MXPA04001053A - Composiciones y metodos para producir heteromultimeros quimericos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona una tecnica para el ensamblado especifico de polipeptidos monomericos para formar un heteromultimero. Esta tecnica es particularmente util para producir un repertorio de heteromultimeros con diversidad generica, como pueden ser las unidades que se unen a los antigenos. La invencion tambien proporciona las unidades que se unen al antigeno no monocatenarias y monocatenarias * * ensambladas por la tecnica descrita en la presente. La presente invencion tambien proporciona los polinucleotidos recombinantes, vectores, celulas hospederas y los equipos para producir las unidades que se unen al antigeno del individuo. Ademas la invencion proporciona los metodos para utilizar las unidades que se unen al antigeno del individuo.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA GENERAR HETEROMÜLTIMEROS QUIMÉRICOS REFERENCIA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente de utilidad US 09/921,144, presentada el 1 de Agosto del 2001, pendiente, que se incorpora en la presente como referencia en su entereza .

CAMPO TÉCNICO Esta invención es en el campo de la inmunología. Específicamente, la invención se refiere a la producción de heteromultímeros quiméricos, como las unidades de unión al antígeno no monocatenarias, utilizando secuencias de heterodimerización únicas. Se refiere a la producción de unidades de unión al antígeno monocatenarias estabilizadas por las secuencias para la heterodimerización objeto de la invención. Las composiciones y métodos incorporados en la presente invención son especialmente útiles para identificar las unidades que se unen al antígeno que sean de importancia potencial para el diagnóstico y/o terapéutica .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos o inmunoglobulinas son moléculas que reconocen y se unen a los antigenos cognados específicos. Debido a sus especificidades exclusivas, los anticuerpos, en particular los anticuerpos monoclonales, se han utilizado extensamente en el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades en humanos.

La inmunoglobulina básica (Ig) en los sistemas vertebrados esta compuesta de dos polipéptidos de cadenas leves ("L") idénticas (de aproximadamente 23 kDa) y dos polipéptidos de cadenas pesadas ("H") idénticas (de aproximadamente 53 a 70 kDa) . Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración "Y". En la base de la Y, las dos cadenas H están unidas por enlaces disulfuro covalentes. Las cadenas L y H están organizadas en una serie de dominios. La cadena L tiene dos dominios, correspondientes a la región C ("CL") y la otra a la región V ("VL") . La cadena H tiene cuatro dominios, un correspondiente a la región V ("VH") y tres dominios (CH1, CH2 y CH3) en la región C. El anticuerpo contiene dos brazos (cada brazo es un fragmento Fab) , cada uno de los cuales tiene una región VL y una VH asociadas entre sí. Es este par de regiones V (VL y VH) que difiere, de un anticuerpo a otros (por las variaciones de las secuencias de aminoácidos) , y que juntas son responsables de reconocer el antigeno y proporcionar un sitio de unión al antígeno. Más específicamente, cada región V esta constituida de tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) separadas por cuatro regiones de la estructura fundamental (FR) . Las CDR son la parte más variable de las regiones variables, y realizan la función crucial de unirse al antigeno. Las regiones CDR provienen de múltiples secuencias de lineas germinales potenciales por un proceso complejo que incluye recombinación, mutación y selección.

La investigación en fechas recientes ha demostrado que la función de un antigeno fijador puede realizarse por los fragmentos de todo el anticuerpo. Los fragmentos de unión al antigeno ejemplares son: (i) el fragmento Fab consistente en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd consistente en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento dAb (Ward, E. S. y col., Nature 341, 544-546 (1989) que consiste en un dominio VH; (iv) las regiones CDR aisladas; y (v) los fragmentos F(ab')2/ un fragmento bivalente que consta de dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región de bisagra; y (vi) el fragmento Fv consistente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo. El fragmento Fv es la unidad funcional más pequeña necesaria para unirse con alta afinidad del antigeno.

Un desafio importante en el campo de los anticuerpos ha sido reconstituir un vasto repertorio diverso de inmunoglobulinas que mimeticen la reserva de inmunoglobulinas en el sistema inmunitario humano. Un repertorio como este por lo regular tiene una complejidad 8 13 que abarca desde 10 hasta 10 inmunoglobulinas diferentes. La producción de un repertorio como este facilitaría en gran medida la identificación y producción de inmunoglobulinas capaces de interactuar específicamente con objetivos terapéuticos. No obstante, el diseño y la producción de un repertorio así tradicionalmente han sido interrumpidos por la falta de un medio estabilizador para el ensamble de la unidad funcional mínima, a saber, el fragmento Fv. Es un problema bien conocido en la técnica que las regiones VH y VL, cuando se expresan solas, tienen muy baja energía de interacción (Glockshuber y col., (1990) Biochemistry 29(6): 1362-1367). Los dos componentes se disocian a bajas concentraciones de la proteína y son demasiado inestables para múltiples aplicaciones a la temperatura corporal fisiológica. También ha sido un impedimento técnico que las proteínas grandes, como los anticuerpos completos (aunque extremadamente estables) no se expresen en un nivel apreciable en la célula hospedera, dificultando así la construcción de un repertorio de anticuerpos altamente diverso.

En fechas más recientes se han diseñado tres enfoques para generar los complejos VL y VH estables. No obstante, cada una de estas técnicas conlleva a un número de limitaciones intrínsecas y ninguna de estas evita por completo los tropiezos técnicos antes mencionados. El primer enfoque utiliza un ligador peptídico para conectar la VL y VH como una sola cadena (xscFv") (Huston y col., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 85: 5879-5883) . Aunque el fragmento scFv resultante muestra considerable actividad de unión al antígeno, no todos los anticuerpos pueden prepararse como cadenas individuales y todavía conservar elevada afinidad de unión (Huston y col., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 85: 5879-5883; Stemmer y col., (1993) Biotechniques 14(2): 256-265) . En parte, esto se debe a la interferencia de las secuencias ligadoras con los sitios de unión al antígeno. El segundo enfoque incluye la inserción de un par de residuos de cisterna en las regiones VL y VH para generar un fragmento Fv estabilizado con uniones disulfuro ("dsFv") (Brinkmann y col., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 90(16): 7538-7542). No obstante, el enlace disulfuro incorporado es inestable en las condiciones reductoras en múltiples células hospederas. Por ejemplo, en el citosol de E. Coli, el enlace disulfuro intermolecular con frecuencia es insuficiente para estabilizar el complejo VL y VH. Más aún, este método por lo regular requiere de información estructural tridimensional de las regiones V para garantizar que se inserte el par de cisteinas en un lugar sin la disrupcion de la actividad de unión. Debido a que se desconoce la información tridimensional de la gran mayoría de los anticuerpos existentes, este enfoque tiene poca utilidad práctica, y es especialmente inadecuado para construir una biblioteca de anticuerpos, en especial para construir repertorios de anticuerpos procedentes de las células V. El tercer enfoque para estabilizar las regiones VL y VH utiliza los enlaces disulfuro naturales para los dominios CHl y CL. Este método se lleva a cabo injertando los dominios CHl y CL ligados por enlaces disulfuro a los C terminales de las regiones VL y VH para reconstituir un fragmento Fab. Aunque el fragmento Fab resultante por lo regular es más estable y con frecuencia muestra mayor afinidad de unión en comparación con scFv, el fragmento Fab no es 'óptimo para la expresión de alto nivel y la construcción de repertorios de anticuerpos por su gran tamaño.

Algunas secuencias para la dimerización que forman estructuras helicoidales también se han empleado para ensamblar anticuerpos multivalentes . Específicamente, la Patente US No. 5,932,448 describe un heterodímero F(ab')2 biespecífico ligado por las cremalleras de leucina Fos y Jun. Las cremalleras de leucina Fos y Jun son secuencias bien identificadas de las que se sabe forman preferentemente heterodímeros . No obstante, todavía muestran una tendencia importante a formar homodimeros en condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a la temperatura corporal fisiológica (O'Shea y col., (1992) Cell 68 699-708; Vidal y col., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A). De hecho, el homodimero Jun/Jun es tan estable que la formación de heterodímero Fos/Jun in vitro requiere la disociación del homodimero Jun/Jun calentando primero o por la reducción con 2-mercaptoetanilamina (véase la Patente US No. 5910,573 columna 7 líneas 35-37; la Patente US No. 5,932,448, columna 16 líneas 15-30). Cuando se prueban in vivo, Fos y Jun producen cantidades detectables de homodimeros (véase, por ejemplo, la columna 15, líneas 41-43 de la Patente US No. 5,932,448; y Vidal y col., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A) aunque la existencia de alguna tendencia a la homodimerización puede no ser un problema considerable para la producción de una sola especie de anticuerpo, tal tendencia es un problema para la construcción de repertorios de anticuerpos, donde es necesaria una elevada eficiencia de la heterodimerización entre las regiones VL y VH.

Además de las cremalleras de leucina Fos y Jun, la Patente US No. 5,824,483 de Houston y col., describe la construcción de una biblioteca combinatoria de péptidos para dimerización enrollados en hélice. Houston y col., propone que la biblioteca es útil para identificar un polipéptido que sea capaz de interactuar específicamente con un ligando macromolécula seleccionado como pueden ser los anticuerpos (véase el último párrafo entre las páginas 8 y 9). Evidentemente, Houston y col., se refieren a la selección de "péptidos antigenos" que se unen a los anticuerpos elegidos, en lugar de la construcción y selección de anticuerpos objetivo. Al enfocarse en un propósito totalmente diferente, Houston y col., no describen ni incluso sugieren el uso de secuencias enrolladas en hélice para generar unidades de unión al antigeno estables.

Asi pues, sigue' habiendo una necesidad considerable de composiciones mejoradas y métodos para generar unidades de unión al antigeno estables y repertorios de estas para efectuar la identificación de unidades terapéuticas que se unan al antigeno. Una unidad ideal para unirse al antigeno sería más estable que un fragmento Fv, pero preferentemente sería más pequeña que un fragmento Fab para permitir la producción a gran escala y presentación eficiente. Una unidad de unión al antígeno como esta también serviría como un bloque constructivo para los anticuerpos multivalentes y/o multiespecíficos . La presente invención satisface estas necesidades y proporciona ventajas relacionadas también.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Un aspecto primordial de la presente invención es el diseño de una técnica para el ensamblaje específico de polipéptidos monoméricos para formar un heteromultímero estable. Esta técnica de producción de los heteromultímeros facilita la producción con altos rendimientos de los heteromultímeros funcionales y evita el ensamblado de homodímeros no deseados. El método es especialmente útil para generar un repertorio con diversidad genética de los heteromultímeros como unidades que se unen al antígeno. La técnica puede adaptarse fácilmente a una variedad de tecnología de "presentación de paquetes genéticos" que facilita la selección de unidades de unión al antígeno que poseen las especificidades de unión deseadas. Tales tecnologías de presentación de paquetes genéticos están detallas en las Patentes US Nos. 6248516, 5969108, 5885793, 5837500, 5571698, 5223409, 5514548, WO9005144, EP0368684, WO09201047, WO09311236 y WO09708320.

La unidad de unión al antígeno objeto se ensambla y estabiliza por la afinidad entre pares de un par diferente de secuencia de heterodimerización . Las secuencias son distintitas en cuanto a que al menos un miembro del par de heterodimerización es prácticamente incapaz de formar homodímeros bajo las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas. En ciertas modalidades, la unidad de unión al antígeno estabilizada no solo tiene un tamaño molecular más pequeño que un fragmento Fab, sino también muestra la especificidad y afinidad de unión necesaria. Más aún, ciertas unidades de unión al antígeno no monocatenarias de la presente invención portan afinidades de unión mayores que los anticuerpos monocatenarios tradicionales correspondientes (los scFv) . La unidad que se une al antígeno es particularmente conveniente para la construcción y presentación de bibliotecas de anticuerpos . Ciertas configuraciones de la unidad de unión al antigeno objeto sirven como unidades constructivas convenientes para inmunoglobulinas multivalentes y multiespecificas .

Específicamente, la presente invención proporciona una unidad de unión al antígeno no monocatenaria: (a) un polipéptido de cadena ligera (L) que consiste en una región variable de cadena ligera (L) fusionada a una primera secuencia de heterodimerización; (b) un polipéptido cadena pesada (H) que consta de una región variable de cadena pesada (H) fusionada a una segunda secuencia de la heterodimerización; en donde los polipéptidos de la cadena L y H se dimerizan por afinidad por pares de la primera y segunda secuencias de heterodimerización; y en donde al menos una de las secuencias de la heterodimerización es prácticamente incapaz de formar un homodímero en las condiciones amortiguadoras y fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas. Preferentemente, la primera y segunda secuencias de heterodimerización son prácticamente incapaces de formar homodímeros en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y a las temperaturas corporales fisiológicas.

En otro aspecto, la presente invención propone una unidad de unión al antigeno no monocatenaria : (a) un polipéptido de cadena ligera (L) que comprende en una región variable de la cadena ligera (L) fusionada a una primera secuencia de heterodimerización; (b) un polipéptido de cadena pesada (H) que comprende de una región variable de cadena pesada (H) fusionada a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde los polipéptidos de la cadena L y de la cadena H se dimerizan por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de heterodimerización; que provienen de los receptores heterodiméricos . En un aspecto, la primera y segunda secuencias de la heterodimerización comprenden secuencia de los receptores para la heterodimerización que median la heterodimerización de los receptores. En todavía otro aspecto, las secuencias de la heterodimerización objeto forman un dímero de la hélice enrollada. En todavía otro aspecto, los polipéptidos de la cadena L y la cadena H se dimerizan por afinidad por el par no covalente de las dos secuencias de la heterodimerización. Preferentemente, el polipéptido de la cadena L y la cadena H además comprende un flexón que es flanqueado por la región variable y la secuencia de la heterodimerización. Las secuencias de los polipéptidos L y H pueden obtenerse de cadenas L y H humanas. Para estabilizar más las unidades de unión al antigeno heterodiméricas , es posible introducir los residuos de cisteina para obtener enlaces disulfuro entre la cadena y la segunda secuencias de heterodimerización. Las unidades de unión al antigeno no monocatenarias pueden ser monovalentes o multivalentes . Estas pueden ser monoespecificas o multiespecificas . Las Bus multiespecificas , preferidas, son moléculas biespecificas, triespecificas y tetraespecificas .

En una modalidad independiente, la presente invención propone una unidad gue se une al antigeno, monocatenaria, que comprende una región variable de cadena ligera (L) y una región variable de cadena pesada (H) conectadas por una primera y una segunda secuencia de heterodimerización abarcando la distancia entre el C terminal de una de las regiones al N terminal de la otra región, en donde las dos regiones forman un dimero intramolecular por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de la heterodimerización; y en donde al menos una de las secuencias de la heterodimerización es prácticamente incapaz de formar un homodimero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas. Preferentemente, la primera y segundas secuencias de la heterodimerización son prácticamente incapaces de formar homodímeros en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y a las temperaturas corporales fisiológicas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una unidad de unión al antigeno monocatenaria, en donde las regiones VL y VH forman un dimero intramolecular por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de la heterodimerización que se obtienen de los receptores heterodiméricos . En un aspecto, la primera y segunda secuencias de la heterodimerización comprenden las secuencias de los receptores de la heterodimerización que medien la heterodimerización de los receptores.

En todavía otro aspecto, la primera y segunda secuencias de la heterodimerización forman un dimero de hélice enrollada. En otro aspecto, la primera y segunda secuencias de heterodimerización se dimerizan por afinidad no covalente por el par. Las regiones VL y VH pueden obtenerse de las secuencias correspondientes en las cadenas L y H humanas, respectivamente.

Las unidades de unión al antígeno no monocatenarias y monocatenarias pueden conjugarse a una porción con funcionalidad química. Las porciones funcionales ejemplares pueden ser, pero no se limitan a, los péptido señal, los agentes que favorezcan la reactividad inmunológica, los agentes que faciliten el acoplamiento a un soporte sólido, portadores de vacunas, modificadores de la bio-respuesta, toxinas, etiquetas que puedan detectarse, etiquetas paramagnéticas y fármacos.

Las secuencias de heterodimerización preferidas contenidas en las unidades de unión al antígeno objeto se obtienen de las secuencias C terminales del receptor GABAB1 y GABAB2, respectivamente. Más específicamente, la primera secuencia de la heterodimerización se liga a un residuo de cisteína, la primera heterodimerización comprende un polipéptido del receptor GABAB1 de al menos 30 residuos de aminoácidos, que es prácticamente idéntico a una secuencia peptídica lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO. 2; y la segunda secuencia de heterodimerización esta ligada a un residuo de cisteína, la segunda heterodimerización comprende un polipéptido del receptor GABAB2 de al menos 30 residuos de aminoácidos, que es prácticamente idéntico a una secuencia peptídica lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO. 4. De otro modo, la primera secuencia de la heterodimerización se liga a un residuo de cisterna, la primera heterodimerización comprende un polipéptido del receptor GABAB2 de al menos 30 residuos de aminoácidos, que es prácticamente idéntico a una secuencia peptídica lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO.4; y la segunda secuencia de la heterodimerización se liga a un residuo de cisteina, la segunda heterodimerización comprende un polipéptido del receptor GABAB1 de al menos 30 residuos de aminoácidos, que es prácticamente idéntico a la secuencia peptídica lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO. 2.

La presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia codificante que codifica el polipéptido L y H de una unidad de unión al antígeno no monocatenaria . La invención también proporciona un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia codificante que codifica las regiones VL y VH de una unidad de unión al antígeno monocatenaria. Asimismo se proporciona un vector que comprende cualquiera de los polinucleótidos recombinantes descritos en la presente. El vector puede ser un vector de expresión, por ejemplo un vector de presentación fago. Además, en esta invención se proporciona una biblioteca selectiva de vectores de expresión que codifican un repertorio de unidad de unión al antigeno, que contiene más de un vector objeto. Preferentemente, la biblioteca selectiva contiene una pluralidad de vectores de presentación fago.

La presente invención también proporciona una célula hospedera que contiene los polinucleótidos recombinantes objeto. El polinucleotido recombinante que codifica el polipéptido de cadena L y el polinucleotido que codifica el polipéptido de cadena H pueden estar presentes en un solo vector o en vectores independientes. la célula hospedera puede ser eucariótica o procariótica .

En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una unidad de unión al antígeno no monocatenaria . El método incluye los siguientes pasos: (a) expresar en una célula hospedera un primer polinucleotido recombinante que codifique un polipéptido de cadena ligera (L) que contenga una región variable de cadena ligera (L) fusionada a una primera secuencia de la heterodimerización, y un segundo polinucleotido recombinante que codifique un polipéptido de cadena pesada (H) que contenga una región variable de la cadena pesada ( (H) fusionada a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde los polipéptidos de la cadena L y de la cadena H se dimerizan por afinidad por el par de las primera y segunda secuencias de la heterodimerización; y en donde al menos una de las secuencias de la heterodimerización prácticamente incapaces de formar un homodímero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a la temperatura corporal fisiológica; y como una opción (b) aislar la unidad de unión al antigeno expresadas en la célula hospedera.

La unidad de unión al antigeno producida también puede contener secuencias de la heterodimerización que se obtengan de receptores heterodiméricos . Además, la unión al antigeno no monocatenaria expresada en el paso (a) puede mostrarse sobre la superficie de la célula hospedera. Preferentemente, la unión al antigeno no monocatenaria expresada en el paso (a) se presenta sobre una partícula de fago.

En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una unidad de unión al antígeno no monocatenaria, el método comprende los pasos de: (a) preparar un primer polinucleótido recombinante que codifique un polipéptido de cadena ligera (L) que contenga una región variable de la cadena ligera (L) fusionada a una primera secuencia de la heterodimerización, y un segundo polinucleótido recombinante que codifique un polipéptido de cadena pesada (H) que comprenda una región variable de la cadena pesada (H) fusionada a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde los polipéptidos de la cadena L y la cadena H se dimerizan por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de heterodimerización; y en donde al menos una de las secuencias de la heterodimerización prácticamente incapaz de formar un homodimero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas o a las temperaturas corporales fisiológicas, o ambas; y (b) permitir que el primero y segundo polipéptidos se dimericen por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de la heterodimerización. El paso de la dimerización puede tomar lugar in vitro ó in vivo.

Esta invención también incluye un método para producir una unidad de unión al antigeno monocatenaria. Los métodos incluye los pasos de: (a) expresar en una célula hospedera un polinucleótido que comprenda una secuencia codificante que codifique la unidad de unión al antigeno monocatenaria objeto; y como una opción (b) aislar la unidad de unión al antigeno monocatenaria expresada en la célula hospedera.

Esta invención además incluye un método para mostrar un heteromultímero quimérico que comprenda al menos dos polipéptidos sobre una superficie de una célula hospedera. Este método consiste en expresar en la célula hospedera: (i) un primer polinucleótido recombinante que codifique para un primer polipéptido fusionado a una primera secuencia de la heterodimerización y una secuencia presentadora de superficie; (ii) un segundo polinucleótido recombinante que codifique para un segundo polipéptido fusionado a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde el primero y segundo polipéptidos se dimerizan por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de la heterodimerización; en donde al menos una de las secuencias de la heterodimerización es incapaz de formar un homodimero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas ó a las temperaturas corporales fisiológicas, o ambas. En un aspecto, el primero y segundo polinuclectidos se expresan por un vector presentador fago individual. En otro aspecto, el primero y segundo polinucleótidos' se expresan por vectores presentadores fago separados. El heteromultímero quimérico preferentemente es una unidad 20 aislar la unidad de unión al antigeno monocatenaria expresada en la célula hospedera.

Esta invención además incluye un método para mostrar un heteromultímero quimérico que comprenda al menos dos polipéptidos sobre una superficie de una célula hospedera. Este método consiste en expresar en la célula hospedera: (i) un primer polinucleótido recombinante que codifique para un primer polipéptido fusionado a una primera secuencia de la heterodimerización y una secuencia presentadora de superficie; (ii) un segundo polinucleótido recombinante que codifique para un segundo polipéptido fusionado a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde el primero y segundo polipéptidos se dimerizan por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de la heterodimerización; en donde al menos una de las secuencias de la heterodimerización es incapaz de formar un homodímero en las' condiciones amortiguadoras fisiológicas o a las temperaturas corporales fisiológicas, o ambas. En un aspecto, el primero y segundo polinucleótidos se expresan por un vector presentador fago individual. Eri otro aspecto, el primero y segundo polinucleótidos se expresan por vectores presentadores fago separados. El heteromultímero quimérico preferentemente es una unidad 21 de unión al antígeno no monocatenaria de la presente invención .

La invención también comprende un método para identificar una unidad de unión al antigeno no monocatenaria que sea inmuno-reactiva con un antigeno deseado. El método comprende los pasos de: (a) preparar un repertorio de unidades de unión al antigeno con diversidad genética, en donde el repertorio consiste en más de una unidad de unión al antigeno objeto; (b) poner en contacto el repertorio de unidades de unión al antigeno con el antigeno deseado; y (c) detectar una unión especifica entre las unidades de unión al antigeno y el antígeno, por medio de lo cual identificar la unidad de unión al antigeno que sea inmuno-reactiva con el antígeno deseado. En un aspecto de esta invención, el repertorio de unidades de unión al antígeno se prepara expresando una biblioteca de vectores que codifiquen para una pluralidad de unidades de unión al antígeno. Preferentemente, la biblioteca de vectores comprende una pluralidad de vectores fago.

Por último, la presente invención proporciona un equipo que contiene un vector de esta invención en un envase conveniente. 22 EXPLICACION DE LAS ABREVIATURAS QUE SE UTILIZAN EN LA PRESENTE Nsc: no monocatenario Se: monocatenario Abu unidad de unión al antigeno Abus unidades de unión al antigeno Cadena L cadena ligera Cadena H: cadena pesada VL: región de la cadena ligera VH: región variable de la cadena pesada BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática de las diferentes unidades de unión al antigeno.

La Figura 2 representa el nucleótido y las secuencias de aminoácidos del receptor GABAB 1 y 2 que se utilizaron para construir las Abus objeto. Las secuencias de hélice enrollada se obtienen de los receptores GABAB-R1 y GABAB-R2 humanos. Las secuencias codificantes de los aminoácidos procedentes del receptor GABAB comienzan con EEKS y terminan con QLQS, como se muestra en la parte superior de la Figura 2. Las secuencias codificantes de los aminoácidos procedentes del receptor GABAB2 comienzan con TSRL y terminan con QLQD, como se 23 muestra en la parte inferior de la Figura 2. Se adicionó un separador flexible SerArgGlyGlyGlyGly a los amino terminales de las secuencias de heterodimerización Rl y R2 para favorecer la formación del heterodimero funcional Fv. Para estabilizar más el heterodimero, introdujimos un separador ValGlyGlyCys para bloquear heterodimérico de hélice enrollada por el enlace disulfuro entre los residuos de cisterna (SEQ ID NOS. 2 y 4) . Las secuencias codificantes SerArg en el N terminal del separador GGGG proporciona los sitios Xbal y Xhol para la fusión de los dominios GR1 (secuencia de heterodimerización procedente del receptor GABAB1) y GR2 (secuencia de heterodimerización procedente de GABAB2) a los carboxilos terminales de los fragmentos VH y VL, respectivamente.

La Figura 3A es una representación esquemática de dos vectores de expresión: pABMXl y pABMX2. pABMXl y pABMX2 se obtuvieron del pbluescript SK(+) que comprende un gen de resistencia a ampicilina (Amp) para selección con antibióticos, un origen de replicación plasmidico (colEl ori) un origen de replicación fago fl (fl ori) y el cásete de expresión promotor lac/proteina obtenida de lac 01 (etiqueta plac-RBS-p8 lider-DH para pABMXl, etiqueta plac-RBS-pelB lider-DH para pABMX2) . La secuencia heteróloga se expresa como una proteína de 24 fusión DH-tag (etiqueta HA y 6 x His) , y se dirige por el péptido señal p8 líder o pelB líder hacia el espacio periplasrrtídico, donde se disocia la secuencia líder.

La Figura 3B representa las secuencias (SEQ ID NOS. 5-8) después del promotor lac entre los sitios Agel y BglII de pABMXl y pABMX2. Los sitios HindIII/Xbal o HindIII/Notl ó Xbal/Notl pueden utilizarse para insertar secuencias heterólogas que se vayan a expresar en el vector pABMXl. Los sitios de clonación adicionales incluidos en el vector pABMX2 son Ncol, PstI, Xbal y Notl.

La Figura 4A es una representación esquemática de los vectores fagémidos pABMDl y pABMD2 útiles para presentar las unidades de unión al antígeno. Los vectores pABMDl y pABMD2 fueron obtenidos de pAMBXl y pABMDX2, respectivamente, estos comprenden todos los elementos funcionales de los vectores pABMXl y pABMX2, y el gen pIII de un fago filamentoso. El gen pIII se insertó inmediatamente junto al extremo 3' de la etiqueta DH. El promotor lac impulsa la expresión de una secuencia heteróloga como proteína de fusión de la cápside pIII, que a su vez se despliega sobre una partícula' de fago tras la súper infección de un fago cooperador como el 25 fago cooperador K07 (Amersham Pharmacia Biotech) ó R408 (Stratagene) . Este vector también puede utilizarse para la expresión de proteínas solubles en una cepa bacteriana no supresora.

La Figura 4 representa la secuencia (SEQ ID NOS. 9-12) después del promotor lac entre los sitios Agel y Salí de pABMDl y pABMD2.

La Figura 5A es una representación esquemática de los vectores pABMX5 y ?????ß. pABMX5 y ABMX6 se obtuvieron de pABMXl y pABMX2,' respectivamente. Las diferentes secuencias líder fueron incorporadas en pAB X5 y pABMX6. Los sitios de subclonación para la inserción de las secuencias heterólogas, por ejemplo, el gen de VH, también difieren en estos dos vectores . pABMX5 contiene el líder p8, y pABMX6 contiene el líder pelB. Dos casetes de expresión de proteínas que emplean el promotor lac fueron manipulados en estos dos vectores. El primer cásete se utiliza para expresar VH-GRl (secuencia de la heterodimerización-VH del receptor GABAB1) y el segundo se utiliza para expresar VL-GR2 (secuencia de eterodimerización-VL del receptor GABAB2) . La etiqueta DH se fusionó al dominio GR2 para facilitar la purificación de los heterodímeros resultantes. 26 La Figura 5B representa las secuencias (SEQ ID NOS. 13-16) entre la secuencia líder y la etiqueta DH en los vectores pABMX5 y pABMX6. Además, el sitio de unión al ribosoma, la etiqueta DH, los sitios de subclonación para la inserción de VH, VL, GR1 y GR2, también están indicados.

La Figura 6 es una representación esquemática de los vectores fagémidos, pAB D5 y pABMD6, que son útiles para expresar y presentar ccFv en una partícula de fago. pABMD5 y pABMD6 fueron obtenidos de pABMX5 y pABMX6, respectivamente. El gen pIII procedente del fago filamentoso fue insertado e inmediatamente después de la etiqueta DH. Las proteínas VL-GR2 fueron ligadas a la proteína de la cápside pIII para facilitar la presentación del heterodímero ccFv.

La Figura 6B representa las secuencias (SEQ ID NOS. 17-20) entre la secuencia líder y pll para los vectores pABMD5 y pABMD6. Además, el sitio de unión al ribosoma, la etiqueta DH, el gen pIII parcial, los sitios de subclonación para la inserción de VH, VL, GRl, y GR2 también están indicados.

La Figura 7 representa el vector pAMEX7 útil para expresar el fragmento ccFv en levaduras. 27 La Figura 8 representa los resultados de un ensayo ELISA utilizando los fragmentos AM2-scFv que fueron expresados por el vector pABMXl . Los resultados muestran una unión AM2-scFv dependiente de la dosis a su antigeno AM2.

La Figura 9 representa los resultados de un ensayo ELISA utilizando los fragmentos AM2-scFv que fueron presentados sobre las partículas de fago. Los resultados demuestran el montaje de los fragmentos scFv funcionales sobre las partículas de fago utilizando el vector fagémido pAB Dl.

La Figura 10A representa los resultados del análisis en SDS-PAGE de AMl-ccFv expresado en E. Coli en condiciones reductoras y no reductoras . Los resultados demuestran la expresión y el montaje exitosos de ccFv heterodimérico en E. Coli.

La Figura 10 representa los resultados de un ensayo ELISA utilizando AMlccFv soluble expresado en E. Coli. Los resultados indican el montaje exitoso de ccFv funcional con la especificidad de unión esperada a su antígeno correspondiente. 28 La Figura 11A representa una comparación de la capacidad de unirse al antígeno del fago que expresa AMl-ccFv y la del fago que expresa AMl-scFv. Los resultados demuestran que las partículas de fago que presentan los fragmentos AMl-ccFv muestran ligeramente mayor capacidad de unión que los fagos que presentan los fragmentos scFv tradicionales.

La Figura 11B representa una comparación de la capacidad para unirse al antígeno del fago que expresa AM2-ccFv y la del fago que expresa AM2-scFv. Los resultados indican que la capacidad de unión de las partículas de fago que presentan los fragmentos AM2-ccFv es aproximadamente un orden de magnitud mayor que la de los fagos que expresan AM2-scF .

La Figura 12 representa tres configuraciones Abu multivalentes, cada una conteniendo más de una unidad ccFv fundamental.

La Figura 13 representa cuatro configuraciones Abu bivalentes, cada una conteniendo una unidad fundamental ccFv y un fragmento qscFv o un dsFv. 29 La Figura 14 representa tres configuraciones Abu trivalentes, cada una conteniendo una o más unidades fundamentales ccFv, uno o más fragmentos scFv o dsFv.

La Figura 15 representa 4 configuraciones Abu biespecificas, cada una conteniendo una o más unidades fundamentales ccFv con diferentes especificidades de unión, y/o un fragmento scFv o dsFv.

La Figura 16 representa tres configuraciones Abu biespecificas, adicionales.

La Figura 17 representa tres configuraciones Abu triespecificas , cada una conteniendo al menos una unidad fundamental ccFv, y al menos un fragmento scFv o dsFv.

La Figura 18 representa dos configuraciones Abus, individuales, ejemplares, en las que las secuencias de la heterodimerización se ordenan en una configuración paralela o antiparalela.

La Figura 19 es una representación esquemática del ccFv presentado sobre la superficie de una célula procariótica o eucariótica. La parte superior representa 30 el ccFv presentado en una partícula fago que se adhiere a la superficie de una célula hospedera.

La Figura 20 representa los resultados de tamizar una "biblioteca de fagos modelo" utilizando ELISA, que incluye el antigeno proteina inmovilizada para M2 procedente del tamizado de una "biblioteca modelo". La "biblioteca modelo" contenia una mezcla de fagos AM2-ccFv y fagos no relacionados, AMl-ccFv, en una proporción de 1:106 y 1:107, respectivamente. Las lecturas de ELISA, puesto que solo detecta la reactividad de A 2-ccFv, representaría la población de AM2-ccFv en la mezcla. Después de una primera ronda de tamizaje, no se detectó ninguna señal ELISA, indicando que la fracción A 2-ccFv presente en la mezcla todavía era baja. No obstante, después de dos rondas de tamizaje, la fracción AM2-ccFv medida se volvió predominante, según se observa por un aumento drástico en la señal ELISA.

La Figura 21 representa el análisis PCR para confirmar el enriquecimiento de AM2-ccFv por tamizaje de la biblioteca modelo que se muestra en la Figura 12. Antes del tamizaje, un fago AM2-ccFv se detectó en cada ? 10 fagos no relacionados (0.00001%) . Después de la primera ronda de tamizaje, la presencia de AM2-ccFv 31 alcanzo 4.4% y luego 100% después de la segunda ronda de tamizaj e .

La Figura 22 represente el diseño de CDR3 de VH (la cadena pesada) de AM2-ccFv. El oligo DNA degenerativo se amplificó por dos cebadores de la PCR que fueron flanqueados por dos sitios de restricción subclonantes . El oligo primero fue amplificado en la PCR y después digerido por restricción antes de ser subclonado para sustituir la CDR3 tipo nativo de la VH de Am2-ccFv.

La Figura 23 representa los resultados ELISA del fago AM2-ccFv de los clones individuales que fueron elegidos al azar del quinto (parte superior) y el séptimo (panel inferior) tamizajes. Cada barra representa la lectura a DO450 de una variante especifica de AM2-ccFv.

La Figura 24 representa las secuencias de las variantes elegidas del tamizaje de la biblioteca AM2-ccFv CDR3 VH. En la parte superior se muestra la secuencia de aminoácidos de la biblioteca (X indica múltiples opciones de residuos procedentes del oligo DNA degenerativo descrito en la Figura 22); abajo se muestran los residuos elegidos en cada posición "X" del tamizaje y sus tasas de acierto (tasa de ocurrencia de un residuo especifico) las 32 posiciones que no cambiaron por el diseño de la biblioteca se muestran en blanco. El concenso procedente del tamizaje se muestra en la base.

La Figura 25 representa una comparación de las tasas Koff de una variante AM2-ccFv y el AM2-ccFv tipo nativo. La pendiente de las curvas representa la rapidez Con la que se disocia el antigeno del anticuerpo de prueba.

MODO(S) PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN A lo largo de esta descripción se hace referencia a algunas publicaciones, patentes y especificaciones de patentes publicadas mediante una cita que las identifica.

Las descripciones de estas publicaciones, patentes y especificaciones de patentes publicadas se incorporan por este medio como referencia en la presente descripción.

Técnicas generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, las técnicas tradicionales de la inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, DNA genómico y recombinante, que están dentro de las habilidades en la técnica. Véase, por ejemplo, "Matthews, PLANT VIROLOGY, 3a edición (1991); Sambrook, Fritsch y 33 Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, y col., (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPhearson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lañe, eds . (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney ed. (1987)).

Cuando se utiliza en la especificación y las reivindicaciones, una forma singular "un", "uno" y "el" incluye las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente de otro modo. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, también las mezclas de estas.

Definiciones Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteínas" se utilizan en forma equivalente para referirse a los polímeros de los aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal, cíclico o ramificado, puede contener aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos . Los términos también comprenden los polímeros de los aminoácidos que han sido modificados, por ejemplo, por sulfación [sic] , glucosilación, lapidación, 34 acetilación, fosforilación, iodinación, metilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, adición mediada por RNA de transferencia de los aminoácidos a las proteínas como arginilación, ubiquitinación o cualquier otra manipulación, como puede ser la conjugación con un componente etiquetador. Cuando se utiliza en la presente, el término "aminoácidos" se refiere a los aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, que incluye la glicina y los isómeros ópticos D ó L y los análogos y péptido miméticos de los aminoácidos .

El polipéptido o secuencia de aminoácidos "procedente de" una proteína determinada se refiere al origen del polipéptido. Preferentemente, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es prácticamente idéntica a la de un polipéptido codificado en la secuencia, o una parte de éste, en donde la parte consiste en al menos 10-20 aminoácidos, de preferencia al menos 20-30 aminoácidos, con mayor preferencia, al menos 30-50 aminoácidos, o que puede ser identificado por medios inmunológicos con un polipéptido codificado en la secuencia. Esta terminología también incluye un polipéptido expresado a partir de una secuencia de ácido nucleico determinada. 35 üna proteina "quimérica" contiene al menos un polipéptido de fusión que comprende las regiones en una posición diferente en la secuencia en comparación como se encuentran en la naturaleza. Las regiones pueden existir normalmente en proteínas separadas y se reúnen en el polipéptido de fusión; o pueden existir normalmente en la misma proteína pero estar colocada en un nuevo arreglo en el polipéptido de fusión. Una proteína quimérica puede ser creada, por ejemplo por síntesis química o creando y traduciendo un polinucleótido en el que las regiones peptídicas estén codificadas en la relación deseada.

Una "proteína multimérica" cuando se utiliza en la presente se refiere a una proteína globular que contenga más de un polipéptido separado o cadena proteínica asociados entre sí para formar una proteína globular individual in vitro ó in vivo. La proteína multimérica puede consistir en más de un polipéptido de la misma clase para formar un "homomultímero" . De otro modo, la proteína multimérica también puede estar compuesta de más de un polipéptido de secuencias distintas para formar un "heteromultímero" . Así pues, un "heteromultímero" es una molécula que comprende al menos un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el segundo polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos del primer 36 polipéptido en al menos un residuo de aminoácido. El heteromultímero puede comprender un "heterodímero" formado por el primero y segundo polipéptido o puede formar estructuras terciarias de orden superior donde estén presentes más de dos polipéptidos . Las estructuras ejemplares para el heteromultímero incluyen heterodímeros (por ejemplo los fragmentos Fv y Fab, diacuerpos, receptores GABAB1 y 2, complejos), proteínas G triméricas, heterotetrámeros (por ejemplo los fragmentos F(ab' )2) y otras estructuras oligoméricas .

El "primer polipéptido recombinante" de un heteromultímero quimérico se refiere a cualquier polipéptido que este o haya sido asociado con un "segundo polipéptido recombinante" por la afinidad por el par de dos secuencias de la dimerización que estén ligadas al primero y segundo polipéptidos,- respectivamente. Preferentemente, el primero y segundo polipéptidos contiene _ secuencias procedentes de una cadena ligera o una pesada de una inmunoglobulina . Más preferentemente, el primero y segundo polipéptido forma un Nsc Abu que confiere especificidad de unión a un antígeno deseado.

Una "primera secuencia de heterodimerización" se refiere a cualquier secuencia de dimerización que esta o 37 fue asociada con una "segunda secuencia de heterodimerización", en donde la segunda secuencia de heterodimerización difiere en la secuencia de aminoácidos por al menos un residuo de aminoácido. Un "par de heterodimerización" se refiere a dos secuencias de heterodimerización capaces de formar un heterodimero .

El término "anticuerpo" cuando se utiliza en la presente se refiere a las moléculas de inmunoglobulina y partes con actividad inmunológica de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contengan un sitio de unión al antigeno que unen específicamente ("inmuno-reaccionan con") un antígeno. Desde el punto de vista estructural, el anticuerpo más simple que se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, la IgG) consiste en cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Las inmunoglobulinas representan una gran familia de moléculas con diversos tipos de moléculas como IgD, IgG, IgA, IgM e IgE. El término "molécula de inmunoglobulina" incluye, por ejemplo, anticuerpos híbridos o anticuerpos ¦ alterados, y fragmentos de estos. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede efectuarse por los fragmentos de un anticuerpo natural. Estos 38 fragmentos se denominan en forma colectiva "unidades de unión al antigeno" ("Abus") . Con base en sus estructuras moleculares, las Abus pueden dividirse ampliamente en los tipos "monocatenario" ("Se") y "no monocatenario" ("Nsc") .

También comprendidas dentro de los términos "anticuerpos" y "Abus" están las moléculas de inmunoglobulina de una variedad de orígenes de especies que incluyen invertebrados y vertebrados. El término "humano" cuando se aplica a un anticuerpo o una Abu se refiere a una molécula de inmunoglobulina expresada por un gen humano o fragmento de este. El término "humanizado" cuando se aplica a anticuerpos no humanos (por ejemplo de roedor o primate) se refiere a inmunoglobulinas híbridas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de estas que contengan la secuencia mínima procedente de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipendario) en el que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del recipendario se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) como puede ser un ratón, rata, conejo o primate que tenga la especificidad, afinidad y 39 capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de la estructura fundamental (FR) Fv de la inmuno-globulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede contener residuos que no se encuentren ni en el anticuerpo recipendario ni en la CDR importada o las secuencias de la estructura fundamental. Estas modificaciones se hacen para retinar más y optimizar el funcionamiento del anticuerpo y llevar al mínimo la inmunogenicidad cuando se introduce en un cuerpo humano. En general, el anticuerpo humanizado contendrá prácticamente todo de al menos uno, y por lo regular dos, dominios variables, en los cuales todas o prácticamente todas las regiones CDR correspondan a las de una inmunoglobulina no humana y todas o prácticamente todas las regiones FR sean las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, por lo regular de una inmunoglobulina humana.

"Unidad de unión al antigeno no monocatenaria" (Nsc Abus" son heteromultímeros que constan de un polipéptido de cadena ligera y un polipéptido de cadena pesada. Los ejemplos de las Nsc Abus incluyen, pero no se limitan a: 40 (i) un fragmento ccFv (Figura 1) estabilizado por las secuencias de heterodimerización aquí descritas; (ii) cualquier otra molécula monovalente y multivalente que contenga al menos un fragmento ccFv como se describe en la presente; (iii) un fragmento Fab consistente en los dominios VL, VH, CL y CHl; (iv) un fragmento Fd consistente en los dominios VH y CHl; (v) un fragmento Fv consistente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (vii) un diacuerpo; (viii) cualquier otra Nsc Abus que este descrito en Little y col., (2000).

Como ya se mencionó, una Nsc Abus puede ser "monovalente" o "multivalente". Aunque la primera tiene un sitio de unión por unidad de unión al antigeno, la última contiene múltiples sitios de unión capaces de unirse a más de un antigeno de la misma clase o diferente. Dependiendo del número de sitios de unión, una Nsc Abus puede ser bivalente (teniendo dos sitios de unión al antigeno) , trivalente (con tres sitios de unión al antigeno) , tetravalente (con cuatro sitios de unión al antigeno) y así sucesivamente. 41 Las Nsc Abus multivalentes además pueden clasificarse con base en sus especificidades de unión. Una Nsc Abu "monoespecifica" es una molécula que puede unirse a uno o más antigenos de la misma clase. Una Nsc Abu "multiespecifica" es una molécula que tiene especificidades de unión para al menos dos antigenos diferentes. Aunque estas moléculas normalmente solo se unirán a dos antigenos distintos (es decir, Abus biespecificas ) , los anticuerpos con especificidades adicionales como los anticuerpos triespecificos están comprendidos por esta expresión cuando se utilizan en la presente (véase, por ejemplo las figuras 15-17). Los ejemplos de las unidades de unión al antigeno biespecificas incluyen aquellas con un brazo dirigido contra un antigeno de célula tumoral y el otro brazo dirigido contra una molécula activadora citotóxica como anti-Fc.RI/anti-CD15, anti-pl85HER2/Fc.RIII (CD16) , anti-CD3/anti-célula B maligna (1D10) , anti-CD3/anti-?185?^ , anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de célula renal, anti-CD3/anti-OVCAR, anti-CD3/L-Dl (anticarcinoma de colon) , anti-CD3/anti-análogo de la hormona estimuladora de melanocitos, anti-receptor EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAl, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18 , anti-molécula de adhesión a las células neurales (NCAM) /anti-CD3 , anti-proteina de unión al 42 folato ( FBP) /anti-CD3 , anti-antígeno asociado al carcinoma pan (AMOC-31) /antiCD3 ; Abus biespecificas con un brazo que se une específicamente a un antígeno de tumor y un brazo que se une a una toxina como anti-saporina/anti-Idl, anti-CD22/antisaporina, anti- CD7 /anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadena ricin A, anti-interferón-a (IFN-a) /anti-hibridoma idiotipo, anti-CEA/anti-alcaloide vinca; BsAbs para convertir profármacos activados por enzimas como anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión del profármaco fosfato de mitomicina a mitomicin alcohol); Abus biespecifica que pueden utilizarse como agentes fibrinoliticos como anti-fibrina/anti-activador de plasmlnógeno de tejido (tPa) , anti-fibrina/anti-activador de plasminógeno tipo urocinasa (uPA) ; unidades de unión al antígeno biespecificas para dirigir complejos inmunes a los receptores de la superficie celular como ' anti-lipoproteína de baja densidad (LDL) /anti-receptor Fe (por ejemplo FcyRI, FcyRII ó FCYRIII); Abus biespecificas para utilizarlas en terapéuticas de enfermedades infecciosas como anti-CD3/anti-virus de herpes simple (VHS) , anti-receptor de células T: complejo CD3/anti-influenza, anti-FCyR/anti-VIH; Abus biespecificas para detección de tumor in vitro ó in 43 vivo como puede ser anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85 /anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacunas (véase Fanger y col., supra) ; y Abus biespecíficas como herramientas de diagnóstico como puede ser IgG/anti conejos/anti-ferritina, anti-peroxidasa de rábano (HRP) /anti-hormona, anti-somatostatina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-beta-galactosidasa (véase Nolan y col., supra) . Los ejemplos de los anticuerpos triespecificos incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8 /anti-CD37.

Unidad de unión al antigeno monocatenaria "("Se Abu") se refiere a una Abu monomérica. Aunque los dos dominios del fragmento Fv están codificados por genes independientes, puede prepararse un ligador sintético que les permita formar una cadena de proteina única (es decir, Fv monocatenario (scFv") como esta descrito en Bird y col., (1988) Science 242:423-426 y Huston y col., (1988) PNAS 85_: 5879-5883) por los métodos recombinantes . Otras Se Abus incluye moléculas de unión al antigeno estabilizadas por las secuencias de heterodimerización objeto (véase por ejemplo la Figura 18), y los fragmentos dAb (Ward y col., (1989) Nature 341: 544-546) que consisten en un dominio VH y una región determinante de 44 la complementariedad aislada {COR) . Un ejemplo de un péptido ligador es (GGGGS)3, que forma el puente de aproximadamente 3.5 nm entre el carboxilo terminal de una región V y el amino terminal de otra región V. Otras secuencias ligadoras también pueden utilizarse, y pueden proporcionar funciones adicionales, como puede ser un medio para unir un fármaco a un soporte sólido. Una unidad de unión al antigeno monocatenario preferida contiene regiones VL y VH que estén ligados entre si y estabilizadas por un par de secuencias de heterodimerización objeto. Los scFvs pueden ensamblarse en cualquier orden, por ejemplo, VH- (primera secuencia de heterodimerización) - (segunda secuencia de heterodimerización) -VL ó VL- (primera secuencia de heterodimerización) - (segunda secuencia de heterodimerización) -VH.

Un "repertorio de unidades de unión al antigeno" se refiere a una pluralidad de unidades que se unen al antigeno , al menos dos de las cuales muestran especificidades, de unión distintas. Un repertorio con diversidad genética de unidades de unión al antigeno se refiere a una pluralidad de unidades de unión al antigeno, la mayoría, si no es que todas las unidades de unión al antígeno muestran especificidades de unión 45 únicas con respecto a las demás. Un repertorio con diversidad genética por lo regular tiene una complejidad de al menos 106 a 1013, de preferencia entre 107 a 109, de 8 10 preferencia entre 10 a 10 , incluso con mayor 8 11 preferencia entre 10 a 10 , unidades de unión al antigeno distintas.

Un anticuerpo o Abu "se une específicamente a" o "es inmuno-reactivo con "un antígeno sí este se une con mayor afinidad o avidez que como se une a otros antígenos de referencia incluidos los polipéptidos y otras sustancias.

Un Abu se presenta "sobre la superficie de una célula hospedera" cuando el Abu se presenta en la superficie exterior de una célula hospedera. El Abu presentado puede estar unido directamente a la superficie externa de la célula hospedera o puede estar unido indirectamente a la célula hospedera por un paquete genético unido a la célula hospedera, como puede ser una partícula de fago.

"Secuencias presentadoras de superficie o superficiales" se refiere a las secuencias que facilitan la presentación de las secuencias heterólogas. Por lo 46 regular, las secuencias presentadoras de superficie están presentes sobre la superficie externa de un paquete genético, por ejemplo fago o bacteria. Las secuencias presentadoras superficiales preferidas de fago es pIII del fago filamentoso M13.

"Antigeno" cuando se utiliza en la presente significa una sustancia que es reconocida y unidad específicamente por un anticuerpo. Los antígenos pueden incluir péptidos, proteínas, glucoproteínas , polisacáridos y lípidos; partes de estos o combinaciones de estos.

Cuando se utiliza en la presente, el término "antígenos de superficie" se refiere a los componentes de la membrana plasmática de una célula. Comprende las proteínas de membrana integradas y periféricas, las glucoproteínas, polisacáridos y lípidos que constituyen la membrana plasmática. Una "proteína de membrana integrada" es una proteína de transmembrana que se extiende a través de la bicapa lipídica de la membrana plasmática en una célula. Una proteína de membrana integrada común consiste en al menos un "segmento que abarca la membrana" que por lo regular contiene residuos de aminoácidos hidrofóbicos . Las proteínas de la membrana 47 periférica no se extienden hacia el interior hidrofóbico de la bicapa lipidica y están unidas a la superficie de la membrana por interacción no covalente con otras proteínas de la membrana.

Los términos "membrana", "citosólicos", "nucleasa" y "secretado" cuando se aplica a las proteínas celulares, específica la ubicación extracelular y/o subcelular en la que la proteína celular se localiza en su mayor parte, principalmente o de preferencia.

"Receptores de la superficie celular" representa una subserie de proteínas de membrana capaces de unirse a sus ligandos respectivos. Los receptores de la superficie celular son moléculas ancladas o insertadas en la membrana plasmática de la célula. Estos constituyen una gran familia de proteínas, glucoproteínas, polisacáridos y lípidos que sirven no sólo como constituyentes estructurales de la membrana plasmática, sino también como elementos reguladores que gobiernan una variedad de funciones biológicas.

Un "receptor heterodímero" comprende las proteínas celulares compuestas de dos subunidades proteináceas que muestran afinidad de unión para un ligando. Las dos 48 subunidades proteináceas son moléculas distintas que difieren en la secuencia de aminoácidos por al menos un residuo de aminoácido. Los receptores heterodiméricos ilustrativos, no limitantes, son aquellos que se unen a los factores de crecimiento (por ejemplo la heregulxna), los neurotransmisores (por ejemplo el ácido aminobutírico) , y otras moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas (por ejemplo los mineralocorticoides o glucocorticoides . Los receptores heterodiméricos preferidos son receptores de hormonas nucleares (Belshaw y col., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A 93(10): 4604-4607) , el complejo de receptores erbB3 y erbB2 y los receptores acoplados a la proteina G que incluyen, pero no se limitan a las familias de receptores de opiodes (Gomes y col., (2000) J. Neuroscience 20(22): RC110) ; Jordán y col., (1999) Nature 399: 697-700), muscarinicos , dopamina, serotonina, adenosina/dopamina y GABAB.

"Dominio" se refiere a una parte de una proteina que se distingue desde el punto de vista físico o funcional de otras partes de la proteina o péptido. Los dominios físicamente definidos incluyen aquellas secuencias de aminoácidos que son excepcionalmente hidrófobas o hidrófilas, como las secuencias que están asociadas a la membrana o asociadas al citoplasma. Los 49 dominios también pueden estar definidos por homologías internas que surgen de, por ejemplo, duplicación génica. Los dominios definidos por la función tienen función (es) biológica (s) distinta (s). El dominio de unión al ligando de un receptor, por ejemplo, es aquel dominio que une el ligando. Un dominio de unión al antigeno se refiere a la parte de una unidad de unión al antígeno o un anticuerpo que se une al antigeno. Los dominios definidos por la función no necesitan estar codificados por secuencias de aminoácidos contiguas. Los dominios definidos por la función pueden contener uno o más dominios físicamente definidos. Los receptores, por ejemplo, se dividen generalmente en el dominio de unión al ligando extracelular, un dominio transmembranal y un dominio efector intracelular . Un "dominio de anclaje a la membrana" se refiere a la parte de una proteína que media la asociación a la membrana. En general, el dominio de anclaje a la membrana esta compuesto de residuos de aminoácidos hidrófobos. De otro modo, el dominio de anclaje a la membrana puede contener aminoácidos modificados, como los aminoácidos que se unen a una cadena de ácido graso, que a su vez ancla la proteína a una membrana. 50 Una "célula hospedera" incluye una célula individual o cultivo de células que puede ser o ha sido un receptor para los vectores objeto. Las células hospederas incluye la progenie de una célula hospedera individual. La progenie puede no necesariamente ser idéntica por completo (en morfología o en el genoma del DNA complementario total) a la célula precursora original debido a la mutación natural, accidental o deliberada. Una célula hospedera incluye células transfectadas in vivo con un vector de esta invención.

Una "línea celular" o "cultivo celular" denota crecimiento de células bacterianas, de plantas, insecto eucarióticas superiores o que se mantienen in vitro. Los descendientes de una célula pueden no ser completamente idénticos (desde el punto de vista morfológico, genotípico o fenotípico) a la célula precursora.

Un "medio definido" se refiere a un medio que contiene los requerimientos nutricionales y hormonales necesarios para la supervivencia y/o crecimiento de las células en el cultivo de modo que se conozcan ' los componentes del medio. Por lo regular, el medio definido ha sido formulado por la adición de factores nutricionales y de crecimiento necesarios para el 51 crecimiento y/o supervivencia. Por lo regular, el medio definido proporciona al menos un componente de una . o más de las siguientes categorías: (a) todos los aminoácidos esenciales, y por lo regular la serie fundamental de los 20 aminoácidos más cisterna; (b) una fuente de energía, por lo regular en forma de un carbohidrato como glucosa (c) vitaminas y/u otros componentes orgánicos necesarios en concentraciones bajas; (d) ácidos grasos libres; y (e) oligoelementos, donde los oligoelementos se definen como compuestos inorgánicos o elementos que ocurren en la naturaleza que por lo regular son necesarios en concentraciones muy bajas, por lo común en el intervalo de microgramos. El medio definido también puede ser suplementado óptimamente con uno o más componentes de cualquiera de las categorías siguientes: a) uno o más agentes mitógenos; b) sales y amortiguadores como puede ser calcio, magnesio y fosfato; c) nucleósidos y bases, por ejemplo adenosina y timidina, hipoxantina; y d) proteína e hidrolizados tisulares.

Cuando se utiliza en la presente, el término "aislado" significa separado de los constituyentes, celular o otro modo, con los cuales el nucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmentos de estos, normalmente se asocian en la naturaleza. Como 52 es evidente para los expertos en la técnica, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteina, anticuerpo o fragmento de estos que no se encuentre en la naturaleza, no necesita "aislamiento" para distinguirlo de su contraparte que ocurre en la naturaleza. Además, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteina, anticuerpo o fragmento de estos ""concentrado", "separado" o "diluido", se puede distinguir de su contraparte que se encuentre en la naturaleza en cuanto a que la concentración o número de moléculas por volumen es mayor que "concentrado" o menor que "separado" en comparación con su contraparte que se encuentra en la naturaleza.

El enriquecimiento puede medirse en forma absoluta, como el peso por volumen de solución, o puede medirse en relación con una segunda sustancia potencialmente interférente presente en la mezcla fuente. Los enriquecimientos crecientes de las modalidades de esta invención son cada vez más preferidos. Asi pues, por ejemplo, se prefiere un enriquecimiento doble, se prefiere más un enriquecimiento de 1000%, es más preferible un enriquecimiento de 1000,000% y es aún más preferible un enriquecimiento de 1,000,000%. Una sustancia también se puede proporcionar en un estado 53 aislado por un proceso de ensamble artificial, como puede ser la síntesis química o la expresión recombinante .

"Ligado" y "fusionado" o "fusión" se utilizan en la presente de manera indistinta. Estos términos se refieren a la unión entre sí de dos o más elementos químicos o componentes, por cualquier medio que incluya la conjugación química o el medio recombinante. Una "fusión en marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos (OFR) para formar un OFR más largo, continuo, en una forma que mantenga el marco de lectura correcto del OFR original. Así pues, la proteína de fusión recombinante resultante es una proteína única que contiene dos o más segmentos que corresponden a los polipéptidos codificados por los OFR originales (cuyos segmentos normalmente no están unidos a sí en la naturaleza.) Aunque el marco de lectura de este modo se hace continuo a lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar física o espacialmente separados por, por ejemplo, la secuencia ligadora en marco (por ejemplo "flexón") , como se describe inf a.

En el contexto de los polipéptidos, una "secuencia lineal o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección amino a carboxilo terminal 54 en cuyos residuos que colindan entre si en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipéptido. Una "secuencia parcial" es una secuencia lineal de parte de un polipéptido que, según se sabe, comprende los residuos adicionales en una o ambas direcciones.

"Heterologo" significa procedente de una entidad genotipicamente distinta del resto de la entidad a la cual se compara. Por ejemplo, un promotor separado de su secuencia codificante nativa y ligado de manera operante a una secuencia codificante diferente de la secuencia nativa es un promotor heterologo. El término "heterologo" cuando se aplica a un polinucleótido, un polipéptido, significa que el polinucleótido o polipéptido procede de una entidad genotipicamente distinta del resto de la entidad a la cual se compara. Por ejemplo, un polinucleótido heterologo o antigeno puede proceder de un origen de especie diferente, un tipo de célula diferente y el mismo tipo de célula de individuos distintos.

Los términos "polinucleótidos", "ácidos nucleicos", "nucleótidos" y "oligonucleótidos" se utilizan de manera indistinta. Estos se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de 55 estos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento génico, loci (locus) definido a partir del análisis del enlace, exones, intrones, RNA mensajero (mRNA) , RNA de transferencia, RNA ribosomal, ribositas, cDNA, polinucleótidos recombinantes , polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, DNA aislado de cualquier secuencia, RNA aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleico y cebadores, ün polinucleótido puede contener polinucleótidos modificados como los nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones a la estructura del nucleósido pueden hacerse antes o después del ensamblado del polímero. La secuencia de los nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificare más después de la polinucleótidos, como puede ser por la conjugación con un componente etiquetador.

"Recombinante" cuando se aplica a un polinucleótido significa que el polinucleótido es el producto de algunas combinaciones de pasos de clonación, restricción y/o 56 ligación, y otros procedimientos que dan como resultado una construcción que sea distinta de un polinucleótido como se encuentra en la naturaleza.

Los términos "gen" o "fragmento génico" se utilizan en la presente en forma intercambiable. Estos se refieren a un polinucleótido que contenga al menos un marco de lectura abierto que sea capaz de codificar una proteina especifica tras ser transcrita y traducida. Un gen o fragmento génico puede ser genómico ó cDNA, siempre que el polinucleótido contenga al menos un marco de lectura abierto, que pueda convertir toda la región codificante o un fragmento de esta.

"Ligado de manera operante" o "ligado de manera operable" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes asi descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma propuesta. Por ejemplo, una secuencia promotora esta ligada de manera operante a una secuencia codificante si la secuencia promotora favorece la transcripción de la secuencia codificante.

Un "gen de fusión" es un gen compuesto de al menos dos polinucleótidos heterologos ligados entre si. 57 Una "base de datos" génica denota una serie de datos almacenados que representa una colección de secuencias que incluye secuencias de nucleótidos y péptidos, que a su vez representa una colección de materiales biológicos de referencia.

Cuando se utiliza en la presente invención, "expresión", se refiere al proceso mediante el cual se transcribe un polinucleótido en mRNA y/o el proceso por el cual el mRNA transcripto (también conocido como "transcrito") posteriormente se va a traducir en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se conocen en forma 'colectiva como producto génico. Si el polinucleótido procede de DNA genómico, la expresión puede incluir empalmes de mRNA en una células eucariótica.

Un "individuo" cuando se utiliza en la presente se refiere a una entidad biológica que contenga materiales génicos expresados. La entidad biológica preferentemente será una planta, animal o microorganismos que incluyen bacterias, virus, hongos y protozoarios . También comprende tejidos, células y su progenie de una entidad biológica obtenida in vivo o cultivada in vitro. 58 Un "vector" es una modalidad de ácido nucleico, preferentemente auto-replicante, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada a y/o entre células hospederas. El término incluye vectores que funcionan principalmente para la inserción de DNA o RNA en una célula, la replicación o reproducción de vectores que funcionan principalmente para la replicación de DNA o RNA, vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del DNA o el RNA. Asimismo están incluidos los vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriores.

Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula hospedera adecuada, puede transcribirse y traducirse en polinucleótido ( s ) . Un "sistema de expresión" por lo reqular define una célula hospedera conveniente compuesta de un vector de expresión que puede funcionar para producir un producto de expresión deseado.

Un "replicón" se refiere a un polinucleótido que contenga un origen de replicación (por lo regular conocido como una secuencia ori) que permita la replicación o repetición del polinucleótido en una célula hospedera adecuada. Los ejemplos de los replicones 59 incluyen epitomas (como pueden ser los plásmidos) , asi como cromosomas (como los cromosomas nucleares o mitocondriales) .

Heterom ltímero quimérico de la presente invención Como ya se indicó, el ensamble adecuado de las subunidades de polinucleótidos para formar un complejo estable es necesario para garantizar la función biológica de una proteina multimérica. Por consiguiente, un aspecto primordial de la presente invención es el diseño de una técnica que permita el ensamble específico de polipéptidos monoméricos seleccionados para efectuar la producción eficiente de los heteromultímeros . El diseño experimental es particularmente útil para generar y detectar heteromultímeros como Abus cuyas especificidades de unión dependen del ensamble de las subunidades específicas en una forma específica. Distinta de las Abus quiméricas anteriormente reportadas, la Abus objeto tiene una o más de las siguientes características únicas. Primera, las Abus están reconstituidas por afinidad por pares de dos secuencias de heterodimerización, y de preferencia ambas de las cuales, carece (n) de la tendencia detectable para formar homodímeros. A diferencia de las secuencias de 60 dimerización antes reportadas, como las cremalleras de leucina Fos y Jun que, según se sabe, forman homodímeros en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y la temperatura corporal fisiológica (O'Shea y col., (1992) Cell 68: 699-708; Vidal y col., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A), las secuencias de heterodimerización objeto son prácticamente incapaces de formar homodímeros en las condiciones amortiguadoras específicas y/o a las temperaturas corporales específicas. Las secuencias de heterodimerización objeto también pueden distinguirse de las secuencias antes empleadas a niveles estructural como se detalla más adelante.

En una modalidad, la presente invención proporciona un heteromultímero quimérico presentado sobre la superficie de la célula hospedera, en donde el heteromultímero contiene: (i) un primer polipéptido fusionado a una primera secuencia de heterodimerización y una secuencia presentadora de superficie; (ii) un segundo polipéptido fusionado a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde el primero y segundo polipéptidos dimerizan por afinidad por pares de la primera y segunda secuencias de heterodimerización; en donde al menos una de las secuencias de 61 heterodimerización es prácticamente incapaz de formar un homodímero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas .

En otra modalidad, la presente invención proporciona un Nsc Abu que contiene: (a) un polipéptido de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera ligada a una primera secuencia de heterodimerización; (b) un polipéptido de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada ligada a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde los polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada dimerizan por afinidad por pares de la primera y segunda secuencias de heterodimerización; al menos una de las cuales es prácticamente incapaz de formar un homodímero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas. En otro aspecto, la presente invención proporciona un Nsc Abu cuyos polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada dimerizan por afinidad por pares de la primera y segundas secuencias de heterodimerización que proceden de los receptores heterodiméricos . En un aspecto, la primera y segunda secuencias de heterodimerización comprenden las 62 secuencias de la heterodimerización de los receptores que median la heterodimerización de los receptores.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un Se Abu que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada conectadas por una primera y una segunda secuencia de heterodimerización que abarca la distancia entre C terminal de una región al N terminal de la otra región, en donde las dos regiones forman un dimero intramolecular por afinidad por pares de la primera y segunda secuencias de heterodimerización, al menos una de las cuales es prácticamente incapaz de formar un homodímero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas. En otro aspecto de esta modalidad, la presente invención proporciona un Se Abu, en donde la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada forman un dimero intramolecular por afinidad por pares de dos secuencias de heterodimerización que proceden de los receptores heterodiméricos . En un aspecto, la primera y segunda secuencias de heterodimerización comprenden secuencias receptoras de la heterodimerización que median la heterodimerización de los receptores. 63 Selección de las secuencias de heterodimerización: Algunos factores aplican al diseño de las Abus con una o más de las características antes mencionadas. Primera, las secuencias de . heterodimerización deben presentar afinidad por el par para efectuar la formación de un complejo estable. Por "estable" se entiende que el complejo o dimero dura lo suficiente para persistir entre la formación del complejo o dimero, y la detección y/o purificación ulteriores. El complejo o dimero debe poder soportar ya sea las condiciones existentes o ser introducido entre el momento de formación y el momento de detección, siendo estas condiciones una función del ensayo o reacción que se realice. De preferencia, la formación del complejo o dimero se lleva a cabo en condiciones amortiguadoras fisiológicas y a temperatura corporales fisiológicas que abarcan desde aproximadamente la temperatura ambiente hasta aproximadamente 37 °C. Las condiciones intervinentes que pueden estar óptimamente presentes y que pueden desarticular un complejo o dimero incluyen el lavado, calentamiento, la adición de otros solutos o disolventes a la mezcla de reacción (como los desnaturalizantes) , y la competición con otras especies reactantes. El complejo o dimero estable puede ser irreversible o reversible, pero debe cumplir los demás requisitos de esta definición. Así pues, un complejo o 64 dímero transitorio puede formarse en una mezcla de reacción, pero no constituye un complejo estable si se disocia espontáneamente en las condiciones amortiguadoras fisiológicas o como resultado de una condición recién impuesta o manipulación introducida antes de la detección.

Segundo, las secuencias de heterodimerización elegidas deben mostrar afinidad por pares dando origen a la formación principal de heterodimero para una exclusión considerable de los homodimeros. De preferencia, la formación predominante produce una combinación heteromultimérica que contiene al menos 60% de heterodimerización, con mayor preferencia, al menos 80% de heterodímeros, más preferentemente entre 8T-90% de heterodimeros, y con mayor preferencia entre 90-9T% de heterodímeros, e incluso con mayor preferencia entre 96-99% de heterodímeros que se pueden formar en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas. En ciertas modalidades de la presente invención, al menos una de las secuencias de heterodimerización empleadas para reconstituir una Abu es prácticamente incapaz de formar un homodímero en un amortiguador fisiológico y/o a la temperatura corporal fisiológica. Por "prácticamente 65 incapaz" se entiende que la secuencia de heterodimerización seleccionadas, cuando se prueban solas, no producen cantidades detectables de heterodímercs en un experimento de sedimentación in vitro como lo detalles Kammerer y col., (1999) Biochemistry 38: 13263-13269), o en el análisis de levaduras 2-híbridos in vivo (véase, por ejemplo White y col., Nature (1998) 396: 679-682). Específicamente, Kammerer y col., han demostrado por experimentos de sedimentación que las secuencias de heterodimerización del receptor GABAB 1 y 2, cuando se prueban solos, sedimentan en la masa molecular del monómero bajo condiciones fisiológicas y a temperaturas corporales fisiológicas (por ejemplo a 37°C). Cuando se mezclan en cantidades equimolares, las secuencias de heterodimerización del receptor GABAB 1 y 2 sedimentan a la masa molecular correspondiente al heterodímero de las dos secuencias (véase la tabla 1 de Kammerer y col.,). Además, las secuencias de heterodimerización individuales pueden expresarse en una célula hospedera, y la ausencia de heterodímeros en la célula hospedera puede demostrarse por diversos análisis de proteínas que incluyen, pero no se limitan a: SDS-PAGE, Western blot e inmunoprecipitación. Los ensayos in vitro deben realizarse en condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o de preferencia a las temperaturas 66 corporales fisiológicas. En general, un amortiguador fisiológico contiene una concentración fisiológica de sal y se ajusta a un pH neutro que abarca desde aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.8, y de preferencia desde aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente 7.5. En Sambrook y col.r (1989) supra se menciona una variedad de amortiguadores fisiológicos, y por tanto no se detallan en la presente. Las condiciones fisiológicas preferidas están descritas en Kammerer y col . , supra .

La asociación especifica de las secuencias de heterodimerización por lo regular incluye interacciones no covalentes. Interacciones como estas comprenden cada enlace estable existente que no de origen a la formación de un enlace covalente. Los ejemplos no limitantes de interacciones no covalentes incluyen enlaces electrostáticos, puentes de hidrógeno, fuerza de Van der Waal, interdigitación esférica de péptidos anfifilicos.

Otra consideración en el diseño de la 7Abu objeto es llevar al mínimo cualquier interferencia estructural entre las secuencias de heterodimerización y el sitio de unión al antígeno del heteromultímero resultante. En la técnica se dispone de diversos métodos para diseñar un 67 heteromultimero quimérico con interferencia estructural interna minima. Por ejemplo, un enfoque incluye el uso de secuencias de heterodimerización minima que contenga solo los residuos de aminoácidos que sean necesarios para la heterodimerización. El segundo enfoque es ligar las secuencias de heterodimerización al N terminal o C terminal del heteromultimero resultante. La elección de cualquier término dependerá de la ubicación del dominio con actividad biológica del heteromultimero. Para construir una Abu quimérica cuyo sitio de unión al antigeno resida en el N terminal en medio de las regiones variables de la cadena ligera y pesada, es preferible ligar las secuencias de la heterodimerización al C terminal de la cadena ligera o la cadena pesada. Otro diseño alternativo emplea un "flexón" incorporado entre el sitio de unión al antigeno y la secuencia de heterodimerización del heteromultimero. "flexón" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un ligador polipéptido flexible (o una secuencia de ácido nucleico que codifique tal polipéptido) que por lo regular comprende aminoácidos con cadenas laterales pequeñas (por ejemplo glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina y serina) . Al incorporar flexones entre uno o más sitios de la Abu objeto se considera que se favorece la funcionalidad permitiéndoles tomar conformaciones 68 relativamente independientes entre si. Tal construcción por lo regular proporciona flexibilidad adicional al dominio de unión al antigeno. Los flexones convenientes preferentemente comprenden entre aproximadamente 4 y aproximadamente 100 aminoácidos, con mayor preferencia alrededor de 4 hasta 50 aminoácidos, e incluso con mayor preferencia alrededor de 4 hasta 15 aminoácidos.

Las secuencias de heterodimerización aplicables para construir las Abus objeto pueden derivarse de diversas fuentes. En general, cualquiera de las secuencias de proteínas involucradas en la formación de • heteromultímeros estables son secuencias de heterodimerización candidatas. Como tales, estas secuencias pueden proceder de cualquiera de los complejos de proteínas heteromultiméricas . Las secuencias candidatas representativas son proteínas virales como las proteínas de la cápside de los virus adeno-asociados, sitios de fosforilación de proteínas cinasa que interactúen con las proteínas que contienen los dominios SH2 (Cantely y col., (1993) Cell 72: 767-778; Cantely y col., (1995) J. Biol. Chem. 270: (44): 26029-26032), dominios de los factores de transcripción y receptores heterodiméricos, los cuales median la formación del heterómero. 69 Los factores de la transcripción heteroitiultiméricos preferidos son los complejos a-Pal/Max y los complejos Hox/Pbx. Hox representa una gran familia de factores de transcripción involucrados en el modelado del eje antero-posterior durante la embriogénesis . Las proteínas Hox se unen al DNA con un homeodominio de tres hélices alfa conservadas. Para unirse a las secuencias específicas del DNA, las proteínas Hox necesitan la presencia de hetero-asociados como el homeodominio Pbx. Wolberger y col., resolvieron la estructura de cristal de 2.35A del complejo ternario HoxBl-Pbxl-DNA para comprender como ocurre la formación del complejo Hox-Pbx y como se une este complejo a DNA. La estructura muestra que el homeodominio de cada proteína se une a las secuencias del reconocimiento adyacentes en los lados contrarios del DNA. La heterodimerización ocurre a través de contactos que se forman entre un hexapéptido de 6 aminoácidos N terminal al homeodominio de HoxBl y un saco en Pbxl formado entre la hélice 3 y las hélices 1 y 2. Una extensión C terminal del homeodominio Pbx 1 forma una hélice alfa que se empaca contra la hélice G para formar un homeodominio de 4 hélices más grande (Wolberger y col., (1999) Cell 96: 587-597; Wolberger y col., Mol Biol. 291: 521-530) . 70 También se ha identificado un gran número de receptores heterodiméricos . Estos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se unen a los factores de crecimiento (como la heregulina) , los neurotransmisores (como el ácido ?-aminobutírico) y otras moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas (por ejemplo los mineracorticoides , glucocorticoides) . Los receptores heterodiméricos preferidos son receptores de hormonas nucleares (Belshaw y col., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A 93 (10) : 4604-4607) , el complejo de receptores erbB23 y erbB2, y los receptores acoplados a la proteina G, que incluye, pero no se limita a los receptores de opiodes (Gomes y col., (2000) J. Neuroscience 20 (22) : RC110); Jordán y col., (1999) Nature 399: 697-700), de muscarinicos, dopamina, serotonina, adenosina/dopamina y de las familias GABAB. En la mayoría de los receptores heterodiméricos, se ha encontrado que sus secuencias C terminales median la formación del heterodímero .

Cuando se desea, las s4ecuencias de los receptores heterodiméricos novedosos pueden emplearse para construir las Abus objeto. En tal caso, la identificación de las secuencias de heterodimerización candidatas en un par de receptores determinado puede determinarse por cualquier ensayo genético o bioquímico sin experimentación 71 indebida. Además, el modelado por computadora y las tecnologías de búsqueda facilitan más la detección de las secuencias de heterodimerización con base en las homologías de la secuencia de los dominios comunes que aparecen en los genes relacionados y no relacionados. Los ejemplos no limitantes de los programas que permiten búsquedas de homología son Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), Fasta (Genetics Computing Group package, Madison, Wisconsin) , DNA Star, Clustlaw, TOFFEE, COBLATH, Genthreader y MegAlign. Cualquiera de las bases de datos de secuencias de que contengan las secuencias de DNA que correspondan a un receptor' objetivo o un segmento de este pueden utilizarse para el análisis de las secuencias. Las bases de datos que comúnmente se emplean incluyen, pero no se limitan a: GenBank, EMBL, DDBJ, PDB, SWISS-PROT, EST, STS, GSS y HTGS.

Otra clase preferida de secuencias de heterodimerización consiste en los péptidos anfifílicos que adoptan una estructura helicoidal de hélice enrollada. La hélice enrollada helicoidal es una de las principales secuencias de la oligomerización de las unidades en las proteínas. El análisis primario de las secuencias muestra que aproximadamente 2-3% de todos los 72 residuos de proteínas forman hélices enrolladas (Wolf y col., (1997) Protein Sci. 6: 1179-1189) . Las proteínas que contienen hélices enrolladas bien caracterizadas incluyen miembros de la familia citoesqueletal (por ejemplo ot-queratina, vimentina) , la familia citoesqueletal motora (por ejemplo miosina, quinesinas y dineinas) , las proteínas de la membrana viral (por ejemplo las proteínas de la membrana de Ebola ó VIH) , las proteínas de unión al DNA y receptores de la superficie celular (por ejemplo los receptores GABAB 1 y 2) . Las secuencias de heterodimerización de hélice enrollada de la presente invención pueden clasificarse ampliamente en dos grupos, a saber, las hélices enrolladas hacia la izquierda y hacia la derecha. Las hélices enrolladas hacia la izquierda se. caracterizan por una repetición héptada denominada "abcdefg" con la presencia de residuos apolares preferentemente ubicados en la primera posición (a) y la cuarta (d) . Los residuos en estas dos posiciones por lo regular constituyen un modelo de zig-zag de "botones y ojales, que se enclavan con los de la otra hebra para formar un núcleo hidrofóbico de ajuste hermético. Por el contrario, la segunda (b) , tercera (c) , y sexta (f) posiciones que cubren la periferia de la hélice enrollada preferentemente son residuos con carga. Los ejemplos de los aminoácidos con carga incluyen 73 residuos básicos como lisina, arginina, histidina y residuos ácidos como aspartato, glutamato, asparagina y glutamina. Los aminoácidos sin carga o apolares convenientes para diseñar una hélice enrollada heterodimérica incluyen, pero no se limitan a: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina y treonina. Aunque los residuos sin carga por lo regular forman el núcleo hidrofóbico, el puente salino inter-helicoidal e intra-helicoidal, incluidos los residuos con carga aún en las posiciones centrales pueden emplearse para estabilizar la estructura de hélice enrollada helicoidal total ( (Burkhard y col., (2000) J. Biol. Chem. 275: 11672-11677). Si bien pueden emplearse diversas longitudes de hélice enrollada, las secuencias de heterodimerizacion objeto preferentemente contendrán de dos a diez repeticiones héptadas . Con mayor preferencia, las secuencias de heterodimerizacion contienen de 3 a 8 repeticiones héptadas, incluso con mayor preferencia contienen de 4 a 5 repeticiones héptadas.

Durante el diseño de las secuencias de heterodimerizacion de hélice enrollada óptima puede utilizarse una variedad de programas software de computo existentes que predicen la estructura secundaria de un péptido. Un análisis por computadora ilustrativo utiliza 74 el algoritmo COILS que compara una secuencia de aminoácidos con las secuencias de la base de datos de las hélices enrolladas bicatenarias conocidas y predice la elevada probabilidad de tramos de la hélice enrollada (Kammerer y col. , (1999) Biochemistry 38: 13263-13269).

Aunque es posible emplear en la presente invención una variedad diversa de hélices enrolladas involucradas en la hetero-oligomerización, las hélices enrolladas preferidas se obtienen de receptores heterodiméricos . Por consiguiente la presente invención comprende las secuencias diméricas de hélice enrollada procedentes de los receptores GABAB 1 y 2. En un aspecto, las hélices enrolladas objeto contienen las secuencias C terminales del receptor GABAB 1 y el receptor GABAB 2. En otro aspecto, las hélices enrolladas objeto además están ligadas a los residuos de cisterna. Las hélices enrolladas son polipéptidos del receptor GABAB 1 y 2 de al menos 30 residuos de aminoácidos, uno de los cuales es prácticamente idéntico a una secuencia lineal de longitud comparable, como se representa en la SEQ ID NO. 2, y el otro es prácticamente idéntico a una secuencia de péptidos lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO. 4. 75 Una secuencia lineal de péptidos es "prácticamente idéntica" a otra secuencia lineal, si ambas secuencias presentan considerable homología en las secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias prácticamente idénticas son al menos aproximadamente 60% idénticas entre sí, después del alineamiento de las regiones homologas. De preferencia, las secuencias son al menos aproximadamente 70% idénticas; con mayor preferencia, estas son al menos aproximadamente 80% idénticas; con mayor preferencia, estas son al menos aproximadamente 90% idénticas; con mayor preferencia, las secuencias son al menos aproximadamente 95% idénticas; todavía más preferentemente, las secuencias son 100% idénticas.

Durante la determinación si las secuencias polipeptídicas son prácticamente idénticas, se prefiere particularmente una secuencia gue preserve la funcionalidad del polipéptido con el cual se compara. La funcionalidad puede establecerse por diferentes criterios como la habilidad para formar un heterodímero con una secuencia de hélice enrollada apareante, y la inhabilidad para formar un homodímero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas. 76 La invención incluye secuencias de heterodimerización GABAB modificadas que son funcionalmente equivalentes a las secuencias que se ejemplifican en la presente. Los polipéptidos modificados que proporcionan mejor estabilidad a los Abus resultantes son preferidos. Los ejemplos de los polipéptidos modificados incluyen aquellos con sustituciones conservativas de los residuos de aminoácidos, y una o más delusiones o adiciones de aminoácidos que no alteren significativamente en forma deletérea la especificidad de la heterodimerización. Las sustituciones pueden abarcar desde cambiar o modificar uno o más residuos de aminoácidos para completar el diseño de una región siempre que se mantenga la afinidad por el par. Las sustituciones de aminoácidos, si están presentes, preferentemente son sustituciones conservadoras que no afectan en forma deletérea el plegado o las propiedades funcionales del péptido. Los grupos de aminoácidos con función relacionada dentro de los cuales pueden hacerse sustituciones conservativas son glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina/triptofano . Los polipéptidos de esta invención pueden estar en forma glucosilada o no glucosilada, pueden ser modificados 77 después de la traducción (por ejemplo la acetilación y fosforilación) pueden modificarse en forma sintética (por ejemplo la unión de un grupo etiquetador) .

Configuraciones y modificaciones de las unidades de unión al antígeno (ñbus) : Las Abus de la presente invención pueden adoptar diversas configuraciones. La Abu no monocatenaria más pequeña es un fragmento ccFv monovalente. El fragmento ccFv es una proteina dimérica compuesta de regiones VL y VH que dimeriza por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de heterodimerización fusionadas en marco con las regiones VL y VH, respectivamente. De preferencia, el fragmento ccFv contiene una secuencia flexón corta que proporciona flexibilidad adicional a las regiones VL y VH (véase un fragmento ccFv ejemplar en la Figura 1) . Una Nsc Abu más compleja es una molécula multivalente que puede unirse a más de un antigeno de la misma clase (por ejemplo multivalente pero monoespecifico) o de diferente clase (es decir, Abus monovalentes y multiespecificas) . Por lo regular, una Abu multivalente es un heteromultimero compuesto de más de un polipéptido de cadena L y H, en el cual el polipéptido L ó H o ambos contienen más de una región V. Por ejemplo, una Abus bivalente, ejemplar, toma la configuración de 78 (ccFv)2 como se representa en la Figura 12. El polipéptido de cadena H esta Abus bivalente, ilustrativa, contiene dos regiones VH, cada una de las cuales dimeriza con una región VL o constituir dos sitios de unión al antigeno. De otro modo, el polipéptido de cadena L puede proporcionar dos regiones L, cada una de las cuales dimeriza con una región VH para reconstituir los dos sitios de unión. Como se muestra en la Figura 12, la Abu multivalente se estabiliza por afinidad por el par de las dos secuencias de heterodimerización ligadas a las regiones VL y VH. La Abu se ensambla eficientemente pór que al menos una, y de preferencia ambas, secuencias de heterodimerización es o son capaces de formar homodímeros, llevando al mínimo de este modo la dimerización intramolecular para formar dímeros VH/VH ó VL/VL no funcionales. Al aplicar este esquema general de manipulación de anticuerpos, es posible construir Abus bivalentes y tetravalentes (véase por ejemplo la Figura 12) .

Un enfoque diferente para construir Abus multivalentes emplea un fragmento ccFv ó dsFv como se ilustra en la Figura 13. Además de la unidad constructiva ccFv que proporciona un sitio de unión al antígeno, las Abus de esta configuración contienen uno o más fragmentos 79 scFv ó dsFv que se ligan al fragmento ssFv. Los fragmentos ssFv ó dsFv ligados proporcionan los otros sitios de unión. Por ejemplo, una Abus bivalente puede adoptar la configuración sccFv-scFv ó ccFv-dsFv (Figura 13) . Si bien uno de los sitios de4 unión al antigeno se ensambla por la afinidad por el par de las secuencias de la heterodimerización ligada a la región VI y la región VH (como en ccFv) , la otra es proporcionada por e fragmento scFv ó dsFv que se fusionan en marco con la región VL. De otro modo, el fragmento scFv ó dsFv puede estar ligado a la región VH.

El mismo enfoque puede emplearse para generar las Abus ccFv-scFv o ccFv-dsFv trivalentes como se muestra en la Figura 14. En un aspecto, las Abus trivalentes toman la configuración de ccFv- (scFV) 2, en la cual con los dos polipéptidos "VH-primera secuencia de heterodimerización-scFv" y "VL- segunda secuencia de heterodimerización-scFv" y dimerizan por afinidad por el par que las dos secuencias de heterodimerización para constituir tres sitios de unión. Uno de los sitios de unión esta compuestos de las regiones VL y VH de las unidades constructivas ccFv; las dos restantes son proporcionadas por los fragmentos scFv ligados a los polipéptidos VL y VH, respectivos. De otro modo, las Abus multivalentes 80 pueden estar configuradas como ccFv-scFv-dsFv. En esta configuración, uno de los sitios de unión al antigeno se ensambla y estabiliza por un enlace disulfuro intermolecular entre un par de residuos de cisteina que se ubican dentro de las regiones VH y VL del fragmento dsFv. Otra variante de esta configuración es un ccFV- (dsFv)2/ trivalente, en el cual dos de los sitios de unión toma el formado dsFv (véase, por ejemplo, la Figura 14) . Cualquiera de las demás variantes de las Abus multivalentes que emplean las unidades constructivas básicas- ccFv, sean monoespecificas o multiespecificas , están comprendidas por esta invención.

Por consiguiente, esta invención además proporciona Abus multiespecifica . Estas son moléculas multivalentes que pueden unirse a al menos dos antigenos distintos. Las Abus multiespecificas , preferidas, son moléculas biespecificas y triespecificas que muestran especificidades de unión a dos y tres antigenos distintos, respectivamente. Distintos de los anticuerpos multiespecificos ya caracterizados (véase, por ejemplo la Patente US No. 5,932,448), las Abus multiespecificas objeto contienen una o más unidades constructivas ccFv con diferentes especificidades de unión. Las Abus multiespecificas objeto también pueden incorporar uno o 81 más fragmentos scFv o dsFv como se menciona en lo anterior. Las Abus biespecificas y triespecificas preferidas están configuradas de acuerdo con las estructuras generales que se representan en las Figuras 15-17.

Además de las Abus no monocatenarias, la presente invención incluye Abus monocatenarias que se estabiliza por las secuencias de heterodimerización objeto, por lo regular, las Se Abus contienen una región VL y una VH formando un dímero intermolecular por afinidad por el par de las secuencias de heterodimerización conectadas a estas dos regiones. Las secuencias de heterodimerización pueden estar configuradas en una forma paralela o antiparalela (véase por ejemplo la Figura 18). En una configuración paralela, las dos secuencias de heterodimerización se alinean de modo que tengan la misma orientación (amino terminal a carboxilo terminal) . En una configuración anti-paralela, las secuencias de la heterodimerización se arreglan de modo que el extremo amino terminal de una secuencia se alinee con el extremo carboxilo terminal de la otra secuencia, y viceversa, en general, las secuencias de la heterodimerización se ligan entre si por una secuencia flexón. Como se describe en la presente, el 82 flexón es un ligador polipéptido flexible (o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido como este) que por lo regular contienen aminoácidos con cadenas laterales pequeñas (por ejemplo glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina y serina) . La incorporación de flexones entre las dos secuencias de heterodimerización por lo regular les proporciona flexibilidad espacial para formar un dimero intramolecular. Los flexones convenientes para la configuración antiparalela preferentemente contienen entre aproximadamente 4 hasta aproximadamente 100 aminoácidos, con mayor preferencia alrededor de 4 hasta 50 aminoácidos, e incluso con mayor preferencia cerca de 4 hasta 15 aminoácidos. Los flexones para la configuración paralela por lo regular son más grandes, preferentemente en el intervalo desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 aminoácidos, con mayor preferencia desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 30 residuos de aminoácidos.

Si se desea, es posible incorporar uno o más pares de residuos de cisteina en el N o C terminal de las secuencias de la heterodimerización para estabilizar más Abus de la presente invención. 83 Las Abus de esta invención pueden contener secuencias procedentes de las regiones constantes de una cadena L o una cadena H. Tales secuencias obtenidas de las regiones constantes por lo regular se colocan entre una región variable de cadena ligera o de cadena pesada y la secuencia de heterodimerización a la cual se liga. Además, las cadenas ligera y pesada pueden contener secuencias parcial o completamente humanas.

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Anticuerpos "humanizados" son anticuerpos en los que al menos parte de la secuencia se ha alterado de su forma inicial para volverla más parecida a las inmunoglobulinas humanas. En una versión, las regiones C de la cadena H y la cadena L se sustituyen con secuencia humana. Este es un polipéptido de fusión que contiene una región V y una región C de inmunoglobulina heteróloga. En otra versión, las regiones CDR comprenden secuencias de anticuerpos no humanos, mientras que las regiones de la estructura fundamental V también se han convertido en secuencias humanas. Véase, por ejemplo, EP 0329400. En una tercera versión, las regiones V son humanizadas diseñando secuencias consenso de las regiones V humanas y de ratón, y convirtiendo los residuos fuera de las CDR que sean diferentes entre las secuencias consenso. 84 Al hacer los anticuerpos humanizados, la elección de los residuos de la estructura fundamental puede ser crucial para conservar la elevada afinidad de unión. En principio, una secuencia de la estructura fundamental de cualquier HuAb puede servir como la plantilla para injertar CDR; no obstante, se ha demostrado que la sustitución CDR lineal en tal estructura fundamental puede dar origen a una pérdida importante de afinidad de unión para el antigeno. Glaser y col., (1992) J. Inmmunol. 149: 2606; Tempest y col., (1992) Biotechnology 9: 266; y Shalaby y col., (1992) J. Exp. Med. 17: 217. Cuanto más homólogo sea un HuAb respecto al muAb original, será menos probable que la estructura fundamental humana introduzca distorsiones en las CDR murinas que puedan reducir la afinidad. Con base en una búsqueda de homología de secuencias contra una base de datos de secuencias de anticuerpos, el HuAbIC4 proporcionan buena homología de la estructura fundamental para muM4TS.22, aunque también serían convenientes otros HuAbs altamente homólogos, especialmente las cadenas L capa de las cadenas I ó H del subgrupo humano III. Kabat y col., (1987). Algunos programas de cómputo como ENCAD (Levitt y col., (1983) J. Mol. Biol. 168: 595) están a la disposición para predecir la secuencia ideal para la región V. De este modo, la invención comprende los HuAbs 85 con diferentes regiones V. Esta dentro de las habilidades de un experto en la técnica determinar las secuencias convenientes de la región V y optimizar estas secuencias. Los métodos para obtener anticuerpos con inmunogenicidad reducida también están descritos en la Patente US No. 5,270,202 y EP 699,755.

Es importante gue los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias parentales y algunos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales son familiares para los expertos en la técnica. Se tienen programas de cómputo gue ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales, probables de secuencias de inmunoglobulinas candidato, seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de la inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de los residuos que tienen influencia en la habilidad de la inmunoglobulina candidato para unirse a 86 su antigeno. De este modo, es posible seleccionar y combinar residuos FR de la secuencia consenso e importada de modo que se obtenga la característica deseada del anticuerpo, como aumentada afinidad para el (los) antígeno(s) elegido (s).

La invención también comprende los Abus conjugados a una porción con funcionalidad química. Por lo regular, la porción es una etiqueta capas de producir una señal detectable. Estos Abus conjugados son útiles, por ejemplo, en los sistemas de detección como la cuantificación de carga tumoral, y la formación de imágenes de focos metastáticos e imágenes de tumor. Tales etiquetas son conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos químiolumíniscentes, cofactores sustratos de compuestos bioluminiscentes e inhibidores. Véase, por ejemplo, las patentes que enseñan el uso de estas etiquetas, las Patentes US Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,336,241. Las porciones pueden estar ligadas en forma covalente a las Abus, ligadas en forma recombinante o conjugadas a las Abus a través de un reactivo secundarios, como puede ser un segundo anticuerpo, proteína A o un complejo biotin-avidina. 87 Otras porciones funcionales incluyen péptidos señal, agentes que favorecen la reactividad inmunológica, agentes que faciliten el acoplamiento a un soporte sólido, portadores de vacunas, modificadores de la bio-respuesta, etiquetas paramagnéticas y fármacos. Los péptidos señal es una secuencia de aminoácidos corta que dirige una proteina recién sintetizada a través de una membrana celular, por lo regular el retículo endoplásmico en las células eucarióticas, y la membrana interna o las membranas interna y externa de las bacterias. Los péptidos señal por lo regular están en la porción N terminal de un polipéptido y por lo regular se separan enzimáticamente entre la biosintesis y la secreción del polipéptido desde la célula. Un péptido como este puede incorporarse en las Abus objeto para permitir la secreción de las moléculas sintetizadas.

Los agentes que favorecen la reactividad inmunológica incluyen, pero no se limitan a, súper antígenos bacterianos. Los agentes que facilitan la copulación a un soporte sólido incluyen, pero no se limitan a, biotina o avidita. Los portadores inmunógenos incluyen, pero no se limitan a, cualquier búfer aceptable en el medio fisiológico. Los modificadores de la bio-respuesta incluyen citocinas, en particular el factor de 88 necrosis tumoral (TNF) , interleucina 2, interleucina 4, el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos e interferones gama.

Las porciones fármaco convenientes incluyen agentes antineoplásicos . Los ejemplos rio limitantes son los radioisótopos, alcaloides vinca como vinblastina, vincristina y sulfatos de vindesina, adriamicina, sulfato de bleomicina, carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, clorhidrato de daunorubicina, clorhidrato de doxorubicina, etopósido, fluorouracilo, lomustina, meclororetamina clorhidrato, melfalano, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitotano, pentostatina, pipobromano, clorhidrato de procarbaza, estreptozotocina, taxol, tioguanina y uracilo mostaza .

Las inmunotoxinas, incluidas las moléculas monocatenarias, pueden producirse por medios recombinantes , la producción de algunas inmunotoxinas es bien conocida en la técnica, y los métodos pueden encontrarse, por ejemplo, en "Monoclonal antibody-toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe y col., (1982) Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190; Vitatta (1987) Science 238: 89 1098-1104; y Winter and Milsteín (1991) Nature 349: 293- 299. Las toxinas convenientes incluyen, pero no se limitan a, ricin, radionúclidos, proteina antiviral de la hierba carmín, exotoxina A de pseudomonas, toxina diftérica, la cadena ricin A, toxinas micóticas como restrictocina y enzimas fosfolipasas . Véase, en genera, "Chimeric Toxins", Olsnes y Pihl, Pharmac. Ther. 15: 355- 381 (1981) ; y "Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy", eds. Baldwin and Byers, pp. 159: 159-179, 224-266, Academic Press (1985) .

Las porciones con funcionalidad química pueden prepararse en forma recombinante por ejemplo creando un gen de fusión que codifique la Abu y la porción funcional. De otro modo, la Abu puede unirse químicamente a la porción por cualquiera de los diferentes procedimientos químicos bien establecidos. Por ejemplo, cuando la porción es una proteína, el enlace puede ser • por medio de reticuladores eterobifuncionales, por ejemplo, SPDP, glutaraldehído, carbodiimida, o similares. Las porciones pueden ser ligadas en forma covalente, o conjugadas, a través de un reactivo secundario, como un segundo anticuerpo, proteína A o un complejo biotina- avidina. Las porciones paramagnéticas y la conjugación de estas a los anticuerpos son bien conocidas en la técnica. 90 Véase, por ejemplo, Miltenyi y col., (1990) Cytometry 11: 231-238.

Preparación de las unidades de unión al antígeno (Abus) : Las Abus objeto pueden prepararse por la tecnología del DNA recombinante, las técnicas de la química sintética o una combinación de estas. Por ejemplo, las secuencias que codifican los componentes deseados de las Abus, incluidas las VL, VH y las secuencias de heterodimerización por lo regular se ensamblan y los fragmentos se ligan en un vector de expresión. Estas secuencias pueden ensamblarse a partir de otros vectores que codifiquen la secuencia proteínica deseada, a partir de fragmentos generados por la PCR utilizando los ácidos nucleicos plantilla respectivos o por el ensamble del oligonucleótido sintéticos que codifiquen las secuencias deseadas. No obstante, todas las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las Abus preferentemente se ensamblan por fusión en marco de las secuencias codificantes. Los flexones, ya descritos, pueden estar incluidos entre algunos componentes y dominios para favorecer la habilidad de los componentes individuales para tomar las configuraciones en forma relativamente independientemente entre sí. Para producir Nsc Abus, la cadena L y H pueden formarse por separado y luego 91 ensamblarse, o ensamblarse in vivo por un sistema de expresión para ambas cadenas. Sistemas de expresión como estos pueden crearse transíectando una células conveniente con un vector que contenga regiones que puedan ser transcritas, separadas para la cadena L y H, o por co-transfección de la misma célula con vectores para cada cadena.

Las Abus ensambladas pueden aislarse utilizando diversas técnicas para la purificación de proteínas conocidas en la técnica. Por lo regular, la Abu se aisla del medio de cultivo como polipéptidos secretados, aunque pueden ser recuperados de los listados de células hospederas o el periplasma bacteriano, cuando se producen directamente sin péptidos señal. Si las Abus están unidas a la membrana, estas se solubilizan por soluciones detergentes convenientes las comúnmente empleadas por los artesanos en la técnica. Las Abus recuperadas además se pueden purificar por precipitación salina (por ejemplo con sulfato de amonio) , cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo en una columna de intercambio catiónico o aniónico que corra a pH neutro y eluya con gradientes de concentración iónica creciente)., cromatografía de filtración en gel (incluida la HPLC de filtración en gel) , y cromatografía en una columna de 92 afinidad por la etiqueta, o en resinas de afinidad como puede ser la proteina A, proteína G, hidroxiapatita y anti-inmunoglobulina .

Polinucleótidos y vectores de la presente invención La invención proporciona algunos polinucleótidos que codifican las Abus de la invención. Los polinucleótidos de la invención se caracterizan, en parte, por las secuencias de heterodimerización únicas contenidas en éstos como ya se describió. Estas secuencias de heterodimerización permiten el ensamble eficiente de y la detección para las Abus, como pueden ser aquellas que se unen específicamente a un antígeno deseado. Tales secuencias también facilitan la presentación de los heteromultímeros sobre entidades biológicas vivas incluidos los fagos, bacterias, otras células procarióticas o eucarióticas . Las secuencias de heterodimerización preferidas se muestran en las SEQ ID NOS: 2 y 4.

En una modalidad, esta invención proporciona polinucleótidos aislados que codifican las Nsc Abus objeto. En un aspecto de esta modalidad, el polinucleótido recombinante comprende una secuencia codificante que codifica el polipéptido de cadena ligera 93 de una Nsc Abu objeto. En otro aspecto, el polinucleótido recombinante contiene una secuencia recombinante que codifica el polipéptido de cadena pesada de una Nsc Abu. En todavía otro aspecto, el polinucleótido recombinante contiene dos secuencias codificantes independientes, una de las cuales codifica para el polipéptido de cadena ligera y el otro codifica para la cadena pesada.

Las secuencias de nucleótidos que corresponden a las diferentes regiones de las cadenas L ó H de un anticuerpo existente pueden fácilmente y secuenciarse utilizando las técnicas convencionales, que incluyen, pero no se limitan a, hibridación, PCR y secuenciación del DNA. Las células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales sirven como una fuente preferida de secuencias de nucleótidos del anticuerpo. Un gran número de células de hibridoma que producen un arreglo de anticuerpos monoclonales puede obtenerse de repertorios públicos o privados. La empresa depositaría más grande es American Type Culture Collection (http://www.atcc.org), que ofrece una diversa colección de líneas de células de hibridoma bien caracterizadas. De otro modo, los nucleótidos del anticuerpo pueden obtenerse de roedores o humanos inmunizados o no inmunizados, y de órganos como bazo y de linfocitos de sangre periférica. Las técnicas específicas 94 que aplican para extraer y sintetizar nucleótidos de anticuerpos están descritas en Orlando y col., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A 86: 3833-3837; Larrick y col., (1989) Biochem Biophys. Res. Común. 160: 1250-1255; Sastry y col., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A 86: 5728-5732; y la Patente US No. 5,969,108.

Las secuencias nucleótidos de anticuerpos también pueden modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para las regiones constantes de la cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias homologas no humanas. De esta forma, los anticuerpos quiméricos se preparan para retener la especificidad de unión del anticuerpo original.

También se entiende que los polinucleótidos incorporados en la invención incluyen la codificación para los equivalentes funcionales y fragmentos de estos de los polipéptidos ejemplificados. Los polipéptidos con función equivalente incluyen aquellos que favorecen, disminuyen o no afectan significativamente las propiedades de los polipéptidos codificados por estos. Los equivalentes funcionales pueden ser polipéptidos con sustituciones de aminoácidos conservativas, análogos incluidas fusiones y mutantes. 95 Debido a la degeneración del código genético, puede haber una variación considerable en los nucleótidos de las secuencias L y H, asi como las secuencias de la heterodimerización convenientes para la construcción del polinucleótido y los vectores de la presente invención. Las variantes de secuencias pueden tener secuencias de DNA o aminoácidos modificadas, una o más sustituciones, deleciones o adiciones, el efecto neto de lo cual es conservar la actividad de unión al antigeno deseada. Por ejemplo, es posible hacer algunas sustituciones en la región codificante que no altere los aminoácidos codificados o de origen a cambios conservativos. Estas sustituciones están comprendidas por la presente invención. Las sustituciones conservativas de los aminoácidos incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, aspáragina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Aunque las sustituciones conservativas efectivamente cambian uno o más residuos de aminoácidos contenidos en el polipéptido que va a producirse, se espera que las sustituciones no interfieran con la actividad de unión al antigeno de las Abus resultantes para ser producidas. Las sustituciones de nucleótidos que no alteran los residuos de aminoácidos 96 codificados son útiles para optimizar la expresión génica en diferentes sistemas. Las sustituciones convenientes son conocidas para el trabajador experto en la técnica y se hacen, por ejemplo, para manifestar el uso preferido de un codón en los sistemas de expresión.

Si se desea, los polinucleótidos recombinantes pueden contener secuencias heterólogas que faciliten la detección de la expresión y purificación del producto génico. Los ejemplos de estas secuencias son conocidos en la técnica e incluyen las que codifican proteínas reportero como ß-galactosidasa, ß-lactamasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , luciferasa, proteina fluorescente verde (GFP) y sus derivados. Otras secuencias heterólogas que facilitan la purificación pueden codificar para epítopes como Myc, HA (procedente de hemaglutinina de virus de influenza) , His-6, FLAG, o la porción Fe de inmunoglobulina, glutation S-transferasa (GST) y la proteína de unión a maltosa (MBP) .

Los polinucleótidos pueden conjugarse a una variedad de porciones con función química antes descritas. Las porciones que se utilizan comúnmente incluyen etiquetas capaces de producir una señal que pueda detectarse, péptido señal, agentes que favorecen la reactividad 97 inmunológica, agentes que faciliten el acoplamiento a un soporte sólido, portadores de vacunas, modificadores de la bio-respuesta, etiquetas paramagnéticas y fármacos. Las porciones pueden ser polinucleótido ligado en forma covalente, en forma recombinante o por otros medios conocidos en la técnica.

Los polinucleótidos de la invención pueden contenerse secuencias adicionales, como las secuencias codificantes adicionales dentro de la misma unidad de trascripción, elementos de control como promotores, sitios de unión al ribosoma y sitios de poliadenilación, otras unidades de trascripción bajo el control del mismo promotor o diferente, secuencias que permitan la clonación, expresión y transformación de una célula hospedera, y cualquier construcción como esta según se desee para proporcionar modalidades de esta invención.

Los polinucleótidos incorporados en esta invención pueden obtenerse utilizando síntesis química, los métodos de clonación recombinante, PCR o cualquier combinación de estos. Los métodos de síntesis química de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y no necesitan ser descritos con detalle en la presente. Un trabajador experto en la técnica puede utilizar los 98 datos de las secuencias proporcionados en la presente para obtener un polinucleótido deseado empleando un sintetizador de DNA u ordenando de un servicio comercial .

Los polinucleótidos que contienen una secuencia deseada pueden insertare en un vector conveniente que a su vez se puede introducir en una células hospedera adecuada para su replicación y amplificación. Por consiguiente, la invención comprende diversos vectores que contienen uno o más de los nucleótidos de la presente invención. Asi mismo se proporciona una biblioteca de vectores de expresión que pueden elegirse y contiene al menos un vector que codifique los Abus objeto.

Los vectores de la presente invención en general se clasifican en vectores de clonación y de expresión. Los vectores de clonación son útiles para obtener copias duplicadas de los polinucleótidos que contienen, o como un medio de almacenamiento de los polinucleótidos en un depósito para recuperación futura. Los vectores de expresión (y las células hospederas que contienen estos vectores de expresión) pueden utilizarse para obtener polipéptidos producidos a partir de los polinucleótidos que contienen. Los vectores de clonación y de expresión 99 convenientes incluyen cualquiera de los conocidos en la técnica, por ejemplo, aquellos que se utilizan en sistemas de expresión para presentación bacteriana, de mamífero, levadura, insecto y fago.

Los vectores de clonación convenientes pueden construirse de acuerdo con las técnicas normales, o seleccionarse de un gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica. Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula hospedera que se pretenda utilizar, los vectores de clonación útiles por lo regular tendrán la habilidad para auto-replicarse, pueden poseer un solo objetivo para una endonucleasa de restricción específica o pueden llevar genes marcadores. Los ejemplos convenientes incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo pBR322, pMB9, ColEl, pCRl, RP4, pUC18, mpl8, mpl9, DNAs de fago (incluidos los DNAs de fagos filamentos y no filamentosos), y vectores lanzadera como pSA3 y pAT28. Estos y otros vectores de clonación están a la disposición de vendedores comerciales como Clontech, BioRad, Stratagene e Invotrogen.

Los vectores de expresión que contienen estos ácidos nucleicos son útiles para obtener sistemas de vectores 100 hospederos para producir proteínas y polipóptidos . Esto implica que estos vectores de expresión deben ser replicables en el organismo hospedero como episomas o como parte integrada del DNA cromosomico. Los vectores de expresión convenientes incluyen plásmidos, vectores virales, incluidos los fagémidos, adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, plásmidos, etcétera. En la técnica se conocen diversos vectores de expresión convenientes para la expresión en células eucarióticas, incluidas las células de levadura, aviarias y de mamífero. Un ejemplo de un vector de expresión es pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) , en el cual la trascripción es impulsada por el promotor/potenciador temprano de citomegalovirus (CMV) . Dos tipos de vectores de expresión especialmente útiles para expresar las Abus objeto son el vector presentador fago y el vector presentador bacteriano .

Las técnicas para construir vectores presentadores fagos están bien establecidas (véase el artículo de Winter G. y col., (1994) Ann. Rev. Immunol. 12: 433-55). Las secuencias de los fagos filamentosos y no filamentosos pueden utilizarse para construir un vector presentador. Los vectores de fagos filamentosos son preferidos porque los genomas de muchos fagos 101 representativos de esta clase han sido secuenciados, y se encontró que sus genomas son mucho más pequeños que los de los fagos no filamentosos. Los fagos representantes de esta clase incluyen M13, fl, fd, Ifl, Ike, Xf, Pfl y Pf3. El vector fago por lo regular se construye para expresar heteromultímeros , por ejemplo péptidos de anticuerpos, por fusión a una parte o el total de una proteina de la cubierta del fago. Las proteínas de la cubierta convenientes incluyen pIII, VIII, VI, VII y IX de M13. La secuencia de heteromultímeros debe insertare en el vector fago en tal forma que no se deteriore la integridad de la capa del fago expresado, y el heteromultímero preferentemente tenga funcionalidad biológica.

Para construir el vector de fusión pIII, los sitios de fusión comúnmente empleados están ubicados en el amino terminal, entre el separador flexible entre los dos dominios de pIII (Smith y col., Science 288: 1315-17), o cualquier otro sitio de fusión alternativo descrito en las Patentes US Nos. 5,969,108, 5,837,500. La fusión de pIII y otras proteínas del fago pueden estar codificadas completamente dentro del replicón del mismo fago o en replicones diferentes. Cuando se utiliza al menos dos replicones, la fusión de pIII generalmente se codifica en un fagémido, un plásmido que contiene un origen de 102 replicación de fago. Los fagemidos pueden estar empacados en particular de fago por "rescate" con un fago cooperador como M13K07, que proporciona todas las proteínas del fago, incluida pIII, pero debido a un origen defectuoso este mismo se empaca deficientemente en competencia con los fagemidos. Otros fagos cooperadores multivalentes (por ejemplo Ml3AgIII) que carece o contiene pIII alterado para favorecer la eficiencia del empaque también puede emplearse (Rondot y col., Nature Biotechnology 19: 75-78) .

Se pueden hacer construcciones similares con otros fagos filamentosos. Pf3 es un fago filamentoso bien conocido que infecta células de Pseudomonas aerugenosa que albergan un plásmido IncP-1 el genoma completo será secuenciado y se han caracterizado las señales genéticas implicadas en la replicación y el ensamble. La principal proteína de la cubierta de PF3 es poco común en no tener péptido señal para dirigir su secreción. La secuencia tiene residuos con carga ASP7, ARG37, LYS40 y PHE44-COCf lo cual es consistente con el amino terminal que se expone. Para construir un vector Pf3 presentador, por lo regular se desea manipular una secuencia señal conocida para probar secreción en P. aeruginosa fusionada en marco a un fragmento génico que codifique para un polipéptido 103 heterólogo, que a su vez se fusione en marco con un DNA que codifique la proteina Pf3 madura de la cubierta.

El mismo esquema de construcción general aplica para generar vectores presentadores que contengan secuencias procedentes de fagos no filamentosos incluido el bacteriófago X174, ?, los fagos T4 y T7. En la técnica se conoce abundante información sobre las estructuras de estos fagos no filamentosos, ün experro en la técnica puede generar fácilmente un vector presentador correspondiente que exprese los heteromultimeros objeto utilizando las secuencias de heterodimerización única sin debida experimentación.

Además del vector presentador fago, otra clase de vector preferido es el vector presentador bacteriano. El esquema general resumido en lo anterior aplica igualmente para construir estos vectores. En resumen, los vectores facilitan la expresión de un' heteromultimero, en particular Abus, como una fusión con una proteina de superficie bacteriana. Investigación anterior ha mostrado un gran número de proteínas de superficie bacteriana aplicables para expresar tales fusiones. Los ejemplos no limitantes de las proteínas de la superficie bacteriana son LamB (Bremen y col, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1984) 104 81: 3830-34; Gene (1987) 52: 165-73); OmpA (Prog Biophys Molec Biol (1987) 49: 89-115); OmpC; OmpF (Pages y col., Biochemimie (1990) 72: 169-76); PhoE (van der Ley y col., J. Biol. Chem. 261: 12222-5); pilin (So y col., Curr Top in Microbiol & Immunol (1985) 118: 13-28); pldA (de Geus y col, EMBO J. (1984) 3(8): 1799-1802) y sus homólogos. La caracterización de éstas y otras proteínas de superficie, y los métodos para utilizar estas proteínas para presentar polipéptidos heterologos se detallan en la Patente US No. 5,837,500, así como las referencias mencionadas en ésta.

Los vectores de la presente invención por lo regular contienen secuencias control de la trascripción o traducción necesarias para expresar la Abus . Las secuencias para el control de la trascripción o la traducción convenientes incluyen, pero no se limitan a, el origen de replicación, promotor, potenciador, regiones de unión al represor, sitios de inicio de la trascripción, sitios de unión al ribosoma, sitios de inicio de la traducción y sitios de terminación para la trascripción y la traducción.

Cuando se utiliza en la presente, "promotor"es una región de DNA capaz bajo ciertas condiciones de unirse a 105 RNA polimerasa e iniciar la trascripción de una región codificante ubicada corriente abajo (en la dirección 3') del promotor. Puede ser constitutiva o inducible. En general, la secuencia promotora se une en su 3' terminal por el sitio de inicio de la trascripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la trascripción en niveles que puedan detectarse sobre el fondo. Dentro de la secuencia promotora esta un sitio de inicio de la trascripción, así como dominios de unión a proteínas responsables de la unión de RNA polimerasa. Los promotores eucarióticos con frecuencia, pero no siempre, contendrán cajas MTATA" y cajas "CAT".

La elección de los promotores dependerá -en gran medida de las células hospederas en las que se introduzca el vector. Para células animales se conocen en la técnica una variedad de promotores robustos, tanto virales y no virales. Los promotores virales representantes, no limitantes, incluyen CMV, los promotores tempranos y tardíos del virus SV40, promotores de diferentes tipos de adenovirus (por ejemplo adenovirus 2) y virus adeno-asociados. También es posible, y con frecuencia se desea, utilizar promotores normalmente asociados con un gen de cadena ligera o pesada deseada, siempre que tales 106 secuencias control sean compatibles con el sistema de la célula hospedera.

Las secuencias promotoras convenientes para otras células eucarióticas incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa, y otras enzimas glucoliticas como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de trascripción regulada por las condiciones del crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2 , isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, y la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa antes mencionada, y las enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa .

En ciertas modalidades preferidas, los vectores de la presente invención utilizan casetes de expresión potenciadores y promotores fuertes. Los ejemplos de estos casetes de expresión incluyen el promotor inmediatamente temprano de citomegalovirus humano (HCMV-IE) (Boshart y 107 col., Cell 41: 521, (1985)), el promotor ß-actina (Gunning y col., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. {USA) 84: 5831), el promotor histona H4 (Guild y col., (1988), J. Viral. 62: 3795), el promotor metalotioneina de ratón (Mclvor y col., (1987), Mol. Cell Biol. 7: 838), el promotor de la hormona de crecimiento de rata (Millet y col., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 431), el promotor adenosina deaminasa humana (Hantzapoulos y col., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3519), el promotor HSV tk 25 (Tabin y col., (1982) Mol. Cell. Biol. 2. 426), el potencxador a-1 antitripsina (Peng y col., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 8146), y el potencxador/promotor de inmunoglobulina (Blankestein y col., (1988) Nucleic Acid Res. 16: 10939), los promotores temprano o tardío de SV40, el promotor tardío adenovirus 2 principal, u otros promotores virales procedentes de poliomavirus, virus de papiloma bovino u otros retrovirus o adenovirus. Los elementos promotores y potenciadotes de los genes de inmunoglobulina (Ig) confieren notable especificidad para los linfocitos B (Banerji y col., (1983) Cell 33: 729; Gillies y col., (1983) Cell 33: 717, Masón y col., (1985) Cell 41: 479), mientras que los elementos que regulan la trascripción del gen de B-globina funcionan solo en células eritroides (Van Assendelft y col., (1989) Cell 56: 969). 108 También es posible utilizar promotores específicos de la célula o específicos del tejido. En la técnica se ha descrito y empleado una gran diversidad de promotores específicos de tejido. Los promotores ejemplares gue operan en células animales seleccionadas incluyen promotores específicos de hepatocitos y promotores específicos del músculo cardiaco. Dependiendo de la elección de los tipos de células receptoras, los expertos en la técnica conocerán de otros promotores específicos de la célula o específicos de tejido convenientes y gue pueden aplicarse para la construcción de los vectores de expresión de la presente invención.

Al utilizar las técnicas de restricción y ligación bien conocidas y las secuencias trascripcionales y de control adecuadas pueden cortarse de diferentes fuentes de DNA e integrarse en relación operante con los genes de fusión seleccionados, intactos que han de ser expresados de acuerdo con la presente invención.

Para la construcción de los vectores objeto, las secuencias de terminación asociadas con las secuencias exógenas también se insertan en el extremo 3' de la secuencia deseada que va a ser transcrita para proporcionar poliadenilación del mRNA y/o señal de la 109 terminación trascripcional. La secuencia terminadora preferentemente contiene una o más secuencias de terminación trascripcional como pueden ser las (secuencias de poliadenilación) y pueden también alargarse por la inclusión de la secuencia de DNA adicional para romper más la lectura trascripcional. Las secuencias terminadoras preferidas (o sitios de terminación) de la presente invención tienen un gen que es seguido por una secuencia de terminación de la trascripción, su propia secuencia de terminación o una secuencia de terminación heteróloga. Los ejemplos de estas secuencias de terminación incluyen codones de interrupción acoplados a diferentes secuencias de poliadenilación que sean bien conocidas en la técnica, que estén muy disponibles y como se ejemplifica más adelante. Cuando el terminado consiste en un gen, puede ser ventajoso un gen que codifique para un marcador que pueda detectarse o seleccionarse; proporcionando de este modo un medio mediante el cual se puede detectar y/o seleccionar la presencia y/o ausencia de la secuencia terminadora (y por tanto la inactivación y/o activación correspondiente de la unidad de trascripción) .

Además de los elementos ya descritos, los vectores pueden contener un marcador que pueda seleccionarse (por 110 ejemplo, un gen que codifique una proteina necesaria para la supervivencia o el crecimiento de una célula hospedera transformada con el vector) , aunque un gen marcador como este puede llevarse sobre otra secuencia de polinucleótidos co-introducida en la célula hospedera, solo las células hospederas en las que se haya introducido un gen que pueda seleccionarse sobrevivirá y/o crecerá en condiciones elegidas. Los genes de selección comunes codifican proteina (s) que: (a) confiere resistencia a los antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, G418, metotrexato, etcétera; (b) complementan deficiencias auxotróficas ; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de los medios complejos. La elección del gen marcador adecuado dependerá de la célula hospedera, y los genes adecuados para diferentes hospederos se conocen bien en la técnica.

En una modalidad preferida, el vector es un vector lanzadera, capaz de replicar en al menos dos sistemas de expresión no relacionados. Para facilitar tal replicación, el vector por lo regular contiene al menos dos orígenes de replicación, uno efectivo en cada sistema de expresión. Por lo regular, los vectores lanzadera son capaces de replicación en un sistema de expresión 111 eucariótico y un sistema de expresión procarióticos . Esto facilita la detección de la expresión de proteínas en el hospedero eucariótico (el tipo de expresión de la célula) y la amplificación del vector en el hospedero procariótico (el tipo de amplificación de la célula) . De preferencia, un origen de replicación se obtiene de SV40 y uno se obtiene de pBR322 aunque cualquier origen conocido en la técnica puede utilizarse siempre que dirija la replicación del vector. Cuando el vector es un vector lanzadera, el vector preferentemente contiene al menos dos marcadores selectivos, uno para el tipo de célula de expresión y uno para el tipo de célula para la amplificación. Cualquier marcador selectivo conocido en la técnica o los descritos en la presente pueden utilizarse a condición de que funcione en el sistema de expresión que se utilice.

Los vectores incorporados en esta invención pueden obtenerse utilizando métodos todos de clonación de recombinante y/o por síntesis química. Un gran número de técnicas de clonación recombinante como la PCR, la digestión y ligación con endonucleasas de restricción se conocen bien en la técnica, y no es necesario describirlas con detalle en la presente. Un experto en la técnica también puede utilizar los datos de las 112 secuencias que se proporcionan en la presente o las de las bases de datos públicas o patentadas para obtener un vector deseado por cualquier medio sintético disponible en la técnica.

Células hospederas de la presente invención: La invención proporciona células hospederas transíectadas con los vectores o una biblioteca de los vectores de expresión antes descritos. Los vectores de expresión pueden introducirse en una célula procariótica o eucariótica conveniente por cualquier medio adecuado, incluida la electroporación, bombardeo de microproyectiles ; lipofección, infección (donde el vector se acopla a un agente infeccioso) , transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias. La elección de medio para introducir vectores con frecuencia dependerá de las características de la célula hospedera.

Para la mayor parte de las células animales, cualquiera de los métodos antes mencionados es conveniente para el suministro del vector. Las células animales preferidas son células de vertebrado, de preferencia células de mamífero, capaces de expresar en 113 forma exógena los productos génicos introducidos en cantidad grande, por ejemplo a nivel de miligramos. Los ejemplos no limitantes de las células preferidas son NIH3T3, COS, HeLa, y células CHO.

Las células animales pueden cultivarse en diferentes medios. Los medios disponibles en el comercio como Ham' s FIO (Sigma) , el medio mínimo esencial (MEM, Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y el medio de Eagle modificado de Dubelcco (DMEM, Sigma) son convenientes para cultivar las células hospederas. Además, las células animales pueden crecer en un medio definido que carezca de suero pero que este suplementado con hormonas, factores de crecimiento o cualquier otro factor necesario para la supervivencia y/o crecimiento de un tipo de célula específico. Aunque un medio definido que de soporte para la- supervivencia de las células mantiene la viabilidad, morfología, capacidad para metabolizarse y potencialmente, capacidad de la célula para diferenciarse, un medio definido que favorezca el crecimiento celular proporcionará todas las sustancias químicas necesarias para la proliferación o multiplicación celular. Los parámetros generales que regulan la supervivencia y el crecimiento de las células de mamífero in vitro están bien establecidos en la técnica. Los parámetros fisicoquímicos que pueden 114 controlarse en los diferentes sistemas de cultivo de células son, por ejemplo pH, pC , temperatura y osmolaridad. Los requisitos nutricionales de las células por lo regular se proporcionan en las formulaciones de los medios normales desarrollados proporcionar un ambiente óptimo. Los nutrientes pueden dividirse en algunas categorías: aminoácidos y sus derivados, carbohidratos, azúcares, ácidos grasos, lípidos complejos, derivados de ácidos nucleicos y vitaminas. Además de los nutrientes para mantener el metabolismo celular, la mayoría de las células también necesitan de una o más hormonas de al menos uno de los siguientes grupos: esteroides, prostaglandinas, factores de crecimiento, hormonas hipofisarias y hormonas peptídicas para proliferar en medios libres de suero (Sato, G. H. y col., en "Growth of Cells in Hormonally Defined Media", Cold Spring Harbor Press, N. Y., 1982). Además de las hormonas, las células pueden necesitar proteínas transportadoras como transferían (proteína transportadora de hierro plasmático) , ceruloplasmina (una proteína transportadora de cobre) y lipoprotexnas de alta densidad (un portador lipídico) para la supervivencia y crecimiento in vitro. La serie de hormonas óptimas y proteínas transportadoras variará para cada tipo de célula. La mayoría de estas hormonas y proteínas 115 transportadoras se han adicionado en forma exógena o, en pocos casos, se ha encontrado una linea de células mutantes que no requiere un factor especifico. Los expertos en la técnica conocerán de otros factores necesarios para mantener un cultivo celular sin indebida experimentación .

Para células de plantas, en la técnica se dispone de una variedad de técnicas para suministro de vectores. Las células hospederas pueden estar en forma de plantas completas, células aisladas o protoplastos . Los procedimientos ejemplares para introducir vectores en células de plantas incluyen la transformación de plantas mediada por agrobacterias, la transformación de los protoplastos, la transferencia génica e polen, la inyección a órganos reproductores y la inyección en embriones inmaduros. Como es evidente para el experto en la técnica, cada uno de estos métodos tiene diferentes ventajas y desventajas. Asi pues, un método especifico para introducir vectores en una especie de planta especifica puede no ser necesariamente el más eficaz para otras especies de plantas.

La transferencia mediada por agrobacterium tumefaciens es un sistema muy aplicable para introducir 116 vectores en células de plantas por que el vector puede introducirse en tejidos de plantas completas, derivando la necesidad de regeneración de una planta intacta desde un protoplasto. El uso de vectores de expresión mediados por agrobacterium para introducir vectores en células de plantas es bien conocido en la técnica. Esta técnica utiliza una característica común de agrobacterium que coloniza plantas al transferir una parte de su DNA (el T-DNA) en una célula hospedera, donde se integra en el DNA nuclear. El T-DNA se define por secuencias limítrofes que son de 25 pares de bases de largo, y cualquier DNA entre estas secuencias limítrofes se transfiere a las células de planta también la inserción de un ácido nucleico viral de planta, recombinante, entre las secuencias limítrofes del T-DNA da origen a la transferencia del ácido nucleico viral de la planta, recombinante a las células de las plantas, donde el ácido nucleico viral de la planta recombinante se replica, y entonces se dispersa sistemáticamente por toda la planta.

Debido a que no todas las plantas son hospederos naturales para agrobacterium, es posible emplear otros métodos como la transformación de los protoplastos para introducir los vectores objeto en las células hospederas. Para algunas monocotiledóneas, la transformación de los 117 protoplastos de las plantas puede lograrse utilizando los métodos basados en la precipitación con fosfato de calcio, el tratamiento con polietilenglicol, electroporacion y combinaciones de estos tratamientos.

Además de la transformación de los protoplastos, el bombardeo de partículas es una técnica alternativa y conveniente para suministrar los vectores de la invención en una célula hospedera de planta. Específicamente, las células de las plantas pueden ser bombardeadas con micropartículas recubiertas con una pluralidad de los vectores objeto. El bombardeo con microproyectiles recubiertos con DNA se ha utilizado con muy buenos resultados para producir transformantes estables en plantas y animales (véase por ejemplo, Sanford y col., (1993) Methods in Enzymology, 217: 483-509). Las micropartículas convenientes para introducir vectores en una célula de planta por lo regular se preparan de metal, preferentemente tungsteno u oro. Estas micropartículas están disponibles por ejemplo de BioRad (por ejemplo BioRad PDS-1000/Ke) . Los expertos en la técnica sabrán que el protocolo del bombardeo de partículas puede optimizarse para cualquier planta modificando los parámetros como la presión de He, la cantidad de partículas recubiertas, la distancia entre el 118 macroportador y la pantalla de frenado y la distancia de vuelo desde la pantalla de frenado hasta el objetivo.

También es posible introducir vectores de plantas por transferencia de DNA directa en polen como esta descrito por Zhou y col., Methods in Enzymology, 101: 433 (1983)/ D. Hess, Intern Rev. Cytol. , 107: 367 (1987); Luo y col., Plant Mol. Biol. Repórter, 6: 165 (1988). De otro modo los vectores pueden ser inyectados en órganos reproductores de una planta como esta descrito por Pena y col., Nature, 325:274 (1987).

Otras técnicas para introducir ácidos nucleicos en células de plantas incluyen: (a) inoculaciones manuales. Las inoculaciones manuales son preferidas utilizando un pH neutro, amortiguador de fosfatos de baja molaridad, con la adición de zelite o carborundum (por lo regular aproximadamente 1%) . De una a cuatro gotas de la preparación se colocan sobre la superficie superior de una hoja y se frota suavemente, (b) inoculaciones mecánicas de lechos de plantas. Las inoculaciones de lechos de plantas se realizan asperjando (propulsado con gas) la 119 solución del vector en un segador accionado por un tractor mientras se cortan las hojas. De otro modo el lecho de la planta se corta y la solución del vector se rocía inmediatamente en las hojas cortadas. aspersión a presión alta de hojas individuales. Las inoculaciones de plantas individuales también puede realizarse asperjando las hojas con un rocío angosto, directo (50 psi, 6-12 pulgadas desde la hoja) que contenga aproximadamente 1% de carburundum en la solución amortiguada del vector. infiltración en vacío. Las inoculaciones pueden llevarse a cabo sometiendo un organismo hospedero a un ambiente con considerable presión de vacío para facilitar la infección.

Los procariotas convenientes para este propósito incluyen bacterias como los organismos gram negativos y gram positivos. Los miembros representantes de esta clase de microorganismos son Enterobacteriaceae (por ejemplo E. Coli) , Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella (por ejemplo Salmonella tiphimurium), Serratia (por ejemplo Serratia marcescans), Shigella, Neisseria (por ejemplo, Neisseria meningitidis) , así como Bacilli 120 (por ejemplo Bacilli subtilis y Bacilli lícheniformis) . De preferencia, la célula hospedera secreta cantidades mínimas de fragmentos proteolíticos de los Abus expresados. Las células hospederas de hongos (incluidas las levaduras) comúnmente empleadas son S. cerevisiae, Kleyveromyces lactis (K. Lactis) , especies de Candida incluidas C. albicans y C. glabrata, C. maltosa, C. utilis, C. stellatoidea , C. parapsilosis, C. tropicalus, Neurospora crassas, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) , Pichia pastoris, y Yarowia lipolytica .

Una vez introducidas en una célula hospedera conveniente, es posible determinar la expresión de las Abus utilizando cualquier ensayo de ácido nucleico o de proteínas conocido en la técnica. Por ejemplo, la presencia de mRNA trascrito de la cadena L ó H, o la Se Abu puede detectarse y/o cuantificarse por ensayos de hibridación tradicionales (por ejemplo, el análisis Northern blot) , los procedimientos de amplificación (por ejemplo RT-PCR) , SAGE (Patente US No. 5,695,937), y las tecnologías basadas en matrices (véase por ejemplo, las Patentes US Nos. 5,405,783, 5,412,087 y 5,445,934), utilizando sondas complementarias a cualquier región del polinucleótido Abu. 121 También es posible determinar la expresión del vector examinando la Abu expresada. Se dispone de una variedad de técnicas para el análisis de proteínas. Estas incluye, pero no se limitan a, radio inmunoensayos, ELISA (ensayos inmuno-radiométricos de enzimas ligadas) , inmunoensayos "sándwic ", ensayos inmuno-radiométricos, inmunoensayos in situ (utilizando por ejemplo oro coloidal, enzimas o etiquetas de radio isótopos) , el análisis Western blot, ensayos de inmunoprecipitación, ensayos inmunoprecipitación, ensayos inmunofluorescentes y PAGE-SDS.

Usos de los polinucleótidos, vectores y células hospederas de la presente invención Los polinucleótidos de vectores ce esta invención tienen diversos usos específicos. Estos son útiles, por ejemplo, en sistemas de expresión para la producción de Abus Se y Nsc. Los polinucleótidos también son útiles como cebadores para efectuar la amplificación de los polinucleótidos deseados. Además, los polinucleótidos esta invención también son útiles en composiciones farmacéuticas que incluyen vacunas, diagnósticos y fármacos . 122 Las células hospederas de esta invención pueden utilizarse, ínter alia, como depositarios de los polinucleótidos objeto, vectores, o como vehículos para producir y detectar las Abus deseadas basándose en sus especificidades de unión al antigeno.

Por consiguiente, la invención propone un método para identificar una Nsc Abu que sea inmuno-reactiva con un antigeno deseado. El método incluye los siguientes pasos: (a) preparar un repertorio con diversidad genética de Abus, en donde el repertorio contenga al menos una Abu objeto; (b) poner en contacto el repertorio de unidades de unión al antígeno con el antigeno deseado; (c) detectar una unión especifica entre las Abus y el antigeno, identificando por este medio la Abu que esa inmuno-reactiva con el antigeno deseado .

La habilidad de una Abu para unirse específicamente a un antígeno deseado puede probarse por diversos procedimientos bien establecidos en la técnica. Véase Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Gherardi y col., (1990) J. Immunol. Meth. 126: 61-68. Por lo regular, las Abus que exhiben las especificidades de unión deseadas 123 pueden detectarse directamente por inmunoensayos, como puede ser mediante la reacción de las Abus etiquetadas con los antigenos que sean inmovilizados sobre un soporte sólido o sustrato. En general, el sustrato al cual se adhiere el antigeno se fabrica con material que muestre un bajo nivel de unión no especifica durante el inmunoensayo . ün soporte sólido preferido se prepara a partir de uno o más de los siguientes tipos de materiales: polímeros plásticos, vidrio, celulosa, nitrocelulosa, material semiconductor y metal. De referencia, el sustrato es una caja de petri, perlas cromatográficos, perlas magnéticas y similares.

Para un ensayo en fase sólida como este, las Abus sin reaccionar se eliminan por lavado. En un ensayo en fase líquida, no obstante, las Abus sin reaccionar se eliminan por alguna otra técnica de separación, como la filtración o cromatografía. Después de unir el antígeno a las Abus etiquetadas, se determina la cantidad de etiqueta unida. Una variación de esta técnica es un ensayo competitivo, en el cual el antígeno se une hasta saturación con una molécula de unión original. Cuando una población de la Abu objeto se introduce al complejo, solo aquellas que muestren mayor afinidad de unión podrán competir, y de este modo permanecerán unidas al antígeno. 124 De otro modo, la unión especifica a un antigeno determinado puede valorarse por clasificación celular, la cual incluye presentar el antigeno deseado en las células que van a ser clasificadas, después etiquetar las células elegidas con las Abus que se acoplen a los agentes detectables, seguido por la separación de las células etiquetadas de las no etiquetadas en un clasificador de células. Un método de separación de células avanzado es la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . Las células que viajan en una célula fila en una corriente fina se pasan a través de un haz láser y entonces se mide la florescencia de cada célula unida por la Abu etiquetada con fluorescencia.

El análisis ulterior de las Abus eluidas puede incluir las secuenciación de las proteínas para delinear las secuencias de aminoácidos de las cadenas L y H. Con base en las secuencias de aminoácidos deducidas, entonces es posible obtener el cDNA que codifica los polipéptidos de los anticuerpos por métodos de clonación recombinante incluida la PCR, escrutinio de bibliotecas, búsquedas de homología en las bases de datos de los ácidos nucleicos existentes, o cualquier combinación de estas . Las bases de datos que comúnmente se emplean incluyen, pero no se limitan a: GenBank, EMBL, DDBJ, PDB, SWISS-PROT, EST, STS, GSS y HTGS . 125 Cuando el repertorio de Abus se presenta sobre partículas fago o bacterianas, la selección preferentemente se realiza utilizando cromatografía por afinidad. El método por lo regular procede con la unión de un repertorio de Abus de fago a placas recubiertas con antígeno, matrices de columnas, células o a antígeno biotinilado en solución seguido por captura. Los fagos o bacterias unidos a la fase sólida se lavan y luego se eluyen por hapteno soluble, ácidos o álcalis. De otro modo es posible utilizar concentraciones crecientes del antígeno para disociar las Abus de la matriz de afinidad. Para ciertas Abus con afinidad extremadamente alta o avidez para el antígeno, la elución eficiente puede necesitar pH alto o una solución reductora moderada como esta descrito en WO 92/01047.

Para evitar las dificultades potenciales en la recuperación de las Abus unidas con las especificidades de unión deseadas, pueden introducirse sitios de disociación por proteasas entre las secuencias de heterodimerización y la proteína de la capa del fago que se emplee para presentar las Abus. Los sitios de desdoblamiento o disociación que pueden aplicarse para este propósito incluyen, pero no se limitan a, los sitios de reconocimiento del factor X, tripsina y trombina. 126 Después de unir el repertorio del fago a una matriz de afinidad y lavar los fagos no específicos, ios fagos restantes que presentan las Abus con la afinidad deseada puede recolectarse lavando la matriz de afinidad por el antígeno con proteasa en condiciones convenientes para la digestión en el sitio de disociación. Tal digestión liberaría las Abus de las partículas fago.

Un procedimiento alternativo al anterior es tomar la matriz de afinidad que haya retenido las partículas fago o bacterianas fuertemente unidas y extraer sus ácidos nucleicos, por ejemplo, por ebullición en solución SDS. Los ácidos nucleicos extraídos pueden utilizarse para transformar directamente células hospederas E. Coli o, de otro modo, las secuencias que codifican el anticuerpo pueden amplificarse por PCR utilizando los cebadores convenientes .

La eficiencia de la selección probablemente dependa de una combinación de diversos factores, que incluye la cinética de disociación durante el lavado, y si múltiples Abís sobre un solo fago o bacteria pueden unirse simultáneamente a los antígenos en un soporte sólido. Por ejemplo, los anticuerpos con cinética de disociación rápida (y afinidades de unión débiles) deben ser 127 retenidos mediante el uso de lávados cortos, presentación multivalente y una elevada densidad de recubrimiento en el antigeno en el soporte sólido. Por el contrario, la selección de las Abus con cinética de disociación lenta (y buenas afinidades de unión) deben ser favorecidas mediante el uso de lavados fuertes, fagos monovalentes y una baja densidad de recubrimiento del antigeno.

Si se desea, el repertorio de las Abus puede ser preseleccionado contra un antigeno no relacionado para contraseleccionar las Abus no deseadas. El repertorio también puede ser preseleccionado contra un antigeno relacionado para aislar, por ejemplo, las Abus anti-idiotipicas, el repertorio de las Abus objeto permite el aislamiento rápido de las Abus con las especificidades deseadas. Se esperarla difícil o imposible obtener muchas de las Abus aisladas por tecnología del hibridoma o en animales transgénicos , tradicional.

Equipos que contienen, los vectores de la presente invención La presente invención también comprende los equipos que contienen los vectores de esta invención en envases convenientes. Los equipos incorporados por esta invención incluyen aquellos que permiten la generación de Abus 128 reconstituidas por afinidad por el par de un par de la secuencia de -heterodimerización único como se describe en la presente.

Cada equipo necesariamente contiene los reactivos que hacen posible el suministro de los vectores en una célula hospedera. La selección de los reactivos que facilitan el suministro de los vectores puede variar dependiendo del método de transfección o infección especifico que se utilice. Los equipos también pueden contener los reactivos útiles para generar sondas de polinucléotidos etiquetados o sondas proteznaseas para la detección de las Abus . Cada reactivo puede ser suministrado en forma sólida o estar disuelto/suspendido en un búfer liquido conveniente para almacenamiento en inventario, y después para intercambiar o adicionar en el medio de reacción cuando se realice el experimento. Se proporciona el envasado conveniente. El equipo, como una opción, puede proporcionar componentes adicionales que sean útiles en el procedimiento. Estos componentes opcionales incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores, reactivos de captura, reactivos reveladores, etiquetas, superficies de reacción, medios para la detección, muestras control, instrucciones e información interpretativa. 129 Otros ejemplos del desarrollo y uso de las ¾.bus, polinucléotidos, vectores y células hospederas de conformidad con esta invención se proporcionan en la sección de los ejemplos siguiente.

Los ejemplos se proporcionan como una guia a un practicante de las habilidades ordinarias en la técnica, y no se deben entender como limitantes en ningún sentido.

EJEMPLOS Construcción de las unidades de unión al antigeno no monocatenarias : Fv de hélice enrollada (ccFv) Como ya se describió, el fragmento Fv es el fragmento de anticuerpo más pequeño que contiene el sitio de unión al antigeno completo. Compuestos de dos regiones variables de cadena pesada y ligera (VH y VL) , el Fv se localiza en las puntas "superiores" de la molécula de inmunoglobulina en forma de Y. los fragmentos Fv tienen energía de interacción muy baja entre sus dos fragmentos VH y VL, y con frecuencia son demasiado inestables para múltiples aplicaciones en condiciones fisiológicas. En una inmunoglobulina en estado natural (por ejemplo la Ig) , un enlace disulfuro intercatenario ubicado en los dominios constantes CHl y CL se utiliza para ligar la VH 130 y VL. Este enlace forma un fragmento de unión a antígeno Fab estabilizado con un peso molecular de 50 kDa. Se ha demostrado que los fragmentos VH y VL también pueden mantenerse artificialmente juntos por un ligador peptidico corto entre el carboxilo terminal de un fragmento y el amino terminal de otro para formar un fragmento de anticuerpo Fv monocatenario (scFv) . La unidad de unión al antigeno scFv solo tiene la mitad del tamaño de Fab. No obstante, algunas proteínas scFv también son inestables. El ligador polipéptido en scFv puede interferir con la unión en algunos casos. Un enlace disulfuro intercatenario también se ha introducido en las regiones de la estructura fundamental en VH y VL para formar un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv) . La configuración de sFv también tiene intensas limitaciones. La introducción de dos residuos Cys en las regiones variables de unión al antígeno puede cambiar el enlace disulfuro intracatenario en VH o VL, por tanto interfiere con la unión al antígeno.

Hemos ideado una nueva estrategia para estabilizar el heterodímero VH y VL. Hemos diseñado y utilizado un par de secuencias de heterodimerización únicas para crear un fragmento Fv artificial, funcional, tipo Fab, a saber, el fragmento Fv de hélice enrollada (ccFv) . El par de 131 heterodimerización se obtuvo de los receptores heterodiméricos los receptores GABAB 1 y 2. El par de secuencias forma una estructura de hélice enrollada y media la heterodimerización funcional de los receptores GABAB-R1 y GABAB-R2.

Diferentes de las cremalleras de leucina de hélice enrollada ya caracterizadas procedentes de las proteínas Fos y Jun, la hélice enrollada C terminal de los receptores GABAB-R1 y GABAB-R2 no forman homodímeros detectables en condiciones fisiológicas (por ejemplo in vivo? ni forman homodímeros a las temperaturas corporales fisiológicas. La investigación de Kuner y col.,' y de White y col., {Science (1999) 283: 74-77); Nat re (1998) 396: 679-682)) han demostrado la especificidad de la heterodimerización de GABAB-R1 y GABAB-R2 in vivo de hecho, White y col., pudieron clonar GABAB-R2 de células de levadura basándose en la especificidad exclusiva de este par de receptores heterodiméricos. Los estudios in vitro de Kammerer y col., supra ha demostrado que ninguna de las secuencias C terminales de GABAB-R1 ni GABAB-R2 pueden formar homodímeros en condiciones amortiguadoras fisiológicas cuando se ensayan a las temperaturas fisiológicas del cuerpo (véase la Tabla 1 de Kammerer) . No obstante, ninguno de estos investigadores quienes 132 estuvieron involucrados en la separación original del gen de GABAB-R2 y la caracterización de las secuencias de la hélice enrollada describen ni incluso sugieren el uso de estas secuencias de heterodimerización únicas para la construcción de heteromúltimeros como las unidades de unión al antigeno.

Hemos modificado el carboxilo terminal de los dominios GR1 y GR2 adicionando un flexón "SerArgGlyGlyGlyGly" al amino terminal de los dominios GRl y GR2 para proporcionar más flexibilidad a las regiones V. Para estabilizar más ccFv, hemos introducido un par de residuos de cisteina adicionando el separador "ValGlyGlyCys" en los C terminales de la hélice enrollada. Los dominios GRl y GR2 se fusionan al carboxilo terminal del fragmento VH y VL, respectivamente. Las fusiones VH-GR1 y VL-GR2 fueron expresadas en E. Coli y presentadas por fagos. Como se muestra en las Figuras 10-11, se generaron las Abus ccFv heterodiméricas, funcionales, estabilizadas por la hélice enrollada. Dado que las secuencias de las heterodimerización de hélice enrollada son aproximadamente la mitad del tamaño de los dominios CHl y CHL, el fragmento ccFv (de aproximadamente 35 kDa) es más pequeño que los fragmentos Fab tradicionales 133 (aproximadamente 50 kDa) . Debido al tamaño pequeño, los Fab y sus derivados son potencialmente más útiles para aplicaciones clínicas como penetración a tumor y tejidos. Se espera expresión y presentación más eficientes de ccFv. Además, el ensamble específico de las regiones VH y VL debido a la afinidad por el par de las secuencias de heterodimerización únicas hace más posible la construcción de un repertorio robusto, más diverso de Abs.

Materiales y métodos Las cepas bacterianas y de fagos: Escherichia coli TG1 ( supEA (hsdM-mcrB) 5 (r~kmk~McrB~) thiA (lac-proAB/Fr traD36, aclqA (lacZ) M15] se utilizó para el DNA plasmídico y la producción del fago; el fago cooperador K07 y el anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP de Pharmersham Pharmacia Biotech, pbluescript SK(+) de Stratagene; el anticuerpo anti-?? de Santa Cruz Biotechnology. 134 Ejemplo 1: Construcción del vector Vectores pABMXl y pABMX2 : Los vectores presentadores de Fagémidos pABMXl y pABMX2 se obtuvieron de pbluscript SK(+). Se introdujo sitio de restricción Agel único inmediatamente después del promotor lac por mutagénesis dirigida al sitio, basada en PCR con una serie de cebadores (pBS-SKa: 5 ' GGAATTGTGAGCGGATAACAATTTACCGGTCACACAGGAAACAGCTATGACCATG -3' y pBS-SKb 5 ' CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGACCGGTAAATTGTTATCCGCTCACAATTCC -3' y los sitios Xhol y Kpnl fueron delecionados cortando y por ligación del extremo romo. Después, los fragmentos de DNA sintético flanqueados por el sitio Agel en 5' y los sitios BglII/EcoRI en 3' , que contenían la secuencia potenciadora de la traducción EP del gen 10 del fago T7 (TTAACTTTA) , la secuencia de unión al ribosoma S/D (TAAGGAGG) , la secuencia líder del gen 8 del fago fd con el sitio HindIII (ATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCCGTAGCCGTTGCTCCCTCGTTCCGATG CTAAGCTTCGCT, para pABMXl) o la secuencia líder pelB (ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCC GGCCATGGCG, para pABMX2) y la etiqueta HA- (His ) 6-tag (DHtag) 135 (TATCCATACGACGTACCAGACTACGCAGGAGGTCATCACCATCATCACCATTAG) , se clonaron en pbluescript SK(+) modificado. Los vectores resultantes se denominaron pABMXl y pABMX2 (véase la Figura 3A-B para los mapas de restricción y las secuencias) . Las secuencias heterólogas que codifican los heteromultímeros como Nsc Abus además fueron subclonadas en estos vectores para la expresión periplásmica . Vectores pABMDl y pABMD2 : El fragmento del gen III (o gen 3) fd amplificado por PCR, flanqueado por los sitios BglII y Salí se insertaron en los vectores pABMXl y pABMX2 (véase la Figura 4) . La secuencia heteróloga que ha de ser presentada se puede insertar después de las secuencias guia. El promotor lac dirige la expresión de la fusión a la cápside de pIII que a su vez puede ser presentada en la superficie del fago después de súper infección por el fago cooperador como K07.

Vectores pABMX5 y pABMX6: Estos dos vectores fueron obtenidos de pABMXl y pABMX2. Un fragmento de DNA sintético flanqueado por el sitio Xbal/AscI en 5' y los sitios Mlul/Xhol/Notl en 3', conteniendo la secuencia de unión al ribosoma S/D 136 (TAAGGAGG) y la secuencia guia del gen 3 (ATGAAA AAATTATTATTCGCAATTCCTTT AGTTGTTC CTT TCTATTCTCACTCCGCT) , se insertó en pABMXl y pABMX2 por los sitios Abal/Notl. Después, la secuencia codificante del dominio GR1 (Figura 2) se subclonó en los sitios Xba/Notl, y la secuencia codificante del dominio GR2 (Figura 2) se insertó en el sitio Xhol/Notl. Después los dominios VH y VL fueron insertados antes de la secuencia GRl y GR2, respectivamente. Una representación esquemática de los vectores pABMX5 y pABMX6 se muestran en la Figura 5A . Estos vectores expresan dos proteínas: VH-GR1 y VL-GR2 bajo un promotor lac.

Vector pABMD5 y pABMD6: Los fragmentos de DNA para ccFv de los vectores pABMX5 y pABMX6 se subclonaron en pABMDl y pABMD2 para producir los vectores pABMD5 y pABMD6 (véase la Figura 6A-B para los mapas de restricción y la secuencias) . Estos vectores expresan dos proteínas: las fusiones de pIII a VH-GR1 y VL-GR2. Las fusiones de pIII a VH-GR1 y VL-GR2 expresadas secretan en el espacio periplásmico, donde toma lugar la dimerización a través de la heterodimerización del dominio de hélice enrollada. La Abu ensamblada entonces se presenta sobre la superficie 137 del fago tras la súper infección de los fagos cooperadores como K07.

Ejemplo 2: Expresión de ccFv funcional Los dominios variables del anticuerpo AM1 fueron subclonados en el vector pABMXG para la expresión del fragmento ccFv. Luego el vector se introdujo en células TG1 o células BL21. Las bacterias transformadas en 500 rriL 2x YT con un contenido aproximado de 100 ug/mL de carbenicilina y 0.1% de glucosa de una sola colonia fueron crecidas hasta una DOgoo = 0.7 (aproximadamente) a 37 °C. Se adicionó IPtg 1 mM durante 4 horas de inducciones a 303 C. El paquete bacteriano se recolectó para la preparación concentrada periplásmica y osmótica. El paquete se resuspendió en 12.5 mi de búfer PPB (200 mg/mL de sacarosa, EDTA ImM, Tris-HCl, pH 8.0) con 1.25 mi del cóctel inhibidor de proteasa de Sigma, y se puso sobre hielo durante 20 minutos. Se recolectó el sobrenadante por centrifugación. El paquete se resuspendió en MgSÜ 5 mM y se incubó en hielo durante 20 minutos. Se combinaron los sobrenadantes de MgSC>4 y PIB se dializaron con la PBS. Después de cargar a 1 mL de la columna Ni-NTA, las proteínas His-tag fueron purificadas por elusión con imidazol 350 mM. La Figura 10A muestra 138 que el fragmento ccFv purificado tiene una mobilidad electroforética de 35 kDa sobre un gel no reductor. Cuando se analizaron en condiciones reductoras, se observaron dos subunidades correspondientes a VL y VH. Se confirmó la banda superior como la fusión VL-His-tag por análisis Western blot.

Para medir la especificidad de unión de AMl-ccFv soluble, se llevó a cabo el ensayo ELISA. Los antigenos AM1 (0.2-1.0 ug/pozo) fueron recubiertos sobre placas de ELISA durante la noche a 4°C. Después de bloquear con 5% leche/PBSA. La solución del anticuerpo en 5% leche/PBS se adicionó a la placa ELISA, y se incubó durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las Abus no unidas se lavaron. La Figura 10B muestra la unión especifica de AMl-ccFv a su antigeno. El control contiene 5% leche en PBS . Este resultado confirma el ensamble de ccFv funcional por las secuencias de heterodimerización GABA3R1/R2 de hélice enrollada .

Ejemplo 3: Presentación del fragmento ccFv funcional La presentación del anticuerpo por un paquete genético es una herramienta poderosa para enriquecer y aislar las Abu especificas de bibliotecas grandes. Para 139 analizar si el fragmento ccFv puede utilizarse en un sistema de presentación de fago, hemos construido un vector fagémido subclonando el gen ccFv del anticuerpo AM1 en el vector pABMD6. Las células TG1 portadoras de los vectores fagémidos fueron súper infectadas por el fago cooperador K07. Las células TG1 infectadas fueron crecidas en 2xYT/Amp/Kan a 30 °C durante la noche. Las partículas fagémidas fueron precipitadas por PEG/NBaCl de los sobrenadantes de cultivo del cultivo dos veces y resuspendidas en PBS . El anticuerpo presentado sobre el fago fue detectado por la actividad de unión al antígeno por el ensayo ELISA para fago. En resumen, primero se recubrieron los antígenos sobre placas de ELISA. Después de bloquear con 5% leche/PBS, la solución del fago se adicionó a las placas ELISA. El fago unido al antígeno. se detectó por incubación con el anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP. Se utilizó el sustrato ABTS [ácido 2, 2' -azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfónico) ]para medir la actividad de la HRP. El anticuerpo anti-HA-tag, también se utilizó para detectar las proteínas presentadas sobre partículas de fago. El anticuerpo anti-HA se recubrió sobre placas e 96 pozos (2 ug/cada pozo) . Los fagos unidos al anticuerpo anti-HA recubiertos sobre las placas de ELISA se detectaron por el anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP. 140 También se preparó el fago del anticuerpo monocatenario para comparar el ccFv y la presentación del fago scFv. Como se muestra en la Figura 11?-?, la capacidad de unión de los fagos ccFv se compara con la de los fagos scFv tradicionales. Para ciertos fagos que expresan ccFv, su capacidad de unión es casi un orden de magnitud mayor que los fagos que expresan scFv habituales (Figura 11B) asi pues, el fragmento ccFv es una Abu funcional incluso cuando se presenta sobre una partícula de fago.

Expresión de las unidades de unión al antigeno monocatenarias Ejemplo 4: Expresión de los scFv convencionales El AM2-scFv se subclonó en el vector de expresión soluble pABMXl en los sitios HindIII/Notl . La preparación preplásmica se llevó a cabo como se delinea en lo anterior. Una proteína anticuerpo de 30 kDa purificada a partir de una columna ??-??? se confirmó por análisis SDS-PAGE y se probó para su especificidad de unión al antígeno utilizando ELISA. Los antígenos AM2 primero fueron recubiertos sobre placas de ELISA en una concentración de 0.2 ug/pozo. Se incubó con el antígeno 141 diferentes cantidades de fragmentos AM2-scFv. Los fragmentos AM2-svFv [sic] unidos fueron detectados por el antígeno anti-HA-tag. El experimento mostró una unión dependiente de la dosis de AM2-scFv a su antigeno AM2 (Figura 8) .

Ej emplo 5 : Presentacion_de1 fragmento scFv tradicional sobre el fago El fragmento AM2-scFv primero se subclonó en el vector fagémido pAMBDl en los sitios HindIII/Notl . Las células TG1 portadoras de este vector fagémido fueron infectadas por el fago cooperador K07. Los fagos fueron purificados de los sobrenadantes. Posteriormente se realizó el ensayo ELISA para fagos para detectar el AM2-scFv presentado sobre las partículas de fago. Debido a que el gen pIII de la cubierta se etiquetó con HA-tag, la fusión puede detectarse con los anticuerpos anti-ha. El ensayo ELISA utilizando el antígeno AM2 y los anticuerpos anti-?? confirmó que el scFv presentado fue capaz de unirse específicamente a los antígenos correspondientes (Figura 9) . El control incluye fagos que presentan anticuerpos no relacionados que no están etiquetados con HA. 142 Expresión de las unidades de unión al antigeno objeto e células eucarióticas Ejemplo 6: Expresión de ccFv en levadura Se construye el vector de levadura ?????7 portador de las secuencias VL y VH que están ligadas a las secuencias de heterodimerización objeto. Las células de levadura competentes, por ejemplo las células AH109, se preparan y transforman con los vectores pAMEX7 de acuerdo con cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Las células de levadura transformadas se cultivan en las condiciones convenientes para la expresión de la proteina. Las condiciones como estas son bien conocidas por los expertos en el campo y por tanto no se detallan en la presente. Las Abus ccFv expresadas se cosechan utilizando los métodos bien conocidos en la técnica y/o los procedimientos descritos en la presente. La capacidad para unirse al antigeno del ccFv cosechado se determina por ELISA de acuerdo con los protocolos descritos en lo anterior . 143 Enriquecimiento e identificación de ccFv fago que muestra la especificidad de unión deseada Ejemplo 7: Enriquecimiento de los AM2-ccFv fagos a partir de una biblioteca modelo Para demostrar que los fagos que presentan ccFv con especificidad de unión deseada pueden ser seleccionados y finalmente enriquecidos para fagos de fondo, se realizó un escrutinio de los AM2-ccFv fagos a partir de una biblioteca modelo. La biblioteca modelo se preparó mezclando los A 2-ccFv fagos con fagos que presentan AM1-ccFv no relacionados en una proporción de 1:106 ó 1:107. Dos rondas de escrutinio de las bibliotecas contra el antigeno proteinico especifico que estaba recubierto sobre placas de 96 pozos Nunc Maxisorb se llevaron a cabo. Después de bloquear con 5% de leche en PBS, se 12 adicionó al pozo 1X10 fagos de la biblioteca en 2% leche/PBS, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego se desechó la solución de fagos, y los pozos se lavaron 5 veces con PBST (0.05% Tween 20 en PBS) y 5 veces con PBS. Los fagos unidos fueron eluidos con trietilamina 100 mM, y fueron adicionados a cultivo de TG1 para infección. Los fagos preparados a partir de las células TG1 infectadas se utilizaron para la siguiente 144 ronda de escrutinio y ELISA contra el antigeno proteinico inmovilizado de AM2-ccFv. Después de cada ronda de escrutinio, también se determinó la relación de A 2-ccFv fago a fago de fondo A l-ccFv fago por' análisis PCR de los clones elegidos al azar por un par de cebadores que fueron específicamente diseñados solo para AM2-ccFv (una banda de producto de la PCR de ~kb podría visualizarse en un gel de agarosa al 1%), pero no para AMl-ccFv (sin producto de la PCR) . Como se muestra en al Figura 20, se realizó el análisis ELISA contra el antígeno proteínico inmovilizado de A 2-ccFv. Los fagos de la segunda ronda del escrutinio produjeron lecturas a DO405 mucho mayores en comparación con los de la primera ronda, sugiriendo que los AM2-ccFv fagos fueron elegidos con muy buenos resultados y enriquecidos durante el escrutinio. El análisis PCR en la Figura 21 mostró la imagen en gel de agarosa al 1% de los productos de la PCR de clones elegidos al azar. Los resultados indican que la tasa de acontecimientos de AM2-ccFv fue de 4.4% a partir de la ? biblioteca 1:10 después de la primera ronda del escrutinio, mientras gue después de la segunda ronda del escrutinio, la ocurrencia se enriqueció al 100%. 145 Ejemplo 8: detección de la biblioteca utilizando la biblioteca de fagos que presenta ccFv funcional La detección de una biblioteca de fagos con un gran número de Abus, todos los cuales pueden unirse a un antígeno deseado pero cada Abu difiere en ciertas regiones del dominio de unión critico, permite identificar y además diseñar anticuerpos con incluso mayor afinidad. Para demostrar que es posible utilizar eficazmente el ccFv como vehículo para tamizar una biblioteca de anticuerpos, construimos una biblioteca de AM2 en el formato de ccFv. La estructura fundamental de AM2 consistió en una región VH y una VL, cada una fue subclonada en las posiciones correspondientes del vector pABMD6 como ya se describió. En resumen, la VH se ligó al N terminal de GR1, y la VL se ligó al N terminal de GR2, respectivamente. GR2 a su vez se fusionó a pIII para presentar el fragmento del anticuerpo ccFv a la superficie de la partícula fago (véase los ejemplos 1,3 y 7) . Para seleccionar fagos unidores con alta afinidad a través del escrutinio de la biblioteca de fagos ccFv, se construyó una CDR3 de VH como biblioteca que contiene múltiples opciones de residuos en múltiples posiciones. Se preparó la biblioteca a través de síntesis normal de DNA oligo degenerativo llevando sitios de restricción en 146 ambos extremos de modo que pudieran ser subclonados en su posición de AM2 después de la amplificación por PCR y digestión de restricción. La Figura 22 ilustra el diseño del DNA oligo degenerativo, sus cebadores de amplificación y direcciones. La diversidad de la biblioteca se diseñó para que fuera de aproximadamente 1X10 especies en total. Después de la ligación, la biblioteca fue electroporada en células competentes TG1. Las transformantes entonces fueron cosechadas y rescatadas por el fago ayudador 07 antes de que las partículas de fago de la biblioteca fuera .recolectadas como se describe en el ejemplo anterior. Para "tamizar" la biblioteca, el antígeno recombinante fue inmovilizado sobre una placa de 96 pozos Nunc maxisorb en NaHC03 0.05 M, pH 9.6 como amortiguador, a 4°C durante la noche. Una , . , 12 alícuota de la biblioteca de fagos que contenia 10 partículas de fagos diluidas en búfer PBS con 2% de leche se adicionó al pozo que esta recubierto con el antígeno. Después de incubar a 37 °C durante 2 horas, el pozo se lavó y el fago se eluyó como se describe en los Ejemplos 3 y 7. Los fagos eluidos fueron utilizados para infectar células TG1, luego fueron rescatados por el fago ayudador K07. Después del crecimiento durante la noche a 30 °C, los fagos fueron amplificados en células TG1 y estuvieron listos para ser cosechados para la siguiente ronda de 147 escrutinio. Estudios anteriores han demostrado que la tasa de disociación, Koff, contribuye muy significativamente para la afinidad de este anticuerpo especifico, mientras que Kon es relativamente constante. Asi pues, para seleccionar fagos con elevada afinidad de unión, se diseñó el tamizado a tasa off, un procedimiento de lavado prolongado para elegir fagos supervivientes para elegir específicamente aquellos fagos que tienen KGff más lenta. Para esta biblioteca se realizó un total de 7 rondas consecutivas de tamizado.

Después del quinto y el séptimo tamizado, los clones individuales fueron elegidos al azar para preparar fagos para ELISA utilizando el mismo antigeno proteínico en el tamizado de los fagos. El ensayo ELISA se realizó utilizando placas de microtitulación de 96 pozos siguiendo los procedimientos descritos en el ejemplo 7 anterior. Como se muestra en la Figura 23, todos los clones elegidos en las rondas 5a y 7a reaccionaron positivamente con el antígeno. Se debe observar que el control negativo fue establecido en las posiciones H10, 11 de la quinta ronda y Hll, 12 de la séptima ronda, todos los cuales estuvieron por debajo de 0.05 a DO405. 148 Los clones que mostraron reactividad positiva en ELISA del séptimo tamizado entonces fueron elegidos al azar para secuencíación, y los residuos en la CDR3 de la VH fueron mapeados o determinados en la Figura 24. Mediante la biblioteca luego se identificó el consenso en las posiciones elegidas. La expresión de proteínas de un clon que represento la secuencia consenso y el tipo nativo (el AM2 original) se llevó a cabo y posteriormente se utilizaron las proteínas en la determinación de su Koff durante la unión con el antígeno proteínico inmovilizado utilizando BiaCore (resonancia superficial del plasmón) . Como se muestra en la Figura 25, la variante AM2 elegida de la biblioteca tiene mucho menor Koff.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> ZHONG, Pingyu et al. <120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA GENERAR HETEROMULTÍMEROS QUIMÉRICOS <130> 13403.0004.OQPC00 <140> Está asignado <141> <160> 30 <170> FastSEQ for Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 146 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) ... (132 <400> 1 tct aga ggt gga gga ggt gag gag aag tcc cgg ctg ttg gag aag gag 48 Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu 1 5 10 15 aac cgt gaa ctg gaa aag atc att gct gag aaa gag gag cgt gtc tct " 96 Asn Arg Glu Leu Glu Lys lie lie Ala Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser 20 25 30 gaa ctg cgc cat ca ctc cag tct gta gga ggt tgt taatagggcg 142 Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Val Gly Gly Cys 35 40 cgcc 14 e <210> 2 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu 1 5 i - 10 15 Asn Arg Glu Leu Glu Lys lie lie Ala Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser 20 25 30 Glu -Leu-. Arg His= -Gln. Leu Gln. Ser Val Gly Gly Cys 35 40 <210> 3 <211> 140 <212> ADN <213> Homo sapi <220> <221> CDS <222> (1) . <400> 3 tct cga gga ggt ggt gga aca tcc cgc ctg gag ggc cta cag tca gaa Ser Arg Gly Gly Gly Gly Tur Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gln Ser Glu 1 5 10 15 aac cat cgc ctg cga atg aag ate aca gag ctg gat aaa gac ttg gaa Asn His Arg Leu Arg Met Lys lie Thr Glu Leu Asp Lys Asp Leu Glu 20 25 30 gag gtc acc atg cag ctg cag gac gtc gga ggt tgc -gcg gee Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly Gly Cys Ala Ala 35 40 45 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Arg Gly Gly Gly Gly Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gln Ser Glu I B 10 15 His Arg Leu Arg Met Lys lie Thr Glu Leu Asp Lys Asp Leu Glu Glu 20 25 30 Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly Gly Cys Ala Ala Ala 35 40 45 <210> 5 <211> 203 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> vector Bluescript <400> 5 aat tgt gag cgg ata acá att tac cgg ttc ttt taa ctt tag taa gga 8 gga att aaa aaa tga aaa agt ctt tag tcc tca aag_ cct ccg tag ccg 95 ttg cta ccc tcg ttc cga tgc taa gct tcg ctt cta gag cgg ccg ctt 144 ate cat acg acg tac cag act acg cag gag gtc ate acc ate ate acc 192 att aga gat ct 203 <210> 6 <211> 45 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Bluescript <400> 6 Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu 1 . 5 10 15 Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ser Arg Ala Ala Ala Tyr Pro Tyx Asp 20 25 30 Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His His His His His His <210> 7 <211> 212 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> vector Bluescript <400> 7 aat tgt gag cgg ata aca att tac cgg ttc ttt taa ctt tag taa gga ga att aaa aaa tga aat acc tat tgc cfca cgg cag ccg ctg gat tgt tat tac tcg cgg ccc- agc cca tgg cgg ccc tgc agg 'cct cta gag cgg ccg ctt atc cat acg acg tac cag act acg cag gag gtc atc acc atc a c acc atfc aga gat ct <210> 8 <211> 48 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Bluescript <400> 8 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 ¦ 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Leu Gln Ala Ser Arg Ala Ala Ala ffyr 20 25 30 Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His His His His His His 35 40 45 <210> 9 <211> 272 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> vector Bluescript <400> 9 aat tgt gag cgg ata ac att tac cgg ttc ttt taa ctt tag taa gga 48 gga att aaa aaa tga aaa agt ctt tag tcc tca aag cct ccg tag ccg 36 ttg cta ccc tcg ttc cga tgc taa gct tcg ctt cta gag cgg ccg ctt 144 ate cat acg acg tac cag act aag cag gag gtc ate acc ate ate acc 192 att aga gat ctg gag gcg gta ctg ttg aaa gtt gtt tag ca aa 236 g cta acá tac tgc gta ata agg agt ctt aag tcg ac 272 <210> 10 <211> 67 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <221> vector BlueScript <400> 10 Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu 1 5 10 15 Val pro Met Leu Ser Phe Ala Ser Arg Ala Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp 20 25 30 Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His Hls His His His His Arg Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Ala Asia lie Leu Arg Asn 50 55 60 Lys Glu Ser 65 <210> 11 <211> 281 <212> ADN <213> Secuencia Artifi <220> <223> vector Bluescript <400> 11 aat tgt gag cgg ata acá att tac cgg ttc ttt taa ctt tag taa gga gga att aaa aaa tga aat acc tat tgc cta cgg cag ccg ctg gat tgt tat tac tcg cgg ccc age cgg oca tgg cgg ccc tgc agg cct cta gag cgg ccg ctt ate cat acg acg tac cag act acg cag gag gtc ate acc ate ate acc att aga gat ctg gag gcg gta ctg ttg aaa gtt gtt tag caá a ag cta acá tac tgc gta ata agg agt ctt aag tcg ac <210> 12 <211> 70 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> vector Bluescript <400> 12 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Leu Gln Ala Ser Arg Ala Ala Ala Tyr 20 25 30 Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His His His His His His 35 40 45 Arg Ser Gly Gly Gly Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Ala Asn lie 50 55 60 Leu Arg- Asn Lys Glu Ser 65 70 <210> 13 <211> 501 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> CDS <222> (1) ... (501) <223> vector Bluescript <400> 13 atg aaa aag tct tta gtc ctc aaa gcc tcc gta gcc gtt gct acc ctc Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu 1 5 10 15 gtt ccg atg cta age ttc gct tct aga ggt gga gga ggt gag gag aag, 96 Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys 20 25 30 tcc cgg ctg ttg gag aag gag aac cgt ga ctg gaa aag ate att gct 144 Ser Arg Leu Leu Glu Lya Glu Asn Arg Glu Leu Glu Lys lie lie Ala 35 40 45 gag aaa gag gag cgt gtc tct gaa cbg cgc cat caa ctc cag tct gta 192 Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Val SO ' 55 SO -J9"a STÍJfc fcgt taa fcag ggc gcg cea caa tbt cae agt aag gag ghh taa 240 Gly Gly Cys * * Gly Ala Pro Gln Phe His Ser Lys Glu Val * 65 70 75 ctt atg aaa aaa tta tta ttc gca att ect tta gtt gtt ect ttc tat 288 Leu Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala lie Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr 80 85 90 tct cae tec gct acg cgt tct cga gga ggt ggt gga acá tec cgc ctg 336 Ser His Ser Ala Thr Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Thr Ser Arg Leu 95 100 105 93 9gc c cag tea gaa aac cat cgc ctg cga atg aag ate acá gag 384 Glu Gly Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met Lys lie Thr Glu 110 115 120 125 ctg gat aaa gac ttg gaa gag gtc acc atg cag ctg cag gac gtc gga 432 Leu Asp Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly 130 135 140 ggt tgc gcg gee gct tat cea tac gac gta cea gac tac gca gga ggt 480 Gly Cys Ala Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly 145 150 155 cat cae cat cat cae cat tag SOI His His His His His His * 160 <210> 14 <211> 163 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> vector Bluescript <400> 14 Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala íhr Leu 1 5 10 15 Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys 20 25 30 Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg Glu Leu Glu Lys lie lie Ala 35- 40.. 45 Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Val 50 55 60 Gly Gly Cys Gly Ala Pro Gln Phe His Ser Lys Glu Val Leu Met Lys 65 70 75 8O' Lys Leu Leu Phe Ala lie Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser His Ser 35 90 95 Ala Thr Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu 100 105 110 Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met Lys lie Thr Glu Leu Asp Lys 115 120 125 Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly Gly Cys Ala 130 135 140 Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His His His 145 150 155 160 His His His <210> 15 <211> 498 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> CDS <222> (1) ... (498) <223> vector Bluescript <400> 15 atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc gcg 48 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 gcc cag ccg gcc atg gcg tct aga ggt gga gga ggt gag gag aag tcc 96 Ala Gln Pro Ala Met Ala Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys Ser 20 25 30 cgg ctg ttg gag aag gag a c cgt gaa ctg gaa aag ate att gct gag 144 Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg Glu Leu Glu Lys lie lie Ala Glu 35 40 45 aaa gag gag cgt gtc tct gaa ctg cgc cat caá ctc cag tct gta gga 192 Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Val Gly 50 55 60 ggt tgt taa tag ggc gcg cea caá ttt cae agt aag gag gtt taa ctt 240 Gly Cys * * Gly Ala Pro Gln Phe His Ser Lys Glu Val * Leu 65 70 75 atg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat tct 288 Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala lie Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser 80 85 90 aac tcc gct acg cgt tct cga gga ggt ggt gga aca tcc cgc ctg gag 335 His Ser Ala Thr Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Thr Ser Arg Leu Glu 95 100 105 ggc cta cag tca gaa aac cat cgc ctg cga atg aag ate aca gag ctg 384 Gly Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met Lys lie Thr Glu Leu 110 115 120 125 gat aaa gac ttg gaa gag gtc acc atg cag ctg cag gac gtc gga ggt 432 Asp Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly Gly 130 135 140 tgc gcg gee gct tat cea tac gac gta cea gac tac gca gga ggt cat 480 Cys Ala Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His 145 150 155 498 cae cat cat cae cat tag His His His His His * 160 <210> 16 <211> 162 <212> PRT <213> Secuencia Artifici <220> <223> vector Bluescript <400> 16 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys Ser 20 25 30 Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg Glu Leu Glu Lys lie lie Ala Glu 35 40 45 Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Val Gly 50 55 60 Gly Cys Gly Ala Pro Gln Phe His Ser Lys Glu Val Leu Met Lys Lvs 65 70 75 80 Leu Leu Phe Ala lie Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser His Ser Ala 85 90 95 Thr Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gln 100 105 110 Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met Lys lie Thr Glu Leu Asp Lys Asp 115 120 125 Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Ásp Val Gly Gly Cys Ala Ala 130 135 140 Ala Tyr Pro Tyx Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His His His His 145 150 155 160 His His <210> 17 <211> 552 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> CDS <222> (1) ... (543) <223> vector Bluescript <400> 17 atg aaa aag tct tta gtc ctc aaa gcc tcc gta gcc gtt gct acc ctc Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val" Ala Thr Leu 1 5 10 15 gtt ccg atg cta age ttc gct tct aga ggt gga gga ggt gag gag aag Val- B o.- Met. Leu. Ser.Phe Ala Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys 20 25 30 tcc cgg ctg ttg gag aag gag aac cgt gaa ctg gaa aag ate att gct Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg Glu Leu Glu Lys lie lie Ala 35 40 45 gag aaa gag gag cgt gtc tct gaa ctg cgc cat caa ctc cag tct gta Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Val 50 55 * 60 gga ggt tgt taa tag ggc gcg cca caa ttt cac agt aag gag gtt taa 240 Gly Gly Cys * * Gly Ala Pro Gln Phe His Ser Lys Glu Val * 65 70 75 ctt atg aaa aaa tta tta ttc gaa att ect tta gtt gtt ect ttc tat 288 Leu Met Lys Lys Leu.Leu Phe Ala lie Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr 80 85 - 90 tct cac tcc gct acg cgt tct cga gga ggt ggt gga acá tcc cgc ctg 336 Ser His Ser Ala Thr Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Thr Ser Arg Leu 35 - 100 ' 105 3a<3 SJ9C cta cag tea gaa aac cat cgc ctg cga atg aag ate acá gag 384 Glu Gly Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met Lys lie Thr Glu 110 115 120 125 ctg gat aaa gac ttg gaa gag gtc acc atg cag ctg cag gac gtc gga 432 Leu Asp Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu Gln. Asp Val Gly 130 135 140 ggt tgc gcg gcc gct tat cea tac gac gta cea gac tac gca gga ggt 480 Gly Cys Ala Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly 145 150 155 cat cae cat cat cae cat tag gga ggc ggt act gtt gaa agt tgt ctg His His His His His His * Gly Gly Gly Thr Val Glu Ser- Cys Leu 160 165 170 cgt aat aag gag tct taagtcgac Arg Asn Lys Glu Ser 175 <210> 18 <211> 185 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> vector Bluescript <400> 18 Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu 1 5 10 15 Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys 20 25 30 Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg Glu Leu Glu Lys He He Ala 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu Arg His Gin Leu Gln Ser Val 50 55 60 Gly Gly Cys Gly Al-a. Pro Gln Phe His Ser Lys Glu Val .Leu Met Lys 65 70 75 80 Lys Leu Leu Phe Ala He Pro Le -Val Val Pro Phe Tyr Ser His Ser 85 90 35 Ala Thr Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu 100 105 110 Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met Lys He Thr Glu Leu Asp Lys 115 120 125 Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly Gly Cys Ala 130 135 · 140 Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His His His 145 150 155 160 His His His Arg Ser Gly Gly Gly Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys 1S5 170 175 Ala Asn He Leu Arg Asn Lys Glu Ser 180 185 <210> 19 <211> 549 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> CDS <222> (1) ... (540) <223> vector Bluescript <400> 19 atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc gcg 48 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 gcc cag ccg gcc atg gcg tct aga ggt gga gga ggt gag gag aag tcc 96 Ala Gln Pro Ala Met Ala Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys Ser 20 25 30 cgg ctg ttg gag aag gag aac cgt gaa ctg gaa aag ate att gct gag 144 Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg Glu Leu Glu Lys lie lie Ala Glu 35 40 45 aaa gag gag cgt gtc tct gaa ctg cgc cat caá ctc cag tct gta gga 192 Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Val Gly 50 55 60 Sjgt tgt taa tag gga gcg cea caá ttt cae agt aag gag gtt taa ctt 240 Gly Cys * * Gly Ala Pro Gln Phe His Ser Lys Glu Val * Leu 65 70 75 atg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat tct 288 Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala lie Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser 80 85 90 cae tcc gct acg cgt tct cga gga ggt ggt gga acá tcc cgc ctg gag 336 His Ser Ala Thr Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Thr Ser Arg Leu Glu 95 100 105 ggc cta cag tea gaa aac cat cgc ctg cga atg aag ate acá gag ctg 384 Gly Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met Lys lie Thr Glu Leu 110 115 120 125 gat aaa gac ttg gaa gag gtc acc atg cag ctg cag gac gtc gga ggt 432 Asp Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly Gly 130 135 140 tgc gcg gcc gct tat cea tac gac gta cea gac tac gca gga ggt cat 480 Cys Ala Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His 145 150 155 cae cat cat cae cat tag gga ggc ggt act gtt. gaa agt tgt ctg cgt 528 His His His His His * Gly Gly Gly Thr Val Glu Ser Cys Leu Arg 160 165 170 aat aag gag tet taagtcgac 54 Asn Lys Glu Ser , 175 <210> 20 <211> 184 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> vector Bluescript <400> 20 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys Ser 20 25 30 Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg Glu Leu Glu Lys lie lie Ala Glu 35 40 45 Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Val Gly 50 55 60 Gly Cys Gly Ala Pro Gln Phe His Ser Lys Glu Val Leu Met Lys Lys 65 70 75 80 Leu Leu Phe Ala lie Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser His Ser Ala 85 90 95 Thr Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gln 100 105 110 Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met Lys lie Thr Glu Leu Asp Lys Asp 115 120 125 Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly Gly Cys Ala Ala 130 135 140 Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His His His His 145 " 150 155 160 His His Arg Ser Gly Gly Gly Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Ala 165 170 175 Asn lie Leu Arg Asn Lys Glu Ser 180 <210> 21 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Primer o cebador <400> 21 ggaattgtga gcggataaca atttaccggt cacacaggaa acagctatga ccatg <210> 22 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Primer o cebador <400> 22 .catggtcata gctgtttcct gtgtgaccgg taaattgtta tccgctcaca attcc <210> 23 <211> 9 <212> ADN <213> Viral <400> 23 ttaacttta ' <210> 24 <211> 8 <212> ADN <213> Viral <400> 24 taaggagg <210> 25 <211> 68 <212> ADN <213> Viral <400> 25 atgaaaaagt ctttagtcct caaagcctcc gtagccgttg ctccctcgtt ccgatgct; gcttcgct <210> 26 <211> 66 <212> ADN <213> Viral <400> 26 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc at3gc <210> 27 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Fago <400> 27 tatccatacg acgtaccaga ctacgcagga ggtcatcacc atcatcacca ttag <210> 28 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Fago <400> 28 atgaaaaaat tattattcgc aattccttta gttgttcctt tctattctca ctccgct <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Bluescript <400> 29 Val Gly Gly Cys 1 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Bluescript <400> 30 Gly Gly Gly Gly 1

Claims (1)

165 R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Una unidad de unión al antigeno no monocatenaria que consta de: (a) un polipéptido de cadena ligera (L) que contiene una región variable de la cadena ligera (L) fusionada en marco a una primera secuencia de heterodimerización; (b) un polipéptido de cadena pesada (H) que contiene una región variable de la cadena pesada (H) fusionada en marco a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde los polipéptidos de la cadena L y la cadena H dimerizan por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de heterodimerización; y en donde al menos una de las secuencias de heterodimerización es prácticamente incapaz de formar un homodimero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas .y/o a las temperaturas corporales fisiológicas . 2. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 1, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización son prácticamente incapaces de formar homodimeros en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y a las temperaturas corporales fisiológicas . 3. Una unidad de unión al antigeno no monocatenaria 166 que consta de: (a) un polipéptido de cadena ligera (L) que comprende una región variable de la cadena ligera (L) fusionada en marco a la primera secuencia de heterodimerización; (b) un polipéptido de cadena pesada (H) que contiene una región variable de la cadena pesada (H) fusionada en marco a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde los polipéptidos de la cadena L y de la cadena H dimerizan por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de heterodimerización; la primera y segunda secuencias de heterodimerización comprendiendo secuencias receptoras heterodiméricas que median la heterodimerización de los receptores. 4. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización forman un dimero de hélice enrollada. 5. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 1 ó 3, caracterizada porque los polipéptidos de la cadena L y la cadena H se dimerizan por afinidad no covalente por el par de las dos secuencias de heterodimerización. 6. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria 167 de la reivindicación 4, caracterizada porque el polipéptido de cadena L además contiene un flexón que está flanqueado por la región variable de la cadena L y la primera secuencia de heterodimerización. 7. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 4, caracterizada porque el polipéptido de cadena H además contiene una secuencia flexón que está flanqueada por la región variable de la cadena H y la segunda secuencia de heterodimerización. 8. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 4, caracterizada porque la primera y la segunda secuencias de heterodimerización se ligan a al menos un residuo de cisterna. 9. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 4, caracterizada porque la unidad de unión al antigeno es multivalente . 10. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 4, caracterizada porque la unidad de unión al antigeno es multiespecifica. 11. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 10, caracterizada porque la unidad de unión al antigeno es biespecifica . 12. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 10, caracterizada porque la unidad de unión al antigeno es triespecifica . 168 13. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria. de la reivindicación 4, caracterizada porque el polipéptido de la cadena L consta de secuencias procedentes de una cadena ligera humana. 14. La unidad de unión al antigeno.no monocatenaria de la reivindicación 4, caracterizada porque el polipéptido de la cadena H consta de secuencias procedentes de una cadena pesada humana. 15. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 4, caracterizada porque la unidad de unión al antigeno se conjuga a una porción con funcionalidad química . 16. La unidad de unión al antígeno no monocatenaria de la reivindicación 15, caracterizada porque la porción se. selecciona del grupo que consiste en péptidos señal, agentes que potencian la reactividad inmunológica, agentes que facilitan el acoplamiento a un soporte sólido, portadores de vacunas, modificadores de la bio-respuesta, toxinas, etiquetas detectables, etiquetas paramagnéticas y fármacos. 17. La unidad de unión al antígeno no monocatenaria de la reivindicación 4, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización proceden de las secuencias C terminales del receptor GABAB 1 y GABAB 2, respectivamente. 18. La unidad de unión al antígeno no 169 monocatenaria de la reivindicación 4, caracterizada porque la primera secuencia de heterodimerizacion es una secuencia de heterodimerizacion que contiene un polipéptido del receptor GABAB 1 de al menos 30 residuos de aminoácidos que es prácticamente idéntica a una secuencia peptidica lineal de longitud comparable, como se representa en la SEQ ID NO: 2, y en donde la segunda secuencia de heterodimerizacion es una secuencia de heterodimerizacion que contiene un polipéptido del receptor GABAB 2 de al menos 30 residuos de aminoácidos que es prácticamente idéntica a una secuencia peptidica lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO: 4, en donde la primera y segunda secuencias de heterodimerizacion se ligan a residuos de cisterna. 19. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 4, en donde la primera secuencia de heterodimerizacion es una secuencia de heterodimerizacion que contiene un polipéptido del receptor GABAB 1 de al menos 30 residuos de aminoácidos que es prácticamente idéntica a una secuencia peptidica lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO: 4, y en donde la segunda secuencia de heterodimerizacion es una secuencia de heterodimerizacion que contiene un polipéptido del receptor GABAB 2 de al menos 30 residuos de aminoácidos, que es prácticamente idéntica a una secuencia peptidica lineal de longitud comparable representada en la 170 SEQ ID NO: 2, en donde la primera y segunda secuencias de heterodimerizacion se ligan a residuos de cisterna. 20. Una unidad de unión al antigeno monocatenaria que contiene una región variable de cadena ligera (L) y una región variable de cadena pesada (H) conectadas por una primera y una segunda secuencias de heterodimerizacion que abarca la distancia entre el C terminal de una región al N terminal de la otra región, en donde las dos regiones forman un dimero intramolecular por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de heterodimerización; y en donde al menos una de las secuencias de heterodimerización es prácticamente incapaz de formar un homodímero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas. 21. La unidad de unión al antigeno monocatenaria de la reivindicación 20, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización son prácticamente incapaces de formar homodimeros en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y a las temperaturas corporales fisiológicas. 22. Una unidad de unión al antigeno monocatenaria que contiene uña' región variable de cadena ligera (L) y una región variable de cadena pesada (H) conectadas por una primera y una segunda secuencias de heterodimerización que abarca la distancia entre el C terminal de una región hasta 171 el N terminal de la otra región, en donde las dos regiones forman un dimero intramolecular por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de heterodimerización, la primera y segunda secuencias de heterodimerización contienen las secuencias receptores heterodiméricas que median la heterodimerización de los receptores. 23. La unidad de unión al antigeno monocatenaria de la reivindicación 20 ó 22, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización forman un dimero de hélice enrollada. 24. La unidad de unión al antigeno monocatenaria de la reivindicación 20 ó 22, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización se dimerizan por afinidad no covalente por el par. 25. La unidad de unión al antigeno monocatenaria de la reivindicación 23, caracterizada porque la unidad de unión al antigeno se conjuga a una porción con funcionalidad química . 26. La unidad de unión al antígeno monocatenaria de la reivindicación 23, caracterizada porque la región variable de la cadena L contiene secuencias procedentes de una cadena ligera humana. 27. La unidad de unión al antígeno monocatenaria de la reivindicación 23, caracterizada porque la región variable de la cadena H contiene secuencias procedentes de una cadena 172 pesada humana. 28. La unidad de unión al antigeno monocatenaria de la reivindicación 23, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización proceden de las secuencias C terminales del receptor GABAB 1 y del receptor GABAB 2, respectivamente. 29. La unidad de unión al antigeno monocatenaria de la reivindicación 23, caracterizada porque la primera secuencia de heterodimerización es una secuencia de heterodimerización que contiene un polipéptido del receptor GABAB 1 de al menos 30 residuos de aminoácidos que es prácticamente idéntica a una secuencia peptidico lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO: 2; y en donde la segunda secuencia de heterodimerización es una secuencia de heterodimerización que contiene un polipéptido del receptor GABAB 2 de al menos 30 residuos de aminoácidos, que es prácticamente idéntica a una secuencia peptidica lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO: 4, en donde la primera y segunda secuencias de heterodimerización se ligan a residuos de cisterna. 30. La unidad de unión al antigeno monocatenaria de la reivindicación 23, caracterizada porque la primera secuencia de heterodimerización es una secuencia de heterodimerización que contiene un polipéptido del receptor GABAB 1 de al menos 30 residuos de aminoácidos que 173 es prácticamente idéntica a una secuencia peptid'ica lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO: 4; y en donde la segunda secuencia de heterodimerización es una secuencia de heterodimerización que contiene un polipéptido del receptor GABAB 2 de al menos 30 residuos de aminoácidos, que es prácticamente idénrica a una secuencia peptidica lineal de longitud comparable representada en la SEQ ID NO: 2, en donde la primera y segunda secuencias de heterodimerización se ligan a residuos de cisterna. 31. Un polinucleótido recombinante que contiene una secuencia codificante que codifica el polipéptido de la cadena L de la reivindicación 1. 32. Un polinucleótido recombinante que contiene una secuencia codificante que codifica el polipéptido de la cadena H de la reivindicación 1. 33. Un polinucleótido recombinante que contiene una primera secuencia codificante que codifica el polipéptido de cadena L de la reivindicación 1, y una segunda secuencia codificante que codifica la cadena H del polipéptido de la reivindicación 1. 3 . Un polinucleótido recombinante que contiene una secuencia codificante que codifica el polipéptido de cadena L de la reivindicación 3 35. Un polinucleótido recombinante que contiene una secuencia codificante que codifica el polipéptido de cadena H 174 de la reivindicación 3. 36. Un polinucleótido recombinante que contiene una primera secuencia codificante que codifica el polipéptido de la cadena L de la reivindicación 3, y una segunda secuencia codificante que codifica la cadena H del polipéptido de la reivindicación 3. 37. Un polinucleótido recombinante que contiene una secuencia codificante que codifica la unidad de unión al antigeno monocatenaria de la reivindicación 20. 38. Un polinucleótido recombinante que contiene una secuencia codificante que codifica la unidad de' unión al antigeno monocatenaria de la reivindicación 22. 39. Un vector que contiene el polinucleótido recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 31-38. 40. El vector de la reivindicación 39, en donde el vector es un vector de expresión. 41. El vector de la reivindicación 39, caracterizado porque el vector es un vector presentador fago. 42. Una biblioteca seleccionable de vectores de expresión que codifican un repertorio de unidades de unión al antigeno, que contiene más de un vector de la reivindicación 39. 43. La biblioteca seleccionable de la reivindicación 39, en donde el vector es un vector presentador fago. 175 44. Una célula hospedera que contiene un polinucleótido recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 31-38. 45. La célula hospedera de la reivindicación 44, caracterizada porque el polinucleótido recombinante que codifica el polipéptido de la cadena L y el polinucleótido que codifica el polipéptido de cadena H, están presentes en un solo vector. 46. La célula hospedera de la reivindicación 44, caracterizada porque el polinucleótido recombinante que codifica el polipéptido de cadena L y el polinucleótido que codifica el polipéptido de cadena H están presentes en vectores separados. 47. La célula hospedera de la reivindicación 44, caracterizada porque la célula hospedera es una célula eucariótica . 48. La célula hospedera de la reivindicación 44, caracterizada porque la célula hospedera es una célula procariótica . 49. ün método para producir una unidad de unión al antigeno no monocatenaria, que consiste en: (a) expresar en una célula hospedera un primer polinucleótido recombinante que codifique un polipéptido de cadena ligera (L) que contenga una región variable de cadena ligera (L) fusionado en marco a una primera 176 secuencia de heterodimerización , y un segundo polinucleótido recombinante que codifique un polipéptido de cadena pesada (H) que contenga una región variable de cadena pesada (H) fusionada en marco a una segunda secuencia de heterodimerización ; en donde los polipéptidos de la cadena L y de la cadena H dimerizan por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de heterodimerización; y en donde al menos una de las secuencias de heterodimerización es prácticamente incapaz de formar un homodimero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas; y, como una opción (b) aislar la unidad de unión al antigeno expresada en la célula hospedera. 50. El método de la reivindicación 49, caracterizado porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización son prácticamente incapaces de formar homodimeros en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y a las temperaturas corporales fisiológicas. 51. Un método para producir una unidad de unión al antigeno no monocatenaria, que consiste en: (a) expresar en una célula hospedera un primer polinucleótido recombinante que codifique un polipéptido de cadena ligera (L) que contenga una región variable de cadena ligera (L) fusionado a una primera secuencia de 177 heterodimerización, y un segundo polinucleótido recombinante que codifique un polipéptido de cadena pesada (H) que contenga una región variable de cadena pesada (H) fusionada a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde los polipéptidos de la cadena L y de la cadena H se dimerizan por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de heterodimerización, la primera y segunda secuencias de heterodimerización contienen secuencias receptoras heterodiméricas que median la heterodimerización de los receptores; y, como una opción (b) aislar la unidad de unión al antigeno expresada en la célula hospedera. 52. El método de la reivindicación 49 ó 51, caracterizado porque la unidad de unión al antigeno no monocatenaria expresada en el paso (a) se presenta sobre la superficie de la célula hospedera. 53. El método de la reivindicación 49 ó 51, en donde la unidad de unión al antigeno no monocatenaria expresada en el paso (a) se presenta sobre una partícula de fago. 54. El método de la reivindicación 49 ó 51, caracterizado porque la célula hospedera es una célula eucariótica . 55. El método de la reivindicación 49 ó 51, caracterizado porque la célula hospedera es una célula 178 procariótica . 56. El método de la reivindicación 49 ó 51, caracterizado porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización forman un dímero de hélice enrollada. ' 5?. El método de la reivindicación 49 ó 51, caracterizado porque los polipéptidos de cadena L y de la cadena H se dimerizan por afinidad no covalente por el par. 58. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque el polipéptido de cadena L además contiene un flexón que es flanqueado por la región variable de cadena L y la primera secuencia de heterodimerización. 59. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque el polipéptido de cadena H además contiene una secuencia flexón que es flanqueada por la región variable de cadena H y la segunda secuencia de heterodimerización. 60. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización se ligan a al menos un residuo de cisterna . 61. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque la unidad de unión al antigeno no monocatenaria es multivalente . 62. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque la unidad de unión al antigeno no 179 monocatenaria es multiespecifica . 63. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque la unidad de unión, al antigeno no monocatenaria es biespecifica, 64. El método de la reivindicación -56, caracterizado porque la unidad de unión al antigeno no monocatenaria es triespecifica . 65. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque el polipéptido de cadena L contiene secuencias procedentes de una cadena ligera humana. 66. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque el polipéptido de cadena H contiene secuencias procedentes de una cadena pesada humana. 67. Un método para producir una unidad de unión al antigeno no monocatenaria, que consiste en: (a) preparar un primer polinucleótido recombinante que codifique un polipéptido de cadena ligera (L) que contenga una región variable de cadena ligera (L) fusionada en marco a una primera secuencia de heterodimerización, y un segundo polinucleótido recombinante que codifique un polipéptido de cadena pesada (H) que contenga una región variable de cadena pesada (H) fusionada en marco a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde los polipéptidos de cadena L y de cadena H se dimerizan por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de 180 heterodimerización; y en donde al menos una de las secuencias de heterodimerización es prácticamente incapaz de formar un homodimero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas; y (b) permitir que el primero y segundo polipéptidos se dimericen por afinidad por el par de la primera y segunda secuencias de heterodimerización. 68. El método de la reivindicación 67, en donde el paso (b) comprende la dimerización del primero y segundo polipéptidos in vitro. 69. Un método para producir una unidad de unión al antigeno monocatenaria, que consiste en: (a) expresar en una célula hospedera un polinucleótido que contenga una secuencia codificante que codifique la unidad de unión al antigeno monocatenaria de la reivindicación 20 ó 22; y, como una opción (b) ¦ aislar la unidad de unión al antigeno monocatenaria expresada en la célula hospedera. 70. El método de la reivindicación 69, caracterizado porque el polinucleótido está contenido en un vector presentador fago. 71. Un método para presentar un heteromultimero quimérico que contiene al menos dos polipéptidos sobre una superficie de una célula hospedera, el método consiste en: expresar en la célula hospedera: 181 (a) un primer polinucleótido recombinante que codifique un- primer polipéptido fusionado en marco a una primera secuencia de heterodimerización y una secuencia presentadora superficial; (b) un segundo polinucleótido recombinante que codifica un segundo polipéptido fusionado en marco a una segunda secuencia de heterodimerización; en donde el primero y segundo polipéptidos se dimerizan por afinidad por el par de la primera y segunda s cuenci s de heterodimerización; en donde al menos una de las secuencias de heterodimerización es prácticamente incapaz de formar un homodímero en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y/o a las temperaturas corporales fisiológicas. 72. El método de la reivindicación 71, caracterizado ¦ porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización son prácticamente incapaces de formar homodimeros en las condiciones amortiguadoras fisiológicas y a las temperaturas corporales fisiológicas. 73. El método de la reivindicación 71, caracterizado porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización forman un dimero de hélice enrollada. 74. El método de la reivindicación 71,, caracterizado porque el primero y segundo polinucleótidos se expresan por ün solo vector presentador, fago. 75. El método de la rei indicación 71, 182 caracterizado porque el primero y segundo polinucleótidos se expresan en vectores presentadores 'fagos separados. 76. El método de la reivindicación 71, ¦ · caracterizado porque la célula hospedera es uña célula procariótica . 77. El método de la reivindicación 71, caracterizado porque la célula hospedera es una célula eucariótica . 78. El método de la reivindicación 71, caracterizado porque el heteromultímero quimérico es una unidad de unión al antigeno no monocatenaria . 79. Un heteromultímero quimérico presentado sobre la superficie de la célula hospedera de conformidad con el método 71. 80. Un método para identificar una unidad de unión al antígeno no monocatenaria que es inmuno-reactiva con un antígeno deseado, el cual consiste en: (a) preparar un repertorio con diversidad genética de unidades de unión al antígeno, en donde el repertorio contiene más de una unidad de unión al antígeno de la reivindicación 1 ó 3; (b) poner en contacto el repertorio de unidades de unión al antígeno con el antígeno deseado; (c) detectar una unión específica entre las unidades de unión al antigeno y el antígeno, 183 identificar por este medio la unidad de unión al antigeno que sea inmuno-reactiva con el antigeno deseado. 81. El método de la reivindicación 80, caracterizado porque el repertorio de unidades de unión al antigeno se prepara expresando una biblioteca de vectores que codifique una pluralidad de las unidades de unión al antigeno . 82. El método de la reivindicación 80, caracterizado porque la biblioteca de vectores contiene una pluralidad de vectores fago. 83. Un método para identificar una unidad de unión al antigeno monocatenaria inmuno-reactiva con un antigeno deseado, consiste en: (a) preparar un repertorio con diversidad genética de las unidades de unión al antigeno monocatenarias, en donde el repertorio contenga al menos una unidad de unión al antigeno de la reivindicación 20 ó 22; (b) poner en contacto el repertorio de unidades de unión al antigeno con el antigeno deseado; detectar una unión especifica entre las unidades de unión al antigeno y el antigeno, identificar por este medio la unidad de unión al antigeno monocatenaria que sea inmuno-reactiva con el antigeno deseado. 84. El método de la reivindicación 83, 184 caracterizado porque el repertorio de unidades de unión al antigeno se preparan expresando una biblioteca de vectores que codifique una pluralidad de las unidades de unión al antigeno . 85. El método de la reivindicación 83, caracterizado porque la biblioteca de vectores contiene una pluralidad de vectores fagos. 86. Un equipo que contiene un vector de la reivindicación 39 en envases convenientes. 87. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 1 ó 3, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización contienen secuencias receptoras heterodiméricas de los receptores del factor de crecimiento . 88. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 1 ó 3, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización contienen secuencias receptoras heterodiméricas de los receptores acoplados a la proteina G. 89. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 1 ó 3, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización contienen secuencias receptoras heterodiméricas de los neurotransmisores . 90. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 1 ó 3, caracterizada porque la primera y 185 segunda secuencias de heterodimerización contienen secuencias receptoras heterodiméricas de receptores de hormonas nucleares . 91. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 1 ó 3, caracterizada porque la unidad de unión al antigeno es un fragmento ccFV. 92. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 1, caracterizada porque las temperaturas corporales fisiológicas son alrededor de 37 °C. 93. La unidad de unión al antigeno no monocatenaria de la reivindicación 1, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de heterodimerización son prácticamente incapaces de formar homodímero.s cuando se mezclan en cantidades equimolares.