DE60123399T2

DE60123399T2 - Pharmazeutische zubereitungen enthaltend beta-turn peptidomimetische zyklische substanzen

Info

Publication number: DE60123399T2
Application number: DE60123399T
Authority: DE
Inventors: Uri Horacio Westmount SARAGOVI; Kevin Bryan BURGESS
Original assignee: McGill University; Texas A&M University System
Current assignee: McGill University; Texas A&M University System
Priority date: 2000-01-18
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2021-01-19
Also published as: DK1265605T3; ES2273849T3; EP1265605B1; ATE340571T1; CA2397670C; AU2001228212A1; CA2397670A1; US6881719B2; DE60123399D1; WO2001052843A1; US20030211982A1; EP1265605A1

Description

Fachgebiet
Diese Erfindung bezieht sich auf Neurotrophin-Rezeptor-agonistische und -antagonistische pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Neurotrophin-nachahmende β-Turn-peptidomimetische cyclische Verbindung der Formel (I) umfassen, und Verwendungen davon.
Technischer Hintergrund
Tyrosin-Kinase A (TrkA) ist ein Transmembran-Tyrosin-Kinase-Rezeptor mit hoher Selektivität für das Neurotrophin Nervenwachstumsfaktor (NGF). Zu den verwandten Neurotrophinen gehören der Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), der Tyrosin-Kinase-B-(TrkB)-Rezeptoren bindet, und Neurotrophin-3 (NT-3), das die Bindung an Tyrosin-Kinase-C-(TrkC)-Rezeptoren bevorzugt.
Das Andocken von NGF an TrkA leitet die Dimerisierung des Rezeptors, die katalytische Phosphorylierung von cytoplasmatischen Tyrosinresten am Rezeptor und eine Kaskade von Zellsignalereignissen ein. Diese Signale führen zur Verhinderung des apoptotischen Zelltods, zur Förderung der Zelldifferenzierung und Axonverlängerung und zur Hochregulierung von Cholin-Acetyl-Transferase (ChAT). Dasselbe gilt für andere Neurotrophine, außer dass verschiedene Zellpopulationen auf der Basis ihrer Rezeptorexpressionsmuster selektiv reagieren. NGF wird als Beweis für das Prinzip verwendet, aber die Gedanken gelten für alle Neurotrophine (NTFs).
Mehrere neuronale Zelltypen, die bei wichtigen Krankheitszuständen beteiligt sind, exprimieren TrkA und sprechen daher auf NGF an, einschließlich sensori scher, sympathischer und cholinergischer Neuronen. Es wurde vorgeschlagen, dass eine NGF-Therapie vielleicht das Einsetzen von Alzheimer-Krankheit verzögert, den mit einem Hirnschlag verbundenen Funktionsverlust verhindert und periphere diabetische Neuropathien lindert. Zu den weiteren Anwendungen, die für NGF vorgeschlagen wurden, gehören die Behandlung von neuronalen Schäden und die Ansteuerung von Tumoren, die aus dem Neuroektoderm stammen. Wegen einer Übersicht über potentiell behandelbare Krankheiten siehe Saragovi und Burgess, 1999.
Trotz des therapeutischen Potentials von NGF waren klinische Versuche mit diesem Protein enttäuschend (Saragovi und Burgess, 1999). Dafür gibt es mehrere Gründe: inhärente Nachteile, die mit der Verwendung von Polypeptiden als Wirkstoffe, der in-vivo-Instabilität und den pleiotrophen Effekten aufgrund der unabsichtlichen Aktivierung von Signalen verbunden sind. Außerdem ist das NGF-Protein für medizinische Anwendungen relativ kostspielig herzustellen.
Agonisten von TrkA, TrkB und TrkC sowie p75-Rezeptor wären nützlich bei der Behandlung und Prävention von Tyrosin-Kinase-Rezeptor-vermittelten Störungen, zum Beispiel chronischer oder akuter Neurodegeneration, Schmerzen, Krebs, Hirnschlag, Neuromen, Augennervenkrankheiten, wie Glaukom, und Alzheimer-Krankheit.
Strategien, die zur Agonisten von Tyrosin-Kinase-Rezeptoren führen, sind nicht gut etabliert. Früher wurden Liganden-Nachahmungs- und Antikörper-Nachahmungs-Strategien versucht, um Peptidanaloga von zwei Agonisten zu erzeugen, die auf die extrazelluläre Domäne von TrkA gerichtet sind: dem natürlichen Liganden NGF (LeSauteur et al., 1995) und dem monoklonalen Antikörper (mAb) 5C3 (LeSauteur et al., 1996). Die TrkA-Bindung wird durch diskrete β-Turn-Bereiche dieser Liganden vermittelt. Nur bestimmte cyclische β-Turn-Analoga waren aktiv (Beglova et al., 1998), und andere Conformere oder lineare Peptide waren inaktiv.
Offenbarung
Diese Erfindung möchte einen Neurotrophin-Rezeptor-agonistische oder -antagonistische pharmazeutische Zusammensetzung bereitstellen.
Die Erfindung möchte auch deren Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Störungen von Geweben, bei denen Neurotrophin-Rezeptoren eine Rolle spielen, angeben.
Weiterhin möchte die Erfindung auch die Verwendung von β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindungen zur Bewertung von Strukturanforderungen von Neurotrophin-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten angeben.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Neurotrophin-Rezeptor-agonistische oder -antagonistische pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die eine annehmbare Neurotrophin-Rezeptor-agonistische oder -antagonistische Menge einer Neurotrophin-nachahmenden β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindung der im Folgenden definierten Formel (I) in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer Neurotrophin-nachahmenden β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindung der Formel (I), wie sie im Folgenden definiert wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Neurotrophin-Rezeptor-vermittelten Störungen angegeben.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Verwendung der β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindungen der Formel (I) zur Bewertung von Strukturanforderungen von Neurotrophin-nachahmenden β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindungen angegeben. Bei den Verbindungen ^der Formel (I) handelt es sich um
oder ein Dimer davon, wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ aus Wasserstoff, Alkyl- oder Aryl-Seitenkettensubstituenten, die man in einer natürlichen oder unnatürlichen Aminosäure findet, ausgewählt sind; oder
R¹ und R² oder R³ und R⁴ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl- oder Cyclohexylgruppe bilden;
Y Wasserstoff oder ein oder zwei Substituenten ist, die aus Nitro, Amino, Halogen, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Naphthyl ausgewählt sind, wobei das Alkyl, Phenyl oder Naphthyl unsubstituiert oder mit Nitro oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist, oder Y eine biotinhaltige derivatisierte Gruppe ist;
X = O, N, S, P, Se, C, NH oder Alkylen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;
n = 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 ist; und
LINKER eine Verknüpfungsgruppe ist, die die Bildung eines Dimers der Verbindung durch Reaktion mit einer homodifunktionellen Verbindung bewirkt, wobei die Verknüpfungsgruppe eine Gruppe trägt, die aus NH₂, OH, SH, COOH, CH₃CO und CHO ausgewählt ist, Zhicheng Wang et al. (1999) und Yangbo Feng et al. (1999),
in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Zu den Verbindungen der Formel (I) gehören die D3 genannte Substanz und Derivate davon.
Einige dieser Derivate können einfache und offensichtliche Modifikationen sein, wie biotinylierte Formen und Moleküle, bei denen zwei solche Einheiten durch Dimere miteinander verknüpft sind. Weitere offensichtliche Derivate von D3 umfassen die folgenden. Die Seitenketten R¹ bis R⁶ könnten irgendeinen Alkyl- oder Arylsubstituenten umfassen, den man in natürlichen und unnatürlichen Aminosäuren findet.
Die Seitenketten, die typisch für die Proteinaminosäuren (z.B. Arg, Trp, His) sind, sind von besonderem Interesse, und viele Verbindungen in dieser Serie wurden hier hergestellt, aber die Vielfalt von Strukturen, die leicht zu erzeugende Derivate von D3 sind, umfassen viele Typen von funktionellen Gruppen. Die konstituierenden Aminosäuren können N-Alkyl-, N-Aryl-, α,α-Dialkyl- und cyclische Derivate, wie sie aus Cyclopropanaminosäuren gebildet werden könnten, sein.
Bei dem oder den Substituenten Y handelt es sich um Wasserstoff oder ein oder zwei Substituenten, die aus Nitro, Amino, Halogen, C_1-6-Alkyl, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Naphthyl ausgewählt sind. Die Alkyl-, Phenyl- und Naphthylsubstituenten Y können unsubstituiert oder mit Nitro oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiert sein.
Y kann auch mit einer funktionellen Gruppe, die Biotin enthält, derivatisiert sein. Die Gruppe X ist O, N, S, P, Se, C, NH oder C_1-6-Alkylen. Der Verbindungspunkt sollte in ortho- oder meta-Position zur Benzoyl-Carbonylgruppe stehen. Werte für "n" sind 0, 1, 2, 3, 4 und 5. Die verknüpfende Seitenkette, die X enthält, kann aliphatisch, wie es in Struktur (I) gezeigt ist, aromatisch oder heteroaromatisch sein.
R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ sind aus Wasserstoff, Alkyl- oder Aryl-Seitenkettensubstituenten, die man in einer natürlichen oder unnatürlichen Aminosäure findet, ausgewählt; oder
R¹ und R² oder R³ und R⁴ können zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl- oder Cyclohexylgruppe bilden.
Es gibt einen großen Variationsbereich für R⁵ und R⁶, aber bei weitem der häufigste Substituent auf diesen Positionen ist Wasserstoff. Diese Substituenten könnten auch so gestaltet sein, dass sie einer der Seitenketten der zwanzig Proteinaminosäuren, insbesondere Methyl, entsprechen.
Die Verbindungen (I) sind insbesondere Verbindungen, die aus den zwanzig Proteinaminosäuren oder einfachen Analoga davon einschließlich ihrer Enantiomeren, N-Alkyl-, N-Aryl-, α,α-Dialkyl- und cyclischen Aminosäuren hergestellt sind. Seitenketten, die sich als besonders förderlich für die biologischen Aktivitäten erwiesen haben, sind R¹ und R³ als Seitenketten von Lysin, Glutaminsäure, Tyrosin, Isoleucin, Asparagin und Threonin sowie R², R⁴, R⁵ und R⁶ als Wasserstoff. Eine oder mehrere der Seitenketten werden insbesondere so ausgewählt, dass sie Seitenketten innerhalb von Turn-Bereichen der Neurotrophinproteine, die die cyclische Verbindung nachahmt, zum Beispiel NGF, NT-3, NT-4/5 und/oder BDNF, entsprechen.
Im Allgemeinen haben die makrocyclischen Verbindungen 13- bis 16-gliedrige Ringe, wobei der X-Substituent O, N, S, SO oder SO₂ ist. Die molekularen Fragmente Z und Y sind typischerweise aromatische Ringe auf der Basis eines einfachen Ringsystems, insbesondere substituierte Benzole. Nitro-, amino-, chlor-, brom- und fluorsubstituierte Benzole sind alle in dieser Position zulässig.
Insgesamt wurden mehrere hundert Verbindungen hergestellt, die der oben angegebenen Struktur entsprechen. Einige spezielle Beispiele für Verbindungen (I), die in Assays für mit Neurotrophin zusammenhängende Aktivitäten getestet wurden, sind im Folgenden aufgeführt.
Beispiele für Ausführungsformen, die neurotrophe Aktivität nachahmen, sind die D3, P27, D53b-d, 25, P56, P57, P58, P39, D21, D46, D40 und P23 genannten Agentien. Beispiele für Ausführungsformen, die die neurotrophe Aktivität antagonisieren, sind P42 und P43. Diese Agentien sind im Folgenden gezeigt:
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung wurden pharmazeutische Zusammensetzungen entwickelt, die kleine, proteolysestabile Moleküle mit neurotropher Aktivität umfassen, welche selektiv für Zellen sind, die Neurotrophinrezeptoren (Trk-Tyrosin-Kinase-Rezeptoren und p75-Rezeptoren) exprimieren.
Auf der Basis der Pharmacophore der schon früher beschriebenen mAb 5C3 und der NGF-Peptidanaioga wurde eine fokussierte Bibliothek von β-Turn-peptidomimetischen Verbindungen synthetisiert.
Diese Bibliothek von Verbindungen besteht aus β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindungen. Diese Verbindungen ahmen insbesondere Neurotrophine nach und sind somit Agonisten oder Antagonisten der Neurotrophinrezeptoren oder können bei der Suche nach solchen Agonisten und Antagonisten und/oder der Bewertung der dafür notwendigen strukturellen Anforderungen eingesetzt werden.
Im Allgemeinen haben die cyclischen Verbindungen einen makrocyclischen Ring von 13 bis 17, insbesondere 14, 15 oder 16, Ringatomen, und der Ring wird vorwiegend durch ein Kohlenstoff- und Stickstoffgerüst mit Seitenketten von Aminosäuren, die natürlich oder synthetisch sein können, gebildet.
Der Ring kann durch eine oder mehrere Seitenketten an der Peptidbindung, insbesondere in den Positionen i, i+1, i+2 und i+3, gekennzeichnet sein. Die cyclische Verbindung weist typischerweise 1, 2 oder 3 Seitenketten auf.
Die eine oder mehreren Seitenketten entsprechen insbesondere Seitenketten innerhalb von β-Turns eines Neurotrophin-Proteins, das von der cyclischen Verbindung nachgeahmt wird, und insbesondere entsprechen die β-Turns den β-Turns eines Neurotrophins, wie NGF, NT-3, NT-4/5 und BDNF.
Die β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindungen der Erfindung können in bestimmten Ausführungsformen durch die Formel (I) dargestellt werden, wie sie oben definiert ist.
In Formel (I) hat der makrocyclische Ring, der R₁ bis R₆ enthält, zweckmäßigerweise 13 bis 17 und vorzugsweise 14, 15 oder 16 Ringatome.
In bevorzugten Ausführungsformen ist X = O, S oder NH, und R₁, R₃, R₅ und R₆ sind Wasserstoffatome. Wenn Y ein Substituent ist, kann er als Marker oder Vorläufer eines Markers fungieren, wobei der Marker bei der Bewertung der direkten Bindung, der in-vivo-Verteilung und der agonistischen oder antagonistischen Fähigkeit der cyclischen Verbindung eingesetzt werden kann.
Die LINKER-Gruppe fungiert als Verknüpfungsgruppe, die die Bildung von Dimeren der Verbindung (I) durch Reaktion mit einer homobifunktionellen Verbindung, wie Polyethylenglycol, bewirkt, wobei der LINKER eine Gruppe trägt, die aus NH₂, OH, SH, COOH, CH₃CO und CHO ausgewählt ist.
Repräsentative Verbindungen der Formel (I), die als Bestandteil der oben genannten Bibliothek hergestellt wurden, sind im Folgenden angegeben.
Die cyclischen Verbindungen der Erfindung können nach dem Verfahren hergestellt werden, das von Feng et al. in J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 10768-1076, beschrieben wird. Der allgemeine Reaktionstyp ist im Folgenden gezeigt:
Dies ist eine Festphasen-S_NAr-Makrocyclisierung, bei der Aminosäuren nacheinander Peptidbindungen des makrocyclischen Rings bilden. Falls notwendig, können Seitenketten an der Peptidbindung geschützt sein, zum Beispiel als t-Butylester oder BOC-Amide.
Der Substituent Y in Formel (I) kann zum Beispiel NO₂ sein, das leicht zu Amino reduziert werden kann, welches dann eingesetzt werden kann, um einen Biotinmarker zu entwickeln; andere Marker, die an den Substituenten Y gebunden werden können, umfassen radioaktive Elemente, wie Iod und Technetium.
Die Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Verbindung EKHse-G-OH, die im Folgenden zweckmäßigerweise als D3 bezeichnet wird, und ihr Biotinderivat, das im Folgenden als D3-Biotin bezeichnet wird, und die Verbindung EKCys, die im Folgenden zweckmäßigerweise als C59 bezeichnet wird, erläutert, wobei die Strukturen im Folgenden angegeben sind:
Die Neurotrophin-Rezeptor-agonistischen oder -antagonistischen Eigenschaften werden am effektivsten bei der Behandlung von Neurotrophinrezeptor-vermittelten Störungen verwendet, wenn die cyclische Verbindung gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Zubereitungstechniken zu neuen pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verarbeitet wird.
Die neuen Zusammensetzungen enthalten wenigstens eine therapeutische Neurotrophin-Rezeptor-agonistische oder -antagonistische Menge der aktiven cyclischen Verbindung. Im Allgemeinen enthält die Zusammensetzung bis zu 0,1 bis 100 mg der cyclischen Verbindung pro kg Körpergewicht des Patienten. Konzentratzusammensetzungen, die vor der Verwendung verdünnt werden, können 90 Gew.-% oder mehr enthalten. Die Zusammensetzungen umfassen Zusammensetzungen, die für die orale, rektale, topische, parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre und intravenöse), pulmonale (nasale oder bukkale Inhalation), nasale Verabreichung oder Einblasung geeignet sind. Die Zusammensetzungen können vorgepackt werden, indem man die cyclische Verbindung innig mit den Komponenten mischt, die für das gewünschte Medium geeignet sind.
Wenn orale Verabreichung eingesetzt werden soll, kann sie mit einer flüssigen Zusammensetzung erfolgen. Für flüssige Präparate wird das therapeutische Mittel mit flüssigen Trägern, wie Wasser, Glycolen, Ölen, Alkoholen und dergleichen zubereitet, und für feste Präparate, wie Kapseln und Tabletten, verwendet man feste Träger, wie Stärken, Zucker, Kaolin, Ethylcellulose, Calcium- und Natriumcarbonat, Calciumphosphat, Kaolin, Talk, Lactose, im Allgemeinen mit Gleitmittel, wie Calciumstearat, zusammen mit Bindemitteln, Sprengmitteln und dergleichen. Weil sie leicht verabreicht werden können, stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhafteste orale Darreichungsform dar. Es ist besonders vorteilhaft, die Zusammensetzungen in Form von Dosiseinheiten (wie es im Folgenden definiert wird) zuzubereiten, um sie leicht verabreichen und gleichmäßig dosieren zu können. Eine Zusammensetzung in Form von Dosiseinheiten bildet einen Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Die cyclische Verbindung kann auch in therapeutischen Zusammensetzungen für die intravenöse und intraperitoneale Injektion zubereitet werden und kann in Form von Dosiseinheiten in Ampullen oder in Multidosisbehältern, gegebenenfalls mit zugesetztem Konservierungsmittel, präsentiert werden. Die Zusammensetzungen können solche Formen annehmen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägern, wie Natriumchlorid oder Dextrose in Wasser, und können Zubereitungsmittel, wie Suspendiermittel, Stabilisatoren und/oder Dispergiermittel, enthalten. Puffermittel sowie Additive, wie Kochsalz oder Glucose, können zugegeben werden, um die Lösungen isotonisch zu machen. Die cyclische Verbindung kann für die tropfenweise intravenöse Verabreichung auch in Alkohol/Propylenglycol oder Polyethylenglycol in Lösung gebracht werden. Alternativ dazu können die Wirkstoffe in Pulverform vorliegen, um sie vor der Verabreichung mit einem geeigneten Träger zu rekonstituieren.
Der Ausdruck "Dosiseinheiten" bezieht sich hier auf physikalisch diskrete Einheiten, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge Wirkstoff enthält, die so berechnet ist, dass in Verbindung mit dem pharmazeutischen Träger die gewünschte therapeutische Wirkung entsteht. Beispiele für solche Dosiseinheiten sind Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulverpäckchen, Waffeln, Oblaten, abgemessene Einheiten in Ampullen oder in Multidosisbehältern und dergleichen. Eine Dosiseinheit der vorliegenden Erfindung enthält im Allgemeinen 100 bis 200 mg einer der cyclischen Verbindungen.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die cyclischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung zweckmäßigerweise in Form einer Aerosolspraypräsentation aus unter Druck stehenden Packungen von Verneblern abgegeben. Die cyclischen Verbindungen können auch als Pulver abgegeben werden, die zubereitet werden können, und die Pulverzusammensetzung kann mit Hilfe einer Pulvereinblas-Inhalatorvorrichtung inhaliert werden. Das bevorzugte Abgabesystem für die Inhalation ist ein Dosieraerosol (MDI), das als Suspension oder Lösung der cyclischen Verbindung in geeigneten Treibmitteln, wie Fluorkohlenstoffen oder Kohlenwasserstoffen, zubereitet werden kann.
Ein weiteres Verabreichungsverfahren ist das Einblasen, insbesondere wenn sich die Infektion bis zu den Ohren und anderen Körperhöhlen ausgebreitet hat.
Wenn die Verabreichung topisch sein soll, kann die cyclische Verbindung in herkömmlichen Cremes und Salben, wie weißer Vaseline, wasserfreiem Lanolin, Cetylalkohol, Kühlsalbe, Glycerylmonostearat, Rosenwasser und dergleichen, zubereitet werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt, dass D3 die partielle Differenzierung von embryonalen DRG-Kulturen induziert, wenn es allein angewendet wird, und eine synergistische Verstärkung der Wirkung von suboptimalen NGF-Konzentrationen bewirkt.
2 zeigt, dass D3 die TrkA·TrkA-Homodimere der Zelloberfläche verstärkt.
3 zeigt NGF mit hervorgehobenen Turn-Bereichen, die vermutlich entscheidend für die Bindung an den TrkA-Rezeptor sind (zwei Zinkatome sind in dem Dimer vorhanden, sind aber wegen der besseren Übersichtlichkeit weggelassen); und
4 zeigt die Struktur eines NG-3/BDNF-Heterodimers, wobei entsprechende Turn-Bereiche von NT-3 hervorgehoben sind.
Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
In 1 wurden primäre neuronale DRG-Kulturen 8 Tage lang so behandelt, wie es angegeben ist, und die Zelldifferenzierung wurde morphometrisch untersucht. Vergrößerung 60 ×. Die Bilder sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente.
In 2 wurden 4-3.6-Zellen TrkA-Liganden gemäß Tabelle 5 (Spuren 1-4) oder keinem Liganden (Spuren 5 und 6) ausgesetzt und chemisch vernetzt (Spuren 1-5) oder nicht vernetzt (Spur 6). Zelllysate wurden einem Western-Biotting mit Anti-TrkA-203-Antiseren unterzogen. Die Intensität der M_r-300-kDa-Bande wurde densitometrisch anhand von 4 Experimenten, die auf 1 nM NGF normiert wurden, analysiert.
Die Verbindung D3 ist ein kleiner, selektiver und proteolysestabiler Agonist des TrkA-Rezeptors. Weiterhin wurde die Andockstelle von D3 an TrkA bewertet und beweist, dass ein kleiner peptidomimetischer Ligand einen Tyrosin-Kinase-Neurotrophinrezeptor agonisieren kann, der normalerweise einen relativ großen Proteinliganden bindet. Die Verbindungen der Erfindung bieten also eine alternative therapeutische Strategie mit pharmakologischen Mitteln, die selektiv neuronale Populationen ansteuern, welche spezifische Neurotrophinrezeptoren auf der Zelloberfläche exprimieren.
Beispiele
Materialien und Verfahren
Herstellung von D3 und D3-Biotin
Verbindung D3 wurde nach den Verfahren hergestellt, die zuvor für verwandte Verbindungen skizziert wurden (Feng et al., 1998). FMOC-Gly, FMOC-Hse (Trt), FMOC-Lys(BOC), FMOC-Glu(OtBu), dann 2-Fluor-5-nitrobenzoylchlorid wurden mit einer Beladung von 0,18 mmol/g an TentaGel-S-PHB-Harz gekoppelt (Aktivierung mit Diisopropylcarbodiimid, 20% Piperidin in DMF zur Entfernung von FMOC-Gruppen). Das trägergebundene Peptid wurde sechsmal 5 min lang mit 1% TFA/4% HSiiPr₃ in CH₂Cl₂ behandelt, um nur den Trt-Schutz zu entfernen. Eine Cyclisierung wurde durch 40 h Behandlung mit 5,0 Äquivalenten K₂CO₃ in DMF bewirkt. Nach Spaltung mit 90% TFA/5% H₂O/5% HSiiPr₃ wurde das Endprodukt durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. D3 und seine Derivate waren bis 5 mg/ml (der höchsten getesteten Konzentration) in Wasser löslich.
D3-Biotin wurde in derselben Weise wie D3 hergestellt, außer dass nach der Cyclisierung die Nitrogruppe durch 20 h Behandlung mit 10 Äquivalenten SnCl₂·2H₂O reduziert wurde. Nach der Reduktion wurde FMOC-Gly und dann Biotin-N-hydroxysuccinimid an das neu gebildete Arylamin gekoppelt. Dann wurde das Produkt vom Harz abgespalten. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
Zelllinien: B104-Ratten-Neuroblastome exprimieren p75-Rezeptoren, exprimieren aber keine der Trks (TrkA– p75+). Die 4-3.6-Zellen sind B104-Zellen, die stabil mit humaner trkA-cDNA transfiziert sind und gleiche Mengen an p75 und TrkA exprimieren (TrkA+ p75+). Für Screening-Agentien, die TrkC-Rezeptoren aktivieren oder antagonisieren, wurden NIH3T3-Fibroblasten stabil mit humaner TrkC-cDNA transfiziert. Diese Zellen sprechen auf den Liganden NT-3 an. Für Screening-Agentien, die TrkA-Rezeptoren aktivieren oder antagonisieren, wurden NIH3T3-Fibroblasten stabil mit humaner TrkA-cDNA transfiziert. Diese Zellen sprechen auf den Liganden NGF an. Wildtyp-NIH3T3-Fibroblasten wurden als Kontrollen verwendet, da sie auf keinen Neurotrophinliganden ansprechen.
Erzeugung von Human-TrkA-Ratten-TrkB-Chimären in HEK293-Zellen
Die IgG-C2-Domäne von humanem TrkA wurde unter Verwendung von einzelnen Restriktionsstellen in den Primern erzeugt, was einen Austausch mit der entsprechenden Ratten-TrkB-Domäne ermöglicht. Die chimärischen Rezeptoren wurden konstruiert, indem man die humane TrkA-IgG-C2-Domäne in die entsprechenden Restriktionsstellen der Ratten-trkB-cDNA subkloniert, die in einer früheren Arbeit beschrieben wurden (Perez et al., 1995). Chimärische Konstrukte wurden durch Sequenzieren bestätigt und in den pCDNA3-Expressionsvektor kloniert, der ein Selektionsgen enthält, das Resistenz gegen Neomycin verleiht (G418, GIBCO). HEK293-Zellen wurden unter Verwendung des Lipofectamin-plus-Verfahrens (GIBCO) transfiziert, mit Neomycin (0,5 mg/ml) selektiert, und wenigstens 3 unabhängige Subklone wurden durch Grenzverdünnungstechniken erhalten (293-TrkB/A-IgC2-Chimäre). Eine Western-Blot-Analyse mit dem polyklonalen Antikörper 203, der gegen die intrazelluläre Trk-Domäne gerichtet ist, und eine Zelloberflächen-FACScan-Analyse mit polyklonalem Antikörper, der gegen die extrazelluläre TrkA-Domäne gerichtet ist, wiesen darauf hin, dass alle stabilen Subklone vergleichbare Mengen an chimärischen Rezeptoren exprimieren.
Kulturen dissoziierter neuronaler Spinalganglien (DRG)
Primärkulturen fetaler Ratten-DRG wurden aus Sprague-Dawley-Ratten-Embryonen vom Tag 17 etabliert. Alle Ganglien wurden seziert und dissoziiert, zuerst enzymatisch mit Trypsin und dann mechanisch. Die dissoziierten Zellen wurden in 96-Napf-Platten, die mit Collagen vorbeschichtet waren, kultiviert (10⁵ Zellen/Napf) und insgesamt 8 Tage lang in Neuro Basal Medium wachsen gelassen, das N2-Ergänzung (GIBCO, Toronto), Antibiotika und L-Glutamin enthielt. Diese DRG-Kulturen sind zu etwa 85% TrkA-exprimierend und hängen zum Überleben stark von TrkA-Signalen ab.
Septale neuronale Kulturen
Zellkulturen wurden aus dem septalen Bereich von 17 Tage alten Rattenembryonen etabliert. Kurz gesagt, Gewebe wurde in PBS, das Trypsin und DNase enthält, inkubiert. Dann wurden Gewebestücke mechanisch dissoziiert. Nach der Zentrifugation wurde das Sedimentin Leibovitz-L-15-Medium suspendiert. Zellen wurden auf 96-Multiwell-NUNC-Schalen ausgestrichen (10⁵ Zellen/Napf), die mit Poly-D-lysin beschichtet waren (% μg/ml). Reinkulturen von septalen Neuronen wurden 1 Tag nach dem Ausstreichen behandelt. Wirkstoffe, die in Medium angesetzt wurden, wurden direkt zu den Zellen gegeben, ohne das Anfangsmedium zu ändern. Die Inkubation wurde 8 Tage lang fortgesetzt, und zu diesem Zeitpunkt wurde die ChAT-Aktivität bewertet.
D3·TrkA-Bindungsassays
Studien zur direkten Bindung: wurden gemäß der Beschreibung (Saragovi et al., 1998) durchgeführt unter Verwendung von 6 ng/Napf rekombinantem Baculovirus-TrkA-extrazelluläre-Domäne-Protein (TrkA-ECD) oder Kontroll-Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V, Boehringer Mannheim), das auf 96-Napf-Mikrotestplatten immobilisiert war. Die Näpfe wurden 1 Stunde lang mit Bindungspuffer (BB: PBS mit 1% BSA) blockiert. Dann wurden 50 ng/Napf biotinyliertes D3 als primäres Reagens in BB während 40 min in Anwesenheit oder Abwesenheit von überschüssigem nichtbiotinyliertem D3 als Kompetitor hinzugefügt. Die Näpfe wurden fünfmal mit BB gewaschen, und an Meerrettich-Peroxidase (HRP) gekoppeltes Avidin (Sigma) wurde 30 min lang als sekundäres Reagens hinzugefügt. Die Platten wurden in BB gewaschen, und die Peroxidase-Aktivität wurde kolorimetrisch unter Verwendung von 2,2-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) (ABTS, Sigma) bestimmt. Die optische Dichte (OD) wurde bei 414 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Bio-Rad) gemessen. Die Assays wurden wenigstens dreimal wiederholt, n = 4.
FACScan-Bindungsassays: 4-3.6-Zellen (2 × 10⁵) in FACScan-Bindungspuffer (PBS, 0,5% BSA und 0,1% NaN₃) wurden einer Immunfärbung gemäß der Beschreibung (Saragovi et al., 1998) unterzogen. Sättigende Anti-TrkA-mAb-5C3 oder Anti-p75-mAb-MC192 oder nichtbindende Kontroll-IgGs wurden 1 Stunde lang bei 4°C in Anwesenheit oder Abwesenheit von D3 als Kompetitor zu Zellen gegeben. Überschüssiger primärer Antikörper wurde abgewaschen, und die Zellen wurden einer Immunfärbung mit fluoresciniertem sekundärem Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper unterzogen. Die Zellen wurden mit einem FACScan erfasst, und die mittlere Kanalfluoreszenz von glockenförmigen Histogrammen wurde unter Verwendung des LYSIS-II-Programms analysiert.
Bindungskonkurrenz: Studien wurden gemäß der Beschreibung für direkte Bindungsassays an TrkA-ECD durchgeführt, außer dass als primäres Reagens 50 ng Anti-TrkA-mAb-5C3/Napf in BB in Anwesenheit oder Abwesenheit von D3 oder Kontrollen als Kompetitoren gemäß der Beschreibung (Saragovi et al., 1998) hinzugefügt wurden. Die Näpfe wurden fünfmal mit BB gewaschen, und HRP-gekoppelter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper wurde 30 min lang als sekundäres Reagens hinzugefügt. Die Platten wurden in BB gewaschen, und die Peroxidase-Aktivität wurde bestimmt. Die Assays wurden wenigstens dreimal wiederholt, n = 4.
Zellüberlebensassays
Primäre DRG-Kulturen: Nach insgesamt 8 Tagen Kultur mit den angegebenen Test- oder Kontrollliganden wurde das Überleben der Zellen unter Verwendung des kolorimetrischen Assays mit 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) und durch mikroskopische Beobachtung untersucht.
Zelllinien: 5000 Zellen/Napf in proteinfreiem Medium (PFHM-II, GIBCO, Toronto), das 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) (kristalline Fraktion V, Sigma, St. Louis, MO) enthält, wurden in 96-Napf-Platten (Falcon, Mississauga, Ontario) ausgesät. Die Kulturen waren unbehandelt oder mit den angegebenen Test- oder Kontrollliganden behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach 56-72 Stunden Kultur unter Verwendung des MTT-Assays quantifiziert. Der prozentuale Schutz wurde anhand von Ablesungen der optischen Dichte (OD) relativ zu optimalem NGF (1 nM) = 100% standardisiert. Die OD von unbehandelten Zellen wurde subtrahiert. Die höhere optische Dichte von unbehandelten Primärkulturen ist wahrscheinlich auf zelluläre Heterogenität und auf die endogene Produktion von begrenzenden Mengen an Wachstumsfaktoren zurückzuführen.
Messung der ChAT-Aktivität
Am 8. Tag der Kultur wurde das Medium abgesaugt, und eiskalter Lysepuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 7,4/0,1% Triton X-100^TM) wurde hinzugefügt. ChAT-Aktivitätsassays wurden direkt in den Näpfen unter Verwendung von Fonnums Verfahren (Fonnum, 1975) durchgeführt.
Nachweis von mutmaßlichen TrkA·TrkA-Homodimeren
In PBS suspendierte lebende 4-3.6-Zellen wurden 40 min lang bei 4°C mit den angegebenen Liganden behandelt, um eine Bindung zu ermöglichen. Dann wurden die Zellen in PBS gewaschen und mit dem membranundurchgängigen Vernetzer Disuccinimidylsuberat vernetzt (DSS, Pierce; 1 mM DSS, 15 Minuten bei 15°C). Nicht umgesetztes DSS wurde mit 5 mM Ammoniumacetat abgelöscht. Dann wurden die Zellen entweder direkt in SDS-Probenpuffer lysiert (Ganzzelllysat) oder in nichtionischem Detergens NP-40 lysiert und einer Immunfällung mit Anti-Trk- oder Anti-p75-Antikörpern gemäß der Beschreibung (LeSauteur et al., 1996) unterzogen. Mit beiden Verfahren wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Für eine Western-Blot-Analyse wurden gleiche Mengen an Protein oder Zelläquivalenten für jede Probe in einem 5-10%-igen SDS-PAGE-Gradienten gelöst, auf Nitrocellulosemembranen (Xymotech Biosystems, Montreal, Quebec) übertragen und einem Blotting mit polyklonalem Anti-Trk-Antikörper 203, der die intrazelluläre Domäne von Trk erkennt, unterzogen. Die Blots wurden unter Verwendung des Systems der verstärkten Chemilumineszenz (ECL) (New England Nuclear, Boston, MA) sichtbar gemacht.
Ergebnisse
Synthese von fokussierten β-Turn-peptidomimetischen Bibliotheken
Eine Festphasensynthese wurde entwickelt, die einen makrocyclischen Ring ergibt, bei dem die Reste i+1 und i+2 eines β-Turns in der geeigneten Konformation vorliegen. Ungefähr 60 Verbindungen dieses Typs wurden hergestellt (Feng et al., 1998), wobei Aminosäureseitenketten so eingebaut wurden, dass sie β-Turns von NGF und mAb 5C3 entsprechen, die am Andocken an TrkA beteiligt sind (LeSauteur et al., 1996; LeSauteur et al., 1995). Die TrkA-Bindung wird durch diskrete β-Turn-Bereiche dieser Liganden vermittelt. Cyclische Peptide als β-Turn-Analoga von NGF und von mAb 5C3 waren nur in der geeigneten Konformation aktiv (Beglova et al., 1998).
C59, das sich als inaktiv erwies, wurde als negative Kontrolle verwendet. Eine biotinylierte Form von D3, D3-Biotin, wurde synthetisiert, um Studien zur direkten Bindung an TrkA durchzuführen. Alle Liganden waren in physiologischen Puffern hochgradig löslich und erforderten keine organischen Lösungsmittel.
D3 ist ein selektiver Ligand für TrkA
Eine FACScan-Analyse mit dem sekundären fluoreszenten Mittel Avidin-FITC wurde verwendet, um die Bindung von D3-Biotin an die Zelloberfläche nachzuweisen (Tabelle 1). Die 4-3.6-Zellen (p75+TrkA+) hatten eine Fluoreszenz, die für D3-Biotin ungefähr viermal so groß war wie für Hintergrund-Kontroll-Peptid-Biotin. Außerdem verhinderte ein zehnfacher molarer Überschuss von D3 die Bindung von D3-Biotin. Dagegen wurde keine spezifische Bindung für B104-Zellen (p75+TrkA–) gemessen. Da 4-3.6-Zellen B104-Zellen sind, die stabil mit TrkA-cDNA transfiziert sind, und diese Zelllinien ansonsten identisch sind, zeigen diese Daten an, dass D3-Biotin und D3 Zelloberflächen-TrkA binden.
Ähnliche Bindungsdaten für D3-Biotin wurden durch ELISA unter Verwendung von reiner löslicher extrazellulärer TrkA-Domäne (TrkA-ECD), die in Baculovirus produziert wird, erhalten (siehe Tabelle 3). Diese Daten weisen weiter darauf hin, dass D3 an die extrazelluläre Domäne von TrkA bindet und dass keine Membranlipide erforderlich sind.
D3 bindet innerhalb der agonistischen Stelle von TrkA
Schon früher zeigte sich, dass mAb 5C3 als voller TrkA-Agonist wirkt. Der mAb 5C3 bindet mit einem K_d von 2 nM (LeSauteur et al., 1996) an ein Epitop innerhalb der IgC2-Domäne von TrkA in der Nähe der NGF-Bindungsstelle. Es wird postuliert, dass diese Stelle einen "Hot Spot" des Rezeptors definiert. D3 und mAb 5C3 wurden getestet, um zu bestimmen, ob sie an überlappende Rezeptorstellen binden.
In zwei verwandten Assays wurde die Fähigkeit von D3 getestet, um die Bindung des vollen TrkA-Agonisten mAb 5C3 zu konkurrieren. Im ersten Test, einem Assay auf FACScan-Basis unter Verwendung von intakten Zellen induzierte D3 eine dosisabhängige kompetitive Abnahme von mAb-5C3·TrkA-Wechselwirkungen (Tabelle 2, Reihen 2-5). Im Durchschnitt zeigte D3 ein IC₅₀ von 4 μM. Anhand der experimentellen Bedingungen wird ein K_d von etwa 2 μM für D3·TrkA-Wechselwirkungen abgeschätzt. Die Blockierung von 5C3·TrkA-Wechselwirkungen durch D3 ist selektiv, da die Bindung des gegen die p75-NGF-Rezeptoruntereinheit gerichteten mAb MC192 nicht blockiert war (Tabelle 2, Reihen 7 vs. 8). Weiterhin hemmten inaktive Kontroll-C59-Peptidomimetika weder die Bindung von mAb 5C3 (Tabelle 2, Reihe 6) noch die von mAb MC192.
Im zweiten Test wurde gereinigte rekombinante extrazelluläre TrkA-Domäne (TrkA-ECD), die auf ELISA-Platten immobilisiert sind, verwendet, um die kompetitive Blockierung von 5C3·TrkA-ECD durch D3 zu bestimmen. D3 zeigte eine dosisabhängige Hemmung von 5C3·TrkA-ECD-Wechselwirkungen, aber das inaktive Kontroll-C59-Peptidomimetikum hatte keine Wirkung (Tabelle 3). Da für 5C3·TrkA-Wechselwirkungen ein K_d von etwa 2 nM gemessen wurde, wurde ^aus dem experimentellen IC50 ein Kd von etwa 2 μM für D3·TrkA-ECD-Wechselwirkungen berechnet. Diese Berechnung steht mit den in Tabelle 2 gezeigten Daten im Einklang. Interessanterweise zeigten ähnliche ELISA- und RIA-Bindungsassays, dass D3 NGF·TrkA-ECD-Wechselwirkungen nicht wesentlich blockiert.
D3 zeigt trophische Aktivität selektiv gegenüber TrkA und ist proteolysestabil
Da D3 an die oder in der Nähe der agonistischen Stelle von TrkA bindet, wurden trophische Effekte in Zellüberlebensassays unter Verwendung des quantitativen MTT-Verfahrens sondiert. Mehrere D3-Dosen wurden getestet. Der Übersichtlichkeit halber sind jedoch nur fest optimale Konzentrationen gezeigt, die das geschätzte K_d annähern.
Dissoziierte primäre neuronale Kulturen von fetalen Spinalganglien (DRG) hängen zum Überleben von TrkA-Agonisten ab. Exogenes NGF zeigte eine dosisabhängige trophische Wirkung (Tabelle 4, Reihen 2-4). D3 allein hatte eine signifikante Schutzwirkung auf DRG-Kulturen (Tabelle 4, Reihe 5), aber Kontroll-C59 hatte eine solche nicht (Tabelle 4, Reihe 6). Primäre Kulturen sind heterogen, und niedrige Konzentrationen an Neurotrophinen werden endogen hergestellt, was eine relativ hohe optische Dichte für unbehandelte Kulturen erklärt (Tabelle 4, Reihe 1).
Da D3 die NGF-Bindung nicht blockiert, wurde die potentielle Synergie zwischen NGF und D3 bewertet. D3 kombiniert mit verschiedenen Konzentrationen an exogenem NGF zeigte eine additive oder potenzierende Wirkung auf das Überleben von DRG (Tabelle 4, Reihe 7-9).
Ähnliche Ergebnisse wurden mit anderen neuronalen Zelllinien erhalten, wobei D3 die Wirkung von niedrigen NGF-Konzentrationen potenzierte (Tabelle 5). Ein optimaler Schutz von 4-3.6-Zellen (p75+TrkA+) und HEK293-TrkB/A-IgC2-Chimären entsprach einer Behandlung mit 1 nM NGF (Tabelle 5, Reihe 2), während 10 pM NGF einen erheblich geringeren Schutz ergab (Tabelle 5, Reihe 3). D3 allein ergab einen geringen, aber signifikanten Schutz (Tabelle 5, Reihe 4), und der Schutz wurde mit einer Kombination von 10 pM NGF + 10 μM D3 (Tabelle 5, Reihe 6) verstärkt. Die negative Kontrollverbindung C59 hatte allein oder in Bezug auf die Verstärkung von 10 pM NGF keine Wirkung (Tabelle 5, Reihen 5 und 7).
Bei anderen Kontrollen schützten weder D3 noch NGF B104-Zellen, Wildtyp-HEK293-Zellen oder TrkB-exprimierende HEK293-Zellen vor Apoptose. Somit erfordert die trophische Aktivität von NGF und D3 eine TrkA-Expression oder wenigstens die IgG-C2-Domäne von TrkA. Außerdem verstärkte D3 nicht die trophische Wirkung von EGF, was vermuten lässt, dass es vielleicht NGF-selektiv ist. Schließlich verstärkte D3 den NGF-Schutz von NIH3T3-Zellen, die stabil mit TrkA-DNA transfiziert sind, verstärkte aber nicht den NT-3-Schutz von NIH3T3-Zellen, die stabil mit trkC-cDNA transfiziert sind. Diese Daten zeigen an, dass D3 selektiv die trophische Wirkung von NGF akzentuiert, und dass eine Expression des niedrigaffinen NGF-Rezeptors p75 nicht erforderlich ist.
Die Proteolysestabilität von D3 gegenüber Trypsin und Papain wurde bewertet. D3 wurde zuerst einer enzymatischen Behandlung unterzogen, wie es schon früher beschrieben wurde (Saragovi et al., 1992), und anschließend wurde seine biologische Aktivität anhand von 4-3.6-Zellen geeicht. Verbindung D3 blieb in trophischen Assays auch nach 1 Stunde Einwirkung von Trypsin oder Pepsin noch voll aktiv, während NGF unter denselben Bedingungen innerhalb von Minuten alle Aktivität verlor.
D3 induziert die Differenzierung von Primärkulturen von fetalem DRG und fetalen septalen Neuronen
Die Wirkung von D3 auf die TrkA-vermittelte zelluläre Differenzierung wurde unter Verwendung von zwei unabhängigen Assays bewertet: morphometrische Analyse von DRG-dissoziierten Neuronen und Induktion von ChAT-Aktivität in septalen neuronalen Kulturen. Im ersten dieser Assays weisen die Daten darauf hin, dass neuronale DRG-Kulturen ein Auswachsen von Neuriten als Reaktion auf D3 erfahren und dass D3 die Wirkung von NGF potenziert (1). Im zweiten Assay zeigte sich, dass die ChAT-Aktivität als Reaktion auf NGF (Tabelle 6, Reihe 1 und 2) und auf D3 allein (Tabelle 6, Reihe 3-5) zunahm, während die Kontrolle C59 keine Wirkung hatte (Tabelle 6, Reihe 6). Erhöhungen der ChAT-Aktivität als Reaktion auf 2 μM D3 allein waren mit denjenigen von 10 pM exogenem NGF vergleichbar. Außerdem erhöhten Kombinationen von 2 μM D3 + 10 pM NGF die ChAT-Aktivität merklich und waren effektiver als 400 pM NGF (Tabelle 6, Reihen 8-10).
D3 verstärkt oder stabilisiert mutmaßliche TrkA·TrkA-Homodimere
Auf der Basis der obigen Daten wurde erwartet, dass D3 TrkA·TrkA-Wechselwirkungen induzieren oder stabilisieren würde. Diese Hypothese wurde biochemisch in 4-3.6-Zellen, die Liganden ausgesetzt wurden, untersucht, und anschließend erfolgte eine chemische Vernetzung auf der Zelloberfläche (2).
Das erwartete Dublett, das mit schon früher beschriebenen TrkA-Monomeren von p110 und p140 im Einklang stand, wurde in allen Proben beobachtet (2, dicker Pfeil). Banden von etwa 300 kDa, die mit dem Molekulargewicht von TrkA·TrkA-Homodimeren im Einklang standen (2, dünner Pfeil), wurden in Proben von Zellen beobachtet, die mit den TrkA-Liganden 1 nM NGF, 10 pM NGF oder 10 pM NGF + 10 μM D3 behandelt wurden, und wurden ebenfalls (wenn auch viel schwächer) in Zellen nachgewiesen, die mit 10 μM D3 allein behandelt wurden. Die Intensität der Bande M_r 300 kDa, bei der es sich vermutlich um TrkA-Dimere handelt, wurde densitometrisch anhand von 4 unabhängigen Experimenten analysiert, die auf 1 nM NGF (100%) normiert wurden. Es gab eine konsistente Zunahme der Dimere nach Behandlung mit D3 allein (21 ± 4%) oder mit 10 pM NGF allein (52 ± 6%), die nach Behandlung mit 10 pM NGF + 10 μM D3 (77 ± 7%) höher war. Kontrollzellen, die in Abwesenheit von Ligand vernetzt wurden, oder Zellen, die Ligand ausgesetzt, aber nicht vernetzt wurden, hatten keine mutmaßlichen Dimere.
TrkA-Homodimere sind wegen kovalenter Vernetzung gegenüber SDS-Denaturierung stabil. Da die Effizienz der chemischen Vernetzung etwa 1-4% des gesamten TrkA-Pools beträgt, war eine weitere biochemische Charakterisierung der Komplexe ausgeschlossen, abgesehen von der Tatsache, dass sie TrkA enthalten. Die Komplexe können vernetzten NGF enthalten. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die Banden p75 umfassen, da Immunfällungen mit Anti-p75-Antikörpern kein Material im M_r von TrkA-Homodimeren zeigten. Weiterhin wurde Material mit einem M_r von 215 kDa, das p75-TrkA-Heterodimere umfassen würde, nicht durchgehend beobachtet.
Biologische Aktivität von Beispielen für bevorzugte Ausführungsformen
Beispiele für einige bevorzugte Ausführungsformen, die die NGF-artige neurotrophe Aktivität nachahmen (Tabelle 7), sind Agentien, die D3, D53b-d, D21, P23 und P58 genannt werden. Diese Agentien, die bei 10 μM getestet wurden, sorgen für ein signifikantes Überleben bei Zellen, die TrkA exprimieren, aber nicht bei Zellen, die keine Neurotrophinrezeptoren exprimieren. Außerdem synergisieren diese Agentien mit suboptimalen NGF-Konzentrationen (10 pM). NGF mit 10 pM sorgt für 32 ± 6% Überleben im Vergleich zu 1 nM NGF, das bei TrkA-Zellen auf 100% Überleben normiert ist. NGF in 10 pM plus die angegebenen Ausführungsformen verstärkt das Überleben der Zellen signifikant.
Beispiele für einige bevorzugte Ausführungsformen, die die NT-3-artige neurotrophe Aktivität nachahmen (Tabelle 8), sind Agentien, die P27 und P23 genannt werden. Diese Agentien, die bei 10 μM getestet wurden, sorgen für ein signifikantes Überleben bei Zellen, die TrkC exprimieren, aber nicht bei Zellen, die keine Neurotrophinrezeptoren exprimieren. Außerdem synergisieren diese Agentien mit suboptimalen NT-3-Konzentrationen (10 pM). NT-3 mit 10 pM sorgt für 29 ± 1% Überleben im Vergleich zu 1 nM NT-3, das bei TrkC-Zellen auf 100% Überleben normiert ist. NT-3 in 10 pM plus die angegebenen Ausführungsformen verstärkt das Überleben der Zellen signifikant. Man beachte, dass P23 das Überleben von Zellen, die TrkA und TrkC exprimieren, verstärkt, und somit verhält es sich wie NT-3, das ein Ligand für beide Rezeptoren ist.
Beispiele für einige bevorzugte Ausführungsformen, die die NGF-neurotrophe Aktivität antagonisieren (Tabelle 9), sind Agentien, die P42 und P43 genannt werden. Während diese Ausführungsformen allein das Überleben der Zellen nicht beeinflussen (Tabelle 9, Reihen 4 und 5), reduzieren sie das Überleben, für das NGF sorgt (Tabelle 9, Reihen 6-9). NGF in 1 nM (Tabelle 9, Reihe 2) sorgt für 100% Überleben, und diese Wirkung wird durch P42 und P43 auf 68% bzw. 55% Überleben reduziert. Daher sind diese Ausführungsformen antagonistisch in Bezug auf NGF-neurotrophe Aktivität.
Diskussion
Ein proteolysestabiler β-Turn-peptidomimetischer kleinmolekularer Agonist des TrkA-Neurotrophinrezeptors. Wir zeigten, dass D3 TrkA bindet, mit der Bindung des TrkA-agonistischen mAb 5C3 konkurriert, den trophischen Schutz von TrkA-exprimierenden Zelllinien und neuronalen Primärkulturen selektiv potenziert und die Differenzierung von primären neuronalen Kulturen induziert. Diese Ergebnisse zeigen an, dass ein kleines β-Turn-Peptidomimetikum einen Tyrosin-Kinase-Neurotrophinrezeptor, der normalerweise eine relativ großen Proteinliganden bindet, aktivieren kann.
Neuere Fortschritte in der Ligandennachahmung haben aus der Durchmusterung von großen Phagen- oder Peptidbibliotheken, Naturprodukten oder chemischen Bibliotheken resultiert. Die meisten der beschriebenen Liganden sind jedoch Antagonisten oder erfordern in anderer Weise die Dimerisierung von relativ großen Peptiden, haben eine zweizählige Symmetrieachse und ähneln damit einem Dimer oder sind in physiologischen Puffern schlecht löslich. Dagegen ist D3 ein kleines unsymmetrisches proteolysestabiles, in hohem Maße wasserlösliches Peptidomimetikum, das die extrazelluläre Domäne von TrkA bindet.
Bindungs- und Ligandenkonkurrenzstudien beweisen eine selektive Wechselwirkung von D3 mit der extrazellulären Domäne von TrkA und nicht mit der katalytischen Domäne. Damit bedeuten die Wasserlöslichkeit und extrazelluläre Zielsteuerung von D3, dass keine toxischen organischen Lösungsmittel erforderlich sind, um die Zellmembran zu durchdringen.
Welche Rolle spielen pM-Konzentrationen von NGF?
In Anbetracht der geringen Konzentrationen, die bei der Synergie mit D3 verwendet werden, ist es unwahrscheinlich, dass die Wirkung von NGF durch Andocken an den niedrigaffinen Rezeptor p75 vermittelt wurde. Es wird postuliert, dass NGF durch Erhöhung der TrkA·TrkA-Wechselwirkungen wirkt, während D3 die Homodimere stabilisiert oder die Trennungsgeschwindigkeit von Rezeptorhomodimeren durch Induzieren von Konformationsänderungen reduziert.
In der vorliegenden Erfindung wurden die gezeigten biologischen Daten mit niedrigen μM-Konzentrationen erhalten, welche optimal sind. Wie man aufgrund der für TrkA·D3-Wechselwirkungen geschätzten Affinität erwartet, sorgen niedrigere D3-Konzentrationen für eine geringere Effizienz. Es ist bemerken^swert, dass die NGF·TrkA-Affinität etwa 10^–11 M beträgt, die optimale Aktivität jedoch 2 nM NGF-Konzentrationen erfordert. Somit ist D3 bei Konzentrationen optimal, die in der Nähe seines K_d liegen, während NGF bei Konzentrationen optimal ist, die 100fach über seinem K_d liegen. Dieser Unterschied wird so interpretiert, dass D3 in Lösung stabiler ist, und diese Vorstellung wird durch die Proteolysebeständigkeit von D3 gestützt.
Ligandbindungsstellen
D3 blockiert kompetitiv die Bindung des mAb 5C3, blockiert aber nicht NGF. Außerdem wurde die optimale agonistische Aktivität des mAb 5C3 durch D3 in dosisabhängiger Weise gehemmt, während die agonistische Wirkung von NGF verstärkt wurde. Es ist unwahrscheinlich, dass D3 aufgrund von Affinitätsunterschieden NGF nicht blockiert, da NGF·TrkA-ECD- und 5C3·TrkA-ECD-Wechselwirkungen beide im nM-Bereich liegen.
Zwei Faktoren könnten für dieses Ergebnis verantwortlich sein. Erstens docken sowohl mAb 5C3 als auch D3 an ein einzelnes und kontinuierliches Epitop innerhalb der IgG-C2-Domäne von TrkA, während NGF ein diskontinuierliches Epitop innerhalb der IgG-C1- und IgG-C2-Domänen von TrkA (Perez et al., 1995) und anderer Domänen bindet. Dies würde die Blockierung von mAb 5C3 durch D3 erleichtern, während NGF über seine zweite Andockstelle binden könnte. Zweitens binden mAb 5C3 und NGF an Stellen, die partiell überlappen, aber nicht. identisch sind (LeSauteur et al., 1996). Somit lassen die Daten vermuten, dass D3 TrkA an einem Epitop bindet, das mit dem agonistischen mAb-5C3-"Hot-Spot" der IgG-C2-Domäne von TrkA in der Nähe der NGF-Andockstelle überlappt. Diese Beobachtungen können dafür verantwortlich sein, dass D3 mit NGF synergisiert und mAb 5C3 blockiert. Die Andockstelle wird "Hot Spot" genannt, weil sie eine funktionelle Stelle definiert, wobei Liganden, die an die Stelle binden, eine Funktion auslösen können. Diese Funktion kann (teilweise) agonistisch oder (teilweise) antagonistisch sein.
Die Tatsache, dass D3 bioaktiv ist und aus einem relativ kleinen Pool von Verbindungen auf β-Turn-Basis ausgewählt wurde, hat weitreichende Implikationen für viele Forschungsinitiativen, bei denen Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind. Insbesondere können diese Vorstellungen auf alle Vertreter der Neurotrophinfamilie von Liganden und ihre Rezeptoren angewendet werden, da sie alle in vergleichbarer Weise wie TrkA·NGF funktionieren.
Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein kleines peptidomimetisches Molekül umfassen, das TrkA bindet und aktiviert. In der vorliegenden Erfindung zeigt sich, dass ein Hybrid aus einem Peptid und einem kleinen organischen Molekül, das so gestaltet ist, dass es wichtige Aminosäurereste in einer Turn-Konformation innerhalb eines kleinen Gerüsts hält, ein Mittel bietet, um einen Peptid-Lead in ein aktives organisches kleines Molekül umzuwandeln. Daher stellt D3 die Validierung des Peptidomimesekonzepts für die Trk-Familie von Tyrosin-Kinase-Rezeptoren dar. Dieser kleinmolekulare peptidomimetische Ligand von TrkA, der neurotrophe Aktivität aufweist, kann verwendet werden, um neurodegenerative Störungen, Schmer zen, Neoplasien und andere Pathologien (Übersicht bei Saragovi und Burgess, 1999), bei denen Trk-Rezeptoren eine Rolle spielen, zu behandeln.
Tabelle 1. D3 und D3-Biotin binden TrkA
Die Bindung von Biotin-D3 an B104-Zellen (p75+TrkA–) oder 4-3.6-Zellen (p75+TrkA+) wurde durch FACScan-Analyse quantifiziert. Liganden sind Kontroll-Biotin (ein inaktives biotinyliertes Peptid) (Reihe 2), D3-Biotin (Reihe 3) oder D3-Biotin mit einem zehnfachen molaren Überschuss an D3 (Reihe 4). Alle Liganden wurden mit Avidin-FITC als Fluoreszenzmarker verfolgt. Bei den gezeigten Daten handelt es sich um die mittlere Kanalfluoreszenz (MCF) von glockenförmigen Histogrammen, 5000 erfasste Ereignisse. MCF-Daten ± Standardfehler des Mittelwerts sind aus 3 unabhängigen Experimenten gemittelt.
Tabelle 2 D3 blockiert spezifisch die Bindung von mAb 5C3 an Zelloberflächen-TrkA
4-3.6-Zellen wurden durch FACScan in Bezug auf die Bindung von Anti-TrkA-mAb 5C3 oder Anti-p75-mAb MC192 analysiert. Zellen, die mit oder ohne 40 μM D3 Kontroll-Primär-Maus-IgG ausgesetzt wurden, liefern eine identische Hintergrundfärbung. Für jeden Zustand wurden 5000 Zellen erfasst. Prozentwerte der maximalen Bindung wurden aus dem MCF von glockenförmigen Histogrammen berechnet, und zwar unter Verwendung der Formel: (TEST_MCF – Hintergrund_MCF) 100/(MAXIMAL_MCF – Hintergrund_MCF). MCF ± Standardfehler des Mittelwerts sind aus 3 unabhängigen Experimenten gemittelt.
Tabelle 3. D3 hemmt 5C3·TrkA-Wechselwirkungen in vitro
Die Bindung des mAb 5C3 (bei konstant 2 nM) an gereinigtes TrkA-ECD, das auf ELISA-Platten immobilisiert war, wurde in Abwesenheit oder Anwesenheit von Kompetitoren gemessen. Der Hintergrund (< 2%) war die optische Dichte von Näpfen mit allen Reaktanten außer immobilisiertem TrkA-ECD. Die Daten sind aus 3 Experimenten gemittelt, und bei jedem Experiment ist n = 4.
Tabelle 4. D3 schützt TrkA-exprimierende primäre Neuronen vor Apoptose und potenziert NGF
NGF-abhängige primäre neuronale Kulturen aus embryonalen Ratten-DRGs wurden insgesamt 8 Tage lang mit den angegebenen Liganden behandelt. Das Überleben der Zellen wurde durch MTT-Assays gemessen. Der Schutz wurde relativ zum optimalen NGF (1 nM, 100% Schutz) unter Subtraktion der OD von unbehandelten Zellen berechnet. Gezeigt ist die OD aus einem Experiment, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts, n = 4. Der prozentuale Schutz wurde aus 3 Experimenten gemittelt.
Tabelle 5 D3 potenziert NGF beim Schützen von TrkA-exprimierenden Zelllinien vor Apoptose durch Bindung an die IgC2-Domäne des Rezeptors
4-3.6-Zellen oder HEK293-Zellen, die TrkB/TrkA-IgG-C2-chimärischen Rezeptor exprimieren, wurden insgesamt 72 Stunden lang mit den angegebenen Liganden behandelt. Das Überleben wurde durch MTT-Assays gemessen. Der prozentuale Schutz wurde wie in Tabelle 4 berechnet. Gezeigt ist die OD aus einem Experiment, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts, n = 4. Der prozentuale Schutz wurde aus 6 (4-3.6-Zellen) bzw. 3 (293-IgG-C2-Chimäre) unabhängigen Experimenten gemittelt.
Tabelle 6 D3 induziert die ChAT-Synthese
Septale neuronale Kulturen wurden insgesamt 8 Tage lang so, wie es angegeben ist, behandelt. Die ChAT-Aktivität (pmol Ach/min/Napf ± Standardfehler des Mittelwerts) wurde am 8. Tag gemessen. Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Die Daten wurden aus 3 unabhängigen Experimenten gemittelt, und in jedem Experiment war n = 4.
Tabelle 7. TrkA-agonistische Aktivität von Beispielen für bevorzugte Ausführungsformen
NIH3T3-Fibroblasten, die mit TrkA- oder TrkC-Rezeptoren transfiziert sind und diese exprimieren, oder untransfizierte Wildtypkontrollen (NIH-wt) wurden insgesamt 72 Stunden lang mit den angegebenen Liganden behandelt. TrkA-exprimierende Zellen reagieren optimal auf NGF. TrkC-exprimierende Zellen reagieren optimal auf NT-3. Tests wurden mit Agentien allein oder in Gegenwart von suboptimalen Konzentrationen von NGF (10 pM) durchgeführt. Das Überleben wurde anhand von MTT-Assays gemessen. Der prozentuale Schutz wurde wie in Tabelle 4 berechnet. Gezeigt ist die optische Dichte aus einem Experiment, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts, n = 4. Jedes Experiment wurde dreimal oder mehr wiederholt.
Tabelle 8. TrkC-agonistische Aktivität von Beispielen für bevorzugte Ausführungsformen
NIH3T3-Fibroblasten, die mit TrkA- oder TrkC-Rezeptoren transfiziert sind und diese exprimieren, oder untransfizierte Wildtypkontrollen (NIH-wt) wurden insgesamt 72 Stunden lang mit den angegebenen Liganden behandelt. TrkA-exprimierende Zellen reagieren optimal auf NGF und in geringerem Maße auf NT-3. TrkC-exprimierende Zellen reagieren optimal auf NT-3. Tests wurden mit Agentien allein oder in Gegenwart von suboptimalen Konzentrationen von NT-3 (10 pM) durchgeführt. Das Überleben wurde anhand von MTT-Assays gemessen. Der prozentuale Schutz wurde wie in Tabelle 4 berechnet. Gezeigt ist die optische Dichte aus einem Experiment, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts, n = 4. Jedes Experiment wurde dreimal oder mehr wiederholt.
Tabelle 9 TrkA-antagonistische Aktivität von Beispielen für bevorzugte Ausführungsformen
NIH3T3-Fibroblasten, die mit TrkA transfiziert sind und dieses exprimieren, wurden insgesamt 72 Stunden lang mit den angegebenen Liganden behandelt. TrkA-exprimierende Zellen reagieren optimal auf 1 nM NGF und suboptimal auf 10 nM NGF. Das Überleben wurde anhand von MTT-Assays gemessen. Der prozentuale Schutz wurde wie in Tabelle 4 berechnet. Gezeigt ist die OD aus einem Experiment, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts, n = 4. Jedes Experiment wurde dreimal oder mehr wiederholt. nd: nicht durchgeführt.
Weitere Betrachtungen
Die molekulare Natur von NT-3/TrkC-Wechselwirkungen ist aus den folgenden Gründen wichtig. Viele Protein-Protein-Wechselwirkungen finden über einen Kontakt an wenigen Schlüsselbereichen, "Hot Spots", und nicht durch ausgedehnte Wechselwirkungen über die gesamte Proteinoberfläche statt. Diese Schlüsselbereiche beinhalten im Allgemeinen 10-30 Kontaktseitenketten auf diskontinuierlichen Teilen jeder Primärsequenz. Es ist jedoch nur eine relativ kleine Fraktion dieser Seitenketten für die feste Bindung an den Grenzflächen erforderlich. Kleine Moleküle, die mit Hot Spots wechselwirken, können die normalen Protein-Protein-Wechselwirkungen stören, wodurch das Konzept der Hormonnachahmung tragfähig wird.
Frühere Ergebnisse beweisen, dass die Turn-Bereiche des Neurotrophins NGF Hot-Spots für die NGF/TrkA-Wechselwirkung sind (LeSauteur et al., 1995). NGF ist ein 22-kDa-Protein, das als Dimer vorliegt und funktioniert. Es ist zwischen den Arten hochgradig konserviert. Reifes NT-3 hat 50 identische Aminosäuren mit NGF gemeinsam, am meisten fokussiert in Bereichen, die die gemeinsame Tertiärstruktur fördern (z.B. sind alle sechs Cys-Reste des Cysteinknotens konserviert). Der Dimergrenzflächenbereich besteht aus β-Strängen und behält die Konformation und Anordnung von strukturellen Motiven bei; diese hydrophoben Kernreste sind unter allen Neurotrophinen hochgradig konserviert. Umgekehrt sind die Turn-Bereiche hochgradig variabel und scheinen die Rezeptorbindungsspezifität zu bestimmen.
Die starken strukturellen Ähnlichkeiten zwischen NGF und NT-3 (im BDNF-Heterodimer) weisen darauf hin, dass die in 4 hervorgehobenen Turn-Bereiche von NT-3 beim Andocken von NT-3 an TrkC wichtig sind. Außerdem können Nachahmer der Turn-Bereiche von NT-3 auch an TrkA und p75 binden (wie NT-3).
Die Daten aus Studien an chimärischen Proteinen sind wie folgt. Eine NT-3-Chimäre, die die NGF-Reste 1-66 und 115-122 (Nummerierung gemäß NGF) exprimiert, weist einen Zuwachs der NGF-artigen Funktion auf, wobei die NT-3-Aktivität voll erhalten bleibt. Diese Ergebnisse implizieren, dass die Sequenzen, die NT-3-artige Eigenschaften verleihen, innerhalb des Bereichs enthalten sind, der den NGF-Resten 67-114 entspricht. Ein andere untersuchte NT-3-Chimäre enthielt die NGF-Sequenzen am N-Terminus und am β-Loop-3-Bereich (ca. Reste 91-98). Diese Rekombinante hatte eine verstärkte NGF-Funktion und reduzierte NT-3-Aktivität relativ zu Wildtyp-NT-3. Diese Daten implizieren, dass ein Hauptbeitrag zur NT-3-Bindung und -Aktivität dem β-Loop 3 zuzuschreiben ist. Dies steht mit den Studien der ersten Chimäre im Einklang, da sich der β-Loop 3 innerhalb des Bereichs befindet, der den Resten 67-114 entspricht und von dem sich zeigte, dass er wichtige Bereiche für die Bindung enthält. In einer weiteren Studie von NT-3/NGF-chimärischen Proteinen zeigte sich, dass der β-Loop 3 ein kritischer Bereich für die Bestimmung der Spezifität war und dass proximale Arg- und Tyr-Reste die Bindung verstärken können.
Mutageneseexperimente zeigen verstreute Reste von NT-3, die zur Bindung beitragen. Somit wird nach der Substitution von sechs Resten von NT-3 durch die entsprechenden Reste in NGF (S73D, F86Y, K88R, F101W, A1075 und V111A) ein gewisser Verlust der NT-3/TrkC-Affinität und Aktivitätsverlust beobachtet. Diese Aminosäuren sind in der Primärsequenz nicht fortlaufend, aber sie sind proximal zum β-Loop 3 im gefalteten dimeren Neurotrophin. Neben dem β-Loop 3 von NT-3 gibt es ein Arginin, das zwischen NGF und NT-3 konserviert ist, aber in jedem Neurotrophin eine andere Rolle zu spielen scheint. Ein signifikanter Verlust der NT-3-Bioaktivität wurde in einer NT-3-R103A-Mutante beobachtet; in einer NGF-R103A-Mutante wurde jedoch kein Verlust von NGF-Bioaktivität beobachtet. Dies weist auf Unterschiede in der Art und Weise hin, wie diese Neurotrophine an ihre Rezeptoren binden. Außerdem befindet sich neben R103 ein Phenylalanin (F104) in NGF und ein Tryptophan (W104) in NT-3. Diese hydrophoben Reste sind lösungsmittelexponiert, und ihre Substitution führt auch zu einer reduzierten Bioaktivität, was eine Rolle entweder in der Bindung oder in der Stabilisierung einer aktiven Konformation vermuten lässt.
Anscheinend spielen die N-Termini der Neurotrophine möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Bindung an ihre Rezeptoren. Dieser Bereich ist ein schwierigerer Angriffspunkt für die Nachahmung, da der N-Terminus von NT-3 (und der von NGF) in Lösung und im festen Zustand "unstrukturiert" ist. Eine Modellbildung weist darauf hin, dass der N-Terminus aus zwei Subdomänen besteht, die die Reste 1-8 und die Reste 9-11 umfassen. Die Reste 1-8 sind flexibel, aber 9-11 sind starr und halten eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen E(11) und R(118) aufrecht. Folglich werden die Reste 1-8 durch eine lange Faltung in der Nähe von -Loop 2/-Loop 3 lokalisiert.
NGF/p75- und NT-3/p75-Wechselwirkungen werden wenigstens teilweise durch den β-Loop 1 des Neurotrophins vermittelt, das positive geladene Aminosäuren aufweist. Sie können auch die Aminosäuren R114 und K115 beinhalten. Insgesamt sind diese Reste nicht fortlaufend mit der Primärsequenz des -Loop 1, sondern sind in der 3D-Struktur nahe bei demselben gepackt.
Auf der Basis der obigen Daten ist es zweckmäßig, spezifisch einen oder mehrere der Reste einzubauen, die man in Neurotrophinen auf den Positionen 1-11, 29-34, 42-48 und 91-98 findet. Diese sind primäre Angriffspunkte für die Entdeckung von Leads.
Tabelle 10 gibt Sequenzausrichtungen an.
Tabelle 10. Ausrichtung von Aminosäuresequenzen von reifen Neurotrophinen in Bereichen, für die vorhergesagt wird, dass sie Rezeptorbindung und -spezifität vermitteln
Abkürzungen

BDNF,

Brain Derived Neurotrophic Factor

BOC,

tert-Butoxycarbonyl

ChAT,

Cholin-Acetyltransferase

DMF,

Dimethylformamid

DRG,

Spinalganglien

ELISA,

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FACScan,

fluoreszenzaktivierter Zellscanner

FITC,

Fluoresceinisothiocyanat

FMOC,

Fluorenyloxycarbonyl

MCF,

mittlere Kanalfluoreszenz

MTT,

3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

NGF,

Nervenwachstumsfaktor

NT-3,

Neurotrophin-3

RIA,

Radioimmunassay

TFA,

Trifluoressigsäure

Trt,

Trityl

Literatur

Beglova, N, LeSauteur, L, Saragovi, H, and Gehring, KB (1998) Solution structure and internal motion of a bioactive peptide derived from Nerve Growth Factor. J. Biol Chem. 273:23652-23658.
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LeSauteur, L, Maliartchouk, S, Jeune, HL, Quirion, R, and Saragovi, HU (1996) Potent Human p140-TrkA Agonists Derived from an Anti-receptor Antibody. J. Neurosci. 16:1308-16.
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Claims

Neurotrophin-Rezeptor-agonistische oder -antagonistische pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine annehmbare Neurotrophin-Rezeptor-agonistische Menge einer Neurotrophin-nachahmenden β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindung der Formel (I):
oder eines Dimers davon, wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ aus Wasserstoff, Alkyl- oder Aryl-Seitenkettensubstituenten, die man in einer natürlichen oder unnatürlichen Aminosäure findet, ausgewählt sind; oder R¹ und R² oder R³ und R⁴ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl- oder Cyclohexylgruppe bilden; Y Wasserstoff oder ein oder zwei Substituenten ist, die aus Nitro, Amino, Halogen, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Naphthyl ausgewählt sind, wobei das Alkyl, Phenyl oder Naphthyl unsubstituiert oder mit Nitro oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist, oder Y eine biotinhaltige derivatisierte Gruppe ist; X = O, N, S, P, Se, C, NH oder Alkylen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; n = 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 ist; und LINKER eine Verknüpfungsgruppe ist, die die Bildung eines Dimers der Verbindung durch Reaktion mit einer homodifunktionellen Verbindung bewirkt, wobei die Verknüpfungsgruppe eine Gruppe trägt, die aus NH₂, OH, SH, COOH, CH₃CO und CHO ausgewählt ist; in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung einen makrocyclischen Ring mit 13 bis 17 Ringatomen aufweist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindung eine oder mehrere Seitenketten an dem makrocyclischen Ring aufweist, wobei die eine oder die mehreren Seitenketten von Gerüstringatomen abstehen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei die eine oder die mehreren Seitenketten Resten entsprechen, die man innerhalb von β-Turns eines Neurotrophins findet.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei dem Neurotrophin um Nervenwachstumsfaktor (NGF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4/5 (NT4/5) oder BDNF (brain derived neurotrophic factor) handelt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei das Neurotrophin an einen Rezeptor bindet.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei es sich bei dem Neurotrophin-Rezeptor um TrkA, TrkB, TrkC oder p75 handelt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei R¹ und R³ aus Seitenketten von Lysin, Glutaminsäure, Tyrosin, Isoleucin, Asparagin und Threonin ausgewählt sind; und R², R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoff sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei X = O, S oder NH ist und R¹, R³, R⁵ und R⁶ Wasserstoff sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus:
Verwendung einer β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindung der Formel (I), wie sie in einem der Ansprüche 1, 8, 9 und 10 definiert ist, zur Bewertung von Strukturanforderungen von Neurotrophin-nachahmenden β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindungen in vitro.
Verwendung einer Neurotrophin-nachahmenden β-Turn-peptidomimetischen cyclischen Verbindung der Formel (I), wie sie in einem der Ansprüche 1, 8, 9 und 10 definiert ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Neurotrophin-Rezeptor-vermittelten Störung.
Verwendung gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei der X enthaltende makrocyclische Ring 13 bis 17 Ringatome aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei die Verbindung die Formel
hat.
Verwendung gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei die Verbindung die Formel
D3-Biotin, hat.
Verfahren zum Suchen nach und/oder Bewerten von notwendigen Strukturanforderungen von Agonisten und Antagonisten für Neurotrophin-Rezeptoren, das sich eine cyclische Verbindung der Formel (I), wie sie in den Ansprüchen 1 oder 8 definiert ist, in Konkurrenz zu einer Testverbindung, die untersucht wird, zu Nutze macht.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I), wie sie in den Ansprüchen 1 oder 8 definiert ist, zum Identifizieren von funktionell wichtigen Rezeptordomänen in Bindungsassays.