TW202136777A

TW202136777A - 內毒素偵測

Info

Publication number: TW202136777A
Application number: TW109145028A
Authority: TW
Inventors: 馬修貝德威爾; 奈德莫澤爾; 塔米瑟曼; 羅伯特小沃伯頓
Original assignee: 美商輝瑞股份有限公司; 美商艾里莉莉公司
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2021-10-01
Also published as: US20230258664A1; WO2021124267A1

Abstract

本發明提供用於克服低內毒素回收率(LER)及去掩蔽內毒素之方法及組成物。本發明提供之組成物及方法可用於製備用於內毒素測試之樣本(諸如藥物產品)。

Description

內毒素偵測

本發明關於用於改善受關注樣本中內毒素的偵測之方法及組成物。具體而言，本發明提供用於去掩蔽內毒素之方法及組成物。本發明提供之方法及組成物可用於例如改善醫藥調配物中內毒素的偵測。

內毒素係革蘭氏陰性菌之細胞壁的主要組分。內毒素亦稱為脂多醣(LPS)，且係由脂質A、核心多醣及O-抗原多醣構成。將內毒素導入人或其他個體可觸發發炎性反應。發炎性反應可為嚴重，且導致個體的休克或甚至死亡。由於與意外投予內毒素至個體相關聯之風險，組成物(諸如醫藥調配物)在經放行用於投予至個體之前必須經過內毒素汙染的測試。各種用於偵測內毒素之方法係所屬技術領域中已知，諸如兔熱原測試(RPT)及鱟變形細胞裂解物(LAL)測定。LAL測定通常優於RPT測定，因為具有較高特異性及敏感度。LAL測定涉及因應內毒素觸發之酶級聯；此級聯中的第一個酶係與內毒素/LPS結合之C因子酶。存在不同版本的LAL測定，包括顯色、濁度量測及凝膠血塊LAL測定。過去，LAL測定使用來自鱟血液的血液細胞(變形細胞)。目前有使用重組蛋白而非鱟血液細胞之LAL測定的替代物(例如，PyroGene™重組C因子測定，Lonza)可用。更近來，識別一種現在統稱為「低內毒素回收率(LER)」之現象。具體而言，觀察到在一些情況下，當測試內毒素時，添加至純(幾乎未稀釋)樣本中之內毒素無法被適當回收。因此，LER係指其中樣本含有經添加之內毒素，但無法在樣本中有效偵測內毒素的狀況。在LER狀況中，樣本中之內毒素可描述為被「掩蔽(masked)」。當一或多個巨分子(例如蛋白質)或小分子(例如金屬離子或清潔劑)以防止LAL測定之C因子或其他組分與內毒素結合之方式與內毒素連結，且因此在內毒素測定中掩蔽/遮蔽內毒素之偵測時，內毒素係經「掩蔽」。雖然可能導致LER/內毒素掩蔽之各種因子已被識別，但該現象仍難以理解且無法預測。此外，雖然已發展一些用於克服LER及「去掩蔽」內毒素之方法，但一些受關注樣本展現無法藉由已知處理LER之方法克服之LER。因此，需要新的、經改善的用於處理LER及去掩蔽內毒素之方法。

本發明提供用於去掩蔽內毒素及克服與內毒素偵測測定相關之低內毒素回收率(LER)狀況之方法及組成物。在一些實施態樣中，本發明提供一種雙相混合物，其包含第一液相及第二液相，其中：a)第一液相係包含受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；且b)第二液相係液相1-十二醇；其中第二液相飄浮在第一液相上。可選地，雙相混合物不含有牛血清白蛋白(BSA)。在一些實施態樣中，本發明提供一種雙相混合物，其包含第一液相及第二液相，其中：a)第一液相係包含受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；且b)第二液相係液相1-十二醇。可選地，雙相混合物不含有牛血清白蛋白(BSA)。在一些實施態樣中，本發明提供一種雙相混合物，其包含液相及固相，其中：a)液相係包含受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；且b)固相係固體1-十二醇；且其中固相飄浮在液相上。可選地，雙相混合物不含有牛血清白蛋白(BSA)。在一些實施態樣中，本發明提供一種雙相混合物，其包含液相及固相，其中：a)液相係包含受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；且b)固相係固體1-十二醇。可選地，雙相混合物不含有牛血清白蛋白(BSA)。在一些實施態樣中，本發明提供一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加液相1-十二醇至含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；及b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分及經固化之1-十二醇。可選地，剩餘之液體部分係「液體A」，且方法進一步包含添加包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之溶液至液體A以產製包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子及液體A之混合物(「液體B」)。可選地，方法進一步包含培育液體B。可選地，方法進一步包含在培育液體B之後震盪液體B。可選地，方法進一步包含將一部分液體B稀釋於包含MgSO₄ 之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本，其中先前經掩蔽之內毒素係在內毒素測試就緒樣本中去掩蔽。在一些實施態樣中，本發明提供一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加液相1-十二醇至含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分(「液體A」)及固體1-十二醇；c)將包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之溶液添加至液體A以產製包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子及液體A之混合物(「液體B」)；d)培育液體B；e)震盪液體B；及f)將一部分液體B稀釋於包含MgSO₄ 之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本；其中先前經掩蔽之內毒素係在步驟f)之樣本中去掩蔽。在一些實施態樣中，本發明提供一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加液相1-十二醇至含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；及b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分及經固化之1-十二醇。可選地，剩餘之液體部分係「液體A」，且方法進一步包含添加分散劑溶液至液體A以產製包含分散劑及液體A之混合物(「液體B」)。可選地，方法進一步包含培育液體B。可選地，方法進一步包含在培育液體B之後震盪液體B。可選地，方法進一步包含將一部分液體B稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本，其中先前經掩蔽之內毒素係在內毒素測試就緒樣本中去掩蔽。在一些實施態樣中，本發明提供一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加液相1-十二醇至含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分(「液體A」)及固體1-十二醇；c)將分散劑溶液添加至液體A以產製包含分散劑及液體A之混合物(「液體B」)；d)培育液體B；e)震盪液體B；及f)將一部分液體B稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本；其中先前經掩蔽之內毒素係在步驟f)之樣本中去掩蔽。在一些實施態樣中，本發明提供一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加液相1-十二醇至含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分(「液體A」)及固體1-十二醇；及c)將一部分液體A稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本；其中先前經掩蔽之內毒素係在步驟c之樣本中去掩蔽。在一些實施態樣中，本發明提供一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加液相1-十二醇至含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分(「液體A」)及固體1-十二醇；c)將分散劑溶液添加至液體A以產製包含分散劑及液體A之混合物(「液體B」)；及d)將一部分液體B稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本；其中先前經掩蔽之內毒素係在步驟d之樣本中去掩蔽。在本發明提供之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，受關注分子係蛋白質。可選地，蛋白質係抗體。可選地，抗體係他尼珠單抗(tanezumab)。在本發明提供之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，包含受關注分子之溶液係他尼珠單抗藥物產品調配物，諸如WO2010/032220所述者，以引用方式併入本文中以達所有目的。可選地，調配物係液體調配物，且包含濃度約2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml或20 mg/ml之他尼珠單抗抗體；及可選地組胺酸緩衝劑。可選地，調配物進一步包含可為聚山梨酯20之界面活性劑。在一些實施態樣中，調配物進一步包含海藻糖去水物或蔗糖。在一些實施態樣中，調配物進一步包含螯合劑，其可為EDTA；在一些實施態樣中為二鈉EDTA。在一些實施態樣中，調配物的pH係6.0±0.3。在本發明提供之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，包含受關注分子之溶液(例如，他尼珠單抗藥物產品調配物)係水溶液。在本發明提供之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，包含受關注分子之溶液係他尼珠單抗藥物產品調配物，其中調配物包含約2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml或20 mg/ml他尼珠單抗；約10 mM組胺酸緩衝劑；約84 mg/ml海藻糖去水物；約0.1 mg/ml聚山梨酯20；約0.05 mg/ml二鈉EDTA；其中調配物的pH係6.0±0.3。在本發明提供之包含他尼珠單抗之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，溶液包含2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml或20 mg/ml他尼珠單抗。可選地，調配物具有約1 ml之總體積。可選地，調配物係含有於玻璃或塑膠小瓶或注射器中。可選地，調配物係含有於預填充之玻璃或塑膠小瓶或注射器中。在本發明提供之包含1-十二醇之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，1-十二醇係純度≥98%或≥99%的1-十二醇。在本發明提供之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，1-十二醇微升對包含該受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液微升的比例係介於a)每10微升溶液0.2微升1-十二醇與b)每10微升溶液2微升1-十二醇之間。可選地，1-十二醇微升對包含該受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液微升的比例係介於a)每10微升溶液0.5微升1-十二醇與b)每10微升溶液1.5微升1-十二醇之間。可選地，1-十二醇微升對包含該受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液微升的比例係每9微升溶液1微升1-十二醇(例如1微升1-十二醇+ 9微升溶液)。在本發明提供之包含1-十二醇及包含受關注分子之溶液之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，混合物含有介於約5%至11%(v/v)之間的1-十二醇/包含受關注分子之溶液。可選地，混合物含有約10%(v/v) 1-十二醇/包含受關注分子之溶液。在本發明提供之涉及將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分(「液體A」)及固體1-十二醇之方法的一些實施態樣中，液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液係於冰水浴或冷卻塊中冷卻。可選地，液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液係經冷卻一段足以使液相1-十二醇固化之時間。可選地，液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液係經冷卻約0.5至20分鐘。可選地，液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液係經冷卻約1、2或3分鐘。在本發明提供之涉及分散劑溶液之方法的一些實施態樣中，分散劑溶液係PYROSPERSE™或包含PYROSPERSE™。在本發明提供之涉及分散劑溶液之方法的一些實施態樣中，分散劑溶液係包含陽離子之溶液。在一些實施態樣中，包含陽離子之分散劑溶液包含二價陽離子。在一些實施態樣中，包含二價陽離子之分散劑溶液包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子。在一些實施態樣中，包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之分散劑溶液包含介於1M至2M之間的Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子。在一些實施態樣中，包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之分散劑溶液包含約1.5M的Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子。在一些實施態樣中，包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之分散劑溶液包含CaCl₂ 。在一些實施態樣中，包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之分散劑溶液包含1.5 CaCl₂ 。在本發明提供之涉及分散劑溶液之方法的一些實施態樣中，分散劑溶液包含離液劑。離液劑係可破壞分子之間及分子內之非共價力(例如，氫鍵、疏水效應)的分子，且可溶解及/或變性巨分子諸如蛋白質。例示性離液劑包括氯化胍、尿素、硫脲、十二基硫酸鈉、過氯酸鋰、乙酸鋰、氯化鎂、苯酚、2-丙醇、正丁醇及乙醇。在一些實施態樣中，分散劑溶液包含氯化胍(GuHCl)，亦稱為胍鹽酸鹽。可選地，包含胍鹽酸鹽之分散劑溶液包含介於0.5至8 M、1至8 M、2至8 M、4至8 M或6至8 M之間的胍鹽酸鹽。可選地，包含胍鹽酸鹽之分散劑溶液包含約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M或8 M胍鹽酸鹽。可選地，包含胍鹽酸鹽之分散劑溶液包含介於約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M或7.5 M胍鹽酸鹽與0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M或8 M胍鹽酸鹽之間，其中第一值小於第二值。在一些實施態樣中，分散劑溶液包含尿素。可選地，包含尿素之分散劑溶液包含介於0.5至8 M、1至8 M、2至8 M、4至8 M或6至8 M之間的尿素。可選地，包含尿素之分散劑溶液包含約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M、8 M、8.5 M、9 M、9.5 M或10 M尿素。可選地，包含尿素之分散劑溶液包含介於約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M或7.5 M尿素與0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M、8 M、8.5 M、9 M、9.5 M或10 M尿素之間，其中第一值小於第二值。在一些實施態樣中，分散劑溶液包含硫脲。可選地，包含硫脲之分散劑溶液包含介於0.5至4 M、1至4 M、2至4 M或3至4 M之間的硫脲。可選地，包含硫脲之分散劑溶液包含約 0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M或4 M硫脲。可選地，包含硫脲之分散劑溶液包含介於約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M或3.5 M硫脲與0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M硫脲之間，其中第一值小於第二值。在一些實施態樣中，分散劑溶液包含過氯酸鋰。可選地，包含過氯酸鋰之分散劑溶液包含介於0.5至8 M、1至8 M、2至8 M、4至8 M或6至8 M之間的過氯酸鋰。可選地，包含過氯酸鋰之分散劑溶液包含約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M、8 M、8.5 M、9 M、9.5 M或10 M過氯酸鋰。可選地，包含過氯酸鋰之分散劑溶液包含介於約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M或7.5 M過氯酸鋰與0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M、8 M、8.5 M、9 M、9.5 M或10 M過氯酸鋰之間，其中第一值小於第二值。在一些實施態樣中，分散劑溶液包含乙酸鋰。可選地，包含乙酸鋰之分散劑溶液包含介於0.5至8 M、1至8 M、2至8 M、4至8 M或6至8 M之間的乙酸鋰。可選地，包含乙酸鋰之分散劑溶液包含約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M、8 M、8.5 M、9 M、9.5 M或10 M乙酸鋰。可選地，包含乙酸鋰之分散劑溶液包含介於約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M或7.5 M乙酸鋰與0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M、8 M、8.5 M、9 M、9.5 M或10 M乙酸鋰之間，其中第一值小於第二值。在一些實施態樣中，分散劑溶液包含氯化鎂。可選地，包含氯化鎂之分散劑溶液包含介於0.5至8 M、1至8 M、2至8 M、4至8 M或6至8 M之間的氯化鎂。可選地，包含氯化鎂之分散劑溶液包含約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M、8 M、8.5 M、9 M、9.5 M或10 M氯化鎂。可選地，包含氯化鎂之分散劑溶液包含介於約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M或7.5 M氯化鎂與0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M、8 M、8.5 M、9 M、9.5 M或10 M氯化鎂之間，其中第一值小於第二值。在一些實施態樣中，分散劑溶液包含十二基硫酸鈉(SDS)。可選地，包含十二基硫酸鈉之分散劑溶液包含介於0.5至8 M、1至8 M、2至8 M、4至8 M或6至8 M之間的十二基硫酸鈉。可選地，包含十二基硫酸鈉之分散劑溶液包含約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M、8 M、8.5 M、9 M、9.5 M或10 M十二基硫酸鈉。可選地，包含十二基硫酸鈉之分散劑溶液包含介於約0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M或7.5 M十二基硫酸鈉與0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M、7.5 M、8 M、8.5 M、9 M、9.5 M或10 M十二基硫酸鈉之間，其中第一值小於第二值。在一些實施態樣中，超過一種類型的離液劑可存在於分散劑溶液中。在本發明提供之涉及添加分散劑溶液至液體A以產製混合物(「液體B」)之方法的一些實施態樣中，分散劑溶液對液體A之微升比例係介於a)每100微升液體A 0.5微升分散劑溶液與b)每100微升液體A 5微升分散劑溶液之間。可選地，分散劑溶液對液體A之微升比例係每100微升液體A 3微升分散劑溶液。在本發明提供之涉及添加分散劑溶液至液體A以產製混合物(「液體B」)之方法的一些實施態樣中，液體B含有介於約0.5%至4%(v/v)之間的分散劑/液體A。可選地，液體B含有約3%(v/v)分散劑/液體A。在本發明提供之方法的一些實施態樣中，不添加分散劑溶液(0微升)至液體A。在本發明提供之涉及添加包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之溶液至液體A以產製混合物(「液體B」)之方法的一些實施態樣中，包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之溶液包含濃度1M、2M或介於1M與2M之間的值之Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子。可選地，包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之溶液包含濃度1.5 M之Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子。可選地，1.5M Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子溶液對液體A之微升比例係介於a)每100微升液體A 0.5微升1.5M Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子溶液與b)每100微升液體A 5微升1.5M Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子溶液之間。可選地，1.5M Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子溶液對液體A之微升比例係每100微升液體A 3微升1.5M Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子溶液。在本發明提供之涉及培育液體B之方法的一些實施態樣中，液體B係在環境溫度下培育。可選地，液體B係培育0.5至20分鐘。可選地，液體B係培育8至10分鐘。可選地，液體B係培育小於1分鐘至大於10分鐘之時間範圍的量。在本發明提供之涉及液體B之方法的一些實施態樣中，不培育液體B。例如，可選地在震盪步驟之前或將一部分液體B稀釋於稀釋緩衝劑之前不培育液體B。在本發明提供之涉及震盪液體B之方法的一些實施態樣中，液體B係震盪0.1至5分鐘。可選地，液體B係震盪1分鐘。可選地，液體B係震盪小於1分鐘。在本發明提供之涉及包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑之方法的一些實施態樣中，緩衝劑包含1至10、1至20、1至50、1、5、10或20 mM的Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子。在本發明提供之涉及包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑之方法的一些實施態樣中，緩衝劑包含Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含1至10 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含1至20 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含1至50 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含1 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含5 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含10 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含20 mM Mg²⁺ 離子。在本發明提供之涉及包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑之方法的一些實施態樣中，緩衝劑包含MgSO₄ 。可選地，緩衝劑包含1至50 mM MgSO₄ 。可選地，緩衝劑包含1至10 mM MgSO₄ 。可選地，緩衝劑包含1 mM MgSO₄ 。可選地，緩衝劑包含5 mM MgSO₄ 。可選地，緩衝劑包含10 mM MgSO₄ 。可選地，緩衝劑包含20 mM MgSO₄ 。在本發明提供之涉及將一部分液體B稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本之方法的一些實施態樣中，緩衝劑包含1至10、1至20、1至50、1、5、10或20 mM的Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子。可選地，包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑包含1至10 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含1至20 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含1至50 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含1 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含5 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含10 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑包含20 mM Mg²⁺ 離子。可選地，緩衝劑進一步包含2至100 mM Tris，pH 6.8至7.6。可選地，緩衝劑進一步包含2至20 mM Tris，pH 6.8至7.6。可選地，緩衝劑進一步包含1至100 mM Tris，pH 6.8至7.6。可選地，緩衝劑進一步包含1至20 mM Tris，pH 6.8至7.6。可選地，緩衝劑進一步包含2 mM Tris，pH 6.8至7.6。可選地，緩衝劑進一步包含5 mM Tris，pH 6.8至7.6。可選地，緩衝劑進一步包含10 mM Tris，pH 6.8至7.6。可選地，緩衝劑進一步包含20 mM Tris，pH 6.8至7.6。可選地，部分液體B係以一比例稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑，該比例介於a)每100微升Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子緩衝劑1微升液體B與b)每3000微升Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子緩衝劑1微升液體B之間。可選地，部分液體B係以一比例稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑，該比例介於a)每100微升Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子緩衝劑1微升液體B與b)每2500微升Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子緩衝劑1微升液體B之間。可選地，部分液體B係以一比例稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑，該比例為每約100、200、295、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000微升的Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子緩衝劑1微升液體B。可選地，部分液體B係以一比例稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑，該比例為每約100、295、2000或2500微升Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子緩衝劑1微升液體B。在本發明提供之涉及將一部分液體B稀釋於包含MgSO₄ 之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本之方法的一些實施態樣中，包含MgSO₄ 之緩衝劑包含1至50 mM MgSO₄ 。可選地，包含MgSO₄ 之緩衝劑包含10 mM MgSO₄ 。可選地，包含MgSO₄ 之緩衝劑進一步包含2至100 mM Tris，pH 6.8至7.6。可選地，包含MgSO₄ 之緩衝劑進一步包含20 mM Tris，pH 6.8至7.6。可選地，部分液體B係以一比例稀釋於包含MgSO₄ 之緩衝劑，該比例介於a)每100微升MgSO₄ 緩衝劑1微升液體B與b)每3000微升MgSO₄ 緩衝劑1微升液體B之間。可選地，部分液體B係以一比例稀釋於包含MgSO₄ 之緩衝劑，該比例為每2000微升MgSO₄ 緩衝劑1微升液體B。在一些實施態樣中，本發明提供一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加100微升液相1-十二醇至900微升含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液於冰水浴或冷卻塊中冷卻2分鐘至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分(「液體A」)及固體1-十二醇；c)將30微升之包含1.5 M Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之溶液添加至液體A以產製包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子及液體A之混合物(「液體B」)；d)在環境溫度下培育液體B達8至10分鐘；e)在培育液體B之後，震盪液體B達1分鐘；f)將來自步驟e)之一部分液體B稀釋於包含10 mM MgSO₄ 之緩衝劑以達1：2000稀釋，以產生內毒素測試就緒樣本；其中先前經掩蔽之內毒素係在步驟f)之樣本中去掩蔽。在一些實施態樣中，本發明提供一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加100微升液相1-十二醇至900微升含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液於冰水浴或冷卻塊中冷卻至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分(「液體A」)及固體1-十二醇；c)將30微升之分散劑溶液添加至液體A以產製包含分散劑溶液及液體A之混合物(「液體B」)；d)在環境溫度下培育液體B；e)在培育液體B之後，震盪液體B；f)將來自步驟e)之一部分液體B稀釋於包含10 mM MgSO₄ 之緩衝劑以達1：2000稀釋，以產生內毒素測試就緒樣本；其中先前經掩蔽之內毒素係在步驟f)之樣本中去掩蔽。在本發明提供之涉及包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之溶液之方法的一些實施態樣中，包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之溶液係PYROSPERSE™溶液。在本發明提供之涉及包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之溶液之方法的一些實施態樣中，包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 之溶液包含1.5 M CaCl₂ 。在本發明提供之涉及低於24℃之溫度之方法或雙相混合物的一些實施態樣中，溫度係介於0至24℃之間。可選地，溫度係介於0至23℃之間。可選地，溫度係介於1至20℃之間。可選地，溫度係介於1至15℃之間。可選地，溫度係介於1至10℃之間。在本發明提供之涉及內毒素測試就緒樣本之方法的一些實施態樣中，內毒素測試就緒樣本進一步係經由鱟變形細胞裂解物(LAL)測定測試內毒素。可選地，LAL測定係凝膠血塊LAL測定、顯色LAL測定、濁度量測LAL測定或包含重組C因子之LAL測定。在本發明提供之涉及內毒素測試就緒樣本之方法的一些實施態樣中，可在內毒素測試就緒樣本中偵測到比未經本發明提供之方法處理之含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之其他相同的對應溶液較大量的內毒素。在本發明提供之雙相混合物或方法之一些實施態樣中，雙相混合物、包含受關注分子之溶液、液體A或液體B不含有牛血清白蛋白(BSA)。在本發明提供之包含抗體之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，抗體包含：具有SEQ ID NO：3所示之序列之HCDR1、具有SEQ ID NO：4所示之序列之HCDR2、具有SEQ ID NO：5所示之序列之HCDR3、具有SEQ ID NO：6所示之序列之LCDR1、具有SEQ ID NO：7所示之序列之LCDR2及具有SEQ ID NO：8所示之序列之LCDR3。在本發明提供之包含抗體之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，抗體包含具有SEQ ID NO：1所示之序列之重鏈可變區(VH)。在一些實施態樣中，抗體包含具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。在一些實施態樣中，抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區具有SEQ ID NO：1所示之序列，該輕鏈可變區具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列。在本發明提供之包含抗體之雙相混合物或方法的一些實施態樣中，抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈具有SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列，且該輕鏈具有SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列。在一些實施態樣中，SEQ ID NO：9之重鏈胺基酸序列的C端離胺酸(K)係可選的。在一些實施態樣中，本發明提供之涉及1-十二醇之雙相混合物或方法可替代地含有2-十二醇或以2-十二醇實施(IUPAC名稱：十二-2-醇；CAS ID：10203-28-8)。在一些實施態樣中，本發明提供之涉及添加內毒素之樣本(例如藥物產品)之雙相混合物或方法可經添加1000內毒素單位(EU)/ml對照標準內毒素(CSE)。在一些實施態樣中，樣本係經添加50至2000、80至1250或500至1500 EU CSE/ml。在一些實施態樣中，樣本係經添加約50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450或1500 EU CSE/ml。詳細描述本發明提供用於去掩蔽內毒素及克服與內毒素偵測測定相關之低內毒素回收率(LER)狀況之方法及組成物。本發明提供之方法可用於製備用於內毒素測試之包含受關注分子之樣本。在一些實施態樣中，本發明提供之方法可用於其中待測試內毒素之樣本已被識別為展現低內毒素回收率/內毒素掩蔽之狀況。在這些狀況中，已識別可存在於樣本中之內毒素無法輕易地藉由內毒素偵測測定偵測。在這些狀況中，為了正確偵測樣本中內毒素之存在及/或量，所欲的是「去掩蔽」可存在於樣本中之內毒素。此外，本發明提供之方法亦可用於其中所欲的是去掩蔽任何可存在於受關注樣本中之內毒素的任何狀況。換句話說，使用本發明提供之方法不需要知道樣本含有經掩蔽之內毒素及/或展現LER；本發明提供之方法可用於製備任何用於內毒素測試之樣本。本發明提供之去掩蔽內毒素/克服LER之方法可用於在內毒素偵測測定之前處理包含受關注分子之樣本。內毒素偵測測定係該領域所知。在一些實施態樣中，內毒素偵測測定係鱟變形細胞裂解物(LAL)測定。LAL測定可經由各種不同方法諸如顯色、濁度量測或凝膠血塊實施。LAL測定可使用重組蛋白質(例如重組C因子)實施。LAL測定試劑及套組係市售可得，諸如購自Lonza、InvivoGen、Pierce、GenScript及Charles River公司。在一些實施態樣中，本發明提供之方法及組成物包括1-十二醇。1-十二醇係12碳脂肪醇。1-十二醇亦稱為月桂基醇、十二醇及十二基醇。IUPAC名稱係十二-1-醇，且CAS編號係112-53-8。用語「1-十二醇」在本文中可與用語「十二醇」互換使用。除非另外指示，否則本文中所使用之用語「1-十二醇」、「十二醇」等係指經高度純化的1-十二醇(即純度≥98%)。1-十二醇在環境/室溫下係固體；其具有24℃/75℉之熔點。在本文中提及「液相1-十二醇」、「經熔化之1-十二醇」及類似物係指因為在高於其熔點之溫度下(即，高於24℃/75℉)而呈液相之經高度純化的1-十二醇(即純度≥98%)。因此，如本文中所使用之「液相1-十二醇」及類似物不是指溶解於溶劑(例如乙醇)中之1-十二醇。在一些實施態樣中，本發明提供之用於去掩蔽內毒素/克服LER之方法及組成物涉及1-十二醇的液相至固相變化或反之亦然。在一些實施態樣中，本發明提供之方法及組成物涉及添加液相1-十二醇至包含受關注分子及內毒素之樣本，隨後將樣本冷卻以固化1-十二醇，作為用於去掩蔽內毒素/克服LER之過程的一個態樣。類似地，本發明亦提供包含受關注分子及內毒素之組成物及液相或固相1-十二醇。 1-十二醇的密度小於水。例如，1-十二醇具有大約831 kg/m³ 之密度。相反地，水具有大約997 kg/m³ 之密度。因此，當液體1-十二醇及水(或水溶液)混合時，1-十二醇歸結在水上的一層(即，1-十二醇漂浮在水上)。在一些實施態樣中，本發明提供之方法及組成物包括PYROSPERSE™。PYROSPERSE™係可購自Lonza之分散劑(目錄編號N188)。按照Lonza產品資訊，PYROSPERSE™可幫助清除在一些樣本中的內毒素結合或掩蔽。按照Lonza產品資訊，PYROSPERSE™係經金屬修飾之多價陰離子分散劑。在一些實施態樣中，本發明提供之方法及組成物包含含有Ca²⁺ 及/或Mg²⁺ 離子之溶液。含有Ca²⁺ 及/或Mg²⁺ 離子之溶液可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知之方法製備。例如，含有Ca²⁺ 離子之溶液可藉由將CaCl₂ 溶解於水中製備，且含有Mg²⁺ 離子之溶液可藉由將MgCl₂ 溶解於水中製備。在一些實施態樣中，本發明提供之含有Ca²⁺ 及/或Mg²⁺ 離子之溶液可含有0.1至2 M Ca²⁺ 及/或Mg²⁺ 離子。可選地，本發明提供之含有Ca²⁺ 及/或Mg²⁺ 離子之溶液可含有0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5或2 M Ca²⁺ 及/或Mg²⁺ 離子。可選地，本發明提供之含有Ca²⁺ 及/或Mg²⁺ 離子之溶液可含有僅Ca²⁺ 離子或僅Mg²⁺ 離子。可選地，本發明提供之含有Ca²⁺ 及/或Mg²⁺ 離子之溶液可含有Ca²⁺ 離子及Mg²⁺ 離子之混合物，其中Ca²⁺ 離子及Mg²⁺ 離子之組合式組合係具有2+電荷之0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5或2 M陽離子。在本發明提供之涉及體積比例(例如，1-十二醇微升對包含受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液微升的比例)的任何實施態樣中，在比例中所提供之體積係例示性，且可根據引述比例增加或降低。例如，當上述比例係描述為「介於a)每10微升溶液0.2微升1-十二醇與b)每10微升溶液2微升1-十二醇之間」時，此亦涵蓋這些數字各者之倍數(當各數字之倍數相同時)。因此，比例亦涵蓋例如用語的5x倍數：「介於a)每50微升溶液1微升1-十二醇與b)每50微升溶液10微升1-十二醇之間」，用語的10x倍數：「介於a)每100微升溶液2微升1-十二醇與b)每100微升溶液20微升1-十二醇之間」，用語的20x倍數：「介於a)每200微升溶液4微升1-十二醇與b)每200微升溶液40微升1-十二醇之間」等。本發明提供之方法及組成物可用於去掩蔽溶液中之內毒素，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素。在一些實施態樣中，受關注分子係醫藥產品。在一些實施態樣中，受關注分子係蛋白質。在一些實施態樣中，受關注分子係抗體。在一些實施態樣中，受關注分子係抗神經生長因子(NGF)抗體。在一態樣中，抗NGF抗體與NGF結合且抑制NGF與trkA及/或p75結合。在一些實施態樣中，受關注分子係抗體，且抗體包含來自SEQ ID NO：1之重鏈可變區之三個CDR。在一些實施態樣中，抗體包含來自SEQ ID NO：2之輕鏈可變區之三個CDR。在一些實施態樣中，抗體包含來自SEQ ID NO：1之重鏈可變區之三個CDR及來自SEQ ID NO：2之輕鏈可變區之三個CDR。在一些實施態樣中，CDR可根據Kabat、Chothia、延伸、AbM、接觸及/或構形定義中任一者加以定義。在一些實施態樣中，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8所示之CDR係藉由Kabat及Chothia方法之組合判定。本發明提供之受關注分子的例示性抗體序列包括但不限於以下列示序列。

在一實施態樣中，本發明提供之方法的受關注分子係抗體他尼珠單抗。抗體「他尼珠單抗」係以人神經生長因子(NGF)為目標之人化第2型免疫球蛋白G(IgG2)單株抗體。他尼珠單抗以高親和力及特異性與人NGF結合且有效阻斷NGF在細胞培養模型中之活性。他尼珠單抗及/或其鼠前驅物已在病理性疼痛包括關節炎、癌症疼痛及手術後疼痛的動物模型中顯示為有效止痛劑。他尼珠單抗具有分別為SEQ ID NO：1及2之重鏈可變區及輕鏈可變區之序列。重鏈及輕鏈序列係分別提供於SEQ ID NO：9及10，其中SEQ ID NO：9之重鏈胺基酸序列之C端離胺酸(K)係可選的。他尼珠單抗之序列提供於上表1。他尼珠單抗在WO2004/058184(以引用方式併入本文中)中被描述為抗體E3。在一些實施態樣中，抗NGF抗體(諸如他尼珠單抗)係呈藥物產品調配物，諸如WO2010/032220(以引用方式併入本文中)中所述。在一些實施態樣中，調配物係液體調配物，且包含濃度約2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml或20 mg/ml之抗NGF抗體；及組胺酸緩衝劑。在一些實施態樣中，調配物進一步包含可為聚山梨酯20之界面活性劑。在一些實施態樣中，調配物進一步包含海藻糖去水物或蔗糖。在一些實施態樣中，調配物進一步包含螯合劑，其可為EDTA；在一些實施態樣中為二鈉EDTA。在一些實施態樣中，調配物的pH係6.0±0.3。在一些實施態樣中，調配物包含約2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml或20 mg/ml他尼珠單抗；約10 mM組胺酸緩衝劑；約84 mg/ml海藻糖去水物；約0.1 mg/ml聚山梨酯20；約0.05 mg/ml二鈉EDTA；其中調配物的pH係6.0±0.3。在一些實施態樣中，調配物包含約2.5 mg/ml或5 mg/ml他尼珠單抗。在一些實施態樣中，調配物具有約1 ml之總體積。在一些實施態樣中，調配物係含有於玻璃或塑膠小瓶或注射器中。在一些實施態樣中，調配物係含有於預填充之玻璃或塑膠小瓶或注射器中。美國臨時專利申請案號62/951,496(2019年12月20日提出)及63/117,201(2020年11月23日提出)之內容以引用方式併入本文中以達所有目的。本發明提供之額外例示性實施態樣包括以下提供之實施態樣(E)： E1. 一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加液相1-十二醇至含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；及b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分及經固化之1-十二醇。 E2.如E1之方法，其中該剩餘之液體部分係「液體A」，且其中該方法進一步包含添加PYROSPERSE™溶液或包含CaCl₂ 之溶液至液體A以產製包含PYROSPERSE™或CaCl₂ 及液體A之混合物(「液體B」)。 E3.如E2之方法，其進一步包含培育液體B。 E4.如E3之方法，其進一步包含在培育液體B之後，震盪液體B。 E5.如E2至E4中任一項之方法，其進一步包含將一部分液體B稀釋於包含MgSO₄ 之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本，其中該先前經掩蔽之內毒素係在該內毒素測試就緒樣本中去掩蔽。 E6.一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加液相1-十二醇至含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分(「液體A」)及固體1-十二醇；c)將PYROSPERSE™溶液或包含CaCl₂ 之溶液添加至液體A以產製包含PYROSPERSE™或包含CaCl₂ 之溶液及液體A之混合物(「液體B」)；d)培育液體B；e)震盪液體B；f)將一部分液體B稀釋於包含MgSO₄ 之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本；其中先前經掩蔽之內毒素係在步驟f)之樣本中去掩蔽。 E7.如E1至E6中任一項之方法，其中該受關注分子係蛋白質。 E8.如E7之方法，其中該蛋白質係抗體。 E9.如E8之方法，其中該抗體係他尼珠單抗。 E10.如E1至E9中任一項之方法，其中該包含受關注分子之溶液係他尼珠單抗藥物產品。 E11.如E9至E10中任一項之方法，其中該溶液包含2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、或20 mg/ml他尼珠單抗。 E12.如E1至E11中任一項之方法，其中該1-十二醇係純度≥98%的1-十二醇。 E13.如E1至E12中任一項之方法，其中1-十二醇微升對包含該受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液微升的比例係介於a)每10微升溶液0.2微升1-十二醇與b)每10微升溶液2微升1-十二醇之間。 E14.如E13之方法，其中1-十二醇微升對包含該受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液微升的比例係介於a)每10微升溶液0.5微升1-十二醇與b)每10微升溶液1.5微升1-十二醇之間。 E15.如E1至E14中任一項之方法，其中1-十二醇微升對包含該受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液微升的比例係每9微升溶液1微升1-十二醇。 E16.如E1至E15中任一項之方法，其中液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液係於冰水浴或冷卻塊中冷卻0.5至20分鐘。 E17.如E1至E16中任一項之方法，其中液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液係冷卻1、2或3分鐘。 E18.如E2至E17中任一項之方法，其中包含CaCl₂ 之溶液包含濃度1M、2M或介於1M與2M之間的值之CaCl₂ 。 E19.如E16之方法，其中包含CaCl₂ 之溶液包含濃度1.5 M之CaCl₂ 。 E20.如E2至E19中任一項之方法，其中PYROSPERSE™或1.5M CaCl₂ 溶液對液體A之微升比例係介於a)每100微升液體A 0.5微升PYROSPERSE™或1.5M CaCl₂ 溶液與b)每100微升液體A 5微升PYROSPERSE™或1.5M CaCl₂ 溶液之間。 E21.如E2至E20中任一項之方法，其中PYROSPERSE™或1.5M CaCl₂ 溶液對液體A之微升比例係每100微升液體A 3微升PYROSPERSE™或1.5M CaCl₂ 溶液。 E22.如E3至E21中任一項之方法，其中液體B係在環境溫度下培育。 E23.如E3至E22中任一項之方法，其中液體B係培育0.5至20分鐘。 E24.如E3至E23中任一項之方法，其中液體B係培育8至10分鐘。 E25.如E4至E24中任一項之方法，其中液體B係震盪0.1至5分鐘。 E26.如E4至E25中任一項之方法，其中液體B係震盪1分鐘。 E27.如E5至E26中任一項之方法，其中包含MgSO₄ 之緩衝劑包含1至50 mM MgSO₄ 。 E28.如E5至E27中任一項之方法，其中包含MgSO₄ 之緩衝劑包含10 mM MgSO₄ 。 E29.如E5至E28中任一項之方法，其中包含MgSO₄ 之緩衝劑進一步包含2至100 mM Tris，pH 6.8至7.6。 E30.如E5至E29中任一項之方法，其中包含MgSO₄ 之緩衝劑進一步包含20 mM Tris，pH 6.8至7.6。 E31.如E5至E30中任一項之方法，其中部分液體B係以一比例稀釋於包含MgSO₄ 之緩衝劑，該比例介於a)每100微升MgSO₄ 緩衝劑1微升液體B與b)每3000微升MgSO₄ 緩衝劑1微升液體B之間。 E32.如E5至E31中任一項之方法，其中部分液體B係以一比例稀釋於包含MgSO₄ 之緩衝劑，該比例為每2000微升MgSO₄ 緩衝劑1微升液體B。 E33.一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含：a)添加100微升液相1-十二醇至900微升含有受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；b)將液相1-十二醇及含有受關注分子之溶液於冰水浴或冷卻塊中冷卻2分鐘至低於24℃之溫度，以使1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分(「液體A」)及固體1-十二醇；c)將30微升PYROSPERSE™溶液或30微升之包含1.5 M CaCl₂ 之溶液添加至液體A以產製包含PYROSPERSE™或包含CaCl₂ 之溶液及液體A之混合物(「液體B」)；d)在環境溫度下培育液體B達8至10分鐘；e)在培育液體B之後，震盪液體B達1分鐘；f)將來自步驟e)之一部分液體B稀釋於包含10 mM MgSO₄ 之緩衝劑以達1：2000稀釋，以產生內毒素測試就緒樣本；其中先前經掩蔽之內毒素係在步驟f)之樣本中去掩蔽。 E34.如E5至E33中任一項之方法，其中該內毒素測試就緒樣本進一步係經由鱟變形細胞裂解物(LAL)測定測試內毒素。 E35.如E34之方法，其中LAL測定係凝膠血塊LAL測定、顯色LAL測定、濁度量測LAL測定或包含重組C因子之LAL測定。 E36.如E5至E35中任一項之方法，其中可在該內毒素測試就緒樣本中偵測到比未經如E5至E35中任一項之方法處理之含有該受關注分子及該經掩蔽之內毒素之其他相同的對應溶液較大量的內毒素。一般技術除非另外說明，本發明之實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習用技術，這些技術係該領域之習知技藝。該等技術係於文獻諸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual, second edition(Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture(R.I. Freshney, ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology(J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology(C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies(P. Finch, 1997)；Antibodies：a practical approach(D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E. Harlow and D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies(M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)以及上述文獻之後續版本及對應網站(如適用)中充分解釋。除非另外定義，此處所使用之所有技術用語、說明及其他科學用語或詞彙係意圖具有本發明之相關領域之技藝人士所通常了解之意義。在一些情況下，具有通常了解之意義之用語係於此處定義以供清楚及/或輕易地參照，且在此處納入該等定義不應被視為表示與該領域所通常瞭解者之實質差異。

下列實施態樣僅作為示範之用，無意在任何方面限制本發明之範圍。事實上，除了在此處顯示及說明之修飾之外，本發明之許多修飾將為該領域之技藝人士自前述說明所顯而易見且屬於隨附之權利要求之範圍內。實例1：識別他尼珠單抗藥物產品中之低內毒素回收率(LER) 本實例描述識別他尼珠單抗藥物產品中之低內毒素回收率(LER)。在第0天，含有2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml或20 mg/ml他尼珠單抗之他尼珠單抗藥物產品(DP)係經添加1000內毒素單位(EU)/ml對照標準內毒素(CSE)。將添加內毒素之他尼珠單抗DP在環境溫度下培育14天。在第0、4、9及14天採集添加內毒素之他尼珠單抗DP樣本，並經由標準動力學顯色(KCA)鱟變形細胞裂解物(LAL)方法測定內毒素(按照USP ＜85＞、Ph. Eur. 2.6.14及JP 4.01標準)。在第4、9及14天自經添加之他尼珠單抗DP回收的內毒素低於可接受之範圍(50至200%)；即，在第4、9及14天各自回收的經添加之內毒素小於50%。具體而言，在第4、9及14天回收約0%的經添加之內毒素。在第0天，內毒素回收%在可接受之範圍內(約70%)。由於在第4、9及14天各自自經添加之他尼珠單抗DP回收的內毒素低於可接受之範圍，此表明他尼珠單抗藥物產品的LER。實例2：發展克服他尼珠單抗藥物產品中之LER之方法本實例描述發展新方法以克服他尼珠單抗藥物產品(DP)中之低內毒素回收率(LER)。在發現如實例1所述之他尼珠單抗DP中之LER之後，嘗試多種不同的已知方法來處理LER/去掩蔽內毒素。然而，這些努力並未找出克服他尼珠單抗DP中之LER的有效方法。接下來，測試廣泛範圍的實驗條件以期發展克服他尼珠單抗DP中之LER的有效方法。本工作的結果顯示，以下描述之試劑及條件的意外組合被識別為有效克服他尼珠單抗DP中之LER且去掩蔽內毒素。發展本方法係有用的，因為其提供在內毒素測試之前預處理他尼珠單抗DP之方法，以使內毒素偵測測定可正確實施於他尼珠單抗DP。如實例1所述，如果他尼珠單抗DP未在內毒素偵測測定之前經去掩蔽內毒素之有效方法預處理，則他尼珠單抗DP中之內毒素將被「掩蔽」且無法被有效偵測(即，將發生LER)，可能導致不正確的內毒素偵測測定結果。此方法的起始材料係添加內毒素之他尼珠單抗DP(2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml或20 mg/ml)，其含有1000內毒素單位(EU)/ml對照標準內毒素(CSE)，且在環境溫度下培育4、9或14天(「起始材料」)。本測定使用液相1-十二醇(純度≥98%)。1-十二醇在室溫下係固體(熔點24℃)；因此，將1-十二醇溫熱至約30至35℃之溫度(例如32℃)成液相以用於本測定。將900微升之起始材料轉移至玻璃試管。將在約32℃下呈液相之100微升之1-十二醇經由輕柔遞送緩慢添加至起始材料以最小化起始材料與1-十二醇之間的混合。在添加1-十二醇至起始材料後，將玻璃試管立即放入冰水浴達2分鐘。在2分鐘之後，1-十二醇已變回固體狀態，且在試管中形成緊實固體。因此，在此時間點，試管中存有液體部分(「液體A」；大約900微升體積)及固體部分。將試管移出冰浴，且添加30微升之分散劑[PYROSPERSE™(Lonza)]至液體A，形成液體A+PYROSPERSE™之混合物(一起稱為「液體B」；大約體積：930微升)。接著使試管留在環境溫度下未經打擾10分鐘。在10分鐘環境溫度培育之後，將試管震盪1分鐘。自試管移出小體積的液相(液體B)，且稀釋於含有10 mM MgSO4、20 mM Tris pH 6.8-7.6之緩衝劑，以產生液體B於緩衝劑之1/2000稀釋。例如，將20微升之液體B添加至980微升之緩衝劑且混合，以產生1 mL之液體B之1：50稀釋。接著，將25微升之液體B之1：50稀釋添加至975微升之緩衝劑，以產生1 mL之液體B之1：2000稀釋。(亦使用其他合適步驟以達成1：2000稀釋。) 接著震盪液體B之1：2000稀釋，並根據標準KCA LAL方法(按照USP ＜85＞、Ph. Eur. 2.6.14及JP 4.01標準)測試內毒素。根據上述方法處理他尼珠單抗DP一致地克服在他尼珠單抗DP中觀察到之LER。換句話說，在測試樣本的內毒素之前當經添加之他尼珠單抗DP係經以上方法處理以克服LER/去掩蔽內毒素時，在第4、9及14天自經添加之他尼珠單抗DP回收的內毒素一致地在可接受之範圍內(50至200%)。實例3：進一步發展克服他尼珠單抗藥物產品中之LER之方法本實例描述進一步發展新方法以克服他尼珠單抗藥物產品(DP)中之低內毒素回收率(LER)。重複多次如實例2所述之方法，同時相較於實例2之方法變化一或多個參數。在廣泛測試如表2所提供之下列條件之後，判定右側欄位亦為如實例2所述之方法以克服他尼珠單抗DP中之LER可接受之變異。表2：

實例 2 之動作	對應可接受之替代物
他尼珠單抗DP(2.5至20 mg/ml)，經添加1000內毒素單位(EU)對照標準內毒素(CSE)/ml	他尼珠單抗DP(2.5至20 mg/ml)，經添加80至1250 EU CSE/ml
製備10%(v/v) 1-十二醇/他尼珠單抗DP混合物 (例如，100 μl液相1-十二醇+ 900 μl他尼珠單抗DP)	5%至11% 1-十二醇/他尼珠單抗DP混合物
製備大約3%(v/v)分散劑(例如，PYROSPERSE™)/液體A混合物(一起稱為「液體B」) [例如，30 μl分散劑溶液+約900 μl液體A = 液體B(含有大約3% v/v分散劑/液體A)]	0.5%至4%(v/v)分散劑/液體A混合物(一起稱為「液體B」)；替代地，另一選項係無分散劑(即，0 μl分散劑溶液)。
在環境溫度下培育液體B達8至10分鐘	培育時間＜ 1 min至培育時間＞10分鐘替代地，另一選項係無培育時間(0分鐘)(培育步驟改善一致性但係可選的。)
震盪液體B達1分鐘	震盪液體B達30至60秒
將一部分經震盪之液體B稀釋於含有10 mM MgSO₄ 之緩衝劑以達1：2000稀釋，以產生內毒素測試就緒樣本	稀釋緩衝劑：1至10 mM MgSO₄ ；2至20 mM Tris pH 6.8至7.6 稀釋倍數：1：100至1：2500

根據實例2之方法連同上表2右側欄位所述之變異處理他尼珠單抗DP一致地克服在他尼珠單抗DP中觀察到之LER。此外，進一步注意到，表2不包括如實例2所述之方法所有可能的可接受替代值；而是提供經實驗證實之替代值。基於本發明提供之教示，所屬技術領域中具有通常知識者將理解額外替代物係屬於本文提供之本發明之範疇內。下表3提供實例2之方法的多個成功變異(變異編號1至48)之實驗細節。在表3中，各水平列描繪實例2之方法的成功變異之細節。如果在經變異方法處理之後，在第2至14天自經添加之他尼珠單抗DP回收的內毒素在可接受之範圍內(50至200%)，則變異方法被視為成功。[LER已在第1天觀察；因此，在第2至14天中任一天測試樣本，以評估表3提供以克服LER之方法的療效。]表3垂直欄位的標題列示實例2之方法的各種態樣，且各別格位提供各變異方法之各別態樣的相關值。以表3中之變異方法各者而言，使用900 μl、950 μl或1000 μl DP。表3之方法中之分散劑係PYROSPERSE™。如表3所示，一些變異方法不包括添加分散劑(編號24、38及48)。因此，添加分散劑係本發明提供之方法可選的。

雖然本發明之揭示內容已藉由各種應用、方法、套組及組成物加以說明，應了解可進行各種改變及修飾而不背離此處之揭示內容及以下之申請專利範圍。前述之實施態樣係為了更清楚地說明本發明之揭示內容而提供，並無意限制本發明之範圍。雖然本發明已藉由該等示範性實施態樣說明，該領域之技藝人士將輕易了解可能針對該等示範性實施態樣進行許多變異及修飾而無須過度實驗。所有該等變異及修飾皆包含在本揭示發明之範圍內。此處之引證文獻(包括專利、專利申請案、論文、教科書及該類似文獻)以及該等文獻中所引證之文獻若未經本發明參照，則以參照方式整體納入此處。若一或多篇該等納入文獻及類似材料與本申請案有不同或衝突之處，包括但不限於經定義之用語、用語之使用、經描述之技術或該類似物，以本申請案為主。前述之詳細說明及實施方式詳細描述本發明之某些特定實施態樣，並說明發明人所考慮之最佳模式。然而應了解的是，不論前述內容說明得多詳細，本發明可以許多方式實施，且應根據該隨附之申請專利範圍及彼等之任何相等範圍被解讀。應了解的是，只要此處之實施態樣係以用語「包含」描述，其亦提供其他以「由...組成」及/或「實質上由...組成」之用語所描述之類似實施態樣。本發明之態樣或實施態樣係以馬庫西群組或其他選擇性形式之群組描述，本發明不僅包含被標示為整體之整個群組，但亦包含該群組之個別成員及該主要群組中所有可能之亞群，且亦包含不含其中一或多個群組成員之主要群組。本發明亦設想明確排除該申請專利之發明中任何群組成員之一或多者。除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語和本發明所屬技術領域中具有通常知識者所通常瞭解之意義相同。若發生衝突，以本說明書(包括定義)為主。在本說明書及申請專利範圍中，用語「包含(comprise)」或變化用語諸如「包括(comprises)」或「含有(comprising)」將被理解為意指包括被敘述之整體或整體之群，但不排除任何其他整體或整體之群。除非上下文另外要求，單數用語應包括複數意義且複數用語應包括單數意義。任何在用語「例如」之後的實例並不具無遺漏或限制之意。當用語「或」用於多個選項清單之上下文時(例如「A、B或C」)，應被解讀為包括選項之任一或多者，除非上下文清楚另行說明。示範性方法及材料係於此處敘述，不過與此處所述之方法及材料類似或相等者亦可被用於實施或檢測本發明。該等材料、方法及實施態樣僅用來示例而非意圖限制。

Claims

一種雙相混合物，其包含液相及固相，其中： a.　該液相係包含受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液；且 b.　該固相係固體1-十二醇。
一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含： a.　添加液相1-十二醇至含有該受關注分子及該經掩蔽之內毒素之溶液；及 b.　將該液相1-十二醇及含有該受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使該1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分及該經固化之1-十二醇。
如請求項2之方法，其中該剩餘之液體部分係「液體A」，且其中該方法進一步包含添加分散劑溶液至液體A以產製包含分散劑及液體A之混合物(「液體B」)。
如請求項3之方法，其進一步包含將一部分液體B稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本，其中該先前經掩蔽之內毒素係在該內毒素測試就緒樣本中去掩蔽。
如請求項4之方法，其中該部分液體B係以一比例稀釋於該包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑，該比例介於a)每100微升Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子緩衝劑1微升液體B與b)每3000微升Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子緩衝劑1微升液體B之間。
一種去掩蔽溶液中之內毒素之方法，該溶液包含受關注分子及經掩蔽之內毒素，該方法包含： a.　添加液相1-十二醇至含有該受關注分子及該經掩蔽之內毒素之溶液； b.　將該液相1-十二醇及含有該受關注分子之溶液冷卻至低於24℃之溫度，以使該1-十二醇固化，且存有剩餘之液體部分(「液體A」)及該固體1-十二醇；及 c.　將一部分液體A稀釋於包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑以產生內毒素測試就緒樣本；其中該先前經掩蔽之內毒素係在步驟c之該樣本中去掩蔽。
如請求項4至6中任一項之方法，其中該包含Ca²⁺ 或Mg²⁺ 離子之緩衝劑包含Mg²⁺ 離子。
如請求項7之方法，其中該緩衝劑包含MgSO₄ 。
如請求項8之方法，其中該緩衝劑包含1、5或10 mM MgSO₄ 。
如請求項4至9中任一項之方法，其中該內毒素測試就緒樣本進一步係經由鱟變形細胞裂解物(LAL)測定測試內毒素。
如請求項4至9中任一項之方法，其中可在該內毒素測試就緒樣本中偵測到比未經如請求項4至9中任一項之方法處理之含有該受關注分子及該經掩蔽之內毒素之其他相同的對應溶液較大量的內毒素。
如請求項1至11中任一項之雙相混合物或方法，其中1-十二醇微升對包含該受關注分子及經掩蔽之內毒素之溶液微升的比例係介於a)每10微升溶液0.2微升1-十二醇與b)每10微升溶液2微升1-十二醇之間。
如請求項1至12中任一項之雙相混合物或方法，其中該受關注分子係蛋白質。
如請求項13之雙相混合物或方法，其中該蛋白質係抗體。
如請求項14之雙相混合物或方法，其中該抗體係他尼珠單抗(tanezumab)。
如請求項1至12中任一項之雙相混合物或方法，其中該包含受關注分子之溶液係他尼珠單抗藥物產品。
如請求項15和16中任一項之雙相混合物或方法，其中該溶液包含2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、或20 mg/ml他尼珠單抗。
如請求項1至17中任一項之雙相混合物或方法，其中該1-十二醇係純度≥98%的1-十二醇。