). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624.

Wynalazek dotyczy też polipeptydów (które mogą, lecz nie muszą być przeciwciałem) zawierających dowolny jeden lub więcej z następujących: a) jeden, lub więcej, rejon CDR przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A i 1B; b) CDR H3 łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A; c) CDR L3 łańcucha lekkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1B; d) trzy rejony CDR łańcucha lekkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1B; e) trzy rejony CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A; i f) trzy rejony CDR łańcucha lekkiego i trzy rejony CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A i 1B. Wynalazek następnie dotyczy polipeptydów (które mogą, lecz nie muszą, być przeciwciałem) zawierających dowolny jeden lub więcej z następujących: a) jeden lub więcej (jeden, dwa, trzy, cztery, pięć, lub sześć) rejonów CDR pochodzących z przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A i 1B; b) CDR pochodzący z CDR H3 łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A; i/lub c) CDR pochodzący od CDR L3 łańcucha lekkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1B. W pewnych rozwiązaniach, rejony CDR mogą oznaczać rejony CDR Kabat, rejony CDR Chotia, lub kombinacje rejonów CDR Kabat i Chotia (określane tu jako „wydłużone lub „połączone rejony CDR). W pewnych rozwiązaniach, polipeptydy (takie jak przeciwciało) wiążą NGF (taki jak ludzki NGF). W pewnych rozwiązaniach, polipeptydy zawierają dowolną z opisanych tu konfiguracji CDF (obejmujących kombinacje, warianty, itp.).

Wynalazek dotyczy też polipeptydów (takie jak przeciwciało), które zawierają rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący SEQ ID nr: 9, przy czym I34 oznacza S, L, V A, lub I; i N35 jest podstawiona przez N, T lub S. Dla wygody, „podstawiono” lub „oznacza” w kontekście lub odniesieniu do aminokwasu, odnosi się do wyboru aminokwasu(ów) dla danej pozycji. Oczywiste jest, że podstawieniem, lub wyborem, może być aminokwas przedstawiony w SEQ ID lub fig.

Ponadto wynalazek dotyczy polipeptydów (takich jak przeciwciało), które zawierają rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący SEQ ID nr: 10, przy czym M50 oznacza M, I, G, Q, S, lub L; A62 oznacza A, lub S; i L63 oznacza L lub V.

Wynalazek dotyczy też polipeptydów (takich jak przeciwciało), które zawierają rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza D, N lub G; i przy czym Y110 oznacza Y, K, S, R lub T.

Wynalazek dotyczy też polipeptydów (takich jak przeciwciało), zawierających rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; i przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas.

Ponadto wynalazek dotyczy polipeptydów (takich jak przeciwciało), zawierających rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący SEQ ID nr: 11, przy czym G98 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym G99 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; i przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas.

Wynalazek dotyczy też polipeptydów (takich jak przeciwciało), zawierających rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący SEQ ID nr: 12, przy czym S26 oznacza S lub F; D28 oznacza D, S, A, lub Y; i H32 oznacza Η, N, lub Q.

PL 215 171 B1

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), zawierające rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący SEQ ID nr: 13, przy czym I51 oznacza I, T, V lub A; i S56 oznacza S lub T.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), zawierające rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza K, H, R, lub S; i przy czym Y96 oznacza Y lub R.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), zawierające rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza dowolny aminokwas; T93 oznacza dowolny aminokwas; i przy czym Y96 oznacza Y lub R.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 9, przy czym I34 oznacza S, L, V A, lub I; i N35 oznacza N, T lub S.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 10, przy czym M50 oznacza M, I, G, Q, S, lub L; A62 oznacza A, lub S; i L63 oznacza L lub V.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M, przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza D, N lub G; i przy czym Y110 oznacza Y, K, S, R lub T.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; i przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 11, przy czym G98 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym G99 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; i przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 12, przy czym S26 oznacza S lub F; D28 oznacza D, S, A, lub Y; i H32 oznacza Η, N, lub Q.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 13, przy czym I51 oznacza I, T, V lub A; i S56 oznacza S lub T.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza K, H, R, lub S; i przy czym Y96 oznacza Y lub R.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza dowolny aminokwas; T93 oznacza dowolny aminokwas; i przy czym Y96 oznacza Y lub R.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciała, w tym przeciwciała humanizowane), które zawierają rejon zmienny łańcucha ciężkiego zawierający rejon CDR1 z SEQ ID nr: 9, przy czym I34 oznacza S, L, V A, lub I; i N35 oznacza N, T lub S; rejon CDR2 z SEQ ID nr: 10, przy czym M50 oznacza M, I, G, Q, S, lub L; A62 oznacza A, lub S; i L63 oznacza L lub V; i rejon CDR3 z SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108, oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza D, N lub G; przy czym Y110 oznacza Y, K, S, R lub T. W pewnych rozwiązaniach, rejon zmienny łańcucha ciężkiego zawiera rejon CDR3 z SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza

PL 215 171 B1

S, A, C, G, D, N, T, lub G; przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas. W innych rozwiązaniach, rejon zmienny łańcucha ciężkiego zawiera rejon CDR3 z SEQ ID nr: 11, przy czym G98 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym G99 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; i przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd (taki jak przeciwciało) dodatkowo zawiera rejon zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), zawierające rejon zmienny łańcucha lekkiego zawierający rejon CDR1 z SEQ ID nr: 12, przy czym S26 oznacza S lub F; D28 oznacza D, S, A, lub Y; i H32 oznacza Η, N, lub Q; rejon CDR2 z SEQ ID nr: 13, przy czym I51 oznacza I, T, V lub A; i S56 oznacza S lub T; i rejon CDR3 z SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza K, H, R, lub S; i przy czym Y96 oznacza Y lub R. W pewnych rozwiązaniach, rejon zmienny łańcucha lekkiego zawiera rejon CDR3 z SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza dowolny aminokwas; T93 oznacza dowolny aminokwas; i przy czym Y96 oznacza Y lub R. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd (taki jak przeciwciało) ponadto zawiera łańcuch ciężki przeciwciała.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają (a) rejon zmienny łańcucha ciężkiego zawierający rejon CDR1 z SEQ ID nr: 9, przy czym I34 oznacza S, L, V A, lub I; i N35 oznacza N, T lub S; rejon CDR2 z SEQ ID nr: 10, przy czym M50 oznacza M, I, G, Q, S, lub L; A62 oznacza A, lub S; i L63 oznacza L lub V; i rejon CDR3 z SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza D, N lub G; przy czym Y110 oznacza Y, K, S, R lub T; i (b) rejon zmienny łańcucha lekkiego zawierający rejon CDR1 z SEQ ID nr: 12, przy czym S26 oznacza S lub F; D28 oznacza D, S, A, lub Y; i H32 oznacza Η, N, lub Q; rejon CDR2 z SEQ ID nr: 13, przy czym I51 oznacza I, T, V lub A; i S56 oznacza S lub T; i rejon CDR3 z SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza K, H, R, lub S; i przy czym Y96 oznacza Y lub R. W pewnych rozwiązaniach, rejon zmienny łańcucha lekkiego zawiera rejon CDR3 z SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza dowolny aminokwas; T93 oznacza dowolny aminokwas; i przy czym Y96 oznacza Y lub R. W pewnych rozwiązaniach, rejon zmienny łańcucha ciężkiego zawiera rejon CDR3 z SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas. W innych rozwiązaniach, rejon zmienny łańcucha ciężkiego zawiera rejon CDR3 z SEQ ID nr: 11, przy czym G98 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym G99 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; i przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd ponadto zawiera łańcuch lekki przeciwciała.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało, w tym przeciwciało humanizowane), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 9, przy czym I34 oznacza S, L, V A, lub I; i N35 oznacza N, T lub S; sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 10, przy czym M50 oznacza M, I, G, Q, S, lub L; A62 oznacza A, lub S; i L63 oznacza L lub V; i sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza D, N lub G; przy czym Y110 oznacza Y, K, S, R lub T. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; i przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; i przy czym

PL 215 171 B1

Y110 oznacza dowolny aminokwas. W innych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 11, przy czym G98 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym G99 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; i przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd (taki jak przeciwciało) ponadto zawiera rejon zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 12, przy czym S26 oznacza S lub F; D28 oznacza D, S, A, lub Y; i H32 oznacza Η, N, lub Q; sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 13, przy czym I51 oznacza I, T, V lub A; i S56 oznacza S lub T; i sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza K, H, R, lub S; i przy czym Y96 oznacza Y lub R. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza dowolny aminokwas; T93 oznacza dowolny aminokwas; i przy czym Y96 oznacza Y lub R. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd (taki jak przeciwciało) ponadto zawiera rejon zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), które zawierają (a) sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 9, przy czym I34 oznacza S, L, V A, lub I; i N35 oznacza N, T lub S; sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 10, przy czym M50 oznacza M, I, G, Q, S, lub L; A62 oznacza A, lub S; i L63 oznacza L lub V; i sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza D, N lub G; i przy czym Y110 oznacza Y, K, S, R lub T; i (b) sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 12, przy czym S26 oznacza S lub F; D28 oznacza D, S, A, lub Y; i H32 oznacza Η, N, lub Q; sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 13, przy czym I51 oznacza I, T, V lub A; i S56 oznacza S lub T; i sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza K, H, R, lub S; i przy czym Y96 oznacza Y lub R. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza dowolny aminokwas; T93 oznacza dowolny aminokwas; i przy czym Y96 oznacza Y lub R. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas. W innych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr: 11, przy czym G98 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym G99 oznacza G, S, A, C, V, N, D, lub T; przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza S, A, C, G, D, N, T, lub G; i przy czym Y110 oznacza dowolny aminokwas. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd ponadto zawiera rejon zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała.

Wynalazek dotyczy też polipeptydu (takiego jak przeciwciała) zawierającego rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący: (a) rejon CDR1 z SEQ ID nr: 9, przy czym I34 oznacza S, L, V A, lub I; i N35 podstawiono N, T lub S; (b) rejon CDR2 z SEQ ID nr: 10, przy czym M50 oznacza I, G, Q, S, lub L; A62 oznacza A, lub S; i L63 oznacza L lub V; i (c) rejon CDR3 z SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza D, N lub G; i przy czym Y110 oznacza Y, K, S, R lub T; przy czym przeciwciało wiąże NGF.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciała) zawierające rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący: (a) rejon CDR1 z SEQ ID nr: 12, przy czym S26 oznacza S lub F; D28 oznacza D, S, A, lub Y; i H32 oznacza Η, N, lub Q; (b) rejon CDR2 z SEQ ID nr: 13, przy czym I51 oznacza

PL 215 171 B1

I, T, V lub A; i S56 oznacza S lub T; i (c) rejon CDR3 z SEQ ID nr: 14, przy czym K92 oznacza K, H, R, lub S; i przy czym Y96 oznacza Y lub R; przy czym przeciwciało wiąże NGF.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciała) zawierające (a) rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący: (i) rejon CDR1 z SEQ ID nr: 9, przy czym I34 podstawiono S, L, V A, lub I; i N35 podstawiono N, T lub S; (ii) rejon CDR2 z SEQ ID nr: 10, przy czym M50 oznacza I, G, Q, S, lub L; A62 oznacza A, lub S; i L63 oznacza L lub V; i (iii) rejon CDR3 z SEQ ID nr: 11, przy czym Y100 oznacza Y, L, lub R; przy czym Y101 oznacza Y lub W; przy czym G103 oznacza G, A, lub S; przy czym T104 oznacza T lub S; przy czym S105 oznacza S, A, lub T; przy czym Y106 oznacza Y, R, T, lub M; przy czym Y107 oznacza Y lub F; przy czym F108 oznacza F lub W; przy czym D109 oznacza D, N lub G; przy czym Y110 oznacza Y, K, S, R lub T; i (b) rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący: (i) rejon CDR1 z SEQ ID nr: 12, przy czym S26 oznacza S lub F; D28 oznacza D, S, A, lub Y; i H32 oznacza Η, N, lub Q; (ii) rejon CDR2 z SEQ ID nr: 13, przy czym I51 oznacza I, T, V lub A; i S56 oznacza S lub T; i (iii) rejon CDR3 z SEQ ID nr: 14, przy czym S91 oznacza S lub E; K92 oznacza K, H, R, lub S; i przy czym Y96 oznacza Y lub R; przy czym przeciwciało wiąże NGF.

Jeśli nie wskazano inaczej, wyboru (np. podstawienia) aminokwasu w jednej pozycji dokonuje się niezależnie od jakiegokolwiek wyboru aminokwasu w dowolnej innej pozycji.

W pewnych rozwiązaniach, polinukleotydy (takie jak przeciwciało) wiążą NGF (taki jak ludzki NGF). W pewnych rozwiązaniach, polipeptydy zawierają dowolną z opisanych tu konfiguracji CDR (w tym kombinacje, wariacje, itp.).

Jak przedstawiono w opisie, stosowaną numeracją rejonów zmiennych jest numeracja sekwencyjna. Fachowcy w dziedzinie rozumieją, że istnieje wiele systemów numeracji przeciwciał (takich jak numeracja Kabat i Chotia), i jak można przekształcić numerację sekwencyjną w inny system numeracji, taki jak numeracja Kabat lub numeracja Chotia.

Wynalazek obejmuje też polipeptyd (taki jak przeciwciało) obejmujący sekwencję aminokwasową (taką jak sekwencja CDR3) wybraną spośród takich jak SEQ ID nr: 46 lub 50. W jeszcze innych rozwiązaniach, polipeptyd ponadto obejmuje jedną lub więcej sekwencji aminokwasowych przedstawionych jako SEQ ID nr: 3, 4, 5, 6, 7 i 8. W jeszcze innych rozwiązaniach, polipeptyd ponadto obejmuje jedną lub więcej sekwencji aminokwasowych przedstawionych jako SEQ ID nr: 9, 10, 11, 12, 13, 14, i 15.

Wynalazek obejmuje też polipeptyd (taki jak przeciwciało) obejmujący sekwencję aminokwasową (taką jak rejon CDR, taki jak rejon CDR H1 i/lub CDR H2) wybraną spośród takich jak (a) SEQ ID nr: 28 i/lub 29; (b) SEQ ID nr: 30 i/lub 31; (c) SEQ ID nr: 32 i/lub 33; (d) SEQ ID nr: 34 i /lub 35; (e) SEQ ID nr: 36 i/lub 37; (f) SEQ ID nr: 38 i/lub 39; i (g) SEQ ID nr: 40 i 41. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową (taką jak rejon CDR H1) wybraną spośród takich jak SEQ ID nr: 28, 30, 32, 34, 36, 38, oraz 40. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową (taką jak rejon CDR H2) wybraną spośród takich jak SEQ ID nr: 29, 31, 33, 35, 37, 39 oraz 41. W jeszcze innych rozwiązaniach, polipeptyd ponadto obejmuje jedną lub więcej sekwencji aminokwasowych przedstawionych jako SEQ ID nr: 3, 4, 5, 6, 7, oraz 8. W jeszcze innych rozwiązaniach, polipeptyd ponadto obejmuje jedną lub więcej sekwencji aminokwasowych przedstawionych jako SEQ ID nr: 9, 10, 11, 12, 13, 14, i 15.

Wynalazek obejmuje też polipeptyd (taki jak przeciwciało) obejmujący sekwencję aminokwasową (taką jak rejon CDR, taki jak rejon CDR L1 i/lub CDR L2) wybraną spośród takich jak (a) SEQ ID nr: 18 i/lub 19; (b) SEQ ID nr: 20 i/lub 21; i (c) SEQ ID nr: 22 i/lub 23. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową (taką jak rejon CDR L1) wybraną spośród takich jak SEQ ID nr: 18, 20, i 22. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową (taką jak rejon CDR L2) wybraną spośród takich jak SEQ ID nr: 19, 21 i 23. W jeszcze innych rozwiązaniach, polipeptyd ponadto obejmuje jedną lub więcej sekwencji aminokwasowych przedstawionych jako SEQ ID nr: 3, 4, 5, 6, 7, 8. W jeszcze innych rozwiązaniach, polipeptyd ponadto obejmuje jedną lub więcej sekwencji aminokwasowych przedstawionych jako SEQ ID nr: 9, 10, 11, 12, 13, 14 i 15.

Wynalazek obejmuje też polipeptyd (taki jak przeciwciało) obejmujący sekwencję aminokwasową (taką jak rejon CDR, taki jak rejon CDR L3 i/lub CDR H3) wybraną spośród takich jak (a) SEQ ID nr: 51 i/lub 52; (b) SEQ ID nr: 55 i/lub 56; (c) SEQ ID nr: 57 i/lub 58; (c) SEQ ID nr: 59 i/lub 60; (d) SEQ ID nr: 61 i/lub 62; (e) SEQ ID nr: 63 i/lub 64. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową (taką jak rejon CDR L3) wybraną spośród takich jak SEQ ID nr: 51, 55, 57, 59, 61 i 63. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową (taką jak rejon CDR H3) wybraną spośród takich jak SEQ ID nr: 52, 56, 58, 60, 62 oraz 64. W jeszcze innych rozwiąPL 215 171 B1 zaniach, polipeptyd ponadto obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako jedna lub więcej z SEQ ID nr: 18, 19, 30 i 31. W jeszcze innych rozwiązaniach, polipeptyd ponadto obejmuje jedną lub więcej sekwencji aminokwasowych przedstawionych jako SEQ ID nr: 3, 4, 5, 6, 7, i 8. W jeszcze innych rozwiązaniach, polipeptyd ponadto obejmuje jedną lub więcej sekwencji aminokwasowych przedstawionych jako SEQ ID nr: 9, 10, 11, 12, 13, 14, i 15.

Wynalazek obejmuje też polipeptyd (taki jak przeciwciało) zawierający jedną, lub więcej, sekwencję aminokwasową (taką jak rejon CDR) przedstawioną jako SEQ ID nr: 61, 63, 18, 19, 30 i 31.

Wynalazek obejmuje też przeciwciało anty-NGF (takie jak przeciwciało działające antagonistycznie), które wiąże się z NGF (takim jak ludzki NGF) z wysokim powinowactwem. W pewnych rozwiązaniach, wysokie powinowactwo oznacza (a) wiązanie NGF ze stałą dysocjacji Kd poniżej około 2 nanomoli (taką jak dowolna z następujących: około 1 nanomola, 800 pikomoli, 600 pikomoli, 400 pikomoli, 200 pikomoli, 100 pikomoli, 90 pikomoli, 80 pikomoli, 70 pikomoli, 60 pikomoli, 50 pikomoli, -5 -1 lub mniej), i/lub koff „wolniejszą” niż około 6 x 10^-5 s^-1); i/lub (b) hamowanie (zmniejszanie, i/lub blokowanie) zależnego od ludzkiego NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 (w obecności około 15 pikomoli NGF) dowolnym z następujących: około 200 pikomoli, 150 pikomoli, 100 pikomoli, 80 pikomoli, 60 pikomoli, 40 pikomoli, 20 pikomoli, 10 pikomoli, lub mniej; i/lub (c) hamowanie (zmniejszanie, i/lub blokowanie) zależnego od ludzkiego NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 (w obecności około 1,5 pikomola NGF) dowolnym z następujących: 50 pikomoli, 40 pikomoli, 30 pikomoli, 20 pikomoli, 10 pikomoli, 5 pikomoli, 2 pikomole, 1 pikomol, lub mniej; i/lub (d) hamowanie (zmniejszanie, i/lub blokowanie) zależnego od szczurzego NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 (w obecności około 15 pikomoli NGF) dowolnym z następujących: 150 pikomoli, 125 pikomoli, 100 pikomoli, 80 pikomoli, 60 pikomoli, 40 pikomoli, 30 pikomoli, 20 pikomoli, 10 pikomoli, 5 pikomoli, lub mniej; i/lub (e) hamowanie (zmniejszanie, i/lub blokowanie) zależnego od szczurzego NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 (w obecności około 1,5 pikomola NGF) dowolnym z następujących: 30 pikomoli, 25 pikomoli, 20 pikomoli, 15 pikomoli, 10 pikomoli, 5 pikomoli, 4 pikomole, 3 pikomole, 2 pikomole, 1 pikomol, lub mniej; i/lub (f) i/lub wiązanie NGF z większym powinowactwem niż receptor trkA.

Wynalazek obejmuje też polipeptydy (takie jak przeciwciało), przy czym polipeptydy (a) wiążą

NGF (taki jak ludzki NGF) z KD poniżej około 2 nM (taką jak dowolna z następujących: około 1 nanomola, 800 pikomoli, 600 pikomoli, 400 pikomoli, 200 pikomoli, 100 pikomoli, 90 pikomoli, 80 pikomoli, -5 -1 pikomoli, 60 pikomoli, 50 pikomoli, lub mniej), i/lub koff „wolniejszą” niż około 6 x 10^-5s^-1); i/lub (b) hamują zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 (w obecności około 15 pikomoli NGF) dowolnym z następujących: 200 pikomoli, 150 pikomoli, 100 pikomoli, 80 pikomoli, 60 pikomoli, 40 pikomoli, 20 pikomoli, 10 pikomoli, lub mniej; i/lub (c) hamują zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 (w obecności około 1,5 pikomola NGF) dowolnym z następujących: 50 pikomoli, 40 pikomoli, 30 pikomoli, 10 pikomoli, 20 pikomoli, 10 pikomoli, 5 pikomoli, 2 pikomole, 1 pikomol, lub mniej; i/lub wiążą się z NGF z większym powinowactwem niż receptor trkA. W pewnych rozwiązaniach, polipeptydy (a) wiążą NGF z Kd poniżej około 2 nM; i/lub (b) hamują zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 około 100 pikomoli lub mniej, przy czym IC50 mierzy się w obecności około 15 pikomoli NGF; i/lub (c) hamują zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 około 10 pikomoli lub mniej, przy czym IC50 mierzy się w obecności około 1,5 pikomola NGF, przy czym IC50 mierzy się w obecności około 15 pikomoli NGF. W pewnych rozwiązaniach, polipeptydy (a) wiążą NGF z Kd poniżej około 100 pikomoli; i/lub (b) hamują zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 około 20 pikomoli lub mniej, przy czym IC50 mierzy się w obecności około 15 pikomoli NGF; i/lub (c) hamują zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 około 2 pikomoli lub mniej, przy czym IC50 mierzy się w obecności około 1,5 pikomola NGF.

Jak jasno wynika z tego opisu, specyficznie wyłączone z wynalazku są rozwiązania dotyczące polipeptydów o sekwencji aminokwasowej identycznej z sekwencją aminokwasową mysiego monoklonalnego przeciwciała, 911. Sekwencje wydłużonych CDR Mab 911 przedstawiono na fig. 1A i 1B, i jako SEQ ID nr: 9-14.

W pewnych rozwiązaniach, wynalazek dotyczy dowolnego z powyższych polipeptydów lub przeciwciał, przy czym polipeptyd (taki jak przeciwciało) jest ponadto wyizolowany. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd (taki jak przeciwciało) jest w znacznym stopniu oczyszczony. W jeszcze innych

PL 215 171 B1 rozwiązaniach, polipeptyd (taki jak przeciwciało) ma dojrzałe powinowactwo. W innych rozwiązaniach, przeciwciało jest przeciwciałem o działaniu antagonistycznym. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd (taki jak przeciwciało) zawiera sekwencje ludzkich rejonów zrębowych. W jeszcze innych rozwiązaniach, polipeptyd (taki jak przeciwciało) zawiera jedną lub więcej domen zrębowych nie mających ludzkiego pochodzenia. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd (taki jak przeciwciało) wiąże się z NGF (takim jak ludzki NGF) z Kd 2 nanomole lub mniej. W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd zawiera jedno lub więcej (jak 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub więcej) podstawień ludzkich aminokwasowów w porównaniu z sekwencją aminokwasową nie pochodzącą od człowieka (taką jak sekwencja rejonu zmiennego, taka jak sekwencja CDR, lub taką jak sekwencja rejonu zrębowego). W pewnych rozwiązaniach, polipeptyd zawiera co najmniej 1, co najmniej 2, lub więcej, jak co najmniej 3, 4, 5, 6, lub więcej podstawień aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej macierzystego polipeptydu (takiej jak sekwencja aminokwasowa przeciwciała 911, takiej jak dowolna jedna, lub więcej, z SEQ ID nr. 9-14). W pewnych rozwiązaniach, zmieniono powinowactwo wiązania przeciwciała (w pewnych rozwiązaniach, zwiększono) w stosunku do powinowactwa macierzystego przeciwciała (takiego jak Mab 911). W jeszcze innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania przeciwciała jest niższe niż powinowactwo wiązania receptora trkA do NGF (takiego jak ludzki NGF). W pewnych rozwiązaniach, polipeptydy mogą być przeciwciałami. W pewnych rozwiązaniach, przeciwciała są przeciwciałami ludzkimi. W innych rozwiązaniach, przeciwciała są przeciwciałami humanizowanymi. W jeszcze innych rozwiązaniach, przeciwciała są przeciwciała monoklonalnymi. W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało jest przeciwciałem o dojrzałym powinowactwie.

Wynalazek dotyczy też polinukleotydów (obejmujących wyizolowany polinukleotyd) zawierających polinukleotydy kodujące dowolne z powyższych rozwiązań.

Wynalazek obejmuje też wyizolowany polinukleotyd zawierający polinukleotyd kodujący fragment lub rejon przeciwciała E3 (określanego tu także jako „E3). W jednym rozwiązaniu, fragment jest łańcuchem lekkim przeciwciała E3 jak pokazano na fig. 1B. W innym rozwiązaniu, fragment jest łańcuchem ciężkim przeciwciała E3 jak przedstawiono na fig. 1A. W jeszcze innym rozwiązaniu, fragment zawiera jeden lub więcej rejonów zmiennych łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przeciwciała E3. W jeszcze innym rozwiązaniu, fragment zawiera jeden lub więcej rejonów determinujących dopasowanie (CDR) łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przeciwciała E3, jak przedstawiono na fig. 1A i 1B.

Wynalazek dotyczy też wyizolowanego polinukleotydu obejmującego polinukleotyd, który koduje przeciwciało E3. W pewnych rozwiązaniach, polinukleotyd zawiera jeden lub oba polinukleotydy przedstawione na fig. 2 i 3.

Wynalazek dotyczy także wyizolowanego polinukleotydu, który koduje łańcuch lekki E3, o numerze depozytowym ATCC PTA-4893 lub ATCC PTA-4894. Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy wyizolowanego polinukleotydu, który koduje łańcuch ciężki E3 o numerze depozytowym ATCC PTA-4895. W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy wyizolowanego polinukleotydu obejmującego (a) rejon zmienny kodowany przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA4893 lub PTA-4894 i (b) rejon zmienny kodowany przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA-4895. W innym aspekcie, wynalazek dotyczy wyizolowanego polinukleotydu zawierającego (a) jeden lub więcej rejonów CDR kodowanych przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA4893 lub PTA-4894; i/lub (b) jeden lub więcej CDR kodowanych przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA-4895.

Wynalazek obejmuje też polinukleotydy kodujące dowolne z przeciwciał (w tym fragmentów przeciwciał) lub polipeptydów tu opisanych.

Wynalazek obejmuje też wektory (obejmujące wektory ekspresyjne i wektory do klonowania) i komórki gospodarzy zawierające dowolny z ujawnionych tu polinukleotydów.

Jak wynika z tego opisu, specyficznie wyłączone z zakresu wynalazku są rozwiązania dotyczące polinukleotydów mających identyczną sekwencję polinukleotydową jak sekwencja polinukleotydowa mysiego przeciwciała monoklonalnego 911. Sekwencje wydłużonych CDR Mab 911 przedstawiono na fig. 1A i 1B, i jako SEQ ID nr: 9-14.

Wynalazek obejmuje też komórki gospodarza zawierające polinukleotyd kodujący łańcuch lekki E3 i polinukleotyd kodujący łańcuch ciężki E3, przy czym polinukleotyd(y) kodujący(e) łańcuch lekki E3 ma numer depozytowy ATCC PTA-4893 i/lub ATCC PTA-4894, a polinukleotyd kodujący łańcuch ciężki E3 ma numer depozytowy ATCC PTA-4895. W pewnych rozwiązaniach, komórka gospodarz zawiera polinukleotyd zawierający (a) rejon zmienny kodowany przez polinukleotyd o numerze depoPL 215 171 B1 zytowym ATCC PTA-4893 lub PTA-4894 i/lub (b) rejon zmienny kodowany przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA-4895. W pewnych rozwiązaniach, komórka gospodarz zawiera polinukleotyd kodujący (a) jeden lub więcej CDR kodowanych przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA-4893 lub PTA-4894; i/lub (b) jeden lub więcej CDR kodowanych przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA-4 8 95. W pewnych rozwiązaniach, komórka gospodarz oznacza komórkę ssaka.

Wynalazek dotyczy też kompleksu NGF związanego przez przeciwciało E3. Zgodnie z innym aspektem, kompleks izoluje się. Zgodnie z innym aspektem, kompleks jest w znacznym stopniu oczyszczony.

Wynalazek dotyczy też kompleksu NGF związanego przez dowolne z opisanych tu przeciwciał lub polipeptydów. Zgodnie z innym aspektem, kompleks izoluje się, zgodnie z innym aspektem, kompleks jest w znacznym stopniu oczyszczony.

Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej zawierającej dowolny z opisanych tu polipeptydów (obejmujących przeciwciała takie jak przeciwciało E3) lub polinukleotydów, takiej jak kompozycje farmaceutyczne zawierające przeciwciało E3 lub przeciwciało zawierające fragment przeciwciała E3, i farmaceutycznie dopuszczalnej substancji pomocniczej.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania przeciwciała E3 obejmującego przygotowanie komórki gospodarza zawierającej wektor ekspresyjny, kodujący przeciwciało E3; hodowlę komórki gospodarza lub jej potomnych w warunkach umożliwiających produkcję przeciwciała E3; i oczyszczanie przeciwciała E3. W pewnych rozwiązaniach, wektor ekspresyjny zawiera jedną lub obie z sekwencji polinukleotydowych przedstawionych na fig. 2 i 3.

Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania przeciwciała E3 obejmującego ekspresję polinukleotydu kodującego łańcuch lekki E3 i polinukleotydu kodującego łańcuch ciężki E3 w odpowiedniej komórce, przy czym polinukleotyd kodujący łańcuch lekki E3 ma numer depozytowy ATCC PTA-4 893 i/lub ATCC PTA-4894, a polinukleotyd kodujący łańcuch ciężki E3 ma numer depozytowy ATCC PTA-4895; po czym na ogół następuje etap odzyskiwania i/lub izolowania przeciwciała.

Wynalazek obejmuje sposoby wytwarzania dowolnego z opisanych tu polipeptydów (takich jak przeciwciała) poprzez ekspresję jednego lub więcej polinukleotydów kodujących przeciwciało (które może być oddzielnie eksprymowane jako pojedynczy łańcuch lekki bądź ciężki, lub zarówno łańcuch lekki jak i ciężki mogą być eksprymowane z jednego wektora) w odpowiedniej komórce, po czym na ogół następuje etap odzyskiwania i/lub izolowania przeciwciała lub polipeptydów według wynalazku.

Wynalazek dotyczy także sposobu przeciwdziałania biologicznej aktywności NGF (takiego jak ludzki NGF) przez zastosowanie dowolnego z ujawnionych tu polipeptydów (obejmujących przeciwciała takie jak przeciwciało E3). W jednym rozwiązaniu, sposób zawiera kontaktowanie ludzkiego czynnika wzrostu nerwów z dowolnym z opisanych tu polipeptydów (obejmujących przeciwciało E3), dzięki czemu aktywności NGF (takiej jak aktywność ludzkiego czynnika wzrostu nerwów) przeciwdziała się, zmniejsza się ją, blokuje, lub hamuje.

Wynalazek dotyczy też sposobu wykrywania NGF z zastosowaniem dowolnego z opisanych tu polipeptydów (obejmujących przeciwciała, takie jak przeciwciało E3). Obecność NGF wykrywa się przez wykrywanie kompleksu NGF z dowolnym z opisanych tu polipeptydów (takich jak przeciwciało E3). Stosowany tu termin „wykrywanie obejmuje jakościowe i/lub ilościowe wykrywanie (pomiar poziomów) w odniesieniu lub bez odniesienia do kontroli.

Wynalazek dotyczy też sposobu leczenia bólu przez podawanie w skutecznej ilości kompozycji zawierającej przeciwciało E3 lub dowolny polipeptyd (obejmujący przeciwciało) lub polinukleotyd według opisanych tu rozwiązań. W pewnych rozwiązaniach, ból oznacza ból pooperacyjny.

Wynalazek dotyczy także sposobu zapobiegania lub leczenia bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów u pacjentów przez podawanie pacjentowi antagonistycznego przeciwciała anty-NGF w skutecznej ilości. Zgodnie z wynalazkiem wykazano, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF posiada zdolność do hamowania lub blokowania bólu związanego z reumatoidalnym zapaleniem stawów. W pewnych rozwiązaniach, ból ulega złagodzeniu w przeciągu około 24 godzin po podaniu antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. W pewnych rozwiązaniach, ból ulega złagodzeniu w przeciągu około 4 dni po podaniu antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. W pewnych rozwiązaniach, ból ulega złagodzeniu przed zaobserwowaniem lub bez objawów zmniejszenia stanu zapalnego u pacjenta.

Wynalazek obejmuje też sposoby zmniejszania występowania bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów, łagodzenia bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów,

PL 215 171 B1 hamowania bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów, uśmierzania bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów, i/lub opóźniania wystąpienia rozwoju, lub postępu bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów u pacjentów, przy czym taki sposób obejmuje podawanie pacjentowi w skutecznej ilości antagonistycznego przeciwciała anty-NGF.

Wynalazek dotyczy też sposobu zapobiegania lub leczenia bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów u pacjentów przez podawanie pacjentowi antagonistycznego przeciwciała anty-NGF w skutecznej ilości.

Wynalazek obejmuje też sposoby leczenia kacheksji spowodowanej stanem zapalnym (utrata masy ciała) związanej z reumatoidalnym zapaleniem stawów u pacjentów, obejmujące podawanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF w skutecznej ilości. Zgodnie z innym aspektem, przedmiotem wynalazku są sposoby zmniejszania występowania bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów, łagodzenia bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów, hamowania bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów, uśmierzania bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów, i/lub opóźniania wystąpienia, rozwoju, lub postępu bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów u pacjentów, przy czym sposób obejmuje podawanie pacjentowi antagonistycznego przeciwciała anty-NGF w skutecznej ilości.

Wynalazek obejmuje też zestawy i kompozycje obejmujące dowolną jedną lub więcej z opisanych tu kompozycji. Te zestawy, na ogół w odpowiednim pakowaniu i zaopatrzone w odpowiednie instrukcje, są przydatne w dowolnym z opisanych tu sposobów.

Wynalazek dotyczy także dowolnych z opisanych tu kompozycji i zestawów do dowolnego z opisanych tu zastosowań, zarówno w kontekście zastosowania jako lek jak i/lub zastosowania do wytwarzania leków.

Krótki opis rysunków

Fig. 1A: przedstawia sekwencję aminokwasową rejonu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 (oznaczone jako „6” i „5 + rejon H3 o dojrzałym powinowactwie”). Rejony CDR Chotia i CDR Kabat przedstawiono odpowiednio jako tekst podkreślony i tekst pogrubiony oraz kursywa. Fig. 1A przedstawia także dopasowanie kolejnych sekwencji aminokwasowych rejonów zmiennych łańcucha ciężkiego; (2) sekwencja akceptorowa ludzkiej linii komórek rozrodczych VH4-59 (oznaczona jako „VH4-59 lub „2”); (3) sekwencje akceptorowe, którym wszczepiono wydłużone rejony CDR mysiego przeciwciała 911 (oznaczone jako „z wszczepionym CDR” lub „3”; (4) sekwencje akceptorowe z wszczepionym CDR zawierające podstawienie V71K (oznaczone jako „3 + jedna mutacja rejonu zrębowego lub „4”); (5) klon zawierający rejony CDR H1 i H2 o dojrzałym powinowactwie (oznaczone jako „5” lub „4 + H1, H2 o dojrzałym powinowactwie); i przeciwciało E3 (jak opisano powyżej).

Fig. 1B: przedstawia sekwencję aminokwasową rejonu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała E3 (oznaczone jako „5 lub „4 + L3 o dojrzałym powinowactwie”). Rejony CDR Chotia i CDR Kabat przedstawiono odpowiednio jako tekst podkreślony i tekst pogrubiony oraz kursywa. Fig. 1B przedstawia także dopasowanie kolejnych sekwencji aminokwasowych rejonu zmiennego łańcucha lekkiego: (2) sekwencja akceptorowa ludzkiej linii komórek rozrodczych 08 (oznaczona jako „08 lub „2); (3) sekwencje akceptorowe, którym wszczepiono wydłużone rejony CDR mysiego przeciwciała 911 (oznaczone jako „z wszczepionym CDR lub „3”); (4) sekwencje akceptorowe z wszczepionym CDR (oznaczone jako „3 + L1, L2 o dojrzałym powinowactwie lub „4”; (5) klon zawierający rejony CDR L1 i L2 o dojrzałym powinowactwie (oznaczony jako „5” lub „4 + L3 o dojrzałym powinowactwie”); i przeciwciało E3 (jak opisano powyżej).

Fig. 2: przedstawia polinukleotyd obejmujący sekwencję polinukleotydową kodującą rejon zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała E3.

Fig. 3: przedstawia polinukleotyd obejmujący sekwencję polinukleotydową kodującą rejon zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała E3.

Fig. 4: przedstawia wykres obrazujący zależną od NGF przeżywalność neuronów E13,5 w obecności ludzkiego i szczurzego NGF w zmiennym stężeniu. Oś X odpowiada stężeniu NGF (ng/ml), a oś Y zliczonym neuronom.

Fig. 5: przedstawia wykres obrazujący porównanie wpływu blokującego NGF różnych fragmentów Fab w obecności albo 0,04 ng/ml ludzkiego NGF (w przybliżeniu 1,5 pikomola; przedstawione na niższym panelu) lub 0,4 ng/ml ludzkiego NGF (w przybliżeniu 15 pikomoli; przedstawione na górnym panelu). Oszacowano przeżywalność neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy różnych stężeniach Fab E3; Fab mysiego przeciwciała 911; i Fab H19-L129 i Fab 8L2-6D5. Wartości IC50 (w pikomolach) obliczono dla każdego Fab przy każdym ze stężeń NGF, i przedstawiono w tabeli 9.

PL 215 171 B1

Fab E3 silnie blokował zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego, przy IC50 równym w przybliżeniu 21 pikomoli w obecności 15 pikomoli ludzkiego NGF, i IC50 w przybliżeniu 1,2 pikomola w obecności 1,5 pikomola ludzkiego NGF. Fragmenty Fab 3C i H19-L129 także silnie blokowały zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego. Na obu panelach, oś X odpowiada stężeniu przeciwciała (nM), a oś Y odpowiada zliczonym neuronom. Ilość 1,5 pikomola NGF w przybliżeniu stanowiła IC50, natomiast 15 pikomoli reprezentowało stężenie wysycające NGF.

Fig. 6: jest wykresem porównującym blokujący NGF wpływ różnych fragmentów Fab w obecności albo 0,04 ng/ml szczurzego NGF (w przybliżeniu 1,5 pikomola; przedstawione na niższym panelu) lub 0,4 ng/ml szczurzego NGF (w przybliżeniu 15 pikomoli; przedstawione na górnym panelu). Przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy różnych stężeniach Fab E3; mysiego Fab 911; i Fab H19-L129 i 8L2-6D5 oszacowano jak opisano powyżej. Wartości IC50 (w pikomolach) obliczono dla każdego Fab przy obu stężeniach NGF, i przedstawiono w tablicy 9. Fab E3 silnie blokował zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego, przy IC50 w przybliżeniu 31,6 pikomoli w obecności 15 pikomoli szczurzego NGF, i IC50 w przybliżeniu 1,3 pikomola w obecności 1,5 pikomola szczurzego NGF. Fragmenty Fab 3C i H19-L129 także silnie blokowały zależne od szczurzego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego. 1,5 pikomola NGF w przybliżeniu stanowiło IC50, podczas gdy 15 pikomoli reprezentowało stężenie wysycające NGF. Na obydwu panelach oś X odpowiada stężeniu przeciwciała (nM), a oś Y odpowiada zliczonym neuronom.

Fig. 7: przedstawia wykres obrazujący ból spoczynkowy oszacowany 24 godziny po zabiegu operacyjnym i wskazujący, że traktowanie z zastosowaniem 0,02 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,6 mg/kg, lub 1 mg/kg przeciwciała anty-NGF E3 zmniejszało ból. Oznaczenie „*” wskazuje statystycznie istotną różnicę (p<0,5) w stosunku do kontroli negatywnej.

Fig. 8: przedstawia wykres obrazujący ból spoczynkowy oszacowany 24 godziny po zabiegu operacyjnym i wskazujący, że traktowanie z zastosowaniem 0,5 mg/kg przeciwciała anty-NGF E3 znacznie (p<0,005) zmniejszało ból spoczynkowy przy wstrzykiwaniu dwie godziny po zabiegu operacyjnym.

Fig. 9: przedstawia wykres obrazujący wyniki analizy BIAcore powinowactwa wiązania mysiego przeciwciała 911 (Fab) do ludzkiego NGF. Mysie przeciwciało 911 wiązało NGF z KD 3,7 nM, k_off 8,4 x 10^-5 s^-1 i k_on 2,2 x 10⁴ s^-1.

Fig. 10: przedstawia wykres obrazujący wyniki analizy BIAcore powinowactwa wiązania przeciwciała E3 (Fab) (określanego jako „3E Fab) do ludzkiego NGF. E3 wiązało się z ludzkim NGF

11 5 1 z K_D równym w przybliżeniu 0,07 nM (i z k_on około 6,0 x 10⁵ M^-1 s^-1 i k_off około 4,2 x 10^-5 s^-1).

Fig. 11: przedstawia wykres wskazujący, że przeciwciało E3 blokuje interakcję pomiędzy NGF a jego receptorami, trkA i p75, jak oceniono na podstawie procentowego wiązania wykrywanego pomiędzy NGF i trkA (przedstawione jako czarne kółka) i NGF i p75 (przedstawione jako puste kwadraty). Oś X odpowiada stężeniu przeciwciała 3E (Fab), a oś Y odpowiada wiązaniu NGF (procent maksymalnych RU). Zwiększenie stężenia Fab E3 blokowało interakcję pomiędzy NGF a zarówno p75 jak i trkA, jak stwierdzono na podstawie zmniejszenia sygnału (mierzonego w RU). Gdy stężenie przeciwciała E3 (Fab) równoważyło stężenie NGF, nie obserwowano wiązania z NGF (na co wskazuje sygnał na poziomie zero).

Fig. 12: przedstawia wykres obrazujący zdolność blokowania ludzkiego NGF przez przeciwciało E3 pełnej długości i Fab E3. Oceniono przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 w obecności ludzkiego NGF i różnych stężeń Fab E3 i przeciwciała E3. Oś X odpowiada miejscom wiążącym NGF (nM), a oś Y odpowiada znormalizowanemu zliczeniu neuronów nerwu trójdzielnego (TG). Przeciwciało E3 pełnej długości i Fab 3E wykazały podobne poziomy hamowania zależnego od NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego, gdy stężenie całego przeciwciała i Fab przeliczono na liczbę miejsc wiążących NGF (Fab ma jedno miejsce wiążące, a całe przeciwciało posiada dwa miejsca wiążące).

Fig. 13: przedstawia wykres obrazujący zdolność przeciwciała E3 (wypełnione trójkąty; określanego jako „3E), przeciwciało 911 (wypełnione koła), i immunoadhezynowy receptor trkA (zaciemnione kwadraty; określanego jako „trkA-Fc) w różnych stężeniach (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128, i 0,0 nM) do hamowania zależnego od NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego E13,5 w obecności 0,4 ng/ml ludzkiego NGF (warunki wysycające). Oś X odpowiada stężeniu przeciwciała (nM), a liczby na osi Y odpowiadają zliczonym neuronom. Te wyniki wskazują, że przeciwciało E3

PL 215 171 B1 blokowało NGF znacznie skuteczniej niż zarówno mysie monoklonalne przeciwciało anty-NGF 911 jak i immunoadhezyna trkA.

Fig. 14: przedstawia wykres wskazujący, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF E3 (na fig. oznaczane jako „3E) lub Fab 911 nie hamują przeżywania neuronów promowanego przez NT3, NT4/5 i MSP, nawet przy stężeniu przeciwciała tak wysokim jak 200nM. Dane reprezentują średni procent przeżywania po 48 godzinach w hodowli (± błąd standardowy średniej, n=3 dla każdego punktu pomiaru) w stosunku do przeżywania obserwowanego w kontroli pozytywnej dla każdego doświadczenia (100% przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego rosnących w obecności wysycającego stężenia NGF). Zastosowano różne stężenia (20 nM, 2 nM, lub 0,2 nM) Fab E3 (na fig. oznaczanego jako „3E) i Fab mysiego przeciwciała 911 bez dodania neurotrofiny (oznaczenie „kontrola”), w obecności 400 pikomoli NGF (oznaczenie „NGF-400 pikomoli), 10 nM NT3 (oznaczenie „NT3-10 nM) lub 600 pikomoli MSP (oznaczenie „MSP-600 pikomoli).

Fig. 15: przedstawia wykres wskazujący, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF E3 (Fab lub całe przeciwciało) (na fig. oznaczane jako „3E) lub mysie przeciwciało 911 (Fab lub całe przeciwciało) nie hamowały przeżywania neuronów promowanego przez NT3, NT4/5 i MSP, nawet przy stężeniach przeciwciała tak wysokich jak 200 nM. Zastosowano różne stężenia (200 nM i 80 nM) Fab i całego przeciwciała E3 i całe mysie przeciwciało 911 i Fab, bez dodania neurotrofin (oznaczenie „bez czynnika), oraz w obecności 400 pikomoli NGF (oznaczenie „NGF-400 pikomoli), 10 nM NT3 (oznaczenie „NT3-10 nM) lub 600 pikomoli MSP (oznaczenie „MSP-600 pikomoli).

Fig. 16: przedstawia wykres wskazujący, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF E3 lub Fab E3 nie hamowały przeżywania neuronów zwoju dolnego nerwu błędnego E17 promowanego przez BDNF, NT4/5 lub LIF. Badano także mysie antagonistyczne przeciwciało anty-NGF 911, i otrzymano podobne wyniki. Różne stężenia (200 nM lub 80 nM) przeciwciała E3 pełnej długości (na fig. oznaczenie „3E), Fab E3, przeciwciała 911 pełnej długości, lub Fab 911 badano bez dodania neurotrofin (oznaczenie „bez czynników”), w obecności 400 pikomoli BDNF (oznaczenie „BDNF-400 pikomoli), 400 pikomoli NT4/5 (oznaczenie „NT4/5-400 pikomoli), lub 2,5 nM LIF (oznaczenie „LIF-2,5 nM).

Fig. 17: przedstawia wykres wskazujący, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF E3 lub Fab E3 nie hamowały przeżywania neuronów zwoju dolnego nerwu błędnego E17 promowanego przez BDNF, NT4/5 lub LIF. Badano różne stężenia (200 nM, 20 nM, 2 nM) Fab E3 (na fig. oznaczenie „3E), lub Fab 911 bez dodania neurotrofin (oznaczenie „kontrola), w obecności 400 pikomoli BDNF (oznaczenie „BDNF-400 pikomoli), 400 pikomoli NT4/5 (oznaczenie „NT4/5-400 pikomoli), lub 2,5 nanomola LIF (oznaczenie „LlP-2,5 nanomola).

Fig. 18: przedstawia wykres obrazujący odpowiedź nocyceptywną u szczurów z zapaleniem stawów (model reumatoidalnego zapalenia stawów) po podawaniu przeciwciał anty-NGF (E3 i 911) w dniach D14 i D19. E3 (1 mg/kg, dożylnie w dniu 14 i dniu 19), 911 (10 mg/kg, dożylnie w dniu 14 i dniu 19), lub indo (indometacyna 3 mg/kg, doustnie, codziennie przez 10 dni) podawanej myszom z zapaleniem stawów. Wartości intensywności wokalizacji wyrażono w mV jako średnie ± s.e.m.

Fig. 19: przedstawia wykres obrazujący wpływ przeciwciała anty-NGF na masę ciała w zapaleniu stawów u szczurów (model reumatoidalnego zapalenia stawów) po podawaniu przeciwciała anty-NGF w dniach D14 i D19. E3 (1 mg/kg, dożylnie w dniu 14 i dniu 19), 911 (10 mg/kg, dożylnie w dniu 14 i dniu 19), lub indo (indometacyna 3 mg/kg, doustnie, codziennie przez 10 dni) podawanej myszom z zapaleniem stawów. Wartości masy ciała wyrażono w gramach jako średnią ± s.e.m.

Fig. 20: przedstawia wykres obrazujący Odpowiedź nocyceptywną u szczurów z zapaleniem stawów (model reumatoidalnego zapalenia stawów) po podawaniu przeciwciała anty-NGF E3 w różnych dawkach (0,003 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, i 5 mg/kg) w dniach D14 i D18. Wartości intensywności wokalizacji wyrażono w mV jako średnie ± s.e.m.

Fig. 21: przedstawia wykres obrazujący wpływ przeciwciała anty-NGF E3 na procent masy w dniu 14 (znormalizowane do dnia 14) u szczurów z zapaleniem stawów (model reumatoidalnego zapalenia stawów) po podawaniu przeciwciała anty-NGF E3 w różnych dawkach (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, i 5 mg/kg) w dniach D14 i D18.

Fig. 22: przedstawia wykres obrazujący wpływ przeciwciała anty-NGF E3 na spadek masy ciała u szczurów z zapaleniem stawów (model reumatoidalnego zapalenia stawów) po podawaniu przeciwciała anty-NGF E3 w różnych dawkach (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, i 5 mg/kg) w dniach D14 i D18. Wartości masy ciała znormalizowano w stosunku do dnia 0.

PL 215 171 B1

Fig. 23: przedstawia sekwencję aminokwasową rejonu zmiennego łańcucha ciężkiego E3 (fig. 23A) i sekwencję aminokwasową rejonu zmiennego łańcucha lekkiego (fig. 23B), numerowane z zastosowaniem numeracji sekwencyjnej, numeracji Kabat, i numeracji Chotia.

Szczegółowy opis wynalazku

Ujawniony tu wynalazek dotyczy antagonistycznego przeciwciała anty-NGF, które wiąże się z NGF (takim jak ludzki NGF) z wysokim powinowactwem. Wynalazek następnie dotyczy przeciwciała i polipeptydów pochodzących od E3, które wiążą NGF, i sposobów wytwarzania i stosowania tych przeciwciał. W pewnych rozwiązaniach, przedmiotem wynalazku jest humanizowane przeciwciało, E3, które wiąże się z czynnikiem wzrostu nerwów („NGF), i sposoby wytwarzania i stosowania tego przeciwciała. Wynalazek dotyczy także polipeptydów E3 (obejmujących przeciwciała), które wiążą NGF, i polinukleotydów kodujących przeciwciało i/lub polipeptyd E3.

Ujawniony tu wynalazek dotyczy także sposobów zapobiegania bólowi i/lub leczenia bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów u pacjentów przez podawanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF w terapeutycznie skutecznej ilości.

Ujawniony tu wynalazek dotyczy także sposobów zapobiegania bólowi i/lub leczenia bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów u pacjentów przez podawanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF w terapeutycznie skutecznej ilości.

Wynalazek dotyczy także sposobów służących do regulacji powinowactwa przeciwciała i sposobów służących do charakteryzowania rejonu CDR.

Ogólne techniki

Jeśli nie wskazano inaczej, w praktycznym zastosowaniu wynalazku wykorzystywać się będzie typowe techniki biologii molekularnej (obejmujące techniki rekombinacyjne), mikrobiologii, biologii komórki, biochemii i immunologii, które są znane w dziedzinie. Takie techniki są całkowicie objaśnione w literaturze, takiej jak Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie (Sambrook i in., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (pod redakcją M.J. Gait'a, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (pod redakcją J.E. Cellis'a, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (pod redakcją R.I. Freshney'a, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather i P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (pod redakcją A. Doile'a, J.B. Griffiths'a, i D.G. Newell'a, 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (pod redakcją D.M. Weir'a i C.C. Blackwell'a); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (pod redakcją J.M. Miller'a i M.P. Calos'a, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (pod redakcją P.M. Ausubel'a i in., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (pod redakcją Mullis'a i in., 1994); Current Protocols in Immunology (pod redakcją J.E. Coligan'a i in., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway i P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (pod redakcją D. Catty, IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: a practical approach (pod redakcją P. Shepherd'a i C. Dean'a, Oxford University Press, 2000); Using antibodies a laboratory manual (E. Harlow i D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (pod redakcją M. Zanetti i J.D. Capra, Harwood Academic Publishers, 1995); i Cancer: Principles and Practice of Oncology (pod redakcją V.T. DeVita i in., J.B. Lippincott Company, 1993).

Definicje „Przeciwciało oznacza cząsteczkę immunoglobuliny zdolną do swoistego wiązania z cząsteczką docelową, taką jak węglowodan, polinukleotyd, lipid, polipeptyd, itp., poprzez co najmniej jedno miejsce rozpoznające antygen, umiejscowione w rejonie zmiennym cząsteczki immunoglobuliny. Stosowany tu termin obejmuje nie tylko nienaruszone poliklonalne lub monoklonalne przeciwciała, lecz także ich fragmenty (takie jak Fab, Fab', F(ab')2, Fv), pojedynczy łańcuch (ScFv), ich mutanty, białka fuzyjne zawierające część przeciwciała, oraz jakiekolwiek inne cząsteczki immunoglobulin o zmodyfikowanej konfiguracji, które zawierają miejsce rozpoznające antygen. Przeciwciało obejmuje przeciwciało dowolnej klasy, takiej jak IgG, IgA, lub IgM (lub ich podklasy), i przeciwciało nie musi należeć do żadnej określonej klasy. Zależnie od sekwencji aminokwasowej stałej domeny łańcucha ciężkiego przeciwciała, immunoglobuliny można przypisać do różnych klas. Istnieje pięć głównych klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, a kilka z nich można dalej podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Stałe domeny łańcucha ciężkiego, które odpowiadają różnym klasom immunoglobulin nazwano odpowiednio alfa, delta, epsilon, gamma, oraz mu. Struktury podjednostek i trójwymiarowe konfiguracje różnych klas immunoglobulin są dobrze znane.

PL 215 171 B1 „Fv jest fragmentem przeciwciała, który zawiera kompletne miejsce rozpoznające antygen i miejsce wiążące. W odmianach dwułańcuchowych Fv, rejon ten składa się z dimeru domeny zmiennej jednego łańcucha ciężkiego i jednego łańcucha lekkiego w ścisłym, niekowalencyjnym połączeniu. W jednołańcuchowych odmianach Fv, domena zmienna jednego ciężkiego i jednego lekkiego łańcucha może być kowalencyjnie związana przez elastyczną peptydową grupę łączącą w ten sposób, że łańcuchy lekki i ciężki mogą łączyć się w dimerową strukturę analogiczną do tej w dwułańcuchowych odmianach Fv. Jest to ta konfiguracja, w której trzy rejony CDR każdej domeny zmiennej oddziaływują między sobą, określając swoistość wiązania antygenu na powierzchni dimeru VH-VL. Jednakże nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv, zawierająca tylko 3 rejony CDR swoiste dla antygenu) posiada zdolność do rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż na ogół z niższym powinowactwem, niż pełne miejsce wiążące.

Fragment Fab zawiera także domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego.

Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab o kilka dodatkowych reszt na karboksylowym końcu domeny CH1 łańcucha ciężkiego obejmujących jedną lub więcej cystein z rejonów zawiasowych przeciwciała.

Określenie „przeciwciało monoklonalne” odnosi się do populacji homogenicznego przeciwciała, w której przeciwciało monoklonalne składa się z aminokwasów (występujących i nie występujących w naturze), które są zaangażowane w selektywne wiązanie antygenu. Populacja monoklonalnych przeciwciał jest wysoce swoista, ponieważ jest skierowana przeciw pojedynczemu miejscu antygenowemu. Termin „przeciwciało monoklonalne obejmuje nie tylko nienaruszone monoklonalne przeciwciała i przeciwciała monoklonalne pełnej długości, lecz także ich fragmenty (takie jak Fab, Fab', F(ab')2, Fv), pojedyncze łańcuchy (ScFv), ich mutanty, białka fuzyjne zawierające fragment przeciwciała, oraz dowolną inną zmodyfikowaną konfigurację cząste czki immunoglobuliny, która zawiera miejsce rozpoznające antygen o wymaganej swoistości i zdolność do wiązania z antygenem. Nie jest ograniczony przez źródło przeciwciała lub sposób, w jaki je otrzymano (np. z hybrydomy, przez selekcję fagową, rekombinacyjną ekspresję, ze zwierząt transgenicznych, itp.).

Stosowany tu termin „ludzkie przeciwciało oznacza przeciwciało mające sekwencję aminokwasową zgodną z sekwencją przeciwciała wytwarzanego przez człowieka i/lub wytworzonego z zastosowaniem dowolnej ze znanych w dziedzinie lub ujawnionych tu technik do otrzymywania ludzkich przeciwciał. Ta definicja ludzkiego przeciwciała obejmuje przeciwciała zawierające co najmniej jeden polipeptyd ludzkiego łańcucha ciężkiego lub co najmniej jeden polipeptyd ludzkiego łańcucha lekkiego. Jedynym przykładem jest przeciwciało zawierające polipeptydy mysiego łańcucha lekkiego i ludzkiego łańcucha ciężkiego. Ludzkie przeciwciała można wytwarzać z zastosowaniem różnych technik znanych w dziedzinie. W jednym rozwiązaniu, ludzkie przeciwciało jest wybrane spośród biblioteki fagowej, przy czym ta biblioteka fagowa eksprymuje ludzkie przeciwciała (Vaughan i in., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets i in., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom i Winter, 1991, J. Mol. Biol, 227:381; Marks i in., 1991, J. Mol Biol., 222:581). Ludzkie przeciwciała można także otrzymywać przez wprowadzenie ludzkiego Ioci immunoglobulinowego do zwierząt transgenicznych, np. myszy, u których endogenne geny immunoglobulinowe poddano częściowej lub całkowitej inaktywacji. Tą metodę ujawniono w patentach St. Zjedn. Ameryki nr 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; i 5661016. Alternatywnie, ludzkie przeciwciało można wytworzyć przez unieśmiertelnienie ludzkich limfocytów B, które wytwarzają przeciwciało skierowane przeciw docelowemu antygenowi (takie limfocyty B można uzyskać od pacjenta lub mogą być immunizowane in vitro). Patrz np. Cole i in., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner i in., 1991, J. Immunol, 147 (1):86-95; i patent St. Zjedn. Ameryki nr 5750373.

Termin „przeciwciała chimeryczne odnosi się do tych przeciwciał, w których jedna część każdej z sekwencji aminokwasowych łańcuchów ciężkiego i lekkiego jest homologiczna do odpowiedniej sekwencji przeciwciał otrzymanych od określonego gatunku lub należących do danej klasy, podczas gdy pozostały odcinek łańcuchów jest homologiczny do odpowiednich sekwencji w innym. Typowo, w tych chimerycznych przeciwciałach, rejon zmienny obu łańcuchów lekkiego i ciężkiego naśladuje rejony zmienne przeciwciała pochodzącego z jednego gatunku ssaków, natomiast części stałe są homologiczne do sekwencji w przeciwciałach pochodzących od innych gatunków. Jedną oczywistą zaletą takich form chimerycznych jest to, że np. rejony zmienne można dogodnie otrzymać z obecnie znanych źródeł, stosując łatwo dostępne hybrydomy lub limfocyty B, od organizmów gospodarzy nie będących człowiekiem, w połączeniu ze stałymi rejonami otrzymanymi np. z preparatów ludzkich komóPL 215 171 B1 rek. Rejon zmienny ma tę zaletę, że łatwo go otrzymać i na jego swoistość nie wpływa pochodzenie, natomiast ludzki rejon stały z mniejszym prawdopodobieństwem wywoła immunologiczną odpowiedź pacjenta będącego człowiekiem, przy wstrzyknięciu przeciwciał, niż rejon stały nie mający ludzkiego pochodzenia. Jednakże definicja nie jest ograniczona do tego konkretnego przykładu.

„Funkcjonalny rejon Fc” ma co najmniej jedną funkcję efektorową natywnej sekwencji rejonu Fc. Przykładowo „funkcje efektorowe” obejmują wiązanie C1q; cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC); wiązanie receptora Fc; cytotoksyczność zależną od przeciwciał (ADCC); fagocytozę; zmniejszanie wrażliwości powierzchniowych receptorów komórkowych (np. receptora limfocytów B; BCR), itp. Takie funkcje efektorowe na ogół wymagają połączenia rejonu Fc z domeną wiążącą (np. domeną zmienną przeciwciała) i mogą być ocenione z zastosowaniem różnych znanych w dziedzinie testów do oceny funkcji efektorowych takiego przeciwciała.

„Natywna sekwencja rejonu Fc obejmuje sekwencję aminokwasową identyczną z sekwencją aminokwasową rejonu Fc występującą w naturze. „Wariant rejonu Fc” obejmuje sekwencję aminokwasową, która różni się od natywnej sekwencji rejonu Fc co najmniej jedną modyfikacją aminokwasu, jednakże zachowuje co najmniej jedną funkcję efektorową natywnej sekwencji rejonu Fc. Korzystnie, wariant rejonu Fc zawiera co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe w porównaniu z natywną sekwencją rejonu Fc lub rejonem Fc macierzystego polipeptydu, np. od około jednego do około dziesięciu podstawień aminokwasowych, i korzystnie od około jednego do około pięciu podstawień aminokwasowych w natywnej sekwencji rejonu Fc lub w rejonie Fc macierzystego polipeptydu. Wariant rejonu Fc w tym opisie wykazuje korzystnie co najmniej około 80% identyczności sekwencji z natywną sekwencją rejonu Fc i/lub rejonu Fc macierzystego polipeptydu, i najkorzystniej co najmniej około 90% identyczności sekwencji z powyższymi, korzystniej co najmniej około 95% identyczności sekwencji z powyższymi.

Stosowany tu termin „cytotoksyczność zależna od przeciwciał” i „ADCC” odnosi się do reakcji z udziałem komórek, w której nieswoiste komórki cytotoksyczne, eksprymujące receptory Fc (FcR) (np. komórki NK (NK), neutrofile, oraz makrofagi) rozpoznają przeciwciało związane na komórce docelowej, a następnie powodują lizę komórki docelowej. Aktywność wywołującą ADCC badanej cząsteczki można oszacować stosując test ADCC in vitro, taki jak przedstawiony w patencie St. Zjedn. Ameryki nr 5500362 lub 5821337. Przydatne komórki efektorowe do takich testów obejmują jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) i komórki NK. Alternatywnie, lub ponadto, wywołującą ADCC aktywność badanej cząsteczki można oszacować in vivo, np. w modelu zwierzęcym takim jak ujawniony przez Clynes i in., 1998, PNAS (USA), 95: 652-656.

Stosowany tu termin „receptor Fc” i „FcR” oznacza receptor, który wiąże się z rejonem Fe przeciwciała. Korzystnym FcR jest FcR o natywnej ludzkiej sekwencji. Ponadto, korzystnym FcR jest taki, który wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma) i obejmuje receptory podklas FcyRI, FcyRII, i FcyRIII, obejmujące warianty alleliczne i formy powstałe w wyniku alternatywnego splicingu tych receptorów. Receptory FcyRII obejmują FcyRIIA („receptor aktywujący” i FcyRIIB („receptor hamujący”), które posiadają podobne sekwencje aminokwasowe, różniące się zasadniczo swymi domenami cytoplazmatycznymi. Receptory FcR opisali Ravetch i Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol, 9:457-92; Capel i in., 1994, Immunomethods, 4:25-34; i de Haas i in., 1995, J. Lab. Clin. Med, 126:330-41. „FcR obejmuje także noworodkowego receptora, FcRn, który odpowiada za przenoszenie matczynych IgG do płodu (Guyer i in., 1976, J. Immunol., 117:587; i Kirn i in., 1994, J. Immunol., 24:249).

Termin „cytotoksyczność zależna od dopełniacza i „CDC odnosi się do Iizy w obecności dopełniacza. Szlak aktywacji dopełniacza rozpoczyna się przez związanie pierwszego składnika układu dopełniacza (C1q) z cząsteczką (np. przeciwciałem) połączoną w kompleks z pokrewnym antygenem. W celu oznaczenia aktywacji dopełniacza można przeprowadzić test CDC, np. jak opisali GazzanoSantoro i in., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Stosowane tu terminy „E3”, „3E”, i „przeciwciało E3” stosuje się wymiennie w odniesieniu do przeciwciała zawierającego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego i rejony zmienne łańcucha lekkiego, przedstawionych odpowiednio na fig. 1A (SEQ ID nr: 1) i 1B (SEQ ID nr: 2). Część CDR przeciwciała E3 (obejmująca rejony CDR Chotia i Kabat) przedstawiono schematycznie na fig. 1A i 1B. Fig. 2 i 3 przedstawiają polinukleotydy kodujące odpowiednio łańcuchy ciężki i lekki, zawierające rejony zmienne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przedstawione odpowiednio na fig. 1A i 1B. Wytwarzanie i charakteryzowanie E3 opisano w przykładach. Z E3 związane są różne biologiczne funkcje, między innymi zdolność do wiązania z NGF i hamowania biologicznej aktywności NGF i/lub szlaku(ów), w których pośredniczy sygnalizacja z udziałem NGF; oraz zdolność do hamowania zależ22

PL 215 171 B1 nego od NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5. Jak tu opisano, przeciwciała według wynalazku mogą mieć dowolną jedną lub więcej z tych właściwości. W pewnych rozwiązaniach, termin „E3 odnosi się do immunoglobulin kodowanych przez (a) polinukleotyd kodujący łańcuch lekki E3, o numerze depozytowym ATCC PTA-4893 lub ATCC PTA-4894, i (b) polinukleotyd kodujący łańcuch ciężki E3, o numerze depozytowym ATCC PTA-4895.

Stosowany tu termin „immunoswoiste wiązanie przeciwciała odnosi się do interakcji swoistego wiązania antygenu, która występuje pomiędzy miejscem wiążącym antygen przeciwciała i specyficznym antygenem, rozpoznawanym przez to przeciwciało (tj. przeciwciało reaguje z białkiem w teście ELISA lub innym teście immunologicznym, i nie reaguje wykrywalnie ze niespokrewnionymi białkami).

Epitop, który „swoiście wiąże się, lub „preferencyjnie wiąże się (stosowane tu zamiennie) z przeciwciałem lub polipeptydem, jest terminem dobrze rozumianym w dziedzinie, a sposoby określenia takiego swoistego lub preferencyjnego wiązania są także dobrze znane. O cząsteczce mówi się, że wykazuje „swoiste wiązanie” lub „preferencyjne wiązanie”, jeśli reaguje ona lub łączy się częściej, szybciej, z większą trwałością i/lub z większym powinowactwem z określoną komórką lub substancją niż z alternatywnymi komórkami lub substancjami. Przeciwciało „wiąże się swoiście lub „preferencyjnie wiąże się z celem, jeśli wiąże się ono z większym powinowactwem, zachłannością, większą łatwością, i/lub z większą trwałością niż wiąże się z innymi substancjami. Na przykład przeciwciało, które specyficznie lub preferencyjnie wiąże się z epitopem NGF jest przeciwciałem, które wiąże się z tym epitopem z większym powinowactwem, zachłannością, łatwiej, i/lub z większą trwałością, niż wiąże się z innymi epitopami NGF lub epitopami nie-NGF. W definicji przyjmuje się też, że np. przeciwciało (lub grupa lub epitop), która swoiście lub preferencyjnie wiąże się z pierwszym celem może, lecz nie musi swoiście lub preferencyjnie wiązać się z drugim celem. Jako takie, „wiązanie swoiste lub „preferencyjne wiązanie nie koniecznie wymaga (chociaż może obejmować) wyłącznie wiązania. Na ogół, lecz nie koniecznie, jako wiązanie rozumie się wiązanie preferencyjne.

Terminy „polipeptyd, „oligopeptyd, „peptyd” i „białko” stosuje się tu zamiennie w odniesieniu do polimerów aminokwasów dowolnej długości. Polimer może być liniowy lub rozgałęziony, może zawierać zmodyfikowane aminokwasy, i może być przerywany przez nie-aminokwasy. Terminy obejmują także polimer aminokwasowy, który zmodyfikowano naturalnie lub przez określone działania chemiczne; np. wytwarzanie wiązania dwusiarczkowego, glikozylację, dołączanie grup lipidowych, acetylację, fosforylację, lub dowolne inne manipulacje lub modyfikacje, takie jak sprzęganie ze znakowanym składnikiem. Do definicji włączone są także np. polipeptydy zawierające jeden lub więcej analogów aminokwasów (obejmujące, np. aminokwasy nie występujące w naturze, itp.), jak również inne modyfikacje znane w dziedzinie. Zrozumiałe jest, że ponieważ polipeptydy według wynalazku bazują na przeciwciele, polipeptydy mogą występować jako pojedyncze łańcuchy lub połączone łańcuchy.

Stosowane wymiennie terminy „polinukleotyd” lub „kwas nukleinowy”, odnoszą się do polimerów nukleotydów dowolnej długości i obejmują DNA i RNA. Nukleotydy mogą być deoksyrybonukleotydami, rybonukleotydami, zmodyfikowanymi nukleotydami lub zasadami, i/lub ich analogami, lub dowolnymi substratami, które można wprowadzać do polimeru przez polimerazy DNA lub RNA. Polinukleotyd może zawierać zmodyfikowane nukleotydy, takie jak metylenowane nukleotydy i ich analogi. Jeśli występują, modyfikacje struktury nukleotydowej mogą być przeprowadzane przed lub po zmontowaniu polimeru. Sekwencja nukleotydowa może być przerwana przez składniki nie będące nukleotydami. Polinukleotyd można ponadto zmodyfikować po polimeryzacji, jak przez sprzęganie ze znakowanym składnikiem. Inne typy modyfikacji obejmują, m.in. tzw. grupy końcowe „kapy, substytucję jednego lub więcej naturalnie występujących nukleotydów analogiem, modyfikacje internukleotydowe takie jak np. nienaładowanymi grupami łączącymi (np. metylofosfonianowymi, fosfotriestrowymi, fosfoamidanowymi, karbaminianowymi, itp.) i naładowanymi grupami łączącymi (np. tiofosforanowymi, ditiofosforanowymi, itp.), modyfikacje obejmujące grupy boczne, takie jak np. białka (np. nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnałowe, ply-L-lizyna, itp.), modyfikacje wykorzystujące związki interkalujące (np. akrydynę, psoralen, itp.), modyfikacje wykorzystujące związki chelatujące (np. chelatujące metale, metale radioaktywne, bor, metale utleniające, itp.), modyfikacje obejmujące związki alkilujące, modyfikacje z modyfikowanymi grupami łączącymi (np. alfa anomerami kwasów nukleinowych, itp.), jak również niemodyfikowane formy polinukleotydu(ów). Ponadto, dowolne grupy hydroksylowe zazwyczaj występujące w cukrach można zastąpić, np. grupami fosfonianowymi, grupami fosforanowymi, zabezpieczonymi z zastosowaniem standardowych grup zabezpieczających, lub aktywowanymi w celu przygotowania dodatkowych wiązań z dodatkowymi nukleotydami, lub mogą być sprzężone ze stałymi nośnikami. Grupy OH na końcach 5' i 3' mogą być ufosforylowane lub grupy od 1 do 20 atoPL 215 171 B1 mów węgla podstawione przez aminy lub organiczne grupy końcowe. Inne grupy hydroksylowe można także przekształcić w pochodne stosując typowe grupy zabezpieczające. Polinukleotydy mogą także zawierać analogiczne formy cukrów rybozy lub deoksyrybozy, które są na ogół znane w dziedzinie, obejmujące, np. 2'-O-metylo-, 2'-O-allil, 2'-fluoro- lub 2'-azydorybozę, karbocykliczne analogi cukrów, α-anomery cukrów, epimery cukrów takie jak arabinoza, ksylozy lub lyksozy, cukry piranozowe, cukry furanozowe, sedoheptulozy, niecykliczne analogi oraz pozbawione zasad analogi nukleozydów takie jak metylorybozyd. Jedno lub więcej połączeń fosfodiestrowych może być zastąpione przez alternatywne grupy łączące. Te alternatywne grupy łączące obejmują między innymi rozwiązania, w których fosforan jest zastąpiony przez P(O)S („tionian), P(S)S („ditionian), ,,(O)NR2 („amidan), P(O)R, P(O)OR', CO lub CH2 („acetal aldehydu mrówkowego), w których każdy R lub R' niezależnie oznacza H lub podstawiony lub niepodstawiony alkil (1-20 C) ewentualnie zawierający wiązanie eterowe (-O-), aryl, alkenyl, cykloalkil, cykloalkenyl lub aryloaldyl. Nie wszystkie wiązania w polinukleotydzie muszą być identyczne. Powyższy opis ma zastosowanie w odniesieniu do wszystkich opisanych tu polinukleotydów, w tym RNA i DNA.

Termin „rejon zmienny” przeciwciała odnosi się do rejonu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała lub rejonu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała, zarówno osobno jak i w kombinacji. Każdy z rejonów zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego składa się z czterech rejonów zrębowych (FR) połączonych przez trzy rejony determinujące dopasowanie (CDR) także znane jako rejony hiperzmienne. Rejony CDR w każdym łańcuchu są utrzymywane razem w bliskim sąsiedztwie przez rejony FR i, z rejonami CDR drugiego łańcucha, przyczyniają się do powstawania miejsca wiążącego antygen na przeciwciele. Istnieją co najmniej dwie techniki służące do określania rejonów CDR: (1) podejście w oparciu o międzygatunkową zmienność sekwencji (tj. Kabat i in. Sequences of

Proteins of Immunological Interest, (wydanie 5, 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD));

i (2) podejście w oparciu o krystalograficzne badania kompleksów antygen-przeciwciało (Chotia i in.

(1989) Nature 342:877; Allazikani i in. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). W stosowanym tu znaczeniu, skrót CDR może odnosić się do rejonów CDR zdefiniowanych na podstawie jednego z tych podejść lub za pomocą kombinacji obu podejść.

Określenie „rejon stały przeciwciała odnosi się do rejonu stałego łańcucha lekkiego przeciwciała lub rejonu stałego łańcucha ciężkiego przeciwciała, samego lub w kombinacji.

Stosowany tu termin „czynnik wzrostu nerwów i „NGF odnosi się do czynnika wzrostu nerwów i jego wariantów, które zachowują co najmniej część biologicznej aktywności NGF. Stosowany tu skrót NGF obejmuje wszystkie ssacze rodzaje natywnej sekwencji NGF, obejmujące ludzki, psi, koci, koński, lub bydlęcy.

Termin „receptor NGF odnosi się do polipeptydu, który wiąże się lub ulega aktywacji przez NGF. Receptory NGF obejmują receptor TrkA i receptor p75 dowolnego z gatunków ssaków, między innymi, człowieka, psa, kota, konia, ssaka z rzędu naczelnych, lub bydła.

Stosowany tu termin „antagonistyczne przeciwciało anty-NGF (stosowane wymiennie z terminem „przeciwciało anty-NGF) odnosi się do przeciwciała zdolnego do wiązania z NGF i hamowania biologicznej aktywności NGF i/lub szlaku(ów), w których pośredniczy sygnalizacja NGF. Antagonistyczne przeciwciało anty-NGF obejmuje przeciwciała, które blokują, działają przeciwstawnie, tłumią lub zmniejszają (w tym znacznie) biologiczną aktywność NGF, w tym szlaki, w których pośredniczy sygnalizacja NGF, takie jak wiązanie z receptorem i/lub wywołanie odpowiedzi komórkowej na NGF. Dla celów wynalazku będzie jasno zrozumiałe, że termin „antagonistyczne przeciwciało anty-NGF obejmuje wszystkie uprzednio określone warunki, nazwy, i stany czynnościowe i cechy, dzięki którym sam NGF, biologiczna aktywność NGF (obejmująca między innymi jego zdolność do uczestniczenia w przekazywaniu każdego rodzaju bólu pooperacyjnego), lub konsekwencje tej biologicznej aktywności są znacznie zniesione, osłabione, lub zneutralizowane w jakimkolwiek znaczącym stopniu. W pewnych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF wiąże się z NGF i zapobiega dimeryzacji NGF i/lub wiązaniu z receptorem NGF (takim jak p75 i/lub trkA). W innych rozwiązaniach, przeciwciało anty-NGF wiąże NGF i zapobiega dimeryzacji receptora trkA i/lub autofosforylacji trkA. W opisie tym przedstawionio przykłady antagonistycznych przeciwciał anty-NGF.

Termin „biologiczna aktywność” NGF na ogół odnosi się do zdolności do wiązania z receptorami NGF i/lub aktywowania szlaków sygnalizacyjnych receptora NGF. Bez ograniczeń, biologiczna aktywność obejmuje dowolne jedno lub więcej z następujących: zdolność do wiązania się z receptorem NGF (takim jak p75 i/lub trkA); zdolność do wspomagania dimeryzacji i/lub autofosforylacji receptora trkA; zdolność do aktywowacji szlaków sygnalizacyjnych receptora NGF; zdolność do wspomagania

PL 215 171 B1 różnicowania komórek, proliferacji, przeżywania, wzrostu i innych zmian w fizjologii komórki, obejmujących (w przypadku neuronów, obejmujących neurony obwodowe i neurony centralnego układu nerwowego) zmiany w morfologii neuronów, synaptogenezę, funkcje synaptyczne, uwalnianie neurotransmitera i/lub neuropeptydu i regenerację po uszkodzeniu; zdolność do wspomagania przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5; oraz zdolność do pośredniczenia w bólu, w tym bólu pooperacyjnego.

Stosowany tu termin „zasadniczo czysty odnosi się do substancji, która jest co najmniej w 50% czysta (tj. wolna od zanieczyszczeń), korzystniej co najmniej w 90% czysta, korzystniej w co najmniej 95% czysta, korzystniej w co najmniej 98% czysta, korzystniej w co najmniej 99% czysta.

„Komórka gospodarz obejmuje pojedynczą komórkę lub hodowle komórkowe, które mogą być lub były biorcą wektora(ów) do wprowadzenia polinukleotydowej wstawki. Komórki gospodarze obejmują komórki potomne pojedynczej komórki gospodarza, i komórki potomne nie muszą być koniecznie całkowicie identyczne (pod względem morfologii lub uzupełnienia genomowego DNA) z oryginalną komórką macierzystą w wyniku naturalnych, przypadkowych, lub celowych mutacji. Komórka gospodarz obejmuje komórki transfekowane in vivo z zastosowaniem polinukleotydu(ów) według wynalazku.

Stosowany tu termin „leczenie” określa podejście służące do osiągania korzystnych lub pożądanych wyników klinicznych. Dla celów wynalazku, korzystne lub pożądane kliniczne wyniki obejmują między innymi jedno lub więcej z następujących: poprawę stanu lub złagodzenie dowolnego aspektu bólu, obejmującego ostry, przewlekły, zapalny, neuropatyczny ból pooperacyjny, ból towarzyszący reumatoidalnemu zapaleniu stawów, lub ból towarzyszący zapaleniu kości i stawów. Dla celów według wynalazku, korzystne lub pożądane kliniczne wyniki obejmują między innymi jedno lub więcej z następujących: zmniejszenie nasilenia schorzenia, złagodzenie jednego lub więcej objawów związanych z bólem, w tym dowolnego aspektu bólu (takiego jak skrócenie czasu trwania bólu, zmniejszenie wrażliwości na ból lub odczuwania bólu).

Lek, związek, lub kompozycja farmaceutyczna w „skutecznej ilości oznacza, że ilość ta wystarcza do osiągnięcia korzystnych lub pożądanych wyników obejmujących kliniczne wyniki takie jak złagodzenie lub zmniejszenie odczuwania bólu. Środek w skutecznej ilości można podawać w jednej lub wielu dawkach. Dla celów według wynalazku, lek związek, lub kompozycja farmaceutyczna w skutecznej ilości, są podawane w ilości wystarczającej do leczenia, łagodzenia, zmniejszania intensywności bólu i/lub zapobiegania bólowi, obejmującemu ból pooperacyjny, ból towarzyszący reumatoidalnemu zapaleniu stawów, i/lub ból towarzyszący zapaleniu kości i stawów. W pewnych rozwiązaniach, „skuteczna ilość środka może zmniejszyć ból przy spoczynku (ból spoczynkowy) lub mechanicznie wywołany ból (obejmujący ból następujący po ruchu), lub oba, i można ją stosować przed, podczas lub po nacięciu, skaleczeniu, naderwaniu lub uszkodzeniu i/lub przed, podczas lub po bodźcach bólowych. W kontekście klinicznym, skuteczna ilość leku, związku, lub kompozycji farmaceutycznej może, lecz nie musi być osiągana w połączeniu z innym lekiem, związkiem, lub kompozycją farmaceutyczną. Zatem „skuteczna ilość” może być rozważana w kontekście podawania jednego lub więcej terapeutycznych środków, i można rozważać podawanie jednego środka w skutecznej ilości, jeśli w połączeniu z jednym lub więcej innymi środkami, może być lub jest osiągany pożądany rezultat.

„Zmniejszanie występowania bólu oznacza jakiekolwiek zmniejszenie nasilenia (co może obejmować zmniejszanie zapotrzebowania na inne leki i/lub zmniejszenie ilości (np. wystawienia na szkodliwe działanie) innych leków i/lub terapii na ogół stosowanych w tych schorzeniach, obejmujących, np. opiaty), czasu trwania, i/lub częstotliwości (obejmujących, np. opóźnianie lub wydłużenie czasu do odczucia bólu pooperacyjnego u pacjentów). Co zrozumiałe dla fachowców w dziedzinie, pacjenci mogą się różnić pod względem ich odpowiedzi na leczenie, i, jako taki, np. „sposób zmniejszania występowania bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów lub bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów u pacjentów oznacza podawanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF w oparciu o rozsądne oczekiwania, że takie podawanie może prawdopodobnie spowodować takie zmniejszenie występowania u tego konkretnego pacjenta.

„Łagodzenie bólu lub jednego lub więcej objawów bólu (takiego jak ból towarzyszący reumatoidalnemu zapaleniu stawów lub ból towarzyszący zapaleniu kości i stawów) oznacza zmniejszenie lub złagodzenie jednego lub więcej objawów bólu w porównaniu z sytuacją bez podawania antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. „Łagodzenie” obejmuje także skracanie lub zmniejszanie czasu trwania objawu.

„Uśmierzanie bólu lub jednego lub więcej objawów bólu (takiego jak ból towarzyszący reumatoidalnemu zapaleniu stawów lub ból towarzyszący zapaleniu kości i stawów) oznacza zmniejszenie

PL 215 171 B1 zakresu jednego lub więcej niepożądanych klinicznie przejawów bólu pooperacyjnego u pacjenta lub populacji pacjentów leczonych z zastosowaniem antagonistycznego przeciwciała anty-NGF zgodnie z wynalazkiem.

W znaczeniu tu stosowanym, „opóźnianie rozwoju bólu oznacza przesunięcie w czasie, przeszkodzenie, spowolnienie, opóźnienie, stabilizowanie, i/lub odroczenie wystąpienia bólu, takiego jak ból pooperacyjny, ból towarzyszący reumatoidalnemu zapaleniu stawów, lub ból towarzyszący zapaleniu kości i stawów. To opóźnienie może mieć różną długość, zależnie od historii choroby i/lub leczonego pacjenta. Co widoczne dla fachowców w dziedzinie, wystarczające lub znaczące opóźnienie może w efekcie obejmować profilaktykę, ponieważ u pacjenta nie rozwija się ból. Sposób, który „opóźnia rozwój objawów oznacza sposób, który zmniejsza prawdopodobieństwo wywoływania objawu w danym okresie i/lub zmniejsza zakres objawów w danym okresie, w porównaniu sytuacją, w której tego sposobu się nie stosuje. Takie porównania typowo opierają się na badaniach klinicznych, z zastosowaniem statystycznie znaczącej liczby pacjentów.

„Ból w stosowanym tu znaczeniu odnosi się do bólu dowolnego pochodzenia, obejmującego ból ostry i przewlekły, oraz dowolny ból z elementem zapalnym. Przykłady bólu obejmują ból pooperacyjny, ból pozabiegowy (obejmujący ból zęba), migrenę, ból głowy i nerwoból nerwu trójdzielnego, ból związany z oparzeniem, raną lub kamieniem nerkowym, ból związany z urazem (obejmującym uraz głowy), ból neuropatyczny, ból związany ze schorzeniami mięśniowo-szkieletowymi, takimi jak reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, zesztywniające zapalenie kręgosłupa, seronegatywne (niereumatoidalne) zwyrodnienie stawów, pozastawowe objawy reumatoidalnego zapalenia stawów i schorzenia okołostawowe, oraz ból związany z nowotworami (obejmujący „ból przebijający i ból związany z końcowym stadium nowotworu), neuropatia obwodowa i neuralgia popółpaścowa. Przykłady bólu z elementem zapalnym (oprócz opisanych powyżej) obejmują ból reumatyczny, ból związany z zapaleniem błon śluzowych i bolesne miesiączkowanie.

„Ból pooperacyjny (określany zamiennie jako „ponacięciowy” lub „ból pourazowy”) odnosi się do bólu powstającego na skutek lub będącego wynikiem urazu, takiego jako skaleczenie, nakłucie, nacięcie, naderwanie, lub zranienie tkanki pacjenta (w tym taki, który powstaje na skutek wszelkich działań chirurgicznych, zarówno inwazyjnych jak i nieinwazyjnych). Stosowane tu określenie ból pooperacyjny nie obejmuje bólu, który występuje (pojawia się lub powstaje) bez zewnętrznego urazu fizycznego. W pewnych rozwiązaniach, ból pooperacyjny oznacza ból wewnętrzny lub zewnętrzny (obejmujący obwodowy), przy czym zranienie, skaleczenie, uraz, naderwanie lub nacięcie mogą wystąpić przypadkowo (jak w przypadku rany urazowej) lub być wywołane rozmyślnie (jak w przypadku nacięcia chirurgicznego). W stosowanym tu znaczeniu „ból obejmuje nocycepcję i wrażenie bólowe, a ból można ocenić obiektywnie i subiektywnie, stosując punktacje w skalach oceny bólu i inne sposoby dobrze znane w dziedzinie. Ból pooperacyjny w stosowanym tu znaczeniu obejmuje allodynię (tj. zwiększoną odpowiedź na normalnie nieszkodliwy bodziec) i hiperalgezję (tj. zwiększoną odpowiedź na normalnie szkodliwe lub nieprzyjemne bodźce), które mogą z kolei, być natury termicznej lub mechanicznej (dotykowe). W pewnych rozwiązaniach, ból określa się jako wrażliwość termiczną, wrażliwość mechaniczną i/lub ból spoczynkowy. W pewnych rozwiązaniach, ból pooperacyjny obejmuje ból wywołany bodźcami mechanicznymi lub ból spoczynkowy. W innych rozwiązaniach, ból pooperacyjny obejmuje ból spoczynkowy. Ból może być bólem pierwotnym lub wtórnym, co jest dobrze znane w dziedzinie.

„Biologiczna próbka obejmuje różne typy próbek otrzymanych od pacjentów, a które można stosować w testach diagnostycznych lub monitoringowych. Definicja obejmuje krew i inne płynne próbki pochodzenia biologicznego, próbki tkanek stałych takie jak materiał pobrany w czasie biopsji lub hodowle tkankowe lub komórki z nich pochodzące, i ich komórki potomne. Definicja obejmuje także próbki, które poddano jakimkolwiek działaniom po ich otrzymaniu, takim jak traktowanie reagentami, rozpuszczanie, lub wzbogacanie w pewne składniki, takie jak białka lub polinukleotydy, lub zatopienie w półstałym lub stałym podłożu w celu pocięcia na skrawki. Termin „biologiczna próbka” obejmuje próbkę kliniczną, a także obejmuje komórki w hodowli, supernatanty komórkowe, lizaty komórkowe, surowicę, osocze, płyny biologiczne, oraz próbki tkanek.

„Pacjent jest kręgowcem, korzystnie ssakiem, korzystniej człowiekiem. Ssaki obejmują między innymi zwierzęta hodowlane (takie jak krowy), zwierzęta sportowe, zwierzęta domowe (takie jak koty, psy i konie), naczelne, myszy i szczury.

Stosowany tu termin „wektor oznacza konstrukt, który ma zdolność do dostarczenia, oraz korzystnie ekspresji, jednego lub więcej badanego genu(ów) lub sekwencji do komórki gospodarza.

PL 215 171 B1

Przykłady wektorów obejmują między innymi wektory wirusowe, wektory ekspresyjne zawierające nagi DNA lub RNA, plazmid, kosmid lub wektory fagowe, wektory ekspresyjne DNA lub RNA, związane z kationowymi czynnikami kondensującymi, wektory ekspresyjne DNA lub RNA zawarte w liposomach, i pewne komórki eukariotyczne, takie jak komórki producenci.

Stosowany tu termin „sekwencja kontrolująca ekspresję oznacza sekwencję kwasu nukleinowego, która kieruje transkrypcją kwasu nukleinowego. Sekwencja kontrolująca ekspresję może być promotorem, takim jak promotor konstytutywny lub indukowany lub enhancer. Sekwencja kontrolująca ekspresję jest czynnościowo związana z transkrybowaną sekwencją kwasu nukleinowego.

Stosowany tu termin „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik obejmuje dowolną substancję, która po połączeniu z aktywnym składnikiem, umożliwia temu składnikowi zachowanie biologicznej aktywności i nie wywołuje reakcji układu odpornościowego pacjenta. Przykłady obejmują między innymi dowolne standardowe nośniki farmaceutyczne takie jak buforowany fosforanem roztwór solanki, woda, emulsje takie jak emulsja olej/woda, i różne typy środków zwilżających. Korzystnymi rozcieńczalnikami do aerozoli lub do podawania parenteralnego są solanka buforowana fosforanem lub zwykła sól fizjologiczna (0,9%). Kompozycje zawierające takie nośniki komponuje się z zastosowaniem typowych sposobów (patrz np. Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 18, pod redakcją A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; i Remington, The Science and Practice of Pharmacy wydanie 20, Mack Publishing, 2000).

Stosowany tu termin „koff”, w zamierzeniu odnosi się do stałej szybkości rozpadu dla dysocjacji przeciwciała od kompleksu przeciwciało/antygen.

Stosowany tu termin „Kd, w zamierzeniu odnosi się do stałej dysocjacji interakcji przeciwciało-antygen.

Przeciwciało E3, przeciwciała otrzymane na bazie E3, kompozycje, oraz sposoby zastosowania

Kompozycje zawierające E3, kompozycje zawierające przeciwciała otrzymane na bazie E3, oraz sposoby otrzymywania kompozycji.

Wynalazek ten dotyczy kompozycji, obejmujących kompozycje farmaceutyczne, zawierające przeciwciało lub polipeptyd E3; oraz polinukleotydów obejmujących sekwencje kodujące przeciwciało lub polipeptyd E3. W stosowanym tu znaczeniu kompozycje obejmują jedno lub więcej przeciwciał lub polipeptydów (które mogą, lecz nie muszą być przeciwciałem) wiążących się z NGF, i/lub jeden lub więcej polinukleotydów obejmujących sekwencje kodujące jedno lub więcej przeciwciał lub polipeptydów, które wiążą się z NGF. Te kompozycje mogą ponadto zawierać odpowiednie substancje pomocnicze, takie jak farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze w tym bufory, które są dobrze znane w dziedzinie.

Wynalazek dotyczy także rozwiązań obejmujących wyizolowane przeciwciało, polipeptyd i polinukleotyd. Wynalazek dotyczy także rozwiązań obejmujących zasadniczo czyste przeciwciało, polipeptyd i polinukleotyd.

Przeciwciała i polipeptydy według wynalazku odznaczają się dowolną (jedną lub więcej) z następujących właściwości:

(a) zdolność do wiązania się z NGF; (b) zdolność do zmniejszania i/lub hamowania biologicznej aktywności NGF i/lub szlaku(ów), w których pośredniczy sygnalizacja NGF; (c) zdolność do zmniejszania i/lub hamowania zależnego od NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5; (d) brak znaczącej reaktywności krzyżowej z NT3, NT4/5, i/lub BDNF; (e) zdolność do leczenia i/lub zapobiegania bólowi (obejmującego ból pooperacyjny); (f) zdolność do zwiększania klirensu NGF; (g) zdolność do zmniejszenia lub hamowania aktywacji receptora trkA, wykrywanej, np. z zastosowaniem test aktywacji kinazy receptorowej (KIRA) (patrz patent St. Zjedn. Ameryki nr 6027927).

Właściwości wiążące przeciwciała E3, które wiąże się z ludzkim NGF z wysokim powinowactwem i wolną kinetyką dysocjacji, w porównaniu z macierzystym mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-NGF 911, podsumowano poniżej. E3 wiąże się z ludzkim NGF z w przybliżeniu 50-krotnie większym powinowactwem wiązania niż macierzyste mysie przeciwciało 911.

Przeciwciało	kD	koff	kon
911 (Fab)	3,7 nM	9 x 10^-5 s^-1	2,2 x 10⁴ M^-1 s^-1
E3 (Fab)	0,07 nM	< 4 X 10^-1 s^-1	6 x 10⁴ M^-1 S^-1

PL 215 171 B1

Przeciwciało E3 i pokrewne przeciwciała także wykazują dużą wydajność przeciwstawiania się ludzkiemu NGF, jak oszacowano na podstawie testów in vitro (patrz przykłady 2 i 3). Na przykład przeciwciało E3 przeciwdziała zależnemu od NGF przeżywaniu mysich neuronów nerwu trójdzielnego E13 przy IC50 około 21 pikomoli w obecności 15 pikomoli ludzkiego NGF, i około 1,2 pikomola w obecności 1,5 pikomola ludzkiego NGF.

Zgodnie z tym, w innym aspekcie, przeciwciała i polipeptydy według wynalazku następnie identyfikuje się i charakteryzuje na podstawie: (h) wysokiego powinowactwa wiązania z ludzkim NGF przy niskiej kinetyce dysocjacji (w pewnych rozwiązaniach, z KD poniżej około 2 nM , i/lub koff wolniejszej

-5 -1 niż około 6 x 10^-5 s^-1 i/lub (i) zdolności do hamowania (blokowania) zależnego od NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 około 100 pikomoli lub mniej przy około 15 pikomolach NGF (w pewnych rozwiązaniach, ludzkiego NGF) i/lub IC50 około 20 pikomoli lub mniej przy około 1,5 pikomola NGF.

W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało wiąże się z ludzkim NGF, i nie wiąże się w znaczącym stopniu z NGF innych gatunków kręgowców (w pewnych rozwiązaniach ssaczym). W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało wiąże się z ludzkim NGF, jak również z NGF jednego lub więcej innych gatunków kręgowców (w pewnych rozwiązaniach ssaczym). W jeszcze innych rozwiązaniach, przeciwciało wiąże się z NGF i nie reaguje krzyżowo w znaczącym stopniu z innymi neurotrofinami (takimi jak pokrewne neurotrofiny, NT3, NT4/5, i/lub BDNF). W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało wiąże się z NGF, jak również, z co najmniej jedną inną neurotrofiną. W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało wiąże się z NGF ssaków, takich jak koń lub pies, lecz nie wiąże w znaczącym stopniu NGF innych gatunków ssaków.

W pewnych rozwiązaniach, wynalazek dotyczy przeciwciała zawierającego łańcuch lekki, kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza o numerze depozytowym ATCC PTA-4893 lub ATCC PTA-4894. Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy przeciwciała zawierającego łańcuch ciężki kodowany przez polinukleotyd wytwarzany przez komórkę gospodarza o numerze depozytowym ATCC PTA-4895. Wynalazek dotyczy także różnych preparatów E3 i równoważnych fragmentów przeciwciała (np. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, itp.), pojedynczego łańcucha (ScFv), jego mutantów, fuzyjnych białek zawierających część przeciwciała, oraz dowolnej innej zmodyfikowanej konfiguracji E3, która zawiera miejsce rozpoznające antygen (NGF) o wymaganej swoistości. Ekwiwalenty przeciwciała E3, obejmujące fragmenty przeciwciała i polipeptydu (który może lecz nie musi być przeciwciałem) E3, oraz polipeptydy zawierające fragmenty polipeptydu E3, identyfikuje się i charakteryzuje za pomocą dowolnego (jednego lub więcej) z kryteriów opisanych powyżej.

Zgodnie z tym, przedmiotem wynalazku jest dowolny z następujących, lub kompozycje (obejmujące kompozycje farmaceutyczne) zawierające dowolny z następujących: (a) przeciwciało E3; (b) fragment lub rejon przeciwciała E3; (c) łańcuch lekki przeciwciała E3, jak przedstawiono na fig. 1B; (c) łańcuch ciężki przeciwciała E3, jak przedstawiono na fig. 1A; (d) jeden lub więcej rejon(ów) zmienny(ch) łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przeciwciała E3; (e) jeden lub więcej rejon(ów) CDR (jeden, dwa, trzy, cztery, pięć lub sześć rejonów CDR) przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A i 1B; (f) CDR H3 łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A; (g) CDR L3 pochodzący z łańcucha lekkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1B; (h) trzy rejony CDR łańcucha lekkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1B; (i) trzy rejony CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A; (j) trzy rejony CDR łańcucha lekkiego i trzy rejony CDR łańcucha ciężkiego, przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A i 1B; i (k) przeciwciało zawierające dowolny spośród (b) do (j). Jak jasno wynika z tego opisu, specyficznie wyłączone z wynalazku są rozwiązania polipeptydowe składające się z sekwencji aminokwasowej identycznej z sekwencją aminokwasową mysiego przeciwciała monoklonalnego 911. Sekwencje wydłużonych CDR Mab 911 przedstawiono na fig. 1A i 1B, i jako SEQ ID nr: 9-14.

Części CDR przeciwciała E3 (obejmujące rejony CDR Chotia i Kabat) schematycznie przedstawiono na fig. 1A i 1B, i składają się z następujący sekwencji aminokwasowych: (a) CDR1 łańcucha ciężkiego („CDR H1”) GFSL1GYDLN (SEQ ID nr: 3); (b) CDR2 łańcucha ciężkiego („CDR H2”) IIWGDGTTDYNSAVKS (SEQ ID nr: 4); (c) CDR3 łańcucha ciężkiego („CDR H3) GGYWYATSYYFDY (SEQ ID nr: 5); (d) CDR1 łańcucha lekkiego („CDR L1”) RASQSISNNLN (SEQ ID nr: 6); (e) CDR2 łańcucha lekkiego („CDR L2) YTSRFHS (SEQ ID nr: 7); i (f) CDR3 łańcucha lekkiego („CDR L3”) QQEHTLPYT (SEQ ID nr: 8). Określanie rejonów CDR jest dobrze znane w dziedzinie. Zrozumiałe jest, że w pewnych rozwiązaniach, rejony CDR mogą stanowić kombinację CDR Kabat i CDR Chotia

PL 215 171 B1 (także określanych jako „połączone CDR” lub „wydłużone rejony CDR”). W pewnych rozwiązaniach, rejony CDR zawierają CDR Kabat. W innych rozwiązaniach, rejony CDR oznaczają CDR Chotia.

W pewnych rozwiązaniach, przedmiotem wynalazku jest przeciwciało, które zawiera, co najmniej jeden CDR w znacznym stopniu homologiczny do co najmniej jednego CDR, co najmniej dwóch, co najmniej trzech, co najmniej czterech, co najmniej 5 rejonów CDR przeciwciała E3 (lub, w pewnych rozwiązaniach w znacznym stopniu homologiczny do wszystkich 6 rejonów CDR przeciwciała E3, lub przeciwciała pochodzącego od E3). Inne rozwiązania obejmują przeciwciała, które posiadają co najmniej dwa, trzy, cztery, pięć, lub sześć rejonów CDR, które są w znacznym stopniu homologiczne do co najmniej dwóch, trzech, czterech, pięciu lub sześciu rejonów CDR przeciwciała E3 lub pochodzącego od E3. Zrozumiałe jest, że, dla celów wynalazku, swoistość wiązania i/lub ogólna aktywność (która może być rozumiana w kategoriach leczenia i/lub zapobiegania bólowi lub hamowania zależnego od NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5) jest na ogół utrzymana, chociaż zakres aktywności może zmieniać się w porównaniu z E3 (może być większy lub mniejszy).

Wynalazek dotyczy także polipeptydu (który może, lecz nie musi być przeciwciałem), zawierającego sekwencję aminokwasową E3 (przedstawioną na fig. 1A i 1B), który posiada dowolny z następujących: co najmniej 5 przyległych aminokwasów, co najmniej 8 przyległych aminokwasów, co najmniej około 10 przyległych aminokwasów, co najmniej około 15 przyległych aminokwasów, co najmniej około 20 przyległych aminokwasów, co najmniej około 25 przyległych aminokwasów, co najmniej około 30 przyległych aminokwasów sekwencji E3, przy czym co najmniej 3 aminokwasy pochodzą z rejonu zmiennego przeciwciała E3, przy czym rozumie się, że rozwiązania, które obejmują sekwencję aminokwasową identyczną z sekwencją aminokwasową mysiego przeciwciała monoklonalnego, 911, są specyficznie wykluczone. Sekwencje wydłużonych CDR przeciwciała Mab 911 przedstawiono na fig. 1A i 1B, i jako SEQ ID nr: 9-14. W jednym rozwiązaniu, rejon zmienny pochodzi z łańcucha lekkiego E3. W innym rozwiązaniu, rejon zmienny pochodzi z łańcucha ciężkiego E3. W innym rozwiązaniu, 5 (lub więcej) przyległych aminokwasów pochodzi z rejonu determinującego dopasowanie (CDR) przedstawionego jako E3 na fig. 1A i 1B.

W innym rozwiązaniu, przedmiotem wynalazku jest polipeptyd, który obejmuje sekwencję aminokwasową E3, która posiada dowolny z następujących: co najmniej 5 przyległych aminokwasów, co najmniej 8 przyległych aminokwasów, co najmniej około 10 przyległych aminokwasów, co najmniej około 15 przyległych aminokwasów, co najmniej około 20 przyległych aminokwasów, co najmniej około 25 przyległych aminokwasów, co najmniej około 30 przyległych aminokwasów sekwencji E3, przy czym sekwencja E3 zawiera dowolny jeden lub więcej z następujących: resztę aminokwasową L29 pochodzącą z CDRH1, 150 z CDRH2, W101 z CDRH3, i/lub A103 z CDRH3; i/lub resztę aminokwasową S28 z CDRL1, N32 z CDRL1, T51 z CDRL2, 91E z CDRL3 i/lub H92 z CDRL3, przy czym przyjmuje się, że rozwiązania obejmujące sekwencję aminokwasową identyczną z sekwencją aminokwasową mysiego przeciwciała monoklonalnego, 911, są specyficznie wykluczone.

Jak widać, w tym opisie schemat numeracji sekwencyjnej aminokwasów stosuje się w odniesieniu do reszt aminokwasowych w rejonach zmiennych (tj. w sekwencji są numerowane reszty aminokwasowe w każdym rejonie zmiennym). Jak dobrze wiadomo w dziedzinie, systemy numeracji Kabat i/lub Chotia są przydatne przy porównywaniu dwóch przeciwciał lub polipeptydów, takich jak przeciwciało E3 i wariant E3 (lub polipeptyd podejrzany o to, że jest wariantem E3). Fachowcy w dziedzinie wiedzą, jak przekształcić numerację sekwencyjną na numerację Chotia i/lub Kabat, jeśli to pożądane, np. do zastosowania w przeprowadzaniu porównań pomiędzy E3 i innymi polipeptydami. Fig. 23 przedstawia rejony zmienne E3 numerowane z zastosowaniem numeracji sekwencyjnej, Chotia i Kabat. Ponadto, w celu ułatwienia porównania, na ogół zrozumiałe jest, że domeny zrębowe na ogół, lecz nie zawsze, mają w przybliżeniu taką samą liczbę reszt. Jednakże, rejony CDR mogą różnić się wielkością (tj. możliwe jest, że posiadają insercje i/lub delecje jednej lub więcej reszt aminokwasowych). Przy porównaniu przeciwciała E3 i badanego wariantu E3 (np. w przypadku rejonu CDR z badanej sekwencji, który ma dłuższą sekwencję w przeciwciele E3 do którego jest dopasowywany), można postępować zgodnie z następującymi etapami (chociaż w dziedzinie znane są inne sposoby). Dokonuje się dopasowania badanej sekwencji przeciwciała i rejonów zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciała E3. Dopasowanie można przeprowadzić ręcznie, lub komputerowo, z zastosowaniem powszechnie akceptowanych programów komputerowych. Dopasowanie można ułatwić stosując pewne reszty aminokwasowe, które są wspólne dla większości sekwencji Fab. Na przykład oba łańcuchy lekki i ciężki typowo posiadają dwie cysteiny, które często znajdują się w konserwowanej pozycji. Zrozumiałe jest, że sekwencja aminokwasowa badanego wariantu przeciwciała

PL 215 171 B1 może być dłuższa (tj. posiadać wstawione reszty aminokwasowe) lub krótsza (mieć wydeletowane reszty aminokwasowe). Do numeru reszty można dodawać przedrostki w celu wskazania insercji dodatkowych reszt, np. reszta 34 abc. Dla badanych sekwencji, które, np. dopasowuje się z sekwencją E3 dla, np. reszt 33 i 35, lecz nie mają reszty pomiędzy nimi do dopasowania z resztą 35, reszta 35 po prostu nie jest przypisywana do żadnej reszty. W innym podejściu, jest na ogół dobrze wiadome, że porównanie można przeprowadzać pomiędzy strukturalnie równoważnymi (np. tymi samymi pozycjami w kompleksie antygen-przeciwciało) aminokwasami, gdy porównuje się rejony CDR o różnej długości. Na przykład numeracja Chotia (Al-Lazikani i in., powyżej) na ogół (lecz nie we wszystkich przypadkach), umiejscawia insercje i delecje w strukturalnie poprawnych pozycjach. Strukturalną równoważność można także wydedukować lub wykazać stosując krystalografię rentgenowską lub analizę cyklu podwójnego mutanta (patrz Pons i in. (1999) Prot. Sci. 8: 958-968).

Powinowactwo wiązania przeciwciała anty-NGF z NGF (takim jak hNGF) mogą wynosić około 0,10 do około 0,80 nanomola, około 0,15 do około 0,75 nanomola i około 0,18 do około 0,72 nanomola. W pewnych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi około 2 pikomole, około 5 pikomoli, około 10 pikomoli, około 15 pikomoli, około 20 pikomoli, około 40 pikomoli, lub powyżej około 40 pikomoli. W jednym rozwiązaniu, powinowactwo wiązania wynosi pomiędzy około 2 pikomoli i 22 pikomoli. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi poniżej około 10 nanomoli, około 5 nanomoli, około 4 nanomoli, około 3,5 nanomola, około 3 nanomole, około 2,5 nanomola, około 2 nanomoli, około 1,5 nanomola, około 1 nanomola, około 900 pikomoli, około 800 pikomoli, około 700 pikomoli, około 600 pikomoli, około 500 pikomoli, około 400 pikomoli, około 300 pikomoli, około 200 pikomoli, około 150 pikomoli, około 100 pikomoli, około 90 pikomoli, około 80 pikomoli, około 70 pikomoli, około 60 pikomoli, około 50 pikomoli, około 40 pikomoli, około 30 pikomoli, około 10 pikomoli. W pewnych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi około 10 nanomoli. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi poniżej około 10 nanomoli. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi około 0,1 nanomola lub około 0,07 nanomola. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi poniżej około 0,1 nanomola lub poniżej około 0,07 nanomola. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi dowolnie około 10 nanomoli, około 5 nanomoli, około 4 nanomoli, około 3,5 nanomola, około 3 nM, około 2,5 nM, około 2 nM, około 1,5 nM, około 1 nM, około 900 pikomoli, około 800 pikomoli, bout 700 pikomoli, około 600 pikomoli, około 500 pikomoli, około 400 pikomoli, około 300 pikomoli, około 200 pikomoli, około 150 pikomoli, około 100 pikomoli, około 90 pikomoli, około 80 pikomoli, około 70 pikomoli, około 60 pikomoli, około 50 pikomoli, około 40 pikomoli, około 30 pikomoli, około 10 pikomoli do dowolnie około 2 pikomoli, około 5 pikomoli, około 10 pikomoli, około 15 pikomoli, około 20 pikomoli, lub około 40 pikomoli. W pewnych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi dowolnie około 10 nanomoli, około 5 nanomoli, około 4 nanomoli, około 3,5 nanomola, około 3 nanomoli, około 2,5 nanomola, około 2 nanomoli, około 1,5 nanomola, około 1 nanomola, około 900 pikomoli, około 800 pikomoli, około 700 pikomoli, około 600 pikomoli, około 500 pikomoli, około 400 pikomoli, około 300 pikomoli, około 200 pikomoli, około 150 pikomoli, około 100 pikomoli, około 90 pikomoli, około 80 pikomoli, około 70 pikomoli, około 60 pikomoli, około 50 pikomoli, około 40 pikomoli, około 30 pikomoli, około 10 pikomoli. W jeszcze innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi około 2 pikomole, około 5 pikomoli, około 10 pikomoli, około 15 pikomoli, około 20 pikomoli, około 40 pikomoli, lub powyżej około 40 pikomoli.

Powinowactwo wiązania przeciwciała z NGF można określić stosując metody dobrze znane w dziedzinie. Jedną z dróg określania powinowactwa wiązania przeciwciała z NGF jest pomiar powinowactwa jednofunkcyjnych fragmentów Fab przeciwciała, jak opisano w przykładach. W celu wytworzenia jednofunkcyjnych fragmentów Fab, przeciwciało (np. IgG) można przeciąć z zastosowaniem papainy lub eksprymować rekombinacyjnie. Powinowactwo fragmentu Fab przeciwciała anty-NGF można określić stosując rezonans plazmonów powierzchniowych (zestaw do rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) BlAcore3000^TM, BIAcore, INC, Piscaway NJ), jak opisano w przykładach. Protokół ten jest odpowiedni do zastosowania w oznaczaniu powinowactwa wiązania przeciwciała z NGF dowolnego gatunku, obejmującego ludzki NGF, NGF innych kręgowców (w pewnych rozwiązaniach, ssaka) (takiego jak mysi NGF, szczurzy NGF, NGF naczelnych), jak również do zastosowania z innymi neurotrofinami, takimi jak pokrewne neurotrofiny NT3, NT4/5, i/lub BDNF.

W pewnych rozwiązaniach, przeciwciała lub peptydy według wynalazku mogą hamować (zmniejszać, i/lub blokować) zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 (w obecności około 15 pikomoli NGF) dowolnym z następujących: 200 pikomoli, 150 pikomoli, 100 pikomoli, 80 pikomoli, 60 pikomoli, 40 pikomoli, 20 pikomoli, 10 pikomoli, lub

PL 215 171 B1 mniej. W pewnych rozwiązaniach, przeciwciała lub peptydy według wynalazku mogą hamować (zmniejszać, i/lub blokować) zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 (w obecności około 1,5 pikomola NGF) dowolnym z następujących: 50 pikomoli, 40 pikomoli, 30 pikomoli, 20 pikomoli, 10 pikomoli, 5 pikomoli, 2 pikomole, 1 pikomol, lub mniej.

W pewnych rozwiązaniach, przeciwciała lub peptydy według wynalazku mogą hamować (zmniejszać, i/lub blokować) zależne od szczurzego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 (w obecności około 15 pikomoli NGF) dowolnym z następujących: 150 pikomoli, 125 pikomoli, 100 pikomoli, 80 pikomoli, 60 pikomoli, 40 pikomoli, 30 pikomoli, 20 pikomoli, 10 pikomoli, 5 pikomoli, lub mniej. W pewnych rozwiązaniach, przeciwciała lub peptydy według wynalazku mogą hamować (zmniejszać, i/lub blokować) zależne od szczurzego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przy IC50 (w obecności około 1,5 pikomola NGF) dowolnym z następujących: 30 pikomoli, 25 pikomoli, 20 pikomoli, 15 pikomoli, 10 pikomoli, 5 pikomoli, 4 pikomole, 3 pikomole, 2 pikomole, pikomol, lub mniej. Sposoby pomiaru zależnego od NGF przeżywania mysich neuronów nerwu trójdzielnego E13 są znane w dziedzinie i opisane np. w przykładzie 2.

Wynalazek dotyczy także sposobów wytwarzania dowolnego z tych przeciwciał lub polipeptydów. Przeciwciała według wynalazku można wytwarzać sposobami znanymi w dziedzinie, z których niektóre zilustrowano w przykładach. Polipeptydy można wytwarzać przez proteolityczną lub inną degradację przeciwciała, metodami rekombinacyjnymi (to jest pojedyncze lub fuzyjne polipeptydy) jak opisano powyżej lub za pomocą chemicznej syntezy. Polipeptydy przeciwciał, szczególnie krótsze polipeptydy powyżej około 50 aminokwasów, są dogodnie wytwarzane z zastosowaniem chemicznej syntezy. Sposoby chemicznej syntezy są znane w dziedzinie i dostępne na rynku. Na przykład przeciwciało E3 można wytwarzać stosując automatyczny syntetyzer polipeptydów posługując się metodą w fazie stałej. Patrz także, patenty St. Zjedn. Ameryki nr 5807715; 4816567; i 6331415. Chimeryczne lub hybrydowe przeciwciała można także wytworzyć in vitro, stosując znane sposoby chemii syntetyzowania białek, obejmujące sposoby wykorzystujące środki sieciujące. Na przykład immunotoksyny można konstruować wykorzystując reakcję wymiany disiarczku lub przez tworzenie wiązania tioeterowego. Przykłady odpowiednich reagentów do tego celu obejmują iminotiolan i 4-merkaptoimidan metylu.

W innych rozwiązaniach przeciwciała można wytwarzać rekombinacyjnie, stosując sposoby, które są dobrze znane w dziedzinie. W jednym rozwiązaniu, polinukleotyd obejmujący sekwencję kodującą rejony zmienne i łańcucha lekkiego przeciwciała E3 (przedstawionego na fig. 1A i 1B) wklonowuje się na wektor do ekspresji lub propagacji w komórce gospodarza (np. komórki CHO). W innym rozwiązaniu, sekwencje polinukleotydowe przedstawione na fig. 2 i 3 wklonowuje się na jeden lub więcej wektorów do ekspresji lub propagacji. Sekwencja kodująca badane przeciwciało może być utrzymana na wektorze w komórce gospodarzu i komórka gospodarz może następnie być rozmnożona i zamrożona w celu zastosowania w przyszłości. Ponadto opisano tu wektory (obejmujące wektory ekspresyjne) i komórki gospodarzy. Ujawniono sposoby rekombinacyjnej ekspresji przeciwciała w roślinach lub w mleku. Patrz np. Peeters i in. (2001) Vaccine 19: 2756; Lonberg, N. i D. Huszar (1995) Int. Rev.Immunol 13: 65; i Pollock i in. (1999) J Immunol Methods 231: 147. W dziedzine znane są sposoby wytwarzania pochodnych przeciwciał, np. humanizowanych, pojedynczego łańcucha, itp.

Wynalazek obejmuje także jednołańcuchowe fragmenty rejonu zmiennego („scFv) przeciwciała według wynalazku, takiego jak E3. Jednołańcuchowe fragmenty rejonu zmiennego wytwarza się przez połączenie rejonów zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego przez zastosowanie krótkich peptydów łączących. Bird i in. (1988) Science 242: 423-426. Przykładem peptydu łączącego jest (GGGGS)3 (SEQ ID nr: 15), który tworzy w przybliżeniu 3,5 nm mostek pomiędzy karboksylowym końcem jednego rejonu zmiennego i końcem aminowym drugiego rejonu zmiennego. Zaprojektowano i zastosowano grupy łączące o innych sekwencjach (Bird i in. (1988)). Grupy łączące można z kolei zmodyfikować dla dodatkowych funkcji, takich jak przyłączanie leków lub przyłączanie do stałych nośników. Jednołańcuchowe warianty można wytwarzać albo rekombinacyjnie albo syntetycznie. Do syntetycznej produkcji scFv, można stosować automatyczny syntetyzer. Do rekombinacyjnej produkcji scFv, odpowiedni plazmid zawierający polinukleotyd, który koduje scFv można wprowadzić do odpowiedniej komórki gospodarza, zarówno eukariotycznej, takiej jak komórki drożdżowe, roślinne, owadzie lub ssacze, jak i prokariotyczne, takie jak komórki E. coli. Polinukleotydy kodujące badane scFv można wytwarzać przez rutynowe działania takie jak ligacja polinukleotydów. Uzyskane scFv można wyizolować stosując znane w dziedzinie, standardowe techniki oczyszczania białka.

Wynalazek obejmuje tekże inne postaci jednołańcuchowych przeciwciał, takie jak przeciwciała dwuswoiste. Przeciwciała dwuswoiste są dwuwartościowymi przeciwciałami o podwójnej swoistości,

PL 215 171 B1 w których domeny VH i VL ulegają ekspresji na pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, lecz z zastosowaniem łącznika, który jest zbyt krótki, by umożliwić parowanie pomiędzy dwiema domenami na tym samym łańcuchu, tym samym zmuszając domeny do parowania z uzupełniającymi domenami innego łańcucha i tworzenia dwóch miejsc wiążących antygen (patrz np. Holliger, P., i in. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., i in. (1994) Structure 2: 1121-1123).

Przeciwciało może być przeciwciałem o podwójnej swoistości, przeciwciałem monoklonalnym, które ma swoistość wiązania dla co najmniej dwóch różnych antygenów. Przeciwciało o podwójnej swoistości można wytworzyć stosując ujawnione tu przeciwciała. Metody wytwarzania przeciwciał dwuspecyficznych są znane w dziedzinie (Patrz np. Suresh i in., 1986, Methods in Enzymology 121: 210). Tradycyjnie, rekombinacyjna produkcja przeciwciała dwuspecyficznych była oparta na koekspresji dwóch par immunoglobulinowych łańcuchów ciężki-lekki, przy czym te dwa łańcuchy ciężkie mają różną swoistość (Millstein i Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

Według jednego podejścia do wytwarzania przeciwciał dwuspecyficznych, domeny zmienne przeciwciała o pożądanych swoistościach wiązania (miejsca łączenia przeciwciało-antygen) są złączone z sekwencjami domeny stałej immunoglobuliny. Korzystnie fuzję przeprowadza się z domeną stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, zawierającą co najmniej część zawiasu, rejony CH2 i CH3. Korzystne jest posiadanie pierwszego rejonu stałego łańcucha ciężkiego (CH1), zawierającego miejsce konieczne do wiązania łańcucha lekkiego, występującego w co najmniej jednym z połączeń. Fragmenty DNA kodujące połączenia immunoglobulinowego łańcucha ciężkiego i, jeśli to pożądane, immunoglobulinowego łańcucha lekkiego, są włączane do oddzielnych wektorów ekspresyjnych i kotransfekowane do odpowiedniego organizmu gospodarza. Zapewnia to wielką elastyczność dostosowania wzajemnych proporcji trzech fragmentów polipeptydowych w rozwiązaniach, w których nierówne proporcje trzech łańcuchów polipeptydowych stosowanych w konstrukcje dają optymalne wydajności. Jednakże możliwe jest wstawienie sekwencji kodujących dwa lub wszystkie trzy łańcuchy polipeptydowe do jednego wektora ekspresyjnego, gdy ekspresja co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych proporcjach prowadzi do wysokich wydajności lub gdy proporcje nie mają szczególnego znaczenia.

W jednym podejściu, dwuspecyficzne przeciwciała składają się z hybrydowego immunoglobulinowego łańcucha ciężkiego z wiązaniem o pierwszej swoistości na jednym ramieniu, i hybrydowej immunoglobulinowej pary łańcuch ciężki-łańcuch lekki (dającej wiązanie o drugiej swoistości) na drugim ramieniu. Ta asymetryczna budowa, z immunoglobulinowym łańcuchem lekkim tylko w jednej połowie dwuspecyficznej cząsteczki, ułatwia rozdzielanie pożądanego dwuspecyficznego związku od niepożądanych kombinacji łańcuchów immunoglobulinowych. To podejście opisano w publikacji PCT nr WO 94/04690, opublikowanej 3 marca 1994.

Wynalazek obejmuje także heterokoniugaty przeciwciał, składające się z dwóch kowalencyjnie związanych przeciwciał. Takie przeciwciała stosowano do skierowania komórek układu odpornościowego przeciw komórkom niepożądanym (patent St. Zjedn. Ameryki nr 4676980), oraz do leczenia infekcji wirusem HIV (zgłoszenie PCT nr WO 91/00360 i zgłoszenie WO 92/200373; EP 03089). Heterokoniugaty przeciwciał można wytwarzać stosując dowolne dogodne metody sieciowania. Odpowiednie środki sieciujące i techniki są dobrze znane w dziedzinie, i opisane w patencie St. Zjedn. Ameryki nr 4676980.

Przeciwciało może być przeciwciałem humanizowanym, jak np. znane w dziedzinie i jak tu opisane.

Przeciwciała można zmodyfikować jak opisano w publikacji PCT nr WO 99/58572, opublikowanej 18 listopada 1999. Przeciwciała te, oprócz domeny wiążącej skierowanej przeciwko cząsteczce docelowej, zawierają domenę efektorową, mającą sekwencję aminokwasową w znacznym stopniu homologiczną do całości lub części domeny stałej ludzkiego immunoglobulinowego łańcucha ciężkiego. Te przeciwciała są zdolne do wiązania cząsteczki docelowej bez wywoływania znaczącej Iizy zależnej od dopełniacza, lub zależnego od komórki zniszczenia celu. Korzystnie, domena efektorowa ma zdolność do swoistego wiązania FcRn i/lub FcyRIIb. Bazują one typowo na chimerycznych domenach, pochodzących od dwóch lub więcej domen ludzkich immunoglobulinowych łańcuchów ciężkich CH2. Przeciwciała zmodyfikowane w ten sposób są korzystne do zastosowania w przewlekłym leczeniu przeciwciałami, w celu uniknięcia reakcji zapalnych i innych reakcji niepożądanych na konwencjonalne leczenie przeciwciałami.

Wynalazek obejmuje modyfikacje przeciwciała E3, obejmujące czynnościowo równoważne przeciwciała, które nie wpływają w znaczący sposób na ich właściwości, oraz warianty, które mają zwiększoną lub zmniejszoną aktywność. Modyfikacja polipeptydów jest rutynową praktyką w dziedzi32

PL 215 171 B1 nie i jest dalej zilustrowana w przykładach. Przykłady zmodyfikowanych polipeptydów obejmują polipeptydy z substytucjami (obejmującymi substytucje konserwatywne) reszt aminokwasowych, jedną lub więcej delecji lub addycji aminokwasów, które nie zmieniają znacząco szkodliwie czynnościowej aktywności, lub zastosowanie chemicznych analogów.

„Wariant” polipeptydu w znaczeniu tu stosowanym, oznacza polipeptyd, który różni się od natywnego białka jedną lub więcej substytucjami, delecjami, addycjami i/lub insercjami, tak, aby nie zmniejszyć znacznie immunoreaktywności polipeptydu. Innymi słowy, zdolność wariantu do swoistego wiązania antygenu może być zwiększona lub niezmieniona, w stosunku do natywnego białka, lub może być zmniejszona o poniżej 50%, i korzystnie poniżej 20%, w stosunku do natywnego białka. Warianty polipeptydowe korzystnie wykazują co najmniej około 80%, korzystniej co najmniej około 90% i najkorzystniej co najmniej około 95% identyczności (określonej jak tu opisano) ze zidentyfikowanymi polipeptydami.

Warianty sekwencji aminokwasowej przeciwciała można wytworzyć przez wprowadzenie odpowiednich zmian nukleotydów do DNA przeciwciała, lub przez syntezę peptydu. Takie warianty zawierają, np. delecje, i/lub insercje i/lub substytucje, reszt w obrębie opisanych tu sekwencji aminokwasowych SEQ ID nr: 1 lub 2. W celu otrzymania końcowego konstruktu można wprowadzać dowolne kombinacje delecji, insercji, i substytucji, pod warunkiem, że końcowy konstrukt ma pożądane właściwości. Zmiany aminokwasowe mogą także zmieniać potranslacyjne procesy, które przechodzi przeciwciało, takie jak zmiana ilości lub pozycji miejsc glikozylacji.

Przydatny sposób identyfikacji pewnych reszt lub rejonów przeciwciała, które są korzystnymi miejscami dla mutagenezy lub modyfikacji nosi nazwę „alanine scanning mutagenesis i opisali go Cunningham i Wells, 1989, Science, 244: 1081-1085. Identyfikuje się resztę lub grupę reszt docelowych (np. reszt obdażonych ładunkiem takich jak arg, asp, his, lys, i glu) i zastępuje aminokwasami obojętnymi lub naładowanymi ujemnie (najkorzystniej alaniną lub polialaniną) w celu wpłynięcia na interakcję aminokwasów z antygenem. Takie położenia amionokwasów wykazujące funkcjonalną wrażliwość na substytucje ulepszane są później przez wprowadzenie następnych lub innych wariantów w, lub do, miejsca substytucji. Zatem, podczas gdy miejsce do wprowadzenia zmiany sekwencji aminokwasowej jest wstępnie określone, charakter mutacji jako taki nie musi być wstępnie określony. Na przykład, aby zanalizować mutację w danym miejscu, przeprowadza się przeszukiwanie „ala scanning” lub mutagenezę losową docelowego kodonu lub rejonu i eksprymowane warianty przeciwciała bada się pod kątem pożądanej aktywności. Mutagenezę z przeszukiwaniem biblioteki, jak tu opisano, można także stosować w celu zidentyfikowania miejsc na przeciwciele, które są odpowiednie do mutagenezy lub modyfikacji.

Insercje do sekwencji aminokwasowej obejmują przyłączanie na końcu aminowym i/lub karboksylowym, różniące się długością od jednej reszty do polipeptydów zawierających sto lub więcej reszt, jak również insercje do sekwencji jednej lub wielu reszt aminokwasowych. Przykłady insercji terminalnych obejmują przeciwciało z N-końcową resztą metioninową lub przeciwciało połączone ze znacznikiem epitopowym. Inne warianty insercyjne cząsteczki przeciwciała obejmują fuzję enzymu lub polipeptydu, który zwiększa okres półtrwania przeciwciała w osoczu z N- lub C-końcem przeciwciała.

Warianty z substytucjami mają co najmniej jedną resztę aminokwasową w cząsteczce przeciwciała usuniętą i w tym miejscu wstawioną inną resztę. Miejsca najbardziej interesujące z punktu widzenia mutagenezy powodującej substytucje obejmują rejony hiperzmienne, lecz zmiany w FR są także rozważane. Konserwatywne substytucje przedstawiono w tabeli 1 pod nagłówkiem „konserwatywne substytucje. Jeśli takie substytucje powodują zmianę biologicznej aktywności, to można wprowadzić bardziej znaczące zmiany, w tabeli 1 opisane jako „przykładowe substytucje, lub jak dalej opisano poniżej w odniesieniu do klas aminokwasów, i przebadać produkty.

T a b e l a 1: Substytucje aminokwasowe

Wyjściowa reszta	Konserwatywne substytucje	Przykładowe substytucje
1	2	3
Ala (A)	Val	Val; Leu; Ile
Arg (R)	Lys	Lys; Gln; Asn
Asn(N)	Gln	Gln; His; Asp, Lys; Arg
Asp(D)	Glu	Glu; Asn

PL 215 171 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
Cys (C)	Ser	Ser; Ala
Gln (Q)	Asn	Asn; Glu
Glu (E)	Asp	Asp; Gln
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Arg	Asn; Gln; Lys; Arg
Ile (I)	Leu	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucyna
Leu (L)	Ile	Norleucyna; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K)	Arg	Arg; Gln; Asn
Met (M)	Leu	Leu; Phe; Ile
Phe (F)	Tyr	Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Phe	Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V)	Leu	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucyna

Znaczących zmian biologicznych właściwości przeciwciała dokonuje przez wybranie substytucji, które różnią się znacznie swym wpływem na zachowanie (a) budowy szkieletu polipeptydowego w obszarze tego podstawienia, np. jako konformacji kartki lub helikalnej, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w miejscu docelowym, lub (c) wielkości łańcucha bocznego. Naturalnie występujące reszty są podzielone na grupy na podstawie wspólnych właściwości łańcucha bocznego:

(1) hydrofobowe: Norleucyna, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) obojętne hydrofilowe: Cys, Ser, Thr;

(3) kwasowe: Asp, Glu;

(4) zasadowe: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) reszty wpływające na orientację łańcucha: Gly, Pro; oraz (6) aromatyczne: Trp, Tyr, Phe.

Substytucji niekonserwatywnych dokonuje się przez wymianę aminokwasu jednej z tych klas na aminokwasu z innej klasy.

Każdą resztę cysteinową nie zaangażowaną w utrzymanie właściwej konformacji przeciwciała także można podstawić, na ogół seryną, w celu poprawy odporności cząsteczki na utlenianie i zapobieżenia tworzenia się nieprawidłowych wiązań krzyżowych. Odwrotnie, wiązanie (a) cysteinowe można dodawać do przeciwciała, aby zwiększyć jego trwałość, szczególnie, gdy przeciwciało jest fragmentem przeciwciała takim jak fragment Fv.

Modyfikacje aminokwasowe mogą obejmować zakres od zmiany lub modyfikacji jednego lub więcej aminokwasów do całkowitego powtórnego zaprojektowania rejonu, takiego jak rejon zmienny. Zmiany w rejonie zmiennym mogą zmieniać powinowactwo wiązania i/lub swoistość. W pewnym rozwiązaniu, w domenie CDR wprowadza się nie więcej niż jedną do pięciu konserwatywnych substytucji aminokwasów. W innych rozwiązaniach, wprowadza się nie więcej niż jedną do trzech konserwatywnych substytucji aminokwasów do domeny CDR3, w jeszcze innych rozwiązaniach, domena CDR oznacza CDRH3 i/lub CDRL3.

Modyfikacje obejmują także glikozylowane i nieglikozylowane polipeptydy, jak również polipeptydy z innymi modyfikacjami potranslacyjnymi, takimi jak np. glikozylacja różnymi cukrami, acetylacja, i fosforylacja. Przeciwciała są glikozylowane w konserwowanych pozycjach w ich rejonach stałych (Jefferis i Lund, 1997, Chem. Immunol. 65: 111-128; Wright i Morrison, 1997, TibTECH 15: 26-32). Oligosacharydowe łańcuchy boczne immunoglobulin wpływają na działanie białka (Boyd i in., 1996, Mol. Immunol. 32: 1311-1318; Wittwe i Howard, 1990, Biochem. 29: 4175-4180) i wewnątrzcząstecz34

PL 215 171 B1 kowe interakcje pomiędzy częściami glikoproteiny, które mogą wpływać na konformację i przedstawioną trójwymiarową powierzchnię glikoproteiny (Hefferis i Lund, powyżej; Wyss i Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7: 409-416). Oligosacharydy mogą także służyć do skierowywania danej glikoproteiny przeciw pewnym cząsteczkom w oparciu o specyficzne rozpoznawanie struktur. Doniesiono także, że glikozylacja przeciwciał ma wpływ na cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC). Opisywano, że w szczególności komórki CHO z regulowaną tetracykliną ekspresją β(1,4)-Ν-acetyloglukozoaminotransferazy III (GnTIII), glikozylotransferazy katalizującej powstawanie dzielącej GlcNAc mają ulepszoną aktywność ADCC (Umana i in., 1999, Mature Biotech. 17: 176-180).

Glikozylacja przeciwciała odbywa się typowo przez wiązanie albo N-glikozydowe albo O-glikozydowe. Wiązanie N-glikozydowe odnosi się do przyłączania grupy węglowodanowej do łańcucha bocznego reszty asparaginianowej. Tripeptydowe sekwencje asparagina-X-seryna i asparagina-X-treonina, gdzie X oznacza dowolny aminokwas oprócz proliny, są sekwencjami rozpoznającymi podczas enzymatycznego przyłączenia grupy węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy. Zatem obecność jednej z tych tripeptydowych sekwencji w polipeptydzie tworzy potencjalne miejsce glikozylacji. Glikozylacja przez wiązanie O-glikozydowe odnosi się do przyłączania jednego z miejsce cukrów takiego jak N-acetylogalaktozoamina, galaktoza, lub ksyloza do hydroksyaminokwasu, najczęściej seryny lub treoniny, chociaż można także stosować 5-hydroksyprolinę lub 5-hydroksylizynę.

Dodanie miejsc glikozylacji do przeciwciała jest dogodnie dokonywane przez zmianę sekwencji aminokwasowej tak, że zawiera ona jedną lub więcej z powyżej opisanych sekwencji tripeptydowych (dla miejsc glikozylacji przez wiązanie N-glikozydowe). Zmiany można także dokonać przez dodanie, lub podstawienie przez, jedną lub więcej reszt seryny lub treoniny do sekwencji oryginalnego przeciwciała (dla miejsc glikozylacji przez wiązanie O-glikozydowe).

Wzór glikozylacji przeciwciał można także zmienić bez zmieniania podstawowej sekwencji nukleotydowej. Glikozylacja głównie zależy od komórki gospodarza zastosowanej do ekspresji przeciwciała. Ponieważ typem komórki użytej do ekspresji rekombinacyjnych glikoprotein, np. przeciwciał, jako potencjalnych terapeutyków jest rzadko komórka natywna, można spodziewać się zmian we wzorze glikozylacji przeciwciał (Patrz np. Hse i in., 1997, J. Biol. Chem. 272: 9062-9070).

Oprócz wyboru komórki gospodarza, czynniki, które wpływają na glikozylację podczas rekombinacyjnej produkcji przeciwciał obejmują rodzaj wzrostu, skład podłoża, gęstość hodowli, n atlenowanie, pH, schematy oczyszczania itp. Proponowano różne sposoby zmiany wzoru glikozylacji osiąganego w poszczególnych organizmach gospodarzach, obejmujące wprowadzanie lub nadekspresję pewnych enzymów zaangażowanych w produkcję oligosacharydów (patent St. Zjedn. Ameryki nr 5047335; 5510261 i 5278299). Glikozylację, lub pewne typy glikozylacji, można enzymatycznie usunąć z glikoproteiny, np. stosując endoglikozydazę H (Endo H). Ponadto, przy zastosowaniu metod inżynierii można otrzymać zrekombinowaną komórkę gospodarza niezdolną do przetwarzania pewnych typów polisacharydów. Te i podobne techniki są dobrze znane w dziedzinie.

Inne sposoby modyfikacji obejmują stosowanie znanych w dziedzinie technik sprzęgania, obejmujących, między innymi środki enzymatyczne, utleniającą substytucję oraz chelatowanie. Modyfikacje można stosować, np. do przyłączania znaczników w celu testu immunologicznego. Zmodyfikowane polipeptydy E3 wytwarza się stosując sposoby ustalone w dziedzinie i można je poddawać skriningowi stosując standardowe testy znane w dziedzinie, z których pewne opisano poniżej i w przykładach.

Inne modyfikacje przeciwciał obejmują przeciwciała, które zmodyfikowano jak opisano w publikacji PCT nr WO 99/58572, opublikowanej 18 listopada 1999. Te przeciwciała zawierają, oprócz domeny wiążącej skierowanej przeciwko cząsteczce docelowej, domenę efektorową, mającą sekwencję aminokwasową w znacznym stopniu homologiczną z całą lub z częścią domeny stałej ludzkiego immunoglobulinowego łańcucha ciężkiego. Przeciwciała te są zdolne do wiązania cząsteczki docelowej bez wywoływania znaczącej Iizy zależnej od dopełniacza, lub zależnego od komórki zniszczenia celu. W pewnych rozwiązaniach, domena efektorowa posiada zdolność do swoistego wiązania z FcRn i/lub FcyRIIb. Bazują one typowo na chimerycznych domenach, pochodzących od dwóch lub więcej domen ludzkich immunoglobulinowych łańcuchów ciężkich CH2. Przeciwciała zmodyfikowane w taki sposób są szczególnie odpowiednie do zastosowania w przewlekłym leczeniu przeciwciałami, w celu uniknięcia reakcji zapalnych i innych reakcji niepożądanych na konwencjonalne leczenie przeciwciałami.

Wynalazek obejmuje także białka fuzyjne zawierające jeden lub więcej fragmentów lub rejonów przeciwciał (takich jak E3) lub polipeptydów według wynalazku. W jednym rozwiązaniu, fuzyjny polipeptyd zawiera co najmniej 10 przyległych aminokwasów rejonu zmiennego łańcucha lekkiego przedPL 215 171 B1 stawionego na fig. 1B i/lub co najmniej 10 aminokwasów rejonu zmiennego łańcucha ciężkiego przedstawionego na fig. 1A. W innym rozwiązaniu, polipeptyd fuzyjny zawiera rejon zmienny łańcucha lekkiego i/lub rejon zmienny łańcucha ciężkiego E3, jak przedstawiono na fig. 1A i 1B. W innym rozwiązaniu, fuzyjny polipeptyd zawiera jeden lub więcej rejon(ów) CDR E3. W jeszcze innych rozwiązaniach, polipeptyd fuzyjny zawiera CDRH3 i/lub CDRL3 przeciwciała E3. W innym rozwiązaniu, fuzyjny polipeptyd zawiera dowolny jeden lub więcej z następujących: resztę aminokwasową L29 rejonu CDRH1, 150 rejonu CDRH2, W101 rejonu CDRH3, i/lub A103 rejonu CDRH3; i/lub resztę aminokwasową S28 rejonu CDRL1, N32 rejonu CDRL1, T51 rejonu CDRL2, 91E rejonu CDRL3 i/lub H92 rejonu CDRL3. Dla celów wynalazku fuzyjne białko E3 zawiera jedno lub więcej przeciwciał E3 i inną sekwencję aminokwasową, z którą nie jest ono przyłączone w natywnej cząsteczce, np. heterologiczną sekwencję lub homologiczną sekwencję z innego rejonu. Przykładowe sekwencje heterologiczne obejmują, między innymi „znacznik taki jak znacznik FLAG lub znacznik 6His. Znaczniki są dobrze znane w dziedzinie.

Fuzyjny polipeptyd E3 można utworzyć sposobami znanymi w dziedzinie, np. syntetycznie lub rekombinacyjnie. Typowo, fuzyjne białka E3 według wynalazku otrzymuje się przez przygotowanie i ekspresję kodującego je polinukleotydu stosując opisane tu metody rekombinacyjne, chociaż można je także wytwarzać innymi sposobami znanymi w dziedzinie, obejmującymi, np. chemiczną syntezę.

Ten wynalazek dotyczy także kompozycji zawierających przeciwciała lub polipeptydy E3 sprzężone (np. związane) ze środkiem, który ułatwia sprzęganie ze stałym nośnikiem (takim jak biotyna lub awidyna). Dla uproszczenia odniesienia będą tyczyły się na ogół do E3 lub przeciwciał, przy czym rozumie się, że te metody stosują się do dowolnego z opisanych tu rozwiązań wiążących się z NGF. Sprzęganie na ogół dotyczy wiązania tych składników jak to tu opisano. Wiązanie, (które oznacza na ogół utrwalenie tych składników w najbliższym połączeniu co najmniej do podawania) można osiągnąć na dowolną liczbę sposobów. Na przykład bezpośrednia reakcja pomiędzy środkiem a przeciwciałem jest możliwa, gdy każdy z nich ma podstawnik zdolny do przereagowania z drugim. Na przykład grupa nukleofilowa, taka jak grupa aminowa lub tiolowa, jednego z nich może być zdolna do przereagowania z grupą zawierajacą grupę karbonylową, taką jak bezwodnik lub halogenek kwasowy, lub z grupą alkilową zawierającą dobrą grupę opuszczającą (np. halogenek) drugiego.

Przeciwciało lub polipeptyd według wynalazku mogą być związane ze środkiem znakującym (alternatywnie określanym jako „znacznik) takim jak cząsteczka fluorescencyjna, cząsteczka radioaktywna lub dowolne inne znaczniki znane w dziedzinie. W dziedzinie znane są cząsteczki znakujące, które na ogół dają (bezpośrednio lub pośrednio) sygnał. Zgodnie z tym, wynalazek obejmuje znakowane przeciwciała i polipeptydy.

Zdolności przeciwciał i polipeptydów według wynalazku, takie jak wiązanie NGF; zmniejszanie lub hamowanie biologicznej aktywności NGF; zmniejszanie i/lub blokowanie indukowanego przez NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5, można badać stosując sposoby znane w dziedzinie, z których pewne opisano w przykładach.

Wynalazek dotyczy także kompozycji (obejmujących kompozycje farmaceutyczne) i zestawów zawierających przeciwciało E3, i, jak to wyjaśnia ten opis, jakiekolwiek lub wszystkie opisane tu przeciwciała i/lub polipeptydy.

Polinukleotydy, wektory i komórki gospodarze

Wynalazek dotyczy także wyizolowanych polinukleotydów kodujących przeciwciała i polipeptydy według wynalazku (obejmujących przeciwciało zawierające polipeptydowe sekwencje rejonów zmiennych łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego przedstawione na fig. 1A i 1B), i wektorów i komórek gospodarzy zawierających polinukleotyd.

Zgodnie z tym, przedmiotem wynalazku są polinukleotydy (lub kompozycje, obejmujące kompozycje farmaceutyczne), obejmujące polinukleotydy kodujące dowolny z następujących: (a) przeciwciało E3; (b) fragment lub rejon przeciwciała E3; (c) łańcuch lekki przeciwciała E3 jak przedstawiono na fig. 1B; (d) łańcuch ciężki przeciwciała E3 jak przedstawiono na fig. 1A; (e) jeden lub więcej rejon(ów) zmienny(ch) łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przeciwciała E3; (f) jeden lub więcej region(ów) CDR (jeden, dwa, trzy, cztery, pięć lub sześć region(ów) CDR) przeciwciała E3 przedstawionych na fig. 1A i 1B; (g) CDRH3 łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 przedstawiony na fig. 1A; (h) CDRL3 łańcucha lekkiego przeciwciała E3 przedstawiony na fig. 1B; (i) trzy rejony CDR łańcucha lekkiego przeciwciała E3 przedstawione na fig. 1B; (j) trzy rejony CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 przedstawione na fig. 1A; (k) trzy rejony CDR łańcucha lekkiego i trzy rejony CDR łańcucha ciężkiego, przeciwciała E3 przedstawionego na fig. 1A i 1B; lub (I) przeciwciało zawierające dowolny z (b)

PL 215 171 B1 do (k). W pewnych rozwiązaniach, polinukleotyd zawiera jeden lub oba z polinukleotydów przedstawionych na fig. 2 i 3.

Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy wyizolowanego polinukleotydu, który koduje łańcuch lekki E3 o numerze depozytowym ATCC PTA-4893 lub ATCC PTA- 4894. Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy wyizolowanego polinukleotydu, który koduje łańcuch ciężki E3 o numerze depozytowym ATCC PTA-4895. W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy wyizolowanego polinukleotydu zawierającego (a) rejon zmienny kodowany przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA-4894 i (b) rejon zmienny kodowany przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA-4895. Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy wyizolowanego polinukleotydu zawierającego (a) jeden lub więcej CDR kodowanych przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA-4894; i/lub (b) jeden lub więcej CDR kodowanych przez polinukleotyd o numerze depozytowym ATCC PTA-4895.

Zgodnie z innym aspektem, przedmiotem wynalazku są polinukleotydy kodujące dowolne z opisanych tu przeciwciał (obejmujących fragmenty przeciwciała) i polipeptydów. Polinukleotydy można wytwarzać sposobami znanymi w dziedzinie.

Zgodnie z innym aspektem, wynalazek dotyczy kompozycji (takich jak kompozycje farmaceutyczne) zawierających dowolny z polinukleotydów według wynalazku. W pewnych rozwiązaniach, kompozycja zawiera wektor ekspresyjny zawierający polinukleotyd kodujący przeciwciało E3, jak tu opisano. W innym rozwiązaniu, kompozycja zawiera wektor ekspresyjny zawierający polinukleotyd kodujący dowolne z opisanych tu przeciwciał lub polipeptydów. W jeszcze innych rozwiązaniach, kompozycja zawiera jeden lub oba z polinukleotydów przedstawionych na fig. 2 i 3.

Ponadto opisano tu wektory ekspresyjne, oraz podawanie kompozycji polinukleotydów.

Zgodnie z innym aspektem, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dowolnego z opisanych tu polinukleotydów.

Wynalazek obejmuje także polinukleotydy komplementarne do którejkolwiek z takich sekwencji. Polinukleotydy mogą być jednoniciowe (kodujące lub antysensowne) lub dwuniciowe, i mogą być cząsteczkami DNA (genomowego, cDNA lub syntetycznego) lub RNA. Cząsteczki RNA obejmują cząsteczki HnRNA, które zawierają introny i odpowiadają cząsteczce DNA w sposób jeden-do-jednego i cząsteczkami mRNA, które nie zawierają intronów. W polinukleotydzie według wynalazku mogą, lecz nie muszą, występować dodatkowe sekwencje kodujące lub niekodujące, i polinukleotyd może, lecz nie musi, być związany z innymi cząsteczkami i/lub substancjami pomocniczymi.

Polinukleotydy mogą obejmować natywną sekwencję (tj. endogenną sekwencję, która koduje przeciwciało lub jego część) lub mogą obejmować wariant takiej sekwencji. Warianty polinukleotydu zawierają jedną lub więcej substytucji, addycji, delecji i/lub insercji takich, że immunoreaktywność kodowanego polipeptydu nie jest zmniejszona, w stosunku do immunoreaktywności natywnej cząsteczki. Wpływ na immunoreaktywność kodowanego polipeptydu można na ogół oceniać jak tu opisano. Warianty korzystnie wykazują co najmniej około 70% identyczności, korzystniej co najmniej około 80% identyczności i najkorzystniej co najmniej około 90% identyczności z sekwencją polinukleotydową kodującą natywne przeciwciało lub jego część.

Dwie sekwencje polinukleotydowe lub polipeptydowe określa się jako „identyczne, jeśli sekwencja nukleotydów lub aminokwasów w dwóch sekwencjach jest taka sama, przy dopasowaniu dla maksymalnego podobieństwa jak opisano poniżej. Porównania pomiędzy dwiema sekwencjami typowo przeprowadza się przez porównanie sekwencji przez okienko porównawcze w celu zidentyfikowania i porównania lokalnych rejonów podobieństwa sekwencji. Stosowany tu termin „okienko porównawcze, odnosi się do segmentu co najmniej około 20 przylegających do siebie pozycji, zazwyczaj 30 do około 75, 40 do około 50, w którym można porównywać sekwencję z sekwencją odniesienia o takiej samej liczbie przylegających do siebie pozycji po opracowaniu optymalnego dopasowania tych dwóch sekwencji.

Optymalne dopasowanie sekwencji dla porównania można prowadzać stosując program Megalign w zestawie bioinformatycznego oprogramowania Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), stosując domyślne parametry. Program ten obejmuje kilka schematów dopasowania opisanych w następujących odsyłaczach literaturowych: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins Matrices for detecting distant relationships. W Dayhoff, M.O. (redaktor) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, tom 5, supl. 3, str. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes str. 626-645 Methods in Enzymology, tom 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. i Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5: 151-153; Myers,

PL 215 171 B1

E.W. i Muller W., 1988, CABIOS 4: 11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11: 105; Santou,

N. , Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Sneath, P.H.A. i Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur,

W.J. i Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730.

Korzystnie, „procent identyczności sekwencji” określa się przez porównanie dwóch optymalnie dopasowanych sekwencji w okienku porównawczym o wielkości co najmniej 20 pozycji, w którym część sekwencji polinukleotydowej lub polipeptydowej w okienku porównawczym może zawierać addycje lub delecje (tj. przerwy) stanowiące 20 procent lub mniej, zazwyczaj 5 do 15 procent, lub 10 do 12 procent, w porównaniu z sekwencją odniesienia (która nie zawiera addycji lub delecji) dla optymalnego dopasowania tych dwóch sekwencji. Procent oblicza się przez określanie liczby pozycji, w których w obu sekwencjach występują identyczne zasady kwasu nukleinowego lub reszty aminokwasowe uzyskując liczbę dopasowanych pozycji, dzieląc liczbę dopasowanych pozycji przez całkowitą liczbę pozycji w sekwencji odniesienia (tj. wielkość okienka) i mnożąc wyniki przez 100, z uzyskaniem procentu identyczności sekwencji.

Warianty mogą także, lub alternatywnie, wykazywać znaczną homologię do natywnego genu; lub jego części lub nici komplementarnej. Takie warianty polinukleotydu mają zdolność do hybrydyzacji w umiarkowanie surowych warunkach z naturalnie występującą sekwencją DNA kodującą natywne przeciwciało (lub sekwencją komplementarną).

Odpowiednie „umiarkowanie surowe warunki” obejmują wstępne przemycie w roztworze 5 x SSC,

O, 5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hybrydyzację w 50°C-65°C, 5 X SSC, przez noc; następnie dwukrotne przemycie w temperaturze 65°C przez 20 minut z zastosowaniem każdego z roztworów 2X, 0,5X i 0,2X SSC zawierających 0,1% SDS.

Stosowany tu termin „bardzo surowe warunki” lub „warunki o wysokiej surowości” oznaczają takie, w których: (1) wykorzystuje się małe stężenie jonów i wysoką temperaturę podczas przemywania, na przykład 0,015M chlorek sodu/0,0015M cytrynian sodu /0,1% dodecylosiarczan sodu w temperaturze 50°C; (2) wykorzystuje się podczas hybrydyzacji środek denaturujący, taki jak formamid, np. 50% (objętościowo) formamid z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej /0,1% fikol /0,1% poliwinylopirolidon /50 mM bufor sodowo-fosforanowy przy pH 6,5 z 750 mM chlorkiem sodu, 75 mM cytrynianem sodu w temperaturze 42°C; lub (3) wykorzystuje się 50% formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M cytrynian sodu), 50 mM fosforan sodu (pH 6,8), 0,1% pirofosforan sodu, 5 x roztwór Denhardt'a, sonikowany DNA ze spermy łososia (50 ąg/ml), 0,1% SDS, i 10% siarczan dekstranu w temperaturze 42°C, i przemywa się w temperaturze 42°C w 0,2 x SSC (chlorek sodu /cytrynian sodu) i 50% formamid w temperaturze 55°C, a następnie przemywa się w bardzo surowych warunkach obejmujących 0,1 x SSC zawierającego EDTA w temperaturze 55°C. Fachowiec pozna, jak dostosować temperaturę, stężenie jonów, itp. konieczne do dostosowania do czynników takich jak długość sondy itp.

Fachowcy w dziedzinie docenią, że, w wyniku zdegenerowania kodu genetycznego, występuje wiele sekwencji nukleotydowch kodujących opisany tu polipeptyd. Niektóre z tych polinukleotydów wykazują minimalną homologię do sekwencji nukleotydowej jakiegokolwiek natywnego genu. Jednakże polinukleotydy, które różnią się z uwagi na różnice w stosowaniu kodonów, są specyficznie rozważane w wynalazku. Ponadto wynalazek obejmuje allele genów obejmujące sekwencje polinukleotydowe tu przedstawione. Allele oznaczają endogenne geny, które są zmienione w wyniku jedej lub więcej mutacji, takich jak delecje, addycje i/lub substytucje nukleotydów. Uzyskane mRNA i białko mogą, lecz nie muszą, mieć zmienioną budowę lub funkcję. Allele można zidentyfikować stosując standardowe techniki (takie jak hybrydyzacja, amplifikacja i/lub porównywanie baz sekwencji).

Polinukleotydy według wynalazku można otrzymać stosując chemiczną syntezę, metody rekombinacyjne, lub PCR. Sposoby chemicznej syntezy polinukleotydów są dobrze znane w dziedzinie i nie ma potrzeby opisywania ich tu szczegółowo. Fachowcy w dziedzinie mogą zastosować dostarczone tu sekwencje i dostępny na rynku syntetyzer DNA w celu wytworzenia pożądanej sekwencji DNA.

Do wytwarzania polinukleotydów z zastosowaniem metody rekombinacyjnych, polinukleotyd zawierający pożądaną sekwencję można wstawić do odpowiedniego wektora, a wektor z kolei można wprowadzić do odpowiedniej komórki gospodarza do replikacji i amplifikacji, jak omówiono dalej. Polinukleotydy można wstawić do komórki gospodarza z zastosowaniem dowolnych sposobów znanych w dziedzinie. Komórki transformuje się przez wprowadzenie egzogennego polinukleotydu przez bezpośrednie pobieranie, endocytozę, transfekcję, przekazywanie na plazmidzie F lub elektroporację. Po wprowadzeniu, egzogenny polinukleotyd można utrzymywać wewnątrz komórki jako niezintegrowany wektor (taki jak plazmid) lub zintegrowany w genomem komórki

PL 215 171 B1 gospodarza. Polinukleotyd tak amplifikowany można wyizolować z komórki gospodarza sposobami dobrze znanymi w dziedzinie. Patrz np. Sambrook i in. (1989).

Alternatywnie, PCR umożliwia powielenie sekwencji DNA. Technologia PCR jest dobrze znana w dziedzinie i opisano ją w patentach St. Zjedn. Ameryki nr 4683195, 4800159, 4754065 i 4683202, jak również w PCR: The Polymerase Chain Reaction, pod redakcją Mullis'a i in., Birkauswer Press, Boston (1994).

RNA można otrzymać stosując wyizolowany DNA w odpowiednim wektorze i wstawiając go do odpowiedniej komórki gospodarza. Gdy komórka replikuje się i DNA jest transkrybowane na RNA, RNA można następnie wyizolować stosując sposoby dobrze znane fachowcom w dziedzinie, jak opisali np. Sambrook i in., (1989) .

Odpowiednie wektory można skonstruować zgodnie ze standardowymi technikami, lub można wybierać spośród dużej liczby wektorów dostępnych w dziedzinie. Podczas gdy wybrany wektor może być różny w zależności od komórki gospodarza, którą zamierza się zastosować, przydatne wektory będą na ogół mieć zdolność do samodzielnej replikacji, mogą posiadać pojedyncze miejsce restrykcyjne dla określonej endonukleazy restryjcyjnej, i/lub mogą zawierać geny markera, który można zastosować do wyselekcjonowania klonów zawierających wektor. Odpowiednie przykłady obejmują plazmidy i wirusy bakteryjne, np. pUC18, pUC19, Bluescript (np. pBS SK+) i ich pochodne, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, fagi DNA, i wektory wahadłowe takie jak pSA3 i pAT28. Te i wiele innych wektorów jest dostępnych na rynku od sprzedawców takich jak BioRad, Strategene, i Invitrogen.

Wektory ekspresyjne na ogół są zdolnymi do replikacji polinukleotydowymi konstruktami, które zawierają polinukleotyd według wynalazku. Sugeruje to, że wektor ekspresyjny musi być zdolny do replikacji w komórkch gospodarzach albo jako episomy, albo jako integralna część chromosomalnego DNA. Odpowiednie wektory ekspresyjne obejmują między innymi plazmidy, wektory wirusowe, obejmujące adenowirusy, wirusy połączone z adenowirusami, retrowirusy, kosmidy, i wektor(y) ekspresyjny(e) ujawniony(e) w publikacji PCT nr WO 87/04462. Składniki wektora mogą na ogół obejmować między innymi jeden lub więcej z następujących: sekwencję sygnałową; miejsce startu replikacji; jeden lub więcej genów markerowych; odpowiednie elementy kontrolujące transkrypcję (takie jak promotory, enhancery i terminator). Do ekspresji (tj. translacji) zazwyczaj wymagane są także, jeden lub więcej elementów kontrolujących translację, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca inicjacji translacji, i kodony stop.

Wektory zawierające porządane polinukleotydy można wprowadzać do komórki gospodarza dowolnym z wielu odpowiednich sposobów, obejmujących elektroporację, transfekcję z zastosowaniem chlorku wapnia, chlorku rubidu, fosforanu wapnia, DEAE-dekstranu, lub innych substancji; mikrowstrzeliwanie; lipofekcję; i infekcję (np. gdy wektor jest czynnikiem zakaźnym takim jak wirus krowianki). Wybór wprowadzanego wektora lub polinukleotydów będzie często zależny od cech komórki gospodarza.

Wynalazek dotyczy także komórek gospodarzy zawierających dowolny z opisanych tu polinukleotydów. Wszelkie komórki gospodarze zdolne do nadekspresji heterologicznych DNA można stosować w celu wyizolowania genów kodujących porządane przeciwciało, polipeptyd lub białko. Nieograniczające przykłady ssaczych komórek gospodarzy obejmują między innymi komórki COS, HeLa, i CHO. Patrz także publikacja PCT nr WO 87/04462. Odpowiednie komórki gospodarze nie będące komórkami ssaczymi obejmują komórki prokariotyczne (takie jak E. coli lub B. subtillis) i drożdże (takie jak S. cerevisae, S. pombe; lub K. lactis). Korzystnie, komórki gospodarze eksprymują cząsteczki cDNA na poziomie około 5 krotnie wyższym, korzystniej, 10 krotnie wyższym, jeszcze korzystniej 20 krotnie wyższym niż poziom ekspresji odpowiedniego endogennego porządanego przeciwciała lub białka, jeśli występują w komórkach gospodarzach. Skrining komórek gospodarzy do swoistego wiązania do NGF przeprowdza się z zastosowaniem testu immunologicznego lub FACS. Można zidentyfikować komórkę z nadekspresją porządanego przeciwciała lub białka.

Sposoby stosowania E3 i przeciwciał pochodzących od E3.

Przeciwciało E3, które wiąże się z NGF można stosować do identyfikacji lub wykrywania obecności lub braku NGF. Dla ułatwienia, odniesienia będą na ogół tyczyć się E3 lub przeciwciał, rozumiejąc, że te metody stosują się do dowolnego z opisanych tu rozwiązań wiążących NGF (takich jak polipeptydy). Wykrywanie na ogół obejmuje kontaktowanie próbki biologicznej z opisanym tu przeciwciałem, które wiąże się do NGF i powstawanie kompleksu pomiędzy NGF i przeciwciałem (np. E3), które wiąże się swoiście z NGF. Kompleks taki może powstawać in vitro lub in vivo. Stosowany tu termin

PL 215 171 B1 „wykrywanie obejmuje jakościowe i/lub ilościowe wykrywanie (pomiar poziomu) z lub bez odniesienia do kontroli.

Do wykrywania można stosować którykolwiek z rozmaitych znanych sposobów, obejmujących między innymi test immunologiczny, stosowanie przeciwciała, które wiąże się z polipeptydem, np. przez test immunoenzymatyczny (ELISA), test radioimmunologiczny (RIA) itp.; i test czynnościowy na kodowany polipeptyd, np. aktywność wiążąca lub test enzymatyczny. W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało jest wykrywalnie znakowane.

Diagnostyczne zastosowania E3 i pochodnych

Przeciwciała i polipeptydy według wynalazku można stosować w wykrywaniu, diagnozowaniu i monitoringu choroby, schorzenia, lub zaburzenia związanego ze zmienioną lub nieprawidłową ekspresją NGF (w pewnych rozwiązaniach, zwiększoną lub obniżoną ekspresją NGF (w stosunku do prawidłowej próbki), i/lub niewłaściwą ekspresją, taką jak występowanie ekspresji w tkance(tkankach) i/lub komórce(komórkach), które normalnie nie eksprymują NGF, lub brak ekspresji NGF w tkance(tkankach) lub komórce(komórkach), które normalnie wykazują ekspresję NGF). Przeciwciała i polipeptydy według wynalazku są ponadto przydatne w wykrywaniu ekspresji NGF, np. w chorobie związanej ze zmienioną lub nieprawidłową wrażliwością lub reaktywnością na NGF. W pewnych rozwiązaniach, ekspresję NGF wykrywa się w próbce od pacjenta podejrzanego o chorobę, zaburzenie mające cechy lub związane ze zmienioną lub nieprawidłową wrażliwością lub reaktywnością na ekspresję NGF (np. nowotwór, w którym NGF promuje wzrost i/lub metastazę).

Zatem, w pewnych rozwiązaniach, przedmiotem wynalazku są sposoby obejmujące kontaktowanie okazu (próbki) od pacjenta podejrzanego o to, że ma zmienioną lub nieprawidłową ekspresję NGF, z przeciwciałem lub polipeptydem według wynalazku i określanie, czy poziom NGF różni się od poziomu w kontroli lub próbce porównawczej. W pewnych rozwiązaniach, pacjent ma arytmię serca, chorobę Alzheimera, i/lub zaburzenie autonomicznego układu nerwowego.

W innych rozwiązaniach, przedmiotem wynalazku są sposoby obejmujące kontaktowanie okazu (próbki) od pacjenta i określania poziomu ekspresji NGF. W pewnych rozwiązan iach, pacjent jest podejrzany o chorobę, zaburzenie mające cechy lub związane ze zmienioną lub nieprawidłową wrażliwością lub reaktywnością na ekspresję NGF. W pewnych rozwiązaniach, pacjent jest chory na drobnokomórkowego raka płuca, raka sutka, raka trzustki, raka stercza, raka jajnika, raka wątrobowokomórkowego, lub czerniaka.

Do zastosowania w diagnostyce, przeciwciało typowo znakuje się stosując wykrywalną grupę obejmującą między innymi radioizotopy, znaczniki fluorescencyjne, i różne znaczniki enzym-substrat. Sposoby dołączania znaczników do przeciwciała są znane w dziedzinie. W innym rozwiązaniu według wynalazku, przeciwciała według wynalazku nie wymagają znakowania, a ich obecność można wykrywać stosując znakowane przeciwciało, które wiąże się z przeciwciałami według wynalazku.

Przeciwciała według wynalazku można stosować w jakimkolwiek znanym sposobie testowym, takim jak testy kompetycyjnego wiązania, bezpośrednie i pośrednie testy sandwiczowe, oraz testy immunoprecypitacji. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, str. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Przeciwciała można także stosować w testach diagnostycznych in vivo, takich jak obrazowanie

111 99 14 131 3 in vivo. Na ogół przeciwciało znakuje się stosując radionuklid (taki jak ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I lub ³H) tak, aby porządane komórki lub tkanki można było lokalizować stosując immunoscyntygrafię.

Przeciwciało można także stosować jako odczynnik barwiący w patologii, zgodnie z technikami dobrze znanymi w dziedzinie.

Sposoby stosowania E3 i pochodnych do celów terapeutycznych

Przeciwciało E3 jest przydatne w zmniejszaniu i/lub blokowaniu biologicznej aktywności NGF. Uważa się, że ta antagonistyczna aktywność jest przydatna w leczeniu stanów chorobowych związanych z endogennym wytwarzaniem NGF, takich jak ból. Na ogół, w tych rozwiązaniach pacjentowi podaje się środek terapeutyczny w skutecznej ilości. Zgodnie z tym, w jednym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób antagonizowania aktywności biologicznej ludzkiego NGF przez stosowanie dowolnego z ujawnionych tu polipeptydów (obejmujących przeciwciała, takie jak przeciwciało E3). W jednym rozwiązaniu, sposób obejmuje kontaktowanie ludzkiego czynnika wzrostu nerwów z dowolnym z opisanych tu polipeptydów (obejmujących przeciwciało E3), dzięki czemu aktywność ludzkiego czynnika wzrostu nerwów jest antagonizowana, zmniejszana, blokowana, lub tłumiona. W jeszcze innym rozwiązaniu, pacjenta odczuwającego ból (taki jak ból pooperacyjny, lub ból towarzyszący reumatoidalnemu zapaleniu stawów) poddaje się leczeniu z zastosowaniem E3.

PL 215 171 B1

Dla ułatwienia, odniesienia będą na ogół robione w stosunku do E3 lub przeciwciała, rozumiejąc, że te sposoby stosują się do dowolnego z opisanych tu wariantów przeciwciała E3 i polipeptydów.

Do podawania można stosować różne preparaty E3 lub fragmenty E3 (np. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, itp.), takie jak pojedyncze łańcuchy (ScFv), ich mutanty, białka fuzyjne zawierające część przeciwciała, i dowolne inne zmodyfikowane konfiguracje E3, które zawierają miejsce rozpoznające antygen NGF o wymaganej swoistości. W pewnych rozwiązaniach, przeciwciała E3 lub różne preparaty E3 można podawać bez domieszek. W innych rozwiązaniach, podaje się E3 lub różne preparaty E3 (obejmujące dowolną kompozycję opisanych tu rozwiązań) i farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą, i mogą występować w różnych preparatach. Farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze są znane w dziedzinie, i są względnie obojętnymi substancjami, które ułatwiają podawanie farmakologicznie skutecznych substancji. Na przykład substancja pomocnicza może nadawać strukturę lub konsystencję, lub działać jako rozcieńczalnik. Odpowiednie substancje pomocnicze obejmują między innymi środki stabilizujące, zwilżające i środki emulgujące, sole do zmiany osmolarności, środki opłaszczające, bufory, i środki ułatwiające penetrację skóry. Substancje pomocnicze jak również preparaty do podawania leku parenteralnie i nieparenteralnie przedstawił Remington w The Science and Practice of Pharmacy, wydanie 20, Mack Publishing (2000).

W pewnych rozwiązaniach, środki te komponuje się do podawania w zastrzyku (np. dootrzewnowo, dożylnie, podskórnie, domięśniowo, itp.), chociaż można także stosować inne formy podawania (np. doustnie, naśluzówkowo, poprzez inhalację, podjęzykowo, etc). Zgodnie z tym, przeciwciało E3 i jego odpowiedniki korzystnie łączy się z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami pomocniczymi takimi jak solanka, roztwór Ringera, roztwór dekstrozy, itp. Określony schemat dawkowania, tj. wielkość, czas podawania i ilość dawek na dobę, będą zależeć od konkretnego pacjenta i jego historii choroby. Na ogół można stosować którąkolwiek z następujących dawek: podaje się dawkę co najmniej około 50 mg/kg masy ciała; co najmniej około 10 mg/kg masy ciała; co najmniej około 3 mg/kg masy ciała; co najmniej około 1 mg/kg masy ciała; co najmniej około 750 gg/kg masy ciała; co najmniej około 500 gg/kg masy ciała; co najmniej około 250 gg/kg masy ciała; co najmniej około 100 gg/kg masy ciała; co najmniej około 50 gg/kg masy ciała; co najmniej około 10 gg/kg masy ciała; co najmniej około 1 gg/kg masy ciała, lub mniej. W przypadku podawania powtarzanego przez kilka dni lub dłużej, zależnie od schorzenia, leczenie przedłuża się aż do osiągnięcia pożądanego stłumienia objawów choroby. Przykładowy schemat dawkowania obejmuje podawanie przeciwciała anty-NGF w początkowej dawce około 2 mg/kg, po czym stosuje się podawaną co tydzień dawkę podtrzymującą około 1 mg/kg, lub dawkę podtrzymującą około 1 mg/kg co dwa tygodnie. Jednakże mogą być przydatne inne reżimy dawkowania, zależnie od wzoru farmakokinetycznego rozpadu, jaki lekarz chce osiągnąć. Względy empiryczne, takie jak ten okres półtrwania, na ogół będą przyczyniać się do określania dawkowania. Postęp tego leczenia łatwo monitorować typowymi technikami i testami.

Niektórzy pacjenci mogą potrzebować więcej niż jednej dawki. Częstotliwość podawania można określić i uregulować w trakcie leczenia. Na przykład częstotliwość podawania można określić lub uregulować na podstawie rodzaju i nasilenia leczonego bólu, tego, czy środek podaje się w celach zapobiegawczych czy terapeutycznych, wcześniejszego leczenia, historii choroby pacjenta i odpowiedzi na środek, oraz uznania lekarza prowadzącego. Typowo klinicysta zastosuje antagonistyczne przeciwciało anty-NGF (takie jak E3), do chwili osiągnięcia dawki, która daje pożądany wynik. W pewnych przypadkach może być odpowiednie przedłużone ciągłe uwalnianie preparatów przeciwciała E3. W dziedzinie znane są różne preparaty i urządzenia do osiągania przedłużonego uwalniania.

W jednym rozwiązaniu, dawki przeciwciała E3 (lub polipeptydów) można określić doświadczalnie u pacjentów, którym podano jedną lub więcej dawkę(dawek). Pacjentom podaje się wzrastające dawki E3. Aby ocenić efektywność E3 lub innego równoważnego przeciwciała, można monitorować markery objawów choroby (takie jak ból).

Podawanie przeciwciała (takiego jak E3) lub polipeptydu zgodnie ze sposobem według wynalazku możne być ciągłe lub przerywane, w zależności np. od stanu fizjologicznego biorcy, od tego, czy celem podawania jest leczenie czy profilaktyka, i od innych czynników znanych doświadczonym lekarzom. Podawanie przeciwciała może być w istocie ciągłe przez wcześniej wybrany okres lub może występować w seriach dawek oddzielonych w czasie, np. przed, podczas, lub po pojawieniu się bólu, przed, podczas, przed i po, podczas i po, lub przed, podczas, i po pojawieniu się bólu. Podawanie może być przed, podczas i/lub po zranieniu, nacięciu, urazie, zabiegu operacyjnym, i dowolnym innym zdarzeniu mogącym wywołać ból pooperacyjny.

PL 215 171 B1

Inne preparaty obejmują odpowiednie formy podawania znane w dziedzinie obejmujące, między innymi, nośniki takie jak Iiposomy. Patrz np. Mahato i in. (1997) Pharm. Res. 14: 853-859. Preparaty liposomowe obejmują między innymi cytofektyny, pęcherzyki wielobłonowe i pęcherzyki jednobłonowe.

W pewnych rozwiązaniach może występować więcej niż jedno przeciwciało lub polipeptyd. Przeciwciała mogą być monoklonalne lub poliklonalne. Takie kompozycje mogą zawierać co najmniej jeden, co najmniej dwa, co najmniej trzy, co najmniej cztery, co najmniej pięć różnych przeciwciał. Mieszanina przeciwciał, jak się je często określa w dziedzinie, może być szczególnie przydatna w leczeniu szerszego zakresu populacji pacjentów.

Polinukleotyd kodujący dowolne z przeciwciał lub polipeptydów według wynalazku (takich jak przeciwciało E3) można także stosować do dostarczania i ekspresji dowolnego z przeciwciał lub polipeptydów według wynalazku (takich jak przeciwciało E3) w pożądanej komórce. Jest oczywiste, że wektor ekspresyjny można stosować do bezpośredniej ekspresji przeciwciała E3 lub polipeptydu. Wektor ekspresyjny można podawać dowolnymi sposobami znanymi w dziedzinie, jak np. dootrzewnowo, dożylnie, domięśniowo, podskórnie, dooponowo, dokomorowo, doustnie, dojelitowo, parenteralnie, donosowo, doskórnie, podjęzykowo, lub inhalacyjnie. Na przykład podawanie wektorów ekspresyjnych obejmuje podawanie miejscowe lub układowe, obejmujące zastrzyk, podawanie doustne, metodą strzelby genowej lub podawanie przez cewnik, i podawanie miejscowe. Fachowiec w dziedzinie jest obeznany z podawaniem wektorów ekspresyjnych w celu uzyskania ekspresji egzogennego białka in vivo. Patrz np. patent St. Zjedn. Ameryki nr 6436908; 6413942; i 6376471.

Można także stosować ukierunkowane dostarczanie kompozycji terapeutycznych zawierających polinukleotyd kodujący dowolne z przeciwciał lub polipeptydów według wynalazku (takich jak przeciwciało E3). Techniki zależnego od receptorów dostarczania DNA opisali np. Findeis i in., Trends Biotechnol. (1993) 11: 202; Chiou i in., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (red. J.A. Wolff) (1994); Wu i in., J. Biol Chem. (1988) 263: 621; Wu i in., J. Biol. Chem. (1994) 269: 542; Zenke i in., Proc. Natl. Acad. Set. (USA) (1990) 87: 3655; Wu i in., J. Biol. Chem. (1991) 266: 338. Kompozycje terapeutyczne zawierające polinukleotyd podaje się w zakresie około 100 ng do około 200 mg DNA przy podawaniu miejscowym w protokole terapii genowej. Podczas protokołu terapii genowej można także stosować zakresy stężeń około 500 ng do około 50 mg, około 1 pg do około 2 mg, około 5 pg do około 500 pg, i około 20 pg do około 100 pg DNA. Terapeutyczne polinukleotydy i polipeptydy można dostarczać stosując nośniki do dostarczania genów. Nośnik do dostarczania genu może być pochodzenia wirusowego lub niewirusowego (patrz Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1: 51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5: 845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1: 185; i Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6: 148). Ekspresję takich sekwencji kodujących można indukować stosując endogenne promotory ssacze lub promotory heterologiczne. Ekspresja sekwencji kodującej może być albo konstytutywna, albo regulowana.

Wektory wirusowe do dostarczania i ekspresji pożądanego polinukleotydu w pożądanej komórce są dobrze znane w dziedzinie. Przykładowe nośniki wirusowe obejmują między innymi zrekombinowane retrowirusy (Patrz np. publikacje PCT nr WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; patent St. Zjedn. Ameryki nr 5219740; 4777127; brytyjski patent nr 2200651; i europejski patent nr 0345242), wektory pochodne wirusów z rodzaju alphavirus (np. wirusa Sindbis, wirusa Semliki Forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), wirusa Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) i wirusa wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu i rdzenia (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), wektory konstruowane z wirusów związanych z adenowirusami (AAV) (patrz np. publikacje PCT nr WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; W O 94/28938; WO 95/11984 oraz WO 95/00655). Można także stosować podawanie DNA połączonego z uśmierconym adenowirusem, jak opisał Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147.

Można także stosować niewirusowe nośniki i sposoby obejmujące między innymi polikationowy skondensowany DNA związany lub niezwiązany z samym uśmierconym adenowirusem (patrz np. Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147); DNA połączony z ligandem (patrz np. Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985); komórki nośnikowe do dostarczania do komórki eukariotycznej (patrz np. patent St. Zjedn. Ameryki nr 5814482; publikacje PCT nr WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; oraz WO 97/42338) i neutralizację ładunku jądrowego lub fuzję z błoną komórkową. Można także stosować nagi DNA. Przykładowe sposoby wprowadzania nagiego DNA opisano w publikacji PCT nr WO 90/11092 i patencie St. Zjedn. Ameryki nr 5580859. Liposomy, które mogą działać jako nośniki do dostarczania

PL 215 171 B1 genu opisano w patencie St. Zjedn. Ameryki nr 5422120; publikacjach PCT nr WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; i europejskim patencie nr 0524968. Dodatkowe metody opisano w Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14: 2411 i w Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 1581.

W odniesieniu do wszystkich opisanych tu sposobów, odniesienie do antagonistycznych przeciwciał anty-NGF obejmuje także kompozycje zawierające jeden lub więcej z tych środków. Kompozycje te mogą ponadto zawierać odpowiednie substancje pomocnicze, takie jak farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze obejmujące bufory, które są dobrze znane w dziedzinie.

Wynalazek można stosować sam lub w połączeniu z innymi typowymi sposobami leczenia.

Sposoby stosowania antagonistycznego przeciwciała anty-NGF w leczeniu lub zapobieganiu bólowi towarzyszącemu reumatoidalnemu zapaleniu stawów

W pewnych aspektach przedmiotem wynalazku są sposoby leczenia i/lub zapobiegania bólowi towarzyszącemu reumatoidalnemu zapaleniu stawów u pacjentów obejmujących ssaki, zarówno ludzi jak i inne ssaki. Zgodnie z tym, w jednym aspekcie, przedmiotem wynalazku są sposoby leczenia bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów u pacjentów, obejmujące podawanie w skutecznej ilości antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. Antagonistyczne przeciwciała anty-NGF są znane w dziedzinie i opisane w tym zgłoszeniu.

Zgodnie z innym aspektem, przedmiotem wynalazku są sposoby zmniejszania występowania, łagodzenia, likwidowania, uśmierzania, i/lub opóźniania wystąpienia, rozwoju lub postępu bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów u pacjentów. Zatem w pewnych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF podaje się przed rozwinięciem się bólu lub epizodem bólowym u pacjentów cierpiących na reumatoidalne zapalenie stawów.

Zgodnie z innym aspektem, przedmiotem wynalazku są sposoby leczenia kacheksji spowodowanej stanem zapalnym (utraty masy ciała) związanej z reumatoidalnym zapaleniem stawów u pacjentów, obejmujące podawanie w skutecznej ilości antagonistycznego przeciwciała anty-NGF (Roubenoff i in., Arthritis Rheum. 40(3): 534-9 (1997); Roubenoff i in., J. Clin. Invest. 93(6): 2379-86 (1994)).

Diagnoza lub ocena bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów jest dobrze ustalona w dziedzinie. Ocenę można przeprowadzić na podstawie miar znanych w dziedzinie, takich jak charakterystyka bólu przez pacjenta z zastosowaniem różnych skal oceny bólu. Patrz np. Katz i in., Surg Clin North Am. (1999) 79 (2): 231-52; Caraceni i in. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3) : 239-55. Istnieją także powszechnie stosowane skale do pomiaru zaawansowania choroby takie jak American College of Rheumatology (ACR) (Felson, i in., Arthritis and Rheumatism (1993) 36(6): 729-740), Health Assessment Questionnaire (HAQ) (Fries, i in., (1982) J. Rheumatol. 9: 789-793), skala Paulus'a (Paulus, i in., Arthritis and Rheumatism (1990) 33: 477-484), oraz Arthritis Impact Measure Scale (AIMS) (Meenam i in., Arthritis and Rheumatism (1982) 25: 1048-1053). Antagonistyczne przeciwciało anty-NGF można podawać pacjentom dowolnymi odpowiednimi drogami. Opisano tu przykłady różnych dróg podawania.

Ulgę w bólu można scharakteryzować przez jej przebieg w czasie. Zgodnie z tym, w pewnych rozwiązaniach, ulgę w bólu obserwuje się w przeciągu około 24 godzin po podawaniu antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. W innych rozwiązaniach, ulgę w bólu obserwuje się w przeciągu około 36, 48, 60, 72 godzin lub 4 dni po podaniu antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. W jeszcze innych rozwiązaniach, ulgę w bólu obserwuje się przed zaobserwowaniem objawów zmniejszenia stanu zapalnego związanego z reumatoidalnym zapaleniem stawów. W pewnych rozwiązaniach, częstotl iwość i/lub intensywność bólu jest zmniejszona, i/lub jakość życia osób cierpiących na chorobę ulega poprawie.

Wytwarzanie i stosowanie przeciwciał anty-NGF w tych sposobach opisano w sekcjach poniżej („Antagonistyczne przeciwciało anty-NGF”; „Identyfikacja antagonistycznego przeciwciała anty-NGF; „Podawanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF”).

Sposoby stosowania antagonistycznego przeciwciała anty-NGF w leczeniu lub zapobieganiu bólowi towarzyszącemu zapaleniu kości i stawów.

W pewnych aspektach, przedmiotem wynalazku są sposoby leczenia i/lub zapobiegania bólowi towarzyszącemu zapaleniu kości i stawów u pacjentów obejmujących ssaki, zarówno ludzi jak i zwierząt. Zgodnie z tym, w jednym aspekcie, przedmiotem wynalazku są sposoby leczenia bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów u pacjentów obejmujące podawanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF w skutecznej ilości. Antagonistyczne przeciwciała anty-NGF są znane w dziedzinie i opisane w tym zgłoszeniu.

PL 215 171 B1

Zgodnie z innym aspektem, przedmiotem wynalazku są sposoby zmniejszania występowania, łagodzenia, likwidowania, uśmierzania, i/lub opóźniania początku, rozwoju lub postępu bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów u pacjentów. Zatem w pewnych rozwiązaniach antagonistyczne przeciwciało anty-NGF podaje się przed rozwojem bólu lub epizodem bólowym u pacjentów cierpiących na zapalenie kości i stawów.

Diagnoza lub ocena bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów jest dobrze ustalona w dziedzinie. Oszacowanie można przeprowadzić na bazie miar znanych w dziedzinie, takich jak charakterystyka bólu przez pacjenta z zastosowaniem różnych skal oceny bólu. Patrz np. Katz i in., Surg Clin North Am. (1999) 79 (2): 231-52; Caraceni i in. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3): 239-55. Na przykład WOMAC Ambulation Pain Scale (obejmujące ból, sztywność, i fizyczne działania) i 100 mm Visual Analog Scale (VAS) można stosować do oceny bólu i oceny odpowiedzi na leczenie.

Antagonistyczne przeciwciało anty-NGF można podawać pacjentom dowolnym odpowiednim sposobem. Opisano tu przykłady różnych sposobów podawania.

Ulgę w bólu można scharakteryzować przez jej przebieg w czasie. Zgodnie z tym, w pewnych rozwiązaniach, ulgę w bólu obserwuje się w przeciągu około 24 godzin po podaniu antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. W innych rozwiązaniach, ulgę w bólu obserwuje się w przeciągu około 36, 48, 60, 72 godzin lub 4 dni po podaniu antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. W pewnych rozwiązaniach, częstotliwość i/lub intensywność bólu jest zmniejszona, i/lub jakość życia osób cierpiących na chorobę ulega poprawie.

Wytwarzanie i stosowanie przeciwciał anty-NGF w tych sposobach opisano w sekcjach poniżej („Antagonistyczne przeciwciało anty-NGF”; „Identyfikacja antagonistycznego przeciwciała anty-NGF”; „Podawanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF”).

Antagonistyczne przeciwciało anty-NGF

W sposobach według wynalazku (odnoszące się do bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów i bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów) stosuje się antagonistyczne przeciwciało anty-NGF, co odnosi się do cząsteczki dowolnego przeciwciała, które blokuje, likwiduje lub zmniejsza (w tym znacznie) biologiczną aktywność NGF, w tym szlaki, w których pośredniczy sygnalizacja NGF, taka jak wiązanie z receptorem i/lub wywołanie odpowiedzi komórkowej na NGF.

Antagonistyczne przeciwciało anty-NGF powinno wykazywać dowolną jedną lub więcej z następujących właściwości: (a) wiązać się z NGF i hamować biologiczną aktywność NGF lub szlaki, w których pośredniczy sygnalizacja w funkcji NGF; (b) zapobiegać, łagodzić, lub leczyć dowolny aspekt bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów lub bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów; (c) blokować lub zmniejszać aktywację receptora NGF (obejmującą dimeryzację receptora TrkA i/lub autofosforylację); (d) zwiększać klirens NGF; (e) hamować (zmniejszać) syntezę, produkcję lub uwalnianie NGF. Antagonistyczne przeciwciała anty-NGF są znane w dziedzinie, patrz np. publikacje PCT nr WO 01/78698, WO 01/64247, patencie St. Zjedn. Ameryki nr 5844092, 5877016, i 6153189; Hongo i in., Hybridoma, 19: 215-227 (2000); Celi. Molec. Biol. 13: 559-568 (1993); numery akcesyjne GenBank U39608, U39609, L17078, lub L17077.

Dla celów wynalazku, przeciwciało reaguje z NGF w sposób, który hamuje NGF i/lub szlaki, w których pośredniczy sygnalizacja funkcji NGF.

W pewnych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF rozpoznaje ludzki NGF. W jeszcze innych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF swoiście wiąże się z ludzkim NGF. W pewnym rozwiązaniu, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF nie wiąże się w istotny sposób z pokrewnymi neurotrofinami, takimi jak NT-3, NT4/5, i/lub BDNF. W jeszcze innych rozwiązaniach, przeciwciało anty-NGF posiada zdolność wiązania z NGF i skutecznie hamuje wiązanie NGF do jego receptora TrkA i/lub p75 in vivo i/lub skutecznie hamuje aktywację receptora TrkA i/lub p75 przez NGF. W jeszcze innym rozwiązaniu antagonistyczne przeciwciało anty-NGF jest przeciwciałem monoklonalnym. W jeszcze innych rozwiązaniach, przeciwciało anty-NGF jest humanizowane (takie jak opisane tu przeciwciało E3) . W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało anty-NGF jest przeciwciałem ludzkim. W jednym rozwiązaniu, przeciwciało jest ludzkim przeciwciałem, które rozpoznaje jeden lub więcej epitopów na ludzkim NGF. W innym rozwiązaniu, przeciwciało jest przeciwciałem mysim lub szczurzym, które rozpoznaje jeden lub więcej epitopów na ludzkim NGF. W innym rozwiązaniu, przeciwciało rozpoznaje jeden lub więcej epitopów na NGF wybranym z grupy obejmującej: naczelne, psowate, kotowate, koniowate, i bydło. W jeszcze innych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF wiąże się zasadniczo taki sam epitop 6 NGF jak przeciwciało wybrane spośród takich jak dowolne jedno lub więcej z następujących: MAb 911, MAb 912 i MAb 938 (Patrz Hongo i in., Hybrido44

PL 215 171 B1 ma 19: 215-227 (2000)). W innych rozwiązaniach, przeciwciało wiąże się z takim samym epitopem, jak Mab 911. W innym rozwiązaniu, przeciwciało zawiera rejon stały, który jest immunologicznie obojętny (np. nie wywołuje Iizy z udziałem dopełniacza lub cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC)). Aktywność ADCC można oszacować stosując metody ujawnione w patencie St. Zjedn. Ameryki nr 5500362. W niektórych rozwiązaniach, rejon stały jest zmodyfikowany jak opisano w Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624; publikacji PCT GB99/01441; i/lub brytyjskim zgłoszeniu patentowym nr 98099518.

W pewnych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF jest humaniowanym mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-NGF określanym jako przeciwciało „E3, dowolnym z opisanych tu przeciwciał pokrewnych E3, lub dowolnymi ich fragmentami, które są antagonistami NGF.

Przeciwciała przydatne według wynalazku mogą obejmować przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, fragmenty przeciwciał (np. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, itp.), przeciwciała chimeryczne, przeciwciała dwuspecyficzne, heterokoniugaty przeciwciał, pojedynczy łańcuch (ScFv), ich mutanty, białka fuzyjne zawierające część przeciwciała, humanizowane przeciwciała, i dowolne inne zmodyfikowane konfiguracje cząsteczki immunoglobuliny, które zawierają miejsce rozpoznające antygen o wymaganej swoistości, obejmujące glikozylowane warianty przeciwciał, warianty sekwencji aminokwasowych przeciwciał, oraz kowalencyjnie zmodyfikowane przeciwciała. Przeciwciała mogą być mysiego, szczurzego, ludzkiego, lub dowolnego innego pochodzenia (obejmującego przeciwciała chimeryczne lub humanizowane).

Powinowactwo wiązania antagonistycznego przeciwciała anty-NGF z NGF (takiego jak hNGF) mogą wynosić około 0,10 do około 0,80 nanomola, około 0,15 do około 0,75 nanomola i około 0,18 do około 0,72 nanomola. W jednym rozwiązaniu, powinowactwo wiązania wynosi pomiędzy około 2 pikomoli i 22 pikomoli. W pewnym rozwiązaniu, powinowactwo wiązania wynosi około 10 nanomoli. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi poniżej około 10 nanomoli. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi około 0,1 nanomola lub około 0,07 nanomola. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi poniżej około 0,1 nanomola lub poniżej około 0,07 nanomola. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi dowolnie około 100 nanomoli, około 50 nanomoli, około 10 nanomoli, około 1 nanomola, około 500 pikomoli, około 100 pikomoli, lub około 50 pikomoli do dowolnie około 2 pikomoli, około 5 pikomoli, około 10 pikomoli, około 15 pikomoli, około 20 pikomoli, lub około 40 pikomoli. W pewnych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi dowolnie około 100 nanomoli, około 50 nanomoli, około 10 nanomoli, około 1 nanomola, około 500 pikomoli, około 100 pikomoli, lub około 50 pikomoli, lub poniżej około 50 pikomoli. W pewnych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi poniżej dowolnie około 100 nanomoli, około 50 nanomoli, około 10 nanomoli, około 1 nanomola, około 500 pikomoli, około 100 pikomoli, lub około 50 pikomoli. W jeszcze innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi około 2 pikomole, około 5 pikomoli, około 10 pikomoli, około 15 pikomoli, około 20 pikomoli, około 40 pikomoli, lub powyżej około 40 pikomoli.

Jednym sposobem określania powinowactwa wiązania przeciwciała do NGF jest pomiar powinowactwa wiązania jednofunkcyjnych fragmentów Fab przeciwciała. Aby otrzymać jednofunkcyjne fragmenty Fab, przeciwciało (np. IgG) można przeciąć papainą lub eksprymować rekombinacyjnie. Powinowactwo fragmentu Fab przeciwciała anty-NGF można określić stosując rezonans plazmonów powierzchniowych (zestaw do rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) BlAcore3000™, BIAcore, INC, Piscaway NJ). Chipy CM5 można aktywować stosując chlorowodorek N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i N-hydroksysukcynoimid (NHS) zgodnie z instrukcjami dostawcy. Ludzki NGF (lub dowolny inny NGF) można rozcieńczyć w 10 mM octanie sodu pH 4,0 i wstrzykiwać na aktywowany chip w stężeniu 0,005 mg/ml. Stosując zmienny czas przepływu przez poszczególne kanały chipu, można otrzymać dwa zakresy gęstości antygenu: 100-200 jednostek odpowiedzi (RU) dla szczegółowych badań kinetycznych i 500-600 RU dla testów skriningowych. Chip można blokować etanoloaminą. Badania regeneracyjne wykazały, że mieszanina buforu do eluowania Pierce (Produkt nr 21004, Pierce Biotechnology, Rockford-IL) i 4 M NaCl (2:1) skutecznie usuwa związane Fab z jednoczesnym utrzymaniem aktywności hNGF na chipie przez ponad 200 iniekcji. Bufor HBS-EP (O,OlM HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactant P29) stosuje się jako bufor reakcyjny do testów BIAcore. Szereg rozcieńczeń (0,1-10 x obliczona KD) oczyszczonych próbek Fab wstrzykuje się przez 1 minutę w ilości 100 μΐ/minutę i dopuszcza się czasy dysocjacji aż do 2 godzin. Stężenia białka Fab określa się przez ELISA i/lub elektroforezę SDS-PAGE stosując Fab w znanym stężeniu (co określa się przez analizę aminokwasów) jako standard. Kinetyczne stopnie

PL 215 171 B1 asocjacji (kon) i dysocjacji (koff) otrzymuje się jednocześnie przez podstawienie danych do modelu wiązania Langmuira 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) stosując program BIAevaluation. Wartości stałej równowagi dysocjacji (KD) oblicza się jako koff/kon. Ten protokół jest odpowiedni do zastosowania w określaniu powinowactwa wiązania przeciwciała do dowolnego NGF, obejmującego ludzki NGF, NGF innych kręgowców (w pewnych rozwiązaniach, ssaka) (takiego jak mysi NGF, szczurzy NGF, NGF naczelnych), jak również do zastosowania z innymi neurotrofinami, takimi jak pokrewne neurotrofiny NT3, NT4/5, i/lub BDNF.

W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało wiąże się z ludzkim NGF, i nie wiąże się w znaczący sposób z NGF pochodzącym od innych gatunków kręgowców (w pewnym rozwiązaniu, ssaków). W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało wiąże się z ludzkim NGF jak również jednym lub więcej NGF innych gatunków kręgowców (w pewnych rozwiązaniach ssaków). W jeszcze innym rozwiązaniu, przeciwciało wiąże się z NGF i nie reaguje krzyżowo w znaczącym stopniu z innymi neurotrofinami (takimi jak pokrewne neurotrofiny, NT3, NT4/5, i/lub BDNF). W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało wiąże się z NGF jak również z co najmniej jedną inną neurotrofiną. W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało wiąże się z NGF gatunków ssaków, takich jak koń lub pies, lecz nie wiąże się w znaczącym stopniu z NGF innych gatunków ssaków.

Epitop(y) mogą być ciągłe lub nieciągłe. W jednym rozwiązaniu, przeciwciało wiąże się z zasadniczo takimi samymi epitopami hNGF jak przeciwciało wybrane z grupy obejmującej MAb 911, MAb 912, i MAb 938 jak opisali Hongo i in., Hybridoma, 19: 215-227 (2000). W innym rozwiązaniu, przeciwciało wiąże się z zasadniczo takim samym epitopem hNGF jak MAb 911. W jeszcze innym rozwiązaniu, przeciwciało wiąże się z zasadniczo takim samym epitopem jak MAb 909. Hongo i in., powyżej. Na przykład epitop może zawierać jedną lub więcej z: reszt K32, K34 i E35 w rejonie zmiennym 1 (aminokwasy 23-35) hNGF; reszt F79 i T81 w rejonie zmiennym 4 (aminokwasy 81-88) hNGF; reszt H84 i K88 w rejonie zmiennym 4; reszt R103 pomiędzy rejonie zmiennym 5 (aminokwasy 94-98) hNGF i C-koniec (aminokwasy 111-118) hNGF; reszt E11 w rejonie pre-zmiennym 1 (aminokwasy 10-23) hNGF; Y52 pomiędzy rejonem zmiennym 2 (aminokwasy 40-49) hNGF a rejonem zmiennym 3 (aminokwasy 59-66) hNGF; reszt L112 i S113 C-końca hNGF; reszt R59 i R69 w rejonie zmiennym 3 hNGF; lub reszt V18, V20, i G23 w rejonie pre-zmiennym 1 hNGF. Ponadto, epitop może zawierać jeden lub więcej rejon zmienny 1, rejon zmienny 3, rejon zmienny 4, rejon zmienny 5, rejon Nkońcowy, i /lub C-koniec hNGF. W jeszcze innym rozwiązaniu, przeciwciało znacznie zmniejsza dostępność rozpuszczalnika do reszty R103 hNGF. Zrozumiałe jest, że chociaż opisane powyżej epitopy odnoszą się do ludzkiego NGF, fachowiec dziedzinie może dopasować struktury ludzkiego NGF do NGF innego gatunku i zidentyfikować prawdopodobne odpowiedniki tych epitopów.

W jednym aspekcie, przeciwciała (np. ludzkie, humanizowane, mysie, chimeryczne), które mogą hamować NGF, można wytwarzać przez zastosowanie immunogenów, które eksprymują NGF pełnej długości lub część sekwencji NGF. Zgodnie z innym aspektem, można stosować immunogen w tym komórkę, która wykazuje nadekspresję NGF. Innym przykładem immunogenu, który można stosować jest białko NGF, które obejmuje NGF pełnej długości lub część białka NGF.

Antagonistyczne przeciwciała anty-NGF można wytwarzać dowolnymi sposobami znanymi w dziedzinie. Droga i schemat immunizacji zwierzęcia gospodarza są na ogół utrzymywane zgodnie z ustalonymi i typowymi technikami stymulacji i produkcji przeciwciała, jak to tu dalej opisano. Ogólne techniki produkcji ludzkich i mysich przeciwciał są znane w dziedzinie i tu opisane.

Pod uwagę bierze się to, że dowolnego pacjenta będącego ssakiem, w tym ludzi lub komórki produkujące ludzkie przeciwciało, można poddać takim manipulacjom, aby służyły jako podstawa do produkcji ssaczych, obejmujących ludzkie, hybrydomowych linii komórkowych. Typowo, zwierzę gospodarz jest szczepione dootrzewnowo, domięśniowo, doustnie, podskórnie, dopodeszwowo, i/lub śródskórnie immunogenem w ilości, obejmującej takie, jak tu opisano.

Hybrydomy można wytworzyć z limfocytów i unieśmiertelnionych komórek szpiczaka, stosując ogólne techniki hybrydyzacji komórek somatycznych według Kohler'a, B. i Milstein'a, C. (1975) Nature

256: 495-497 lub zmodyfikowane przez Buck'a, D. W., i in., In Vitro, 18: 377- 381 (1982). Do hybrydyzacji można stosować dostępne linie szpiczaka, obejmujące między innymi X63-Ag8653 i linie z Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornia, USA. Na ogół, technika obejmuje fuzję komórek szpiczaka i komórek Iimfoidalnych, z zastosowaniem fuzogenu takiego jak glikol polietylenowy, lub sposobami elektrycznymi dobrze znanymi fachowcom w dziedzinie. Po fuzji, komórki oddziela się od podłoża fuzyjnego i hoduje na selekcyjnym podłożu wzrostowym, takim jak podłoże hipoksantyna-aminopteryna- tymidyna (HAT), w celu wyeliminowania niezhybrydyzowanych komórek macierzys46

PL 215 171 B1 tych. Do hodowli hybrydom, wydzielających monoklonalne przeciwciała, można stosować dowolne z opisanych tu podłoży, uzupełnione lub nieuzupełnione surowicą. Jako inną alternatywę techniki fuzyji komórek, w celu wytworzenia monoklonalnych przeciwciał anty-NGF będących przedmiotem wynalazku, można stosować unieśmiertelnione limfocyty B Ebr. Hybrydomy namnaża się i subklonuje, jeśli to pożądane, a supernatanty bada się pod kątem aktywności przeciw immunogenowi stosując konwencjonalne procedury testu immunologicznego (np. test radioimmunologiczny, test immunoenzymatyczny, lub immunofluorescencję).

Hybrydomy, które można stosować jako źródło przeciwciał obejmują wszystkie pochodne, komórki potomne komórki macierzystej hybrydomy, która wytwarza monoklonalne przeciwciała swoiste względem NGF, lub jego część.

Hybrydomy, które wytwarzają takie przeciwciała można hodować in vitro lub in vivo stosując znane sposoby. Jeśli to pożądane, monoklonalne przeciwciała można wyizolować z podłoża hodowlanego lub płynów ustrojowych, stosując typowe procedury oczyszczania immunoglobulin takie jak wytrącanie siarczanem amonu, elektroforeza na żelu, dializa, chromatografia, i ultrafiltracja. Niepożądaną aktywność, jeśli występuje, można usunąć, np. przepuszczając preparat przez adsorbenty wykonane z immunogenu przyłączonego z fazą stałą i eluując lub uwalniając pożądane przeciwciała od immunogenu. Immunizując zwierzę gospodarza ludzkim NGF, lub fragmentem zawierającym docelową sekwencję aminokwasową sprzężoną z białkiem, które jest immunogenne dla immunizowanego gatunku, np. hemocyjaniną ślimaka Megathura crenulate, albuminą osocza, tyroglobuliną bydlęcą, lub inhibitorem trypsyny z soi, stosując czynnik dwufunkcyjny lub czynnik do otrzymywania pochodnych, np. ester sulfosukcynoimidowy kwasu maleimidobenzoesowego (sprzęganie poprzez reszty cysteiny), N-hydroksysukcynoimid (poprzez reszty lizyny), aldehyd glutarowy, bezwodnik kwasu bursztynowego, SOCl2, lub R1N=C=NR, przy czym R i R1 oznaczają różne grupy alkilowe, można uzyskać populację przeciwciał (np. przeciwciał monoklonalnych).

Jeśli to pożądane, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF (monoklonalne lub poliklonalne), które chcemy uzyskać można zsekwencjonować, a sekwencję polinukleotydową można następnie wklonować do wektora w celu ekspresji lub namnażania. Sekwencję kodującą pożądane przeciwciało można utrzymywać w wektorze w komórkce gospodarzu, a komórkę gospodarza można następnie namnażać i zamrozić do zastosowania w przyszłości. Alternatywnie, sekwencję polinukleotydową można stosować do genetycznych manipulacji do „humanizacji przeciwciała lub w celu poprawy powinowactwa, lub innych właściwości przeciwciała. Na przykład rejon stały można poddać metodom inżynierii, aby bardziej przypominało ludzkie rejony stałe, w celu uniknięcia odpowiedzi immunologicznej, jeśli przeciwciało stosuje się w próbach klinicznych i leczeniu ludzi. Może być pożądane przeprowadzenie genetycznej manipulacji sekwencji przeciwciała z wytworzeniem większego powinowactwa do NGF i większej efektywności hamowania NGF. Dla fachowców dziedzinie będzie oczywiste, że do antagonistycznego przeciwciała anty-NGF można wprowadzić jedną lub więcej polinukleotydowych zmian i wciąż utrzymać jego zdolność do wiązania z NGF.

Humanizowanie przeciwciała monoklonalnego przeprowadza się w czterech ogólnych etapach. Są to: (1) określanie sekwencji nukleotydowej i przewidywanej sekwencji aminokwasowej początkowych domen zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała (2) projektowanie humanizowanego przeciwciała, tj. decyzja, który rejon zrębowy przeciwciała zastosować podczas procesu humanizowania (3) bieżące metodologie/techniki humanizowania i (4) transfekcja i ekspresja humanizowanego przeciwciała. Patrz np. patent St. Zjedn. Ameryki nr 4816567; 5807715; 5866692; 6331415; 5530101; 5693761; 5693762; 5585089; i 6180370.

Opisano wiele cząsteczek „humanizowanych przeciwciał zawierających miejsce wiążące antygen, otrzymane z immunoglobulin nie mających ludzkiego pochodzenia, w tym przeciwciał chimerycznych mających rejony V gryzoni lub zmodyfikowane rejony V gryzoni i związane z nimi rejony determinujące dopasowanie (rejony CDR) połączone z ludzkimi domenami stałymi. Patrz np. Winter i in. Nature 349: 293-299 (1991), Lobuglio i in. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224 (1989), Shaw i in. J Immunol. 138: 4534-4538 (1987), i Brown i in. Cancer Res. 47: 3577-3583 (1987). Inne odsyłacze literaturowe opisują rejony CDR gryzoni wszczepione do ludzkich wspomagających rejonów zrębowych (FR) przed fuzją z odpowiednią ludzką stałą domeną przeciwciała. Patrz np. Riechmann i in. Nature 332: 323-327 (1988), Verhoeyen i in. Science 239: 1534-1536 (1988), i Jones i in. Nature 321: 522-525 (1986). Inne odsyłacze opisują rejony CDR gryzoni wspierane przez rekombinacyjnie maskowane rejony zrębowe gryzoni. Patrz np. Europejska publikacja patentowa nr 0519596. Te „humanizowane cząsteczki zaprojektowano tak, aby zminimalizować niepożądaną odpowiedź przeciw cząPL 215 171 B1 steczkom gryzoniowych anty-ludzkich przeciwciał, która ogranicza czas trwania i skuteczność terapeutycznego zastosowania tych fragmentów u ludzkich biorców. Na przykład rejon stały przeciwciała można przekształcić tak, aby był immunologicznie obojętny (np. nie wywoływał Iizy zależnej od dopełniacza). Patrz np. publikacja PCT nr GB99/01441; brytyjskie zgłoszenie patentowe nr 98099518. Inne sposoby humanizowania przeciwciał, które można także stosować ujawniają Daugherty i in., Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476 (1991) i patenty St. Zjedn. Ameryki nr 6180377; 6054297; 5997867; 5866692; 6210671; i 6350861; i publikacja PCT nr WO 01/27160.

W jeszcze innym alternatywnym rozwiązaniu, całkowicie ludzkie przeciwciała można otrzymać przez zastosowanie dostępnych na rynku myszy, które „skonstruowano”, aby eksprymowały specyficzne ludzkie białka immunoglobulin. Zwierzęta transgeniczne, które zaprojektowano w celu wytworzenia bardziej pożądanej (np. przeciwciała całkowicie ludzkie) lub silniejszej odpowiedzi immunologicznej można także stosować do wytwarzania humanizowanych lub ludzkich przeciwciał. Przykładami _® takich technologii są Xenomouse™ firmy Abgenix, Inc. (Fremont, CA) i HuMAb-Mouse^® i TC Mouse™ firmy Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

Alternatywnie, przeciwciała można wytwarzać rekombinacyjnie i eksprymować stosując dowolny sposób znany w dziedzinie. W innej alternatywie, przeciwciała można wytwarzać rekombinacyjnie stosując technologię ekspresji fagowej. Patrz np. patent St. Zjedn. Ameryki nr 5565332; 5580717; 5733743; i 6265150; oraz Winter i in., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994). Alternatywnie, technologię ekspresji fagowej (McCafferty i in., Nature 348: 552-553 (1990)) można stosować w celu wytworzenia ludzkich przeciwciał i fragmentów przeciwciał in vitro, z repertuarów immunoglobulinowych genów domen zmiennych (V) od nieimmunizowanych dawców. Zgodnie z tą techniką, geny domeny V przeciwciała wklonowuje się nie zaburzając ramki odczytu (in-frame) do genu kodującego główne albo małe białko kapsydu nitkowatego bakteriofaga, takiego jak M13 lub fd, i eksprymuje jako funkcjonalne fragmenty przeciwciała na powierzchni cząstki faga. Ponieważ nitkowata cząstka zawiera jednoniciową kopię DNA genomu faga, selekcje bazujące na funkcjonalnych właściwościach przeciwciała skutkują także wyselekcjonowaniem genu kodującego przeciwciało wykazujące takie właściwości. Zatem fag naśladuje pewne właściwości limfocytu B. Ekspresję fagową można przeprowadzać w rozmaitych formatach; przegląd patrz np. Johnson, Kevin S. i Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Do ekspresji fagowej można stosować kilka źródeł segmentów genu V. Clackson i in., Nature 352: 624-628 (1991) wyizolowali różnorodną matrycę przeciwciał anty-oksazolon z małej losowej kombinatorycznej biblioteki genów V, pochodzących ze śledzion immunizowanych myszy. Można skonstruować repertuar genów V od nieimmunizowanych ludzkich dawców i przeciwciała przeciw różnorodnej matrycy antygenów (obejmujących antygeny własne) można wyizolować zasadniczo zgodnie z technikami opisanymi przez Mark i in., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), lub Griffith i in., EMBO J. 12: 725-734 (1993). W naturalnej odpowiedzi immunologicznej, geny przeciwciał akumulują mutacje z dużą częstością (somatyczna hipermutacja). Niektóre z wprowadzonych zmian będą nadawać większe powinowactwo, a limfocyty B eksprymujące immunoglobulinę powierzchniową o wysokim powinowactwie ulegają preferencyjnej replikacji i różnicowaniu podczas późniejszej prowokacji antygenem. Ten naturalny proces można naśladować stosując technikę znaną jako „chain shuffling”. Marks i in., Biol Technol 10: 779-783(1992)). W tym sposobie powinowactwo „pierwotnego” ludzkiego przeciwciała otrzymanego przez ekspresję fagową można zwiększyć przez kolejne zastępowanie genów rejonu V łańcucha ciężkiego i lekkiego repertuarami naturalnie występujących wariantów (repertuarów) genów domeny V otrzymanymi od nieimmunizowanych dawców. Ta technika umożliwia produkcję przeciwciał i fragmentów przeciwciała o powinowactwie zakresie pM-nM. Strategię wytwarzania bardzo dużych fagowych repertuarów przeciwciał (znanych także jako „matka wszystkich bibliotek”) opisali Waterhouse i in., Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993). Tasowanie genów można także stosować w celu otrzymania ludzkich przeciwciał z przeciwciał gryzoni, przy czym ludzkie przeciwciało ma podobne powinowactwa i swoistości do wyjściowego przeciwciała gryzoni. Zgodnie z tym sposobem, który określa się także jako „imprinting epitopów”, gen domeny V łańcucha ciężkiego lub lekkiego przeciwciał gryzoni otrzymano techniką ekspresji fagowej zastępuje się repertuarem ludzkich genów domeny V, tworząc chimery gryzoniowo-ludzkie. W wyniku selekcji pod kątem powinowactwa do antygenu można wyizolować ludzkie rejony zmienne zdolne do przywrócenia funkcjonalnego miejsca wiążącego antygen, tj. epitop rządzi (imprint) wyborem partnera. Gdy proces powtarza się w celu zastąpienia pozostałej domeny V gryzonia, otrzymuje się ludzkie przeciwciało (patrz publikacja PCT nr WO 93/06213, opublikowana 1 kwietnia 1993). W odróżnieniu od tradycyjnego hu48

PL 215 171 B1 manizowania przeciwciał gryzoni przez wszczepianie CDR, ta technika daje całkowicie ludzkie przeciwciała, które nie posiadają fragmentów zrębowych lub CDR pochodzących od gryzoni.

Jest oczywiste, że chociaż powyższa dyskusja odnosi się do humanizowanych przeciwciał, ogólne omówione zasady są odpowiednie do zamawianych przeciwciał do zastosowania, np. u psów, kotów, naczelnych, koni i bydła. Ponadto jest oczywiste, że jeden lub więcej aspektów humanizowania przeciwciała opisanego tu można łączyć, np. wszczepianie CDR, mutacja zmieniająca ramkę odczytu i mutacja CDR.

Przeciwciała można wytwarzać rekombinacyjnie najpierw przez izolację przeciwciał i komórek produkujących przeciwciała ze zwierząt gospodarzy, otrzymywanie sekwencji genu, i wykorzystując sekwencję genu do ekspresji zrekombinowanego przeciwciała w komórkach gospodarzach (np. komórkach CHO). Innym sposobem, który można stosować jest eksprymowanie sekwencji przeciwciała w roślinach (np. tytoniu) lub transgenicznym mleku. Ujawniono sposoby rekombinacyjnej ekspresji przeciwciała w roślinach lub mleku. Patrz np. Peeters, i in. Vaccine 19: 2756 (2001); Lonberg, N. i D. Huszar Int. Rev. Immunol 13: 65 (1995); i Pollock, i in., J Immunol Methods 231: 147(1999). Sposoby wytwarzania pochodnych przeciwciała, np. humanizowanych, pojedynczych łańcuchów, itp. są znane w dziedzinie.

Do izolacji przeciwciał swoistych dla NGF można także stosować testy immunologiczne i techniki sortującej cytometrii przepływowej takie jak sortująca cytofluorymetria przepływowa (FACS).

Przeciwciała mogą być związane z wieloma różnymi nośnikami. Nośniki mogą być aktywne i/lub obojętne. Przykłady dobrze znanych nośników obejmują polipropylen, polistyren, polietylen, dekstran, nylon, amylazy, szkło, naturalne i modyfikowane celulozy, poliakrylamidy, agarozy i magnetyt. Dla celów wynalazku nośnik może być zarówno rozpuszczalny jak i nierozpuszczalny. Fachowcy w dziedzinie znają inne odpowiednie nośniki do wiązania przeciwciała, lub mogą je ustalić stosując rutynowe doświadczenia. W pewnych rozwiązaniach, nośnik zawiera fragment, której organem docelowym jest mięsień sercowy.

DNA kodujący monoklonalne przeciwciała łatwo izoluje się i sekwencjonuje z zastosowaniem typowych sposobów (np. stosując sondy oligonukleotydowe, które mają zdolność do swoistego wiązania do genów kodujących łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała monoklonalnego). Komórki hybrydomy służą jako korzystne źródło takiego DNA. Po wyizolowaniu DNA można włączać do wektorów ekspresyjnych (takich jak wektory ekspresyjne ujawnione w publikacji PCT nr WO 87/04462), którymi następnie transferuje się komórki gospodarzy takie jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), lub komórki szpiczaka, które w innym wypadku nie produkują białka immunoglobulinowego, uzyskując syntezę monoklonalnych przeciwciał w zrekombinowanych komórkach gospodarzach. Patrz np. publikacja PCT nr WO 87/04462. DNA można także zmodyfikować, np. przez podstawianie sekwencji kodującej stałe domeny ludzkich łańcuchów ciężkiego i lekkiego w miejsce homologicznych sekwencji mysich, Morisson i in., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851 (1984), lub przez kowalencyje dołączanie do immunoglobulinowej sekwencji kodującej całość lub część sekwencji kodującej polipeptyd nie będący immunoglobuliną. W taki sposób tworzy się „chimeryczne lub „hybrydowe” przeciwciała, mające swoistość przeciwciała monoklonalnego wiązania anty-NGF według wynalazku.

Antagonistyczne przeciwciała anty-NGF można scharakteryzować stosując sposoby dobrze znane w dziedzinie. Na przykład jednym sposobem jest identyfikacja epitopu, z którym się ono wiąże, lub „mapowanie epitopu. Istnieje wiele sposobów znanych w dziedzinie służących do mapowania i określania położenia epitopów na białkach, obejmujące określanie struktury krystalicznej kompleksu przeciwciało-antygen, testy kompetycyjne, testy ekspresji fragmentu genu, i testy w oparciu o syntetyczny peptyd, jak opisali np. Harlow i Lane w rozdziale 11, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. W dodatkowym przykładzie, mapowanie epitopu można stosować w celu określenia sekwencji, z którą wiąże się antagonistyczne przeciwciało anty-NGF. Mapowanie epitopu można wykonać stosując dostępne na rynku różne źródła, np. Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Holandia). Epitop może być epitopem liniowym, tj. zawartym w pojedynczym odcinku aminokwasów, lub epitopem konformacyjnym utworzonym przez trójwymiarową interakcję aminokwasów, które nie koniecznie muszą być zawarte w pojedynczym odcinku. Peptydy o zmiennej długości (np. długości co najmniej 4-6 aminokwasów) można wyizolować lub zsyntetyzować (np. rekombinacyjnie) i stosować do testów wiązania z antagonistycznym przeciwciałem anty-NGF. W innym przykładzie epitop, z którym wiąże się antagonistyczne przeciwciało anty-NGF można określić przez uporządkowany skrining stosując zachodzące peptydy

PL 215 171 B1 pochodzące z sekwencji NGF i określanie wiązania z antagonistycznym przeciwciałem anty-NGF. Zgodnie z testami ekspresji fragmentu genu, otwarta ramka odczytu kodująca NGF jest fragmentowana albo losowo albo przez specyficzne genetyczne konstrukcje i określa się reaktywność eksprymowanych fragmentów NGF z badanym przeciwciałem. Fragmenty genu mogą, np. być wytwarzane techniką PCR, a następnie in vitro transkrybowane i poddawane translacji na białka, w obecności radioaktywnych aminokwasów. Wiązanie przeciwciała z radioaktywnie znakowanymi fragmentami NGF określa się następnie przez immunoprecypitację i elektroforezę w żelu. Pewne epitopy można także zidentyfikować stosując duże losowe biblioteki sekwencji peptydowych eksprymowane na powierzchni cząstek fagowych (biblioteki fagowe). Alternatywnie, określoną bibliotekę zachodzących fragmentów peptydowych można badać pod kątem wiązania z testowym przeciwciałem w prostych testach wiązania. W dodatkowym przykładzie, mutagenezę domeny wiążącej antygen, doświadczenia wymiany domen i technikę alanine scanning mutagenesis można przeprowadzać w celu zidentyfikowania reszt wymaganych, wystarczających, i/lub koniecznych do wiązania epitopu. Na przykład doświadczenia z wymianą domen można przeprowadzać stosując zmutowany NGF, w którym różne fragmenty polipeptydu NGF zastąpiono (wymieniono) sekwencjami ze ściśle pokrewnego, lecz antygenowo odmiennego białka (takiego jak inne białko z rodziny neurotrofin). Przez ocenę wiązania przeciwciała ze zmutowanym NGF, można ocenić znaczenie poszczególnych fragmentów NGF dla wiązania z przeciwciałem.

Jeszcze innym sposobem, który można stosować do charakteryzowania antagonistycznego przeciwciała anty-NGF jest zastosowanie testów kompetycji z innymi przeciwciałami, o których wiadomo, że wiążą się do takiego samego antygenu, tj. różnych fragmentów na NGF, w celu określenia czy antagonistyczne przeciwciało anty-NGF wiąże się z takim samym epitopem, jak inne przeciwciała. Testy kompetycji są dobrze znane fachowcom w dziedzinie. Przykład przeciwciała, które można stosować w testach kompetycji dla tego wynalazku obejmują MAb 911, 912, 938, jak opisali Kongo, i in., Hybridoma 19: 215-227 (2000).

Wektor ekspresyjny można stosować do bezpośredniej ekspresji antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. Fachowiec w dziedzinie jest obeznany z podawaniem wektorów ekspresyjnych z uzyskaniem ekspresji egzogennego białka in vivo. Patrz np. patent St. Zjedn. Ameryki nr 6436908; 6413942; i 6376471. Podawanie wektorów ekspresyjnych obejmuje podawanie miejscowe lub układowe, obejmujące zastrzyk, podawanie doustne, technikę strzelby genowej lub podawanie przez cewnik, oraz podawanie miejscowe. W innym rozwiązaniu, wektor ekspresyjny podaje się bezpośrednio do pnia lub zwoju współczólnego, lub do tętnicy wieńcowej, przedsionka, komory, lub osierdzia.

Można także stosować ukierunkowane dostarczanie terapeutycznych kompozycji zawierających wektor ekspresyjny, lub polinukleotydy subgenomowe. Techniki zależnego od receptorów dostarczania DNA opisali np. Findeis i in., Trends Biotechnol. (1993) 11: 202; Chiou i in., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu i in., J. Biol. Chem. (1988) 263: 621; Wu i in., J. Biol. Chem. (1994) 269: 542; Zenke i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 3655; Wu i in., J. Biol. Chem. (1991) 266: 338. Kompozycje terapeutyczne zawierające polinukleotyd podaje się w zakresie około 100 ng do około 200 mg DNA przy podawaniu miejscowym w protokole terapii genowej. Podczas protokołu terapii genowej można także stosować zakresy stężeń około 500 ng do około 50 mg, około 1 μg do około 2 mg, około 5 μg do około 500 μg, i około 20 μg do około 100 μg DNA. Terapeutyczne polinukleotydy i polipeptydy można dostarczać stosując nośniki do dostarczania genów. Nośnik do dostarczania genu może być pochodzenia wirusowego lub niewirusowego (patrz Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1: 51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5: 845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1: 185; i Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6: 148). Ekspresję takich sekwencji kodujących można indukować stosując endogenne promotory ssacze lub promotory heterologiczne. Ekspresja sekwencji kodującej może być albo konstytutywna, albo regulowana.

Wektory wirusowe do dostarczania i ekspresji pożądanego polinukleotydu w pożądanej komórce są dobrze znane w dziedzinie. Przykładowe nośniki wirusowe obejmują między innymi zrekombinowane retrowirusy (patrz np. publikacje PCT nr WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; patent St. Zjedn. Ameryki nr 5219740 i 4777127; brytyjski patent nr 2200651; i europejski patent nr 0345242), wektory pochodne wirusów z rodzaju alphavirus (np. wirusa Sindbis, wirusa Semliki forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), wirus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) i wirus wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu i rdzenia (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), wektory konstruowane z wirusów związanych z adenowirusami (AAV) (patrz np. publikacje PCT nr WO 94/12649, WO

PL 215 171 B1

93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 oraz WO 95/00655). Można także stosować podawanie DNA połączonego z uśmierconym adenowirusem, jak opisano w Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147.

Można także stosować niewirusowe nośniki i sposoby obejmujące między innymi polikationowy skondensowany DNA związany lub niezwiązany z samym uśmierconym adenowirusem (patrz np. Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147); DNA połączony z ligandem (patrz np. Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985); komórki nośnikowe do dostarczania do komórki eukariotycznej (patrz np. patent St. Zjedn. Ameryki nr 5814482; Publikacje PCT nr WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; oraz WO 97/42338) i neutralizację ładunku jądrowego lub fuzję z błoną komórkową. Można także stosować nagi DNA. Przykładowe sposoby wprowadzania nagiego DNA opisano w publikacji PCT nr WO 90/11092 i patencie St. Zjedn. Ameryki nr 5580859. Liposomy, które mogą działać jako nośniki do dostarczania genu opisano w patencie St. Zjedn. Ameryki nr 5422120; publikacjach PCT nr WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; i europejskim patencie 0524968. Dodatkowe metody opisali Philip, Mol Cell Biol (1994) 14: 2411, i Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 1581.

Identyfikacja antagonistycznych przeciwciał anty-NGF

Antagonistyczne przeciwciała anty-NGF można identyfikować lub charakteryzować stosując sposoby znane w dziedzinie, dzięki czemu wykrywa się i/lub mierzy zmniejszenie, złagodzenie, lub neutralizację biologicznej aktywności NGF. Na przykład test aktywacji kinazy receptorowej (KIRA) opisany w patencie St. Zjedn. Ameryki nr 5766863 i 5891650, można stosować do identyfikacji środków anty-NGF. Ten test typu ELISA jest odpowiedni do jakościowego lub ilościowego pomiaru aktywacji kinazy przez pomiar autofosforylacji domeny kinazowej receptorowej tyrozynowej kinazy białkowej (określanej poniżej „rPTK”), np. receptora TrkA, jak również do identyfikacji i charakteryzacji potencjalnych antagonistów wybranej rPTK, np. TrkA. Pierwsza faza testu obejmuje fosforylację domeny kinazowej kinazy receptorowej, np. receptora TrkA, przy czym receptor występuje w błonie komórkowej komórki eukariotycznej. Receptor może być receptorem endogennym lub kwasem nukleinowym kodującym ten receptor, lub konstruktem receptorowym, którym można transformować komórkę. Typowo, pierwszą fazę stałą (np. studzienkę pierwszej płytki testowej) powleka się w znacznym stopniu jednorodną populacją takich komórek (zazwyczaj ssaczej linii komórkowej) tak, aby komórki przylgnęły do fazy stałej. Często komórki są adherentne i tym samym naturalnie przylegają do pierwszej fazy stałej. Jeśli stosuje się „konstrukt receptorowy, zazwyczaj obejmuje on fuzję kinazy receptorowej i polipeptydowego znacznika. Znacznik polipeptydowy jest rozpoznawany przez czynnik wychwytujący, często przeciwciało wychwytujące, w części ELISA testu. Analit, taki jako badane antagonistyczne przeciwciało anty-NGF dodaje się następnie razem z NGF do studzienki zawierającej adherentne komórki, tak, aby receptorowa kinaza tyrozynowa (np. receptor TrkA) była eksponowana na (lub weszła w kontakt z) NGF i analit. Ten test umożliwia identyfikację przeciwciał, które hamują aktywację TrkA przez jej ligand NGF. Po ekspozycji na NGF i analit, zaadherowane komórki rozpuszcza się stosując bufor do Iizy (który zawiera w sobie rozpuszczający detergent) i delikatnie miesza, tym samym uwalniając lizat komórkowy, który można bezpośrednio poddać części testu ELISA, bez potrzeby zatężania lub klarowania lizatu komórkowego.

Tak przygotowany lizat komórkowy jest gotowy do poddania fazie testu ELISA. Jako pierwszy etap w fazie ELISA, drugą fazę stałą (zazwyczaj studzienka płytki ELISA do mikromiareczkowania) powleka się czynnikiem wychwytującym (często wychwytującym przeciwciałem), który wiąże się swoiście do receptorowej kinazy tyrozynowej, lub, w przypadku konstruktu receptorowego, do znacznika polipeptydowego. Powlekanie drugiej fazy stałej prowadzi się tak, aby czynnik wychwytujący przylgnął do drugiej fazy stałej. Czynnik wychwytujący jest na ogół przeciwciałem monoklonalnym, lecz, jak opisano w zamieszczonych tu przykładach, można także stosować przeciwciała poliklonalne. Otrzymany lizat komórkowy eksponuje się następnie na, lub kontaktuje z, zaadherowanym czynnikiem wychwytującym tak, aby receptor lub konstrukt receptorowy adherował do (lub był wychwytywany na) drugiej fazie stałej. Następnie przeprowadza się etap przemywania, tak, aby usunąć niezwiązany lizat komórkowy, pozostawiając związany receptor lub konstrukt receptorowy. Zaadherowany lub wychwycony receptor lub konstrukt receptorowy następnie eksponuje się na, lub kontaktuje z, przeciwciałem anty-fosfotyrozynowym, które identyfikuje ufosforylowane reszty tyrozyny w receptorowej kinazie tyrozynowej. W jednym rozwiązaniu, przeciwciało anty-fosfotyrozynowe jest sprzężone (bezpośrednio lub pośrednio) z enzymem, który katalizuje zmianę zabarwienia nieradioaktywnego odczynnika barwiącego. Zgodnie z tym, fosforylację receptora można zmierzyć przez następującą zmianę zabarwienia odczynnika. Enzym może być bezpośrednio związany z przeciwciałem anty-fosfotyrozynowym, lub

PL 215 171 B1 cząsteczka łącząca (np. biotyna) może być sprzężona z przeciwciałem anty-fosfotyrozynowym i enzym może być ponadto związany z przeciwciałem anty-fosfotyrozynowym poprzez cząsteczkę łączącą. Wreszcie mierzy się wiązanie przeciwciała anty-fosfotyrozynowego z wychwyconym receptorem lub konstruktem receptorowym, np. przez zmianę zabarwienia odczynnika barwiącego.

Antagonistyczne przeciwciało anty-NGF można także zidentyfikować przez inkubację badanego środka z NGF i monitorowanie dowolnej jednej lub więcej z następujących właściwości: (a) wiązanie z NGF i hamowanie biologicznej aktywności NGF lub szlaków, w których pośredniczy sygnalizacyjne działanie NGF; (b) hamowanie, blokowanie lub zmniejszenie a ktyw acji receptora NGF (obejmujące dimeryzację i/lub autofosforylację TrkA); (c) zwiększanie klirensu NGF; (d) leczenie lub zapobieganie dowolnemu aspektowi bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów lub bólowi towarzyszącemu zapaleniu kości i stawów; (e) hamowanie (zmniejszanie) syntezy, produkcji lub uwalniania NGF. W pewnych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF identyfikuje się przez inkubację badanego środka z NGF i monitorowanie wiązania i/lub towarzyszącego zmniejszenia lub neutralizację biologicznej aktywności NGF. Test wiązania można przeprowadzić z zastosowaniem oczyszczonego (oczyszczonych) polipeptydu(ów) NGF, lub komórek naturalnie eksprymujących, lub transfekowanych w celu ekspresji, polipeptydu(ów) NGF. W jednym rozwiązaniu, test wiązania jest kompetycyjnym testem wiązania, przy czym oszacowuje się zdolność badanego przeciwciała do współzawodniczenia o wiązanie z NGF ze znanymi antagonistami anty-NGF. Test można przeprowadzić w różnych formatach, obejmujących format ELISA. W innych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF identyfikuje się przez inkubację badanego środka z NGF i monitorowanie wiązania i towarzyszącego hamowania dimeryzacji i/lub autofosforylacji receptora trkA.

Po wstępnej identyfikacji, aktywność badanego antagonistycznego przeciwciała anty-NGF można następnie potwierdzić i oczyścić przez testy biologiczne, znane z badania ukierunkowanej aktywności biologicznej. Alternatywnie, testy biologiczne można stosować w celu bezpośredniego skriningu badanych przeciwciał. Na przykład NGF promuje wiele morfologicznie rozpoznawalnych zmian we wrażliwych komórkach. Obejmują one między innymi promowanie różnicowania komórek PC12 i poprawę wzrostu neurytów od tych komórek (Greene i in., Proc Natl Acad Sci USA. 73(7): 2424- 8,1976), promowanie wyrastania neurytów z eksplantów wrażliwych zwojów czuciowych i współczulnych (Levi- Montalcini, R. i Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48: 534569,1968) i promowanie przeżywania NGF zależnych neuronów takich jak embrionalnego zwoju międzykręgowego, zwoju nerwu trójdzielnego, lub neurony zwoju współczulnego (np. Chun & Patterson,

Dev. Biol. 75: 705-711, (1977); Buchman & Davies, Developement 118: 989-1001 (1993). Zatem test na hamowanie biologicznej aktywności NGF pociąga za sobą hodowlę NGF-wrażliwych komórek z NGF plus analit, taki jak badane antagonistyczne przeciwciało anty-NGF. Po odpowiednim czasie określi się odpowiedź komórki (różnicowanie komórki, wyrastanie neurytów lub przeżywanie komórek).

Zdolność badanego antagonistycznego przeciwciała anty-NGF do blokowania lub neutralizowania biologicznej aktywności NGF można także oszacować monitorując zdolność badanego środka do hamowania zależnego od NGF przeżywania w biologicznych testach przeżywania w szczurzych embrionalnych zwojach międzykręgowych jak opisali Hongo i in., Hybridoma 19: 215-227 (2000).

Podawanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF

Antagonistyczne przeciwciało anty-NGF można podawać pacjentom (z reumatoidalnym zapaleniem stawów i zapaleniem kości i stawów) dowolnym odpowiednim sposobem. Dla fachowców w dziedzinie powinno być oczywiste, że opisane tu przykłady nie są w zamierzeniu ograniczające, lecz mają na celu ilustrację dostępnych technik. Zgodnie z tym, w pewnych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF podaje się pacjentowi zgodnie ze znanymi sposobami, takimi jak podawanie dożylne, np. w bolusie lub przez ciągły wlew przez pewien czas, domięśniowo, dootrzewnowo, do płynu mózgowo-rdzeniowego, podskórnie, dostawowo, podjęzykowo, wewnątrzmaziówkowo, wziewnie, dooponowo, doustnie, przez inhalację lub miejscowo. Podawanie może być układowe, np. podawanie dożylne, lub zlokalizowane.

Przydatne do podawania są dostępne w handlu rozpylacze do ciekłych preparatów, obejmujące rozpylacze dyszowe i rozpylacze ultradźwiękowe. Ciekłe preparaty można bezpośrednio rozpylać, a liofilizowany proszek można rozpylać po rozpuszczeniu. Alternatywnie, z antagonistycznego przeciwciała anty-NGF można wytworzyć aerozol stosując preparat fluorowcowęglowodoru i inhalator odmierzający dawkę, lub wdychać jako liofilizowany i zmielony proszek.

W jednym rozwiązaniu, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF podaje się technikami ukierunkowanego dostarczania lub nakierowanego, miejscowego dostarczania. Przykłady technik ukierunko52

PL 215 171 B1 wanego lub nakierowanego miejscowego dostarczania obejmują różne wszczepialne źródła antagonistycznego przeciwciała anty-NGF do osiągania efektu depotu lub cewniki do miejscowego podawania, takie jak cewniki infuzyjne, cewnik założony na stałe, lub wenflon, syntetyczne przeszczepy, otoczki przydankowe, przyrządy zmieniające kierunek przepływu krwi i stenty lub inne wszczepialne urządzenia, nośniki specyficzne dla miejsca, bezpośredni zastrzyk, lub bezpośrednie podawanie. Patrz np. publikacja PCT nr WO 00/53211 i patent St. Zjedn. Ameryki nr 5981568.

Do podawania można stosować różne preparaty antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. W pewnych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF można podawać bez dodatków. W pewnych rozwiązaniach, z antagonistycznego przeciwciała anty-NGF i farmaceutycznie dopuszczalnej substancji pomocniczej można tworzyć różne preparaty. Farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze są znane w dziedzinie, i są względnie obojętnymi substancjami, które ułatwiają podawanie farmakologicznie skutecznych substancji. Na przykład substancja pomocnicza może nadawać strukturę lub konsystencję, lub działać jako rozcieńczalnik. Odpowiednie substancje pomocnicze obejmują między innymi środki stabilizujące, zwilżające i środki emulgujące, sole do zmiany osmolarności, środki opłaszczające, bufory, i środki ułatwiające penetrację skóry. Substancje pomocnicze jak również preparaty do podawania leku parenteralnie i nieparenteralnie przedstawił Remington w The Science and Practice of Pharmacy, wydanie 20, Mack Publishing (2000).

W pewnych rozwiązaniach, środki te komponuje się do podawania w zastrzyku (np. dootrzewnowo, dożylnie, podskórnie, domięśniowo, itp.). Zgodnie z tym, środki te można łączyć z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami pomocniczymi takimi jak solanka, roztwór Ringera, roztwór dekstrozy, itp. Określony schemat dawkowania, tj. wielkość, czas podawania i ilość dawek, będzie zależał od konkretnego pacjenta i jego historii choroby.

Przeciwciało anty-NGF można podawać stosując dowolny odpowiedni sposób, obejmujący podawanie przez zastrzyk (np. dootrzewnowo, dożylnie, podskórnie, domięśniowo, itp.).

Przeciwciała anty-NGF można także podawać poprzez inhalację, jak tu opisano. Na ogół, przy podawaniu przeciwciała anty-NGF początkowa próbna dawka może wynosić około 2 mg/kg. Dla celów wynalazku, typowa dzienna dawkowanie może mieścić się w zakresie od dowolnego z następujących: 1 μg/kg do 3 μg/kg do 30 μg/kg do 300 μg/kg do 3 mg/kg, do 30 mg/kg do 100 mg/kg lub więcej, zależnie od wyżej wymienionych czynników. Na przykład przeciwciało anty-NGF można podawać w ilości około 1 μg/kg, około 10 μg/kg, około 20 μg/kg, około 50 μg/kg, około 100 ug/kg, około 200 μg/kg, około 500 μg/kg, około 1 mg/kg, lub około 2 mg/kg. Przy podawaniu wielokrotnym przez kilka dni lub dłużej, zależnie od schorzenia, leczenie przedłuża się aż do pożądanego zahamowania występujących objawów lub aż osiągnięcia poziomów terapeutycznych wystarczających do zmniejszenia bólu. Przykładowy schemat dawkowania obejmuje podawanie przeciwciała anty-NGF w początkowej dawce około 2 mg/kg, po czym stosuje się podawaną co tydzień dawkę podtrzymującą około 1 mg/kg, lub dawkę podtrzymującą około 1 mg/kg co drugi tydzień. Jednakże mogą być przydatne inne reżimy dawkowania, zależnie od farmakokinetyki rozpadu, jaki lekarz chce osiągnąć. Na przykład w pewnych rozwiązaniach rozważa się dawkowanie od jednego do czterech razy na tydzień. Postęp tego leczenia łatwo monitorować typowymi technikami i testami. Schemat dawkowania (obejmujący stosowanie antagonisty(ów) NGF) może zmieniać się z czasem.

Dla celów wynalazku, odpowiednie dawkowanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF będzie zależało od stosowanego antagonistycznego przeciwciała anty-NGF (lub jego kompozycji), typu i nasilenia leczonego bólu, tego, czy środek podaje się w celach zapobiegawczych czy terapeutycznych, wcześniejszego leczenia, historii choroby pacjenta i odpowiedzi na środek, oraz uznania lekarza prowadzącego. Typowo klinicysta zastosuje antagonistyczne przeciwciało anty-NGF, aż do osiągnięcia dawki, która daje pożądany wynik. Dawka i/lub częstotliwość mogą zmieniać się podczas przebiegu leczenia.

Względy empiryczne, takie jak okres półtrwania, na ogół będą przyczyniać się do określania dawkowania. Na przykład w celu przedłużenia okresu półtrwania przeciwciała i aby zapobiec zaatakowaniu przeciwciała przez układ odpornościowy gospodarza można stosować przeciwciała, które są kompatybilne z ludzkim układem odpornościowym, takie jak humanizowane przeciwciała lub całkowicie ludzkie przeciwciała. Częstotliwość podawania można określić i regulować w trakcie leczenia, i na ogół, choć nie koniecznie, opiera się na leczeniu i/lub hamowaniu i/lub zmniejszeniu i/lub opóźnieniu wystąpienia bólu. Alternatywnie, odpowiednie mogą być preparaty antagonistyczne przeciwciała anty-NGF o przedłużonym, ciągłym uwalnianu. W dziedzinie znane są różne preparaty i urządzenia do osiągania przedłużonego uwalniania.

PL 215 171 B1

W jednym rozwiązaniu, dawkowanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF można określić empirycznie u pacjentów, którym raz, lub więcej, podano antagonistyczne przeciwciało anty-NGF. Pacjentom podaje się rosnące dawki antagonistycznego przeciwciała anty-NGF. Aby ocenić efektywność antagonistycznego przeciwciała anty-NGF, można kierować się objawami bólu.

Podawanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF zgodnie ze sposobem według wynalazku może być ciągłe lub przerywane, w zależności np. od stanu fizjologicznego biorcy, od tego, czy celem podawania jest leczenie czy profilaktyka, i innych czynników znanych doświadczonym lekarzom. Podawanie przeciwciała może być w istocie ciągłe przez wcześniej wybrany okres lub może występować w seriach dawek oddzielonych w czasie, np. przed, podczas, lub po wywołaniu bólu; przed; podczas; przed i po; podczas i po; przed i podczas; lub przed, podczas, i po wywoływaniu ból.

W pewnych rozwiązaniach może występować więcej niż jedno antagonistyczne przeciwciało anty-NGF. Może występować co najmniej jedno, co najmniej dwa, co najmniej trzy, co najmniej cztery, co najmniej pięć różnych, lub więcej antagonistycznych przeciwciał anty-NGF. Na ogół, te antagonistyczne przeciwciała anty-NGF mają uzupełniające się aktywności, które zaburzają się wzajemnie.

Terapeutyczne preparaty antagonistycznego przeciwciała anty-NGF stosowane zgodnie z wynalazkiem wytwarza się do przechowywania przez zmieszanie przeciwciała mającego pożądany stopień czystości z dowolnym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, substancją pomocniczą lub stabilizatorami (Remington, The Science and Practice of Pharmacy wydanie 20, Mack Publishing (2000)), w postaci liofilizowanych preparatów lub wodnych roztworów. Dopuszczalne nośniki, substancje pomocnicze, lub stabilizatory są nietoksyczne dla biorców w stosowanych dawkach i stężeniach, i mogą obejmować bufory takie jak fosforanowy, cytrynianowy, i inne kwasy organiczne; sole takie jak chlorek sodu; przeciwutleniacze obejmujące kwas askorbinowy i metioninę; środki konserwujące (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamoniowy; chlorek heksametonium; chlorek benzalkoniowy, chlorek benzetonium; fenol, butyl lub alkohol benzylowy; alkiloparabeny, takie jak metylo- lub propyloparaben; katechol; rezorcyna; cykloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptydy o małej masie cząsteczkowej (poniżej około reszt 10); białka, takie jak albumina osocza, żelatyna, lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina, lub lizyna; monocukry, dwucukry, i inne węglowodany obejmujące glukozę, mannozę, lub dekstryny; środki chelatujące takie jak EDTA; cukry takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol; tworzące sól przeciwjony takie jak sód; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko); i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne takie jak TWEEN^TM PLURONICS™ lub glikol polietylenowy (PEG).

Liposomy zawierające antagonistyczne przeciwciało anty-NGF wytwarza się sposobami znanymi w dziedzinie, takimi jak opisano w Epstein i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang, i in., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); i opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr 4485045 i 4544545. Liposomy o przedłużonym okresie cyrkulacji ujawniono w patencie St. Zjedn. Ameryki nr 5013556. Szczególnie przydatne liposomy można wytwarzać przez odparowywanie w fazie odwróconej z zastosowaniem kompozycji lipidowej zawierającej fosfatydylocholinę, cholesterol i fosfatydyloetanoloaminę przyłączoną do PEG (PEG-PE). Liposomy wytłacza się poprzez filtry o określonej wielkości porów z wytworzeniem liposomów o pożądanej średnicy.

Aktywne składniki można także zamknąć w mikrokapsułkach wytworzonych, np. technikami koacerwacji lub przez polimeryzację międzyfazową, odpowiednio np. hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych mikrokapsułkach i mikrokapsułkach z poli(metakrylanu metylu), w koloidalnych systemach dostarczania leku (np. liposomy, mikrosfery albuminowe, mikroemulsje, nanocząstki i nanokapsułki) lub w makroemulsjach. Takie techniki ujawnił Remington, The Science and Practice of Pharmacy wydanie 20, Mack Publishing (2000).

Można wytworzyć preparaty o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne struktury ze stałych hydrofobowowych polimerów zawierające przeciwciało, przy czym struktury mają postać ukształtowanych wyrobów, np. filmów, lub mikrokapsułek. Przykłady struktur do przedłużonego uwalniania obejmują poliestry, hydrożele (np. poli(metakrylan 2-hydroksyetylu, lub alkohol poliwinylowy), polilaktydy (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 3773919), kopolimery: kwasu L-glutaminowego i 7 etylo-L-glutaminianu, niedegradowalny kopolimer etylen-octan winylu, degradowalne kopolimery kwas mlekowy-kwas glikolowy takie jak LUPRON DEPOT™ (mikrosfery do wstrzykiwania składające się z kopolimeru kwas mlekowy-kwas glikolowy i octanu leuprolidu), octan izomaślanu sacharozy, i kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy.

PL 215 171 B1

Preparaty stosowane do podawania in vivo muszą być sterylne. Łatwo to osiągnąć np. przez filtrację przez sterylne błony filtracyjne. Terapeutyczne kompozycje antagonistycznego przeciwciała anty-NGF na ogół umieszcza się w opakowaniu mającym jałowy port dostępowy, np. woreczek lub fiolka z dożylnym roztworem, mające korek, który można przekłuć igłą do wstrzyknięć podskórnych.

Kompozycje według wynalazku mogą występować w jednostkowych postaciach dawkowania takich jak tabletki, pigułki, kapsułki, proszki, granulki, roztwory lub zawiesiny, lub czopki, do doustnego, parenteralnego lub doodbytniczego podawania, lub podawania przez inhalację lub wdmuchiwanie.

Do wytwarzania kompozycji stałych takich jak tabletki, główny aktywny składnik miesza się z farmaceutycznym nośnikiem, np. typowymi składnikami do wytwarzania tabletek takimi jak skrobia kukurydziana, laktoza, sacharoza, sorbitol, talk, kwas stearynowy, stearynian magnezu, difosforan wapnia lub gumy, i innymi farmaceutycznymi rozcieńczalnikami, np. wodą, z wytworzeniem stałych kompozycji preformulacyjnych zawierających homogeniczną mieszaninę związku według wynalazku, lub jego nietoksyczną, farmaceutycznie dopuszczalną sól. Przez określenie tych preformulacyjnych kompozycji jako homogenicznych rozumie się, że aktywny składnik rozprasza się równomiernie w kompozycji tak, aby kompozycję można łatwo podzielić na równie skuteczne jednostkowe postaci dawkowania takie jak tabletki, pigułki i kapsułki. Te stałe preformulacyjne kompozycje następnie dzieli się na jednostkowe postaci dawkowania typu jak opisano powyżej, zawierające od 0,1 do około 500 mg aktywnego składnika według wynalazku. Tabletki lub pigułki nowej kompozycji można powlekać lub w inny sposób preparować z wytworzeniem postaci dawkowania, uzyskując korzystne przedłużone działanie. Na przykład tabletka lub pigułka może zawierać składnik wewnętrznej i zewnętrznej dawki, ten ostatni w postaci otoczki wokół pierwszego. Dwa składniki można rozdzielać stosując warstwę dojelitową, która służy do zabezpieczenia przed strawieniem w żołądku i umożliwia wewnętrznemu składnikowi przejście do dwunastnicy w stanie nienaruszonym lub opóźnienie jego uwalniania. Jako takie dojelitowe warstwy lub powłoki można stosować wiele różnych materiałów, takich jak substancje obejmujące pewną liczbę polimerycznych kwasów i mieszaniny polimerycznych kwasów z takimi substancjami jak szelak, alkohol cetylowy i octan celulozy.

Odpowiednie środki powierzchniowo czynne obejmują, w szczególności środki niejonowe, takie jak polioksyetylenosorbitany (np. Tween™ 20, 40, 60, 80 lub 85) i inne sorbitany (np. Span™ 20, 40, 60, 80 lub 85). Kompozycje ze środkami powierzchniowo czynnymi będą dogodnie zawierać pomiędzy 0,05 i 5% środków powierzchniowo czynnych, jak również pomiędzy 0,1 i 2,5%. Należy rozumieć, że, jeśli to konieczne, można dodawać inne składniki, np. mannitol lub inne farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze.

Odpowiednie emulsje można wytworzyć stosując dostępne na rynku emulsje tłuszczowe, takie jak Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol^TM, Lipofundin™ i Lipiphysan™. Aktywny składnik można albo rozpuszczać we wstępnie zmieszanej emulsji kompozycji lub alternatywnie można go rozpuszczać w oleju (np. oleju sojowym, oleju szafranowym, oleju z nasion bawełny, oleju sezamowym, oleju kukurydzianym lub oleju migdałowym) i tworzyć emulsję przez mieszanie z fosfolipidem (np. fosfolipidy jaja, fosfolipidy sojowe lub lecytyna sojowa) i wody. Należy rozumieć, że można dodawać inne składniki, np. gilcerol lub glukozę, w celu regulowanania toniczności emulsji. Odpowiednie emulsje będą typowo zawierać do 20% oleju, np. pomiędzy 5 i 20%. Emulsja tłuszczowa może zawierać kropelki tłuszczu pomiędzy 0,1 i 1,0 μm, szczególnie 0,1 i 0,5 μm, i mieć pH w zakresie 5,5 do 8,0.

Kompozycjami w emulsji mogą być te wytworzone przez zmieszanie przeciwciała przeciw czynnikowi wzrostu nerwów z Intralipid™ lub jego składnikami (olej sojowy, fosfolipidy jaja, glicerol i woda).

Kompozycje do inhalacji lub wdmuchiwania obejmują roztwory i zawiesiny w farmaceutycznie dopuszczalnych, wodnych lub organicznych rozpuszczalnikach, lub ich mieszaniny, oraz proszki. Ciekłe lub stałe kompozycje mogą zawierać odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze jak przedstawiono powyżej. W pewnych rozwiązaniach, kompozycje podaje się przez usta lub nos do dróg oddechowych do osiągnięcia efektu miejscowego lub układowego. Kompozycje w korzystnie sterylnych farmaceutycznie dopuszczalnych rozpuszczalnikach można rozpylać z zastosowaniem gazów. Rozpylane roztwory można wdychać bezpośrednio z rozpylacza lub rozpylacz może być przyłączony do maski na twarz, namiotu lub maszyny do oddychania wytwarzającej okresowo nadciśnienie. Kompozycje w postaci roztworu, zawiesiny lub proszku można podawać korzystnie doustnie lub donosowo, stosując urządzenia, które dostarczają preparat w odpowiedni sposób.

Efektywność leczenia można oszacować sposobami dobrze znanymi w dziedzinie.

Zestawy zawierające przeciwciała i polinukleotydy według wynalazku.

PL 215 171 B1

Wynalazek dotyczy także zestawów zawierających przeciwciała lub polipeptydy do zastosowania w wykrywaniu i/lub leczeniu. Zgodnie z tym, w pewnych rozwiązaniach, zestawy zawierają przeciwciało E3. W pewnych rozwiązaniach, zestaw zawiera dowolne opisane tu przeciwciało lub polipeptyd.

Zgodnie z innymi aspektami, zestawy można stosować w dowolnym z opisanych tu sposobów, obejmujących, np. leczenie bólu (obejmującego ból pooperacyjny, ból towarzyszący reumatoidalnemu zapaleniu stawów, oraz ból towarzyszący zapaleniu kości i stawów) u pacjenta. Zestawy według wynalazku są w odpowiednim opakowaniu, i mogą ewentualnie zawierać dodatkowe składniki takie jak bufory, i instrukcje do zastosowania przeciwciała w dowolnym z opisanych tu sposobów. W pewnych rozwiązaniach, zestawy obejmują instrukcje leczenia bólu. W pewnych rozwiązaniach, zestaw zawiera opisane tu antagonistyczne przeciwciało anty-NGF i instrukcje leczenia i/lub zapobiegania bólowi towarzyszącemu reumatoidalnemu zapaleniu stawów u pacjenta. W innych rozwiązaniach, zestaw zawiera opisane tu antagonistyczne przeciwciało anty-NGF i instrukcje leczenia i/lub zapobiegania bólowi towarzyszącemu zapaleniu kości i stawów u pacjentów. W niektórych z rozwiązań, antagonistyczne przeciwciało anty-NGF oznacza przeciwciało E3.

Zgodnie z innym aspektem, przedmiotem wynalazku są zestawy zawierające polinukleotyd kodujący polipeptyd E3 jak to tu opisano. W pewnych rozwiązaniach, zestawy ponadto zawierają instrukcje do zastosowania polinukleotydu w dowolnym z opisanych tu sposobów.

Sposoby regulacji powinowactwa przeciwciała i sposoby charakteryzowania CDR

W tym opisie opracowano nowy sposób charakteryzowania CDR przeciwciała i/lub zmiany (takiej jak poprawa) powinowactwa wiązania polipeptydu, takiego jak przeciwciało, określany jako „mutageneza z przeszukiwaniem biblioteki”. Na ogół, mutageneza z przeszukiwaniem biblioteki działa następująco. Jedną lub więcej pozycji aminokwasowych w CDR zastępuje się dwoma lub więcej (takimi jak 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20) aminokwasami stosując sposoby znane w dziedzinie. Powoduje to powstanie małej biblioteki klonów (w pewnych rozwiązaniach, jednej na każdą analizowaną pozycję aminokwasową), każdą złożoną z dwóch lub więcej elementów (jeśli w każdej pozycji podstawia się dwa lub więcej aminokwasów). Na ogół, biblioteka obejmuje także klon zawierający natywny (niepodstawiony) aminokwas. Niewielką liczbę klonów, np. około 20-80 klonów (zależnie od złożoności biblioteki), z każdej biblioteki poddaje się skriningowi pod kątem powinowactwa wiązania z docelowym polipeptydem, i identyfikuje się badane klony charakteryzujące się zwiększonym, takim samym, obniżonym wiązaniem lub jego brakiem. Sposoby określania powinowactwa wiązania są dobrze znane w dziedzinie. W pewnych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania określa się stosując analizę rezonansu plazmonów powierzchniowych BIAcore, która wykrywa różnice powinowactwa wiązania około 2-krotną lub większą. BIAcore jest szczególnie przydatna, gdy wyjściowe przeciwciało już wiąże się z względnie wysokim powinowactwem, np. z KD około 10 nanomoli lub mniej. Klasyfikację z zastosowaniem rezonansu plazmonów powierzchniowych BIAcore opisano tu w przykładach.

W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania określa się stosując Kinexa Biocensor, scyntylacyjne testy sąsiedztwa, ELISA, test immunologiczny ORIGEN (IGEN), wygaszanie fluorescencji, przeniesienie fluorescencji, i/lub ekspresję drożdżową. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania bada się stosując odpowiedni test biologiczny.

W pewnych rozwiązaniach, każda pozycja aminokwasowa w CDR jest zastępowana (w pewnych rozwiązaniach, jedna za każdym razem) wszystkimi 20 naturalnymi aminokwasami z zastosowaniem metod mutagenezy znanych w dziedzinie (z których pewne tu opisano). Generuje to małe biblioteki klonów (w pewnych rozwiązaniach, jedną na każdą analizowaną pozycję aminokwasową), każdą złożoną z 20 elementów (jeśli wszystkie z 20 aminokwasów jest podstawionych w każdej pozycji).

W pewnych rozwiązaniach, przeszukiwana biblioteka zawiera substytucje w dwóch lub więcej pozycjach, które mogą być w tym samym CDR lub w dwóch lub więcej rejonach CDR. Zatem w pewnych rozwiązaniach, biblioteka zawiera substytucje w dwóch lub więcej pozycjach w jednym CDR. W innych rozwiązaniach, biblioteka zawiera substytucje w dwóch lub więcej pozycjach w dwóch lub więcej rejonach CDR. W jeszcze innych rozwiązaniach, biblioteka zawiera substytucję w 3, 4, 5, lub więcej pozycjach, przy czym wymienione pozycje znajdują w dwóch, trzech, czterech, pięciu lub sześciu rejonach CDR. W pewnych rozwiązaniach, substytucję wytwarza się stosując kodony o małej redundancji. Patrz np. tabela 2 Balint i in. (1993) Gene 137(1): 109-18).

PL 215 171 B1

W pewnych rozwiązaniach, CDR oznacza CDRH3 i/lub CDRL3. W innych rozwiązaniach, CDR oznacza jeden lub więcej z CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, i/lub CDRH3. W pewnych rozwiązaniach, CDR oznacza CDR Kabat, CDR Chotia, lub wydłużony CDR.

Kandydatów o ulepszonym wiązaniu można sekwencjonować, tym samym identyfikując mutanta CDR z substytucją, która prowadzi do poprawionego powinowactwa (także określanego jako „ulepszająca substytucja). Na przykład jak pokazano w przykładzie 1, zastosowanie tego sposobu pozwala na identyfikację pojedynczej substytucji, która ulepsza wiązanie, nawet gdy ocena 18 innych substytucji w tej samej pozycji aminokwasowej dawała w wyniku brak wiązania (tj. utratę funkcji przeciwciała). Kandydatów, którzy wiążą się można także zsekwencjonować, tym samym identyfikując substytucję CDR, która zachowuje wiązanie.

W pewnych rozwiązaniach, przeprowadza się wiele rund przeszukiwania. Na przykład kandydaci (każdy zawierający substytucję aminokwasową w jednej lub więcej pozycjach jednego lub więcej rejonów CDR) z ulepszonym wiązaniem są także przydatni do projektowania drugiej biblioteki zawierającej co najmniej oryginalny i podstawiony aminokwas w każdej ulepszonej pozycji CDR (tj. pozycji aminokwasowej w CDR, w której mutant z substytucją wykazał lepsze wiązanie). Wytwarzanie i przeszukiwanie lub wybór tej biblioteki omówiono następnie poniżej.

Mutageneza z przeszukiwaniem biblioteki dotyczy także sposobów charakteryzowania CDR, w miarę możliwości jak frekwencja klonów z ulepszonym wiązaniem, takim samym wiązaniem, obniżonym wiązaniem lub brakiem wiązania także dostarcza informacji odnośnie znaczenia każdej pozycji aminokwasowej dla trwałości kompleksu przeciwciało-antygen. Na przykład, jeśli w pozycji CDR zachowuje zdolność do wiązania przy zmianie na wszystkie 20 aminokwasów, ta pozycja jest identyfikowana jako pozycja co do której jest mało prawdopodobne, aby była wymagana do wiązania antygenu. Odwrotnie, jeśli pozycja CDR zachowuje wiązanie w tylko niewielkim procencie substytucji, taką pozycję identyfikuje się jako pozycję, która jest ważna dla funkcji CDR. Zatem metody mutagenezy z przeszukiwaniem biblioteki generują informacje odnośnie pozycji w rejonach CDR, które można zmienić na wiele różnych aminokwasów (obejmujących wszystkie 20 aminokwasów), i pozycji w rejonach CDR, których nie można zmieniać lub które można zmieniać tylko na kilka z aminokwasów. Ten aspekt omówiono i przedstawiono przykładowo w przykładzie 1.

W pewnych rozwiązaniach, kandydatów z ulepszonym powinowactwem łączy się w drugą bibliotekę, która zawiera ulepszony aminokwas, oryginalny aminokwas w tamtej pozycji, i może ponadto zawierać dodatkowe substytucje w tamtej pozycji, zależnie od pożądanej, lub dozwolonej złożoności biblioteki, stosując pożądane sposoby przeszukiwania lub selekcji. Ponadto, jeśli to pożądane, sąsiadujące pozycje aminokwasowe można losowo wymieniać na co najmniej dwa lub więcej aminokwasów. Randomizacja sąsiadujących aminokwasów może dopuszczać dodatkową elastyczność konformacyjną w zmutowanym CDR, która może z kolei dozwalać lub ułatwiać wprowadzenie większej liczby ulepszających mutacji. W pewnych rozwiązaniach, biblioteka zawiera także substytucję w pozycjach, które nie wykazują ulepszania powinowactwa w pierwszej rundzie przeszukiwania.

Drugą bibliotekę przeszukuje się lub selekcjonuje pod kątem elementów biblioteki z ulepszonym i/lub zmienionym powinowactwem wiązania, stosując dowolny sposób znany w dziedzinie, obejmujący przeszukiwanie z zastosowaniem analizy rezonansów plazmonów powierzchniowych BIAcore, i selekcję z zastosowaniem dowolnego sposobu selekcji znanego w dziedzinie, obejmującego ekspresję fagową, ekspresję drożdżową, i metodę ribosome display.

Zalety sposobów regulacji powinowactwa przeciwciała i charakteryzowanie CDR

Sposoby są przydatne do wstępnego skriningu pozycji aminokwasowych CDR w celu identyfikacji substytucji aminokwasowych, które poprawiają wiązanie lub utrzymują wiązanie. Wstępna identyfikacja ważnych reszty, substytucja poprawiająca wiązanie i/lub substytucje utrzymujące funkcję przeciwciała umożliwiają efektywne projektowanie i przeszukiwanie biblioteki o dojrzałym powinowactwie.

Niniejszy sposób jest także przydatny do charakteryzowania CDR, i dostarcza obszernych informacji dotyczących znaczenia każdej pozycji aminokwasowej w CDR dla wiązania z antygenem. Niniejszy sposób można także stosować w celu identyfikacji substytucji, które poprawiają wiązanie.

Zastosowanie małej biblioteki, w której każda pozycja może być losowo zmieniana (w pewnych rozwiązaniach, jedna na raz), umożliwia przeszukiwanie mutantów z substytucjami z zastosowaniem czułej metody takiej jak BIAcore, która dostarcza szczegółowych informacji kinetycznych. Sposoby przeszukiwania są na ogół niepraktyczne, jeśli przeszukuje się większe biblioteki. Zamiast nich do identyfikacji klonów, które zachowują wiązanie stosuje się zwykle metody selekcyjne, takie jak ekspresja fagowa, ekspresja drożdżowa i metoda rybosome display. Ekspresja fagowa i testy ELISA mogą

PL 215 171 B1 w dużym stopniu zależeć od stężenia próbki białkowej wytworzonej z klonu, a zatem mają skłonność do znacznego nastawienia raczej na klony, które mają zwiększoną ekspresję, zwiększoną trwałość, lub obniżoną toksyczność, niż na identyfikację klonów o zwiększonym powinowactwie wiązania. Ponadto, różnice w poziomie ekspresji klonów mogą maskować niewielką poprawę powinowactwa wiązania. Te wady są szczególnie dotkliwe, gdy jako substancję wyjściową stosuje się przeciwciało o wysokim powinowactwie wiązania, ponieważ trzeba stosować bardzo niskie poziomy antygenu, aby przeszukiwanie było dostatecznie surowe.

Dla odmiany, sposoby według wynalazku, takie jak randomizacja w każdej pozycji (w pewnych rozwiązaniach, jednej pozycji na raz), umożliwiają wprowadzenie i charakteryzację wpływu substytucji, np. wszystkich 20 aminokwasów w danej pozycji. Ta analiza dostarcza informacji, ile substytucji w danej pozycji jest tolerowanych (tj. zachowuje wiązanie przeciwciała), co z kolei dostarcza informacji odnośnie znaczenia każedego aminokwasu dla funkcji przeciwciała. Następnie, substytucje, które powodują poprawę wiązania można zidentyfikować, nawet w okolicznościach, w których wiele lub większość substytucji w danej pozycji daje niefunkcjonalne (niezdolne do wiązania) przeciwciała. Dla odmiany, technika alanine-scanning mutagenesis, którą powszechnie stosuje się do identyfikacji ważnych pozycji w CDR, dostarcza informacji odnośnie tego, czy podstawienie alaniną umożliwia wiązanie czy mu zapobiega. Na ogół, pozycje w których podstawienie alaniną zapobiega wiązaniu usuwa się z biblioteki o dojrzałym powinowactwie. Jednakże w wielu przypadkach alanina może być słabym podstawnikiem w pozycji CDR.

Sposoby według wynalazku pozwalają także identyfikować i charakteryzować wpływ pojedynczych mutacji CDR. Dla odmiany sposoby takie jak ekspresja fagowa wprowadzają i selekcjonują wiele mutacji jednocześnie, a zatem potencjalnie zwiększają ryzyko, że pozytywne mutacje będą zamaskowane przez obecność szkodliwych mutacji występujących w danym klonie.

Sposoby według wynalazku są także przydatne do poprawy powinowactwa z jednoczesnym utrzymaniem swoistości wiązania oryginalnego (wyjściowego) przeciwciała, o ile sposoby według wynalazku pozwalają na identyfikację niewielkiej liczby mutacji (np. 1, 2, 3, 4 lub 5 mutacji w pojedynczym CDR), które powodują poprawę powinowactwa wiązania. Dla odmiany sposoby takie jak ekspresja fagowa typowo poprawiają powinowactwo wiązania wykorzystując wiele mutacji na raz, co może spowodować zmianę specyficzności przeciwciała i/lub zwiększenie niepożądanej tendencji do reagowania krzyżowo.

Następujące przykłady zamieszczono w celu ilustracji, lecz nie ograniczenia, wynalazku.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1: Humanizowanie i dojrzewanie powinowactwa mysiego antagonistycznego przeciwciała anty-NGF 911

A. Ogólne metody

Następujące ogólne metody stosowano w tym przykładzie.

Wytwarzanie biblioteki

Biblioteki wytwarza się techniką PCR z mutagenezą kasetową z zastosowaniem zdegenerowanych oligonukleotydów jak opisali Kay i in. (1996), Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press (patrz, str. 277-291). Do randomizacji jednej pozycji aminokwasowej użyto kodon dopingowy NNK tak, aby obejmowała 20 możliwych aminokwasów. Do randomizacji jednej pozycji aminokwasowej, aby obejmowała tylko podzbiór aminokwasów o specyficznych właściwościach, zastosowano kodony dopingowe takie jak opisali Balint i in., (1993) Gene 137(1): 109-18). Mutagenezę ukierunkowaną przeprowadza się stosując rekombinacyjny PCR jak opisali Innis i in., (1990) PCR protocols: A guide to methods and applications (patrz str. 177-183).

Wytwarzanie Fab na małą skalę

Ekspresję na małą skalę w 96-dołkowych płytkach zoptymalizowano dla przeszukiwania biblioteki Fab. Wychodząc od komórek E. coli transformowanych biblioteką Fab, kolonie wybrano do zaszczepienia zarówno na płytce wzorcowej (agar LB + ampicylina (50 μg/ml) + 2% glukoza) i płytce roboczej (2 ml/studzienkę, 96 studzienek/płytkę zawierającą 1,5 ml LB + ampicylina (50 μg/ml) + 2% glukoza). Obie płytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 8-12 godzin. Płytkę wzorcową przechowywano w temperaturze 4°C, a komórki z płytki roboczej żwirowano przy 5000 obrotów na minutę i ponownie zawieszono w 1ml LB + ampicylina (50 μg/ml)+ 1 mM IPTG w celu indukcji ekspresji fragmentów Fab. Komórki zebrano przez odwirowanie po 5 godzinach ekspresji w temperaturze 30°C, następnie ponownie zawieszono w 500 μl buforu HBS-EP (100 mM bufor HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0, 005% P20, 3 mM EDTA). Lizę komórek ponownie zawieszonych w HBS-EP uzyskano przez

PL 215 171 B1 jeden cykl zamarzania (-80°C), po czym rozmrożono w temperaturze 37°C. Lizaty komórkowe wirowano przy 5000 obrotach na minutę przez 30 minut w celu oddzielenia pozostałości komórek od supernatantów zawierających fragmenty Fab. Potem supernatanty wstrzykiwano do urządzenia do rezonansu plasmonów BIAcore uzyskując informację o powinowactwie dla każdego Fab. Klony eksprymujące fragmenty Fab odzyskano z płytki wzorcowej w celu zsekwencjonowania DNA i produkcji do Fab na dużą skalę i szczegółowego scharakteryzowania jak opisano poniżej.

Wytwarzanie Fab na dużą skalę

W celu uzyskania szczegółowych parametrów kinetycznych, fragmenty Fab eksprymowano i oczyszczono z dużych hodowli. Kolby Erlenmeyera zawierające 200 ml LB + ampicylina (50 μg/ml) + 2% glukoza zaszczepiono 5 ml nocnej hodowli z wybranych klonów E. coli eksprymujacych Fab. Klony inkubowano w temperaturze 30°C aż do osiągnięcia OD550nm 10 a następnie indukowano przez wymianę podłoża na 200 ml LB + ampicylina (50 μg/ml) + 1 mM IPTG. Po 5 godzinach ekspresji w temperaturze 30°C, przez odwirowanie otrzymano osady komórek, po czym ponownie zawieszono w 10 ml PBS (pH 8). Lizę komórek uzyskano przez dwa cykle zamrażanie/rozmrażanie (odpowiednio w temperaturach -80°C i 37°C). Supernatant lizatów komórkowych wprowadzono do kolumny Ni-NTA z sefarozą Superflow (Qiagen, Valencia. CA) zrównoważoną PBS, pH 8, po czym przemyto 5 objętościami kolumny stosując PBS, pH 8. Poszczególne fragmenty Fab eluowano w różnych frakcjach stosując PBS (pH 8) + 300 mM imidazol. Frakcje zawierające fragmenty Fab połączono i dializowano w PBS, następnie oceniono ilościowo metodą ELISA przed scharakteryzowaniem powinowactwa.

Wytwarzanie pełnego przeciwciała

W celu ekspresji pełnego przeciwciała, rejony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego sklonowano do 2 ssaczych wektorów ekspresyjnych (opisane tu Eb.911.E3 lub Eb.pur.911.3E dla łańcucha lekkiego i Db.911.3E dla łańcucha ciężkiego) i transfekowano nimi komórki HEK 293 stosując lipofektaminę w celu uzyskania przejściowej ekspresji. Przeciwciała oczyszczono stosując białko A z zastosowaniem standardowych sposobów.

Test BIAcore

Powinowactwa fragmentów Fab anty-NGF i monoklonalnych przeciwciał określono stosując zestaw do rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) BlAcore3000™ (BIAcore, INC, Piscaway NJ). Chipy CM5 aktywowano stosując chlorowodorek N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i N-hydroksysukcynoimid (NHS) zgodnie z instrukcjami dostawcy. Ludzki NGF rozcieńczono w 10 mM octanie sodu pH 4,0 i wstrzykiwano na aktywowany chip w stężeniu 0,005 mg/ml. Stosując zmienny czas przepływu przez poszczególne kanały chipu, otrzymano dwa zakresy gęstości antygenu: 100-200 jednostek odpowiedzi (RU) dla szczegółowych badań kinetycznych i 500-600 RU dla testów skriningowych. Chip zablokowano stosując etanoloaminę. Badania regeneracyjne wykazały, że mieszanina buforu do eluowania Pierce (produkt nr 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) i 4 M NaCl (2:1) skutecznie usuwa związane Fab z jednoczesnym zachowaniem aktywności hNGF na chipów przez ponad 200 iniekcji. Bufor HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfaktant P29) użyto jako buforu reakcyjnego do wszystkich testów BIAcore.

Test skriningowy

Test skriningowy BIAcore zoptymalizowano w celu określenia powinowactwa klonów Fab z biblioteki. Supernatanty z lizatów małych hodowli wstrzykiwano przy 50 μl/minutę przez 2 minuty. Czasy dysocjacji wynoszące 10 do 15 minut stosowano do określania pojedynczego wykładniczego stopnia dysocjacji (koff) stosując oprogramowanie BIAevaluation. Próbki, które wykazały stopnie koff w takim samym zakresie, jak wzorzec użyto do stworzenia biblioteki.

-3 -1

Klon 8L2-6D5, (koff 1x10^-3s^-1) wstrzykiwano w celu potwierdzenia i pozostawiono na czaszy dysocjacji do 45 minut w celu uzyskania lepszych wartości koff. Klony wykazujące poprawione (wolniejsze) wartości koff eksprymowano na dużą skalę i na oczyszczonym białku określono pełne parametry kinetyczne, kon i koff. Test mógł wykryć różnice w powinowactwie, które były w przybliżeniu 2-krotne lub większe.

Test określania powinowactwa

Szereg rozcieńczeń (0,1-10x oszacowana KD) oczyszczonych próbek Fab wstrzykiwano przez 1 minutę przy 100 μl/minutę i pozostawiono na czaszy dysocjacji do 2 godzin. Stężenia białek Fab określono z zastosowaniem testu ELISA i/lub elektroforezy SDS-PAGE jako standard stosując Fab o znanym stężeniu (co określa się przez analizę aminokwasów). Kinetyczne stopnie asocjacji (kon) i dysocjacji (koff) otrzymano jednocześnie przez podstawienie danych do modelu wiązania Langmuira

PL 215 171 B1

1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) stosując program BIAevaluation. Wartości stałej równowagi dysocjacji (KD) obliczono jako koff/kon.

B. Humanizowanie i dojrzewanie powinowactwa mysiego antagonistycznego przeciwciała anty-NGF 911

Mysie antagonistyczne przeciwciało anty-NGF, 911 (patrz Hongo i in., (2000) Hybridoma 19(3): 215-227) wybrano do humanizowania i dojrzewania powinowactwa. Mab 911 wiąże się z ludzkim i szczurzym NGF z wysokim powinowactwem i nie wykazuje znaczącej reaktywności krzyzowej z neurotrofinami NT3, NT4/5 lub BDNF. Patrz Hongo, jak powyżej. Powinowactwo otrzymanego w wyniku trawienia papainą fragmentu Fab mysiego Mab 911 określono stosując analizę BIAcore jak opisano powyżej. Otrzymany w wyniku trawienia papainą Fab fragment mysiego Mab 911 wiązał sięz ludzkim NGF z KD w przybliżeniu 10 nanomoli.

Humanizowanie i dojrzewanie powinowactwa przeprowadzono w kilku następujących etapach:

(1) wytwarzanie wzorca z wszczepieniem CDR. Wydłużone rejony CDR łańcucha przeciwciała 911 (tj. obejmujące obszary CDR zarówno Kabat jak i Chotia w CDR) wszczepiono do pochodzących z ludzkiej linii komórek rozrodczych sekwencji akceptorowych O8 z JK2, a wydłużone rejony CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała 911 wszczepiono do sekwencji akceptorowej ludzkiej linii komórek rozrodczych VH4-59 z JH4. Sekwencje aminokwasowe sekwencji akceptorowych ludzkiej linii komórek rozrodczych przedstawiono na fig. 1A i 1B. Numeracja aminokwasów jest sekwencyjna. Stosując białkowe rejony zrębowe wskazane powyżej, zaprojektowano sekwencje DNA dla syntetycznych genów kodujących ludzkie rejony zrębowe z mysimi rejonami CDR. Te humanizowane domeny zmienne ciężkiego i lekkiego łańcucha określono odpowiednio hVH i hVL. Kodony zoptymalizowano dla zastosowania w E. coli i komórkach chomika. Kilka zachodzących oligonukleotydów (długości 69-90 zasad) wyrażających pełną długość hVL i hVH z dwoma krótkimi oskrzydlającymi starterami dla każdego łańcucha zastosowano, aby oddzielnie zsyntetyzować te dwa geny stosując rekursywną technikę PCR zasadniczo jak opisali Prodromou i In., (1992) Protein Eng 5(8): 827-9. Uzyskane fragmenty DNA prawidłowej długości oczyszczono na żelu, a następnie sklonowano do dwucistronowego plazmidu ekspresyjnego E. coli (oporne na ampicylinę). Ekspresja przeciwciał była kontrolowana przez promotor lacZ indukowany IPTG podobne do opisanej przez Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (patrz Vector pComb3X pCombSX, na str. 2,10), jednakże modyfikacje obejmowały dodanie i ekspresję następujących dodatkowych domen: ludzki łańcuch lekki kappa domeny stałej (patrz numer akcesyjny GenBank CAA09181) i domena stała CHI ludzkiej immunoglobuliny IgG2 (numer akcesyjny GenBank P01859). Sekwencje aminokwasowe rejonów zmiennych przeciwciała o wszczepionym CDR (określanego także jako „wzorzec”), określane jako 8L2-4D5, także przedstawiono na fig. 1A i 1B. Powinowactwo 8L2-4D5 określono stosując analizę BIAcore jak opisano powyżej . 8L2-4D5 wiązał się z ludzkim NGF z KD w przybliżeniu 38 nanomoli.

(2) wprowadzenie mutacji punktowej do sekwencji zrębowej. Substytucję V71K wprowadzono do łańcucha ciężkiego z wszczepionym CDR stosując rekombinacyjny PCR z ukierunkowaną mutagenezą jak opisali Innis i in., (1995) PCR strategies. San Diego, Academic Press. Ta substytucja zastąpiła ludzką resztę zrębową odpowiadającą jej mysią resztą zrębową. Uzyskane przeciwciało nazwano 8L2-6D5, a sekwencję aminokwasową rejonu zmiennego łańcucha ciężkiego 8L2-6D5 przedstawiono na fig. 1A. Powinowactwo 8L2-6D5 określono stosując analizę BIAcore jak opisano powyżej. Fragment Fab 8L2-6D5 wiąże się z ludzkim NGF z KD w przybliżeniu 15 nanomoli. 8L2-6D5 wybrano jako wzorzec do dojrzewania powinowactwa.

(3) humanizowanie i dojrzewanie powinowactwa rejonów CDR L1, L2, H1 i H2.

Rejony CDR L1, L2, H1 i H2 poddano humanizowaniu i dojrzewaniu powinowactwa. Pozycje aminokwasowe w rejonach CDR L1, L2, H1, i H2 zidentyfikowano jako niezbędne dla struktury rejonów CDR w oparciu o kanoniczną strukturę Chotia (patrz Al-Lazikani i in. (1997) J. Mol Biol 273(4): 927-48); i poddano randomizacji jak następuje. Przygotowano dwie biblioteki zawierające mutacje łańcucha lekkiego lub mutacje łańcucha ciężkiego przedstawione w tabeli 2, i odpowiednio wszczepione (mysie) CDR L3 lub CDR H3, stosując PCR z mutagenezą kasetową ze zdegenerowanymi oligonukleotydami jak opisali Kay i in. (1996), Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press, stosując kodony dopingowe jak opisali Balint i in., (1993) Gene 137(1): 109-18). Na ogół, reszty aminokwasowe zmieniano na reszty, które są bardziej powszechne w ludzkich przeciwciałach, na bazie dopasowań sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiegp przeciwciała 911 i sekwencji przeciwciał ludzkiej linii komórek rozrodczych. Reszta aminokwasowa typu dzikiego (niepodstawiona) także była reprezentowana w bibliotece za wyjątkiem

PL 215 171 B1 reszty 50 CDR H2, metioniny, jako że metionina typu dzikiego nie była reprezentowana w bibliotece. Reszty metioninowe są narażone na utlenianie; tak więc oczekuje się, że zastąpienie takiej reszty poprawi trwałość uzyskanego przeciwciała. Biblioteki fragmentów Fab sklonowano na wektor pComb3X plus ludzkie rejony CH1 i Ck, jak opisano powyżej.

T a b e l a 2

1. Biblioteka H1/H2 łańcucha ciężkiego:

CDR-H1

134 zmieniono na F, L, V, S, P, T, A, lub I N35 zmieniono na N, T, S, lub Y CDR-H2 M50 zmieniono na wszystkie 20 naturalne aminokwasy A62 zmieniono na A lub S

L63 zmieniono na L lub V 2.

2. Biblioteka L1/L2 łańcucha lekkiego CDR-L1

S26 zmieniono na S, A, V, lub F D28 zmieniono na D, A, S, lub Y H32 zmieniono na H-N, K, D, E, Q, lub Y CDR-L2

Y50 zmieniono na Y, D, A, lub S I51 zmieniono na I, T, A, lub V F54 zmieniono na F lub L S56 zmieniono na S i T

Dla doświadczeń klasyfikacji powinowactwa, każdą bibliotekę następnie sparowano z odpowiednim lekkim lub ciężkim łańcuchem z wszczepionym CDR (np. bibliotekę H1/H2 sparowano z łańcuchem lekkim z wszczepinym CDR), przeciwciało eksprymowano, i przeprowadzono skrining powinowactwa poszczególnych klonów do ludzkiego NGF z zastosowaniem systemu rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) BIAcore (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ) zgodnie z instrukcjami producenta i jak opisano powyżej. Określono koff, kon i KD. Klony przeciwciała sklasyfikowano na podstawie stopni koff, ponieważ na ogół większość zmian powinowactwa można zaobserwować na stopniach koff, a ponadto ponieważ stopnie koff są niezależne od stężenia przeciwciała.

Określono sekwencję klonów zdolnych do wiązania, a sekwencję klonów zdolnych do wiązania przedstawiono w tabeli 3.

T a b e l a 3: sekwencje aminokwasowe L1 i L2, sekwencje aminokwasowe H1 i H2, oraz dane kinetyczne dla klonów zdolnych do wiązania według skriningu powinowactwa klonów biblioteki H1/H2 lub L1/L2.

Mutanty CDR 1-2, dane kinetyczne
klony biblioteki łańcucha lekkiego sparowane z łańcuchem ciężkim	CDRL1 sekwencja aminokwasowa	CDRL2 sekwencja aminokwasowa	koff (s ¹)	*Kd (nanomole)
8L2-6D5 (kontrola)	RASQDISNHLN (SEQ ID nr: 12)	YISRFHS(SEQ ID nr: 13)	** 1e-3	25
L129	RASQSISNNLN	YTSRFHS	4, 5e-4	11
	(SEQ ID nr: 18)	(SEQ ID nr: 19)
L208	RASQYISNHLN (SEQ ID nr: 20)	YTSRFHS (SEQ ID nr: 21)	4, 6e-4	11
L97	RASQSISNQLN (SEQ ID nr: 22)	YVSRFHS (SEQ ID NR: 23)	5, 6e-4	14
L81	RAFQAISNQLN (SEQ ID nr: 24)	YISRFHT (SEQ ID nr: 25)	7, 4e-4	18
L6	RAFQSISNQLN (SEQ ID nr: 26)	YASRFHS (SEQ ID nr: 27)	8, 2e-4	20

PL 215 171 B1 cd. tabeli 3

biblioteka klonów łańcucha ciężkiego sparowana z łańcuchem lekkim 6D5	CDRH1 sekwencja aminokwasowa	CDRH2 sekwencja aminokwasowa	koff (s¹)	*Kd (nanomole)
8L2-6D5 (kontrola)	GFSLIGYDIN (SEQ. ID nr 9)	MIWGDGTTDYNSAL (SEQ ID nr: 10)	1e-3	25
H109	GFSL1GYDSN (SEQ ID nr: 28)	IIWGDGTTDYNSAL (SEQ ID nr: 29)	1, 6-e	4
H19	GFSLIGYDLN (SEQ ID nr: 30)	IIWGDGTTDYNSAV (SEQ ID nr: 31)	2, 4-e	6
H222	GFSLIGYDVT (SEQ ID nr: 32)	GIWGDGTTDYNSAV (SEQ ID nr: 33)	3,8e-4	9,5
H225	GFSLIGYDVT (SEQ ID nr : 34)	GIWGDGTTDYNSSV (SEQ ID nr: 35)	3, 8e-4	9,5
H18	GFSLIGYDAT (SEQ ID nr: 36)	GIWGDGTTDYNSAV (SEQ ID nr: 37)	4, 2e-4	10,5
H9	GFSLIGYDVS (SEQ ID nr: 38)	IIWGDGTTDYNSSV (SEQ ID nr: 39)	4, 1e-4	10,2
H227	GFSLIGYDIS	QIWGDGTTDYNSSV	5, 4e-4	13,5
	(SEQ ID nr: 40)	(SEQ ID nr: 41)
H17	GFSL1GYDAS (SEQ ID nr: 42)	GIWGDGTTDYNSSV (SEQ ID nr: 43)	6, 1e-4	15,2
H28	GFSLIGYDST (SEQ ID nr : 44)	SIWGDGTTDYNSAL (SEQ ID nr: 45)	7, 5e-4	18,7

aminokwasy pogrubione randomizowano jak wskazano powyżej *KD obliczono stosując kon 4e4 M^-1s^-1 **Dla wygody, stosowany tu „e” oznacza „x10”. Zatem, 4e4 wymiennie oznacza 4x10⁴.

Rejony CDR zawierające następujące substytucje zachowały wiązanie:

CDR-H1

I34: S, L, V, I i A związane.

N35: N, T i S związane.

CDR-H2

M50: M, I, G, Q, S, L związane.

A62: A i S związane.

L63: L i V związane.

CDR-L1

S26: S, i F związane.

D28: D, S, A, Y związane.

H32: H-N, Q związane.

CDR-L2

Y50: Y związane.

I51: I, T, V, A, związane.

F54: F związane

S56: S i T związane

Rejony CDR zawierające następujące substytucje wybrano na ogół na bazie powinowactwa wiązania i połączono w pojedynczy klon, nazwany H19-L129:

CDR-H1: 134L: N35N (brak zmiany)

CDR-H2: M501; A62A (brak zmiany); L63V

CDR-L1: S26S (brak zmiany); D28S; H32N

CDR-L2: Y50Y (brak zmiany); 15IT; F54F (brak zmiany); S56S (brak zmiany)

Te mutacje połączono (przez amplifikację łańcuchów H i L techniką PCR, przecinając produkty PCR i wektor (pRN8) enzymem restrykcyjnym i przeprowadzając ligację 3 fragmentów) w pojedynczy klon, nazwany H19-L129, który także zawierał wszczepione rejony CDR H3 i CDR L3. Sekwencję rejonów zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego H19-L129 przedstawiono na fig. 1A i 1B,

PL 215 171 B1 a tabela 4 przedstawia sekwencję aminokwasową rejonów CDR L1, L2, H1 i H2. H19-L129 wiązał się z NGF z KD w przybliżeniu 1 nanomol, co określa się stosując analizę BIAcore jak to tu opisano.

T a b e l a 4: Sekwencja aminokwasowa rejonów CDR H1, H2, L1 i i L2 i dane kinetyczne dla połączonego klonu H19-L129.

Połączony klon: mutacje w rejonach CDR H1, H2, L1, L2	CDRL1 CDRH1 sekwencja aminokwasowa	CDRL2 CDRH2 sekwencja aminokwasowa	koff (s^-1)	*Kd (nanomole)
H19-L12 9	CDR-L1: RASQSISNNLN (SEQ ID nr: 18) CDR H1: GFSL1GYDLN (SEQ ID nr: 30)	CDRL2: YTSRFHS (SEQ ID nr: 19) CDR-H2: IIWGDGTTDYNSAV (SEQ ID nr: 31)	1,1e-4	3,5

*KD obliczono stosując kon 4e4 M^-1s^-1 (4) Dojrzewanie powinowactwa rejonów CDR H3 i L3. Dojrzewanie powinowactwa rejonów CDR H3 i L3 prowadzono w dwóch etapach. Najpierw, w procesie zwanym „mutageneza z przeszukiwaniem biblioteki”, każdą resztę aminokwasową w H3 i L3 indywidualnie poddano wstępnemu skriningowi w celu identyfikacji pozycji aminokwasowych, w których mutacja powodowała zwiększenie powinowactwa wiązania do ludzkiego NGF. Na bazie wyników mutagenezy z przeszukiwaniem biblioteki (także określanej jako „analiza randomizowanej małej biblioteki”), podzbiór pozycji aminokwasowych w H3 i L3 wybrano do otrzymywania biblioteki o dojrzałym powinowactwie, i bibliotekę o dojrzałym powinowactwie poddano skriningowi pod kątem powinowactwa do ludzkiego NGF stosując analizę BIAcore jak to tu opisano. Należy docenić, że te techniki można na ogół stosować.

(a) Mutageneza z przeszukiwaniem biblioteki

Każdą pozycję aminokwasową w rejonach CDR H3 i L3 poddano indywidualnemu wstępnemu skriningowi pod kątem substytucji, które powodowały zwiększenie powinowactwa wiązania z ludzkim NGF. Częstotliwość substytucji aminokwasowych w dowolnej danej pozycji, które powodowały poprawę wiązania, nie zmieniały wiązania, pogarszały wiązanie lub powodowały brak wiązania dostarczała informacji odnośnie pozycji w rejonach CDR, które można zmieniać na wiele różnych aminokwasów (w tym wszystkich 20 aminokwasów), i pozycji w rejonach CDR, których nie można zmieniać lub które można zmieniać tylko na kilka aminokwasów. Zidentyfikowano także substytucje aminokwasowe prowadzące w efekcie do zwiększenia powinowactwa wiązania. Na podstawie wyników tego przeszukiwania, podzbiór pozycji aminokwasowych w rejonach CDR H3 i L3 wybrano do otrzymywania biblioteki o dojrzałym powinowactwie.

Wytworzono indywidualne biblioteki Fab, w których każdy aminokwas rejonów CDR L3 i H3 losowo podstawiano wszystkimi 20 aminokwasami, jednym na raz, prowadząc w efekcie do kilku (5 bibliotek dla łańcucha lekkiego i 13 bibliotek dla łańcucha ciężkiego) małych bibliotek, każdej złożonej z 20 aminokwasowych możliwości w każdej pozycji aminokwasowej. We wszystkich przypadkach, natywny (tj. niezmieniony) aminokwas był reprezentowany w bibliotece. Biblioteki wytworzono przez PCR z mutagenezą kasetową ze zdegenerowanymi oligonukleotydami jak opisali Kay i in. (1996), Phage display of Peptides and Proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press, stosując kodon dopingowy NNK do randomizacji jednej pozycji aminokwasowej tak by obejmowała 20 możliwych aminokwasów. 8L2-6D5 (przeciwciało z wszczepionym CDR, mającym mutację rejonu zrębowego V71K) służyło jako wzorzec do konstrukcji biblioteki, ponieważ niższe powinowactwo przeciwciała z wszczepionym CDR pozwalało na łatwiejsze wykrywanie różnic powinowactwa mutantów H3 i L3 podczas przeszukiwania. Zatem każdy element biblioteki zawierał CDR3 (albo H3 lub L3) z substytucją jednego aminokwasu, oraz 5 wszczepionych rejonów CDR.

20-80 klonów z każdej małej biblioteki poddano skriningowi z zastosowaniem analizy BIAcore jak to tu opisano. Próbki jednocześnie zanalizowano metodą BIAcore pod kątem powinowactwa wiązania do NGF w jednym kanale chipu BIAcore i na obecność Fab przez wiązanie z przeciwciałem znakowanym pięcioma resztami His w innym kanale wykrywającego chipu, w celu wykrycia znacznika his na C-końcu łańcucha ciężkiego. Klony, które eksprymowały białko sklasyfikowano jako mające takie samo powinowactwo, gorsze powinowactwo, lepsze powinowactwo lub wykazujące brak wiązania, do klasyfikacji wykorzysując koff. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 5.

PL 215 171 B1

T a b e l a 5. Klony eksprymujące białko sklasyfikowno jako mające takie samo powinowactwo, gorsze powinowactwo, lepsze powinowactwo lub wykazujące brak wiązania, na podstawie koff.

	Mutacja	Lepsze 1e-3	Takie samo >1e-3, 2e-3<	Gorsze >2e-3	Brak wiązania	Procent aminokwasów utrzymujących zdolność wiązania
Łańcuch lekki
	L_S91X		40%	20%	26%	50%
	L_K92X	13%	100%			około 100%
	L_T93X		93%	7%		93%
	L_L94X		40%	60%		40%
	L_Y96X		13%	80%	7%	13%
Łańcuch ciężki
	H_G98X		50%	37%	13%	50%
	H_G99X		46%	54%		46%
	H_Y100X		26%		73%	26%
	H_Y101X	6%		12%	82%	6%

	H_Y102X		7%	25	68%	7%
	H_G103X	4%	21%	16%	58%	25%

	H_T104X		20%	30%	50%	20%
	H_S105X	10%	25%	26%	39%	35%
	H_Y106X		75%	25%		75%
	H_Y107X		8%	46%	46%	8%
	H_F108X		23%	27%	50%	23%
	H_D109X		29%	46%	25%	29%
	H_Y110X		90%	5%	5%	90%

Określono sekwencję wszystkich klonów o poprawionym powinowactwie, ujawniając częstotliwość i identyczność substytucji aminokwasowych, powodujących zwiększenie powinowactwa. Ponadto z każdej biblioteki wybrano kilka klonów, które zachowały podobne powinowactwo do klonu 812-6D5, w celu stwierdzenia, jakie substytucje sekwencji aminokwasowej były dozwolone w danej pozycji, chociaż substytucja nie koniecznie zwiększała powinowactwo wiązania. Wyniki tej analizy podsumowano w tabeli 6.

T a b e l a 6

Mutacje CDRH3 (wzorzec 8L2-6D5, obejmujący sekwencję aminokwasową przeciwciała 911 CDR-H3: GGYYYGTSYYFDY (SEQ ID nr: 11)	koff (s^-1) 1e-3	Kd* (nanomole) 25
Y100L	1, 2e-3	30
Y100R	1, 1e-3	27
Y101W	5, 6e-4	14
G103A	1, 6e-4	4

PL 215 171 B1 cd. tabeli 6

T104S	2,2e-3	55
S105A	5,1e-4	13
S105T	6,4e-4	16
Y106R	1,6e-3	40
Y106T	2,0e-3	50
Y106M	2,7e-3	67
Y107F	1,4e-3	35
F108W	1,22e-3	30
D109N	1,5e-3	37
D109G	1e-3	25
Y110K	1,4e-3	35
Y110S	1,5e-3	37
Y110R	1,6e-3	40
Y110T	1,7e-3	42
Mutacje CDR L3 (wzorzec 8L2-6D5, obejmujący sekwencję aminokwasową CDR-L3 typu dzikiego (niepodstawioną): QqSKTLPYT (SEQ ID nr: 14)	koff (s^-1) 1e-3	Kd* (nanomole) 25
S91E	2,5e-4	6
Y96R	1,7e-3	42

*KD obliczono stosując kon 4e4 M^-1s^-1

Kilka mutacji powodowało zwiększenie powinowactwa wiązania. Przynajmniej następujące mutacje powodowały znaczne zwiększenie powinowactwa wiązania w porównaniu z wzorcem 8L2- 6D5: (H_Y101W (sekwencja CDR GGYWYGTSYYFDY (SEQ ID nr: 46)); H_S105A (sekwencja CDR GGYYYGTAYYFDY (SEQ ID nr: 47)); H_S105T (sekwencja CDR GGYYYGTTYYFDY (SEQ ID nr: 48)); H_G103A (sekwencja CDR GGYYYATSYYFDY (SEQ ID nr: 49); i L_S91E (sekwencja CDR QQEKTLPYT (SEQ ID nr: 50)).

Wyniki tego doświadczenia wykorzystano do kierowania wyborem pozycji aminokwasowych do wytwarzania biblioteki o dojrzałym powinowactwie.

To doświadczenie dostarczyło także informacji dotyczącej częstotliwości substytucji aminokwasowych w dowolnej danej pozycji, które powodowały poprawę wiązania, nie zmieniały wiązania, pogarszały wiązanie lub powodowały brak wiązania, jak przedstawiono w tabeli 5. Ta informacja pozwoliła na identyfikację pozycji aminokwasowych w rejonach CDR, które można zmienić na wiele różnych aminokwasów (obejmujących wszystkie 20 aminokwasów), i pozycji w rejonach CDR, które można zmienić na kilka aminokwasów lub bardzo niewiele aminokwasów (w pewnych rozwiązaniach, na żadne aminokwasy). Te wyniki wskazały także substytucje aminokwasowe, które zwiększały powinowactwo wiązania.

(b) Dojrzewanie powinowactwa

Następnie, te wyniki analizy randomizacji małej biblioteki (powyżej) wykorzystano do wybrania reszty do produkcji bibliotek H3 i L3 do dojrzewania powinowactwa rejonów CDR H3 i L3. Reszty Y101 i G103 CDR H3 i reszty S91 i K92 CDR L3 wybrano do stworzenia biblioteki H3 i L3 do dojrzewania powinowactwa rejonów CDR H3 i L3.

Ta biblioteka połączyła jednocześnie mutacje w H3 i L3 w klonie 8L2-6D5 z wszczepionym CDR, i oddzielnie w tle H19-L129, i zawierała rozmaitość 80 różnych klonów. W tabeli 7 wskazano reszty aminokwasowe wybrane do substytucji i aminokwasy, które podstawiono w każdej pozycji.

T a b e l a 7. Reszty aminokwasowe w H3 i L3 wybrane do substytucji i aminokwasy, które podstawiono w każdej pozycji CDR-H3:

Y101 zmieniono na Y i W, C. (Należy zwrócić uwagę, że C włączono, ponieważ zastosowanie kodonu TRS w jednym zdegenerowanym oligonukleotydzie wytwarzało także kodon C).

G103 zmieniono na A, P, S

CDR-L3:

S91 zmieniono na E.

K92 zmieniono na wszystkie dwadzieścia aminokwasów.

PL 215 171 B1

A, R, K i H związane.

Każdy polipeptyd eksprymowano jako Fab, i dla każdej biblioteki 96 poszczególnych klonów poddano skriningowi pod kątem powinowactwa do ludzkiego NGF, z zastosowaniem analizy BIACORE zgodnie z instrukcjami producenta i opisano powyżej. Wyniki tej analizy przedstaiono w tabeli 8.

T a b e l a 8

Kombinacja mutacji CDR L3 H3 (wzorzec 8L2-6D5)	koff (s ¹) 1e-3	Kd* (nanomole) 25
L S91E; LJC92A (sekwencja CDR QQEATLPYT (SEQ ID nr: 51)) H Y101W; H G103A (sekwencja CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID nr: 52))	5,5e-4	13
L S91E; L K92R (sekwencja CDR QQERTLPYT (SEQ ID nr: 53)) H Y101W; H G103A (sekwencja CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID nr: 54))	1,0e-4	25
kombinacja mutacji CDR L3 H3 (H19-L129 wzorzec, H1H2L1L2 o dojrzałym powinowactwie)	koff (s ¹) 1,1e-4	Kd* (nanomole
L S91E; L K92H (sekwencja CDR QQEHTLPYT (SEQ ID nr: 55)) H Y101W; H G103A sekwencja CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID nr: 56)) (klon E3))	1,2e-5	0,3
L_S91 E; L_K92S (sekwencja CDR QQESTLPYT (SEQ ID nr: 57)) H Y101W; H G103S (sekwencja CDR GGYWYSTSYYFDY (SEQ ID nr: 58))	4,7e-5	1,1
LJS91E; L_K92K (sekwencja CDR QQEKTLPYT (SEQ ID nr: 59)) H Y101Y; H G103A (sekwencja CDR GGYYYATSYYFDY (SEQ ID nr: 60))	2e-5	0,5
L_S91E; L_K92R (sekwencja CDR QQERTLPYT (SEQ ID nr: 61)) H Y101W; H G103A (sekwencja CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID nr: 62)) (klon 3C)	1,4e-5	0,35
L_S 91E; L_K92R (sekwencja CDR QQERTLPYT (SEQ ID nr: 63)) H_Y101Y; H_G103A (sekwencja CDR GGYYYATSYYFDY (SEQ ID nr: 64))	1,5e-5	0,37

*KD obliczono stosując kon 4e4 M^-1s^-1

Na podstawie powinowactwa wiązania, wybrano najlepsze klony E3 (określane zamiennie jako „3E”) i 3C do późniejszegc scharakteryzowania. E3 zawierało następujące substytucje CDR: CDR-H3: Y101W, G103A; i CDR-L3: S91E, K92H, które połączono w pojedynczy klon, który zawierał także następujące mutacje L1, L2, H1 i H2:

CDR-H1; I34L;

CDR-H2: M50I: L63V;

CDR-L1: D28S: H32N:

CDR-L2: I51T.

Sekwencję rejonów zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego E3 przedstawiono na fig. 1A i 1B. 3C zawierał następujące substytucje CDR: CDR-L3: S91E; K92R; CDRH3: Y101W; G103A, które połączono w jeden klon, który zawierał także mutacje L1 L2, H1 i H2 opisane dla klonu 3E.

Sekwencje 3E i 3C wklonowano do ssaczych wektorów ekspresyjnych w celu produkcji Fab i pełnego przeciwciała, i eksprymowano w komórkach HEK293 i oczyszczono stosując chromatografię NiNTA lub białka A. Czyste białko dokładnie oznaczono ilościowo stosując analizę aminokwasową.

PL 215 171 B1

Powinowactwa wiązania z ludzkim NGF fragmentów Fab E3 i 3C zmierzono stosując analizę BIAcore zgodnie z instrukcjami producenta i jak opisano powyżej, z tym wyjątkiem, że na chip użyto 100 RU NGF, aby zapobiec efektowi powtórnego wiązania. W skrócie, kilka stężeń przeciwciał (fragmentów Fab) wstrzykiwano przez 2 minuty na chip CM5 ze 100 RU unieruchomionego na nim ludzkiego NGF, i pozwolono na dysocjację przez 1800 sekund. Mysie przeciwciało 911 (Fab) zanalizowano jako kontrolę. Dane zanalizowano stosując oprogramowanie BIAevaluation postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki analizy przeciwciał E3 i 911 przedstawiono na fig. 9 i 10. E3 wiązało ludzki NGF z KD w przybliżeniu -1 -1 -1

0,07 nanomola (i z kon około 6,0 e5 M^-1s^-1, i koff około 4,2e-5 s^-1). 3C wiązało ludzki NGF z KD w przybliżeniu 0,35 nanomola (z koff około 1,4E-5). Dla odmiany mysie przeciwciało 911 wiązało NGF z KD 3,7 nM, koff 8,4x10^-1s^-1 i k_on 2,2x10⁴Ms^-1.

Przeciwciało E3 (określane zamiennie jako 3E) wybrano do późniejszej analizy na podstawie wysokiego powinowactwa wiązania. W celu przetestowania zdolności E3 do zapobiegania interakcji pomiędzy NGF a receptorami NGF trkA i p75, 2,5 nanomola ludzkiego NGF wstępnie zmieszano i inkubowano przez jedną godzinę z 0 do 50 nanomolami przeciwciała E3 (Fab). Po inkubacji, próbki wstrzykiwano przy μί/minutę do chipu CM5 BIAcore zawierającego 260 RU p75 (kanał 2) i 600 RU trkA (kanał 3), i określono procent wiązania. Wyniki tej analizy przedstawiono na fig. 11. Rosnące stężenia Fab E3 blokowały interakcję pomiędzy NGF zarówno z p75 jak i z trkA, jak wykazano przez zmniejszenie sygnału (zmierzonego w RU), wskazując, że Fab E3 blokuje interakcję ludzkiego NGF z trkA i z p75. Gdy stężenie przeciwciała E3 (Fab) równoważyło stężenie NGF (przy stężeniu NGF około 2,5 nM), nie zaobserwowano wiązania z NGF (jak wykazano na podstawie sygnału wynoszącego zero). Fakt, że zerowy procent wiązania z receptorem NGF wystąpił, gdy stężenie NGF było równe stężeniu przeciwciała 3E sugerował, że 2,5 nanomola NGF było co najmniej dziesięciokrotnie wyższe niż KD E3 dla NGF i w równowadze.

P r z y k ł a d 2: oszacowanie zdolności przeciwciał anty-NGF do blokowania NGF, z zastosowaniem testu przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5.

Zdolność Fab E3 lub przeciwciała E3 pełnej długości do blokowania aktywności NGF oszacowano przez pomiar skuteczności hamowania zależnego od NGF przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 przez przeciwciało in vitro. Zwój nerwu trójdzielnego składa się ze skórnych neuronów czuciowych, które unerwiają rejon twarzowy. Przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 jest czułym testem do oceny blokowania aktywności NGF przez antagonistyczne przeciwciała anty-NGF, ponieważ NGF jest wymagany do wspomagania przeżywania tych neuronów. Na przykład przy wysycających stężeniach NGF, przeżywanie jest bliskie 100% przez 48 godzin w hodowli. Dla odmiany poniżej 5% neuronów przeżywa przez 48 godzin przy braku NGF.

Test przeżywania przeprowadzono następująco: zapłodnione w konkretnym czasie ciężarne samice myszy Swiss Webster uśmiercono przez inhalację CO2. Rogi macicy usunięto, a embriony w stadium embrionalnym E13,5 wyjęto i zdekapitowano. Zwoje nerwu trójdzielnego wypreparowano stosując elektronicznie ostrzone igły wolframowe. Następnie zwoje poddano działaniu trypsyny, mechanicznie rozdzielono i wysiano na płytkę przy gęstości 200-300 komórek na studzienkę w określonym, niezawierającym surowicy podłożu w 96-dołkowych płytkach powlekanych poli-L-ornityną i lamininą.

Blokującą aktywność fragmentów Fab anty-NGF lub przeciwciał anty-NGF oszacowano przez dodanie do trójdzielnych neuronów w zmiennych dawkach przeciwciała anty-NGF Mab 911 (Fab), 8L2-6D5; H19-L129; E3 i 3C; i ludzkiego lub szczurzego NGF w następujących stężeniach: 0,4 ng/ml (około 15 pikomoli; to stężenie stanowiło stężenie wysycające NGF dla przeżywania) i 0,04 ng/ml (około 1,5 pikomola; to stężenie w przybliżeniu stanowiło IC50). Po 48 godzinach w hodowli, komórki poddano zautomatyzowanemu protokołowi immunocytochemii, przeprowadzonemu z zastosowaniem systemu dozowania cieczy Biomek FX (Beckman Coulter) następująco: utrwalanie z zastosowaniem 4% formaldehydu, 5% sacharozy, i PBS; permeabilizacja z zastosowaniem 0,3% Triton X-100 w PBS); blokowanie miejsc niespecyficznego wiązania z zastosowaniem 5% zwyczajnej surowicy koziej, 0,11% BSA w PBS; i kolejna inkubacja z pierwszorzędowym i drugorzędowym przeciwciałem w celu wykrywania neuronów. Pierwszorzędowe przeciwciało było króliczym poliklonalnym przeciwciałem przeciw białkowemu produktowi genu 89,5 (PGP9,5, Chemicon), ustalonemu neuronalnemu markerowi fenotypowemu. Drugorzędowym przeciwciałem było kozie przeciwciało skierowane przeciw królikowi Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit (Molecular Probes), wraz z jądrowym barwnikiem Hoechst 33342 (Molecular Probes), aby wyznakować jądra wszystkich komórek obecnych w hodowli. Otrzymywanie i analizę obrazu przeprowadzono na Discovery-I/GenII Imager (Universal Imaging Corporation). Obrazy uzyskano automatycznie przy dwóch długościach fal dla Alexa Fluor 488 i Hoechst 33342, przy czym znakowanie jądrowe wykorzystano jako punkt odniesienia dla systemu image-based auto-focus układu kształtowania obrazu, ponieważ wybarwienie jądrowe występuje

PL 215 171 B1 we wszystkich studzienkach. Odpowiednie obiektywy i liczbę odwzorowanych miejsc na studzienkę wybrano tak, by objąć całą powierzchnię każdej studzienki. Zautomatyzowana analiza obrazu była nastawiona na zliczenie liczby neuronów występujących w każdej studzience po 48 godzinach w hodowli, w oparciu o ich specyficzne znakowanie z zastosowaniem przeciwciała anty-PGP9,5. Ostrożne progowanie obrazu i zastosowanie morfologii i intensywności fluorescencji w oparciu o filtr selektywności umożliwiło dokładne zliczenie neuronów na studzienkę.

Wyniki tego doświadczenia wskazują, że Fab E3 blokował aktywność NGF z wysokim powinowactwem. Wyniki przedstawiono na fig. 4-6, oraz w tabeli 9.

Fig. 4 przedstawia wykres obrazujący zależne od NGF przeżywanie neuronów E13,5 w obecności zmiennego stężenia ludzkiego i szczurzego NGF.

Fig. 5 przedstawia wykres obrazujący porównanie blokującego wpływu na NGF różnych fragmentów Fab w obecności albo 0,04 ng/ml ludzkiego NGF (w przybliżeniu 1,5 pikomola; przedstawione na dolnym panelu) albo 0,4 ng/ml ludzkiego NGF (w przybliżeniu 15 pikomoli; przedstawione na górnym panelu). 1,5 pikomola NGF stanowiło w przybliżeniu EC50 NGF wzmacniającego przeżywanie, podczas gdy 15 pikomoli reprezentowało stężenie wysycające NGF. Przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 w różnych stężeniach Fab E3; mysiego Fab 911; oraz Fab H19-L129 i Fab 8L2-6D5 oszacowano jak opisano powyżej. Wartości IC50 (w pikomolach) obliczono dla każdego Fab przy każdym stężeniu NGF, i przedstawiono w tabeli 9. Fab E3 silnie blokował zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego, przy IC50 w przybliżeniu 21 pikomoli w obecności 15 pikomoli ludzkiego NGF, i IC50 w przybliżeniu 1,2 pikomola w obecności 1,5 pikomola ludzkiego NGF. Fragmenty Fab 3C i H19-L129 także silnie blokowały zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego.

Fig. 6 jest wykresem porównującym wpływ blokujący na NGF różnych fragmentów Fab w obecności albo 0,04 ng/ml szczurzego NGF (w przybliżeniu 1,5 pikomola; przedstawione na dolnym panelu) lub 0,4 ng/ml szczurzy NGF (w przybliżeniu 15 pikomoli; przedstawione na górnym panelu). 1,5 pikomola NGF stanowiło w przybliżeniu EC50, podczas gdy 15 pikomoli reprezentowało stężenie wysycające NGF. Przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E13,5 w różnych stężeniach Fab E3; mysiego Fab 911; oraz Fab H19-L129 i 8L2-6D5 oszacowano jak opisano powyżej. Wartości EC50 (w pikomolach) obliczono dla każdego Fab przy każdym stężeniu NGF, i przedstawiono w tabeli 9. Fab E3 silnie blokował zależne od ludzkiego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego, przy IC50 w przybliżeniu 31,6 pikomola w obecności 15 pikomoli szczurzego NGF, i IC50 w przybliżeniu 1,3 pikomola w obecności 1,5 pikomola szczurzego NGF. Fragmenty Fab 3C i H19-L129 także silnie blokowały zależne od szczurzego NGF przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego.

T a b e l a 9

Ludzki NGF	IC50 (w obecności 15 pikomoli NGF)	IC50 (w obecności 1,5 pikomola NGF)

	pikomole	pikomole
Fab 8L2-6D5	1580,5	461,8
Fab H19-L129	60,1	9,6
Fab 3E	<21,0	<1,2
Fab 3C	80,9	5,6
Fab 911	322,3	63, 5

Szczurzy NGF	IC50 (15 pikomoli NGF)	IC50 (1,5 pikomola NGF)

	pikomole	pikomole
Fab 8L2-6D5	730,3	169,4
Fab Hl9-L129	31,0	6,0
Fab 3E	<8,3	<1,3
Fab 3C	31,6	6,0
911 Fab	161,0	34,6

PL 215 171 B1

W różnych doświadczeniach, porównywano zdolność przeciwciała E3 pełnej długości i Fab 3E do hamowania zależnego od NGF przeżywania neuronów E13,5 w obecności 0,4 ng/ml (wysycające stężenie) ludzkiego NGF. Wyniki analizy przedstawiono na fig. 12. Przeciwciało E3 pełnej długości i Fab 3E wykazały podobny poziom hamowania zależnego od NGF przeżywania, gdy stężenie całego przeciwciała i Fab znormalizowano dla liczby miejsc wiążących dla NGF (Fab ma jedno miejsce wiążące, a całe przeciwciało ma dwa miejsca wiążące). Te wyniki wykazały, że wiązanie przeciwciała pełnej długości do dimeru NGF nie miało wpływu na zachłanność.

W innych doświadczeniach porównywano zdolność przeciwciała E3, przeciwciała 911, i receptora immunoadhezynowego trkA (składającego się z zewnątrzkomórkowej domeny receptora NGF trkA połączonej z immunoglobulinową domeną Fe, CH2-CH3) w różnych stężeniach (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128, i 0,0 nM) do hamowania zależnego od NGF przeżywania neuronów E13,5 w obecności 0,4 ng/ml (warunki wysycające). Te wyniki przedstawiono na fig. 13. Wyniki te wskazują, że przeciwciało E3 blokuje NGF lepiej niż zarówno przeciwciało 911 jak i immunoadhezyna trkA.

P r z y k ł a d 3: Oszacowanie specyficzności przeciwciała anty-NGF E3 z zastosowaniem testów przeżywania neuronów mysiego nerwu trójdzielnego i neuronów zwoju dolnego nerwu błędnego.

Zdolność przeciwciała E3 do specyficznego blokowania aktywności NGF oszacowano przez pomiar wydajności hamowania przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego myszy E17/18 przeciwciała in vitro w obecności wysycającego stężenia NGF, NGF-pokrewnej neurotrofiny NT3, lub niespokrewnionego z NGF czynnika neurotroficznego, białka stymulującego makrofagi (MSP). Przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego myszy E17/18 jest czułym testem oceny aktywności blokującej NGF antagonistycznych przeciwciał anty-NGF, ponieważ NGF jest wymagane do wspomagania przeżycia tych neuronów w większych stężeniach, niż poziom NGF wymagany do wspomagania przeżywania neuronów E13,5 TG). Przeżycie tych neuronów jest także wspomagne przez NT3 lub MSP; zatem, przeżycie tych neuronów jest także wrażliwym testem do oceny, czy antagonistyczne przeciwciało anty-NGF blokuje także NT3 lub MSP.

Zdolność przeciwciała E3 do specyficznego blokowania aktywności NGF oszacowano także przez pomiar zdolności przeciwciała do hamowania przeżywania neuronów zwoju dolnego nerwu błędnego myszy E17 w obecności wysycającego stężenia BDNF lub NT4/5. Przeżycie neuronów zwoju dolnego nerwu błędnego jest wspomagane przez BDNF lub NT4/5; a zatem, przeżywanie tych neuronów jest czułym testem do oceny zdolności antagonistycznego przeciwciała anty-NGF do blokowania BDNF lub NT4/5.

Test przeżywania prowadzono następująco: zapłodnione w konkretnym czasie ciężarne samice myszy Swiss Webster uśmiercano przez inhalację CO2. Rogi macicy usunięto i embriony (w 17 lub 18 dniu rozwoju embrionalnego) wyjęto i zdekapitowano. Zwoje nerwu trójdzielnego i zwój dolny nerwu błędnego wypreparowano i oczyszczono. Następnie zwoje poddano trypsynizacji, rozdzielono mechanicznie i wysiano na płytki przy gęstości 100-300 komórek na studzienkę w określonym, nie zwierającym surowicy podłożu w 4-dołkowych płytkach (Greiner) powlekanych poli-L-ornityną i lamininą.

Neurony nerwu trójdzielnego E17/18 hodowano albo bez dodania czynników neurotroficznych (kontrola negatywna) lub w obecności wysycającego stężenia ludzkiego NGF (400 pikomoli i 15 pikomoli) (kontrola pozytywna); NT3 (400 pikomoli); lub MSP (600 pikomoli). Nastawiono podwójne hodowle, które zawierały zmienne stężenia fragmentów Fab E3 i 911 i pełnego przeciwciała. Stężenie Fab i pełnego przeciwciała wskazano w przeliczeniu na miejsce wiążące (np. pełne przeciwciało zawiera dwa miejsca wiążące, natomiast Fab zawiera jedno miejsce wiążące).

Neurony zwoju dolnego nerwu błędnego E17 hodowano albo bez dodatku czynników neurotroficznych (kontrola negatywna), lub z wysycającym stężeniem BDNF (400 pikomoli) (kontrola pozytywna) lub NT4/5 (400 pikomoli) lub niespokrewnionego z NGF czynnika wzrostu ILF (interleukinowy czynnik hamujący). Stosowano wysokie stężenia neurotrofin, ponieważ celem tego doświadczenia było zbadanie specyficzności przeciwciał. Nastawiono podwójne hodowle, które zawierały różne warianty ponownie z dodatkiem i bez dodatku przeciwciał E3 i 911. Po 48 godzinach w hodowli, całkowitą liczbę neuronów, które przeżyły w każdej studzience w każdych z warunków potwierdzono przez ręczne zliczanie stosując mikroskop z kontrastem fazowym.

Wyniki tych doświadczeń wskazują, że przeciwciała E3 i 911 całkowicie blokują wzmacniający przeżywalność wpływ NGF na neurony nerwu trójdzielnego E18. Dla odmiany, przeciwciała

PL 215 171 B1

E3 i 911 nie miały wpływu na przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego promowane przez NT3 lub MSP, lub przeżywanie neuronów zwoju dolnego nerwu błędnego promowane przez BDNF lub NT4/5 lub LIF. Wyniki te wskazują, że przeciwciało E3 posiada selektywną swoistość dla NGF, jako że nie występowała wykrywalna interakcja pomiędzy tymi przeciwciałami i innymi neurotrofinami spokrewnionymi z NGF (NT3, NT4/5, BDNF) przy stężeniach 1000-krotnie do 10000-krotnie wyższych niż stężenie skutecznie blokujące NGF. Ponadto wyniki te wykazały, że śmierć neuronów obserwowana w uzupełnionych o NGF hodowlach neuronów zależnych od NGF, przy dodaniu przeciwciała lub Fab E3 była spowodowana specyficzną interakcją pomiędzy tymi przeciwciałami i NGF i nie była spowodowana ogólną toksycznością. Badano także mysie antagonistyczne przeciwciało anty-NGF 911, i zaobserwowano podobne wyniki. Należy zwrócić uwagę, że z uwagi na zastosowane wysokie stężenia neurotrofin, zarówno przeciwciało E3 jak i 911 są bardzo zbliżone do ich warunków miareczkowania i oczekuje się, że będą wiązać NGF na podobnych poziomach, ponieważ różnice w powinowactwie wiązania tych przeciwciał z NGF powinny być mniej widoczne w tych warunkach.

Wyniki tych doświadczeń przedstawiono na fig. 14, 15, 16, i 17. Dane wskazały średni procent przeżywania po 48 godzinach w hodowli (± standardowy błąd średniej, n=3 dla każdego punktu pomiaru) w stosunku do przeżwania obserwowanego w kontroli pozytywnej dla każdego doświadczenia (odpowiednio np. 100% przeżywania neuronów nerwu trójdzielnego rosnących w obecności wysycającego stężenia NGF, i 100% przeżywania neuronów zwoju dolnego nerwu błędnego rosnących w obecności wysycającego stężenia BDNF). Fig. 14-15 przedstawiają wykresy wskazujące, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF E3 lub Fab E3 nie hamują przeżywania promowanego przez NT3, i MSP, nawet przy stężeniach przeciwciała tak wysokich jak 200 nanomoli. Dla odmiany, 20 nanomoli przeciwciała E3 lub Fab 3E i Fab 911 całkowicie blokowało przeżywanie wywołane NGF. Badano także mysie antagonistyczne przeciwciało anty-NGF 911, i zaobserwowano podobne wyniki. Szczególnie fig. 14 przedstawia wykres obrazujący porównanie wpływu Fab E3 (oznaczenie „3E” na fig.) i Fab mysiego przeciwciała 911 w różnych stężeniach (20nM, 2nM, lub 0,2nM) na przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego E18 bez dodawania neurotrofiny (oznaczenie „kontrola), w obecności 400 pikomoli NGF (oznaczenie „NGF-400 pikomoli), 10 nanomoli NT3 (oznaczenie „NT3-10 nanomoli”) lub 600 pikomoli MSP (oznaczenie „MSP-600 pikomoli). Fig. 15 przedstawia wykres obrazujący porównanie wpływu Fab i pełnego przeciwciała E3 i mysiego pełnego przeciwciała i Fab 911 w różnych stężeniach (200nM i 80nM) na przeżywanie neuronów nerwu trójdzielnego E17 bez dodania neurotrofin (oznaczenie „brak czynnika), w obecności 400 pikomoli NGF (oznaczenie „NGF-400 pikomoli”), 10 nanomoli NT3 (oznaczenie „NT3-10 nanomoli”) lub 600 pikomoli MSP (oznaczenie „MSP-600 pikomoli”).

Fig. 16-17 przedstawiają wykresy wskazujące, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF E3 lub Fab E3 nie hamowały przeżywania neuronów zwoju dolnego nerwu błędnego E17, promowanego przez BDNF, NT4/5 lub LIF. Badano także mysie antagonistyczne przeciwciało anty-NGF 911, i zaobserwowano podobne wyniki. Szczególnie fig. 16 przedstawia wykres obrazujący porównanie wpływu przeciwciała E3 pełnej długości (oznaczenie „3E na fig.), Fab E3, przeciwciała 911 pełnej długości, lub Fab 911 w różnych stężeniach (200 nanomoli lub 80 nanomoli) na przeżywanie E17 neuronów zwoju dolnego nerwu błędnego bez dodatku neurotrofin (oznaczenie „brak czynników), w obecności 400 pikomoli BDNF (oznaczenie „BDNF-400 pikomoli”), 400 pikomoli NT4/5 (oznaczenie „NT4/5-400 pikomoli) lub 2,5 nanomola LIF (oznaczenie „LIF-2,5 nanomola). Fig. 17 przedstawia wykres obrazujący porównanie wpływu Fab E3 (oznaczenie „3E” na fig.), lub Fab 911 w różnych stężeniach (200 nanomoli, 20 nanomoli, 2 nanomole) na przeżywanie neuronów zwoju dolnego nerwu błędnego E17 bez dodatku neurotrofin (oznaczenie „kontrola”), w obecności 400 pikomoli BDNF (oznaczenie „BDNF-400 pikomoli), 400 pikomoli NT4/5 (oznaczenie „NT4/5-400 pikomoli), lub 2,5 nanomola LIF (oznaczenie „LIF-2,5 nanomola).

P r z y k ł a d 5: Wytwarzanie ssaczych wektorów ekspresyjnych i ekspresja przeciwciała E3 w ssaczych komórkach.

Trzy ssacze wektory ekspresyjne zaprojektowano i skonstruowano do zastosowania do ekspresji przeciwciała E3 w ssaczych komórkach.

Wektor Db.911.3E jest wektorem ekspresyjnym zawierającym rejon zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała E3 i ludzki rejon stały IgG2a, i jest odpowiedni do przejściowej lub trwałej ekspresji łańcucha ciężkiego. Db.911.3E składa się z sekwencji nukleotydowych odpowiadających następującym rejonom: rejonowi promotora mysiego cytomegalowirusa (nukleotydy 1-612); syntetycznemu

PL 215 171 B1 intronowi (nukleotydy 619-1507); rejonowi kodującemu DHFR (nukleotydy 707-1267); peptydowi sygnałowemu ludzkiego hormonu wzrostu (nukleotydy 1525-1602); rejonowi zmiennemu łańcucha ciężkiego przeciwciała 3E (nukleotydy 1603-1965); rejonowi stałemu łańcucha ciężkiego ludzkej IgG2a zawierającemu następujące mutacje: A330P331 na S330S331 (numeracja aminokwasów w odniesieniu do sekwencji IgG2a typu dzikiego; patrz Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624); późnemu sygnałowi poliadenylacji SV40 (nukleotydy 2974-3217); rejonowi enhancera SV40 (nukleotydy 3218-3463); rejonowi faga fl (nukleotydy 3551-4006) i rejonowi kodującemu beta laktamazy (AmpR) (nukleotydy 4443-5300). Db.911.3E zdeponowano w ATCC w 8 stycznia 2003, i nadano mu numer akcesyjny ATCC PTA-4895.

Wektor Eb.911.3E jest wektorem ekspresyjnym zawierającym rejon zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała E3 i rejon stały ludzkiego łańcucha kappa, i jest odpowiedni do przejściowej ekspresji łańcucha lekkiego. Eb.911.3E składa się z sekwencji nukleotydowych odpowiadających następującym rejonom: rejonowi promotora mysiego cytomegalowirusa (nukleotydy 1-612); ludzki intron EF-1 (nukleotydy 619-1142); peptydowi sygnałowemu ludzkiego hormonu wzrostu (nukleotydy 1173-1150); rejonowi zmiennemu łańcucha lekkiego przeciwciała E3 (nukleotydy 1251-1571); rejonowi stałemu ludzkiego łańcucha kappa (nukleotydy 1572-1892); późnemu sygnałowi poliadenylacji SV40 (nukleotydy 1910-2153); rejonowi enhancera SV40 (nukleotydy 2154-2399); rejonowi faga fl (nukleotydy 2487-2942) i rejonowi kodującemu beta laktamazę (AmpR) (nukleotydy 33794236). Eb.911.3E zdeponowano w ATCC 8 stycznia 2003, i nadano mu numer akcesyjny ATCC PTA-4893.

Wektor Eb.pur.911.3E jest wektorem ekspresyjnym zawierającym rejon zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała E3 i rejon stały ludzkiego łańcucha kappa, i jest odpowiedni do trwałej ekspresji łańcucha lekkiego. Eb.pur.911.3E składa się z sekwencji nukleotydowych odpowiadających następującym rejonom: rejonowi promotora mysiego cytomegalowirusa (nukleotydy 1-612); ludzkiemu intronowi EF-1 (nukleotydy 619-1758); rejonowi kodującemu gen pac (puromycyna R) (nukleotydy 739-1235); rejonowi ludzkiego 5'UTR hsp70 (nukleotydy 1771-1973); peptydowi sygnałowemu ludzkiego hormonu wzrostu (nukleotydy 1985-2062); rejonowi zmiennemu łańcucha lekkiego przeciwciała E3 (nukleotydy 2063-2383); rejonowi stałemu ludzkiego łańcucha kappa (nukleotydy 2384-2704); późnemu sygnałowi poliadenylacji SV40 (nukleotydy 2722-2965); rejonowi enhancerowemu SV40 (2966-3211); rejonowi faga fl (nukleotydy 3299-3654) i rejonowi kodującemu beta laktamazę (AmpR) (nukleotydy 4191-5048). Eb.pur.911.E3 zdeponowano w ATCC 8 stycznia 2003, i nadano mu numer akcesyjny ATCC PTA-4894.

Przejściowej ekspresji w komórce dokonano następująco: komórki CHO i HEK293T na 150 mm szalkach przejściowo kotransfekowano 25 μg każdego plazmidu (tj. jednego plazmidu zawi erającego łańcuch ciężki i jednego plazmidu zawierającego łańcuch lekki) . DNA zmieszano z 100 μ! lipofektaminy 2000 (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Kompleksy DNA-Iipid pozostawiono do kontaktu z komórkami w podłożu DMEM/F12 bez surowicy czy antybiotyków przez 5 godzin. Po tej inkubacji, podłoża wymieniono do ekspresji na Opti-MEM (Invitrogen) bez jakichkolwiek dodatków na dwa dni. Supernatanty znad komórek zawierających przeciwciało zbierano kolejno aż do czterech razy po czym wymieniano podłoża. Supernatanty oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa stosując żywicę MapSelect Protein A (Amersham Biosciences 17-5199-02). Przeciwciało związało się na żywicy z białkiem A w 0,3M glicyny, 0,6M buforze NaCl przy pH 8, następnie eluowano z zastosowaniem 0,1M buforu cytrynianowego przy pH 3. Frakcje zawierające przeciwciało bezpośrednio zobojętniono stosując 1M bufor Tris o pH 8,0. Później frakcje przeciwciała dializowano i zatężono w PBS.

P r z y k ł a d 6: Przeciwciało anty-NGF E3 jest skuteczne w leczeniu bólu pooperacyjnego

Aby ocenić efektywność leczenia przeciwciałem E3 zastosowano model bólowy naśladujący ból pooperacyjny. Przeciwciało E3 składające się z rejonu stałego ludzkiego łańcucha ciężkiego IgG2a zawierającego następujące mutacje: A330P331 do S330S331 (numeracja aminokwasów w odniesieniu do sekwencji IgG2a typu dzikiego; patrz Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624); rejon stały ludzkiego łańcucha lekkiego kappa; i rejony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego przedstawione w tabelach 1A i 1B.

Zwierzęta. Samce szczurów Sprague Dawley ważące pomiędzy 220-240 gramów zakupiono od Harlan (Wisconsin) i aklimatyzowano w zwierzętarni przez jeden tydzień przed zabiegiem operacyjnym.

PL 215 171 B1

Zabieg operacyjny. Przeprowadzono zabieg operacyjny w oparciu o procedurę opisaną przez Brennan'a, i in. Pain 64: 493-501 (1996). Zwierzęta poddano narkozie stosując 2% izofluran w mieszance z powietrzem, podając ją przez okres operacji za pomocą stożka na nos. Podeszwową powierzchnię prawej tylnej łapy przygotowano stosując tampon z jodyną powidonową, wykonano 1-cm centralne podłużne nacięcie poprzez skórę i powięź, zaczynając 0,5 cm od krawędzi pięty i przedłużając w kierunku palców u nogi. Pomiary wykonano linijką, trzymując stopę w pozycji wyprostowanej. Mięsień podeszwowy podniesiono stosując wygięte kleszcze i nacięto wzdłużnie. Mięsień nacięto na całą jego głębokość, pomiędzy jego początkiem a przyczepem. Krwawienie kontrolowano podczas zabiegu operacyjnego poprzez ucisk tamponem z gazy. Ranę zamknięto dwoma szwami materacowymi (5-0 czarna jednowłókninowa nić poliamidowa ethilon). Te szwy zawiązano 5-6 razy, przy czym pierwszy węzeł zawiązano luźno. Miejsce rany pędzlowano stosując roztwór bacytracyny. Zwierzęta pozostawiono aż odzyskały przytomność i wypoczęły w czystej klatce na dwie godziny lub więcej przed rozpoczęciem testów behawioralnych.

Ocena bólu spoczynkowego. Do oceny bólu w odniesieniu do obciążenia stosowano rosną₂ cą skalę oceny bólu. Zwierzęta umieszczono na plastikowej siatce (kratka: 8 mm²) w przezroczystych plastikowych klatkach, które były podwyższone na platformie (wysokość: 18) co umożliwiło badanie spodu ich łap. Po 20 minutowym okresie aklimatyzacji, oszacowano obciążenie w skali od 0 do 2. Zero punktów przyznawano, jeśli łapa była blada lub przyciśnięta do siatki, wskazując na całkowite obciążenie. Jeden punkt przyznawano, jeśli łapa była uniesiona ze skórą jedynie dotykającą siatki, bez zbielenia lub wgniecenia skóry. Dwa punkty przyznawano jeśli łapa była całkowicie utrzymywana z dala od siatki. Cofanie łapy było uznawane za 2 jeśli szczur był wciąż nieprzytomny. Każde zwierzę obserwowano przez 1 minutę co 5 minut przez 30 minut. Sumę 6 wyników (0-12) otrzymanych podczas 1/2 godziny zastosowano do oceny bólu w naciętej stopie. Obliczono także częstotliwość wyniku 2 i użyto go w celu oceny występowania silnego bólu lub całkowitego ochraniania łapy przez zwierzę. Każde zwierzę badano 24 godziny przed zabiegiem operacyjnym (wartości odniesienia), i 2 godziny, 24 godziny, 48 godzin, i 72 godziny po operacji. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na fig. 1, która przedstawia rosnącą skalę oceny bólu spoczynkowego obserwowanego u zwierząt traktowanych 35 mg/kg mysiego przeciwciała antyNGF 911. Te wyniki wykazały, że traktowanie przeciwciałem anty-NGF znacznie zmniejszało pooperacyjny ból spoczynkowy. Obciążenie dobrze korelowało z tym, jak chętnie zwierzę używało łapy, a więc było skuteczną miarą ulgi w bólu.

Przeciwciało E3 wstrzykiwano dootrzewnowo (i.p.) w różnych stężeniach przeciwciała (0,004, 0,01, 0,02, 0,1, 0,6, i 1 mg na kilogram masy zwierzęcia) 15 godzin przed nacięciem. Grupa będąca kontrolą negatywną nie otrzymała przeciwciała lecz wstrzykiwano jej i.p. roztwór solanki. Jako kontrolę pozytywną wstrzykiwano i.p. 0,01 mg/kg fentanylu 30 minut przed badaniem, 24 godziny po operacji. Każde doświadczenie obejmowało 8 zwierząt (n=8 na grupę) dla wszystkich warunków, a grupa kontrolna obejmowała 56 zwierząt. Przeprowadzono zabieg operacyjny i przeprowadzono pomiar stosując rosnącą skalę oceny bólu jak opisano powyżej. Ból spoczynkowy oszacowano dwadzieścia cztery godziny po zabiegu operacyjnym.

Jak wskazano na fig. 7, humanizowane przeciwciało anty-NGF E3 znacznie zmniejszało ból spoczynkowy (p < 0,05) po zabiegu operacyjnym przy podawaniu w dawce 0,02 mg/kg do 1 mg/kg. Przez „oznaczono” bardzo istotną różnicę w porównaniu z kontrolą (p < 0,05). Traktowanie 0,02 mg/kg tłumiło zachowanie bólowe co najmniej równie skutecznie jak traktowanie 0,01 mg/kg fentanylu. Ta dawka fentanyl jest 10-krotnością dawki tego silnego opioidu zazwyczaj podawanej ludziom.

W innym doświadczeniu badano efektywność przeciwciała E3 w zmniejszaniu bólu pooperacyjnego przy podawaniu po operacji. Przeciwciało E3 (0,5 mg/kg) wstrzykiwano dożylnie (i.v.) dwie godziny po zabiegu operacyjnym. Grupa kontrolna nie otrzymała przeciwciała, lecz wstrzykiwano w niej i.v. roztwór solanki. Przeprowadzono zabieg operacyjny i ból spoczynkowy oszacowany 24 godziny po zabiegu operacyjnym wyrażono w rosnącej skali oceny bólu. Jak wskazano na fig. 8, traktowanie przeciwciałem anty-NGF znacznie (p < 0,05) zmniejszało ból spoczynkowy w dwadzieścia cztery godziny po nacięciu przy podawaniu przeciwciała 2 godzin po nacięciu. Wyniki te wykazały, że przeciwciało E3 skutecznie łagodzi ból pooperacyjny przy podawaniu po zabiegu operacyjnym.

P r z y k ł a d 7: Oszacowanie przeciwbólowego działania antagonistycznego przeciwciała anty-NGF 911 w szczurzym modelu reumatoidalnego zapalenia stawów.

PL 215 171 B1

Zbadano działanie przeciwbólowe przeciwciała anty-NGF 911 (patrz Hongo i in., Hybridoma 19(3): 215-227 (2000)) w wywołanym kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) przewlekłym zapaleniu stawów u szczurów stosując test wokalizacji, w porównaniu z indometacyną stosowaną jako substancja wzorcowa.

Badaniem tym objęto pięćdziesiąt (50) samców szczurów Lewis (LEWIS LEW / Crl Ico) (Charles River Belgium) o masie 150 g do 220 g na początku fazy eksperymentalnej. Wszystkie zwierzęta hodowano przez co najmniej 5 dni przed doświadczeniem, i umieszczono je w pokoju z kontrolowaną temperaturą 19,5-24,5°C, wilgotnością względną (45-65%) i 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dowolnym dostępem do filtrowanej wody kranowej i standardowej granulowanej karmy dla zwierząt laboratoryjnych (U.A.R., Francja) podczas badania. Zwierzęta identyfikowano na podstawie ogona.

W dniu 0 (D0), u szczurów wywołano zapalenie stawów przez doskórne wstrzyknięcie do ogona 0,05 ml zawiesiny Mycobacterium butyricum (Difco, USA) w oleju mineralnym (10 mg/ml). W dniu 14 (D14), szczury z zapaleniem stawów objęto badaniem na podstawie ich zdolności do wokalizacji przy delikatnym zginaniu tylnej łapy i na podstawie ich indeksu zapalenia stawów, oszacowanego z zastosowaniem punktacji zapalenia dla każdej tylnej i przedniej łapy (patrz Kuzuna i in., Chem. Pharm. Arthritis Bull (Tokyo) 23: 1184-1191 (1975); Pearson i in., Arthritis Rheum. 2: 440-459 (1959)). Zwierzęta oceniano na podstawie następujących kryteriów: Zero punktów: prawidłowy wygląd; Jeden punkt: rumień; Dwa punkty: rumień z nieznacznym obrzękiem; trzy punkty: silne zapalenie bez zesztywnienia stawu; cztery punkty: zesztywnienie stawu. Badaniem objęto tylko zwierzęta zdolne do wokalizacji przy delikatnym zginaniu i ocenione na 2 lub 3.

Badaniem objęto cztery grupy, po 10 szczurów każda. W grupie 1 (nośnik), w dniu 14 (D14), po selekcji, szczurom podawano dożylnie nośnik (solankę). W dniu 18 (D18), intensywność nocycepcji oszacowano przez delikatne zginanie tylnej łapy i rejestrację intensywności poziomu wokalizacji dla każdego zwierzęcia. Dla grupy 2 (4 dni), w D14, po selekcji, szczurom dożylnie podawano 911 (10 mg/kg). W dniu 18 (D18), intensywność nocycepcji oszacowano przez delikatne zginanie tylnej łapy i rejestrację intensywności poziomu wokalizacji dla każdego zwierzęcia. W grupie 3 (24 godziny), w dniu 17 po zastrzyku CFA, szczurom dożylnie podawano 911 (10 mg/kg). Intensywność nocycepcji oszacowano przez delikatne zginanie tylnej łapy 24 godziny później, i rejestrację intensywności poziomu wokalizacji dla każdego zwierzęcia. W grupie 4 (indometacyna), w dniu 18 (D18), intensywność nocycepcji oszacowano przez delikatne zginanie tylnej łapy jedną godzinę po doustnym podaniu indometacyny (10 mg/kg). Dla każdego zwierzęcia rejestrowano także intensywność poziomu wokalizacji. Substancje testowe podawano z próbą ślepą i w sposób losowy drogą dożylną w objętości 5 ml/kg, podczas gdy indometacynę podawano drogą doustną w objętości 10 ml/kg.

Działanie przeciwbólowe przeciwciała anty-NGF 911 przedstawiono w tabeli 10. Wyniki wyrażono dla każdej grupy jako intensywność nocycepcji oszacowaną przez intensywność poziomu wokalizacji rejestrowaną dla każdego zwierzęcia w mV (średnia ± SEM), i procent różnicy intensywności nocycepcji obliczono ze średniej wartości dla grupy traktowanej nośnikiem. Znamienność statystyczną między traktowanymi grupami i grupą traktowaną nośnikiem określono z zastosowaniem testu Dunnett'a stosując pozostałą wariancję po jednostronnej analizie wariancji (P< 0,05).

T a b e l a 10. Działanie przeciwbólowe 911 w wywołanym kompletnym adiuwantem Freunda przewlekłym zapaleniem stawów u szczurów

Substancja (dzień podawania)	Nośnik (D14)	911 (D14)	911 (D17)	Indometacyna (D18)
Dawka (mg/kg)		10	10	10
Intensywność nocycepcji (mV)	971,0±116,2	234,7±34,4*	247,2+41,8*	145,8±29,9*
% zmiany	-	-76	-75	-85

Wyniki wyrażono jako średnią ± standardowy błąd średniej n=10 szczurów na grupę Dzień 0 (D0) Indukcja przewlekłego zapalenia stawów przez podawanie CFA Substancja pomocnicza: solanka

911 (10 mg/kg) podawano dożylnie w dniach D14 lub D17, a pomiar bólu przeprowadzono w dniu D18.

PL 215 171 B1

Indometacynę (10 mg/kg) podano doustnie w dniu D18, a pomiar bólu przeprowadzono godzinę po podaniu.

Test Dunnetta: * wskazuje istotną różnicę w porównaniu z grupą traktowaną substancją pomocniczą dla P<0,05.

Jak wskazano w tabeli 10, przeciwciało anty-NGF 911 znacznie zmniejszało ból w szczurzym modelu reumatoidalnego zapalenia stawów 24 godziny lub 4 dni po jednokrotnym podaniu przeciwciała.

P r z y k ł a d 8: Efekty farmakologiczne antagonistycznego przeciwciała anty-NGF E3 i 911 w szczurzym modelu reumatoidalnego zapalenia stawów.

Efekty farmakologiczne (działanie przeciwzapalne i przeciwbólowe) antagonistycznego przeciwciała anty-NGF E3 i 911 badano na modelu wywołanego kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) przewlekłego zapalenia stawów u szczurów w porównaniu z indometacyną użytą jako substancja do wewnętrznej kontroli pozytywnej . Działanie przeciwbólowe E3 i 911 oszacowano przez ocenę odpowiedzi nocyceptywnej. Przeciwzapalne działanie oszacowano na podstawie objętości łapy, indeksu zapalenia stawów (ocena punktowa zapalenia), masy ciała i tylnych łap. Poziomy cytokin w łapie (IL-6, IL-1 β, TNF-α i TGF-31), TGF-31 w krążącym osoczu, stężenia E3 i 911 w osoczu, parametry biologiczne i radiografie rentgenowskie przeprowadzono pod koniec doświadczenia.

Protokół eksperymentalny

1. Projekt badania

Badaniem tym objęto 80 samców szczurów Lewis (LEWIS Lew/Ico) (Charles River Laboratories-Belgia) w wieku 5 tygodni. Umieszczono je w pokoju z kontrolowaną temperaturą (19,5-24,5°C) i wilgotnością względną (45-65%) w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, ze swobodnym dostępem do filtrowanej wody kranowej i standardowej granulowanej karmy dla zwierząt laboratoryjnych (SAFE, Francja) podczas badania. Po dostarczeniu do zwierzętarni, umieszczono je po 5 na klatkę i obserwowano podczas okresu 10-dniowej aklimatyzacji przed jakimikolwiek badaniami. Zwierzęta indywidualnie na podstawie ogona.

Pięć grup po 10 zwierząt (5-tygodniowe samce szczurów Lewis -LEWIS Lew/Ico, z Charles River Laboratories - Belgia) każda objęta tym badaniem: grupa 1: szczury bez zapalenia stawów/solanka (nośnik), i.v. w bolusie, n=10; grupa 2: szczury z zapaleniem stawów/solanka (nośnik), i.v. w bolusie, n=10; grupa 3: szczury z zapaleniem stawów/indometacyna 3 mg/kg, p.o. codziennie przez 10 dni, n=10; grupa 4: szczury z zapaleniem stawów/E3, 1 mg/kg, i.v. w bolusie, n=10; grupa 5: szczury z zapaleniem stawów/911, 10 mg/kg, i.v. w bolusie, n=10. Dawki wyrażono w postaci ilości wolnej substancji czynnej (mg/kg). E3 i 911 wytworzono bezpośrednio przed podaniem w solance z roztworu podstawowego do pożądanego stężenia. E3 1 mg/kg: 3,41 ml roztworu podstawowego (0,88 mg/ml) q.s.p. 15 ml solanki. 911 10 mg/kg: 12 ml roztworu podstawowego (2,5 mg/ml) q.s.p. 15 ml solanki. Wszystkie rozcieńczone roztwory (przed zastrzykiem

i.v.) sterylizowano stosując sterylny filtr o rozmiarze 0,20 μm. Wartości pH i osmolarności rozcieńczonych roztworów mierzono przed każdym zastrzykiem i.v. Przed pierwszym i.v. osmolarność (mosm/l) dla solanki, E3, i 911 wynosiła odpowiednio 278, 269, i 308; pH dla solanki, E3, i 911 wynosiło odpowiednio 5,93, 6,76, 6,71. Przed drugim i.v. osmolarność (mosm/l) dla solanki, E3, i 911 wynosiła odpowiednio 280, 270, i 309; pH dla solanki, E3, i 911 wynosiło odpowiednio 5,86, 6,72, i 6,59.

E3 lub 911 lub solankę podawano poprzez zastrzyk i.v. w bolusie w dniu 14 i dniu 19 po wywołaniu zapalenia stawów w sposób zakodowany i losowy w objętości 5 ml/kg. W grupie bez zapalenia stawów podawano przez zastrzyk i.v. w bolusie solankę w dniu 14 i dniu 19 stosując objętość 5 ml/kg. Indometacynę wytworzono bezpośrednio przed podaniem w 1% metylocelulozie. Indometacynę podawano drogą doustną (p.o.) raz dziennie przez 10 dni od dnia 14 do dnia 23 po wywołanii zapalenia stawów w sposób zakodowany i losowy stosują* objętość 10 ml/kg.

2. Wywoływanie zapalenia stawów.

W dniu 0 (D0), u 70 szczurów wywołano zapalenie stawów przez doskórny zastrzyk w ogon 0,05 ml z zawiesiny Mycobacterium butyricum. Grupa 10 szczurów nie otrzymywała żadnego zastrzyku doskórnie (szczury bez zapalenia stawów). W dniu 14 (D14), szczury z zapaleniem stawów objęto badaniem stosując następujące kryteria: wszystkie objęte badaniem szczury wykazywały zwiększenie średniej objętości łapy (średnia objętości lewej i prawej łapy) o co najmniej 0,30 ml w porównaniu ze średnią objętością łapy (średnia objętości lewej i prawej łapy) w grupie bez za74

PL 215 171 B1 palenia stawów (pomiar objętości łapy jak opisano poniżej); wszystkie objęte badaniem szczury wykazywały wokalizację po delikatnym zginaniu (odpowiedź nocyceptywna pomiaru jak opisano poniżej); i u wszystkich objętych badaniem szczu rów indeks zapalenia stawów wynosił 2-3 dla każdej tylnej łapy (ocena indeksu zapalenia stawów jak opisano poniżej) (zwierzęta z oceną 0, 1 lub 4 odrzucono).

3. Masa ciała

Zwierzęta ważono raz dziennie od dnia 0 do dnia 24 (z wyjątkiem dni weekendowych przed traktowaniem: D1, D2, D8, D9, D10). Wszystkie pomiary przeprowadzono pomiędzy 9:00 i 12:00 z wyjątkiem dnia D14 (7:30-9:00 rano) i D24 (7:30-8:00 rano).

4. Pomiar objętości łapy

Objętość prawej i lewej tylnej łapy każdego szczura (szczury z zapaleniem stawów i szczury bez zapalenia stawów) określono stosując urządzenie do pomiaru objętości łapy. Pomiary przeprowadzono w następujących czasach (po wywołaniu zapalenia stawów): dzień 14 (przed podawaniem i.v. w bolusie lub p.o.); i dzień 24 (5 dni po ostatnim podaniu zastrzyku i.v. w bolusie lub 24 godziny po ostatnim podaniu p.o.). Wszystkie pomiary przeprowadzono pomiędzy 9:00 i 12:00 przed południem. Wszystkie dane zebrano i przechowywano stosując oprogramowanie WinDas.

5. Indeks zapalenia stawów

Indeks zapalenia stawów oszacowano stosując ocenę punktową zapalenia każdej tylnej i przedniej łapy (szczury z zapaleniem stawów): zero punktów: prawidłowy wygląd; 1 punkt: rumień; 2 punkty: rumień z nieznacznym obrzękiem; 3 punkty: silne zapalenie bez zesztywnienia stawu; 4 punkty: zesztywnienie stawu. To oszacowanie przeprowadzono w następujących czasach (po wywołaniu zapalenia stawów): dzień 14 (przed podawaniem i.v. w bolusie lub podawaniem p.o.); i dzień 24 (5 dni po ostatnim podaniu zastrzyku i.v. w bolusie lub 24 godziny po ostatnim podawaniu p.o.). Wszystkie pomiary przeprowadzono pomiędzy 2:00 i 3:00 w nocy (D14), 8:00 i 9:00 rano (D24). Wszystkie dane zebrano i przechowywano stosując oprogramowanie WinDas.

6. Pomiar odpowiedzi nocyceptywnej (test wokalizacji)

Odpowiedź nocyceptywną oszacowano przez delikatne zginanie palcem prawej i lewej tylnej łapy wiele razy 2-krotnie w przedziałach czasu od 4 do 5 sekund (szczury z zapaleniem stawów). Rejestrację intensywności poziomu wokalizacji dla każdego zwierzęcia dla każdej tylnej łapy (2 razy: dla prawej tylnej łapy: s1 i s3; 2 razy: dla lewej tylnej łapy: s2 i s4). To oszacowanie przeprowadzono w następujących czasach (po wywołaniu zapalenia stawów): dzień 14 (przed podawaniem i.v. w bolusie lub podawaniem p.o.); dzień 18 (przed podaniem drugiego zastrzyku i.v. w bolusie lub 1 godzinę po podawaniu p.o.); i dzień 24 (5 dni po ostatnim podaniu zastrzyku i.v. w bolusie lub 24 godziny po ostatnim podawaniu p.o.). Wszystkie pomiary przeprowadzono pomiędzy 9:00 i 12:00 przed południem z wyjątkiem pomiaru w dniu D14 (7:30 - 9:00 rano) i D24 (7:30 - 9:00 rano).

7. Pobieranie krwi do pomiaru stężenia E3 lub 911 i krążącego TGF-a1 i parametry hematologiczne.

W dniu 24 (po pomiarach objętości łap i określeniu indeksu zapalenia stawów i teście wokalizacji), w znieczuleniu ogólnym z zastosowaniem izofluranu (w mieszaninie tlenu i podtlenku azotu), próbki krwi (około 800-1000 μΓ> pobrano z zatoki pozagałkowej wykorzystując zjawisko kapilarne z zastosowaniem mikropipety.

Pomiar stężenia E3 lub 911 (grupy 2, 4 i 5): część próbek krwi zebrano do probówek zawierających Li-Heparynę (trzymane na lodzie) i wirowano przy 2500-3000 g przez 10 minut. Otrzymano próbki osocza (co najmniej 100 μθ, zamrożono w ciekłym azocie, przechowywano w temperaturze -80°C. Jedna próbka była nieznacznie zhemolizowana (traktowany nośnikiem szczur z zapaleniam stawów nr 36).

Pomiar TGF-31 w krążeniu (grupy 1-2-3-4-5): część próbek krwi zebrano do mikroprobówek w celu przygotowania osocza w temperaturze otoczenia. Po pobraniu próbki, krew wymieszano i pozostawiono do skrzepnięcia przez 30 minut przed żwirowaniem. Probówki wirowano przy około 6000 g przez 3 minuty. Każdą próbkę osocza (co najmniej 100 pl, z wyjątkiem szczura nr 52 i nr 53) podzielono na równe porcje i przechowywano w temperaturze -20°C aż do aktywacji próbki do analizy TGF-31. Te próbki (50 fiolek) przechowywano przez 6 miesięcy począwszy od końca badania. Niektóre próbki były nieznacznie zhemolizowane (traktowany nośnikiem szczur bez zapalenia stawów: nr 2, nr 5, nr 9, nr 10; traktowany nośnikiem szczur z zapaleniem stawów: nr 53, nr 63; traktowany E3 szczur z zapaleniem stawów nr 31, nr 51; traktowany 911 szczur z zapaleniem stawów: nr 52, nr 62, nr 64). Poziomy TGF-31 zmierzono stosując zestaw ELISA do ludzkiego TGF-31 (ref. DB100, partie 212258 i 213610, R&DSystems - Francja).

PL 215 171 B1

Pobieranie krwi dla zbadania parametrów hematologicznych (grupy 1-2-3-4-5: 50 fiolek): część krwi próbek zebrano do probówek zawierających K3-EDTA (co najmniej 100 μ!). Określanie parametrów przeprowadzono w dniu pobrania i próbek nie przechowywano. Parametry hematologiczne obejmujące krwinki czerwone, krwinki białe, płytki krwi, hemoglobinę, hematokryt zmierzono z zastosowaniem licznika hematologicznego (D24). Pewnych parametrów hematologicznych nie zmierzono z powodu skrzepnięcia próbek (traktowany nośnikiem szczur bez zapalenia stawów: nr 10; traktowane E3 szczury z zapaleniem stawów: nr 59, nr 67; traktowane 911 szczury z zapaleniem stawów: nr 16).

8. Poziomy cytokin w łapie

W dniu 24 (5 dni po ostatnim zastrzyku i.v. w bolusie lub 24 godziny po ostatnim podawaniu p.o.) (po wykonaniu radiografii rentgenowskich), każdą tylną łapę zwierzęcia (szczury z zapaleniem stawów i bez zapalenia stawów) zważono i zebrano do oznakowanej polietylenowej fiolki. Próbki tkanki zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C.

Wytwarzanie homogenatów stawów: zamrożone tylne łapy sproszkowano z zastosowaniem urządzenia Bio-Pulverizer. Sproszkowane tylne łapy następnie umieszczono w 50 ml stożkowej probówce wirówkowej zawierającej 3 ml PBS uzupełnione 50 μl koktajlu inhibitorów proteaz i h omogenizowano na lodzie stosując homogenizator Ultra-Tu rrax (50% maksymalnej prędkości). Homogenaty następnie wirowano przy 2000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C i supernatanty przesączono przez filtry o rozmiarze 0,2 μm Sartorius, podzielono na próbki o równej objętości i przechowywano w temperaturze -80°C aż do użycia.

Pomiar poziomów cytokin: poziomy cytokin TNF-α (zestaw ELISA do szczurzego TNF-a, ref. RTA00, partia 213718, R&DSystems, Francja), IL-1 β (zestaw ELISA do szczurzej IL-1 β, ref. RLB00, partia 212435, R&DSystems, Francja), IL-6 (zestaw ELISA do szczurzej IL-6, ref. R6000, partia 211773, 214008 i 214362, R&DSystems, Francja), i TGF^1 (zestaw ELISA do ludzkiego TGF-β! ref. DB100, partia 212258 i 213610, R&DSystems, Francja) określono w dwóch powtórzeniach, zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. Próbki homogenatów z tylnej łapy przechowywano w temperaturze -80°C.

9. Analiza rentgenowska

W dniu 24, po pobraniu krwi zwierzęta uśmiercono i wykonano radiografie rantgenowskie (tylnych łap) w celu oszacowania uszkodzeń stawów. W analizie rentgenowskiej skupiono się na ubytkach stawów, szparze stawowej , nieprawidłowościach okostnej w obu tylnych łapach.

Wszystkie radiografie zanalizowano zwracając uwagę na siedem różnych punktów: uszkodzenie tkanki miękkiej, deformację, demineralizację, szparę stawową, ubytki, osteogenezę i odczyn okostnowy. Dla każdego zwierzęcia, pierwszych sześć punktów zanalizowano niezależnie oglądając gorszą tylną stopę. Odczyn okostnowy zanalizowano oglądając ogon. Dla każdego miejsca punktacja kształtuje się od 0 (prawidłowa) do 4 (maksymalne uszkodzenia). Zatem całkowita punktacja kształtuje się od 0 do 28. Interpretację radiograficzną przeprowadzono tym samym czytnikiem nie wiedząc nic na temat zwierząt (traktowane czy nie potraktowane).

10. Obserwacje

Jedno zwierzę (nr 65) zmarło w dniu D23 po podawaniu indometacyny (przed podawaniem w dniu D23) z nieznanych przyczyn.

11. Analiza i przedstawienie wyników

Wszystkie wyniki przedstawiono jako średnią ± S.E.M. dla 10 szczurów w każdej grupie w każdym punkcie czasowym. Objętość łapy wyrażono w ml obliczonych ze średniej wartości objętości prawej i lewej łapy. Indeks zapalenia stawów obliczono z sumy wyników otrzymanych dla każdej z 4 łap. Odpowiedź nocyceptywną oszacowano przez intensywność poziomu wokalizacji zarejestrowanej dla każdego zwierzęcia (średnia z 4 wartości: 2-krotnie/łapę) w mV. Procent hamowania odpowiedzi nocyceptywnej obliczono ze średniej wartości dla traktowanej nośnikiem grupy z zapaleniem stawów [(średnia wartość dla traktowanej nośnikiem grupy z zapaleniem stawów - średnia wartość traktowanej grupy z zapaleniem stawów/ średnia wartość dla grupy traktowanej nośnikiem z zapaleniem stawów)* 100]. Masę ciała wyrażono w gramach. Masę tylnych łap (lewej i prawej) wyrażono w gramach. Pozimy cytokin (IL-6, IL-1 β, TNF-α i TGF-β! dla każdej tylnej łapy wyrażono w pg/ml. Poziomy TGF^1 w krążeniu wyrażono w pg/ml. Indeks radiologic zny dla każdego parametru (demineralizacja, ubytki, odczyn okostnowy, uszkodzenia tkanki miękkiej, szpara stawowa, osteogeneza, deformacja) i całkowity indeks radiologiczny (całkowita punktacja) obliczono z sumy punktów uzyskanych dla każdego parametru. Istotności różnic między

PL 215 171 B1 grupami pomiędzy wartościami dla traktowanej nośnikiem grupy (szczury z zapaleniem stawów) i traktowanej nośnikiem grupy (szczury bez zapalenia stawów) oszacowano z zastosowaniem testu t Studenta lub test sumy rang Mann'a-Whitney'a gdy zawiódł test równości wariancji lub test normalności rozkładu. Istotności różnic między grupami pomiędzy wartościami dla grupy traktowanej nośnikiem (szczury z zapaleniem stawów) i grup traktowanych E3, oraz 911, oraz indometacyną oszacowano stosując jednostronną analizę wariancji ANOVA, po której przeprowadzono niesparowany t-test Dunnett'a. Za istotne uznawano prawdopodobieństwo P<0,05. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono stosując oprogramowanie Sigmasta^TM.

Wyniki

1. Odpowiedź nocyceptywna (test wokalizacji)

Jak przedstawiono w tabeli 11 i fig. 18, w D14, odpowiedź nocyceptywna wynosiła 4147±331,4386±235, 4644±367 i 4468±143 odpowiednio w grupach z zapaleniem stawów: traktowanej nośnikiem, traktowanej indometacyną, traktowanej E3, i traktowanej 911. Indometacyna silnie i znacznie zmniejszała odpowiedź nocyceptywną po podawaniu 3 mg/kg/dobę p.o. (przez 10 dni) o około -3768 mV (% hamowania: 71%) i -4353 mV (% hamowania: 74%) w dniach D18 i D24, odpowiednio w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (D18: 1511±398 w porównaniu 5279±326 mV; D24: 1552±508 w porówaniu z 5905±345 mV). E3 (1 mg/kg i.v. w dniach D14 i D19) silnie i znacznie zmniejszał odpowiedź nocyceptywną o około -4167 mV (% hamowania: 79%) i -5905 mV (% hamowania: 100%) odpowiednio w dniach D18 i D24, w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (D18: 1112±401 w porówaniu z 5279±326 mV; D24: 0±0 w porównaniu z 5905±345 mV) . Środek 911 (10 mg/kg i.v. 2 dni w D14 i D19) silnie i znacznie zmniejszał odpowiedź nocyceptywną o około -3932 (% hamowania: 74%) i -5358 mV (% hamowania: 91%) w dniach D18 i D24, odpowiednio w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (D18: 1347±492 w porównaniu z 5279±326 mV; D24: 547±307 w porównaniu z 5905±345 mV).

T a b e l a 11. Wpływ E3 i 911 po zastrzyku i.v. (2 dni: D14-D19) na odpowiedź nocyceptywną w reumatoidalnym zapaleniu stawów u szczurów

	Dzień	D14	D18	D24
	Nośnik i.v.	4147±331	5279±326	5905±345
Szczury	E3 1 mg/kg i.v.	4644±367	1112±401*	0±0*
z zapaleniem stawów	% hamowania	0	79	100
	911 10 mg/kg i.v.	4468±143	1347±492*	547±307*
	% hamowania	0	74	91
	indometacyna 3 mg/kg p.o. (przez 10 dni)	4386±235	1511±398*	1552±508
	% hamowania	0	71	74

Wartości wyrażono w mV jako średnią ± S.E.M.

n=10 zwierząt na grupę z wyjątkiem D24 dla indometacyny (n=9) test t Dunnett'a: * P < 0,05 w porównaniu ze szczurami z zapaleniem stawów traktowanymi nośnikiem

2. Masa ciała

Jak wskazano w tabeli 12 i fig. 19, wyraźne zmniejszenie przyrostu masy ciała obserwowano u szczurów z zapaleniem stawów w porównaniu ze szczurami bez zapalenia stawów od D0 do D14 z uwagi na wytworzenie zapalenia stawów. W D14 (dzień selekcji) szczury z zapaleniem stawów wykazywały znaczące zmniejszenie masy ciała w porównaniu ze szczurami bez zapalenia stawów (289±2 w porówaniu z 217±4 g) (test t studenta P<0,05). Jednakże nie wykryto znaczącej różnicy w masie ciała (D14) we wszystkich grupach z zapaleniem stawów (test t Dunnett'a P> 0,05). Masa ciała umiarkowanie i znacznie wzrosła w grupie traktowanej indometacyną (3 mg/kg/dobę przez 10 dni) od D17 do D24 z maksimum około 43 g w D24 w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (261±5 w porównaniu 218±3 g). Po potraktowaniu E3 (1 mg/kg i.v. w D14 i D19), masa ciała umiarkowanie i znacznie wzrosła od D17 do D24 z maksimum około 46 g w D24 w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (264±5 g w porównaniu

PL 215 171 B1 z 218±3 g). Po potraktowaniu środkiem 911 (10 mg/kg i.v. w D14 i D19), masa ciała umiarkowanie i znacznie wzrosła od D18 do D24 z maksimum około 47 g w D24 w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów z traktowaną nośnikiem (265±7 w porównaniu z 218±3 g).

T a b e l a 12. Wpływ E3 i 911 po zastrzyku i.v. (2 dni: D14-D19) na masę ciała w reumatoidalnym zapaleniu stawów u szczurów

Dzień	D0	D3	D4	D5	D6	D7	D11	D12	D13	D14
Szczury bez	Nośnik i.v.	197	215	222	232	236	244	272	277	282	289
zapalenia		±2	±2	±2	±2	±2	±2	±2	±2	±2	±2
stawów
	Nośnik i.v.	199	214	221	230	236	241	229	223	218	217
		±2	±2	±2	±2	±2	±3	±6	±5	±5	±4
	E3 1 mg/kg	206	222	230	241	243	249	242	237	230	225
	i.v.	±4	±3	±3	±3	±3	±3	±6	±6	±5	±5
	911	201	211	218	227	231	239	234	228	221	218
Szczury	10 mg/kg i.v.	±2	±5	±5	±5	±5	±5	±8	±7	±7	±6
z zapaleniem stawów	Indometacyna	202	217	225	235	239	246	242	235	227	224
3 mg/kg p.o. przez 10 dni	±3	±4	±4	±4	±4	±4	±7	±7	±6	±5

Dzień	D15	D16	D17	D18	D19	D20	D21	D22	D23	D24
Szczury bez	Nośnik	285	291	297	302	307	308	312	316	321	326
zapalenia	i.v.	±2	±2	±2	±3	±3	±3	±3	±3	±3	±3
stawów	Nośnik	213	212	211	210	208	210	212	214	216	218
	i.v.	±4	±4	±3	±3	±3	±3	±3	±3	±3	±3
	E3 1 mg/kg	223	224	227	232	235	238	245	250	257	264
	i.v.	±5	±5	±4*	±4*	±4*	±4*	±4*	±5*	±5*	±5*
Szczury	911	217	221	226	229	233	239	246	253	258	265
z zapaleniem	10 mg/kg i.v.	±5	±5	±5	±5*	±6*	±6*	±6*	±6*	±6*	±7*
stawów
	Indometacyna	230	230	231	234	236	241	246	248	253	261
	3 mg/kg p.p. przez 10 dni	±4	±5	±4*	±4*	±4*	±4*	±4*	±5*	±5*	±5*

Wartości wyrażono w gramach jako średnią ± S.E.M. n=10 zwierząt na grupę z wyjątkiem dni D23 i D24 (n=9) dla indometacyny

Test t Dunnett'a: * P < 0,05 w porównaniu z traktowanymi nośnikiem szczurami z zapaleniem stawów.

3. Objętość łapy

W D14 przeprowadzono randomizację w celu wytworzenia homogenicznej grupy w sensie objętości łapy. Jak pokazano w tabeli 13, w D14 objętość tylnej łapy (średnia objętości prawej i lewej łapy) była znacznie większa w grupie z zapaleniem stawów niż w grupie bez zapalenia stawów (2,10±0,05 w porównaniu z 1,44±0,02 ml (test t Studenta P< 0,05)). Indometacyna (3 mg/kg/dobę p.o przez 10 dni) znacznie zmniejszała objętość łapy o około -0,75 ml (D24) w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (1,59±0,03 ml w porównaniu z 2,34±0,08 ml). E3 (1 mg/kg do podawania dożylnego w D14 i D19) nieznacznie i znacznie zwiększało objętość łapy o około 0,37 ml w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (2,71+0,09 ml w porównaniu z 2,34±0,08 ml. Środek 911 (10 mg/kg p.o. w D14 i D19) nieznacznie i znacznie zwiększał objętość łapy o około 0,36 ml w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (2,70±0,11 ml w porównaniu z 2,34±0,08 ml).

PL 215 171 B1

T a b e l a 13. Wpływ E3 i 911 po zastrzyku i.v. (2 dni: D14-D19) na objętość łapy w reumatoidalnym zapaleniu stawów u szczurów

Dzień	D14	D24
Szczury bez zapalenia stawów	Nośnik i.v.	1,44+0,02	1,47+0,02
Szczury z zapaleniem stawów	Nośnik i.v. E3 1 mg/kg i.v. 911 10 mg/kg i.v.	2,10±0,05 2,06+0,03 2,02±0,07	2,34±0,08 2,71±0,09* 2,70±0,11*
Indometacyna 3 mg/kg p.o. przez 10 dni	2,08+0,06	I,59+0,03*

Wartości wyrażono w ml jako średnią ± S.E.M.

n=10 zwierząt na grupę z wyjątkiem dnia D24 dla indometacyny (n=9)

Test t Dunnett'a: * P < 0,05 w porównaniu ze szczurami z zapaleniem stawów traktowanymi nośnikiem

4. Indeks zapalenia stawów

Jak przedstawiono w tabeli 14, w D14, indeks zapalenia stawów wynosił 10,1±0,8, 8,7±0,6, 10,2+0,4 oraz 9,4±0,7, odpowiednio w grupach z zapaleniem stawów traktowanych: nośnikiem, indometacyną, E3, oraz 911. Indometacyna silnie i znacznie obniżała indeks zapalenia stawów po podawaniu 3 mg/kg/dobę p.o. (przez 10 dni) maksymalnie o około -8,0 w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (2,7±0,7 w porównaniu z 10,7±0,6). E3 (1 mg/kg i.v. w D14 i D19) nie wpływało na indeks zapalenia stawów w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (11,4±0,4 w porównaniu z 10,7±0,6). Środek 911 (10 mg/kg p.o. w D14 i D19) nie wpływał na indeks zapalenia stawów w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (10,9±0,7 w porównaniu z 10,7±0,6).

T a b e l a 14. Wpływ E3 i 911 po zastrzyku i.v. (2 dni: D14-D19) na indeks zapalenia stawów w reumatoidalnym zapaleniu stawów u szczurów

	Dzień	D14	D24
	Nośnik i.v.	10,1±0,8	10,7±0,6
Szczury	E3 1 mg/kg i.v.	10,2±0,4	11,4±0,4
z zapaleniem stawów	911 10 mg/kg i.v.	9,4±0,7	10,9±0,7
	Indometacyna 3 mg/kg p.o. przez 10 dni	8,7±0,6	2,7±0,7*

Wartości wyrażono jako średnią ± S.E.M. (punktacja) n=10 zwierząt na grupę z wyjątkiem indometacyny (n=9)

5. Poziomy cytokin w łapie

Jak przedstawiono w tabeli 15, w D24, pozimy cytokin w łapach lewej i prawej były podwyższone w grupie z zapaleniem stawów traktowanej nośnikiem maksymalnie około 3,5 (IL-1 β), 4 (TNF-α) i 1,8 (TGF-ββ krotnie w porównaniu z grupą bez zapalenia stawów traktowaną nośnikiem. Nie zaobserwowano znaczącej różnicy dla poziomów IL-6, w prawej i lewej łapie, pomiędzy tymi dwiema grupami. Poziomy cytokin w grupie z zapaleniem stawów były podobne w lewej i prawej łapie: 259,7±38,5 w porównaniu z 219,2±32,4, 4802,8±365,5 w porównaniu z 4007,1+380,4, 17,8±1,6 w porównaniu z 18,6±1,9 i 9735,0±1219,8 w porównaniu z 9161,4±846,1 pg/ml odpowiednio dla IL-6, IL-1 β, TNF-α i TGF-β! Indometacyna słabo, lecz istotnie, obniżała poziom TGF^1 w prawej łapie po podawaniu 3 mg/kg/dobę p.o. (przez 10 dni) około 1,3 krotnie, w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (7057,4±335,6 w porównaniu z 9161,4±846,1), natomiast nie zmieniała poziomów IL-6, TNF -α lub IL-1 β. Podobne lecz nie znaczące działanie obserwowano w lewej łapie. E3 (1 mg/kg i.v. w D14 i D19) nie wpływało na poziomy IL-6, IL-1 β, TNF-α lub TGF-ββ w obu łapach, w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem. 911 (10 mg/kg p.o. w D14 i D19) zwiększało poziom IL-1 β w prawej łapie w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (6215,31666,7 w porównaniu z 4007,1±380,4). Nie miało wpływu na pozimy innych cytokin w obu łapach.

PL 215 171 B1

T a b e l a 15. Wpływ E3 i 911 po zastrzyku i.v. (2 dni w D14 i D19) na poziomy cytokin w łapie u szczurów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

Poziomy cytokin w lewej łapie
Szczury bez zapalenia stawów	Szczuty z zapaleniem stawów
Nośnik i.v.	Nośnik i.v.	E3 1 mg/kg i.v.	911 10 mg/kg i.v.	Indometacyna 3 mg/kg p.o.
IL-6	298,6±35,6	259,7±38,5	234,4± 35,2	262,5±142,5	249,7±60,4
IL-1P	1383,0±157,9	4802,8±365,5	5060,0±473,5	5500,8±625,3	4029,1±449,9
TNF-a	4,3±2,9	17,8±1,6	23,6±2,5	29,9±4,8	29,9±3,6
TGF-P1	5264,7±209,2	9735,0±1219,8	9796,7±491,2	11053,5±713,3	7708,2±293,9
Poziomy cytokin w prawej łapie
Szczury bez zpalenia stawów	Szczury z zapaleniem stawów
Nośnik i.v.	Nośnik i.v.	E3 1 mg/kg i.v.	911 10 mg/kg i.v.	Indometacyna 3 mg/kg p.o.
IL-6	286,4±76,1	219,2±32,4	214,6±47,2	284,9±38,9	295,9±47,8
EL-1P	1342,1 ±86,1	4007,1±380,4	4853,5±605,0	6215,3±666,7*	3884,4±534,4
TNF-a	15,7±4,8	18,6±1,9	21,5±2,5	33,4±5,7	30,6±5,7
TGF-P1	5024±148,4	9161,4±846,1	9362,7±423,4	10861,2±604,6	7057,4±335,6*

Wartości wyrażono w pg/ml, jako średnią ± S.E.M.

n=10 zwierząt na grupę z wyjątkiem: grupy bez zapalenia stawów/nośnik (prawa łapa), grupy z zapaleniem stawów/nośnik(lewa łapa) i grupy z indometacyną (n=9)

Test Dunnett'a: * P < 0,05 w porównaniu ze szczurami z zapaleniem stawów traktowanymi nośnikiem

6. Pomiar TGF-P1 w krążeniu

Jak przedstawiono w tabeli 16, w D24 poziom TGF-P1 w osoczu był podwyższony w grupie z zapaleniem stawów traktowanej nośnikiem w porównaniu z grupą bez zapalenia stawów traktowaną nośnikiem (81715,7±1984,1 w porównaniu z 60269,9±2142,8). Indometacyna znacznie obniżała poziom TGF-P1 w osoczu po podawaniu 3 mg/kg/dobę p.o. (przez 10 dni) około 1,5-krotnie, w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (57222,2±3194,1 w porównaniu z 81715,7±1984,1). E3 (1 mg/kg i.v. w D14 i D19) i 911 (10 mg/kg p.o. w D14 i D19) znacznie obniżało poziom TGF-P1 w osoczu tak, że poziomy cytokin w grupach traktowanych E3 i 911 były porównywalne z poziomami obserwowanymi w grupie bez zapalenia stawów traktowanej nośnikiem (odpowiednio 69408,8±3926,7 i 67214,5±3649,4, w porównaniu z 60269,9±2142,8).

T a b e l a 16. Wpływ E3 i 911 po zastrzyku i.v. (2 dni w D14 i D19) na poziomy TGF-P1 w osoczu u szczurów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

Szczury bez zapalenia stawów	Szczury z zapaleniem stawów
Nośnik i.v.	Nośnik i.v	E3 1 mg/kg i.v.	911 10 mg/kg i.v.	Indometacyna 3 mg/kg
TGF-P1	60269,9 ±21428	81715,7±1984,1	69408,8±3926,7*	67214,5±3649,4*	57222,2±3194,1*

Wartości wyrażono w pg/ml, jako średnią ± S.E.M.

n=10 zwierząt na grupę z wyjątkiem grup: bez zapalenia stawów/nośnik (prawa łapa), z zapaleniem stawów/nośnik (lewa łapa) i z indometacyną (n=9)

Test t Dunnett'a: * P < 0,05 w porównaniu ze szczurami z zapaleniem stawów traktowanymi nośnikiem.

7. Parametry hematologiczne

Jak przedstawiono w tabeli 17, parametry hematologiczne takie jak krwinki białe i płytki krwi były wyższe u szczurów z zapaleniem stawów traktowanych nośnikiem w porównaniu do szczurów bez zapalenia stawów traktowanych nośnikiem (test t Studenta P<0,05), podczas gdy krwinki czerwone, hemoglobina i hematokryt (test t Studenta P>0,05) pozostały niezmienione. Indometacyna nie wpływa

PL 215 171 B1 na parametry krwi po podawaniu 3 mg/kg/dobę p.o. (przez 10 dni) w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem. E3 (1 mg/kg i.v. w D14 i D19) nie wpływało na parametry krwi w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem. 911 (10 mg/kg p.o. w D14 i D19) nie wpływało na parametry krwi w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem.

T a b e l a 17. Wpływ E3 i 911 po zastrzyku i.v. (2 dni w D14 i D19) na parametry krwi w reumatoidalnym zapaleniu stawów u szczurów (pomiar w D24)

Dzień	Krwinki białe 103/mm3	Krwinki czerwone 106/mm3	Hemoglobina g/dl	Hematokryt %	Płytki krwi 103/mm3
Szczury bez	Nośnik i.v.	8,7±0,9	7,98±0,31	15,1±0,7	42,±1,6	322±89
zapalenia stawów		n = 9	n = 9	n = 9	n = 9	n = 9
	Nośnik i.v.	19,0±0,9	7,54±0,31	13,2±0,7	37,4±1,6	10,43±89
		n=10	n=10	n=10	n=10	n=10
	E3 1 mg/kg	19,1±1,2	7,74±0,17	12,9±0,3	38,5±1,0	827±77
	i.v.	n = 7	n = 8	n = 8	n = 8	n = 8
Szczury z za-	911	22,6±2,9	7,30±0,40	12,1±0,7	36,5±2,1	799±121
paleniem sta-	10 mg/kg i.v.
wów		n = 8	n = 9	n = 9	n = 9	n = 9
	Indometacyna 3 mg/kg	21,7±2,5	6,93±0,31	11,8±0,6	35,0±1,5	705±111
	p.o. przez 10 dni	n = 9	n = 9	n = 9	n = 9	n = 9

Wartości wyrażono jako średnią ± S.E.M.

Anova: P > 0,05 w porównaniu ze szczurami z zapaleniem stawów traktowanymi nośnikiem.

7. Masa tylnej łapy

Jak pokazano w tabeli 18, masa lewej i prawej tylnej łapy była większa u szczurów z zapaleniem stawów traktowanych nośnikiem niż u szczurów bez zapalenia stawów traktowanych nośnikiem (odpowiednio 3,43±0,11 w porównaniu z 1,98±0,01 i 3,32±0,12 w porównaniu z 1,99±0,02 g) (test t Studenta lub test Mann'a-Withney'a P<0,05). Indometacyna znacznie zmniejszała masę tylnych łap po podawaniu 3 mg/kg/dobę p.o. (przez 10 dni) w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (lewa tylna łapa: 2,23±0,04 w porównaniu z 3,43+0,11 g; prawa tylna łapa: 2,20±0,05 w porównaniu z 3,32±0,12 g). E3 (1 mg/kg i.v. w D14 i D19) znacznie zwiększało tylko masę lewej tylnej łapy w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (lewa tylna łapa: 3,86±0,14 w porównaniu z 3,43±0,11 g; prawa tylna łapa: 3,72±0,13 w porównaniu z 3,32±0,12 g). 911 (10 mg/kg p.o. w D14 i D19) znacznie zwiększało tylko masę prawej tylnej łapy w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (lewa tylna łapa: 3,73±0,12 w porównaniu z 3,43±0,11 g; prawa tylna łapa: 3,83±0,15 w porównaniu z 3,32±0,12 g).

T a b e l a 18. Wpływ E3 i 911 po zastrzyku i.v. (2 dni w D14 i D19) na masę tylnych łap w reumatoidalnym zapaleniu stawów u szczurów (Pomiar w D24)

	Lewa łapa	Prawa łapa
Szczury	Nośnik i.v	1,98±0,01	1,99±0,02
bez zapalenia stawów
	nośnik i.v.	3,43+0,11	3,32±0,12
	E3 1 mg/kg i.v.	3,86±0,14*	3,72±0,13
Szczury z zapaleniem stawów	911 10 mg/kg i.v.	3,73±0,12	3,83±0,15*
indometacyna 3 mg/kg p.o.	2,23+0,04*	2,20±0,05*

	przez 10 dni

Wartości wyrażono w gramach jako średnią + S.E.M.

PL 215 171 B1 n=10 zwierząt na grupę z wyjątkiem indometacyny (n=9)

8. Analiza rentgenowska

Jak pokazano w tabeli 19, całkowitą punktację 0,0±0,0 obserwowano u traktowanych nośnikiem szczurów bez zapalenia stawów. Szczury z zapaleniem stawów traktowane nośnikiem mają całkowitą punktację 15,1±1,3 z dużą liczbą punktów za demineralizację (2,4±0,3), ubytki (2,7±0,3), uszkodzenia tkanki miękkiej (3,1±0,2) i szparę stawową (3,3±0,2), a umiarkowaną punktację za odczyn okostnowy (1,0±0,3), osteogenezę (0,8±0,2) i deformację (1,8±0,2). Indometacyna (3 mg/kg/dobę p.o przez 10 dni) silnie i znacznie obniżała całkowitą punktację o około 10,7 w porównaniu do traktowanych nośnikiem szczurów z zapaleniem stawów (4,4±0,9 w porównaniu z 15,1±1,3). E3 (1 mg/kg i.v. w D14 i D19) nie wpływało na całkowitą punktację w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (14,2±1,3 w porównaniu z 15,1±1,3). Środek 911 (10 mg/kg p.o. w D14 i D19) nie wpływał na całkowitą punktację w porównaniu z grupą z zapaleniem stawów traktowaną nośnikiem (15,4+1,0 w porównaniu z 15,1±1,3).

T a b e l a 19. Wpływ E3 i 911 po zastrzyku i.v. (2 dni w D14 i D19) na parametry rentgenowskie w reumatoidalnym zapaleniu stawów u szczurów

Dzień	Demine- ralizacja	Ubytki	Odczyn okostnowy	Uszkodzenia tkanki miękkiej	Szpara stawowa	Oste- ogeneza	Defor- macja	Całkowita punktacja
Szczury bez zapa-	nośnik i.v.	0,0±0,0	0,0±0,0	0,0±0,0	0,0±0,0	0,0±0,0	0,0±0,0	0,0±0,0	0,0±0,0
lenia stawów	nośnik i.v.	2,4±0,3	2,7±0,3	1,0±0,3	3,1±0,2	3,3±0,2	0,8±0,2	1,8±0,2	15,1±1,3
	E3 1 mg/kg i.v.	2,0±0,2	2,4±0,3	0,8±0,2	3,3±0,3	2,7±0,2	1,2±0,2	1,8±0,2	14,2±1,3
Szczury z zapaleniem stawów	911 10 mg/kg i.v.	2,3±0,3	2,5±0,2	1,0±0,3	3,4±0,2	3,3±0,2	0,9±0,2	2,0±0,2	15,4±1,0
	Indome- tacyna 3 mg/kg p.o.	0,3±0,2*	0,9±0,2*	0,7±0,3	1,0±0,2*	1,0±0,2*	0,1±0,1	0,4±0,2*	4,4±0,9*

Wartości wyrażono jako średnią ± S.E.M. (punktacji). n=10 zwierząt na grupę z wyjątkiem indometacyny (n=9)

Wnioski

W warunkach eksperymentalnych opisanych powyżej, E3 (1 mg/kg i.v. 2 dni: D14 - D19) i 911 (10 mg/kg i.v. 2 dni: D14 - D19) wykazały silne działanie przeciwbólowe, lecz nie wykazują znaczącego działania przeciwzapalnego w tym modelu zapalenia stawów.

P r z y k ł a d 9. Wpływ przeciwciała anty-NGF E3 w różnych dawkach w szczurzym modelu reumatoidalnego zapalenia stawów

Zdolność E3 do wywoływania zmniejszenia bólu u szczurów z zapaleniem stawów zbadano ponadto przez badanie zależności dawka-odpowiedź pomiędzy podawaniem E3 i zmniejszeniem bólu. Szczury traktowano adiuwantem w celu wywołania zapalenia stawów jak opisano powyżej. Dziesięciu szczurów nie nastrzykiwanych adiuwantem użyto jako kontroli bez zapalenia stawów. Czternaście dni po zastrzyku z adiuwantu, zwierzęta kwalifikowano do badania na podstawie kryteriów opisanych powyżej, losowo rozdzielając do ośmiu grup po dziesięć szczurów i badano pod kątem intensywności ich odpowiedzi wokalizacyjnej. Następnie w dniu 14 podawano im solankę, lub 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg lub 5 mg/kg przeciwciała E3 jak opisano powyżej. Zwierzęta badano pod kątem ich odpowiedzi wokalizacyjnej w dniach 16, 18, 20, i 24. Zwierzętom ponownie podawano solankę lub E3 w takiej samej dawce w dniu 18 po testowaniu wokalizacji. Zwierzęta także

PL 215 171 B1 ważono każdego dnia, rozpoczynając od dnia 14. Zatem zwierzętom podawano dwukrotnie solankę lub przeciwciało w danej dawce w dniach 14 i 18, i oceniano pod kątem bólu pięć razy, w dniach 14, 16, 18, 20 i 24. Dane przedstawiono w tabelach 20-22 i na fig. 20-22.

T a b e l a 20. Wpływ różnych dawek E3 na Odpowiedź nocyceptywną (intensywność wokalizacji) u szczurów z reumatoidalnym zapaleniem stawów.

Wartości intensywności wokalizacji wyrażono w mV jako średnią ± s.e.m.

Dzień 14

Dzień 16

Dzień 18

Dzień 20

Dzień 24

Wpływ traktowania zwierząt przeciwciałem anty-NGF E3 w różnych dawkach na wywołaną bólem wokalizację (dane przedstawione w tabeli 20) zanalizowano statystycznie stosując analizę wariancji dwuczynnikowej two-way ANOVA w celu porównania wyników otrzymanych parami pomiędzy zwierzętami z zapaleniem stawów potraktowanymi nośnikiem a tymi potraktowanymi przeciwciałem E3 w danej dawce. Wystąpił bardzo znaczący wpływ na wszystkich badanych poziomach E3 (p<0,0001). Nawet w najniższej badanej dawce (0,003 mg/kg E3), różnica w wokalizacji była znacząca (p<0,0001).

Jak pokazano w tabeli 20 i fig. 20, w zgodzie z powyższymi doświadczeniami, traktowanie przeciwciałem E3 w dawce 1 mg/kg wykazało szybką i zdecydowaną ulgę w bólu. W czasie dwóch dni (najwcześniejszy badany punkt czasowy) intensywność wokalizacji spadła o 90%. Traktowanie E3 w niższych stężeniach także zapewniało zdecydowaną ulgę w bólu, chociaż w niższych dawkach ulga w bólu występowała nieco później. Jest prawdopodobne, że widoczne zmniejszenie skuteczności w dniu 24 wszystkich badanych dawek oprócz najwyższej było spowodowane zmniejszeniem faktycznego poziomu osoczowego poziomu E3 w wyniku wtórnej odpowiedzi immunologicznej szczurów. Widoczne jest, że dawki tak niskie jak 0,003 mg/kg zapewniają co najmniej częściową ulgę w bólu w tym modelu.

T a b e l a 21. Wpływ różnych dawek E3 na masę ciała u szczurów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (znormalizowane do dnia 14).

Dzień 14	Bez zapalenia stawów	Nośnik	0,003 mg/kg	0,01 mg/kg	0,03 mg/kg
Średnia 100,00	S.E.M 0,00	Średnia 100,00	S.E.M 0,00	Średnia 100,00	S.E.M 0,00	Średnia 100,00	S.E.M 0,00	Średnia 100,00	S.E. 0,0
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
15	99,53	0,30	99,14	0,37	99,20	0,48	99,10	0,43	100,34	0,36
16	102,52	0,45	99,57	0,60	99,58	0,79	99,33	0,72	100,89	0,57
17	103,31	0,41	99,50	0,64	100,46	0,77	99,69	0,73	101,80	0,82
18	106,11	0,72	100,26	0,93	100,90	1,19	100,69	0,72	102,70	0,92

PL 215 171 B1 cd. tabeli 21

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
20	109,62	0,85	101,46	1,22	102,26	1,58	102,70	1,07	104,51	0,75
21	110,52	0,93	102,73	1,49	103,16	1,87	102,63	1,18	105,08	0,98
23	114,28	1,19	104,54	1,92	106,09	1,67	104,41	1,33	106,14	1,06
24	115,44	1,15	105,12	1,92	106,16	1,90	104,23	1,46	106,23	1,26
	Dzień 14	0,1 mg/kg	0,3 mg/kg		1,0 mg/kg x 5,0 mg/kg
		Średnia	S.E.M	Średnia	S.E.M	Średnia	S.E.M	Średnia	S.E.M
		100,00	0,00	100,00	0,00	100,00	0,00	100,00	100,00
	15	99,83	0,59	101,05	0,38	100,53	0,37	101,61	0,41
	16	101,07	0,82	102,88	0,50	102,95	0,56	104,09	0,60
	17	101,89	1,12	104,76	0,70	105,74	0,76	106,85	0,79
	18	103,69	1,47	107,11	0,78	108,46	0,82	109,53	1,00
	20	107,36	1,78	111,26	0,77	113,57	0,83	115,32	1,11
	21	108,50	2,01	113,31	0,87	116,71	0,92	119,11	1,21
	23	109,25	2,15	115,59	1,38	123,35	1,13	126,36	1,94
	24	108,77	2,08	115,58	1,43	124,41	1,00	127,25	1,79

T a b e l a 22. Wpływ E3 w różnych dawkach na masę ciała u szczurów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (znormalizowane do dnia 0).

Dzień 0	Bez zapalenia stawów	Nośnik	0,003 mg/kg	0,01 mg/kg	0,03 mg/kg
	Średnia 100,0	S.E.M 0,00	Średnia 100,0	S.E.M 0,00	Średnia 100,0	S.E.M 0,00	Średnia 100,0	S.E.M 0,00	Średnia 100,00	S.E.M 0,00
1	100,45	0,19	98,34	0,48	98,37	0,35	98,86	0,33	98,67	0,34
2	105,94	0,33	101,75	0,71	102,47	0,59	102,61	0,40	102,05	0,53
3	109,29	0,33	105,04	1,04	106,54	0,99	106,29	0,60	105,31	0,85
4	113,13	0,46	109,14	1,15	110,09	0,72	110,61	0,41	109,24	0,82
7	124,15	0,70	119,90	1,39	121,29	1,32	121,59	0,72	117,15	1,36
8	127,82	0,80	123,38	1,52	124,44	1,43	124,47	1,24	118,52	1,89
9	132,40	0,80	125,50	1,59	125,91	1,69	125,82	1,95	118,60	2,62
10	135,91	0,83	123,51	1,77	123,30	2,47	123,87	2,59	115,26	3,19
11	140,42	1,13	119,82	1,98	119,55	2,76	121,20	2,99	112,94	3,48
14	152,59	1,72	111,79	1,40	111,50	1,87	111,80	1,65	108,37	2,75
15	151,87	1,87	110,82	1,41	110,63	2,05	110,85	1,44	108,68	2,45
16	156,47	2,25	111,33	1,74	111,08	2,32	110,98	1,31	109,21	2,16
17	157,65	2,08	111,24	1,62	112,06	2,36	111,42	1,66	110,16	2,03
18	161,98	2,71	112,16	2,21	112,60	2,78	112,54	1,64	111,14	2,11
20	167,36	2,93	113,49	2,37	114,17	3,24	114,82	2,12	113,17	2,49
21	168,73	3,07	114,93	2,62	115,25	3,68	114,76	2,30	113,80	2,68
23	174,51	3,54	116,96	3,02	118,48	3,49	116,76	2,51	114,93	2,62
24	176,27	3,50	117,63	3,13	118,58	3,71	116,56	2,57	114,99	2,51
Dzień 0	0,1 mg/kg	0,3 mg/kg	1,0 mg/kg	5,0 mg/kg
	Średn.	S.E.M	Średn. S.E.M	Średn.	S.E.M	Średn. S.E.M
	100,00	0,00	100,00	0,00	100,00	0,00	100,00	0,00
1	99,31	0,61	99,26	0,28	98,81	0,27	98,25	0,58
2	102,87	0,73	102,98	0,43	103,18	0,50	101,82	0,53

PL 215 171 B1 cd. tabeli 22

3	106,26	0,82	106,95	0,50	106,52	0,55	105,47	0,58
4	110,20	0,64	110,50	0,58	110,52	0,67	109,29	0,58
7	120,50	1,20	120,03	0,82	121,54	1,15	119,77	1,19
8	123,48	1,58	121,38	1,31	124,28	1,59	121,96	1,72
9	125,46	2,47	121,57	2,09	125,60	2,23	123,04	2,42
10	123,95	3,38	118,27	3,07	124,11	2,97	120,00	2,81
11	121,98	3,93	116,02	3,32	121,27	3,42	117,97	2,98
14	113,90	2,14	108,43	1,94	111,72	2,27	111,58	2,59
15	113,66	1,91	109,59	2,12	112,30	2,23	113,33	2,37
16	115,06	2,00	111,54	2,02	115,00	2,36	116,06	2,30
17	115,99	2,18	113,57	2,04	118,08	2,32	119,14	2,42
18	118,01	2,29	116,13	2,14	121,16	2,55	122,14	2,61
20	121,17	2,57	120,62	2,20	126,90	2,87	128,60	2,77
21	123,49	2,90	122,88	2,49	130,41	2,98	132,82	2,84
23	124,35	3,02	125,36	2,83	137,81	3,09	140,79	2,83
24	123,77	2,80	125,33	2,75	138,93	2,76	141,77	2,61

Wpływ traktowania zwierząt przeciwciałem anty-NGF E3 w różnych dawkach na masę ciała zanalizowano statystycznie stosując analizę wariancji dwuczynnikowej - two-way ANOVA w celu porównania otrzymanych wyników parami pomiędzy zwierzętami z zapaleniem stawów traktowanymi nośnikiem z traktowanymi przeciwciałem E3 w danej dawce. Stosując dane znormalizowane do masy ciała w dniu 14 (tabela 21), dawki 0,03 mg/kg E3 powodowały znaczącą zmianę masy ciała (p<0, 005). We wszystkich większych dawkach E3, różnica pomiędzy potraktowanymi i nietraktowanymi zwierzętami z zapaleniem stawów była znacząca (p = lub <0,0001). Stosując dane znormalizowane do masy ciała w dniu 0 (tabela 22), dawka 0,03 mg/kg E3 powodowała znaczącą zmianę masy ciała (p<0,002). We wszystkich większych dawkach E3, różnica pomiędzy traktowanymi i nietraktowanymi zwierzętami z zapaleniem stawów była znacząca (p0.0001).

Ponownie zgodnie z wcześniejszymi badaniami, szczury traktowane E3 wykazały mniej widoczną utratę masy ciała niż szczury z zapaleniem stawów traktowane solanką (tabela 22 i fig. 22). Właściwie, szczury traktowane przeciwciałem E3 w dużych dawkach wcześniej odrabiały utratę masy ciała, i właściwie przybierały na wadze szybciej, niż ich szczury z grupy kontrolnej bez zapalenia stawów (tabela 21 i fig. 21).

Deponowanie materiału biologicznego

Następujące materiały zdeponowano w American Type Culture Collection, 10801 University

Boulevard, Manassas, Virginia, USA (ATCC):

Materiał		Numer akcesyjny ATCC	Data zdeponowania
Eb.911.3E	Łańcuch lekki E3	PTA-4893	8 stycznia 2003
Eb.pur.911.3E	Łańcuch lekki E3	PTA-4894	8 stycznia 2003
Db.911.3E	Łańcuch ciężki E3	PTA-4895	8 stycznia 2003

Wektor Eb.911.3E jest polinukleotydem kodującym rejon zmienny łańcucha lekkiego E3; wektor Eb.pur.911.3E jest polinukleotydem kodującym rejon zmienny łańcucha lekkiego E3, a wektor Db,911,3E jest polinukleotydem kodującym rejon zmienny łańcucha ciężkiego E3.

Ten depozyt złożono zgodnie z postanowieniami Traktatu Budapesztańskiego w International Recognition of the Deposit of Microorganisms zgodnie z wymaganiami Purpose of Patent Procedure and Regulations (Traktat Budapesztański). Zapewnia to utrzymanie zdolnej do życia zdeponowanej hodowli przez 30 lat od daty zdeponowania. Depozyt będzie udostępniany przez ATCC zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego, i będzie przedmiotem porozumienia pomiędzy Rinat Neuroscience Corp. i ATCC, co zapewnia stałą i nieograniczoną dostępność potomnych hodowli depozytu zgodnie z odnośnym opisem patentowym St. Zjedn. Ameryki lub ogólnie udostępnionych zgodnie z którymkolwiek opisem patentowym St. Zjedn. Ameryki lub zagranicznych zgłoszeń patentowych,

PL 215 171 B1 zgodnie z pierwszeństwem, i zapewnia dostępność hodowli potomnych podmiotom określonym przez Komisarza ds Patentów i Znaków Towarowych Stanów Zjedn. Ameryki Półn. upoważnionego do tego zgodnie z 35 USC rozdz. 122 i przepisów dotyczących Komisarza odnośnie tegoż (w tym 37 CFR rozdz. 1,14 ze szczególnym odniesieniem do 886 OG 638).

Następca prawny niniejszego zgłoszenia zgodził się, że jeśli materiał hodowlany depozytu obumrze lub zostanie utracony lub zniszczony podczas hodowli w odpowiednich warunkach, materiały będą natychmiast zastąpione po powiadomieniu innym identycznym meteriałem. Dostępności zdeponowanego materiału nie należy interpretować jako licencji na stosowanie wynalazku w praktyce wbrew prawom przyznanym zgodnie z prawem dowolnego rządu zgodnie z jego prawami patentowymi.

Sekwencje przeciwciał

Rejon zmienny łańcucha ciężkiego (rejony Kabat CDR są podkreślone; rejony Chotia CDR oznaczono TŁUSTYM, POCHYŁYM DRUKIEM)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSA VKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLV TVS (SEQ ID nr: 1)

Rejon zmienny łańcucha lekkiego (Rejony Kabat CDR są podkreślone; rejony Chotia CDR oznaczono TŁUSTYM, POCHYŁYM DRUKIEM) diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqSisnnlnwyqqkpgkapklliyytsrfhsgvpsraFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRT (SEQ ID nr: 2)

Wydłużone rejony CDR łańcucha ciężkiego E3

CDRH1: GFSLIGYDLN (SEQ ID nr: 3)

CDRH2: IIWGDGTTDYNSAVKS (SEQ ID nr: 4)

CDRH3: GGYWYATSYYFDY (SEQ ID nr: 5)

Wydłużone rejony CDR łańcucha lekkiego E3

PL 215 171 B1

CDRLl: RASQSISNNLN (SEQ ID nr: 6)

CDRL2: YTSRFHS (SEQ ID nr: 7)

CDRL3: QQEHTLPYT (SEQ ID nr: 8)

Wydłużone rejony CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego

911

Wydłużone rejony CDR łańcucha ciężkiego 911 CDRHl : GFSLIGYDIN (SEQ ID nr: 9)

CDRH2 : M1WGDGTTDYKSALKS (SEQ ID nr: 10)

CDRH3: GGYYYGTSYYFDY (SEQ ID nr: 11)

Wydłużone rejony CDR łańcucha lekkiego 911 CDRLl: RASQDISNHLN (SEQ ID nr: 12)

CDRL2: YISRFHS (SEG ID nr: 13)

CDRL3: QQSKTLFYT (SEQ ID nr: 14}

Sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego E3 (pełna) QVQLGESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGT

TDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLV

TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFFEFVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL

QSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPS

VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF

RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID nr: 16)

Sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego 3E (pełnego przeciwciała)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHS

GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQGEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFI

FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHXVYAC£VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID nr: 17)

Sekwencja nukłeotydowa łańcucha ciężkiego 3E (pełnego przeciwciała)

PL 215 171 B1

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTC

CCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAG

CCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAACCACAGACTATA

ATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCT

GAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTAT

TGGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCT

CAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGA

GAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCC

TGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAG

GTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTA

CACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAG

TGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGT

TCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGT

GGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAG

GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGA

GCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTC

CAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGA

GAGCCACAGGTGTATACCCTGCCACCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCC

TGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGG

ACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTC

CTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTT

CCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGG

AAAGTAA (SEQ ID nr: 65)

Sekwencja nukleotydowa domeny zmiennej łańcucha ciężkiego 3E

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTC

CCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAG

CCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAACCACAGACTATA

ATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCT (□AAlnL-1 óAkjC X ΙσΧΗΧ X/iv Wi ΙζνΧχίτΛ?Mί^^Α^^Χ Xni

PL 215 171 B1

TGGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCT

CA (SEQ ID nr: 66)

Sekwencja nukleotydowa łańcucha lekkiego 3E (pełnego przeciwciała)

GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGT

CACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAG

CCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCAT

CACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACC

AGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAA

GGCACCAAGCTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTTCCTCCAT

CTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCC

ACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAG

AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGA

GCAAAGCAGACIACGAGAAACACMAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAG

TTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA (SEQ ID nr: 67)

Sekwencja nukleotydowa domeny zmiennej łańcucha lekkiego

3E

GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGT

CACCAT CACCT GC CGC G CATCTCAGT CCATTAGCAATAATCT GAACT GGTATCAGCAGAAG

CCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCAT

CACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACC

AGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAA

GGCACCAAGCTGGAGAICAAACGC (SEQ ID nr: 68)

PL 215 171 B1

Lista sekwencji <110> Rinat Neuroscience Corp.

SHSLTON, David L.

PONS, Jaume ROSENTHAL, Arnon <120> PRZECIWCIAŁA ANTY-NGF I SPOSOBY ICH ZASTOSOWANIA <130> 514712001453 <140> Jeszcze nie przypisany <141> 2003-12-24 <150> PCT/US2003/041252 <151> 2003-12-24 <150> US 60/510,006 <151> 2003-10-06 <150> US 60/443,522 <151> 2003-01-28 <150> US 60/436,905 <151> 2002-12-24 <160> 77 <170> FastSEQ dla Windows Yersion 4.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 1

Gln

Val

Gln

Leu

Gln

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Yal

Lys

Pro

Ser

Glu

1

5

10

15

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ile

Gly

Tyr

20

25

30

Asp

Leu

Asn

Trp

Ile

Arg

Gln

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

4 0

45

Gly

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

Yal

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

As n

Gln

Phe

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Giy

Gly

Tyr

Trp

Tyr

Ala

Thr

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

IGO

105

110

Gln

dy

Thr

Leu

Yal

Thr

Yal

Ser

115

120

<210> 2

PL 215 171 B1 <211> 109 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 2

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Yal Gly

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Ile

Ser

Asn

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Thr

Ser

Arg

Phe

His

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Glu

His

Thr

Leu

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

<210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 3

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Asn 1 5 ' 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 4

Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Yal Lys Ser 15 10 15 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 5

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

PL 215 171 B1

1	5	10
<210	6
<211>	1 1
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220
<223>	Konstrukt syntetyczny
<400	6
Arg Al	.a Ser Gin Ser Ile Ser Asn	Asn Leu
1	5	10
<210>	7
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220
<223>	Konstrukt syntetyczny
<400>	7
Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser
1	5
<210	8
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220
<223>	Konstrukt syntetyczny
<400>	8
Gin Gin Glu His Thr Leu Pro Tyr	Thr
1	5
<210>	9
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Mus musoulus
<40Q>	9
Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp	Ile Asn
1	5	10
<210>	10
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Mus musculus

PL 215 171 B1 <400> 10

Met Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 15 IG 15 <21O> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 IG <21O> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Mus imisculus <4CO> 12

Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn His Leu Asn 15 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13

Tyr Ile Ser Arg Phe His Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Kus musculus <400> 14

Gin Gin Ser Lys Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5

<210» <211> <212> <213>	15 15 PRT Sekwencja	s ztuczna
<220> <223>	Konstrukt	syntetyczny

<400> 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15

PL 215 171 B1 <210> 16 <211> 441 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 16

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Vał

Lys

Pro

Ser

Glu

1

5

10

15

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ile

Gly

Tyr

20

25

30

Asp

Leu

Asn

Trp

Tle

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

Val

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Al a

Val

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Gly

Tyr

Trp

Tyr

Ala

Thr

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

115

120

125

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

130

135

14Q

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

val

145

150

155

160

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

165

170

175

Val

Leu

Gin

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

Val

180

185

190

Pro

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

195

2 00

205

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

210

215

220

Val

Glu

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

225

230

235

240

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

245

250

255

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

2 60

265

270

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

275

280

285

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Ser

290

2 95

300

Va 1

Leu

Thr

Yal

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

305

310

315

320

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

^Ly^s

Gly

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

325

330

335

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

340

345

350

Pro

Ser

Arg

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

355

360

365

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Al a

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

370

375

380

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

385

390

395

400

PL 215 171 B1

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

^Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

405

410

415

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

420

425

430

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

c-ly

Lys

435

440

445

<210> 17 <211> 214 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <220>

<221> ODMIANA <222> 190 <223> Xaa - Dowolny aminokwas <400> 17

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Asn

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Thr

Ser

Arg

Phe

His

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Glu

His

Thr

Leu

Pro

Tyr

35

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

IGO

105

110

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Vał

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145

150

155

160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Xaa

Val

Tyr

180

135

190

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

dy

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210>	18
<211>	11
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny

PL 215 171 B1

<400> Arg Al 1	18 .a Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu	Asn
5	10
<210>	19
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<22Ο> <223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	19
Tyr Thr Ser Arg	Phe His Ser
1		5
<210>	20
<211>	11
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220> <223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	20
Arg Ala Ser Gln	Tyr Ile Ser	Asn	His	Leu	Asn
1		5			10
<210>	21
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220> <223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	21
Tyr Thr Ser Arg	Phe His Ser
1		5
<210>	22
<211>	11
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220> <223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	22
Arg Ά.	la Ser Gln	Ser Ile Ser	Asn	Gln	Leu	Asn
1		5			10

<210> 23 <211> 7 <212> PRT

PL 215 171 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 23

Tyr Val Ser Arg Phe His Ser

- 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 24

Arg Ala Phe Gin Ala Ile Ser Asn Gin Leu Asn 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 25

Tyr Ile Ser Arg Phe His Thr

1	5
<210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja	sztuczna
<220>
<223> Konstrukt	syntetyczny
<400> 26 Arg Ala Phe Gin	Ser Ile Ser Asn Gin Leu Asn

10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 27

Tyr Ala Ser Arg Phe His Ser

PL 215 171 B1

1		5
<210>	28
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Sekwencj a	sztuczna
<220
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400	28
Gly Phe Ser Leu	Ile Gly Tyr Asp Ser Asn

<210>	23
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400	29
Ile Ile Trp Gly	Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu

<210>	30
<111»	10
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	30
Gly Phe Ser Leu	Ile Gly Tyr Asp Leu Asn

<210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 31

Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Yal 15 10

<210 <211> <212> <213»	32 10 ϋΟΤ Je Χλ X Sekwencja
<220>

PL 215 171 B1 <223> Konstrukt syntetyczny <400> 32

Gly Phe Ser Len Ile Gly Tyr Asp Val Thr 1 5 10

<210>	33
<211>	14
< 212 >	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<22Q>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	33
Gly Ile Trp Gly	Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val

<210> <211> <212> <213>	34 10 PRT Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	34

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Val Thr 15 10

<210>	35
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny

<400> 35

Gly Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Val 15 10

<210>	36
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	36
Gly Phe Ser Leu	Ile Gly Tyr Asp Ala Thr
^x		5 10
<210	37

PL 215 171 B1 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400 37

Gly Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val

1		5			10
<210	38
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Sekwencj a	sztuczna
<220
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400	38
Gly Phe Ser Leu	Ile Gly Tyr	Asp	Val	Ser
1		5			10
<210>	39
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Sekwencj a	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	39
Ile Ile Trp Gly	Asp Gly Thr	Thr	Asp	Tyr
1		5			10
<210	40
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Sekwencj a	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400	40
Gly Phe Ser Leu	Ile Gly Tyr	Asp	Ile	Ser
1		5			10
<210	41
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220
<223>	Konstrukt	syntetyczny

<400 41

100

PL 215 171 B1

Gin Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Val 15 10

<210>	4 2
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	42
Gly Phe Ser Leu	Ile Gly Tyr Asp Ala Ser

<210>	43
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sstuc^na
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	43
Gly Ile Trp Gly	Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Val

<210>	44
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	44
Gly Phe Ser Leu	Ile Gly Tyr Asp Ser Thr

<210>	45
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Sekwencj a	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	45
Ser Ile Trp Gly	Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu

<210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 215 171 B1

101 <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400 46

Gly Gly Tyr Trp	Tyr Gly Thr	Ser	Tyr	Tyr	Phe	Asp	Tyr
1		5			10
<210	47
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Sekwencj a	s ztuc zna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	47
Gly Gly Tyr Tyr	Tyr Gly Thr	Ala	Tyr	Tyr	Phe	Asp	Tyr
1		5			10

<210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Konstrukt syntetyczny <40(0 48

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 , <223> Konstrukt syntetyczny <400> 49

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10

<210> <211> <212> <213>	50 9 PRT Sekwencja	sztuczna
<220 <223>	Konstrukt	syntetyczny
<400	50
Gln G.	Ln Glu Lys	Thr Leu Pro Tyr Thr

5

102

PL 215 171 B1

<210> <211> <212> <213>	51 9 PRT Sekwencj a	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny

<400> 51

Gin Gin Glu Ala Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 52

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Ty: 1 5 10 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 53

Gin Gin Glu Arg Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 54 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 54

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1	5
<210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja	sztuczna
<220>
<223> Konstrukt	syntetyczny
<400> 55

PL 215 171 B1

103

Gln Gln Glu His 1	Thr Leu Pro 5	Tyr	Thr
<210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja	sztuczna
<220> <223> Konstrukt	syntetyczny
<400> 56 Gly Gly Tyr Trp 1	Tyr Ala Thr 5	Ser	Tyr	Ty£ 10	Phe	Asp	Tyr
<210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja	sztuczna
<220> <223> Konstrukt	syntetyczny
<400> 57 Gln Gln Glu Ser 1	Thr Leu Pro 5	Tyr	Thr
<210 58 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja	sztuczna
<220> <223» Konstrukt	syntetyczny
<400> 5Θ Gly Gly Tyr Trp 1	Tyr Ser Thr 5	Ser	Tyr	Tyr 10	Phe	Asp	Tyr
<210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja	sztuczna
<220> <223> Konstrukt	syntetyczny
<400> 59 Gln Gln Glu Lys	Thr Leu Pro	Tyr	Thr

5 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

104

PL 215 171 B1 <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 60

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10

<210>	61
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Sekwencj a	s ztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	61
Gln Gln Glu Arg	Thr Leu Pro Tyr Thr

<210>	62
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Sekwencj a	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	62
Gly Gl	,y Tyr Trp	Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

<210>	63
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	63
Gln Gln Glu Arg	Thr Leu Pro Tyr Thr

<210>	64
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Sekwencj a
<220>
<223>	Konstrukt
<400>	64
Gly Gly Tyr Tyr
1
<210>	65

PL 215 171 B1

105 <211» 1344 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 65 caggtgcagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc cttccgagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctgggtt ctcacttatc ggctatgatc ttaactggat ccgacagcct 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggatt atctggggtg atggaaccac agactataat 180 tcagetgtca aatcccgcgt caccatctca aaagacacct ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggaggttat 300 tggtacgcca ctagctacta ctttgactac tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atctgtcttc ccactgaccc catgctcccg cagcacctcc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tcccagaacc tgtgaccgtg 480 tcctggaact ctggcgctct gaceagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtcc 540 tcaggtctct actccctcag cagcgtggtg accgtgccat ccagcaactt cggcacccag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagcca agcaacacca aggtcgacaa gaccgtggag 660 agaaagtgtt gtgtggagtg tccaccttgt ccagcccctc cagtggccgg accatccgtg 720 ttcctgttcc ctccaaagcc aaaggacacc ctgatgatct ccagaacccc agaggtgacc 780 tgtgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac ccagaggtgc agttcaactg gtatgtggac 840 ggagtggsgg tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg agcagttcaa ctccaccttc 900 agagtggtga gcgtgctgac cgtggtgcac caggactggc tgaacggaaa ggagtataag 960 tgtaaggtgt ccaacaaggg actgccatcc agcatcgaga agaccatctc caagaccaag 1020 ggacagccaa gagagccaca ggtgtatacc ctgccaccat ccagagagga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggattctatc cstccgacat cgccgtggag 1140 tgggagtcca acggacagcc agagaacaac tataagacca cccctocaat gctggactcc 1200 gacggatcct tcttcctgta ttccaagctg accgtggaca agtccagatg gcagcaggga 1260 aacgtgttct cttgttccgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagagc 1320 ctgtccctgt ctccaggaaa gtaa 1344 <210> 66 <211> 363 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400 66 caggtgcagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc cttccgagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctgggtt ctcacttatc ggctatgatc ttaactggat ccgacagcct 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggatt atctggggtg atggaaccac agactataat 180 tcagetgtca aatcccgcgt caccatctca aaagacacct ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggaggttat 300 tggtacgcca ctagctacta ctttgactac tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tea 363 <210> 67 <211> 645 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Konstrukt syntetyczny <400> 67 gatatccaga tgacacagtc cccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggtga ccgcgtcacc 60 atcacctgcc gcgcatctca gtccattagc aataatctga actggtatca gcagaagcca 120

106

PL 215 171 B1 ggcaaagccc cgcttcagtg gaagatattg ggcaccaagc tctgatgagc ccacgcgagg gagagtgtca ctgagcaaag ctgagttctc caaaactcct gcagtggctc ccacttatta tggagatcaa agttgaaatc ccaaagtaca cagagcagga cagactacga cagtcacaaa gatctactac tggtacagat ctgccaacag acgcactgtg cggaactgcc gtggaaggtg cagcaaggac gaaacacmaa gagcttcaac acctcacgct ttcaccttca gagcataccc gctgcaccat tctgttgtgt gataacgccc agcacctaca gtctacgcct cgcggtgagt tccactcagg ccattagcag ttccatatac ctgtcttcat gcctgctgaa tccaatccgg gcctcagcag gcgaagtcac gctaa tgtcccatca 180 cctgcaacca 240 cttcggtcaa 300 ctttcctcca 360 taacttctat 420 taactcccag 480 caccctgacc 540 ccatcagggc 500

645 <21Q> 66 <211> 324 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 68 gatatccaga atcacctgcc ggcaaagccc cgcttcagtg gaagatattg ggcaccaagc tgacacagtc cccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggtga ccgcgtcacc 60 gcgcatctca gtccattagc aataatctga actggtatca gcagaagcca 120 caaaactcct gatctactac acctcacgct tccactcagg tgtcccatca 180 gcagtggctc tggtacagat ttcaccttca ccattagcag cctgcaacca 240 ccacttatta ctgccaacag gagcataccc ttccatatac cttcggtcaa 300 tggagatcaa acgc 324

<210>	69
<211>	98
<212>	PRT
<213>	Homo

<400> 69

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Glu

1

5

10

15

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Tle

Ser

Tyr

20

25

30

Tyr

Trp

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Ser

dy

Ser

Thr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

P he

Ser

Leu

65

70

75

50

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Yal

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Gly

<210> 70 <211> 120 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 70

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Yal Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Yal Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr

PL 215 171 B1

107

20

25

30

Asp

Ile

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Met

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

Leu

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Al a

85

90

95

Arg

Gly

Tyr

Gly

Thr

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

lic

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 71 <211> 120 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 71

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Glu

1

5

10

15

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ile

Gly

Tyr

20

25

30

Asp

Ile

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Met

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

Leu

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Αερ

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Gly

Tyr

Gly

Thr

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

val

Ser

115

120

<210> 72 <211> 120 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 72

Gin

Va.l

Gin

Leu

Gin 5

Glu

Ser

Gly Pro Gly Leu yal 10

Lys

Pro

Ser 15

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ile

Gly

Tyr

20

25

30

Asp

Leu

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

11©

35

40

45

Giy

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

Val

108

PL 215 171 B1

50

55

60

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

As n

Gln

Phe

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

cys

Ala

35

90

95

Arg

Gly

Tyr

Gly

Thr

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210 73 <211» 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr Gln 5

Ser

Pro

Ser

Ser Leu Ser Ala Ser 10

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Gln

Ala

Ser

Gln

Asp

Ile

Ser

Asn

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Thr

Gly

val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Asp

Asn

Leu

Pro

85

SO

95

<210> <211> <212> <213»	74 109 PRT Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Konstrukt	syntetyczny
<400>	74
Asp Ile Gln Met	Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1		5 10 15
Asp Arg Yal Thr	Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn His
	20	25 30
Leu Asn Trp Tyr	Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
	35	40 45
Tyr T	yr Ile Ser	Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50	55 60
Ser Gly Ser Gly	Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65		70 . 75 80
Glu Asp Ile Ala	Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Thr Leu Pro Tyr
		85 90 95
Thr Phe Gly Gln	Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
	100	105

<210»	75
<211>	109
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna

PL 215 171 B1

109 <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <400> 75

Asp

Ile

Gln

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Yal

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Yal

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Ile

Ser

Asn

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Thr

Ser

Arg

Phe

His

Ser

dy

Yal

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

dy

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Ser

Lys

Thr

Leu

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

dy

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

G1U

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

<210> 76 <211> 1429 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> .

<223> Konstrukt syntetyczny <4Ο0> 76 atggccaccg actccagaac ctcctggctg ctgacagtgt ccctgctgtg tctgctgtgg 60 ccacaggagg ccagcgctca ggtgcagctg caggaglctg gcccaggact ggtgaagcct 120 tccgagaccc tgtccctcac ctgcactgtc tctgggttct cacttatcgg ctatgatctt 180 aactggatcc gacagcctcc agggaaggga ct.ggagtgga ttgggattat ctggggtgat 240 ggaaccacag actataattc agctgtcaaa tcccgcgtca ccatctcaaa agacacctcc 300 aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct gtgaccgccg cggacacggc cgtgtattac 360 tgtgcgagag gaggttattg gtacgccact agctactact ttgactactg gggccagggc 420 accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat ctgtcttccc actggcccca 480 tgctcccgca gcacctccga gagcacagcc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 540 ccagaacctg tgaccgtgtc ctggaactct ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc 600 ccagctgtcc tgcagtcctc aggtctctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccatcc 660 agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc aacgtagatc acaagccaag caacaccaag 720 gtcgacaaga ccgtggagag aaagtgttgt gtggagtgtc caccttgtcc agcccctcca 780 gtggccggac catccgtgtt cetgttccct ccaaagccaa aggacaccct gatgatctcc 840 agaaccccag aggtgacctg tgtggtggtg gacgtgtccc acgaggaccc agaggtgcag 900 ttcaactggt atgtggacgg agtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc aagagaggag 960 cagttcaact ccaccttcag agtggtgagc gtgctgaccg tggtgcacca ggactggctg 1020 aacggaaagg agtataagtg taaggtgtcc aacaagggac tgccatccag catcgagaag 1080 accatctcca agaccaaggg acagccaaga gagccacagg tgtataccct gccaccatcc 1140 agagaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgtc tggtgaaggg attctatcca 1200 tccgacatcg ccgtggagtg ggagtccaac ggacagccag agaacaacta taagaccacc 1260 cctccaatgc tggactccga cggatccttc ttcctgtatt ccaagctgac cgtggacaag 1320 tccagatggc agcagggaaa cgtgttctct tgttccgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1380 cactataccc agaagagcct gtccctgtct ccaggaaagt aattctaga 1429 <210> 77 <211> 729 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

110

PL 215 171 B1 <220>

<223> Konstrukt syntetyczny <220>

<221> Różnorodne cechy <222> 646 <223> m - A lub C <400> 77 atggccaccg actccagaac ctcctggctg ctgacagtgt ccctgctgtg tctgctgtgg 60 ccacaggagg ccagcgctga tatccagatg acacagtccc catcctccct gtctgcctct 120 gtgggtgacc gcgtcaccat cacctgccgc gcatctcagt ccattagcaa taatctgaac 180 taatatcacfc aqaagccagg caaaącccca aaactcctaa tctactacac ctcacgcttc 240 cacteaggtg tcccatcacg cttcagtggc agtggctctg gtacagattt caccttcacc 300 attagcagcc tgcaaccaga agatattgcc acttattact gccaacagga gcataccctt 360 ccatatacct tcggtcaagg caccaagctg gagatcaaac gcactgtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct ttcctccatc tgatgagcag ttgaaatccg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc acgcgaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatccggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgaccct gagcaaagca gactacgaga aacacmaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagttctcca gtcacaaaga gcttcaaccg cggtgagtgc 720 taattctag 729

Claims

1. Przeciwciało przeciw czynnikowi wzrostu nerwów (NGF) lub jego fragment, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment:

(a) wiąże się z NGF z KD poniżej około 2 nanomoli;

2. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym.

3. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem o dojrzałym powinowactwie.

4. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonaInym.

5. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, 2, znamienne tym, że przeciwciało jest wyizolowane.

6. Przeciwciało lub jego fragment zawierające rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący:

(b) rejon CDR2 o SEQ ID nr 10, w którym aminokwasem w pozycji 1 w SEQ ID nr 10 jest M, I, G, Q, S, lub L; aminokwasem w pozycji 13 w SEQ ID nr 10 jest A, lub S; i aminokwasem w pozycji 14 w SEQ ID nr 10 jest L lub V; i (c) rejon CDR3 o SEQ ID nr: 11, w którym aminokwasem w pozycji 3 w SEQ ID nr 11 jest Y, L, lub R; aminokwasem w pozycji 4 w SEQ ID nr 11 jest Y lub W; aminokwasem w pozycji 6 w SEQ ID nr 11 jest G, A, lub S; aminokwasem w pozycji 7 w SEQ ID nr 11 jest T lub S; aminokwasem w pozycji 8 w SEQ ID nr 11 jest S, A, lub T; aminokwasem w pozycji 9 w SEQ ID nr 11

PL 215 171 B1

111 jest Y, R, T, lub M; aminokwasem w pozycji 10 w SEQ ID nr 11 jest Y lub F; aminokwasem w pozycji 11 w SEQ ID nr 11 jest F lub W; aminokwasem w pozycji 12 w SEQ ID nr 11 jest D, N lub G; i aminokwasem w pozycji 13 w SEQ ID nr 11 jest Y, K, S, R lub T;

przy czym przeciwciało wiąże NGF;

7. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 6, znamienne tym, że zawiera ponadto rejon zmienny łańcucha lekkiego.

8. Przeciwciało lub jego fragment zawierające rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący:

(a) rejon CDR1 o SEQ ID nr 12, w którym aminokwasem w pozycji 3 w SEQ ID nr 12 jest S lub F; aminokwasem w pozycji 5 w SEQ ID nr 12 jest D, S, A, lub Y; i aminokwasem w pozycji 9 w SEQ ID nr 12 jest Η, N,lub Q;

9. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 8, znamienne tym, że zawiera ponadto rejon zmienny łańcucha cięż kiego.

10. Przeciwciało lub jego fragment zawierające (a) rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący:

(ii) rejon CDR2 o SEQ ID nr 10, w którym aminokwasem w pozycji 1 SEQ ID nr 10 jest M, I, G, Q, S, lub L; aminokwasem w pozycji 13 SEQ ID nr 10 jest A, lub S; i aminokwasem w pozycji 14 SEQ ID nr 10 jest L lub V; i (iii) rejon CDR3 o SEQ ID nr: 11, w którym aminokwasem w pozycji 3 SEQ ID nr 11 jest Y, L, lub R; aminokwasem w pozycji 4 SEQ ID nr 11 jest Y lub W; aminokwasem w pozycji 6 SEQ ID nr 11 jest G, A, lub S; aminokwasem w pozycji 7 SEQ ID nr 11 jest T lub S; aminokwasem w pozycji 8 SEQ ID nr 11 jest S, A, lub T; aminokwasem w pozycji 9 SEQ ID nr 11 jest Y, R, T, lub M; aminokwasem w pozycji 10 SEQ ID nr 11 jest Y lub F; aminokwasem w pozycji 11 SEQ ID nr 11 jest F lub W; aminokwasem w pozycji 12 SEQ ID nr 11 jest D, N lub G; aminokwasem w pozycji 13 SEQ ID nr 11 jest Y, K, S, R lub T; i (b) rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący:

(i) rejon CDR1o SEQ ID nr: 12, w którym aminokwasem w pozycji 3 SEQ ID nr 12 jest S lub F; aminokwasem w pozycji 5 SEQ ID nr 12 jest D, S, A, lub Y; i aminokwasem w pozycji 9 SEQ ID nr 12 jest Η, N, lub Q;

(ii) rejon CDR2 o SEQ ID nr: 13, w którym aminokwasem w pozycji 2 SEQ ID nr 13 jest I, T, V lub A; i aminokwasem w pozycji 7 SEQ ID nr 13 jest S lub T; i (iii) rejon CDR3 o SEQ ID nr: 14, w którym aminokwasem w pozycji 3 SEQ ID nr 14 jest S lub E; aminokwasem w pozycji 4 SEQ ID nr 14 jest K, H, R, lub S; i aminokwasem w pozycji 8 SEQ ID nr 14 jest Y lub R;

przy czym przeciwciało wiąże NGF, oraz przeciwciało nie jest przeciwciałem zawierającym rejon zmienny ciężkiego łańcucha zawierający rejon CDR1 przedstawiony w SEQ ID nr 9, rejon CDR2 przedstawiony w SEQ ID nr 10 i rejon CDR3 przedstawiony w SEQ ID nr 11 i rejon zmienny łańcucha lekkiego zawierający rejon

112

PL 215 171 B1

CDR1 przedstawiony w SEQ ID nr 12, rejon CDR2 przedstawiony w SEQ ID nr 13 i rejon CDR3 przedstawiony w SEQ ID nr 14.

11. Przeciwciało lub jego fragment według któregokolwiek z zastrz. 6-10, znamienne tym, że przeciwciało wiąże ludzki NGF.

12. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 11, znamienne tym, że przeciwciało ponadto wiąże NGF gryzoni.

13. Przeciwciało lub jego fragment według któregokolwiek z zastrz. 6-10, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

14. Przeciwciało lub jego fragment według któregokolwiek z zastrz. 6-10, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym.

15. Przeciwciało lub jego fragment według któregokolwiek z zastrz. 6-10, znamienne tym, że przeciwciało wiąże NGF z KD około 2 nanomoli lub mniej.

16. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 15, znamienne tym, że KD wynosi około 100 pikomoli lub mniej.

17. Przeciwciało anty-NGF lub jego fragment, znamienny tym, że zawiera: a) trzy CDR-y ze zmiennego rejonu łańcucha ciężkiego sekwencji SEQ ID nr 1; i b) trzy CDR-y ze zmiennego rejonu łańcucha lekkiego sekwencji SEQ ID nr 2.

18. Przeciwciało lub jego fragment zawierające rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący:

(a) rejon CDR1 przedstawiony jako SEQ ID nr: 3;

19. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 18, zawierające ponadto rejon zmienny łańcucha lekkiego.

20. Przeciwciało lub jego fragment zawierające rejon zmienny łańcucha lekkiego obejmujący:

(a) rejon CDR1 przedstawiony jako SEQ ID nr: 6;

21. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 20, znamienne tym, że zawiera ponadto rejon zmienny łańcucha ciężkiego.

22. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 20, znamienne tym, że zawiera ponadto rejon zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący:

(a) rej on CDR1 przedstawiony jako SEQ ID nr: 3;

23. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 22, znamienne tym, że rejon zmienny łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję przedstawioną jako SEQ ID nr: 1.

24. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 22, znamienne tym, że rejon zmienny łańcucha lekkiego zawiera sekwencję przedstawioną jako SEQ ID nr: 2.

25. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 23, znamienne tym, że rejon zmienny łańcucha lekkiego zawiera sekwencję przedstawioną jako SEQ ID nr: 2.

26. Przeciwciało Iub jego fragment według zastrz. 22, znamienne tym, że łańcuch ciężki składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako SEQ ID nr: 16.

27. Przeciwciało Iub jego fragment według zastrz. 22, znamienne tym, że łańcuch lekki składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako SEQ ID nr: 17.

28. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 26, znamienne tym, że łańcuch lekki składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako SEQ ID nr: 17.

29. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 18 albo 20 albo 22, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym.

30. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 18 albo 20 albo 22, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem o dojrzałym powinowactwie.

31. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 18 albo 20 albo 22, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

PL 215 171 B1

113

32. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca (a) przeciwciało lub jego fragment z któregokolwiek z zastrz. 1, 6, 8 i 10, oraz (b) farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.

33. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca (a) przeciwciało lub jego fragment z któregokolwiek z zastrz. 18, 20 i 22, oraz (b) farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.

34. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca (a) przeciwciało lub jego fragment z zastrz. 28, oraz (b) farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.

35. Zestaw, znamienny tym, że zawiera przeciwciało lub jego fragment z któregokolwiek z zastrz. 1, 6, 8 i 10.

36. Zestaw, znamienny tym, że zawiera przeciwciało lub jego fragment z któregokolwiek z zastrz. 18, 20 i 22.

37. Zestaw, znamienny tym, że zawiera przeciwciało lub jego fragment z zastrz. 28.

38. Sposób wytwarzania przeciwciała lub jego fragmentu z zastrz. 1, 6, 8 i 10, znamienny tym, że polinukleotyd kodujący przeciwciało lub jego fragment eksprymuje się w komórce gospodarza.

39. Sposób wytwarzania przeciwciała lub jego fragmentu z zastrz. 18, 20 i 22, znamienny tym, że polinukleotyd kodujący przeciwciało lub jego fragment eksprymuje się w komórce gospodarza.

40. Sposób wytwarzania przeciwciała lub jego fragment określonego zastrzeżeniem 28, znamienny tym, że polinukleotyd kodujący przeciwciało lub jego fragment eksprymuje się w komórce gospodarza.

41. Zastosowanie skutecznej ilości antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragmentu do wytwarzania leku do leczenia bólu towarzyszącego reumatoidalnemu zapaleniu stawów u pacjenta.

42. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że ból ulega złagodzeniu w przeciągu około 24 godzin po podaniu antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragment pacjentowi.

43. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że ból ulega złagodzeniu w przeciągu około czterech dni po podaniu antagonistycznego prze ciwciała anty-NGF lub jego fragmentu.

44. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment specyficznie wiąże się z ludzkim NGF.

45. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment jest przeciwciałem zawierającym sekwencje aminokwasowe przedstawione jako SEQ ID nr: 1 i 2.

46. Zastosowanie skutecznej ilości antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragmentu do wytwarzania leku do leczenia kacheksji wywołanej stanem zapalnym związanym z reumatoidalnym zapaleniem stawów u pacjenta.

47. Zastosowanie antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragmentu do leczenia bólu.

48. Zastosowanie według zastrz. 47, w którym antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment wiąże się specyficznie z NGF.

49. Zastosowanie według zastrz. 47, w którym antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment stanowi przeciwciało zawierające sekwencję aminokwasową opisaną sekwencjami

SEQ. ID nr 1 i 2.

50. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment specyficznie wiąże się z ludzkim NGF.

51. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment jest przeciwciałem zawierającym sekwencje aminokwasowe przedstawione jako SEQ ID nr: 1 i 2.

52. Zastosowanie skutecznej ilości antagonistycznego przeciwciała anty-NGF lub jego fragment do wytwarzania leku do leczenia bólu towarzyszącego zapaleniu kości i stawów u pacjenta.

53. Zastosowanie według zastrz. 52, znamienne tym, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF lub jego fragment specyficznie wiąże się z ludzkim NGF.

54. Zastosowanie według zastrz. 52, znamienne tym, że antagonistyczne przeciwciało anty-NGF Iub jego fragment jest przeciwciałem zawierającym sekwencje aminokwasowe przedstawione jako SEQ ID nr: 1 i 2.

114

PL 215 171 B1

55. Izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment z dowolnego z zastrz. 1, 6, 8 i 10.

56. Izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment z dowolnego z zastrz. 18, 20 i 22.

57. Izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment z zastrz. 28.

58. Polinukleotyd według zastrz. 56, znamienny tym, że polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 65.

59. Polinukleotyd według zastrz. 50, znamienny tym, że polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 66.

60. Polinukleotyd według zastrz. 50, znamienny tym, że polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 67.

61. Polinukleotyd według zastrz. 50, znamienny tym, że polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 68.

62. Polinukleotyd według zastrz. 50, znamienny tym, że polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 66 i sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 68.

63. Wektor zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment z dowolnego z zastrz. 1, 6, 8 i 10.

64. Wektor zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało z dowolnego z zastrz. 18, 20 i 22.

65. Wektor zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało z zastrz.28.

66. Komórka gospodarza zawierająca polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment z dowolnego z zastrz. 1, 6, 8 i 10.

67. Komórka gospodarza zawierająca polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment z dowolnego z zastrz. 18, 20 i 22.

68. Komórka gospodarza zawierająca polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało lub jego fragment z zastrz. 28.