MX2014003071A - Metodos y composiciones para controlar malezas. - Google Patents

Metodos y composiciones para controlar malezas.

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Abstract

La presente invención provee nuevas composiciones para usar para mejorar el control de malezas; específicamente, la presente invención provee métodos y composiciones que modulan Acetil-CoA carboxilasa en especies de malezas; la presente invención también proporciona combinaciones de composiciones y métodos que mejoran el control de malezas.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA CONTROLAR MALEZAS Esta solicitud reclama el beneficio de acuerdo con 35USC § 119(e) de la solicitud provisoria de los Estados Unidos acta no. 61/534.073 presentada el 13/09/2011 , incorporada a la presente como referencia en su totalidad. El listado de secuencias que está contenido en el archivo con nombre "40_21(58637)B seq listing.txt", el cual tiene 2,094,591 bytes (medido en el sistema operativo MS-Windows) y fue creado el 6 Sept 2012, se presenta junto con la presente y se incorpora a la presente a modo de referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere, en general, al campo de control de malezas. Más específicamente, la invención se refiere a genes de acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) en plantas que se consideran malezas y composiciones que contienen moléculas de polinucleótido para modular y/o regular su expresión. La invención provee además métodos y composiciones de utilidad para controlar malezas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las malezas son plantas que compiten con plantas cultivadas en un ambiente agronómico y cuestan a los agricultores billones de dólares anuales en pérdidas de cultivos y gasto de esfuerzos para mantener a las malezas bajo control. Las malezas también sirven como huéspedes para enfermedades en cultivos y plagas de insectos. Las pérdidas causadas por las malezas en ambientes de producción agrícola incluyen reducciones en el rendimiento de los cultivos, menor calidad de los cultivos, mayores costos de irrigación, mayores costos de recolección, menor valor de la tierra, lesiones al ganado y daños a los cultivos provenientes de insectos y enfermedades albergadas por las malezas. Los principales medios por los cuales las malezas causan estos efectos son: 1) competencia con plantas de cultivo para agua, nutrientes, luz solar y otros factores esenciales para el crecimiento y el desarrollo, 2) producción de productos químicos tóxicos o irritantes que causan problemas de salud en humanos o animales, 3) producción de inmensas cantidades de semillas o partes reproductivas vegetativas o ambas que contaminan los productos agrícolas y perpetúan las especies en tierras agrícolas y 4) producción en tierras agrícolas y no agrícolas de vastas cantidades de vegetación que deben ser eliminadas. Las malezas tolerantes a herbicidas son un problema con casi todos los herbicidas en uso, hay una necesidad de controlar efectivamente estas malezas. Hay más de 365 biotipos de malezas actualmente identificadas como resistentes a uno o varios herbicidas por el Herbicide Resistance Action Committee (HRAC), el North American Herbicide Resistance Action Committee (NAHRAC) y el Weed Science Society of America (WSSA).
La enzima acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) cataliza la carboxilación dependiente de biotina de acetil-CoA para producir malonil-CoA, este es el primer y comprometido paso en la biosíntesis de ácidos grasos de cadena larga. Esta enzima es el blanco de muchos herbicidas que incluyen miembros de las familias químicas de ariloxifenoxipropionatos, ciclohexandionas y fenilpirazolina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención proporciona un método de control de plantas que son malezas que comprende una aplicación externa a una planta tipo maleza de una composición que comprende un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde el polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia génica de ACCasa o su fragmento o al transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ACCasa o su fragmento, en donde dicha secuencia génica de ACCasa está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-92 o su fragmento de polinucleótido, por lo cual el crecimiento o el desarrollo de la planta tipo maleza o capacidad reproductiva se reduce o la planta tipo maleza es más sensible a un herbicida inhibidor de ACCasa respecto a una planta tipo maleza no tratada con dicha composición. De esta manera, las plantas que se han vuelto más resistentes a la aplicación de un inhibidor de ACCasa con herbicidas pueden ser más susceptibles a los efectos herbicidas de un inhibidor de ACCasa que contiene herbicida, potenciando así el efecto del herbicida. El fragmento de polinucleótido tiene una longitud de al menos 18 nucleótidos contiguos, al menos 19 nucleótidos contiguos, al menos 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y es al menos el 85% idéntico a una secuencia génica de ACCasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-92 y el agente de transferencia es una composición o compuesto de organosilicio. El fragmento de polinucleótido también pueden ser ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o híbridos de dsADN/ARN. La composición puede incluir más de un fragmento de polinucleótido, y la composición puede incluir un herbicida inhibidor de ACCasa y/u otros herbicidas que mejoran la actividad de control de malezas de la composición.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan moléculas de polinucleótido y métodos para modular la expresión génica de ACCasa en una especie de planta tipo maleza. El método reduce, reprime o retarda de otro modo la expresión de un gen de ACCasa en una planta tipo maleza que comprende una aplicación externa de tal planta tipo maleza de una composición que comprende un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde el polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia génica de ACCasa, reprime o de otro modo retarda, o al transcripto de ARN de la secuencia génica de ACCasa, reprime o de otro modo retarda, en donde la secuencia génica de ACCasa está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-54 o su fragmento de polinucleótido. El fragmento de polinucleótido tiene una longitud de al menos 18 nucleótidos contiguos, al menos 19 nucleótidos contiguos, al menos 20 nucleótidos contiguos, al menos 21 nucleótidos contiguos y es al menos el 85% idéntico a una secuencia génica de ACCasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-92 y el agente de transferencia es un compuesto de organosilicio. El fragmento de polinucleótido también pueden ser ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o híbridos de dsADN/ARN.
En otro aspecto de la invención, la composición que contiene moléculas de polinucleótido de la invención se puede combinar con otros compuestos herbicidas para proporcionar un control adicional de plantas no deseadas en un campo de plantas cultivadas.
En otro aspecto, la composición de moléculas de polinucleótido se puede combinar con uno o varios productos químicos agrícolas adicionales tales como insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, quimioesterilizantes, semioquímicos, repelentes, atrayentes, feromonas, estimulantes de la alimentación, biopesticidas, pesticidas microbianos u otros compuestos biológicamente activos para formar un pesticida multicomponente para dar un espectro incluso más amplio de protección agrícola.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y están incluidos para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede ser mejor comprendida por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en esta invención. La invención puede ser comprendida en forma más completa a partir de la siguiente descripción de las figuras: Figura 1. Tratamiento de Amaranthus palmer con polinucleótidos activadores de ssDNA y herbicida inhibidor de ACCasa, cletodim.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporcionan métodos y composiciones que contienen un polinucleótido que proporcionan regulación, represión o retraso de la expresión génica de ACCasa (acetil-CoA carboxilasa) y mejor control de especies de plantas herbáceas e importantes biotipos de malezas resistentes al inhibidor de ACCasa. Los aspectos del método se pueden aplicar para controlar diversas plantas herbáceas en ambientes agronómicos y otros ambientes cultivados.
Las siguientes definiciones y métodos se proporcionan para definir mejor la presente invención y guiar a los expertos en el arte en la práctica de la presente invención. A menos que se note otra cosa, los términos se han de entender de acuerdo con el uso convencional por los expertos en el arte. Cuando un término se proporciona en singular, los inventores también contemplan aspectos de la invención descritos por el plural de ese término.
Por polinucleótidos "no transcribióles" se entiende que los polinucleótidos no comprenden una unidad de transcripción completa de polimerasa II. Tal como se usa en la presente, "solución" se refiere a mezclas homogéneas y mezclas no homogéneas tales como suspensiones, coloides, micelas y emulsiones.
Las plantas herbáceas son plantas que compiten con plantas cultivadas, aquellas de particular importancia incluyen, pero sin limitación, importantes malezas invasivas y nocivas y biotipos resistentes a herbicidas en la producción de cultivos, tales como, especies de Amaranthus -A. albus, A. blitoides, A. hybridus, A. palmeri, A. powellii, A. retroflexus, A. spinosus, A. tuberculatus y A. viridis; especies de Ambrosia - A. trífida, A. artemisifolia; especies de Lolium - L. multiflorum, L rigidium, L perenne; especies de Digitaria -D. insularis; especies de Euphorbia -E. heterophylla; especies de Kochia - K. scoparia; especies de Sorghum -S. halepense; especies de Conyza - C. bonariensis, C. canadensis, C. sumatrensis; especies de Chloris -C. trúncate; especies de Echinochola - E. colona, E. crus-galli; especies de Eleusine -E. indica; especies de Poa -P. annua; especies de Plantago -P. lanceolata; especies de Avena - A. fatua; especies de Chenopodium - C. álbum; especies de Setaria - S. viridis, Abutilón theophrasti, especies de Ipomoea, especies de Sesbania, especies de Cassia, especies de Sida, especies de Brachiaria y especies de Solanum.
Las especies de plantas herbáceas adicionales halladas en áreas cultivadas incluyen Alopecurus myosuroides, Avena sterilis, Avena sterilis ludoviciana, Brachiaria plantaginea, Bromus diandrus, Bromus rigidus, Cynosurus echinatus, Digitaria ciliaris, Digitaria ischaemum, Digitaría sanguinalis, Echinochloa oryzicola, Echinochloa phyllopogon, Eriochloa punctata, Hordeum glaucum, Hordeum leporínum, Ischaemum rugosum, Leptochloa chinensis, Lolium persicum,, Phalaris minor, Phalaris paradoxa, RottboelUa exalta, Setaria faberí, Setaria viridis var, robusta-alba schreiber, Setaria viridis var, robusta-purpurea, Snowdenia polystachea, Sorghum sudanese, Alisma plantagc—aquatica, Amaranthus lividus, Amaranthus quitensis, Ammania aurículata, Ammania coccínea, Anthemis cotula, Apera spica-venti, Bacopa rotundifolia, Bidens pilosa, Bidens subalternans, Brassica tournefortii, Bromus tectorum, Camelina microcarpa, Chrysanthemum coronarium, Cuscuta campestris, Cyperus difformis, Damasonium minus, Descurainia sophia, Diplotaxis tenuifolia, Echium plantagineum, Elatine triandra var, pedicellata, Euphorbia heterophylla, Fallopia convolvulus, Fimbristylis miliacea, Galeopsis tetrahit, Galium spurium, Helianthus annuus, Iva xanthifolia, Ixophorus unisetus, Ipomoea indica, Ipomoea purpurea, Ipomoea sepiaria, Ipomoea aquatic, Ipomoea triloba, Lactuca sémola, Limnocharis flava, Limnophila erecta, Limnophila sessiliflora, Lindernia dubia, Lindernia dubia var, major, Lindernia micrantha, Lindernia procumbens, Mesembryanthemum crystallinum, Monochoria korsakowii, Monochoria vaginalis, Neslia paniculata, Papaver rhoeas, Parthenium hysterophorus, Pentzia suffruticosa, Phalaris minor, Raphanus raphanistrum, Raphanus sativus, Rapistrum rugosum, Roíala indica var, uliginosa, Sagittaría guyanensis, Sagittaría montevidensis, Sagittaría pygmaea, Salsola ibérica, Scirpus juncoides var, ohwianus, Scirpus mucronatus, Setaria lutescens, Sida spinosa, Sinapis arvensis, Sisymbrium oriéntale, Sisymbrium thellungii, Solanum ptycanthum, Sonchus asper, Sonchus oleraceus, Sorghum bicolor, Stellaria media, Thlaspi arvense, Xanthium strumaríum, Arctotheca caléndula, Conyza sumatrensis, Crassocephalum crepidiodes, Cuphea carthagenenis, Epilobium adenocaulon, Erigeron philadelphicus, Landoltia punctata, Lepidium virginicum, Monochoria korsakowii, Solanum amerícanum, Solanum nigrum, Vulpia bromoides, Youngia japónica, Hydrilla verticillata, Carduus nutans, Carduus pycnocephalus, Centaurea solstitialis, Cirsium arvense, Commelina diffusa, Convolvulus arvensis, Daucus carota, Digitaria ischaemum, Echinochloa crus-pavonis, Fimbristylis miliacea, Galeopsis tetrahit, Galium spurium, Limnophila erecta, Matricaria perfórate, Papaver rhoeas, Ranunculus acris, Soliva sessilis, Sphenoclea zeylanica, Stellaria media, Nassella trichotoma, Stipa neesiana, Agrostis stolonifera, Polygonum aviculare, Alopecurus japonicus, Beckmannia syzigachne, Bromus tectorum, Chloris Ínflate, Echinochloa erecta, Portulaca olerácea y Senecio vulgaris. Se cree que todas las plantas contienen un gen de fitoeno desaturasa en su genoma, cuya secuencia se puede aislar y los polinucleotidos se preparan de acuerdo con los métodos de la presente invención que son de utilidad para regular, suprimir o retardar la expresión del gen blanco de ACCasa en las plantas y el crecimiento o el desarrollo de las plantas tratadas.
Algunas plantas cultivadas también pueden ser plantas herbáceas cuando se producen en ambientes no deseados. Por ejemplo, las plantas de maíz que crecen en un campo de soja. Los cultivos transgénicos con una o varias tolerancias a herbicidas necesitarán métodos de control especializados para controlar malezas y plantas de cultivo voluntarias. La presente invención permite el direccionamiento de un transgen para tolerancia herbicida para permitir que las plantas tratadas se vuelvan sensibles al herbicida. Por ejemplo, las secuencias de ADN de ACCasa del transgén en eventos transgénicos que incluyen DAS-40278-9.
Un "disparador" o "polinucleótido disparador" es una molécula de polinucleótido que es homologa o complementaria a un gen de polinucleótido blanco. Las moléculas de polinucleótido disparadoras modulan la expresión del gen blanco cuando se aplican tópicamente a la superficie de una planta con un agente de transferencia, en donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ACCasa como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con una composición que contiene la molécula disparadora.
Se contempla que la composición de la presente invención contenga uno o varios polinucleótidos y herbicidas que incluyen, pero sin limitación, polinucleótidos disparadores de gen de ACCasa y un herbicida inhibidor de ACCasa y uno o varios gen de herbicida adicional de polinucleótidos disparadores blanco y los herbicidas relacionados y uno o varios polinucleótidos disparadores génicos esenciales adicionales. Los genes esenciales son genes en una planta que proporcionan enzimas clave u otras proteínas, por ejemplo, una enzima biosintética, enzima metabolizante, receptor, proteína de transducción de señales, producto génico estructural, factor de transcripción o proteína de transporte; o ARN de regulación, tales como, microAARN, que son esenciales para el crecimiento o la supervivencia del organismo o célula o están implicados en el crecimiento normal y desarrollo de la planta (Meinke, et al., Trends Plant Sci. 2008 Sep;13(9):483-91). La supresión de un gen esencial mejora el efecto de un herbicida que afecta la función de un producto génico diferente del gen esencial suprimido. Las composiciones de la presente invención pueden incluir diversos polinucleótidos disparadores que modulan la expresión de un gen esencial distinto de ACCasa.
Los herbicidas para los cuales se demostraron los transgenes para tolerancia de plantas y el método de la presente invención pueden aplicarse, incluyen, pero sin limitación: herbicidas de tipo auxina, glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinilo, delapon, dicamba, ciclohexandiona, inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa, herbicidas inhibidores de 4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa. Por ejemplo, transgenes y sus moléculas de polinucleótido que codifican proteínas incluidas en la tolerancia a herbicidas son conocidos en el arte e incluyen, pero sin limitación, una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), por ejemplo, como se describe más exhaustivamente en las patentes U. S. Nros. 7.807.791 (SEQ ID NO:5); 6.248.876 B1 , 5.627.061 , 5.804.425, 5.633.435, 5.145.783, 4.971.908, 5.3072.910, 5.188.642, 4.940.835, 5.866.775, 6.225.114 B1 , 6.130.366, 5.3070.667, 4.535.060, 4.769.061 , 5.633.448, 5.510.471, patente U. S. N 0 RE 36.449; patentes U. S. Nros. RE 37.287 E y 5.491.288; tolerancia a sulfonilurea y/o imidazolinona, por ejemplo, tal como se describe más exhaustivamente en las patentes U. S. Nros. 5.605.011 , 5.013.659, 5.141.870, 5.767.361 , 5.7307.180, 5.304.732, 4.761.373, 5.3307.107, 5.928.937 y 5.378.824, y la publicación internacional WO 96/33270; tolerancia a herbicidas inhibidores de hidroxifenilpiruvatodioxigenasas en plantas se describen described en las patentes U. S. Nros. 6.245.968 B1 , 6.268.549 y 6.069.115; publicación de patente U. S. 20110191897 y US 7.3072.379 SEQ ID NO:3; US 7.935.869, US 7.304.209, SEQ ID NO:1 , 3, 5 y 15; polinucleótidos de ariloxialcanoato dioxigenasa, que confieren tolerancia a 2,4-D y otros herbicidas de fenoxiauxina, así como herbicidas de ariloxifenoxipropionato tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2005/107437; US 7.838.733 SEQ ID NO:5;) y polinucleótidos tolerantes a dicamba tal como se describe, por ejemplo, en Hermán et al. (2005) J. Biol. Chem. 280: 24759-24767. Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas incluyen aquellos conferidos a polinucleótidos que codifican una fosfinotricina acetiltransferasa exógena, tal como se describe en las patentes U. S. Nros. 5.969.213, 5.489.520, 5.550.3078, 5.874.265, 5.919.675, 5.561.236, 5.648.477, 5.646.024, 6.177.616 y 5.879.903. Las plantas que contienen una fosfinotricina acetiltransferasa exógena pueden exhibir mejor tolerancia a herbicidas de glufosinato, que inhiben la enzima glutamina sintasa. Adicionalmente, los polinucleótidos de tolerancia a herbicidas incluyen aquellos conferidos por polinucleótidos que confieren actividad alterada de protoporfirinógeno oxidasa (protox), tal como se describe en las patentes U. S. Nros. 6.288.306 B1 , 6.282.837 B1 y 5.767.373 y WO 01/12825. Las plantas que contienen estos polinucleótidos pueden exhibir mejor tolerancia a cualquiera de una variedad de herbicidas que se dirigen a la enzima protox (también mencionada como inhibidores de protox). Los polinucleótidos que codifican una glifosato oxidorreductasa y una glifosato-N-acetiltransferasa (GOX descrita en la patente U. S. 5.463.175 y GAT descrito en la publicación de patente U. S. 20030083480, dicamba monooxigenasa publicación de patente U. S. 20030135879, todos los cuales se incorporan en la presente por referencia); una molécula de polinucleótido que codifica la bromoxinilo nitrilasa (Bxn descrito en la patente U. S. N.° 4.810.648 para tolerancia a Bromoxinilo, que se incorpora en la presente por referencia); una molécula de polinucleótido que codifica fitoeno desaturasa (crtl) describía en Misawa et al, (1993) Plant J. 4:833-840 y Misawa et al, (1994) Plant J. 6:481-489 para tolerancia a norflurazona; una molécula de polinucleótido que codifica acetohidroxiácido sintasa (AHAS, aka ALS) descrita en Sathasiivan et al. (1990) Nucí. Acids Res. 18:3078-2193 para la tolerancia a sulfonilherbicidas de urea; y el gen bar descrito en DeBlock, et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2519 para la tolerancia a glufosinato y bialafos. Las regiones codificantes transgénicas y elementos de regulación de los genes de tolerancia a herbicidas son blancos en los que se pueden incluir polinucleótidos disparadores y herbicidas en la composición de la presente invención.
La composición de la presente invención incluye un componente que es un herbicida inhibidor de ACCasa, el cual incluye miembros de las familias químicas de ariloxifenoxipropionatos, ciclohexandionas y fenilpirazolina que incluyen, aunque sin limitarse a un ariloxifenoxipropionato que comprende clodinafop (ácido propanoico, éster de 2-[4-[(5-cloro-3-fluor-2-piridinil)oxi]fenoxi]-,2-propinilo, (2R)), cihalofop (butil(2R)-2-[4-(4-ciano-2-fluorofenoxi)fenoxi] propionato), diclofop (metil 2-[4-(2,4-diclorofenoxi)fenoxi]propanoato), fenoxaprop (etil (R)-2-[4-(6-cloro-1 ,3-benzoxazol-2-iloxi)fenoxi]propionato), fluazifop ácido (2f?)-2-[4-[[5-(trifluormetil)-2-piridinil]oxi]fenoxi]propanoico), haloxifop (ácido 2-[4-[[3-cloro-5-(trifluormetil)-2-piridinil]oxi]fenoxi]propanoico), propaquizafop (2-[[(1-metiletiliden)amino]oxi]etil (2R)-2-[4-[(6-cloro-2quinoxalinil)oxi]fenoxi]propanoato) y quizalofop (ácido 2f?)-2-[4-[(6-cloro-2-quinoxalinil)oxi]fenoxi]propanoico; una ciclohexandiona que comprende aloxidim (metil 2,2-dimetil-4,6-dioxo-5-[(1E)-1-[(2-propen-1-iloxi)imino]butil]ciclohexancarboxilato), butroxidim (2-[1-(etoxiimino)propil]-3- hidroxi-S-^^.e-tnmetil-S-íl-oxobutilJfenill- -cicIohexen-l-ona), cletodim (2-[1-[[[(2£)-3-cloro-2-propen-1-il]oxi]imino]propil]-5-[2-(et¡ltio)prop¡l]-3-hidroxi-2-c¡clohexen-1-ona), cicloxidim (2-[1-(etoxümino)butil]-3-hidroxi-5-(tetrahidro-2/-/-tiopiran-3-il)-2-ciclohexen-1-ona), profoxidim (2-[1-[[2-(4-clorofenoxi)propoxi]¡m¡no]butil]-3-hidroxi-5-(tetrahidro-2H-tiopiran-3-¡l)-2-ciclohexen-1-ona), setoxidim (2-[1-(etoxi¡mino)butil]-5-[2-(etiltio)prop¡l]-3-h¡drox¡-2-ciclohexen-1-ona), tepraloxidim (2-[1-[[[(2£)-3-cloro-2-propen-1-il]oxi]imino]propil]-3-h¡drox¡-5-(tetrahidrc^^ ona) y tralcoxidim (2-[1-(etoxiimino)propil]-3-h¡droxi-5-(2,4,6-trimet¡lfenil)-2-c¡clohexen-1-ona); una fenilpirazolina que comprende pinoxaden (8-(2,6-dietil— 4— metilfenil)— 1 ,2,4,5-tetrahidro-7-oxo-7/-/-p¡razolo[1 ,2-d][1 ,4,5]oxadiazepin-9-il 2,2-dimetilpropanoato).
Numerosos herbicidas con modos de acción similares o diferentes (en la presente, mencionados como coherbicidas) están disponibles, que se pueden añadir a la composición de la presente invención, por ejemplo, miembros de las familias de herbicidas que incluyen, pero sin limitación, herbicidas de amida, herbicidas de ácidos aromáticos, herbicidas de arsénico, herbicidas de benzotiazol, herbicidas de benzoilciclohexandiona, herbicidas de benzofuranilalquilsulfonato, herbicidas de carbamato, herbicidas de ciclohexenoxima, herbicidas de ciclopropilisoxazol, herbicidas de dicarboximida, herbicidas de dinitroanilina, herbicidas de dinitrofenol, herbicidas de éter difenílico, herbicidas de ditiocarbamato, herbicidas alifáticos halogenados, herbicidas de imidazolinona, herbicidas inorgánicos, herbicidas de nitrito, herbicidas de organofosforo, herbicidas de oxadiazolona, herbicidas de oxazol, herbicidas de fenoxi, herbicidas de fenilendiamina, herbicidas de pirazol, herbicidas de piridazina, herbicidas de piridazinona, herbicidas de piridina, herbicidas de pirimidindiamina, herbicidas de pirimidiniloxibencilamina, herbicidas de amonio cuaternario, herbicidas de tiocarbamato, herbicidas de tiocarbonato, herbicidas de tiourea, herbicidas de triazina, herbicidas de triazinona, herbicidas de triazol, herbicidas de triazolona, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de uracilo y herbicidas de urea. En particular, las tasas de uso de los herbicidas añadidos se pueden reducir en composiciones que comprenden los polinucleótidos de la invención. Las reducciones en la tasa de uso de los herbicidas añadidos adicionales pueden ser del 10-25%, 26-50%, 51-75% o más que mejoran la actividad de los polinucleótidos y composición herbicida y se contempla como un aspecto de la invención. Los coherbicidas representativos de las familias incluyen, pero sin limitación, acetoclor, acifluorfeno, acifluorfeno-sodio, aclonifeno, acroleína, alaclor, aloxidim, alcohol alílico, ametrina, amicarbazona, amidosulfurona, aminopiralida, amitrol, sulfamato de amonio, anilofos, asulam, atraton, atrazina, azimsulfurona, BCPC, beflubutamida, benazolina, benfluralina, benfuresato, bensulfurona, bensulfurona-metilo, bensulide, bentazona, benzfendizona, benzobiciclona, benzofenap, bifenox, bilanafos, bispiribac, bispiribac-sodio, bórax, bromadlo, bromobutide, bromoxinilo, butaclor, butafenacilo, butamifos, butralina, butroxidim, butilato, ácido cacodílico, clorato de calcio, cafenstrol, carbetamida, carfentrazona, carfentrazona-etilo, CDEA, CEPC, clorflurenol, clorflurenol-metilo, cloridazona, clorimurona, clorimurona-etilo, ácido cloroacético, clorotolurona, clorprofam, clorsulfurona, clortal, clortal-dimetilo, cinidona-etilo, cinmetilina, cinosulfurona, cisanilida, cletodim, clodinafop, clodinafop-propargilo, clomazona, clomeprop, clopiralida, cloransulam, cloransulam-metilo, CMA, 4-CPB, CPMF, 4-CPP, CPPC, cresol, cumilurona, cianamida, cianazina, cicloato, ciclosulfamurona, cicloxidim, cihalofop, cihalofop-butilo, 2,4-D, 3,4-DA, daimurona, dalapon, dazomet, 2,4-DB, 3,4-DB, 2,4-DEB, desmedifam, dicamba, diclobenilo, orto-diclorobenceno, para-diclorobenceno, diclorprop, diclorprop-P, diclofop, diclofop-metilo, diclosulam, difenzoquat, metilsulfato de difenzoquat, diflufenicano, diflufenzopir, dimefurona, dimepiperato, dimetaclor, dimetametrina, dimetenamida, dimetenamida-P, dimetipina, ácido dimetilarsínico, dinitramina, dinoterb, difenamida, diquat, dibromuro de diquat, ditiopir, diurona, DNOC, 3,4-DP, DS A, EBEP, endotal, EPTC, esprocarb, etalfluralina, etametsulfurona, etametsulfurona-metilo, etofumesato, etoxifeno, etoxisulfurona, etobenzanida, fenoxaprop-P, fenoxaprop-P-etilo, fentrazamida, sulfato ferroso, flamprop-M, flazasulfurona, florasulam, fluazifop, fluazifop-butilo, fluazifop-P, fluazifop-P-butilo, flucarbazona, flucarbazona-sodio, flucetosulfurona, flucloralina, flufenacet, flufenpir, flufenpir-etilo, flumetsulam, flumiclorac, flumiclorac-pentilo, flumioxazina, fluometurona, fluoroglicofeno, fluoroglicofeno-etilo, flupropanato, flupirsulfurona, flupirsulfurona-metilo-sodio, flurenol, fluridona, fluorocloridona, fluoroxipir, flurtamona, flutiacet, flutiacet-metilo, fomesafeno, foramsulfurona, fosamina, glufosinato, glufosinato-amonio, glifosato, halosulfurona, halosulfurona-metilo, haloxifop, haloxifop-P, HC-252, hexazinona, imazametabenz, imazametabenz-metilo, ¡mazamox, imazapic, imazapir, imazaquina, imazetapir, imazosulfurona, indanofano, yodometano, yodosulfurona, yodosulfurona-metil-sodio, ioxinilo, isoproturona, isourona, isoxabeno, isoxaclortol, isoxaflutol, carbutilato, lactofeno, leñadlo, linurona, MAA, MAMA, MCPA, MCPA-tioetilo, MCPB, mecoprop, mecoprop-P, mefenacet, mefluiduro, mesosulfurona, mesosulfurona-metilo, mesotriona, metam, metamifop, metamitrona, metazaclor, metabenztiazurona, ácido metílarsónico, metildimrona, isotiocianato de metilo, metobenzurona, metolaclor, S-metolaclor, metosulam, metoxurona, metribuzina, metsulfurona, metsulfurona-metilo, MK-66, molinato, monolinurona, MSMA, naproanilida, napropamida, naptalam, neburona, nicosulfurona, ácido nonanoico, norflurazona, ácido oleico (ácidos grasos), orbencarb, ortosulfamurona, orizalina, oxadiargilo, oxadiazona, oxasulfurona, oxaziclomefona, oxifluorfeno, paraquat, dicloruro de paraquat, pebulate, pendimetalina, penoxsulam, pentaclorofenol, pentanoclor, pentoxazona, petoxamida, aceites de petróleo, fenmedifam, fenmedifam-etilo, picloram, picolinafeno, pinoxadeno, piperofos, arsenito de potasio, azida de potasio, pretilaclor, primisulfurona, primisulfurona-metilo, prodiamina, profluazol, profoxidim, prometona, prometrina, propaclor, propanilo, propaquizafop, propazina, profam, propisoclor, propoxicarbazona, propoxicarbazona-sodio, propizamida, prosulfocarb, prosulfurona, piraclonilo, piraflufeno, piraflufeno-etilo, pirazolinato, pirazosulfurona, pirazosulfurona-etilo, pirazoxifeno, piribenzoxim, piributicarb, piridafol, piridato, piriftalida, piriminobac, piriminobac-metilo, pirimisulfano, piritiobac, piritiobac-sodio, quinclorac, quinmerac, quinoclamina, quizalofop, quizalofop-P, rimsulfurona, setoxidim, sidurona, simazina, simetrina, SMA, arsenito de sodio, azida de sodio, clorato de sodio, sulcotriona, sulfentrazona, sulfometurona, sulfometurona-metilo, sulfosato, sulfosulfurona, ácido sulfúrico, aceites de alquitrán, 2,3,6-TBA, TCA, TCA-sodio, tebutiurona, tepraloxidim, terbacilo, terbumetona, terbutilazina, terbutrina, tenilclor, tiazopir, tifensulfurona, tifensulfurona-metilo, tiobencarb, tiocarbazilo, topramezona, tralcoxidim, tri-alato, triasulfurona, triaziflam, tribenurona, tribenurona-metilo, tricamba, triclopir, trietazina, trifloxisulfurona, trifloxisulfurona-sodio, trifluralina, triflusulfurona, triflusulfurona-metilo, trihidroxitriazina, tritosulfurona, éster etílico del ácido [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(-metil-6-trifluorometil-2,4- lioxo-1 ,2,3,4-tetrahidropirimidin-3-il)fenoxi]-^ pirifiloxi]acético (CAS RN 353292-3-6), ácido 4-[(4,5-dihidro-3-metoxi-4-metil-5-oxo)-H-2,4-triazol-ilcarbonil- sulfamoil]-5-metiltiofen-3-carboxílico (BAY636), BAY747 (CAS RN 33504-84-2), topramezona (CAS RN 2063-68-8), 4-hidroxi-3-[[2-[(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluoro-metil)-3-piridinil]carbonil]-b¡ciclo[3.2.]oct-3-en-2-ona (CAS RN 35200-68-5) y 4-hidroxi-3-[[2-(3-metoxipropil)-6-(difluorometil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.]oct-3-en-2-ona. Adicionalmente, incluyendo los compuestos herbicidas de modos de acción inespecíficas tal como se describe en los documentos CN 101279950A, CN 101279951 A, DE 10000600A1 , DE 10116399A1, DE 102004054666A1 , DE 102005014638A1 , DE 102005014906A1 , DE 102007012168A1 , DE 102010042866A1 , DE 10204951 A1 , DE 10234875A1, DE 10234876A1 , DE 10256353A1, DE 10256354A1 , DE 10256367A1 , EP 1157991A2, EP 1238586A1 , EP 2147919A1 , EP 2160098A2, JP 03968012B2, JP 2001253874A, JP 2002080454A, JP 2002138075A, JP 2002145707A, JP 2002220389A, JP 2003064059A, JP 2003096059A, JP 2004051628A, JP 2004107228A, JP 2005008583A, JP 2005239675A, JP 2005314407A, JP 2006232824A, JP 2006282552A, JP 2007153847A, JP 2007161701 A, JP 2007182404A, JP 2008074840A, JP 2008074841 A, JP 2008133207A, JP 2008133218A, JP 2008169121A, JP 2009067739A, JP 2009114128A, JP 2009126792A, JP 2009137851A, US 20060111241 A1, US 20090036311 A1 , US 20090054240 A1, US 20090215628 A1 , US 20100099561 A1 , US 20100152443 A1, US 20110105329 A1 , US 20110201501 A1 , WO 2001055066 A2, WO 2001056975 A1 , WO 2001056979 A1 , WO 2001090071 A2, WO 2001090080 A1 , WO 2002002540 A1, WO 2002028182 A1 , WO 2002040473 A1 , WO 2002044173 A2, WO 2003000679 A2, WO 2003006422 A1 , WO 2003013247 A1, WO 2003016308 A1, WO 2003020704 A1 , WO 2003022051 A1 , WO 2003022831 A1, WO 2003022843 A1 , WO 2003029243 A2, WO 2003037085 A1, WO 2003037878 A1, WO 2003045878 A2, WO 2003050087 A2, WO 2003051823 A1, WO 2003051824 A1, WO 2003051846 A2, WO 2003076409 A1 , WO 2003087067 A1 , WO 2003090539 A1 , WO 2003091217 A1 , WO 2003093269 A2, WO 2003104206 A2, WO 2004002947 A1 , WO 2004002981 A2, WO 2004011429 A1, WO 2004029060 A1, WO 2004035545 A2, WO 2004035563 A1, WO 2004035564 A1, WO 2004037787 A1, WO 2004067518 A1, WO 2004067527 A1, WO 2004077950 A1, WO 2005000824 A1, WO 2005007627 A1, WO 2005040152 A1, WO 2005047233 A1, WO 2005047281 A1, WO 2005061443 A2, WO 2005061464 A1, WO 2005068434 A1, WO 2005070889 A1, WO 2005089551 A1, WO 2005095335 A1, WO 2006006569 A1, WO 2006024820 A1, WO 2006029828 A1, WO 2006029829 A1, WO 2006037945 A1, WO 2006050803 A1, WO 2006090792 A1, WO 2006123088 A2, WO 2006125687 A1, WO 2006125688 A1, WO 2007003294 A1, WO 2007026834 A1 , WO 2007071900 A1 , WO 2007077201 A1 , WO 2007077247 A1, WO 2007096576 A1, WO 2007119434 A1, WO 2007134984 A1, WO 2008009908 A1, WO 2008029084 A1, WO 2008059948 A1, WO 2008071918 A1, WO 2008074991 A1, WO 2008084073 A1. WO 2008100426 A2, WO 2008102908 A1, WO 2008152072 A2, WO 2008152073 A2, WO 2009000757 A1, WO 2009005297 A2, WO 2009035150 A2, WO 2009063180 A1, WO 2009068170 A2, WO 2009068171 A2, WO 2009086041 A1, WO 2009090401 A2, WO 2009090402 A2, WO 2009115788 A1, WO 2009116558 A1, WO 2009152995 A1, WO 2009158258 A1, WO 2010012649 A1, WO 2010012649 A1, WO 2010026989 A1, WO 2010034153 A1, WO 2010049270 A1, WO 2010049369 A1, WO 2010049405 A1, WO 2010049414 A1, WO 2010063422 A1, WO 2010069802 A1, WO 2010078906 A2, WO 2010078912 A1, WO 2010104217 A1, WO 2010108611 A1, WO 2010112826A3, WO 2010116122A3, WO 2010119906 A1, WO 2010130970 A1, WO 2011003776 A2, WO 2011035874 A1 , WO 201106545 A1, todos los cuales se incorporan en la presente por referencia.
Un campo agronómico que necesita control de plantas se trata por aplicación de la composición de la presente invención directamente a la superficie de las plantas en crecimiento, tales como por un spray. Por ejemplo, el método se aplica para controlar malezas en un campo de plantas de cultivo por pulverización del campo con la composición. La composición se puede proporcionar como una mezcla en tanque, un tratamiento secuencial de componentes (en general, el polinucleótido que contiene la composición seguido del herbicida) o un tratamiento simultáneo o mezcla de uno o varios de los componentes de la composición de recipientes separados. El tratamiento del campo se puede producir tantas veces como sea necesario para proporcionar un control de malezas y los componentes de la composición se pueden ajustar para dirigirse a especies de malezas específicas o familias de malezas por utilización de polinucleótidos específicas o composiciones de polinucleótidos capaces de dirigirse selectivamente a las especies específicas o familia de plantas por controlar. La composición se puede aplicar en tasas de uso efectivas de acuerdo con el tiempo de aplicación en el campo, por ejemplo, preplantado, durante el plantado, después del plantado, después de la cosecha. Los herbicidas inhibidores de ACCasa se pueden aplicar a un campo con tasas de 10 a 500 g ai/ha (ingrediente activo por hectárea) o más. Los polinucleótidos de la composición se pueden aplicar en tasas de 1 a 30 gramos por acre según la cantidad de moléculas disparadoras necesarias para el alcance de malezas en el campo.
Las plantas de cultivo en las que se necesita control de malezas incluyen, pero sin limitación, i) maíz, soja, algodón, cañóla, remolacha, alfalfa, caña de azúcar, arroz y trigo; ii) plantas vegetales que incluyen, pero sin limitación, tomate, pimiento morrón, pimiento picante, melón, sandía, pepino, berenjena, coliflor, brócoli, lechuga, espinaca, cebolla, judías, zanahorias, maíz dulce, repollo chino, puerro, hinojo, calabaza o zapallo, rábano, repollos de Bruselas, tomatillo, alubias, frijoles secos o quimbombó; Ni) plantas culinarias que incluyen, pero sin limitación, albahaca, perejil, café o té; o iv) plantas frutales que incluyen, pero sin limitación, manzana, pera, cereza, durazno, ciruela, damasco, banana, plátano, uva de mesa, uva, cítricos, aguacate, mango o bayas; v) un árbol crecido para uso ornamental o comercial, que incluyen, pero sin limitación, un árbol frutal o nogal; o vi) una planta ornamental (por ejemplo, una planta de flor ornamental o arbusto o césped). Los métodos y composiciones proporcionados en la presente también se pueden aplicar a plantas producidas por un proceso de corte, clonación o injerto (es decir, una planta no crecida de una semilla) incluyen árboles frutales y plantas que incluyen, pero sin limitación, cítricos, manzanas, aguacates, tomates, berenjena, pepino, melones, sandias y uvas, así como diversas plantas ornamentales.
Mezclas pesticidas Las composiciones de polinucleótido también se pueden usar como mezclas con diversos productos químicos agrícolas y/o agentes insecticidas, miticidas y fungicidas, pesticidas y biopesticidas. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, azinfos-metilo, acefato, isoxationa, isofenfos, etiona, etrinfos, oxidemetona-metilo, oxideprofos, quinalfos, clorpirifos, clorpirifos-metilo, clorfenvinfos, cianofos, dioxabenzofos, diclorvos, disulfotona, dimetilvinfos, dimetoato, sulprofos, diazinona, tiometona, tetraclorvinfos, temefos, tebupirinfos, terbufos, naled, vamidotiona, piraclofos, piridafentiona, pirimifos-metilo, fenitrotiona, fentiona, fentoato, flupirazofos, protiofos, propafos, profenofos, foxima, fosalona, fosmet, formotiona, forato, malationa, mecarbam, mesulfenfos, metamidofos, metidationa, parationa, metilparationa, monocrotofos, triclorfona, EPN, isazofos, ¡samidofos, cadusafos, diamidafos, diclofentiona, tionazina, fenamifos, fostiazato, fostietano, fosfocarb, DSP, etoprofos, alanicarb, aldicarb, isoprocarb, etiofencarb, carbarilo, carbosulfano, xililcarb, tiodicarb, pirimicarb, fenobucarb, furatiocarb, propoxur, bendiocarb, benfuracarb, metomilol, metolcarb, XMC, carbofurano, aldoxicarb, oxamilo, acrinatrina, aletrina, esfenvalerato, empentrina, cicloprotrina, cihalotrina, gamma-cihalotrina, lambda-cihalotrina, ciflutrina, beta-ciflutrina, cipermetrina, alfa-cipermetrina, zeta-cipermetrina, silafluofeno, tetrametrina, teflutrina, deltametrina, tralometrina, bifentrina, fenotrina, fenvalerato, fenpropatrina, furametrina, praletrina, flucitrinato, fluvalinato, flubrocitrinato, permetrina, resmetrina, etofenprox, cartap, tiociclam, bensultap, acetamiprid, imidacloprid, clotianidina, dinotefurano, tiacloprid, tiametoxam, nitenpiram, clorfluazurona, diflubenzurona, teflubenzurona, triflumurona, novalurona, noviflumurona, bistrifluorona, fluazurona, flucicloxurona, flufenoxurona, hexaflumurona, lufenurona, cromafenozida, tebufenozida, halofenozida, metoxifenozida, diofenolano, ciromazina, piriproxifeno, buprofezina, metopreno, hidropreno, quinopreno, triazamato, endosulfano, clorfensona, clorobencilato, dicofol, bromopropilato, acetoprol, fipronilo, etiprol, piretrina, rotenona, sulfato de nicotina, agente BT (Bacillus thuringiensis), espinosad, abamectina, acequinocilo, amidoflumet, amitraz, etoxazol, quinometionato, clofentezina, óxido de fenbutatina, dienoclor, cihexatina, espirodiclofeno, espiromesifeno, tetradifona, tebufenpirad, binapacrilo, bifenazato, piridabeno, pirimidifeno, fenazaquina, fenotiocarb, fenpiroximato, fluacripirim, fluazinam, flufenzina, hexitiazox, propargita, benzomato, complejo de polinactina, milbemectina, lufenurona, mecarbam, metiocarb, mevinfos, halfenprox, azadiractina, diafentiurona, indoxacarb, benzoato de emamectina, oleato de potasio, oleato de sodio, clorfenapir, tolfenpirad, pimetrozina, fenoxicarb, hidrametilnona, almidón de hidroxipropilo, piridalilo, flufenerim, flubendiamida, flonicamida, metaflumizol, lepimectina, TPIC, albendazol, oxibendazol, oxfendazol, triclamida, fensulfotiona, fenbendazol, clorhidrato de levamisol, tartrato de morantel, dazomet, metam-sodio, triadimefona, hexaconazol, propiconazol, ipconazol, procloraz, triflumizol, tebuconazol, epoxiconazol, difenoconazol, flusilazol, triadimenol, ciproconazol, metconazol, fluquinconazol, bitertanol, tetraconazol, triticonazol, flutriafol, penconazol, diniconazol, fenbuconazol, bromuconazol, imibenconazol, simeconazol, miclobutanilo, himexazol, imazalilo, furametpir, tifluzamida, etridiazol, oxpoconazol, fumarato de oxpoconazol, pefurazoato, protioconazol, pirifenox, fenarimol, nuarimol, bupirimato, mepanipirim, ciprodinilo, pirimetanilo, metalaxilo, mefenoxam, oxadixilo, benalaxilo, tiofanato, tiofanato-metilo, benomilo, carbendazim, fuberidazol, tiabendazol, manzeb, propineb, zineb, metiram, maneb, ziram, tiuram, clorotalonilo, etaboxam, oxicarboxina, carboxina, flutolanilo, siltiofam, mepronilo, dimetomorf, fenpropidina, fenpropimorf, espiroxamina, tridemorf, dodemorf, flumorf, azoxistrobina, cresoxim-metilo, metominostrobina, orisastrobina, fluoxastrobina, trifloxistrobina, dimoxistrobina, piraclostrobina, picoxistrobina, iprodiona, procimidona, vinclozolina, clozolinato, flusulfamida, dazomet, isotiocianato de metilo, cloropicrina, metasulfocarb, hidroxiisoxazol, hidroxiisoxazol de potasio, ecomezol, D-D, carbam, cloruro de cobre básico, sulfato de cobre básico, nonilfenolsulfonato de cobre, oxina cobre, DBEDC, sulfato de cobre anhidro, sulfato de cobre pentahidrato, hidróxido cúprico, azufre inorgánico, azufre humectable, azufre de cal, sulfato de zinc, fentina, hidrógeno-carbonato de sodio, hidrógeno-carbonato de potasio, hipoclorito de sodio, plata, edifenfos, tolclofos-metilo, fosetilo, iprobenfos, dinocap, pirazofos, carpropamida, ftalida, triciclazol, piroquilona, diclocimet, fenoxanilo, casugamicina, validamicina, polioxinas, blasticideno S, oxitetraciclina, mildiomicina, estreptomicina, aceite de colza, aceite de máquina, bentiavalicarbisopropilo, iprovalicarb, propamocarb, dietofencarb, fluoroimida, fludioxanilo, fenpiclonilo, quinoxifeno, ácido oxolínico, clorotalonilo, captano, folpet, probenazol, acibenzolar-S-metilo, tiadinilo, ciflufenamida, fenhexamida, diflumetorim, metrafenona, picobenzamida, proquinazida, famoxadona, ciazofamida, fenamidona, zoxamida, boscalida, cimoxanilo, ditianona, fluazinam, diclofluanida, triforina, isoprotiolano, ferimzona, diclomezina, tecloftalam, pencicurona, quinometionato, acetato de iminoctadina, albesilato de iminoctadina, ambam, policarbamato, tiadiazina, cloroneb, dimetilditiocarbamato de níquel, guazatina, acetato de dodecilguanidina, quintoceno, tolilfluanida, anilazina, nitrotalisopropilo, fenitropano, dimetirimol, bentiazol, proteína harpina, flumetover, mandipropamida y pentiopirad.
Polinucleótidos Tal como se usa en la presente, la expresión "ADN", "molécula de ADN", "molécula de polinucleótido de ADN" se refiere a una molécula de ADN monocatenaria (ssADN) o ADN bicatenaria (dsADN) de origen genómico o sintético, tales como un polímero de bases de desoxirribonucleótido o una molécula de polinucleótido de ADN. Tal como se usa en la presente, la expresión "secuencia de ADN", "secuencia de nucleótido de ADN" o "secuencia de polinucleótido de ADN" se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. Tal como se usa en la presente, la expresión "ARN", "molécula de ARN", "molécula de polinucleótido de ARN" se refiere a una molécula de ARN monocaternaria (ssARN) o una molécula de ARN bicatenaria (dsARN) de origen genómico o sintético, tales como un polímero de bases de ribonucleótido que comprenden regiones monocatenarias o bicatenarias. A menos que se establezca otra cosa, las secuencias de nucleótidos en el texto de esta memoria descriptiva se brindan cuando se lee de izquierda a derecha en la dirección 5' a 3'. La nomenclatura usada en la presente es aquella requerida por el título 37 del Código de los Estados Unidos de Regulaciones Federales § 1.822 y establecida en los cuadros en WIPO Standard ST.25 (1998), Apéndice 2, Cuadros 1 y 3.
Tal como se usa en la presente, "polinucleótido" se refiere a una molécula de ADN o ARN que contiene múltiples nucleótidos y en general se refiere tanto a "oligonucleótidos" (una molécula de polinucleótido de típicamente 50 o menos nucleótidos de longitud) como a polinucleótidos de 51 o más nucleótidos. Las modalidades de esta invención incluyen composiciones que incluyen oligonucleótidos que tienen una longitud de 18-25 nucleótidos (18-meros, 19-meros, 20-meros, 21-meros, 22-meros, 23-meros, 24-meros o 25-meros), por ejemplo, oligonucleótidos (SEQ ID NO:3901-4530 o sus fragmentos o polinucleótidos de longitud media que tienen una longitud de 26 o más nucleótidos (polinucleótidos de 26, 27, 28, 29, 30, 307, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 260, aproximadamente 270, aproximadamente 280, aproximadamente 290 o aproximadamente 300 nucleótidos), por ejemplo, (oligonucleótidos SEQ ID NO: 93-3900) o sus fragmentos o polinucleótidos largos que tienen una longitud más largo de aproximadamente 300 nucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de entre aproximadamente 300 y aproximadamente 400 nucleótidos, entre aproximadamente 400 y aproximadamente 500 nucleótidos, entre aproximadamente 500 y aproximadamente 600 nucleótidos, entre aproximadamente 600 y aproximadamente 700 nucleótidos, entre aproximadamente 700 y aproximadamente 800 nucleótidos, entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 nucleótidos, entre aproximadamente 900 y aproximadamente 1000 nucleótidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 500 nucleótidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 600 nucleótidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 700 nucleótidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 800 nucleótidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 900 nucleótidos o aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud o incluso más de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo, hasta la longitud entera de un gen blanco que incluye las porciones codificantes o no codificantes o ambas del gen blanco), por ejemplo, polinucleótidos del Cuadro 1 (SEQ ID NO: 1-93), en donde los polinucleótidos seleccionados o sus fragmentos son homólogos o complementarios a la SEQ ID NO:1-93 suprime, reprime o demora de otro modo la expresión del gen blanco de ACCasa. Un gen blanco comprende cualquier molécula de polinucleótido en una célula de planta o su fragmento para los que la modulación de la expresión del gen blanco es proporcionado por los métodos y composiciones de la presente invención. Cuando un polinucleótido es bicatenario, su longitud puede describirse de forma similar en términos de pares de bases. Los oligonucleótidos y polinucleótidos de la presente invención se pueden preparar, que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios a los elementos genéticos adyacentes de un gen, por ejemplo, que abarca la región de unión de un intrón y exón, la región de unión de un promotor y una región transcripta, la región de unión de una secuencia líder 5' y una secuencia codificante, la unión de una región no traducida 3' y una secuencia codificante.
Las composiciones de polinucleótido usadas en las diversas modalidades de esta invención incluyen composiciones que incluyen oligonucleótidos o polinucleótidos o una mezcla de ambos, incluyendo ARN o ADN o híbridos de ARN/ADN u oligonucleótidos o polinucleótidos químicamente modificados o una mezcla de ellos. En algunas modalidades, el polinucleótido puede ser una combinación de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, por ejemplo, polinucleótidos sintéticos que consisten principalmente ribonucleótidos pero con uno o varios deoxiribonucleótidos terminales o polinucleótidos sintéticos que consisten principalmente en desoxirribonucleótidos pero con uno o varios didesoxirribonucleótidos terminales. En algunas modalidades, el polinucleótido incluye nucleótidos no canónicos tales como inosina, tiouridina o pseudouridina. En algunas modalidades, el polinucleótido incluye nucleótidos químicamente modificados. Los ejemplos de oligonucleótidos o polinucleótidos químicamente modificados son bien conocidos en el arte; ver, por ejemplo, la publicación de patente U. S. 20110171287, la publicación de patente U. S. 20110171176 y la publicación de patente U. S. 20 10152353, la publicación de patente U. S. 20110152346, publicación de patente U. S. 20110160082, incorporadas en la presente por referencia. Por ejemplo, incluyen, pero sin limitación, la estructura de fosfodiéster natural de un oligonucleótido o polinucleótido puede estar parcial o completamente modificado con modificaciones de ligación de internucleótido de fosforotioato, fosforad itioato o metilfosfonato, se pueden usar bases de nucleósidos modificados o azúcares modificados en la síntesis de oligonucleótidos o polinucleótidos y oligonucleótidos o polinucleótidos se pueden rotular con un resto fluorescente (por ejemplo, fluoresceína o rodamina) u otro rótulo (por ejemplo, biotina).
Los polinucleótidos pueden ser ARN monocatenario o bicatenario o un ADN monocatenario o bicatenario o híbridos de ADN/ARN bicatenarios o sus análogos modificados y pueden tener longitudes de oligonucleótidos o más. En algunas modalidades más específicas de la invención, los polinucleótidos que proporcionan ARN monocatenarios en la célula de planta están seleccionados del grupo que consiste en (a) una molécula de ARN monocatenario (ssARN), (b) una molécula de ARN monocatenana que se autohibrida para formar una molécula de ARN bicatenaria, (c) una molécula de ARN bicatenaria (dsARN), (d) una molécula de ADN monocatenaria (ssADN), (e) una molécula de ADN monocatenana que se autohibrida para formar una molécula de ADN bicatenaria y (f) una molécula de ADN monocatenaria que incluye un gen Pol III modificado que se transcribe en una molécula de ARN, (g) una molécula de ADN bicatenaria (dsADN), (h) una molécula de ADN bicatenaria que incluye un gen Pol III modificado que se transcribe en una molécula de ARN, (i) una molécula de ARN/ADN hibridada bicatenaria o combinaciones de ellas. En algunas modalidades, estos polinucleótidos incluyen nucleótidos o nucleótidos no canónicos químicamente modificados. En algunas modalidades, los oligonucleótidos pueden tener extremos romos o pueden comprender una saliente 3' de 1-5 nucleótidos de al menos una o las dos cadenas. Otras configuraciones de los oligonucleótidos se conocen en el campo y se contemplan en la presente. En modalidades del método, los polinucleótidos incluyen ADN bicatenario formado por hibridación intramolecular, ADN bicatenario formado por hibridación intermolecular, ARN bicatenario formado por hibridación intramolecular o ARN bicatenario formado por hibridación intermolecular. En una modalidad, los polinucleótidos incluyen ADN monocatenario o ARN bicatenario que se autohibrida para formar una estructura en horquilla con una estructura al menos parcialmente bicatenaria incluyendo al menos un segmento que hibridará en ARN transcripto del gen dirigido para supresión. Sin pretender quedar ligado por cualquier mecanismo, se cree que tales polinucleótidos son o producirán ARN monocatenario con al menos un segmento que hibridará en ARN transcripto de un gen dirigido para supresión. En ciertas modalidades diferentes, los polinucleótidos también incluyen un promotor, en general, un promotor funcional en una planta, por ejemplo, un promotor de pol II, un promotor de pol III, un promotor de pol IV o un promotor de pol V.
El término "gen" se refiere a ADN cromosómico, plásmido ADN, cADN, ADN de intrón y exón, polinucleótido de ADN artificial u otro ADN que codifica un péptido, polipéptido, proteína o molécula de transcripto de ARN y los elementos genéticos que flanquean la secuencia codificante que están implicados en la regulación de expresión, tales como, regiones promotores, regiones líder 5', regiones no traducidas 3'. Cualquiera de los componentes del gen son blancos potenciales para los oligonucleótidos y polinucleótidos de la presente invención.
Las moléculas de polinucleótido de la presente invención se diseñan para modular la expresión al inducir la regulación o la supresión de un gen de ACCasa endógeno en una planta y se diseñan para tener una secuencia de nucleótidos esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen de ACCasa endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcripta de un gen de ACCasa endógeno de una planta, incluyendo un transgén en una planta que proporciona una enzima de ACCasa resistente a herbicidas, que puede ser una secuencia codificante o una secuencia no codificante. Las moléculas efectivas que modulan la expresión se mencionan como una "molécula disparadora o polinucleótido disparador". Por "esencialmente idéntico" o "esencialmente complementario" se entiende que los polinucleótidos disparadores (o al menos una cadena de un polinucleótido bicatenario o una de sus porciones o una porción de un polinucleótido monocatenario) se diseñan para hibridar en la secuencia no codificante del gen endógeno o ARN transcripto (conocido como ARN mensajero o un transcripto de ARN) del gen endógeno para realizar la regulación o la supresión de la expresión del gen endógeno. Las moléculas disparadoras se identificar por "azulejado" de los blancos génicos con sondas parcialmente superpuestas o sondas no superpuestas de polinucleótidos antisentido o consentido que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios a la secuencia de nucleótidos de un gen endógeno. Múltiples secuencias blanco se pueden alinear y regiones de secuencia con homología en común, de acuerdo con los métodos de la presente invención, se identifican como potenciales moléculas disparadoras para los blancos múltiples. Las múltiples moléculas disparadoras de diversas longitudes, por ejemplo 18-25 nucleótidos, 26-50 nucleótidos, 51-100 nucleótidos, 101-200 nucleótidos, 201-300 nucleótidos o más se pueden reunir en pocos tratamientos a fin de investigar moléculas de polinucleótido que cubren una porción de una secuencia génica (por ejemplo, una porción de una porción codificante versus una porción de una región no codificante o una porción 5' versus 3' de un gen) o una secuencia génica entera que incluye las regiones codificantes y no codificantes de un gen blanco. Las moléculas de polinucleótido de las moléculas disparadoras reunidas se pueden dividir en pools más pequeños o moléculas individuales a fin de identificar moléculas disparadoras que proporcionan el efecto deseado.
Las moléculas de polinucleótido de ARN y ADN de gen blanco (Cuadro 1 , SEQ ID NO: 1-93) se secuencian por cualquier cantidad de métodos y equipamiento apropiados. Algunas de las tecnologías de secuenciación están disponibles en comercios, tales como la plataforma de secuenciación por hibridación de Affymetrix Inc. (Sunnyvale, Calif.) y las plataformas de secuenciación por síntesis de 454 Life Sciences (Bradford, Conn.), Illumina/Solexa (Hayward, Calif.) y Helicos Biosciences (Cambridge, Mass.) y la plataforma de secuenciación por ligación de Applied Biosystems (Foster City, Calif.), tal como se describe más abajo. Además de la secuenciación de moléculas simples realizada usando secuenciación por síntesis de Helicos Biosciences, están comprendidas otras tecnologías de secuenciación de moléculas simples por el método de la invención e incluyen la tecnología SMRT, TM de Pacific Biosciences, la tecnología Ion Torrent, T y secuenciación de nanoporos desarrolla, por ejemplo, por Oxford Nanopore Technologies. Un gen blanco de ACCasa que comprende ADN o ARN se puede aislar usando cebadores o sondas esencialmente complementarias o esencialmente homologas a la SEQ ID NO:1-93 o a su fragmento. Un gen de reacción de polimerasa en cadena (PCR) se puede producir usando cebadores esencialmente complementarios o esencialmente homólogos a SEQ ID NO: 1-93 o a su fragmento que es de utilidad para aislar un gen de ACCasa de un genoma de planta. SEQ ID NO: 1-93 o sus fragmentos se pueden utilizar en diversas tecnologías de captura de secuencias para aislar secuencias génicas blanco adicionales, por ejemplo, incluyendo aunque sin limitarse a Roche NimbleGen® (Madison, Wl) y Dynabeads® acopladas a Estreptavidina (Life Technologies, Grand Island, NY) y US20110015084, incorporada a la presente como referencia en su totalidad.
Las modalidades de polinucleótidos monocatenarios tienen una complementariedad de secuencia que no requiere ser del 100%, pero es al menos suficiente para permitir la hibridación en ARN transcripto del gen blanco o ADN del gen blanco para formar un dúplex para permitir un mecanismo de silenciación génica. Así, en modalidades, un fragmento de polinucleótido se diseña para ser esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en la secuencia de gen blanco de ACCasa o ARN mensajero transcripto del gen blanco. Por "esencialmente idéntico" se entiende que tiene 100% de identidad de secuencia o al menos aproximadamente 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% de identidad de secuencia cuando se compara con la secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos ya sea en el gen blanco o ARN transcripto del gen blanco; por "esencialmente complementario" se entiende que tiene 100% de complementariedad de secuencia o al menos aproximadamente 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% complementariedad de secuencia cuando se compara con la secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos ya sea en el gen blanco o ARN transcripto del gen blanco. En algunas modalidades de esta invención, las moléculas de polinucleótido se diseñan para tener 100% de identidad de secuencia o complementariedad con un alelo o un miembro de la familia de un gen blanco dado (secuencia codificante o no codificante de un gen para de la presente invención); en otras modalidades, las moléculas de polinucleótido se diseñan para tener 100% de identidad de secuencia o complementariedad con múltiples alelos o miembros de la familia de un gen blanco dado.
En ciertas modalidades, los polinucleótidos usados en las composiciones que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios al gen blanco o transcripto comprenderán el ácido nucleico predominante en la composición. Así, en ciertas modalidades, los polinucleótidos que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios al gen blanco o transcripto comprenderán al menos aproximadamente 50%, 75%, 95%, 98% o 100% de los ácidos nucleicos proporcionados en la composición por concentración de masa o molar. Sin embargo, en ciertas modalidades, los polinucleótidos que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios al gen blanco o transcripto pueden comprender al menos aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 20% a aproximadamente 50% o aproximadamente 30% a aproximadamente 50% de los ácidos nucleicos proporcionados en la composición por concentración de masa o molar. También se proporcionan composiciones en las que los polinucleótidos que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios al gen blanco o transcripto pueden comprender al menos aproximadamente 1% a 100%, aproximadamente 10% a 100%, aproximadamente 20% a aproximadamente 100%, aproximadamente 30% a aproximadamente 50% o aproximadamente 50% a 100% de los ácidos nucleicos proporcionados en la composición por concentración de masa o molar.
"Identidad" se refiere al grado de similitud entre dos secuencias de ácido polinucleico o proteína. Una alineación de las dos secuencias se lleva a cabo por medio de un programa de computadora apropiado. Un programa de computadora ampliamente usado y aceptado para realizar alineaciones de secuencias es CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nucí. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). La cantidad de bases o aminoácidos coincidentes se divide por la cantidad total de bases o aminoácidos y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad. Por ejemplo, si dos secuencias de 580 pares de bases tienen 145 bases coincidentes, serán 25% idénticas. Si las dos secuencias comparadas son de diferentes longitudes, la cantidad de coincidencia se divide por la más corta de las dos longitudes. Por ejemplo, si hay 100 aminoácidos coincidentes entre una proteína de 200 y 400 aminoácidos, son 50% idénticos respecto de la secuencia más corta. Si la secuencia más corta es menor a 150 bases o 50 aminoácidos de longitud, la cantidad de coincidencias se dividen por 150 (para bases de ácidos nucleicos) o 50 (para aminoácidos) y se multiplican por 100 para obtener un porcentaje de identidad.
Las moléculas disparadoras para miembros de la familia génica específica se pueden identificar de secuencias codificantes y/o no codificantes de familias de genes de una planta o múltiples plantas, por alineación y selección de 200-300 fragmentos de polinucleótidos de las últimas regiones homologas entre las secuencias alineadas y evaluadas usando polinucleótidos aplicados tópicamente (como ssADN o ssARN, dsARN o dsADN con sentido o antisentido) para determinar su eficacia relativa en la inducción del fenotipo herbicida. Los segmentos efectivos luego se subdividen en 50-60 fragmentos de polinucleótidos, se priorizan por mínima homología y se reevalúan usando los polinucleótidos aplicados tópicamente. Los fragmentos efectivos de 50-60 polinucleótidos se subdividen en 19-30 fragmentos de polinucleótidos, se priorizan por mínima homología y nuevamente se evalúan respecto de la inducción del fenotipo de rendimiento / calidad. Una vez determinada la efectividad relativa, los fragmentos se utilizan individualmente o se evalúan otra vez en combinación con uno o varios fragmentos diferentes para determinar la composición disparadora o mezcla de polinucleótidos disparadores para proporcionar el fenotipo de rendimiento / calidad.
Las moléculas disparadores para la actividad amplia se pueden identificar de secuencias codificantes y/o no codificantes de familias de genes de una planta o varias plantas, por alineación y selección de 200-300 fragmentos de polinucleótidos de las regiones más homologas entre las secuencias alineadas y evaluadas usando polinucleótidos tópicamente aplicados (como ssADN o ssARN, dsARN o dsADN con sentido o antisentido) para determinar su efectividad relativa en la inducción del fenotipo de rendimiento / calidad. Los segmentos efectivos se subdividen en 50-60 fragmentos de polinucleótidos, se priorizan por la máxima homología y se reevalúan usando polinucleótidos tópicamente aplicados. Los 50-60 fragmentos de polinucleótido se subdividen en 19-30 fragmentos de polinucleótidos, se priorizan por la máxima homología y se reevalúan respecto de la inducción del fenotipo de rendimiento / calidad. Una vez determinada la eficacia relativa, los fragmentos se pueden utilizar de forma individual o en combinación con uno o varios otros fragmentos para determinar la composición disparadora o mezcla de polinucleótidos disparadores para proporcionar el fenotipo de rendimiento / calidad.
Los métodos para preparar polinucleótidos son bien conocidos en el arte. Las síntesis químicas, las síntesis in vivo y métodos de síntesis in vivo y composiciones son conocidos en el arte e incluyen diversos elementos virales, células microbianas, polimerasas modificadas y nucleótidos modificados. La preparación comercial de oligonucleótidos proporciona a menudo dos desoxirribonucleótidos en el extremo 3' de la cadena con sentido. Las moléculas largas de polinucleótido se pueden sintetizar de kits asequibles en comercios, por ejemplo, kits de Applied Biosystems/Ambion (Austin, TX) tuenen ADN ligado en el extremo 5' en un cásete de expresión microbiano que incluye un promotor bacteriano T7 de polimerasa que hace que cadenas de ARN se puedan reunir en un dsARN y kits proporcionados por diversos fabricantes que incluyen T7 RiboMax Express (Promega, Madison, Wl), AmpliScribe T7-Flash (Epicentre, Madison, Wl) y TranscriptAid T7 High Yield (Fermentas, Glen Burnie, MD). Las moléculas de dsARN se pueden producir a partir de casetes de expresión microbiano en células bacterianas (Ongvarrasopone et al. ScienceAsia 33:35-39; Yin, Appl. Microbiol. Biotechnol 84:323-333, 2009; Liu et al., BMC Biotechnology 10:85, 2010) que tienen una actividad enzimática regulada o deficiente de ARNasa III o el uso de diversos vectores virales para producir cantidades suficientes de dsARN. En la presente invención, los fragmentos génicos de ACCasa se insertan en los casetes de expresión microbiana en una posición position en donde los fragmentos se expresan para producir ssARN o dsARN de utilidad en los métodos descritos en la presente para regular la expresión en un gen de ACCasa blanco. En algunas modalidades, parámetros de diseño tales como puntaje de Reynolds (Reynolds et al. Nature Biotechnology 22, 326 - 330 (2004), reglas de Tuschl (Pei y Tuschl, Nature Methods 3(9): 670-676, 2006), puntaje i (Nucleic Acids Res 35: e123, 2007), herramienta de diseño de puntaje i y algoritmos asociados (Nucleic Acids Res 32: 936-948, 2004. Biochem Biophys Res Commun 316: 1050-1058, 2004, Nucleic Acids Res 32: 893-901, 2004, Cell Cycle 3: 790-5, 2004, Nat Biotechnol 23: 995-1001, 2005, Nucleic Acids Res 35: e27, 2007, BMC Bioinformatics 7: 520, 2006, Nucleic Acids Res 35: e123, 2007, Nat Biotechnol 22: 326-330, 2004) se conocen en el arte y se pueden usar en la selección de secuencias de polinucleótido efectivas para la silenciación génica. En algunas modalidades, la secuencia de un polinucleótido se controla contra el ADN genómico de la planta pretendida para minimizar la silenciación no intencional de otros genes.
Las composiciones de polinucleótido de molécula de polinucleótido y oligonucleótido disparadoras son de utilidad en composiciones, tales como líquidos que comprenden estas moléculas de polinucleótido, en bajas concentraciones, solas o en combinación con otros componentes, por ejemplo una o más moléculas herbicidas, ya sea en la misma solución o en líquidos aplicados por separado que también proporcionan un agente de transferencia. Si bien no hay límite superior en las concentraciones y dosis de moléculas de polinucleótido que pueden ser de utilidad en los métodos de esta invención, se buscarán menores concentraciones efectivas y dosis por su eficacia. Las concentraciones se pueden ajusfar en consideración del volumen de spray o tratamiento aplicadas a hojas de plantas u otra parte de una superficie de planta, tales como pétalos de flores, tallos, tubérculos, frutas, anteras, polen o semillas. En una modalidad, un tratamiento de utilidad para plantas herbáceas usando moléculas de oligonucleótido 25-mero es de aproximadamente 1 nanomol (nmol) de moléculas de oligonucleótido por planta, por ejemplo, de aproximadamente 0.05 a 1 nmol por planta. Otras modalidades para plantas herbáceas incluyen rangos de utilidad de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 100 nmol o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 nmol o aproximadamente 1 nmol a aproximadamente 10 nmol de polinucleótidos por planta. Plantas muy grandes, árboles o vinos pueden requerir cantidades correspondientemente grandes de polinucleótidos. Cuando se usan moléculas largas de dsARN que se pueden procesar en múltiples oligonucleótidos, se pueden usar concentraciones menores. Para ilustrar las modalidades de la invención, el factor 1X, cuando se aplica a moléculas de oligonucleótido, es usa arbitrariamente para denotar un tratamiento de 0.8 nmol de molécula de polinucleótido por planta; 10X, 8 nmol de molécula de polinucleótido por planta; y 100X, 80 nmol de molécula de polinucleótido por planta.
Las composiciones de polinucleótido de esta invención son de utilidad en composiciones, tales como líquidos que comprenden moléculas de polinucleótido, solas o en combinación con otros componentes, ya sea en el mismo líquido o en líquidos aplicados por separado que proporcionan un agente de transferencia. Tal como se usa en la presente, un agente de transferencia es un agente que, cuando se combina con un polinucleótido en una composición que se aplica tópicamente a una superficie blanco, permite que el polinucleótido entre en una célula de planta. En ciertas modalidades, un agente de transferencia es un agente que condiciona la superficie del tejido vegetal, por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores o frutas, a la permeación por las moléculas de polinucleótido en células de plantas. La transferencia de polinucleótidos en células de plantas se puede facilitar por la aplicación anterior o contemporánea de un agente de transferencia de polinucleótidos al tejido vegetal. En algunas modalidades, el agente de transferencia se aplica luego de la aplicación de la composición de polinucleótido. El agente de transferencia de polinucleótido permite una vía de polinucleótidos a través de las barreras de cera de las cutículas, estomas y/o pared celular o barreras de membrana en células de plantas. Los agentes de transferencia apropiados para facilitar la transferencia del polinucleótido en una célula vegetal incluyen agentes que incrementan la permeabilidad del exterior de la planta o que incrementan la permeabilidad de las células vegetales a oligonucleótidos o polinucleótidos. Estos agentes para facilitar la transferencia de la composición en una célula vegetal incluyen un agente químico o un agente físico o sus combinaciones. Los agentes químicos para acondicionamiento o transferencia incluyen (a) tensoactivos, (b) un solvente orgánico o una solución acuosa o mezclas acuosas de solventes orgánicos, (c) agentes oxidantes, (d) ácidos, (e) bases, (f) aceites, (g) enzimas o sus combinaciones. Las modalidades del método pueden incluir opcionalmente una etapa de incubación, una etapa de neutralización (por ejemplo, para neutralizar un ácido, una base o un agente oxidante o para inactivar una enzima), una etapa de enjuague o sus combinaciones. Las modalidades de agentes o tratamientos para acondicionamiento de una planta para la permeación por polinucleótidos incluyen emulsiones, emulsiones inversas, liposomas y otras composiciones de tipo micelar. Las modalidades de agentes o tratamientos para acondicionamiento de una planta a la permeación por polinucleótidos incluyen contraiones u otras moléculas que se conocen para asociarse con moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo, iones amonio inorgánicos, iones alquilamonio, iones litio, poliaminas tales como espermina, espermidina o putrescina y otros cationes. Los solventes orgánicos de utilidad en el acondicionamiento de una planta a la permeación por polinucleótidos incluyen DMSO, DMF, piridina, /V-pirrolidina, hexametilfosforamida, acetonitrilo, dioxano, polipropilenglicol, otros solventes miscibles con agua o que disolverán fosfonucleótidos en sistemas no acuosos (tal como se usa en reacciones de síntesis). Los aceites naturales o sintéticos con o sin tensoactivos o emulsionantes se pueden usar, por ejemplo, aceites de origen vegetal, aceites de cultivos (tales como los enumerados en el 9th Compendium of Herbicide Adjuvants, disponibles al público en la WorldWide Web (Internet) en herbicide.adjuvants.com, por ejemplo, aceites parafínicos, ésteres de ácido grasos de poliol o aceites con moléculas de cadena corta modificadas con amidas o poliaminas tales como polietilenimina o A/-pirrolidina. Los agentes de transferencia incluyen, pero sin limitación, preparaciones de organosilicio.
En ciertas modalidades, una preparación de organosilicona que está disponible en el comercio como tensoactivo Silwet® L-77 que tiene Número CAS 27306-78-1 y Número EPA: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA, y disponible actualmente de Momentive Performance Materials, Albany, New Cork se puede usar para preparar una composición de polinucleótido. En ciertas modalidades cuando se usan una preparación de organosilicona Silwet L-77 como un tratamiento pre-rociado de hojas de planta u otras superficies de plantas, concentraciones recién preparadas en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso) son eficaces para preparar una hoja u otra superficie de planta para la transferencia de moléculas de polinucleótidos en células de plantas a partir de una aplicación tópica sobre la superficie. En ciertas modalidades de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente, se usa o proporciona una composición que comprende una molécula de polinucleótido y una preparación de organosilicona que comprende Silwet L-77 en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso) .
En ciertas modalidades, alguna de las preparaciones de organosilicona disponibles en el comercio provistas tales como las siguientes Breakthru S 321 , Breakthru S 200 Cat# 67674-67-3, Breakthru OE 441 Cat#68937-55-3, Breakthru S 278 Cat #27306-78-1 , Breakthru S 243, Breakthru S 233 Cat#134180-76-0, disponibles del fabricante Evonik Goldschmidt (Germany), Silwet® HS 429, Silwet® HS 312, Silwet® HS 508, Silwet® HS 604 (Momentive Performance Materials, Albany, New York) se pueden usar como agentes de transferencia en una composición de polinucleótido. En ciertas modalidades cuando una preparación de organosilicona se usa como un tratamiento de pre-rociado de hojas de plantas u otras superficies, las concentraciones recién preparadas en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0.01 , 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso) son eficaces para preparar una hoja u otra superficie de planta para la transferencia de las moléculas de polinucleótidos en las células vegetales a partir de la aplicación tópica sobre la superficie. En ciertas modalidades de los métodos y composiciones provistos en la presente, se usa o proporciona una composición que comprende una molécula de polinucleótido y una preparación de organosilicona en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) {por ejemplo, aproximadamente 0.01 , 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso).
Las preparaciones de organosilicona usadas en los métodos y composiciones provistos en la presente pueden comprender uno o más compuestos de organosilicona efectivos. Como se usa en la presente, la frase "compuesto de organosilicona efectivo" se usa para describir cualquier compuesto de organosilicona que se halla en una preparación de organosilicona que permite que un polinucleótido entre en una célula de planta. En ciertas modalidades, un compuesto de organosilicona efectivo puede permitir que un polinucleótido entre a una célula de planta de una manera que permite una supresión mediada por polinucleótido de una expresión del gen blanco en la célula de planta. En general, los compuestos de organosilicona efectivos incluyen, pero sin limitación, compuestos que pueden comprender: i) un grupo principal trisiloxano que se une covalentemente a, ii) un ligador alquilo que incluye, pero sin limitación, un ligador n-propilo, que se une covalentemente a, iii) una cadena de poliglicol, que se une covalentemente a, iv) un grupo terminal. Los grupos principales trisiloxano de tales compuestos de organosilicona efectivos incluyen, pero sin limitación, heptametiltrisiloxano. Los ligadores alquilo pueden incluir, pero sin limitación, un ligador n-propilo. Los cadenas poliglicol incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol o polipropilenglicol. Las cadenas de poliglicol pueden comprender una mezcla que proporciona una longitud de cadena promedio "n" de aproximadamente "7.5". En ciertas modalidades, la longitud de cadena promedio "n" puede variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 14. Los grupos terminales pueden incluir, pero sin limitación, grupos alquilo tales como un grupo metilo. Se considera que los compuestos de organosilicona efectivos incluyen, pero sin limitación, tensoactivos de etoxilato de trisiloxano o heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno.
(Compuesto I: heptametiltrisiloxano con óxido de polialquileno, promedio=7.5).
En ciertas modalidades se usa una preparación de organosilicona que comprende un compuesto de organosilicona que comprende un grupo principal en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, se usa una preparación de organosilicona que comprende un compuesto de organosilicona que comprende un grupo principal heptametiltrisiloxano en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, se usa una composición de organosilicona que comprende Compuesto I en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, se usa una composición de organosilicona que comprende el Compuesto I en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente, se usa o proporciona una composición que comprende una molécula de polinucleótido y uno o más compuestos de organosilicona efectivo en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0.01 , 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso) .
Las composiciones incluyen pero sin limitación componentes que son uno o más polinucleótidos esencialmente idénticos, o esencialmente complementarios a una secuencia del gen ACCasa (promotor, intrón, exón, región no traducida 5', región no traducida 3'), un agente de transferencia que permite que el polinucleótido entre en una célula de planta, un herbicida que complementa la acción del polinucleótido, uno o más herbicidas adicionales que también potencian la actividad herbicida de la composición o proporcionan un modo de acción adicional diferente del herbicida de complementación, varias sales y agentes estabilizantes que aumentan la utilidad de la composición como una combinación de los componentes de la composición.
Los métodos incluyen una o más aplicaciones de una composición de polinucleótido y una o más aplicaciones de un agente potenciador de la permeabilidad para acondicionar una planta para la penetración por los polinucleótidos. Cuando el agente para acondicionar la penetración es una composición de organosilicona o compuesto contenida en esta, las modalidades de las moléculas de polinucleótidos son oligonucleótidos de ARN de cadena doble, oligonucleótidos de ARN de cadena simple, polinucleótidos de ARN de cadena doble, polinucleótidos de ARN de cadena simple, oligonucleótidos de ADN de cadena doble, oligonucleótidos de ADN de cadena simple, polinucleótidos de ADN de cadena doble, polinucleótidos de ADN de cadena simple, oligonucleótidos o polinucleótidos de ARN o ADN modificado químicamente o sus mezclas.
Los composiciones y los métodos son útiles para modular la expresión de un gen ACCasa endógeno (por ejemplo Patente US No. 7.297.541 , Publ. de Patente US 20110185444, y 20110185445) o gen de ACCasa transgénico (por ejemplo, Patente US No: 7.3072.379, Publ. de Patente US 20110191897) o genes inactivadores de inhibidor de ACCasa (Pat. US No. 6.268.549; 6.768.044; 7.3072.379; 7.304.209; WO 96/38567, WO 99/24585) en una célula de planta. En varias modalidades, un gen de ACCasa incluye la secuencia codificadora (codificadora de la proteína o traducible), secuencia no codificadora (no traducible) o secuencia codificadora y no codificadora. Las composiciones de la invención pueden incluir polinucleótidos y oligonucleótidos diseñador para genes múltiples blanco o múltiples segmentos de uno o más genes. El gen blanco puede incluir múltiples segmentos consecutivos de un gen blanco, múltiples segmentos no consecutivos de un gen blanco, múltiples alelos de un gen blanco, o múltiples genes blanco de una o más especies.
Un aspecto de la invención proporciona un método para modular la expresión de un gen de ACCasa en una planta que incluye (a) acondicionamiento de una planta para la penetración por polinucleótidos y (b) tratamiento de la planta con las moléculas de polinucleótidos, donde las moléculas de polinucleótidos incluyen al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos clonados de o identificados de otro modo del gen ACCasa blanco en orientación antisentido o sentido, a través de lo cual las moléculas de polinucleótidos penetran el interior de la planta e inducen la modulación del gen blanco. El acondicionamiento y la aplicación del polinucleótido se pueden realizar de modo separado o en una etapa única. Cuando el acondicionamiento y la aplicación del polinucleótido se realizan en etapas separadas, el acondicionamiento puede preceder o puede seguir a la aplicación del polinucleótido dentro de minutos, horas, o días. En algunas modalidades se pueden realizar más de una etapa de acondicionamiento o más de una aplicación de la molécula de polinucleótido en la misma planta. En modalidades del método, el segmento se puede clonar o identifica de (a) parte codificadora (que codifica una proteína), (b) no codificadora (promotor y otras moléculas relacionadas con el gen), o (c) las partes codificadora y no codificadora del gen blanco. Las partes no codificadoras incluyen ADN, tal como regiones promotoras o el ARN transcripto por el ADN que proporciona moléculas regulatorias de ARN, que incluyen pero sin limitación: intrones, regiones no traducidas 5' o 3' y microARN (miARN), ARNsi de acción actúan trans, ARNsi antisentido natural y otros ARN pequeños con función reguladora o ARN que tienen función estructural o enzimática que incluyen, pero sin limitación: ribozimas, ARN ribosómicos, t-ARNs, aptámeros, y riboswitches.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan en la presente por referencia en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara en forma específica e individual incorporada por referencia.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de ciertas modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que las técnicas descriptas en los siguientes ejemplos representan métodos que los autores han hallado que funcional bien en la práctica de la invención, y en consecuencia se puede considerar que constituyen ejemplos de modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas descriptas y aún obtienen un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Polinucleótidos relacionados con las secuencias del gen ACCasa La molécula de polinucleótido ACCasa blanco se produce naturalmente en el genoma de Amaranthus palmen, Amaranthus rudis, Amaranthsu chlorostachys, Amaranthus thunbergii, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus lividus, Amanaranthus spinosus, , Abutilón theophrasti, Ambrosia trífida, Commelina diffusa, Conyza candensis, Lolium multiflorum, Sorghum halepense, Xanthium strumarium, Euphorbia heterophylla, Kochia scoparía and Digitaría sanguinalis, e incluyen moléculas relacionadas con la expresión de un polipéptido identificado como una ACCasa, que incluye moléculas reguladoras, ADNc que comprenden las regiones codificadoras y no codificadoras de un gen de ACCasa y fragmentos de este como se muestran en el Cuadro 1.
Las moléculas de polinucleótidos se extrajeron de estas especies de planta por métodos estándares en el campo, por ejemplo, se extrae ARN total usando el reactivo Trizol (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA Cat. No. 15596-018), siguiendo el protocolo del fabricante o modificaciones de estos por los expertos en la técnica de extracción del polinucleótido que puede aumentar la recuperación o pureza del ARN extraído. En breves palabras, se comienza con 1 gramo de tejido de planta molido para la extracción. Se prealicuotan 10 mililitros (mL) de reactivo Trizol a tubos cónicos de 15 mL. Se añade polvo molido a los tubos y se agita para homogenizar. Se incubas las muestras homogenizadas durante 5 minutos (min) a temperatura ambiente (RT) y luego se añaden 3 mL de cloroformo. Los tubos se agitan vigorosamente a mano durante 15-30 segundos (seg) y se incuban a RT durante 3 min. Se centrifugan los tubos a 7.000 revoluciones por minuto (rpm) durante 10 min a 4 grados C. Se transfiere la fase acuosa a un nuevo tubo de 1.5 mL y se añade 1 volumen de isopropanol frío. Se incuban las muestras durante 20-30 min a RT y se centrifuga a 10.000 rpm durante 10 min a 4 grados C. Se lava el pellet con 8 etanol 80 por ciento grado Sigma. Se retira el sobrenadante y se seca al aire brevemente el pellet. Se disuelve el pellet de ARN en aproximadamente 200 microlitros de agua tratada con DEPC. Se calienta brevemente a 65 grados C para disolver el pellet y agitar o pipetear para resuspender el sedimento de ARN. Se ajusta la concentración de ARN a 1-2 microgramo/microlitro.
Se extrajo ADN usando el Mini kit de ADN de planta EZNA SP (Omega Biotek, Norcross GA, Cat#D5511) y tubos R de matriz de lisado (Q-Biogen, Cat#6914), siguiendo el protocolo del fabricante o sus modificaciones realizadas por los expertos en la técnica de extracción de polinucleótido que pueden aumentar la recuperación o pureza del ADN extraído. En breves palabras, se alícuota el tejido molido en un tubo E de matriz de lisis en hielo seco, se añaden 800 µ? de Buffer SP1 a cada muestra, se homogeniza en un batidor de microesferas durante 35-45 segundos, se incuba en hielo durante 45-60 seg, se centrifuga a >14000 rpm durante 1 min a RT, se añaden 10 microlitros de ARNasa A al Usados, se incuba a 65°C durante 10 min, se centrifuga durante 1 min a RT, se añaden 280 µ? de Buffer SP2 y se agita con vórtex para mezclar, se incuba las muestras en hielo durante 5 min, se centrifuga a >10.000 g durante 10 min a RT, se transfiere el sobrenadante a una columna homogenizadora en un tubo de recolección de 2 mi, se centrifuga a 10.000 g durante 2 min a RT, se transfiere al lisado aclarado a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi, se añaden 1.5 volúmenes de Buffer SP3 al lisado aclarado, se agita en vórtex inmediatamente para obtener una mezcla homogénea, se transfiere hasta 650 µ? de sobrenadante en la columna Hi-Bind se centrifuga a 10.000 g durante 1 min, se repite, aplican 100 µ? de buffer de elución 65°C a la columna, se centrifuga a 10.000 g durante 5 min a RT.
Las secuencias de ADN de próxima generación, tal como la 454-FLX (Roche, Branford, CT), el SOLiD (Applied Biosystems), y el analizador de genoma (HiSeq2000, lllumina, San Diego, CA) se usaron para proporcionar la secuencia de polinucleótidos del ADN y ARN extraído de los tejidos de planta. Los datos de la secuencia sin procesar se ensamblaron en cóntigos. La secuencia del contigo se usó para identificar moléculas activadoras que se pueden aplicar a la planta para permitir la regulación de la expresión del gen.
La secuencia de ADN blanco aislada del ADN genómico (ADNg) y ADN codificador (ADNc) de las diversas especies de planta tipo maleza para el gen de ACCasa y los cóntigos ensamblados expuestos en la SEQ ID NO 1-93 y Cuadro 1.
EJEMPLO 2 Polinucleótidos de la invención relacionados con las moléculas disparadoras Las secuencias génicas y fragmentos del Cuadro 1 se dividieron en longitudes de 200 polinucleótidos (200-mero) con regiones superpuestas de 25 polinucleótidos (SEQ ID NO:93-3900). Estos polinucleótidos se ensayan para seleccionar las regiones disparadoras más eficaces a través del largo de cualquier secuencia blanco. Los polinucleótidos disparadores se constryen como as ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o híbridos de dsADN/ARN y se combinan con un agente de transferencia a base de organosilicio para proporcionar una preparación de polinucleótido. Los polinucleótidos se combinan en grupos de dos o tres polinucleótidos por grupo, usando 4-8 nmol de cada polinucleótido. Cada grupo de polinucleótidos se prepara con el agente de transferencia y se aplica a una planta o un campo de plantas en combinación con un inhibidor de ACCasa que contiene herbicidas o seguido por un tratamiento con inhibidor de ACCasa uno a tres días después de la aplicación del polinucleótido, para determinar el efecto sobre la susceptibilidad de la planta por un inhibidor de ACCasa. El efecto se mide como impidiendo el crecimiento y/o matando la planta y se mide 8-14 días después del tratamiento con el grupo de polinucleótidos e inhibidor de ACCasa. Los grupos más eficaces se identifican y los polinucleótidos individuales se ensayan en los mismos métodos que los grupos y se identifican el 200-mero individual más eficaz. La secuencia de 200-meros se divide en secuencias más pequeñas de regiones de 50-70-meros con regiones superpuestas de 10-15 polinucleótidos y los polinucleótidos se ensayaron de forma individual. El 50-70-mero más eficaz luego se divide en secuencias más pequeñas de regiones de 25-meros con una región superpuesta de 12 a 13 polinucleótidos y se ensayó respecto de la eficacia en combinación con un tratamiento de inhibidor de ACCasa. Mediante este método, es posible identificar un oligonucleótido o varios oligonucleótidos que son la molécula disparadora más eficaz para efectuar la sensibilidad de la planta a un inhibidor de ACCasa o modulación de la expresión de un gen de ACCasa. La modulación de la expresión génica de ACCasa se determina por medio de la detección de moléculas de siARN de ACCasa específicas de un gen de ACCasa o por una observación de una reducción en la cantidad de transcripto de ARN de ACCasa producido respecto de una planta no tratada o por mera observación del fenotipo anticipado de la aplicación del disparador con el inhibidor de ACCasa con herbicida. La detección de siARN se puede realizar, por ejemplo, usando kits tales como mirVana (Ambion, Austin TX) y mirPremier (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
La secuencia blanco de ADN aislado de (gADN) genómico y que codifica ADN (cADN) de las diversas especies de plantas herbáceas para el gen de ACCasa y los cóntigos reunidos tal como se establecen en las SEQ ID NOs 1-92 se dividieron en fragmentos de polinucleótido tal como se establece en las SEQ ID NOs 93-3900.
Las secuencias génicas y los fragmentos de genes del Cuadro 1 se compararon y se identificaron 21-meros de polinucleótidos contiguos que tienen homología a través de diversas secuencias génicas de ACCasa. La finalidad consiste en identificar moléculas disparadoras que son de utilidad como moléculas herbicidas o en combinación con un herbicida inhibidor de ACCasa a través de un amplio rango de especies de malezas. Las secuencias, SEQ ID NO: 3901- 4530 representan los 21-meros que están presentes en el gen de ACCasa de al menos ocho de las especies de malezas del Cuadro 1. Se contempla que 21-meros adicionales se pueden seleccionar de las secuencias del Cuadro 1 que son específicas de una especie individual de malezas o algunas especies de malezas dentro de un género o moléculas disparadoras que tienen una longitud de al menos 18 nucleótidos contiguos, al menos 19 nucleótidos contiguos, al menos 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y es al menos es 85% idéntico a una secuencia génica de ACCasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-92 o su fragmento.
Mediante este método, es posible identificar un oligonucleótido o varios oligonucleótidos que son la molécula disparadora más eficaz para efectuar la sensibilidad de la planta al inhibidor de ACCasa o modulación de expresión génica de ACCasa. La modulación de expresión génica de ACCasa se determina por detección de las moléculas de siARN de ACCasa específicas del gen de DHPS o por observación de una reducción en la cantidad de transcripto de ARN de DHPS producido respecto de una planta no tratada o observando meramente el fenotipo anticipado de la aplicación del disparador con el inhibidor de ACCasa que contiene herbicida. La detección de siARN se puede realizar, por ejemplo, usando kits tales como mirVana (Ambion, Austin TX) y mirPremier (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
La secuencia de ADN blanco aislada de (gADN) genómico y ADN codificante (cADN) de diversas especies de plantas herbáceas para el gen de ACCasa y los cóntigos reunidos como se establecen en las SEQ ID NOs 1-92 se dividieron en fragmentos tal como se establecen en la SEQ ID NOs 3901-4530.
EJEMPLO 3 Métodos utilizados en la invención relacionados con el tratamiento de plantas o partes de plantas con una mezcla tópica de las moléculas disparadoras Plantas de amaranto Palmer sensibles a glifosato (A. palmeri R-22) se cultivaron en invernadero (30 / 20 °C día/noche T; fotoperíodo de 14 horas) en macetas de 4 pulgadas cuadradas con Sun Gro® Redi-Earth y 3.5 kg/m3 de fertilizante Osmocote® 14-14-14. Las plantas de amaranto Palmer de 5 a 10 cm de altura se trataron con una mezcla de ocho 8 polinucleótidos de ADN oligo antisentido de una sola hebra (21-22 mero) (ssDNA) que apuntan a ACCasa como se muestra en el Cuadro 2 a 16 nmol, formulados en tampón de fosfato de 10 milimoles (pH 6.8) con 2% de sulfato de amonio y 0.5% de Silwet L-77. Las plantas se trataron de forma manual pipeteando 10 µ?_ de solución de polinucleótido en cuatro hojas maduras completamente expandidas, para un total de 40 microlitros de solución por planta. 24 y cuarenta y ocho horas más tarde, las plantas se trataron con cletodim (SelectMax®, 0.97 Ib ia por galón; inhibidor de ACCasa 272 g ai/ha, concentrado de aceite de cultivo (COC) a 1% se agregó a los tratamientos herbicidas. Se realizaron cuatro replicaciones de cada tratamiento. La altura de la planta se determinó justo antes del tratamiento con ssDNA y en intervalos de hasta 12 días después de los tratamientos con herbicida para determinar el efecto de los tratamientos con oligonucleótido y herbicida.
CUADRO 2 Oliqonucleótidos de ssDNA de ACCasa Los resultados de los tratamientos se muestran en la Figura 1 y demuestran que las plantas tratadas con 16 nmol y el herbicida cletodim causaron un 22 por ciento de reducción en la altura de la planta con relación al control no tratado y cletodim solo causó un 0 por ciento de reducción en la altura de la planta. Un resultado sorprendente puesto que las plantas dicotiledóneas no son normalmente sensibles a los herbicidas inhibidores de ACCasa.
Se llevó a cabo un ensayo adicional para determinar cual de los oligonucleótios de ACCasa era responsable del resultado. En este ensayo, cada oligonucleótido fue aplicado a cuatro plantas a 4 nmol (nanomoles) por planta, el herbicida fue aplicado 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos y las plantas fueron evaluadas para efectos de crecimiento. Este ensayo de seguimiento identificó que oligo6 formulado (SEQ ID NO:4536) tenía el efecto más grande y era capaz de reducir el crecimiento de plantas en un promedio de 40 por ciento con relación a las plantas no tratadas. Este resultado proporciona una oportunidad de ampliar el espectro de uso para los herbicidas de ACCasa de incluir malezas dicotiledóneas.
EJEMPLO 4 Un método para controlar malezas en un campo Un método para controlar malezas en un campo comprende el uso de polinucleótidos disparadores que pueden modular la expresión de un gen de ACCasa en una o varias especies de malezas de plantas blanco. Un análisis de secuencias génicas de ACCasa de diecisiete especies de plantas proporcionaron una colección de polinucleótidos 21-meros que se pueden usar en composiciones para afectar el crecimiento o desarrollo o sensibilidad al herbicida inhibidor de ACCasa para controlar múltiples especies de malezas en un campo. Una composición que contiene 1 ó 2 ó 3 ó 4 o más de los polinucleótidos de SEQ ID NO: 3901- 4530 permitirá una actividad amplia de la composición contra las múltiples especies de malezas que se producen en un ambiente de campo.
El método incluye crear una composición que comprende componentes que incluyen al menos un polinucleótido de SEQ ID NO:3901-4530 o cualquier otra expresión génica efectiva que modula polinucleótidos esencialmente idénticos o esencialmente complementarios de SEQ ID NO:1-92 o su fragmento, un agente de transferencia que moviliza el polinucleótido en una célula de planta y un herbicida que inhibe ACCasa y opcionalmente un polinucleótido que modula la expresión de un gen esencial y opcionalmente un coherbicida que tiene un modo de acción diferente respecto de un inhibidor de ACCasa. El polinucleótido de la composición incluye un dsARN, ssADN o dsADN o una de sus combinaciones. Una composición que contiene un polinucleótido puede tener una tasa de uso de aproximadamente 1 a 30 gramos o más por acre según el tamaño del polinucleótido y la cantidad de polinucleótidos en la composición. La composición puede incluir uno o varios herbicidas adicionales cuando se necesite para proporcionar el control efectivo de malezas multiespecies. Un campo de plantas de cultivo que necesita de control de plantas herbáceas se trata por aplicación de spray de la composición. La composición se puede proporcionar como una mezcla en tanque, un tratamiento secuencial de componentes (en general, el polinucleótido seguido del herbicida), un tratamiento simultáneo o mezcla de uno o varios de los componentes de la composición de recipientes separados. El tratamiento del campo se produce tantas veces como se necesite para proporcionar control de malezas y los componentes de la composición se pueden ajustar a especies de malezas o familias de malezas específicas blanco.
CUADRO 1 Secuencias génicas de ACCasa aisladas de especies de plantas tipo maleza GAGAGCAACAAATATACGATCTTGTGCCATATCACA G G G AG GTG AACATAG ATC ACC AAC AAG AAGAGG CT TCGGTTCAATTCTTTTTGGAAGATCTCGCGCATGAAA TCCATAGTCTTGCTGGTGTAAGGATGCATAAACTAA ATGTTTGTGAGTGGGAAGTGAAACTTCGGGTATCAT CTCCCGGGAAAGCTAATGGTTTATGGAGGGTGGCA GTTACTAATGTGACTGGTCATACCTGTTCGGTACAT GTTTATCGTGAATTGGAAGATAGCAACCTACATGAA ATGGTCTACCATTCAGTATCTGTTCACGGCCCCCAC CATGGGGTACCTGTGAATGCACCCTATCAACCACTC GGTGGCATCGCCC GTAAGC G ACTTC AGGC C ATG AA AAGTAGCACAACTTACTGTTACGATTTTCCACTGGCT TTCTCAACTGCCCTGAAGCAATCATGGGCATCGGAA G CTCC GG ATGTC AAG AAAC CCTC G G AC AAAG C GCT TTTGAAAGTAACCGAGCTTAGCATTTGCTGATCCAAA AGGCACATGGGGAACTCCGCTTGTTCCAATAAATCG CAAGCCTGGTATGAACGATGTTGGCATGGTAGCCTG GTACATGGAAATGTCCACCCCCGAGTTCCCTAACGG AAGAACAATAATGGTTGTAGCTAATGATGTTACCTTC AAGG CCG G ATCTTTC GG AC CAC G AG AAG ATG CTTTC TTCCTTGCTGTTACAAATCTTGCTTGCGCGAAGAAA CTTCCTCTTATTTATCTG G CTG C C AATTC AG G AG CTC GACTTGGTGTTGCCGAAGAGCTAAAATCCTGCTTTA 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Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Un método de control de plantas que comprende: tratamiento de una planta con una composición que comprende un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia génica de ACCasa o su fragmento o a un transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ACCasa o su fragmento, en donde dicha secuencia génica de ACCasa está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-92 o su fragmento de polinucleótido, en donde dicho crecimiento o desarrollo de la planta o capacidad reproductiva se reduce o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ACCasa respecto a una planta no tratada con dicha composición.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho agente de transferencia es una composición o compuesto tensoactivo de organosilicio contenidos dentro.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho fragmento de polinucleótido tiene una longitud de 18 nucleótidos contiguos, 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos es 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ACCasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-92.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho fragmento de polinucleótido está seleccionado del grupo que consiste en ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o híbridos de dsADN/ARN sentido o anti-sentido.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha planta está seleccionada del grupo que consiste en Amaranthus palmen, Amaranthus rudis, Amaranthsu chiorostachys, Amaranthus thunbergii, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus lividus, Amanaranthus spinosus, , Abutilón theophrasti, Ambrosia trífida, Commelina diffusa, Conyza candensis, Lolium multiflorum, Sorghum halepense, Xanthium strumarium, Euphorbia heterophylla, Kochia scoparia y Digitaria sanguinalis.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha composición también comprende dicho herbicida inhibidor de ACCasa y aplicación externa a una planta con dicha composición.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicha composición también comprende uno o varios herbicidas diferentes de dicho herbicida inhibidor de ACCasa.
8. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha composición comprende cualquier combinación de dos o más de dichos fragmentos de polinucleótido y aplicación externa a una planta con dicha composición.
9. Una composición que comprende un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia génica de ACCasa o a un transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ACCasa, en donde dicha secuencia génica de ACCasa está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-92 o su fragmento de polinucleótido y donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ACCasa como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con dicha composición.
10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho agente de transferencia es una composición de organosilicio.
11. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho fragmento de polinucleótido tiene una longitud de 18 nucleótidos contiguos, 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos es 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ACCasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-92.
12. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho polinucleótido está seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:308-2912.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho polinucleótido está seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2913-5012.
14. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque también comprende un herbicida inhibidor de ACCasa.
15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicho inhibidor de la molécula de ACCasa está seleccionado del grupo que consiste en ariloxifenoxipropionatos, ciclohexandionas y fenilpirazolina.
16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque comprende además un herbicida inhibidor no de ACCasa.
17. Un método de reducción de la expresión de un gen de ACCasa en una planta que comprende: aplicación externa a una planta de una composición que comprende un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia génica de ACCasa o su fragmento, o al transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ACCasa o su fragmento, en donde dicha secuencia génica de ACCasa está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-92 o su fragmento de polinucleótido, en donde dicha expresión de dicho gen de ACCasa está reducida respecto a una planta a la que no se aplicó la composición.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicio.
19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho fragmento de polinucleótido tiene una longitud de 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos es 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ACCasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-92.
20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicha molécula de polinucleótido está seleccionada del grupo que consiste en ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o híbridos de dsADN/ARN sentido o anti-sentido.
21. Un cásete de expresión microbiana que comprende un fragmento de polinucleótido de una longitud de 18 nucleótidos contiguos, 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos es 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ACCasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-92.
22. Un método de preparación de un polinucleótido que comprende a) transformación del cásete de expresión microbiano de acuerdo con la reivindicación 21 en un microbio; b) cultivo de dicho microbio; c) recolección de un polinucleótido de dicho microbio, en donde dicho polinucleótido tiene una longitud de 18 nucleótidos contiguos, 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos es 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ACCasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-92.
23. Un método de identificación de polinucleótidos de utilidad en la modulación de expresión génica de ACCasa cuando se trata externamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos que comprenden una región esencialmente idéntica o esencialmente complementaria de un fragmento de polinucleótido de una longitud de 18 nucleótidos contiguos, 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos es 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ACCasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-92; b) tratar externamente dicha planta con uno o varios de dicho polinucleótidos y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta o extracto para modulación de expresión génica de ACCasa, y en donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ACCasa como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con dicha composición.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha planta está seleccionada del grupo que consiste en Amaranthus palmeri, Amaranthus rudis, Amaranthsu chlorostachys, Amaranthus thunbergii, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus lividus, Amanaranthus spinosus, , Abutilón theophrasti, Ambrosia trífida, Commelina diffusa, Conyza candensis, Lolium multiflorum, Sorghum halepense, Xanthium strumarium, Euphorbia heterophylla, Kochia scoparía y Digitaría sanguinalis.
25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha expresión del gen de ACCasa se reduce respecto a una planta no tratada con dicho fragmento de polinucleótido y un agente de transferencia.
26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicio.
27. Una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido y un inhibidor de ACCasa y un coherbicida, en donde dicho polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una porción de una secuencia génica de ACCasa o una porción de un transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ACCasa, en donde dicha secuencia génica de ACCasa está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-92 o su fragmento de polinucleótido y en donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ACCasa como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con dicha composición.
28. La composición química agrícola de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque dicho coherbicida está seleccionado del grupo que consiste en herbicidas de amida, herbicidas de arsénico, herbicidas de benzotiazol, herbicidas de benzoilciclohexandiona, herbicidas de benzofuranilalquilsulfonato, herbicidas de ciclohexenoxima, herbicidas de ciclopropilisoxazol, herbicidas de dicarboximida, herbicidas de dinitroanilina, herbicidas de dinitrofenol, herbicidas de éter difenílico, herbicidas de ditiocarbamato, herbicidas de glicina, herbicidas alifáticos halogenados, herbicidas de imidazolinona, herbicidas inorgánicos, herbicidas de nitrilo, herbicidas de organofósforo, herbicidas de oxadiazolona, herbicidas de oxazol, herbicidas de fenoxi, herbicidas de fenilendiamina, herbicidas de pirazol, herbicidas de piridazina, herbicidas de piridazinona, herbicidas de piridina, herbicidas de pirimidindiamina, herbicidas de pirimidiniloxibencilamina, herbicidas de amonio cuaternario, herbicidas de tiocarbamato, herbicidas de tiocarbonato, herbicidas de tiourea, herbicidas de triazina, herbicidas de triazinona, herbicidas de triazol, herbicidas de triazolona, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de uracilo y herbicidas de urea.
29. Una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido y un herbicida inhibidor de ACCasa y un pesticida, en donde dicho polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una porción de una secuencia génica de ACCasa o una porción de un transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ACCasa, en donde dicha secuencia génica de ACCasa está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-92 o su fragmento de polinucleótido, en donde un campo de plantas de cultivo que requieren del control de malezas y plagas se trata con dicha composición y en donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ACCasa como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con dicha composición.
30. La composición química agrícola de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho pesticida está seleccionado del grupo que consiste en insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, quimioesterilizantes, semioquímicos, repelentes, atrayentes, feromonas, estimulantes de la alimentación y biopesticidas.
31. Una composición herbicida que comprende un herbicida inhibidor de ACCasa y un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido está seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:4538 o su complemento o fragmento de polinucleótido y en donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ACCasa como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con dicha composición.
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