JP7176724B2 - ヒト末梢性コリン作動性神経検出用抗体 - Google Patents
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Description
項2.項1に記載のポリペプチドに結合する抗体。
項3.抗血清、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である、項2に記載の抗体。
項4.ヒト末梢性コリンアセチル基転移酵素に対する抗体である、項2又は3に記載の抗体。
項5.項2~4のいずれか一項に記載の抗体を含む、ヒトの末梢性コリン作動性神経の検出用試薬。
項6.項2~4のいずれか一項に記載の抗体を含む、ヒトの末梢性コリン作動性神経が障害される疾患の診断薬。
項7.前記ヒトの末梢性コリン作動性神経が障害される疾患が、ヒルシュスプリング病、自律神経失調症、片頭痛、又は神経変性疾患(例えば、パーキンソン病、レビー小体病、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症など)である、項6に記載の診断薬。
本発明のポリペプチドは、配列番号1~4のいずれか一つで表されるアミノ酸配列をC末端側に含む20残基以内のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
配列番号1:SYKALLDRTQSSRK
配列番号2:YKALLDRTQSSRK
配列番号3:KALLDRTQSSRK
配列番号4:ALLDRTQSSRK
本発明の抗体は、上記ポリペプチドに結合することを特徴とする。
本発明のヒトの末梢性コリン作動性神経の検出用試薬は、上記抗体を含むことを特徴とする。また、本発明のヒトの末梢性コリン作動性神経が障害される疾患の診断薬は、上記抗体を含むことを特徴とする。
・ペプチドデザイン
推測されるヒトpChAT配列のエクソン5と10の間の接合部の配列は、pChATに特有のものであるため、抗原として使用した(図1参照)。エクソン5及び10の接合部分を含む異なる長さの以下のペプチドをデザインした。
(C)LISGVLSYKALLDRTQSSRKLIRADSVSE (配列番号5、6)
(C)GVLSYKALLDRTQSSRKLIRADS (配列番号7、8)
(C)SYKALLDRTQSSRKLIR (配列番号9,10)
(C)SYKALLDRTQSSRK (配列番号11)
Fmoc固相ペプチド合成法を使用して合成ペプチドを作製した。ペプチドの同一性及び純度は、UV-HPLC及び質量分析計を用いて確認した。ペプチドの純度は70%以上であった。免疫のために使用した抗原ペプチドの配列は上記のものである。マレイミド化学を用いた結合を容易にするために、システインをN末端に結合した。Imject Maleimide-Activated mcKLH Spin Kit (Thermo Fisher Scientific)を用いてマニュアルに従って、ペプチドをN末端のシステインを介して免疫原性担体KLHと結合した。
ヒト(男と女の両方)組織標本は病理剖検から得られ、胃腸の病状は診断されなかった。ヒトの標本の使用と収集方法は、滋賀医科大学倫理委員会によって承認された。全ての組織検体は、死後3-7時間以内に得られた。サルは本プロジェクトのために屠殺されなかった。カニクイザルからの結腸の3つの検体は、滋賀医科大学動物実験委員会及びバイオセイフティー委員会によって承認された方法に従って屠殺された動物から得られた。
ヒト及びサルの組織は、4日間4℃で、0.1 Mリン酸バッファー(pH 7.4)で希釈された4%パラホルムアルデヒドを含む混合液中で固定化した。ラットの組織は、同じ固定剤を使用して経心的に灌流した(Bellier and Kimura, 2007)。固定化された組織は、24時間以上、15%スクロースを含む0.1 Mリン酸バッファー(pH 7.4)中に静置した後、Tissue-Tek (登録商標) optimum cutting temperature compound (サクラファインテックジャパン株式会社)で凍結させ、28μm厚の切片にクリオスタットでカットした。切片は、4℃で、0.9% NaClと0.3% Triton (登録商標) X-100を含む0.01 Mリン酸バッファー(pH 7.4)(PBST)中で保存し、組織透過性を向上させた。
内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害するために、最初に、free-floating切片を室温で0.1%アジ化ナトリウム及び0.5%過酸化水素を含むPBSTで60分間処理した。ChATの一般的な形態(cChAT)の検出のために、cChAT抗体を1:10,000の希釈率で使用した(Kimura et al. 2007)。次に、切片は、4℃で12-24時間、一次マウス又はウサギポリクローナル抗ヒトpChAT抗血清とインキュベートし、その後、1時間、ビオチン化ヤギ抗マウスIgG (BA-2000; Vector Laboratories, Burlingame, CA; 1:3,000希釈)又はビオチン化ヤギ抗ウサギIgG (BA-1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA; 1:3,000希釈)とインキュベートした。次に、切片は、室温で1時間、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体(PK-6100; Vector Laboratories; 1:3,000希釈)とインキュベートした。50 mM Tris-HClバッファー(pH 7.6)中に0.04% 3,3'-ジアミノベンジジン4塩酸塩、0.4%硫酸ニッケルアンモニウム、及び0.003%過酸化水素を含む溶液で20分間処理することでダークブルーの沈殿を生じさせ、ペルオキシダーゼ活性を可視化して免疫標識を行った。全ての試薬の希釈及び各工程の後の洗浄のためにPBSTを使用した。染色された切片は水道水で洗浄し、ガラススライド(プラチナコート, 松波硝子工業株式会社)上に乗せ、一連のアルコール洗浄により脱水し、キシレンで洗浄し、Entellan (Merck, Darmstadt, Germany)でカバースリップした。免疫組織化学法のコントロールは、一次抗体を免疫前の血清に代えることにより、及び(1:20モルの割合で)抗体をmcKLHフリー抗原ペプチドで吸着することにより実施した。デジタル画像は、顕微鏡(BX50、オリンパス株式会社)に付属のカメラ(D27、オリンパス株式会社)に装着された画像収集システム(DP2-SAL、オリンパス株式会社)を使用して収集した。
組織のfree-floating切片は、マウスポリクローナル抗ヒトpChAT抗体(1:10,000希釈)、及び標準的なヒト血清と吸着されたウサギポリクローナル抗ラットpChAT抗体(Tooyama and Kimura, 2000)(1:100希釈)の混合液と4℃で48時間、インキュベートした。PBSTでの3度のリンスの後、切片は室温で3時間、最適な二次抗体とインキュベートした。二次抗体は、Alexa Fluor 555結合抗ウサギIgG、Alexa Fluor 647結合抗マウスIgG (1:500希釈; Thermo Fisher Scientific)であった。ネガティブコントロールの切片は一次抗体無しで同じ手順に供された。PBSTでの3回の洗浄後、切片はコートされたガラススライド上に乗せ、供焦点レーザー走査型顕微鏡(FV-1000、オリンパス株式会社)を用いて試験した。
・ペプチドからポリクローナル抗体の生成
上記のペプチドを用いて作製した抗血清について、ヒト結腸の切片で試験を行った。それらの中で、ペプチドSYKALLDRTQSSRKを用いて免疫化することによって生成した抗体は最も良いシグナル/バックグラウンド比を示し、ロバストな免疫染色が確実に観察された。しかしながら、エクソン5由来ペプチド、エクソン7由来ペプチド、LISGVLSYKALLDRTQSSRKLIRADSVSE、GVLSYKALLDRTQSSRKLIRADS、SYKALLDRTQSSRKLIRなどに対する抗体では、ヒトpChATを認識できなかった(図2)。
抗ヒトpChAT抗体、及び以前報告されたcChAT遺伝子を特異的に認識する抗血清を用いた免疫組織化学染色をヒト線条体及び内臓に対して行った。
以前作製された抗ラットpChAT抗体(Tooyama and Kimura, 2000)をヒトの内臓切片に適用した。過剰な非特異的バックグラウンド染色のために、特異的な染色は観察されなかった(図5A)。この非特異的染色は、標準的なヒト血清と抗血清を吸着させることで一部は抑制された。反対に、新たな抗ヒトpChAT抗体は吸着又はブロッキングを必要とせず、高い希釈率で組織切片を効率的に染色できた。新たな抗ヒトpChAT抗体はロバストな染色、高いシグナル/バックグラウンド比、及び正確な解剖学的描写を可能にする高い解像度を示した(図5C)。
ヒト結腸において新たな抗ヒトpChAT抗体を用いた免疫組織化学法は、高い解剖学的解像度で結腸壁の細胞及び繊維を標識化した。低倍率では、抗ヒトpChAT抗体の染色パターンは腸神経系に限定されていた。ポジティブな平滑線維は、輪走及び縦走筋層の両方において粘膜の腺窩の間に観察された。粘膜下神経叢及び筋層間神経叢において、標識化は細胞体及び線維の両方において存在した(図7)。詳細な観察は、ほとんどの染色された線維が異常に拡張していたことを示した。
高倍率で、抗ヒトpChAT抗体を用いた免疫組織化学法は、粘膜下神経叢及び筋層間神経叢においてロバスト及び詳細な染色を示した。免疫染色は細胞質性であり、神経細胞体、樹状突起、及び軸索に局在化した。抗ヒトpChAT抗体は高い解剖学的解像度及び高感度を提供したので、形態に従い神経細胞の種類の特定が容易であった。粘膜下神経叢では、Dogiel type II及びIVが多くの単極及び星状ニューロンと一緒に染色された。筋層間神経叢では、Dogile I、II及びIIIがsmall Dogiel I細胞と同様に染色された(図8)。全てのこれらの神経細胞の種類は神経伝達物質としてアセチルコリンを使用することが知られている(Furness, 2006)。それ故、抗ヒトpChAT抗血清は腸神経系の全てのコリン作動性ニューロンを標識化できることを示している。
Bellier, J. and Kimura, H. (2007) Acetylcholine synthesis by choline acetyltransferase of a peripheral type as demonstrated in adult rat dorsal root ganglion. J Neurochem 101: 1607-1618.
Furness JB (2006) The Enteric Nervous System. Blackwell, Oxford.
Kimura S, Bellier JP, Matsuo A, Tooyama I, Kimura H. (2007) The production of antibodies that distinguish rat choline acetyltransferase from its splice variant product of a peripheral type. Neurochem Int. 50(1):251-5.
Tooyama I, Kimura H. (2000) A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17(4):217-26.
Claims (5)
- 配列番号1~4及び11のいずれか一つで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドに結合する抗体。
- 抗血清、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である、請求項2に記載の抗体。
- 請求項2又は3に記載の抗体を含む、ヒトの末梢性コリン作動性神経の検出用試薬。
- 請求項2又は3に記載の抗体を含む、ヒトの末梢性コリン作動性神経が障害される疾患の診断薬。
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Acta Histochem. Cytochem.,2013年,Vol. 46, No. 2,P. 59-64 |
Journal of Chemical Neuroanatomy,2000年,Vol. 17,P. 217-226 |
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