NO320909B1 - Pyrimidinforbindelser, samt anvendelse og fremstilling derav og farmasoytisk preparat. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører pyrimidinforbindelser, samt anvendelse og fremstilling derav og farmasøytisk preparat. Forbindelsene innehar celle-syklus inhibitorisk aktivitet og er følgelig nyttig for deres anticancer (så som anti-celle-proliferativ, anti-celle migrasjon, og/eller apoptotisk) aktivitet og som derfor er nyttige for behandling av menneske- eller dyrelegemet.

WO 95/09852 beskriver N-(fluoralkoksyfenyl)-pyrimidin-amin derivater med protein kinase C inhibitorisk aktivitet som kan anvendes inter alia som antitumor midler.

En familie av intracellulære proteiner betegnet sykliner spiller en sentral rolle i cellesyklusen. Syntese og degradering av sykliner er nært kontrollert slik at deres nivå av ekspresjon varierer i løpet av cellesyklusen. Sykliner bindes til syklin-avhengige serin/treonin kinaser (CDK) og denne assosiasjonen er vesentlig for CDK (så som CDK1, CDK2, CDK4 og/eller CDK6) aktivitet i cellen. Til tross for at de nøyaktige detaljene angående hvordan hver av disse faktorene kombineres for å regulere CDK aktiviteten er ikke helt klarlagte så dikterer balansen mellom disse to om cellen vil få løpe gjennom cellesyklusen.

Nylige oppdagelser innen onkogen og tumor supressor genforskning har identifisert regulering av inngang i cellesyklusen som et hovedkontrollpunkt for mutagenese i tumorer. CDK ser ut til å være nedstrøms for et antall onkogen signaliserende reaksjonsveier. Feilregulering av CDK aktivitet ved oppregulering av sykliner og/eller delesjon av endogene inhibitorer ser ut til å være en viktig akse mellom mitogene signaliserings reaksjonsveier og proliferasjon av tumorceller.

Det er følgelig blitt bestemt at en inhibitor av cellesyklus kinaser, spesielt inhibitorer av CDK2, CDK4 og/eller CDK6 (som opererer i henholdvis S-fasen, G1-s og G1-s fasen) bør være av verdi som en selektiv inhibitor av celleproliferasjon, så som vekst av pattedyr cancer celler.

Det er videre antatt at inhibisjon av fokal addisjon kinase (FAK), som er involvert i signal transduksjons reaksjonsveier, induserer apoptose (celle-død) og/eller inhiberer cellemigrasjon og en inhibitor av FAK kan derfor ha verdi som et anti-cancer middel.

Foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelsen av at visse pyrimidinforbindelser overraskende inhiberer effekter av cellesyklus kinaser som viser selektivitet for CDK2, CDK4 og CDK6, og som også inhiberer FAK og som dermed innehar anti-cancer (anti-celle-migrasjon/proliferasjon og/eller apoptotisk). Slike egenskaper er ventet å være av verdi for behandling av sykdomstilstander assosiert med feil cellesyklus og celleproliferasjon så som cancerformer (faste tumorer og leukemier), fibroproliferative og differensierende forstyrrelser, psoriasis, revmatoid artritt, Kaposis sarkom, haemangiom, akutte og kroniske nefropatier, aterom, aterosklerose, arteriall restenose, autoimmune sykdommer, akutt og kronisk inflammasjon, bensykdommer og okkulære sykdommer med retinal karproliferasjon.

Ifølge oppfinnelsen er det tilveiebrakt et pyrimidinderivat, kjennetegnet ved at den har formelen (I) eller (I'):

hvor:

Rx er valgt fra hydrogen, halogen, Ci-3alkyl;

Qi er fenyl og Qi bærer på et tilgjengelig karbonatom ikke ved siden av

-NH-koblingen en substituent ifølge formel (la):

hvor:

X er -O;

Y<1> er-OH;

Y<2>er H;

Z er-N(Ci-4-alkyl)2;

n er 1, 2 eller 3;

m er 1, 2 eller 3;

og -NQ2 er indolin, piperazin, morfolin, 1, 2, 3, 4-tetrahydrokonolin, benzimidazol eller indol og -NQ2 kan eventuelt og uavhengig bære på et hvilket som helst tilgjengelig karbonatom opp til fire substituenter uavhengig valgt fra halogen, Ci-5alkanoyl,

Ci-6alkyl og dersom en heterocyklisk gruppe i -NQ2 inneholder en -NHgruppe er det nitrogenatomet usubstituert eller substituert med C^alkoksykarbonyl; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester derav.

I beskrivelsen innbefatter betegnelsen "alkyl" både lineære og forgrenede alkylgrupper, men referanser til individuelle alkylgrupper så som "propyl" er spesifikke for kun den lineære versjonen. En analog konvensjon gjelder for andre generiske termer.

Pyrimidinderivat ifølge krav 1 er kjennetegnet ved at substituenten ifølge formel (la) er 3-dimetylamino-2-hydroksypropoksy; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller en in vivo hydrolyserbar ester derav.

Pyrimidinderivat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2 er kjennetegnet ved at substituenten med formel (la) er para for-NH-; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester derav.

Pyrimidinderivat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 er kjennetegnet ved at det er: 2-{4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]anilino}-4-(2,3-dimetylindolin-1-yl)pyrimidin;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester derav.

Et egnet farmasøytisk akseptabelt salt av et pyrimidinderivat ifølge oppfinnelsen er for eksempel et syre-addisjonssalt av et pyrimidinderivat ifølge oppfinnelsen som er tilstrekkelig basisk, for eksempel, et syre-addisjonssalt som for eksempel er en uorganisk eller organisk syre, for eksempel saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, trifluoreddiksyre, sitronsyre eller maleinsyre. I tillegg er et egnet farmasøytisk akseptabelt salt av et pyrimidinderivat ifølge oppfinnelsen som er tilstrekkelig surt et alkalimetallsalt, for eksempel et natrium eller kaliumsalt, et jordalkalisk metallsalt, for eksempel kalsium eller magnesiumsalt, et ammoniumsalt eller et salt med en organisk base som tilveiebringer et fysiologisk-akseptabelt kation, for eksempel et salt med metylamin, dimetylamin, trimetylamin, piperidin, morfolin eller tris-(2-hydroksyetyl)amin.

Forbindelser ifølge formel (I) eller (I') kan bli administrert i form av et promedikament som blir brutt ned i dyre eller menneskekroppen for å tilveiebringe en forbindelse ifølge formel (I) eller (I'). Eksempler på promedikamenter innbefatter in vivo hydrolyserbar ester av en forbindelse ifølge formel (I) eller (I").

En in vivo hydrolyserbar ester av en forbindelse ifølge formel (I) eller (I') inneholdende karboksy eller hydroksygruppe er for eksempel en farmasøytisk akseptabel ester som er hydrolysert i menneske eller dyrekroppen for å produsere opphavssyren eller alkoholen. Egnede farmasøytisk akseptable estere for karboksy innbefatter d-ealkoksymetylestere for eksempel metoksymetyl, Ci-6alkanoyloksymetylestere for eksempel pivaloyloksymetyl, ftalidylestere, C3-8sykloalkoksykarbonyloksyCi-6alkylestere for eksempel 1-sykloheksylkarbonyloksyetyl; 1,3-dioksolen-2-onylmetylestere for eksempel 5-metyl-1,3-dioksolen-2-onylmetyl; og Ci-6alkoksykarbonyloksyetylestere for eksempel 1 -metoksykarbonyloksyetyl og kan bli dannet ved en hvilke som helst karboksygruppe i forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen.

En in vivo hydrolyserbar ester av en forbindelse ifølge formel (I) eller (I') inneholdende en hydroksygruppe innbefatter uorganiske estere så som fosfatestere (inkludert fosforamidinsykliske estere) og a-acyloksyalkylestere og beslektede forbindelser som på grunn av et resultat av in vivo hydrolyse av esternedbrytningen for å tilveiebringe opphavshydroksygrupper. Eksempler på oc-acyloksyalkyletere innbefatteracetoksymetoksy og 2,2-dimetylpropionyloksy-metoksy. En gruppe in vivo hydrolyserbar esterdannende grupper for hydroksy innbefatter alkanoyl, benzoyl, fenylacetyl og substituert benzoyl og fenylacetyl, alkoksykarbonyl (for å tilveiebringe alkylkarbonatestere), dialkylkarbamoyl og N-(dialkylaminoetyl)-N-alkylkarbamoyl (for å tilveiebringe karbamater), dialkylaminoacetyl og karboksyacetyl. Eksempler på substituenter på benzoyl innbefatter morfolino og piperazino koblet fra et nitrogenatom via en metylengruppe til 3- eller 4-posisjonen av benzoylringen.

Noen forbindelser ifølge formel (I) eller (I') kan ha chirale sentre og/eller geometriske isomeriske sentre (E- og Z-isomerer), og det er å bemerke at oppfinnelsen omfatter alle slike optiske, diastereo-isomerer og geometriske isomerer (og blandinger derav) som innehar CDK og/eller FAK inhibitorisk aktivitet.

Oppfinnelsen vedrører hvilke som helst og alle tautomere former av forbindelsene ifølge formel (I) eller (I') som innehar CDK og/eller FAK inhibitorisk aktivitet.

Det er også å bemerke at visse forbindelser ifølge formel (I) eller (I') kan eksistere i solvatert samt usolvaterte former så som for eksempel hydrerte former. Det er å bemerke at oppfinnelsen omfatter alle slike solvaterte former som innehar CDK og FAK inhibitorisk aktivitet.

Foretrukne aspekter ifølge oppfinnelsen er de som er relatert til forbindelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Et pyrimidinderivat ifølge formel (I) eller (I') eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller en in vivo hydrolyserbar ester derav, kan bli fremstilt ved hvilke som helst av fremgangsmåtene kjent for å kunne anvendes for fremstilling av kjemisk-relaterte forbindelser. Slike fremgangsmåter, når anvendt for å fremstille et pyrimidinderivat ifølge formel (I) eller (I'), eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller en in vivo hydrolyserbar ester derav, er gitt som et ytterligere trekk ved oppfinnelsen og er illustrert i følgende representative eksempler hvor (dersom ikke annet er angitt) Qi, -NQ2, Rx, X, Y<1>, Y<2>, Z, m og n har hvilke som helst av betydningene definert ovenfor for et pyrimidinderivat ifølge formel (I) eller (I') og hvis ikke en annen substituent er tegnet på ring Q eller -NQ2 kan ringen bære hvilke som helst av substituentene beskrevet ovenfor (eventuelt beskyttet etter behov). Når en substituent er tegnet på ring Qi innbefatter dette (dersom ikke annet er angitt) muligheter (etter behov) av at substituenten er på ring -NQ2 i tillegg til, eller i stedet for, at substituenten er på ring Qi. Når Q er definert i denne delen som -NH, er det å bemerke at dette også innbefatter muligheten av at X er-NR<y->. Nødvendige utgangsmaterialer kan bli oppnådd ifølge standardprosedyrer innen organisk kjemi (se for eksempel Advanced Organic Chemistry (Wiley-lnterscience), Jerry March - som nyttig for generell rettledning angående reaksjonsbetingelser og reagenser). Fremstilling av slike utgangsmaterialer er beskrevet innenfor vedlagte fremgangsmåter og eksempler. Alternativt kan nødvendige utgangsmaterialer oppnås ved analoge prosedyrer som de illustrert og som hører inn under det som er kjent for fagfolk innen organisk kjemi.

2. 4- pvrimidiner: fremgangsmåter

Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen omfatter følgende fremgangsmåte for å fremstille et pyrimidinderivat ifølge formel (I),

kjennetegnet ved at den omfatter:

a) omsetning av et pyrimidin ifølge formel (II):

hvor L er en forflyttbar gruppe som definert nedenfor, med en forbindelse ifølge formel (III): b) omsetning av et pyrimidin med formel (IV):

hvor L er en forflyttbar gruppe som definert nedenfor, med en forbindelse ifølge

formel (V):

c) for forbindelser med formel (I) hvor n er 1, 2 eller 3, m = 1; ved omsetning av en tre-leddet heteroalkylring inneholdende forbindelse ifølge formel (VI): hvor A er O; med en nukleofil ifølge formel (VII): hvor D er H eller et egnet mot-ion; d) ved omsetning av en alkohol ifølge formel (VIII): med en alkohol ifølge formel (IX):

e) for forbindelser ifølge formel (I) hvor

m er 2 eller 3; omsetning av en forbindelse ifølge formel (X):

hvor LgO er en avspaltbar gruppe som definert nedenfor; med en nukleofil ifølge formel (VII);

og deretter om nødvendig:

i) omdanning av en forbindelse ifølge formel (I) til en annen forbindelse ifølge formel (I);

ii) fjerning av eventuelle beskyttelsesgrupper;

iii) dannelse av et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester.

Spesifikke reaksjonsbetingelser for ovennevnte reaksjoner er som følger: -

fremgangsmåte a)

pyrimidiner ifølge formel (II) og forbindelser ifølge formel (III) kan bli omsatt sammen i) eventuelt i nærvær av en egnet syre, for eksempel en uorganisk syre så som saltsyre eller svovelsyre, eller en organisk syre så som eddiksyre eller maursyre. Reaksjonen blir fortrinnsvis utført i et egnet inert løsningsmiddel eller fortynningsmiddel, for eksempel diklormetan (DCM), acetonitril, butanol, tetrametylensulfon, tetrahydrofuran, 1,2-dimetoksyetan, N,N-dimetylformamid, N,N-dimetylacetamid eller N-metylpyrrolidin-2-one og ved en temperatur i området på for eksempel 0°C til 150°C, hensiktsmessig ved eller nære ved tilbakeløpstemperaturen; eller

ii) under standard Buchwald betingelser (se for eksempel J. Am. Chem. Soc, 118,7215; J. Am. Chem. Soc, 119, 8451; J. Org. Chem., 62,1568 og 6066) for eksempel i nærvær av palladiumacetat, i et egnet løsningsmiddel for eksempel et aromatisk løsningsmiddel så som toluen, benzen eller xylen, med en egnet base for eksempel en uorganisk base så som cesiumkarbonat eller en organisk base så som kalium-t-butoksid, i nærvær av en egnet ligand så som 2,2'-bis(difenylfosfino)-1,1 '-binaftyl og ved en temperatur i området 25 til 80°C.

Pyrimidiner ifølge formel (II) kan bli fremstilt ifølge følgende skjema:

hvor R<*> er en eventuelt substituert alkyl eller arylgruppe og L er en forflyttbar gruppe som definert ovenfor. Det er foretrukket at Ra er metyl, etyl p-tolyl.

Forbindelser med formel (V) og (III) er kommersielt tilgjengelige eller blir fremstilt ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.

fremgangsmåte b)

Pyrimidiner med formel (IV) og forbindelser ifølge formel (V) kan bli omsatt sammen i nærvær av et egnet løsningsmiddel for eksempel et keton så som aceton eller en alkohol så som etanol eller butanol eller et aromatisk hydrokarbon så som toluen eller N-metyl pyrrolidin, eller et løsningsmiddel så som tetrametylensulfon, eventuelt i nærvær av en egnet syre (så som de som er definert for fremgangsmåte a) ovenfor eller en Lewis syre) eller base (så som Hunigs base eller kalsiumkarbonat) og ved en temperatur i området 0°C til tilbakeløp, fortrinnsvis tilbakeløp.

Pyrimidiner ifølge formel (IV) kan bli fremstilt ifølge følgende skjema:

Forbindelser ifølge formet (IVA), (ill) og (V) er kommersielt tilgjengelige og blir fremstilt ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet. For eksempel kan pyrimidiner ifølge formel (IVA) bli fremstilt for eksempel ved omsetning av en forbindelse ifølge formel (IVA) hvor L er-OH (dvs. en uracil), med POCta for å tilveiebringe en forbindelse ifølge formel (IVA) hvor L er -Cl.

fremgangsmåte c)

Tre-leddet heteroalkylring inneholdende forbindelser med formel (VI) og nukleofiler med formel (VII) blir omsatt sammen ved en temperatur i området 20°C til 100°C, fortrinnsvis 20°C til 50°C, eventuelt i nærvær av et egnet løsningsmiddel,foreksempel N,N-dimetylformamid, dimetylsulfoksid eller tetrahydrofuran.

Forbindelser med formel (VI) kan bli fremstilt ifølge følgende skjemaer:

Omdanning av (VIB) til (VI) kan også bli oppnådd ved omsetning med Br-(CH2)n-CHO, eller en ekvivalent ester, i DM F og tilstedeværelse av en base, etterfulgt av omsetning med et svovelylid så som (Me2SOCH2) i et inert løsningsmiddel så som THF (se skjema V).

(for PhINT se for eksempel, Tet.Let., 1997, 38 (39), 6897-6900; forbindelser ifølge formel (VIC) kan også bli oksidert til epoksid ved anvendelse av betingelser som ligner de i skjema IV) nedenfor); hvor R<3> sammen med -COO-gruppen hvortil den er koblet danner en estergruppe, for eksempel en metylester eller en etylester.

(VU) blir omsatt med (IV) (ifølge skjema 1) for å tilveiebringe (VI).

En ekvivalent ester av (VIH) kan også bli anvendt. Se også Russ. Chem. Rev. 47, 975-990, 1978.

Forbindelser ifølge formel (VIH), (VII) og (VIA) og (VIE) er kommersielt tilgjengelige eller blir fremstilt ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.

Fremgangsmåte d)

Alkoholer (for eksempel fenoler) ifølge formel (VIII) og (IX) kan bli omsatt sammen under standard Mitsunobu betingelser. For eksempel i nærvær av dietylazodikarboksylat og trifenylfosfin i et egnet løsningsmiddel så som diklormetan, toluen eller tetrahydrofuran, og ved en temperatur i området 0° til 80°C, fortrinnsvis i området 20° til 60°C. Alternativt kan alkoholer ifølge formel (VIII) bli alkylert med en egnet forbindelse ifølge formel (IX) hvor terminal hydroksygruppe er blitt erstattet av en egnet avspaltbar gruppe.

Alkoholer ifølge formel (VIII) blir dannet ifølge skjema I) ovenfor for syntese av mellomprodukt (VIB) (hvor X er oksygen).

Alkoholer ifølge formel (IX) er kommersielt tilgjengelige og blir dannet ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.

I en fremgangsmåte analog med fremgangsmåte d) kan forbindelser hvor X er - S- bli fremstilt ved omsetning av en forbindelse ifølge formel (VIII) hvor hydroksygruppen er-SH, med en forbindelse ifølge formel (IX) hvor hydroksygruppen er en avspaltbar gruppe så som mesylat eller tosylat.

Fremgangsmåte e)

Forbindelser ifølge formel (X) hvor X er-CH2-, -O-, -NH- eller-S-; Y<1> er OH; Y<2 >er H og m er 2 eller 3 og nukleofiler ifølge formel (VII) blir omsatt sammen ved en temperatur i området 20°C til 100°C, fortrinnsvis 20° til 50°C, eventuelt i nærvær av et egnet løsningsmiddel, for eksempel N,N-dimetylformamid, dimetylsulfoksid eller tetrahydrofuran og eventuelt i nærvær av en egnet base så som kaliumkarbonat.

Forbindelser ifølge formel (X) blir fremstilt ifølge følgende skjema (m er 2 eller 3):

Rekkefølgen av trinnene 1) og 2) i det endelige trinnet kan bli reversert. En egnet base for trinn 2) er trietylamin.

Forbindelser ifølge formel (XA) og (VII) er kommersielt tilgjengelige og blir fremstilt ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet. For eksempel kan forbindelser ifølge formel (XA) hvor X er -NH-, -O- eller -S- bli fremstilt ved omsetning av en forbindelse ifølge formel (VIA) med en egnet halogenaldehyd eller ekvivalent ester under standardbetingelser for slike reaksjoner.

Fremgangsmåte f

Forbindelser ifølge formel (XI) og nukleofiler ifølge formel (VII) blir omsatt sammen som beskrevet for fremgangsmåte e) ovenfor.

Forbindelser ifølge formel (XI) blir fremstilt på analog måte som trinn 2) i det endelige trinnet av fremgangsmåten for fremstilling av forbindelser ifølge formel

(X) ovenfor. Nødvendige primære alkoholutgangsmaterialer er kommersielt tilgjengelige eller blir fremstilt ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.

Fremgangsmåte a

Forbindelser med formel (XII) og (XIII) blir omsatt i et inert løsningsmiddel så som DMF i nærvær av en base så som kaliumkarbonat. Forbindelser med formel (XII) har samme generiske formel som forbindelser med formel (VIB) beskrevet heri og blir fremstilt som beskrevet for de forbindelsene (se skjema I). Forbindelser med formel (XIII) er kommersielt tilgjengelige eller blir fremstilt ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.

Fremgangsmåte f

For forbindelser ifølge formel (I) hvor Z er SH blir omdanning av en tioacetatgruppe til tilsvarende forbindelse blir utført som beskrevet heri for omdanning av forbindelser ifølge formel (IJ) til (IK).

Egnede utgangsmaterialer inneholdende en tioacetatgruppe blir fremstilt fra tilsvarende forbindelser inneholdende en avspaltbar gruppe så som mesylat eller tosylat (fremstilt ved anvendelse av standardbetingelser fra tilsvarende hydroksyforbindelse) ved anvendelse av tiol eddiksyre som beskrevet heri for omdanning av forbindelser ifølge formel (IG) til (IJ).

Eksempler på omdanninger av en forbindelse ifølge formel (I) til en annen forbindelse ifølge formel (I) er: Omdanning i) av en sidekjede ifølge formel (la) eller (la') til en annen sidekjede ifølge formel (la) eller (la'), for eksempel: Omdanning I) for forbindelser ifølge formel (I) hvor Y<1> er H og Y<1> er NH2 (angitt nedenfor ved anvendelse av ammoniakk), Ci^alkoksy, Ci^alkyltio, -NH Ci-4alkyl, -N[Ci-4alkyl]2, pyrrolidin-1-yl, piperidin-1-yl, piperazin-1-yl, morfolino eller tiomorfolino;

eller

omdanning II) for forbindelser ifølge formel (I) hvor Y2 er H og Y<1> er S:

Omdanning III) for forbindelser med formel (I) hvor Y<1> er H og Y<2> er H:

Omdanning ii) av en verdi av Rx til en annen verdi av Rx ved anvendelse av standardteknikker, for eksempel, omdanning av Rx som hydroksy til Ci-3alkoksy.

Fagfolk vil vite at manipulering av sidekjeden (la) eller (la') beskrevet i fremgangsmåtene c) og d) ovenfor også kan bli utført på mellomprodukter for eksempel for å danne mellomprodukter ifølge formlene (II), (MA), (NB) eller (V). For eksempel:

4, 6- pvrimidiner: fremgangsmåter

som et ytterligere trekk ved oppfinnelsen er det følgelig tilveiebrakt følgende fremgangsmåte for fremstilling av et pyrimidinderivat ifølge formel (I'), kjennetegnet ved at den omfatter:

a) omsetning av et pyrimidin ifølge formel (II'):

hvor L er en forflyttbar gruppe som definert nedenfor, med en forbindelse ifølge

formel (III'):

b) omsetning av et pyrimidin ifølge formel (IV):

hvor L er en forflyttbar gruppe som definert nedenfor, med en forbindelse ifølge

formel (V):

c) for forbindelser med formel (I') hvor n er 1, 2 eller 3, m = 1, omsetning av en tre-leddet heteroalkylring ifølge formel (VI'): hvor A er O; med en nukleofil ifølge formel (VII'): hvor D er H eller et egnet mot-ion; d) for forbindelser ifølge formel (I') hvor X er oksygen, ved omsetning av en alkohol ifølge formel (VIII'): med en alkohol ifølge formel (IX'): e) for forbindelser med formel (I') hvor m er 2 eller 3; omsetning av en forbindelse ifølge formel (X'):

hvor LgO er en avspaltbar gruppe som definert nedenfor; med en nukleofil ifølge formel (VII');

og deretter om nødvendig:

i) omdanning av en forbindelse ifølge formel (I') til en annen forbindelse ifølge formel (I');

ii) fjerning av eventuelle beskyttelsesgrupper;

iii) dannelse av et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester.

Dersom ikke angitt på annen måte er verdien av variablene (så som L og D) i denne 4,6-pyrimidin fremgangsmåte delen som beskrevet i ovennevnte 2,4-pyrimidin fremgangsmåtedel.

Spesifikke reaksjonsbetingelser for ovennevnte 4,6-pyrimidin fremgangsmåte reaksjoner er som følger:

fremgangsmåte a')

pyrimidiner ifølge formel (II') og forbindelser ifølge formel (III') kan bli omsatt sammen som beskrevet i ovennevnte 2,4-pyrimidin fremgangsmåte a).

Pyrimidiner ifølge formel (II') kan bli fremstilt ifølge følgende skjema:

Forbindelser ifølge formel (III') er kommersielt tilgjengelige eller blir fremstilt ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.

fremgangsmåte b')

pyrimidiner ifølge formel (IV) og forbindelser ifølge formel (V) kan bli omsatt sammen som beskrevet i ovennevnte 2,4-pyrimidiner fremgangsmåte b)-Pyrimidiner ifølge formel (IV) blir fremstilt ifølge følgende skjema:

hvor L er en forflyttbar gruppe som definert ovenfor.

Forbindelser ifølge formel (V) er kommersielt tilgjengelige eller kan bli fremstilt ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.

fremgangsmåte c')

Tre ledd av heteroalkylringene ifølge formel (VI') og nukleofiler ifølge formel (VII') blir omsatt sammen som beskrevet i ovennevnte 2,4-pyrimidiner fremgangsmåte c).

Forbindelser ifølge formel (VI') kan bli fremstilt ifølge skjemaer analoge med skjemaene I) til IV) som beskrevet ovenfor i 2,4-pyrimidin fremgangsmåtedelen (men ved anvendelse av 4,6-pyrimidin forbindelser i stedet for 2,4-pyrimidiner vist i ovennevnte skjemaer).

Forbindelser ifølge formel (VII') og nødvendige mellomprodukter er kommersielt tilgjengelige eller blir fremstilt ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet (analogt med 2,4-pyrimidin fremgangsmåtedelen c) beskrevet ovenfor).

fremgangsmåte d')

Alkoholer ifølge formel (VIII') og (IX') kan bli omsatt sammen under standard Mitsunobu betingelser som beskrevet i ovennevnte 2,4-pyrimidin fremgangsmåte d).

Alkoholer ifølge formel (VIII') blir dannet analogt med 2,4-pyrimidin fremgangsmåte delen d) beskrevet ovenfor.

Alkoholer ifølge formel (IX') er kommersielt tilgjengelig eller blir dannet ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.

Fremgangsmåte e')

Forbindelser ifølge formel (X') og (VII') kan bli omsatt sammen under standardbetingelser som beskrevet i ovennevnte 2,4-pyrimidin fremgangsmåte

e) .

Forbindelser ifølge formel (X') blir dannet analogt med 2,4-pyrimidin

fremgangsmåte delen d) beskrevet ovenfor.

Forbindelser ifølge formel (VII') er kommersielt tilgjengelig eller blir dannet ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.

Fremgangsmåte f)

Forbindelser ifølge formel (XI') og (VII') kan bli omsatt sammen under standardbetingelser som beskrevet i ovennevnte 2,4-pyrimidin fremgangsmåte

f) -

Forbindelser med formel (X'll) blir dannet analogt med 2,4-pyrimidin

fremgangsmåte del d) beskrevet ovenfor.

Fremgangsmåte a')

Forbindelser ifølge formel (XII') og (XIII') kan bli omsatt sammen under standardbetingelse som beskrevet i ovennevnte 2,4-pyrimidin fremgangsmåte

g)<->

Forbindelser ifølge formel (X'll) blir dannet analogt med 2,4-pyrimidin

fremgangsmåte del d) beskrevet ovenfor.

Forbindelser ifølge formel (XIII') er kommersielt tilgjengelig eller blir dannet ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.

Fremgangsmåte h')

Omdanning av tioacetat kan bli oppnådd ifølge standardbetingelser som beskrevet i ovennevnte 2,4-pyrimidin fremgangsmåte h).

Eksempler på omdanning av en forbindelse ifølge formel (I') til en annen forbindelse ifølge formel (I') er analog ved omdanningene I) til III) beskrevet ovenfor for 2,4-pyrimidiner ifølge formel (I), for eksempel, omdanning av en sidekjede ifølge formel (la) eller (la') til en annen sidekjede ifølge formel (la) eller (la') (men ved anvendelse av 4,6-pyrimidin forbindelser i stedet for 2,4-pyrimidiner vist i ovennevnte omdanninger).

Når det gjelder omdanningene beskrevet ovenfor for 2.4-pyrimidiner med formel (I) vil fagfolk dra nytte av at manipulering av sidekjeden (la) eller (la') som er beskrevet kan også bli utført på mellomprodukter (analogt med 2,4-pyrimidin fremgangsmåte del d) beskrevet ovenfor).

Det er å bemerke at visse at de forskjellige ringsubstituentene i forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli introdusert ved standard aromatiske substitusjonsreaksjoner eller dannet ved konvensjonelle funksjonelle gruppemodifikasjoner enten før eller rett etter fremgangsmåtene beskrevet ovenfor, og er følgelig inkludert i fremgangsmåteaspektet ifølge oppfinnelsen. Slike reaksjoner og modifikasjoner innbefatter for eksempel introduksjon av en substituent ved hjelp av en aromatisk substitusjonsreaksjon, reduksjon av substituenter, alkylering av substituenter og okidasjon av substituenter. Reagensene og reaksjonsbetingelser for slike prosedyrer er velkjente innenfor det kjemiske området. Spesielle eksempler på aromatiske substitusjonsreaksjoner innbefatter introduksjon av en nitrogruppe ved anvendelse av konsentrert svovelsyre, introduksjon av en acylgruppe ved anvendelse av for eksempel et acylhalid og en Lewis syre (så som aluminium triklorid) under Friedel Crafts betingelser; introduksjon av en alkylgruppe ved anvendelse av et alkylhalid og Lewis syre (så som aluminiumtriklorid) under Friedel Crafts betingelser; og introduksjon av en halogengruppe. Spesielle eksempler på modifikasjoner innbefatter reduksjon av en nitrogruppe til en aminogruppe ved for eksempel katalytisk hydrogenering med en nikkel katalysator eller behandling med jern i nærvær av saltsyre med oppvarming; oksidasjon av alkyltio til alkylsulfinyl eller alkylsulfonyl.

Det er også å bemerke at i noen av reaksjonene nevnt heri kan det være nødvendig/ønskelig å beskytte eventuelle sensitive grupper i forbindelsene. I de tilfellene hvor beskyttelse er nødvendig eller ønskelig og egnede metoder for beskyttelse er kjent for fagfolk innenfor dette området. Konvensjonelle beskyttelsesgrupper kan bli anvendt i henhold til standardpraksis (for illustrasjon se T.W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 1991). Dersom reaktanter dermed innbefatter grupper så som amino, karboksy eller hydroksy kan det være ønskelig å beskytte gruppen i noen av reaksjonene nevnt heri.

En egnet beskyttelsesgruppe for en amino eller alkylaminogruppe er for eksempel en acylgruppe, for eksempel en alkanoylgruppe så som acetyl, en alkoksykarbonylgruppe, for eksempel en metoksykarbonyl, etoksykarbonyl eller t-butoksykarbonylgruppe, en arylmetoksykarbonylgruppe, for eksempel benzyloksykarbonyl, eller en aroylgruppe, for eksempel benzoyl. Betingelser for avbeskyttelse av ovennevnte beskyttelsesgrupper vil nødvendigvis variere med valg av beskyttelsesgruppe. Dermed kan for eksempel en acylgruppe så som en alkanoyl eller alkoksykarbonylgruppe eller en aroylgruppe for eksempel bli fjernet ved hydrolyse med en egnet base så som et alkalimetallhydroksid, for eksempel litium eller natriumhydroksid. Alternativt kan en acylgruppe så som en t-butoksykarbonylgruppe for eksempel bli fjernet ved behandling med en egnet syre som saltsyre, svovelsyre eller fosforsyre eller trifIfuoreddiksyre og en arylmetoksykarbonylgruppe så som en benzyloksykarbonylgruppe kan for eksempel bli fjernet ved hydrogenering over en katalysator så som palladium-på-karbon, eller ved behandling med en Lewis syre for eksempel bor tris(trifluoracetat). En egnet alternativ beskyttelsesgruppe for en primær aminogruppe er for eksempel en ftaloylgruppe som kan bli fjernet ved behandling med et alkylamin, for eksempel dimetylaminopropylamin eller med hydrazin.

En egnet beskyttelsesgruppe for en hydroksygruppe er for eksempel en

acylgruppe, for eksempel en alkanoylgruppe så som acetyl, en aroylgruppe, for eksempel benzoyl, eller en arylmetylgruppe, for eksempel benzyl. Betingelse for avbeskyttelse av ovennevnte beskyttelsesgrupper vil nødvendigvis variere med valg av beskyttelsesgruppe. Dermed kan for eksempel en acylgruppe så som en alkanoyl eller en aroylgruppe for eksempel bli fjernet ved hydrolyse med en egnet base så som et alkalimetallhydroksid, for eksempel litium eller natriumhydroksid. Alternativt kan en arylmetylgruppe så som en benzylgruppe for eksempel bli fjernet ved hydrogenering over en katalysator så som palladium-på-karbon.

En egnet beskyttelsesgruppe for en karboksygruppe er for eksempel en forestringsgruppe, for eksempel en metyl eller en etylgruppe som for eksempel kan bli fjernet ved hydrolyse med en base så som natriumhydroksid, eller for eksempel en t-butylgruppe som kan bli fjernet, for eksempel, ved behandling med en syre, for eksempel en organisk syre så som trifluoreddiksyre, eller for eksempel en benzylgruppe som for eksempel kan bli fjernet ved hydrogenering over en katalysator så som palladium-på-karbon.

Beskyttelsesgrupper kan bli fjernet ved et hvilket som helst hensiktsmessig trinn i syntesen ved anvendelse av konvensjonelle teknikker velkjente innenfor det kjemiske området.

Mange av mellomproduktene definert heri er nye, for eksempel de med formel II og IV og disse er gitt som ytterligere trekk ved oppfinnelsen.

ANALYSER

Som angitt ovenfor innehar pyrimidinderivatet definert i foreliggende oppfinnelse anti-celle-proliferasjonsaktivitet så som anti-cancer aktivitet som antas å skyldes CDK og/eller FAK inhibitorisk aktivitet til forbindelsen. Disse egenskapene kan for eksempel bli vurdert ved anvendelse av prosedyren angitt nedenfor:

CDK4 inhibisionsanalvse

Følgende forkortelser er blitt anvendt:

HEPES er N-(2-hydroksyetyl)piperazin-N'-(2-etansulfonsyre)

DTT er ditiotreitol

PMSF er fenylmetylsulfonylfluorid

Forbindelsene ble testet i en in vitro kinase analyse i 96 brønn format ved anvendelse av scintillasjons proksimitetsanalyse (SPA - oppnådd fra Amersham) for måling av innkorporering av [Y-33-P]-adeonosin trifosfat inn i et testsubstrat (GST-retinoblastom). I hver brønn ble forbindelsen som skulle bli testet plassert (fortynnet i DMSO og vann for å korrigere konsentrasjoner) og i kontrollbrønner enten p16 som en inhibitorkontroll eller DMSO som en positiv kontroll.

Omtrent 0,5 jil CDK4/syklin D1 delvis-renset enzym (mengde avhengig av enzymaktivitet) fortynnet i 25 uJ inkubasjonsbuffer ble tilsatt til hver brønn og deretter 20 uJ GST-Rb/ATP/ATP33 blanding (inneholdende 0,5 jig GST-Rb og 0,2 U.M ATP og 0,14 jiCi [y-33-P]-adenosin trifosfat) og resulterende blanding ble forsiktig ristet og deretter inkubert ved romtemperatur i 60 minutter.

Til hver brønn ble det deretter tilsatt 150 |il stoppløsning inneholdende (0,8 mg/brønn protein A-PVT SPA kule (Amersham)), 20pM/brønn anti-glutation transferase, kanin IgG (oppnådd fra Molecular Probes), 61 mM EDTA og 50 mM HEPES pH 7,5 inneholdende 0,05% natriumazid.

Platene ble forseglet med Topseal-S plateforsegler, latt stå i 2 timer og deretter sentrifugert ved 2500rpm, 1124xg, i 5 minutter. Platene ble avlest på en Topcount i 30 sekunder per brønn.

Inkubasjonsbufferen anvendt for å fortynne enzym og substratblandinger inneholdt 50 mM HEPES pH 7,5,10mM MnCI2,1mM DTT, 100 um natrium vanadat, 100 jim NaF, 10 mM natriumglycerofosfat, BSA (1 mg/ml endelig).

Som en kontroll kan en annen kjent inhibitor av CDK4 bli anvendt i stedet for p16.

Testsubstrat

I denne analysen ble kun del av retinoblastom (Science 1987 Mar13; 235

(4794): 1394-1399; Lee W. H., Bookstein R., Hong F., Young L.J., Shew J.Y., Lee E.Y.) anvendt, kondensert til en GST tag. PCR av retinoblastoma aminosyrene 379-928 (oppnådd fra retinoblastoma plasmid ATCC pLRbRNL) ble utført, og sekvensen klonet inn i pGEX 2T fusjonsvektoren (Smith D. B. and Johnson, K.S. Gene 67, 31 (1988); som inneholdt en tac promoter for induserbar ekspresjon, indre lac I<9> gen for anvendelse i en hvilke som helst E. coli vert, og en kodende region for trombin spaltning, oppnådd fra Pharmacia Biotech) som ble anvendt for å amplifisere aminosyrene 792-928. Denne sekvensen ble deretter klonet inn i pGEX 2T.

Retinoblastom 792-928 sekvensen oppnådd på denne måten ble uttrykt i E. Coli (BL21 (DE3) pLysS celler) ved anvendelse av standard induserbare ekspresjonsteknikker, og renset som følger.

E. coli pasta ble resuspendert i 10 ml/g NETN buffer (50 mM tris pH 7,5,120 mM NaCI, 1mM EDTA, 0,5% v/v NP-40, 1 mM PMSF, 1 u.g/ml leupeptin, 1 u.g/ml aprotinin og 1 jig/ml pepstatin) og sonikert i 2 x 45 sekunder på 100 ml homogenat. Etter sentrifugering ble supernatanten belastet på en 10 ml glutation Sepharose kolonne (Pharmacia Biotech, Herts, UK) og vasket med NETN buffer. Etter vasking med kinasebuffer (50 mM HEPES pH 7,5,10 mM MgCI2, 1 mM DTT, imM PMSF, 1 ug/ml leupeptin, 1 jxg/ml aprotinin og 1 u.g/ml pepstatin) proteinet ble eluert med 50 mM redusert glutation i kinasebuffer. Fraksjoner inneholdende GST-Rb(792-927) ble slått sammen og dialysert over natt mot kinasebuffer. Det endelige produktet ble analysert ved natrium Dodeca Sulfate (SDS) PAGE (polyakrylamid gel) ved anvendelse av 8-16% Tris-glycin geler (Novex, San Diego, USA).

CDK4 og svklin D1

CDK4 og syklin D1 ble klonet fra RNA fra MCF-7 cellelinje (oppnådd fra ATCC nummer: HTB22, brystadenokarsinomlinje) som følger. RNA ble dannet fra MCF-7 celler, deretter revers transkribert ved anvendelse av oligo dT primere. PCR ble anvendt for å amplifisere den fullstendige kodende sekvensen til hvert gen [CDK4 aminosyrer 1-303; Ref. Cell 1992 Oet 16; 71(2): 323-334; Matsushime H., Ewen M. E., Stron D.K., Kato J.Y., Hanks S. K., Roussel M.F., Sherr C.J. og syklin D1 aminosyrer 1-296; Ref. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1991; 56;93-97; Arnold A., Motokura T., Bloom T., Kronenburg, Ruderman J., Juppner H., Kim H.G.].

Etter sekvensering ble PCT produktene klonet ved anvendelse av standardteknikker inn i insektsekspresjonsvektor pVL1393 (oppnådd fra Invitrogen 1995 katalog nummer: V1392-20). PCR produktene ble deretter dobbelt uttrykt [ved anvendelse av en standard virus baculogold ko-infeksjonsteknikk] inn i insekt SF21 cellesystemet (Spodoptera Frugiperda celler avledet fra ovarie vev til Fall Army Worm-kommersielt tilgjengelig).

Følgende eksempel angir detaljer for produksjon av syklin D1/CDK4 i SF21 celler (i TC100 + 10% FBS(TCS) + 0,2% Pluronic) med dobbelt infeksjon MOI 3 for hvert virus av syklin D1 & CDK4.

Eksempelvis produksjon av svklin D1/ CDK4

SF21 celler dyrket i rullef laskekultur til 2,33 x 106 celler/ml ble anvendt for å inokulere 10 x 500 ml rulleflasker ved 0,2 x 10E6 celler/ml. Rullef laskene ble inkubert på en rulleinretning ved 28°C.

Etter 3 dager (72 timer) ble cellene opptelt og gjennomsnittet fra 2 flasker funnet å være 1,86 x 10E6 celler/ml. (99% levedyktighet). Kulturene ble deretter infisert med dobbelt viruser ved en MOI 3 for hvert virus. 10 x 500 ml ble infisert med JS303 syklin D1 virus titer - 9 x 10E7 pfu/ml. JS304 CDK4 virus titer - 1 x 10E8 pfu/ml.

Viruser ble blandet sammen før tilsetning til kulturene, og kulturene ble returnert til rulleinnretningen ved 28°C.

Etter 3 dager (72 timer) postinfeksjon ble 5 liter av kulturen høstet. Det totale celleantallet som ble høstet var 1,58 x 10E6 celler/ml (99% levedyktighet). Cellene ble sentrifugert ved 2500 rpm, 30 min., 4°C i Heraeus Omnifuge 2.0RS

i 250 ml mengder. Supernatanten ble kastet.

20 pelleter med ~ 4 x 10E8 celler/pellet ble hurtigfrosset i LN2 og lagret ved - 80°C i CCRF kaldt rom. SF21 cellene ble deretter hypotonisk lysert ved resuspendering i lyseringsbuffer (50 mM HEPES pH 7,5,10 mM magnesiumklorid, 1 mM DTT, 10 mM glycerofosfat, 0,1 mM PMSF, 0,1 mM natriumfluorid, 0,1 mM natrium ortovanadat, 5 u.g/ml aprotinin, 5 u.g/ml leupeptin og 20% v/v sukrose), og tilsetning av iskaldt deionisert vann. Etter sentrifugering ble supernatanten applisert på en Poros HQ/M 1,4/100 anion byttekolonne (PE Biosystems, Hertford, UK). CDK4 og syklin D1 ble koeluert med 375 mM NaCI i lyseringsbuffer, og deres tilstedeværelse ble undersøkt ved western blot ved anvendelse av egnede anti-CDK4 og anti-syklin D1 antistoffer (oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, California, US).

p16 kontroll ( Nature 366: 704- 707: 1993: Serrano M. Hannon GJ. Beach D p16 (naturlig inhibitor av CDK4/syklin D1) ble amplifisert fra HeLa cDNA (Hela celler oppnådd fra ATCC CCL2, human epiteloid karsinom fra cervix; Cancer Res. 12: 264,1952), klonet inn i pTB 375 NBSE som hadde en 5' His tag og transformert ved anvendelse av standardteknikker inn i BL21 (DE3) pLysS celler (oppnådd fra Promega; Ref. Studier F.W. og Moffat B.A., J. Mol. Biol., 189, 113,1986). En 1 liter kultur ble dyrket til hensiktsmessig OD og deretter inkubert med IPTG for å uttrykke p16 over natt. Cellene ble deretter lysert ved sonikering i 50 mM natriumfosfat, 0,5 M natriumklorid, PMSF, 0,5 |ig/ml leupeptin og 0,5 jig/ml aprotinin. Blandingen ble sentrifugert ned, supernatanten ble tilsatt til nikkel chelaterte kuler og blandet i 1,5 time. Kulene ble vasket i natriumfosfat NaCI pH 6,0 og p16 produkt eluert i natriumfosfat NaCI pH 7,4 med 200 mM imidazol.

pTB NBSE ble konstruert fra pTB 375 NBPE som følger:

PTB375

Bakgrunnsvektoren anvendt for dannelse av pTB 375 var pZEN0042 (se UK patent 2253852) og inneholdt tetA/tetR induserbar tetrasyklin resistens sekvens fra plasmid RP4 og cer stabilitetssekvensen fra plasmid pKS492 i en pAT153 avledet bakgrunn. pTB375 ble dannet ved tilsetning av en ekspresjonskassett bestående av T7 gen 10 promoter, multippelt kloningssete og T7 gen 10 termineringssekvens. I tillegg ble en terminatorsekvens konstruert for å redusere transkripsjonen gjennomlesning fra bakgrunnsvektoren inkludert oppstrøms for ekspresjonskassetten.

<p>TB 375 NBPE

Det unike EcoRI restriksjonssetet tilstede i pTB 375 ble fjernet. Et nytt multippelt kloningssete inneholdende gjenkjenningssekvenser for restriksjonsenzymene Ndel, BamHI, Pstl og EcoRI ble introdusert i pTB 375 mellom Ndel og BamHI seter som ødelegger det opprinnelige BamHI setet tilstede i pTB 375.

PTB 375 NBSE

En nytt multippelt kloningssete inneholdende gjenkjenningssekvenser for restriksjonsenzymene Ndel, BamHI, Smal og EcoRI ble introdusert inn i pTB 375 NBPE mellom Ndel og EcoRI setene. Oligonukleotidet inneholdende disse restriksjonssetene inneholdt også 6 histidinkodoner beliggende mellom Ndel og BamHI setene i samme leserramme som initiatorkodon (ATG) tilstede i Ndel setet.

Analogt med en ovennevnte kan analyser konstruert for å vurdere inhibisjon av CDK2 og CDK6 bli konstruert. CDK2 (EMBL aksesjonsnr. X62071) kan bli anvendt sammen med syklin A eller syklin E (se EMBL aksesjonsnr. M73812) og ytterligere detaljer for slike analyser er innbefattet i PCT internasjonale publikasjon nr. W099/21845, relevante Biochemical & Biological Evaluation del er herved innkorporert som referanse.

Dersom det anvendes CDK2 med syklin E delvis ko-rensing kan bli oppnådd som følger: Sf21 celler blir resuspendert i lyseringsbuffer (50 mM tris pH 8,2, 10 mM MgCl2,1 mM DTT, 10 mM glycerofosfat, 0,1 mM natriumortovanadat, 0,1 mM NaF, 1 mM PMSF, 1 u.g/ml leupeptin og 1 |ig/ml aprotinin) og homogenisert i 2 minutter i en 10 ml Dounce homogenisator. Etter sentrifugering blir supernatanten applisert på en Poros HQ/M 1,4/100 anion byttekolonne (PE Biosystems, Hertford, UK). CDK2 og syklin E blir koeluert i begynnelsen av en 0-1 NaCI gradient (kjørt i lyseringsbuffer minus protease inhibitorer) over 20 kolonne volum. Koeluering blir undersøkt ved western blot ved anvendelse av både anti-CDK2 og anti-syklin E antistoff (Santa Cruz Biotechnology, California,

US).

FAK3 kinase inhibisionsanalvse

Denne analysen bestemmer evnen som en testforbindelse har til å inhibere tyrosinkinase aktiviteten av human fokal adhesjonskinase (FAK).

DNA kodende for FAK blir oppnådd ved total gensyntese (Edwards M, International Biotechnology Lab 5(3), 19-25,1987) eller ved kloning. Disse blir deretter uttrykt i et egnet ekspresjonssystem for å oppnå polypeptidet med tyrosinkinase aktivitet. For eksempel ble FAK oppnådd ved ekspresjon av rekombinant protein i insektsceller funnet å utvise intrinsisk tyrosinkinaseaktivitet.

FAK (fullengde human cDNA beskrevet av Andre et al (Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993,190(1): 140-147; EMBL/GenBank aksesjonsnr. L05186)) ble modifisert slik at det resulterende proteinet som ble translatert hadde en 6-histidin tag ved den N-terminale enden som følger etter startmetionin. Aktivt FAK protein er tidligere blitt uttrykt i et bakulovirus system ved anvendelse av en lignende N-terminal 6-histidin tag (Protein Expression And Purification, 1996, 7:12-18). Human FAK cDNA ble klonet inn i bakulovirus transplacement vektor pFastbac 1 (Life Technologies) og den rekombinante konstruksjonen ble ko-transfektert inn i insektsceller (for eksempel Spodoptera frugiperda 21 (Sf21)) med viral DNA for å danne rekombinant bakulovirus (detaljer angående metoder for oppstilling av rekombinante DNA molekyler og preparering og anvendelse av rekombinant bakulovirus finnes i standardtekster foreksempel Sambrook et al, 1989, Molecular doning - A Laboratory Manual, 2nd edition, Cotd Spring Harbour Laboratory Press and 0'Reilly et al, 1992, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Co, New York. Detaljer spesifikke for anvendelse av pFastbac ('Bae til Bae') system er angitt i Anderson et al., 1995, FOCUS (Life Technologies Bulletin Magazine), 17, s53).

For ekspresjon av biologisk aktivt humant FAK protein ble Sf21 celler infisert med plakk-rent FAK rekombinant virus ved en multiplisitet for infeksjon på 3 og høstet 48 timer senere. Høstede celler ble vasket med iskald fosfatbufret saltvannsløsning (PBS) (10 mM natriumfosfat pH 7,4,138 mM natriumklorid, 2,7 mM kaliumklorid) og deretter resuspendert i iskald lyseringsbuffer (50 mM HEPES pH 7,5,1 mM ditiotreitol, 100 uJvl natriumfluorid, 100 uM natriumortovanadat, 10 mM glycerofosfat, 100 u.M fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 5 ug/ml aprotinin, 5 u.g/ml leupeptin, 1% Tween; PMSF blir tilsatt like før bruk fra en friskt dannet 100 mM løsning i metanol) ved anvendelse av 250 jil lyseringsbuffer per 10 millioner celler. Suspensjonen ble deretter inkubert på is i 15 minutter og sentrifugert i 10 minutter ved 13000 rpm ved 4°C. Supernatanten (enzym stamløsning) ble fjernet og alikvoter dannet som ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og deretter lagret ved -70°C. For en typisk batch ble enzym stamløsning fortynnet 1 i 250 med enzymfortynningsmiddel ((100 mM HEPES pH 7,4, 0,2 mM ditiotreitol, 200 uM natriumotrovanadat, 0,1% Triton X-100) og 50 ml friskt fortynnet enzym ble anvendt for hver analysebrønn (se FAK3 protokollen nedenfor).

FAK3: In vitro enzym analyse protokoll

En stamløsning av substratløsningen ble dannet fra en tilfeldig kopolymer inneholdende tyroisin, for eksempel Poly (Glu, Ala, Tyr) 6:3:1 (Sigma P3899), lagret som 1 mg/ml stamløsning i PBS ved -20°C og fortynnet 1 til 500 med PBS for platebelegging.

På dagen før analysen ble 100 \ i\ fortynnet substratløsning dispensert inn i alle brønnene til analyseplatene (Maxisorp 96 brønn immunoplater Life technologies, Cat. No. 439454A) som ble forseglet med plateforseglere og latt stå over natt ved 4°C.

På analysedagen ble substratløsningen kastet og analyseplatebrønner ble vasket en gang med 200 |il PBST (PBS inneholdende 0,05% v/v Tween 29) og en gang med 200 uJ 50 mM Hepes pH 7,4.

Testforbindelser ble dannet som 10 mM eller 30 mM stamløsninger i DMSO og deretter ytterligere fortynnet i glassdestillert vann fortynnet til en konsentrasjon 10 ganger høyere enn den endelige analysekonsentrasjonen. 10 \ i\ fortynnet forbindelse ble overført til brønner i vaskede analyseplater. "Ingen forbindelse" kontrollbrønner inneholdt 10 jil glassdestillert vann i stedet for forbindelse.

Førti mikroliter 25 mM manganklorid inneholdende 6,25 um adenosin-5'-trifosfat (ATP) ble tilsatt til alle testbrønnene. For å begynne reaksjonene ble 50 \ i\ friskt fortynnet enzym tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert ved 23°C i 90 minutter. Deretter reaksjonen stoppet ved tilsetning av 100 uJ PBS inneholdende 20 mM EDTA. Væsken ble deretter fjernet og brønnene ble vasket to ganger med PBST.

100 mikroliter myse HRP-koblet anti-fosfotyrosin antistoff (Santa Cruz, Product SC 7020-HRP), fortynnet 1 til 1500 med PBST inneholdende 0,5% v/v bovint serumalbumin (BSA), ble tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur før væsken ble kastet og brønnene vasket to ganger med 200 uJ PBST. 100 uJ 2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre) (ABST) løsning, friskt dannet ved anvendelse av en 50 mg ABTS tablett (Boehringer 1204 521) i 50 ml friskt dannet 50 mM fosfat-sitratbuffer pH5,0 + 0,03% natriumperborat (dannet med 1 fosfat sitrat buffer med natriumperborat (PCSB) kapsel (Sigma P4922) per 100 ml destillert vann), ble tilsatt til hver brønn. Platene ble deretter inkubert i 20-60 minutter ved romtemperatur helt til absorbanse verdien av "uten forbindelse" kontrollbrønner, målt ved 405 nm ved anvendelse av et plateavlesningsspektrofotometer var omtrent 1,0.

Doseresponskurver ble dannet fra absorbanse avlesninger ved anvendelse av Origin Software. Forbindelser ble rangert etter potens ved anvendelse av inhibitorisk konsentrasjon 50 (IC50), som definert ved Origin Software analyse.

Til tross for at de farmakologiske egenskapene til forbindelsene ifølge formelen (I) eller (I') varierer med strukturell forandring, i generell aktivitet som forbindelsene ifølge formel (I) eller (I') har i ovennevnte analyser kan bli demonstrert ved IC50 konsentrasjoner eller doser i området 250 \ iM til 1 nM.

Når testet i ovennevnte in vitro analyse var CDK4 inhibitorisk aktivitet til eksempel 5 målt som IC50 = 0,02 uM. Når testet i ovennevnte in vitro analyse var FAK inhibitorisk aktivitet til eksempel 3 målt som IC50 = 0,553 u.M.

In-vivo aktiviteten til forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli vurdert ved standardteknikker, for eksempel ved måling av inhibisjon av cellevekst og vurdering av cytotoksisitet. For eksempel kan ytterligere detaljer finnes i følgende referanser:

a) Attenution of the Expression of the Focal Adhesion Kinase Apoptosis in Tumor Cells. Xu L-h et al. Cell Growth & Differentiation (1996), 7, s413-418; b) The COOH-Terminal Domain of the Focal Adhesion Kinase Induces Loss of Adhesion and Cell Death in Human Tumor Cells. Xu L-h et al. Cell Growth & Differentiation (1998) 9, S999-1005; c) Inhibition of pp125-FAK in Cultured Fibroblasts Results in Apoptosis. Hungerford J. E et al. The Journal of Cell Biology (1996) 135, s1383-1390; d) Inhibition of Focal Adhesion Kinase (FAK) Signalling in Focal Adhesions Decreases Cell Motility and Proliferation. Gilmore A. P. and Romer L. H:

Molecular Biology of the Cell (1996) 7, s1209-1224.

Inhibisjon av cellevekst kan bli målt ved å farge cellene med Sulforhodamine B (SRB), et fluorescens fargestoff som farger proteiner og som derfor gir en vurdering av mengden av protein (dvs. celler) i en brønn (se Boyd, M. R. (1989) Status of the NCI preclinical antitumour drug delivery screen. Prin. Prae Oncol 10:1-12). Følgende detaljer er følgelig gitt for måling av inhibisjon av cellevekst: Cellene ble sådd ut i hensiktsmessig medium i et volum på 100 (il i 96 brønn plater; mediet var Dulbeccos modifiserte Eagles medium for MCF-7, SK-UT-1B og SK-UT-1. Cellene ble latt bli koblet, og deretter ble inhibitor forbindelser tilsatt i forskjellige konsentrasjoner i en maksimal konsentrasjon på 1 % DMSO (v/v). En kontrollplate ble analysert for å tilveiebringe en verdi for cellene før dosering. Cellene ble inkubert bed 37°C, (5% C02) i 3 dager.

Etter tre dager ble TCA tilsatt til platene til en endelig konsentrasjon på 16%

(v/v). Platene ble deretter inkubert ved 4°C i 1 time, supernatanten ble fjernet og platene ble vasket i springvann. Etter tørking ble 100 jxl SRB fargestoff (0,4% SRB i 1% eddiksyre) tilsatt i 30 minutter ved 37°C. SRB overskudd ble fjernet og platene vasket i 1% eddiksyre. SRB bundet til protein ble oppløst i 10 mM Tris pH 7,5 og ristet i 30 minutter ved romtemperatur. OD ble avlest ved 540 nm og konsentrasjonen av inhibitor som forårsaker 50% inhibisjon av vekst ble

bestemt ut fra en semi-log plott inhibitor konsentrasjon mot absorbanse. Konsentrasjonen av forbindelse som reduserte den optiske aktiviteten til under den oppnådd når cellene ble sådd ut i begynnelsen av eksperimentet ga verdi for toksisitet.

Typiske IC5o verdier for forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble testet i SRB analyse og er i området 1 mM til 1 nM.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er anvendelse av et pyrimidin derivat ifølge formel (I) eller (I') ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt, eller in vivo hydrolyserbar ester derav, for fremstilling av et medikament for anvendelse ved dannelse av en anti-cancer effekt i et varmblodig dyr.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det omfatter et pyrimidinderivat ifølge formel (I) eller (I') ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller en in vivo hydrolyserbar ester derav, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddle eller en bærer.

Preparatet kan være i en form egnet for oral administrering, for eksempel som en tablett eller kapsel, for parenteral injeksjon (inkludert intravenøs, subkutan, intramuskulær, intravaskulær eller infusjon) som en steril løsning, suspensjon eller emulsjon, for topisk administrering som en salve eller krem eller for rektal administrering som en suppositorie.

Generelt kan ovennevnte preparater bli fremstilt på konvensjonell måte ved anvendelse av konvensjonelle eksipienter.

Pyrimidin vil normalt bli administrert til et varmblodig dyr i en enhetsdose i området 5-5000 mg per kvadratmeter kroppsareal til dyret, dvs. omtrent 0,1-100 mg/kg, og dette tilveiebringer normalt en terapeutisk effektiv dose. En enhetsdoseform så som en tablett eller kapsel vil vanligvis inneholde, for eksempel 1 -250 mg aktivt ingrediens. Det er foretrukket at en daglig dose i området 1 -50 mg/kg blir anvendt. Den daglige dosen vil nødvendigvis bli variert avhengig av verten som blir behandlet, den bestemte administreringsveien og hvor alvorlig sykdommen som blir behandlet er. Følgelig kan optimal dosering bli bestemt av behandleren som behandler en hvilke som helst bestemt pasient.

Vi har oppdaget at pyrimidinderivater definert i foreliggende oppfinnelse, eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester derav er effektive cellesyklus inhibitorer (anti-celle proliferasjonsmidler), i det egenskapen (uten å være bundet til noen teori) antas å oppstå ut fra deres CDK inhibitoriske egenskaper. Forbindelsene er også effektive inhibitorer av FAK. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er følgelig ventet å være nyttige for behandling av sykdommer eller medisinske tilstander mediert kun eller delvis av CDK og/eller FAK enzymer, dvs. forbindelsene kan bli anvendt for å produsere en CDK inhibitorisk effekt i et varmblodig dyr som trenger slik behandling. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for behandling av proliferasjon og/eller migrering av maligne celler kjennetegnet ved inhibisjon av CDK og/eller FAK enzymer, dvs. forbindelsene kan bli anvendt for å produsere en anti-proliferativ/migreringseffekt mediert kun eller delvis av inhibisjon av CDK og/eller FAK. Forbindelsene er også nyttige som FAK inhibitorer ved å indusere celle-død (apoptose). Et slikt pyrimidinderivat ifølge oppfinnelsen er ventet å inneha en rekke anti-cancer egenskaper i det CDK og/eller FAK har vært implisert i mange vanlige humane cancerformer så som leukemi og bryst, lunge, tarm, rektal, mage, prostata, blære, bukspyttkjertel og ovariecancer. Det er derfor ventet at et pyrimidinderivat ifølge oppfinnelsen vil inneha anti-cancer aktivitet overfor disse cancerformene. Det er i tillegg ventet at et pyrimidinderivat ifølge foreliggende oppfinnelse vil inneha aktivitet mot en rekke leukemier, lymfoide maligne tilstander og faste tumorer så som karsinomer og sarkomer i vev så som lever, nyre, prostata og bukspyttkjertel. Slike forbindelser ifølge oppfinnelsen er spesielt ventet å redusere fordelaktig vekten av primære og tilbakevendende faste tumorer i for eksempel tarm, bryst, prostata, lunger og hud. Slike forbindelser ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester derav er spesielt ventet å inhibere veksten av primære og tilbakevendende faste tumorer som er assosiert med CDK og/eller FAK, spesielt de tumorene som er signifikant avhengig av CDK og/eller FAK for deres vekst og spredning, inkludert for eksempel visse tumorer i tarm, bryst, prostat, lunge, vulva og hud.

Det er videre ventet at et pyrimidin derivat ifølge foreliggende oppfinnelse vil inneha aktivitet mot andre celle-proliferasjons/migreringssykdommer i en rekke andre sykdomstilstander inkludert leukemier, fibroproliferative og forskjellige forstyrrelser, psoriasis, revmatoid artritt, Kaposis sarkom, haemangiom, akutt og kronisk nefropati, aterom, aterosklerose, arteriell restenose, autoimmune sykdommer, akutt og kronisk inflammasjon, bensykdommer og okulære sykdommer med retinal kar proliferasjon.

Som angitt ovenfor vil størrelsen på dosen som er nødvendig for terapeutisk eller profylaktisk behandling av en bestemt celle-proliferasjonssykdom nødvendigvis variere avhengig av verten som blir behandlet, administreringsvei og hvor alvorlig sykdommen som blir behandlet er. En enhetsdose i området på for eksempel 1-100 mg/kg, fortrinnsvis 1-50 mg/kg kommer i betraktning.

CDK og/eller FAK inhibitorisk aktivitet definert ovenfor kan bli anvendt som en eneste terapi eller kan involvere, i tillegg til en forbindelse ifølge oppfinnelsen, en eller flere andre substanser og/eller behandlinger. Slik samlet behandling kan bli oppnådd ved simultan, sekvensiell eller separat administrering av de individuelle komponentene ved behandligen. Innen området medisinsk onkologi er det vanlig praksis å anvende en kombinasjon av forskjellige former for behandling for å behandle hver pasient med cancer. I medisinsk onkologi kan den andre komponenten (ene) av slik samlet behandling i tillegg til cellesyklus inhibitorisk behandlig definert nedenfor være: kirurgi, radioterapi eller kjemoterapi. Slik kjemoterapi kan omfatte tre hovedkategorier av terapeutisk middel: (i) andre cellesyklus inhibitoriske midler som virker på samme eller ved andre mekanismer i forhold til de som er definert ovenfor; (ii) cytostatiske midler så som antiøstrogener (for eksempel tamoksifen, toremifen, raloksifen, droloksifen, jodoksyfen), progestogener (for eksempel megestrol acetat), aromatase inhibitorer (for eksempel anastrozol, letrazol, vorazol, eksemestan), antiprogestogener, antiandrogener (for eksempel flutamid, nilutamid, bikalutamid, cyproteron acetat), LHRH agonister og antagonister (for eksempel goserelin acetat, luprolid), inhibitorer av testosteron 5a-dihydroreduktase (foreksempelfinasterid), anti-invasjonsmidler (for eksempel metalloproteinase inhibitorer som marimastat og inhibitorer av urokinase plasminogen aktivator reseptorfunksjon) og inhibitorer av vekstfaktorfunksjonen (slike vekstfaktorer innbefatter for eksempel blodplateavledet vekstfaktor og hepatocytt vekstfaktor og slike inhibitorer innbefatter vekstfaktor antistoffer, vekstfaktor reseptorantistoffer, tyrosinkinase inhibitorer og serin/treonin kinaseinhibitorer); og (iii) antiproliferative/antineoplastiske medikamenter og kombinasjoner derav, som anvendt innen medisinsk onkologi, så som antimetabolitter (for eksempel antifolater som metotreksat, fluorpyrimidiner som 5-fluoruracil, purin og adenosin analoger, cytosin arabinosid); antitumor antibiotika (for eksempel antrasykllner som doksorubicin, daunomycin, epirubicin og idarubicin, mitomycin-C, daktinomycin, mitramycin); platinumderivater (for eksempel cisplatin, karboplatin); alkyleringsmidler (for eksempel nitrogensennep, melfalan, klorambucil, busulfan, syklofosfamid, ifosfamid, nitrosoureas, tiotepa); antimitotiske midler (for eksempel vinkaalkaloider som vinkristin og taksoider som taksol, taksoter);

toposiomerase inhibitorer (for eksempel epipodofyllotoksiner som etoposid og teniposid, amsakrin, topotekan). Ifølge dette aspektet av oppfinnelsen er det tilveiebrakt et farmasøytisk produkt som omfatter et pyrimidinderivat ifølge formel (I) eller (I') som definert ovenfor og en ytterligere anti-tumorforbindelse som definert ovenfor for samtidig

behandling av cancer. Et anti-emetisk middel kan også være nyttig å administrere, for eksempel ved anvendelse av en slik samlet behandling som beskrevet ovenfor.

I tillegg til deres anvendelse innen terapeutisk medisin kan forbindelsene ifølge formel (I) eller (I') og deres farmasøytisk akseptable salter være nyttige som farmakologiske redskaper ved utvikling og standardisering av in vitro og in vivo testsystemer for vurdering av effekter av inhibitorer av cellesyklusaktiviteten i laboratoriedyr så som katter, hunder, kaniner, aper, rotter og mus, som del av forskning på nye terapeutiske midler.

I ovenfor andre, farmasøytisk sammensetning, fremgangsmåte, prosess, anvendelse og medikament fremstillingstrekk, gjelder også de alternative og foretrukne utførelsesformene av forbindelsene ifølge oppfinnelsen beskrevet heri.

Oppfinnelsen vil nå bli i eksempler, hvor standardteknikker kjent for fagfolk innen kjemi og teknikker analoge med de som er beskrevet i disse eksemplene kan bli anvendt hvor hensiktsmessig, og hvor, dersom ikke annet er angitt: (i) avdampninger ble utført ved roterende avdampning i vakuum og opparbeidningsprosedyrer ble utført etter fjerning av gjenværende faststoffer, så som tørkemidler ved filtrering; (ii) operasjoner ble utført ved omgivelsestemperatur, typisk i området 18-. 25°C og i luft dersom ikke annet er angitt, eller hvis ikke fagfolkene driver dette på andre måter under en atmosfære av en inert gass så som argon; (iii) kolonnekromatografi (ved flashprosedyre) og middels trykk væskekromatografi (MPLC) utført på Merck Kieselgel silika (Art. 9385) eller på Merck Lichoprep RP-18 (Art. 9303) revers-fase silika, oppnådd fra E. Merck, Darmstadt, Tyskland; bond elute kromatograf ble utført ved anvendelse av Varian Mega Bond Elut patroner (10 g, order code 1225-6034), oppnådd fra Varian Sample Preparation Products, California, USA; (iv) utbyttene er gitt kun for illustrasjon og er ikke nødvendigvis de maksimalt oppnåbare; (v) strukturer av sluttproduktene ifølge formel (I) ble generelt bekreftet ved nukleær (generelt proton) magnetisk resonans (NMR) og massespektral teknikker; proton magnetiske resonans kjemiske skiftverdier ble målt i deuterert DMSO-d6 (dersom ikke annet er angitt) på deltaskala (ppm nedfelt fra tetrametylsilan) ved anvendelse av et Varian Gemini 2000 spektrometer drevet ved en feltstyrke på 300 MHz, eller et Bruker AM250 spektrometer drevet ved en feltstyrke på 250MHz; og toppmultiplisiteter er vist som følger: s, singlett; d, dublett; dd, dobbel dublett; t, triplett; tt, trippel triplett; q, kvartett; tq, trippel kvartett; m, multiplett; br, bred; massespektrometri (MS) ble utført ved elektrospray på en VG plattform; (vi) mellomprodukter var generelt ikke fullstendig karakterisert og renheten ble vurdert ved tynnsjiktskromatografi (TLC), HPLC, infra-rød (IR), MS eller NMR analyse; (vii) når løsninger ble tørket var magnesiumsulfat tørkemidlet;

(viii) følgende forkortelser kan bli oppnådd nedenfor eller ovenfor:

DCM diklormetan;

DMF N,N-dimetylformamid;

DMSO dimetylsulfoksid;

NMP N-metylpyrrolidin-2-one;

Eksempel 1

2-( 4- r2- hvdroksv- 3- fN. N- dietvlamino) propoksvlanilino)- 4-( indolin- 1- vnpvrimidin En varm løsning av 4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]anilin hydroklorid (fremgangsmåte 1,219 mg, 0,77 mmol) i metanol (2 ml) ble tilsatt til en løsning av 2-klor-4-(indolin-1-yl)pyrimidin (metode 3, 200 mg, 0,86 mmol) i n-butanol (20 ml). Blandingen ble oppvarmet ved 100°C i 18 timer og silika (1 g) ble tilsatt. Det flyktige materialet ble fjernet ved avdampning og resten ble renset ved kolonnekromatografi, eluering med 0-5% 2,OM metanolisk ammoniakk løsning i DCM, for å tilveiebringe produktet som et fargeløst fast stoff (201 mg, 61%). NMR: 2,19 (s, 6H), 2,21-2,3 (m, 1H), 2,3-2,4 (m, 1H), 3,1-3,25 (m, 2H), 3,8-4,1 (m, 5H), 5,75 (m, 1H), 6,2 (m, 2H), 6,8-6,9 (m, 3H), 7,0-7,1 (m, 1H), 7,15-7,25 (m, 1H), 7,5-7,6 (m, 2H), 8,05-8,1 (m, 1H), 8,3-8,4 (m, 1H), 8,95 (s, 1H); MS (MH<+>): 406,5.

Eksemplene 2- 5

Følgende forbindelser ble fremstilt ved en analog metode som den beskrevet i eksempel 1 ved anvendelse av 4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]anilin hydroklorid (metode 1) og hensiktsmessig 2-klor-4-(indolin-1-yl)pyrimidin (metodene 4-7):

Eksempel 6

4- n . 2. 3. 4- tetrahvdrokinolin- 1 - vn- 2-( 4- f2- hvdroksv- 3-( N. N-dimetvlamino) propoksvlanilino) pyrimidin

Ved anvendelse av en analog metode som den beskrevet i eksempel 1, men begynnende fra 4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]anilin hydroklorid (metode 1) og 2-klor-4-(1,2,3,4-tetrahydrokinolin-1-yl)pyrimidin (metode 8), ble produktet oppnådd. NMR: 1,8-2,0 (m, 2H), 2,19 (s, 6H), 2,2-2,3 (m, 1H), 2,3-2,45 (m, 1H), 2,7-2,8 (m, 2H), 3,7-3,9 (m, 5H), 5,7 (m, 1H), 6,35 (m, 2H), 6,8 (m, 2H), 7,0-7,05 (m, 1H), 7,1-7,2 (m, 2H), 7,35-7,4 (m, 1H), 7,5-7,6 (m, 2H), 7,9-8,0 (m, 2H), 8,95 (s, 1H); MS (MH<+>): 420,5.

Eksemplene 7- 9

Følgende forbindelser ble fremstilt ved en analog metode som den beskrevet i eksempel 1 ved anvendelse av 4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]anilin hydroklorid (metode 1) og hensiktsmessig 4-substituert 2-klorpyrimidin (oppnådd som beskrevet i PCT Int. Appl. WO 9911657 og Eur. J. Med. Chem., 1991, 26, 729-33):

Eksemplene 10- 11

Følgende forbindelser ble fremstilt ved en analog metode som den beskrevet i eksempel 1 ved anvendelse av 4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]anilin hydroklorid (metode 1) og hensiktsmessig 2-klor-5-halogen-4-(indolin-1-yl)pyrimidin (metodene 9-10):

Eksemplene 12- 14

Følgende forbindelser ble fremstilt ved en analog metode som den beskrevet i eksempel 1, ved anvendelse av 4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]anilin hydroklorid (metode 1) og hensiktsmessig 4-substituert 2-klor-5-halogen-pyrimidin (metodene 12-14):

Eksempel 15

2-( 4- r2- hvdroksv- 3-( N. N- dimetvlamino) propoksv1anilino)- 4-( indol- 1- vh- 5-metyl<p>vrimidin

Natriumhydrid (60% dispersjon i olje; 116 mg, 2,9 mmol) ble tilsatt til en løsning av indol (340 mg, 2,9 mmol) i NMP (2 ml) ved 0°C. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 10 minutter og deretter tilsatt dråpevis til en kald (0°C) løsning av 2,4-diklor-5-metylpyrimidin (489 mg, 3,0 mmol) i NMP (3 ml). Blandingen ble omrørt ved 0°C i 3 timer og deretter ble 4-[3-(N,N-dimetyl)amino-2-hydroksypropoksyjanilin hydroklorid (metode 1, 500 mg, 1,76 mmol) tilsatt. Blandingen ble oppvarmet ved 100°C over natt og deretter ble silika (2 g) tilsatt. Det flyktige materialet ble fjernet ved avdampning og resten ble renset ved kolonnekromatografi, eluering med 0-5% 2,0M metanolisk ammoniakk løsning i DCM, for å tilveiebringe produktet som et hvitt fast stoff (166 mg, 13%). NMR: 2,1 (m, 9H), 2,3 (m, 2H), 3,9 (m, 3H), 4,8 (d, 1H), 6,85 (d, 1H), 6,9 (d, 2H), 7,2 (m, 2H), 7,6 (m, 5H), 8,5 (s, 1H), 9,5 (s, 1H); MS (MH<+>): 418.

Eksempel 16

6-( 4- r2- hvdroksv- 3-( N. N- dimetvlamino) propoksv1anilino)- 4-( indolin- 1- vl) pyrimidin

En løsning av4-klor-6-(indolin-1-yl)pyrimidin (metode 15, 220 mg, 0,95 mmol) og 4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]anilin hydroklorid (metode 1, 229 mg, 0,81 mmol) i NMP (5 ml) ble oppvarmet til 150°C i 1 time. Natriumbikarbonatløsning (20 ml) ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert med etylacetat (20 ml). Ekstraktene ble vasket med vann (2x10 ml) og tørket. Silika (1 g) ble tilsatt og det flyktige materialet ble fjernet ved avdampning. Resten ble renset ved kolonnekromatografi, eluering med 0-8% 2,OM metanolisk ammoniakkløsning i DCM for å tilveiebringe produktet som et fargeløst fåst stoff (108 mg). NMR: 2,18 (s, 6H), 2,32 (m, 2H), 3,17 (m, 2H), 3,86 (m, 5H), 4,78 (d, 1H), 5,96 (s, 1H), 6,85 (m, 3H), 7,16 (m, 2H), 7,44 (d, 2H), 8,26 (m, 2H), 9,02 (s, 1H);MS(MH<+>):406.

Eksemplene 17- 18

Følgende forbindelser ble fremstilt ved en analog metode som den beskrevet i eksempel 16 ved anvendelse av 4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]anilin hydroklorid (metode 1) og hensiktsmessig 4-klor-6-(indolin-1-yl)pyrimidin (metodene 16-17):

Fremstilling av utgangsmaterialer

Utgangsmaterialene for eksemplene ovenfor er enten kommersielt tilgjengelige eller kan lett bli fremstilt ifølge standardmetoder ut fra kjente materialer. For eksempel er følgende reaksjoner gitt som illustrasjon, men er ingen begrensning av noen av utgangsmaterialene anvendt i ovennevnte reaksjoner.

Metode 1

4- r2- hvdroksv- 3-( N. N- dimetvlamino) propoksvlanilin h<y>droklorid En løsning av 4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]nitrobenzen (metode 2, 3,75 g) i etanol (40 ml) ble katalytisk hydrogenert over 10% palladium-på-karbon (0,4 g) over natt. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering gjennom diatomejord og filtratet ble konsentrert. Resten ble løst opp i dietyleter inneholdende en liten mengde isopropanol og eterholdig hydrogenklorid (1M, 16 ml) ble tilsatt. Dietyleter ble fjernet ved avdampning og faststoff resten ble suspendert i isopropanol. Blandingen ble oppvarmet på et dampbad i flere minutter og deretter latt bli avkjølt. Det uoppløselige faststoffet ble deretter samlet ved filtrering, vasket med isopropanol og eter, og tørket for å tilveiebringe produktet (3,04 g, 72,4%). NMR: 2,80 (s, 6H), 3,15 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 4,25 (m, 1H), 5,93 (br S, 1H), 6,88 (m, 4H); MS (MH<+>): 211; CnH^NzOz.l.eHCI krever: C; 49,2, H; 7,4; N; 10,4, Cl; 21,7%; funnet: C; 49,2, H; 7,2, N; 10,1; Cl; 19,1%.

Metode 2

4- f2- hydroksy- 3-( N. N- dimetvlamino) propoksv1nitrobenzen 4-(2,3-epoksypropoksy)nitrobenzen (oppnådd som beskrevet i Synthetic Communications, 1994, 24, 833; 4,3 g) ble løst opp i metanol (30 ml) og DMF (10 ml). En løsning av dimetylamin i metanol (2M, 17 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt over natt. Det flyktige materialet ble fjernet ved avdampning og resten ble fordelt mellom mettet natriumbikarbonat (100 ml) og etylacetat (100 ml). Det organiske laget ble separert og vasket med mettet natriumklorid (2 x 100 ml) og tørket.

Konsentrering ga produktet som en olje som sakte krystalliserte under høyt vakuum (4,79 g, 89,9%). NMR (CDCI3): 2,33 (s, 6H), 2,98 (m, 1H), 2,54 (m, 1H), 4,00 (m, 3H), 7,00 (d, 2H), 8,20 (d, 2H); MS (MH<+>): 241.

Metode 3

2- klor- 4- flndolin- 1- vDpyrimidin

En løsning av 2,4-diklorpyrimidin (596 mg, 4,0 mmol), indolin (0,45 ml, 4,0 mmol) og N,N-diisopropyletylamin (0,69 ml, 4,0 mmol) i n-butanol (20 ml) ble oppvarmet ved 100°C i 18 timer. Silika (3 g) ble tilsatt og det flyktige materialet ble fjernet ved avdampning. Resten ble renset ved kolonnekromatografi eluerende med 0-40% etylacetat/isoheksan for å tilveiebringe produktet som et fargeløst fast stoff (460 mg, 50%). NMR (CDCI3): 3,2 (t, 2H), 4,0-4,1 (t, 2H), 6,5 (d, 1H), 7,0-7,1 (m, 1H), 7,2-7,3 (m, 2H), 8,2 (m, 1H), 8,3^8,4 (m, 1H); MS (MH<+>): 232,7.

Metodene 4- 7

Følgende forbindelser ble fremstilt ved en analog metode som den beskrevet i metode 3, begynnende fra 2,4-diklorpyrimidin og hensiktsmessig substituert indolin:

Metode 8

2- klor- 4-( 1, 2. 3. 4- tetrahvdrokinolin- 1 - vDpvrimidin

Ved anvendelse av en analog metode som den beskrevet i metode 3, men begynnende fra 2,4-diklorpyrimidin og 1,2,3,4-tetrahydrokinolin, ble produktet oppnådd. MS (MH<+>): 246, 248.

Metodene 9- 10

Følgende forbindelser ble fremstilt ved en analog metode som den beskrevet i metode 3, begynnende fra indolin og hensiktsmessig 2,4-diklor-5-halogenpyrimidin (kommersielt tilgjengelig eller oppnådd som beskrevet i metode 11):

Metode 11

2, 4. 5- triklorpvrimidin

5-kloruracil (10,0 g, 68,5 mmol) ble løst opp i fosforoksyklorid (60 ml) og fosforpentaklorid (16,0 g, 77,0 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble oppvarmet under tilbakeløp i 16 timer, latt bli avkjølt og deretter helt sakte i vann (200 ml) med omfattende omrøring. Blandingen ble omrørt i 1,5 timer og deretter ble etylacetat (250 ml) tilsatt. Det organiske laget ble separert og det vandige laget ble ekstrahert med en ytterligere porsjon etylacetat (250 ml). Kombinerte ekstrakter ble vasket med mettet natriumbikarbonat (200 ml) og mettet natriumkloridløsning (200 ml), og deretter tørket. Det flyktige materialet ble fjernet ved avdampning og resten ble renset ved kolonnekromatografi, eluering med DCM, for å tilveiebringe produktet som en gul væske (6,37 g, 51%). NMR (CDCI3): 8,62 (s, 1H); MS (MH<+>): 182, 184,186.

Metode 12

5- brom- 2- klor- 4-( benzimidazol- 1- vnpvrimidin

Natrium hydrid (60% dispersjon i olje; 110 mg, 2,75 mmol) ble tilsatt til en løsning av benzimidazol (295 mg, 2,5 mmol) i DMF (6 ml) ved 0°C. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 10 minutter og deretter dråpevis tilsatt til en kald (0°C) løsning av 5-brom-2,4-diklorpyrimidin (712 mg, 3,14 mmol) i DMF (6 ml). Blandingen ble omrørt ved 0°C i 2 timer og deretter ble etylacetat (20 ml) og vann (20 ml) tilsatt. Den organiske fasen ble separert og tørket og det flyktige materialet ble fjernet ved avdampning. Resten ble renset ved kolonnekromatografi eluerende med 20% etylacetat/DCM, for å tilveiebringe produktet som et hvitt fast stoff (500 mg, 52%). NMR: 7,4 (m, 2H), 7,8 (m, 2H), 8,8 (s, 1H), 9,3 (s, 1H); MS (MH<+>): 309, 311.

Metodene 13- 14

Følgende forbindelser ble fremstilt ved en analog metode som den beskrevet i metode 12 begynnende fra indol og hensiktsmessig 2,4-diklor-5-halogenpyrimidin (kommersielt tilgjengelig eller oppnådd som beskrevet i metode 11):

Metodene 15- 17

Følgende forbindelser ble fremstilt ved en analog metode som den beskrevet i metode 3 begynnende fra 4,6-diklorpyrimidin og hensiktsmessig indolin og reaksjonen ble utført ved 125°C i 1 time:

Eksempel 19

Følgende illustrerer representative farmasøytiske doseringsformer inneholdende forbindelsen ifølge formel (I) eller (l')n eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester derav (nedenfor forbindelse X), for terapeutisk eller profylaktisk anvendelse i mennesker:

Anmerkning

Ovennevnte formuleringer kan bli oppnådd ved konvensjonelle prosedyrer velkjente innenfor det farmasøytiske området. Tablettene (a)-(c) kan bli belagt enterisk ved konvensjonelle metoder, for eksempel for å tilveiebringe et belegg av celluloseacetat ftalat.

Claims (8)

1. Pyrimidinderivat, karakterisert ved at den har formelen (I) eller (I<*>): hvor: Rx er valgt fra hydrogen, halogen, C^alkyl; Qi er fenyl og Qi bærer på et tilgjengelig karbonatom ikke ved siden av -NH-koblingen en substituent ifølge formel (la): hvor: Xer-O; Y<1> er-OH; Y<2>er H; Z er-N(Ciwralk<y>l)2; n er 1, 2 eller 3; merl, 2 eller 3; og -NQ2 er indolin, piperazin, morfolin, 1,2,3, 4-tetrahydrokonolin, benzimidazol eller indol og -NQ2 kan eventuelt og uavhengig bære på et hvilket som helst tilgjengelig karbonatom opp til fire substituenter uavhengig valgt fra halogen, Ci-5alkanoyl, C^alkyl og dersom en heterocyklisk gruppe i -NQ2 inneholder en -NHgruppe er det nitrogenatomet usubstituert eller substituert med Ci-6alkoksykarbonyl; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester derav.

2. Pyrimidinderivat ifølge krav 1, karakterisert ved at substituenten ifølge formel (la) er 3-dimetylamino-2-hydroksypropoksy; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller en in vivo hydrolyserbar ester derav.

3. Pyrimidinderivat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2, karakterisert ved at substituenten med formel (la) er para for -NH-; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester derav.

4. Pyrimidinderivat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det er: 2-{4-[2-hydroksy-3-(N,N-dimetylamino)propoksy]anilino}-4-(2,3-dimetylindolin-1-yl)pyrimidin; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester derav.

5. Fremgangsmåte for å fremstille et pyrimidinderivat ifølge formel (I), karakterisert ved at den omfatter: a) omsetning av et pyrimidin ifølge formel (II): hvor L er en forflyttbar gruppe som definert nedenfor, med en forbindelse ifølge formel (III): b) omsetning av et pyrimidin med formel (IV): hvor L er en forflyttbar gruppe som definert nedenfor, med en forbindelse ifølge formel (V): c) for forbindelser med formel (I) hvor n er 1, 2 eller 3, m = 1; ved omsetning av en tre-leddet heteroalkylring inneholdende forbindelse ifølge formel (VI): hvor A er O; med en nukleofil ifølge formel (VII): hvor D er H eller et egnet mot-ion; d) ved omsetning av en alkohol ifølge formel (VIII): med en alkohol ifølge formel (IX): e) for forbindelser ifølge formel (I) hvor m er 2 eller 3; omsetning av en forbindelse ifølge formel (X): hvor LgO er en avspaltbar gruppe som definert nedenfor; med en nukleofil ifølge formel (VII); og deretter om nødvendig: i) omdanning av en forbindelse ifølge formel (I) til en annen forbindelse ifølge formel (I); ii) fjerning av eventuelle beskyttelsesgrupper; iii) dannelse av et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et pyrimidinderivat ifølge formel (I'), karakterisert ved at den omfatter: a) omsetning av et pyrimidin ifølge formel (II'): hvor L er en forflyttbar gruppe som definert nedenfor, med en forbindelse ifølge formel (III'): b) omsetning av et pyrimidin ifølge formel (IV): hvor L er en forflyttbar gruppe som definert nedenfor, med en forbindelse ifølge formel (V): c) for forbindelser med formel (I') hvor n er 1, 2 eller 3, m = 1, omsetning av en tre-leddet heteroalkylring ifølge formel (VI'): hvor A er O; med en nukleofil ifølge formel (VII'): hvor D er H eller et egnet mot-ion; d) for forbindelser ifølge formel (I') hvor X er oksygen, ved omsetning av en alkohol ifølge formel (VIII'): med en alkohol ifølge formel (IX'): e) for forbindelser med formel (I') hvor m er 2 eller 3; omsetning av en forbindelse ifølge formel (X'): hvor LgO er en avspaltbar gruppe som definert nedenfor; med en nukleofil ifølge formel (VII'); og deretter om nødvendig: i) omdanning av en forbindelse ifølge formel (I') til en annen forbindelse ifølge formel (I'); ii) fjerning av eventuelle beskyttelsesgrupper; iii) dannelse av et farmasøytisk akseptabelt salt eller in vivo hydrolyserbar ester.

7. Anvendelse av et pyrimidin derivat ifølge formel (I) eller (I') ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt, eller in vivo hydrolyserbar ester derav, for fremstilling av et medikament for anvendelse ved dannelse av en anti-cancer effekt i et varmblodig dyr.

8. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et pyrimidinderivat ifølge formel (I) eller (I') ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller en in vivo hydrolyserbar ester derav, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddle eller en bærer.