FI120349B - Menetelmä fuusiopolypeptidin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä fuusiopolypeptidin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI120349B FI120349B FI20075159A FI20075159A FI120349B FI 120349 B FI120349 B FI 120349B FI 20075159 A FI20075159 A FI 20075159A FI 20075159 A FI20075159 A FI 20075159A FI 120349 B FI120349 B FI 120349B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antigen
- particles
- binding
- amino acid
- epitopes
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 71
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 54
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 56
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 56
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 56
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 47
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 2
- YTAHJIFKAKIKAV-XNMGPUDCSA-N [(1R)-3-morpholin-4-yl-1-phenylpropyl] N-[(3S)-2-oxo-5-phenyl-1,3-dihydro-1,4-benzodiazepin-3-yl]carbamate Chemical compound O=C1[C@H](N=C(C2=C(N1)C=CC=C2)C1=CC=CC=C1)NC(O[C@H](CCN1CCOCC1)C1=CC=CC=C1)=O YTAHJIFKAKIKAV-XNMGPUDCSA-N 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 16
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 16
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 16
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000003314 affinity selection Methods 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010027044 HIV Core Protein p24 Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009146 cooperative binding Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1054—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV gag-pol, e.g. p17, p24
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
- G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
- G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
- G01N2333/161—HIV-1, HIV-2 gag-pol, e.g. p55, p24/25, p17/18, p.7, p6, p66/68, p51/52, p31/34, p32, p40
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Ecology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Menetelmä fuusiopolypeptidin valmistamiseksi Förfarande för producering av en fusionspolypeptid
5 KEKSINNÖN ALA
Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän, jolla voidaan valmistaa fuusiopolypeptidi sellaisten erittäin muuntelevien proteiinien luotettavaan diagnostiseen osoittamiseen, joilta puuttuvat vasta-ainetta sitovat säilyneet epitoopit. Tämä saadaan 10 aikaan samassa kohdeproteiinissa olevien itsenäisten mutta kytkettyjen rakennedeterminanttien tunnistamisen välityksellä käyttämällä kahdesta tai useammasta sitoutumisyksiköstä muodostuvia polypeptidejä. Tällä lähestymistavalla kohteeksi otetut rakennedeterminantit koostuvat lyhyistä (3-5 tähdettä) säilyneistä aminohapposekvensseistä näissä muuten muuntelevissa proteiineissa. Näitä tri-, tetra- ja 15 pentapeptidejä voidaan tehokkaasti ottaa kohteiksi käyttämällä biomuokattuja, korkean affiniteetin omaavia sitoutumispolypeptidejä (BHAP), mutta koska tällaisia lyhyitä sekvenssejä voi esiintyä kiinnostavien näytteiden, esim. seeruminäytteiden, monissa muissa proteiineissa, tämän sitoutumisen diagnostinen arvo on rajoittunut. Multiepitooppeja sitovien fuusiopolypeptidien (MEBIP), jotka koostuvat kahdesta tai 20 useammasta BHAP:stä, jotka sitoutuvat multippeleihin säilyneisiin tri-, tetra- tai pentapeptideihin, kooperatiivista sitoutumista voidaan kuitenkin käyttää tämän ongelman ohittamiseen, ja ylivoimaisella affiniteetilla varmistetaan spesifinen kohdentuminen kiinnostavaan proteiiniin, mikä mahdollistaa mainitun proteiinin diagnostisen osoittamisen. Rekombinanttivasta-ainefragmentti on yksi esimerkki useista 25 sitoutumisproteiinityypeistä, jotka voisivat edustaa yhtä tai kaikkia MEBIP:ssä olevia BHAP-alayksiköitä. Tästä johtuen tämä keksintö mahdollistaa uusia keinoja korkeita mutaatiokapasiteetteja omaavien virusten, kuten HIV:n, koodaamien proteiinien luotettavaan ja kvantitatiiviseen osoittamiseen.
30 2
KEKSINNÖN TAUSTA
Schupbach et ai. (Journal of Medical Virology, 2001, 65:225 - 232) tuovat esille, että lämpödenaturoitua, monistumisella tehostettua p24-antigeenia voidaan käyttää 5 vaihtoehtona HIV-RNA:n testaukselle HIV-infektion hoidon seuraamiseksi. Myös
Respess et ai. [Journal of Clinical Microbiology, 2005, 43(1):506 - 508] ja Knuchel et ai. (Journal of Clinical Virology, 2006, 36:64 - 67) tuovat esille ultraherkkiä p24-antigeenimäärityksiä vaihtoehtona HIV-RNA:n testaukselle.
10 Boder et ai. [PNAS, 2000, 97(20):10 701 - 10 705] tuovat esille monovalenttia femtomolaarista, antigeeniä sitovaa affiniteettia omaavien vasta-ainefragmenttien suunnatun evoluution. Holliger ja Hudson [Nature Biotechnology, 2005, 23(9):1 126 -1 136] esittävät katsauksen muokatuista vasta-ainefragmenteista. Nygren ja Uhlen (Current Opinion in Structural Biology, 1997, 7:463 - 469) ja Hosse et ai. (Protein 15 Science, 2006, 15:14 - 27) esittävät katsauksen proteiinirakenteita esittelevän proteiinirungon muokkauksesta molekulaarista tunnistusta varten.
Bin/ et ai. [Nature Biotechnology, 2005, 23(10):1 257 - 1 268] ja Hey et ai. [Trends in Biotechnology, 2005, 23(10):514 - 422] esittävät katsauksen ei-immunoglobuliini-20 domeeneista peräisin olevien uusien sitoutumisproteiinien muokkauksesta.
Kirjallisuudessa tunnetaan hyvin kaksispesifisiä rekombinanttivasta-ainemolekyylejä, jotka voivat tunnistaa ja saattaa yhteen kaksi erilaista ligandia (katso esim. Albrecht et ai., J Immunol Meth 310: 100-16, 2006). On kuvattu myös kaksispesifisiä 25 rekombinanttivasta-aineita, jotka sitoutuvat kahteen erilaiseen epitooppiin samassa proteiinissa (katso esim. Neri et ai., J Mol Biol 246: 367-73, 1995; Zhou, J Mol Biol 329: 1-8, 2003). Yhdistelmäsitoutuminen johti sitoutumisaffiniteetin merkittävään lisääntymiseen verrattuna kummankin kahden rekombinanttivasta-aineen sitoutumiseen yksinään. Samalla kun MEBIP:eillä voi olla samankaltaisuutta kaksispesifisten 30 rekombinanttivasta-aineiden konstruktion kanssa, on tärkeää ymmärtää, että esillä oleva 3 innovaatio on uusija liittymätön kaksispesifisten rekombinanttivasta-aineiden kuvattuun rakenteeseen ja käyttöön.
Useamman kuin yhden kovalenttisesti liitetyn BHAP:n (joko rekombinanttivasta-aineen 5 tai muun tyyppisen molekyylin) kooperatiivisen sitoutumisen mukanaan tuoma lisääntynyt affiniteetti, vaikkakin hyödyllistä ei ole syy kiinnostavan proteiinin multippelien alueiden käyttöön kohteina. Sen sijaan tämän innovaation avainidea on yhdistää muuntelevassa proteiinissa hajallaan olevia lyhyitä säilyneitä peptidejä "virtuaaliepitoopiksi", joka saa aikaan osoituksessa riittävän kompleksisuuden 10 diagnostista spesifisyyttä varten. Tällaisen rakenteellisen kompleksisuuden aikaansaamiseksi lineaarisen peptidiepitoopin pitäisi koostua vähintään kuudesta tähteestä. Silmäys saatavissa oleviin sekvenssitietokantoihin kuitenkin osoittaa, että hyvin säilyneitä jatkuvia kuuden tähteen aminohappo-osuuksia on vaikea löytää monista erittäin muuntelevista mikrobiproteiineista, erityisesti RNA-virusten proteiineista. Esimerkiksi 15 HIV-1 :n p24-proteiini ei sisällä yhtäkään heksapeptidiä (6-meeri), joka olisi säilynyt useammassa kuin 99 %:ssa tunnetuista HIV-1-sekvensseistä, mikä tekee sen luotettavasta immunologisesta osoittamisesta ongelmallista. Kuten alla on käsitelty, säilyneiden tri-, tetra- tai pentapeptidien yhdistelmien yhdessä toimiva osoittaminen MEBIP-lähestymistapaa käyttämällä voi auttaa ratkaisemaan tämän ongelman. Niinpä tämä uusi 20 lähestymistapa sallii siten parempien keinojen kehittämisen erittäin muuntelevien mikrobiproteiinien, kuten HIV-1 :n p24:n, diagnostiseen osoittamiseen.
PIIRUSTUSTEN LYHYT KUVAUS
25 Kuvio 1. Tyypillisen HIV-l-kannan p24-proteiinin aminohapposekvenssi (SEQ ID NO:l). Kuvio esittää p24:n tähteiden suhteellista säilyncisyyttä HIV-1 :n vallitsevan M-tyypin kladien A - K ja erilaisten kiertävien rekombinanttivirusten sekä O- ja N-tyypin virusten ja simpanssien läheisten SIV-virusten joukossa. Pistemäärä 1 tarkoittaa yli 99,75 %:n säilyncisyyttä, pistemäärä 2 tarkoittaa > 99,50 %:n säilyneisyyttä, pistemäärä 3 30 tarkoittaa > 99,00 %:n säilyneisyyttä, pistemäärä 4 tarkoittaa > 98,00 %:n säilyneisyyttä, pistemäärä 5 tarkoittaa > 97,00 %:n säilyncisyyttä (pistemäärä esitetään kunkin tähteen 4 yläpuolella). Tähteitä, jotka ovat vähemmän kuin 97 %:isesti säilyneitä, ei ole pisteytetty. Yhtäjaksoiset peptidiosuudet, joiden kokonaissäilyncisyys on > 99,00 %, on alleviivattu ja merkitty lihavoituna.
5 KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN SELITYS
Joillekin tässä julkaisussa käytetyille termeille annetaan seuraavat määritelmät.
"Vasta-ainetta" eri kieliopillisissa muodoissaan käytetään tässä kollektiivisena 10 substantiivina, joka viittaa immunoglobuliinimolekyylien populaatioon ja/tai immunoglobuliinimolekyylien immunologisesti aktiivisiin osiin eli molekyyleihin, jotka sisältävät antigeeniä sitovan kohdan tai paratoopin.
"Epitooppi" on makromolekyylin, kuten polypeptidien osa, jonka immuunijärjestelmä, 15 tarkasti sanoen vasta-aineet, B-solut tai sytotoksiset T-solut tunnistavat. Useimmat vasta-aineiden tunnistamat epitoopit voidaan ajatella antigeenimolekyylin kolmiulotteisina pinnan yksityiskohtina. Nämä yksityiskohdat sopivat täsmällisesti vasta-aineisiin ja sitoutuvat siten niihin. Nämä pinnat voivat olla riippuvaisia tertiäärisestä proteiinirakenteesta siten, että tähteet, jotka muodostavat epitoopin, ovat sijoittuneet 20 proteiinin aminohapposekvenssissä erilleen toisistaan (konformationaaliset epitoopit) tai ne voivat olla proteiinissa olevien yhtäjaksoisten peptidialueiden muodostamia (lineaariset epitoopit). Siten jos proteiini denaturoidaan, kuten on usein asianlaita vasta-aineiden diagnostisessa käytössä, osoittamiseen voidaan käyttää vain lineaarisia epitooppeja. Vasta-aineen tunnistaman lineaarisen epitoopin muodostavien peräkkäisten 25 aminohappotähteiden lukumäärä vaihtelee mutta on tyypillisesti kuudesta kymmeneen (6 - 10). Luonnolliset vasta-aineet voivat kuitenkin tunnistaa lyhyempiä epitooppeja merkittävillä affiniteeteilla, ja rekombinanttivasta-aineita voidaan kohdentaa sitoutumaan jopa yhteen ainoaan aminohappotähteeseen.
30 "Antigeeniä sitova kohta", "paratooppi" on vasta-ainemolekyylin rakenneosa, joka sitoo spesifisesti antigeeniä.
5 "Yksiketjuista vasta-ainetta" (scFv) käytetään sellaisen molekyylin määrittelemiseksi, jossa vasta-aineen raskaan ja kevyen ketjun vaihtelevat domeenit ovat liittyneet yhteen linkkeripeptidin välityksellä yhdestä ainoasta mRNA-molekyylistä syntetisoidun 5 yhtäjaksoisen aminohappoketjun (transkriptin) muodostamiseksi.
"Immunomääritys" on biokemiallinen testi, joka mittaa aineen tasoa biologisessa nesteessä, tyypillisesti seerumissa, plasmassa, virtsassa tai muissa kehon juoksevissa aineissa käyttämällä vasta-aineen tai vasta-aineiden reaktiota antigeeninsä suhteen.
10 Määrityksessä käytetään vasta-aineen spesifistä sitoutumista antigeeniinsä. Usein käytetään monoklonaalisia vasta-aineita, koska ne sitoutuvat tavallisesti osoitettavan molekyylin yhteen ainoaan kohtaan ja tarjoavat siten spesifisemmän ja täsmällisemmän testauksen, jota näytteen muut molekyylit eivät häiritse. Käytetyillä vasta-aineilla täytyy olla korkea affiniteetti antigeenin suhteen. Antigeenin läsnäolo voidaan mitata 15 esimerkiksi infektiivisten sairauksien diagnoosissa osoittamalla mikrobispesifisiä molekyylirakenteita. Antigeenin määrän osoittaminen voidaan saada aikaan monilla eri menetelmillä. Eräs tavallisimmista käytetyistä tekniikoista on leimata antigeeni tai vasta-aine. Leima voi koostua entsyymistä (entsyymi-immunomääritys, EIA), fluoresenssista (FIA), luminesenssista (LIA), tai ne voivat perustua agglutinaatioon, nefelometriaan, 20 turbidimetriaan tai immunoblottaukseen (Western blot).
Immunomääritykset voivat olla joko kilpailevia tai ei-kilpailevia ja ne voivat olla homogeenisia tai heterogeenisiä. Kilpailevassa määrityksessä näytteessä oleva antigeeni kilpailee leimatun antigeenin kanssa vasta-aineen kanssa sitoutumisesta. Sitten mitataan 25 vasta-ainekohtaan sitoutuneen leimatun antigeenin määrä. Vaste on käänteisesti verrannollinen näytteessä olevan antigeenin konsentraatioon, koska mitä suurempi vaste, sitä vähemmän näytteessä on antigeeniä saatavana leimatun antigeenin kanssa kilpailemiseksi.
30 Ei-kilpailevissa immunomäärityksissä, joita kutsutaan usein "voileipämääritykseksi", näytteessä oleva antigeeni sitoutuu "sieppausvasta-aineeseen” ja leimatun vasta-aineen 6 määrä sitoutumiskohdassa mitataan. Toisin kuin kilpailevan määrityksen tapauksessa tulos on suoraan verrannollinen antigeenin konsentraatioon.
Heterogeeninen immunomääritys vaatii ylimääräisen vaiheen sitoutumattoman vasta-5 aineen tai antigeenin poistamiseksi sitoutumiskohdasta tavallisesti kiinteän faasin materiaalia käyttämällä. Homogeeniset määritykset eivät vaadi erotusvaihetta sitoutumattoman vasta-aineen tai antigeenimolekyylien poistamiseksi. Immunomäärityksillä on erityisen tärkeä rooli HIV:n diagnoosissa.
10 Lyhenne "MEBIP" viittaa "multiepitooppiin sitoutuviin fuusiopolypeptideihin", jotka ovat geneettisesti muokattuja proteiinikonstrukteja, jotka käsittävät kaksi tai useampia itsenäisiä sitoutumisyksiköitä, jotka sitoutuvat eri kohtiin yhteisessä kohdeproteiinissa. Yksi tai useampi MEBIP:ssä olevista sitoutumisyksiköistä voi olla scFv.
15 "Virtuaaliepitooppi" on rakenne, joka on tyypillisesti kahden kolmesta viiteen aminohappotähdettä sisältävän osuuden muodostama, joilla osuuksilla on taipumus olla muuttumattomia jopa muuten erittäin muuntelevissa proteiineissa, kuten monissa virusproteiineissa, ja ne voivat toimia ligandina MEBIP:lle. "Virtuaaliepitooppi" voi mennä päällekkäin antigeenisen epitoopin kanssa, mutta perinteinen vasta-aine ei ehkä 20 kohdennu siihen.
Tässä käytettynä termi "spesifisesti sitova" tai "spesifisesti tunnistava" tai ilmaus "omata sitomisspesifisyyttä epitoopin suhteen" viittaa matalaan taustaan ja korkean affiniteetin sitoutumiseen MEBIP:n tai sen fragmentin tai johdannaisen ja sen kohdemolekyylin 25 välillä (eli epäspesifisen sitoutumisen puutteeseen). Toisin sanoen, termit (ja ekvivalentit ilmaisut) viittaavat sitovan osan (esim. reseptorin, vasta-aineen, ligandin tai antiligandin) kykyyn sitoutua valikoivasti tiettyyn kohdemolekyyliin (esim. ligandiin tai antigeeniin) proteiinien ja muiden biologisten aineiden heterogeenisen populaation läsnä ollessa (eli ilman merkittävää sitoutumista tcstinäyttccssä läsnä oleviin muihin komponentteihin).
30 Tyypillisesti spesifinen sitoutuminen kahden kokonaisuuden, kuten ligandin ja reseptorin välillä, tarkoittaa sitoutumisaffiniteettia, joka on vähintään noin 106 M'1 ja edullisesti 7 vähintään noin ΙΟ7, ΙΟ8, 109 tai lO10 M"1, edullisemmin vähintään noin ΙΟ11, ΙΟ12, 1013, 1014 tai 1015 M'1.
Termit "spesifisyys" tai "korkea spesifisyys" voivat viitata myös sitoutumispolypeptidin, 5 kuten MEBIP:n kykyyn sitoutua 95 %:iin, 95,5 %:iin, 96 %:iin, 96,5 %:iin, 97 %:iin, 97,5 %:iin, 98 %:iin, 98,5 %:iin, 99 %:iin 99,5 %:iin tai 100 %:iin sen ei-säilyneen polypeptidiligandin muunnoksista.
Termejä "affinitteettiselektio" (engl. biopanning) ja "faagi-display-kirjasto" käytetään 10 tässä samalla tavalla kuin US-patenttihakemuksessa nro 2005/0074747 (Arap et ai.).
Edelleen, antigeenin klassinen määritelmä on "mikä tahansa vieras aine", joka herättää immuunivasteen (esim. spesifisten vasta-ainemolekyylien tuoton) vietynä alttiin eläimen kudoksiin ja kykenee liittymään yhteen muodostuneiden spesifisten vasta-aineiden kanssa. 15 Antigeeneillä on tavallisesti korkea molekyylipaino ja ne ovat yleensä proteiineja tai polysakkarideja. Polypeptidit, lipidit, nukleiinihapot ja monet muut materiaalit voivat myös toimia antigeeneinä. Immuunivasteita voi muodostua myös hapteeneiksi kutsuttuja pienempiä aineita vastaan, jos ne ovat kemiallisesti kytkettyjä suurempaan kantajaproteiiniin, kuten naudan seerumin albumiiniin, keyhole limpet -hemosyaniiniin 20 (KLH) tai muihin synteettisiin matrikseihin. Monet eri molekyylit, kuten lääkkeet, yksinkertaiset sokerit, aminohapot, pienet peptidit, fosfolipidit tai triglyseridit voivat toimia hapteeneina. Siten jos annetaan tarpeeksi aikaa, immuunijärjestelmä tunnistaa suunnilleen minkä tahansa vieraan aineen ja aine saa aikaan spesifisen vasta-aineen tuoton. Tämä spesifinen immuunivaste on kuitenkin erittäin vaihteleva ja riippuu paljon 25 osaksi antigeenien koosta, rakenteesta ja koostumuksesta. Voimakkaita immuunivasteita herättävien antigeenien sanotaan olevan voimakkaasti immunogeenisiä.
Hyvän antigeenin ominaispiirteitä ovat: 30 · Rakenteellisen stabiilisuuden ja kemiallisen kompleksisuuden alueet molekyylissä.
• Merkittävät osuudet, joista puuttuvat ekstensiiviset toistoyksiköt.
8 • Molekyylipaino minimissään 8 000 - 10 000 daltonia, vaikka hapteeneja, joiden molekyylipainot ovat niinkin alhaisia kuin 200 Da, on käytetty kantajaproteiinin läsnä ollessa.
• Kyky tulla immuunijärjestelmän käsittelemäksi.
5 · Immunogeeniset alueet, jotka ovat alttiita vasta-ainetta muodostavalle mekanismille.
• Rakenne-elementit, jotka ovat riittävän erilaisia kuin isännällä • Peptidiantigeeneillä alueet, jotka sisältävät vähintään 30 % immunogeenisiä aminohappoja: K, R, E, D, Q, N.
• Peptidiantigeeneillä merkittävät hydrofiiliset tai varautuneet tähteet.
10
Koska vasta-aineen sitoutumisepitooppi voi koostua vain muutamasta aminohaposta, sillä ei ole ehkä diagnostista arvoa, koska sama epitooppi voi olla läsnä saman näytteen (esim. seeruminäytteen) monissa muissa proteiineissa. Siten epitooppia, joka on käyttökelpoinen esim. ihmisen veren mikrobiproteiinien osoittamisessa, ei pitäisi olla läsnä 15 humaaniseerumissa, jonka on arvioitu sisältävän jopa 10 0000 erilaista proteiinia. Kun oletetaan, että seerumiproteiinin keskikoko olisi 50 kD (noin 500 aminohappoa) ja että kaikkia 20 luonnollista aminohappoa käytettäisiin yhtäläisesti humaaniproteiineissa, jonkin tietyn seerumista havaitun di-, tri- tai tetrapeptidin todennäköisyyden voidaan laskea olevan oleellisesti 100 %. Tietyn pentapeptidin (5 aminohappoa) vastaava 20 todennäköisyys olla läsnä 10 000 hypoteettisen 50 kD:n proteiinin joukossa on 79 % ja heksapeptidin (6 aminohappoa) todennäköisyys olla läsnä on 7,5 %.
Siten voidaan arvioida, että 79 % kaikista 5-meerivasta-aine-epitoopeista ja 7,5 % kaikista 6-meerivasta-aine-epitoopeista omaavat heikentyneen diagnostisen 25 käyttökelpoisuuden mikrobi-patogeeneissä johtuen niiden läsnäolosta normaalissa seerumissa. Toisin sanoen, vain 21 % vasta-aineista (tai muun tyyppisistä spesifisistä sitoutumisproteiineista), jotka kykenevät sitoutumaan riittävän tiukasti mikrobiproteiiniin lineaarisen 5-meeri-peptidiepitoopin tunnistuksen välityksellä, voidaan odottaa jäävän sitoutumatta humaaniseerumissa läsnä olevaan epitooppiin ja olevan siten käyttökelpoisia 30 tämän mikrobin diagnostisessa osoittamisessa. Näihin verrattuna suurella enemmistöllä antimikrobiaalisista vasta-aineista, jotka tunnistavat kuudesta tai useammasta tähteestä 9 koostuvan lineaarisen epitoopin, ei ole tätä ongelmaa. Diagnostisten vasta-aineiden käyttökelpoisuus voi tietysti heikentyä myös siitä johtuen, että ne ristireagoivat toisistaan riippumattomien peptidisekvenssien koodaamien epitooppien kanssa, mutta kohde-epitoopin pituus on vähemmän oleellinen tämän komplikaation tapauksessa.
5
Edellä oleviin laskelmiin perustuen on ilmeistä, että viidestä tähteestä koostuvilla lineaarisilla epitoopeilla on vain rajoitettu arvo eivätkä viittä tähdettä lyhyemmät epitoopit ole käyttökelpoisia osoituskohteina mikrobidiagnostiikassa. Tilanne on kuitenkin erilainen, jos tarkastellaan tällaisten lyhyiden epitooppien yhdistelmällistä 10 läsnäoloa. Tri-, tetra- ja pentapeptidien erilaisten yhdistelmien esiintymisen laskettu todennäköisyys yhdessä ainoassa proteiinissa 1 000 tai 10 000 hypoteettisen, 500 tähdettä pitkän polypeptidin joukossa esitetään alla (taulukko 1).
Taulukko 1
Epitooppiyhdistelmä Läsnäolon mahdollisuus Läsnäolon mahdollisuus 1 000:ssa 50 kD:n 10 000:ssa 50 kD:n proteiinissa proteiinissa
Tripeptidi + tripeptidi 97% -100%
Tripeptidi + tetrapeptidi 17 % 85 %
Tripeptidi + pentapeptidi 0,94 % 9,0 %
Tetrapeptidi + tetrapeptidi 1,0% 9,3%
Tetrapeptidi + pentapeptidi 0,05 % 0,5 %
Pentapeptidi + pentapeptidi -0 % 0,02 % 15 Tämä analyysi osoittaa, että niinkin lyhyet epitoopit kuin kolme tai neljä tähdettä voisivat olla hyvin käyttökelpoisia diagnostisiin tarkoituksiin, jos niiden yhdistetty läsnäolo toisen suboptimaalisen pituisen epitoopin (tetra- tai pentameerien) kanssa voitaisiin osoittaa.
20 Yhdessä tällaisia lyhyitä ja siten ei-diagnostisia epitooppeja voitaisiin pitää diagnostisesti arvoikkaina "virtuaaliepitooppeina". Tämä ajatus voisi olla erittäin käyttökelpoinen, kun 10 yritetään osoittaa luotettavasti erittäin muuntelevia mikrobiproteiineja, kuten HIV-p24-antigeeniä, jotka sisältävät harvoja aminohappotähteitä, jotka olisivat sijoittuneina toistensa viereen ja säilyneitä useimmissa viruskannoisssa ja kvasilajeissa.
5 Edellä olevaan perustuen esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän fuusiopolypeptidin, eli MEBIP:n, valmistamiseksi, joka fuusiopolypeptidi kykenee samanaikaisesti sitoutumaan spesifisesti vähintään kahteen muuntelevaksi tunnetun polypeptidiantigeenin epitooppiin, mainittujen yhtäjaksoisten epitooppien koostuessa mainitun antigeenin kolmesta, neljästä tai viidestä vierekkäin sijoittuneesta säilyneestä 10 aminohappotähteestä, joka menetelmä käsittää vaiheet: a) valitaan antigeenin tunnettujen aminohapposekvenssien tietokoneanalyysillä antigeenistä 3 - 5 aminohappoa pitkiä säilyneitä alueita; 15 b) valmistetaan antigeenin valittuun säilyneeseen alueeseen perustuva peptidi; c) saatetaan sitoutumisproteiineja ilmentävien partikkelien kirjasto, kuten yksiketjuisten vasta-aineiden faagikirjasto, kosketukseen mainitun peptidin kanssa; 20 d) eristetään ne partikkelit, jotka ilmentävät sitoutumisproteiineja, joilla on sitoutumisaktiivisuutta mainittua peptidiä kohtaan; e) alistetaan vaiheessa d) eristetyistä partikkeleista saatu tai johdettu nukleiinihappo mutageneesille; 25 f) valmistetaan sitoutumisproteiineja ilmentävien partikkelien kirjasto vaiheesta e) saatuihin partikkeleihin perustuen; g) saatetaan vaiheesta f) saatu kirjasto kosketukseen mainitun peptidin tai sen fragmentin 30 kanssa; 11 h) eristetään ne partikkelit, jotka ilmentävät sitoutumisproteiineja, joilla on parantunut sitoutumisaktiivisuus mainittua peptidiä tai sen fragmenttia kohtaan; i) toistetaan vaiheet e) - h) yhden tai useamman kerran; 5 j) otetaan vaiheesta i) saaduista partikkeleista partikkeleja, jotka kykenevät sitoutumaan spesifisesti mainitun antigeenin vähintään 3-5 vierekkäistä tai ei-peräkkäistä aminohappoa pitkään epitooppiin; 10 k) valmistetaan mainittua fuusiopolypeptidiä vaiheessa j) eristettyihin partikkeleihin perustuen yhdistämällä yhteen fuusiopolypeptidiin mainitun antigeenin vähintään kahdelle erilaiselle epitoopille spesifisyyden omaavan kahden mainitun partikkelin sitomisspesifisyys, mikä johtaa fuusiopolypeptidiin, jolla on korkea spesifisyys mainitun antigeenin muunnosten suhteen.
15
Vaiheessa k) saatu MEBIP sitoutuu spesifisesti edullisesti 95 %:iin, 95,5 %:iin, 96 %:iin, 96,5 %:iin, 97 %:iin, 97,5 %:iin, 98 %:iin, 98,5 %:iin, 99 %:iin tai yli 99 %:iin mainitun antigeenin muunnoksista, joka antigeeni on edullisesti HIV:n p24-polypeptidi.
20 Mainittu vaiheen b) peptidi on valittu edullisesti HIV:n p24-polypcptidin säilyneiden peptidien 3-5 aminohappoa pitkistä alueista, jotka koostuvat seuraavista: NAWVK, FRDY, RAEQ, NPDC, VGGP, AWVK, NAWV, RDY, FRD, AEQ, RAE, PDC, NPD, GGP, VGG, WVK, AWV, NAW, SDI, PVG, GLN, WMT, TLL, EMM ja HKA.
25 Esillä oleva keksintö tuo esille myös fuusiopolypeptidin, eli MEBIP:in, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti samanaikaisesti vähintään kahteen muuntelevaksi tunnetun polypeptidiantigeenin epitooppiin mainittujen epitooppien koostuessa mainitun antigeenin säilyneiden aminohappotähteiden 3-5 tähdettä pitkistä osuuksista ja mainitulla polypeptidillä ollessa korkea spesifisyys mainitun antigeenin muunnosten 30 suhteen. Tällainen MEBIP voidaan hankkia edellä kuvatulla menetelmällä.
12
HlV-määritys
Ihmisen immuunikatoviruksen, HIV:n, osoittamisen tapauksessa ongelmana on, että viruksen antigeeniset kohdat muuttuvat jatkuvasti ja nopeasti. Esillä olevan keksinnön 5 mukainen ratkaisu on antaa käyttöön keinot sellaisen MEBIP:n valmistamiseksi, joka sitoutuu spesifisesti kahteen erilaiseen aminohappo-osuuteen, jotka koostuvat p24-polypeptidin erittäin säilyneistä 3-5 aminohappotähdettä pitkistä epitoopeista, mikä olisi vaikeaa tai mahdotonta toteuttaa tavanomaisilla vasta-aineilla. Siten saatuja MEBIP:ejä voidaan käyttää osoittamismenetelmissä samalla tavoin kuin vasta-aineita, ja ne ovat siten 10 käyttökelpoisia ihmisen immuunikatoviruksen läsnäolon osoittamisessa biologisesta näytteestä.
Alan ammattilainen voi soveltaa helposti edellä olevaa lähestymistapaa myös muihin antigeenimäärityksiin. Siten esillä oleva keksintö mahdollistaa yleisen menetelmän 15 antigeenin läsnäolon osoittamiseksi biologisesta näytteestä, joka menetelmä käsittää a) saatetaan mainittu näyte tai sen fraktio kosketukseen MEBIP:n kanssa; ja b) osoitetaan mainitun polypeptidin ja antigeenin kompleksi mainitun kompleksin 20 läsnäolon tarkoittaessa mainitun antigeenin läsnäoloa mainitussa näytteessä.
Edullisesti mainittu antigeeni on HIV:n p24-polypeptidi ja menetelmä on HIV:n osoittamiseksi näytteestä.
25 Tässä käytetyt julkaisut ja muut materiaalit keksinnön taustan valaisemiseksi ja erityisesti lisäyksityiskohtien tarjoamiseksi sen käytännön toteuttamisen suhteen, sisällytetään tähän viitteeksi. Esillä olevaa keksintöä kuvataan edelleen seuraavissa esimerkeissä, joiden ei ole tarkoitus rajoittaa keksinnön suojapiiriä.
30 13 ESIMERKIT ESIMERKKI 1 5 Virtuaaliepitooppeina käyttökelpoisten säilyneiden alueiden tunnistamiseksi HIV-p24:stä asetettiin suuri joukko julkisista tietokannoista, kuten http://www.hiv.lanl.gov/content/index, saatavia yksittäisiä aminohapposekvenssejä rinnakkain toistensa kanssa ja kunkin aminohappotähteen suhteellinen säilyneisyys arvioitiin. Tähän analyysiin perustuen valittiin myöhempään analyysiin peptidiosuuksia, 10 jotka koostuivat kolmesta tai useammasta tähteestä, jotka olivat säilyneitä useammassa kuin 99 %:ssa sekvensseistä (katso kuviota 1).
Synteettisiä peptidejä, jotka sisältävät yhden tai useita mahdollisia säilyneitä alueita HIV:n p24:n virtuaaliepitooppeja varten, käytetään sellaisten polypeptidien suurten 15 kirjastojen seulomiseksi, jotka voivat toimia MEBIP-esiasteina, käyttämällä affiniteettiin perustuvia selektiomenetelmiä. Esimerkiksi ETH-2-Gold-faagi-display-kirjasto, jonka ovat muodostaneet Neri ja työtoverit (Proteomics 5:2 340 - 2 350, 2005) ja joka sisältää kolme miljardia yksittäistä rekombinanttivasta-ainekloonia, seulotaan polypeptidien suhteen, jotka voivat toimia spesifisesti vuorovaikutuksessa säilyneitä alueita sisältävien 20 peptidien kanssa. On olemassa myös useita kirjastoja, jotka sisältävät mahdollisia ligandin sitovia polypeptidejä ei-Ig:stä johdettuihin polypeptideihin perustuen (katso esim. Nature Biotechnology 23:1 257 - 1 268) tai joita voidaan suunnitella de novo, ja niitä käytetään polypeptidien seulomiseen MEBIP:ien kehittämiseksi. Sen lisäksi, että tällaisia MEBIP-esiastekirjastoja seulotaan synteettisillä peptideillä, affiniteettiselektiossa 25 käytetään ligandeina rekombinanttiproteiineja, jotka sisältävät yhden tai useamman potentiaalisen säilyneen alueen, sekä denaturoituja HIV-kapsidiproteiineja (p24). Jälkimmäisessä tapauksessa sitoutumisen kohdentuminen mainittuja säilyneitä alueita sisältäviin peptideihin voidaan saada aikaan esimerkiksi näiden peptidien käytöllä haluttuja sitoutumisspesifisyyksiä omaavien faagien eluoimisessa.
30 14
Sen jälkeen, kun näihin peptideihin sitoutuvat potentiaaliset MEBIP-molekyylit muodostetaan, esimerkiksi seulomalla scFv-faagikirjastoja (rekombinanttivasta-ainekirjastojen seulonnan perusperiaatteiden katsauksen esittää Hoogenboom, Nature Biotechnology 23(9):1 105 - 1 116), tästä sitoutumisesta vastaavat tähteet varmistetaan 5 käyttämällä peptidisiruteknologiaa. Kuviossa 1 esitetyn kahden tai useamman epitoopin mikä tahansa yhdistelmä on mahdollinen yhdistelmäkohde HIV-p24:n osoittamisessa käytettävälle MEBIP:n sitoutumiselle.
ESIMERKKI 2 10
Jatkokehitykseen valitaan MEBIP-esiasteita, jotka sitoutuvat sekä denaturoituun p24:ään että määriteltyyn virtuaaliepitoopin sisältävään peptidiin. Näiden esi-MEBIP:ien sitoutumisaffiniteetti maksimoidaan toistetun mutageneesin ja affiniteettiselektion välityksellä, kuten keksijät ovat kuvanneet SCA-muokkaukseen liittyvissä aikaisemmissa 15 tutkimuksissaan (Biochemistry 41:12 729 - 12 738, 2003). Käytetään sekä umpimähkäistä mutageneesiä käjättämällä virhealtista PCR:ää, kuten edellä mainitussa Biochemistry-artikkelissa on kuvattu, tai muita samanlaisia tekniikoita sekä esi-MEBIP:eissä olevien sitoutumispintojen kohdennettua mutageneesiä tai näiden lähestymistapojen yhdistelmiä. Affiniteettiselektioon ja parannettujen esi-MEBIP-20 molekyylien monistukseen käytetään M13: sta j ohdettuun phasmidiin perustuvaa perinteistä faagi-displaytä plus auttajabakteriofagin välittämää lähestymistapaa mutta voidaan käyttää myös muita vastaavia seulontamenetelmiä.
Sen jälkeen valmistetaan MEBIP (katso esim. Albrecht et ai., 2006, Journal of 25 Immunological Methods 310:100 -116) yhdistämällä yhteen fuusiopolypeptidiin p24:n virtuaaliepitoopin säilyneisiin alueisiin spesifisyyden omaavan kahden esi-MEBIP:n sitoutumisspesifisyys, mikä johtaa fuusiopolypeptidiin, MEBIP:iin. Lopuksi kootun MEBIP:n sitoutumisspesifisyyttä komposiittikohdettaan kohtaan optimoidaan edelleen käyttämällä samaa metodologiaa kuin käytettiin aluksi esi-MEBIP-alayksiköiden 30 sitoutumisominaisuuksien muokkaamiseksi.
15
Sitten sitoutumisaffiniteetit ja muut tärkeimmät ominaisuudet karakterisoidaan yksityiskohtaisesti. Niiden optimaalisten MEBIP:ien ominaisuuksia, joita käytetään sellaisenaan tai erilaisina fuusioproteiinijohdannaisina uusien p24-osoittamismääritysten muodostamisessa, ovat: 1) korkea affiniteetti lämpödenaturoidun HIV-p24-proteiinin • -12 5 suhteen tarkoittaen edullisesti dissosiaatiovakiota, joka on matalampi kuin 10" M, 2) virtuaaliepitoopin absoluuttinen säilyneisyys useammassa kuin 99 %:ssa asiaankuuluvista viruskannoista ja 3) hyvä liukoisuus ja helppo suuren mittakaavan rekombinanttituotto.
Claims (8)
1. Menetelmä fuusiopolypeptidin valmistamiseksi, joka fuusiopolypeptidi kykenee sitoutumaan spesifisesti samanaikaisesti vähintään kahteen muuntelevaksi tunnetun 5 polypeptidiantigeenin epitooppiin, mainittujen epitooppien koostuessa mainitun antigeenin 3-5 vierekkäisestä säilyneestä aminohappotähteestä, joka menetelmä käsittää vaiheet: a) valitaan antigeenin tunnettujen aminohapposekvenssien tietokoneanalyysillä 10 antigeenistä 3 - 5 aminohappoa pitkiä säilyneitä alueita; b) valmistetaan peptidejä, jotka perustuvat valittuihin säilyneisiin alueisiin antigeenissä; c) saatetaan sitoutumisproteiineja ilmentävien partikkelien kirjasto kosketukseen yhden 15 tai useamman mainitun peptidin kanssa; d) eristetään ne partikkelit, jotka ilmentävät sitoutumisproteiineja, joilla on sitoutumisaktiivisuutta peptidejä kohtaan; 20 e) alistetaan vaiheessa d) eristety(i)stä partikkel(e)ista saatu tai johdettu nukleiinihappo mutageneesille; f) valmistetaan sitoutumisproteiineja ilmentävien partikkelien kirjasto vaiheesta e) saatuihin partikkeleihin perustuen; 25 g) saatetaan vaiheesta f) saatu kirjasto kosketukseen yhden tai useamman mainitun peptidin tai niiden fragmentin kanssa; h) eristetään ne partikkelit, jotka ilmentävät sitoutumisproteiineja, joilla on parantunut 30 sitoutumisaktiivisuus mainittuja peptidejä tai niiden fragmenttia kohtaan; i) toistetaan vaiheet e) - h) yhden tai useamman kerran; j) otetaan vaiheesta i) saaduista partikkeleista partikkeleja, jotka kykenevät sitoutumaan spesifisesti mainitun antigeenin vähintään 3 - 5 vierekkäistä aminohappoa pitkään 5 epitooppiin; k) valmistetaan mainittua fuusiopolypeptidiä vaiheessa j) eristettyihin partikkeleihin perustuen yhdistämällä yhteen fuusiopolypeptidiin mainitun antigeenin vähintään kahdelle erilaiselle epitoopille spesifisyyden omaavan kahden mainitun partikkelin 10 sitoutumisspesifisyys, mikä johtaa fuusiopolypeptidiin, jolla on korkea spesifisyys mainitun antigeenin muunnoksien suhteen.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin vaiheesta k) saatu mainittu fuusiopolypeptidi sitoutuu spesifisesti 95 %:iin, 95,5 %:iin, 96 %:iin, 96,5 %:iin, 97 %:iin, 15 97,5 %:iin, 98 %:iin, 98,5 %:iin, 99 %:iin 99,5 %:iin tai 100 %:iin mainitun antigeenin muunnoksista.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin mainittu kirjasto on yksiketjuisten vasta-aineiden faagikirjasto. 20
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin mainittu antigeeni on HIV:n p24-polypeptidi.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, jolloin mainittu peptidi on valittu HIV:n 25 p24-polypeptidin 3-5 aminohappoa pitkistä alueista, jotka koostuvat seuraavista: NAWVK, FRDY, RAEQ, NPDC, VGGP, AWVK, NAWV, RDY, FRD, AEQ, RAE, PDC, NPD, GGP, VGG, WVK, AWV, NAW, SDI, PVG, GLN, WMT, TLL, EMM ja HKA.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin epitoopit koostuvat 3 - 4 tai 4 - 5 vierekkäisestä aminohappotähteestä.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin toinen tai molemmat epitoopit koostuvat 3, 4 tai 5 vierekkäisestä aminohappotähteestä.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin mainitun fuusiopolypeptidin -12 -15 affiniteetti antigeenin suhteen on 10" - 10" M.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20075159A FI120349B (fi) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Menetelmä fuusiopolypeptidin valmistamiseksi |
| US12/530,019 US8735328B2 (en) | 2007-03-07 | 2008-03-07 | Fusion polypeptide for detection of conserved combinatorial or composite epitopes in non-conserved proteins |
| EP08718564A EP2129689A4 (en) | 2007-03-07 | 2008-03-07 | FUSION POLYPEPTIDE FOR DETECTING COMBINATION OR COMPOSITE EPITOPES PRESERVED IN NON-PRESERVED PROTEINS |
| CN200880015324A CN101679514A (zh) | 2007-03-07 | 2008-03-07 | 用于检测非保守蛋白质中保守的组合或复合表位的融合多肽 |
| PCT/FI2008/050111 WO2008107523A2 (en) | 2007-03-07 | 2008-03-07 | A fusion polypeptide for detection of conserved combinatorial or composite epitopes in non-conserved proteins |
| JP2009552239A JP2010520266A (ja) | 2007-03-07 | 2008-03-07 | 非保存性タンパク質内の、保存性のコンビナトリアルエピトープまたは複合エピトープを検出するための融合ポリペプチド |
| CA002680123A CA2680123A1 (en) | 2007-03-07 | 2008-03-07 | A fusion polypeptide for detection of conserved combinatorial or composite epitopes in non-conserved proteins |
| MX2009009503A MX2009009503A (es) | 2007-03-07 | 2008-03-07 | Un polipeptido de fusion para deteccion de epitopos combinatorios conservados o compuestos en proteinas no conservadas. |
| AU2008223755A AU2008223755A1 (en) | 2007-03-07 | 2008-03-07 | A fusion polypeptide for detection of conserved combinatorial or composite epitopes in non-conserved proteins |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20075159A FI120349B (fi) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Menetelmä fuusiopolypeptidin valmistamiseksi |
| FI20075159 | 2007-03-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20075159A0 FI20075159A0 (fi) | 2007-03-07 |
| FI20075159A FI20075159A (fi) | 2008-09-08 |
| FI120349B true FI120349B (fi) | 2009-09-30 |
Family
ID=37930071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20075159A FI120349B (fi) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Menetelmä fuusiopolypeptidin valmistamiseksi |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8735328B2 (fi) |
| EP (1) | EP2129689A4 (fi) |
| JP (1) | JP2010520266A (fi) |
| CN (1) | CN101679514A (fi) |
| AU (1) | AU2008223755A1 (fi) |
| CA (1) | CA2680123A1 (fi) |
| FI (1) | FI120349B (fi) |
| MX (1) | MX2009009503A (fi) |
| WO (1) | WO2008107523A2 (fi) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7176724B2 (ja) | 2018-07-20 | 2022-11-22 | 国立大学法人滋賀医科大学 | ヒト末梢性コリン作動性神経検出用抗体 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO314588B1 (no) | 2000-09-04 | 2003-04-14 | Bionor Immuno As | HIV-peptider, antigener, vaksinesammensetning, immunoassay- testsett og en fremgangsmåte for å påvise antistoffer indusert av HIV |
| US6610472B1 (en) | 2000-10-31 | 2003-08-26 | Genetastix Corporation | Assembly and screening of highly complex and fully human antibody repertoire in yeast |
| US6833441B2 (en) | 2001-08-01 | 2004-12-21 | Abmaxis, Inc. | Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers |
| GB0305702D0 (en) * | 2003-03-12 | 2003-04-16 | Univ Birmingham | Bispecific antibodies |
-
2007
- 2007-03-07 FI FI20075159A patent/FI120349B/fi not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-03-07 CA CA002680123A patent/CA2680123A1/en not_active Abandoned
- 2008-03-07 CN CN200880015324A patent/CN101679514A/zh active Pending
- 2008-03-07 JP JP2009552239A patent/JP2010520266A/ja not_active Withdrawn
- 2008-03-07 WO PCT/FI2008/050111 patent/WO2008107523A2/en active Application Filing
- 2008-03-07 US US12/530,019 patent/US8735328B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-03-07 MX MX2009009503A patent/MX2009009503A/es not_active Application Discontinuation
- 2008-03-07 AU AU2008223755A patent/AU2008223755A1/en not_active Abandoned
- 2008-03-07 EP EP08718564A patent/EP2129689A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX2009009503A (es) | 2010-02-17 |
| US20100190655A1 (en) | 2010-07-29 |
| FI20075159A (fi) | 2008-09-08 |
| EP2129689A4 (en) | 2011-11-02 |
| US8735328B2 (en) | 2014-05-27 |
| AU2008223755A1 (en) | 2008-09-12 |
| WO2008107523A2 (en) | 2008-09-12 |
| CN101679514A (zh) | 2010-03-24 |
| WO2008107523A8 (en) | 2009-07-30 |
| CA2680123A1 (en) | 2008-09-12 |
| FI20075159A0 (fi) | 2007-03-07 |
| EP2129689A1 (en) | 2009-12-09 |
| JP2010520266A (ja) | 2010-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114163523B (zh) | 一种针对新型冠状病毒的单域抗体及其应用 | |
| CN112010966B (zh) | 一种针对新冠病毒棘突蛋白非rbd区的单克隆抗体及其应用 | |
| KR102229225B1 (ko) | 사스-코로나바이러스-2 표면의 스파이크 단백질에 결합하는 사스-코로나바이러스 감염증의 진단용 결합 분자 | |
| US7049060B2 (en) | HCV anti-core monoclonal antibodies | |
| EP0759037B1 (en) | Antigen/antibody specificity exchanger | |
| CN111748032B (zh) | 抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测 | |
| US20030129587A1 (en) | Antigen/antibody specificity exchanger | |
| Chen et al. | Synthetic antibodies and peptides recognizing progressive multifocal leukoencephalopathy-specific point mutations in polyomavirus JC capsid viral protein 1 | |
| FI120349B (fi) | Menetelmä fuusiopolypeptidin valmistamiseksi | |
| de Haard et al. | Selection of recombinant, library-derived antibody fragments against p24 for human immunodeficiency virus type 1 diagnostics | |
| CN109503711A (zh) | 一种用于血凝方法检测pcv2病毒的双功能纳米抗体、编码基因及其应用 | |
| US20200017582A1 (en) | Immunoassay method using anti-human bnp fragment (4-32) antibody | |
| FI120376B (fi) | Menetelmä biomuokatun, korkean affiniteetin polypeptidin valmistamiseksi | |
| FI112501B (fi) | Heveiiniä sitovat monoklonaaliset vasta-aineet | |
| Qiu et al. | A camel anti-lysozyme CDR3 only domain antibody selected from phage display VHH library acts as potent lysozyme inhibitor | |
| Liu et al. | Bispecific monoclonal antibodies against a viral and an enzyme: utilities in ultrasensitive virus ELISA and phage display technology | |
| IL87768A (en) | Blood assay including erythrocyte agglutination and reagent for the assay comprising conjugate of erythrocyte binding molecule and analyte binding molecule | |
| EP4194054A1 (en) | Camelid antibodies for use in therapy and diagnosis | |
| TW201943727A (zh) | 單域結合蛋白及其組合及多種標記單域結合蛋白之應用及用於特異性過敏原ＩｇＥ的檢測方法 | |
| Chen et al. | Isolation of human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by immobilized metal affinity chromatography | |
| Twair et al. | Production of polyclonal antibody against M13 phage for application in nanobody technology | |
| AP81A (en) | Agglutination assay | |
| US20230228763A1 (en) | Process for direct readout of immunoglobulins | |
| Kramer et al. | Antibodies for biosensors | |
| TWI532838B (zh) | 蓖麻子毒素融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的免疫檢測試劑及套組 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 120349 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |