NO323597B1 - Substituerte benzimidazoler, fremgangsmate for fremstilling av samme, farmasoytisk sammensetning innbefattende samme, anvendelse av samme for fremstilling av medikament og fremgangsmate for fremstilling av farmasoytisk middel. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører nye substituerte benzimidazoler, fremgangsmåte for fremstilling

av samme, farmasøytisk sammensetning innbefattende samme, anvendelse av samme for fremstilling av medikament og fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytisk middel.

I patentsøknad WO 94/12478 beskrives blant annet benzimidazolderivater som inhibe-

rer blodplateaggregering.

NFkB er en heterodimer transkripsjonsfaktor som kan aktivere et flertall gener som

blant annet koder for proinflammatoriske cytokiner som IL-1, IL2, TNFa eller IL-6. NFkB foreligger kompleksert i cytosol fira celler med sin naturlig forekommende inhibi-

tor IkB. Stimulering av celler, for eksempel ved cytokiner, fører til fosforylering og på-følgende proteolytisk nedbygging av IkB. Denne proteolytiske nedbygging fører til ak-tivering av NFkB som deretter vandrer inn i kjernen av cellen og der aktiverer et flertall proinflammatoriske gener.

I sykdommer som reumatoid artritt (ved inflammasjonen), osteoartritt, astma, hjerteinfarkt, Alzheimer' s sykdom eller aterosklerose er NFkB aktivert i større grad enn nor-

malt. Hemmingen av NFkB er også av nytte i kreftterapien da den der anvendes for for-sterkning av cytostatikaterapien. Det kunne vises at legemidler som clukokortikoider, salicylater eller gullsalter, som anvendes innenfor reumaterapien inngriper inhiberende på forskjellige steder i den NFkB-aktiverende signalkjede eller interfererer direkte med transkripsjonen av genene.

Det første skritt i den nevnte signalkaskade er nedbyggingen av IkB. Denne fosforyle-

ring reguleres ved den spesifikke iKB-kinase. Hittil er det ikke kjent noen inhibitorer som spesifikt inhiberer IKB-kinase.

I bestrebelsene på å tilveiebringe virksomme forbindelser for behandling av reumatoid artritt (ved inflammasjonen), osteoartritt, astma, hjerteinfarkt, Alzheimer's sykdom, kreftsykdommer (potensiering av cytotoksikaterapier) eller aterosklerose, ble det nå

funnet at benzimidazolene ifølge oppfinnelsen er sterke og meget spesifikke inhibitorer for IicB-kinase.

Oppfinnelsen vedrører således forbindelsen med formel I

og/eller en stereoisomer form av forbindelsen med formel I og/eller et fysiologisk akseptabelt salt av forbindelsen med formel I, hvor R<6> er en 4-pyridylgruppe, en pyrimi-dinring som i 2-stilling er substituert med en gruppe N(R] l)2, der R<11> er valgt fra H eller Ci.6alkyl; R<1>, R<2> og R<5> er H og én av R<3> eller R<4> er gruppen -D-NH-CHCR^-Z, der Z er valgt fra -COOH, fenyl-Ci.6alkyl eller -CONH2, eller-GOR'<0>, der R<10> er valgt fra OCi^alkyl eller NfR1 x) i, hvor R<11> er som definert ovenfor, eller Z kan være 2-okso-l,3,4-oksadiazol;

Der-C(0)-;

R<9> er valgt fra Ci-galkylfenyl, hvor fenyl kan eventuelt være substituert med C1-4 alkyl, C]-4 alkoksy, halogen, nitro, amino, trifluormetyl, hydroksyl, cyano, hydroksykarbonyl, fenyl og benzyloksy, Ci-salkyl-heteroaryl der heteroaryl er tienyl, pyridinyl eller kino-lyl, eller R<9> er Ci^alkyl substituert med C3-6cykloalkyl, fenyl(Ci.6alkyl)amino, Q. 6alkyltio eller fenyltio, der fenylgruppen er substituert med Ci-^alkyl, eller R<9> er en 1.3.4- oksadiazol-2-yl som i 5-stilling eventuelt er substituert med amino, fenylsulfony-lamino eller 3-metylurea, eller Ci^alkylen substituert substituert med en amingruppe N(A)(B), der A er fenyl eventuelt substituert med et halogenatom og B er valgt fra Ci-ealkyl, fenyl, pyrimidinyl, pyridyl eller tiazolyl.

Under begrepet "halogen" forstås fluor, klor, brom eller jod.

I monosubstituerte fenylrester kan substituenten befinne seg i 2-posisjonen, 3-posisjonen eller 4-posisjonen. To ganger substituert fenyl kan være substituert i 2,3-posisjonen, 2,4-posisjonen, 2,5-posisjonen, 2,6-posisjonen, 3,4-posisjonen eller 3,5-posisjonen. I tre ganger substituerte fenylrester kan substituentene befinne seg i 2,3,4-posisjonen, 2,3,5-posisjonen, 2,4,5-posisjonen, 2,4,6-posisjonen, 2,3,6-posisjonen eller 3.4.5-posisjonen.

Forklaringene til arylrestene gjelder tilsvarende for toverdige arylenrester, f.eks. for fenylenrester, som kan foreligge f.eks. som 1,4-fenylen eller som 1,3-fenylen.

Fenylen-(Ci-C6)-alkyl er spesielt fenylenmetyl (-C6H4-CH2-) og fenylenetyl, (Ci-Cg)-alkylen-fenyl spesielt metylenfenyl (-CH2-QH4-). Fenylen-(C2-C6)-alkenyI er spesielt fenylenetenyl og fenylenpropenyl.

Som egnet beskyttelsesgruppe anvendes for dette foretrukket de innen peptidkjemien vanlige N-beskyttelsesgrupper, f.eks. beskyttelsesgrupper av uretantypen, benzyloksy-karbonyl (Z), t-butyloksykarbonyl (Boe), 9-fluorenyloksykarbonyl (Fmoc), allyloksykarbonyl (Aloe) eller av syreamid-type, spesielt formyl, acetyl eller trifluoracetyl så vel som av alkyltype som f.eks. benzyl. For det tilfellet med en inudazolrest i R<9> tjener f.eks. det for sulfonamiddannelsen anvendte sulfonsyrederivat med formel IV som beskyttelsesgruppe for imidazolnitrogenet, som spesielt lar seg avspalte igjen i nærvær av baser som natronlut. Utgangsstoffene for de kjemiske omsetninger er kjent eller lar seg lett fremstille etter metoder kjent fra litteraturen.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen med formel I ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at

a) omsette en forbindelse med formel IV,

hvori Pg er en passende beskyttelende gruppe (f.eks. metylester), en amidgruppe eller en hydroksylgruppe og Z, R<8>=H og R<9> er definert som i formel I, med et sy-reklorid eller en aktivert ester av forbindlesen med formel III,

hvor Dl er -COOH eller sulfonylhalogen og Rs og R<6> er som definert i formel I, under nærvær av en base, hvis hensiktsmessig, et dehydreringsmiddel i løsning,

og, etter fjerning av, den beskyttende gruppen omdanning til en forbindelse med formel I, eller

b) omsette en forbindelse med formel IVa,

hvori R<8>=H og R<9> er som definert i formel I og E er en N-aminobeskyttende gruppe, med dens karboksylgruppe koblet via en intermediatkjede L til en poly-merharpiks med formelen PS, som resulterer i en forbindelse med formel V Som, etter selektiv fjerning av den beskyttende gruppen E, omsettes med en forbindelse med formel III, hvor R<5> og R<*> er som definert i formel I, under nærvær av en base, eller, hvis hensiktsmessig, et dehydreringsmiddel for å gi en forbindelse med formel VI og omdanne forbindelsen med formel VI etter fjerning av støttematerialet, til en forbindelse med formel I, eller c) omsette en forbindelse med formel V, etter selektiv fjerning av den beskyttende gruppen E, med en forbindelse med formel VII, hvor Di er -COOH eller sulfonylhalogen og RX er halogen og RY er et radikal -NO2 eller -NH-E og E er en beskyttende gruppe, for å gi en forbindelse med formel VIII og deretter omsettes forbindelsen med formel VIII med en forbindelse med formel LX hvor R<6> er som definert i forbindelse med formel I, for å gi en intermediat- forbindelse med formel Via

og deretter enten omdanne intermediatforbindelsen med formel Via til en forbindelse med formel I etter fjerning av støttematerialet eller redusere den f.eks. med tributylfosfin for å gi en forbindelse med formel VI og omdanne den til en forbindelse med formel I etter fjerning av støttematerialet, eller

d) omdanne en forbindelse med formel I til et fysiologisk akseptabelt salt.

I fremgangsmåtevariant a) forsynes syrefunksjonen av forbindelsene med formel IVa

med en beskyttelsesgruppe Pg, idet denne selektive karboksylsyrederivatisering skjer etter metoder som beskrevet i Houben-Weyl "Methoden der Org. Chemie", bind 15/1.1 fremgangsmåtevariant b) forsynes aminofunksjonen av utgangsforbindelsene med for-meler IVa med en beskyttelsesgruppe E, denne selektive aminogruppederivatisering skjer etter metoder som er beskrevet i Houben-Weyl "Methoden der Org. Chemie", bind 15/1.

Som egnet beskyttelsesgruppe Pg anvendes for dette de innen peptidkjemien vanlige karboksybeskyttelsesgrupper, f.eks. beskyttelsesgrupper av alkylestertype, som metyl-, etyl-, tert-butyl-, iso-propyl-, benzyl-, fluorenylmetyl-, allyl-, arylester-typen, som fenyl-, amid-typen, som amid- eller benzhydrylamin. Som egnet beskyttelsesgruppe E anvendes for dette de innen peptidkjemien vanlige N-beskyttelsesgrupper, f.eks. beskyttelsesgrupper av uretantype, som benzyloksykarbonyl(Z), t-butyloksykarbonyl (Boe), 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc) og allyloksykarbonyl (Aloe) eller av syre-amidtype, spesielt formyl, acetyl eller trifiuoracetyl av alkyltype som benzyl.

Særlig egnet for dette har også (trimetyl-silyl)etoksykarbonyl (Teoc)-gruppen vist seg (P. Kociénski, "Protecting Groups", Thieme Verlag, 1994).

Som utgangsproduktet for fremstilling av benzimidazolderivatene med formel III tjener foretrukket 2,3- og 3,4-diaminobenzosyrer og aryl- eller heteroarylaldehyder som omsettes i nærvær av nitfobenzen som løsningsmiddel ved 145°C. Videre fremstilles de nevnte syrer med metyl- eller etylimidater som omsetes i en Pinner-reaksjon fra de tilsvarende akrylnitriler eller heteroarylnitriler.

For kondensasjon av forbindelsene med formel IV med forbindelsene med formel III anvendes fordelaktig de for den fagkyndige i og for seg velkjente koblingsmetoder fra peptidkjemien (se f.eks. Houben-Weyl, "Methoden der Organischen Chemie", bind 15/1 og 15/2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Som kondensasjonsmiddel eller kob-lingsreagenser kommer forbindelser som karbonyldiimidazol, karbodiimider som di-cykloheksylkarbodiimid eller diisopropylkarbodiimid (DIC), O-((cyano(etoksykarbonyl)-metylen)amino)^

(TOTU) eller propanfosfonsyreanhydrid (PPA) på tale.

Kondensasjonen kan gjennomføres under standard betingelser. Ved kondensasjonen er det som regel nødvendig at de tilstedeværende, ikke-reagerende aminogrupper beskyttes ved hjelp av reversible beskyttelsesgrupper. Det samme gjelder for karboksylgrupper som ikke deltar i reaksjonen og som under kondensasjonen foretrukket foreligger som (Ci-C6)-alkylester, benzylester eller tert-butylester. En aminogruppebeskyttelse blir overflødig når aminogruppen ennå foreligger i form av fortrinn som nitrogrupper eller cyanogrupper og først etter kondensasjonen dannes ved hydrogenering. Etter kondensasjonen avspaltes de tilstedeværende beskyttelsesgrupper på egnet måte. For eksempel kan N02-grupper (guanidinobeskyttelse i aminosyre), benzyloksykarbonylgrupper og benzylgrupper dehydrogeneres til benzylestere. Beskyttelsesgruppene av tert-butyltype avspaltes surt mens 9-fluorenylmetyloksykarbonylresten fjernes ved hjelp av sekundære aminer.

Den i formelen V og VI med PS betegnede polymere bærer er en tverrbundet polysty-renharpiks med en som mellomkjede L betegnet linker. Denne linker bærer en egnet funksjonell gruppe, f.eks. amin kjent f.eks. som Ring-amidharpiks, eller en OH-gruppe, kjent f.eks. som Wang-harpiks eller Kaiser<*>s oksimharpiks). Alternativt kan det anvendes andre polymere bærere som glass, bomull eller cellulose med forskjellige mellom-kjeder L.

Den med L betegnede mellomkjede er kovalent bundet til den polymere bærer og tillater en reversibel, amidaktig eller esteraktig binding med forbindelsen med formel IVa, som under den videre omsetning ved den bundne forbindelse med formel IVa forblir stabil; under sterkt sure reaksjonsbetingelser, f.eks. blandinger med trifluoreddiksyre frigis imidlertid igjen gruppen som befinner seg ved linkeren.

Frigivelsen av den ønskede forbindelse med den generelle formel I fra linkeren kan skje på forskjellige steder i reaksjonsrekkefølgen.

A. Generell prosedyre for kobling av beskyttede aminokarboksylsyrer med formel IVa til den faste bærer etter prosedyre b): Syntesen ble gjennomført i reaktorer hver med 15 ml reaksjonsvolum. Hver av reakto-rene ble fyllt med 0,179 g Ring-amid-AM-harpiks (Fmoc-Rink-amid AM/Nova-Biochem; ladning 0,56 mmol/g; dvs. 0,1 mmol/reaktor). For avspalting av Fmoc-beskyttelsesgruppen fra harpiksen ble det i hver reaktor tildosert en 30% piperi-din/DMF-løsning og blandingen ble omrystet i 45 minutter (min.). Deretter ble blandingen filtrert og harpiksen vasket tre ganger med dimetylformamid (DMF).

For kobling av den beskyttede aminosyre ble det til hver av den således forberedte harpiks tildosert en 0,5 molar løsning av den tilsvarende Fmoc-aminosyre (0,3 mmol i DMF), løsning av HOBt (0,33 mmol i DMF) og en løsning av DIC (0,33 mmol i DMF) og blandingen ble omrystet i 16 timer (h) ved 35°C. Deretter ble harpiksen vasket flere ganger med DMF.

For overprøving av koblingen ble noen harpikskuler tatt ut og underkastet en KAISER-test; i alle tilfeller var testen negativ. Avspaltingen av Fmoc-beskyttelsegruppen skjedde som nevnt ovenfor med 30% piperidin/DMF-løsning.

For kobling av benzimidazolkarboksylsyrer ble det tildosert en 0,1 molar løsning av den tilsvarende 4- eller 5-substituerte syre (0,4 mmol i DMF), en 0,5 molar løsning av kob-lingsreagenset TOTU (0,44 mmol i DMF) og en 0,5 molar løsning av DIPEA (0,6 mmol i DMF) og blandingen ble omrystet i 16 timer ved 40°C. Deretter ble produktet vasket flere ganger med DMF. For reaksjonskontroll ble igjen noen harpikskuler tatt ut og underkastet en KAISER-test

For avspalting av de ønskede substanser fra den faste bærer ble harpiksen vasket flere ganger med diklormetan. Deretter ble avspaltningsløsningen (50% diklormetan og 50% av en blanding av 95% TF A, 2% H20,3% triisopropylsilan) tildosert og blandingen ble omrystet i 1 time ved romtemperatur. Blandingen ble filtrert og filtratet inndampet til tørrhet. Resten ble utfelt med dietyleter og filtrert.

De faste rester inneholdt de ønskede produkter for det meste i høy renhet og ble f.eks. fraksjonert ved hjelp av preparativ høytrykksvæskekromatografl HPLC på en revers fase (elueringsmidler: A: H2O/0,l% TF A, B: acetonitril/0,1% TF A). Frysetørking av de erholdte fraksjoner ga de ønskede produkter.

Fremstillingen av fysiologisk tålbare salter fra forbindelser med formel I som er i stand til saltdannelse, inklusive deres stereoisomere former, skjer på i og for seg kjent måte. Karboksylsyrene danner med basiske reagenser som hydroksider, karbonater, hydro-genkarbonater, alkoholater så vel som ammoniakk eller organiske baser, f.eks. trimetyl-eller trietylamin, etanolamin eller trietanolamin eller også basisk aminosyrer, som lysin, omitin eller arginin, stabile alkalimetall-, jordalkali- eller eventuelt substituerte ammo-niumsalter. I den utstrekning forbindelsene med formel I fremviser basiske grupper lar seg også fremstille stabile syreaddisjonssalter med sterke syrer. For dette kommer så vel uorganiske som også organiske syrer som saltsyre, bromhydrogensyre, svovel-, fosfor-, metansulfon-, benzensulfon-, p-toluensulfon-, 4-brombenzensulfon-, cykloheksylami-dosulfon-, trifluormetylsulfon-, eddik-, oksal-, vin-, rav- eller trifluoreddiksyre på tale.

Oppfinnelsen vedrører også legemidler, karakterisert ved et virksomt innhold av minst en forbindelse med formel I og/eller et fysiologisk tålbart salt av forbindelsen med formel I og/eller en eventuelt stereoisomer form av forbindelsen med formel I, sammen med et farmasøytisk egnet og fysiologisk tålbart bærerstoff, tilsetningsstoff og/eller andre virke- og hjelpestoffer.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av minst en forbindelse med formel I

for fremstilling av farmasøytiske midler for profylakse og behandling av forstyrrelser valgt blant astma, reumatoid artritt, osteo-artritt, Alzheimers sykdom, karcinome forstyrrelser, hjerteinfarkt, hjerteutilstrekkelighet, akutt koronar syndrom, ustabil angina pectoris, septisk sjokk, akutt og kronisk renalsvikt, slag eller aterosklerose.

På grunn av de farmakologiske egenskaper egner seg forbindelsene ifølge oppfinnelsen for profylakse og terapi av alle slike sykdommer, ved hvis forløp en forsterket aktivitet av IicB-kinase deltar. Dertil hører f.eks. astma, reumatoid artritt (ved inflammasjonen), osteoartritt, Alzheimer<*> sykdom, kreftsykdommer (potensiering av cytotoksikaterapier), hjerteinfarkt, hjerteinsuffisiens, akutt koronarsyndrom (ustabil Angina Pectoris), septisk sjokk, akutt og kronisk nyresvikt, slag og aterosklerose.

Legemidlene ifølge oppfinnelsen tilføres generelt oralt eller parenteralt. Den rektale, inhallative eller transdermale tilførsel er også mulig.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av et legemiddel karakterisert ved at minst en forbindelse med formel I bringes i en egnet tilførselsform med en farmasøytisk tålbar og fysiologisk tålbar bærer og eventuelt ytterligere egnede virke-, tilsetnings- eller hjelpestoffer.

Egnede faste eller galeniske tilberedningsformer er f.eks. granulater, pulvere, drageer,

tabletter, mikrokapsler, stikkpiller, siruper, eliksirer, suspensjoner, emulsjoner, dråper eller injiserbare løsninger så vel som preparater med protrahert virkestoffrigivelse, med hvis fremstilling vanlige hjelpemidler som bærerstoffer, desintegrasjons-, binde-, over-trekks-, svelle-, glide- eller smøremidler, smaksstoffer, søtningsmidler og løsningsfor-midlere finner anvendelse. Som hyppig anvendte hjelpestoffer skal det nevnes magnesi-

umkarbonat, titandioksid, laktose, mannit og andre sukkerarter, talkum, melkeeggehvi-

te, gelatin, stivelse, cellulose og dens derivater, dyre- og planteoljer som levertran, sol-sikke-, jordnøtt- eller sesamolje, polyetylenglykol og løsningsmidler som f.eks. sterilt vann og en- eller flerverdige alkoholer som glyserol.

Foretrukket fremstilles de farmasøytiske preparater i doseringsenheter og tilføres, idet

hver enhet som aktiv bestanddel inneholder en bestemt dose av forbindelsen med formel I ifølge oppfinnelsen. Ved faste doseringsformer som tabletter, kapsler, drageer eller stikkpiller kan denne dose utgjøre opptil omtrent 1 000 mg, foretrukket fra omtrent 50

mg til 300 mg og ved injeksjonsløsninger i ampulleform opp til omtrent 300 mg, foretrukket fra omtrent 10 mg til 100 mg.

For behandling av en voksen, omtrent 70 kg tung pasient er det alt etter virkningen av forbindelsen ifølge formel I indikert dagsdoser på fra omtrent 20 mg til 1 000 mg virke-stoff, foretrukket fra omtrent 100 mg til 500 mg. Alt etter forholdene kan imidlertid og-

så høyere eller lavere dagsdoser være passende. Tilførselen av dagsdosen kan skje så vel ved en gangs tilførsel i form av en enkelt doseringsenhet eller også flere mindre doseringsenheter så vel som også flere gangers tilsetning av oppdelte doser med bestemte intervaller.

Sluttprodukter bestemmes som regel ved hjelp av massespektroskopiske metoder

(FAB-, ESI-MS). Temperaturangivelser i grader Celcius, RT betyr romtemperatur (22-26°C). Anvendte forkortelser er enten forklart eller tilsvarer vanlige konvensjoner.

Eksempel etter fremgangsmåtevariant b) ifølge generell arbeidsforskrift HPLC (RP 18; UV 210 nm); gradient 0-15 min. B=5-70% (A »100% H2O/0,l% trifluoreddiksyre; B = 100% acetonitril/0,1% trifluoreddiksyre).

De i den følgende tabell nevnte eksempler er fremstilt analogt til fremgangsmåtevariant

b) ifølge generell arbeidsforskrift. Eksempel 91: (2-(pyrid-4-yl)-lH-benzoimidazol-4-karbonyl)-(L>leucin-metylester (1)

AmmoQium-3-nitro-flalamidsyre (la). 100 g (518 mmol) 3-nitroftalsyreanhydrid ble innført ved romtemperatur (RT) og under omrøring hurtig tilsatt med 170 ml konsentrert ammoniumhydroksidløsning. Blandingen ble deretter omrørt i 1 time (h) ved RT. Utfellingen ble frafUtrert og tørket i eksikkator.

Utbytte: 95,6 g (88%).

2-amino-3-nitro-benzosyre (lb). 22 g (105,2 mmol) ammonium-3-nitro-ftalamidsyre (la) ble under omrøring tilsatt 165 ml natriumhypoklorittløsning. Etter 5 minutter ble det tilsatt en løsning av 8,8 g natriumhydroksid i 22 ml vann og blandingen ble deretter omrørt i 1 time ved 70°C. Suspensjonen ble heilt ut i 500 ml vann. Den dannede klare løsning ble surgjort med konsentrert HC1. Utfellingen ble frafUtrert og tørket i eksikkator.

Utbytte: 9,68 g (51%).

2,3-diamino-benzosyre (lc). 14 g (76,9 mmol) 2-amino-3-nitro-benzosyre (lb) ble løst i 500 ml metanol, tilsatt Pd/C og hydrogenert med hydrogen. Etter 4 timer ble katalysatoren frafUtrert og blandingen inndampet. Det ble oppnådd et mørkebrunt faststoff.

Utbytte: 11,67 g (99%).

(2-pyridyl-4-yl)-lH-benzoimidazol-4-karboksylsyre (ld). 700 mg (4,6 mmol) 2,3-diamino-benzosyre (lc) og 0,47 ml (4,95 mmol) 4-pyridylaldehyd ble oppløst i 40 ml mtrobenzen og oppvarmet under omrøring i 2 timer ved 145°C. Deretter ble blandingen avkjølt og utfellingen frafUtrert. Utfellingen ble vasket med eddikester og tørket i eksikkator.

Utbytte: 800 mg (73%).

((2-pyridyl-4-yl)-lH-benzoimidazol-4-karbonyl)-(L)-leucin-metylester (1). 120 mg (0,5 mmol) ((2-pyridyl-4-yl)-lH-benzoimidazol-4-karboksylsyre (ld) og 84 mg (0,5 mmol) H-(L)-leucin-metylester ble løst i 5 ml DMF. Blandingen ble tilsatt 164 mg (0,5 mmol) TOTU (0-[(cyano(etoksykarbonyl)metyliden)amino-l, 1,3,3-tetrametyl]uroniumtetrafluor-borat) og 0,086 ml diisopropyletylamin og ble omrørt i 3 timer ved RT. Utfellingen ble frafiltrert og filtratet inndampet. Resten ble løst i eddikester, vasket med vann, den organiske fase ble tørket med vannfri natriumsulfat og inndampet.

Utbytte: 180 mg (98%).

(M+H)<+> = 367,1 (Cl<+>).

Eksempel 92 ((2-pyridyl-4-yl)-lH-benzimidazol-4-karbonyl)-(L)-valin-amid (2)

120 mg (0,5 mmol) ((2-pyridyl-4-yl)-lH-berizoimidazol-4-karboksylsyre (ld) og 76,4 mg (0,5 mmol) H-(L)-valin-amid ble oppløst i 5 ml DMF. 164 mg (0,5 mmol) TOTU (0-[(cyano(etoksykarbonyl)metyliden)amino-1,1,3,3-tetrametyl]uroniumtetrafluorborat) og 0,086 ml diisopropyletylamin tilsettes og blandingen omrøres i 3 timer ved RT. Utfellingen frafiltreres og filtratet inndampes. Resten løses i eddikester, vaskes med mettet natrtumkloridløsning, den organiske fase tørkes med vannfritt natriumsulfat og inndampes.

Utbytte: 168 mg (99%).

(M+H)<+>= 338,2 (Cl<*>).

Eksempel 93 ((2-pyridy]-4-yl)-lH-benzimidazol-4-karbonylHS)-histidin-metylester (3)

((2-pyridyl-4-yl)-1 H-benzimidazol-4-karbonyl)-(L)-histidin(Ttr)-metylester (3a). 120 mg (0,5 mmol) ((2-pyridyl-4-yl)-lH-benzimidazol-4-karboksylsyre (ld) og 242 mg (0,5 mmol) H-(L)-histidin(Trt)-metylester ble oppløst i 5 ml DMF. 164 mg (0,5 mmol) TOTU og 0,172 ml diisopropyletylamin tilsettes og blandingen omrøres i 3 timer ved RT. Den klare løsning ble inndampet. Resten ble oppløst i eddikester, vasket med vann, den organiske fase tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet.

Utbytte: 380 mg råprodukt.

(M+H)<+> = 6,33,3 (ES<*>).

Eksempel 94 ((2-pyridyl-4-yl)-lH-benzimidazol-4-karbonyl)-(L)-metionin-amid (4)

120 mg (0,5 mmol) ((2-pyridyl-4-yl)-lH-benzimidazol-4-karboksylsyre (ld) og 74,2 mg (0,5 mmol) H-(L)-metionin-amid ble oppløst i 5 ml DMF. 164 mg (0,5 mmol)

TOTU og 0,086 ml diisopropyletylamin tilsettes og blandingen omrøres i 3 timer ved RT. Den klare løsning ble inndampet. Resten ble løst i eddikester, vasket med mettet natriumkloridløsning, den organiske fase ble tørket med vannfri natriumsulfat og inndampet.

Utbytte: 149 mg (81%)

(M+H)<+> = 370,2 (ES<+>).

De i den følgende tabell 2 nevnte eksempler er gjennomført analogt til eksemplene 91 til 94 (dvs. fremgangsmåtevariant a).

Eksempel 156

De etterfølgende forbindelser ble fremstilt etter fremgangsmåtevariant a):

a) Fremstilling av 2-fluor-isonikotinsyre:

5,00 g (45 mmol) 2-fluor-4-metylpyridin og 1,00 g (17 mmol) KOH ble tilsatt 50 ml

pyridin og oppvarmet under tilbakeløp. Ved denne temperatur ble det porsjonsvis i løpet av 30 minutter tilsatt 20,00 g (127 mmol) kaliumpermanganat og det ble oppvarmet under tilbakeløp i ytterligere 1,5 time. Deretter ble blandingen avkjølt i isblandet vann-bad, tilsatt 100 ml vann og ved hjelp av konsentrert saltsyre bragt til pH 1. Etter tilsetning av 100 ml eddikester ble den uoppløselige rest frafUtrert og den vandige fase ennå ekstrahert to ganger hver gang med 100 ml eddikester. De forenede eddikesterfaser ble separert over magnesiumsulfat og inndampet under redusert trykk. Man erholder 2,70 g 2-fluor-isonikotinsyre.

Utbytte: 42%.

b) Fremstilling av (2-fluor-pyridin-4-yl)-metanol:

12,60 g (89 mmol) 2-fluor-isonikotinsyre ble plassert med 13,3 ml (95 mmol) trietylamin i 300 ml toluen og tilsatt 9,08 ml (95 mmol) klormaursyreetylester og omrørt i 1 time ved romtemperatur (20°-23°C). Deretter ble trietylammoniumkloridet frafiltrert og toluenfasen inndampet under redusert trykk. Resten ble opptatt i 200 ml absolutt THF og avkjølt til -78°C. Ved denne temperatur, ble en suspensjon av litiumaluminiumhydrid (3,55 g, 95 mmol) i THF tildryppet og blandingen ble omrørt i ytterligere 30 minutter. Deretter lot man reaksjonsblandingen komme opp på romtemperatur og heilte den ut på 11 isblandet vann. Det fulgte ekstraksjon med 4x300 ml eddikester, tørking av den forenede eddikesterfase over magnesiumsulfat og avdamping av løsningsmidlet ga råproduktet som etter rensing ved hjelp av middeltrykkromatografi (CHjC^MeOH som 9:1) ga 5,10 g (40 mmol) åv det ønskede produkt.

Utbytte: 45%.

c) Fremstilling av 2-fluor-pyridin-4-karbaldehyd

Til en løsning av 4,6 ml (54 mmol) oksalylklorid og 7,6 ml (106 mmol) dimetylsulfoksid (DMSO) i 45 ml diklormetan ble ved -78°C en løsning av 5 g (93 mmol) (2-fluor-pyridin-4-yl)-metanol i diklormetan tildryppet og blandingen ble etterrørt i 15 minutter. Deretter ble 24 ml (180 mmol) trietylamin tilsatt og reaksjonsløsningen oppvarmet langsomt til romtemperatur. Blandingen ble heilt ut på 500 ml vann og vasket en gang med hver av 10% sitronsyre (200 ml) og med 10% natriumkarbonatløsning. Diklorme-tanfasen ble tørket over magnesiumsulfat og inndampet under redusert trykk.

Utbytte: 4,60 g (37 mmol) 94%.

d) Fremstilling av 2-(2-fluor-pyirdin-4-yl)-lH-benzoimidazol-5-karboksylsyre:

2,00 g (15 mmol) 2-fluor-pyridin-4-karbaldehyd ble suspendert med 2,40 g (15 mmol)

3,4-diaminobenzosyre i 100 ml nitrobenzen og omrørt i 3 timer ved 145<*>C. Deretter ble reaksjonsløsningen avkjølt til 0°C og de derved langsomt dannende krystaller ffafiltrert. Det ble erholdt 2,53 g (9,8 mmol) av det ønskede benzimidazol.

Utbytte: 62%.

e) Fremstilling av 2-(2-merylamino-pyridin-4-yl)-lH-benzoimidazol-5-karboksylsyre: 100 mg (0,38 mmol) 2-(2-fluor-pyridin-4-yl)-lH-benzoimidazol-5-karboksylsyre ble

oppløst i 5 ml metanol. Deretter ble metanolløsning mettet med gassformig metylamin og reaksjonsblandingen omrørt i en autoklav i 10 timer under egentrykk ved 120°C. Middeltrykkromatografi (CtfeCtøMeOH = 2:1) ga 56 mg (0,21 mmol) av substitusjons-produktet.

Utbytte: 55%.

f) Fremstilling av 2-(S)-{[2-(2-metylamino-pyridin-4-yl)-lH-benzoimidazol-5-karbonyl]-amino}-4-pyrrol-l-yl-smørsyretrifluoracetat: 50 mg (0,186 mmol) 2-(2-fluor-pyirdin-4-yl)-lH-benzoimidazol-5-karboksylsyre ble oppløst i 3 mi DMF og avkjølt ved 0°C. Dertil ble det tilsatt 100 ul (0,58 mmol) diisopropyletylamin og 64 mg (0,195 mmol) TOTU. Dertter ble det tilsatt 33 mg (0,196 mmol) 2-(S)-amino-4-pyrrol-l-yl-smørsyre og reaksjonsoppløsningen fikk oppvarme seg til romtemperatur. Blandingen ble etterrørt i 18 timer, deretter heilt ut på 20 ml 10% natriumhydrogenkarbonatløsning og ekstrahert tre ganger med n-butanol (50 ml). Etter avdamping av butanolen ble resten renset ved hjelp av preparativ HFLC (acetonitril, 0,1% trifluoreddiksyre). Man erholdt således 40 mg (0,075 mmol) av det koblede produkt.

Utbytte: 42%.

De i den følgende tabell 3 nevnte eksempler ble gjennomført analogt:

Eksempel 163

Den etterfølgende forbindelse ble fremstilt etter fremgangsmåtevariant a):

a) Fremstilling av 2-(S)-amino-3-fenylsulfanyl-propionsyreetylester Til 1,00 g (5 mmol) 2-(S)-amino-3-fenylsulfanyl-propionsyre oppløst i 10 ml metanol

ble det ved -10°C tildryppet 1,7 ml (23 mmol) tionylklorid. Deretter fikk reaksjonsløs-ningen oppvarme seg til romtemperatur og S ml DMF ble tilsatt. Det ble så oppvarmet i 23 timer ved 70°C og etter avkjøling til -10*C på nytt tilsatt 1 ml (13,5 mmol) tionylklorid. Blandingen ble deretter ytterligere omrørt i 14 timer ved 70°C. Etter avdamping av den flytende fase ble resten opptatt i vann og innstilt basisk med konsentrert vandig ammoniakkløsning og ekstrahert tre ganger med eddikester (hver gang 75 ml). Etter tørking over magnesiumsulfat og inndamping kom produktet ut som olje som uten ytterligere rensing ble benyttet for kobling med karboksylsyrekomponenten.

Utbytte: 830 mg (3,7 mmol) 74%.

b) Fremstilling av 3-fenylsulfanyl-2-(S)-[(2-pyirdin-4-yI-lH-benzoimidazol-5-karbonyl)-amino]-propionsyreetylester

Ved dette ga standard TOTU kobling med 188 mg (0,83 mmol) 2-(S)-amino-2-fenylsulfanyl-propionsyreetylester og 200 mg (0,83 mmol) 2-pyridin-4-yl-lH-benzoimidazol-5-karboksylsyre det ønskede produkt.

Utbytte: 43% (160 mg, 0,36 mmol)...

De i den følgende tabell 4 nevnte eksempler ble gjennomført analogt:

Eksempel 168

Den etterfølgende forbindelse ble fremstilt etter fremgangsmåtevariant a):

a) Fremstilling av 2-pyridin-4-yI-lH-benzoimidazol-5-karboksylsyre [l-(2-morfolin-4-yl-etyIkarbamoyI)-2-fenylsulfanyl-etyl]-amid

100 mg (0,24 mmol) 3-fenylsulfanyl-2-[(2-pyridin-4-yl-lH-benzoimidazol-5-karbonyl)-aminoj-propionsyre ble oppløst i 10 ml DMF. Dertil tilsettes ved 0°C 68 ul (0,39 mmol) diisopropyleteylamin og 248 mg (0,48 mmol) benzotriazol-l-yloksy-tripyrrolidin-fosfoniumheksafluorfosfat. Deretter fikk blandingen oppvarme seg til romtemperatur og ble etterrørt i 24 timer. Løsningsmidlet ble fjernet i høy vakuum ved romtemperatur og resten ble renset ved hjelp av mellomtrykkromatografi (CrfcCtøMeOH = 8:2).

Utbytte: 73 mg (0,1376 mmol) 57%.

De i den følgende tabell 5 nevnte eksempler ble analogt gjennomført:

Eksempel 180

Den følgende forbindelse ble fremstilt etter fremgangsmåtevariant a):

a) Fremstilling av Z-homofenylalaninhydrazid:

5 g (16 mmol) Z-homofenylalanin ble ved romtemperatur oppløst i 100 mi metyl-tert.butyleter, tilsatt 3,3 g (16 mmol) N,N'-dicykloheksylkarbodiimid og 50 mg dimety-laminopyridin og omrørt i 2 timer ved romtemperatur. Deretter ble reaksjonsblandingen filtrert gjennom et foldefilter og filtratet ble vasket med IM kaliumhydrogensulfatløs-ning, mettet natriumhydrogenkarbonatløsning og vann. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet under redusert trykk. Resten ble oppløst i 20 ml tørr etanol, tilsatt 0,78 ml (16 mmol) hydrazinhydrat og omrørt i 2 timer ved romtemperatur. Reaksjonsforløpet ble fulgt ved hjelp av tynnsjiktkromatografi (DC) og etter avsluttet reaksjon ble blandingen inndampet under redusert trykk. Resten ble omkrystallisert fra eddiksyreetylestenn-heptan 1:1 og man erholdt Z-homofenylalaninhydrazid

som ble direkte omsatt videre.

b) Fremstilling av [l-(5-amino-[l,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyl]-karbaminsyre-benzylester

0,66 g Z-homofenylalaninhydrazid ble ved romtemperatur suspendert i 10 ml vann, tilsatt 200 ml kaliumhydrogenkarbonat og deretter ble 0,4 ml av en bromcyanløsning (5M i acetonitril) tildryppet. Blandingen ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur og ble deretter flere ganger ekstrahert med eddiksyreetylester. De forenede organiske faser ble vasket med mettet natriumkloirdløsmng, tørket over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet under redusert trykk. Resten ble omrørt med metyl-tert.butyleter, avsuget på filter og tørket under redusert trykk. Den således erholdte [ 1 -(5 -amino-[l,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyl]-karbaminsyre-benzylester ble uten ytterligere rensing anvendte i det neste trinn.

c) Fremstilling av 5-(l-amino-3-fenyl-propyl)-[l,3,4]oksadiazol-2-ylamin 0,33 g [l-(5-amino-[ 1,3,4]oksadiazol-2-yI)-3-fenyl-propyl]-karbaminsyre-benzylester

ble ved romtemperatur oppløst i 50 ml tørr metanol, under argon tilsatt hydreringskata-lysator (10% palladium på kull) og hydrogenert i 3 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble frafiltrert over "Celite", filtratet ble inndampet under redusert trykk og resten tørket i høyvakuum. Man erholder 5-(l-amino-3-fenyl-propyl)-[l,3,4]oksadiazol-2-ylamin, som ble anvendt i det neste trinn uten ytterligere rensing.

d) Fremstilling av 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre [l-(5-amino-[ 1,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyl]-amid

0,18 g 5-(l-amino-3-fenyl-propyl)-[l,3,4]oksadia2ol-2-ylamin ble ved romtemperatur

oppløst i 10 ml tørr dimetylformamid, tilsatt 200 mg 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre, 270 mg TOTU og 0,12 ml diisopropylamin og omrørt i 4 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble inndampet, resten opptatt i eddiksyreetylester og i rekkefølge vasket med vann, mettet natriurnhydrogenkarbonatløsning, vann og mettet natriumkloirdløsning. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet. Resten ble omrørt med metyl-tert.butyl-eter, frafiltrert og tørket i høyva-kuum. Man erholdt 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre [l-(5-amino-[l,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyl]-amid, som smelter ved 160°C under spaltning.

Eksempel 181

Den følgende forbindelse ble fremstilt ifølge fremgangsmåtevariant a):

a) Z-homofenylalaninhydrazid ble fremstilt som beskrevet i eksempel 180.

b) Fremstilling av (l-[l,3,4)oksadiazol-2-yl-3-fenyl-propyl)-karbaminsyre benzylester: 1 g Z-homofenylalaninhydrazid ble suspendert ved romtemperatur i 8 ml ortomaursy-reetylester og oppvarmet i 4 timer under tilbakeløp. Den avkjølte reaksjonsblanding ble tilsatt metyl-tert.butyleter, utfellingen ble frafiltrert og filtratet inndampet under redusert trykk. Resten ble kromatografert over kiselgel med eddiksyreetylester/n-heptan 1/1 og ga (l-[l,3,4]oksadiazol-2-yl-3-fenyl-propyl)-karbaminsyrebenzylester som ble anvendt i det neste trinn.

c) Fremstillingen av l-[l,3,4]oksadiazol-2-yl-3-fenyl-propylamin skjer analogt til fremstillingen av 5-(l-amino-3-fenyl-propyl)-[l(3,4]oksadiazol-2-ylamin som beskrevet i

eksempel 180.

d) Fremstilling av 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre (1-[l,34]oksadiazol-2-yl-3-fenyl-propyl)-amid: 220 mg l-[l,3,4]oksadiazol-2-yl-3-fenylpropy!amin ble ved romtemperatur oppløst i 10 ml tørr dimetylformamid, tilsatt 260 mg 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre, 350 mg TOTU og 0,15 ml diisopropylamin og omrørt i 4 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble inndampet, resten opptatt i eddiksyreetylester og i rekkefølge vasket med vann, mettet natriumhydrogenkarbonatløsning, vann og mettet natriumkloridløsning. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet. Resten ble kromatografert over kiselgel med diklormetan/metanol 8/1 og ga 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre(l-[l,3,4]oksadiazol-2-yl-3-fenyl-propyl)-amid, som smelter ved 103<*>C under spaltning.

Eksempel 182

Den etterfølgende forbindelse ble fremstilt ifølge fremgangsmåtevariant a):

a) Fremstilling av L-N-benzyloksykarbonyl-4-([l,3,4]oksadiazol-2-yl)-2-amino-butansyre 1 g Z-glutaminsyre-y-hydrazid ble suspendert med 30 ml para-toluensulfonsyre i 20 ml ortomaursyretrimetylester og omrørt ved romtemperatur. Suspensjonen klaret seg i løpet av 30 minutter og den derved oppståtte løsning ble filtrert og fortynnet med 100 ml vann. Etter tilsetning av 20 ml 2N saltsyre ble det ekstrahert fem ganger med etylacetat og deretter ble de forenede organiske faser tørket over natriumsulfat. Etter filtrering ble løsningen inndampet under redusert trykk og det ble erholdt en seig opak masse. b) Fremstilling av L-N-benzyloksykarbonyl-4-([l,3(4]oksadiazol-2-yl)-2-amino-butansyremorfolid 300 mg L-N-benzyloksykarbonyM-ttl^^loksadiazol^-ylJ^-amino-butansyre og 200 mg EDC-hydroklorid ble løst i 20 ml diklormetan og deretter tilsatt 2 ml morfolin. Etter 2 dagers omrøring ved romtemperatur, ble løsningen utrystet tre ganger med mettet nat-riumhydrogenkarbonatløsning og tre ganger med vandig sitronsyreløsning og en gang med mettet natriumhydrogenkarbonatløsning. Den organiske fase ble tørket over natriumsulfat og etter filtrering inndammpet under redusert trykk. Man erholder en gulaktig opak rest. c) Fremstilling av L-4-([l,3,4]oksadiazol-2-yl)-2-amino-butansyremorfolid 70mgL-N-benzyloksykarbonyl-4-(tl,3,4]oksadiazol-2-yl)-2-aminobutansyremorfoIid ble oppløst i 20 ml metanol og ble tilsatt en spatelspiss palladium på aktivkull (5%) og suspensjonen omrørt under hydrogenatmosfære. Etter 3 timer ble katalysatoren frafiltrert over "Celite" og filtratet etter filtrering gjennom et 0,45 um filter inndampet under redusert trykk. d) Fremstilling av 2-pyridin-4-yl-lH-benzirmdazol-5-karboksylsyre[l-(morfolin-4-karbonyl)-3-[ 1,3,4]oksadiazol-2-yl-propyl]-amid 43 mg 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre, 75 mg HATU og 51 mg diisopropyletylamin ble oppløst i 1 ml N,N-dimetylformamid og etter omrøring i 10 minutter tilsatt 40 mg L-4-([l,3,4]oksadiazol-2-yl)-2-amino-butansyremorfolid i 0,4 ml N,N-dimetylformamid. Etter 7 timers omrøring ved romtemperatur ble 200 mg amino-metylpolystyren (1,37 mmol/g) og 20 ml N,N-dimetylformamid tilsatt. Etter 1 time ble det filtrert og N,N-dimetylformamidet avdestillert under redusert trykk. Resten ble dige-rert med kald acetonitril. Den uoppløselige rest ble kastet og acetonitrilløsningen underkastet en gradientifltrering over RP18-kiselgel med vann/acetonitirlblandinger. Det ble isolert et glassaktig, gulaktig faststoff. Eksempel 183:3-fenoksy-2-[(2-pyridin-4-yHH-benzoimidazol-5-karbonyl)-aminoj-propionsyre hydrogenacetat

a) 2-pyridin-4-yl-lH-benzBirnidazol-5-karboksylsyre (i det følgende benevnt forbindle-se I), 15,2 g (0,1 mol) 3,4-diaminobenzosyre ble suspendert i 11 nitrobenzen og tilsatt

11,2 g (0,104 mol) pyridin-4-aldehyd. Blandingen ble så oppvarmet under heftig omrø-ring i 8 timer ved 145°C til 155°C. Etter avkjøling av løsningen ble det utfelte produkt avsuget og vasket grundig med etylacetat og diklormetan. For rensing oppvarmet man råproduktet i en blanding av 300 ml metanol, 100 ml diklormetan og 10 ml DMF til koking. Etter avkjøling filtrerte man fra det uløste produkt og vasket med diklormetan. Det erholdte materialet ble opptatt i omtrent 200 ml DMSO, og deretter ble blandingen oppvarmet til det oppstå en homogen løsning - blandingen ble avkjølt til omtrent 50°C og ble tilsatt 200 ml metanol - produktet krystalliserte etter omtrent 30 minutter ved romtemperatur. Bunnfallet ble frafiltrert og vasket grundig med metanol.

Utbytte: 19,4 g.

b) (S) 2-amino-3-fenoksypropionsyre hydroklorid (M.W. 217,6).

2,8 g Trt-Ser-OMe (Bachem), 0,75 g fenol og 2,25 g trifenylfosfin ble sammen oppløst i 60 ml absolutt THF, og ble ved 0°C i løpet av 30 minutter tilsatt med 1,49 g azodikar-boksylsyredieteylester. Reaksjonsblandingen ble etterrørt i 30 minutter ved 0°C, oppvarmet til romtemperatur (omtrent 1 time). For opparbeidelse fjernet man løsningsmid-let under redusert trykk og renset råproduktet ved kromatografi på kiselgel (heptan:EE = 1,5:1). Den således erholdte (S)-2-tritylamino-3-fenoksy-propionsyremetylester krystalliserte langsomt i lange nåler og ble for avspalting av beskyttelsesgruppene oppvarmet

under tilbakeløp i 1 time i 5M HC1. Reaksjonsløsningen ble inndampet til tørrhet under redusert trykk ved flere gangers samevapoering med toluen og resten omkrystallisert fra litt tert.butanol.

Fremgangsmåtetrinn c)

239 mg 2-pyrid^n-4-yl-lH-benzoiimdazol-5-karboksylsyre fra a) ble suspendert i 10 ml DMF og i rekkefølge tilsatt 328 mg TOTU og 0,17 ml etyldiisopropylamin. Blandingen ble omrørt i 45 minutter ved romtemperatur og til den dannede klare løsning ble det tilført 217,6 mg (S) 2-amino-3-fenoksypropionsyre hydroklorid fremstilt som under b), så vel som 0,34 ml etyldiisopropylamin. Etter 4 timers omrøring ble det inndampet under redusert trykk og tittelforbindelsen ble isolert ved hjelp av flashkromatografi på kiselgel (DCM:MeOH:AcOH:vann = 70:10:1:1). Den erholdte tittelforbindelse viste M.V. = 402,41; molmasse 402; summeformel C22H18N4O4.

Eksempel 184:3-fenylamino-2-[(2-pyridin-4-yl-lH-benzoimidazol-5-karbonyl)-amino]-propionsyrehydrogenacetat

a) L-2-amino-3-fenylaminopropionsyre

2,74 g trifenylfosfin ble under oppvarming løst i 30 ml acetonitril og under utelukkelse

av fuktighet avkjølt til -35°C til -45°C (derved ble fosfmet finfordelt) og deretter ble ved denne temperatur i løpet av 40 minutter dråpevis tilsatt 1,82 ml azodikarboksylsyredietylester. Blandingen ble etterrørt 15 minutter ved -35°C. Til denne blanding ble det tildryppet en løsning av 2,5 g N-benzyloksykarbonyl-L-serin i 5 ml acetonitril og 2 ml THF, derved lot man temperaturen ikke stige over -35°C. I tilslutning til dette, lot man blandingen etterreagere 1 time ved -35°C og oppvarmet den til romtemperatur. Reak-sjonsløsningen ble under redusert trykk befridd for løsningsmiddel og råproduktet ble med en gang renset med middeltrykkromatografi på kiselgel. (DCM/AcCN = 20/1). Etter fjernelse av løsningsmidlet erholder man 1,4 g rent N-benzyloksykarbonyl-L-serin-p-lakton (se også "Org. Synth." 1991 (70) 1 osv.) i fine nåler. 1,2 g av laktonet ble løst i 10 ml acetonitril og oppvarmet i 2 timer under tilbakeløp med 0,51 g anilin. Etter fjernelse av løsningsmidlet isolerte man produktet ved kromatografi på kiselgel

(DCM/MeOH/AcOH = 100/5/1). Man erholder på denne måte 1,1 g (68%) L-2-benzyloksykarbonylamino-3-fenylaminopropionsyre.

For avspalting av beskyttelsesgruppen ble det Z-beskyttede derivat løst i metanol, under inertgass ble 80 mg katalysator (10% Pd-C) tilsatt og hydrogen ble innledet til fullstendig avspalting av Z-beskyttelsesgruppen. Etter frafiltrering av katalysatoren og inndamping av filtratet erholder man 0,58 g L-2-amino-3-fenylamino-propionsyre (92%) som gulaktige myke nåler.

Fremgangsmåtetrinn b)

239 g 2-pyridin-4-yl-lH-benzoimidazol-5-karboksylsyre fremstilt som i eksempel 183, ble suspendert i 10 ml DMF og i rekkefølge tilsatt 328 mg TOTU og 0,17 ml etyldiisopropylamin. Blandingen ble omrørt i 45 minutter ved romtemperatur og til den dannede klare løsning ble det tilsatt 180,2 mg (S) 2-amino-3-fenylaminopropionsyre fremstilt ifølge a) så vel som 0,34 ml etyldiisopropylamin. Etter 4 timers omrøring inndampet man under redusert trykk og isolert tittelforbindelsen ved hjelp av flashkromatografi på kiselgel (DCM:MeOH:AcOH:vann = 70:10:1:1). Den erholdte tittelforbindelse viste M.W. = 401,43; summeformel C22H19N5O3.

Eksempel 185

239,2 mg (1 mmol) av forbindelse I fremstilt som i eksempel 183 ble i omtrent 8 ml DMF i rekkefølge tilsatt 182,7 mg (1 mmol) H-Leu-OMe HC1, 328 mg (1 mmol) TOTU og 0,34 ml (2 mmol) etyldiisopropylamin. Etter 6 timer ved romtemperatur ble løs-ningsmidlet avdestillert under redusert trykk, resten ble opptatt i EE og vasket tre ganger med hver av vann og mettet NaCl-løsning. Den organiske fase ble tørket og inndampet til tørrhet under redusert trykk. Resten ble renset ved flashkromatografi på kiselgel (DCM/MeOH=15/l).

Utbytte: omtrent 200 mg.

Eksempel 186

239,2 mg (1 mmol) av forbindelse I fremstilt som i eksempel 183 ble i omtrent 8 ml DMF i rekkefølge tilsatt 166,6 mg (1 mmol) H-Leu-NH2 HC1,328 mg (1 mmol) TOTU og 0,34 ml (2 mmol) etyldiisopropylamin. Etter 6 timer ved romtemperatur ble løs-ningsmidlet avdestillert under redusert trykk, resten ble opptatt i EE og vasket en gang med vann. Den vandige fase ble så mettet med NaCl og to ganger ekstrahert med EE/THF = 1/1. De forenede organiske faser ble vasket en gang med mettet NaCl-løsning, tørket og inndampet under redusert trykk til tørrhet. Resten ble utfelt med diklormetan og frafiltrert. For rensing ble råproduktet utkokt med DCM/EE = 1/1, frafiltrert og grundig vasket med DCM/eter.

Utbytte: omtrent 200 mg.

Eksempel 187

239,2 mg (1 mmol) av forbindelse I fremstilt som i eksempel 183 ble i omtrent 8 ml DMF i rekkefølge tilsatt 152,6 mg (1 mmol) H-Val-NH2*HC1,328 mg (1 mmol) TOTU) og 0,34 ml (2 mmol) etyldiisopropylamin. Etter 6 timer ved romtemperatur ble løs-ningsmidlet avdestillert under redusert trykk, resten ble opptatt i EE og vasket en gang med vann. Den vandige fase ble så mettet med NaCl og ble ekstrahert to ganger med EE/THF = 1/1. De forenede organiske faser ble vasket en gang med mettet NaCl-løsning, tørket og inndampet til tørrhet under redusert trykk. Resten ble utfelt med

diklormetan og frafiltrert. For rensing ble råproduktet utkokt med DCM/EE = 1/1, frafiltrert og vasket grundig med DCM/eter.

Utbytte: omtrent 200 mg.

Eksempel 188

239,2 mg (1 mmol) av forbindelse I fremstilt som i eksempel 183 ble i omtrent 8 ml DMF i rekkefølge tilsatt 247,7 mg (1 mmol) H-Dopa-OMe»HCl, 328 mg (1 mmol) TOTU og 0,34 ml (2 mmol) etyldiisopropylamin. Etter 6 timer ved romtemperatur ble

løsningsmidle avdestillert under redusert trykk, resten opptatt i EE og vasket tre ganger med hver av vann og mettet NaCl-løsning. Den organiske fasen ble tørket og inndampet til tørrhet under redusert trykk. Resten ble utfelt med diklormetan og frafiltrert. For rensing ble råproduktet utkokt med DCM/EE = 1/1, frafiltrert og grundig vasket med DCM/eter.

Utbytte: omtrent 200 mg.

Eksempel 189

Den følgende forbindelse ble fremstilt etter fremgangsmåtevariant c):

2,0 g polystyren-AM RAM, 160-200 um (0,64 mmol/g; Rapp-polymer) - harpiks ble innført i en plastsprøyte, fikk svelle i 20 minutter i DMF og deretter behandlet en løs-

ning av DMF/piperidin (1:1) i 20 minutter. Etter vasking med DMF, DCM og en gang til med DMF ble harpiksen så anvendt i det neste syntesetrinn.

Fremgangsmåtetrinn a)

Til en løsning av Fmoc-homoPheOH (0,71 g, 3,84 mmol) og HOBt-hydrat (0,59 g, 3,84 mmol) i DMF ble det tilført DIC (0,59 ml, 3,84 mmol). Den dannede løsning ble trukket inn i den ovennevnte sprøyte og blandingen ble omrørt i 16 timer ved romtemperatur. Harpiksen ble vasket med DMF (10x15 ml), DCM (4x15 ml) og DMF (2x15 ml), og deretter oppbevart ved 4°C. For reaksjonskontroll ble det gjennomført en KAISER-test på noen harpikskuler.

Fremgangsmåtetrinn b)

Harpiksen ble som beskrevet ovenfor, avbeskyttet og vasket. Til en løsning av 4-fluor-3-nitro-benzosyre (0,71 g, 3,84 mmol) og HOBt-hydrat (0,59 g, 3,84 mmol) i DMF (omtrent 15 ml) ble det tilført DIC (0,59 ml, 3,84 mmol). Denne løsning ble trukket inn i sprøyten med den forberedte harpiks og blandingen ble rystet i 16 timer ved romtemperatur. Harpiksen ble vasket med DMF (10x15 ml) og oppbevart ved 4°C. For reaksjonskontroll ble det gjennomført i KAISER-test på noen harpikskuler.

Fremgangsmåtetrinn c)

En løsning av 4-(aminometyl)pyridin (1,4 ml, 12,8 mmol) i DMF (10 ml) ble tilført til den forberedte harpiks og blandingen ble etterlatt under rysting i 2 dager ved romtemperatur. Harpiksen ble vasket med DMF (8x15 ml), DCM (4x15 ml) og DMF (2x15 ml). Anmerkning: Det ble senere funnet at enkel oppvarming av harpiksblandingen i DMA (dimetylacetamid, i stedet for DMF) i 16 timer ga den ønskede hydroksybenzimidazol; således kunne syntesen påskyndes.

Fremgangsmåtetrinn d)

En løsning av harpiksen i DMA ble fyllt i en lukkbar glassreaktor og reaksjonsblandingen ble oppvarmet i 16 timer ved lett bevegelse ved 125°C. Den resulterende ringslutning kunne bekreftes ved GOMS (etter avspalting av en delmengde av substansen fira harpiksen). Etter vasking med DMA (5x15 ml) ble harpiksen så anvendt i syntesetrinn e).

Fremgangsmåtetrinn e)

Til en løsning av harpiksen (0,5 g) fra fremgangsmåtetrinn d) i DMA (5,0 ml) ble det tilsatt tributylfosfin (0,6 ml) og blandingen ble etterlatt under forsiktig omrøring i 6 timer ved 150°C. Harpiksen ble så vasket med DMF (20x10 ml), MeOH (10x10 ml) og DCM (10x10 ml).

Fremgangsmåte f) Avspalting og opprensing

Den i fremgangsmåtetrinn e) erholdte harpiks ble behandlet med TFAÆfeO (95/5) i 3 timer ved romtemperatur. TFA/H2O ble fjernet under redusert trykk og det ble erholdt et brunt glassaktig faststoff som råprodukt Råproduktet ble kromatografert på kiselgel (flashkromatografi; elueringsmiddel: 95/5 DCM/2,0 M NH3 i MeOH, deretter 92/8 DCM/2,0 M NH3 i MeOH). De ønskede fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet fjernet under redusert trykk. Produktet ble erholdt som hvitt faststoff.

MS (ES; M+H<*> = 400) 1H-NMR tilsvarte den ovennevnte strukturformel.

Eksempel 190

Den følgende forbindelse ble fremstilt ifølge fremgangsmåtevariant c):

A) Syntese av 3(R/S)-vinyl-2(S)-azido-3-fenylpropionsyre

a) Til en løsning av 3-vinyl-4-fenylsmørsyreetylester (0,129 mol) i vandig THf (120 ml/20 ml H20) ble det tilsatt litiumhydroksid (monohydrat, 21 g; 645

mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten og deretter konsentrert under redusert trykk. Resten ble fordelt mellom AcOEt og vandig HC1 (1 M), fase-ne ble separert og den vandige fase ble vasket to ganger med AcOEt. De forenede organiske faser ble vasket med mettet koksaltløsning, tørket over MgS04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Det ble oppnådd 15,6 g (utbytte 62%) syre, som så ble anvendt i den følgende reaksjon.

b) Til en avkjølt (-78°C) løsning av den ovennevnte syre (1,74 g, 9,16 mmol) i vannfri THf (10 ml) ble det tilsatt trietylamin (1,27 ml) og 15 minutter senere

pivaloylklorid (1,18 ml). Blandingen ble omrørt i 1 time ved 0°C og avkjølt til -78°C. I en separat kolbe ble det til en avkjølt (-78<*>C) løsning av S-fenyl-oksazolidinon (1,64 g) i THF (36 ml) langsomt tilsatt n-butyl-litium (5,7 ml, 1,6M i heksan). Løsningen ble omrørt i 1 time ved -78°C, oppvarmet til 0°C og via en kannyle tildryppet i den ovennevnte løsning. Etter avsluttet tilsetning ble løsningen omrørt over natten ved romtemperatur. Mettet NH4CI-løsning (20 ml) ble tilsatt og løsningen ble konsentrert under redusert trykk til 1/3 av volumet. Den vandige løsning ble ekstrahert tre ganger med diklormetan, de kombinerte organiske faser ble vasket med vandig natronlut, tørket over MgSO<t, filtrert og inndampet. Resten ble renset ved hjelp av flashkromatografi (kiselgel, 5-20% AcOEt/heksan). Det ble erholdt 2,06 g (67% utbytte) av imid som blanding av de to diastereomerer.

c) Til en avkjølt (-78°C) løsning av imidet (1,88 g, 5,61 mmol) i vannfri THF (15 ml) ble det tilsatt 1,1,1,3,3,3-heksametyldisilazan kaliumsalt (14,6 ml, 0,5 molar

løsning i toluen) dråpevis. Etter 40 minutter, ble det tilsatt en avkjølt (-78°C) løsning av trimetylstlylazid (2,51 g) i THF. Etter ytterligere 35 minutter ble det tilsatt eddiksyre (1,47 ml) og løsningen etterlatt under omrøring over natten ved romtemperatur. Reaksjonsløsningen ble fordelt mellom diklormetan og mettet koksaltløsning, den organiske fase ble tørket over MgS04, filtrert og inndampet.

Resten ble flashkromatografert over kiselgel (elueringsmiddel: a) DCM/MeOH/vandig ammoniakk = 95/5/1; b) DCM; begynnelsesforhold a:b = 1:10, til rent DCM. Det ble oppnådd 2,5 g (95% utbytte) azidoprodukt.

d) Til en avkjølt løsning (0°C) av den ovennevnte azidoforbindelse (2,5 g) i THF (20 ml), H2O (4 ml) og litiumhydroksid monohydrat (558 mg) ble det tilsatt 3 ml

hydrogenperoksid (30%). Blandingen ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur og deretter ble den tilsatt 19 ml av en 10% løsning av natriumsulfat. Løsningen ble under redusert trykk konsentrert til 1/10 av det opprinnelige volum, den erholdte rest ble ekstrahert tre ganger med etylacetat, de forenede organiske faser ble tør-ket over MgSCU, filtrert og inndampet til tørrhet under redusert trykk. Resten ble renset over kiselgel (flashkromatografi, elueringsmiddel: 1-5% MeOH i 1%

vandig ammoniakkløsning/99% DCM). Det ble oppnådd 912 mg av den ønskede syre (74% utbytte).

B) Syntese av 2-pyridin-4-yl-lH-ben2oimidazol-5-karbonyl-3-R,S-benzyl-S-prolinamid 0,4 gpolystyren-Knorr-harpiks (0,61 mmol/g) - harpiks ble innført i en plastsprøyte, etterlatt svellende i 20 minutter i DMF og deretter behandlet i 20 minutter med en løs-ning av DMF/piperidin (1:1). Etter vasking med DMF, DCM og ennå en gang med DMF ble harpiksen så anvendt i det neste syntesetrinn.

Fremgangsmåtetrinn a)

Til den ovennevnte harpiks ble tilsatt en løsning av 3(R/S)-vinyl-2(S)-azido-3-fenylpropionsyre (se også trinnene a) - d); 0,28 mmol), PyBOP (0,28 mmol) og DIPEA (0,32 mmol). Den dannede blanding ble omrystet i 16 timer ved RT. Harpiksen ble vasket med MeOH (3x15 ml) og DCM (4x15 ml) og tørket under redusert trykk. For reaksjonskontroll ble det gjennomført en KAISER-test på noen harpikskuler.

Fremgangsmåtetrinn b)

Cykloheksen (23 mmol) ble tilsatt en til 2M løsning av dicykloheksylbo-ran/dimetylsulfidkompleks (11,6 mmol) i vannfri dietyleter under en inertgassatmosfæ-re. Etter 1 time var det dannet et hvitt faststoff. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og den ovennevnte harpiks og 10 ml DCM ble tilført. Den heterogene blanding ble lett omrørt i 2,5 timer til gassutviklingen var avsluttet. Harpiksen ble vasket med MeOH og tørket under redusert trykk. Deretter ble den omrørt med en 50/50 (vol/vol) blanding av etanolamin og DMF i 1 time og deretter vasket med MeOH og DCM (hver gang tre ganger) og deretter tørket.

Fremgangsmåtetrinn c)

Til en løsning av 4-fluor-3-nitro-benzosyre (0,69 mmol) og HO At (0,69 mmol) i DMF (omtrent 5 ml) ble det tilsatt DIC (0,69 mmol). Denne løsning ble trukket inn i sprøyten med den forberedte harpiks og blandingen ble omrystet i 16 timer ved romtemperatur (RT). Harpiksen ble vasket med DMF (10x15 ml) og tørket under vakuum. For reak-sjottskontroll ble det gjennomført i KAISER-test på noen harpikskuler.

Fremgangsmåtetrinn d)

En løsning av 4-(aminometyl)pyridin (4,6 mmol) i DMF (4 ml) ble tilsatt til den forberedte harpiks og blandingen ble omrystet i 32 dager ved romtemperatur. Harpiksen ble vasket med MeOH og DCM (hver 3x15 ml) og tørket.

Fremgangsmåtetrinn e)

En løsning av harpiksen i DMA ble fyllt i en lukkbar glassreaktor og reaksjonsblandingen ble oppvarmet i 16 timer ved 125°C under lett bevegelse. Den resulterende ringslutning kunne bekreftes ved hjelp av GC/MS (etter avspalting av en delmengde av substansen fra harpiksen). Harpiksen ble vasket med MeOH og DCM (hver 3x15 ml) og tørket.

Fremgangsmåtetrinn f)

Til en løsning av harpiksen (0,21 mmol) fra fremgangsmåtetrinn e) i DMA (3,0 ml) ble det tilsatt tributylfosfin (0,5 ml) og blandingen ble etterlatt under forsiktig omrøring i 5 timer ved 125°C. Harpiksen ble så vasket med DMF (2x10 ml), MeOH (2x10 ml) og DCM (3x10 ml) og tørket under redusert trykk.

Fremgangsmåtetrinn g) Avspalting og rensing

Den i fremgangsmåtetrinn f) erholdte harpiks ble behandlet med TFA/H2O (97/3) i 1 time ved romtemperatur. TFA/H20 ble fjernet under redusert trykk og det ble erholdt et brunt glassaktig faststoff som råprodukt. Råproduktet ble kromatografert på kiselgel (flashkromatografi; elueringsmiddel: 95/5 DCM/2,0M NH3 i MeOH, og deretter 92/8 DCM/2,0M NH3 i MeOH). De ønskede fraksjonene ble samlet og løsningsmidlet fjernet under redusert trykk. Produktet ble oppnådd som hvitt faststoff.

MS (ES;M+H+ = 426).

1H-NMR tilsvarte den ovenstående strukturformel.

Eksempel 191

Den følgende forbindelse ble fremstilt ifølge fremgangsmåtevariant c):

1,5 g av polystyren-Knorr-harpiks (0,64 mmol/g) ble innført i en plastsprøyte, fikk svelle i 20 minutter i DMF og ble deretter behandlet med en løsning av DMF/piperidin (1:1) i 20 minutter. Etter vasking med DMF, DCM og ennå en gang med DMF, ble harpiksen så anvendt i det neste syntesetrinn.

Fremgangsmåtetrinn a)

En løsning av Fmoc-3R,S-fenyl-S-prolin (1,5 mmol), PyBOP (1,5 mmol) og DIPEA (2,1 mmol) i DCM ble tilført harpiksen. Den dannede blanding ble omrystet i 16 timer ved romtemperatur. Harpiksen ble vasket med DCM (4x15 ml), MeOH (2x15 ml) og DCM og tørket under redusert trykk. For reaksjonskontroll, ble det gjennomført ei KAISER-test på noen harpikskuler.

Fremgangsmåtetrinn b)

Harpiksen ble som beskrevet i eksempel 190 under fremgangsmåte B, omsatt videre til den ønskede forbindelsen.

MS (ES; M+H<*> = 412).

1H-NMR tilsvarte den ovenstående struktur fonn el.

Eksempel 192:

Den etterfølgende forbindelse ble fremstilt etter fremgangsmåtevariant a):

a) Fremstilling av Z-homofenylalaninhydrazid:

Z-homofenylalaninhydrazid ble fremstilt som beskrevet i eksempel 180a.

b) Fremstilling av [l-(5-amino-[ 1,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyljkarbaminsyre-benzylester

[l-(5-amino-[l ,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyl]karbaminsyre-benzylester ble fremstilt som beskrevet i eksempel 180b.

c) Fremstilling av [l-(5-benzensulfonylamino-[ 1,3,4]oksadiazol-2-yi)-3-fenyl-propylj-karbaminsyre-benzylester

0,35 g av forbindelsen ifølge eksempel 192b ble ved romtemperatur oppløst i 5 ml pyridin, tilsatt 0,13 ml benzensulfonylklorid og omrørt i 4 timer ved 80°C. Ennå en gang tilføyes 0,13 ml benzensulfonylklorid og det omrøres i ytterligere 2 timer ved 80°C.

Reaksjonsblandingen ble konsentrert i vakuum og resten ble opptatt i eddiksyreetylester, vasket to ganger med vann og en gang med mettet koksaltløsning, tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert i vakuum. Man erholder [l-(5-benzensulfonylamino-[l,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyl]-karbaminsyre-benzylester, som omsettes videre uten ytterligere rensing.

d) Fremstilling av N-[5-(l-amino-3-fenyl-propyl)-[l,3,4]oksadiazol-2-yl]-benzensulfonamid

0,18 g av forbindelse 192c ble oppløst ved romtemperatur i 30 ml tørr metanol, tilsatt Pd/C-katalysator under argon og hydrogenert i 4 timer ved romtemperatur. Etter filtrering, vasking av resten med metanol og konsentrering av filtratet erholdes en N-[5-(l-amino-3-fenyl-propyl)-[l,3,4]oksadiazol-2-yl]-benzensulfonamid, som anvendes i det neste trinn.

e) Fremstilling av 2-pyridin-4-yl-1 H-benzimidazol-5-karboksylsyre [ 1 -(5 - benzensulfonylamino-[l,3,4]oksadiazol-2-yI)-3-fenyl-propyl]-amid 70 mg av forbindelsen ifølge eksempel 192d ble oppløst i 5 ml tørr DMF, og tilsatt 30 ul diisopropylamin, 48 mg 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre og 66 mg TOTU. Etter 4 timers ornrøring ved romtemperatur, var reaksjonen avsluttet og reaksjonsblandingen ble konsentrert. Resten ble behandlet med eddiksyreetylester og vann. Løsningsmidlene ble dekantert; den oljeaktige rest ble behandlet med varm aceton, av-kjølt og det krystallinske produkt ble samlet på et filter, vasket med aceton og tørket. Det ble erholdt 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre [l-(5-benzensulfonylamino-[l,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyl]-amid, som smeltet fra 220<*>C under spalting.

Eksempel 193:

Den følgende forbindelse ble fremstilt ifølge fremgangsmåtevariant a)

a) Fremstilling av Z-homofenylalaninhydrazid

Z-homofenylalaninhydrazid ble fremstilt som beskrevet i eksempel 180a.

b) Fremstilling av [l-(5-amino-[l,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyl]-karbaminsyre-benzylester

[1 -(5-amino-[ 1,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyl]karbaminsyre-benzylester ble fremstilt som beskrevet i eksempel 180b.

c) Fremstilling av {1 -[5-(3-metyl-ureido)-[ 1 ,3,4]oksadiazol-2-yl]-3-fenyl-propyl} - karbaminsyre benzylester

350 mg [ 1 -(5-amino-[l .S^Joksadiazol^-yO-S-fenyl-propylJkarbaminsyre-benzylester ble oppløst i 5 ml tørr dimetylsulfoksid, tilsatt 140 mg kaliumkarbonat og 140 mg metylisocyanat og omrørt i 16 timer ved 80°C. Reaksjonsblandingen ble avkjølt, tilsatt eddiksyreetylester, vasket to ganger med vann og en gang med mettet koksaltløsning, tør-ket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert i vakuum. Man erholdt {l-[5-(3-metyl-ureido)-[l,3,4]oksadiazol-2-yl]-3-fenyl-propyl}-karbaminsyre benzylester, som uten ytterligere rensing ble anvendt i det neste trinn (hydrogenolyse).

d) Fremstilling av l-[5-(l-amino-3-fenyl-propyl)-[l,3,4]oksadiazol-2-yl]-3-metylurea

120 mg av den ovenstående forbindelse ble oppløst ved romtemperatur i 20 ml tørr metanol, tilsatt Pd/C-katalysator under argon og hydrogenert i 4 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble filtrert, resten ble vasket med metanol og filtratet ble konsen-tert i vakuum. l-[5-(l-amino-3-fenyl-propyl)-[l,3,4]oksadiazol-2-yl]-3-metyl-ureaforbindelsen ble anvendt i det neste trinn uten videre rensing.

e) Fremstilling av 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre {l-[5-(3-metyl-ureido)-[l,3,4]oksadiazol-2-yl]-3-fenyl-propyl}-amid

40 mg av den ovenstående forbindelse ble oppløst i 3 ml tørr DMF ved romtemperatur og i rekkefølge tilsatt 33 mg 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre, 20 ul diisopropylamin og 40 mg TOTU og ble omrørt i 4 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble konsentrert i vakuum; resten ble opptatt i eddiksyreetylester/tetrahydrofuran 1/1, vasket med vann, mettet natriumhydrogenkarbonatoppløsning og mettet koksaltløsning, tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert i vakuum. Man erholdt 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre {l-[5-(3-metyl-ureido)-[l,3,4]oksadiazol-2-yl]-3-fenyl-propyl}-amid, som i massespektrum fremviste m/z = 497,3 (=MH<+>).

Eksempel 194:

Den følgende forbindelse ble fremstilt ifølge fremgangsmåtevariant a):

2-pyridin-2-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre [l-(5-acetylamino-[l,3,4]oksadiazol-2-yl)-3-fenyl-propyl]-amid ble fremstilt på prinsippiell analog måte, men med den for-skjell at omsetningen foregikk med acetylklorid i stedet for metylisocyanat. Forbindelsen fremviser et smeltepunkt fra 183-186°C under spalting.

Eksempel 195:

Den følgende forbindelse ble fremstilt etter fremgangsmåtevariant a):

a) Fremstilling av (l-cyano-3-fenyl-propyl)-karbaminsyre benzylester:

2,78 g (l-karbamoyl-3-fenyl-propyl)-karbaminsyre benzylester, fremstilt fra L-homofenylalaninamid hydroklorid og N-Cbz-suksinimid, ble løst i 30 ml tørt pyridin og tilsatt 6 ml eddiksyreanhydrid. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 24 timer ved 75°C.

Den avkjølte løsning ble konsentrert i vakuum, tilsatt 100 ml eddiksyreetylester og deretter utrystet hver gang tre ganger med 50 ml 5% sitronsyreløsning og mettet koksalt-løsning. Den organiske ekstrakt ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert, konsentrert i vakuum og kromatografert over kiselgel med n-heptan/eddiksyreetylester 1/1. Man erholdt (l-cyano-3-fenyl-propyl)-karbaminsyre benzylester, som ble anvendt uten ytterligere rensing i det neste trinn.

b) Fremstilling av [3-fenyl-l-(lH-tetrazol-5-yl)-propyl]-karbaminsyre benzylester: 0,15 g av forbindelsen fra eksempel 195 a ble suspendert med 0,115 g trimetyltinnazid i 5 ml tørr toluen og omrørt i 6 timer under tilbakeløp. Den avkjølte reaksjonsblanding ble surgjort med eterisk saltsyre og fikk stå over natten i kjøleskap. Den neste dag ble blandingen konsentrert i vakuum og kromatografert over kiselgel med diklormetan/metanol 9/1. Den således erholdte [3-fenyl-l-(lH-tetrazol-5-yl)-propyl]-karbaminsyre benzylester ble uten videre rensing anvendt i det neste trinn.

c) Fremstilling av 3-fenyl-l-(lH-tetrazol-5-yl)-propylamin:

337 mg av forbindelsen fra eksempel 195b ble løst i 2 ml acetonitril, tilsatt 0,477 ml trietylsilan, en dråpe trietylamin og en spatelspiss palladium-II-klorid og omrørt i 3 timer under tilbakeløp. Den avkjølte løsning ble filtrert, inndampet i vakuum og resten tørket i høyvakuum. Det således erholdte 3-fenyl-l-(lH-tetrazol-5-yl)-propylamin ble omsatt videre. d) Fremstilling av 2-pyridin-4-yI- lH-benzimidazol-5-karboksylsyre [3-fenyl-1-(lH-tetrazol-5-yl)-propyl]-amid 0,9 mmol av forbindelsen fra eksempel 195c ble oppløst i 5 ml tørr DMF og tilsatt 0,9 mmol 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre, 0,365 ml diisopropylamin og 415 mg TOTU, ble omrørt i 20 timer ved romtemperatur og i ytterligere 4 timer ved 50°C. Reaksjonsblandingen ble konsentrert i vakuum; resten ble opptatt i eddiksyreetylester, vasket med vann, mettet natriumhydrogenkarbonatløsning og mettet koksaltløs-ning, tørket over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet i vakuum. Det således erholdte råprodukt ble kromatografert over kiselgel med diklormetan/metanol/vann/iseddik 60/10/1/1. Man erholdt 2-pyridin-4-yl-lH-benzimidazol-5-karboksylsyre [3-fenyl-l-(lH-tetrazol-5-yl)-propyl]-amid, som spaltet seg fra 87°C og fremviste en moltopp ved m/z = 425,2 (MH<4>). Eksempel 196:3-fenylaminoetyl-2-[(2-pyirdm-4-yl-lH-benzimidazol-5-karbonyl)-amino]-propionsyre trifluoracetat

a) L-2-amino-3-fenylaminoetylpropionsyre

54,8 g (0,209 mol) tri fenyl fosfin ble suspendert i 600 ml acetonitril og avkjølt under

utelukkelse av fuktighet til -35°C til -45°C. Deretter ble det ved denne temperatur i løpet av 50 minutter dråpevis tilsatt 36,4 g (0,209 mol) azodikarboksylsyredietylester. Blandingen ble etterrørt i 15 minutter ved -35°C. Til denne blanding ble det tildryppet en løsning av 50 g (0,209 mol) N-benzyloksykarbonyl-L-serin i 500 ml acetronil, idet temperaturen ikke ble tillatt å stige over -35°C. Deretter lot man blandingen etterreagere i 12 timer ved 5°C og oppvarmet til romtemperatur. Reaksjonsløsningen ble under redusert trykk befridd fra løsningsmiddel og råproduktet renset ved middeltrykkromatografi på kiselgel (DCM/AcCN:25/l). Etter fjerning av løsningsmidlet erholdt man 20,8 g (utbytte 45%) rent N-benzyloksy-karbonyl-L-serin-p-lakton (se også "Org. Synth.", 1991 (70), 1 osv.) i fine nåler.

Summeformel: CnHnNO*; M.W. = 221,2; MS (M+H) 222,1.

Til 7,3 ml (57,36 mmol) N-etylanilin i 250 ml acetonitril ble det under argon beskyttel-sesatmosfære tilsatt 15,5 ml (63,51 mmol) N,0-bis-(trimetylsilyl)acetamid og blandingen ble omrørt i 3 timer ved 50°C. Deretter ble det ved 20°C tilsatt en løsning av det ovennevnte lakton (10,7 g, 48,37 mmol) oppløst i 250 ml acetonitril og oppvarmet i 17 timer under tilbakeløp. Etter fjerning av løsningsmidlet ble resten tilsatt mettet nafrium-karbonatløsning hvorunder pH-verdien av løsningen ikke oversteg 9. Den vandige suspensjon ble vasket med litt dietyleter og deretter innstilt med konsentrert saltsyre til en pH-verdi på 6 til 7 og med NaHPO^buffer innstilt på en pH-verdi på 5. Den vandige løsning ble flere ganger ekstrahert med eddikester. Etter avdamping av løsningsmidlet erholdt man det ønskede produkt i et utbytte på 45% (7,4 g).

Summeformel: C19H22N2O4; M.W. = 342,4; MS (M+H) 343,2.

Til 75 ml metanol ble det ved -10°C tildryppet 6,5 ml (89,1 mmol) tionylklorid og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Deretter ble det tilsatt i 75 ml metanol oppløst L-2-aminoetyl-3-fenylamino-propionsyre 8,6 g (25,12 mmol), og omrørt i 30 minutter ved -10°C og i ytterligere 3 timer ved romtemperatur. Etter avdamping av løsningsmidlet ble resten opptatt i eddikester og vasket med natriumkarbonatløsning. Etter avdamping av løsningsmidlet og rensing ved hjelp av flashkromatografi (n-heptan/eddikester 7:3) ble det oppnådd 4,43 g (50% utbytte) av L-2-aminoetyl-3-fenylaminopropionsyremetylester.

Summeformel: C2oH24N204; M.W. = 356,4; MS (M+H) 357,3.

For avspalting av beskyttelsesgruppen ble 4,4 g (12,35 mmol) av det Z-beskyttede derivat i 500 ml metanol, 100 mg katalysator ble tilsatt under inertgass (10% Pd(OH)2-C) og hydrogen ble innført til fullstendig avspalting av Z-beskyttelsesgruppen. Etter frafiltrering av katalysatoren og inndamping av filtratet erholdt man 2,8 g L-2-aminoetyl-3-fenylamino-propionsyre (kvantitativ).

Summeformel: C12H18N2O2; M.W. = 222,3; MS (M+H) 223,1.

Fremgangsmåtetrinn b)

2,4 g (10,03 mmol) 2-pyridin-4-yl-lH-benzoimidazol-5-karboksylsyre fremstilt som i eksempel 183 ble suspendert i 350 ml DMF og i rekkefølge tilsatt 4,2 g (12,80 mmol) TOTU og 2,3 ml (13,52 mmol) etyldiisopropylamin. Man omrørte i 10 minutter ved romtemperatur og tilsatte til den dannede klare løsning 2,8 g (12,60 mmol) (S) 2-amino-3-fenylaminoetylpropionsyremetylester fremstilt ifølge a). Etter 2 timers omrøring kon-sentrerte man blandingen under nedsatt trykk og metylesteren av tittelforbindelsen ble isolert ved flashkromatografi på kiselgel (DCM:MeOH = 9:1).

Utbytte: 4,36 g (98%).

Summeformel: C25H25N5O3; M.W. = 443,5; MS (M+H) 444,3.

4,3 g (9,7 mmol) av den således erholdte metylester ble hydrolysert i 400 ml metanol ved tilsetning av 200 ml IM natronlut ved romtemperatur i 2 timer. Etter avdamping av metanolen ble den erholdte suspensjon innstilt til pH = 5 med NaH2P04-løsning. Derved

faller produktet ut fra løsningen. Rensing ved hjelp av flashkromatografi på kiselgel (DCM:MeOH = 4:1) og preparativ HPLC (acetonitril/0,1% TFA) ga 2,92 g (utbytte 70%) av 3-fenylaminoetyl-2-[(2-pyridin-4-yl- lH-ben2oimida2ol-5-karbonyl)-amino]-propionsyre trifluoracetat.

Summeformel: C24H23N5O3; M. W. =429,5; MS (M+H) 430,3; smeltepunkt: omtrent 258°C (under spaltning).

Farmakologisk eksempel

IxB-kinase filtertest:

Aktiviteten IicB-kinasen ble bestemt ved hjelp av "SignaTECT" proteinkinaseanalyse-system (Promega katalog 1998, s. 330; analog til "SignaTECT" DNA-Dependent Pro-tein Kinase forskrift). Kinasen ble renset ifølge Z.J. Chen ("Cell" 1996, bind 84, s. 853-862) fra HeLa-celleekstrakter og inkubert med substratpeptidet (Biotin-(CH2)«-DRHDSGLDSMKD-CONH2) (20 um). Reaksjonsbufferen inneholdt 50 mM HEPES, pH 7,5,10 mM MgCl2,5 mM ditiotreitiol (DTT), 10 mM p-glyserolfosfat, 10 mM 4-nitrofenylfosfat, 1 uM mikrocystin-LR og 50 uM ATP (inneholdende 1 uCi y-<33>P-ATP).

Metode PKA, PKC, CKII

cAMP-avhengig proteinkinase (PKA), proteinkinase C (PKC) og kaseinkinase II (CK II) ble bestemt med de tilsvarende testsett fra Upstate Biotechnology ifølge produsen-tens forskrift ved en ATP-konsentrasjon på 50 uM. Til avvik derfra ble det ikke anvendt noe fosfocellulosefilter, men derimot MultiScreen-plater (Millipore; Fosfocellulose MS-PH, kat. MAPHNOBIO) med det tilsvarende avsugningssystem. Platene eller membra-nene (IicB-kinase) ble deretter målt i en Wallac MicroBeta Scintillasjonsteller. Det ble hver gang anvendt 100 uM testsubstans.

Hver testsubstans ble testet i dobbeltbestemmelse. Av middelverdien (enzym med og uten substanser) ble middelverdien for blindprøven (uten enzym) fratrukket og prosent inhibisjon beregnet. ICjo-beregninger ble gjennomført med programvarepakke GraFit 3.0. Den etterfølgende tabell 6 viser resultatene.

Claims (5)

1. Forbindelse, karakterisert ved formell og/eller en stereoisomer form av forbindelsen med formel I og/eller et fysiologisk akseptabelt salt av forbindelsen med formel I, hvor R<6> er en 4-pyridylgruppe, en pyrimi-dinring som i 2-stilling er substituert med en gruppe N(R' ^2, der R<11> er valgt fra H eller Ci-ealkyl; R<1>, R<2> og R5 er H og én av R<3> eller R4 er gruppen -D-NH-CH(R9)-Z, der Z er valgt fra -COOH, fenyl-Ci^alkyl eller -CONH2, eller-COR<10>, der R<10> er valgt fra OCi.6alkyl eller N(R' ')2, hvor R<11> er som definert ovenfor, eller Z kan være 2-okso-l,3,4-oksadiazol; Der-C(O)-; R<9> er valgt fra Ci^alkylfenyl, hvor fenyl kan eventuelt være substituert med Ci-4 alkyl, C1-4 alkoksy, halogen, nitro, amino, trifluormetyl, hydroksyl, cyano, hydroksykarbonyl, fenyl og benzyloksy, Cnsalkyl-heteroaryl der heteroaryl er tienyl, pyridinyl eller kino-lyl, eller R<9> er Ci^alkyl substituert med C3-6cykloalkyl, fenyl(Ci-6alkyl)amino, Ct-6alkyltio eller fenyltio, der fenylgruppen er substituert med Ci^alkyl, eller R<9> er en l,3,4-oksadiazol-2-yl som i 5-stilling eventuelt er substituert med amino, fenylsulfony-lamino eller 3-metylurea, eller Ci.6alkylen substituert substituert med en amingruppe N(A)(6), der A er fenyl eventuelt substituert med et halogenatom og B er valgt fra Ci^alkyl, fenyl, pyrimidinyl, pyridyl eller tiazolyl.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsene med formel I ifølge krav 1, karakterisert ved at a) omsette en forbindelse med formel IV, hvori Pg er en passende beskyttelende gruppe (f.eks. metylester), en amidgruppe eller en hydroksylgruppe og Z, R<8>=H og R<9> er definert som i formel I, med et sy-reklorid eller en aktivert ester av forbindlesen med formel III, hvor Dl er -COOH eller sulfonylhalogen og Rs og R<6> er som definert i formel I, under nærvær av en base, hvis hensiktsmessig, et dehydreringsmiddel i løsning, og, etter fjerning av, den beskyttende gruppen omdanning til en forbindelse med formel I, eller b) omsette en forbindelse med formel IVa, hvori R<8>=H og R<9> er som definert i formel I og E er en N-aminobeskyttende gruppe, med dens karboksyl gruppe koblet via en intermediatkjede L til en poly-merharpiks med formelen PS, som resulterer i en forbindelse med formel V Som, ener selektiv fjerning av den beskyttende gruppen E, omsettes med en forbindelse med formel III, hvor R<5> og R<6> er som definert i formel I, under nærvær av en base, eller, hvis hensiktsmessig, et dehydreringsmiddel for å gi en forbindelse med formel VI og omdanne forbindelsen med formel VI etter fjerning av støttematerialet, til en forbindelse med formel I, eller c) omsette en forbindelse med formel V, etter selektiv fjerning av den beskyttende gruppen E, med en forbindelse med formel VII, hvor Di er -COOH eller sulfonylhalogen og RX er halogen og RY er et radikal -NO2 eller -NH-E og E er en beskyttende gruppe, for å gi en forbindelse med formel VIII og deretter omsettes forbindelsen med formel VEI med en forbindelse med formel DC hvor R<6> er som definert i forbindelse med formel I, for å gi en intermediat-forbindelse med formel Via og deretter enten omdanne intermediatforbindelsen med formet Via til en forbindelse med formel I etter fjerning av støttematerialet eller redusere den f.eks. med tributylfosfin for å gi en forbindelse med formel VI og omdanne den til en forbindelse med formel I etter fjerning av støttematerialet, eller d) omdanne en forbindelse med formel I til et fysiologisk akseptabelt salt.

3. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at det innbefatter en effektiv mengde av minst en forbindelse med formel I ifølge krav 1 sammen med en farmasøytisk egnet og fysiologisk akseptabel eksipient, additiv og/eller andre aktive forbindelser og hjelpestoffer.

4. Anvendelse av minst en forbindelse med formel I for fremstilling av farmasøytiske midler for profylakse og behandling av forstyrrelser valgt blant astma, reumatoid artritt, osteo-artritt, Alzheimers sykdom, karcinome forstyrrelser, hjerteinfarkt, hjerteutilstrekkelighet, akutt koronar syndrom, ustabil angina pectoris, septisk sjokk, akutt og kronisk renalsvikt, slag eller aterosklerose.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk middel, karakterisert ved at den innbefatter å bringe minst en forbindelse med formel I ifølge krav 1 i en egnet administrasjonsform ved anvendelse av en farmasøytisk egnet og fysiologisk akseptabel eksipient, og hvis hensiktsmessig, ytterligere egnede aktive forbindelser, additiver eller hjelpestoffer.