MX2011004003A - Composiciones alimenticias a partir de biomasa de microalgas. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona una biomasa de algas, aceite de algas, composiciones alimenticias que comprenden la biomasa de algas, células completas de microalgas y/o aceite de microalgas, en combinación con uno o más de otros ingredientes comestibles, y métodos para hacer tales composiciones, combinando la biomasa de algas o el aceite de algas con otros ingredientes comestibles. En las modalidades preferidas, los componentes de las microalgas se derivan de cultivos de microalgas cultivados y propagados de manera heterotrófica, en los cuales las células de algas comprenden al menos 10% de aceite de alga por peso seco.

Description

COMPOSICIONES ALIMENTICIAS A PARTIR DE BIOMASA DE MICROALGAS REFERENCIAS CRUZADAS CON LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U.S.C. 119(e) de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos núm. 61/105,121, presentada el 14 de octubre de 2008, Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos núm. 61/157,187, presentada el 3 de marzo de 2009, Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos núm. 61/173,166, presentada el 27 de abril de 2009, y la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos núm. 61/246,070, presentada el 25 de septiembre de 2009. Cada una de estas solicitudes se incorpora en la presente como referencia en su totalidad para todos los propósitos.

CON REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIA Esta solicitud incluye un Listado de secuencias, anexado como páginas 1-10.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se aplica en los campos de la microbiología, la preparación de alimentos y la nutrición humana y animal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Como la población humana sigue aumentando, hay una necesidad creciente de contar con fuentes adicionales de alimentos, particularmente fuentes con bajos costos de producción, pero que a su vez sean nutritivas. Por otra parte, la actual dependencia de la carne como el alimento básico de muchas dietas, al menos en la mayor parte de los países desarrollados, contribuye significativamente a la emisión de gases de efecto invernadero, y existe la necesidad de contar con nuevos productos alimenticios que sean igualmente sabrosos y nutritivos y que su producción sea menos dañina para el medio ambiente.

Requiriendo sólo "el agua y la luz del sol" para crecer, las algas se han visto durante mucho tiempo como una fuente potencial de alimentos. Mientras ciertos tipos de algas, principalmente las algas marinas, realmente proporcionan productos alimenticios importantes para el consumo humano, la promesa de las algas como un producto alimenticio no se ha hecho efectivo. El polvo de algas obtenido de algas cultivadas fotosintéticamente en estanques al aire libre o con fotobiorreactores está disponible comercialmente, pero tiene un color verde oscuro (producto de la clorofila) y un gusto fuerte y desagradable. Una vez convertidos en productos alimenticios o suplementos nutritivos, estos polvos de algas le confieren a los productos alimenticios o a los suplementos nutritivos un color verde visualmente poco atrayente y un sabor desagradable a pescado o a alga marina.

Hoy existen varias especies de algas que son usadas en productos alimenticios, la mayoría son macroalgas tales como las kelps, el laver púrpura {Porphyra, usado en nori), el dulse {Palmaria pálmate) y la lechuga de mar {Ulva lactuca). Las microalgas, como la espirulina {Arthrospira platensis) son cultivadas comercialmente en estanques al aire libre (fotosintéticamente) para ser usadas como suplemento nutritivo o incorporadas en pequeñas cantidades en batidos o jugos de frutas (generalmente menos de 0.5 %p/p). Otras microalgas, incluyendo algunas especies de Chlorella son populares en países asiáticos como suplemento nutritivo.

Además de estos productos, el aceite de algas con alto contenido de ácido docosahexaenoico (DHA, siglas en inglés) es usado como ingrediente en fórmulas infantiles. El DHA es un aceite altamente poliinsaturado. El DHA tiene propiedades antiinflamatorias y es un suplemento bien conocido, así como un aditivo usado en la preparación de productos alimenticios. Sin embargo, el empleo del DHA no es adecuado para alimentos que requieran cocción porque este se oxida con el tratamiento térmico. También, el DHA es inestable cuando se expone al oxígeno incluso a temperatura ambiente en presencia de antioxidantes. La oxidación del DHA da como resultado un sabor a pescado y un aroma desagradable.

Todavía existe la necesidad de contar con métodos para la obtención de productos alimenticios a partir de las algas, a gran escala, a bajos precios y de manera eficiente, en particular productos alimenticios que sean sabrosos y nutritivos. La presente invención satisface estas y otras necesidades.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona métodos para la preparación de biomasa a partir de microalgas, adecuadas para su empleo como producto alimenticio. En estos métodos, las microalgas son fermentadas bajo condiciones heterotróficas, de ahí que carezcan o presenten una cantidad considerablemente reducida de pigmentos verdes, que caracterizan a otros productos alimenticios derivados de microalgas. En una modalidad, las microalgas carecen o presentan considerablemente reducidas las cantidades de cualquier pigmento. En un aspecto, la invención es una microalga de la especie Chlorella protothecoides, cepa 33-55 (Chlorella protothecoides 33-55) depositada, conforme al Tratado de Budapest, el 13 de octubre de 2009, en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, siglas en inglés), cita en Boulevard Universidad 10801, Manassas, VA 20110-2209, con una Designación de Patente de Depósito de PTA-XXXX. En otro aspecto, la invención es una microalga de la especie Chlorella protothecoides, cepa 25-32 (Chlorella protothecoides 25-32) depositada el 13 de octubre de 2009, en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, siglas en inglés), cita en Boulevard Universidad 10801, Manassas, VA 20110-2209, con una Designación de Patente de Depósito de PTA-XXXX. En una modalidad, las condiciones de fermentación son manipuladas para proporcionar una biomasa rica en lípidos. En otra modalidad, las condiciones de fermentación son manipuladas para proporcionar una biomasa rica en proteínas. En todas las modalidades, los métodos pueden realizarse a gran escala, a bajo precio y de manera eficiente (la biomasa producida en fermentadores de 4500 1 o más grandes).

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una biomasa de microalgas adecuada para su incorporación en productos alimenticios para el consumo humano. En una modalidad, esta biomasa de microalgas es una biomasa concentrada que es un resultado directo de los métodos de preparación de biomasa de la presente invención. En otra modalidad, esta biomasa se presenta en forma de hojuelas secas que son el resultado del secado, por ejemplo mediante secadores de tambor, de tales preparaciones de biomasa. En esta última modalidad, se puede añadir un antioxidante a la biomasa, antes del proceso de secado, para prolongar el tiempo de vida útil de la biomasa de microalgas y de cualquier producto alimenticio que contenga dicha biomasa.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento posterior de la biomasa de microalgas en forma de hojuelas, hasta convertirse en un homogenizado de microalgas. En una modalidad, las hojuelas secas de microalgas son re-hidratadas en agua desmineralizada para crear una suspensión. Esta suspensión es micronizada después con un homogeneizador de alta presión, de modo que el tamaño de partícula medio sea menor de 10 µp? de tamaño, creando un homogenizado de microalgas.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona métodos para procesar la biomasa de microalgas en un ingrediente alimenticio, que es multifuncional en tanto que proporciona a aceites sanos a los alimentos y proporciona beneficios estructurales a los alimentos tales como los productos de panadería. En una modalidad, el proceso implica el secado neumático (por ejemplo, el secado por aspersión o el secado rápido) la preparación de biomasa para formar un polvo de algas que contiene un porcentaje grande de células de microalgas intactas. En otra modalidad, la biomasa es primero micronizada para romper las células antes del secado neumático y formar una harina de algas que contiene sólo un pequeño porcentaje (o no) de células de algas intactas; en algunas modalidades, antes de la etapa de secado, se añade un flujo o un agente de dispersión.

En un quinto aspecto, la presente invención se dirige a un método de producción de aceite o de biomasa microbiana que contiene aceite adecuado para el consumo humano. En algunas modalidades, el proceso implica la extracción del lípido (el aceite) de la biomasa para formar un aceite de algas. En una modalidad, el método comprende proporcionar un microorganismo, y cultivar el microorganismo en presencia de materia prima que no se deriva de una composición alimenticia adecuada para el consumo humano, en la cual el microorganismo convierte al menos alguna parte de la materia prima en aceite de triglicéridos. En algunos casos, el aceite de triglicéridos comprende al menos 50 % 18: 1 del lípido.

En un sexto aspecto, la presente invención contempla alimentos que incorporan un polvo de algas, harina de algas, y/o aceite de algas. En una modalidad, el alimento es un producto de panadería, aderezo, salsa o mayonesa, en el cual, en relación con el mismo alimento producido usando recetas convencionales, todo o una parte del huevo o la mantequilla han sido substituidos por una harina de algas rica en aceite de algas. En otra modalidad, el alimento es un producto de huevo pulverizado que contiene una harina de algas rica en aceite de algas. En otra modalidad, el alimento es un producto de huevo líquido que contiene una harina de algas rica en aceite de algas. En otra modalidad, el alimento es un producto lácteo líquido que contiene proteína, fibra y aceite de algas. En otra modalidad, el alimento es un producto cárnico en el cual, en relación con otros productos cárnicos disponibles anteriormente, una parte o todo (un sustituto cárnico) de la carne se sustituye por una harina de algas, polvo de algas, u hojuelas de algas ricos en proteína.

En un séptimo aspecto, la invención contempla los métodos de inducir saciedad al proporcionar alimentos a base de algas o ingredientes alimenticios que contienen fibra de algas y opcionalmente proteínas de algas y/o aceites de algas.

Estos y otros aspectos y modalidades de la invención se describen en los dibujos acompañantes, una breve descripción de los cuales sigue a continuación y una descripción detallada de la invención a continuación y ejemplificados en los ejemplos a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el perfil lipídico de las variedades de microalgas seleccionadas, como porcentaje del contenido de lípidos totales. La especie/cepa correspondiente a cada número de variedad se muestra en la Tabla 1 del Ejemplo 1.

La Figura 2 muestra el perfil de aminoácidos de la biomasa de Chlorella protothecoides, comparada con el perfil de aminoácidos de las proteínas del huevo entero.

La Figura 3 muestra la evaluación sensorial del huevo líquido entero con y sin la harina de algas, conservado sobre una mesa de vapor durante 60 minutos. El aspecto, la textura y la sensación en la boca de los huevos, fue evaluado cada 10 minutos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Esta descripción detallada de la invención se divide en secciones y subdivisiones para la conveniencia del lector. La sección I contempla las definiciones para varios términos usados en este documento. La sección II, en las partes de A-E, describe los métodos para la preparación de la biomasa de microalgas, incluyendo organismos adecuados (A), los métodos para la generación de variedades de microalgas que carezcan o tengan una pigmentación considerablemente reducida (B), condiciones de cultivo (C), condiciones de concentración (D), y la composición química de la biomasa producida conforme a la invención (E). La sección III, en las partes de la A-D, describe los métodos para procesar la biomasa de microalgas en hojuelas de algas (A), polvo de algas (B), harina de algas (C); y aceite de algas (D) de la invención. La sección IV describe varios alimentos de la invención y los métodos para combinar la biomasa a base de microalgas con otros ingredientes alimenticios.

Todos los procesos descritos en este documento se pueden realizar conforme a las regulaciones GMP o regulaciones equivalentes. En los Estados Unidos, las regulaciones GMP para la fabricación, el envasado, o el almacenamiento del alimento humano son codificados en la 21 C.F.R. 110. Estas disposiciones, así como otras disposiciones secundarias referidas allí se incorporan en este documento como referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Las condiciones GMP en los Estados Unidos, y condiciones equivalentes en otras jurisdicciones, son válidas al determinarse si un alimento es adulterado (el alimento se fabricó bajo condiciones que no son aptas para su consumo) o se prepararon, envasaron, o almacenaron bajo condiciones no sanitarias, de manera que puedan haberse contaminado o de otra manera puedan ser perjudiciales para la salud. Las condiciones GMP pueden incluir la adhesión a las regulaciones del gobierno: control de enfermedades; limpieza y entrenamiento del personal; mantenimiento y operación sanitaria de edificios e instalaciones; disponibilidad de alojamientos e instalaciones sanitarias adecuadas; diseño, construcción, mantenimiento, y limpieza de equipo y utensilios; la disposición de procedimientos de control de calidad apropiados para asegurar todas las precauciones razonables que se deben tener en cuenta para el recepción, inspección, transporte, segregación, preparación, fabricación, envase y almacenamiento de productos alimenticios, según los principios sanitarios adecuados para evitar la contaminación de cualquier fuente; y el almacenamiento y transporte del alimento terminado bajo condiciones que protejan el alimento contra la contaminación indeseable, física, química, o microbiana, así como contra el deterioro del alimento y su envase.

I. DEFINICIONES A menos que se defina de otra manera a continuación, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por una persona experta la técnica a la cual pertenece la siguiente invención. Las definiciones generales de muchos de los términos usados aquí se pueden encontrar en Singleton y otros, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2da edición, 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Ediciones Walker, 1988); The Glossary of Genetics, 5ta Edición, R. Rieger jy otros, (editores), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).

"Axénico" define a un cultivo de un organismo que no está contaminado por otros organismos vivos.

"Producto de panadería" define a un alimento, típicamente encontrado en una panadería, que se prepara mediante el uso de un horno. Los productos horneados incluyen, pero sin limitarse a, bizcochos, galletas, tartas, tortas y pasteles.

"Biorreactor" y 'Termentador" definen a un recinto total o parcial como un tanque o recipiente de fermentación, en el cual las células se cultivan típicamente en suspensión.

"Pan" define a un alimento que contiene harina, líquido, y un agente leudante. Los panes por lo general se preparan por cocción en un horno, aunque otros métodos de cocción son también aceptables. El agente leudante puede ser de naturaleza química u orgánica. Típicamente, el agente leudante orgánico es la levadura. En el caso donde el agente leudante es de naturaleza química (como la levadura en polvo y/o el bicarbonato de sodio), estos productos alimenticios se refieren como "panes rápidos".

"Material celulósico" define a los productos de digestión de la celulosa, en particular glucosa y xilosa. Típicamente, la digestión de la celulosa produce compuestos adicionales como disacáridos, oligosacáridos, lignina, furfurales y otros compuestos. Las fuentes de material celulósico incluyen, por ejemplo y sin limitación, el bagazo de caña de azúcar, pulpa de azúcar de remolacha, rastrojos de maíz, virutas de madera, aserrín, y pasto de aguja.

"Co-cultivo" y variantes de esta como "co-cultivar" y "co-fermentar" definen que dos o más tipos de células están presentes en el mismo biorreactor en las condiciones de cultivo. Para los propósitos de la presente invención, los dos o más tipos de células son típicamente ambos microorganismos, típicamente ambas microalgas, pero en algunos casos puede incluir un tipo de célula que no sea de microalgas. Las condiciones de cultivo adecuadas para el co-cultivo incluyen, en algunos casos, aquellos que fomentan el crecimiento y/o la propagación de los dos o más tipos celulares, y, en otros casos, aquellos que facilitan el crecimiento y/o la proliferación de sólo uno, o sólo un subconjunto de las dos o más células, mientras se mantiene el crecimiento celular para el resto.

"Co-factor" define a una molécula, distinta del sustrato, necesaria para que una enzima realice su actividad enzimática.

"Productos alimenticios convencionales" define a una composición destinada para el consumo, por ejemplo humano, que carece de la biomasa de algas u otros componentes de algas e incluye ingredientes comúnmente asociados con el producto alimenticio, en particular un aceite vegetal, grasa animal, y/o huevo(s), junto a otros ingredientes comestibles. Los productos alimenticios convencionales incluyen productos alimenticios que se venden en tiendas y restáurantes y aquellos hechos en casa. Los productos alimenticios convencionales a menudo son confeccionados siguiendo recetas convencionales que especifican la inclusión de un aceite o grasa de una fuente diferente de las algas y/o huevo(s) juntos con otro(s) ingrediente(s) comestible(s).

"Producto cocinado" define a un alimento que se calienta, por ejemplo, en un horno durante un período del tiempo.

"Aderezo cremoso para ensalada" define a un aderezo para ensalada que es una dispersión estable con una alta viscosidad y una tasa lenta de vertimiento. Generalmente, los aderezos cremosos para ensalada son opacos.

"Cultivar", "cultivo" y "fermentar", y variantes de estas, definen el fomento intencional del crecimiento y/o propagación de una o varias células, de manera general microalgas, mediante el empleo de condiciones de cultivo. Las condiciones planificadas excluyen el crecimiento y/o la propagación de microorganismos en la naturaleza (sin la intervención humana directa).

"Citólisis" define la lisis de células en un entorno hipotónico. La citólisis es el resultado de la osmosis o el movimiento del agua al interior de una célula, a un estado de hiperhidratación tal que la célula no puede soportar la presión osmótica del agua dentro y se rompe.

"Fibra dietética" define a los carbohidratos diferentes del almidón, encontrados en plantas y otros organismos que contienen paredes celulares, incluyendo las microalgas. La fibra dietética puede ser soluble (disuelta en el agua) o insoluble (no capaz de ser disuelta en el agua). La fibra dietética total está compuesta por la fibra soluble y la insoluble.

"Comida deslipidada" define a la biomasa de algas que ha sufrido un proceso de extracción del aceite y por tanto contiene menos aceite, con relación a la biomasa antes de la extracción del aceite. Las células presentes en la comida deslipidada son predominantemente Usadas. La comida deslipidada incluye a la biomasa de algas que se extrae con solvente (hexano).

"Proteína cruda digerible" define a la parte de la proteína que está disponible o puede ser convertida en nitrógeno libre (aminoácidos) después de la digestión con enzimas gástricas. La medición in vitro de la proteína cruda digerible se logra usando enzimas gástricas tales como la pepsina y digiriendo una muestra y midiendo el aminoácido libre después de la digestión. La medición in vivo de una proteína cruda digerible se logra midiendo los niveles de proteína en una muestra de comida/alimento, suministrando la muestra a un animal y midiendo la cantidad de nitrógeno que se recoge en el excremento del animal.

"Peso seco" y "peso seco de la célula" definen el peso determinado en ausencia relativa de agua. Por ejemplo, la referencia a la biomasa de microalgas que comprende un porcentaje especificado de un componente particular por peso seco, significa que el porcentaje se calcula basado en el peso de la biomasa después que sustancialmente toda el agua se elimina.

"Ingrediente comestible" define cualquier sustancia o composición que es apta para ser comida. "Ingredientes comestibles" incluyen, sin limitación, granos, frutas, verduras, proteínas, hierbas, especias, carbohidratos y grasas.

"Suministrada exógenamente" define a una molécula que se suministra a una célula (incluye suministrar los medios a una célula en cultivo).

"Grasa" define a un lípido o a una mezcla de lípidos que son generalmente sólidos en condiciones normales de presión y temperatura ambiente. "Grasa" incluye sin limitación, manteca de cerdo y mantequilla.

"Fibra" define a los carbohidratos diferentes del almidón, en forma de polisacáridos. La fibra puede ser soluble o insoluble en agua. Muchas microalgas producen tanto fibra soluble como insoluble, que típicamente forman parte de la pared celular.

"Producto alimenticio terminado" e "ingrediente alimenticio terminado" definen una composición de alimentos que está lista para el envase, uso o consumo. Por ejemplo, un "producto alimenticio terminado" puede haberse cocinado o los ingredientes que comprenden el "producto alimenticio terminado" pueden haberse mezclado o de otra manera integrado entre ellos. Un "ingrediente alimenticio terminado" se usa típicamente en combinación con otros ingredientes, para formar un producto alimenticio.

"Fuente fija de carbono" define la(s) molécula(s) que contienen carbono, típicamente moléculas orgánicas, que están presentes en forma sólida o líquida en condiciones de presión y temperatura ambiente.

"Alimento", "composición alimenticia", "productos alimenticios" y "producto alimenticio" definen cualquier composición que se destina o se espera que sea ingerida por humanos, como fuente de nutrientes y/o calorías. Las composiciones alimenticias están compuestas principalmente de carbohidratos, grasas, agua y/o proteínas y contribuyen considerablemente al consumo calórico diario de una persona. Una "composición alimenticia" puede tener un mínimo de peso que es al menos diez veces el peso de una tableta típica o una cápsula (los intervalos típicos de peso de la tableta/cápsula son menores o iguales a 100 mg y hasta 1500 mg). Una "composición alimenticia" no está encapsulada o en forma de tableta.

"Perfil de glicerolípidos" define la distribución de cadenas carbonadas de diferentes longitudes y los niveles de saturación de los glicerolípidos en una muestra particular de biomasa o aceite. Por ejemplo, una muestra podría tener un perfil de glicerolípidos en el cual aproximadamente el 60 % de los glicerolípidos es C18:l, el 20 % es C18:0, el 15 % es C16:0, y el 5 % es C14:0. Cuando se hace referencia genéricamente a una longitud de cadena carbonada como "C:18", tal referencia puede incluir cualquier cantidad de saturación; por ejemplo, la biomasa de microalgas que contiene 20 % de lípidos como C: 18 puede incluir C18:0, C18:l, C18:2, y similares, en cantidades iguales o diferentes, cuya suma constituye el 20 % de la biomasa. Las referencias a los porcentajes de un cierto tipo de saturación, tales como "al menos 50 % monoinsaturado en una forma de glicerolípidos 18: 1" define que al menos el 50 % de las cadenas alifáticas laterales del glicerolípido son 18:1, pero no significa necesariamente que al menos el 50 % de los triglicéridos sean trioleína (tres cadenas 18:1 unidas a una sola cadena principal de glicerol); tal perfil puede incluir glicerolípidos con una mezcla de 18:1 y otras cadenas laterales, siempre y cuando al menos el 50 % de todas las cadenas laterales sea 18:1.

"Buena práctica de manufactura" y "GMP" definen aquellas condiciones establecidas por las regulaciones expuestas en el 21 C.F.R. 110 (para alimento humano) y 111 (para suplementos dietéticos), o esquemas regulatorios comparables establecidos en escenarios fuera de los Estados Unidos. Las regulaciones estadounidenses son promulgadas por la Agencia de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos bajo la autoridad de la Ley Federal sobre Alimentos, Drogas y Cosméticos, para regular a los fabricantes, procesadores, empaquetadores de productos alimenticios y suplementos dietéticos para el consumo humano.

"Crecimiento" define el aumento del tamaño de la célula, el contenido total celular, y/o la masa celular o el peso de una célula individual, incluyendo el aumento del peso de la célula debido a la conversión de una fuente fija de carbono en aceite intracelular.

"Homogenizado" define la biomasa que se afecta físicamente. La homogeneización es un proceso mecánico fluido que implica la subdivisión de partículas en tamaños más pequeños y uniformes, formando una dispersión que puede ser sometida a procesamientos posteriores. La homogeneización se usa en el tratamiento de varios alimentos y productos lácteos para mejorar la estabilidad el tiempo de vida útil, la digestión y el gusto.

"Incremento del rendimiento lipídico" define un aumento de la productividad de lípidos/aceites de un cultivo microbiano que se puede alcanzar por ejemplo, aumentando el peso seco de las células por litro de cultivo, aumentando el porcentaje de células que contienen lípidos, y/o aumentando la cantidad de lípidos totales por litro de volumen de cultivo por unidad de tiempo.

"In situ" define "en el lugar" o "en su posición original". Por ejemplo, un cultivo puede contener un primer tipo de célula de microalgas que secreta un catalizador y un segundo tipo de célula de microorganismo que secreta un sustrato, en donde el primero y el segundo tipos de células producen los componentes necesarios para que ocurra una reacción química particular in situ en el co-cultivo sin que se requiera separar o procesar posteriormente los materiales.

"Lípido" define cualquier clase de moléculas solubles en solventes no polares (como el éter y el hexano) y relativamente o completamente insolubles en agua. Las moléculas de lípidos tienen estas propiedades, ya que están compuestas en gran parte por largas cadenas hidrocarbonadas que son de naturaleza hidrofóbica. Como ejemplo de lípidos se incluyen los ácidos grasos (saturados e insaturados); glicéridos o glicerolípidos (tales como monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos o grasas neutras, y fosfoglicéridos o glicerofosfolípidos); y no glicéridos (esfíngolípidos, tocoferoles, tocotrienoles, lípidos esteróles incluyendo el colesterol y las hormonas esteroideas, lípidos preñóles incluyendo los terpenoides, alcoholes grasos, ceras, y policétidos).

"Lisado" define una solución que contiene el contenido de células Usadas.

"Lisis" define la rotura de la membrana plasmática y opcionalmente la pared celular de un microorganismo que es suficiente para liberar al menos algún contenido intracelular, lo cual se logra frecuentemente mediante mecanismos mecánicos u osmóticos que ponen en peligro su integridad.

"Lisar" define la perturbación de la membrana celular y opcionalmente de la pared celular de un organismo biológico o célula que es suficiente para liberar al menos algún contenido intracelular.

"Microalgas" define un organismo microbiano eucariota que contiene un cloroplasto, y que puede o no ser capaz de realizar la fotosíntesis. Las microalgas incluyen a los fotoautótrofos obligados, que no pueden metabolizar una fuente fija de carbono como energía, así como los heterótrofos, los cuales pueden vivir únicamente a costa de una fuente fija de carbono, incluyendo los heterótrofos obligados, que no pueden realizar la fotosíntesis. Las microalgas incluyen organismos unicelulares que se separan de células hermanas poco tiempo después de la división celular, tales como las Chlamy domónos, así como microbios tales como por ejemplo, el Volvox, que es un simple microbio multicelular fotosintético de dos tipos de células diferentes. "Microalgas" también incluye células tales como Chlorella, Parachlorella y Dunaliella.

"Biomasa de microalgas", "biomasa de algas" y "biomasa" definen un material producido por el crecimiento y/o la propagación de células de microalgas. La biomasa puede contener células y/o contenido intracelular así como el material extracelular. El material extracelular incluye, pero no se limita a, compuestos secretados por una célula.

"Aceite de microalgas" y "aceite de algas" definen cualquiera de los componentes lipidíeos producidos por células de microalgas, incluyendo los triacilgliceroles.

"Micronizado" define la biomasa que se homogeniz bajo alta presión (o un proceso equivalente) de modo que al menos el 50 % del tamaño de partícula no sea superior a 10 µp? en su dimensión más larga. De manera general, al menos 50 % a 90 % o más de tales partículas son menores de 5 µp? en su dimensión más larga. En cualquier caso, el tamaño de partícula medio de biomasa micronizada es más pequeño que la célula de microalga intacta.

"Microorganismo" y "microbio" definen cualquier organismo microscópico unicelular.

"Suplemento nutritivo" define una composición destinada a complementar la dieta, proporcionando nutrientes específicos en contraposición a grandes cantidades de calorías. Un suplemento nutritivo puede contener alguno o más de los siguientes ingredientes: una vitamina, un mineral, una hierba, un aminoácido, un ácido graso esencial, y otras sustancias. Los suplementos nutritivos son típicamente tabletas o cápsulas. Una simple tableta o cápsula de suplemento nutritivo es ingerido de manera general en un nivel que no excede los 15 gramos por día. Los suplementos nutritivos se pueden ser proporcionar en bolsitas listas-para-mezclar, que pueden ser mezcladas con composiciones de alimentos, tales como el yogur o un "batido", para complementar la dieta, y que son ingeridas de típicamente en un nivel que no excede los 25 gramos por día.

"Aceite" define a cualquier triacilglicérido producido por organismos, incluyendo las microalgas, otras plantas y/o animales. El "aceite", a diferencia de la "grasa", se refiere a menos que se indique de otra manera, a los lípidos que son generalmente líquidos en condiciones normales de presión y temperatura ambiente. Por ejemplo, "aceite" incluye a los aceites vegetales o de semillas derivados de las plantas, incluyendo sin limitación, un aceite derivado de la soya, semilla de colza, cañóla, palma, grano de palma, coco, cereales, aceituna, girasol, semilla de algodón, cufea, cacahuete, camelina sativa, semilla de mostaza, marañón, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza, avellana, euforbia, semilla de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, aceite del árbol de tung, cacao, copra, opio de amapola, semillas de ricino, pacana, jojoba, jatrofa, macadamia, nueces del Brasil y aguacate, así como combinaciones de éstas.

"Choque osmótico" define la ruptura de células en una solución después de una reducción repentina de la presión osmótica y puede ser usado para inducir la liberación de los componentes celulares en una solución.

"Pasteurización" define el proceso de calentamiento que se requiere con el objetivo de disminuir el crecimiento microbiano en productos alimenticios. Típicamente, la pasteurización se realiza a una alta temperatura (pero por debajo de la temperatura de ebullición) durante un corto período de tiempo. Como se ha descrito en este documento, la pasteurización no sólo puede reducir el número de microbios indeseados en productos alimenticios, sino que también puede inactivar ciertas enzimas presentes en el producto alimenticio.

"Polisacárido" y "glicano" definen a cualquier carbohidrato compuesto de monosacáridos unidos mediante acoplamientos glicósidicos. La celulosa es un ejemplo de un polisacárido que forma parte de ciertas paredes celulares de plantas.

"Puerto" define una apertura en un biorreactor que permite el influjo o el eflujo de materiales como son gases, líquidos, y células; un puerto por lo general está unido a una tubería.

"Predominantemente encapsulado" define que más de 50 % y típicamente más de 75 % a 90 % de un componente referenciado, por ejemplo, el aceite de algas, se aisla en un recipiente referenciado, que puede incluir, por ejemplo, una célula de microalgas.

"Células predominantemente intactas" y "biomasa predominantemente intacta" definen una población de células que comprende más de 50, y la mayoría de las veces más de 75, 90, y 98 % de las células intactas. "Intacto", en este contexto, define que la continuidad física de la membrana celular y/o la pared celular que restringe a los componentes intracelulares de la célula no se ha interrumpido de ninguna manera que pueda liberar los componentes intracelulares de la célula a un grado que exceda la permeabilidad de la membrana celular en cultivo.

"Predominantemente lisada" define a una población de células en la cual más del 50 %, y típicamente más de 75 a 90 % de las células se han roto, de modo tal que los componentes intracelulares de la célula no se encuentran completamente restringidos dentro de la membrana celular.

"Proliferación" define una combinación tanto de crecimiento como de propagación.

"Propagación" define un aumento del número de células vía mitosis u otra tipo de división celular.

"Análisis proximal" define el análisis en los productos alimenticios de la grasa, la relación nitrógeno/proteína, la fibra cruda (la celulosa y lignina como principales componentes), la humedad y la ceniza. Los carbohidratos solubles (la fibra total dietética y los azúcares libres) se pueden calcular restando el total de los valores conocidos del análisis proximal de 100 (carbohidratos determinados por diferencia).

"Sonicación" define la ruptura de materiales biológicos, como la célula, mediante la energía de las ondas de sonido.

"Especies de furfura define al 2-furancarboxaldehído y a los derivados de éste que conservan las mismas características estructurales básicas.

"Rastrojo" define a los tallos y hojas secas de un cultivo que quedaron después de que el grano se cosecha.

"Adecuado para el consumo humano" define una composición que puede consumirse por los humanos en su dieta alimenticia sin efectos dañinos para su salud y puede proporcionar un consumo calórico significativo debido a la asimilación del material digerido en el tracto gastrointestinal.

"Producto crudo" define una composición que no se somete a tratamiento térmico, pero puede incluir uno o varios componentes anteriormente sujetos a tratamiento térmico.

"V V" o "v/v", en referencia a las proporciones de volumen, definen la proporción del volumen de una sustancia en una composición con respecto al volumen de la composición. Por ejemplo, refiriéndose a una composición formada por un v/v del 5 % de aceite de microalgas, se define que el 5 % del volumen de la composición está compuesto de aceite de microalgas (por ejemplo, una composición que tiene un volumen de 100 mm3 contendría 5 mm de aceite de microalgas), y el resto del volumen de la composición (por ejemplo, 95 mm3 en el ejemplo) está compuesto por otros ingredientes.

"P/P" o "p/p", en referencia a las proporciones de peso, definen la proporción del peso de una sustancia en una composición con respecto al peso de la composición. Por ejemplo, refiriéndose a una composición formada por un p/p del 5 % de biomasa de microalgas, se define que el 5 % del peso de la composición está compuesto de biomasa de microalgas (por ejemplo, una composición que tiene un peso de 100 mg contendría 5 mg de biomasa de microalgas) y el resto del peso de la composición (por ejemplo, 95 mg en el ejemplo) está compuesto por otros ingredientes.

II. Métodos para la preparación de biomasa de microalgas La presente invención proporciona biomasa de algas adecuada para el consumo humano que es rica en nutrientes, incluyendo componentes de lípidos y/o proteínas, los métodos de combinar los mismos con ingredientes comestibles y composiciones alimenticias que contienen la misma. La invención se originó, en parte, a partir de los descubrimientos de que la biomasa de algas se puede preparar con un alto contenido de aceite y/o con una funcionalidad excelente, e incorporar la biomasa resultante en los productos alimenticios en los que el aceite y/o contenido de proteína de la biomasa pueden sustituir en su totalidad o en parte a los aceites y/o grasas y/o proteínas presentes en los productos alimenticios convencionales. El aceite de algas, que puede comprender predominantemente aceite monoinsaturado, proporciona beneficios para la salud en comparación con las grasas saturadas, hidrogenadas (grasas trans) y poliinsaturadas que se encuentran frecuentemente en los productos alimenticios convencionales. El aceite de algas se puede usar también como un aceite de cocina saludable estable libre de grasas trans. El resto de la biomasa de algas puede encapsular el aceite al menos hasta que un producto alimenticio se cocina, por consiguiente aumenta la durabilidad del aceite. En los productos crudos, en los que las células permanecen intactas, la biomasa, junto con los antioxidantes naturales que se encuentran en el aceite, protegen también al aceite de la oxidación, que de lo contrario podría crear olores, sabores y texturas desagradables. La biomasa proporciona también varios micro-nutrientes beneficiosos, además del aceite y/o la proteína, tales como fibras dietéticas derivadas de algas (tanto carbohidratos solubles como insolubles), fosfolípidos, glicoproteínas, fitosteroles, tocoferoles, tocotrieneoles, y selenio.

Esta primera sección revisa los tipos de microalgas adecuadas para el uso en los métodos de la invención (parte A), los métodos de generación de una cepa de microalgas que carece o tiene una pigmentación significativamente reducida (parte B), las condiciones de cultivo (parte C) que se usan después para propagar la biomasa, las etapas de concentración que se usan después para preparar la biomasa durante el procesamiento adicional (parte D), y concluye con una descripción de la composición química de la biomasa preparada de acuerdo con los métodos de la invención (parte E).

Microalgas para el uso en los métodos de la invención Una variedad de especies de microalgas que producen aceites adecuados y/o lípidos y/o proteína se pueden usar de acuerdo con los métodos de la presente invención, aunque son preferidas las microalgas que producen naturalmente altos niveles de aceites adecuados y/o lípidos y/o proteína. Las consideraciones que afectan la selección de las microalgas para el uso en la presente invención incluyen, además de la producción de aceites adecuados, lípidos, o proteína para la producción de productos alimenticios: (1) el alto contenido de lípido (o proteína) como un porcentaje de peso celular; (2) la facilidad de crecimiento; (3) la facilidad de propagación; (4) la facilidad de procesamiento de biomasa; (5) el perfil de glicerolípido, y (6) la ausencia de toxinas de algas (el ejemplo 5 a continuación muestra la biomasa seca de microalgas y los aceites o lípidos extraídos de la biomasa que carece de toxinas de algas).

En algunas modalidades, la pared celular de las microalgas se debe romper durante el procesamiento del alimento (por ejemplo, al cocinarlo), para liberar los componentes activos o para la digestión, y, en estas modalidades se prefieren las cepas de microalgas con paredes celulares susceptibles a la digestión en el tracto gastrointestinal de un animal, por ejemplo, un humano u otros monogástricos, en especial si la biomasa de algas se debe usar en los productos alimenticios crudos. La digestibilidad se disminuye generalmente para las cepas de microalgas que tienen un alto contenido de celulosa hemicelulosa en las paredes celulares. La digestibilidad se puede evaluar mediante un ensayo estándar de digestibilidad de la pepsina.

En modalidades particulares, las microalgas comprenden células que son al menos 10% o más de aceite por peso seco. En otras modalidades, las microalgas contienen al menos 25-35% o más de aceite por peso seco. Generalmente, en estas modalidades, mientras más alto sea el contenido de aceite, en las microalgas, más nutritiva es la biomasa, por lo que las microalgas que se pueden cultivar para contener al menos 40%, al menos 50%, 75% o más de aceite por peso seco, son especialmente preferidas. Las microalgas preferidas para el uso en los métodos de la invención pueden cultivarse heterotróficamente (sobre azúcares en ausencia de luz) o son heterótrofos obligados. No todos los tipos de lípidos son convenientes para usar en alimentos y/o nutracéuticos, pues podrían tener un sabor no deseado u olor desagradable, así como presentar pobre estabilidad o proporcionar una pobre sensación bucal, y estas consideraciones influyen también en la selección de las microalgas para usar en los métodos de la invención.

Las microalgas del género Chlorella son útiles generalmente en los métodos de la invención. La Chlorella es un género de algas verdes unicelulares, que pertenecen al phylum Chlorophyta. Las células de Chlorella son generalmente de forma esférica, aproximadamente de 2 a 10 µp? de diámetro, y carecen de flagelos. Algunas especies de Chlorella son naturalmente heterotróficas. En modalidades preferidas, la microalga usada en los métodos de la invención es Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella minutissima, Chlorella zofinienesi, Chlorella luteoviridis, Chlorella kessleri, Chlorella sorokiniana, Chlorella fusca var. vacuolata Chlorella sp., Chlorella cf. minutissima o Chlorella emersonii. La Chlorella, en particular, laChlorella protothecoides, es un microorganismo preferido para el uso en los métodos de la invención debido a su alta composición de lípidos. Las especies de Chlorella protothecoides preferidas en particular para el uso en los métodos de la invención incluyen aquellas ejemplificadas en los ejemplos a continuación.

Otras especies de Chlorella adecuadas para usar en los métodos de la invención incluyen las especies seleccionadas del grupo consistente de anitrata, Antárctica, aureoviridis, candida, capsúlate, desiccate, ellipsoidea (incluyendo la cepa CCAP 211/42), emersonii, fusca (incluyendo var. vacuolata), glucotropha, infusionum (incluyendo var. actophila y var. auxenophila), kessleri (incluyendo cualquiera de las cepas UTEX 397,2229,398), lobophora (incluyendo la cepa SAG 37.88), luteoviridis (incluyendo la cepa SAG 2203 y var. aureoviridis y lutescens), miniata, cf. minutissima, minutissima (incluyendo la cepa UTEX 2341), mutabilis, nocturna, ovalis, parva, photophila, pringsheimii, protothecoides (incluyendo cualquiera de las cepas UTEX 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25 o CCAP 211/8D o CCAP 211/17 y var. acidicold), regularis (incluyendo var. mínima, y umbricata), reisiglii (incluyendo la cepa CCP 11/8), saccharophila (incluyendo la cepa CCAP 211/31, CCAP 211/32 y var. ellipsoided), salina, simplex, sorokiniana (incluyendo la cepa SAG 211.40B), sp. (incluyendo la cepa UTEX 2068 y CCAP 211/92), sphaerica, stigmatophora, trebouxioides, vanniellii, vulgaris (incluyendo las cepas CCAP 211/11K, CCAP 211/80 yf.tertia y var. autotrophica, viridis, vulgaris, vulgaris f. tertia vulgaris f. viridis), xanthella y zofingiensis.

Las especies de Chlorella (y especies de otros géneros de microalgas) para usar en la invención se pueden identificar por la comparación de determinadas regiones blanco de su genoma con esas mismas regiones de especies identificadas en este documento; las especies preferidas son aquellas que presentan identidad o al menos un elevado nivel de homología con las especies identificadas en este documento. Por ejemplo, la identificación de una de las especies o cepa específica de Chlorella se puede lograr a través de la amplificación y secuenciación de ADN nuclear y/o de cloroplasto mediante los cebadores y la metodología usando las regiones apropiadas del genoma, por ejemplo, mediante los métodos descritos en Wu y otros, Bot. Bull. Acad. Sin. 42:115-121 (2001), Identification of Chlorella spp. isolates using ribosomal DNA sequences. Los métodos de análisis filogenéticos bien establecidos, tales como son la amplificación y secuenciación del espaciador interno transcrito de ribosoma (ITS1 e ITS2 del ADNr), AR 23S, AR r 18S, y otras regiones genómicas conservadas se pueden usar por aquellos expertos en la técnica para identificar las especies no sólo de Chlorella, sino de otras microalgas que producen aceite y lípido adecuadas para el uso en los métodos descritos en este documento. Para los ejemplos de métodos de identificación y clasificación de las algas ver Genetics, 170(4):1601-10 (2005) y RNA, 11(4):361-4 (2005).

De este modo, se puede usar la comparación del ADN genómico para identificar las especies adecuadas de microalgas a usarse en la presente invención. Las regiones de ADN genómico conservado, tales como y no limitadas al ADN que codifica para el ARNr 23 S, se pueden amplificar de especies de microalgas que podrían estar taxonómicamente relacionadas, por ejemplo, con las microalgas preferidas usadas en la presente invención y comparadas con las regiones correspondientes de aquellas especies preferidas. Las especies que presentan un alto nivel de similitud se seleccionan después para el uso en los métodos de la invención. Los ejemplos ilustrativos de semejante comparación de secuencia de ADN entre las especies dentro del género Chlorella se presentan a continuación. En algunos casos, las microalgas que se prefieren para el uso en la presente invención tienen secuencias de ADN genómico que codifica para el ARNr 23S que tienen al menos 65% de identidad de nucleótido para al menos una de las secuencias enumeradas en las sec. con núm. de ident: 1-23 y 26-27. En otros casos, las microalgas que se prefieren para el uso en la presente invención tienen secuencias de ADN genómico que codifican para el ARNr 23 S que tienen al menos 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de nucleótido para al menos una o más de las secuencias enumeradas en las sec. con núm. de ident: 1 -23 y 26-27. El genotipado de una composición alimenticia y/o de la biomasa de algas se combina antes con el de otros ingredientes para formular una composición alimenticia que es un método fiable también para determinar si la biomasa de algas es más de una única cepa de microalgas.

Durante la comparación de secuencias para determinar el por ciento de identidad de nucleótido o aminoácido, una secuencia actúa típicamente como una secuencia de referencia, a la que se comparan las secuencias de prueba. Al aplicar un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia se introducen en una computadora, las coordenadas posteriores se designan, si es necesario, y se designan los parámetros del programa para el algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de la secuencia calcula después el por ciento de identidad de secuencia para la secuencia(s) de prueba en relación con la secuencia de referencia, basado en los parámetros de programa designados. La alineación óptima de las secuencias para la comparación se puede conducir, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math, 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y& Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda del método de similitud de Pearson y& Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por las implementaciones computarizadas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de genética de Wisconsin, Grupo informático de genética, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual (ver generalmente Ausubel y otros, supra). Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el por ciento de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo de BLAST, que se describe en Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa para realizar análisis de BLAST está disponible al público a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (en el sitio web www.ncbi.nlm.nih.gov).

Adicionalmente a la Chlorella, otro género de microalgas se puede usar también en los métodos de la presente invención. En modalidades preferidas, la microalga es una especie selecionada del grupo consistente de Parachlorella kessleri, Parachlorella beijerinckii, Neochloris oleabundans, Bracteacoccus, incluyendo B. granáis, B. cinnabarinas, y B. aerius, Bracteococcus sp. o Scenedesmus rebescens. Otros ejemplos no limitantes de especies de microalgas incluyen las especies del grupo de las especies y género consistente de Achnanthes orientalis; Agmenellum; Amphiprora hyaline; Amphora, que incluye A. coffeiformis que incluye A.c. linea, A.c. punctata, A.c. taylori, A.c. tennis, A. c. delicatissima, A.c. delicatissima capitata; Anabaena; Ankistrodesmus, que incluye A. falcatus; Boekelovia hooglandii; Borodinella; Botryococcus braunii, que incluye B. sudeticus; Bracteoccocus, que incluye B. aerius, B.grandis, B.cinnabarinas, B.minor, y B. medionucleatus; Cartería; Chaetoceros, que incluye C. gracilis, C. muelleri, y C. muelleri subsalsum; Chlorococcum, que incluye C. infusionum; Chlorogonium; Chroomonas; Chrysosphaera; Cricosphaera; . Crypthecodinium cohnii; Cryptomonas; Cyclotella, que incluye C. cryptica y C. meneghiniana; Dunaliella, que incluye D. bardawil, D. bioculata, D. granúlate, D. maritime, D. minuta, D. parva, D. peircei, D. primolecta, D. salina, D. terrícola, D. tertiolecta, y D. viridis; Eremosphaera, que incluye E. viridis; Ellipsoidon; Euglena; Franceia; Fragilaria, que incluye F. crotonensis; Gleocapsa; Gloeothamnion; Hymenomonas; ísochrysis, que incluye /. aff. galbana y I. galbana; Lepocinclis; Micractinium (incluyendo UTEX LB 2614); Monoraphidium, que incluye M. minutum; Monoraphidium; Nannochloris; Nannochloropsis, que incluye N. salina; Navícula, que incluye N acceptata, N. biskanterae, N. pseudotenelloides, N. pelliculosa, y N. saprophila; Neochloris oleabundans; Nephrochloris; Nephroselmis; Nitschia communis; Nitzschia, que incluye JV. alexandrina, N. communis, N. dissipata, N. frustulum, N. hantzschiana, N. inconspicua, N. intermedia, N. microcephala, N. pusilla, N. pusilla elliptica, N. pusilla monoensis, and N. quadrangular; Ochromonas; Oocystis, que incluye O. parva y O. pusilla; Oscillatoria, que incluye O. limnetica y O. subbrevis; Parachlorella, que incluye P. beijerinckii (incluyendo la cepa SAG 2046) y P. kessleri (que incluye cuaquiera de las cepas SAG 11.80, 14.82, 21.11H9); Pascheria, que incluye P. acidophila; Pavlova; Phagus; Phormidium; Platymonas; Pleurochrysis, que incluye P. carterae y P. dentate; Prototheca, que incluye P. stagnora (incluyendo UTEX 327), P. portoricensis, y P. moriformis (incluyendo cepas de UTEX 1441,1435, 1436, 1437, 1439); Pseudochlorella aquatica; Pyramimonas; Pyrobotrys; Rhodococcus opacus; Sarcinoid chrysophyte; Scenedesmus, que incluye S. armatus y S. rubescens; Schizochytrium; Spirogyra; Spirulina platensis; Stichococcus; Synechococcus; Tetraedron; Tetraselmis, que incluye T. suecica; Thalassiosira weissflogii; yViridiella fridericiana.

B. Métodos de generación de una cepa de microalgas que carece o ha reducido significativamente la pigmentación.

Las microalgas, tales como Chlorella, pueden ser capaces del crecimiento ya sea fotosintético o heterotrófico. Cuando se cultiva en condiciones heterotróficas donde la fuente de carbono es una fuente fija de carbono y en la ausencia de luz, la microalga que normalmente se colorea de verde tiene un color amarillo, que carece o se reduce significativamente en la pigmentación verde. Las microalgas de pigmentación verde reducida (o carente) pueden ser ventajosas como un ingrediente alimenticio. Una de las ventajas de las microalgas de pigmentación verde reducida (o carente) es que la microalga tiene un sabor reducido de clorofila. Otra ventaja de las microalgas de pigmentación verde reducida (o carente) es como un ingrediente alimenticio, la adición de las microalgas a los alimentos, no darán un color verde que sea desagradable al consumidor. La pigmentación verde reducida de del cultivo de microalgas es transitoria bajo condiciones heterotróficas.

Cuando se cambia de nuevo al crecimiento fototrófico, las microalgas capaces tanto del crecimiento fototrófico como heterotrófico recuperarán la pigmentación verde. Además, incluso con los pigmentos verdes reducidos, la microalga que heterotróficamente se cultiva es de un color amarillo y esto podría ser inadecuado para algunas aplicaciones alimenticias donde el consumidor espera que el color de los alimentos sea blanco o de color claro. De este modo, es ventajoso generar una cepa de microalgas que sea capaz de un crecimiento heterotrófico (de tal modo se reduce o carece en la pigmentación verde) y se reduce también en la pigmentación amarilla (de tal modo que sea un color neutro para aplicaciones alimenticias).

Un método para la generación de semejante cepa de microalgas que carece de o ha reducido significativamente la pigmentación es a través de la mutagénesis y después la selección para el fenotipo conveniente. Diversos métodos de mutagénesis se conocen y practican en la técnica. Por ejemplo, Urano y otros, (Urano y otros, J Bioscience Bioengineering (2000) vol. 90 (5): págs. 567-569) describen imitantes de Chlorella ellipsoidea de color amarillo y negro generados mediante la radiación de UV. Kamiya (Kamiya, Plant Cell Physiol. (1989) vol. 30 (4): 513-521) describe una cepa incolora de Chlorella vulgaris, 1 lh (M125).

Además de la mutagénesis por radiación de UV, la mutagénesis química se puede emplear también para generar las microalgas con pigmentación reducida (o carente). Los mutágenos químicos, tales como metanosulfonato de etilo (EMS) o N-metil-N'nitro-N-nitroguanidina (NTG) mostraron ser eficaces mutágenos químicos en una variedad de microbios, que incluyen levaduras, hongos, micobacterias y microalgas. La mutagénesis se puede llevar a cabo también en varias rondas, donde se expone la microalga al mutágeno (ya sea UV o químico o ambos) y se selecciona después para el fenotipo conveniente de pigmentación reducida. Las colonias con el fenotipo conveniente se estrían después en las placas y reaislan para asegurar que la mutación es estable de una generación a otra y que la colonia es pura y no de una población mixta.

En un ejemplo en particular, Chlorella protothecoides se usó para generar cepas carentes o con pigmentación reducida mediante una combinación de ÜV y mutagénesis química. La Chlorella protothecoides se expuso a una ronda de mutagénesis química con NTG y las colonias se seleccionaron para los imitantes de color. Las colonias que no presentaron mutaciones de color se sometieron después a una ronda de radiación UV y se seleccionaron de nuevo para los mutantes de color. En una modalidad, se aisló una cepa de Chlorella protothecoides carente de pigmentación y es Chlorella protothecoides 33-55, depositada el 13 de octubre de 2009 en la Colección Americana de Cultivos Tipo en 10801 University Bóulevard, Manassas, VA 20110-2209, de acuerdo con el tratado de Budapest, con una denominación de depósito de patente PTA-XXXX. En otra modalidad, se aisló una cepa de Chlorella protothecoides con pigmentación reducida y es Chlorella protothecoides 25-32, depositada el 13 de octubre de 2009 en la Colección Americana de Cultivo Tipo, en 10801 University Bóulevard, Manassas, VA 20110-2209, de acuerdo con el tratado de Budapest, con una denominación de depósito de patente PTA-XXXX.

C. Medios y condiciones de cultivo para las microalgas Las microalgas se cultivan en medio líquido para propagar la biomasa de acuerdo con los métodos de la invención. En los métodos de la invención, las especies de microalgas se cultivan en un medio que contiene una fuente fija de carbono y/o fuente fija de nitrógeno en la ausencia de luz. El crecimiento de este tipo se conoce como crecimiento heterotrófico. Para algunas especies de microalgas, por ejemplo, el crecimiento heterotrófico durante largos períodos de tiempo tales como 10 a 15 o más días bajo condiciones limitadas de nitrógeno resulta en la acumulación de alto contenido de lípido en las células.

Los medios de cultivo de microalgas contienen típicamente componentes tales como una fuente fija de carbono (se discute a continuación), una fuente fija de nitrógeno (tales como proteínas, harina de soya, extracto de levadura, licor de maíz macerado, amoníaco (puro o en forma de sal), nitrato, o sal de nitrato), oligoelementos (por ejemplo, zinc, boro, cobalto, cobre, manganeso y molibdeno en, por ejemplo, las formas respectivas de ZnCl2, H3BO3, CoCl2-6H20, CuCl2 2H20, MnCl2-4H20 y (NH4)6Mo7024-4H20), opcionalmente, un tampón para el mantenimiento de pH, y fosfato (una fuente de fósforo; se pueden usar otras sales de fosfato). Otros componentes incluyen las sales tales como cloruro de sodio, en particular para las microalgas de agua de mar.

En un ejemplo en particular, un medio adecuado para el cultivo de Chlorella protothecoides comprende el medio de proteosa. Este medio es adecuado para cultivos axénicos, y un volumen de 11 del medio (pH ~ 6.8) se puede preparar por la adición de 1 g de proteosa peptona para 11 de medio bristol. El medio bristol comprende en una solución acuosa 2.94 mM de NaN03, 0.17 mM de CaCl2 · 2H20, 0.3 mM de MgS04 · 7H20, 0.43 mM, 1.29 mM de KH2P04, y 1.43 mM de NaCl. Para 1.5% de medio agar, se pueden adicionar 15 g de agar a 1 1 de solución. La solución se cubre y esteriliza en autoclave, y se guarda después a una temperatura refrigerada antes de usar. Otros métodos se describieron para el crecimiento y la propagación de Chlorella protothecoides para altos niveles de aceite como porcentaje de peso seco (ver, por ejemplo, Miao y Wu, J. Biotechology, 2004, 11:85-93 y Miao y Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846 (que muestra los métodos de fermentación para la obtención de 55% de aceite del peso seco celular)). Las algas ricas en aceite se pueden generar típicamente por el aumento de la duración de una fermentación mientras que se proporciona un exceso de fuente de carbono bajo limitación de nitrógeno.

Los medios de crecimiento sólidos y líquidos están disponibles generalmente a partir de una amplia variedad de fuentes, y las instrucciones para la preparación de los medios en particular que son adecuados para una amplia variedad de cepas de microorganismos se pueden encontrar por internet, por ejemplo, en http://www.utex.org/, un sitio mantenido por la Universidad de Texas en Austin para su colección de cultivos de algas (UTEX). Por ejemplo, varios medios acuosos frescos incluyen 1/2, 1/3, 1/5, IX, 2/3, 2X de medio Diatomea CHEV; 1:1 de DYIII/PEA + Gr+; medio Diatomea Ag; medio Alien; medio BG11-1; medio Bold 1NV y 3N; medio de Botryococcus; medio Bristol; medio de Chu; medio Diatomea CR1, CR1-S, y CR1+; medio Cianidio; medio Cianoficeano; medio Desmid; medio DYIII; medio Euglena; medio HEPES; medio J; medio Malta; medio MES; medio Bold 3N modificado; medio COMBO modificado; medio N/20; medio ocromonas; medio P49; medio Politomella; medio de Proteosa; medios de algas de nieve; medio de extracto de suelo; agua de suelo: medio BAR, GR-, GR-/NH4, GR+, GR+/NH4, PEA, turba, y VT; medio espirulina; medio Tap; medio Trebouxia; medio Volvocacean; medio Volvocacean-3N; medio Volvox; medio Volvox-Dextrosa; medio Waris; y medio Waris+medio de extracto de suelo. Diferentes medios de agua salada incluyen: 1%, 5%, y medio F/2 IX; medio de Erdschreiber 1/2, IX, y 2X; 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, IX, 5/3, y medio 2X de suelo+ agua de mar; 1/4 ERD; 2/3 de medio de agua de mar enriquecido; 20% de Alien + 80 % de ERD; medio de agua de mar artificial; medio de BG11-1+ .36% de NaCl; medio de BGl l-1 + 1% de NaCl; Bold lNV:Erdshreiber (1: 1) y (4: 1); medio Bristol-NaCl; medio de agua de mar Dasicladales; 1/2 y IX de medio de agua de mar enriquecido, que incluye ES/10, ES/2, y ES/4; F/2+NH4; medio LDM; CHEV modificado IX y 2X; CHEV modificado 2 + suelo; medio modificado de agua de mar artificial; medio Porfridio; y medio Diatomea SS.

Otros medios adecuados para el uso con los métodos de la invención se pueden identificar fácilmente mediante la consulta de la URL identificada anteriormente, o mediante la consulta de otras organizaciones que mantienen los cultivos de microorganismos, tales como SAG, CCAP, o CCALA. La SAG se refiere a la colección de cultivo de algas en la Universidad de Góttingen (Góttingen, Alemania), la CCAP se refiere a la colección de cultivos de algas y protozoos dirigido por la Asociación Escocesa de Ciencias Marinas (Escocia, Reino Unido), y el CCALA se refiere a la colección de cultivo del laboratorio de algas en el Instituto de Botánica (Tfeboñ, República Checa).

Los microorganismos útiles se encuentran en diferentes sitios y ambientes en todo el mundo, de acuerdo con los métodos de la presente invención. Como una consecuencia de su aislamiento a partir de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, puede ser difícil o imposible de predecir el medio de cultivo particular para un crecimiento óptimo y la generación de aceite y/o lípido y/o proteína de cualquiera de las especies en particular del microbio, pero aquellos expertos en la técnica pueden encontrar fácilmente los medios apropiados por las pruebas de rutina, considerando la descripción en este documento. En algunos casos, determinadas cepas de microorganismos podrían ser incapaces de cultivarse en un medio de cultivo en particular, debido a la presencia de algún componente inhibitorio o la ausencia de alguna necesidad nutritiva esencial requerida en particular por la cepa del microorganismo. Los ejemplos a continuación proporcionan los métodos ejemplares de cultivo de diferentes especies de microalgas para acumular altos niveles de lípido como un porcentaje del peso seco celular.

La fuente fija de carbono es un componente clave del medio. Las fuentes fijas de carbono adecuadas para los propósitos de la presente invención, incluyen, por ejemplo, glucosa, fructosa, sacarosa, galactosa, xilosa, mañosa, ramnosa, arabinosa, N-acetilglucosamina, glicerol, floridosida, ácido glucurónico, y/o acetato. Otras fuentes de carbono para el cultivo de microalgas, de acuerdo con la presente invención incluyen mezclas, tales como mezclas de glicerol y glucosa, mezclas de glucosa y xilosa, mezclas de fructosa y glucosa, y mezclas de sacarosa y pulpa despolimerizada de remolacha. Otras fuentes de carbono adecuadas para el uso en el cultivo de microalgas incluyen, licor negro, almidón de maíz, material celulósico despolimerizado (derivados de, por ejemplo, paja de maíz, pulpa de remolacha, y pasto de aguja, por ejemplo), lactosa, suero de leche, melaza, papa, arroz, sorgo, sacarosa, remolacha, caña de azúcar y trigo. Una o más fuente(s) de carbono se pueden suministrar a una concentración de al menos aproximadamente 50 µ?, al menos aproximadamentelOO µ?, al menos aproximadamente 500 µ?, al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 50 mM, y al menos aproximadamente 500 mM.

De este modo, en diferentes modalidades, la fuente de energía fija de carbono que se usa en el medio de cultivo comprende glicerol y/o azúcares de 5- y/o 6-carbonos, tales como glucosa, fructosa y/o xilosa, que se pueden derivar a partir de sacarosa y/o material celulósico, que incluye material celulósico despolimerizado. Múltiples especies de Chlorella y múltiples cepas dentro de una especie se pueden cultivar en presencia de sacarosa, material celulósico despolimerizado, y glicerol, como se describió en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núms. 20090035842, 20090011480, 20090148918, respectivamente, y ver también, la publicación de solicitud de patente PCT núm. 2008/151149, cada uno de las cuales se incorpora como referencia a este documento.

De este modo, en una modalidad de la presente invención, los microorganismos se cultivan usando la biomasa celulósica despolimerizada como una materia prima. A diferencia de otras materias primas, tales como almidón de maíz o la sacarosa de caña de azúcar o remolacha, la biomasa celulósica (despolimerizada o diferente) no es adecuada para el consumo humano y, potencialmente, podría estar disponible a bajo costo, lo que la hace particularmente ventajosa para los propósitos de la presente invención. Las microalgas pueden proliferar en el material celulósico despolimerizado. Los materiales celulósicos incluyen generalmente celulosa en 40-60% del peso seco; hemicelulosa en 20-40% del peso seco, y lignina en 10-30% del peso seco. Los materiales celulósicos adecuados incluyen residuos de cultivos de fibra herbácea y leñosa, así como cultivos agrícolas, es decir, partes de la planta, principalmente tallos y hojas, que no se eliminaron de los campos con el alimento principal o el producto de fibra. Los ejemplos incluyen los desperdicios agrícolas tales como, el bagazo de caña de azúcar, cáscara de arroz, fibra de maíz (incluyendo tallos, hojas, cortezas, y mazorcas), paja de trigo, paja de arroz, pulpa de remolacha, pulpa de cítrico, cáscaras de cítrico; los desperdicios forestales, tales como, diluyentes de madera dura y blanda y residuos de madera dura y blanda de las operaciones de madera; los desperdicios de madera tales como, desperdicios de aserraderos (virutas de madera, aserrín) y desperdicio del molino de pulpa; los desperdicios urbanos, tales como, fracciones de papel del desperdicio sólido municipal, desperdicio urbano de madera y desperdicio urbano verde, tales como, recortes de hierba municipales; y el desperdicio de la construcción con madera. Los celulósicos adicionales incluyen los cultivos celulósicos dedicados, tales como, pasto de aguja, madera híbrida de álamo, y miscantus, fibra de caña, fibra de sorgo. Los azúcares de cinco carbonos que se producen de semejantes materiales incluyen xilosa. El Ejemplo 20 describe Chlorella protothecoides que se cultiva con éxito en condiciones heterotróficas usando azúcares derivados celulósicos de paja de maíz y pulpa de remolacha.

Algunos microbios son capaces de procesar el material celulósico y utilizan materiales celulósicos directamente como una fuente de carbono. Sin embargo, el material celulósico necesita tratarse típicamente para aumentar el área superficial de acceso o para que la celulosa sea descompuesta primero como una preparación de utilización microbiana como fuente de carbono. Los métodos de preparación o pretratamiento del material celulósico para la digestión enzimática se conocen bien en la técnica. Los métodos se dividen en dos categorías principales: (1) la separación del material celulósico por ruptura en partículas más pequeñas para aumentar el área superficial de acceso, y (2) el tratamiento químico del material celulósico para crear un sustrato utilizable durante la digestión enzimática.

Los métodos para aumentar el área superficial de acceso incluyen la explosión de vapor, que involucra el uso de vapor a altas temperaturas para separar por ruptura los materiales celulósicos. Debido a la necesidad de alta temperatura de este proceso, se podrían perder algunos de los azúcares en el material celulósico, reduciendo de este modo la fuente de carbono disponible para la digestión enzimática (ver, por ejemplo, Chahal, D.S. y otros, Proceedings of the Td World Congress of Chemical Engineering; (1981) y Kaar j> otros, Biomass and Bioenergy (1998) 14(3):277-87). La explosión de amoníaco permite la explosión de material celulósico a una temperatura más baja, pero es más costoso de realizar, y el amoníaco pudiera interferir con los procesos posteriores de digestión enzimática (ver por ejemplo, Dale, B.E. y otros, Biotechnology and Bioengineering (1982); 12: 31-43). Otra técnica de explosión involucra el uso de explosión supercrítica de dióxido de carbono para romper el material celulósico en fragmentos más pequeños (ver por ejemplo, Zheng y otros, Biotechnology Letters (1995), 17 (8): 845-850).

Los métodos de tratamiento químico del material celulósico para crear sustratos utilizables por la digestión de la enzima se conocen también en la técnica. La patente de los Estados Unidos núm. 7,413,882 describe el uso de microbios genéticamente modificados que segregan beta-glucosidasa en el caldo de fermentación y el tratamiento de material celulósico con el caldo de fermentación para mejorar la hidrólisis del material celulósico en glucosa. El material celulósico se puede tratar también con ácidos y bases fuertes para ayudar a la posterior digestión enzimática. La patente de los Estados Unidos núm. 3,617,431 describe el uso de la digestión alcalina para descomponer los materiales celulósicos.

La Chlorella puede proliferar en los medios que contienen combinaciones de xilosa y glucosa, tales como material celulósico despolimerizado, y sorprendentemente, algunas especies presentan aún niveles superiores de productividad cuando se cultivan en una combinación de glucosa y xilosa que cuando se cultivan sólo en glucosa o xilosa. De este modo, determinadas microalgas pueden utilizar tanto una materia prima no comestible diferente, tal como material celulósico (o un material celulósico pre-tratado) o glicerol, como una fuente de carbono y producir aceites comestibles. Esto permite la conversión de la celulosa no comestible y el glicerol, que normalmente no son parte de la cadena alimentaria humana (a diferencia de la glucosa de maíz y sacarosa de la caña de azúcar y remolacha) en alta nutrición, aceites comestibles, que pueden proporcionar nutrientes y calorías como parte de la dieta humana diaria. De este modo, la invención proporciona los métodos para convertir la materia prima no comestible en aceites comestibles de alta nutrición, productos alimenticios, y composiciones alimenticias.

Las microalgas que se co-cultivan con un organismo que expresa por secreción una invertasa de sacarosa o se cultivan en medios que contienen una invertasa de sacarosa o que expresan un gen exógeno de invertasa de sacarosa (donde la invertasa se secreta o el organismo expresa también un transportador de sacarosa), pueden proliferar en la melaza desperdiciada de melaza de la caña de azúcar u otras fuentes de sacarosa. El uso de este tipo de productos desperdiciados de bajo valor, que contienen sacarosa puede proporcionar ahorros de costos significativos en la producción de aceites comestibles. De este modo, los métodos de cultivo de microalgas en una materia prima de sacarosa y la formulación de composiciones alimenticias y suplementos nutritivos, como se describen en este documento, proporcionan un medio para convertir la baja nutrición de sacarosa en aceites de alta nutrición (ácido oleico, DHA, ARA, etc.) y biomasa que contiene semejantes aceites.

Como se detalló en las publicaciones de patentes citadas anteriormente, las especies y cepas múltiples de Chlorella distintas proliferan muy bien no sólo en glicerol de grado reactivo purificado, sino también en derivados de glicerol acidulados y no acidulados a partir de la transesterificación del biodiesel. Sorprendentemente, algunas cepas de Chlorella sufren una división celular más rápida en la presencia de glicerol que en presencia de glucosa. Los procesos de crecimiento de dos etapas, en los que las células se alimentan primero de glicerol, para aumentar la densidad celular rápidamente, y se alimentan de glucosa después para acumular lípidos, pueden mejorar la eficacia con la que se producen los lípidos.

Otro método para aumentar el contenido de lípido como un porcentaje de peso seco celular involucra el uso de acetato como la materia prima para las microalgas. El acetato alimenta directamente en el punto del metabolismo que inicia la síntesis de ácido graso (es decir, acetil-CoA); de este modo, se puede aumentar la producción de ácido graso proporcionando acetato en el cultivo. Generalmente, el microbio se cultiva en presencia de una cantidad suficiente de acetato para aumentar el rendimiento microbiano de lípidó y/o ácido graso, específicamente, en relación con el rendimiento en la ausencia de acetato. La alimentación de acetato es un componente útil de los métodos que se proporcionan en este documento para la generación de la biomasa de microalgas que tiene un alto porcentaje de peso seco celular como lípido.

En otra modalidad, el rendimiento de lípido se aumenta mediante el cultivo de una microalga que produce lípido en la presencia de un cofactor o más para una enzima de la vía de lípido (por ejemplo, una enzima sintética del ácido graso). Generalmente, la concentración del(de los) cofactor(es) es suficiente para aumentar el rendimiento del lípido microbiano (por ejemplo, ácido graso) por encima del rendimiento de lípido microbiano en ausencia del(de los) cofactor(es). En modalidades particulares, del(de los) cofactor(es) se proporciona(n) al cultivo por la inclusión en el cultivo de un microorganismo que secreta del(de los) cofactor(es) o por la adición del(de los) cofactor(es) al medio de cultivo. Por otra parte, las microalgas se pueden modificar para expresar un gen exógeno que codifica una proteína que participa en la síntesis del cofactor. En determinadas modalidades, los cofactores adecuados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de la vía de lípido, tales como, por ejemplo, biotina o pantotenato.

La biomasa de alto contenido en lípido a partir de microalgas es un material ventajoso para su inclusión en los productos alimenticios en comparación con la biomasa pobre en lípido, debido a que permite incorporar la misma cantidad de lípido en una composición alimenticia por la adición de menos biomasa de microalgas. Esto es una ventaja, debido a que los aceites saludables a partir de microalgas de alto contenido de lípidos se pueden adicionar a los productos alimenticios sin alterar otros atributos tales como la textura y el sabor comparado con la biomasa pobre en lípido. La biomasa de alto contenido en lípido que se proporciona por los métodos de la invención tiene típicamente, al menos 25% de lípido por peso seco de la célula. Las condiciones del proceso se pueden ajustar para aumentar el porcentaje de peso de células que es de lípido. Por ejemplo, en determinadas modalidades, una microalga se cultiva en presencia de una concentración límite de uno o más nutrientes, tales como, por ejemplo, nitrógeno, fósforo o azufre, aunque se proporciona un exceso de una fuente fija de carbono, tal como glucosa. La limitación de nitrógeno tiende a aumentar el rendimiento de lípido microbiano por encima del rendimiento de lípido microbiano en un cultivo en el que se proporciona el nitrógeno en exceso. En modalidades particulares, el aumento en el rendimiento de lípido es al menos aproximadamente 10%, 50%, 100%, 200% ó 500%. El microbio se puede cultivar en la presencia de una cantidad limitante de un nutriente durante una parte del período total de cultivo o durante el período completo. En algunas modalidades, la concentración de nutriente se alterna entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el período total de cultivo.

En un estado estacionario de crecimiento, las células acumulan aceite, pero no sufren división celular. En una modalidad de la invención, el estado de crecimiento se mantiene por la continuidad de proporcionar todos los componentes de los medios de crecimiento originales a las células, con la excepción de una mente fija de nitrógeno. El cultivo de células de microalgas por la alimentación de todos los nutrientes proporcionados inicialmente a las células, excepto una fuente fija de nitrógeno, tal como a través de la alimentación de las células durante un largo período de tiempo, resulta en un porcentaje superior de lípido por peso seco de la célula.

En otras modalidades, la biomasa de alto contenido en lípidos se genera por la alimentación de una fuente fija de carbono a las células después que todo el nitrógeno fijo se consumió durante largos períodos de tiempo, tal como al menos una o dos semanas. En algunas modalidades, las células se dejan acumular aceite en la presencia de una fuente fija de carbono y en ausencia de una fuente fija de nitrógeno durante más de 20 días. Las microalgas cultivadas con las condiciones descritas en este documento o diferentes conocidas en la técnica pueden comprender al menos aproximadamente 20% de lípido por peso seco, y con frecuencia comprenden 35%, 45%, 55%, 65%, e incluso 75% o más de lípido por peso seco. El porcentaje del peso seco celular como lípido en la producción microbiana de lípido se puede mejorar por lo tanto, mediante el mantenimiento de las células en un estado de crecimiento heterotrófico en el que consumen carbono y acumulan aceite, pero no sufren división celular.

La biomasa rica en proteína a partir de algas es otro material ventajoso para la inclusión en los productos alimenticios. Los métodos de la invención pueden proporcionar también la biomasa que tiene al menos 30% de su peso seco celular como proteína. Las condiciones de cultivo se pueden ajustar para aumentar el porcentaje del peso de las células que es proteína. En una modalidad preferida, una microalga se cultiva en un entorno rico en nitrógeno y un exceso de energía fija de carbono, tales como glucosa o cualquiera de las otras fuentes de carbono discutidas anteriormente. Las condiciones en las que el nitrógeno está en exceso tienden a aumentar el rendimiento de proteína microbiana por encima del rendimiento de proteína microbiana en un cultivo en el que el nitrógeno no se proporciona en exceso. Para la máxima producción de proteína, el microbio se cultiva de preferencia, en presencia de exceso de nitrógeno durante el período total de cultivo. Las fuentes adecuadas de nitrógeno para las microalgas podrían provenir de fuentes de nitrógeno orgánico y/o fuentes de nitrógeno inorgánico.

Las fuentes orgánicas de nitrógeno se usaron en los cultivos microbianos desde principios de 1900. El uso de fuentes de nitrógeno orgánico, tales como licor de maíz macerado se popularizó con la producción de la penicilina del hongo. Los investigadores encontraron que la inclusión de licor de maíz macerado en el medio de cultivo aumentó el crecimiento del microorganismo y resultó en un rendimiento aumentado de productos (tal como, la penicilina). Un análisis del licor de maíz macerado determinó que era una fuente rica de nitrógeno y de vitaminas también, tales como las vitaminas del complejo B, riboflavina, ácido pantoténico, niacina, inositol y nutrientes minerales tales como calcio, hierro, magnesio, fósforo y potasio (Ligget y Koffler, Bacteriological Reviews (1948);12(4): 297-311). Las fuentes orgánicas de nitrógeno, tales como licor de maíz macerado, se usaron en los medios de fermentación para levaduras, bacterias, hongos y otros microorganismos. Los ejemplos no limitativos de las fuentes de nitrógeno orgánico son extracto de levadura, peptona, licor de maíz macerado y polvo de maíz macerado. Los ejemplos no limitativos de las fuentes preferidas de nitrógeno orgánico incluyen, por ejemplo, y sin limitación, (NH-^SCU y NH4OH. En una modalidad, los medios de cultivo para llevar a cabo la invención contienen sólo fuentes de nitrógeno inorgánico. En otra modalidad, los medios de cultivo para llevar a cabo la invención contienen sólo fuentes de nitrógeno orgánico. Aún en otra modalidad, los medios de cultivo para llevar a cabo la invención contienen una mezcla de fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico.

En los métodos de la invención, un biorreactor o fermentador se usa para cultivar las células de microalgas a través de las diferentes fases de su ciclo fisiológico. A modo de ejemplo, un inoculo de células de microalgas que producen lípido se introduce en el medio; existiendo un período de latencia (fase de latencia) antes de las células comienzan a propagarse. A continuación del período de latencia, la velocidad de propagación aumenta constantemente y entra en la fase logarítmica, o exponencial. La fase exponencial a su vez se sigue por una disminución de la propagación debido a la disminución de nutrientes como el nitrógeno, el aumento de sustancias tóxicas, y los mecanismos de detección de quorum. Después de esta desaceleración, se detiene la propagación, y las células entran en una fase estacionaria o estado de crecimiento constante, en función del entorno en particular que se proporciona a las células. Para la obtención de biomasa rica en proteína, el cultivo se cosecha típicamente durante o luego poco después del final de la fase exponencial. Para la obtención de biomasa rica en lípido, el cultivo se cosecha típicamente luego bien después del final de la fase exponencial, lo que se podría terminar temprano permitiendo que el nitrógeno u otro nutriente clave (aparte del carbono) se agote, obligando a las células a convertir en lípido las fuentes de carbono, presentes en exceso. Los parámetros de las condiciones de cultivo se pueden manipular para optimizar la producción total de aceite, la combinación de especies de lípidos producidas y/o la producción de un aceite específico.

Los biorreactores ofrecen muchas ventajas para el uso en el crecimiento heterotrófico y métodos de propagación. Como se apreciará, las provisiones tomadas para generar luz disponible a las células en los métodos de crecimiento fotosintético son innecesarias cuando se usa una fuente fija de carbono en el crecimiento heterotrófico y métodos de propagación descritos en este documento. Para producir biomasa para uso en alimentos, las microalgas son fermentadas de preferencia en grandes cantidades en el líquido, tales como cultivos en suspensión como un ejemplo. Los biorreactores tales como los fermentadores de acero (5000 litros, 10,000 litros, 40,000 litros, y superiores se usan en diferentes modalidades de la invención) pueden acomodar grandes volúmenes de cultivos. Los biorreactores típicamente permiten también el control de las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, tensión de oxígeno, y niveles de dióxido de carbono. Por ejemplo, los biorreactores son típicamente configurables, por ejemplo, usando puertos conectados a la tubería, para permitir que los componentes gaseosos, como oxígeno o nitrógeno, sean burbujeados a través de un cultivo líquido.

Los biorreactores se pueden configurar para fluir los medios de cultivos a través del biorreactor todo el período de tiempo durante el que las microalgas se reproducen y aumentan en número. En algunas modalidades, por ejemplo, los medios se pueden infundir en el biorreactor después de la inoculación pero antes de que las células alcancen una densidad conveniente. En otros ejemplos, un biorreactor se llena con los medios de cultivo en el inicio de un cultivo, y ninguno de los medios de cultivo se infunde después que el cultivo se inocula. En otras palabras, la biomasa de microalgas se cultiva en un medio acuoso por un período de tiempo durante el que las microalgas se reproducen y aumentan en número; sin embargo, las cantidades de medio de cultivo acuoso no fluyen a través del biorreactor durante todo el período de tiempo. De este modo, en algunas modalidades, el medio de cultivo acuoso no fluye a través del biorreactor después de la inoculación.

Los biorreactores equipados con dispositivos tales como aspas giratorias e impulsores, mecanismos de oscilación, barras de agitación, medios para la infusión de gas a presión que se pueden usar para someter a los cultivos de microalgas a mezclarse. La mezcla podría ser continua o intermitente. Por ejemplo, en algunas modalidades, no se mantiene un régimen de flujo turbulento de entrada de gas y entrada de medios para la reproducción de las microalgas, hasta logrado un aumento conveniente en el número de dichas microalgas.

En resumen, como se mencionó anteriormente, los biorreactores son equipados con frecuencia con diferentes puertos que permiten, por ejemplo, que sea manipulado el contenido de gas del cultivo de microalgas. Para ilustrar, parte del volumen de un biorreactor puede ser gas en lugar de líquido, y las entradas de gas del biorreactor permitir el bombeo de gases en el biorreactor. Los gases que se pueden bombear beneficiosamente a un biorreactor incluyen aire, mezclas de aire/C02, gases nobles, tales como el argón y otros gases. Los biorreactores se equipan típicamente para que el usuario pueda controlar la velocidad de entrada de gas en el biorreactor. Como se señaló anteriormente, el aumento del flujo de gas en un biorreactor se puede usar para aumentar la mezcla del cultivo.

El flujo de gas aumentado afecta igualmente la turbidez del cultivo. La turbulencia se puede lograr colocando un puerto de entrada de gas por debajo del nivel de los medios de cultivo acuosos para que la entrada del gas al biorreactor burbujee a la .superficie del cultivo. Uno o más puertos de salida de gas permiten escapar gas, evitando así la concentración de presión en el biorreactor. De preferencia un puerto de salida de gas conduce a una válvula de "un sentido" que evita la entrada de microorganismos contaminantes en el biorreactor.

Los ejemplos específicos de biorreactores, condiciones de cultivo, y crecimiento heterotrófico y métodos de propagación descritos en este documento se pueden combinar de manera adecuada para mejorar los rendimientos del crecimiento microbiano y la producción de lípido y/o proteína.

D. Concentración de microalgas después de la fermentación Los cultivos de microalgas generados de acuerdo con los métodos descritos anteriormente producen biomasa de microalgas en el medio de fermentación. Para preparar la biomasa para el uso como una composición alimentaria, la biomasa se concentra, o cosecha, del medio de fermentación. En el momento de la cosecha de la biomasa de microalgas del medio de fermentación, la biomasa se comprende principalmente de células intactas suspendidas en un medio de cultivo acuoso. Para concentrar la biomasa, se realiza un paso de deshidratación. La deshidratación o concentración se refiere a la separación de la biomasa del caldo de fermentación u otro medio líquido y así es la separación sólido-líquido. De este modo, durante la deshidratación, el medio de cultivo se elimina de la biomasa (por ejemplo, por el drenaje del caldo de fermentación a través de un filtro que retiene la biomasa), o de lo contrario la biomasa se elimina del medio de cultivo. Los procesos comunes para la deshidratación incluyen centrifugación, filtración y el uso de una presión mecánica. Estos se pueden usar individualmente o en cualquier combinación.

La centrifugación involucra el uso de la fuerza centrífuga para separar mezclas. Durante la centrifugación, los componentes más densos de la mezcla migran lejos del eje de la centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. Al aumentar la fuerza de gravedad efectiva (es decir, por el aumento de la velocidad de centrifugación), el material más denso, tales como sólidos, se separan del material menos denso, tales como líquidos, y así se separan de acuerdo a la densidad. La centrifugación de biomasa y caldo u otra solución acuosa forman una pasta concentrada que comprende las células de microalgas. La centrifugación no elimina cantidades significativas de agua intracelular. De hecho, después de la centrifugación, podría haber todavía una cantidad considerable de humedad superficial o libre en la biomasa (por ejemplo, mayor que 70%), por lo que la centrifugación no se considera una etapa de secado.

Filtración se puede usar también para la deshidratación. Un ejemplo de la filtración que es adecuado para la presente invención es la filtración de flujo tangencial (TFF), conocida también como la filtración de flujo cruzado. La filtración de flujo tangencial es una técnica de separación que usa sistemas de membrana y fuerza de flujo para separar sólidos de líquidos. Para ver/ ilustrar un método de filtración adecuado ilustrativo, ver Geresh, Carb. Polym. 50; 183-189 (2002), que describe el uso de una tecnología MaxCell A G de filtro de fibra hueca de 0.45µ? hueco del filtro. Ver también, por ejemplo, los dispositivos de Millipore Pellicon®, usados con membranas de lOOkD, 300kD, membranas 1000 kD (número de catálogo P2C01MC01), 0.1 µ? (número de catálogo P2WPPV01), 0.22µ? (número de catálogo P2GVPPV01), y 0.45µ? (número de catálogo P2HVMPV01). De preferencia, el volumen retenido no pasa por el filtro en un nivel significativo, y de preferencia el producto en el volumen retenido no se adhiere al material de filtro. TFF se puede realizar también usando los sistemas de filtración de fibras huecas. Los filtros con un tamaño de poro de al menos aproximadamente 0.1 micrómetro, por ejemplo, aproximadamente de 0.12, 0.14, 0.16, 0.18, 0.2, 0.22, 0.45, micrómetros o al menos aproximadamente 0.65 micrómetros, son adecuados. Los tamaños de poros preferidos de TFF dejan atravesar solutos y restos celulares del caldo de fermentación, pero no las células microbianas.

La deshidratación se puede efectuar también con una presión mecánica aplicada directamente a la biomasa para separar el caldo de fermentación líquido de la biomasa microbiana suficiente para deshidratar la biomasa, sin causar la lisis de las células predominantes. La presión mecánica para deshidratar la biomasa microbiana se puede aplicar usando, por ejemplo, un filtro prensa de banda. Un filtro prensa de banda es un dispositivo de deshidratación que aplica una presión mecánica a una suspensión (por ejemplo, la biomasa microbiana tomada directamente del fermentador o biorreactor) que se pasa entre los dos bandas de tensión a través de un serpentín de cilindros de diámetro decrecientes. El filtro prensa de banda se puede dividir realmente en tres zonas: zona de gravedad, donde el agua/líquido drena libre por gravedad a través de una banda porosa, una zona de cuña, donde los sólidos se preparan para la aplicación de presión, y una zona de presión, donde la presión regulable se aplica por gravedad a los sólidos agotados.

Después de la concentración, la biomasa de microalgas se puede procesar, como se describe a continuación en el documento, para producir pastel empaquetado al vacío, hojuelas de alga, homogenizado de alga, polvo de alga, harina de alga, o aceite de alga.

E. Composiciones química de la biomasa de microalgas La biomasa de microalgas generadas por los métodos de cultivo descritos en este documento comprende el aceite de microalgas y/o proteína, así como otros componentes generados por los microorganismos o incorporados durante la fermentación por los microorganismos del medio de cultivo.

La biomasa de microalgas con un alto porcentaje de acumulación de aceite/lípido por peso seco se generó usando diferentes métodos de cultivo, incluyendo los métodos conocidos en la técnica. La biomasa de microalgas con un alto porcentaje de aceite/lípido acumulado es útil de acuerdo con la presente invención. Los cultivos de Chlorella vulgaris con hasta 56.6% de lípido por peso seco de la célula (DCW) en los cultivos estacionarios cultivados bajo condiciones autotróficas usando altas concentraciones de hierro (Fe) se describieron (Li y otros, Bioresource Technology 99(11):4717-22 (2008). Los cultivos de Nanochloropsis sp. y Chaetoceros calcitrans con 60% de lípido por DCW y 39.8% de lípido por DCW, respectivamente, que se cultivan en un fotobiorreactor bajo condiciones de falta de nitrógeno se describieron también (Rodolfi y otros, Biotechnology & Bioengineering (2008). Cultivos de Parietochloris incise con aproximadamente 30% de lípido por DCW cuando se cultivan fototróficamente y bajo condiciones pobre de nitrógeno se describieron (Solovchenko y otros, Journal of Applied Phycology 20:245-251 (2008). Chlorella protothecoides puede producir hasta 55% de lípido por DCW cuando se cultiva bajo determinadas condiciones heterotróficas con falta de nitrógeno (Miao y Wu, Bioresource Technology 97:841-846 (2006)). Otras especies de Chlorella, incluyendo Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana y Chlorella minutissima describieron tener acumulado hasta 63% de aceite por DCW cuando se cultivaron en biorreactores de tanque agitado bajo condiciones de medios pobres en nitrógeno (Illman y otros, Enzyme and Microbial Technology 27:631-635 (2000). Incluso se reportó un por ciento superior de lípido por DCW, incluyendo 70% de lípido en los cultivos de Dumaliella tertiolecta cultivados en condiciones de NaCl aumentada (Takagi y otros, Journal of Bioscience and Bioengineering 101(3): 223-226 (2006) y 75% de lípido en los cultivos de Botryococcus braunii (Banerjee y otros, Critical Reviews in Biotechnology 22(3): 245-279 (2002)).

El crecimiento heterotrófico resulta en el contenido relativamente bajo de clorofila (cuando se compara con los sistemas fototróficos tales como estanques abiertos o sistemas cerrados de fotobiorreactor). El contenido reducido de clorofila mejora generalmente las propiedades organolépticas de las microalgas y por lo tanto permite que más biomasa de alga (o aceite preparado de ésta) se incorpore en un producto alimenticio. El contenido de clorofila reducido encontrado en microalgas heterotróficamente cultivadas (por ejemplo, Chlorella) reduce también el color verde en la biomasa en comparación con microalgas fototróficamente cultivadas. De este modo, el contenido reducido de clorofila evita una coloración verde inconveniente, a menudo asociada con los productos alimenticios que contienen microalgas fototróficamente cultivadas y permite la incorporación o una incorporación aumentada de la biomasa de alga en un producto alimenticio. Al menos en una modalidad, el producto alimenticio contiene microalgas heterotróficamente cultivadas de contenido reducido de clorofila comparado a microalgas fototróficamente cultivadas.

La biomasa de microalgas ricas en aceite generada por los métodos de cultivo descritos en este documento y útil de acuerdo con la presente invención comprende al menos 10% de aceite de microalgas por DCW. En algunas modalidades, la biomasa de microalgas comprende al menos 15%, 25%, 50%, 75% o al menos 90% de aceite de microalgas por DCW.

El aceite de microalgas de la biomasa descrito en este documento (o extraído de la biomasa) puede comprender glicerolípidos con una o más cadenas laterales distintas de éster de ácido graso. Los glicerolípidos se comprenden de una molécula de glicerol esterificada a una, dos, o tres moléculas de ácidos grasos, que pueden ser de longitudes variables y con variables grados de saturación. Las mezclas específicas de aceite de alga se pueden preparar ya sea en una sola de las especies de algas, o mezclando en conjunto la biomasa (o aceite de alga) de dos o más especies de microalgas.

De este modo, la composición del aceite, es decir, las propiedades y proporciones de los componentes de ácidos grasos de los glicerolípidos, se puede manipular también por la combinación de la biomasa (o aceite) de al menos dos especies de microalgas distintas. En algunas modalidades, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípidos. Las distintas especies de microalgas se pueden cultivar juntas o por separado como se describió en este documento, de preferencia bajo condiciones heterotróficas, para generar los respectivos aceites. Las diferentes especies de microalgas pueden contener diferentes porcentajes de distintos componentes de ácidos grasos en los glicerolípidos de la célula.

En algunas modalidades, el aceite de microalgas está compuesto principalmente de aceite monoinsaturado. En algunos casos, el aceite de alga es al menos 20% de aceite monoinsaturados por peso. En diferentes modalidades, el aceite de alga es al menos 25%, 50%, 75% o más de aceite monoinsaturado por peso o por volumen. En algunas modalidades, el aceite monoinsaturado es 18: 1, 16:1, 14:1 ó 12:1. En algunas modalidades, el aceite de microalgas comprende al menos 10%, 20%, 25%, ó 50% o más de ácido oleico esterificado o ácido linolénico alfa esterificado en peso por volumen. Al menos en una modalidad, el aceite de alga comprende menos de 10%, menos de 5%, menos de 3%, menos de 2% o menos de 1% por peso o por volumen, o está sustancialmente libre de ácido docosahexanoico esterificado (DHA (22:6)). Para los ejemplos de producción de microalgas que contienen alto DHA, tal como en Crypthecodinium cohnii, ver las patentes de los Estados Unidos núms. 7,252,979, 6,812,009 y 6,372,460.

La biomasa de microalgas de alto contenido en proteína se generó usando diferentes métodos de cultivo. La biomasa de microalgas con un porcentaje superior de contenido de proteína es útil de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el contenido de proteína de diferentes especies de microalgas se reportó (ver la Tabla 1 de Becker, Biotechnolog Advances (2007) 25:207-210). El control de la tasa de renovación en un cultivo semi-continuo fotoautotrófico de Tetraselmis suecica se reportó que afecta el contenido de proteína por célula, siendo el más alto de aproximadamente 22,8% de proteína (Fabregas, y otros, Marine Biotechnology (2001) 3:256-263).

La biomasa de microalgas generada por los métodos de cultivo descritos en la presente y útil de acuerdo con las modalidades de la presente invención relativas al alto contenido proteico típicamente comprende al menos 30% de proteína por peso seco de la c'élula. En algunas modalidades,la biomasa de microalgas comprende al menos 40%, 50%, 75% o más de proteína por peso seco de la célula. En algunas modalidades,la biomasa de microalgas comprende de 30-75% de proteína por peso seco de la célula o de 40-60% de proteína por peso seco de la. célula. En algunas modalidades, la proteína en la biomasa de microalgas comprende al menos 40% de proteína cruda digerible. En otras modalidades, la proteína en la biomasa de microalgas comprende al menos 50%, 60%, 70%, 80%, o al menos 90% de proteína cruda digerible. En algunas modalidades, la proteína en la biomasa de microalgas comprende de 40-90% de proteína cruda digerible, de 50-80% de proteína cruda digerible, o de 60-75% de proteína cruda digerible.

La biomasa de microalgas (y el aceite extraído de éstas), puede incluir, además, otros constituyentes producidos por las microalgas, o incorporados en la biomasa a partir del medio de cultivo. Estos otros constituyentes pueden estar presentes en cantidades variables dependiendo de las condiciones de cultivo usadas y las especies de microalgas (y, si es aplicable, el método de extracción usado para recuperar el aceite de microalgas de la biomasa). Los otros constituyentes pueden incluir, sin limitarse a, fosfolípido (por ejemplo, lecitina de algas), carbohidratos, fibra soluble e insoluble, glicoproteínas, fitosteroles (por ejemplo, ß-sitosterol, campesterol, estigmasterol, ergosterol, y brassicasterol), tocoferoles, tocotrienoles, carotenoides (por ejemplo, a-caroteno, ß-caroteno, y licopeno), xantofila (por ejemplo, luteína, zeaxantina, a-criptoxantina, y ß-criptoxantina), proteínas, polisacáridos (por ejemplo, arabinosa, mañosa, galactosa, 6-metilo galactosa y glucosa) y varios compuestos orgánicos o inorgánicos (por ejemplo, selenio).

En algunos casos, la biomasa comprende al menos 10 ppm de selenio. En algunos casos, la biomasa comprende al menos 25% p/p polisacárido de algas. En algunos casos, la biomasa comprende al menos 15% p/p glicoproteína de algas. En algunos casos, la biomasa comprende entre 0-1 15mcg/g de carotenoides totales. En algunos casos, la biomasa comprende al menos 0.5% fosfolípidos de algas. En algunos casos, el aceite derivado de la biomasa de algas contiene al menos 0.10 mg/g de tocotrienoles totales. En algunos casos, el aceite derivado de la biomasa de algas contiene entre 0.125 mg/g a 0.35 mg/g de tocotrienoles totales. En algunos casos, el aceite derivado de la biomasa de algas contiene al menos 5.0 mg/100g de tocoferoles totales. En algunos casos, el aceite derivado de la biomasa de algas contiene entre 5.0mg/100g a lOmg/lOOg de tocoferoles. Una descripción detallada de la composición de tocotrienoles y tocoferoles en Chlorella protothecoides se incluye en los Ejemplos a continuación.

En algunos casos, la biomasa de microalgas comprende al menos 10% de fibra soluble. En otras modalidades, la biomasa de microalgas comprende al menos 20% a 25% de fibra soluble. En algunas modalidades, la biomasa de microalgas comprende al menos 30% de fibra insoluble. En otras modalidades, la biomasa de microalgas comprende al menos 50% a al menos 70% de fibra insoluble. La fibra dietética total es la suma de la fibra soluble y fibra insoluble. En algunas modalidades, la biomasa de microalgas comprende al menos 40% de fibra dietética total. En otras modalidades, la biomasa de microalgas comprende al menos 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 90%, a 95% de fibra dietética total.

III. PROCESAMIENTO DE LA BIOMASA DE MICROALGAS EN INGREDIENTES ALIMENTICIOS TERMINADOS La biomasa concentrada de microalgas producida de acuerdo con los métodos de la invención es en sí un ingrediente alimenticio terminado y se podría usar en los productos alimenticios sin modificación adicional, o sólo con mínima modificación. Por ejemplo, el pastel se puede envasar al vacío o congelado. Por otra parte, la biomasa se puede secar por liofilización, un proceso de "deshidratación por congelación", en el que se congela la biomasa en una cámara de secado por congelación a la que se aplica un vacío. La aplicación de un vacío a una cámara de secado por congelación resulta en sublimación (secado primario) y desorción (secado secundario) del agua de la biomasa. Sin embargo, la presente invención proporciona una diversidad de ingredientes alimenticios terminados con propiedades mejoradas derivados de microalgas que resultan de los métodos de procesamiento de la invención que se pueden aplicar a la biomasa de1 microalgas concentrada.

El secado de la biomasa de microalgas, ya sea predominantemente intacta o en forma de homogenizado, es ventajoso para facilitar el procesamiento adicional o para el uso de la biomasa en los métodos y composiciones descritas en este documento. El secado se refiere a la eliminación de la humedad/agua libre o superficial a partir de biomasa predominantemente intacta o la eliminación de agua superficial de una suspensión de la biomasa homogenizada (por ejemplo, por micronización). Diferentes texturas y sabores se pueden atribuir a los productos alimenticios en función de si la biomasa de algas está seca, y si es así, el método de secado. El secado de la biomasa generada a partir de los cultivos de microalgas descritos en este documento elimina el agua que podría ser un componente indeseable de los productos alimenticios terminados o ingredientes alimenticios. En algunos casos, el secado de la biomasa podría facilitar un más eficiente proceso de extracción de aceite de microalgas.

En una modalidad, la biomasa de microalgas concentrada se seca en tambor a una forma de hojuela para producir hojuela de alga, como se describió en la parte A de esta sección. En otra modalidad, la biomasa de microalgas concentrada se seca por aspersión o secado rápido (es decir, sometidos a un proceso de secado neumático) para formar un polvo que contiene predominantemente células intactas para producir polvo de alga, como se describió en la parte B de esta sección. En otra modalidad, la biomasa concentrada de microalgas es micronizada (homogenizada) para formar un homogenizado de células predominantemente Usadas que se secan después por aspersión o secado rápido para producir harina de algas, como se describió en la parte C de esta sección. En otra modalidad, el aceite se extrae de la biomasa concentrada de microalgas para formar aceite de alga, como se describió en la parte D de esta sección.

A. Hojuela de algas La hojuela de algas de la invención se prepara a partir de biomasa concentrada de microalgas que se aplica como una película a la superficie de un tambor caliente giratorio. Los sólidos secos entonces se raspan con un cuchillo o cuchilla, lo que resulta en unas hojuelas pequeñas. La patente de los Estados Unidos, núm. 6,607,900 describe el secado de la biomasa de microalgas. usando un secador de tambor sin etapa anterior de centrifugación (concentración), y un proceso de este tipo se podía usar de acuerdo con los métodos de la invención.

Debido a que la biomasa se podría exponer a altas temperaturas durante el proceso de secado, podría ser ventajoso añadir un antioxidante a la biomasa antes del secado. La adición de un antioxidante no sólo protegerá la biomasa durante el secado, sino también extenderá la durabilidad de la biomasa seca de microalgas cuando se almacena. En una modalidad preferida, se adiciona un antioxidante a la biomasa de microalgas antes del procesamiento posterior, tales como el secado u homogenización. Los antioxidantes que son adecuados para el uso se discuten en detalle a continuación.

Además, si existe un tiempo significativo entre la producción de la biomasa de deshidratada de microalgas y las etapas posteriores de procesamiento, podría ser ventajoso pasteurizar la biomasa antes del secado. Los ácidos grasos libres a partir de lipasas se podrían formar si existe un tiempo significativo entre la producción y secado de la biomasa. La pasteurización de la biomasa inactiva estas lipasas y evita la formación de un sabor "jabonoso" en el producto resultante de la biomasa seca. De este modo, en una modalidad, la invención proporciona la biomasa pasteurizada de microalgas. En otra modalidad, la biomasa pasteurizada de microalgas es una hojuela de alga.

B. Polvo de algas El polvo de algas de la invención se prepara a partir de biomasa concentrada de microalgas usando un secador neumático o por aspersión (ver por ejemplo la patente de los Estados Unidos, núm. 6,372,460). En un secador por aspersión, el material en una suspensión líquida como una dispersión de gota fina se pulveriza en una corriente de aire caliente. El material retenido se seca rápidamente y forma un polvo seco. En algunos casos, un secador de combustión de pulso se puede usar también para lograr una textura en polvo en el material final seco. En otros casos, una combinación de secado por aspersión seguido por el uso de un secador de lecho fluido se usa para lograr las condiciones óptimas para el secado de la biomasa microbiana (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos, núm. 6,255,505). Como una alternativa, los secadores neumáticos se pueden usar también en la producción de polvo de algas. Los secadores neumáticos atraen o retienen el material que se seca en una corriente de aire caliente. Aunque el material se retiene en el aire caliente, la humedad se elimina rápidamente. El material seco se separa después del aire húmedo y el aire húmedo se recircula el secado adicional.

C. Harina de algas La harina de algas de la invención se prepara a partir de biomasa concentrada de microalgas que se lisó mecánicamente y homogenizó y el homogenizado se secó por aspersión o secado rápido (o se secó mediante otro sistema de secado neumático). La producción de harina de algas requiere que las células se lisen para liberar su aceite y que los componentes de la pared celular e intracelulares se micronizen o se reduzca el tamaño de partícula a un tamaño promedio de no más de 10 µp?. El aceite, el agua y partículas micronizadas resultantes se emulsionan de manera que el aceite no se separe de la dispersión antes del secado. Por ejemplo, un desestabilizador de la presión se puede usar para bombear una célula que contiene la suspensión a través de una válvula de orificio restringido para lisar las células. Se aplica alta presión (hasta 1500 bares), seguido por una expansión instantánea a través de una boquilla de salida. La ruptura celular se lleva a cabo por tres mecanismos diferentes: el impacto extemo en la válvula, gran cantidad de líquido atravesando el orificio, y la caída de presión repentina en la descarga, causando una explosión de la célula. El método libera moléculas intracelulares. Un homogenizador Niro (Niro Soavi GEA) (o cualquier otro homogenizador de alta presión) se puede usar para procesar las células predominantemente a partículas de longitud de 0.2 a 5 mieras. El procesamiento de la biomasa de algas bajo alta presión (aproximadamente 1000 bar) lisa típicamente mayor que 90% de las células y reduce el tamaño de las partículas a menos de 5 mieras.

Por otra parte, se puede usar un molino de bola. En un molino de bola, las células se agitan en suspensión con partículas abrasivas pequeñas, tales como perlas. Las células se rompen porque las fuerzas de corte, la maceración entre las perlas, y las colisiones con las perlas. Las perlas rompen las células para liberar los contenidos celulares. En una modalidad, la biomasa de algas se rompe y forma en una emulsión estable usando un molino de bola Dyno-mill ECM Ultra (CB Mills). Las células se pueden romper también por fuerzas de corte, tal como con el uso del mezclador (tal como con una velocidad alta o en la licuadora Waring como ejemplos), la prensa francesa, o incluso la centrifugación para romper las células en el caso de las paredes celulares débiles. Un molino de bola adecuado que incluye las especificaciones de tamaño de bola y cuchilla se describió en la patente de los Estados Unidos, núm. 5,330,913.

El producto inmediato de la homogenización es una suspensión de partículas de menor tamaño que las células originales que se suspenden en aceite y agua. Las partículas representan los desechos celulares. El aceite y el agua se liberan por las células. El agua adicional se podría aportar por los medios acuosos que contienen las células antes de la homogenización. Las partículas son de preferencia en forma de un homogenizado micronizado. Si se deja reposar, algunas de las partículas más pequeñas podrían unirse. Sin embargo, una dispersión uniforme de partículas pequeñas se puede conservar por la siembra con un estabilizador microcristalino, tal como la celulosa microcristalina.

Para formar la harina de algas, la suspensión se seca por aspersión o secado rápido, eliminando el agua y dejando un polvo seco que contiene los restos celulares y el aceite. Aunque el contenido de aceite del polvo puede ser al menos 10, 25 ó 50% por peso de polvo seco, el polvo puede tener una sensación y apariencia seca en lugar de grasosa (por ejemplo, carente de aceite visible) y puede también fluir libremente cuando se agita. Diferentes agentes de flujo (incluidos los productos derivados de sílice) se puede adicionar también. Después del secado, el contenido de agua o humedad del polvo es típicamente inferior que 10%, 5%, 3% o 1% por peso. Otros secadores tales como los secadores neumáticos o secadores de combustión de pulso se pueden usar también para producir harina de alga.

El contenido de aceite de la harina de alga puede variar en dependencia del por ciento de aceite de la biomasa de alga. La harina de alga se puede producir a partir de la biomasa de algas de diferente contenido de aceite. En ciertas modalidades, la harina de alga se produce a partir de biomasa de algas de igual contenido de aceite. En otras modalidades, la harina de algas se produce a partir de biomasa de algas de diferente contenido de aceite. En este último caso, la biomasa de algas de diferente contenido de aceite se puede combinar y realizar después de la etapa de homogenización. En otras modalidades, la harina de alga de diferente contenido de aceite primero se produce y se mezcla después de conjunto con proporciones diferentes para lograr un producto de harina de alga que incluya el contenido de aceite final conveniente. En modalidad adicional, la biomasa de algas de los diferentes perfiles de lípidos se puede combinar entre sí y homogenizar después para producir harina de algas. En otra modalidad, la harina de algas de diferentes perfiles de lípidos se produce primero y después se mezclan juntos con proporciones diferentes para lograr un producto de harina de algas que contiene el perfil final de lípido conveniente.

La harina de algas de la invención es útil para un amplio intervalo de preparaciones alimenticias. Debido al contenido de aceite, contenido de fibra y las partículas micronizadas, la harina de alga es un ingrediente alimenticio multifuncional. La harina de algas se puede usar en productos horneados, panes, productos de masa de levadura, productos de huevo, aderezo, salsas, bebidas nutricionales, leche de alga, pasta y productos sin gluten. Otros detalles de la formulación de estos productos alimenticios y más con harina de alga se describen en los ejemplos a continuación.

La harina de algas se puede usar en productos horneados y huevos en el lugar de las fuentes de grasa convencional (por ejemplo, aceite, mantequilla o margarina). Los productos horneados y sin gluten tienen un contenido de humedad superior y una estructura de miga que es indistinguible de los productos convencionales horneados con mantequilla y huevos. Debido al contenido de humedad superior, estos productos horneados tienen una durabilidad mayor y conservan su textura original mayor que los productos convencionales horneados que se producen sin harina de alga.

La harina de algas puede actuar también como un expansor de grasa con uso en batidos, salsas o aderezos. La composición de la harina de alga es única en su capacidad de transmitir cualidades organolépticas y de sensación bucal comparable a un producto alimenticio con un contenido de grasa superior. Los aderezos, salsas y bebidas preparadas con harina de algas tienen una reología y la opacidad que está cerca de las recetas convencionales con un contenido de grasa superior, aunque estos productos alimenticios contienen aproximadamente la mitad de los niveles de grasa/aceite. La harina de algas es también un emulsionante superior y es adecuada para usar en preparaciones alimenticias que requieren de espesor, opacidad y la viscosidad, tales como salsas, aderezos y sopas. Además, el perfil de lípido que se encuentra en la harina de alga de las invenciones descritas en este documento no contiene grasas trans, tiene grasas insaturadas en comparación con la mantequilla o margarina (u otras grasas animales) y un mayor nivel de salud. De este modo, los productos preparados con harina de alga pueden tener un menor contenido de grasa (con grasas más saludables) sin sacrificar la sensación bucal y las cualidades organolépticas del mismo producto alimenticio que se prepara mediante una receta convencional usando una fuente de grasa convencional.

La harina de algas se puede adicionar también a los huevos en polvo o líquido, que se sirven típicamente en un entorno de servicio alimenticio. La adición de harina de alga mejora la apariencia, textura y sensación bucal de los huevos en polvo y líquido y tiende también a mejorar la apariencia, textura y sensación bucal con el tiempo, incluso cuando los huevos preparados se conservan sobre una mesa de vapor. Las formulaciones específicas y los resultados del panel sensorial se describen a continuación en los Ejemplos.

D. Aceite de algas En un aspecto, la presente invención se dirige a un método de preparación de aceite de alga por la cosecha de aceite de alga a partir de una biomasa de alga que comprende al menos 15% de aceite por peso seco bajo condiciones GMP, en el que el aceite de alga es lípido 18:1 mayor que 50%. En algunos casos, la biomasa de alga comprende una mezcla de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las especies distintas de microalgas se cultivaron por separado. Al menos en una modalidad, dos de las especies distintas de microalgas al menos tienen perfiles de glicerolípidos diferentes. En algunos casos, la biomasa de alga se obtiene a partir de algas cultivadas heterotróficamente. En algunos casos, al menos dos de todas las especies distintas de microalgas contienen al menos 15% de aceite por peso seco.

En un aspecto, la presente invención se dirige a un método para preparar una composición alimenticia que comprende la combinación de aceite de alga a partir de células de alga que contienen al menos 10%, o al menos 15% de aceite por peso seco, con uno o más ingredientes comestibles para formar la composición alimenticia. En algunos casos, el método comprende además la preparación del aceite de alga en condiciones GMP.

El aceite de algas para su uso en un producto alimenticio (entre otras aplicaciones) se puede separar de la biomasa lisada. La biomasa de alga que permanece después de la extracción del aceite se refiere como harina deslipidada. La harina deslipidada contiene menos aceite por peso o volumen seco que el contenido en las microalgas antes de la extracción. Normalmente 50-90% de aceite se extrae de manera que la harina deslipidada contiene, por ejemplo, 10-50% del contenido en aceite de la biomasa antes de la extracción. Sin embargo, la biomasa tiene todavía un alto valor nutritivo en el contenido de proteínas y otros componentes discutidos anteriormente. De este modo, la harina deslipidada se puede usar en la alimentación animal o en aplicaciones de alimentación humana.

En algunas modalidades del método, el aceite de alga es al menos 50% de ácido oleico p/p y contiene menos de 5% de DHA. En algunas modalidades del método, el aceite de alga es al menos 50% de ácido oleico p/p y contiene menos de 0.5% de DHA. En algunas modalidades del método, el aceite de alga es al menos 50% de ácido oleico p/p y contiene menos de 5% de glicerolípido que contiene cadena de carbono de longitud mayor que 18. En algunos casos, las células de alga de las que se obtiene el aceite de alga comprenden una mezcla de células de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las especies distintas de microalgas se cultivaron por separado. Al menos en una modalidad, dos de las especies distintas de microalgas al menos tienen perfiles de glioerolípidos diferentes. En algunos casos, las células de alga se cultivan bajo condiciones heterotróficas. En algunos casos, al menos dos de todas las especies distintas de microalgas contienen al menos 10%, o al menos 15% de aceite por peso seco.

En un aspecto, la presente invención se dirige al aceite de alga que contienen al menos el 50% de aceite monoinsaturado y que contiene menos de 1% de DHA preparado bajo condiciones GMP. En algunos casos, el aceite monoinsaturado es lípido 18:1. En algunos casos, el aceite de alga se envasa en una cápsula para entregar una dosis unitaria de aceite. En algunos casos, el aceite de alga se obtiene de una mezcla de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las especies distintas de microalgas se cultivaron por separado. Al menos en una modalidad, dos de las especies distintas de microalgas al menos tienen perfiles de glicerolípidos diferentes. En algunos casos, el aceite de algas se obtiene a partir de células de algas cultivadas bajo condiciones heterotróficas.

En un aspecto, la presente invención se dirige al aceite que comprende el 18:1 mayor que 60%, y al menos 0.20mg/g de tocotrienol.

En un aspecto, la presente invención se dirige a una composición de alquil éster del ácido graso que comprende el éster 18:1 mayor que 60% y al menos 0.20 mg/g de tocotrienol.

El aceite de algas de la invención se prepara por extracción a partir de biomasa concentrada, lavada de microalgas. Las células en la biomasa se lisan antes de la extracción. Opcionalmente, la biomasa microbiana se podría secar también (en el horno, liofilizado, etc.) antes de la lisis (ruptura celular). Por otra parte, las células se pueden lisar sin separar algunas o todas del caldo de fermentación, cuando la fermentación se ha completado. Por ejemplo, a la vez que las células se lisan, las células al líquido extracelular pueden estar en una proporción menor que 1 : 1 , v: v.

Las microalgas que contienen lípidos se pueden lisar para producir un lisado. Como se detalló en este documento, la etapa de lisis de un microorganismo (también conocida como lisis celular) se puede lograr por cualquiera de los medios convenientes, incluyendo la lisis inducida por calor, adición de una base, adición de un ácido, uso de enzimas tales como proteasas y las enzimas de degradación de polisacáridos tales como amilasas, uso de ultrasonido, lisis mecánica basada en la presión, y lisis mediante choque osmótico. Cada uno de estos métodos para la lisis de un microorganismo se puede usar como un método único o en combinación simultánea o secuencial. El alcance de la ruptura celular se puede observar por el análisis microscópico. Mediante uno o más de los métodos anteriores, se observa típicamente mayor que 70% de ruptura celular. De preferencia, la ruptura celular es mayor que 80%, con mayor preferencia mayor que 90% y con máxima preferencia aproximadamente 100%.

Los lípidos y aceites generados por las microalgas de acuerdo con la presente invención se pueden recuperar por extracción. En algunos casos, la extracción se puede realizar usando un aceite o un solvente orgánico, o se puede realizar mediante un procedimiento de extracción sin solventes.

[0001] Para la extracción del aceite de microalgas con solvente orgánico, el solvente orgánico preferido es el hexano. Típicamente, el solvente orgánico, se adiciona directamente al lisado sin la separación anterior de los componentes del lisado. En una modalidad, el lisado generado por uno o varios de los métodos descritos anteriormente se pone en contacto con un solvente orgánico por un período de tiempo suficiente para permitir a los componentes lípidos formar una solución con el solvente orgánico. En algunos casos, la solución se puede además refinar después para recuperar de manera específica los componentes lipidíeos convenientes. La mezcla se puede filtrar después y eliminar el hexano, por ejemplo, por rotoevaporación. Los métodos de extracción de hexano son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Frenz y otros, Enzyme Microb. Technol, 11 :717 (1989).

Miao y Wu describieron un protocolo de la recuperación del lípido de microalgas de un cultivo de Chlorella protothecoides en el que las células se recogieron por centrifugación, lavaron con agua destilada y secaron por liofilización. El polvo celular resultante se pulverizó en un mortero y extrajo con «-hexano. Miao y Wu, Biosource Technology 97:841-846 (2006).

En algunos casos, los aceites de microalgas se pueden extraer por medio de licuación (ver, por ejemplo Sawayama y otros, Biomass and Bioenergy 17:33-39 (1999) y Inoue y otros, Biomass Bioenergy 6(4):269-274 (1993)); licuación de aceite (ver, por ejemplo Minowa otros, Fuel 74(12): 1735-1738 (1995)); o extracción con C02 supercrítico (ver, por ejemplo Mendes y otros, Inorgánica Chimica Acta 356:328-334 (2003)).

La extracción de aceite incluye la adición de un aceite directamente a un lisado sin separación anterior de los componentes del lisado. Después de la adición del aceite, el lisado se separa en diferentes capas ya sea por su propia cuenta o como un resultado de la centrifugación o similares. Las capas se pueden incluir en orden de densidad decreciente: un sedimento de sólidos pesados, una fase acuosa, una fase de emulsión, y una fase oleosa. La fase de emulsión es una fase de emulsión de lípidos y acuosa. En dependencia del porcentaje de aceite adicionado con respecto al lisado (p/p o v/v), la fuerza de centrifugación si es el caso, el volumen de medios acuosos y otros factores, cualquiera de las fases de emulsión y oleosa o ambas pueden estar presente. La incubación o tratamiento con el aceite del lisado celular o la fase de emulsión se llevan a cabo durante un tiempo suficiente para permitir al lípido producido por el microorganismo solubilizarse en el aceite para formar una mezcla heterogénea.

En varias modalidades, el aceite usado en el proceso de extracción se selecciona del grupo consistente de aceite de soya, colza, cañóla, palma, almendra de palma, coco, maíz, aceite de desechos vegetales, sebo chino, aceituna, girasol, semilla de algodón, grasa de pollo, sebo vacuno, sebo porcino, microalgas, macroalgas, Cuphea, lino, maní, sebo blanco de primera (manteca de cerdo), semilla de mostaza Camelina sativa, semilla del anacardo, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, semilla de lino, avellanas, euforbia, semilla de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, aceite de árbol de tung, cacao, copra, opio de amapola, semillas de ricino, pacana, jojoba, jatrofa, nueces de Brasil, y aguacate. La cantidad de aceite que se adiciona al lisado es típicamente mayor que 5% (medido por v/v y/o p/p) del lisado que se combina al aceite. De este modo, un v/v o p/p de preferido del aceite es mayor que 5%, 10%, 20%, 25%, 50%, 70%, 90%, o al menos 95% del lisado celular.

Los lípidos se pueden extraer también de un lisado sin sustancial o cualquier uso de solventes orgánicos o aceites a través de un procedimiento de extracción sin solventes por enfriamiento del lisado. La sonicación se puede usar también, particularmente si la temperatura está entre la temperatura ambiente y 65 ° C. Un lisado de centrifugación o sedimentación de este tipo, se puede separar en capas una de ellas es acuosa: la capa de lípido. Otras capas pueden incluir un sedimento sólido, una capa acuosa y una capa de lípido. El lípido se puede extraer de la capa de emulsión por congelación descongelación o de otra manera enfriando la emulsión. En métodos semejantes, no es necesario adicionar cualquier solvente orgánico o aceite. Si cualquier solvente o aceite, se adiciona, puede ser por debajo del 5% v/v o p/p del lisado.

IV. COMBINACIÓN DE BIOMASA DE MICROALGAS O MATERIALES DERIVADOS DE ÉSTAS CON OTROS INGREDIENTES ALIMENTICIOS En un aspecto, la presente invención se dirige a una composición alimenticia que comprende al menos 0.1% p/p biomasa de algas y uno o más ingredientes comestibles, en donde la biomasa de algas comprende al menos 10% de aceite por peso seco, opcionalmente en donde al menos 90% del aceite es glicerolípido. En algunas modalidades, la biomasa de algas contiene al menos 25%, 40%, 50% o 60% de aceite por peso seco. En algunos casos, la biomasa de algas contiene 10-90%, 25-75%, 40-75% o 50- 70% de aceite por peso seco, opcionalmente en donde al menos 90% del aceite es glicerolípido. En al menos una modalidad, al menos 50% en peso del aceite es aceite de glicerolípido monoinsaturado. En algunos casos, al menos 50% en peso del aceite es una forma 18:1 lípido en glicerolípido. En algunos casos, menos de 5% en peso del aceite es ácido docosahexanoico (DHA) (22:6). En al menos una modalidad, menos de 1% en peso del aceite es DHA. Se prefiere un contenido de lípidos de algas con niveles inferiores de ácidos grasos poliinsaturados (PUF A) para asegurar la estabilidad química de la biomasa. En modalidades preferidas, la biomasa de algas se cultiva bajo condiciones heterotróficas y tiene una pigmentación verde reducida. En otras modalidades, la microalga es un muíante de color que carece o tiene pigmentación reducida.

En otro aspecto, la presente invención se dirige a una composición alimenticia que comprende al menos 0.1% p/p biomasa de algas y uno o más ingredientes comestibles, en donde la biomasa de algas comprende al menos 30% de proteína por peso seco, al menos 40% de proteína por peso seco, al menos 45% de proteína por peso seco, al menos 50% de proteína por peso seco, al menos 55% de proteína por peso seco, al menos 60% de proteína por peso seco o al menos 75% de proteína por peso seco. En algunos casos, la biomasa de algas contiene 30-75% o 40-60% de proteína por peso seco. En algunas modalidades, al menos 40% de la proteína cruda es digerible, al menos 50% de la proteína cruda es digerible, al menos 60% de la proteína cruda es digerible, al menos 70% de la proteína cruda es digerible, al menos 80% de la proteína cruda es digerible, o al menos 90% de la proteína cruda es digerible. En algunos casos, la biomasa de algas se cultiva bajo condiciones heterotróficas. En al menos una modalidad, la biomasa de algas se cultiva bajo condiciones repletas de nitrógeno. En otras modalidades, la microalga es un muíante que carece o tiene pigmentación reducida. ' En algunos casos, la biomasa de algas comprende las células predominaníemeníe iníactas. En algunas modalidades, la composición alimenticia comprende aceite que es predominantemente o íotalmente encapsulado dentro de las células de la biomasa. En algunos casos, la composición alimenticia comprende las células de microalgas predominantemeníe iníacías. En algunos casos, el aceiíe de algas es predominaníemeníe encapsulado en las células de la biomasa. En oíros casos, la biomasa comprende predominantemente las células Usadas (por ejemplo, un homogenizado). Como se mencionó anteriormente, un homogenizado de este tipo se puede proporcionar como una suspensión, hojuela, polvo, o harina.

En algunas modalidades de la composición alimenticia, la biomasa de algas comprende, además, al menos 10 ppm de selenio. En algunos casos, la biomasa comprende, además, al menos 15% p/p polisacárido de algas. En algunos casos, la biomasa comprende, además, al menos 5% p/p glicoproteína de algas. En algunos casos, la biomasa comprende entre 0 y 1 15 mcg/g carotenoides totales. En algunos casos, la biomasa comprende al menos 0.5% p/p fosfolípidos de algas. En todos los casos, como se denotó, estos componentes son verdaderos componentes celulares y no extracelulares.

En algunos casos, la biomasa de alga de la composición alimenticia contiene componentes que tienen cualidades antioxidantes. Las cualidades antioxidantes fuertes se pueden atribuir a los múltiples antioxidantes en la biomasa de algas, los que incluyen, pero no se limitan a los carotenoides, minerales esenciales tales como zinc, cobre, magnesio, calcio y manganeso. La biomasa de algas mostró también que contiene otros antioxidantes como los tocoferoles y tocotrienoles. Estos miembros de la familia de la vitamina E son antioxidantes importantes y tienen otros beneficios de salud tales como, efectos de protección contra las lesiones inducidas por accidente cerebrovascular, reversión de la obstrucción arterial, inhibición del crecimiento de las células de cáncer de mama y próstata, disminución de los niveles de colesterol, disminución del riesgo de diabetes tipo II, y efectos protectores contra el daño glaucomatoso. Las fuentes naturales de tocotrienoles y tocoferoles se encuentran en los aceites producidos a partir de palma, girasol, maíz, soya y aceite de oliva, sin embargo las composiciones proporcionadas en este documento tienen niveles significativamente mayores de tocotrienoles que los materiales hasta ahora conocidos.

En algunos casos, las composiciones alimenticias de la presente invención contienen aceite de algas que comprende al menos 5mg/100g, al menos 7mg/100g o al menos 8mg/100g de tocoferol total. En algunos casos, las composiciones alimenticias de la presente invención contienen aceite de algas que comprende al menos 0.15mg/g, al menos 0.20mg/g o al menos 0.25mg/g de tocotrienol total.

En modalidades particulares de las composiciones y/o métodos descritos anteriormente, las microalgas pueden producir carotenoides. En algunas modalidades, los carotenoides producidos por las microalgas pueden ser co-extraídos con lípidos o aceite producido por las microalgas (es decir, el aceite o lípido contendrá los carotenoides). En algunas modalidades, los carotenoides producidos por las microalgas son xantofilas. En algunas modalidades, los carotenoides producidos por las microalgas son carotenos. En algunas modalidades, los carotenoides producidos por las microalgas son una mezcla de carotenos y xantofilas. En diferentes modalidades, los carotenoides producidos por las microalgas comprenden al menos un carotenoide seleccionado del grupo consistente de astaxantina, luteína, zeaxantina, alfa-caroteno, trans-beta caroteno, cis-beta caroteno, licopeno y cualquier combinación de éstos. Un ejemplo no limitativo de un perfil carotenoide del aceite de Chlorella protothecoides se incluye a continuación en los Ejemplos.

En algunas modalidades de la composición alimenticia, la biomasa de alga se obtiene a partir de las algas cultivadas y secadas bajo las condiciones de las buenas prácticas de fabricación (GMP). En algunos casos, la biomasa de alga se combina con uno o más de otros ingredientes comestibles, incluyendo, sin limitación, granos, frutas, vegetales, proteína, lípido, hierba y/o ingredientes de especias. En algunos casos, la composición alimenticia es un aderezo para ensaladas, productos de huevo, horneados, pan, barra, pastas, salsa, sopa, bebida, postre helado, mantequilla o untables. En modalidades particulares, la composición alimenticia no es una pildora o polvo. En algunos casos, la composición alimenticia de acuerdo con la presente invención pesa al menos 50g o al menos lOOg.

La biomasa se puede combinar con uno o más de otros ingredientes comestibles para preparar un producto alimenticio. La biomasa puede ser de una única fuente de algas (por ejemplo, cepa) o la biomasa de algas a partir de múltiples fuentes (por ejemplo, cepas diferentes). La biomasa también puede ser de una única especie de alga, pero con un perfil de composición diferente. Por ejemplo, un fabricante puede mezclar microalgas que son de alto contenido en aceite con microalgas que son de alto contenido en proteína para contenido exacto de aceite y proteína que es conveniente en el producto alimenticio terminado. La combinación se puede realizar por un fabricante de alimento para preparar un producto terminado para la venta o uso de servicio alimenticio. Por otra parte, un fabricante puede vender la biomasa de alga como un producto y un consumidor puede incorporar la biomasa de algas en un producto alimenticio, por ejemplo, mediante la modificación de una receta convencional. En cualquier caso, la biomasa de alga se usa típicamente para sustituir la totalidad o parte de aceite, grasa, huevos, o similares usados en muchos productos alimenticios convencionales.

En un aspecto, la presente invención se dirige a una composición alimenticia que comprende al menos 0.1% p/p biomasa de algas y uno o más ingredientes comestibles, en donde la biomasa de algas se formula a través del mezclado de la biomasa de alga que contiene al menos 40% de proteína por peso seco con biomasa de alga que contiene 40% de lípido por peso seco para obtener una combinación de una proteína y lípido en porcentaje deseado por peso seco. En algunas modalidades, la biomasa es de la misma cepa de las algas. Alternativamente, la biomasa de alga que contiene al menos 40% de lípido por peso seco conteniendo menos de 1% de su lípido como DHA se mezcla con biomasa de alga que contiene al menos 20% de lípido por peso seco conteniendo al menos 5% de su lípido como DHA para obtener una combinación de biomasa seca que contiene en el agregado al menos 10% lípido y 1% DHA por peso seco.

En un aspecto, la presente invención se dirige a un método de preparación de la biomasa de alga por secado de un cultivo de alga para proporcionar la biomasa de alga que comprende al menos 15% de aceite por peso seco bajo condiciones GMP, en las que el aceite de algas es mayor que 50% del lípido monoinsaturado.

En un aspecto, la presente invención se dirige a la biomasa de alga que contienen al menos 15% de aceite por peso seco fabricado bajo condiciones GMP, en las que el aceite de alga es mayor que 50% del lípido 18: 1. En un aspecto, la presente invención se dirige a la biomasa de alga que contiene al menos el 40% de aceite por peso seco fabricado bajo condiciones GMP. En un aspecto, la presente invención se dirige a la biomasa de alga que contiene al menos 55% de aceite por peso seco fabricado bajo condiciones GMP. En algunos casos, la biomasa de algas se envasa como una tableta para la entrega de una dosis unitaria de la biomasa. En algunos casos, la biomasa de alga se envasa con o de otra manera lleva una etiqueta que proporciona las indicaciones para la combinación de la biomasa de alga con otros ingredientes comestibles.

En un aspecto, la presente invención se dirige a los métodos de la combinación de la biomasa de microalgas y/o materiales derivados de éstos, como se describió anteriormente, con al menos otro ingrediente alimenticio terminado, como se describe a continuación, para formar una composición alimenticia o producto alimenticio. En diferentes modalidades, la composición alimenticia que se forma por los métodos de la invención comprende un producto de huevo (en polvo o líquido), un producto de pasta, un producto de aderezo, un producto de mayonesa, un producto de pastel, un producto de pan, una barra de energía, un producto de leche, un producto de jugo, un untable, o un batido. En algunos casos, la composición alimenticia no es una pildora o en polvo. En diferentes modalidades, la composición alimenticia pesa al menos de 10 g, al menos 25 g, al menos 50 g, al menos 100 g, al menos 250 g, o al menos 500 g o más. En algunas modalidades, la composición alimenticia formada por la combinación de la biomasa de microalgas y/o productos derivados de éstos es un producto crudo. En otros casos, la composición alimenticia es un producto cocido.

En otros casos, la composición alimenticia es un producto cocido. En algunos casos, la composición alimenticia contiene menos que 25% de aceite o grasa por peso, excepto el aceite aportado por la biomasa de alga. La grasa, en forma de triglicéridos saturados (TAG o grasas trans), se prepara mientras la hidrogenación de aceites vegetales, como se practica mientras la preparación de untables tales como margarinas. La grasa contenida en la biomasa de alga no tiene presente grasas trans. En algunos casos, la composición alimenticia tiene menos que 10% de aceite o grasa por peso excepto el aceite aportado por la biomasa. Al menos en una modalidad, la composición alimenticia es libre de aceite o grasa excepto el aceite aportado por la biomasa. En algunos casos, la composición alimenticia es libre de aceite que no sea el aceite aportado por la biomasa. En algunos casos, la composición alimenticia está libre de huevo o productos de huevo.

En un aspecto, la presente invención se dirige a un método de preparar una composición alimenticia en el que se sustituya total o parcialmente la grasa o el aceite de un producto alimenticio convencional con la biomasa de algas que contienen al menos un 10% por peso de aceite. En una modalidad, el método comprende la determinación de una cantidad de biomasa de alga para la sustitución mediante la proporción de aceite de alga en la biomasa y la cantidad de aceite o grasa en el producto alimenticio convencional, y la combinación de la biomasa de alga con al menos otro ingrediente comestible y menos de la cantidad de aceite o grasa contenida en el producto alimenticio convencional para formar una composición alimenticia. En algunos casos, la cantidad de biomasa de alga combinada con al menos otro ingrediente es de 1-4 veces la masa o el volumen de aceite y/o grasa en los productos alimenticios convencionales.

En algunas modalidades, el método descrito anteriormente incluye, además, proporcionar una receta para un producto alimenticio convencional que contiene al menos un ingrediente de otros comestibles combinado con un aceite o grasa, y la combinación de 1-4 veces la masa o el volumen de la biomasa de alga con al menos un ingrediente de otros comestibles como la masa o el volumen de grasa o aceite en el producto alimenticio convencional. En algunos casos, el método además incluye la preparación de la biomasa de alga bajo condiciones GMP.

En algunos casos, la composición alimenticia formada por la combinación de biomasa de microalgas y/o el producto derivado de éstas comprende al menos 0.1%, al menos 0.5%, al menos 1%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 25%, o al menos 50% p/p o v/v de biomasa de microalgas o aceite de microalgas. En algunas modalidades, las composiciones alimenticias formadas como se describe en la presente comprenden al menos 2%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 90%, o al menos 95% p/p biomasa de microalgas o producto derivado de éstas. En algunos casos, la composición alimenticia comprende 5-50%, 10-40%, o 15-35% de biomasa de alga o producto derivado de éstas en peso o en volumen.

Como se describió anteriormente, la biomasa de microalgas se puede sustituir por otros componentes que de lo contrario serían incluidos en un producto alimenticio convencional. En algunas modalidades, la composición alimenticia contiene menos que 50%, menos que 40% o menos que 30% de aceite o grasa, por peso, excepto el aceite de microalgas aportado por la biomasa o fuentes de microalgas. En algunos casos, la composición alimenticia contiene menos que 25%, menos que 20%, menos que 15%, menos que 10% o menos que 5% de aceite o grasa por peso, excepto el aceite de microalgas aportado por la biomasa o fuentes de microalgas. Al menos en una modalidad, la composición alimenticia es libre de aceite o grasa excepto el aceite de microalgas aportado por la biomasa o fuentes de microalgas. En algunos casos, la composición alimenticia es libre de huevos, mantequilla, u otras grasas/aceites, o al menos un ingrediente de otros que normalmente serían incluidos en un producto alimenticio convencional comparable. Algunos productos alimenticios están libres de productos lácteos (por ejemplo, mantequilla, crema y/o queso).

La cantidad de biomasa de algas usadas para preparar una composición alimenticia depende de la cantidad de aceite sin alga, grasa, huevos, o similares que se sustituyen un producto alimenticio convencional y el porcentaje de aceite en la biomasa de alga. De este modo, al menos en una modalidad, los métodos de la invención incluyen la determinación de una cantidad de la biomasa de alga para combinar con al menos un ingrediente de otros comestibles de una proporción de aceite en la biomasa y una proporción de aceite y/o grasa que se combina normalmente con al menos un ingrediente de otros comestibles en un producto alimenticio convencional. Por ejemplo, si la biomasa de alga es de 50%> p/p de aceite de microalgas, y 'es conveniente la sustitución completa de aceite o grasa en una receta convencional, el aceite se puede sustituir por ejemplo en una proporción de 2:1. La proporción se puede medir por la masa, salvo que en la práctica, a menudo es más fácil medir el volumen usando una taza de medir o una cuchara, y la sustitución puede ser por volumen. En un caso general, el volumen o masa de aceite o grasa a sustituirse se sustituye por un volumen o masa de la biomasa de algas (100/100-X), donde X es el porcentaje de aceite de microalgas en la biomasa. En general, el aceite y las grasas a sustituirse en las recetas convencionales se pueden sustituir en total por la biomasa de alga, aunque la sustitución total no sea necesaria y cualquier proporción de aceite y/o grasas convenientes se pueden retener y se sustituye el resto de acuerdo con el gusto y necesidades nutricionales. Debido a que la biomasa de alga contiene proteínas y fosfolípidos, que funcionan como agentes emulsionantes, los elementos tales como los huevos se pueden sustituir con la totalidad o parte de la biomasa de alga. Si un huevo se sustituye con la totalidad de la biomasa, a veces es conveniente o necesario aumentar las propiedades emulsionantes en la composición alimenticia con un agente(s) emulsionante adicional y/o adicionar más agua u otro(s) líquido(s) para compensar la pérdida de estos componentes que de otra manera podrían ser proporcionados por el huevo. Debido a que un huevo no es todo grasa, la cantidad de biomasa usada para sustituir un huevo podría ser menor que la usada para sustituir el aceite o la grasa pura. Un huevo promedio pesa aproximadamente 58 gramos y comprende aproximadamente 11.2% de grasa. De este modo, aproximadamente 13 g de biomasa de alga que comprende 50% de aceite de microalgas por peso, se puede usar para sustituir la parte de grasa total de un huevo en total. La sustitución de la totalidad o parte de los huevos en un producto alimenticio tiene la ventaja adicional de reducir el colesterol.

Para simplificar, las proporciones de sustitución se pueden proporcionar también en términos de masa o volumen de aceite, grasa y/o huevos sustituidos por masa o volumen de la biomasa. En algunos métodos, la masa o el volumen de aceite, grasa y/o huevos en una receta convencional se sustituyen por 5-150%, 25-100% ó 25-75% de la masa o volumen de aceite, grasa y/o huevos. La tasa de sustitución depende de factores tales como los productos alimenticios, perfil nutricional conveniente del producto alimenticio, textura y apariencia de los productos alimenticios en conjunto, y el contenido de aceite de la biomasa.

En los alimentos cocidos, la determinación de los porcentajes (es decir, peso o volumen) se pueden preparar antes o después de la cocción. El porcentaje de biomasa de algas puede aumentar durante el proceso de cocción debido a la pérdida de líquidos. Debido a que algunas células de la biomasa de algas podrían lisar en el curso del proceso de cocción, puede dificultarse medir el contenido de la biomasa de algas directamente en un producto cocido. Sin embargo, el contenido se puede determinar indirectamente a partir de la masa o el volumen de biomasa que entró en el producto bruto como porcentaje del peso o volumen del producto terminado (en base a los sólidos secos de la biomasa), así como por los métodos de análisis de componentes que son exclusivos de la biomasa de algas, tales como las secuencias genómicas o compuestos que se entregan exclusivamente por la biomasa de algas, tales como determinados carotenoides.

En algunos casos, podría ser conveniente combinar la biomasa de algas con al menos un ingrediente de otros comestibles en una cantidad que exceda la cantidad proporcional de aceite, grasa, huevos, o similares que se presentan en un producto alimenticio convencional. Por ejemplo, se podría sustituir la masa o el volumen de aceite y/o grasa en un producto alimenticio convencional con 1, 2, 3, 4 o más veces esa cantidad de biomasa de algas. Algunas modalidades de los métodos de la invención incluyen proporcionar una receta para un producto alimenticio convencional que contiene al menos un ingrediente de otros comestibles combinado con un aceite o grasa, y la combinación de 1-4 veces la masa o el volumen de la biomasa de algas con al menos un ingrediente de otros comestibles como la masa o el volumen de grasa o aceite en el producto alimenticio convencional.

La biomasa de algas (predominantemente intacta u homogenizada o micronizada) y/o aceite de algas se combinan con al menos un ingrediente de otros comestibles para formar un producto alimenticio. En algunos productos alimenticios, la biomasa de algas y/o aceite de algas se combina con 1-20, 2-10, ó 4-8 ingredientes de otros comestibles. Los ingredientes comestibles se pueden seleccionar de todos los grupos de alimentos principales, incluyendo sin limitación, frutas, verduras, legumbres, carnes, pescado, granos (por ejemplo, trigo, arroz, avenas, harina de maíz, cebada), hierbas, especias, agua, caldo vegetal, jugo, vino y vinagre. En algunas composiciones alimenticias, al menos 2, 3, 4 ó 5 grupos de alimentos se representan, así como la biomasa de algas o aceite de algas.

Los aceites, grasas, huevos y similares se pueden combinar también en composiciones alimenticias, pero, como se discutió anteriormente, usualmente están presentes en cantidades reducidas (por ejemplo, menos de 50%, 25%, o 10% de la masa o volumen de aceite, grasa o huevos comparado con productos alimenticios convencionales. Algunos productos alimenticios de la invención están libres de aceite distinto del proporcionado por la biomasa de alga y/o aceite de algas. Algunos productos alimenticios están libres de aceite distinto del proporcionado por la biomasa de alga. Algunos productos alimenticios están libres de grasas distintas de las proporcionadas por la biomasa de alga o aceite de algas. Algunos productos alimenticios están libres de grasas distintas de las proporcionadas por la biomasa de alga. Algunos productos alimenticios están libres de aceites y grasas distintas de las proporcionadas por la biomasa de alga o aceite de algas.

Algunos productos alimenticios están libres de aceites y grasas distintas de las proporcionadas por la biomasa de alga. Algunos productos alimenticios están libres de huevos. En algunas modalidades, los aceites producidos por las microalgas pueden ajustarse por las condiciones de cultivo o selección de la cepa para comprender un(unos) componente(s) o niveles de ácido graso particular.

En algunos casos, la biomasa de algas usada para preparar la composición alimenticia comprende una mezcla de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las especies distintas de microalgas se cultivaron por separado. Al menos en una modalidad, dos de las especies distintas de microalgas al menos tienen perfiles de glicerolípidos diferentes. En algunos casos, el método descrito anteriormente comprende, además, cultivar las algas bajo condiciones heterotróficas y preparar la biomasa de las algas. En algunos casos, al menos dos de todas las especies distintas de microalgas contienen al menos 10%, o al menos 15% de aceite por peso seco. En algunos casos, una composición alimenticia contiene una combinación de dos preparaciones de biomasa distintas de la misma especie, en donde una de las preparaciones contiene al menos 30% de aceite por peso seco y la segunda contiene menos de 15% de aceite por peso seco. En algunos casos, una composición alimenticia contiene una combinación de dos preparaciones de biomasa distintas de la misma especie, en donde una de las preparaciones contiene al menos 50% de aceite por peso seco y la segunda contiene menos de 15% de aceite por peso seco, y en donde, adicionalmente, la especie es Chlorella protothecoides.

Además del uso de la biomasa de algas como una sustitución de aceite, grasa o huevo alimentos convencionales diferentes, la biomasa de algas se puede usar como un suplemento en los alimentos que normalmente no contienen aceite, tal como un batido. La combinación de aceite con productos que son principalmente carbohidratos puede tener beneficios asociados con el aceite, y de la combinación de aceite y carbohidratos para reducir el índice glucémico de los carbohidratos. El suministro de aceite encapsulado en la biomasa es ventajoso para proteger el aceite de la oxidación y también puede mejorar el sabor y la textura del batido.

El aceite extraído de la biomasa de algas se puede usar de la misma manera que la propia biomasa, es decir, como un sustituto de aceite, grasa, huevos, o similares en las recetas convencionales. El aceite se puede usar para sustituir el aceite convencional y/o grasa en aproximadamente 1 : 1 en peso/peso o volumen/volumen. El aceite se puede usar para sustituir huevos por sustitución de aproximadamente 1 cucharadita de aceite de algas por huevo, opcionalmente en combinación con agua adicional y/o un emulsionante (un promedio de 58g de huevo es aproximadamente 11.2% de grasa, el aceite de algas tiene una densidad de aproximadamente 0.915 g/ml, y una cucharadita tiene un volumen de unos 5 ml=1.2 cucharaditas de aceite de algas/huevo). El aceite se puede incorporar también en aderezos, salsas, sopas, margarinas, cremas, mantecas y similares. El aceite es particularmente útil para los productos alimenticios en los que es necesaria la combinación del aceite con otros ingredientes alimentarios que se necesitan para dar un sabor, textura y/o apariencia conveniente. El contenido de aceite por peso o volumen de productos alimenticios puede tener al menos 5, 10, 25 40, ó 50%.

Al menos en una modalidad, el aceite extraído de la biomasa de algas se puede usar también como un aceite de cocina por los fabricantes de alimentos, restaurantes y/o consumidores. En casos tales, el aceite de algas puede sustituir los aceites convencionales de cocina como el aceite de cártamo, aceite de cañóla, aceite de oliva, aceite de semilla de uva, aceite de maíz, aceite de girasol, aceite de coco, aceite de palma, o cualquier otro aceite de cocina usado convencionalmente. El aceite obtenido a partir de biomasa de algas al igual que con otros tipos de aceite puede ser objeto del refinamiento adicional para aumentar su idoneidad para cocinar (por ejemplo, el punto de humo aumentado). El aceite se puede neutralizar con sosa cáustica para eliminar los ácidos grasos libres. Los ácidos grasos libres forman un concentrado de jabón extraíble. El color del aceite se puede eliminar por el blanqueamiento con productos químicos tales como negro de carbón y tierra de blanquear. La tierra de blanquear y los productos químicos se pueden separar del aceite por filtración. El aceite se puede desodorizar también por tratamiento con vapor.

La biomasa predominantemente intacta, la biomasa homogenizada o micronizada (como una suspensión, hojuela, polvo o harina) y el aceite purificado de algas se pueden todos combinar con otros ingredientes alimenticios para formar productos alimenticios. Todos son una fuente de aceite con un perfil nutricional favorable (contenido de grasas monoinsaturadas relativamente alto). La biomasa predominantemente intacta, la biomasa homogenizada o micronizada suministra también proteína de alta calidad (composición equilibrada de aminoácidos), carbohidratos, fibra y otros nutrientes como se discutió anteriormente. Los alimentos que incorporan cualquiera de estos productos se pueden preparar en forma vegetariana o vegetariana estricta. Otra de las ventajas en el uso de la biomasa de microalgas (ya sea predominantemente intacta u homogenizada (o micronizada) o ambas) es como una fuente de proteína vegetariana estricta/vegetariana que no proviene de una fuente principal de alérgenos, tales como soya, huevos o productos lácteos.

Otros ingredientes comestibles con los que la biomasa de algas y/o aceite de algas se pueden combinar de acuerdo con la presente invención incluyen, sin limitación, granos, frutas, verduras, proteínas, carnes, hierbas, especias, carbohidratos y grasas. Los otros ingredientes comestibles con los que la biomasa de algas y/o aceite de algas se pueden combinar para formar composiciones alimenticias dependen de los productos alimenticios que se producen y el sabor, la textura y otras propiedades convenientes del producto alimenticio.

Aunque, en general, cualquiera de estas fuentes de aceite de algas se pueden usar en cualquier producto alimenticio, la fuente preferida depende, en parte, principalmente si el aceite está presente para propósitos nutritivos o calóricos en vez de para textura, apariencia o sabor de los alimentos, o por otra parte si se pretende que el aceite en combinación con otros ingredientes alimentarios contribuyan con un sabor, textura o apariencia conveniente de los alimentos, así también o en vez de mejorar su perfil nutricional y calórico.

Los productos alimenticios, según conveniencia, se pueden cocinar por procedimientos convencionales. En dependencia de la duración y la temperatura, el proceso de cocción podría romper algunas paredes celulares, liberando el aceite de manera que se combine con otros ingredientes en la mezcla. Sin embargo, algunas células de algas intactas sobreviven a menudo a la cocción. Por otra parte, los productos alimenticios se pueden usar sin cocinar. En este caso, la pared de las algas se mantiene intacta, protegiendo el aceite de la oxidación.

La biomasa de algas, si se proporciona en una forma con células predominantemente intactas, o como un polvo homogenizado, difiere del aceite, grasa o huevos en que se puede proporcionar como un ingrediente seco, lo que facilita la mezcla con otros ingredientes secos, tal como la harina. En una modalidad la biomasa de algas se proporciona como un homogenizado seco que contiene entre el 25 y el 40% de aceite en peso seco. Un homogenizado de biomasa se puede proporcionar también en forma de suspensión. Después de la mezcla de ingredientes secos (y suspensión de biomasa homogenizada, si se usa), se pueden adicionar líquidos tales como el agua. En algunos productos alimenticios, la cantidad de líquido necesario es algo mayor que en un producto alimenticio convencional a causa del componente no aceitoso de la biomasa y/o debido a que el agua no se suministra por otros ingredientes, tales como los huevos. Sin embargo, la cantidad de agua se puede determinar fácilmente como en la cocina convencional.

En un aspecto, la presente invención se dirige a una composición de ingrediente alimenticio que comprende al menos 0.5% p/p de la biomasa de algas que contiene al menos un 10% de aceite de algas en peso seco y al menos un ingrediente de otros comestibles, en los que el ingrediente alimenticio por la adición de un líquido a la composición del ingrediente alimenticio se puede convertir en un producto alimenticio reconstituido. En una modalidad, el líquido es agua.

La biomasa rica en aceite homogenizada o micronizada es particularmente ventajosa en líquido, y/o productos alimenticios emulsionados (emulsiones de agua en aceite y aceite en agua), tales como salsas, sopas, bebidas, aderezos para ensaladas, mantequillas, untables y similares, en los cuales el aceite aportado por la biomasa forma una emulsión con otros líquidos. Los productos que se benefician de reología mejorada, tales como aderezos, salsas y untables se describen en los Ejemplos a continuación. Una emulsión con textura (por ejemplo, sensación bucal), sabor y apariencia (por ejemplo, la opacidad) conveniente se puede formar con un contenido inferior de aceite (por peso o volumen del producto completo) usando biomasa homogenizada, que en el caso de los productos convencionales emplean aceites convencionales, de este modo se puede usar como extensor de grasa. Algo semejante es útil para los productos de baja caloría (es decir, dieta). El aceite de algas purificado es ventajoso también para estos líquidos y/o productos emulsionados. Tanto la biomasa rica en aceite homogenizada o micronizada como el aceite purificado de algas combinan bien con otros ingredientes comestibles en los productos horneados logrando un sabor similar o mejor, apariencia y textura que los productos similares de otra manera preparados con aceites convencionales, grasas y/o huevos, pero con un perfil nutricional mejorado (por ejemplo, contenido superior de aceite monosaturado y/o contenido o calidad superior de proteína, y/o contenido superior de fibra y/u otros nutrientes).

La biomasa predominantemente intacta es particularmente útil en situaciones en las que se desea cambiar o aumentar el perfil nutricional de un alimento {por ejemplo, contenido superior de aceite, contenido diferente de aceite (por ejemplo, más aceite monoinsaturado), contenido superior de proteínas, contenido superior de calorías, contenido superior de otros nutrientes). Los alimentos de este tipo pueden ser útiles, por ejemplo, para los atletas o los pacientes que sufren de trastornos de desgaste. La biomasa predominantemente intacta se puede usar como un agente de relleno. Los agentes de relleno se pueden usar, por ejemplo, para aumentar la cantidad de un alimento más caro (por ejemplo, suplemento de carne y similares) o en los alimentos simulados o de imitación, como sustitutos vegetarianos de la carne. Los alimentos simulados o de imitación difieren de los alimentos naturales en los que el sabor y relleno se proporcionan por lo general por fuentes diferentes. Por ejemplo, los sabores de los alimentos naturales, tal como carne, se pueden dar dentro de un agente de relleno que mantiene el sabor. La biomasa predominantemente intacta se puede usar como un agente de relleno en alimentos de este tipo. La biomasa predominantemente intacta es particularmente útil también en los alimentos secos, tales como pasta, ya que tiene buenas propiedades de retención de agua, y de este modo puede facilitar la rehidratación de alimentos de este tipo. La biomasa predominantemente intacta es útil también como un conservante, por ejemplo, en productos horneados. La biomasa predominantemente intacta puede mejorar la retención de agua y de este modo la durabilidad.

La biomasa de algas que se rompió o micronizó también mejora la retención de agua y de este modo la durabilidad. El aumento de la retención de la humedad es especialmente conveniente en los productos libres de gluten, tales como productos horneados libres de gluten. Una descripción detallada de la formulación de una galleta libre de gluten usando biomasa de algas rotas y el estudio de durabilidad posterior se describe en los ejemplos a continuación.

En algunos casos, la biomasa de algas se puede usar en las preparaciones de huevo. En algunas modalidades, la biomasa de algas (por ejemplo, harina de algas) adicionada a una preparación convencional de huevo seco en polvo para crear huevos revueltos que son más cremosos, tienen más humedad y una mejor textura que los huevos secos en polvo preparados sin la biomasa de algas. En otras modalidades, la biomasa de algas se adiciona a los huevos líquidos enteros para mejorar la textura general y la humedad de los huevos que se preparan y se mantienen después en una mesa a vapor. Los ejemplos específicos de la preparación anterior se describen en los Ejemplos a continuación.

La biomasa de algas (predominantemente intacta y/o homogenizada o micronizada) y/o el aceite de algas se pueden incorporar en prácticamente cualquier composición alimenticia. Algunos ejemplos incluyen los productos horneados, tales como tortas, bizcochos, torta amarilla, pan incluyendo brioche, galletas incluyendo galletas dulces, galletas y pasteles. Otros ejemplos incluyen los productos que a menudo se proporcionan en forma seca, tales como pastas o aderezos en polvo, cremas secas, carnes trituradas y sustituías de la carne. La incorporación de biomasa predominantemente intacta en algunos productos tales como un agente de unión y/o de relleno puede mejorar la hidratación y aumentar el rendimiento debido a la capacidad de retención de agua de la biomasa predominantemente intacta. Los alimentos rehidratados, tales como los huevos revueltos preparados a partir de huevos secos en polvo, podrían tener también una textura y perfil nutricional mejorado. Otros ejemplos incluyen los productos líquidos alimenticios, tales como salsas, sopas, aderezos (listos para comer), cremas, bebidas lácteas, jugos, batidos, cremas. Otros productos alimenticios líquidos incluyen bebidas nutricionales que sirven como un sustituto de comida o leche de algas. Otros productos alimenticios incluyen mantequillas o quesos y similares, incluyendo manteca, margarina para untar, mantequillas de frutos secos y productos derivados del queso, tales como la salsa de nacho. Otros productos alimenticios incluyen barras de energía, sustitutos de confecciones de chocolate-lecitina, barras sustituías de comidas, productos de granóla en barra. Otro tipo de producto alimenticio es la masa y cubierta. Al proporcionar una capa de aceite alrededor de un alimento, la biomasa predominantemente intacta o un homogenizado repelen de la penetración a un alimento del aceite adicional de un medio de cocción. De este modo, el alimento puede conservar los beneficios del alto contenido de aceite monoinsaturado del recubrimiento sin recoger los aceites menos deseables (por ejemplo, grasas trans, grasas saturadas, y sub-productos del aceite de cocina). El revestimiento de la biomasa puede proporcionar también una textura conveniente (por ejemplo, crujiente) a los alimentos y un sabor más limpio debido a la menor absorción de aceite de cocina y sus subproductos.

En los alimentos crudos, la mayoría de las células de algas en la biomasa se mantienen intactas. Esto tiene la ventaja de proteger el aceite de algas de la oxidación, que le confiere una larga durabilidad y minimiza la interacción adversa con otros ingredientes. Dependiendo de la naturaleza de los productos alimenticios, la protección conferida por las células podría reducir o evitar la necesidad de refrigeración, envasado al vacío o similares. Las células que se mantienen intactas también evitan el contacto directo entre el aceite y la boca de un consumidor, lo que reduce la sensación oleosa o grasosa que podría ser indeseable. En los productos alimenticios en los que el aceite se usa más como suplemento nutritivo, puede ser una ventaja para mejorar las propiedades organolépticas del producto. De este modo, la biomasa predominantemente intacta es adecuada para usar en productos de este tipo. Sin embargo, en los productos crudos, tales como un aderezo de ensalada, en el que el aceite da una sensación bucal deseada (por ejemplo, como una emulsión con una solución acuosa tal como vinagre), se prefiere el uso del aceite purificado de algas o biomasa micronizada. En los alimentos cocidos, algunas células de algas de la biomasa original intacta podrían ser Usadas, pero otras células de algas podrían permanecer intactas. La proporción de células lisadas por intactas depende de la temperatura y la duración del proceso de cocción. En los alimentos cocidos en el que se desea la dispersión del aceite de manera uniforme con otros ingredientes de sabor, textura y/o apariencia (por ejemplo, productos horneados), se prefiere el uso de la biomasa de algas micronizadas o aceite purificado. En los alimentos cocinados, la biomasa de algas se usa para suministrar aceite y/o proteínas y otros nutrientes, principalmente por su valor nutricional o calórico más que por su textura.

La biomasa de algas puede ser útil también en aumentar el índice de saciedad de un producto alimenticio (por ejemplo, una bebida sustituía de comida o batido) en relación con un producto diferente al similar convencional preparado sin la biomasa de algas. El índice de saciedad, es una medida de la extensión para la que el mismo número de calorías de diferentes alimentos satisfaga el apetito. Un índice semejante se puede medir por el suministro de un alimento que se prueba y la medida del apetito por otros alimentos en un intervalo fijo en lo sucesivo. Mientras menos apetito por otros alimentos en lo sucesivo, más alto el índice de saciedad. Los valores del índice de saciedad se pueden expresar en una escala en la que se asigna al pan blanco un valor de 100. Los alimentos con un alto índice de saciedad son útiles para la dieta. Aunque no depende de una comprensión del mecanismo, la biomasa de algas se cree aumentar el índice de saciedad de un alimento por el aumento del contenido de la proteína y/o fibra del alimento para una cantidad determinada de calorías.

La biomasa de algas (predominantemente intacta y homogenizada o micronizada) y/o aceite de algas se pueden fabricar también en los suplementos nutritivos o dietéticos. Por ejemplo, el aceite de algas se puede encapsular en cápsulas digeribles de una manera similar al aceite de pescado. Tales cápsulas se pueden envasar en una botella y tomar diariamente (por ejemplo, 1-4 cápsulas o comprimidos por día). Una cápsula puede contener una dosis unitaria de la biomasa de algas o aceite de algas. Del mismo modo, la biomasa se puede comprimir dentro de los comprimidos de forma opcional con excipientes farmacéuticos u otro. Las comprimidos se pueden envasar, por ejemplo, en un frasco o envase blíster, y tomar a diario a una dosis de, por ejemplo, 1-4 comprimidos al día. En algunos casos, la tableta u otra formulación de dosis comprenden una dosis unitaria de la biomasa o aceite de algas. La fabricación de productos de cápsulas y comprimidos y otros suplementos se realiza de preferencia en condiciones GMP apropiadas para los suplementos nutritivos como se codifica en 21 C.F.R. 111, o regulaciones comparables establecidas por jurisdicciones extranjeras. La biomasa de algas se puede mezclar con otros polvos y presentarse en sobres como un material listo para mezclar (por ejemplo, con agua, jugo, leche u otros líquidos). La biomasa de algas se puede mezclar también en productos tales como yogures.

Aunque la biomasa de algas y/o aceite de algas se pueden incorporar en los suplementos nutritivos, los productos de alimentos funcionales discutidos anteriormente tienen distinciones de suplementos típicos nutricionales, que son en forma de pildoras, cápsulas o polvos. El tamaño de la porción de tales productos alimenticios es típicamente mucho más grande que un suplemento nutritivo tanto en términos de peso como en términos de calorías suministradas. Por ejemplo, los productos alimenticios tienen a menudo un peso por encima de 100 gramos y/o suministro de al menos 100 calorías cuando se envasan o consumen al mismo tiempo. Los productos alimenticios contienen típicamente al menos un ingrediente es decir ya sea una proteína, un carbohidrato o un líquido y, contienen a menudo dos o tres de otros ingredientes semejantes. Las proteínas o carbohidratos en un producto alimenticio suministran a menudo al menos 30%, 50% ó 60% de las calorías del producto alimenticio.

Como se discutió anteriormente, la biomasa de algas se puede preparar por un fabricante y vender a un consumidor, tal como un restaurante o individuo, para el uso en un entorno comercial o en el hogar. Tal biomasa de algas se fabrica y envasa de preferencia en condiciones de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) para los productos alimenticios. La biomasa de algas en forma predominantemente intacta o forma homogenizada o micronizada como un polvo seco se envasa a menudo en un recipiente hermético, tal como una bolsa sellada. La biomasa homogenizada o micronizada en forma de suspensión se puede envasar convenientemente en una cuba entre otros recipientes. Opcionalmente, la biomasa de algas se puede envasar al vacío para mejorar la durabilidad. La refrigeración de la biomasa de algas envasada no es necesaria. La biomasa de algas envasada puede contener instrucciones de uso incluyendo las indicaciones de cuanto usar de la biomasa de algas para reemplazar una cantidad determinada de aceite, grasa o huevos en una receta convencional, como se discutió anteriormente. Para simplificar, las indicaciones pueden afirmar que aceite o grasa deben ser sustituidos en una proporción de 2:1 por masa o volumen de la biomasa, y los huevos en una proporción de 1 lg de biomasa o 1 cucharadita de aceite de algas por huevo. Como se discutió anteriormente, otras proporciones son posibles, por ejemplo, usando una proporción de 10-175% de la masa o volumen de la biomasa para la masa o el volumen de aceite y/o grasa y/o huevos en una receta convencional. Al abrir un envase sellado, las instrucciones podrían dirigir al usuario a mantener la biomasa de algas en un recipiente hermético, tal como aquellos ampliamente disponibles en el comercio (por ejemplo, Glad), opcionalmente con refrigeración.

La biomasa de algas (predominantemente intacta o polvo homogenizado o micronizada) se puede envasar también en una forma combinada con otros ingredientes secos (por ejemplo, azúcar, harina, frutos secos, saborizantes) y envasar en porciones para garantizar la uniformidad en el producto terminado. La mezcla se puede convertir después por un consumidor o una compañía de servicio de alimentos en un producto alimenticio simplemente por la adición de un líquido, tales como agua o leche, y mezclando y/o cocinando opcionalmente sin la adición de aceites o grasas. En algunos casos, el líquido se adiciona para reconstituir una composición seca de biomasa de algas. La cocción se puede realizar opcionalmente usando un horno de microondas, horno de convección, horno convencional, o en una estufa. Las mezclas de este tipo se pueden usar para preparar tortas, panes, panqueques, barquillos, bebidas, salsas y similares. Las mezclas de este tipo tienén ventajas de conveniencia para el consumidor, así como larga durabilidad sin refrigeración. Las mezclas de este tipo se envasan típicamente en un recipiente sellado que tiene instrucciones para convertir la mezcla en un producto alimenticio por adición de líquido.

El aceite de algas para el uso como un ingrediente alimenticio se fabrica y envasa del mismo modo de preferencia bajo condiciones GMP para los alimentos. El aceite de algas se envasa típicamente en una botella u otro recipiente en forma similar a los aceites usados convencionalmente. El recipiente puede incluir una etiqueta fijada con las indicaciones para el uso del aceite en sustitución de los aceites convencionales, grasas o huevos en los productos alimenticios, y como un aceite de cocina. Cuando se envasa en un recipiente sellado, el aceite tiene una larga durabilidad (al menos un año) sin deterioro sustancial. Después de abierto, el aceite de algas que se compone principalmente de los aceites monoinsaturados no es extremadamente sensible a la oxidación. Sin embargo, las porciones sin usar del aceite se pueden mantener más tiempo y con menos oxidación si se mantienen frías y/o fuera de la luz solar directa (por ejemplo, dentro de un espacio cerrado, tal como un armario). Las indicaciones incluidas con el aceite pueden contener información del tipo de almacenamiento preferido.

Opcionalmente, la biomasa de algas y/o el aceite de algas puede contener un preservante/antioxidante aprobado para alimentos para maximizar tiempo de vida útil, que incluye pero sin limitarse a, carotenoides (por ejemplo, astaxantina, luteína, zeaxantina, alfa-caroteno, beta-caroteno y licopeno), fosfolípidos (por ejemplo, N-acilfosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol y lisofosfatidilcolina), tocoferoles (por ejemplo, alfa tocoferol, beta tocoferol, gamma tocoferol y delta tocoferol), tocotrienoles (por ejemplo, alfa tocotrienol, beta tocotrienol, gamma tocotrienol y delta tocotrienol), hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, polifenoles, ácido rosmarínico, propil galato, ácido ascórbico, ascorbato de sodio, ácido sórbico, ácido benzoico, metil parabenos, ácido levulínico, ácido anísico, ácido acético, ácido cítrico, y bioflavonoides.

La descripción de la incorporación de la biomasa predominantemente intacta, o biomasa homogenizada o micronizada (suspensión, hojuelas, polvo, o harina) o aceite de algas en los alimentos para la nutrición humana es en general aplicable también a los productos alimenticios para los animales no humanos.

La biomasa confiere aceite o proteínas de alta calidad o ambos en alimentos de este tipo. El contenido de aceite de algas es de preferencia al menos 10 ó 20% por peso como es el contenido de proteína de las algas. La obtención al menos una parte de aceite y/o proteína de algas de la biomasa predominantemente intacta a veces es ventajoso para la alimentación de animales de alto rendimiento, tales como perros o caballos de deporte. La biomasa predominantemente intacta es útil también como conservante. La biomasa o aceite de algas se combina con otros ingredientes que se encuentran típicamente en alimentos de animal (por ejemplo, una carne, saborizante de carne, ácidos grasos, vegetales, frutas, almidón, vitaminas, minerales, antioxidantes, probiótica) y cualquier combinación de éstos. Los alimentos de este tipo son adecuados también para los animales de compañía, en particular aquellos que tienen un estilo de vida activo. La inclusión de taurina se recomienda para alimentos de gatos. Al igual que con los alimentos convencionales de animales, el alimento se puede proporcionar en partículas de tamaño de un bocado apropiado para el animal destinado.

La harina deslipidada es útil como alimento de los animales de granja, por ejemplo, rumiantes, aves de corral, cerdos, y de acuicultura. La harina deslipidada es un subproducto de la preparación de aceite de alga purificada ya sea para alimentos u otros propósitos. La harina resultante, aunque de contenido de aceite reducido, todavía contiene proteínas de alta calidad, carbohidratos, fibra, cenizas y otros nutrientes adecuados para un pienso animal. Debido a que las células son predominantemente Usadas, la harina deslipidada es fácilmente digerible por animales de este tipo. La harina deslipidada se puede combinar opcionalmente con otros ingredientes, tales como grano, en un alimento animal. Debido a que la harina deslipidada tiene una consistencia en polvo, se puede presionar en los sedimentos mediante un extrusor o expansores, que están disponibles en el comercio.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada.

V. EJEMPLOS EJEMPLO 1 Cultivo de microalgas para lograr alto contenido de aceite Las cepas de microalgas se cultivaron en frascos de agitación con el objetivo de lograr más de 20% de aceite por peso seco de ia célula. El medios del frasco usado fue como sigue: K2HP04: 4.2 g/1, NaH2P04: 3.1 g/1, MgS04»7H20: 0.24 g/1, ácido cítrico monohidratado: 0.25 g/1, 2H20 CaCl2: 0.025g/l, extracto de levadura: 2 g/, y 2% de glucosa. Las células criopreservadas se descongelaron a temperatura ambiente y 500 µ? de células se adicionaron a 4.5 mi de medio y crecieron durante 7 días a 28 °C con agitación (200 rpm) en una placa de 6 pocilios. Los pesos secos celulares se determinaron por centrifugación de 1 mi de cultivo a 14,000 rpm durante 5 minutos en un tubo eppendorf pre-pesado. El sobrenadante de cultivo se descartó y el sedimento celular resultante se lavó con 1 mi de agua desionizada. El cultivo se centrifugó de nuevo, el sobrenadante se descartó, y los sedimentos de célula se colocaron a -80 °C hasta su congelación. Las muestras se liofilizaron después durante 24 horas y se calcularon los pesos secos celulares. Para la determinación de lípido total en los cultivos, 3 mi de cultivo se eliminaron y se sometieron a un análisis mediante un sistema de Ankom (Ankom Inc., Macedonia, Nueva York), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras se sometieron a extracción por solvente con un extractor Amkom XT10 de acuerdo con el protocolo del fabricante. El lípido total de las muestras secas se determinó como la diferencia en masa entre las muestras secas hidrolizadas con ácido y solvente extraído. Las mediciones del peso seco celular del aceite en por ciento se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Porcentaje de aceite por peso seco de la célula EJEMPLO 2 Tres procesos de fermentación se realizaron con tres formulaciones diferentes de medios con el objetivo de generar la biomasa de algas con alto contenido de aceite. La primera formulación (Medio 1) se basó en el medio descrito en Wu y otros. (1994 Science in China, vol. 37, núm. 3, pág. 326-335) y consistió por litro en: KH2P04, 0.7g; K2HP04, 0.3 g; MgS0 -7H20, 0.3 g; FeS04.7H20, 3 mg; hidrocloruro de tiamina, 10^g; glucosa, 20 g, glicina, 0.1 g; H3BO3, 2.9mg; MnCl2-4H20, 1.8mg; ZnS04-7H20, 220µg; CuS04-5H20, 80µg; y NaMo04-2H20, 22.9mg. El segundo medio (Medio 2) se derivó del medio del frasco descrito en el Ejemplo 1 y consistió por litro en: K2HP04, 4.2 g; NaH2P04, 3.1g; MgS04-7H20, 0.24 g; ácido cítrico monohidratado, 0.25 g; cloruro de calcio dihidratado, 25 mg; glucosa, 20 g, extracto de levadura, 2 g. El tercer medio (Medio 3) fue un híbrido y consistió por litro en: K2HP04, 4.2 g; NaH2P04, 3.1g; MgS04-7H20, 0.24 g, ácido cítrico monohidratado, 0.25 g; cloruro de calcio dihidratado, 25 mg; glucosa, 20 g; extracto de levadura, 2 g; H3B03, 2.9mg; MnCl2-4H20, 1.8 mg; ZnS04-7H20, 220µ& CuS04-5H20, 80 g; y NaMo04-2H20, 22.9mg. Las tres formulaciones de medios se prepararon y se esterilizaron en autoclave en recipientes de fermentador a escala de laboratorio durante 30 minutos a 121 °C. La glucosa estéril se adicionó a cada recipiente después de la esterilización en autoclave posterior al enfriamiento.

El inoculo para cada fermentador fue Chlorella protothecoides (UTEX 250), preparado en dos frascos por etapa usando las condiciones de medio y temperatura del fermentador inoculado. Cada fermentador se inoculó con 10% (v/v) del cultivo semi-logarítmico. Los tres fermentadores a escala de laboratorio se mantuvieron a 28 °C durante todo el experimento. El crecimiento celular de microalgas en el Medio 1 se evaluó también a una temperatura de 23 °C. Para todas las evaluaciones del fermentador, el pH se mantuvo a 6.6-6.8, las agitaciones en 500rpm, y el flujo de aire en 1 wm. Los cultivos de fermentación se cultivaron durante 11 días. La acumulación de biomasa se midió por densidad óptica a 750 nm y peso seco celular.

La concentración lípido/aceite se determinó mediante transesterificación directa con los métodos de cromatografía de gases estándar. En resumen, las muestras del caldo de fermentación con biomasa se transfirieron en un papel de transferencia y se trasladaron a tubos de centrifugación y secaron en una estufa de vacío a 65-70 °C durante 1 hora. Cuando las muestras se secaron, 2 mi de 5% de H2S04 en metanol se adicionó a los tubos. Los tubos se calentaron después en un bloque térmico a 65-70 °C durante 3.5 horas, mientras que se agitaron y sonicaron de forma intermitente. 2 mi de heptano se adicionó después, y los tubos se agitaron vigorosamente. 2 mi de 6% de 2C03 se adicionó y los tubos se agitaron para mezclar vigorosamente y se centrifugaron después a 800 rpm durante 2 minutos. El sobrenadante se transfirió después a viales GC que contienen agente de secado Na2S04 y ejecutó usando métodos estándar de cromatografía de gases. El por ciento de aceite/lípido se fundamentó en base al peso seco celular. Los pesos secos celulares para las células cultivadas usando: Medio 1 a 23 °C fue 9.4g/l; Medio 1 a 28 °C fue 1.0 g/1, Medio 2 a 28 °C fue 21.2g/l, y Medio 3 a 28 °C fue 21.5g/l. La concentración lípido/aceite para las células cultivadas usando: Medio 1 a 23 °C fue 3 g/1; Medio 1 a 28 °C fue 0.4 g/1; Medio 2 a 28 °C fue 18 g/1; y Medio 3 a 28 °C fue 19g/l. El por ciento de aceite basado en el peso seco celular para las células cultivadas usando: Medio 1 a 23 °C fue 32%; Medio 1 a 28 °C fue 40%; Medio 2 a 28 °C fue 85%, y Medio 3 a 28 °C fue 88%. Los perfiles de lípidos (en % de área, después de la normalización con el estándar interno) para la biomasa de algas generada usando las tres formulaciones diferentes de medios a 28 °C se resumen a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2. Perfiles de lípido para Chlorella protothecoides cultivada bajo diferentes condiciones del medio.

EJEMPLO 3 Preparación de biomasa para productos alimenticios La biomasa de microalgas se genera por el cultivo de microalgas como se describió en cualquiera de los Ejemplos 1t2. La biomasa de microalgas se cosecha del fermentador, frasco, u otro biorreactor.

Los procedimientos de GMP se siguen. Cualquier persona que, por reconocimiento médico o la observación supervisora, se muestra tener, o parece tener, una enfermedad, lesión abierta, incluyendo ampollas, llagas, o heridas infectadas, o cualquier otra fuente anormal de contaminación microbiana por la que existe una posibilidad razonable de contaminarse el alimento, superficies de contacto con el alimento o materiales de envase del alimento, se debe excluir de cualquiera de las operaciones de las que se esperaría resultar en tal contaminación hasta que la enfermedad se corrija. Los empleados se instruyen para reportar tales enfermedades de salud a sus supervisores. Todas las personas que trabajan en contacto directo con la biomasa de microalgas, superficies en contacto con la biomasa, materiales de envase de la biomasa obedecen a las prácticas de higiene a la vez de la necesaria extensión en el servicio para proteger la biomasa de microalgas contra la contaminación. Los métodos para el mantenimiento de la limpieza incluyen, pero no se limitan a: (1) El uso de uniforme exterior adecuado para la operación de manera que proteja contra la contaminación de biomasa, superficies en contacto con la biomasa, materiales de envase de biomasa. (2) El mantenimiento de la adecuada higiene personal. (3) El lavado de las manos completamente (y desinfección si es necesario para proteger contra la contaminación con microorganismos indeseables) en una adecuada instalación para el lavado de manos antes de empezar a trabajar, después de cada ausencia del puesto de trabajo, y en cualquier otro momento cuando las manos podrían ensuciarse o contaminarse. (4) La eliminación de todas las joyas inseguras y otros objetos que podrían caer en la biomasa, equipos, o recipientes, y la eliminación de las joyas de mano que no se pueden desinfectar adecuadamente durante los períodos en los que la biomasa se manipula con la mano. Si las joyas de mano de este tipo no se pueden eliminar, se cubren con material que se pueda mantener en un estado intacto, limpio y salubre y que proteja eficazmente contra la contaminación por estos objetos a la biomasa, superficies de contacto de biomasa, o materiales de envase de biomasa. (5) El mantenimiento de guantes, si se usan en el manejo de la biomasa, en una estado intacto, limpio y salubre. Los guantes deberán ser de un material impermeable. (6) El uso, donde sea apropiado, en una manera eficaz, redecillas para el cabello, bandas para la cabeza, gorras, cubre barbas, u otras restricciones efectivas para el pelo. (7) El almacenamiento de ropa u otros objetos personales en otras áreas donde la biomasa se expone o donde el equipo o los utensilios se lavan. (8) La limitación de lo siguiente a otras áreas donde la biomasa se podría exponer o donde los equipos o utensilios se lavan: comer biomasa, masticar chicle, tomar bebidas, o usar tabaco. (9) La toma de otras precauciones cualquieras necesarias para proteger contra la contaminación de la biomasa, las superficies de contacto de la biomasa, los materiales de envase de la biomasa con microorganismos o sustancias extrañas, incluyendo pero no limitado a, sudor, cabello, cosméticos, tabaco, productos químicos y medicinas aplicadas a la piel. La biomasa de microalgas se puede opcionalmente someter a un procedimiento de ruptura celular para generar un lisado y/o, secar opcionalmente para formar una composición de la biomasa de microalgas.

EJEMPLO 4 Cultivo de Chlorella protothecoides para generar hojuelas de algas ricas en aceite.

La biomasa Chlorella protothecoides (UTEX 250) se produjo usando tanques de fermentación de 5,000 1 mediante los procesos descritos en los Ejemplos 2 y 3. La concentración de glucosa (jarabe de maíz) se controló durante toda la corrida. Cuando la concentración de glucosa fue baja, más glucosa se adicionó al tanque de fermentación. Después de que todo el nitrógeno se consumió, las células comenzaron a acumular lípido. Las muestras de biomasa se tomaron durante toda la corrida para controlar los niveles de lípido y la corrida se detuvo cuando la biomasa alcanzó el contenido de lípido conveniente (encima de 40% de lípido por peso seco de la célula). En este caso, la biomasa se cosechó cuando alcanzó aproximadamente 50% de lípido por peso seco de la célula.

Para procesar la biomasa de microalgas en frascos de algas, la biomasa de Chlorella protothecoides cosechada se separó del medio de cultivo mediante centrifugación y se secó en un secador de tambor usando métodos estándar de aproximadamente 150-170 °C. La biomasa de Chlorella protothecoides resultante secada en tambor con aproximadamente 50% de lípido por peso seco de la célula (rico en lípido) se envasó y se almacenó para el uso como frascos de algas.

EJEMPLO 5 Ausencia de toxinas de algas en la biomasa seca de Chlorella protothecoides Una muestra de biomasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250) se cultivó y preparó usando los métodos descritos en el ejemplo 4. La biomasa seca se analizó mediante análisis de cromatografía liquida-espectrometría de masa/ espectrometría de masas (LC-MS/MS) para la presencia de algas contaminantes y toxinas de cianobacterias. Los análisis abarcaron todos los grupos de toxinas de algas y cianobacterias publicados en la literatura y mencionados en las regulaciones internacionales de alimentos. Los resultados muestran que la muestra de biomasa no contenía niveles detectables de ninguna de las toxinas de algas o cianobacterias que se probaron. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3. Resultados analíticos LC-MS/MS para las toxinas de algas y cianobacterianas.

EJEMPLO 6 Contenido de fibra en la biomasa de Chlorella protothecoides El análisis proximal se realizó en muestras de biomasa seca de Chlorella protothecoides (UTEX 250) cultivadas y preparadas mediante los métodos descritos en el Ejemplo 4 y en el Ejemplo 17, de acuerdo con los Métodos Oficiales de la Internacional ACOC (Método 991.43 de AOAC). La hidrólisis ácida para el contenido total de grasas (lípido/aceite) se realizó en ambas muestras y el contenido de grasa para la biomasa de algas de alto contenido en lípidos fue aproximadamente 50% y para la biomasa de algas de alto contenido en proteína fue de aproximadamente 15%. El contenido crudo de fibra fue de 2% tanto para la biomasa de algas de alto contenido en lípidos como de alto contenido en proteína. La humedad (determinada por gravimetría) fue de 5% tanto para la biomasa de algas de alto contenido de lípidos como de alto contenido en proteína. El contenido de cenizas, determinado por la quema en crisol y análisis de la ceniza inorgánica, fue 2% para la biomasa de algas de alto contenido de lípidos y 4% para biomasa de algas de alto contenido en proteínas. La proteína cruda, determinada por la cantidad de nitrógeno liberado de la combustión de cada biomasa, íue de 5% para la biomasa de alto contenido en lípido y 50% para la biomasa de alto contenido en proteína. El contenido de carbohidratos se calculó por diferencia, tomando los valores anteriores conocidos para grasa, fibra cruda, humedad, cenizas y proteína cruda y restando ese total de 100. El contenido de carbohidratos calculado para la biomasa de alto contenido en lípido fue de 36% y el contenido de carbohidrato de la biomasa de alto contenido en proteínas de 24%.

Un análisis adicional del contenido de carbohidratos de ambas biomasas de algas mostró aproximadamente 4-8% (p/p) de azúcares libres (principalmente sacarosa) en las muestras. Múltiples lotes de biomasa de algas que contienen alto lípido se probaron para los azúcares libres (ensayos para fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa, y lactosa) y la cantidad de sacarosa en el intervalo de 2.83%-a 5.77; maltosa en el intervalo de no detectado a 0.6; y glucosa en el intervalo de no detectado a 0.6 %. Los otros azúcares, es decir, fructosa, maltosa y lactosa, no se detectaron en ninguno de los lotes ensayados. Múltiples lotes de biomasa de algas que contiene alta proteína se probaron también para los azúcares libres y solamente la sacarosa se detectó en cualquiera de los lotes en un intervalo de 6.93% a 7.95%.

El análisis del contenido de fibra dietética total (dentro de la fracción de carbohidratos de la biomasa de algas), de ambas biomasas de algas se realizó usando los métodos de acuerdo con los Métodos Oficiales de la Internacional ACOC (Método 991.43 de AOAC). La biomasa rica en lípido contenía 19.58% de fibra soluble y 9.86% de fibra insoluble, para una fibra dietética total de 29.44%. La biomasa de alto contenido en proteína contenía 10.31% de fibra soluble y 4.28% de fibra insoluble, para una fibra dietética total de 14.59%.

EJEMPLO 7 Perfil de aminoácidos de la biomasa de algas Una muestra de biomasa seca de Chlorella protothecoides (UTEX 250) con aproximadamente 50% de lípido por peso seco de la célula, cultivadas y preparadas mediante los métodos descritos en el Ejemplo 4 se analizó para el contenido de aminoácidos de acuerdo con los Métodos Oficiales de la Internacional AOAC (análisis de triptófano: método 988.15; de AOAC; análisis de metionina y cisteína: método 985.28 de AOAC y otros aminoácidos: método 994.12 de AOAC). El perfil de aminoácidos de la biomasa seca de algas (expresado en por ciento de proteína total) se comparó con el perfil de aminoácidos de huevo entero seco (el perfil de la hoja de especificaciones de producto para Huevo entero, Protein Factory Inc., Nueva Jersey), y los resultados muestran que las dos fuentes tienen valores nutricionales de proteína comparables. Los resultados del perfil relativo de aminoácidos (para la proteína total) de una muestra de Chlorella protothecoides muestra que la biomasa contiene metionina (2.25%), cisteína (1.69%), Usina (4.87%), fenilalanina (4.31%), leucina (8.43% ), isoleucina (3.93%), treonina (5.62%), valina (6.37%), histidina (2.06%), arginina (6.74%), glicina (5.99%), ácido aspártico (9.55%), serina (6.18%) , ácido glutámico (12.73%), prolina (4.49%) hidroxiprolina (1.69%), alanina (10.11%), tirosina (1.87%) y triptófano (1.12%). La comparación de la biomasa de algas y los perfiles de aminoácidos de huevo entero se muestran en la Figura 2.

EJEMPLO 8 Composición de carotenoide, fosfolípido, tocotrienol y tocoferol de biomasa de Chlorella protothecoides UTEX 250 Una muestra de la biomasa de algas producidas mediante los métodos descritos en el Ejemplo 4 se analizó para el contenido de tocoferol y tocotrienol mediante HPLC en fase normal, Método Ce 8-89 de AOCS. La fracción que contiene tocotrienol y tocoferol de la biomasa se extrajo usando hexano u otro solvente no polar. Los resultados de la composición completa de tocotrienol y tocoferol se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4. Contenido de tocotrienol y tocoferol en la biomasa de alga.

Composición de tocotrienol y tocoferol de Chlorella protothecoides UTEX 250 Tocoferoles Alfa tocoferol 6.29 mg/100g Delta tocoferol 0.47 mg/100g Gamma tocoferol · 0.54 mg/100g Tocoferoles totales 7.3 mg/100g Tocotrienoles Alfa tocotrienol 0.13 mg/g Beta tocotrienol 0 Gamma tocotrienol 0.09 mg g Delta tocotrienol 0 Tocotrienol totales 0.22 mg/g La fracción de la biomasa que contiene carotenoide se aisló y analizó para los carotenoides FP mediante métodos HPLC. La fracción que contiene carotenoide se preparó por la mezcla de la biomasa de algas liofilizada (producida mediante los métodos descritos en el Ejemplo 3) con carburo de silicio en un mortero de aluminio y macerando cuatro veces durante 1 minuto cada vez, con un mortero y mano de mortero. La mezcla de biomasa y silicio macerada se enjuagó con tetrahidrofurano (THF) y el sobrenadante se colectó. La extracción de la biomasa se repitió hasta que el sobrenadante fue incoloro y el sobrenadante THF de todas las extracciones se mezcló y analizó para el contenido de carotenoide mediante métodos estándar de HPLC. El contenido de carotenoide de la biomasa de algas que se secó usando un secador de tambor se analizó también mediante los métodos descritos anteriormente.

El contenido de carotenoide de la biomasa de algas liofilizadas fue: luteína total (66.9-68.9mcg/g: con cis-luteína en el intervalo de 12.4-12.7mcg/g y trans-luteína en el intervalo de 54.5-56.2mcg g); trans-zeaxantina (31.427-33.45 lmcg/g); cis-zeaxantina (1.201-1.315mcg/g); t-alfa criptoxantina (3.092-3.773mcg/g); t-beta criptoxantina (1.061-1.354mcg/g); 15-cis-beta caroteno (0.625-.0675mcg/g); 13-cis-beta caroteno (.0269-.0376mcg/g); t-alfa caroteno (0.269-.0376mcg/g); c-alfa caroteno (0.043-.010mcg/g); t-beta caroteno (0.664-0.741mcg/g); y 9-cis-beta caroteno (0.241-0.263mcg/g). El total reportó carotenoides en el intervalo de 105.819mcg/g a 110.815mcg/g.

El contenido de carotenoides de la biomasa de algas seco en tambor fue significativamente inferior: luteína total (0.709mcg/g: con trans-luteína siendo 0.09 lmcg/g y cis-luteína siendo 0.618mcg/g); trans-zeaxantina (0.252mcg/g), cis-zeaxantina (0.037mcg/g), alfa-criptoxantina (O.OlOmcg/g), beta-criptoxantina (O.OlOracg/g) y t-beta-caroteno 0.008mcg/g). El total de carotenoides reportados fue 1.03mcg g. Estos datos sugieren que el método usado para el secado de la biomasa de algas puede afectar significativamente el contenido de carotenoide.

El análisis de fosfolípido se realizó también en la biomasa de algas. La fracción que contiene fosfolípido se extrajo mediante el método de extracción de Folch (cloroformo, metanol y mezcla de agua) y la muestra de aceite se analizó mediante el Método Oficial Ja 7b-91 de AOCS, determinación por HPLC de lecitinas hidrolizadas (Sociedad Internacional de Lecitina y Fosfolípido 1999), y análisis por HPLC de los fosfolípidos con métodos de detección de dispersión de la luz (Sociedad Internacional de Lecitina y Fosfolípido 1995) para el contenido de fosfolípido. El total de fosfolípido en por ciento p/p fue de 1.18%. El perfil de fosfolípido del aceite de algas fue fosfatidilcolina (62.7%), fosfatidiletanolamina (24.5%), lisofosfatidilcolina (1.7%) y fosfatidilinositol (11%). Un análisis similar se realizó también mediante la extracción de hexano de la fracción que contiene fosfolípido de la biomasa de algas. El total de fosfolípido en por ciento p/p fue 0.5%. El perfil de fosfolípido fue fosfatidiletanolamina (44%), fosfatidilcolina (42%) y fosfatidilinositol (14%).

EJEMPLO 9 Productos alimenticios que contienen hojuelas de aleas (ricas en aceite) Barra de salud cardio/metabólica Los ingredientes de la barra de salud cardio/metabólica consistieron en avena rápida (30.725%o), arroz crujiente (9.855%), azúcar fina granulada (sacarosa) (14.590%), azúcar marrón claro (6.080%), sal (0.550%), aceite de cañóla (10.940%), jarabe de maíz 42 DE (7.700%), miel (3.650%), agua (7.700%), lecitina (0.180%), bicarbonato de sodio (0.180%), biomasa seca de algas (Chlorella protothecoides UTEX 250, 48% de lípido) (1.540%), esterol de planta corowise (1.060%), inulina (fibra soluble) (4.280%), y el psilio (fibra insoluble) (0.970%).

Instrucciones: (1) Precalentar el horno a 325 grados Fahrenheit con convección. (2) Pesar los primeros 5 ingredientes en un tazón. (3) Mezclar el agua, lecitina y bicarbonato de sodio en un mezclador Hobart. (4) Mezclar juntos la miel, jarabe de maíz y aceite de cañóla, calentar en el microondas durante 30-40 segundos. Mezclar a mano con una espátula y verter la mezcla en el mezclador Hobart. (5) Adicionar el sabor de alimento estándar deseado. (6) Adicione los nutracéuticos secos (biomasa de algas, esterol de planta, fibra) en el mezclador Hobart. (7) Adicionar los ingredientes secos restantes. (8) Formar y hornear a 325 grados Fahrenheit durante 20-25 minutos con convección.

Cardioestimulante diario (un alimento líquido que contiene biomasa intacta de algas ricas en aceite Los ingredientes del cardioestimulante saborizados con naranja consistieron en agua destilada (869.858 g), benzoato de sodio (0.100 g), polvo de Ticaloide 5415 (1.000 g), azúcar evaporada de jugo de caña (88.500 g), biomasa seca de algas (más de 40% de aceite) (16.930 g), fibersol-2 ADM (47.000 g), esterol de planta corowise ES-200 con (18.300 g), ácido cítrico granular (1.312 g), extracto de naranja (WONF, Sabor 884.0062U) (1.000 g). Los ingredientes se combinaron y mezclaron hasta suavizarse.

Batido para el manejo de peso (un alimento líquido que contiene biomasa intacta de algas ricas en aceite) Los ingredientes del batido basado en frutas consistieron en agua destilada (815.365g), estabilizador (4.5 g), concentrado de jugo manzana (58g), concentrado de jugo de naranja (46.376g), concentrado de jugo de limón (1.913g), concentrado de puré de mango ( 42. g), puré de banana (40.656g), concentrado de jugo de maracuyá (8.4 g), ácido ascórbico (0.320g), hojuelas de algas (46.41g), extracto de sabor a naranja (lg), sabor piña (0.4 g) y sabor de mango (0.16g). Los ingredientes se combinaron y mezclaron hasta suavizarse.

Comprimidos Cardio/metabólicos (biomasa intacta de algas ricas en aceite en forma de comprimido/encapsulado) Los ingredientes del comprimido metabólico de salud (1.25-1.75 g de tamaño) consistieron en biomasa de microalgas seca de Chlorella protothecoides (UTEX 250, más de 40% de lípido por peso seco de la célula) (1000 mg/comprimido), betateno beta caroteno (beta caroteno 20% de Dunaliella) (15 mg/comprimido), vitamina C como ácido ascórbico (100 mg/comprimido), y bioperina (piper nigrum potenciador de la biodisponibilidad) (2.5 mg/tableta).

Trozos aperitivos de algas Los ingredientes de los trozos aperitivos de algas consistieron en harina blanca sin blanquear (1 taza), harina de papa (1/2 taza), biomasa de algas (más de 40% peso seco celular de lípido) (3 cucharadas), sal (3/4 de cucharadita, ajuste al gusto), harina de cebada (2 cucharadas), agua (1/3-1 taza), y condimentos (por ejemplo, comino, curry, aderezo ranchero) (al gusto).

Procedimiento de preparación: Los ingredientes secos se mezclaron y 1/3 taza de agua se adicionó a los ingredientes secos. El agua adicional se adicionó (hasta un total de 1 taza) para formar la masa. La masa se amasa en un producto uniforme y se deja reposar después durante 30 minutos a temperatura ambiente. La masa reposada se cortó y moldeó en trozos finos y se horneó a 275 °F durante 20-30 minutos, o hasta tostarse.

Galletas de pasas con algas Los ingredientes de las galletas de pasas con algas consistieron en mantequilla o margarina (1/2 taza, la receta convencional de alimento requiere de 3/4 de taza), hojuelas de cebada o harina de avena (1 3/4 de taza), nuez moscada (1/4 de cucharadita), agua o leche (2-3 cucharadas), el azúcar prieta (1 taza), sal (1/2 cucharadita), polvo de hornear (1/2 cucharadita), vainilla (1 cucharadita), canela (1 cucharadita), pasas (opcionalmente embebidas en brandy o jugo de naranja) (3/4 de taza), y biomasa seca de algas (más del 30% de aceite) (1/3 de taza). Esta receta prepara aproximadamente 2 docenas de galletas: La receta convencional de alimento requiere de 2 huevos y ¾ de taza de mantequilla o margarina. Con el uso de la biomasa seca de algas, ¼ de taza de mantequilla o margarina y los huevos se eliminan por la sustitución con la biomasa de algas que contienen aceite.

Procedimiento de preparación: Batir la mantequilla y azúcar. Batir hasta que esté esponjoso bastante. Adicionar la vainilla. Combinar la harina y hojuelas de cebada y algas. Combinar la mezcla de mantequilla con la mezcla de harina-hojuelas. Adicionar las pasas. Dejar caer en cucharaditas, y aplanar, ligeramente. Hornear aproximadamente 90-10 minutos a 375 grados F.

Pasta de cebada con algas Los ingredientes de la pasta de cebada con algas consistieron en harina de cebada (3/4 de taza), biomasa seca de algas con al menos 20% de lípido por peso seco de la célula (2 cucharadas), huevo grande (1), y sal (1/2 cucharadita).

Procedimiento de preparación: Colocar la harina en un bol y adicionar las algas y sal. Batir juntos. Adicionar el huevo en el centro (hacer un pozo), y poco a poco remover en la harina. Si es difícil remover, adicionar 1 cucharada de agua, salpicando a su alrededor. Cuando toda la harina se ha incorporado, comenzar a amasar la masa para hacerla más uniforme. Esto se debería hacer durante 5-8 minutos. Cuando la masa está uniforme, dividir en dos bolas pequeñas, y frotar aceite de oliva en el exterior. Tapar y dejar reposar aproximadamente 30 minutos. Aplanar la masa, y después pasar un rodillo a un espesor de aproximadamente un octavo de una pulgada, para las pastas similar a fettucine. Cortar la pasta en tiras finas. Dejar caer en agua salada hirviendo. Cocinar aproximadamente 8-10 minutos. La pasta se puede servir con una cantidad pequeña de queso parmesano rallado arriba y un poco de pimienta agrietada.

Pasta En este ejemplo se compara la pasta preparada con una receta convencional y una biomasa de célula completa rica en lípido (Chlorella protothecoides (cepa UTEX 250) con 48% de lípido por peso seco de la célula) para sustituir el huevo en la receta convencional.

Tabla 5. Receta para la pasta control tradicional.

Componente Medidas de la receta Peso(g) Porcentaje % Grasa, Peso húm.

Huevo entero (batido) 1 55.67 24.97% 1.87% Sal de mesa ½ cdta. 3.74 1.68% 0.00% Harina, todos los propósitos 1 taza 133.18 59.74% 0.00% Agua 1-2 cda. 30.35 ' 13.61% 0.00% Rendimiento: 3 222.94 100.00% 1.87% Tabla 6. Receta para biomasa de algas de célula completa substituyendo el huevo entero.

Componente Medidas de la receta Peso(g) Porcentaje % Grasa, Peso húm.

Biomasa de célula completa 7.55 3.16% 1.52% Sal de mesa ½ cdta 3.61 1.51% 0.00% Harina, todos los propósitos 1 taza 146.28 61.25% 0.00% Agua 8L37 34.07% 0.00% Rendimiento: 3 238.81 100.00% 1.52% En cada caso el procedimiento de cocción fue: 1. En un bol de ayuda en la cocina usando un gancho de masa, combinar la harina y sal. 2. Batir ligeramente los huevos. A baja velocidad (velocidad # 2), adicionar el huevo ligeramente batido hasta que forme una masa consistente. 3. Si se necesita, remover en 1-2 cucharadas de agua. 4. Mezclar durante 3-4 minutos, adicione un poco de harina extra si la masa está muy pegajosa. 5. Repartir la masa en porciones capaces de laminar. Deje reposar la masa una hora antes de laminado. 6. Usando un laminador de pasta, laminar la masa con el espesor conveniente. 7. Cortar la pasta en tiras. 8. Colocar una olla de agua en la estufa para hervir. 9. Cocinar la pasta y remover con aceite/mantequilla para evitar que se pegue. Servir con salsa.

La pasta de la biomasa de célula completa tuvo textura y apariencia similar a la receta convencional. Ningún sabor prominente de algas fue evidente. La biomasa de algas de célula completa mejoró el rendimiento en la pasta seca, muy probablemente debido a una función de retención de agua. Estas observaciones son consistentes con la idea de que la biomasa de algas de célula completa puede actuar como un buen agente de relleno en los alimentos secos o procesados.

Leche de algas La leche de algas contiene aproximadamente 8% de sólidos, que se compone de 4% lípido saludables para el corazón, 2.5% de proteínas ricas en aminoácidos esenciales, 1.5% de carbohidratos y 0.5% de fibra, y se fortifica con vitaminas A y D. La leche de algas es muy saludable, es vegetariana, y se puede usar como un sustituto de la leche de vaca y leche de soya. A diferencia de la leche de vaca, es muy baja en grasas saturadas, y a diferencia de la leche de soya, la grasa es principalmente un mono-insaturado (más del 50% de C 18: 1). La leche de algas tiene un sabor suave; no a "frijol" como en la leche de soya. Los saborizantes se pueden adicionar, tal como fresa o frambuesa.

Los ingredientes de la leche de algas consistieron en células de algas secas completas que contienen aproximadamente 40% de lípido (8%), vitamina D (200 unidades), vitamina A (200 unidades), goma xantana (0.2%), y agua (hasta 100%). El agua se calentó la goma xantana se dispersó. Las células de algas secas, completas se dispersaron después en la solución caliente de goma xantana y se adicionaron las vitaminas. La solución se homogenizó después usando un homogenizador de alta presión y se pasteurizó. Una formulación adicional se incluye a continuación usando harina de algas.

EJEMPLO 10 Producción de homogenizado de algas (rico en lípido) Chlorella protothecoides que contiene alto lípido se cultivó usando los métodos y condiciones descritos en el ejemplo 4 se procesó en un homogenizado de algas rico en lípido. Para procesar la biomasa de microalgas en un homogenizado de algas, la biomasa de Chlorella protothecoides cosechada se procesó primero en hojuelas de algas (ver Ejemplo 4). Las hojuelas secas de algas se rehidrataron después, en agua desionizada en aproximadamente 40% de concentración de sólidos. La suspensión resultante de hojuelas de algas se micronizó después usando un homogenizador de alta presión (GEA modelo NSlOOl) que funciona a un nivel de presión de 1000-1200 Bar hasta que el tamaño medio de partícula de la biomasa fue menos que 10 um. El homogenizado resultante de algas se envasó y almacenó hasta el uso.

EJEMPLO 11 Productos alimenticios funcionales: Las hojuelas de algas de alto contenido de lívidos y homoeenizado de aleas usados en los alimentos como un sustituto de grasa Los siguientes ejemplos describen el uso de hojuelas de algas de alto contenido de lípidos (por encima del 40% por peso) u homogenizado de algas como un sustituto de grasa en las recetas convencionales y baja en grasa. Las hojuelas de algas de alto contenido de lípidos se prepararon usando los métodos descritos en el Ejemplo 4. El homogenizado de algas rico en lípido se preparó mediante los métodos descritos en el ejemplo 8.

Bizcochos de chocolate Este ejemplo compara los bizcochos de chocolate preparados usando una receta convencional, una receta de control baja en grasa y con hojuelas de algas de alto contenido de lípidos (Chlorella protothecoides (cepa UTEX 250) con 48% de lípido por peso seco de la célula) que sustituyen parte de la grasa en la receta convencional.

Tabla 7. Receta para el bizcocho de chocolate convencional control.

Componente Medidas de la receta Pesoíe) Porcentaje % Grasas, Peso húm.

Mantequilla 1 barra, 1/4 Ib 114.00 19.05% 15.24% Polvo de cacao 1/4 taza 48.00 8.02% 0.80% Huevo enteros 3 156.00 26.07% 1.96% Azúcar, granulada 1 taza 140.92 23.55% 0.00% Harina, todos los propósitos 1 taza 130.40 21.79% 0.00% Levadura en polvo 1 cdta. 3.97 0.66% 0.00% Extracto de vainilla 1 cdta. 5.07 0.85% 0.00% Rendimiento: 1 molde 598.36 100.00% 18.00% Tabla 8. Receta para el control baja en grasa.

Componente Medidas de la receta Peso(g Porcentaje % Grasas, Peso húm.

Mantequilla 0.00 0.00% 0.00% Polvo de cacao 1/4 taza 48.00 10.25% 1.03% Agua 139.80 29.86% 0.00% Huevó enteros 0.00 0.00 0.00% 0.00% Azúcar, granulada 1 taza 140.92 30.10% 0.00% Harina, todos los propósitos 1 taza 130.40 27.85% 0.00% Levadura en polvo 1 cdta. 3.97 0.85% 0.00% Extracto de vainilla 1 cdta. 5.07 1.08% 0.00% Rendimiento: 1 molde 468.16 100.00% 1.03% Tabla 9. Receta para bizcochos de biomasa de alga completa como sustituto de mantequillamantequilla y huevos.

Componente Medidas de la receta Peso(s Porcentaje % Grasas. Peso húm.

Biomasa de célula completa 73.00g 12.59% 6.5% Polvo de cacao 1/4 taza 24.00 4.14% Agua 3 148.00 25.52% Azúcar, granulada 1 taza 183.00 31.55% Harina, todos los propósitos 1 taza 133.00 22.93% Levadura en polvo 1 cdta. 4.00 0.69% Nuez, cortada 1 taza 0.00 0.00% Extracto de vainilla 15.00 2.59% Rendimiento: 1 molde 580.00 100.00% 6.5% En cada caso, el procedimiento de cocción fue: 1. Precalentar el horno a 350 °F. Engrasar y enharinar un molde de 8x8. 2. En una cacerola de salsa pequeña, derretir la mantequilla con el polvo de cacao. Dejar enfriar aparte. 3. En un bol de ayuda en la cocina con pala adjunta, batir los huevos hasta que espume. Poco a poco adicionar el azúcar. 4. Adicionar a temperatura ambiente/sl caliente la mezcla de mantequilla/polvo de cacao a la mezcla de huevo. 5. Mezclar la harina y el polvo de hornear juntos. Adicionar 1/2 mezcla lentamente a la masa. 6. Adicionar las nueces a la porción restante de harina. Adicionar la mezcla a la masa. Mezclar a baja (velocidad #2) hasta mezclarse bien. Adicione el extracto de vainilla y mezcle. 7. Extender la masa en el molde. Hornear durante 20-25 minutos. 8. Enfriar los bizcochos y helado, si desea.

Los bizcochos bajo en grasa de control (con la mantequilla y los huevos omitidos) no tienen la misma estructura de la miga en comparación con los bizcochos preparados con las hojuelas de algas o los bizcochos convencionales. Los bizcochos de hojuelas de algas tuvieron una buena, estructura visible de la miga, pero fueron un poco más densos y engomados que los bizcochos de grasa total. En general, los bizcochos preparados con las hojuelas de algas tuvieron aproximadamente una reducción del 64% en el contenido de grasa cuando se comparó con los bizcochos convencionales Torta Amarilla En. este ejemplo se compara la torta amarilla preparada con una receta convencional, una receta baja en grasa, homogenizado de algas de alto contenido de lípidos (HL-AH) para sustituir los huevos y la mantequilla en la receta convencional, y las hojuelas de algas de alto contenido de lípidos para sustituir los huevos en la receta convencional. Tanto el homogenizado de algas como las hojuelas de algas fueron de Chlorella protothecoides (cepa UTEX 250) con 48% de lípido por peso seco de la célula.

Tabla 10. Receta de pastel amarillo convencional.

Componente Medidas de la receta Pesofg) Porcentaje % Grasas, Peso húm.

Mantequilla 1 taza 222.20 11.38% 9.11% Azúcar, granulada 2 ½ tazas 476.16 24.40% 0.00% Huevos, enteros 3 148.26 7.60% 0.57% Extracto de vainilla 1 ½ cdta. 6.50 0.33% 0.00% Suero de leche. 1% MF 2 ½ tazas 575.00 29.46% 0.29% Harina, todos los propósitos 3 ¾ tazas 502.96 25.77% . 0.00% Levadura en polvo 2 ¼ cdta. 8.35 0.43% 0.00% Bicarbonato de sodio 2 ½ cdta. 12.44 0.64% 0.00% Rendimiento: 2 moldes 1951.87 100.00% 9.97% Tabla 11. Receta para el control negativo bajo en grasas.

Componente Medidas de la receta Peso(g) Porcentaie % Grasas, Peso húm.

Mantequilla 0.00 0.00 0.00% 0.00% Azúcar, granulada 2 ½ tazas 475.00 30.36% 0.00% Huevos, enteros 0.00 0.00 0.00% 0.00% Extracto de vainilla 1 ½ cdta. 6.50 0.42% 0.00% Suero de leche. 1% MF 2 ½ tazas 575.00 36.75% 0.37% Harina, todos los propósitos 3 ¾ tazas 487.69 31.17% 0.00% Levadura en polvo 2 ¼ cdta. 8.52 0.54% 0.00% Bicarbonato de sodio 2 ½ cdta. 11.90 0.76% 0.00% Rendimiento: 2 moldes 1564.61 100.00% 0.37% Tabla 12. Receta para biomasa de alga de alto contenido de lípidos micronizada como un substituto del huevo y la mantequilla.

Componente Medidas de la receta Pesofg) Porcentaie % Grasas, Peso húm. , Mantequilla 0.00 0.00 0.00 0.00 Azúcar, granulada 2 ½ tazas 457.00 22.98% HL-AH micronizada 100.00 5.03% 2.41% Agua (a partir de huevo, 308.47 15.51% Mantequilla) + adicional Extracto de vainilla 1 ½ cdta. 20.00 1.01% Suero de leche 2 ½ tazas 575.00 28.92% Harina, todos los propósitos 3 ¾ tazas 505.00 25.40% Levadura en polvo 2 ¼ cdta. 9.80 0.49% Bicarbonato de sodio 2 ½ cdta. 13.30 0.67% 1988.57 100.00% 2.41% Tabla 13. Receta para hojuelas de alga de alto contenido de lípidos como sustituto del huevo.

Componente Medidas de la receta Peso(e> Porcentaje % Grasas, Peso húm.

Mantequilla 1 taza 227.00 11.69% 9.35% Azúcar, granulada 2 ½ tazas 457.00 23.53% Hojuelas de algas 22.50 1.16% 0.56% Agua (a partir del huevo) 112.50 5.79% Extracto de vainilla 1 ½ cdta. 20.00 1.03% Suero de leche 2 ½ tazas 575.00 29.61% Harina, todos los propósitos 3 ¾ tazas 505.00 26.00% Levadura en polvo 2 ¼ cdta. 9.80 0.50% Bicarbonato de sodio 2 ½ cdta 13.30 0.68% Rendimiento: 2 moldes 1942.10 100.00% 9.91% En cada caso el procedimiento de cocción fue: 1. Precalentar el horno a 350 °F. Engrasar y enharinar en dos moldes 9x13. 2. Espolvorear juntos la harina, polvo de hornear y bicarbonato de sodio. Dejar aparte. 3. En un bol de ayuda en la cocina, batir la mantequilla y azúcar juntos hasta que esté suave. Batir los huevos uno por uno. 4. Adicionar el extracto de vainilla. 5. Adicionar la mezcla de harina a la mezcla alternando con el suero de leche. Mezclar hasta justo que se incorporen. 6. Verter la mezcla en los moldes preparados. 7. Hornear las tortas durante 35-40 minutos, o hasta que un palillo salga limpio. 8. Enfriar.

La torta amarilla preparada con las hojuelas de algas de alto contenido de lípidos (como un sustituto de huevo) fue muy densa, con casi nada de estructura de la miga. Sin embargo, la torta amarilla preparada con hojuelas de algas de alto contenido de lípidos fue húmeda en comparación con el control negativo bajo en grasa, que fue muy denso y seco. La torta preparada con homogenizado de algas de alto contenido de lípidos (HL-AH) (que sustituye toda la mantequilla y los huevos en la torta de grasa total) fue muy húmedo y mantequilloso en la textura y tuvo muy buena estructura de la miga que fue similar a la torta de la receta convencional. En la degustación, la torta preparada con HL-AH careció de un sabor a mantequilla que estuvo presente en la torta convencional. En general, la HL-AH fue un buen sustituto de la mantequilla y los huevos en una receta convencional de torta amarilla. La torta con la HL-AH contenía aproximadamente 75% menos grasa que la torta amarilla convencional, pero produjo una torta con una buena estructura de la miga, textura y humedad.

Galletas Este ejemplo compara las galletas preparadas con una receta convencional, hojuelas de algas de alto contenido de lípidos para sustituir los huevos y la manteca en la receta convencional y homogenizado de algas de alto contenido de lípidos (HL-AH) para sustituir los huevos y la manteca en la receta convencional. Tanto las biomasas de las hojuelas de algas como homogenizado de algas fueron de Chlorella protothecoides (cepa UTEX 250) con 48% de lípido por peso seco de la célula.

Tabla 14. Receta convencional para galletas.

Componente Medidas de la receta Peso(g) Porcentaje % Grasas, Peso húm.

Harina, todos los propósitos 2 tazas 277.73 44.59% 0.00% Levadura en polvo 4 cdta. 20.28 3.26% 0.00% Azúcar, granulada 3 cdta. 12.61 2.02% 0.00% Sal de mesa ½ cdta. 3.40 0.55% 0.00% Manteca (Crisco) ½ taza 82.04 13.17% 13.17% Huevo, entero 1 53.15 8.53% 0.64% Leche, 2% 2/3 taza 173.68 27.88% 0.56% Rendimiento: 12 622.89 100.00% 14.37% Tabla 15. Receta para hojuelas de alga de alto contenido de lípidos para sustituir el huevo y la manteca.

Componente Medidas de la receta Pesofg-) Porcentaje % Grasas, Peso húm.

Harina, todos los propósitos 2 tazas 275.00 46.08% Levadura en polvo 4 cdta. 17.20 2.88% Azúcar, granulada 3 cdta. 11.28 1.89% Sal de mesa ½ cdta. 3.30 0.55% Hojuelas de algas 50.00 8.38% 4.02% Agua 56.00 9.38% Leche. 2% 2/3 taza 184.00 30.83% 0.62% Rendimiento: 12 596.78 100.00% 4.64% Tabla 16. Receta de galletas usando un homogenizado de alga de alto contenido en lípidos (HL-AH).

Componente Medidas de la receta Peso(g) Porcentaje % Grasas, Peso húm.

Harina, todos los propósitos 2 tazas 137.50 46.08% Levadura en polvo 4 cdta. 8.60 2.88% Azúcar, granulada 3 cdta. 5.65 1.89% Sal de mesa ½ cdta. 1.65 0.55% HL-AH 25.00 8.38% 4.02% Agua 28.00 9.38% Leche, 2% 2/3 taza 92.00 30.83% 0.62% Rendimiento: 12 298.40 100.00% 4.64% En cada caso el procedimiento de cocción fue: 1. Precalentar el horno a 450 °F. 2. En un bol de ayuda en la cocina, combinar la harina, polvo de hornear, azúcar y sal. 3. Adicionar la manteca a la mezcla hasta que forme migas gruesas, (velocidad # 2). 4. Batir el huevo con la leche. Adicionar humedad a los ingredientes secos y mezclar justo hasta que los ingredientes secos se humedezcan. 5. Mezclar hasta que forme una masa (velocidad # 2 durante 15 segundos). 6. Pasar el rodillo a 3/4" de espesor (u hoja, si desea). Cortar con cortador de galletas enharinado 2 1/2" 7. Colocar en una bandeja ligeramente engrasada. Hornear durante 8-10 minutos, o hasta dorarse. 8. Servir caliente.

La muestra que se prepara con HL-AH parece similar al control de grasa total en textura y apariencia. En general, las galletas HL-AH fueron las más cercanas a las galletas de receta convencional, produciendo una galleta con 65% menos grasa, pero todavía conservó la textura y elevación de una galleta de receta convencional.

Aderezo de Ensalada Cremoso Éste ejemplo compara el aderezo mayonesa/ensalada usando una receta convencional con el control 40% de grasa, una receta baja en grasa con control 20% de grasa, y una receta con homogenizado de algas de alto contenido de lípidos (HL-AH) (con ~ 20% de grasa por peso) de Chlorella protothecoides (cepa UTEX 250) con 48% de lípido por peso seco de la célula.

Tabla 17. Receta para 40% de control de grasa.

Componente Medidas de la receta Peso(g) Porcentaje % Grasas, Peso húm.

Aceite, cañóla 200.00 40.00% 40.00% Yema de huevo líquida 15.00 3.00% 3.00% Vinagre, destilado, 60 granos 200.00 40.00% 0.00% Sal de mesa 0.00 0.00% 0.00% Aeua 85.00 17.00% 0.00% 500.00 100.00% 43.00% Tabla 18. Receta para 20% de control de grasas.

Componente Medidas de la receta Peso(g) Porcentaje % Grasas, Peso húm.

Aceite, cañóla 100.00 20.00% 20.00% Yema de huevo líquida 14.78 2.96% 2.96% Vinagre, destilado, 60 granos 200.00 40.00% 0.00% Sal de mesa 0.00 0.00% 0.00% Aeua 185.22 37.04% 0.00% 500.00 100.00% 22.96% Tabla 19. Receta para aderezo cremoso para ensalada de HL-AH.

Componente Medidas de la receta Peso(g) Porcentaje % Grasas, Peso húm.

HL-AH 200.00 40.00% 19.0 Agua 180.00 36.00% Vinagre (5% ácido) 120.00 24.00% Sal de mesa 0.00 0.00% 500.00 100.00% 19.0% En cada caso el procedimiento de cocción fue: 1. Usando un procesador de alimentos, combinar la yema de huevo, ácido, agua y sal. 2. Lentamente chorrear en el aceite, hasta que se forme una emulsión compacta. 3. Si la emulsión es muy compacta, agregar un poco de agua adicional 4. Raspar los lados hacia abajo y cortar de nuevo durante 10 segundos para incorporar cualquier gotitas de aceite.

El aderezo control 20% de grasa (preparado con aceite de cañóla) no tuvo ninguna viscosidad y falló para formar una emulsión. La superficie fue espumosa y las gotas de aceite se formaron después de dejar el aderezo asentar. El aderezo preparado con la HL-AH tuvo un sabor de la biomasa de algas, opacidad buena y viscosidad, y una sensación bucal cremosa. En general, la HL-AH confirió una opacidad mejor y viscosidad al aderezo cuando se comparó con tanto los aderezos de 20% grasa como el de 40%. La HL-AH funcionó como un emulsionante grande y produjo un aderezo que tuvo las características de un aderezo de 40% de grasa con la sensación bucal apropiada a la mitad del contenido de grasas. Resultados similares se obtuvieron con HL-AH micronizada (con un contenido de 19% de grasa) en una receta de salsa Holandesa (el control de la receta convencional fue a 80% de grasa). La degustación de la salsa holandesa producida con la HL-AH fue suave y rica, con una sensación bucal cremosa y buena viscosidad. El color de la salsa fue amarillo un poco más oscuro que el control de grasa total. En general, la salsa Holandesa con HL-AH micronizada produjo un producto que fue comparable con el control de grasa total con 75% menos de grasa.

Bebidas de chocolate modelo.

En este ejemplo se compara una bebida nutricional de chocolate modelo preparada con una receta convencional, con homogenizado de algas de alto contenido de lípidos (HL-AH) para sustituir la leche y aceite en la receta convencional, y una con biomasa de hojuelas de algas de alto contenido de lípidos para sustituir la leche y aceite en la receta convencional. Tanto la biomasa de hojuelas de algas como el HL-AH fueron de Chlorella protothecoides (cepa UTEX 250) con 48% de lípido por peso seco de la célula.

Tabla 20. Receta para la bebida de chocolate convencional control.

Componente Peso(g) lOOO.OOg Porcentaje % Grasa Agua 278.60 g 835.81 g 83.581% Leche seca sin grasa 17.88 g 53.64 g 5.364% Polvo de cacao alcalizado 11.38 g 34.14 g 3.414% 0.376% Aislado de proteína de soya 8.12 g 24.36 g 2.436% Maltodextrina 5.00 g 15.00 g 1.500% Sabor, Choc 1.62 g 4.86 g 0.486% Lecitina 1.14 g i g 0.1% Mezcla de gomas 0.81 g 2.43 g 0.243% Fosfato disódico 0.32 g 0.96 g 0.096% Sucralosa 0.13 g 0.39 g 0.039% Aceite de cañóla 8.33 e 24.99 e 2.499% 2.499% 333.33 g 1000.00 g 100.000% 2.875% Tabla 21. Receta para la bebida de chocolate usando HL-AH para sustituir la el aceite.

Componente Pesoíe 1000.00e Porcentaie % Grasa Agua 278.60 g 857.23 g 85.723% HL-AH 17.88 g 55.02g 5.502% 2.641% Polvo de cacao alcalizado 11.38 g 35.02 g 3.502% 0.385% Aislado de proteína de soya 8.12 g 24.98 g 2.498% Maltodextrina 5.00 g 15.38 g 1.538% Sabor, Choc 1.62 g 4.98 g 0.498% Mezcla de gomas 0.81 g 2.49 g 0.249% Fosfato disódico 0.32 g 0.98 g 0.098% Sucralosa 0.13 e 0.40 e 0.040% 325.00 g 1000.00 g 100.000% 3.026% Tabla 22. Receta para una bebida de chocolate usando biomasa de hojuelas para sustituir la leche y el aceite.

Componente Pesoíe) 1000.00e Porcentaie % Grasa Agua 278.60 g 857.23 g 85.723% Hojuela de algas (48% lípido) 17.88 g 55.02g 5.502% 2.641% Polvo de cacao alcalizado 11.38 g 35.02 g 3.502% 0.385% Aislado de proteína de soya 8.12 g 24.98 g 2.498% Maltodextrina 5.00 g 15.38 g 1.538% Sabor, Choc 1.62 g 4.98 g 0.498% Mezcla de gomas 0.81 g 2.49 g 0.249% Fosfato disódico 0.32 g 0.98 g 0.098% Sucralosa 0.13 e 0.40 e 0.040% 325.00 g 1000.00 g 100.00% 3.026% En cada caso el procedimiento de cocción fue: 1) Mezclar los ingredientes secos 2) Adicionar a la olla los húmedos (excepto saborizante). 3) Batir en los ingredientes secos. 4) Cortar con licuadora de mano durante 1 minuto 5) Calentar en la parte superior de la estufa a 200° F. 6) Homogenizar a 2500/500 psi. 7) Enfriar a <40° F y conservar en el refrigerador.

La bebida de chocolate que contiene la HL-AH tuvo una apariencia más espesa, más rica que la bebida de chocolate que contiene las hojuelas de algas, y estaba más cerca en apariencia a la bebida de chocolate convencional. En general, la muestra de HL-AH micronizada se pareció más al control de bebida de chocolate convencional, que confiere una buena viscosidad y con un poco más opacidad que el control de bebida de chocolate convencional.

EJEMPLO 12 Producción de polvo de algas (ricas en lípido) Chlorella protothecoides que contiene alto contenido de lípido cultivada usando los métodos de fermentación y las condiciones descritas en el Ejemplo 4 se procesó en un polvo de algas de alto contenido de lípidos. Para procesar la biomasa de microalgas en polvo de algas, la biomasa de Chlorella protothecoides cosechada se separó del medio de cultivo y se concentró después mediante centrifugación y secó mediante un secador por aspersión de acuerdo con los métodos estándar. El polvo de algas resultante (células de algas completas que se secaron por aspersión en forma de polvo) se envasó y almacenó hasta el uso.

EJEMPLO 13 Producción de harina de algas (rica en lípidos) Chlorella protothecoides que contiene alto contenido de lípido cultivada usando los métodos de fermentación y las condiciones descritas en el Ejemplo 4 se procesó en una harina de algas de alto contenido de lípidos. Para procesar la biomasa de microalgas en harina de algas, la biomasa de Chlorella protothecoides cosechada se separó del medio de cultivo y se concentró mediante centrifugación. La biomasa concentrada resultante, que contiene más de 40% de humedad, se micronizó usando un homogenizador de alta presión ((modelo NS1001 de GEA) que funciona a un nivel de presión de 1000-1200 Bar hasta que el tamaño medio de partícula de la biomasa fue menos que 10 µp?. El homogenizado de algas se secó por aspersión después mediante métodos estándar. La harina de algas resultante (células de algas micronizadas que se secó por aspersión en forma de polvo) se envasó y almacenó hasta su uso.

EJEMPLO 14 Harina de aleas (rica en aceite) que contienen los productos alimenticios Los siguientes ejemplos describen el uso de harina de algas rica en lípido (al menos 20% por peso, típicamente 25-60% de lípido por peso) como un sustituto de grasa en las recetas convencionales. Los ejemplos adicionales muestran también funcionalidad única de la harina de algas en la retención aumentada de humedad y textura mejorada cuando se usa en alimentos preparados tales como los huevos en polvo revueltos. La harina de algas rica en lípido se preparó mediante los métodos descritos en el Ejemplo 13.

Bizcochos de chocolate En un esfuerzo para evaluar las diferencias funcionales y perfil de sabor usando harina de algas rica en lípido, los bizcochos de chocolate preparados con una receta convencional se compararon con bizcochos preparados con harina de algas y un bizcocho convencional reducido en grasa. La harina de algas rica en lípido (aproximadamente el 53% de lípido por peso seco) se usó en lugar de mantequilla y huevos.

Tabla 23. Receta de bizcocho convencional.

Componente Peso(g) 650.00e Porcentaje % Grasa Mantequilla, sin salí 70.00 135.75 20.88 16.71 Polvo de cacao 50.00 39.93 6.14 0.61 Huevo enteros 200.00 159.71 24.57 1.84 Azúcar, granulada 250.00 199.63 30.71 0.00 Harina, todos los propósitos 130.00 103.81 15.97 0.00 Levadura en polvo 4.00 3.19 0.49 0.00 Sal 3.00 2.40 0.37 0.00 Extracto de vainilla 7.00 5.59 0.86 0.00 814.00 650.00 100.00% 19.16% Tabla 24. Receta de bizcocho reducido en grasas.

Componente Peso(g) 650.00e Porcentaje % Grasa Mantequilla, sin sal60.00 57.44 8.84 7.07 Polvo de cacao 50.00 47.86 7.36 0.74 Huevo enteros 100.00 95.73 14.73 1.10 Azúcar, granulada 225.00 215.39 33.14 0.00 Agua 50.00 47.86 7.36 0.00 .

Jarabe de maíz 50.00 47.86 7.36 0.00 Harina, todos los propósitos 130.00 124.45 19.15 0.00 Levadura en polvo 4.00 3.83 0.59 0.00 Sal 3.00 2.87 0.44 0.00 Extracto de vainilla 7.00 6.70 1.03 0.00 679.00 650.00 100.00% 8.91% Tabla 25. Receta de bizcocho con 1 harina de algas.

Componente Pesofe) 600.00e Porcentaje % Grasa Harina de algas 195.00 206.72 34.45 7.30 Polvo de cacao 48.00 50.88 8.48 0.85 Agua 41.00 43.46 7.24 0.00 Azúcar, granulada 140.92 149.39 24.90 0.00 Harina, todos los propósitos 130.40 138.24 23.04 0.00 Levadura en polvo 4.00 • 4.24 0.71 0.00 Sal 1.67 1-.77 0.30 0.00 Extracto de vainilla 5.00 5.30 0.88 0.00 565.99 600.00 100.00% 8.15% En cada caso, el procedimiento de cocción fue: 1. Precalentar el horno a 350 °F. Engrasar y enharinar un molde de 8"x 8". 2. En una cacerola de salsa pequeña, derretir la mantequilla con el polvo de cacao. Dejar enfriar aparte. 3. Batir los huevos junto con la vainilla hasta que este espumoso ligeramente. Poco a poco adicionar azúcar y resto de los ingredientes húmedos. 4. Adicionar la mezcla mantequilla/cacao a la mezcla de huevo. Combinar el resto de los ingredientes secos y adicionar lentamente a la mezcla húmeda hasta que se mezclen. 5. Extender la masa en el molde y hornear durante 20-25 minutos, o hasta que endurezca.

Para los bizcochos con harina de algas, los ingredientes secos se combinaron y la harina de algas se adicionó después a los ingredientes secos. Los ingredientes húmedos (agua y vainilla) se mezclaron después lentamente en los ingredientes secos. Se extendió la masa en el molde y horneó durante 27-28 minutos.

La receta convencional reducida en grasa produjo un bizcocho que tuvo una textura seca y fue más parecida a la torta que una textura de bizcocho. Los bizcochos preparados con harina de algas (que tuvieron por ciento similar de grasa como los bizcochos de receta reducida en grasa, aproximadamente 8% de grasa) fueron muy húmedos y tuvieron una textura de bizcocho, pero tuvieron una estructura de la miga más frágil cuando se comparó con la receta de bizcocho convencional (aproximadamente 19 % de grasa). Cuando se comparó con los bizcochos preparados con hojuelas de algas que se describieron en el Ejemplo 11, los bizcochos preparados con harina de algas no fueron tan densos, tuvieron una estructura de la miga más suave. En general, la harina de algas fue un sustituto eficaz para la mantequilla y los huevos en una receta buena al horno, y produjo un producto similar en textura, sabor y apariencia al producto de la receta convencional. La harina de algas presenta funcionalidad única (por ejemplo, estructura de la miga más fina, no como de goma, y textura suave) no vista con el uso de las hojuelas de algas.

Mayonesa Para evaluar la capacidad emulsionante de la harina de algas, la mayonesa preparada con harina de algas que se reconstituyó en agua (40% en p/v) y homogenizó a baja presión (100-200 bar) para producir una suspensión se comparó con mayonesa preparada con una receta convencional y una mayonesa reducida en grasa. La suspensión de harina de algas se preparó con harina de algas rica en lípido que tiene aproximadamente 53% de lípido por peso seco y sustituyó por completo el aceite y yemas de huevo en las recetas convencionales.

Tabla 26. Receta de mayonesa convencional.

Componente Peso(g) 1000.00e Porcentaje % Grasa Aceite, soya 344.00 573.33 57.33 57.33 Yema de huevo líquida 60.00 100.00 10.00 2.65 Vinagre, destilado 47.50 79.17 7.92 0.00 Azúcar, granulada 12.00 20.00 2.00 0.00 Sal 1 1.00 18.33 1.83 0.00 Concentrado de jugo de limó 1.25 2.08 0.21 0.00 Goma xantana 1.20 2.00 0.20 0.00 Polvo gárlico 0.50 0.83 0.08 0.00 Polvo de cebolla 0.75 1.25 0.13 0.00 Agua 121.80 203.00 20.30 0.00 600.00 1000.00 100.00% 59.98% Tabla 27. Receta de mayonesa convencional reducida en grasa.

Componente Pesoíe) lOOO.OOe Porcentaie % Grasa Aceite, soya 152.00 253.33 25.33 25.33 Yema de huevo líquida 15.00 25.00 2.50 0.66 Vinagre, destilado 47.50 79.07 7.91 0.00 Almidón aliment. instant. 15.00 24.97 2.50 0.00 Azúcar, granulada 15.50 25.80 2.58 0.00 Sal 11.00 18.31 1.83 0.00 Concent, de jugo de limón 1.25 2.08 0.21 0.00 Acido fosfórico 5.70 9.49 . 0.95 0.00 Goma xantana 1.80 3.00 0.30 0.00 Polvo gárlico 0.50 0.83 0.08 0.00 Pol vo de cebolla 0.75 1.25 0.13 0.00 Aeua 333.00 555.00 55.50 0.00 600.00 1000.00 100.00% 26.00% Tabla 28. Receta para mayonesa hecha con una suspensión de harina de algas.

Componente Pesoíe) lOOO.OOe Porcentaie % Grasí Harina de algas, suspensión 344.00 499.38 49.94 26.47 Yema de huevo líquida 0.00 0.00 0.00 0.00 Vinagre, destilado 47.50 79.07 7.91 0.00 Almidón aliment. instant. 15.00 24.97 2.50 0.00 Azúcar, granulada 15.50 25.80 2.58 0.00 Sal 11.00 18.31 1.83 0.00 Concent, de jugo de limón 1.25 2.08 0.21 0.00 Acido fosfórico 5.70 9.49 0.95 0.00 Goma xantana 1.80 3.00 0.30 0.00 Polvo gárlico 1.50 2.50 0.25 0.00 Polvo de cebolla 1.50 2.50 0.25 0.00 Agua 200.00 332.92 33.29 0.00 600.75 1000.00 100.00% 26.47% En cada caso, el procedimiento fue: 1. Usando un procesador de alimentos, combinar los ácidos, agua e ingredientes secos. 2. Adicionar las yemas de huevo y lentamente chorrear con aceite o suspensión de harina de algas. Una emulsión compacta se debería formar. Si la emulsión es muy compacta, adicionar agua adicional hasta que la emulsión alcance la consistencia deseada. 3. Raspar los lados hacia abajo y cortar de nuevo durante 10 segundos para incorporar cualquier gota de aceite/suspensión.

La mayonesa preparada con la suspensión de harina de algas tuvo la viscosidad entre la mayonesa convencional y la reducida en grasa. La sensación bucal de la mayonesa con la suspensión de harina de algas fue comparable a la mayonesa convencional (pero contiene menos que 50% de grasa total). El almidón alimenticio instantáneo se necesitó tanto en la mayonesa reducida en grasa como la mayonesa con suspensión de harina de algas para retener más agua y endurecer el producto para ser más "untable". En general, usando la suspensión de harina de algas para sustituir todas las fuentes de grasa (por ejemplo, aceite y yemas de huevo) en una receta convencional de mayonesa produjo una mayonesa con buena viscosidad y una sensación bucal que fue indistinguible de la mayonesa convencional. La suspensión de harina de algas funcionó como un emulsionante eficaz, sustituyendo con éxito la funcionalidad encontrada del aceite y las yemas de huevo en la mayonesa convencional.

En una aplicación adicional, la suspensión de harina de algas rica en lípido se usó para preparar una salsa/aderezo de inmersión de mostaza miel reducida en grasa. La miel, mostaza, vinagre blanco, sabor de jugo de limón y sal de mar se adicionaron a la mayonesa preparada (ligeramente modificada para lograr la consistencia apropiada de una salsa/aderezo de inmersión) descrita anteriormente. Todos los ingredientes se combinaron y mezclaron en un procesador de alimentos hasta que estén homogéneos y suaves. El producto terminado contenía aproximadamente 14% de harina de algas por peso, y tuvo aproximadamente 8% de grasa total. La salsa/aderezo de inmersión de mostaza miel que contiene harina de algas tuvo una sensación bucal cremosa comparable con una salsa de inmersión de mostaza miel convencional (grasa total).

Aderezo Miso de Ensalada Para evaluar la harina de algas en una aplicación de aderezo cremoso de ensaladas, el aderezo miso de ensalada se preparó usando una receta convencional y una receta que contiene harina de algas rica en lípido reconstituida como una suspensión (40% de sólidos), producido mediante métodos como se describió en la formulación de mayonesa anterior.

Tabla 29. Receta para el aderezo miso de ensalada convencional.

Componente Peso(g) Porcentaje (en peso Fase oleosa: Aceite de cañóla 294.00 98.00 Aceite de sésamo 6.00 2.00 300.00 100% Fase acuosa: Vinagre, vino de arrozarroz 143.50 20.50 Pasta de miso, roja 166.25 23.70 Azúcar, granulada 78.75 11.250 Polvo gárlico 3.5 0.50 Harina de mostaza 5.25 0.75 Polvo dejenjibre 5.25 0.75 Goma xantana 1.50 0.214 Sorbato potásico 0.88 0.125 Calcio EDTA disódico 0.18 0.025 Agua 294.95 42.136 700.00 100.00% Tabla 30. Receta para aderezo miso de ensalada hecho con una suspensión de harina de algas.

Componente \ Peso(g) Porcentaje (en peso) Fase oleosa: Aceite de cañóla 94.0 94.00 Aceite de sésamo 6.00 6.00 100.00 100% Fase acuosa: Harina de algas, suspensión 125.00 13.889 Vinagre, vino de arrozarroz 80.00 8.889 Vinagre, destilado 60.00 6.667 Pasta de miso, roja 225.00 25.00 Azúcar, granulada 85.00 9.444 Polvo gárlico 3.5 0.389 Harina de mostaza 5.25 0.583 Polvo dejenjibre 5.25 0.583 Goma xantana 2.70 0.300 Sorbato potásico 0.88 0.097 calcio EDTA disódico 0.18 0.019 Dióxido de titanio 4.20 0.467 Agua 300.00 33.344 900.00 100.00% En cada caso, los ingredientes secos se mezclaron juntos dejando aparte. El agua, vinagre y el ácido se mezclaron juntos y dejaron aparte. La pasta de miso se midió por separado. Para la receta convencional, los aceites se combinaron juntos y dejaron aparte Para la receta que contiene harina de algas, la suspensión de harina de algas, aceite, y dióxido de titanio se pesó afuera por separado y combinó. La mezcla de agua/vinagre se mezcló después con una licuadora de alto corte. Después de mezclar, los ingredientes secos se adicionaron en la mezcla de agua/vinagre. La mezcla de aceites se chorreó después lentamente mientras que se mezclaron el agua/vinagre y los ingredientes secos con una licuadora de alto corte. El aderezo se calentó después a 190 °F durante 2 minutos y el aderezo se pasó después por un molino coloidal en el ajuste más compacto. El aderezo terminado se embotelló después y refrigeró hasta el uso.

Tanto las recetas que contienen la harina convencional como de algas produjeron un aderezo de ensalada cremoso espeso y opaco. Visualmente, los dos aderezos fueron comparables en color y textura. El aderezo miso de ensalada preparado con la receta convencional contenía aproximadamente 30% de grasa, mientras que el aderezo miso de ensalada preparada con la suspensión de harina de algas contenía aproximadamente 12.65% de grasa. En general, el aderezo miso preparado con la suspensión de harina de algas contenía menos que la mitad de la grasa del aderezo miso preparado con la receta convencional, mientras que conserva la sensación bucal cremosa y opacidad.

Masa de pizza/palitos de pan La capacidad de la harina de algas para funcionar en una aplicación de masa de levadura se probó usando una receta de masa de pizza convencional/palitos de pan y una receta de masa de pizza/palito de pan que contiene 5% ó 10% por peso de harina de algas. La masa de pizza/palitos de pan que contiene harina de algas se preparó con la suspensión de harina de algas rica en lípido (40% de sólidos), producida mediante los métodos como se describió en la formulación de mayonesa anterior.

En cada caso, 7.3 gramos de levadura se combinó con 9.3 gramos de harina para todos los propósitos y se mezcló con 58 gramos de agua caliente. La mezcla de levadura se dejó reposar a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos. En las muestras que contienen la suspensión de harina de algas, la suspensión se mezcló con 167 gramos de agua y combinó con 217 gramos de harina para todos los propósitos y 4.9 gramos de sal en una batidora. En la receta convencional, el agua se combinó sólo con la harina y la sal en la batidora. Después de que se combina, la mezcla de levadura se adicionó a la masa y se adicionaron unos 90 gramos adicionales de harina para todos los propósitos. La masa se amasó después a mano, adicionando harina adicional según sea necesario si la masa estaba muy mojada. La masa se cubrió y dejó crecer durante 1 hora en un lugar caliente. Después de dejar crecer, la masa se repartió y se le pasó rodillo como masa de pizza o se formó en palitos de pan. La masa se horneó después en un horno a 450 0 F durante 8-12 minutos o hasta hechos.

La masa de pizza y palitos de pan de receta convencional fueron masticables con una corteza tradicional. La masa de pizza que contiene 5% de suspensión de harina de algas tuvo una textura más parecida a la galleta y fue más crujiente que la masa de pizza de la receta convencional. La masa de pizza que contiene 10% de suspensión de harina de algas fue más crujiente que la masa de pizza que contiene 5% de suspensión de harina de algas. En los palitos de pan preparados con suspensión de harina de algas, los palitos de pan del 5% de algas tuvieron un centro húmedo, masticable, cuando se compararon con la receta convencional de palitos de pan. Los palitos de pan que contienen 10% de suspensión de harina de algas fueron todavía más húmedos que los palitos de pan del 5% de algas. El tiempo al horno se aumentó con ambos palitos de pan que contienen harina de algas. Una vez más, hubo sabor mínimo de algas en los palitos de pan que contienen suspensión de harina de algas, lo que no interfirió con el sabor en general. En general, la suspensión de harina de algas aumentó la encrespadura de la masa de pizza y le dio una textura más parecida a la galleta, y aumentó la esponjosidad de los palitos de pan, cuando se compararon con los palitos de pan de la receta convencional. En otra aplicación, la suspensión de harina de algas rica en lípido (40% de sólidos) se usó en una receta de tortilla de maíz y se comparó con tortillas de maíz preparadas de una receta convencional. Al igual que los resultados de la masa de pizza, las tortillas de maíz que contienen la suspensión de harina de algas fueron más parecidas a la galleta en textura y más crujiente que las tortillas de receta convencional.

Galleta con trozos de chocolate de horneado ligero La capacidad de la harina de algas para funcionar en una aplicación de galleta se probó usando una receta convencional de galleta con trozos de chocolates de horneado ligero, una receta de galleta reducida en grasa con trozos de chocolate de horneado ligero y una galleta con trozos de chocolate preparada con suspensión de harina de algas rica en lípido (producida usando los mismos métodos como se describieron en la formulación de mayonesa anterior). La suspensión de harina de algas sustituyó también toda la mantequilla y huevos, tanto en la receta de galleta convencional como reducida en grasa.

Tabla 31. Receta para galletas con trozos de chocolate de horneado ligero convencional.

Componente Peso (z) Porcentaie % Grasa Harina, todos los propósitos 2 tazas 284.00 24.88 0.00 Bicarbonato de sodio ½ cdta 2.50 0.22 0.00 Levadura en polvo ½ cdta 1.23 0.1 1 0.00 Sal ½ cdta 3.35 0.29 0.00 Azúcar marrón claro 1 taza 239.00 20.94 0.00 Mantequilla sin sal, derretida 1 ½ barras 170.25 14.92 11.93 Jarabe de maíz ¼ taza 82.00 7.18 0.00 Huevo, entero 2 100.00 8.76 0.66 Extracto de vainilla 1 cdta 4.00 0.35 0.00 Trozos chocolate semi-dule 1 ½ tazas 255.00 22.34 6.37 1 141.33 100.00% 18.96% Tabla 32. Receta para galletas con trozos de chocolate de horneado ligero.

Componente Peso (e) Porcentaie % Grasa Harina, todos los propósito 2 ½ tazas 355.00 33.58 0.00 Bicarbonato de sodio ½ cda 2.50 0.24 · 0.00 Levadura en polvo ½ cdta 1.23 0.12 0.00 Sal ½ cdta 3.35 0.32 0.00 Azúcar marrón claro 1 taza 239.00 22.61 0.00 Mantequilla sin sal, derretida ½ barra 40.00 3.78 3.03 Jarabe de maíz ¼ taza 82.00 7.76 0.00 Huevo, entero 1 50.00 4.73 0.35 Clara de huevo 1 25.00 2.37 0.00 Extracto de vainilla 1 cdta 4.00 0.38 0.00 Trozos chocolate semi-dulce 1 ½ tazas 255.00 24.12 6.88 1057.08 100.00% 10.26% Tabla 33. Receta para galletas con trozos de chocolate de horneado ligero con une suspensión de harina de algas.

Componente Peso (z) Porcentaie % Grasa Harina, todos los propósitos 2 Vi tazas 355.00 31.08 0.00 Bicarbonato de sodio ½ cda 2.50 0.22 0.00 Levadura en polvo . ¼ cda 1.23 0.11 0.00 Sal ½ cdta 3.35 0.29 0.00 Azúcar marrón claro 1 taza 239.00 20.93 0.00 Suspensión de harina de algas 200.00 17.51 3.71 Jarabe de maíz ¼ taza 82.00 7.18 0.00 Extracto de vainilla 1 cdta 4.00 0.35 0.00 Trozos chocolate semi-dulce 1 ½ tazas 255.00 22.33 6.36 1142.08 100.00% 10.08% En cada caso, el procedimiento fue: 1. Precalentar el horno a 350 °F. En un bol, combinar la harina, bicarbonato de sodio, polvo de hornear y sal. Dejar aparte. 2. Batir la mantequilla/suspensión de harina de algas con azúcar y jarabe de maíz hasta que esté suave. Batir en huevo (si procede) y vainilla. 3. Adicionar poco a poco en los ingredientes secos y mezclar hasta que se forme justo una masa. Doblar los trozos de chocolate. 4. Tomar cucharadas de la masa, dejar caer encima de bandeja de galletas o rollo en bolas y colocar sobre una bandeja para galletas. 5. Hornear durante 16-18 minutos o hasta que estén doradas, gire la bandeja de galleta a mitad del horneado.

La galleta dé la receta convencional tuvo buena extensión durante el horneado y fue suave y esponjosa fuera del horno. En la galleta reducida en grasa, la masa no se extendió en el primer lote, pero en los lotes posteriores, la masa se aplastó antes de hornear. La galleta reducida en grasa fue suave fuera del horno, y endureció en una galleta densa al enfriarse. La galleta reducida en grasa tuvo pronunciado también el sabor inicial de jarabe de maíz. La galleta de harina de algas tuvo extensión parecida durante el horneado como la galleta de la receta convencional y fue en textura mejor que la galleta reducida en grasa. Después de tres días a temperatura ambiente, la galleta de harina de algas fue más húmeda que ambas galletas, la de receta convencional y la reducida en. grasa. En general, en una aplicación de galleta la suspensión de la biomasa de algas fue eficaz como un sustituto de la mantequilla y huevos. Funcionalmente, la suspensión de la biomasa de algas extendió la durabilidad de la galleta, en la que la galleta retuvo más humedad después de tres días en temperatura ambiente.

Estudio de durabilidad de la galleta sin gluten de harina de avena con pasas Con los resultados de durabilidad extendido de los experimentos anteriores con galletas de trozos de chocolate, una galleta sin gluten de harina de avena con pasas se preparó usando harina de algas rica en lípido (aproximadamente 53% de lípido por peso seco), producida mediante los métodos descritos en el Ejemplo 13. Las galletas se hornearon y mantuvieron después a temperatura ambiente durante siete días. Las pruebas sensoriales iniciales y de actividad de agua se realizaron en las galletas inmediatamente después del horneado y enfriamiento. Las pruebas sensoriales adicionales y pruebas de actividad de agua se realizaron el día 1, 3 y 7. En cada día de prueba, una galleta se cortó en pedazos pequeños de esta manera las pasas y la avena se distribuyeron uniformemente en la muestra. Al menos dos muestras por galleta se analizaron en la prueba de actividad de agua para garantizar la exactitud de la medición. Las pruebas de actividad de agua (Aw, por sus siglas en inglés) se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante usando un instrumento Aqua Lab, Modelo Series 3 TE (Decagon Devices, Inc.). En resumen, la actividad de agua mide la presión de vapor de agua que cuantifíca el agua disponible, unida no químicamente a un producto, mientras más alto el valor Aw, el producto es más húmedo. En esta aplicación de galleta, el valor Aw más alto correlaciona con una mayor durabilidad. Un nivel de Aw de 0.65 fue el objetivo deseado.

Tabla 34. Receta para galleta sin gluten de harina de avena con pasas hecha con una suspensión de harina de algas.

Componente Peso(g) lOOO.OOg Porcentaje Harina sin gluten 225.00 174.69 17.47 Harina de arroz integral 25.00 19.41 1.94 Bicarbonato de sodio 4.00 3.11 0.31 Levadura en polvo 2.00 1.55 0.16 Sal 3.50 2.72 0.27 Canela molida 1.30 1.01 0.10 Nuez moscada molida 1.20 0.93 0.09 Goma xantana 2.50 1.94 0.19 Agua, filtrada 215.00 166.93 16.69 Harina de algas 110.00 85.40 8.54 Azúcar marrón claro 270.00 209.63 20.96 Azúcar, granulada 45.00 34.94 3.49 Extracto de vainilla 8.50 6.60 0.66 Pasas 125.00 97.05 9.70 Avena enrollada 250.00 194.10 \9A\ 600.75 1000.00 100.00% El procedimiento fue: 1. Precalentar el horno a 375 °F. 2. Mezclar los ingredientes secos juntos excepto para la avena y la harina de algas. Hidratar la avena en ¼ de agua. Hidratar la harina de algas en ¾ de agua y mezclar bien usando una licuadora de mano. Dejar hidratar durante 10 minutos la avena y harina de algas. 3. Adicionar la harina de algas hidratada a los ingredientes secos mezcle bien. Adicionar la vainilla y mezclar bien hasta que esté mezclado y suave. 4. Adicionar la avena y las pasas y mezclar justo hasta que esté homogéneo. 5. Repartir las galletas en una bandeja de galleta y presionar ligeramente hacia abajo cada una. 6. Hornear las galletas en el horno durante 20 minutos, girando la bandeja de la galleta a la mitad del horneado.

Los resultados de las pruebas sensoriales y la actividad de agua se resumen a continuación en la Tabla 35. Las muestras para la prueba sensorial se evaluaron en una escala de 10 puntos: 1-2 = inaceptable, 3-4 = pobre, 5-6 = justo; 7-8 = bueno; y 9-10 = excelente. En general, las galletas preparadas con harina de algas mantuvieron un buen nivel de humedad cuando se mantienen a temperatura ambiente durante siete días, con poco deterioro del sabor y textura.

Tabla 35. Resultados de las puntuaciones sensoriales y actividad de agua para las galletas de harina de avena con pasas a temperatura ambiente.

Puntuación Comentarios sensoriales Aw Otros Sensorial Inicial 8 Interior húmedo, textura 0.776 Aw más alto que el objetivo crujiente, sabor bueno harina deseado de 0.65. de avena con pasas con toque mínimo de la biomasa de algas.

La estructura de la galleta se desarrolló con superficie ligera Día 1 7.5 Húmedo, suave, exterior no 0.717 Aw continúa siendo más alto que crujiente, ligeramente el objetivo deseado 0.65. masticable, no tan sólida como el inicio. Un poco menos sabor a mantequilla, pero el sabor es todavía bueno con un mínimo de toque de la biomasa de algas Día 3 7 Muy húmeda y masticable, 0.735 Aw continúa siendo más alto que todavía tiene el sabor típico de el objetivo deseado 0.65. harina de avena con pasas con un mínimo de toque de la biomasa de algas. No crujiente Día 7 7.5 Un poco más seco, no 0.719 Aw continúa siendo más alto que "crujiente fresco al horno"; el objetivo deseado 0.65. galleta ligeramente más seca en el interior, más masticable, sabor dulce de harina de avena, la humedad es todavía por todo el producto. Producto todavía muy bueno.

Huevos revueltos (de huevos en polvo) La capacidad de la harina de algas para retener la humedad y ofrecer mejoras en la textura se probó en una aplicación de huevos en polvo reconstituidos. Los huevos en polvo se prepararon usando una receta convencional, y con niveles diversos (5%, 10% y 20%) de harina de algas rica en lípido como un sustituto para el por ciento correspondiente (p/p) de huevos en polvo. La harina de algas usada en las formulaciones a continuación se preparó mediante los métodos descritos en el Ejemplo 13 y contenía aproximadamente 53% de lípido por peso seco.

Tabla 36. Receta convencional paira huevos revueltos a partir de huevo en polvo.

Componente Pesofg) 200.00g Porcentaje % Grasa Huevo en polvo, entero 25.00 49.83 24.91 9.77 Sal 0.25 0.50 0.25 0.00 Pimienta negra, molida 0.10 0.20 0.10 0.00 Agua 75.00 149.48 74.74 0.00 100.35 200.00 100.00% 9.77% Tabla 37. Receta para huevos revueltos a partir de huevo en polvo con 5% de harir de algas.

Componente Pesofg) 200.00g Porcentaje % Grasa Huevo en polvo, entero 23.75 47.33 23.67 9.28 Harina de algas 1.25 2.49 1.25 0.66 Sal ¦ 0.25 0.50 0.25 0.00 Pimienta negra, molida 0.10 0.20 0.10 0.00 Agua 75.00 149.48 74.74 0.00 100.35 . 200.00 100.00% 9.94% Tabla 38. Receta para huevos revueltos a partir de huevo en polvo con 10% de harina de algas.

Componente Peso(g) 200.00g Porcentaje % Grasa Huevo en polvo, entero 22.50 44.84 22.42 8.79 Harina de algas 2.50 4.98 2.49 1.32 Sal 0.25 0.50 0.25 0.00 Pimienta negra, molida 0.10 0.20 0.10 0.00 Agua 75.00 149.48 74.74 0.00 100.35 200.00 100.00% 10.11% Tabla 39. Receta para huevos revueltos a partir de huevo en polvo con 20% de harir de algas.

Componente Pesoíe) 200.00g Porcentaje % Grasa Huevo en polvo, entero 20.00 39.86 19.93 7.81 Harina de algas 5.00 9.97 4.98 2.64 Sal 0.25 0.50 0.25 0.00 Pimienta negra, molida 0.10 0.20 0.10 0.00 Agua 75.00 149.48 74.74 0.00 100.35 200.00 100.00% 10.45% En todos los casos, los huevos se prepararon como sigue: 1. Mezclar la harina de algas (si procede) con los huevos en polvo. Mezclar los huevos con agua. Batir hasta que esté suave. Si es necesario, use la licuadora de mano para cortar cualquier aglomeración. 2. En una sartén precalentada, antiadherente, verter la mezcla de huevo. 3. Cocinar la mezcla de huevo hasta que endurezca y condimentar si desea.

Todas las preparaciones fueron similares en color y no se observaron diferencias apreciables de color entre los huevos de la receta convencional y los huevos que contienen harina de algas. Los huevos de la receta convencional estaban secos, demasiados aireados, esponjosos en la textura y le faltaba una sensación bucal cremosa. Los huevos preparados con 5% de la biomasa de algas fueron más húmedos y fue más firme en la textura que los huevos de la receta convencional. La sensación bucal fue más cremosa que los huevos de la receta convencional. Los huevos preparados con 10% de harina de algas fueron todavía más húmedos que los huevos de la receta convencional y tuvieron la textura y sensación bucal de los huevos revueltos preparados de huevos frescos. Los huevos preparados con 20% de harina de algas fueron también húmedos y tuvieron la textura de los huevos crudos, poco hechos. En general, la inclusión de harina de algas mejoró la sensación bucal, textura y humedad de los huevos en polvo preparados en comparación con los huevos en polvo preparados de forma convencional. En 5% y 10%, la harina de algas funcionó bien en la aplicación de huevo sin aumentar significativamente el contenido de grasa. En 20%, la harina de algas confirió también mucha humedad, lo que hace inaceptable la textura de los huevos en polvo preparados.

Prueba de almacenamiento de los huevos en polvo Debido a que la harina de algas fue capaz de adicionar humedad significativa y mejorar la textura de los huevos en polvo, la siguiente prueba de almacenamiento se realizó para evaluar cómo se podrían realizar los huevos cocidos cuando se almacenan en una tabla de vapor. Los huevos revueltos preparados con una receta convencional usando huevos en polvo, 5% de harina de algas y 10% de harina de algas (todas preparadas mediante los métodos descritos anteriormente) se hidrataron 10-15 minutos antes para que se cocinen en la parte arriba de la estufa. Después de la cocción, las muestras se trasladaron de inmediato a una mesa calentada a vapor, donde permanecieron cubiertos durante 30 minutos a una temperatura entre 160-200 °F. Cada 10 minutos, muestras frescas se prepararon para comparar contra las muestras almacenadas. Las muestras se evaluaron en una escala de 10 puntos: 1-2 = inaceptable, 3-4 = pobre, 5-6 = justo; 7-8 = bueno; y 9-10 = excelente. Los resultados de la prueba se resumen a continuación en la Tabla 40.

Tabla 40. Resultados sensoriales de la prueba de almacenamiento de los huevos en polvo Tiempo de almacenamiento variable Inicial 10 minutos 20 minutos 30 minutos Receta 6: elástico en la 5: ligeramente más 4: más seco, más 3: amarillo brillante en el convencional textura y seco/resistente, pero resistente; textura color, bordes duros, resistencia; pero todavía aceptable masticable secos, resistente y similar al huevo elástico; inaceptable 5% de 8: húmedo, 7: un poco más 6: más seco que 5: no como de color harina de blando resistente que la muestra inicial del 5% amarillo con matiz algas muestra inicial de de harina de algas, ligeramente opaco, seco y 5% de harina de pero todavía más resistente, pero todavía algas, pero todavía húmedo que la mejor que la receta aceptable muestra inicial de la convencional después de receta convencional 30 minutos (sin bordes duros) 10 % de 7: ligeramente 8: húmedo, blando, 7: ligeramente 6.5: Seco y ligeramente harina de también no resistente resistente, pero más resistente que la algas húmedo/húmedo; todavía húmedos en el muestra inicial, pero blando interior. Más húmedo todavía más húmedo que que la muestra de la la muestra convencional y receta convencional la muestra de 5% de inicial , pero más seco harina de algas después que la muestra inicial de 30 minutos, sin bordes de 10% de harina de secos, el interior es algas todavía húmedo Egg Beaters La capacidad de la harina de algas para mejorar la textura y sensación bucal de las claras de huevos revueltos se probó usando Egg Beaters®. 100 gramos de Egg Beaters® se revolvió usando una pequeña sartén antiadherente durante aproximadamente 1-2 minutos hasta que los huevos se endurecieron. No se usaron mantequilla ni condimentos Una muestra con sustitución 10% p/p de la suspensión de harina de algas rica en lípido (preparada mediante los métodos descritos anteriormente en la aplicación de mayonesa con harina de algas que contiene aproximadamente 53% de lípido por peso seco). Egg Beaters ® con la harina de algas se preparó de una manera idéntica al control.

La muestra control tuvo una consistencia más acuosa y se disolvió en la boca más parecido al agua, con relativamente poca o ninguna textura. Egg Beaters ® con la harina de algas se preparó de una manera idéntica al control. La muestra que contiene 10% de suspensión de harina de algas cocinó más parecido a los huevos revueltos con huevos frescos. En general, la adición de la suspensión de harina de algas fue muy exitosa en la mejora de la textura y sensación bucal de las claras de huevo revuelto, que hace el sabor de las claras de huevo más parecido a los huevos revueltos preparados con huevos frescos enteros.

Huevos Líquidos Enteros La capacidad de la harina de algas para mejorar la textura y humedad de los huevos revueltos usando huevos líquidos enteros fue probada en un estudio de almacenamiento y mediante un panel sensorial. El huevo líquido entero se preparó de acuerdo con las indicaciones del fabricante como un control y se comparó con el huevo líquido entero preparado con 10% de suspensión de harina de algas (2.5% de harina de algas con un 7.5% de agua). Tanto los huevos control como los de 10% de harina de algas se cocinaron como los huevos revueltos y almacenaron en una mesa calentada a vapor durante 60 minutos en total. Las muestras de cada producto de huevos revueltos se tomaron y probaron en un panel sensorial cada 10 minutos. El panel sensorial consideró el aspecto general, nivel de humedad, textura y sabor del producto de huevo revuelto en una escala de 1 a 9, con 1 siendo inaceptable, 3 siendo moderadamente inaceptable, ,5 siendo justo, 7 siendo aceptable y 9 siendo excelente.

En general, la adición de 10% de suspensión de harina de algas (2.5% de sólidos de harina de algas) mejoró la textura, nivel de humedad y sensación bucal de los huevos preparados. Después de 60 minutos en la mesa calentada a vapor, el producto de huevo revuelto con 10% de suspensión de harina de algas fue todavía aceptable (5 en la escala sensorial) en comparación con el control de huevos revueltos, que estaba en el intervalo inaceptable a moderadamente inaceptable (2.7 en la escala sensorial). Los resultados de todos los intervalos de tiempos se resumen en la Figura 3.

Panqueques con huevos en polvo Las mezclas de panqueques/galleta que se encuentran en las tiendas minoristas contienen como un ingrediente huevos enteros en polvo. Como se muestra anteriormente en la formulación de huevos en polvo, la adición de harina de algas rica en lípido mejoró la textura y sensación bucal del producto de huevo preparado. La capacidad de la harina de algas rica en lípido se probó para mejorar la textura y sensación bucal de panqueques preparados con mezclas de panqueques mezcla lista.

Tabla 41. Receta para los panqueques control.

Componente Peso(e) Porcentaje Huevo en polvo entero 10.1 4.6 Sólidos lácteos no grasos 10.9 5 Harina trigo todos los propósitos 65.5 29.8 Aceite de cañóla 7.3 3.3 Levadura en polvo 3.6 1.6 Sal 0.9 0.41 Azúcar 1.8 0.82 Aeua 120 54.5 Total 220.1 Tabla 42. Receta para panqueques que contienen harina de algas de alto contenido en lípidos.

Componente Peso(g Porcentaje Huevo en polvo entero 5.05 2.3 Harina de algas 5.05 2.3 Sólidos lácteos no grasos 10.9 5 Harina trigo todos propósitos 65.5 . 29.8 Aceite de cañóla 7.3 3.3 Levadura en polvo 3.6 1.6 Sal 0.9 0.41 Azúcar 1.8 0.82 Agua 120 54JL Total 220.1 En ambos casos, el agua se usó para rehidratar los huevos en polvo, harina de algas, y sólidos lácteos no grasos. El resto de los ingredientes se adicionaron después y batieron hasta que la masa fue suave. La masa se vertió en un sartén antiadherente caliente sin grasa en porciones del tamaño de panqueque. Los panqueques se cocinaron hasta que las burbujas en la tapa estallaron y se voltearon después y cocinaron hasta que estén hechos.

Ambas masas fueron similares en apariencia y ambos panqueques tomaron aproximadamente la misma cantidad de tiempo para cocinar. Los panqueques que contienen harina de algas fueron más ligeros, más cremosos y esponjosos en textura y fueron menos elásticos que los panqueques de control. En general, la sustitución de 50% por peso de los huevos enteros en polvo con harina de algas produjo un panqueque con textura mejor con una mejor sensación bucal.

Leche de algas/ postre congelado Una formulación adicional para leche de algas se produjo usando harina de algas rica en lípido. La leche de algas contenía los siguientes ingredientes (por peso): 88.4% de agua, 6.0% de harina, 3.0% de concentrado de proteína de suero, el 1.7% de azúcar, 0.6% de extracto de vainilla, 0.2% de sal y 0.1% de estabilizantes. Los ingredientes se combinaron y homogenizaron a baja presión usando un homogenizador de mano. La leche resultante de algas se enfrió antes de servir. La sensación bucal fue comparable con aquella de la leche entera y tuvo buena opacidad. La harina de algas usada contenía aproximadamente 50% de lípidos, de manera que la leche resultante de algas contenía aproximadamente 3% de grasa. Cuando se comparó con la leche de soya con sabor a vainilla (Silk), la leche de algas tuvo una sensación bucal y opacidad comparable y careció del sabor a frijol de la leche de soya.

La leche de algas se combinó después con azúcar adicional y extracto de vainilla y mezcló durante 2-4 minutos en una licuadora hasta que esté homogénea. La mezcla se colocó en una máquina de pre-enfriado para hacer helados (Cuisinart) durante 1-2 horas hasta que se alcanzó la consistencia deseada. Un helado de receta convencional preparado con 325 gramos de mitad y mitad, 220 gramos de 2% de leche y 1 yema de huevo se preparó como una comparación. El helado de la receta convencional tuvo la consistencia suave comparable a aquella del helado servido, y fue un helado de degustación rica, textura suave. Aunque el helado preparado de leche de algas careció de cremosidad y sensación bucal en general del helado de receta convencional, la consistencia y sensación bucal fue comparable con una leche helada de rica degustación. En general, el uso de leche de algas en una aplicación de postre congelado fue un éxito: el postre congelado de leche de algas producido fue una alternativa a un helado convencional inferior en grasa.

EJEMPLO 15 Aceite de aleas Extracción por solventes del aceite de la biomasa El aceite de algas se extrae de la biomasa de microalgas preparado como se describió en los ejemplos 1-4 por secado de la biomasa mediante métodos descritos en este documento, ruptura de la biomasa mediante métodos descritos en este documento, y contacto de la biomasa rota con un solvente orgánico, por ejemplo, hexano, durante un período de tiempo suficiente para permitir al aceite formar una solución con el hexano. La solución se filtra después y el hexano se elimina por rotoevaporación para recuperar el aceite extraído.

Extracción sin solventes del aceite de la biomasa El aceite de algas se extrae de la biomasa de microalgas preparadas como se describió en los ejemplos 1-4, secando la biomasa, y rompiendo físicamente la biomasa en una prensa de semillas oleaginosas, donde el aceite de algas queda liberado de la biomasa. El aceite, se recupera después, de este modo se separa de la biomasa rota.

Diversidad de las cadenas de lípido en las especies de algas Las muestras de lípido de un subconjunto de cepas cultivadas en el Ejemplo 1 se analizaron para el perfil lipídico mediante HPLC. Los resultados se muestran en la Figura 1.

EJEMPLO 16 Nutracéuticos y productos alimenticios que condene aceite de aleas Cápsulas de aceite de algas (aceite encapsulado que se extrajeron de las algas (a) a través de extracción con solvente o (b) a través de la extracción sin solvente-) El sistema-aceite de algas de protección completa proporciona tocotrienoles tocoferoles, carotenoides, Omega 3 y esteróles de origen natural. Ofrece una alternativa no animal basada en plantas para el uso de aceite de pescado.

Tabla 43. Ingredientes de la composición nutracéutica ilustrativa.

Aceite de algas (aceite que se extrae de las algas por extracción con solvente o por extracción sin solvente) Tabla 44. Ingredientes de la composición nutracéutica ilustrativa.

Bizcochos y tortas de vainilla que contienen aceite de algas El aceite extraído de Chlorella protothecoides (UTEX 250) cultivadas mediante los métodos de fermentación descritos en el Ejemplo 4 se usó en las aplicaciones de productos horneados. La torta amarilla (Moist Deluxe, Duncari Hiñes) y los bizcochos (Chocolate Chunk, Pillsbury) se produjeron usando 1/3 taza de aceite extraído de Chlorella protothecoides de acuerdo con las instrucciones sugeridas por el fabricante. El aceite extraído de Chlorella protothecoides (UTEX 250) cultivadas mediante los métodos de fermentación descritos en el ejemplo 4 se usó en las aplicaciones de productos horneados. EJEMPLO 17 Producción de biomasa de alea de alto contenido proteico Cultivo heterotrofíco de microalgas con alto contenido proteico Chlorella protothecoides (UTEX 250) producida heterotróficamente se cultivó bajo condiciones ricas en nitrógeno suministrado por uno o más de los siguientes: extracto de levadura (fuente de nitrógeno orgánico), NH4OH y (NFL^SC^, que suplementa el medio descrito en los Ejemplos 2-4. Aparte de los medios de cultivo, las condiciones de fermentación fueron idénticas a las condiciones descritas en el Ejemplo 2. La biomasa de algas rica en proteína se cosechó después de aproximadamente 3-5 días de crecimiento exponencial, cuando este alcanzó la densidad de cultivo deseado. Cualquiera de los métodos de procesamiento anteriormente descritos (hojuelas de algas en el ejemplo 4, homogenizado de algas en el Ejemplo 10, polvo de algas en el Ejemplo 12 y harina de algas en el Ejemplo 13) se pueden aplicar a la biomasa de algas rica en proteína.

Análisis inmediato de la biomasa de microalgas La biomasa rica en proteína se procesó en hojuelas de algas mediante los métodos descritos en el ejemplo 4. Tanto la biomasa seca, rica en lípidos (ejemplo 4) como rica en proteína, se analizaron para humedad, grasa, fibra, ceniza, proteína cruda y digestibilidad de la proteína usando métodos de acuerdo con los Métodos Oficiales de la Internacional ACOC. Los resultados se resumen en la Tabla 45 a continuación.

Tabla 45. Análisis aproximado de microalgas con alto contenido proteico.

ND= no hecho Los carbohidratos totales se calcularon por diferencia: 100% menos los porcentajes conocidos del análisis inmediato. El total de carbohidrato por peso de la biomasa rica en lípido fue aproximadamente 36% y el total de carbohidrato por peso de la biomasa rica en próteína fue aproximadamente 24%.

La fibra cruda anterior representa la cantidad de celulosa y lignina (entre otros componentes) en las muestras de biómasa. Ambas biomasas se sometieron a las mediciones de fibra soluble e insoluble (en conjunto es fibra dietética total), que es parte del componente de carbohidrato de la biomasa, usando métodos de acuerdo con los Métodos Oficiales de la Internacional ACOC (Método 991.43 de AOAC). Para la biomasa rica en lípido, la fibra soluble fue 19.58% y la fibra insoluble fue 9.86% (fibra dietética total de 29.44%). Para la biomasa rica en proteína, la fibra soluble fue 10.31% y la fibra insoluble fue 4.28% (fibra dietética total de 14.59%).

Digestibilidad de las proteínas en la biomasa de algas Varios lotes de biomasa rica en proteína y rica en lípido (producida mediante los métodos descritos en el Ejemplo 4) y biomasa rica en proteína se analizaron para la digestibilidad mediante un ensayo de digestibilidad in vitro (ensayo de digestibilidad de 0.2% de pepsina, Método número 971.09 de AOAC). Para la biomasa rica en lípido, el por ciento de proteína total cruda en el intervalo de 5.4% a 10.3%, con el por ciento de proteína total digerible en el intervalo 46.4% a 58.6%. Para la biomasa rica en proteína, el por ciento de proteína total cruda en el intervalo 40.8% a 53.3%, con el por ciento de proteína total digerible en el intervalo 71.6% a 85.3%. El mismo ensayo de digestibilidad se realizó también en bioalimento extraída con hexano (biomasa de algas rica en lípido después de la extracción del aceite de algas con hexano). El por ciento de proteína total cruda fue aproximadamente 11-12% para todos los lotes de prueba, con el por ciento de proteína total digerible en el intervalo 76.72% a 80.2%.

Cuando se comparó con la harina integral de frijol de soya que tiene un por ciento de proteína total cruda de aproximadamente 40.9% y 95.35% de proteína total digerible, la biomasa de algas rica en proteína tuvo un por ciento de proteína total digerible que fue un poco menos que la harina integral de frijol de soya. Ensayos adicionales se realizaron en la biomasa de algas rica en proteína que se procesó de manera que las células de algas se lisaron predominantemente. Estos ensayos resultaron en el por ciento de proteína total digerible para ser comparado con aquel de harina integral de frijol de soya (aproximadamente 95% de la proteína total digerible). En general, el por ciento de proteína total cruda y el por ciento total de los niveles de proteína total digerible de la biomasa rica en proteína son comparables con aquellos de harina integral de frijol de soya.

Los resultados del ensayo de digestibilidad del bioalimento extraído con hexano indicaron que el bioalimento puede ser un aditivo viable para la alimentación animal. El bioalimento tenía proteína como aceite residual y tuvo un por ciento del nivel de proteína total digerible de aproximadamente 80%.

EJEMPLO 18 Productos alimenticios que contienen biomasa de aleas rica en proteína Composiciones de alimentos usando biomasa de algas rica en proteína (hojuelas de algas y homogenizado de algas) La biomasa de algas rica en proteína usada en las recetas a continuación se produjo con los métodos anteriormente descritos en el Ejemplo 17. La biomasa de algas usada en las recetas a continuación proviene de Chlorella protothecoides UTEX 250, que contenía aproximadamente 51% de proteína por peso y se refiere a continuación como biomasa de algas rica en proteína y se denomina ya sea como hojuelas de algas u homogenizado de algas.

Pastelillo de Hamburguesa Vegetariana Este ejemplo compara los pastelillos de hamburguesa vegetariana preparados con una receta convencional, con la biomasa de algas rica en proteína, ya sea de hojuelas de algas u homogenizado de algas (AH), sustituyendo las fuentes vegetarianas de proteína (proteína de soya texturizada (TSP), gluten de trigo y/o aislado de proteína de soya (SPI)).

Tabla 46. Receta convencional de pastelillo de hamburguesa vegetariana.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Agua 62.0 62.0 0 0 0 TSP (Arcon T U272) 11.0 11.0 2.09 7.59 0.22 TSP (Arcon T U218) 10.0 10.0 1.9 6.90 0.20 Aceite de cañóla 4.0 4.0 0 0 4.0 SPI 5.5 5.5 0 4.95 0.22 Gluten de trigo 3.0 3.0 0 2.46 0.03 Sabor Hamburguesa veget. Nat. 2.0 2.0 0 0 0 Sensirome Ultra Vegetable 1.0 1.0 0 0 0 Metilcelulosa 1.0 1.0 0.09 0 0 Sal 0.5 0.5 0 0 0 Total 100 gramos 100 4.08 21.90 4.67 Tabla 47. Receta para a pastelillo de hamburguesa vegetariana hecho con hojuelas de algas de alto contenido proteico en sustitución del aislado de proteína de soya (SPI), metilcelulosa, y gluten de trigo.

Componente Peso íg) % % Fibra % Proteíná % Grasa Agua 54.28 58.82 0 0 0 TSP (Arcon T U272) 11.0 11.92 2.26 8.22 0.24 TSP (Arcon T U218) 10.0 10.84 2.06 7.48 0.22 Aceite de cañóla 4.0 4.33 0 0 4.33 SPI 0 0 0 0 0 Hojuelas de algas ricas proteína 9.5 10.29 4.12 5.18¦ 0.51 Gluten de trigo 0 0 0 0 0 Sabor Hamburguesa veget. Nat 2.0 2.17 0 0 0 Sensirome Ultra Vegetable 1.0 1.08 0 0 0 Metilcelulosa 0 0 0 0 0 Sal 0.5 0.54 0 0 0 Total 92.28 100 8.44 20.88 530 Tabla 48. Receta para un pastelillo de hamburguesa vegetariana hecho con hojuelas de algas de alto contenido proteico en sustitución concentrado de proteína de soya texturizado (TSP) y aislado de proteína de soya.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Agua 57.5 49.57 0 0 0 TSP (Arcon T U272) 0 0 0 0 0 TSP (Arcon T U218) 0 0 0 0 0 Aceite de cañóla 4.0 3.45 0 0 3.45 Aislado de proteína de soya 0 0 0 0 0 Hojuelas de algas ricas proteína 47.0 40.52 16.21 20.38 2.03 Gluten de trigo 3.0 2.59 0 2.12 0.03 Sabor Hamburguesa veget. Nat 2.0 1.72 0 0 0 Sensirome Ultra Vegetable 1.0 0.86 0 0 0 etücelulosa 1.0 0.86 0.08 0 0 Sal 0.50 0.43 0 0 0 Total 116.0 100 16.29 22.50 5.50 Tabla 49. Receta para un pastelillo de hamburguesa vegetariana hecho con homogenizado de algas de alto contenido proteico (AH) en sustitución del aislado de proteína de soya (SPI), metilcelulosa, y gluten de trigo.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Agua 62.0 62.0 0 0 0 TSP (Arcon T U272) 11.0 11.0 2.09 7.59 0.22 TSP (Arcon T U218) 10.0 10.0 1.90 6.90 0.20 Aceite de cañóla 4.0 4.0 0 0 4.0 SPI 0 0 . 0 0 0 AH de alto cont. proteico 9.5 9.5 3.80 4.78 0.48 Gluten de trigo 0 0 0 0 0 Sabor Hamburguesa veget. Nat 2.0 2.0 0 0 0 Sensirome Ultra Vegetable 1.0 1. 0 0 0 Metilcelulosa 0 0 0 0 0 Sal 0.5 0.5 0 0 0 Total 100 100 7.79 19.27 4.90 Tabla 50. Receta para un pastelillo de hamburguesa vegetariana hecho con homogenizado de algas de alto contenido proteico en sustitución del concentrado de proteína de soya texturizado (TSP) y aislado de proteína de soya.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Agua 52.570 47.33 0 0 0 TSP (Arcon T U272) 0 0 0 0 0 TSP (Arcon T U218) 0 0 0 0 0 Aceite de cañóla 4.0 3.60 0 0 3.60 Aislado de proteína de soya 0 0 0 0 0 AH de alto contenido proteico 47.0 42.32 16.93 21.28 2.12 Gluten de trigo 3.0 2.7 0 2.12 0.03 Sabor Hamburguesa veget. Nat 2.0 1.8 0 0 0 Sensirome Ultra Vegetable 1.0 0.90 0 0 0 Metilcelulosa 1.0 0.90 0.08 0 0 Sal 0.50 0.43 0 0 0 Total 111.07 100 17.01 23.50 5.74 En cada caso el procedimiento de cocción fue: 1. Pesar junto las dos proteínas de soya texturizadas (si procede). c 2. En un bol de batidora estándar, adicionar la primera porción de agua (2.5-3 veces el peso de TSP y mezclar durante 10 minutos. 3. Pesar el concentrado de proteína de soya, metilcelulosa, gluten de trigo, y biomasa de algas y mezclar juntos los secos. 4. Adicionar los ingredientes secos a la batidora estándar. Adicionar el agua restante y mezclar durante 5-10 minutos. 5. Pesar la sal y saborizantes. Pesar el aceite. Adicionar a la batidora y mezclar durante 5 minutos. 6. Formar los pastelillos usando el molde (65-75g por pastelillo), tapar y congelar.

En las muestras donde la biomasa de algas (hojuelas de algas y homogemzado de algas), sustituyó a TSP, los pastelillos fueron muy pegajosos no tuvieron relativamente estructura cuando se cocinaron. La adición de otros aglutinantes tales como avena, salvado de avena y harina de arroz integral produjo un pastelillo, que fue de textura endurecida cuando se cocinó. Las recetas donde las hojuelas de algas sustituyen la proteína de soya produjeron un pastelillo que fue más suave, pastoso y de menos textura que el control. Los pastelillos que contienen homogenizado de algas que sustituye el aislado de proteína de soya tuvieron una firmeza y textura que fue comparable al control. En general, el pastelillo de hamburguesa vegetariana preparado con homogenizado de algas que sustituye el aislado de proteína de soya fue la más exitosa de las recetas probadas y produjo un pastelillo que fue comparable al pastelillo vegetariano de control, pero con casi dos veces más fibra dietética.

Barra de proteína Í25 El ejemplo siguiente compara una barra de proteína convencional, con biomasa de algas rica en proteína, ya sea hojuelas de algas u homogenizado de algas (AH), que sustituye las fuentes convencionales de proteína (aislado de proteína de soya (SPI) y concentrado de proteína de leche (MPC)).

Tabla 51. Receta de barra de proteína convencional.

Componente Peso (g % % Fibra % Proteína % Grasa Jarabe de maíz 63/43 53.0 53.7 0 0 0 Harina de arroz integral 8.3 8.41 3.15 0 0 Aislado de proteína de soya 9.35 9.47 0 8.24 0 Concentrado de proteína láctea 9.35 9.47 0 7.67 0.14 Polvo de cacao, Alcalizado 8.0 8.11 2.59 1.824 0.89 Leche seca sin grasa 7.0 7.09 0 2.483 0 Sabor chocolate 0.5 0.51 0 0 0 Sabor vainilla 0.4 0.41 0 0 0 Glicerina (99.5% USP) 2.3 2.33 0 0 0 Mezcla de vitaminas 0.49 0.5 0 0 0 Total 98.69 100 5.75 20.22 1.03 Tabla 52. Receta para barras de proteína hechas con hojuelas de algas de alto contenido proteico en sustitución de SPI y MPC.

Componente Peso (e % % Fibra % Proteína % Grasa Jarabe de maíz 63/43 49.7 52.21 0 0 0 Hojuelas de algas ricas proteína 34.0 35.72 14.29 17.97 1.79 Polvo de cacao, Alcalizado 8.0 8.40 2.69 1.89 0.92 Sabor Chocolate 0.47 0.49 0 0 0 Sabor Vainilla 0.375 0.39 0 0 0 Glicerina (99.5% USP) 2.16 2.27 0 0 0 Mezcla de vitaminas 0.49 0.51 0 0 0 Total 95.20 100 16.98 19.86 2.71 Tabla 53. Receta para barras de proteína hechas de homogenizado de algas de alto contenido proteico (AH) en sustitución de SPI y MPC.

Componente Peso (e % % Fibra % Proteína % Grasa Jarabe de maíz 63/43 48.0 51.4 0 0 0 AH de alto contenido proteico 34.0 36.41 14.56 18.31 1.82 Polvo de cacao, Alcalizado 8.0 8.57 2.741 1.928 0.942 Sabor Chocolate 0.47 0.48 0 0 0 Sabor vainilla 0.36 0.39 0 0 0 Glicerina (99.5% USP) 2.080 2.23 0 0 0 Mezcla de vitaminas 0.49 0.52 0 0 0 Total 93.38 100 17.31 20.24 2.76 En cada caso el procedimiento de cocción fue: 1. Mezclar todos los ingredientes del jarabe. 2. Calentar en la estufa a 190 °F y agujerear durante 10 minutos con la tapa puesta. Remover ocasionalmente. 3. Mantener el calor durante 10 minutos. Enfriar a aproximadamente 140 °F. 4. Combinar con los ingredientes secos. 5. Dividir en trozos y deje endurecer durante toda la noche. 6. Cortar en barras, cubrir con el compuesto que recubre como se desee y envasar.

En general, la barra de proteína preparada con homogenizado de algas rico en proteína mostró unión ligeramente mejor en comparación con la barra de proteína preparada con las hojuelas de algas. También, la barra de proteína preparada con el homogenizado de algas requirió la menor cantidad de jarabe de maíz para unir juntos los ingredientes. La barra de proteína preparada con el homogenizado de algas rico en proteína fue la composición más exitosa en comparación con la barra de proteína convencional: por cantidad comparable de proteína y grasa, contenía aproximadamente 3 veces más fibra dietética.

Bebida nutricional de Chocolate (sustituto de comida En el ejemplo siguiente comparan un bebida nutritiva convencional saborizada con chocolate, con bebidas nutricionales de chocolate preparados ya sea con hojuelas de algas ricas en proteína o homogenizado de algas rico en proteína (AH), que sustituyen las fuentes convencionales de proteína (aislado de proteína de soya (SPI) y concentrado de proteína de leche (MPC ).

Tabla 54. Receta para la bebida nutritiva de chocolate convencional.

Componente Peso (g) % Azúcar % Fibra % Proteína % Grasa Agua (filtrada) 908.0 72.99 0 0 0 0 Azúcar (granulada) 95.0 7.637 7.64 0 0 , 0 Jarabe de maíz 70.0 5.627 1.24 0 0 0 Maltodextrina 60.0 4.823 0 0 0 0 Aislado proteína leche 44.0 3.53 0 0 2.86 0 Aceite de cañóla 29.0 2.33 0 0 0 2.33 Polvo de cacao 15.0 1.206 0 0.39 0.27 0.13 Aislado proteína soya 11.5 0.924 0 0 0.8 0.04 Fosfato disódico . 2.0 0.161 0 0 0 0 Lecitina 1.7 0.137 0 0 0 0 Mezcla estabilizante 2.0 0.161 0 0 0 0 Sabor, vainilla 2.0 0.161 0 0 0 0 Sabor, Chocolate 2.0 0.161 0 0 0 0 Mezcla de vitaminas 1.8 ¦ 0.145 0 0 0 0 Total 1244 100 8.88 0.39 3.93 2.5 Tabla 55. Receta para la bebida nutritiva de chocolate hecha con hojuelas de algas en sustitución de SPI, maltodextrina y aislado de proteína de leche.

Componente Peso ( g) % Azúcar % Fibra % Proteína % Grasa Agua (filtrada) 910.0 74.959 0 0 0 0 Azúcar (granulada) 92.5 7.619 7.62 0 0 0 Jarabe de maíz 70.0 5.766 1.27 0 0 0 Hojuelas algas ricas prot. 87.0 7.166 0 2.87 3.6 0 Aceite de cañóla 28.0 2.306 0 0 0 2.31 Polvo de cacao 15.0 1.236 0 0.4 0.28 0.14 Fosfato disódico 2.0 0.165 0 0 0 0 Lecitina 1.7 0.14 0 0 0 0 Mezcla estabilizante 2.0. 0.165 0 0 0 0 Sabor, Vainilla 2.0 0.165 0 0 0 0 Sabor, Chocolate 2.0 0.165 0 0 0 0 Mezcla de vitaminas 1.8 0.148 0 0 0 0 Total 1214 100 8.89 3.27 3.88 2.45 Tabla 56. Receta para la bebida nutritiva de chocolate hecha con homogenizado de algas de alto contenido proteico (AH) en sustitución de SPI, maltodextrina y aislado de proteína de leche.

Componente Peso (e) % Azúcar % Fibra % Proteína % Grasa Agua (filtrada) 910.0 74.959 0 0 0 0 Azúcar (granulada) 92.5 7.619 7.62 0 0 0 Jarabe de maíz 70.0 5.766 1.27 0 0 0 AH de rica proteína 87.0 7.166 0 2.87 3.6 0 Aceite de cañóla 28.0 2.306 0 0 0 2.31 Polvo de cacao 15.0 1.236 0 0.4 0.28 0.14 Fosfato disódico 2.0 0.165 0 0 0 0 Lecitina 1.7 0.14 0 0 0 0 Mezcla estabilizante 2.0 0.165 0 0 0 0 Sabor, vainilla 2.0 0.165 0 0 0 0 Sabor, Chocolate 2.0 0.165 0 0 0 0 Mezcla de vitaminas 1.8 0.148 0 0 0 0 Total 1214 100 8.89 3.27 3.88 2.45 El homogenizado de algas rico en proteína produjo una bebida nutricional que fue más espesa en cuerpo cuando se comparó con la bebida de receta convencional. Las hojuelas de algas ricas en proteína produjeron una bebida nutricional que fue menos espesa que la bebida de control. En general, la bebida que contiene homogenizado de algas rico en proteína fue más exitosa en esta aplicación, produciendo una bebida espesa nutricional con gran opacidad. La bebida nutricional preparada con homogenizado de algas fue comparable en azúcar, grasa y niveles de proteína con la bebida convencional, mientras que contiene casi diez veces más fibra.

EJEMPLO 19 Genotipado para identificar otras cepas de microaleas adecuadas para el uso como alimento Genotipado de algas , El ADN genómico se aisló de biomasa de algas como sigue. Las células (aproximadamente 200 mg) de cultivos líquidos se centrifugaron 5 minutos a 14,000 x g. Las células se resuspendieron después en agua destilada estéril, centrifugaron 5 minutos a 14,000 x g y se desechó el sobrenadante. Una sola perla de cristal ~ 2 mm de diámetro se adicionó a la biomasa y los tubos se colocaron a ÷80 °C durante al menos 15 minutos. Las muestras se eliminaron y se adicionó 150 µ? de tampón de parada (1% Sarkosil, 0.25 M de sacarosa, 50 mM de NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, RNasa A 0.5 µg/µl). Los sedimentos se resuspendieron con una breve agitación, seguido por la adición de 40 µ? de NaCl 5M. Las muestras se agitaron brevemente, seguido por la adición de 66 µ? de 5% de CTAB (bromuro de cetil trimetilamonio) y una agitación breve final. Las muestras se incubaron luego a 65 °C durante 10 minutos después que ellas se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y extrajo una vez con 300 µ? de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 12:12:1, seguido por centrifugación durante 5 minutos a 14,000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo nuevo que contiene 0.7 volumen de isopropanol (~ 190 µ?), mezclado por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante toda la noche a 4°C. El ADN se recuperó a través de centrifugación a 14,000 xg durante 10 minutos. El sedimento resultante se lavó después dos . veces con 70% de etanol, seguido por un lavado final con 100% de etanol. Los sedimentos se secaron al aire durante 20-30 minutos a temperatura ambiente, seguida por la resuspensión en 50 µ? de 10 mM de TrisCl, 1 mM de EDTA (pH 8.0).

Cinco µ? de ADN total de algas, preparado como se describió anteriormente, se diluyó 1 :50 en 10 mM de Tris, pH 8.0. Las reacciones de PCR, volumen final de 20 ul, se establecieron como sigue. Diez µ? de mezcla maestra 2 x iProof HF (BIO-RAD) se adicionó a 0.4 µ? del cebador SZ02613 1 (5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3 '(sec. con núm. de ident: 24) a una concentración stock de 10 mM). Esta secuencia de cebador se ejecutó desde la posición primera 567-588 en el número de acceso del Gen Bank. L43357 y se conserva altamente en las plantas superiores y genomas de los plastidios de algas. Esto fue seguido por la adición de 0.4 µ? del cebador SZ02615 1 (5'-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3 (sec. con núm. de ident:25) en concentración inicial de 10. mM). Esta secuencia de cebador es complementaria con la posición de 1112-1093 en el número de acceso del Gen Bank. L43357 y se conserva altamente en las plantas superiores y genomas de plastidios de algas. Luego, se adicionaron 5ul de ADN total diluido y 3.2 µ? d¾0. Las reacciones de PCR se ejecutaron como sigue: 98°C, 45"; 98°C, 8"; 53°C, 12"; 72°C, 20" durante 35 ciclos seguidos de 72°C durante 1 minuto y manteniéndose a 25°C. Para la purificación de los productos de PCR, 20 µ? de 10 mM de Tris, pH 8.0, se adicionó a cada reacción, seguido por la extracción con 40 µ? de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 12: 12:1, agitando y centrifugando a 14.000 x g durante 5 minutos . Las reacciones de PCR se aplicaron a columnas S-400 (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3,000 x g. Los productos purificados de PCR se clonaron TOPO posteriormente en PCR8/GW/TOPO y se seleccionaron los clones positivos para placas de LB/Spec. El plásmido purificado de ADN se secuenció en ambas direcciones usando cebadores MI 3 directo y reverso. Las alineaciones de la secuencia y árboles no enraizados se generaron mediante el programa de análisis Geneious ADN, que se muestra en las Figuras 12a-12i. Las secuencias de las cepas 1-23 (denominado en el Ejemplo 13) se listan como sec. con núm. de ident: 1-23 en el Listado de Secuencias adjunto.

Análisis del ADN génómico de ARNr 23 S de 8 cepas de Chlorella protothecoides El ADN genómico de 8 cepas de Chlorella protothecoides _(UTEX 25, UTEX 249, UTEX 250, UTEX 256, UTEX 264, UTEX 411, CCAP 211/17, y CCAP 211/8d) se aislaron y el análisis del ADN genómico de ARNr 23 S se realizó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente en el Ejemplo 30. Todas las cepas de Chlorella protothecoides probadas fueron idénticas en secuencia excepto para UTEX 25. Los resultados se resumen en Cladogramas en las Figuras 13a- 13c. Las secuencias de las ocho cepas se enumeran como sec. con núm de ident: 26 y 27 en el listado de secuencias adjunto.

Análisis de genotipado de muestras de Chlorella adquiridas en el comercio Tres muestras de Chlorella adquiridas en el comercio, Chlorella regularis (New Chapter, 390mg/cápsula de gel), Chlorella de Whole Foods Broken Cell Wall (Whole Foods, de 500mg/comprimido prensado) y Chlorella de NutriBiotic CGF (NutriBiotic, 500mg/comprimido prensado), se genotiparon mediante los métodos descritos en el Ejemplo 30. Aproximadamente 200 mg de cada una de las muestras de Chlorella adquirida en el comercio se resuspendieron en agua destilada estéril para el aislamiento de ADN genómico.

Los productos resultantes de PCR se aislaron y clonaron en los vectores y secuenciaron usando cebadores MI 3 directo y reverso. Las secuencias se compararon con las secuencias conocidas mediante una búsqueda BLAST.

La comparación de las secuencias de ADN de ARNr 23 s reveló que dos de cada tres muestras de Chlorella adquiridas en. el comercio tuvo secuencias de ADN que coinciden con aestuarii Lyngbya presente (Whole Foods Broken Chlorella Wall y NutriBiotic CGF). Lyngbya aestuarii es una cianobacteria de especie marina. Estos resultados muestran que algunas Chlorella disponibles en el comercio contienen otras especies de microorganismos contaminantes, incluyendo organismos de géneros tales como Lyngbya que se conoce que producen toxinas (ver por ejemplo Teneva y otros, Environmental Toxicology, 18 (1) 1, pág. 9 - 20 (2003), Mateo y otros, Nat J Prod, 71 (6): pág. 1113-6 (2008) Carmona y otros, Environ Microbiol APPL, 63 (8): pág.3104-3110 (1997).

EJEMPLO 20 Mutantes de color de biomasa de microalsas adecuados para el uso como alimento Mutagénesis química para generar mutantes de color Chlorella Protothecoides (UTEX 250) se cultivó de acuerdo con los métodos y condiciones descritas en el Ejemplo 1. La mutagénesis química se realizó en la cepa de algas usando el N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG). El cultivo de algas se sometió al mutágeno (NTG) y se seleccionaron después a través de rondas de reaislamiento en placas de agar de 2.0% de glucosa. Las colonias se seleccionaron para los mutantes de color.

Chlorella protothecoides (tipo salvaje) parece ser de un color dorado cuando se cultiva heterotróficamente. La selección produjo una cepa que parece de color blanco en la placa de agar. Este mutante de color se nombró 33-55 (depositado el 13 de octubre de 2009 de acuerdo con el Tratado de Budapest, de la Colección Americana de Cultivos Tipo en 10.801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 con Denominación del Depósito de Patentes de PTA-XXXX). Otra colonia se aisló también y fue a través de tres rondas de reaislamiento para confirmar que esta mutación fue estable. Este mutante que parece ser de color amarillo claro en la placa de agar y se nombró 25-32 (depositado el 13 de octubre de 2009 de acuerdo con el Tratado de Budapest, en la Colección Americana de Cultivos Tipo en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 a 2209 con Denominación de Patentes de PTA-XXXX).

Perfil de lípidos de Chlorella protothecoides 33-55 Chlorella protothecoides 33-55 y Chlorella protothecoides parentales (UTEX 250) se cultivaron de acuerdo con los métodos y las condiciones descritas en el Ejemplo 1. El por ciento de lípido (por peso seco de células) se determinó para ambas cepas: Chlorella protothecoides 33-55 fue a 68% de lípidos y la cepa parental fue a 62% de lípido. Los perfiles de lípido se determinaron para ambas cepas y fueron como sigue (expresado como % del área): Chlorella protothecoides 33- 55, C14: 0 (0.81), C16:0 (10.35), C16: l (0.20), C18:0 (4.09), C18: l (72.16), C18:2 (10.60), C18:3 (0.10), y otros (1.69), para la cepa parental, C14:0 (0.77), C16:0 (9.67); C16:l (0.22), C18:0 (4.73), C18: l (71.45), C18:2 (10.99), C18:3 (0.14), y otros (2.05).

EJEMPLO 21 Materia prima celulósica para el cultivo de biomasa de microalsas adecuada para el uso como alimento Para evaluar si Chlorella protothecoides (UTEX 250) fue capaz de utilizar una fuente de carbono no alimenticia, materiales celulósicos (paja de maíz abierto) se preparó para el uso como una fuente de carbono para el cultivo heterotrófico de Chlorella protothecoides que es adecuado para el uso en cualquiera de las aplicaciones de alimentos descritos en los ejemplos anteriores.

El material de paja de maíz en pedazos, húmedo se preparó por el Laboratorio Nacional de Energía Renovable (Golden, CO) por la cocción de paja de maíz en una solución de ácido sulfúrico a 1.4% y desecación de la suspensión resultante. Mediante un analizador de humedad Mettler Toledo, los sólidos secos en la paja de maíz húmedo se determinaron para ser 24%. Una muestra húmeda de 100 g se resuspendió en agua desionizada hasta un volumen final de 420 mi y el pH se ajustó a 4.8 con 10 N de NaOH. Celluclast™ (Novozymes) (una celulasa) se adicionó a una concentración final de 4% y la suspensión resultante se incubó con agitación a 50°C durante 72 horas. El pH de este material se ajustó después a 7.5 con NaOH (cambio de volumen despreciable), este material esterilizó por filtro a través de un filtro de 0.22 µt? y almacenó a 20°C. Una muestra se reservó para la determinación de la concentración de glucosa mediante un kit hexoquinasa de Sigma, como se describe a continuación Las concentraciones de glucosa se determinaron mediante Reactivo # G3293 Ensayo de Glucosa de Sigma. Las muestras, tratadas como se indica anteriormente, se diluyeron 400 veces y 40µ1 se adicionó a la reacción. La preparación celulósica de la paja de maíz se determinó para contener aproximadamente 23 g/1 de glucosa.

Después del tratamiento enzimático y la sacarificación de la celulosa a glucosa, xilosa y otros azúcares monosacáridos, el material preparado anteriormente se evaluó como materia prima para el crecimiento de Chlorella protothecoides (UTEX 250) usando el medio descrito en el Ejemplo 1. Diversas concentraciones de azúcares celulósicos mezclado con glucosa pura se probaron (0, 12.5, 25, 50 y 100% de azúcares celulósicas). Las células se incubaron en la oscuridad en concentraciones diversas de azúcares celulósicas a 28°C con agitación (300 rpm). El crecimiento se evaluó por la medición de la absorbancia a 750 nm en un espectrofotómetro UV. Los cultivos de Chlorella protothecoides crecieron en el material de paja de maíz preparado con Celluclast, incluyendo las condiciones de medios en los que el 100% de azúcar fermentable fue derivado celulósico. Experimentos similares se realizaron también usando suspensión de remolacha tratada con Accellerase como materia prima celulósica. Al igual que los resultados obtenidos con el material de paja de maíz, todas los cultivos de Chlorella protothecoides fueron capaces de utilizar el azúcar derivado celulósico como una fuente de carbono.

La solicitud de patente PCT números: PCT/US2007/001319, presentado el 19 de enero de 2007, titulado "Nutraceutical Compositions from microalgas and Related Methods of Production and Administration" se incorpora en su totalidad por la presente para todos los propósitos. La solicitud de patente PCT núm: PCT/US2007/001653, presentada el 19 de enero 2007, titulada "Microalgae Derived Composition for Improving Health and Appearance of Skin" se incorpora en su totalidad por la presente para todos los propósitos. La solicitud de patente PCT* núm.: PCT US2008/065563, presentada el 2 de junio del 2008, titulada "Production of Oil in Microorganisms" se incorpora en su totalidad por la presente para todos los propósitos. La solicitud de patente provisional de Estados Unidos núms. 61/043, 318, presentada el 8 de abril del 2008, titulada "Fractionation of Oil-Bearing Microbial Biomass," y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm. 61/043, 620, presentada el 9 de abril del 2008, titulado "Direct Chemical Modification of Microbial Biomass" que se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Todas las referencias citadas en este documento, incluyendo las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones, se incorporan como referencia en su totalidad, ya sean previamente incorporadas de forma específica o no. Las publicaciones mencionadas en este documento se citan con el propósito de describir y divulgar los reactivos,, metodologías y conceptos que se podrían usar en conjunción con la presente invención. En este documento nada debe ser interpretado como una admisión de que estas referencias en relación con las invenciones descritas en la presente son de la técnica anterior.

Aunque esta invención se describió en conjunto con las modalidades específicas de ésta, se entenderá que es capaz de otras modificaciones. Esta aplicación pretende cubrir cualquiera de las variaciones, usos, o adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo las desviaciones de la presente descripción como originadas de la práctica conocida o rutinaria en la técnica a la que pertenece la invención y que se podrían aplicar a las características esenciales expuestas anteriormente.

Claims (16)

REIVINDICACIONES:

1. Una composición alimenticia que comprende al menos 0.1% p/p de biomasa de algas y uno o más ingrediente, en donde la biomasa de algas se cultiva bajo condiciones heterotróficas, y en donde la biomasa de algas comprende uno o más de los siguientes atributos: a. al menos aproximadamente 10% de aceite de algas por peso seco; b. al menos aproximadamente 50% en peso del aceite de algas es aceite monoinsaturado; c. menos de aproximadamente 5% en peso del aceite de algas es ácido docosahexanoico (DHA) (C22:6); d. entre aproximadamente 0-115 mcg/g de carotenoides totales; e. entre aproximadamente 20% a aproximadamente 40% de carbohidratos por peso seco; and f. al menos aproximadamente 0.5% p/p de fosfolipidos de alga.

2. La composición alimenticia de la reivindicación 1, en donde la biomasa de algas es predominantemente células intactas.

3. La composición alimenticia de la reivindicación 1, en donde la biomasa de algas es predominantemente células Usadas.

4. La composición alimenticia de la reivindicación 3, en donde la biomasa de algas es un hómogenizado.

5. La composición alimenticia de la reivindicación 3, en donde la biomasa de algas es un polvo.

6. La composición alimenticia de la reivindicación 3, en donde la biomasa está en forma de un polvo, y en donde la biomasa de algas comprende al menos aproximadamente 40% de aceite de algas por peso seco.

7. La composición alimenticia de la reivindicación 1 que es un aderezo para ensalada, producto de huevo, producto de panadería, pan, barra, trozos aperitivos, pasta, salsa, sopa, bebida, postre helado, mantequilla o untables.

8. La composición alimenticia de la reivindicación 5, en donde tamaño de partícula promedio del polvo es de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 10 mieras.

9. Un método de preparar una composición alimenticia, que comprende combinar la biomasa de algas heterotróficamente cultivada que contiene al menos 10% en peso aceite de algas con al menos otro ingrediente.

10. El método de la reivindicación 9 que comprende las etapas de: a. determinar la cantidad de aceite que no sea de algas, grasa que no sea de algas o huevo en un producto alimenticio convencional; y b. sustituir todo o una parte del aceite que no es de algas, grasa que no es de algas o huevo o suplementar el aceite que no es de algas, la grasa que no es de algas o el huevo con una cantidad especificada de biomasa de algas.

11. El método de la reivindicación 10 en donde no se añade aceite que no es de algas, grasa que no es de algas o huevo a la composición alimenticia.

12. El método de la reivindicación 10 en donde la cantidad de biomasa de algas es de aproximadamente 0.25 veces a aproximadamente 4 veces la masa o volumen de aceite que no es de algas, grasa que no es de algas o huevo en el producto alimenticio convencional.

13. El método de la reivindicación 10 en donde la biomasa de algas es predominantemente lisada y está en forma de un polvo o un homogenizado.

14. Una composición alimenticia que comprende al menos ¦ aproximadamente 0.1% p/p biomasa de algas y uno o más ingredientes, en donde la biomasa de algas es un muíante de color y comprende al menos aproximadamente 10% aceite de algas por peso seco.

15. La composición alimenticia o método de las reivindicaciones 1, 9 y 14, en donde la biomasa de algas es una especie del género Chlorella.

16. La composición alimenticia o método de la reivindicación 15, en donde la biomasa de algas se cultiva bajo condiciones GMP.