ME00419B - Antigonistička antitijela usmjerena protiv kalcitonita, peptida povezanog sa genom i postupkom njihovog korišćenja - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak daje postupke zaprevenciju ili tretiranje poremećaja povezanih sa KPPG, kao što su vazomotornisimptomi, uključujući glavobolje (npr. migrena, klaster glavobolja itenziona glavobolja) i nastupe crvenila i vrućine, koji se sastoje odordiniranja anti-KPPG antagonističkog antitela. Opisani sutakođe antagonističko antitelo G1 i antitela izvedena iz G1 usmerena naKPPG.

Description

Ovu prijavu štiti prioritet United States Patent Application No. 60/736,623, podnete 14. novembra 2005, koja je ove priključena kroz citat.

POLJE PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu anti-KPPG (kalcitonin, peptid povezan sa genom), (na engleskom: CGRP - calcitonin gene-related peptide) antagonističkih antitela za prevenciju, ublažavanje ili tretman vazomotornih simptoma, kao što su glavobolje povezane sa KPPG (npr. migrena) i nastupi crvenila i vrućine.

OSNOVA PRONALASKA

KPPG (kalcitonin, peptid povezan sa genom) je neuropeptid od 37 aminokiselina koji pripada porodici peptida koja obuhvata kalcitonin, adrenomedulin i amilin. Kod humanih bića postoje dva oblika KPPG (α-KPPG i β-KPPG) i imaju slične aktivnosti. Razlikuju se u tri aminokiseline i pokazuju diferencijalnu raspodelu. Najmanje dve podvrste receptora KPPG mogu takođe biti odgovorne za diferencijalne aktivnosti. KPPG je neurotransmiter u centralnom nervnom sistemu, a pokazano je da je snažan periferijski vazodilatator, gde su neuroni koji sadrže KPPG tesno povezani sa krvnim sudovima. Vazodilatacija posredovana sa KPPG je takođe povezana sa neurogenom inflamacijom, kao deo kaskade događanja koje dovodi do ekstravazacije plazme i vazodilatacije mikrovaskulature, prisutne kod migrene.

KPPG je zapažen povodom moguće veze sa vazomotornim simptomima (Wyon et at., Scand J. Urol. Nephrol. 35, 92-96 (2001); Wyon et al., Menopause 7(1), 25-30 (2000)). Vazomotorni simptomi (VMS), kao što su nastupi crvenila i vrućine, predstavljaju najčešće simptome povezane sa menopauzom, a dešavaju se kod 60% do 80% svih žena nakon prirodno ili hirurški izazvane menopauze. Nastupi crvenila i vrućine su izgleda prilagođeni odgovor centralnog nervnog sistema (CNS) na smanjenje polnih steroida (Freedman, Am. J. Human Biol. 13, 453-464 (2001)) Do danas, najefikasnije terapije za nastupe crvenila i vrućine su tretmani na bazi hormona, uključujući estrogene i/ili neke progestine. Hormonalni tretmani mogu biti efikasni za ublažavanje nastupa crvenila i vrućine, ali ne odgovaraju svim ženama. Zapaženi psihološki i emocionalni simptomi, kao što su nervoza, zamor, iritabilnost, nesanica, depresija, gubitak pamćenja, glavobolja, anksioznost, nervoza ili nesposobnost koncentrisanja, smatra se da su izazvani gubitkom sna nakon nastupa crvenila i vrućine i noćnih preznojavanja (Kramer et al., u ”Murphy et al., 3- sup. rd. Int’l Symposium on Recent Advances in Urological Cancer Diagnosis and Treatment-Proceedings”, Pariš, SCI: 3-7 (1992)).

Nastupi crvenila i vrućine se dešavaju kod ljudi nakon smanjivanja steroidnog hormona (androgen). Ovo je takođe i u slučajevima opadanja androgena povezanog sa starosnom dobi (Katovich et al., Proceedings of the Sodety for Expeiimental Biology & Medicine 193(2), 129=35 (1990)) kao i u ekstremnim slučajevima osiromašavanja u hormonima, povezanim sa tretmanom kancera prostate (Berendsen et al., European Journal of Pharmacology 419(1), 47-54 (2001). Oko trećine ovih pacijenata će osetiti trajne i česte simptome, dovoljno jake da izazovu neprijatnost i nelagodnost.

KPPG je snažan vazodilatator koji je impliciran u patologiji drugih vazomotarnih simptoma, kao što su svi oblici glavobolje, uključujući migrene (sa ili bez aure) i klaster glavobolju, Durham, N. Eng. J. Med. 350, 1073-1075 (2004). Sadržaji KPPG u serumu eksterne jugularne vene su povišeni kod pacijenata, za vreme napada migrene Goadsby et al., Ann. Neurol. 28, 183-7 (1990). Intravenozno ordiniranje humanog ot-KPPG izazvalo je glavobolju i migrenu kod pacijenata koji su patili od migrene bez aure, što ukazuje da KPPG ima uzročnu ulogu kod migrene. Lassen et al., Cephalgia 22, 54-61 (2002).

Moguće učešće KPPG kod migrene je predstavljalo osnovu za razvoj i testiranje brojnih jedinjenja koja inhibiraju oslobađanje KPPG (npr. sumatriptan), a antagonisti su receptora KPPG (npr. dipeptidni derivat BIBN4096BS (Boerhringer Ingelheim); KPPG(8.37)) ili stupaju u interakciju sa jednim ili više proteina povezanih sa receptorom, kao što je receptor proteina za aktivnost membrane ili komponenta proteina receptora. gde oba utiču na vezivanje KPPG za njegove receptore. Brain, S. et al., Trends in Pharmacologtcai Sciences 23, 51-53 (2002). Podvrste alfa-1 adrenoceptora i receptora adenozina A1 takođe kontrolišu (inhibiraju) oslobađanje KPPG i trigeminalno aktiviranje (Goadsby et al., Brain 125, 1392-401 (2002)) Agonist receptora adenozina A1 GR 79236 (metrafadil), za koga je pokazano da inhibira neurogenu vazodilataciju i trigeminalni prenos bola kod humanih bića, mogu takođe da poseduju aktivnost protiv migrene (Arulmani et al., Cephalgia 25, 1082-1090 (2005); Giffin et al., Cephalgia 23, 287-292 (2003)).

Zbunjuje u ovoj teoriji opažanje da je tretman sa jedinjenjima koja izričito inhibiraju neurogenu rnflamaciju (npr. tachykinin antagonist NK1 receptora) ili trigeminalno aktiviranje (npr. agonisti receptora 5HTid), relativno neefikasan u tretiranju akutne migrene, što je navelo neke istraživače na pitanje da li je inhibiranje oslobađanja KPPG primarni mehanizam delovanja efikasnih tretmana protiv migrene Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol 500, 315-330 (2004).

Migrena je kompleksno, obično neurološko stanje koje karakterišu snažni, epizodni napadi glavobolje i s tim povezani simptomi, koji mogu biti mučnina, povraćanje, osetljivost na svetlost, zvuk ili pokrete. Kod nekih pacijenata, glavobolji prethodi ili je prati i aura. Bol prilikom glavobolje može biti snažan, a kod nekih pacijenata može takođe biti i jednostran.

Napadi migrene remete dnevni život. U SAD i Zapadnoj Evropi, ukupno brojno stanje onih koji pate od migrene je 11% od ukupne populacije (6% muškaraca i 15-18% žena). Dalje, srednja frekvencija napada migrene kod pojedinaca je 1,5 na mesec dana. lako postoje brojni dostupni tretmani za olakšavanje ili umanjenje simptoma, preporučuje se preventivna terapija kod onih pacijenata koji imaju više od 3-4 napada migrene na mesec dana. Goadsby et al. New Engl, J. Med. 346(4). 257-275 (2002).

Raznovrsnost farmakoloških intervencija koja se koristi za tretiranje migrene i varijabilnost odgovora pacijenata svedoče o raznolikoj prirodi ovog poremećaja. Tako, neki relativno ne-selektivni lekovi, kao što su ergot alkaloidi (npr. ergotamine, dihydroergotamine, methysergide) koji izazivaju serolonergijsku, kao i adrenergijsku, noradrenergijsku i dopaminergijsku aktivnost, koriste se već čitavih osamdeset godina za tretiranje migrene Drugi tretmani obuhvataju opijate (npr. oxycodone) i p-adrenergijske antagoniste (npr. propranolol). Neki pacijenti, obično oni sa blažim simptoima, u stanju su da kontrolišu simptome sa sredstvima koja se ne daju na recept, kao što su jedan ili više ne-steroidnih inflamatornih agenasa (NSAID), kao što su kombinacija aspirina, acetaminofenona i kafeina (npr. Excedrin® Migraine).

Nedavno, neki pacijenti od migrene su tretirani sa topiramate-om, antikolvuzantom, koji blokira natrijumove kanale zavisne od napona i neke receptore glutamata (AMPA-kainate), osnažuje aktivnost receptora GABA-A i blokira ugljenične anhidraze Relativno skorašnji uspeh kod nekih pacijenata sa agonstima serotonina 5HT-1B/1D i/ili 5HT-1a, kao što je sumatriptan, naveo je istraživače da predpostave serotonergijsku etiologiju ovog poremećaja. Nažalost, dok neki pacijenti dobro reaguju na ovaj tretman, drugi su relativno otporni na njegove efekte.

Predpostavljeno je da u osnovi ovog poremećaja leži disfunkcija jonskog kanala u aminergijskom jezgru moždanog stabla, ali ipak precizna patofiziologija migrene se još uvek dobro ne razume. Jedan oblik migrene, porodična hemiplegična migrena, pokazano je da je povezana sa nedostatkom mutacija u a1 podjedinici kalcijumovog kanala P/Q-vrste sa naponskim ulazom, i smatra se verovatnim da će se otkriti i druge mutacije u jonskim kanalima, kod drugih populacija ovih pacijenata, lako je dilatacija krvnih sudova kod migrene povezana i pogoršava simptome bola, danas se smatra da ovi neurovaskularni događaji predstavljaju rezultat, a ne uzCDR ovom stanju. Uopšteno, smatra se da je disfunkcija puteva u moždanom stablu, koja moduliše senzorski input jedinstvena karakteristika migrene. Goadsby, P.J. et al. New Eng. J. Med. 346(4), 257-275 (2002).

Kroz ovu prijavu se navode razne publikacije (uključujući patente i patentne prijave). Opisi tih publikacija su u celini ovde priključeni kroz citat.

KRATAK OPIS PRONALASKA

Pronalazak koji je ovde opisan odnosi se na anti-KPPG antagonistička antitela i postupke upotrebe anti-KPPG antagonističkih antitela za tretiranje ili prevenciju vazomotornih simptoma, kao što su glavobolje, kao što je migrena sa ili bez aure, hemiplegijska migrena, klaster glavobolje, migrenozna neuralgija, hronične glavobolje, tenzione glavobolje i glavobolje koje su posledica drugih medicinskih stanja (kao što je infekcija ili povišeni pritisak u lobanji usled tumora). Drugi vazomotorni simptomi su nastupi crvenila i vrućine.

U jednom aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za tretiranje ili prevenciju najmanje jednog vazomotornog simptoma kod pojedinca, koji se sastoji od ordiniranja tom pojedincu efikasne količine anti-KPPG antagonističkog antitela.

U jednom aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za tretiranje ili prevenciju glavobolje (npr. migrene ili klaster glavobolje) kod pojedinca, koji se sastoji od ordiniranja tom pojedincu efikasne količine anti-KPPG antagonističkog antitela.

U jednom aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za ublažavanje, kontrolu, smanjenje pojave ili odlaganje razvoja ili napredovanja glavobolje (npr. migrene ili klaster glavobolje) kod pojedinca, koji se sastoji od ordiniranja tom pojedincu efikasne količine anti-KPPG antagonističkog antitela.

U sledećoj realizaciji, ovaj pronalazak daje postupak za ublažavanje, kontrolu, smanjenje pojave ili odlaganje razvoja ili napredovanja glavobolje (npr. migrene ili klaster glavobolje) kod pojedinca, koji se sastoji od ordiniranja tom pojedincu efikasne količine anti-KPPG antagonističkih antitela u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim agensom za tretiranje glavobolje. Ovi dodatni agensi su agonisti nalik 5-HT1 (i agonisti koji deluju na drugim mestima 5-HT1) i ne-steroidni anti-inflamatorni lekovi (NSAID).

Primere 5-HT1 agonista, koji se mogu koristiti u kombinaciji sa anti-KPPG antitelom, predstavlja klasa jedinjenja poznata kao triptani, kao što su sumatriptan, zolmitriptan, naratriptan, rizatriptan, eletriptan, almotriptan i frovatriptan. Poznato je takođe da ergot alkaloidi i srodna jedinjenja imaju aktivnost 5-HT1 agonista i koriste se za tretiranje glavobolje, kao što je migrena. Među ovim jedinjenjima su ergotamin tartarat, ergonovin maleat i ergoloid mezilat (npr. dihydroergocornine, dihydroergocristine, dihydroergocryptine i dihydroergotamine mezilat (DHE 45)).

Primeri jedinjenja NSAID koja se mogu koristiti u kombinaciji sa anti-KPPG antitelom, su naproxen, flurbiprofen, ketoprofen, oxaprozin, etodolac, indomethacin, ketorolac, nabumetone, mefanaminksa kiselina i piroxican. Tu su još i inhibitori cikloksigenaze-2 (COX-2). Članovi ove grupe su celecoxib, rofecoxib, meloxicam, JTE-522, L-745,337, NS398 i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za ublažavanje, kontrolu, smanjenje pojave ili odlaganje razvoja ili napredovanja nastupa crvenila i vrućine kod pojedinca, koji se sastoji od ordiniranja tom pojedincu efikasne količine anti-KPPG antagonističkog antitela.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za ublažavanje, kontrolu, smanjenje pojave ili odlaganje razvoja ili napredovanja nastupa crvenila i vrućine kod pojedinca, koji se sastoji od ordiniranja tom pojedincu efikasne količine anti-KPPG antagonističkog antitela u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim agensom korisnim za tretiranje nastupa crvenila i vrućine. Ovi dodatni agensi su, ali bez ograničavanja, tretmani na bazi hormona, uključujući estrogene i/ili progestine.

U jednoj realizaciji anti-KPPG antagonističko antitelo, koje se koristi u bilo kom postupku opisanom gore, je bilo koje od antitela opisanih u nastavku.

U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo prepoznaje humani KPPG. U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo se vezuje za humani i cc-KPPG i β-KPPG. U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo se vezuje za KPPG humanih bića i pacova. U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo se vezuje za fragment C-terminala koji ima aminokiseline 25-37 iz KPPG. U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo se vezuje sa C-terminal epitopa sa aminokiselinama 25-37 KPPG.

U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističke) antitelo je monoklonalno antitelo. U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističke antitelo je humanizovano. U nekim realizacijama antitelo je humano U nekim realizacijama anti-KPPG antagomstičko antitelo je antitelo G1 (kao što je opisano u nastavku) U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo sadrži jedan ili više CDR (kao što je jedan, dva tri, četiri, pet ili u nekim realizacijama svih šest CDR) antitela G1 ili varijanata G1, prikazani u Tabeli 6. U još nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo sadrži sekvenciju aminokiselina teškog lanca varijabilnog regiona, prikazanu na Slici 5 (SEQ ID NO: 1) i sekvenciju amino kiselina lakog lanca varijabilnog regiona, prikazanu na Slici 5 (SEQ ID NO: 2)

U nekim realizacijama ovo antitelo sadrži modifikovani konstantni region, kao što je imunološki inertan konstantni region (uključujući delimično imunološki inertan), npr. koji ne pokreće komplementarno posredovanu ližu, ne stimuliše ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitiela, ne aktivira mikrogliju, ili ima umanjenu jednu ili više ovih aktivnosti. U nekim realizacijama konstantni region je modifikovan kao što je opisano u Eur. J. Immunol. 29, 2613-2624 (1999); PCT Application No. PCT/GB99/01441; i/ili UK Patent Application NO. 9809951.8. U drugim realizacijama, ovo antitelo sadrži konstantan region teškog lanca humanog lgG2, koji se sastoji od sledećih mutacija: A330P331 do S330S331 (obeležavanje aminokiselina je kao u sekvenciji divljeg tipa lgG2). Eur. J. Immunol. 29, 2613-2624 (1999) U nekim realizacijama konstantan region teškog lanca antitela je teški lanac humanog lgG1, sa bilo kojom od sledećih mutacija 1) A327A330P331 do G327S330S331; 2) E233L234L235G236 do

P233V234A235 sa izbačenim G236; 3) E233L234L235 do P233V234A235; 4) E233L234 L235G236A327A330P331 do P233V234A235G327S330S331 sa izbačenim G236; 5) E233L234L235A327A330P331 do

P233V234A235G327S330S331; i 6) N297 do A297, ili bilo koja druga aminokiselina izuzev N U nekim realizacijama, konstantni egion teškog lanca antitela je teški lanac humanog lgG4 sa bilo kojom od sledećih mutacija:

E233F234L235G236 do P233V234A235 sa izbačenim G236; E233F234L235 do P233V234A235; i S228L235 do P228E235.

U još jednoj realizaciji konstantni region je aglikczilovan za glikozilovanje povezano sa N U nekim realizacijama konstantni region je aglikozšlovan za glikozilovanje povezano sa N, mutacijom ostatka dodatnog oligosaharida (kao što je Asn297) i/ili bočnih ostataka koji su deo sekvencije za prepoznavanje N-glikozilovanja u konstantnom regionu. U nekim realizacijama konstantni region je aglikozilovan za glikozilovanje povezano sa N. Konstatni region može biti agtikozilovan za enzimatsko glikozilovanje povezano sa N. ili ekspresovanje u ćeliji domaćina deficitarnoj sa glikozilovanjem.

Afinitet vezivanja (KD) anti-KPPG antagonisitičkog antiteia za KPPG (kao što je humani α-KPPG, meren rezonancijom površinskog plazmona na odgovrajućoj temperaturi, kao što je 25° ili 37X), može da iznosi oko 0,02 do oko 200 nM. U nekim realizacijama afinitet vezivanja je oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 pM, oko 50 pM, oko 20 pM, oko 15 pM, oko 10 µM oko 5 µM ili oko 2 pM. U nekim realizacijama, afinitet vezivanja je manji od bilo kog od sledećih, oko 250 nM, oko 200 nM. oko 100 nM, oko 50 nM oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 µM ili oko 50 pM

Ovo anti-KPPG antagonisitčko antitelo se može ordinirati pre, za vreme i/ili posle glavobolje. U nekim realizacijma, anti-KPPG antagonisitčko antitelo se ordinira pre napada glavobolje (npr. migrene i klaster glavobolje). Ordiniranje anti-KPPG antagonističkog antiteia može biti na bilo koji način poznat u stanju tehnike, uključujući: oralni, intravenozni, subkutani, intraarterijalni, intramuskularni, mtrakardijalni, intraspinalni, intratorakalni, intraperitonealni, intraventnkularni, sublingvalni, transdermalni i/ili inhalacioni Ordiniranje može biti sistemsko, npr. intravenozno, ili lokalizovano

U nekim realizacijama anfi-KPPG antagonisitčko antiteto se može ordinirati zajedno sa drugim agensom, kao što je neki drugi agens za tretiranje glavobolje.

U stedećem aspektu, ovaj pronalazak daje upotrebu anti-KPPG antagonističkog antitela za proizvodnju medikamenta za upotrebu u bilo kom ovde opisanom postupku, na primer, za tretiranje ili prevenciju glavobolje.

U sfedećem aspektu, ovaj pronalazak daje farmaceutski preparat za prevenciju ili tretiranje glavobolje (npr. migrene ili klaster glvaobolje), koji sadrži efikasnu količinu anti-KPPG antagonističkog antitela u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih dodataka.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak daje komplet za upotrebu u bilo kome od ovde opisanih postupaka. U nekim realizacijama ovaj komplet sadrži kontejner, preparat koji sadrži ovde opisano anti-KPPG antagonističko antitelo u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i uputstvo za upotrebu preparata u bilo kom od ovde opisanih postupaka.

Ovaj pronalazak daje takođe anti-KPPG antagonistička antitela i polipeptide izvedene iz antitela G1 ili njegove varijante, prikazane u Tabeli 6. Prema tome, u jednom aspektu, ovaj pronalazak predstavlja antitelo G1 (naizmenično se naziva ”G1”) koje se proizvodi ekspresijom vektora koji imaju ATCC Accession No. PTA-6866 i PTA-6867. Na primer, u jednoj realizaciji to je antitelo koje sadrži teški lanac dobijen ekspresijom vektora sa ATCC Accession No PTA-6867. U drugoj realizaciji to je antitelo koje sadrži laki lanac dobijen ekspresijom vektora sa ATCC Accession No PTA-6866. Sekvencije aminokiseiina teškog lanca i lakog lanca varijabilnih regiona G1 su prikazane na Slici 5. Delovi antitela G1 koji određuju region komplementarnosti (CDR, od engleski complementarity determining region) (uključujući Ghotia-ev i Kabat-ov CDR), prikazani su takođe na Slici 5. Podrazumeva se da pozivanje na bilo koji deo ili na čitav region G1 obuhvata sekvencije proizvedene ekspresijom vektora koji imaju ATCC

Accession NO. PTA-6866 i PTA-6867, i/ili sekvencije prikazane na Slici 5. Ovaj pronalazak daje takođe varijante antitela G1 sa sekvencijama aminokiselina prikazanim u Tabeli 6.

U jednom aspektu ovaj pronalazak predstavlja antitelo koje sadrži VH domen koji je najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičan sa sekvencijom aminokiselina SEQ ID NO: 1.

U drugom aspektu ovaj pronalazak predstavlja antitelo koje sadrži VL domen koji je najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičan sa sekvencijom aminokiselina SEQ ID NO: 2.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak predstavlja antitelo koje sadrži fragment regiona antitela G1 ili njegovih varijanti prikazanih u Tabeli 6. U jednoj realizaciji ovaj fragment je laki lanac antitela G1. U drugoj realizaciji ovaj fragment je teški lanac antitela G1. U još jednoj realizaciji ovaj fragment sadrži jedan ili više varijabilnih regiona iz lakog lanca i/ili teškog lanca antitela G1. U još jednoj realizaciji, ovaj fragment sadrži jedan ili više varijabilnih regiona iz lakog lanca i/ili teškog lanca, prikazanog na Slici 5. U još jednoj realizaciji, ovaj fragment sadrži jedan ili više CDR iz lakog lanca i/ili teškog lanca antitela G1.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje polipeptide (koji mogu, ali ne moraju biti antitelo) koji sadrže VH CDR3, kao što je dato u SEQ ID NO: 5, ili sekvenđju koja se razlikuje od SEQ ID NO: 5 po 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija aminokiselina. U posmatranoj realizaciji te supstitucije aminokiselina su konzervativne supstitucije.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje polipeptide (koji mogu, ali ne moraju biti antitelo) koji sadrže VL CDR3, kao što je dato u SEQ ID NO: 8, ili sekvenciju koja se razlikuje od SEQ ID NO: 8 po 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija aminokiselina. U posmatranoj realizaciji te supstitucije aminokiselina su konzervativne supstitucije.

U narednom aspektu ovaj pronalazak daje polipeptide (koji mogu, ali ne moraju biti antitelo) koji sadrže bilo koji ili koje od sledećih: a) jednan ili više CDR antitela G1 ili njegovih varijanti, prikazanih u Tabeli 6; b) CDR H3 iz teškog lanca antitela

G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; c) CDR L3 iz lakog lanca antitela

G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; d) tri CDR iz lakog lanca antitela

G1, ili njegovih varijanti prikazanih u Tabeli 6; e) tri CDR iz teškog lanca antitela

G1, ili njegovih varijanti prikazanih u Tabeli 6; f) tri CDR iz iz lakog lanca i tri CDR iz teškog lanca antitela G1, ili njegovih varijanti prikazanih u Tabeli 6. Ovaj pronalazak daje još polipeptide (koji mogu, ali ne moraju biti antitelo) koji sadrže jedan ili više od sledećih: a) jedan ili više (jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest) CDR, izvedenih iz antitela G1 ili njegovih varijanti, prikazanih u Tabeli 6; b) CDR izveden iz CDR H3 teškog lanca antitela G1, i/ili CDR izveden iz CDR L3 lakog lanca antitela G1. U nekim realizacijama CDR je CDR prikazan na Slici 5. U nekim realizacijama, jedan ili više CDR izvedenih iz antitela G1, ili njegovih varijanti iz Tabele 6, najmanje je 85%, najmanje je 86%, najmanje je 87%, najmanje je 88%, najmanje je 89%, najmanje je 90%, najmanje je 91%, najmanje je 92%, najmanje je 93%, najmanje je 94%, najmanje je 95%, najmanje je 96%, najmanje je 97%, najmanje je 98% ili najmanje je 99% identičan sa najmanje jednim, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet ili najmanje šest CDR iz G1 ili njegovih varijanti.

U nekim realizacijama CDR je Kabat-ovCDR. U drugim realizacijama CDR je Chotia-ev CDR. U drugim realizacijama CDR je kombinacija Kabat-ovih i Chothia-evih CDR (takođe se nazivaju "kombinovam CDR” ili "prošireni CDR”).

Drugim rečima, za bilo koju realizaciju koja sadrži više od jednog CDR, ovi CDR

mogu biti Kabat-ovi, Chothi-evi i/ili kombinovani.

U nekim realizacijama polippetid (kao što je antitelo) sadrži sekvenciju

aminokiselina KASKXaaVXaaTYVS, gde Xaa u položaju 5 predstavlja R W, G, L ili N; i gde Xaa u položaju 7 predstavlja T, A, D, G, R, S; W ili V. U nekim realizacijama sekvencija aminokiselina KASKXaaVXaaTYVS predstavlja CDR1 lakog lanca antitela.

U nekim realizacijama polipeptid (kao što je antitelo) sadrži sekvenciju

aminokiselina XaaXaaSNRYXaa, gde Xaa u položaju 1 predstavlja G ili A; gde Xaa u položaju 2 predstavlja A ili H, i gde Xaa u položaju 7 predstavlja L, T, I ili

S. U nekim realizacijama sekvencija aminokiselina XaaXaaSNRYXaa predstavlja CDR2 lakog lanca antitela.

U nekim realizacijama polipeptid (kao što je antitelo) sadrži sekvenciju

aminokiselina EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG, gde Xaa u položaju 5 predstavlja E, R, K, Q ili N; gde Xaa u položaju 8 predstavlja A, G, N, E, H, S, L, R, C, F, Y, V, D ili P; gde Xaa u položaju 9 predstavlja S, G, T, Y, C, E, L, A, P, I, N, R, V, D ili M, gde Xaa u položaju 12 predstavlja H ili F; i gde Xaa u položaju 15 predstavlja E ili D. U nekim realizacijama sekvencija aminokiselina EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG predstavlja CDR2 teškog lanca antitela.

U nekim realizacijama polipeptid (kao što je antitelo) sadrži sekvenciju

aminokiselina SEQ ID NO:1, gde ostatak aminokiseline u položaju 99 SEQ ID NO: 1 predstavlja L, ili je supstituisan sa A, N, S, T, V ili R; i gde ostatak aminokiseline u položaju 100 u SEQ ID NO: 1 predstavlja A ili je supstituisan sa L, R, S, V, Y, C, G, T, K ili P.

U nekim realizacijama antitelo iz ovog pronalaska predstavlja humano antitelo, U drugim realizacijama antitelo iz ovog pronalaska je humanizovano antitelo. U nekim realizacijama antitelo je monoklonalno. U nekim realizacijama antitelo (ili polipeptid) je izolovano. U nekim realizacijama antitelo (ili polipeptid) u suštini je čisto.

Konstantni region teškog lanca antitela može biti od bilo koje vrste konstantnog regiona, kao što je IgG, IgM, IgD, IgA i IgE; i bilo koja izo-vrsta, kao što je lgG1, lgG2, !gG3 i lgG4.

U nekim realizacijama antitelo sadrži modifikovani konstantni region, kao što je opisan u nastavku.

U drugom aspektu ovaj pronalazak daje polinukleotid (koji se može izolovati) koji sadrži polinukleotid koji kodira fragment ili region antitela G1, ili njegovih varijanti, prikazanih u Tabeli 6. U jednoj realizaciji, fragment je laki lanac antitela G1. U drugoj realizaciji, fragment je teški lanac antitela G1. U još jednoj realizaciji, ovaj fragment sadrži jedan ili više varijabilnih regiona iz lakog lanca i/ili teškog lanca antitela G1. U još jednoj realizaciji, fragment sadrži jedan ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest) regiona koji određuju komplementarnost (CDR) iz lakog lanca i/ili teškog lanca antitela G1.

U drugom aspektu, ovaj pronalazak daje polinukleotid (koji se može izolovati) koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo G1 ili njegove varijante iz Tabele 6. U nekim realizacijama, ovaj polinukleotid sadrži bilo koji ili oba polinukleotida prikazana u SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak daje polinukleotide koji kodiraju bilo koje od ovde opisanih antitela (uključujući fragmente antitela) ili polipeptida.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak daje vektore (uključujući vektore ekspresije i kloniranja) i ćelije domaćina koje sadrže bilo koji od ovde opisanih polinukleotida. U nekim realizacijama vektor je pDb.CGRP.hFcGI, koji ima ATCC

No. PTA.6867. U nekim realizacijama vektor je pEb.CGRP.hKGI, koji ima ATCC No. PTA.6866.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak je ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira bilo koje od ovde opisanih antitela.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak predstavlja kompleks KPPG vezanog za bilo koje ovde opisanih antitela ili polipeptida. U nekim realizacijama antitelo predstavlja antitelo G1 ili njegove varijante, prikazane u Tabeli 6.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak predstavlja farmaceutski preparat koji sadrži efikasnu količinu bilo kog od ovde opisanih polipeptida (uključujući antitela, kao što je antitelo koje sadrži jedan ili više CDR iz antitela G1) ili polinukleotida, i farmaceutski prihvatljiv dodatak.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak predstavlja postupak za generisanje antitela G1, koje sadrži kultivisanu ćeliju domaćina ili njenog potomka, pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela G1, gde ćelija domaćina sadrži vektor ekspresije koji kodira antitelo G1; a u nekim realizacijama i prečišćavanje antitela G1. U nekim realizacijama vektor ekspresije sadrži jedan ili oba polinukleotida čije su sekvencije date kao SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak daje postupak za generisanje bilo kog ovde opisanog antitela ili polipeptida ekspresijom jednog ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo (koje odvojeno može da se ekspresuje kao jedan laki ili teški lanac, ili i kao laki i kao teški lanac ekspresovan iz jednog vektora) ili polipeptida u pogodnoj ćeliji, posle čega obično sledi regenerisanje i/ili izolovanje tog antitela ili polipeptida.

Anti-KPPG antagonističko antitelo i polipeptidi i polinukleotidi koji kodiraju antitela i polipeptide iz ovog pronalaska, mogu se upotrebiti za tretiranje, prevenciju, ublažavanje, kontrolu ili redukovanje pojave bolesti povezane sa abnormalnom funkcijom KPPG, kao što su glavobolja (npr. migrena, klaster glavobolja, hronična glavobolja i tenziona glavobolja) i druga stanja koja se mogu tretirati i preduprediti antagoniziranjem aktivnosti KPPG.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak daje komplete i preparate koji sadrže jedan ili više ovde opisanih preparata. Ovi kompleti, obično u prigodnom pakovanju, daju se sa odgovarajućim uputstvom za uporebu, koje služi za bilo koji od ovde opisanih postupaka.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slika 1 je tabela koja pokazuje afinitete vezivanja 12 mišjih antitela za različite fragmente humanog α-KPPG supstituisanih alaninom. Afiniteti vezivanja su mereni na 25°C, korišćenjem Biacore, proticanjem Fabs preko KPGG na čipu. Oivičene vrednosti predstavljaju gubitak afiniteta alaninskih mutanata u odnosu na fragment roditelja, 25-37 (kurziv), izuzev K35A, koji je izveden iz roditelja 1937, Superskript ”a” označava da afiniteti za fragmente 19-37 i 25-37 predstavljaju srednje vrednosti ± standardnu devijaciju za dva nezavisna merenja na različitim senzorskim čipovima. Superskript ”b” označava da te interakcije odstupaju od prostog modela bimolekulske interakcije, usled dvofaznog odstupanja u brzini, tako da su njihovi afiniteti odrđeni korišćenjem modela konformacione promene. Ključ za skalu šrafura: belo (1,0) pokazuje izvorni afinitet; svetio sivo (manje od 0,5) pokazuje veći afinitet od izvornog; tamno sivo (više od 2) pokazuje niži afinitet od izvornog; i crno, pokazuje da nije opaženo vezivanje.

Slike 2A i 2B pokazuju efekat ordimranja KPPG 8-37 (400 nmol/kg), antitela 4901 (25 mg/kG) i antitela 7D11 (25 mg/kg) na protok krvi kroz kožu, meren kao fluks krvnih zrnaca posle stimulacije električnim pulsem u trajanju 30 s. KPPG 8-37 je ordiniran intravenski (iv) 3-5 min pre stimulacije električnim pulsem Antitela su ordinirana intraperitonealno (IP) 72 h pre stimulacije električnim pulsem. Svaka tačka na grafiku predstavlja PIK(površina ispod krive) jednog pacova, tretiranog pod naznačenim uslovima. Svaka linija na grafiku predstavlja prosečnu PIK pacova tretiranih pod naznačenim uslovima. PIK je jednaka: ΔfluksxΔvreme, gde Δfluks predstavlja promenu jedinica fluksa posle stimulacije električnim pulsem, a Δvreme predstavlja period vremena potreban da se nivo fluksa krvnih zrnaca vrati na nivo pre stimulacije električnim pulsem.

Slika 3 pokazuje efekat ordiniranja različiitih doza antitela 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2, 5 mg/kg ili 1 mg/kg) na protok krvi kroz kožu, meren fluksem krvnih zrnaca posle stimulacije električnim pulsem u trajanju 30 s. Antitiela se ordiniraju intravenozno (IV) 24 h pre stimulacije električnim pulsem Svaka tačka na grafiku predstavlja PIK za jednog pacova, tretiranog pod naznačenim uslovima. Linija na grafiku predstavlja prosečnu PIK za pacove tretirane pod naznačenim uslovima.

Slike 4A i 4B pokazuju efekat ordiniranja antitela 4901 (1 mg/kg ili 10 mg/kg, iv), antitela 7E9 (10 mg/kg, iv) i antitela 8B6 (10 mg/kg, iv) u krvotoku kože, meren kao fluks krvnih zrnaca posle stimulacije električnim pulsem, u trajanju 30 s. Antitela su ordinirana intravenski (iv), posle čega sledi stimulacija električnim pulsem u 30. min, 60. min, 90. min i 120. min posle ordiniranja antitela. Y-osa predstavlja procenat PIK, u poređenju sa veličinom PIK kada antitelo nije ordinirano (vreme 0). X-osa predstavlja vreme (min), period između ordiniranja antitela i stimulacije električnim pulsem. Superskript ''*'' označava P<0,05, a ”**” označava P<0,01, u poređenju sa vremenom 0. Podaci su analizirani korišćenjem jednostrukog ANOVA, sa upotrednim testom Dunnett’s Multiple.

Slika 5 pokazuje sekvenciju aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca (SEQ ID NO: 1) i varijabilnog regiona lakog lanca (SEQ ID NO: 2) antitela G1. Kabat-ove vrednosti CDR su date masnim slovima, a Clothia-eve CDR su podvučene Ostaci aminokiselina za varijabilni region teškog lanca i lakog lanca redom su obeležene brojevima.

Slika 6 pokazuje mapiranje epitopa antitefa G1 pomoću kompeticije peptida, korišćenjem Biacore N-biotinilovani humani α-KPPG je zahvaćen na senzorskom čipu SA. G1 Fab (50 nM) u odsustvu kompetitivnog peptida ili prethodno inkubiran 1 h sa 10 µM kompetitivnim peptidom je tekao preko čipa. Mereno je vezivanje G1 Fab za humani α-KPPG na čipu. Y-osa predstavlja procenat vezivanja blokiran prisustvom kompetitivnog peptida, u poređenju sa vezivanjem u odsustvu kompetitivnog peptida.

Slika 7 pokazuje efekat ordiniranja antitela G1 (1 mg/kg ili 10 mg/kg, iv) ili tečnog nosača (PBS, 0, 01% TWEEN 20) u krvotoku kože, meren kao fluks krvnih zrnaca posle stimulacije električnim pulsem u trajanju 30 s. Antitelo G1 ili tečni nosač je ordinirano intravenski (iv), posle čega sledi stimulacija električnim pulsem u 30. min, 60. min, 90. min i 120. min posle ordiniranja antitela. Y-osa predstavlja procenat PIK, u poređenju sa vrednošću PIK kada nije bilo antitela ili u prisustvu tečnog nosača (definisana kao 100%) (vreme 0) X-osa predstavlja vreme (min), period između ordiniranja antitela i stimulacije električnim pulsem. Superskript ''*'' označava P<0, 05, a ”**” označava P<0, 01, kao poređenje sa tečnim nosačem Podaci au analizirani koristeći dvostruki ANOVA i Bonferroni testove.

Slika 8A pokazuje efekat ordiniranja antitela G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, iv) ili tečnog nosača (PBS, 0, 01 TVVEEN 20) u krvotoku kože mereno kao fluks krvnih zrnaca posle stimulacije električnim pulsem u trajanju od 30 s, 24 h posle doziranja. Antitelo G1 ili tečni nosač su ordinirani intravenski (iv) 24 h pre stimulacije nerva električnim pulsem Y-osa predstavlja ukupnu površinu ispod krive (promena u fluksu krvnih zrnaca pomnožena sa pramenom vremena od stimulacije pa dok se fluks ne vrati na osnovnu vrednost, PIK). X-osa predstavlja promenljive doze antitela G1. Superskript označava P<0, 05, a ”**” označava P<0, 01, u poređenju sa tečnim nosačem Podaci su analizirani korišćenjem jednosmernog ANOVA i Dunn-ovog testa višestrukog poređenja.

Slika 8B pokazuje efekat ordiniranja antitela G1 (0, 3 mg/kg, 1 mg/kg. 3 mg/kg ili 10 mg/kg, iv) ili nosača (PBS, 0, 01 TVVEEN 20) u krvotoku kože mereno kao fluks krvnih zrnaca posle stimulacije električnim pulsem u trajanju od 30 s, 7 dana posle doziranja. Antitelo G1 ili tečni nosač su ordinirani intravenski (iv) 7 dana pre stimulacije nerva električnim pulsem. Y-osa predstavlja ukupnu PIK. X-osa predstavlja promenljive doze antitela G1. Superskript ”*” označava P<0, 01, a ”**” označava P<0, 001, u poređenju sa tečnim nosačem. Podaci su analizirani korišćenjem jednosmernog ANOVA i Dunn-ovog testa višestrukog poređenja.

Slika 8C je fitovana kriva analiziranih podataka sa Slika 8A i 8B. Intravenski su ordinirani antitelo G1 ili tečni nosač ili 24 h ili 7 dana pre električne stimulacije nerva. Y-osa predstavlja ukupnu PIK, a X-osa predstavlja promenljive doze antitela G1 u "mg/kg” na logaritamskoj skali, zbog određivanja EC50.

Slika 9 pokazuje efekat antitela mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS ili tečnog nosača (PBS, 0, 01% TVVEEN 20) na promenu prečnika srednje meningealne arterije, posle stimulacije električnim poljem. Antitelo mu7E9, BIB4096BS i tečni nosač su ordinirani intravenski (iv) u vremenskoj tački 0 min, nakon što je utvrđen odgovor osnovne linije na električnu stimulaciju. Y-osa predstavlja promenu prečnika srednje meningealne arterije posle stimulacije električnim poljem Risetovani parametar odgovara vrednosti 0%. X-osa predstavlja vreme (min) stimulacije električnim pulsem. Superskript ”*” ”*” označava P<0, 05, a ”**” označava P<0, 01, u poređenju sa tečnim nosačem. Podaci su analizirani korišćenjem jednosmernog ANOVA i Dunn-ovog testa višestrukog poređenja.

Slika 10 pokazuje efekat variranja doza antitela G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, iv) ili nosača (PBS, 0, 01% TVVEEN 20) na promenu prečnika srednje meningealne arterije, posle stimulacije električnim poljem. Antitelo G1 ili tečni nosač su ordinirani intravenski 7 dana pre stimulacije električnim poljem. Y-osa predstavlja promenu prečnika srednje meningealne arterije posle stimulacije električnim poljem. X-osa predstavlja napon stimulacije. Superskript ”*” označava 3<0, 05, ”**” označava P<0, 01, a ”***” označava P<0, 001, u poređenju sa tečnim nosačem. Podaci su analizirani korišćenjem dvosmernog ANOVA i Bonferroni-evog naknadnog testa.

Slika 11A pokazuje efekat antitela mu4901 (10 mg/kg) ili tečnog nosača (PBS, 0, 01% TVVEEN 20), ordiniranih intravenski 24 h pre izazvanog smanjenja temperature pupile potkožnom injekcijom naloxone-a (1 mg/kg) kod pacova zavisnika od morfijuma. Y-osa predstavlja razliku temperature u odnosu na osnovnu liniju. X-osa predstavlja vreme mereno od injektiranja naloxone-a.

Slika 11 B pokazuje efekat antitela mu4901 (10 mg/kg) ili tečnog nosača (PBS, 0, 01% TVVEEN 20), ordiniranih intravenski 24 h pre izazvanog smanjenja temperature na površini repa potkožnom injekcijom naloxone-a (1 mg/kg) kod pacova zavisnika od morfijuma. Y-osa predstavlja razliku temperature u odnosu na osnovnu liniju. X-osa predstavlja vreme mereno od injektiranja naloxone-a.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Ovde opisani pronalazak daje postupke za tretiranje i/ili prevenciju vazomotornih simptoma, kao što su glavobolja (npr. migrena, klaster glavobolja, hronična glavobolja i tenziona glavobolja) ili nastupi crvenila i vrućine kod pojedinca, tako što se tom pojedincu ordinira terapeutski efikasna količina anti-KPPG antagonističkog antitela.

Ovde opisani pronalazak daje takođe anti-KPPG antagonistička antitela i polipeptide izvedene iz G1 ili njegovih varijanti, prikazanih u Tabeli 6. Ovaj pronalazak takođe daje postupke za pravljenje i upotrebu tih antitela i polipeptida.

Opšte tehnike

U realzaciji ovog pronalaska će se koristiti, ako se drugačije ne naglasi, konvencionalne tehnike molekularne biologije (uključujući rekombinantne tehnike), mikrobiologije, biologije ćelije, biohemije i imunologije, koje su poznate u stanju tehnike. Ove tehnike su potpuno objašnjene u literaturi, kao što su: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed. (Sambrook et a!., 1989), Cold Spring Harbor Press; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, uredn, 1984); "Methods in Molecular Biology" Humana Press; ”Cell Biology: A Laboratory Notebook” (J. E. Cellis, uredn., 1998) Academic Press; "Animal Cell Culture” (R. l. Freshney, uredn., 1987); "Introduction to Cell and Tissue Culture” (J. P. Mather i P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; ”Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures” (A. Doyle, J. B. Griffiths i D. G. Newell, uredn., 1993-1998) J. Wiley and Sons; "Methods in Enzymology” (Academic Press, Ine. ); "Handbook of Experimental lmmunology” (D. M. Weir i C. C. Blackwell, uredn. ); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller i M. P. Calos, uredn., 1987); "Current Protocois in Molecular Biology” (F M Ausubel et al., uredn., 1987); ”PCR: The Polymerase Chain Reaction” (Mullis et al., uredn., 1994); "Current Protocois in lmmunology" (J. E. Coligan et al., uredn, 1991); "Short Protocois in Molecular Biology” (Wiley and Sons, 1999); ''lmmunology'’ (C. A. Janeway i P. Travers, 1997); ”Antibodies’, (P. Finch, 1997); "Antibodies: A Practical Approach" (D. Catty, uredn., IRL Press, 1988-1989); "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach” (P. Shepherd i C. Dean, uredn., Oxford University Press, 2000); ”Using Antibodies: A Laboratory Manual" (E. Harlow i D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999), "The Antibodies” (M. Zanetti i J. D. Capra, uredn., Harvvood Academic Publishers, 1995).

Definicije

"Antitelo" je molekul imunoglobulina u stanju da se specifično veže za cilj, kao što je ugljenihidrat, polinukleotid, lipid, polipeptid itd., preko najmanje jednog mesta za prepoznavanje antigena, lociranog u varijabilnom regionu molekula imunoglobulina. Kako se ovde koristi, ovaj termin obuhvata ne samo nedirnuta poliklonalna ili monoklonalna antitela, već takođe i njihove fragmente (kao što su Fab, Fab’. F/ab’)2, Fv), jedan lanac (ScFv), njihove mutante, fuzione proteine koji sadrže deo antitela (kao što je domen antitela) i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koja sadrži mesto za prepoznavanje antigena. Antitelo obuhvata antitelo bilo koje klase, kao što je IgG, IgA ili IgM (ili njihove podklase), i antitelo ne treba da bude bilo koje određene vrste Zavisno od sekvencije aminokiselina konstantnog domena teških lanaca antitela, imunoglobulini se mogu svrstati u različite klase. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se može dalje deliti u podklase (izotipovi), npr. lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 i lgA2. Konstantni domeni teškog lanca, koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina, nazivaju se alfa, delta, epsilon, gama i mi, respektivno. Dobro su poznate strukturne podjedinice i trodimenzione konfiguracije različitih klasa imunoglobulina.

Kako se ovde koristi, "monoklonaino antitelo” se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. individualna antitela koja čine populaciju su identična izuzev mogućih mutacija koje se dešavaju u prirodi, a koje mogu biti prisutne u malom iznosu Monoklonalna antitela su visoko specifična i usmerena samo na jedno antigensko mesto. Dalje, suprotno od preparata poliklonalnog antitela, koji tipično sarže različita antitela usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonaino antitelo je usmereno samo na jednu determinantu na antigenu. "Monoklonalni” modifikator ukazuje da je karakter antitela dobijen iz suštinski homogene populacije antitela, a nije protumačen *ako da zahteva dobijanje antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonalna antitela, koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom, mogu se napraviti postupkom hibridoma, koji su prvi opisali Kohler i Milstein, Nature 256, 495 (1975), ili se može dobiti postupcima rekombinantne DNK, kao što je opisano u U. S. Patent No., 4, 816, 567. Monoklonalna antitela se mogu takođe izolovati iz generisanih biblioteka faga, na primer, korišćenjem tehnika koje su opisali McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990).

Kako se ovde koriste, "humanizovana” antitela se odnose na oblike ne-humanih (npr. mišjih) antitela, koja su specifični himerični imunoglobulini, lanci imunoglobulina ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ili druge subsekvencije antitela koje vezuju antigen), a sadrže minimalnu sekvenciju izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. U većem delu, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antiteto recipijent) u kojima su ostaci regiona koji određuje komplementarnost (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR nehumane vrste (antitelo donor), kao što je miš, pacov ili zec, koji imaju željenu specifičnost, afinitet i biološku aktivnost. U nekim slučajevima, ostaci regiona skeleta (RS) humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim ne-humanim ostacima. Pored toga, humanizovano antitelo može da sadrži ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu redpijentu. niti u importovanoj CDR ili sekvencijama skeleta, nego su uključene da bi dalje rafimsali i optimtzovali performanse antitela Obično, humanizovano antitelo će sadržati suštinski čitav najmanje jedan, a tipiično dva, varijabilna domena, u kome svi ili suštinski svi regiom CDR odgovaraju onima iz ne-humanog imunoglobulina, a svi, ili suštinski svi, regioni CDR su oni iz konsenzusne sekvencije humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo optimalno će takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona ili domena (Fc) imunoglobulina, tipično onog iz humanog imunoglobulina. Antitela mogu imati modifikovane Fc regione kao što je opisano u WO 99/58572. Drugi oblici humanizovanih antitela imaju jedan ili više CDR (jedan, dva, tri, četiri, pet, šest) koji se menjaju u odnosu na originalno antitelo, a takođe se nazivaju Jednim ili više CDR "izvedenih iz” jednog ili više CDR originalnog antitela.

Kako se ovde koristi, "humano antitelo” označava antitelo koje ima sekvenciju aminokiselina koja odgovara sekvenciji antitela koje proizvodi humano biće i/ili je napravljeno bilo kojom od tehnika za pravljenje humanih antitela koje su poznate u stanju tehnike, a ovde su opisane. Ova definicija humanog antitela obuhvata antitela koja sadrže najmanje jedan humani teški lanac polipeptida ili najmanje jedan humani laki lanac polipeptida Jedan takav primer je antitelo koje sadrži mišji laki lanac, a humani teški lanac polipeptida Humana antitela se mogu proizvesti korišćenjem raznih tehnika poznatih u stanju tehnike U jednoj realizaciji humano antitelo se bira iz biblioteke faga, pri čemu ta biblioteka faga ekspresuje humana antitela (Vaughan et al, Nature Bio! ogy 14, 309-314 (1966);

Sheets et al., PNAS (USA) 95, 6157-6162 (1998); Hoogenboom and VVinter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)) Humana antitela se mogu takođe napraviti uvođenjem humanog imunoglobulina u transgenska animalna bića, npr. miševe, gde su endogeni geni imunoglobulina delimićno ili potpuno inaktivirani. Ovakav pristup je opisan u U. S. Patent No. 5, 545, 807; 5, 545, 806; 5. 569, 825; 5, 625, 126; 5. 633, 425 i 5, 661, 016. Alternativno, humano antiteio se može dobiti činjenjem humanih B limfocita besmrtnim, koji proizvode antiteio usmereno protiv ciljanog antigena (ovi B limfociti se mogu regenerisati iz nekog pojedinca ili se mogu imunizovati in vitro). Videti, npr., Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy" Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol. 147, 86-95 (1991) i U. S. Patent No. 5, 750, 373.

Kako se ovde koristi, termin "kalcitonin, peptid povezan sa genom” ili "KPPG”, se odnosi na bilo koji oblik kalcitonina, peptida povezanog sa genom i njegove varijante, koji zadržavaju najmanje jedan deo aktivnosti KPPG. Na primer, KPPG može biti α-KPPG ili p-KPPG. Kako se ovde koristi, KPPG obuhvata sve vrste sisara sa nativnom sekvencijom KPPG, npr. humani, pseći, mačji, konjski i goveđi.

Kako se ovde koristi, ”anti-KPPG antagonističko antiteio” (naizmenično se naziva ”anti-KPPG antiteio”) odnosi se na antiteio koje je u stanju da se vezuje za KPPG i inhibira biološku aktivnost KPPG i/ili silazne puteve posredovane sa signalizacijom KPPG. Anti-KPPG antagonističko antiteio obuhvata antitela koja blokiraju, antagonizuju, suzbijaju ili smanjuju (uključujućii značajno) biološku aktivnost KPPG, uključujući silazne puteve posredovane sa signalizacijom KPPG, kao što je vezivanje receptora i/ili izazivanje ćelijskog odgovora na KPPG. Za potrebe ovog pronalaska, izričito se podrazumeva da termin "anti-KPPG antagonističko antiteio” obuhvata sve ranije pomenute termine, naslove i funkcionalna stanja i karakteristike, pri čemu je KPPG sam po sebi, biološka aktivnost KPPG (uključujući, ali bez ograničavanja, njegovu sposobnost da posreduje u bilo kom aspektu glvobolje) ili posledice te biološke aktivnosti su suštinski poništene, umanjene ili neutralisane u bilo kom razumnom stepenu. U nekoj realizaciji, anti-KPPG antagonističko antitelo vezuje KPPG i sprečava da se KPPG vezuje za receptor KPPG. U drugim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo vezuje KPPG i sprečava aktiviranje receptora KPPG, Primeri anti-KPPG antagonističkih antitela su dati ovde.

Kako se ovde navode, termini "G1” i "antitelo G1” koriste se naizmenično, a odnose se na antitelo proizvedeno ekspresijom vektora koji imaju deponovane brojeve ATCC PTA-6867 i ATCC PTA-6866. Varijabilni regioni sekvencije aminokiselina teškog lanca i lakog lanca su prikazani na Slici 5. Delovi CDR antitela G1 (uključujući CDR Chotia-e i Kabat-a) predstavljeni su dijagramom na Slici 5. Polinukleotidi koji kodiraju varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca prikazani su sa SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10. Karakterizacija G1 je prikazana u Primerima

Termini "polipeptid”, "oligopeptid", "peptid" i "protein" koriste se ovde naizmenično, a odnose se na polimere aminokiselina bilo koje dužine. Taj polimer može biti linearan ili račvast, može da sadrži modifikovane aminokiseline i može biti prekidan ne-aminokiselinama. Ovi termini obuhvataju takođe polimer aminokiselina koji je modifikovan prirodno ili intervencijom, na primer, stvaranjem disulfidne veze, glikozilovanjem, lipidovanjem. acetilovanjem, fosforilovanjem ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao što je konjugovanje sa komponentom za obeležavanje. Takođe, ovom definicijom su obuhvaćeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiselina (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline itd. ), kao i druge modifikacije poznate u stanju tehnike. Podrazumeva se da, pošto su polipeptidi iz ovog pronalaska zasnovani na nekom antitelu, peptidi mogu da se javljaju kao jedinstveni lanci ili združeni lanci.

"Polinukleotid" ili "nukleinska kiselina” koriste se ovde naizmenično, a odnose se na polimere nukleotida bilo koje dužine, a obuhvataju DNK i RNK. Ovi nukleotidi mogu biti deoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze i/ili njihovi analozi, ili bilo koji substrat koji se može ugraditi u polimer pomoću DNK ili RNK polimeraze Polinukleotid može sadržati modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi Ukoliko je prisutna, modifikacija strukture nukleotida može da se saopšti pre ili posle sklapanja polimera. Sekvencija nukleotida može da bude prekinuta ne-nukleotidnim komponentama. Polinukleotid može biti još modifikovan, posle polimerizacije, kao što je konjugovanje sa komponentom za obeležavanje. Druge vrste modifikacija su, na primer, supstitucije "caps" jednog ili više nukleotida koji se javljaju u prirodi sa nekim analogom, internukleotidnim modifikacijama, kao što su na primer, one sa nenaelektrisanim vezama (npr. fosforotioati, fosforoditioati, itd. ), one koje sadrže viseće ostatke, kao što su na primer proteini (npr. nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, ply-L-lizin, itd. ), one sa interkalatorima (npr. akridin, psoralen, itd. ), one koje sadrže helatore (npr. metali, radioaktivni metali, bor, metali podložni oksidaciji, itd. ), one koji sadrže alkilatore, one sa imodifikovanim vezama (npr. alfa-anomerne nukleinske kiseline, itd. ), kao i nemodifikovane oblike jednog ili više polinukleotida. Dalje, bilo koja hidroksilna grupa, obično prisutna u šećerima, može se zameniti sa, na primer, fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, zaštićena sa standardnim zaštitnim grupama ili aktivirana za dobijanje dodatnih veza sa dodatnim nukleotidima. ili se mogu konjugovati na čvrste nosače. Terminalna OH grupa u položajima 5’ i 3’ se može fosforilovati, ili supstituisati sa aminima ili ostacima organskih pokrivnih grupa, sa od 1 do 20 atoma ugljenika. Druge hidroksilne grupe se mogu takođe derivatizovati u standardne zaštitne grupe. Polinukleotidi mogu takođe sadržati analogne oblike šećera riboze ili deoksiriboze, koji su obično poznati u stanju tehnike, uključujući, na primer, 2’-Q-metil-, 2-O-alil, 2’-fluoro- ili 2’-azido-ribozu, anaioge karboksilnih šećera. D-anomerne šećere, epimerne šećere, kao što je arabinoza, ksiloza ili liksoza, piranozne šećere, furanozne šećere, sedoheptuloze, aciklične anaioge i abazne anaioge nukleozida, kao što je metilribozid Jedna ili više fosfodiestarskih veza se može zameniti alternativnim veznim grupama. Ove alternativne vezne grupe su, ali bez ograničavanja, realizacije gde je fosfat zamenjen sa P(Q)S ("tioat"), P(S)S ("ditioat"), (0)NR2 ("amidat”), P(0)R, P(0)OR\ CO i CH2 ("formacetal"), gde svaki R ili R’, nezavisno, predstavlja H ili supstituisani ili nesupstituisani alkil (1-20 C), koji opciono sadrži etarsku vezu (-0-), aril alkenil, cikloalkil, cikioalkenil ili araidil Ne treba da sve veze u polinukleotidu budu identične. Prethodni opis važi za sve polinukleotide koji se ovde navode, uključujući RNK i DNK.

"Varijabilni region” antitela se odnosi na varijabilni region lakog lanca antitela ili na varijabilni region teškog lanca antitela, bilo pojedinačno ili u kombinaciji. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca mogu da se sastoje od četiri skeletna regiona (SR), povezna sa tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poznata kao hipervarijabilni regioni. CDR-i u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini pomoću odgovarajućih SR, a sa CDR-ima iz drugog lanca doprinose stvaranju mesta vezivanja antigena na antitelima. Postoje najmanje dve tehnike za određivanje CDR. (1) pristup zasnovan na varijabilnosti sekvencije umreženih vrsta (tj. Kabat et al, ”Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th ed., National Institute of Helath, Bethesda MD, 1991); i (2) pristup zasnovan na kristalografskim ispitivanjima kompleksa antigen-antitelo (Al-lazikani et al., J. Molec. Biol. 273, 927-948 (1997)). Kako se ovde koristi, CDR se može odnositi na sve CDR definisane bilo kojim pristupom, ili na kombinaciju oba pristupa.

"Konstantni region" antitela se odnosi na konstantni region lakog lanca antitela ili na konstantni region teškog lanca antitela, bilo pojedinačno ili u kombinaciji.

Epitop koji se "preferencijalno vezuje” ili "specifično vezuje” (koriste se ovde naizmenično) za antitelo ili polipeptid, predstavlja termin koji se dobro razume u stanju tehnike, a postupci za određivanje tog specifičnog ili preferentnog vezivanja takođe su dobro poznati u stanju tehnike. Za molekul se kaže da pokazuje "specifično vezivanje" ili "preferentno vezivanje", ako reaguje ili se udružuje češće, ili mnogo brže i uz duže trajanje i/ili sa većim afinitetom, sa određenom ćelijom ili supstancom, nego sa alternativnim ćelijama ili supstancama. Antitelo se "specifično vezuje" ili "preferentno vezuje" za cilj ako se vezuje sa većim afinitetom, žudnjom i/ili dužim trajanjem, nego kad se vezuje za druge supstance. Na primer, antitelo koje se specifično ili preferentno vezuje za KPPG epitop je antitelo koje vezuje taj epitop sa većim afinitetom, žudnjom, lakše i/ili sa dužim trajanjem nego što se vezuje za druge KPPG epitope ili ne-KPPG epitope. Podrazumeva se takođe, da se interpretacijom ove definicije, na primer, antitelo (ili deo ili epitop) koji se specifično ili preferentno vezuje za prvi cilj, može ali ne mora se specifično ili preferentno vezivati za drugi cilj. Kao takvo, "specifično vezivanje" ili "preferentno vezivanje” nije neophodno da zahteva (mada može da uključuje) eksluzivno vezivanje. Obično, ali ne i neophodno, pozivanje na vezivanje označava preferentno vezivanje.

Kako se ovde koristi "suštinski čisto" odnosi se na materijal koji je najmanje 50% čist (tj. bez kontaminanata), poželjnije najmanje 90% čist, još poželjnije najmanje 95% čist, pa još poželjnije 98% čist i najpoželjnije najmanje 99% čist.

"Ćelija domaćina” je pojedinačna ćelija ili kultura ćelija koje mogu biti ili su bile recipijent za vektor(e) za ugradnju polinukleotidnih inserata. Ćelije domaćina su potomci jedne ćelije domaćina, a potomstvo ne mora neophodno biti potpuno identično (po morfologiji ili genomskom DNK komplementu) originalnoj roditeljskoj ćeliji, usled prirodnih, slučajnih ili promišljenih mutacija. Ćelija domaćina obuhvata ćelije transfidrane in vivo sa jednim ili više polinukleotida iz ovog pronalaska.

Termin ”Fc region" koristi se za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina. ”Fc region” može biti nativna sekvencija Fc regiona ili varijanta Fc regiona. Mada granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu da variraju, Fc region humanog teškog lanca IgG se obično definiše da se proteže od ostatka aminokisetina u položaju Cys226, ili od Pro230, pa do njegovog karboksilog terminala. Numeracija ostataka u Fc regionu je ona iz EU index, kao i kod Kabat-a. Kabai et al.t ”Sequences of Proteins of Immunologicai Interesf, 5th ed. Public Health Service. National Institutes of Health. Bethesda, MD, 1991. Fc region imunoglobulina obično sadrži dva konstantna domena. CH2 i CH3.

Kako se ovde koristi, termin ”Fc receptor" i "FcR" opisuje receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjan FcR je nativna sekvencija humanog FcR. Pored toga, poželjan FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i obuhvata receptore za podklase FcyRI, FcyRII i FcyRill, uključujući varijante alela i alternativno spojene oblike ovih receptora. Receptori FcyRII obuhvataju FcyRIIA ("aktivirajući receptor") i FcyRIIB ("inhibirajući receptor”), koji imaju slične sekvencije aminokiselina, a koje se razlikuju primarno u njihovim citoplazmičnim domenima. Razni FcR su pregledno dati u Ravetch i Kinet. Ann. Rev. Immunol. 9, 457-92 (1991); Capel et al. Immunomethods 4, 25-34 (1994); i de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126. 330-41 (1995), "FcR" takođe obuhvata neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za transfer majčinog IgGs u fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117. 587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24, 249 (1994).

"Citotoksičnost zavisna od komplementa” i "CZK" odnose se na lizovanje cilja u prisustvu komplementa. Put aktiviranja komplementa počinje sa vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za molekul (npr. antitelo) kompleksiran sa srodnim antigenom. Da bi se došlo do aktiviranja komplementa, može se obaviti test CZK. npr. onaj koji je opisan u Gazzano-Santoro et al., J. Immunol Methods 202, 163 (1996).

"Funkcionalni Fc region” poseduje najmanje jednu efektorsku funkciju nativne sekvencije Fc regiona. Primer "efektorskih funkcija" su vezivanje C1q; citotoksičnost zavisna od komplementa (CZK); vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela; fagocitoza; podregulacija receptora površine ćelije (npr. receptor B ćelije) itd. Ove efektorske funkcije obično zahtevaju da se Fc region kombinuje sa domenom vezivanja (npr.

varijabilni domen antitela) i mogu se testirati korišćenjem raznih testova poznatih u stanju tehnike za vrednovanje tih efektorskih funkcija antitela.

"Nativna sekvencija Fc regiona" sadrži sekvenciju aminokiselina identičnu sekvenciji aminokiselina Fc regiona u prirodi. ’Varijantni Fc region” sadrži sekvenciju aminokiselina koja se razlikuje od nativne sekvencije Fc regiona po tome što ima najmanje jednu modifikaciju aminokiseline, a ipak zadržava najmanje jednu efektorsku funkciju nativne sekvencije Fc regiona. Poželjno je da varijantni Fc region ima najmanje jednu supstituciju aminokiseline, u poređenju sa nativnom sekvencijom Fc regiona ili Fc regiona roditeljskog polipeptida. npr. od oko jedan do oko deset supstitucija aminokiselina i poželjno od oko jedan do oko pet supstitucija aminokiselina u nativnoj sekvenciji Fc regiona ili Fc regiona roditeljskog polipeptida. Varijantni Fc region poželjno je da poseduje najmanje oko 80% identičnosti sekvencije sa nativnom sekvencijom Fc regiona i/ili Fc regiona roditeljskog polipeptida, poželjnije najmanje oko 90% identičnosti sekvencije, još poželjnije najmanje oko 90%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% identičnosti sekvencije sa istima.

Kako se ovde koristi "ćehjski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela" ”ĆPCZA” se odnosi na ćelijski posredovanu reakciju u kojoj nespecifične citotoksične ćelije, koje ekspresuju Fc receptore (FcR) (npr. prirodne ćelije ubice, neutrofili i makrofage) prepoznaju vezano telo na ciljanoj ćeliji i zatim izazivaju ližu ciljane ćelije Aktivnost ĆPCZA posmatranog molekula se može testirati korišćenjem in vitro testa ĆPCZA, kao što je onaj opisan u U.S. Patent No. 5,500,362 ili 5.821,337. Korisne efektorske ćelije za te testove su mononuklearne ćelije iz perifernog krvotoka i prirodne ćelije ubice. Alternativno, ili dodatno, aktivnost ĆPCZA posmatranog molekula se može testirati in vivo, npr. na animalnom modelu, kao što je onaj opisan u Clynes et al., PNAS (USA) 95, 652656 (1998).

Kako se ovde koristi "tretman'' je pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. Za potrebe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati su, ali bez ograničavanja, jedan ili više od sledećih: poboljšanje glavobolje u bilo kom aspektu, uključujući smanjenje žestine, ublaženje intenziteta bola i drigih povezanih simptoma, smanjenje frekvencije recidiva glavobolje, porast kvaliteta života onih koji pate od glavobolje i smanjenje doze drugih medikamenata korišćenih za tretiranje glavobolje. Kod migrene, drugi povezani simptomi su, ali bez ograničavanja, mučnina, povraćanje i oseltjivost na svetlost, zvuk i/ili pokret Kod klaster glavobolje, drugi povezani simptomi su, ali bez ograničavanja otok ispod ili oko očiju, pojačano suzenje, crvenilo očiju, rinoreja ili nazalna kongestija i crvenilo lica.

"Smanjenje pojave” glavobolje znači bilo kakvo smanjenje žestine (koje može da uključi smanjenje potrebe za i/ili količine (npr. izlaganje istim) drugih lekova i/ili terapija korišćenih za to stanje, uključujući na primer, za migrenu ergotamine, dihydroergotamine, ili triptans), trajanje i/ili frekvenciju (uključujući na primer, odlaganje ili povećanje vremena do sledečeg napada kod pojedinca). Oni koji su verzirani u stanje tehnike znaju da pojedinci variraju u pogledu njihovog odgovora na tretman i da na primer, "postupak za smanjenje pojave glavobolje kod pojedinca" predstavlja ordimranje anti-KPPG antagonističkog antitela zasnovano na razumnom očekivanju da će to ordiniranje verovatno izazvati smanjenje pojave glavobolje kod posmatranog pojedinca.

"Ublažavanje'1 glavobolje ili jednog ili više simptoma glavobolje znači umanjenje ili poboljšanje jednog ili više simptoma glavobolje, u poređenju sa slučajem kada se ne ordinira anti-KPPG antagonističke antiteio. '‘Ublažavanje" takođe obuhvata skraćenje ili smanjenje trajanja simptoma.

Kako se ovde koristi "kontrolisanje glavobolje" se odnosi na održavanje ili smanjenje žestine ili trajanja jednog ili više simptoma glavobolje ili frekvencije napada glavobolje kod pojedinca (u poređenju sa stanjem pre tretmana). Na primer, trajanje ili žestina bola u glavi, ili frekvencija napada se smanjuje najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ili 70%, u poređenju sa istim pre tretmana.

Kako se ovde koristi, "odlaganje" razvoja glavobolje znači da bolesti popusti, da se spreči, uspori, odloži, stabilizuje i/ili odloži njeno napredovanje. Ovo odlaganje može biti promenijive dužine vremena, zavisno od istorije bolesti i/ili pojedinca koji se tretira. Onome ko je verziran u stanje tehnike je jasno da dovoljno ili značajno odlaganje može ustvari da obuhvati prevenciju, na taj način da se pojedincu ne razvije glavobolja (npr. migrena). Postupak koji "odlaže" razvoj simptoma je postupak koji smanjuje verovatnoću razvoja simptoma u datom vremenu i/ili smanjuje domašaj simptoma u datom vremenskom okviru, u poređenju sa vremnom kada postupak nije korišćen.

"Razvoj” ili "napredovanje” glavobolje znači početne manifestacije i/ili nastanak napredovanja poremećaja. Za potrebe ovog pronalaska razvoj ili napredovanje se odnosi na biološki tok simptoma. "Razvoj” obuhvata dešavanje, ponovno javljanje i početak. Kako se ovde koristi "početak” ili "dešavanje” glavobolje obuhvataju inicijalni početak i/ili ponovno javljanje.

Kako se ovde koristi, "efikasna doza" ili "efikasna količina" leka, jedinjenja ili farmaceutskog preparata je količina koja je dovoljna da ostvari korisne ili željene rezultate U profilaktičkoj upotrebi, korisni ili željeni rezultati su rezultati kao što su eleiminisanje ili smanjenje rizika, slabljenje žestine, ili odlaganje početka bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihejvioralne simptome bolesti, njene komplikacije i intermedijarne patološke fenotipove prisutne tokom razvoja bolesti. Za terapeutsko korišćenje, korisni ili željeni rezultati su klinički rezultati, kao što su smanjenje intenziteta bola, trajanje, ili frekvencija napada glavobolje i smanjenje jednog ili više simptoma koji proističu iz glavobolje (biohemijski, histološki i/ili bihejvioralni), uključujući njene komplikacije i intermedijarne patološke fenotipove prisutne tokom razvoja bolesti, povećanje kvaliteta života

onih koji pate od bofesti, smanjenje doze drugih medikamenata potrebnih za tretiranje bofesti, poboljšani efekat drugih medikamenata i/ili odlaganje napredovanja bolesti kod posmatranog pacijenta. Efikasna doza se može ordinirati u jednom ili više ordiniranja. Za svrhe ovog pronalaska, efikasna doza leka, jedinjenja ili farmaceutskog preparata je količina koja je dovoljna da se sprovede profilaktički ili terapeutski tretman, direktno ili indirektno. U kiiničkom kontekstu podrazumeva se da se efikasna doza leka, jedinjenja ili farmaceutskog preparata može ili ne mora postići zajedno sa drugim lekom, jedinjenjem ili farmaceutskim preparatom. Dakle, "efikasna doza" se može posmatrati u kontekstu ordiniranja jednog ili više terapeutskih agenasa, a pojedinačni agens se može posmatrati tako kao da se daje u efikasnoj količini, ako se, zajedno sa jednim ili više drugih agenasa, željeni rezultat može postići.

"Pojedinac" ili "subjekt” je sisar, poželjnije humano biće. Sisari obuhvataju takođe, ali bez ograničavanja, seosku stoku, sportske životinje, kućne ljubimce, primate, konje, pse, mačke, miševe i pacove.

Kako se ovde koristi, "vektor'’ označava konstrukt koji je u stanju da oslobađa i poželjno ekspresuje jedan ili više gena ili posmatranih sekvencija u ćeliji domaćina. Primeri vektora su, ali bez ograničavanja, virusni vektori, vektori ekspresije ogoljene DNK ili RNK, vektori plazmida, kozmida ili fage, vektori ekspresije DNK ili RNK povezani sa katjonskim agensima za kondenzovanje, vektori ekspresije DNK ili RNK enkapsulirani u fipozomima i neke eukariotske ćelije, kao što su ćelije proizvođači.

Kako se ovde koristi, "sekvencija kontrole ekspresije” označava sekvenciju nukleinske kiseline koja upravlja transkripcijom nukleinske kiseline, Sekvencija kontrole ekspresije može biti promoter, kao što je konstitutivni ili induktibilm promoter, ili poboljšivač. Sekvencija kontrole ekspresije je operabilno povezana sa sekvencijom nukleinske kiseline koja treba da se transkribuje.

Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač” ili "farmaceutski prihvatljiv dodatak" označava bilo koji materijal koji, kada se kombinuje sa aktivnim sastojkom, dozvoljava aktivnom sastojku da zadrži njegovu biološku aktivnost, a da ne reaguje sa imuno sistemom subjekta. Primeri su, ali bez ograničavanja, bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača, kao što je rastvor slanog fosfatnog pufera, voda, emulzije, kao što je emulzija ulje/voda i razne vrste agenasa za kvašenje. Poželjni razblaživači za aerosol ili parenteralno ordiniranje su slani fosfatni pufer ili normalni rastvor soli (0, 9%). Preparati koji sadrže ovakve nosače se formulišu dobro poznatim konvencionalnim postupcima (viđeti, na primer, "Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 18th, edition. A. Genaro uredu., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; i Remington, "The Science and Practice of Pharmacy", 20th. edition, Mack Publishing, 2000).

Oznaka ”kon”, kako se ovde koristi, odnosi se konstantu brzine asocijacije antitela sa antigenom.

Oznaka ”k0ff”, kako se ovde koristi, odnosi se konstantu brzine disocijacije antitela iz kompleksa antitelo/antigen.

Oznaka "Kd”, kako se ovde koristi, odnosi se konstantu ravnoteže disocijacije interakcije antitelo/antigen.

Kako se ovde koristi, termin "vazomotorni simptom"’, odnosi se na stanja povezana sa vazodilatacijom, a obuhvata, ali bez ograničavanja, glavobolju (kao što je migrena, i druge), nastupe crvenila i vrućine (ili valunge), hladne nastupe crvenila, nesanicu, poremećaje sna, poremećaje raspoloženja, razdražljivost, pojačano znojenje, noćna znojenja, dnevna znojenja, zamor i slično, izazvana, između ostalog, disfunkcijom termoregulacije.

Kako se ovde koriste, termini "crvenjenje”, "nastupi crvenila i vrućine" se u struci prepoznaju po tome što se odnose na apizodne smetnje u telesnoj temperaturi, a sastoje se tipično od iznenadnog crvenila kože i vrućine, koje obično prati zojenje subjekta.

Postupci za prevenciju ili tretman vazomotornih simptoma U jednom aspektu ovaj pronalazak daje postupak za tretman ili prevenciju najmanje jednog vazomotornog simptoma, kao što su glavobolja (npr migrena) ili nastupi crvenila i vrućine kod pojedinca, koji se sastoji od ordiniranja tom pojedincu efikasne količine nekog anti-KPPG antagmističkog antitela ili polipeptida izvedenog iz tog antitela.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak daje postupak za ublažavanje, kontrolu, smanjenje javljanja ili odlaganje razvoja ili napredovanja najmanje jednog od vazomotornih simptoma, kao što su glavobolja (npr. migrena) ili nastupi crvenila i vrućine kod pojedinca, koji se sastoji od ordiniranja tom pojedincu efikasne količine nekog anti-KPPG antagmističkog antitela

U sledećem aspektu ovaj pronalazak daje postupak za ublažavanje, kontrolu, smanjenje javljanja ili odlaganje razvoja ili napredovanja najmanje jednog od vazomotornih simptoma, kao što su glavobolja (npr. migrena) ili nastupi crvenila i vrućine kod pojedinca, koji se sastoji od ordiniranja tom pojedincu efikasne količine nekog anti-KPPG antaginističkog antitela u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim agensom korisnim za tretiranje glavobolje.

Ti dodatni agensi su, ali bez ograničavanja. 5-HT agonisti i NSAID-i. Na primer, antitelo i najmanje jedan dodatni agens se mogu ordinirati uporedno, tj. mogu se davati u dovoljno bliskom vremenskom razmaku da se dozvoli preklapanje njihovih pojedinačnih terapeutskih efekata Na primer, količina 5-HT agonista ili NSAID ordinirana u kombinaciji sa anti-KPPG antitelom treba da je dovoljna da se smanji frekvencija recidiva glavobolje kod pacijenta ili da izazove dugotrajniju efikasnost, u poređenju sa ordiniranjem bilo kog od ovih agenasa u odsustvu drugih. Ova procedura se može koristiti za tretiranje glavobolja koje spadaju u bilo koju od raznih klasa, uključujući migrenu sa ili bez aure, hemiplegičnu migrenu, klaster glavobolje, migrensku neuralgiju, hronične glavobolje, tenzione glavobolje, glavobolje koje potiču iz drugih medicinskih stanja (kao što je infekcija ili povišeni pritisak u lobanji usled tumora), hronična paroksimalna hemikranija, razne glavobolje koje nisu povezane sa strukturnim lezijama, glavobolje povezane sa ne-vaskularnim intrakranijalnim poremećajem, glavobolje povezane sa ordiniranjem neke supstance ili sa apstinencijom od iste, glavobolje povezane sa noncefalnom infekcijom, glavobolje povezane sa metaboličkim poremećajem, glavobolje povezane sa poremećajem kranijuma, vrata, očiju, ušiju, nosa, sinusa, zuba, usta ili drugih facijalnih ili kranijafnih struktura, kranijalne neuralgije i bol torakalnih nerava i bol usled kidanja nerva.

Oni koji su verzirani u stanje tehnike u stanju su da odrede odgovarajuće količine za doziranje agenasa koji treba da se koriste u kombinaciji sa anti-KPPG antitelom Na primer, sumatriptan se može ordinirati sa dozom od oko 0, 01 do oko 300 mg. Kada se ordinira ne-parenteralno, tipična doza sumatriptana je od oko 25 do oko 100 mg, stim što je oko 50 mg opše poželjno, a kada se ordinira parenteralno, poželjna doza je oko 6 mg. Međutim, ove doze mogu da se menjaju, u skladu sa standardnim metodama u stanju tehnike, tako da se optimizuju za posmatranog pacijenta ili za posmatranu kombinaciju terapije Dalje, na primer, celecoxib se može ordinirati u količini između 50 i 500 mg.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje postupke za ublažavanje, kontrolu, smanjenje javljanja ili odlaganje razvoja ili napredovanja nastupa crvenila i vrućine kod pojedinca, koji se sastoji od ordiniranja tom pojedincu efikasne količine nekog anti-KPPG antaginističkog antitela u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim agensom korisnim za tretiranje nastupa crvenila i vrućine. Ovi dodatni agensi su, ali bez ograničavanja, tretmani na bazi hormona, uključujući estrogene i/ili neke progestine.

S obzirom na sve ovde opisane postupke, pozivanje na anti-KPPG antagonistička antitela obuhvata takođe preparate koji sadrže jedan ili više ovih agenasa. Ovi preparati mogu još da sadrže pogodne dodatke, kao što su farmaceutski prihvatljivi dodaci, uključujući pufere, dobro poznate u stanju tehnike. Ovaj pronalazak može da se koristi sam ili u kombinaciji sa drugim konvencionalnim postupcima tretmana.

Anti-KPPG antagonističke antitelo se može ordinirati pojedincu bilo kojim pogodnim putem Osobi verziranoj u stanje tehnike treba da je jasno da ovde opisani primeri nemaju nameru da ograniče, već da budu ilustracija raspoloživih tehnika. U skladu sa tim, u nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo se ordinira pojedincu u skladu sa poznatim postupcima, kao što je intravensko ordiniranje, npr. kao bolus, ili kao kontinuaina infuzija tokom nekog vremena, mtramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, subkutano, intra-artikulamo, sublingvalno, intrasinovijalno, insuflacijom, mtratekalno, oralno, inhalacijom ili površinskim putevima. Ordiniranje može biti sistemsko, npr. intravensko ordiniranje, ili lokalizovano Komercijalno dostupni nebulizatori za tečne formulacije, uključujući mlazne nebulizatore i ultrazvučne nebulizatore, svi se mogu koristiti za ordiiranje Tečne formulacije se mogu direktno nebulizovati, a liofilizovani prah se može nebulizovati posle rekonstituisanja. Alternativno, anti-KPPG antagonističko antitelo se može raspršivati, korišćenjem fluorougljeničnih formulacija i inhalatora sa meračem doze, ili se mhalirati kao liofilizovani i mleveni prah.

U jednoj realizaciji anti-KPPG antagonističko antitelo se ordinira tehnikama oslobađanja na specifične ili ciljane lokacije Primeri tehnika oslobađanja na specifične ili ciljane lokacije su razni depo izvori anti-KPPG antagonističkog antitela koji se mogu implantirati, ili kateteri za lokalno oslobađanje, kao što su kateteri za infuziju, kateteri koji se otvaraju na licu mesta, ili igle-kateteri, sintetski graftovi, adventivni zavoji, šantovi i stentovi ili drugi uređaji za implantaciju, nosači na specifičnu lokaciju, direktno injektiranje ili direktna primena. Videti. npr. PCT Publication No. WO 00/53211 i U. S. Patent No. 5, 981, 563.

Za ordiniranje mogu se koristiti razne formulacije anti-KPPG antagonističkog antitela. U nekim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo se može ordinirati čisto. U nekim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo i farmaceutski prihvatljiv dodatak mogu biti u različitim formulacijama. Farmaceutski prihvatljivi dodaci su poznati u stanju tehnike, i to su relativno inertne supstance koje olakšavaju ordiniranje farmakološki efikasne supstance. Na primer, dodatak može dati oblik ili konzistenciju, ili delovati kao razblaživač. Pogodni dodaci su, ali bez ograničavanja, agensi za stabilizaciju, agensi za vlaženje i emulgovanje, soli za variranje osmotskog pritiska, agensi za kapsuliranje, puferi, poboljšivači penetracije kroz kožu. Dodaci, kao i formulacije za parenteralno i ne-parenteralno oslobađanje leka navedni su u Remington, "Science and Practice of Pharmacy1', 20th ed., Mack Publishing (2000)

U nekim realizacijama ovi agensi se formulišu za ordiniranje injekcijama (np intraperitonealno, mtravenski, subkutano, intramuskularno. itd. ). U skladu sa tim, ovi agensi se mogu kombinovati sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, kao što su rastvor soli, Ringer-ov rastvor, rastvor dekstroze i slično. Određeni režim doziranja, tj. doza, vreme i ponavljanje, zavisiće od posmatranog pojedinca i medicinkse istorije tog pojedinca.

Anti-KPPG antagonističko antitelo se može ordinirati korišćenjem bilo kog pogodnog postupka, uključujući injekcije (npr. intraperitonealno, intravenskl, subkutano, intramuskularno itd. ). Anti KPPG antitela se mogu takođe ordinirati inhalacijom, kao što je ovde opisano. Obično, za ordiniranje anti-KPPG antitela, početna doza je oko 2 mg/kg. Za potrebe ovog pronalaska tipična dnevna doza može da se kreće u osegu bilo koga od oko 3 gg/kg do 30 pg/kg do 300 pg/kg do 3 mg/kg, do 30 mg/kg do 100 mg/kg ili više, zavisno od gore pomenutih faktora Na primer, može da se koristi doza od oko 1 mg/kg, oko 2, 5 mg/kg, oko 5 mg/kg.

oko 10 mg/kg i oko 25 mg/kg. Za ponovljeno ordiniranje, tokom nekoliko dana ili duže, zavisno od stanja, tretman se zadržava sve dok se ne ostvari suzbijanje simptoma, ili dok se ne postignu povoljni terapeutski rezultati, na primer, da se smanji bol. Režimi doziranja na primer, sastoje se od ordimranja inicijalne doze od oko 2 mg/kg, a zatim sledi tokom nedelju dana zadržavanje doze od oko 1 mg/kg anti-KPPG antitela, ili sledi zadržavanje doze od oko 1 mg/kg tokom svake druge nedelje. Međutim, korisni mogu biti i drugi režimi doziranja, zavisno od sheme farmakokinetičkog razlaganja, koje ordinirajući lekar želi da ostvari. Na primer, u nekim realizacijama podrazumeva se doziranje od jedan do četiri puta nedeljno. Režimi doziranja (uključujući i korišćeni KPPG antagonist) mogu da se menjaju sa vremenom.

Za potrebe ovog pronalaska, odgovarajuća doza anti-KPPG antagonističkog antitela će zavisiti od upotrebljenog anti-KPPG antagonističkog tela (ili njegovog preparata), vrste i žestine glavobolje (npr, migrene) koja treba da se tretira, zatim da li se agens ordinira u preventivne ili terapeutske svrhe, od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na agens, kao i od diskretnih zahteva ordinirajućeg lekara. Tipično, lekar će ordinirati anti-KPPG antagonističko antitelo dok se ne dostigne doza kojom se postiže željeni rezultat. Doza i/ili frekvencija može varirati tokom tretmana.

Empirijska razmatranja, kao što je polu-vreme, obično doprinose određivanju doze. Na primer, antitela koja su kompatibilna sa humanim imuno sistemom, kao što su humanizovana antitela ili kompletno humana antitela, mogu se koristiti za produženje polu-vremena antitela i za sprečavanje da antitelo bude napadnuto imuno sistemom domaćina. Frekvencija ordiniranja se može određivati i podešavati tokom trajanja terapije, a obično, ali ne i neophodno, je zasnovana na tretmanu i/ili suzbijanju i/ili ublažavanju i/ili odlaganju glavobolje (npr. migrene). Alternativno, može da odgovara i kontinualno uzdržano oslobađanje formulacije anti-KPPG antagonističkog antitela. U stanju tehnike su poznate različite formulacije i uređaji za postizanje uzdržanog oslobađanja

U jednoj realizaciji doziranje anti-KPPG antagonističkog antitela se može odrediti empirijski kod pojedinaca kojima je davana jedna ili više ordinacija anti-KPPG antagonističkog antitela. Pojedincima se daju inkrementalne doze anti-KPPG antagonističkog antitela. Da bi se proverila efikasnost anti-KPPG antagonističkog antitela, može se slediti neki indikator bolesti.

Ordiniranje anti-KPPG antagonističkog antitela, u skladu sa postupkom iz ovog pronalaska, može biti kontinualno ili sa prekidima, zavisno, na primer, od fiziološkog stanja primaoca, da li je svrha ordiniranja terapeutska ili profilaktička i drugih faktora koji su poznati verziranom licu. Ordiniranje anti-KPPG antagonističkog antitela može biti u suštini kontinualno tokom unapred odabranog perioda vremena, ili to može biti serija raspoređenih doza, npr. bilo pre, za vreme ili posle javljanja glavobolje (npr. migrene); pre; za vreme; pre i posle; za vreme i posle; pre i za vreme; ili pre, za vreme i posle javljanja glavobolje. Ordiniranje može biti pre, za vreme i/ili posle bilo kog događaja za koji se veruje da će dovesti do glavobolje.

U nekim realizacijama, može biti prisutno više od jednog anti-KPPG antagonističkog antitela. Prisutno može biti najmanje jedno, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet različitih, ili više, anti-KPPG antagonističkih antitela. Obično, ta anti-KPPG antagonistička antitela mogu imati komplementarne aktivnosti, koje ne deluju štetno jedna na drugu. Antagonističko anti-KPPG antitelo može takođe da se koristi zajedno sa drugim KPPG antagonistima ili antagonistima receptora KPPG. Na primer, mogu se koristiti jedan ili više sledećeih KPPG antagonista: anti-sensni molekul usmeren na KPPG (uključujući anti-sensni molekul usmeren na nukleinsku kiselinu koja kodira KPPG), jedinjenje inhibitor za KPPG, strukturni analog KPPG, dominantno negativna mutacija receptora KPPG koja vezuje KPPG i receptor antitela anti-KPPG. Anti-KPPG antagonističko antitelo se može takođe koristiti zajedno sa drugim agensima koji služe poboljšanju i/ili kompelmentarnoj efikasnosti tih agenasa.

Terapeutske formulacije anti-KPPG antagonističkog antitela koje se koriste u skladu sa ovim pronalaskom, dobijaju se skladištenjem i mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće, sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima ili stabilizatorima (Remington, ’The Science and Practice of Pharmacy’' 20th ed., Mack Publishing, 2000), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, dodaci, stabilizatori su netoksični za primaoca u dozama i koncentracijama koje se koriste, a to mogu da budu puferi, kao što je fosfatni, citratni i drugih organskih kiselina; soli, kao što je natrijum-hlorid, antioksidanti, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; prezervativi (kao što je oktadecilmetilbenzilamonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkomjum-hlorid; benzetonijum-hlorid; fenol, butil- ili benzilalkohol, alkil parabeni, kao što je metil- ili propilparaben; katehol; rezorcin; cikloheksanol; 3-pentanol i m-krezol); polipeptidi niske molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što je serum albumina, želatin ili imunoglobulini; hidrofobni polimeri, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući glukozu, manozu ili dektrine; agensi za helatiranje, kao što je EDTA; šećeri, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sobitol; kontra-joi koji formiraju soli, kao što je natrijum; kompleksi metala (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili ne-jonski surfaktanti, kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilenglikol (PEG).

Lipozomi koji sadrže anti-KPPG antagonističko antitelo dobijaju se postupcima koji su poznati u stanju tehnike, kao što su opisali Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 4030 (1980) i U.S. Patent No. 4,485,045 i 4.544,545. Lipozomi sa poboljšanim vemenom cirkulacije su opisani u U.S. Patent No. 5,013,556. Naročito pogodni lipozomi se mogu generisati postupkom isparavanja uravnoteženih faza, sa sastavom lipida koji sadrži fosfatidilholin. holesterol i fisfatidiletanolamin derivatizovan sa (PEG-PE) PEG. Lipozomi se ekstrudiraju kroz filtere definisanih dimenzija pora, dajući lipozome željenog prečnika.

Aktivni sastojci se mogu takođe ubaciti: u mikrokapsule dobijene, na primer, tehnikama koacervacije ili međupovršinske polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze ili želatinske mikrokapsule i poli-(metilmetakrilat)ne mikrokapsule, respektivno, u sisteme za koloidno oslobađanje leka (na primer, lipozomi, mikrosfere albumina, mikroemulzije, nano-čestice i nano-kapsule) ili u makroemulzije. Ovakve tehnike su opisane u Remington, "The Science and Practice of Pharmacy”, 20th ed. Mack Publishing, 2000.

Mogu se pripremiti i preparati za uzdržano oslobađanje. Pogodni primeri preparata za uzdržano oslobađanje su semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, a te matrice su u obliku oblikovanih artikala, npr. filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica za uzdržano oslobađanje su poliestri, hidrogelovi (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinil-alkohol), polilaktidi (U.S. Patent No. 3,773,919), kopolimeri L-glutaminske i 7-etil-L-glutamata, ne-degradabilni etilen-vinilacetat, degradabilni kopolimeri mlečna kiselina-glikolna kiselina, kao što je LUPRON DEPOT™ (injektibilne mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid acetata), saharoza-acetat-izobutirat i poli-D-(-)-3-hidroksibuterna kiselina.

Formluacije koje treba da se koriste za ordiniranje in vivo moraju biti sterilne. Ovo se lako ostvaruje, na primer, filtriranjem kroz sterilne membrane za filtriranje. Terapeutski preparati anti-KPPG antagonističkog antitela obično se stavljaju u kontejner koji ima sterilan pristup, na primer, kesa za intravenski rastvor ili fiola sa zapušačem koji se može probiti hipodermičnom iglom za injekcije.

Preparati u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti u obliku jedinične doze, kao što su tablete, pilule, kapsule, prahovi, granule, rastvori ili suspenzije, ili supozitorije, za oralno, parenteralno ili rektalno ordiniranje, ili ordiniranje inhalacijom ili insuflacijom.

Za dobijanje čvrstih preparata, kao što su tablete, osnovni aktivni sastojak se meša sa farmaceutskim nosačem, npr. konvencionalnim sastojcima za tabletiranje, kao što su kukuruzni škrob, laktoza, saharoza, sorbitol, talk, stearinska kiselina, magnezijum-stearat, dikalcijum-fosfat ili gume, i drugim farmaceutskim razblaživačima, npr. vodom, kako bi se formirala čvrsta formulacija preparata, koju čini homogena smeša jedinjenja iz ovog pronalaska, ili njegove ne-toksične farmaceutski prihvatljive soli. Kada se pominju ove prethodne formulacije preparata kao homogene, podrazumeva se da je aktivni sastojak ravnomerno dispergovan u preparatu, tako da se preparat lako može deliti u jednako efikasne jedinične doze, oblika tableta, pilula i kapsula. Ova čvrsta prethodna formulacija preparata se zatim deli u oblike jedinične doze, gore opisanih vrsta, koje sadrže od 0,1 do oko 500 mg aktivnog sastojka iz ovog pronalaska. Tablete ili pilule novog preparata se mogu obložiti ili slično obraditi da obezbede oblik za doziranje koji poseduje prednost produženog detovanja Na primer, tableta ili pilula može da sadrži komponentu unutrašnje doze i spoljašnje doze, gde je ova poslednja obavija prethodnu. Ove dve komponente mogu biti razdvojene enteričkim slojem, koji služi da se odupre razgradnji u stomaku i dozvoli unutrašnjoj komponenti da nedirnuta pređe u duodenum, ili da se odloži njeno oslobađanje. Raznovrsni materijali se mogu upotrebiti za ovakve enteričke obloge, ti materijali obuhvataju brojne polimerne kiseline i smeše polimernih kiselina sa materijalima kao što je šelak, cetilalkohol i ceiuloza-acetat.

Pogodni površinski aktivni agensi su, posebno ne-jonski agensi, kao što su polioksietilensorbitani (npr. TAA/EEN™ 20, 40, 60, 80 i 85) i drugi sorbitani (npr. ŠPAN™ 20, 40, 60, 80 ili 85). Pogodno je da preparati sa površinski aktivnim agensom sadrže između 0,05 i 5% površinski aktivnog agensa, a isti može biti između 0,1 i 2,5%. Podrazumeva se da se mogu dodati i drugi sastojci, na primer, manitol ili drugi farmaceutski prihvatljivi tečni nosači, ukoliko je to potrebno.

Pogodne emulzije se mogu pripremiti korišćenjem komercijalno dostupnih emulzija, kao što su Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Upofundin M i Upiphysan M Aktivni sastojak može biti ili rastvoren u prethodno umešanoj emulziji, ili alternativno, može se rastvoriti u ulju (npr. sojino ulje, suncokretovo ulje, ulje pamučnih semenki, susamovo ulje, kukuruzno ulje ili bademovo ulje), pa se emulzija formira mešanjem sa fosfolipidom (npr. fosfolipidi jajeta, fosfolipidi soje ili lecitin iz soje) i vodom. Podrazumeva se da se mogu dodati i drugi sastojci, na primer, glicerin ili glukoza, radi ostvarivanja izotoničnosti emulzije. Pogodne emulzije sadrže tipično do 20% ulja, na primer između 5 i 20%. Emulzije u mastima mogu sadržati kapljice između 0,1 i 1,0 pm, naročito između 0,1 i 0,5 pm, i imaju pH u opsegu od 5,5 do 8,0.

Preparati emulzija mogu biti i oni koji se dobijaju mešanjem anti-KPPG antagonističkog antitela sa Intralipid M-om ili njegovim komponentama (sojino ulje, fosfolipidi jajeta, glicerin i voda).

Preparati za inhalaciju ili insuflaciju su rastvori i suspenzije prahova u farmaceutski prihvatljivim vodenim ili organskim rastvaračima ili njihovim smešama Tečni ili čvrsti preparati mogu sadržati pogodne farmaceutski prihvatljive dodatke, koji su opisani gore. U nekim realizacijama, preparati se ordiniraju oralnim ili nazalnim respiratornim putem za potrebe lokalnog ili sistemskog efekta. Preparati u poželjnim, sterilnim farmaceutski prihvatljivim rastvaračima, mogu se nebulizovati korišćenjem gasa. Nebulizovani rastvori se mogu udisati direktno iz nebulizatora, ili se nebulizatorski uređaj može priključiti na masku za lice, u šator ili mašinu za disanje sa naizmeničnim pozitivnim pritiskom. Preparati u obliku rastvora, suspenzije ili praha, poželjno oralni ili nazalni, mogu se ordinirati iz uređaja koji na odgovarajući način oslobađaju formulaciju.

Dijagnoza ili ocena glavobolje je dobro poznata u stanju tehnike. Ocena se može dati na bazi subjektivnih merila, kao što je karakterizacija simptoma pacijenta. Na primer, migrena se može dijagnostikovati na osnovu sledečih kriterijuma: 1) povremeni napadi glavobolje, koji traju od 4 do 72 h; 2) sa dva od sledečih simptoma: bol na jednoj strani, kljucanje, pogoršanje pri kretanju i bol srednjeg ili jakog intenziteta; i 3) jedan od sledečih simptoma: mučnina ili povraćanje i fotofobija i fonofobija. Goadsby et al., N. Eng. J. Med. 346, 257-270 (2002).

Efikasnost tretmana se može testirati postupcima dobro poznatim u stanju tehnike. Na primer, može se ocenjivati popuštanje bola. U skladu sa tim, u nekim realizacijama, popuštanje bola se subjektivno opaža posle 1, 2 ili nekoliko sati nakon ordiniranja anti-KPPG antitela. U nekim realizacijama, frekvencija napada glavobolje se i subjektivno opaža posle ordiniranja anti-KPPG antitela.

B. Anti-KPPG antagonistička antitela

Postupci iz ovog pronalaska koriste anti-KPPG antagonističko antitelo, koje se odnosi na bilo koji molekul antitela koji blokira, suzbija ili smanjuje (uključujući i značajno) biološku aktivnost KPPG, uključujući silazne puteve posredovane pomoću KPPG signalizacije, kao što je vezivanje za receptor i/ili izazivanje celijskog odgovora na KPPG.

Anti-KPPG antagonističko antitelo treba da ispoljava bilo jednu ili više sledečih karakteristika: (a) vezuje se za KPPG; (b) blokira vezivanje KPPG za njegov receptor, ili receptore: (c) blokira ili smanjuje aktivnost receptora KPPG (uključujući i aktiviranje cAMP); d) inhibira biološku aktivnost KPPG ili silazne puteve posredovane sa signalnom funkcijom KPPG; (e) sprečava, ublažava ili tretira bilo koji aspekt glavobolje (npr. migrene); (f) pojačava raščišćavanje KPPG; i (g) inhibira (smanjuje) sintezu, stavaranje ili oslobađanje KPGG Anti-KPPG antagonistička antitela su poznata u stanju tehnike. Videti, na primer, Tan et al., Clin. Sci. (London) 89,1225-1229 (1993).

Za potrebe ovog pronalaska, antitelo reaguje sa KPPG na način da inhibira KPPG i/ili silazne puteve posredovane funkcijom signalizacije KPPG. U nekim realizacijama, anti-KPPG antagonističke) antitelo prepozanje humani KPPG U nekim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo se vezuje za humani i a-KPPG i β-KPPG. U nekim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo se vezuje za humani i pacovski KPPG U nekim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo se vezuje za fragment C-terminala, koji ima aminokiseline 25-37 u KPPG. U nekim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo se vezuje za C-terminal epitopa sa aminokiselinama 25-37 u KPPG,

Antitela koja se koriste u ovom pronalasku mogu da obuhvate monoklonalna antitela, poliklonalna antitela, fragmente antitela (npr. Fab, Fab’, F(ab)2, Fv, Fc itd.), himerna antitela, bispecifična antitela, heterokonjugovana antitela, pojedinačni lanac (ScFv), njihove mutante, fuzione proteine koji sadrže deo antitela (npr. demen antitela), humanizovana antitela i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koja sadrži mesto za prepoznavanje antigena zahtevane specifičnosti, uključujući varijante glikozilovanja antitela, varijante sekvencije aminokiselina antitela i kovalentno modifikovana antitela. Antitela mogu biti mišja, pacovska, humana ili bilo kog drugog porekla (uključujući himerna ili humanizovana antitela).

U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo je monoklonalno antitelo. U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo je humanizovano, U nekim realizacijama antitelo je humano. U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo je antitelo G1 (kao što je ovde opisano), U nekim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo sadrži jedan ili više CDR (kao što je jedan, dva, tri, četiri, pet ili u nekim realizacijama svih šest CDR) antitela G1 i varijanata G1, prikazanih u Tabeli 6. U još nekim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo sadrži sekvenciju aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca, prikazanu na Slici 5 (SEQ ID NO: 1) i sekvenciju aminokiselina varijabilnog dela lakog lanca, prikazanu na Slici 5 (SEQ ID NO: 2).

U nekim realizacijama ovo antitelo sadrži modifikovani konstantni region, kao što je konstantni region imunološki inertan, kao što je ovde opisano. U nekim realizacijama, ovaj konstantni region je modifikovan kao što je opisano u Eur. J. Immunol. 29, 2613.2624 (1999); PCT Application No. PCT/GB99/01441; i/ili UK Patent Application No. 9809951.8. U drugim realizacijama ovo antitelo sadrži konstantan region humanog teškog lanca lgG2, koji sadrži sledeće mutacije: A330P331 do S330S331 (numeracija aminokiselina je pozivanjem na sekvenciju divljeg tipa lgG2). Eur. J. Immunol. 29, 2613-2624 (1999). U nekim realizacijama antitelo sadrži konstantni region iz !gG4, koji ima sledeće mutacije:

E233F234L235 do P233V234A235. U još nekim realizacijama konstanti region je aglikozilovan za glikozilovanje povezano sa N. U nekim realizacijama konstantni region je aglikozilovan za glikozilovanje povezano sa N, mutacijom ostatka dodatka na oligosaharidu (kao što je Asn297) i/ili bočnih ostataka koji su deo sekvencije za prepoznavanja N-glikozilovanja u konstantnom regionu. U nekim realizacijama konstantni region je aglikozilovan za glikozilovanje povezano sa N. Konstantni region može da se aglikoziluje za glikozilovanje povezano sa N emzimatskim putem, ili ekspresijom u ćeliju koja je deficitarna u glikozilovanju.

Afinitet vezivanja (KD) anti-KPPG antagonističkog antitela za KPPG (kao što je humani α-KPPG) može da bude oko 0,02 do oko 200 nM U nekim realizacijama ovaj afinitet vezivanja je bilo koji između oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM. oko 1 nM oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 pM, oko 50 µM oko 20 pM oko 15 pM, oko 10 pM, oko 5 µM ili oko 2 pM. U nekim realizacijama afinitet vezivanja je manji od oko 250 nM, oko 20 nM, oko 100 nM, oko 50 nM oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 µM ili oko 50 pM.

Jedan način određivanja afiniteta vezivanja antitela za KPPG je merenjem afiniteta vezivanja monofunkcionalnih Fab fragmenata antitela Da bi se dobili monofunkcionalni Fab fragmenti, antitelo (na primer, IgG) se može otcepiti sa papainom ili rekombinantno ekspresovati. Afinitet Fab fragmenta anti-KPPG antitela se može odrediti rezonancijom površinskog plazmona (Biacore 3000™, sistem rezonancije površinskog plazmona , Biacore, Ine., Piscataway, NJ), opremljenog sa senzorskim čipovima prethodno imobilizovanim streptavidinom koristeći protočni pufer HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCI, 3 mM EDTA, 0,005 vol% Surfactant P20). Biotinilovani humani KPPG (ili bilo koji drugi KPPG) može da se razblaži u puferu HBS-EP do koncentracije manje od 0,5 pg/mL, pa se injektuje preko pojedinačnih kanala čipa, koristeći varijabilna vremena kontakta za postizanje dva opsega gustine antigena, ili jedinice odgovora 50-200 za detaljna kinetička ispitivanja, ili 800-1000 jedinica odgovora za testove. Ispitivanja regeneracije, pokazala su da 25 mM NaOH u 25 vol% etanola, efikasno uklanja vezani Fab, uz održavanje aktivnosti KPPG na čipu, tokom preko 200 injektiranja. Tipično, dozvoljena su injektiranja u serijskim razblaženjima prečišćenih uzoraka Fab (pokrivaju koncentracije od 0,1-10 * procenjena vrednost KD), u trajanju 1 min, sa 100 pUmin i vremenom disocijađje do 2 h. Koncentracije Fab proteina se određuju pomoću testa ELISA i/ili SDS/PAGE elektroforeze, koristeći kao standard poznate koncentracije Fab (određene analizom aminokiselina). Konstante brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (k0ff) dobijaju se istovremeno, fitovanjem podataka globalno u Languir-ov model vezivanja 1:1 (Karlsson, R., Roos, H. Fargerstam L., Pepeterson, B., Methods Enzymology 6, 99-110 (1994), koristeći program BIAevaiuation. Vrednosti konstante ravnoteže disocijacije (KD) izračunavane su kao koff/kon- Ovaj protokol je pogodan za korišćenje pri određivanju afiniteta vezivanja antitela za bilo koji KPPG, uključujući humani KPPG, KPPG nekog drugog sisara (kao što je mišji KPPG, pacovski KPPG, KPPG primata) , kao i za razne oblike KPPG (kao što su a-oblik i (3-oblik). Afinitet vezivanja antitela se obično meri na 25°C, ali može se takođe meriti i na 37°C

Anti-KPPG antagonistička antitela se mogu dibit biio kojim postupkom poznatim u stanju tehnike. Put i shema imunizacije animalnog bića-domaćina, obično se sadrže u pridržavanju utvrđenih i konvencionalnih tehnika stimulisanja i proizvodnje antitela, kako će u nastavku biti opisano. Opšte tehnike za dobijanje humanih i mišjih antitela su poznate u stanju tehnike, i ovde su opisane,

Podrazumeva se da se može manipulisati sa bilo kojim sisarskim subjektom, uključujući humana bića, i njihovim ćelijama za proizvodnju antitela, što čini osnovu dobijanja sojeva ćelija hibridoma sisara, uključujući humana bića. Tipično, animalno biće-domaćin se intraperitonealno, intramuskulatorno, oralno, subkutano, intraplanarno i/ili intradermalno inokulira sa količinom imunogena, kao što je ovde opisano.

Hibridome se mogu dobiti iz limfocita i besmrtnih ćelija mijeloma, koristeći tehniku opšte somatske hibridizacije ćelija, koju su dali Kohler, B. i Milstein, C. Nature 256, 495-497 (1975), a modifikovali Buck, D.W. et al., ln Vitro 18, 377381 (1982). Za hibridizaciju se mogu koristiti dostupni sojevi mijeloma, uključujući, ali bez ograničavanja, X63-Ag8.653 i one iz Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornija, SAD. Obično, tehnika se sastoji od fuzionisanja ćelija mijeloma i limfoidnih ćelija, koristeći fuzogen, kao što je polietilenglikol, ili električnim načinima, dobro poznatim onima koji su verzirani u stanje tehnike. Posle fuzionisanja, ćelije se odvoje od medijuma za fuzionisanje, pa rastu u selektivnom medijumu za rast, kao što je medijum hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT), kako bi se eliminisale nehibridizovane ćelije roditelja. Bilo koji od opisanih medijuma, uz dodatak ili bez dodatka seruma, može biti upotrebljen za kultivisanje hibrodoma koje izlučuju monoklonalna antitela. Kao sledeća alternativa tehnici fuzionisanja ćelija, može se koristiti EBV besmrtnih B ćelija za proizvodnju anti-KPPG monoklonalnih antitela iz ovog pronalaska. Ako se želi, hibridome se razmnože i subkloniraju, a supernatanti se testiraju na anti-imunogenu aktivnost, koristeći konvencionalne procedure imunotestiranja (npr. radioimunotest, enzimski imunotest ili fluorescentni imunotest).

Hibridome, koje se mogu koristiti kao izvor antitela, obuhvataju sve derivate ćelija potomaka roditeljskih hibridoma, koje proizvode monoklonalna antitela specifična za KPPG, ili njihove delove.

Hibridome, koje proizvode ovakva antitela, mogu da se gaje in vitro ili in vivo, korišćenjem poznatih procedura. Monoklonalna antitela se mogu izolovati iz medijuma za kultivisanje ili iz telesnih fluida, konvencionalnim procedurama prečišćavanja imunoglobulina, kao što je taloženje sa amonijum-sulfatom, gel elektroforeza, dijaliza, hromatografija i ultracentrifugiranje. Ukoliko je prisutna, neželjena aktivnost se može ukloniti, naprimer, prepuštanjem preparata preko adsorbenata, napravljenih od čvrste faze obložene imunogenom, pa eluiranjem ili oslobađanjem željenih antitela sa imunogena. Imunizacija animalnog bića domaćina sa humanim KPPG, ili fragmentom koji sadrži ciljanu sekvenciju aminokiselina konjugovanu sa proteinom koji je imunogen u vrstama koje treba da se imunizuju, npr. odgovarajuće primerenim hemocijaninom, serumom albumina, goveđim tiroglobulinom ili inhibitorom sojinog tripsina, korišćenjem bifunkcionalnih ili derivatizujućih agenasa, na primer, maleimidobenzoil-sulfosukciniimidnog estra (konjugovanog preko cisteinskih ostataka), N-hidroksisukcinimida (preko lizinskih ostataka), glutaraldehida, anhidrida ćilibarne kiseline, SOCI2 ili R-|N=C=NR, gde su R i različite alkil grupe, može dati populaciju antitela (npr. monoklonalnih antitela).

Ukoliko se želi, posmatrano anti-KPPG antagonističko antitelo (monoklonalno ili poliklonalno) može se sekvencionisati, a zatim se može sekvencija polinukleotida klonirati u vektor za ekspresiju ili propagaciju. Kodiranje sekvencije posmatranog antitela može da se održava u vektoru ćelije domaćina, a ćelija domaćina se zatim razmnoži i zamrzne za buduću upotrebu. Alternativno, sekvencija polinukleotida se može upotrebiti za genetsku manipulaciju "humanizovanja” antitela ili za poboljšanje afiniteta ili drugih karakteristika antitela. Na primer, konstantni region se može skrojiti da više potseća na humani konstantni region, kao bi se izbegao imuno odgovor, ako se antitelo koristi u kliničkim probama i tretmanima humanih bića. Može biti poželjno da se genetski manipuliše sekvencijom antitela. kako bi se dobio veći afiniteta prema KPPG i veća efikasnost inhibicije KPPG. Onome ko je verziran u stanje tehnike je jasno da se može načiniti jedna ili više izmena polinukieotida na anti-KPPG antagonističkom antitelu, a da se još uvek zadrži svojstvo vezivanja za KPPG.

Postoje četiri opšta koraka humanizacije monoklonalnog antitela. To su: (1) određivanje nukleotida i predviđanje sekvencija aminokiselina lakog i teškog varijabilnog domena polaznog antitela; (2) dizajniranje humanizovanog antitela, tj. odlučivanje koji region skeleta antitela će da se koristi u procesu humanizacije; (3) metodologije/tehnike stvarne humanizacije; i (4) transficiranje i ekspresija humanizovanog antitela. Videti, na primer, U.S. Patent No. 4,816,567: 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5.693,762; 5,585,089 i 6,180,370.

Opisani su brojni molekuli "humanizovanilf antitela koji sadrže mesto za vezivanje antigena izvedeno iz ne-humanog imunoglobulina, uključujući himerna antitela glodara ili modifikovane V regione glodara i sa njima povezane regione koji određuju komplementarnost (CDR) fuzionisane sa humanim konstantnim domenima. Videti na primer, Winter et al., Nature 349, 293-299 (1991), Lobuglio et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 4220-4224 (1989); Shaw et al. J. Immunol. 138. 4534-4538 (1987) i Brovvn et al. Cancer Res. 47, 3577-3583 (1987). Ostali navodi opisuju CDR glodara graftovan u podržavajući skelet humanog regiona, pre fuzionisanja sa odgovarajućim konstatnim domenom humanog antitela. Videti na primer, Reichmann et al Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239, 1534-1536 (1988) i Jones et al. Nature 321, 522-525 (1986). Drugi navodi opisuju CDR glodara potpomognute sa rekombinantno obloženim regionima skeleta glodara. Videti na primer, European Patent Publication No. 0519596 Ovi "humanizovani” molekuli dizajnirani su da bi minimalizavali neželjen imunološki odgovor prema anti-humanim molekulima antitela glodara, koji ograničava trajanje i efikasnost terapeutske primene ovakvih ostataka u humanim primaocima. Na primer, konstantni region antitela se može skrojiti tako da je imunološki inertan (npr. ne pokreće komplementarnu ližu). Videti, npr. PCT Publication No. PCT/GB99/01441; UK Patent Application No. 9809951. Drugi postupci humanizacije antitela, koji se takođe mogu koristiti, opisani su u

Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19, 2471-2476 (1991) i u U.S. Patent No. 6,180.377: 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671 i 6,350,861, kao i u PCT Publication No. WO 01/27160.

U još jednoj alternativi, humana antitela se mogu dobiti korišćenjem komercijalno dostupnih miševa koji su inžinjeringom podešeni da ekspresuju specifične humane proteine imunoglobulina, Transgena animalna bića, dizajnirana za proizvodnju poželjnijih (npr. u celini humanih antitela) ili robustnija na imuno odgovor, mogu se koristiti za generisanje humanizovanih ili humanih antitela. Primeri ovakve tehnologije su Xenomouse™ iz firmi Abgenix, Ine. (Fremont, CA) i HuMAb-Mouse'1' i TC Mouse™ iz Medarex, Ine. (Princeton, NJ).

U alternativi, antitela se mogu napraviti rekombinantno, pa ekspresovati korišćenjem bilo kog postupka poznatog u stanju tehnike. U sledećoj alternativi, antitela se mogu napraviti rekombinantno tehnologijom prikazivanja faga. Videti npr., U.S. Patent No. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; i 6,265,150: i VVinter et al. Ann. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994). Alternativno, tehnologija prikazivanja faga (McCafferty et al. Nature 348, 552-553 (1990)) može se upotrebiti za proizvodnju humanih antitela i fragmenata antitela in vitro, iz reperotoara imunoglobulina iz varijabilnog (V) domena gena donora koji nisu imunizovani. U skladu sa ovom tehnikom, V domen antitela gena se klonira unutar okvira bilo glavnog ili sporednog proteina obloge gena vlaknaste bakteriofage, kao što je M13 ili fd, pa se prikažu kao fragmenti funkcionalnog antitela na površini čestice fage. Zato što vlaknasta čestica sadrži jednostruko upredenu kopiju DNK genoma fage, selekcije zasnovane na funkcionalnim svojstvima antitela takođe daju za rezultat selekciju gena koja kodira antitelo koje pokazuje ovakve osobine Dakle, fage imitiraju neke osobine B ćelija. Prikazivanje faga se može obaviti u raznovrsnim formatima; za pregled videti, na primer, Johnson, Kevin S. i Chisvvell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Nekoliko izvora segmenata V-gena može da se koristi za prikazivanje faga Clackson et af Nature 352, 624=628 (1991) su izolovali razne skupine anti-oksazolonskih antitela iz male nasumične kombinatorne biblioteke V gena, izvedene iz slezine imunizovanih miševa. Može se konstruisati repertoar V gena iz imunizovanih humanih donora i mogu se izolovati antitela sa širokim skupom antigena (uključujući self-antigene), kada se u suštini slede tehnike koje su opisali Mark et al. J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991) ili Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993) U prirodnom imuno odgovoru geni antitela akumuliraju mutacije velikom brzinom (somatske hipermutacije). Neke od uvedenih promena će iskazivati veći afinitet, a B ćelije, koje prikazuju površinu imunglobulina sa visokim afinitetom, prvenstveno se repliciraju i diferenciraju tokom narednog napada na antigen. Prirodni proces se može imitirati korišćenjem tehnike, poznate kao ’ mešanje lanaca", Marks et al. Bio/Technoi 10, 779-783 (1992)). U ovom postupku afinitet "primarnih” humanih antitela, dobijenih tehnologijom prikazivanja faga, može da se unapredi skevencijalnim zamenama teškog i lakog lanca V regiona gena, sa repertoarom varijanti koje se nalaze u prirodi (repertoari) V domena gena, dobijenih iz donora koji nisu imunizovani. Ova tehnika dozvoljava stvaranje antitela i fragmenata antitela sa afinitetima u opsegu pM-nM Strategiju za pravljenje vrlo velikih repertoara antitela fage (poznata takode kao "majka svih biblioteka”) opisali su VVaterhouse et al. Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993). Mešanje gena se može takođe koristiti za izvođenje humanih antitela iz antitela glodara, pri čemu humano antiteio ima slične afinitete i specifičnosti sa polaznim antitelom glodara. U skladu sa ovim postupkom, koji se takođe navodi kao "utiskivanje epitopa", teški ili laki lanac antitela V domena gena glodara, dobijen tehnikom prikazivanja fage, zameni se sa repertoarom humanog V domena gena, stvarajući humano-glodarske himere. Selekcija rezultata antigena u izolovanju humanih varijabilnih regiona koji su u stanju da obnove mesto funkcionalnog vezivanja antigena, tj. epitop vlada izborom partnera (utiskivanje). Kada se ovaj proces ponovi, sa ciljem da se zameni postojeći V domen glodara, dobije se humano antiteio (videh PCT Pubiication No. WO 93/06213, publikovanu 1. aprila 1993). Za razliku od tradicionalne humanizacije antitela glodara preko graftovanja CDR, ova tehnika daje kompletno humana antitela, koja nemaju skelet ili CDR ostatke glodarskog porekla.

Jasno je da su, mada se gornja diskusija odnosi na humanizovana antitela, diskutovani opšti principi primenljivi na prekrajanje antitela za upotrebu, na pnmer, kod pasa, mačaka, primata, konja i goveda. Jasno je još i da se jedan ili više ovde opisanih aspekata humanizovanja antitela može kombinovati, npr. graftovanje CDR, mutacija skeleta i mutacija CDR.

Antitela se mogu praviti rekombinantno, prvo izolovanjem antitela i ćelija koje proizvode antitela iz animalnih bića domaćina, dobijanjem sekvencije gena i korišćenjem te skvencije gena za ekspresiju antitela rekombinantnim putem u ćelijama domaćina (npr. ćelije CDR). Sledeči postupak, koji se može koristiti, je ekspresija sekvencije antitela u biljkama (npr. duvan) ili u transgenskom mleku. Opisani su postupci za ekspresiju antitela reombinantnim putem u biljkama ili mleku Videti na primer, Peeters, et al. Vaccine 19, 2756 (2001); Lonberg, N. i D. Huszar, Int. rev. Immunol. 13, 65 (1995) i Pollock et al. J. Immunol. Methods 231. 147(1999). Postupci pravljena derivata antitela, npr. humanizovanih, jednog lanca itd., poznati su u stanju tehnike.

Imunotestovi i tehnike sortiranja protočnom citometrijom, kao što je sortiranje ćelija aktivirano fluorscencijom (FACS) može takođe da se koristi za izolovanje antitela koja su specifična na KPPG.

Antitela mogu da se vežu za mnoge različite nosače. Nosači mogu biti aktivni i/ili inertni. Primeri dobro poznatih nosača su polipropilen, polistiren. polietilen, dekstran, najlon, amilaze, staklo, prirodne i midifikovane celuloze, polialkrilamidi, agaroze i magnetit. Za potrebe ovog pronalaska, nosač može po prirodi biti ili rastvoran ili nerastvoran. Oni koji su verzirani u stanje tehnike znaju i druge pogodne nosače za vezivanje antitela, ili su u stanju da takve nađu, koristeći se rutinskim eksperimentisanjem. U nekim realizacijama, nosač sadrži i ostatak koji cilja miokard

DNK koja kodira monoklonalna antitela se lako izoluje i sekvencionira korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem proba oligonukleotida koji su u stanju da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance monoklonalnih antitela). Ćelije hibridome služe kao poželjan izvor takve DNK. Kada se jednom izoluje, DNK se može staviti u vektore ekspresije (kao što su vektori ekspresije opisani u PCT Publication No. WO 87/04462), koji se zatim transficiraju u ćelije domaćina, kao što su ćelije E. coli, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, kako bi se dobila sinteza monoklonalnih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. Videti npr., PCT Publication No. WO 97/04462. Ova DNK se takođe može modifikovati, na primer, supstituicijom kodirajuće sekvencije konstantnih domena humanog teškog i lakog lanca umesto homolognih mišjih sekvencija, Morrison et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984), ili kovalentnim pripajanjem na sekvenciju koja kodira imunolgobulin, na čitavu ili samo deo sekvencije za kodiranje ne-imunoglobulinskog polipeptida. Na taj način se dobijaju "himerna” ili ”hibridna‘'antitela, koja imaju specifičnost vezivanja za anti-KPPG monoklonalno antitelo

Anti-KPPG antagonistička antitela i polipeptidi, izvedeni iz antitela, mogu se identifikovati i karakterisati korišćenjem postupaka koji su poznati u stanju tehnike, pri čemu se detektuje i/ili meri smanjenje, ublaženje ili neutralizacija biološke aktivnosti KPPG. Na primer, anti-KPPG antagonističko antitelo može takođe da se identifikuje inkubiranjem odabranog agensa sa KPPG, pa praćenjem jedne ili više od sledećih karakteristika: (a) vezivanje za KPPG, (b) blokiranje KPPG od vezivanja za njegov(e) receptor(e), (c) blokiranje ili smanjenje aktiviranja reeeptora KPPG (uključujući i aktiviranje cAMP), (d) inhibiranje biološke aktivnosti KPPG ili silaznih puteva funkcije signalizacije posredovane sa KPPG, (e) sprečavanje, ublažavanje ili tretiranje bilo kog aspekta glavobolje (npr. migrene), (f) povećanje uklanjanja KPPG, i (g) inhibiranje (smanjenje) sinteze, proizvodnje ili oslobađanja KPPG. U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo ili polipeptid se iđentifikuje inkubacijom odabranog agensa sa KPPG, pa praćenjem vezivanja i/ili pratećeg smanjenja ili neutralizacije biološke aktivnosti kPPG. Ocena vezivanja se može obaviti sa prečišćenim polipeptidom KPPG ili sa ćelijama koje prirodno ekspresuju ili su transficirane da ekspresuju polipeptide KPPG. U jednoj realizaciji test vezivanja je kompetitivni test vezivanja, gde se ocenjuje svojstvo odabranog antitela za nadmetanje sa poznatim anti-KPPG antagonistom za KPPG vezivanje. Ovaj test se može obaviti u raznim formatima, uključujući i ELISA format. U drugim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo se iđentifikuje inkubiranjem odabranog agensa sa KPPG, pa praćenjem vezivanja i prateće inhibicije aktiviranja receptroa KPPG ekspresovanog po površini ćelije.

Posle početne identifikacije, aktivnost odabranog anti-KPPG antagonističkog antiteia se može dalje potvrditi i rafinirati pomoću biotestova, poznatih kao testova na ciljane biološke aktivnosti. Alternativno, biotestovi se mogu koristiti za direktno testiranje kandidata. Na primer, KPPG promoviše niz merljivih promena prilikom odgovora ćelije To je, ali bez ograničavanja, stimulisanje cAMP u ćeliji (npr. ćelije SK-N-MC). Aktivnost antagonista može takođe da se meri korišćenjem modela na animalnim bićima, kao što je merenje vazodilatacije kože, izazvane stimulacijom nerva safene pacova. Escott et al. Br. J. Pharmacol. 110. 772-776 (1993). Modeli glavobolje na animalnim bićima (kao što je migrena) mogu se koristiti za testiranje efikasnosti antagonističkih antitela ili polipeptida. Reuter et al., Functional Neurology 15, dodatak 3, (2000). Neki od postupaka za identifikaciju i karakterisanje anti-KPPG antagonističkih antiteia ili polipeptida detaljno su opisani u Primarima.

Anti-KPPG antagonistička antitela se mogu karakterisati korišćenjem dobro poznatih postupaka u stanju tehnike, Na primer, jedan od postupaka je identifikacija epitopa za koji se ono veže, ili ’mapiranje epitopa". Postoje mnogi poznati postupci u stanju tehnike za mapiranje i karakterizaciju lokacije epitopa na proteinima, uključujući rešavanje kristalne strukture kompleksa antitelo-antigen, kompeticione testove, testove ekspresije fragmenata gena i testove zasnovane na sintetskim peptidima, kao što je opisano, na primer u 11. glavi publikacije Harlovv i Lane, ”Using Antibodies. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. U još jednom primeru, mapiranje epitopa se može koristiti za određivanje sekvencije za koju se vezuje anti-KPPG antagonističko antitelo. Mapiranje epitopa je komercijalno dostupno iz raznih izvora, na primer, Pepscan Systems (Edelhertvveg 15, 8219 PH Lelysand, Holandija). Epitop može biti linearni epitop, tj sadržan u jedinoj istegnutoj aminokiselini, ili konformaciom epitop, formiran trodimenzionom interakcijom aminokiselina koje ne moraju neizbežno da budu u jedinom istegnuću. Peptidi raznih dužina (npr. dugačak najmanje 4-6 aminokiselina) mogu se izolovati ili sintetizovati (npr. rekombinantno) i koristiti u testovima vezivanja sa anti-KPPG antagonističkim antitelom. U drugom primeru, epitop za koji se vezuje anti-KPPG antagonističko antitelo, može biti detektovan preko sistematskog skrininga, koristeći preklopne peptide, izvedene iz sekvencije KPPG, i određivanja vezivanja za anti-KPPG antagonističko antitelo. U skladu sa testovima ekspresije fragmenata gena, otvoreni riding frejm koji kodira KPPG je fragmentiran, bilo nasumice ili pomoću specifičnih genetskih konstrukcija, pa se određuje reaktivnost ekspresovanih fragmenata KPPG, sa antitelom koje treba da se testira. Fragmenti gena mogu, na primer. da se proizvedu pomoću CDR, a zatim transkribuju i transliraju u protein in vitro, u prisustvu radioaktivnih aminokiselina. Vezivanje antitela za radioaktivno obeležene fragmente KPPG određuje se zatim imunoprecipitacijom i gel elektroforezom. Neki epitopi se mogu takođe identifikovati korišćenjem velikh biblioteka nasumičnih sekvencija peptida prikazanih na površini čestica fage (biblioteke faga). Alternativno, definisana biblioteka preklapajućih fragmenata peptida se može testirati na vezivanje testiranog antitela u prostim testovima vezivanja. U dodatnom primeru, mutageneza vezujućeg domena antigena, eksperimentima razmene domena i mutageneze skenovanja alanina, može se obaviti identifikacija ostataka traženih, dovoljnih i/ili neophodnih za vezivanje epitopa. Na primer, eksperimenti razmene domena mogu se obaviti korišćenjem mutanta KPPG, u kome su razni fragmenti KPPG polipeptida zamenjeni (razmenjeni) sa sekvencijama iz srodnog, ali antigenski različitog proteina {kao što je drugi član familije neutrotrofnog proteina). Testiranjem vezivanja antitela za KPPG mutant, može se testirati značaj određenog fragmenta KPPG za vezivanje antitela.

Još jedan postupak se može koristiti za karakterizaciju anti-KPPG antagonističkog antitela, a to je korišćenje kompeticionog testa sa drugim antitelima, za koje se zna da se vezuju za isti antigen, tj. raznih fragmenata KPPG, da bi se odredilo da li se anti-KPPG antagonističko antitelo vezuje za isti epitop, kao i druga antitela. Kompeticioni testovi su dobro poznati onima koji su verzirani u stanje tehnike.

Vektor ekstresije se može koristiti za direktnu ekspresiju anti-KPPG antagonističkog antitela. Onaj ko je verziran u stanje tehnike upoznat je sa ordiniranjem vektora ekspresije za dobijanje ekspresije egzogenih proteina in vivo. Videti na primer, U.S. Patent No. 6.436,908; 6,413,942 i 6,376,471. Ordiniranje vektora ekspresije obuhvata lokalno ili sistemsko ordiniranje, uključujući injekcije, oralno ordiniranje, ubrizgavanje čestica ili ordiniranje kateterizacijom i površinsko ordiniranje U drugoj realizaciji vektor ekspresije se ordinira direktno u simpatetićko stablo ili u ganglion, ili u koronarnu arteriju, atrijum, ventrikulu ili perikardijum.

Može se koristiti takođe i ciljano oslobađanje terapeutskog preparata koji sadrži vektor ekspresije ili subgenomske polinukleotide. Tehnike oslobađanja DNK posredovanog receptorom opisane su u, na primer, Findels et al., Trends Biotechnol. 11, 202 (1993); Chiou et al. "Gene Therapeutics. Methods and Applications of Direct Gene Transfer1' (J.A. Wolf, uredn.)(1994); Wu et al. J. Biol. Chem. 263, 621 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 542 (1994); Ženke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655 (1990), Wu et al. J. Biol. Chem. 266, 338 (1991). Terepeutski preparati koji sadrže polinukleotid se ordiniraju u opsegu od oko 100 ng do oko 200 mg DNK za lokalno ordiniranje u protokolu terapije genima. Opsezi koncentracije od oko 500 ng do oko 50 mg, oko 1 pg do oko 2 mg, oko 5 pg do oko 500 pg i od oko 20 pg do oko 100 pg DNK, mogu se takođe koristiti u protokolu terapije genima. Terapeutski polinukleotidi i poiipeptidi se mogu oslobađati korišćenjem tečnih nosača za oslobađanje gena. Tečni nosač za oslobađanje gena može biti virusnog ili ne-virusnog porekla (videti uopšteno, Jolly, Cancer Gene Therapy 1_, 51 (1994); Kimura, Human Gene Therapy 5, 845 (1994), Connelly, Human Gene Therapy 1, 185 (1995); i Kaplitt, Nature Genetics 6, 148 (1994)). Ekspresija tih kodiranih sekvencija se može indukovati korišćenjem endogenih sisarskih ili heterologmh promotera. Ekspresija kodirajuće sekvencije može biti ili konstitutivna ili regulisana.

Vektori na bazi virusa za oslobađanje željenog polinukleotida i ekspresiju u željenu ćeliju dobro su poznati u stanju tehnike. Primeri tečnih nosača na bazi virusa su, ali bez ograničavanja, rekombmantni retrovirusi (videti npr., PCT Publication No. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; U.S. Patnet No. 5,219,740 i 4,777,127; GB Patent No. 2,200,651 i EP Patent No. 0 345 242), vektori na bazi alfavirusa (npr. vektori virusa Sindbis, šumski virus Semiiki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) i Venecuelanski virus konjskog encefalitisa (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532)) i vektori adeno-asociranog virusa (AAV) (videti npr., PCT Publication No. WO 94/12649; WO 93/03769: WO 93/19191, WO 94/28938; WO 95/11984 i WO 95/00655). Može se takođe koristiti ordiniranje DNK povezane sa ubijenim adenovirusom kao što je opisao Curiel, Hum. Gene Ther. 3, 147 (1992).

Ne-virusni tečnii nosači i postupci za oslobađanje mogu takođe da se koriste, uključujući, ali bez ograničavanja, samu polikatjonski kondenzovanu DNK, povezanu sa ili nepovezanu sa ubijenim adenovirusom (videti npr., Curiel, Hum. Gene Ther. 3, 147 (1992)); DNK povezanu sa ligandom (videti npr., Wu, J. Biol.

Chem. 264, 16985 (1989); tečne nosače ćelija za oslobađanje eukariotske ćelije (videti npr., U.S. Patent No. 5,814,482; PCT Publication No. WO 95/07994; WO 96/17072, WO 95/30763; i WO 97/42338) i neutralizaciju naelektnsanja jezgra ili fuziju sa ćelijskim membranama Može se takođe koristiti čista DNK. Primeri postupaka uvođenja čiste DNK su opisani u PCT Publicatin No. WO 90/11092 i U.S. Patent No. 5,580,859. Lipizomi, koji mogu da se koriste kao tečni nosači za oslobađanje gena, opisani su u U.S. Patent No. 5,422,120; PCT Publication No. WO 95/13796; WO 94/23697: WO 91/14445 i EP 0524968. Još neki pristupi su opisani u Philip Mol. Cell Biol. 14, 2411 (1994) i u VVolfendin, Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 1581 (1994).

C. Antitelo G1 i srodna antitela. poiioeptidi. polinukleotidi. vektori i ćeltie domaćini Ovaj pronalazak obuhvata preparate, uključujući farmaceutske preparate, koji sadrže antitelo G1 i njegove varijante, prikazane u Tabeli 6, ili poiipeptide izvedene iz antitela G1 i njihove varijante prikazane u Tabeli 6, i polinukleotide, koji sadrže sekvencije koje kodiraju G1 i njihove varijante ili poiipeptide. Kako se ovde koristi, preparati sadrže jedno ili više antitela ili polipeptida (koji mogu ili ne moraju biti anttielo) koji se vezuju za KPPG, i/ili jedan ili više polinukleotida koji sadrže sekvencije koje kodiraju jedno li više antitela ili polipeptida koji se vezuju za KPPG, Ovi preparati mogu još da sadrže pogodne dodatke, kao što su farmaceutski prihvatljivi dodaci, uključujući pufere, koji su dobro poznati u stanju tehnike.

Anti-KPPG antagonistička antitela i poiipeptide iz ovog pronalaska karakteriše bilo koja (jedna ili više) od sledećih karakteristika: (a) vezivanje za KPPG; (b) blokiranje vezivanja KPPG za njegov(e) receptor(e); (c) blokiranje ili smanjenje aktiviranja KPPG receptora (uključujući aktiviranje cAMP); (d) inhibiranje biološke aktivnosti KPPG ili silaznih puteva funkcije signalizacije posredovanih sa KPPG; (e) sprečavanje, ublažavanje ili tretiranje glavobolje (npr. migrene); (f) smanjenje uklanjanja KPPG, i (g) inhibicija (smanjenje) sinteze, proizvodnje ili oslobađanja KPPG.

U skladu sa tim, ovaj pronalazak daje bilo koji od sledećih preparata (uključujući farmaceutske preparate), a koji sadrže bilo koji od sledećih: (a) antitelo G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (b) fragment ili region antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (c) laki lanac antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (d) teški lanac antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (e) jedan ili više varijabilnih regiona iz lakog lanca i/ili teškog lanca antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (f) jedan ili više CDR (jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR) antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (g) CDR H3 iz teškog lanca antitela G1; (h) CDR L3 iz lakog lanca antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (i) tri CDR iz lakog lanca antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (j) tri CDR iz teškog lanca antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (k) tri CDR iz lakog lanca i tri CDR iz teškog lanca antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; i (I) antitelo koje sadrži jedan od (b) do (k). Ovaj pronalazak daje takođe polipeptid koji sadrži jednu ili više od gornjih karakteristika

Detovi CDR antitela G1 (uključujući Chothia-eve i Kabat-ove CDR) prikazani su u dijagramu na Slici 5. Određivanje regiona CDR je unutar veštine u stanju tehnike. Podrazumeva se da u nekim realizacijama CDR može da budu kombinacija Kabat-ovih i Chotia-evih CDR (nazivaju se takođe "kombinovani CDR’ ili ''prošireni CDR"). U nekim ralizacijama CDR su Kabat-ovi CDR. U drugim realizacijama CDR su Chotia-evi CDR. Drugim rečima, u realizacijama sa više od jednog CDR. ovi CDR mogu da budu Kabat-ovi, Chotia-evi, kombinacija CDR ili njihove kombinacije

U nekim realizacijama, ovaj pronalazak daje polipeptid (koji može ili ne mora biti antitelo) koji sadrži najmanje jedan CDR, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet ili svih šest CDR, koji su suštinski identični sa najmanje jednim CDR, sa najmanje dva, sa najmanje tri, sa najmanje četiri, sa najmanje pet ili sa svih šest CDR u G1, ili u njegovim varijantama prikazanim u Tabeli 6. Druge realizacije obuhvataju antitela koja imaju najmanje dva, tri, četiri, pet ili šest CDR, koji su suštinski identični sa najmanje dva, tri, četiri, pet ili šest CDR u G1, ili izvedeni iz G1. U nekim realizacijama, najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR su najmanje oko 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%,98% ili 99% identični sa najmanje jednim, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR iz G1, ili njegovih varijanti prikazanih u Tabeli 6. Podrazumeva se, za svrehe ovog pronalaska, da se specifičnost vezivanja i/ili ukupna aktivnost obično zadržava, mada iznos aktivnosti može da varira u poređenju sa G1, ili njegovim varijantama prikazanim u Tabeli 6 (može biti manja ili veća).

Ovaj pronalazak daje takođe polipeptid (koji može ali ne mora biti antitelo) koji sadrži sekvenciju aminokiselina G1, ili njegovih varijanti prikazanih u Tabeli 6, a koja ima bilo šta od sledećeg: najmanje 5 susednih aminokiselina, najmanje 8 susednih aminokiselina, najmanje 10 susednih aminokiselina, najmanje 15 susednih aminokiselina, najmanje 20 susednih aminokiselina, najmanje 30 susednih aminokiselina iz sekvencije G1, ili njegovih varijanti prikazanih u Tabeli 6, gde su najmanje 3 od aminokiselina iz varijabilnog regiona G1 (Slika 5), ili njegovih varijanti prikazanihu Tabeli 6. U jednoj realizaciji varijabilni region je iz lakog lanca G1. U drugoj realizaciji varijabilni region je iz teškog lanca G1. Polipeptid za primer ima susedne aminokiseline (dužina je prikazana gore) i iz teškog lanca i iz lakog lanca varijabilnih regiona G1. U drugoj realizaciji su 5 (ili više) susednih aminokiselina iz regiona koji određuje komplementarnost (CDR) u G1, prikazanog na Slici 5. U nekim realizacijama, susedne aminokiseline su iz varijabilnog regiona G1.

Afinitet vezivanja (Kd) anti-KPPG antagonističkog antitela i poiipeptšđa za KPPG (kao što je humani α-KPPG), može biti oko 0,06 do oko 200 nM. U nekim realizacijama, afinitet vezivanja je bilo koji od oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 µM oko 50 pM, oko 20 pM, oko 15 pM, oko 10 pM, oko 5 µM ili oko 2 pM. U nekim realizacijama, afinitet vezivanja je manji od oko 250 nM, oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 µM ili oko 50 pM.

Ovaj pronalazak daje takođe postupke za pravljenje ovih antitela ili polipeptida. Antitela iz ovog pronalaska se mogu napraviti po procedurama koje su poznate u stanju tehnike. Polipeptidi se mogu napraviti proteolitskom ili drugom degradacijom antitela, rekombinantnim postupcima (tj. kao jedinstveni ili fuzioni polipeptidi), kao što je opisano gore, ili hemijskom sintezom. Polipeptidi antitela, a naročito kraći polipeptidi, do 50 aminokiselina, pogodno je da se prave hemijskom sintezom, Postupci hemijske sinteze su poznati u stanju tehnike i komercijalno su dostupni. Na primer, antitelo se može proizvesti u automatizovanom aparatu za sintetzu polipeptida, gde se koristi postupak CDR sa čvrstom fazom. Videti takođe. U.S. Patent No. 5,807,715; 4,816,567 i 6,331,415.

Kao sledeća alternativa, antitela se mogu napraviti rekombinantno, koristeći procedure koje su dobro poznate u stanju tehnike. U jednoj realizaciji polinukleotid sadrži sekvenciju koja kodira teški lanac i/ili laki lanac varijabilnog regiona antitela G1, prikazanu kao SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10. U drugoj realizaciji, polinukleotid. koji sadrži sekvenciju nukleotida prikazanu u SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10, se klonira u jedan ili više vektora ekspresije ili propagacije. Sekvencija koja kodira posmatrano antitelo može da se održava u vektoru u ćeliji domaćina, pa se ćelija domaćina može zatim razmnožiti i zamrznuti za buduću upotrebu. Vektori (uključujući vektore ekspresije) i ćelije domaćina su opisani u nastavku

Ovaj pronalazak obuhvata takođe fragmente jedinstvenog lanca varijabilnog regiona ("scFv") antitela iz ovog pronalaska, kao što je G1. Fragmenti jedinstvenog lanca varijabilnog regiona se prave vezivanjem lakog i/ili teškog lanca varijabilnih regiona, koristeći peptide za kratko vezivanje. Bird et al. Science, 242, 423-426 (1988). Primer vezivnog peptida je (GGGGS}3, koji premošćava približno 3,5 nm između karboksi terminusa jednog varijabilnog regiona i amino terminusa drugog varijabilnog regiona. Koriste se dizajnirami linkeri drugih sekvencija. Bird et al (1988). Za uzvrat, iinkeri mogu biti modifikovani za dodatne funkcije, kao što je pripajanje lekova ili pripajanje čvrstih nosača. Varijante jedinstvenog lanca se mogu proizvesti ili rekombinantno ili sintetski. Za sintetsko dobijanje scFv, može da se koristi automatizovani aparat za sintezu. Za rekombinantnu proizvodnju ScFv, može se uvesti pogodan plazmid, koji sadrži polinukleotid koji kodira scFv, u pogodnu ćeliju domaćina, ili u eukariotsku, kao što je kvasac, biljka, insekt ili ćelije sisara, ili u prokariotsku, kao što je E. coli. Polinuleotid, koji kodira posmatrani scFv, može se napraviti rutinskim manipulacijama, kao što je ligacija polinukleotida. Nastali scFv se može izolovati korišćenjem tehnika standardnog prečišćavanja proteina, koje su poznate u stanju tehnike.

Obuhvaćeni su takođe i drugi oblici antitela jedinstvenog lanca, kao što su diatela. Diatela su bivalentna, bispecifična antitela u kojima se VH i VL domeni ekspresuju na jedinstveni lanac polipeptida, ali korišćenjem linkera koji je toliko kratak sa dozvoljavva sparivanje između dva domena na istom lancu, čime se forsiraju domeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca, tako da se kreiraju dva mesta za vezivanje antigena (videti npr., Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993); Poljak, R.J. et al., Structure 2, 1121-1123 (1994).

Na primer, bispecifična antitela, monoklonalna antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita antigena, mogu se dobiti korišćenjem antitela koja su ovde opisana. Postupci za pravljenje bispecifičnih antitela su poznati u stanju tehnike (videti, npr. Suresh et al, Methods in Enzvmologv 121,210 (1986)). Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela se zasniva na ko-ekspresiji dva para teškog lanca-lakog lanca imunoglobulina, stim da dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Millstein i Cuello, Nature 305, 537-539 (1983).

U skladu sa jednim pristupom pravljenja bispecifičnih antitela, varijabilni domeni antitela sa željenim spcifičnostima vezivanja (mesta kombinovanja antitelo-antigen) se fuzionišu sa sekvencijama konstantnog domena. Poželjno je

fuzionisanje sa teškim lancem konstantnog domena imunoglobulina, koji sadrži najmanje deo preklopa, CH2 i CH3 regione. Poželjno je da se ima prvi teški lanac konstantnog domena (CH1), koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca, prisutno u najmanje jednom od fuzionisanja. DNK koje kodiraju fuzije teškog lanca imunoglobulina i, ako se želi, lakog lanca imunoglobulina, se insertuju u odvojene vektore ekspresije, pa se ko-transficiraju u pogodan organizam domaćina. Ovo daje veliku fleksibilnost u podešavanju uzajamnih proporcija tri fragmenta polipeptida u realizacijama kada se koriste nejednaki odnosi tri polipeptidna lanca u konstrukciji, da bi se dobio optimalan prinos. Međutim, moguće je insertovati kodirajuće sekvencije za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan vektor ekspresije, ako je ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakom odnosu, što daje visoke prinose, ili ako ovi odnosi nisu značajno različiti.

U jednom pristupu bispecifična antitela su sačinjena od teškog lanca hibridnog imunoglobulina sa prvom specifičnošću vezivanja u jednom kraku, i para teškog lancadakog lanca hibridnog imunglobulma (koji obezbeđuje drugu specifičnost vezivanja) u drugom kraku Ova asimetrična struktura, sa lakim lancem imunoglobulina u samo jednoj polovini ovog bispecifičnog molekula, olakšava razdvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija lanca imunoglobulina. Ovaj pristup je opisan u PCT Publication No. WO 94/04690, objavljenoj 3. marta 1994.

Heterokonjugovana antitela, koja sadrže dva kovalentno spojena antitela, takođe spadaju u obim ovog pronalaska. Ta antitela se koriste za usmeravanje ćelija imunog sistema ka neželjenim ćelijama (U.S. Patent No. 4,676,980) i za tretman HIV infekcije (PCT Application Publication No. VV091/00360 i WO 92/200373; EP 03089). Heterokonjugovana antitela se mogu napraviti korišćenjem bilo koje pogodne metode umrežavanja. Pogodni agensi i tehnike za umrežavanje su dobro poznati u stanju tehnike, a opisani su u U.S. Patent No. 4,676.980.

Himerna ili hibridna antitela se mogu takođe dobiti in vitro, korišćenjem poznatih postupaka sintetske hernije proteina, uključujući one koje obuhvataju agense za umrežavanje. Na primer, imunotoksini se mogu konstruisati korišćenjem reakcije disulfidne izmene ili formiranjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagenasa za ove potrebe su iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat.

Humanizovano antitelo koje sadrži jedan ili više CDR antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6, ili jedan ili više CDR izvedenih iz antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6, može se napraviti korišćenjem bilo koga od postupaka poznatih u stanju tehnike. Na primer, za humanizaciju monoklonalnog antitela mogu se koristiti četiri opšta koraka.

Ovaj pronalazak obuhvata modifikacije antitela G1 ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6, uključujući antitela ekvivalentne funkcionalnosti koja značajno ne utiču na njihova svojstva i varijante koji imaju poboljšanu ili pogoršanu aktivnost i/ili afinitet. Na primer, sekvencija aminokiselina antitela G1, ili njenih varijanti prikazanih u Tabeli 6, mogu se mutirati tako da se dobije antitelo sa željenim afinitetom vezivanja za KPPG. Modifikacija polipeptida je rutinska praksa u stanju tehnike, i ne treba ovde da se detaljno opisuje. Modifikacija polipeptida daje se i ilustruje u Primerima, Primeri modifikovanih poipetida su polipeptidi sa konzervativnim supstitucijama ostataka aminokiselina, jednim i više izbacivanja ili dodavanja aminokiselina, koja značajnije štetno ne menjaju funkcionalnu aktivnost, ili sa upotrebom hemijskih analoga.

Insertovanja sekvencije aminokiselina obuhvataju fuzionisanja amino- i/ili karboksilnog terminala, koji se do dužini kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrži stotinu ili više ostataka, kao i insertovanja unutar sekvencije jednog ili više ostataka aminokiselina. Primeri terminalnih insertovanja su antitelo sa metioml ostatkom na N-terminalu, ili antitelo fuzionisano na oznaku epitopa. Druge varijante insertovanja molekula antitela su fuzionisanje na N- ili C-terminal antitela enzima ili polipeptida koji povećava poluživot seruma antitela.

Varijante supstitucije imaju najmanje jedan uklonjeni ostatak aminokiselina u molekulu antitela, a različit ostatak insertovan na njegovo mesto. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu su hipervarijabilni regioni, ali podrazumevaju se takođe i FR izmene. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1, pod naslovom “konzervativne supstitucije". Ukoliko ovakve supstitucije dovode do promene u biološkoj aktivnosti, tada se mogu uvoditi suštinskije promene, označene u Tabeli 1 kao "egzemplarne supstitucije”, ili kako su dalje opisane u nastavku u odnosu na klase aminokiselina, a proizvodi testirati.

TABELA 1

Supstitucije aminokiselina

Suštinske modifikacije bioloških svojstava antitela se ostvaruju izborom supstitucija koje se značajno razlikuju po njihovom efektu na održavanje: (a) strukture polipeptidnog skeleta u oblasti supstitucije, na primer, kao planarna ili spiralna konformacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljanom mestu, ili (c) mase bočnog lanca. Ostaci koji se nalaze u prirodi dele se u grupe na bazi zajedničkih svojstava bočnog lanca:

(1) Ne-polarni: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, lle;

(2) Polarni bez naelektrisanja: Cysf Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) Kiseli (negativno naelektrisane): Asp. Glu;

(4) Bazni (pozitivno naelektrisane): Lys, Arg;

(5) Ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i

(6) Aromatični: Trp, Tyr, Phe, His.

Ne-konzervativne supstitucije se prave zamenom člana iz jedne od ovih klasa sa članom iz druge klase

Bilo koji cisteinski ostatak, koji nije uključen u održavanje ispravne konfiguracije antitela, može takođe biti supstituisan, obično sa serinom, da se poboljša stabilnost prema oksidaciji molekula i spreči štetno umrežavanje. Obrnuto, cisteinska veza (ili veze) mogu se dodati antitelu da se poboljša njegova stabilnost, naročito ako je to antitelo fragment antitela, kao što je Fv fragment

Modifikacije aminokiselina se kreću od izmene ili modifikacije jedne ili više aminokiselina, pa do kompletnog redizajniranja regiona, kao što je varijabilni region Promene u varijabilnom regionu mogu da izmene afinitet vezivanja i/ili specifičnost. U nekim realizacijama, unutar CDR domena može da se napravi ne više od jedne do pet konzervativnih supstitucija aminokiselina. U drugim realizacijama, unutar CDR domena može da se napravi ne više od jedne do tri konzervativne supstitucije aminokiselina U još nekim realizacijama CDR domen predstavlja CDR H3 i/ili CDR L3.

Modifikacije obuhvataju takođe glikozilovane i negiikozilovane polipeptide, kao i polipeptide sa drugim post-translacionim modifikacijama, kao što je na primer, glikozilovanje sa različitim šećerima, acetilovanje i fosforilovanje. Antitela su glikozilovana u konzervisanim položajima njihovih konstantnih domena (Jefferis i Lund, Chem. Immunol. 65, 111-128 (1997); VVright i Morison, TibTECH 15, 26-32 (1997). Sporedni lanci oligosaharida imunoglobulina mogu da utiču na funkcije proteina (Boyd et al. Mol. Immunol. 32, 1311-1318 (1996); Wittwe i Howard, Biochem. 29, 4175-4180 (1990)) i intramolekularne interakcije između delova glikoproteina, koji mogu da utiču na konformaciju i predstavljaju trodimenzionu površinu glikoproteina (Heferis i Lund. v. gore; Wyss i VVagner, Current Opin. Biotech. 7, 409-416 (1996)). Oligosaharidi mogu takođe da služe da ciljaju dati glikoprotein na nekim molekulima, na osnovu specifične strukture za prepoznavanje. Objavljeno je takođe da glikozilovanje antitela utiče na ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ĆCZA). Određenije, ćelije CHO sa ekspresijom P(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferaze III (Gnlll), regulisanom tetraciklinom, a objavljeno je da glikoziltransferaza katalizuje stvaranje prepolovljenog GlcNAc, koji ima poboljšanu aktivnost za ĆCZA (Umana et al, Mature Biotech. 17, 176-180(1989)).

Glikozilovanje antitela je tipično sa N-povezano ili sa O-povezano. N-povezano se odnosi na dodatak ugljenohidratnog ostatka na stranu lanca sa asparaginskim ostatkom. Sekvencije tripeptida asparagin-X-serm, asparagin-X-treonin i asparagin-X-cistein, gde X predstavlja bilo koja aminokiselina izuzev prolina, su sekvencije za prepoznavanje enzimatskog dodatka ugljenohidratnog ostatka na asparaginsku stranu lanca Dakle, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvencija u polipeptidu stvara potencijalno mesto za glikozilovanje. O-povezano glikozilovanje se odnosi na dodatak jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksi-aminokiselinu, najčešće na serin ili treonin, mada 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin mogu takođe da se koriste

Dodatak mesta za glikozilovanje antitelu pogodno je da se obavlja menjanjem sekvencije ammokiselina, tako da ona sadrži jednu ili više gore opisanih tripeptidnih sekvencija (za mesta glikozilovanja povezana sa N). Može se takođe napraviti zamena dodavanjem ili supstitucijom jednog ili više serinskih ili treoninskih ostataka u sekvenciju originalnog antitela (za mesta za glikozilovanje povezana sa O).

Shema glikozilovanja antitela može se takođe menjati bez suštinskog menjanja sekvencije nukleotida. Glikozilovanje većinom zavisi od ćelije domaćina koja se koristi za ekspresiju antitela. Pošto je vrsta ćelije, koja se koristi za ekspresiju rekombinantih glikoproteina, npr. antitela, kao potencijalnih terapeutskih sredstava, retko nativna ćelija, mogu da se očekuju varijacije u shemi glikozilovanja antitela (videti, npr. Hse et al., J. Biol. Chem, 272, 9062-9070 (1997))

Pored izbora ćelija domaćina, faktori koji utiču na glikozilovanje tokom rekombinantnog dobijanja antitela, obuhvataju način rasta, formulaciju medijuma, gustinu kulture, oksigenaciju, pH, sheme prečišćavanja i slično. Predloženi su razni postupci za menjanje sheme glikozilovanja ostvarene u određenim organizmima domaćina, uključujući uvođenje ili nad-ekspresiju izvesnih enzima koji učestvuju u proizvodnji oligosaharida (U.S. Patent No. 5,047,335; 5,510,261 i 5,278,299). Glikozilovanje, ili neke vrste glikozilovanja, mogu se enzimatskim putem ukloniti iz glikoproteina, na primer, korišćenjem endoglikozidaze H (Endo H), N-glikozidaze F, endoglikozidaze F1, endoglikozidaze F2, endoglikozidaze F3. Pored toga, rekombinantna ćelija domaćina se može krojiti genetskim inžinjeringom tako da je defektna u procesuiranju nekih vrsta polisaharida. Ova i slične tehnike su dobro poznati u stanju tehnike.

Drugi postupci modifikovanja koriste tehnike kuplovanja, poznate u stanju tehnike, uključujući, ali bez ograničavanja, enzimatske načine, oksidacionu supstituciju i helatiranje. Mogu se koristiti modifikacije, na primer, za pripajanje obeležja za imunotest. Modifikovani G1 polipeptidi prave se korišćenjem procedura iz stanja tehnike, a mogu se testirati korišćenjem standardnih testova, poznatih u stanju tehnike, od kojih su neki opisani u nastavku i u odeljku Primeri.

U nekim realizacijama ovog pronalaska antitelo sadrži modifikovani konstantni region, kao što je konstantni region koji je imunološki inertan ili delimično inertan, npr. ne pokreće komplementarno posredovanu ližu, ne stimuliše posredovanu citotoksičnost ćelije zavisnu od antitela, ili ne aktivira mikroglije; ili ima smanjene aktivnosti (u poređenju sa nemodifikovanim antitelom) u jednom ili više sledećih aspekata: pokretanje komplementarno posredovane liže, stimulisanje posredovane citotoksičnosti ćelije zavisne od antitela ili aktiviranje mikroglija. Različite modifikacije konstantnog regiona se mogu koristiti za postizanje optimalnog nivoa i/ili kombinacije efektorskih funkcija. Videti na primer, Morgan et al., lmmunology 86, 319.324 (1995); Lund et al., J. Immunolopv 157, 4963-4969 (1996); Idusogie et al., J. lmmunology 164, 41783184 (2000); Tao et al. J. Immunolopv 143, 2595-2601 (1989); i Jefferis et al. Immunological Revievvs 163, 59-76 (1998)). U nekim realizacijama konstantni region je modifikovan kao što je opisano u Eur. J. Immunol. 29, 2613-2624 (1999); PCT Application No. PCT/GB99/01441 i/ili UK Patent Application No. 9809951.8. U drugim realizacijama antitelo sadrži konstantni region humanog teškog lanca lgG2, koji sadrži sledeće mutacije: A330P331 do S330S331 (numeracija aminokiselina se poziva na divlji tip sekvenceije lgG2). Eur. J. Immunpl. 29, 2613-2624 (1999). U još nekim realizacijama, konstantni region je aglikozilovan za glikozilovanje povezano sa N. U nekim realizacijama konstatni region je aglikozilovan za glikozilovanje povezano sa N mutacijom glikozilovanog ostatka aminokiseline ili bočnih ostataka koji su deo sekvencije za prepoznavanje glikozilovanja povezanog sa N u konstatnom regionu. Na primer, mesto za glikozilovanje povezano sa N je N297 i može se mutirati u A, Q, K ili H. Videti, Tao et al. J. Immunolopv 143, 2595-2601 (1989); i Jefferis et al., Immunological Revievvs 163, 59-76 (1998). U nekim realizacijama konstantni region je aglikozilovan za glikozilovanje povezano sa N. Konstantni region se može aglikozilovati za glikozilovanje povezano sa N enzimatski (kao što je uklanjanje ugljenoghidrata pomoću enzima PNGaze) ili ekspresijom u ćeliju domaćina deficitarnu u glikozilovanju.

Druge modifikacije antitela su antitela koja su modifikovana kao što je opisano u PCT Publication No. WO 99/58572, objavljenoj 18. novembra 1999. Ova antitela sadrže, pored domena za vezivanje usmerenog na ciljani molekul, domen efektora koji ima sekvenciju aminokiselina koja je suštinski homologna sa svim delovima konstantnog domena teškog lanca humanog imunoglobulina. Ova antitela su u stanju da se vezuju za ciljani molekul bez značajnijeg pokretanja komplementarno zavisne liže, ili destrukcije cilja posredoanog ćelijom. U nekim realizacijama domen efektora je u stanju da specifično veže FcRn i/ili FcyRllb. Oni su tipično zasnovani na himeričnim domenima izvedenim iz dva ili više CH2 domena teškog lanca humanog imunoglobulina. Antitela modifikovana na ovaj način su naročito pogodna za upotrebu u hroničnoj terapiji antitelima, kako bi se izbegle inflamatorne i druge štetne reakcije konvencionalne terapije antitelima.

Ovaj pronalazak obuhvata realizacije sa razvojem sazrelog afiniteta. Na primer, antitela sa razvojem sazrelog afiniteta se mogu proizvesti po procedurama koje su poznate u stanju tehnike (Marks et al., Bio/Technology 19, 779-783 (1992); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169, 147-155 (1955); Yelton et al. J. Immunol. 155, 1994-2004 (1995); Jackson et al. J. Immunol. 154, 3310-3319 (1995); Havvkins et al. J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992); i WO 2004/058184).

Za podešavanje afiniteta antitela i karakterizaciju CDR mogu se koristiti sledeći postupci. Jedan način karakterizacije CDR antitela i/ili menjanja (kao što je poboljšanje) afiniteta vezivanja polipeptida, kao što je antitelo, nazvan je "biblioteka skenirajuće mutageneze”. Obično, biblioteka skenirajuće mutageneze radi kao što sledi. Jedno ili više mesta aminokiselina u CDR se zameni sa dve ili više (kao što je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20) aminokiselina, korišćenjem postupka prepoznavanja, poznatog u struci. Ovo generiše male biblioteke klona (u nekim realizacijama, po jednu za svaki položaj aminokiseline koja se analizira), svaka složena od dva ili više članova (ukoliko je dve ili više aminokiselina supstituisano u svakom položaju). Obično, ova biblioteka uključuje takođe i klon koji sadrži (nesupstituisanu) nativnu aminokiselinu. Mali broj klona, npr. oko 20-80 klona (zavisno od složenosti biblioteke) iz svake biblioteke se testira na afinitet vezivanja za ciljani polipeptid (ili drugi cilj vezivanja), pa se identifikuju kandidati sa pojačanim, istim, smanjenim ili nikakvim vezivanjem Postupci za određivanje afiniteta vezivanja su dobro poznati u stanju tehnike. Afinitet vezivanja se može odrediti korišćenjem Biacore analize rezonancije površinskog plazmona, koja detektuje razlike u afinitetu vezivanja koje su oko 2-struke i veće Biacore je naročito koristan kada se polazno antitelo već vezuje sa relativno visokim afinitetom, na primer, sa vrednošću Kd oko 10 ili nižom. Testiranje korišćenjem Biacore rezonancije površinskog plazmona je ovde opisano u Primerima.

Afinitet vezivanja se može odrediti i korišćenjem Kinexa Biocensor, testova bliske scintilacije, ELISA, ORIGEN imunotesta (IGEN), gašenja fluorescencije, prenosa fluorescencije i/ili prikazivanjem kvasca Afinitet vezivanja se može takođe testirati korišćenjem pogodnog biotesta.

U nekim realizacijama, svaki položaj aminokiseline u CDR se zamenjuje (u nekim realizacijama po jedan) sa svih 20 prirodnih aminokiselina, koristeći postupke prepoznavanja mutageneze (neki su ovde opisani), Ovo generiše male biblioteke klona (u nekim realizacijama, po jednu za svaki položaj aminokiseline koja se analizira), a svaka je složena od 20 članova (ako se u svakom položaju supstituiše svih 20 aminokiselina).

U nekim realizacijama, biblioteka koja se ispituje sadrži supstitucije u dva ili više položaja, koji mogu biti u istom CDR ili u dva ili više CDR. Tako, biblioteka može da sadrži supstitucije u dva ili više položaja u CDR. Ova biblioteka može da sadrži supstitucije u dva ili više položaja CDR. Ova biblioteka može da sadrži supstitucije u 3, 4, 5 ili više položaja, a pomenuti položaji se mogu nalaziti u dva, tri, četiri, pet ili šest CDR. Ova supstitucija se može dobiti korišćenjem kodona sa niskim viškom. Videti, npr. Tabelu 2 u Balintet al. Gene 137(1), 109-118 (1993)).

CDR može biti CDRH3 i/ili CDRL3. CDR može biti jedan ili više CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 i/ili CDRH3. CDR može biti Kabat-ov CDR, Choti-ev CDR ili prošireni CDR.

Kandidati sa poboljšanim vezivanjem mogu se sekvencionisati, čime se identifikuje mutant CDR supstitucije koja je dovela do poboljšanog afiniteta (takođe se naziva "poboljšana” supstitucija). Kandidati koji vezuju, mogu takođe da se sekvencioniraju, identifikujući tako CDR supstituciju koja zadržava vezivanje.

Mogu se obaviti višestruki krugovi ispitivanja. Na primer, kandidati (svaki sadrži supstituciju aminokiseline u jednom ili više položaja jednog ili više CDR) sa poboljšanim vezivanjem, korisni su takođe za dizajniranje druge biblioteke, koja sadrži najmanje originalnu i supstituisanu aminokiselinu u svakom poboljšanom položaju CDR (tj. položaj aminokiseline u CDR u kome supstituisani mutant pokazuje poboljšano vezivanje). Dobijanje i ispitivanje ili selekcija ove biblioteke diskutovaće se u nastavku.

Biblioteka skenirajuće mutageneze predstavlja takođe način karakterizacije CDR, utoliko što frekvencija klona sa poboljšanim vezivanjem, istim vezivanjem, smanjenim vezivanjem ili bez vezivanja, takođe daje informaciju koja se odnosi na značaj svakog položaja aminokiseline za stabilnost kompleksa antitelo-antigen. Na primer, ako neki položaj u CDR zadržava vezivanje kada se zameni svih 20 aminokiselina, taj položaj se identifikuje kao položaj za koga nije verovatno da je potreban za vezivanje antigena. Obrnuto, ako položaj u CDR zadržava vezivanje samo u slučaju malog procenta supstitucija, taj položaj se identifikuje kao značajan za funkciju CDR; Dakle, postupci biblioteke skenirajuće mutageneze generišu informacije u pogledu položaja u CDR koji se može menjati sa mnogo različitih aminokiselina (uključujući svih 20 aminokiselina) i položaja u CDR koji se ne mogu menjati ili koji mogu da se promene samo sa

nekoliko aminokiselina

Kandidali sa poboljšanim afinitetom se mogu kombinovati u drugoj biblioteci, koja u tom položaju obuhvata poboljšanu aminokiselinu, originalnu aminokiselinu, a može još da obuhvati i dodatne supstitucije u tom položaju, zavisno od složenosti biblioteke koja se želi ili dozvoljava, korišćenjem željenog postupka ispitivanja ili selekcije. Pored toga, ukoliko se želi susedni položaj aminokiseline može da se nasumice tretira sa najmanje dve ili više aminokiselina. Ovakva nasumična supstitucija susedne aminokiseline može da dozvoli dodatnu konformacionu fleksibilnost u CDR mutantu, što za uzvrat, dozvoljava ili olakšava uvođenje većeg broja poboljšanih mutacija. Ova biblioteka može takođe da sadrži supstituciju u položajima koji nisu pokazali poboljšan afinitet u prvom krugu ispitivanja.

Druga biblioteka se ispituje ili selekcionišu članovi biblioteke sa poboljšanim i/ili izmenjenim afinitetom vezivanja, korišćenjem postupaka poznatih u stanju tehnike, uključujući ispitivanje koje koristi Biacore analizu rezonancije površinskogplazmona, i selekciju koja koristi Postupak poznat u stanju tehnike za selekciju, uključujući prikazivanje faga, prikazivanje kvasca i prikazivanje

ribozoma.

Ovaj pronalazak obuhvata takođe fuzionisane proteine, koji sadrže jedan ili više fragemnata ili regiona iz antitela (kao što je G1) ili polipeptida iz ovog pronalaska U jednoj realizaciji, dobijeni fuzionisani polipeptid sadrži najmanje 10 susednih aminokiselina iz varijabilnog regiona lakog lanca, prikazanog sa SEQ ID NO: 2 (Slika 5) i/ili najmanje 10 aminokiselina iz varijabilnog regiona teškog lanca prikazanig sa SEQ ID NO: 1 (Slika 5). U drugim realizacijama daje se fuzionisani polipeptid koji sadrži najmanje oko 10, najmanje oko 15, najmanje oko 20, najmanje oko 25 ili najmanje oko 30 susednih aminokiselina iz varijabilnog regiona lakog lanca, prikazanog sa SEQ ID NO: 2 (Slika 5) i/ili najmanje oko 10, najmanje oko 15, najmanje oko 20, najmanje oko 25 ili najmanje oko 30 susednih aminokiselina iz varijabilnog regiona teškog lanca, prikazanog sa SEQ ID NO: 2 (Slika 5). U drugoj realizaciji fuzionisani polopeptid sadrži varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilnii region teškog lanca iz G1, kao štopokazuju SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 1 na Slici 5. U drugoj realizaciji fuzionisani polipeptid sadrži jedan ili više CDR iz G1. U još nekim realizacijama, fuzionisani polipeptid sadrži CDR H3 i/ili CDR L3 antitiela G1. Za potrebe ovog pronalska, fuzionisani protein G1 sadrži jedno ili više antitela G1 i drugu sekvenciju aminokiselina za koju on nije pripojen u nativnom molekulu, na primer, heterolognu sekvenciju ili homolognu sekvenciju iz drugo regiona. Primeri heterolognih sekvencija su, ali bez ograničavanja, '‘privezak”, kao što je FLAG privezak ili 6His privezak. Privesci su dobro poznati u stanju tehnike.

Fuzionisani popipeptid G1 se može stvoriti postupcima koji su poznati u stanju tehnike, na primer, sintetskim ili rekombinantnim. Tipično, fuzionisani proteini G1 iz ovog pronalaska prave se pripremanjem ekspresije polinukleotiđa koji ih kodira, koristeći rekombinantne postupke opisane ovde, mada se mogu takođe dobiti i na druge načine poznate u stanju tehnike, uključujući, na primer, hemijsku sintezu.

Ovaj pronalazak daje takođe preparate koji sadrže antitela ili polinukfeotide izvedene iz G1, konjugovane (na primer, povezane) sa agensom koji olakšava kuplovanje na čvrsti nosač (kao što je biotin ili avidin) Jednostavnosti radi, ovde se n avodi obično G1 ili antitela, uz podrazumevanje da se ovi postupci primenjuju na bilo koju od realizacija vezivanja KRPG, koje su opisane ovde. Obično, konjugovanje se odnosi na povezivanje ovih komponenata, kao što jeovde opisano. Povezivanje (koje je obično fiksiranje ovih komponenata u blisku zajednicu, bar za potrebe ordiniranja} se može postići bilo kojim od brojnih načina. Na primer, moguća je direktna reakcija između nekog agensa i nekog antitela, ukoliko svaki od njih poseduje supstituent koji je u stanju da reaguje sa drugim. Na primer, nukleofilna grupa, kao što je amino ili sulfhifrilna grupa, na jednom, može biti u stanju da reaguje sa grupom koja sadrži karbonil, kao što je anhidrid ili halid kiseline, ili sa alkil grupom koja sadrži dobru odlazeću grupu (npr. halid), na drugom.

Antitelo ili polipeptid iz ovog pronalaska se može povezati sa agensom za obeležavanje (alternativno se naziva "oznaka”), kao što je fluorescentni molekul, radioaktivni molekul ili neka druga oznaka poznata u stanju tehnike. Oznake su poznate u stanju tehnike, tako što obezbeđuju (bilo direktno ili indirektno) neki signal.

Ovaj pronalazak daje takođe preparate (uključujući farmaceutske preparate) ik omplete koji sadrže antitelo G1 i, što je razjašnjeno u ovom opisu, bilo koje ili sva antitela i/ili polipeptide koji su ovde opisani.

Ovaj pronalazak daje takođe izolovane polinukleotide koji kodiraju antitela i polipeptide iz ovog pronalaska (uključujući antitelo koje sadrži sekvencije polipeptida lakog lanca i teškog lanca varijabilnih regiona prikazanih na Slici 5) i vektore, i ćelije domaćina koje sadrže polinukleotide.

Prema tome, ovaj pronalazak daje polinukleotide (ili preparate, uključujući i farmaceutske preparate) koji sadrže polinukleotide koji kodiraju bilo koje od sledećih: (a) antitelo G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (b) fragment ili region antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (c) laki lanac antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (d) teški lanac antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (e) jedan ili više varijabilnih regiona iz lakog lanca i/ili teškog lanca antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (f) jedan ili više CDR (jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR) antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (g) CDR H3 iz teškog lanca antitela G1;

(h) CDR L3 iz lakog lanca antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6;

(i) tri CDR iz lakog lanca antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (j) tri CDR iz teškog lanca antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; (k) tri CDR iz lakog lanca i tri CDR iz teškog lanca antitela G1, ili njegove varijante prikazane u Tabeli 6; i (I) antitelo koje sadrži bilo koje od (b) do (k). U nekim realizacijama polinukieotid sadrži jedan ili oba polinukleotida prikazana u SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak daje polinukleotide koji kodiraju bilo koje od antitela (uključujući i fragmente antitela) i polipeptida opisanih ovde, kao što su antitela i polipeptidi koji imaju neuparene efketorske funkcije. Polinuklotidi se mogu napraviti po procedurama koje su poznate u stanju tehnike

U sledećem aspektu ovaj pronalazak daje preparate (kao što su farmaceutski preparati) koji sadrže bilo koji od polinukleotida iz ovog pronalaska. U nekim realizacijama preparat sadrži vektor ekspresije koji sadrži polinukieotid koji kodira antitelo G1r kao što je opisano ovde. U drugoj realizaciji preparat sadrži vektor ekspresije koji sadrži polinukieotid koji kodira bilo koje od antitela ili polipeptida opisanih ovde. U još jednoj realizaciji preparat sadrži bilo jedan ili oba polinukleotida prikazana u SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10. Vektori ekspresije i ordiniranje preparata polinukleotida opisuju se dalje u nastavku.

U sledećem aspektu ovaj pronalazak daje postupak za pravljenje bilo koga od ovde opisanih polinukleotida.

Ovim pronalaskom su obuhvaćeni polinukleotidi koji su komplementarni bilo kojoj od ovih sekvencija. Polinukleotidi mogu biti jednostruko upredeni (kodirani ili antisensm) ili dvostruko upredeni, a mogu biti molekuli DNK (genomska. cDNK ili sintetska) ili RNK. Molekuli RNK su molekuli HnRNK, koji sadrže mtrone i odgovaraju molekulu DNK na način jedan-na-jedan, i molekuli mRNK koji ne sadrže introne. Dodatne sekvencije za kodiranje ili za ne-kodiranje mogu, ali ne moraju, da budu prisutne unutar polinukleotida iz ovog pronalaska, a polinukleotid može, ali ne mora da bude povezan sa drugim molekulima i/ili nosećim materijalima.

Polinukleotidi mogu da sadrže nativnu sekvenciju (tj. endogenu sekvenciju koja kodira antitelo ili njegov deo) ili mogu da sadrže varijantu te sekvencije. Varijante polinukleotida sadrže jednu ili više supstitucija, adicija, izbacivanja i/ili insertovanja, ali tako da imunoreaktivnost kodiranog polipeptida nije umanjena, relativno prema nativnom molekulu imunoreaktiva. Efekat imunoreaktivnosti kodiranog popipeptida se obično može testirati kao što je ovde opisano. Poželjno je da varijante pokazuju najmanje 70% identičnosti, poželjnije najmanje oko 80% identičnosti, a najpoželjnije najmanje oko 90% identičnosti sa sekvencijom polinukleotida koja kodira nativno antitelo ili njegov deo.

Za dve sekvencije polinukleotida ili polipeptida se kaže da su Identične” ukoliko je sekvencija aminokiselina nukleotida u ove dve sekvencije ista, kada se uporede tako da maksimalno korespondiraju, kao što je opisano u nastavku. Poređenje između dve sekvencije tipično se obavlja poređenjem sekvencija unutar prozora za poređenje, da se identifikuju i uporede sličnosti lokalnih regiona sekvencije. "Prozor za poređenje”, kako se ovde koristi, odnosi se na segment od najmanje oko 20 susednih pozicija, obično 30 do oko 75, 40 do oko 50, unutar koga se sekvencije mogu porediti prema referentnoj sekvenciji istog broja susednih pozicija, nakon što se dve sekvencije optimalno uporede.

Optimalno upoređivanje sekvencija za poređenje može se obaviti korišćenjem programa Megalign u softveru Lasergene suite bioinformatics softvvare (DNASTAR, Ine. Madison, Wl), koristeći parametre date u difoltu Ovaj program sadrži nekoliko shema za upoređivanje, opisanih u sledećim referencama: Dayhoff, M.O., članak "A Model of Evolutionary Change in Proteins Matrices for Detecting Distant Relationships" (1978) in Dayhoff, M.O. (uredn.), ” Atlas of Protein Sequence and Structure", National Biomedical Research Foundation, VVashington. DC, Vol. 5, Dodatak 3., str. 345-358: Hein, J., članak "Unified

Approach to Aligment and Phylogenes”, str. 636-645, u "Methods in Enzimology, Vol. 183, Academic Press, Ine. San Diego, CA; Higgins, D.G. i Sharp, P.M., CABIOS 5, 151-153 (1989); Myers, E.W. i Muller W., CABIOS 4, 11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb Theor. 1_1_, 105 (1971); Santou, N., Ness, M., Mol. Biol. Evol. 4, 406-425 (1987); Sneath, P.H.A. i Sokal, R.R., "Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy”, Freeeman Press, San Francisco. CA; VVilbur, W.J. i Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 726730 (1983)

Poželjno je da se "procenat identičnosti sekvencije" određuje poređenjem dve optimalno poravnate sekvencije unutar prozora poređenja od najmanje 20 položaja, pri čemu deo sekvencije polinukleotida ili polipeptida u prozoru za poređenje može da sadrži dodavanja ili izbacivanja (tj. praznine) od 20 procenata ili manje, obično 5 do 15 procenata, ili 10 do 12 procenata, u poređenju sa referentnom sekvencijom (koja ne sadrži dodavanja ili izbacivanja) za optimalno poravnavanje dve sekvencije. Procenat se izračunava određivanjem broja položaja u kojima se nalaze identične nukleinske baze ili ostaci aminokiselina u obe sekvencije, dajući broj uparenih položaja, pa deljenjem broja uparenih položaja sa ukupnim brojem položaja u referentnoj sekvenciji (tj. veličinom prozora), i množenjem dobijenog rezultata sa 100, što daje procenat identičnosti sekvencije.

Varijante mogu takođe, ili alternativno, da budu homologne sa nativmm genom ili njegovim delom ili komplementom Ovakve varijante polinukleotida su u stanju da se hibridizuju pod umereno oštrim uslovima u sekvenciju DNK koja se nalazi u prirodi, kodirajući nativno antitelo (ili komplementarnu sekvenciju).

Pogodni "umereno strogi uslovi” su prethodno pranje u rastvoru 5* SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridizacija na SO^SS^C, 5><SSC, preko noći; posle čega sledi pranje dva puta po 20 min, na 65°C, sa svakim od 2*, 0,5* i 0,2* SSC, koji sadrži 0,1% SDS.

Kako se ovde koristi, sintagma "veoma strogi uslovi" ili "uslovi visoke strogosti" su oni kada se: (1) pri pranju koristi niska |onska jačina, a visoka temperatura, na primer 0,015 M natrijum-hiorid/0,0015 M natrijum-citrat/0,1% natrijum-dodecilsulfat, na 50DC; (2) kada se prilikom hibridizacije koristi agens za denaturaciju, kao što je formamid, na primer 50 vol% formamid sa 0,1% seruma goveđeg albumina/0,1%Ficoll/0,1% polivinilpirolidona/50 mM pufera natrijum-fosfata sa pH 6,5 sa 750 mM natrijum-hloridom, 75 mM natrijum-citratom, na 42°C: ili (3) koristi 50% formamid, 5*SSC (0,75 M NaCI, 0,075 M natrijum-citrat), 50 mM natrijum-fosfat (pH 6,8), 0,1% natrijum-pirofosfat, 5*Denhard-ov rastvor, sonikovana DNK iz sperme lososa (50 pg/mL), 0,1% SDS i 10% dekstran-sulfat, na 42°C, sa ispiranjem na 42°C u 0,2xSSC (natrijunvhlorid/natrijum-citrat) i 50% formamid, na 55°C, pa sledi pranje visoke strogosti, koje se sastoji od 0,1*SSC, koji sadrži EDTA, na 55°C Verzirani stručnjak zna kako će podesiti temperaturu, jonsku jačinu itd., kako je neophodno da se prilagode faktori, kao što je dužina probe i slično.

Onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike zna da kao rezultat degeneracije genetskog koda postoje mnoge sekvencije nukleotida koje kodiraju polipeptid, kao što je ovde opisano. Neki od ovih polinukleotida nose minimalnu homologiju sa sekvencijom nukleotida nativnog gena. Ipak, posebno se podrazumevaju ovim pronalaskom polinukleotidi koji variraju usled razlika u korišćenju kodcna. Dalje, alele gena koji sadrži sekvencije polinukleotida koje se ovde daju, unutar su obima ovog pronalaska. Alele su endogene genima koji su izmenjeni kao posledica jedne ili više mutacija, kao što su izbacivanja, adicije i/ili supstitucije nukleotida. Nastala mRNK i protein mogu, ali ne moraju, imati izmenjenu strukturu ili funkciju. Alele se mogu identifikovati korišćenjem standardnih tehnika (kao što je hibridizacija, amplifikacija i/ili poređenje sa sekvencijom iz baze podataka).

Polinukleotidi iz ovog pronalaska se mogu dobiti korišćenjem hemijske sinteze, rekombinantmm postupcima ili sa PCR. Metode hemijske sinteze polinukleotida su dobro poznate u stanju tehnike i ne treba da se ovde detaljno opisuju. Onaj ko je verziran u stanje tehnike koristi sekvencije koje se ovde daju i komercijalni aparat za sintezu DNK za prozvodnju željene sekvencije DNK.

Za dobijanje polinukleotida upotrebom rekombinantnih postupaka, polinukleotid koji sadrži željenu sekvenciju može se insertovati u pogodan vektor, a taj vektor se zatim može uvesti u pogodnu ćeliju domaćina za replikaciju i amplifikaciju, kao što se diskutuje u nastavku. Polinukleotidi se mogu insertovati u ćelije domaćina bilo kojim načinom, poznatim u stanju tehnike. Ćelije se transformišu uvođenjem egzogenog polinukleotida direktnim upijanjem, endocitozom, transfekcijom, F-sparivanjem ili eiektroporacijom. Kada se jednom uvede, egzogeni polinukleotid može da se održava unutar ćelije kao neintegrisani vektor (kao što je plazmid) ili integrisan u genom ćelije domaćina. Ovako amplifikovan, polinukleotid se može izolovati iz ćelije domaćina postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike. Videti npr., Sambrook et al. (1989).

Alternativno, PCR dozvoljava reprodukciju sekvencija DNK. Tehnologija PCR je dobro poznata u slanju tehnike, a opsiana je u U.S. Patent No. 4,683,195; 4,800,159; 4,754,065 i 4,683,202, kao i u "PCR: The Polimeraze Chain

Reaction", Mullis et al. uredn., Birkauswer Press, Boston (1994).

RNK se može dobiti korišćenjem izolovane DNK u odgovarajućem vektoru, pa insertovanjem u ćeliju pogodnog domaćina. Kada se ova ćelija replicira, a DNK transkribuje u RNK, ova RNK se zatim može izolovati korišćenjem postupaka koji dobro poznati onima koji su verzirani u stanju tehnike, a kao što je opisano, na primer u Sambrook et al. (1989)

Pogodni vektori za kloniranje se mogu konstruisati u skladu sa standardnim tehnikama, ili se mogu odabrati iz velikog broja vektora za kloniranje, dostunih u stanju tehnike. Dok odabrani vektor za kloniranje može da varira u skladu sa namenjenom ćelijom domaćina koja treba da se koristi, korisni vektori za kloniranje obično imaju svojstvo da se samo-replikuju, a mogu da poseduju jedan cilj za posmatranu restrikciju endonukleaze i/ili mogu da nose gene za marker, koji se može koristiti za selekciju klona koji sadrže taj vektor. Pogodni primeri su plazmidi i virusi bakterija, npr. pUC18, pUC19, Bluescript (npr. pBS SK+) i njihovi derivati, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, PR4, DNK faga i šatl vektori, kao što su pSA3 i pAT28. Ovi i mnogi drugi vektori za kloniranje dostupni su od komercijalnih proizvođača, kao što su BioRad, Strategene i Invitrogen.

Vektori ekspresije su obično replikabilni konstrukti polinukleotida, koji sadrže polinukleotid u skladu sa ovim pronalaskom. Podrazumeva se da vektor ekspresije mora biti replikabilan u ćelijama domaćina, bilo kao epizomer ili kao integralni deo hromozomalne DNK. Pogodni vektori ekspresije su, ali bez ograničavanja, plazmidi, virusni vektori, uključujući adenoviruse, adeno-povezane viruse, retroviruse, kosmide i vektore ekspresije opisane u PCT Publication No. WO 87/04462. Komponente vektora mogu obično da uključuju, ali bez ograničavanja, jedan ili više sledećih: signalnu sekvenciju; izvor replikacije; jedan ili više gena markera; pogodne elemente transkripcione kontrole (kao što su promoteri, pojačavači i terminator). Za ekspresiju (tj. translaciju), mogu se zahtevati jedan ili više elelemanta koji kontrolišu translaciju kao što su mesta za vezivanje ribozoma, mesta za inicijaciju translacije i zaustavni kodoni.

Vektori koji sadrže posmatrane polinukleotide mogu se uvesti u ćeliju domaćina bilo kojim od brojnih odgovarajućih načina, uključujući elektroporaciju, transficiranje korišćenjem kalcijum-hlorida, rubidijum-hlorida, kalcijum-fosfata, DEAE-dekstrana ili drugih supstanci; bombardovanjem mikroprojektilima; lipofekcijom i inficiranjem (npr. ako je vektor infektivni agens, kao što je virus vaccinia). Izbor uvođenja vektora ili polinukleotida često će zavisiti od karakteristika ćelije domaćina.

Ovaj pronalazak daje ćelije domaćina koje sadrže bilo koji od polinukleotida opisanih ovde. Bilo koja ćelija domaćina, koja je u stanju da nad-ekspresuje heterologne DNK može da se koristi u svrhu izolovanja gena koji kodiraju posmatrano antitelo, polipeptid ili protein. Primeri bez ograničavanja sisarskih ćelija domaćina su, ali bez ograničavanja, ćelije COS, HeLa i CHO. Videti takođe PCT Publication No. WO 87/04462. Pogodne ne-sisarske ćelije domaćini su prokariotske (kao što je E. coli ili B.subtillis) i kvasci (kao što je S. cerevisiae, S. pomba ili K. lactis). Poželjno je da ćelije domaćina ekspresuju cDNK u sadržaju oko 5-struko većem, poželjnije 10-struko većem, još poželjnije 20-struko većem, nego što odgovara posmatranom endogenom antitelu ili proteinu, ukoliko je prisutno u ćelijama domaćina. Ispitivanje ćelija domaćina na specifičnost vezivanja za AD1-40 ostvaruje se imunotestom ili sa FACS. Ćelija koja nad-ekspresuje posmatrano antitelo ili protein može da se identifikuje.

D. Preparati

Preparati koji se koriste u postupcima iz ovog pronalaska sadrže efikasnu količinu anti-KPPG antagonističkog antitela ili izvedenog polipeptida iz anti-KPPG antagonističkog antitela opisanog ovde. Primeri takvih preparata, kao i kako se formulišu, takođe su opisani u ranijim odeljcima, a biće i u nastavku. U jednoj realizaciji ovaj preparat još sadrži i KPPG antagonist. U drugoj realizaciji, preparat sadrži jedno ili više anti-KPPG antagonističkih antitela. U drugim realizacijama, anti-KPPG antagonističko antitelo prepoznaje humani KPPG. U još nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo je humanizovano. U još nekim realizacijama, ovo anti-KPPG antagonističko antitelo sadrži konstantni region koji ne pokreće neželjeni ili nepoželjan imuno odgovor, kao što je liza ili ADCC posredovana antitelom. U drugim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo sadrži jedno ili više CDR antitela G1 (kao što je jedan, dva, tri, četiri, pet ili u nekim realizacijama svih šest CDR iz G1). U nekim realizacijama anti-KPPG antagonističko antitelo je humano.

Podrazumeva se da ovi preparati mogu da sadrže više od jednog anti-KPPG antaginističkog antitela (npr. smešu anti-KPPG antagonističkih antitela koja prepoznaju različite epitope KPPG). Drugi preparati za primer sadrže više od jednog anti-KPPG antagonističkog antitela koja prepoznaju isti epitop (ili epitope), ili različite vrste anti-KPPG antagonističkih antitela koja se vezuju za različite epitope KPPG.

Prparat koji se koristi u ovom pronalasku može još da sadrži farmaceutski prihvatljive nosače, dodatke ili stabilizatore (Remington, "The Science and Practice of Pharmacy”, 20th ed. (2000), Lippincott, VVilliams and VVilkins, ed. K. Hoover) u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, dodaci ili stabilizatori su netoksični za primaoca u dozama i koncentracijama u kojima se koriste, a mogu da sadrže pufere, kao što su fosfati, citrati i druge organske kiseline; antioksidante, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; prezervative, (kao što su oktadecilmetilbenzilamonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkonijum-hlorid, benzetonijum-hlorid; fenol, butil- ili benzilalkohol; alkilparabene, kao što je metil- ili propilparaben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol i m-krezol); poipeptide niske molarne mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je serum albumina, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljenehidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrane; agense za helatiranje, kao što je EDTA; šećere, kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji formiraju soli, kao što je natrijum; komplekse metala (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što su TVVEEN™, PLURONICS™ ili polietilenglikol (PEG). Farmaceutski prihvatljivi dodaci se ovde još opisuju.

Anti-KPPG antagonističko antitelo i njegovi preparati se mogu takođe koristiti zajedno sa drugim agensima koji služe za pojačavanje i/ili komplementarnu efikasnost ovih agenasa.

E. Kompleti

Ovaj pronalazak daje takođe komplete za upotrebu ovih postupaka. Kompleti iz ovog pronalaska su jedan ili više kontejnera koji sadrže ovde opisano anti-KPPG antagonistićko antitelo (kao što je humanizovano antitelo) ili ovde opisan polipeptid i uputstvo za upotrebu, u skladu sa bilo kojim od ovde opisanih postupaka iz ovog pronalaska. Obično, ova uputstva sadrže opis ordiniranja anti-KPPG antagonističkog antiteia za tretiranje, ublažavanje Ili prevenciju glavobolje (kao što je migrena) u skladu sa bilo kojim od ovde opisanih postupaka. Komplet može još da sadrži opis izbora pojedinca pogodnog za tretman zasnovan na identifikaciji da li taj pojedinac ima glavobolju ili da li je taj pojedinac pod rizikom da dobije glavobolju. U još nekim realizacijama, ovo uputstvo sadrži opis ordiniranja anti-KPPG antagonističkog antiteia pojedincu koji je pod rizikom da dobije glavobolju (kao što je migrena).

U nekim realizacijama antitelo je humanizovano antitelo. U nekim realizacijama antitelo je humano. U drugim realizacijama antitelo je monklonalno antitelo. U još nekim realizacijama antitelo sadrži jedan ili više CDR antiteia G1 (kao što je jedan, dva, tri, četiri, pet, ili u nekim slučajevima svih šest CDR iz G1).

Uputstvo koje se odnosi na upotrebu anti-KPPG antagonističkog antiteia obično sadrži informacije kao što su doziranje, shema doziranja i put ordiniranja za namenjeni tretman. Kontejneri mogu da sadrže jedinične doze, veća pakovanja (npr. pakovanje sa više doza) ili sub-jedinične doze. Uputstvo kojim je opremljen komplet iz ovog pronalaska tipično je pisano uputstvo na etiketi ili umetnuto u pakovanje (npr. list papira priključen uz komplet), ali prihvatljiva su uputstva koja može da čita mašina (npr. uputstvo dato na magnetnom ili optičkom disku za skladištenje podataka).

Etiketa ili umetak u pakovanje pokazuje da se preparat koristi za tretiranje, ublažavanje i/ili prevenciju glavobolje (kao što je migrena). Uputstvo se može dati za praktičnu upotrebu bilo koga od postupaka opisanih ovde.

Kompleti iz ovog pronalaska su u pogodnim pakovanjima. Pogodno pakovanje obuhvata, ali bez ograničavanja, fiole, bočice, tegle, savitljiva pakovanja (npr. zapečaćene Mylar ili plastične kesice) i slično. Takođe podrazumevaju se pakovanja za upotrebu u kombinaciji sa specifičnim uređajem, kao što je inhalator, uređaj za nazalno ordiniranje (npr. atomizer) ili uređaj za infuziju, kao što je minipumpa. Komplet može imati sterilni ulazni pristup (na primer, kontejner može biti kesa ili fiola sa intavenskim rastvorom, koja ima čep koji se može probušiti sa hipodermičkom iglom za injekcije). Kontejner može takođe da ima sterilni ulazni pristup (na primer kontejner može biti kesa ili fiola koja ima čep koji se može probušiti sa hipodermičkom iglom za injekcije). Najmanje jedan aktivni agens u preparatu je anti-KPPG antagonističko anitelo. Kontejner može još da sadrži i drugi farmaceutski aktivni agens.

Opciono, komplet može da sadrži i dodatne komponente, kao što su puferi i informacije. Normalno, komplet sadrži kontejner i etiketu ili dodatak pakovanju na njemu ili povezan sa kontejnerom.

Primeri koji slede daju se da se ilustruje, ali ne ograniči, ovaj pronalazak.

Primeri Primer 1.

Generisanie i karakterizaciia monoklonalnih antitela usmerenih protiv KPPG Generisanje anti-KPPG antagonističkog antitela. Da bi se generisalo anti-KPPG antagonističko antitelo koje ima ukrštenu reaktivnost čestice za pacovski i humani KPPG, miševi se imunizuju sa 25-100 pg humanog α-KPPG ili β-KPPG, konjugovanog sa KLH, u adjuvantu (50 pL za početak, ukupno 100 pL po mišu) u raznim intervalima. Intimizacija se obično obavlja kao što je opisano u Geerligs, H.J. et al., J. immunol. Methods 124, 95-102 (1989); Kenney, J.S: et al., J. Immunol. Methods 121, 157 166 (1989); i VVicher, K. et al Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89, 128-135 (1989). Miševi se prvo imunizuju sa 50 pg humanog a-KPPG ili |3-KPPG, konjugovanog sa KLH u CFA (kompletan Freund-ov adjuvant).

Posle 21 dan miševi se drugi put imunizuju sa 25 pg humanog [3-KPPG (za miševe koji su prvi put imunizovani sa humanim α-KPPG) ili sa α-KPPG (za miševe koji su prvi put imunizovani sa β-KPPG) konjugovanim sa KLH u IFA (nekompletni Freund-ov adjuvant). Dvadesettri dana posle druge imunizacije, obavi se treća imunzacija, sa 25 pg α-KPPG konjugovanog sa KLH u IFA. Deset dana kasnije testiraju se titri antitela korišćenjem ELISA. Četvrta imunizacija se obavlja sa 25 pg peptida (pacovski α-KPPG-KLH) u IFA, 34 dana posle treće imunizacije. Konačna injekcija se obavi sa 100 pg rastvornog peptida (pacovski α-KPPG) 32 dana posle četvite imunizacije

Uzmu se splenociti iz imunizovanih miševa, pa se fuzionišu sa NSO ćelijama mijeloma, u odnosu 10:1 sa polietilenglikolom 1500. Ovi hibridi se stave na ploče sa 96 bazenčića u DMEM, koji sadrži 20% konjskog seruma, 2-oksaloacetat/piruvat/insulin (Sigma) i hipoksantin/aminoplerin/timidin, pa se počne selekcija. Osmog dana se u sve bazenčiće doda 100 pL DMEM sa 20% konjskog seruma. Supernatant (gornji bistri sloj) hibrida se ispita korišćenjem imunotesta sa zahvatom antitela. Određivanje klase antitela se obavi sa drugim antitelima specifičnim po klasi.

Za potrebe dalje karakterizacije izabere se panei sojeva ćelija koje proizvode monoklonaino antitelo, na osnovu njihovog vezivanja za humani i pacovski KPPG. Ova tela i njihove karakteristike su prikazana u Tabelama 2 i 3, niže.

Prečišćavanje i dobijanje Fab fragmenta. Monokionalna antitela, koja su odabrana za dalje karakterisanje, prečiste se od hibridoma iz bistrog sloja kulture, korišćenjem hromatografije sa afinitetom prema proteinu A. Ovi supernatanti se zatim prebace u kolonu sa proteinom A MabSelect (Amersham Bioscience #17-5199-02), uravnoteženu sa PBS do pH 8. Ova kolona se ispere sa 5 zapremina kolone sa PBS, pH 8. Antitela se eluiraju sa 50 mM puferom citrat-fosfat, pH 3. Eluirana antitela se neutrališu sa 1M fosfatnim puferom, pH 8. Prečišćena antitela se dijalizuju sa PBS, pH 7,4. Koncentracije antitela se odrede pomoću SDS-PAGE, korišćenjem standardne krive mišjeg monokionalnog antitela.

Fab-ovi se dobijaju proteolizom celakupnih antitela sa papainom, koristeći komplet Immunopurine Fab kit (Pierce #44385), pa se prečiste proticanjem kroz hromatografsku kolonu sa proteinom A, sledeći uputstva proizvođača. Koncentracije se odrede pomoću ELISA i/ili SDS-PAGE elektroforeze, koristeći Fab standard poznate koncentracije (određene analizom aminoktselina) i pomoću A280, koristeći 10D=0,6 mg/mL (ili teorijski ekvivalent, na osnovu sekvencije aminokiselina).

Određivanje afiniteta Fab. Afiniteti anti-KPPG monoklonalnih antitela se određuju ili na 25°C ili na 37°C, korišćenjem Biacore3000TI sistema rezonancije površinskog plazmona (Biacore, INC, Piscataway, NJ) sa protočnim puferom proizvođača, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCt, 3 mM EDTA, 0,005 vol% polisorbat P20). Afinitet se određuje zahvatanjem biotinifovanih KPPG peptida sa N-terminala (nabavljenih iz GenScript Corporation, New Jersey, ili iz Global Peptide Services, Colorado), preko prethodno imobilizovanog streptavidina na čipu SA, pa merenjem kinetike vezivanja antitela Fab, titrisanog preko površine KPPG, Biotinilovani KPPG se razblaži sa HBS-EP, pa injektira preko čipa, sa koncentracijom manjom od 0,001 mg/mL. Koristeći promenljivo vreme protoka preko pojedinačnih kanala čipa, ostvarena su dva opsega gustine antigena: <50 jedinica odgovora za detaljno kinetičko ispitivanje i oko 800 jedinica odgovora za ispitivanje koncentracije i testiranje. Dvostruka ili trostruka razblaženja, tipično sa koncentracijom koja se kreče od 1 µM do 0,1 nM (ciljano na 0,1-10 puta procenjenu vrednost Kd) prečišćenih fragmenata Fab, injektiraju se tokom 1 min, sa 100 pL/min, pa se dozvoli vreme za disocijaciju u trajanju od 10 min Posle svakog ciklusa vezivanja, površine se regenerišu sa 25 mM NaOH u 25 vol% etanola, sa tolerancijom od preko stotinu ciklusa. Konstanta brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (k0fr) dobija se istovremeno fitovanjem podataka u 1:1 Langmuir-ov model vezivanja (Karlsson, R., Roos, H.,

Fagerstam, L, Peterson, B., Methods Enzymology 6, 99-110 (1994), koristeći program za vrednovanje BIAevaluation. Celovite konstante ravnoteže disocijacije (KD), ili "afiniteti”, izračunavaju se iz odnosa KD = k0ff/kon. Afiniteti mišjih fragmenata Fab su prikazani u Tabelama 2 i 3.

Mapiranje epitopa mišjih anti-KPPG antitela. Da bi se odredio epitop koji vezuje anti-KPPG antitela za humani α-KPPG, afiniteti vezivanja fragmenata Fab, za razne fragmente KPPG, mereni su kao što je gore opisano, zahvatanjem na N-terminalu biotinilovanih KPPG fragmenata aminokiselina 19-37 i aminokiselina 25-37 na senzorskom čipu SA. Slika 1 prikazuje njihove afinitete vezivanja merene na 25°C. Kao što pokazuje Slika 1, sva antitela, izuzev antitela 4901, se vezuju za humane α-KPPG fragmente 19-37 i 25-37, sa afinitetom sličnim njihovim afinitetima vezivanja za humani α-KPPG čitave dužine (1-37). Antitelo 4901 se vezuje za humani α-KPPG fragment 25-37 sa šestostruko manjim afinitetom, nego što se vezuje za humani α-KPPG fragment celokupne dužine, uglavnom usled gubitka u brzini disocijacije. Ovi podaci ukazuju da se ova anti-KPPG antitela obično vezuju za KPPG sa kraja C-terminala.

Skenovanje alanina je obavljeno da bi se dalje karakterisale aminokiseline u humanom α-KPPG, koji je uključen u vezivanje anti-KPPG antitela. Različite varijante humanog α-KPPG sa po jednom supstitucijom alanina, generisane su sintezom peptida. Njihove sekvencije aminokiselina su prikazane u Tabeli 4, zajedno sa svim ostalim peptidima, koji su korišćeni u analizi Biacore. Afiniteti fragmenata Fab iz anti-KPPG antitela u ovim varijantama su određeni korišćenjem Biacore, kao što je opisano gore. Kao što pokazuje Slika 1, svih 12 antitela ciljaju epitop na C-terminalu, sa aminokiselinom F37, kao najhitnijim ostatkom. Mutacija F37 u alanin značajno snižava afintet ili čak kompletno ukida vezivanje anti-KPPG antitela za ovaj peptid. Sledeći najznačajniji ostatak aminokiselina je G33, ali samo su antitela visokog afiniteta (7E9, 8B6, 10A8 i 7D11) pod uticajem zamene alanina u ovom položaju. Ostatak aminokiseline S34 takođe igra značajnu ulogu, ali u manjoj meri, u vezivanju ova četiri antitela visokog afiniteta.

TABELA 2.

Karakteristike anti-KPPG monoklonainih antitela koja se vezuju za humani α-KPPG i njihova antagonistička aktivnost

Primedbe: Antitelo 4901 je komercijalno dostupno (Sigma, Product No. C7113) n. o. = nije određivano

TABELA 3

Karakteristike anti-KPPG monkionalnih antitela koja se vezuju za pacovski

α-KPPG i antagonistička aktivnost

Primedba: "n.o." označava da test nije obavljen za to antitelo

TABELA 4

Sekvencije aminokiselina fragmenata humanog α-KPPG (SEQ ID NO: 15-40) i srodnih peptida (SEQ ID NO: 41-47). Svi peptidi su u okolini C-terminala, izuzev SEQ ID NO: 36-40. Ostaci označeni masnim slovima ukazuju na rnesto mutacija

Primedba: rat = pacovski

Primer 2.

Ispitivanje anti-KPPG antagonističkih antitela korišćeniem testova in vitro Mišja anti-KPPG antitela su dalje ispitivana na antagonističku aktivnost in vitro, koristeći test ćelijske aktivacije cAMP i test vezivanja

Antagonistička aktivnost merena testom cAMP. Razdeli se 5 |jL humanog ili pacovskog α-KPPG (konačna kncentracija 50 nM) u prisustvu ili u odsustvu anti-KPPG antitela (konačna koncentracija 1-3000 nM), ili pacovskog α-KPPG ili humanog α-KPPG (konačna koncentracija 0,1 nM - 10 pM. kao pozitivna kontrola za aktiviranje cAMP), na ploču sa 384 bazenčića (Nunc, cat. No. 264657). U bazenčiće na ovoj ploči se doda 10 pL ćelija (humanih SK-N-MC ako se koristi humani α-KPPG, ili pacovskih L6 iz ATCC, ako se koristi pacovski a-KPPG), u puferu za stimulaciju (20 mM HEPES, pH 7,4, 146 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM CaCI2, 1 mM MgCI2 i 500 µM 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX)). Ploča se inkubira 30 min na sobnoj temperaturi.

Posle inkubacije obavi se aktiviranje cAMP korišćenjem testa HitHunter™ Enzyme Fragment Complementation Assay (Applied Biosystems), sledeći uputstva proizvođača. Ovaj test je zasnovan na genetskim inžinjeringom skrojenom enzimu (3-galaktozidazi, koji se sastoji od dva fragmenta, nazvana akceptor enzima, ili Enzyme Acceptor (EA) i donor enzima, ili Enzyme Donor (ED). kada su ova dva fragmenta razdvojena enzim nije aktivan Kada su fragmenti zajedno, mogu spontano da se rekombinuju formirajući enzim, procesom koji se zove komplementacija. Test platforma EFC koristi konjugat peptida ED-cAMP. gde cAMP prepoznaje anti-cAMP. Ovaj ED fragment je u stanju da se reasocira sa EA formirajući aktivni enzim U testu, anti-cAMP antitelo se optimalno titriše da bi vezalo ED-cAMP konjugat i inhibira stvaranje enzima. Sadržaji cAMP u uzorcima ćelijskog lizata nadmeću se sa ED-cAMP konjugatom prilikom vezivanja za anti-cAMP antitelo. Količina ED konjugata u testu je proporcionalna koncentraciji cAMP Stoga, cAMP se meri formiranjem aktivnog enzima, koji se kvantitativno određuje obrtom luminiscentnog substrata p-galaktozidaze. Test aktiviranja cAMP se obavlja dodavanjem 10 pL pufera za ližu i anti-cAMP antitela (odnos 1:1), posle 60 min inkubiranja na sobnoj temperaturi Zatim se 10 pL reagensa ED-cAMP doda u svaki bazenčić, pa se inkubira 60 min na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije u svaki bazenčić se doda 20 pL reagensa EA i smeše CL (koja sadrži substrat) (odnos 1:1), pa se inkubira 1-3 h, ili preko noći, na sobnoj temperaturi. Ploča se očitava sa 1 s/bazenčić na instrumentu PMT, ili 30 s/mestu na imidžeru. Identifikuju se antitela koja inhibiraju aktivnost cAMP pomoću α-KPPG (označeno sa ”da”) u gornjim Tabelama 2 i 3. Podaci u Tabelama 2 i 3 pokazuju da antitela koja pokazuju antagonističku aktivnost u testu obično imaju visoki afinitet. Na primer, antitela koja imaju KD (određena na 25°C) od oko 80 nM ili manju za humani α-KPPG ili imaju Kd (određenu na 37°C) od oko 47 ili manju, za pacovski α-KPPG, pokazuju antagonističku aktivnost u ovom testu.

Test vezivanja radioaktivnog Uganda. Test vezivanja se obavlja da bi se odredila vrednost IC50 anti-KPPG antitela za blokiranje KPPG vezivanja za receptor, kao što je ranije opisano. Zimmermann et al. Peptides 16, 421-4 (1995); Mallee et al. J. Biol. Chem. 277, 14294-8 (2002). Inkubiraju se 90 min membrane (25 pg) ćelija SK-N-MC, na sobnoj temperaturi, u puferu za inkubaciju (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 5 mM MgCI2, 0,1% BSA), koji sadrži 10 µM 126l-humani α-KPPG u ukupnoj zapremini od 1 ml_. Da bi se odredile inhibicione koncentracije (IC50) antitela ili neobeleženog KPPG (kao kontrole), od 100-struko koncentrovanijeg rastvora, rastvaraju se različite koncentracije u puferu za inkubaciju, pa se inkubiraju istovremeno sa membranama i 10 µM 125l-humanim α-KPPG. Inkubacija se završava filtriranjem kroz stakleni mikrofilter (GF/B, 1 pm), koji je blokiran sa 0,5% polietileniminom. Nacrtaju se krive doza-odgovor, pa se vrednosti Kj odrede korišćenjem jednačine: K = IC5o/{1+[ligand]/KD}, gde je konstanta ravnoteže disocijacije KD=8 µM za humani α-KPPG za recepor KPPG1, prisutan u ćelijama SK-N-MC, a Bmax = 0,025 pmol/mg proteina. Prikazane vrednosti IC5o (za molekule lg) se konvertuje u mesta za vezivanje (množenjem sa 2), tako da se može uporediti sa afinitetima (KD), određenim pomoću Biacore (videti Tabelu 2).

Tabela 2 pokazuje vrednosti IC50 za mišja antitela 7E9, 8B6, 6H2 i 4901. Podaci ukazuju da je afinitet antitela u korelaciji sa IC50: antitela sa višim afinitetom (niže vrednosti KD) imaju niže vrednosti IC50, u testu vezivanja radioaktivnog liganda.

Primer 3.

Efekat anti-KPPG antagonističkih antitela na vazodilataciiu kože izazvanu stimulacijom nerva satene pacova

Da bi se testirala antagonistička aktivnost anti-KPPG antitela, testiran je efekat antitela na vazodilataciju kože stimulisanjem nerva safene pacova: koristeći model pacova. opisan ranije Escott et al. Br. J. Pharmacol, 110, 772-776 (1993). U ovom modelu električna stimulacija nerva safene izaziva oslobađanje KPPG iz nervnih završetaka, što za rezultat ima porast protoka krvi u koži. Protok krvi u koži stopala mužjaka pacova soja Sprague Dawley (170-300 g iz Charles River Hollister) meri se nakon stimulacije nerva safene Pacovi se drže pod anestezijom sa 2% izofluranom. Na početku eksperimenta se daje bretilijum tozilat (30 mg/kg, ordiniran iv), kako bi se svela na minimum vazokonstrikcija usled istovremene stimulacije simpatetskih vlakana nerva safene Telesna temperatura se održava na 37°C, korišćenjem rektalne probe, termostatski povezane sa kontrolom temperature grejnog ćebeta. Jedinjenja koja obuhvataju antitela, pozitivnu kontrolu (KPPG 8-37) i tečni nosač (PBS, 0,01% TVVEEN 20) daju se intravenski kroz desnu femoralnu venu, izuzev u eksperimentu prikazanom na Slici 3, gde su testirano jedinjenje i kontrola injektovani kroz repnu venu, i za eksperimente prikazane na Slikama 2A i 2B, gde su antitela 4901 i 7D11 injektovana intraperitonealno (IP). Jedinjenje - pozitivna kontrola je KPPG 8-37 (antagonist vazodilatacije), zahvaljujući njegovom kratkom polu-životu, davano je 3-5 min pre stimulacije nerva, sa 400 nmol/kg (200 pL). Tan et al., Clin. Sci. 89, 656-73 (1995), Antitela se daju u različitim dozama (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg. 10 mg/kg i 25 mg/kg)

U eksperimentima prikazanim na Slikama 2A i 2B, antitelo 4901 (25 mg/kg), antitelo 7D11 (25 mg/kg) ili tečni nosač kao kontrola (PBS sa 0,01% TVVEEN 20) ordiniraju se intraperitonealno (IP) 72 h pre stimulacije električnim pulsem. U eksperimentu prikazanom na Slici 3, antitelo 4901 (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg ili 25 mg/kg) ili tečni nisač kao kontrola (PBS sa 0,01% TVVEEN 20) ordiniraju se intravenski 24 h pre stimulacije električnim pulsem. Posle ordiniranja antitela ili tečnog nosača kao kontrole, hirurški se otvori nerv satena desne zadnje noge, iseče proksimalno i prekrije plastičnim zavojem, kako bi se sprečilo isušivanje. Laserska Doppler-ova proba se stavi na medio-dorsalnu stranu kože zadnje šape, koja predstavlja region koji je inerviran nervom satene. Protok krvi kroz kožu se meri kao protok krvnih zrnaca, a prati se sa laserskim meračem Doppler-ovog protoka. Kada se uspostavi stabilan osnovni protok (varijacije manje od 5%) tokom poslednjih 5 min, nerv se postavi preko platinskih bipolarnih elektroda, pa se električno stimuliše sa 60 pulseva (2 Hz, 10 V, 1 ms tokom 30 s), a zatim ponovo posle 20 min. Određuje se kumulativna promena u protoku krvi kroz kožu, preko površine ispod krive (PIK) protok-vreme (PIK je jednaka promeni protoka pomnoženoj sa pramenom vremena) za svaki odgovor protoka na stimulaciju električnim pulsem. Uzima se prosečan odgovor protoka krvi za dve stimulacije. Životinje se drže pod anestezijom tokom perioda od jednog do tri sata.

Kao što pokazuju Slika 2A i Slika 2B, porast protoka krvi, stimulisan primenom električnih pulseva na nerv satene, inhibira prisustvo KPPG 8-37 (400 mmol/kg, ordiniran i.v.), antitela 4901 (25 mg/kg, ordiniran i.p.) ili antitela 7D11 (25 mg/kg, ordiniran i.p.), u odnosu na kontrolu. KPPG 8-37 se ordinira 3-5 min pre stimulacije nerva satene, a antitela se ordiniraju 72 h pre stimulacije nerva satene. Kao što pokazuje Slika 3, porast protoka krvi, stimulisan primenom električnih pulseva na nerv satene, inhibira prisustvo antitela 4901, sa različitim dozama (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg i 25 mg/kg), ordiniranog intravenski 24 h pre stimulacije nerva satene.

U eksperimentima prikazanim na Slikama 4A i 4B, nerv satene je hirurški otvoren pre ordiniranja antitela. Nerv satene zadnje desne noge je hirurški otvoren, isečen proksimalno i pokriven plastičnim zavijem da se spreči sušenje. Laserska Doppler-ova proba se stavi na medio-dorsalnu stranu kože zadnje noge, koja je region inerviran nervom satene. Protok krvi kroz kožu meri se kao protok krvnih zrnaca, a prati se meračem protoka sa laserskim Doppler-om. Trideset do

četrdesetpet minuta posle injekcije bretilijum-tozilata, kada se tokom 5 min uspostavi stabilan osnovni protok (varijacije manje od 5%), nerv se stavi preko platinskih bipolarnih elektroda, pa se električno stimuliše (2 Hz, 10 V, 1 ms, tokom 30 s), pa ponovo nakon 20 min. Prošek odgovora protoka krvi na dve ovakve stimulacije se koristi za utvrđivanje osnovne linije (veme 0) za električnu stimulaciju. Antitelo 4901 (1 mg/kg ili 10 mg/kg), antitelo 7E9 (10 mg/kg), antitelo 8B6 (10 mg/kg) ili tečni nosač (PBS sa 0,01% TVVEEN 20) ordiniraju se zatim intravenski. Nerv se zatim stimuliše (2 Hz, 10 V, 1 ms, tokom 30 s) 30 min, 60 min, 90 min i 120 min posle ordiniranja antitela ili tečnog nosača. Životinje se drže pod anestezijom tokom perioda od približno 3 h. Kumulativna promena u protoku krvi kroz kožu, određena kao površina ispod krive protok-vreme (PIK je jednaka promeni protoka pomnoženoj sa pramenom vremena), za svaki odgovor fluksa na stimulaciju električnim pulsem.

Kao što pokazuje Slika 4A porast protoka krvi, stimulisan primenom električnih pulseva na nerv safene, značajno je inhibiran prisustvom antitela 4901 sa 1 mg/kg, ordiniranog i.v., kada je stimulacija električnim pulsem primenjivana 60 min, 90 min i 120 min posle ordiniranja antitela, i da je protok krvi stimulisan primenom električnih pulseva na nerv safene značajno inhibiran u prisustvu antitela 4901 sa 10 mg/kg ordiniranog i.v., kada je električna stimulacija primenjivana 30 min, 60 min, 90 min i 120 min posle ordiniranja antitela. Slika 4B prikazuje da je porast protoka krvi stimulisan primenom električnh pulseva na nerv safene značajno inhibiran u prisustvu antitela 7E9 (10 mg/kg, ordiniranje i.v.) kada je električna stimulacija primenjivana 30 min, 60 min, 90 min i 120 min posle ordiniranja antitela, i u prisustvu antitela 8B6 (10 mg/kg, ordiniranje i.v.) kada je stimulacija električnim pulsem primenjivana 30 min posle ordiniranja antitela.

Ovi podaci pokazuju da su antitela 4901, 7E9, 7D11 i 8B6 efikasna u blokiranju aktivnosti KPPG, prilikom merenja vazodilatacije kože izazvane stimulacijom nerva safene pacova.

Primer 4.

Karakterizaciia anti-KPPG antitela G1 i njegovih varijanti

Sekvencija aminokiselina teškog lanca varijabilnog regiona i lakog lanca varijabilnog regiona anti-KPPG antitela G1 prikazana je na Slici 5. Sledeći postupci su korišćeni za ekspresiju i karakterizaciju antitela G1 i njegovih varijanti.

Koristi se vektor ekspresije. Ekspresija Fab fragmenta ovog antitela je pod kontrolom promotera OacZ koji se indukuje sa IPTG, slično onom koji je opisao Barbas u Thage Display: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, str. 2.10 (2001). Međutim, modifikacije vektora pComb3X su obuhvatile adiciju i ekspresiju sledećih dodatnih domena: konstantni domen lakog lanca humanog kapa i konstantan domen CH1 iz humanog globulina lgG2, C region lg gama-2 lanca, pristupni broj proteina P01859; laki lanac imunoglobulina kapa (homosapiens), pristupni broj proteina CAA09181.

Dobijanje Fab na maloj skali. Iz transformisane E. coli (ili korišćenjem TG1 ćelija kompetenetnih za elektroporaciju, ili hemijski kompetentnih ćelija Top 10) sa bibliotekom Fab, upotrebljene su pojedinačne kolonije za inokulaciju master-ploče (agar LB + karbencilin (50 pg/mL) + 2% glukoza) i radne ploče (2 mL/bazenčić, ploča sa 96 bazenčića), gde je svaki bazenčić sadržao 1,5 mL LB + karbencilin (50 pg/mL) + 2% glukoze. Preko ploča je stavljena adhezivna traka, propusna za gasove (Abgene, Surrey, UK). Obe ploče se12-16 h inkubiraju na 30°C; radna ploča se snažno mućka. Master-ploča se čuva na 4°C, dok ne zatreba, a ćelije iz radne ploče se peletiraju (4000 o/min, 4°C, 20 min), pa resuspenduju u 1,0 mL LB + karbencilin (50 pg/mL) + 0,5 mM IPTG, da se izazove ekspresija Fab, uz snažno mućkanje, tokom 5 h, na 30°C. Indukovane ćelije se centrifugiraju sa 4000 o/min, na 4°C, tokom 20 min, pa resuspenduju u 0,6 mL pufera Biacore HB-SEP (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0,005 vol% P20). Uza ćelija, resuspendovanih u HB-SEP, se sprovodi smrzavanjem (-80JC), a zatim otkravljivanjem na 37DC. Lizati ćelija se centrifugiraju sa 4000 o/min, na 4°C, tokom 1 h, da se odvoji otpad od supernatanta u kome je sadržan Fab, koji se zatim filtrira (0, 2 μm), koristeći sistem Milipore MultiScreen Assay System i ploču za filtriranje sa 96 bazenčića u vakuum uređaju. Za analizu filtriranih supernatanata koristi se Biacor injektiranjem preko KPPG na senzorskom čipu. Klonovi izabrani po afinitetu, koji ekspresuju Fab, izolovani su sa master-ptoče, čime se dobije kalup DNK za PCR, sekvencioniranje i dobijanje plazmida.

Dobijanje Fab na velikoj skali. Da bi se dobili kinetički parametri, Fab se ekspresuju na velikoj skali, kao što sledi. Erlenmajerovi sudovi, koji sadrže 150 mL LB + karbencilin (50 pg/mL) + 2% glukozu, inokuliraju se preko noći sa 1 mL kulture :,startera'’, iz po afinitetu selekcionisanih klona E. coli koji ekspresuju Fab. Ostatak kulture startera (~3 mL) se koristi za dobijanje plazmida DNK (OIAprep mini-prep, Qiagen kit) za sekvencioniranje i dalju manipulaciju. Ova velika kultura se inkubira na 30°C, uz snažno mućkanje, sve dok se ne dostigne vrednost ODeoonm od 1,0 (tipično za 12-16 h). Ćelije se peletiraju centrifugiranjem sa 4000 o/min, na 4°C, tokom 20 min, pa se resuspenduju u 150 mL LB + karbancilin (50 pg/mL) + 0,5 mM IPTG. Posle 5 h ekspresije na 30CC, ćelije se peletiraju centrifugiranjem sa 4000 o/min, na 4°C, tokom 20 min, pa se resuspenduju u 10 mL pufera Biacore HBS-EP i lizuju koristeći jedan ciklus smrzavanja (-S0°C) i odmrzavanja (37°C). Lizati ćelija se peletiraju centrifugiranjem sa 4000 o/min, na 4°C, tokom 1 h, a supernatanti se sakupe i filtriraju (0,2 pm) Supernatanti filtrata se prebace u kolone Ni-NTA sa superprotokom sefaroze (Qiagen, Valencia, CA), uravnotežene sa PBS, pH 8, a zatim isperu sa 5 zapremina kolone sa pBS pH 8. Eluiraju se Fab pojedinačno u različitim frakcijama sa PBS (pH () + 300 mM imidazolom. Frakcije koje sadrže Fab se sakupe pa dijalizuju u PBS, zatim kvantitativno odrede pomoću ELISA, pre karakterizacije afiniteta.

Dobijanje celovitog antitela. Za ekspresiju celovitih antitela varijabilni regiom teškog i lakog lanca se kloniraju u sisarske vektore ekspresije i transficiraju

korišćenjem liofektamina u ćelije HEK 293 za tranzientnu ekspresiju. Antitela se prečišćavaju korišćenjem proteina A u standarnim postupcima.

Vektor pDb.KPPG.hFcGI je vektor ekspresije koji sadrži teški lanac antitela G1 i pogodan je za tranzijentnu ili stabilnu ekspresiju teškog lanca. Vektor pDb.KPPG.hFcGI ima sekvenciju nukleotida koja odgovara sledećim regionima: mišjem regionu promotera citomegalovirusa (nukleotidi 7-612); sintetskom intronu {nukleotidi 613-1679); regionu kodiranja DHFR (nukleotidi 688-1253); signalnom peptidu humanog hormona rasta (nukleotidi 1899-1976); teškom lancu varijabilnog regiona G1 (nukleotidi 1977-2621); teškom lancu konstantnog regiona humanog lgG2, koji sadrži sledeće mutacije: A330P331 do S330S331 (numeracija ammokiselina se odnosi na sekvenciju divljeg tipa lgG2; videti Eur. J. Immunol. 29, 2613-2624 (1999) Vektor pDb.KPPG.hFcGI je deponovan u ATCC 15. jula 2005, i pripisan mu je ATCC Accession No. PTA-6867

Vektor pEb.KPPG.hKG1 je vektor ekspresije koji sadrži laki lanac antitela G1 i pogodan je za tranzijentnu ekspresiju lakog lanca. Vektor pEb.KPPG.hKG1 ima sekvencije nukleotida koje odgovaraju sledećim regionima: mišjem regionu promotera citomegalovirusa (nukleotidi 2-613); humanom EF-1 intronu (nukleotidi 614-1149). regionu kodiranja DHFR (nukleotidi 688-1253); signalnom peptidu humanog hormona rasta (nukleotidi 1160-1237); lakom lancu varijabilnog regiona antitela G1 (nukleotidi 1238-1558); konstantnom regionu humanog kapa lanca (nukleotidi 1559-1882). Vektor pEb.KPPG.hKG1 je deponovan u ATCC 15. jula 2005, i pripisan mu je ATCC Accession No. PTA-6866.

Biacore test za određivanje afiniteta. Afiniteti monokionalnog antitela G1 i njegovih varijanti određivan je ili na 25° ili na 37°C, koristeći sistem Biacore 3000™ rezonancije površinskog plazmona (Biacore, INC., Piscataway NJ). Afinitet se određuje zahvatanjem biotinilovanog KPPG ili fagmenata sa N-terminala, preko imobilizovanog streptavidina (SA senzorski čip), pa merenjem kinetike vezivanja Fab fragmenata antitela G1 ili varijanti, titrisamh na čipu po

KPPG ili fragmentu Svi testovi Biacore su obavljeni u protočnom puferu HBS-EP (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCI, 3 mMEDTA i 0,005 vol% polisorbata P20). KPPG površine se dobijaju razblaživanjem N-biotinilovanog KPPG do koncentracija manjih od 0,001 mg/mL u puferu HBS-EP, pa injektiranjem preko SA senzorskog čipa, uz korišćenje varijabilnih vremena kontakta. Površine niskog kapaciteta, koji odgovaraju nivoima zahvatanja <50 jedinica odgovora, koriste se za kinetička ispitivanja visoke rezolucije, dok se površine visokog kapaciteta (oko 800 jedinica odgovora zahvaćenog KPPG) koriste za ispitivanja koncentracije i određivanja afiniteta rastvora. Kinetički podaci se dobijaju serijskim razblaživanjem antitela G1 Fab u dvostrukim ili trostrukim inkrementima do koncentracija koje se kreću od 1 µM do 0,1 nM (ciljano na 0,1-10* od procenjene vrednosti Kd). Tipično, uzorci se injektiraju 1 min sa 100 pL/min, a dozvoljena su vremena za disocijaciju od najmanjelO min. Posle svakog ciklusa vezivanja, površine se regenerišu sa 25 mM NaOH u 25 vol% etanola, a toleriše se preko stotinu ciklusa. Celokupna serija titracija (tipično se generišu u duplikatu) fituje se u Langmuir-ov model vezivanja (1:1), koristeći BIAevaluation program. Ovako se dobije jedinstven par konstanti brzine kinetike asocijacije i disocijacije (respektivno, kon i k 0ff) za svaku interakciju vezivanja, čiji odnos daje konstantu ravnoteže disocijacije (KD=k(,ff/kon). Afiniteti (vrednosti KD), koji su na ovaj način određeni, dati su u Tabelama 6 i 7.

Analiza visoke rezolucije interakcija vezivanja sa ekstremno niskim odstupanjima. Za interakcije sa ekstremno niskim odstupanjima (naročito, vezivanje antitela G1 Fab za humani d.KPPG na čipu, na 25°C) afiniteti se dobijaju u eksperimentu iz dva dela. Koristi se gore opisani protokol uz sledeće modifikacije. Konstanta brzine asocijacije (kon) se određuje injektiranjem 2-struke serije titracija (u duplikatu), koja se kreće od 500 nM tokom 30 s, pri 100 pL/min, uz dozvoljavanje samo 30 s za fazu disocijacije Konstanta brzine disocijacije (k0ff) se određuje injektiranjem tri koncenracije (visoke, srednje i niske) iste serije titracija, u duplikatu, tokom 30 s, dozvoljavajući 2 h za disocijaciju faze. Afinitet (Kd) za svaku interakciju se dobija kombinovanjem vrednosti kon i k0ff, dobijenih u obe vrste eksperimenta, kao što je pokazano u Tabeli 5.

Određivanje afiniteta rastvora pomoću Biacore. Afinitet rastvora antitela G1, za pacovski n-KPPG i F37A (19.37) humanog n-KPPG, meren je pomoću Biacore, na 37°C. Koristi se površina čipa visokog kapaciteta za KPPG (za potrebe detekcije odabran je humani n-KPPG visokog afiniteta) i protočni pufer HBS-EP, koji je proticao sa 5 pL/mL. Fab fragment antitela G1, konstantne koncentracije 5 nM (sa ciljem da bude na ili ispod vrednosti ekspresovane Kd za interakciju na bazi rastvora), prethodno se inkubira sa kompetitivnim peptidom, ili sa pacovskim □-KPPG ili F37A (19-37) humanog n-KPPG, pri konačnoj koncentraciji koja se kreće od 1 nM do 1 pM, u trostrukim serijskim razblaženjima. Rastvori antitela Fab u odsustvu ili u prisustvu kompetitivnog peptida na bazi rastvora, injektuju se preko KPPG na čip, pa se detektuje umanjenje odgovora vezivanja na površini čipa, kao rezultat kompeticije u rastvoru. Ovakvi odgovori vezivanja se konvertuju u "koncentracije Fab” korišćenjem kalibracione krive, koja je konstruisana titrisanjem samog antitela G1 Fab (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 i 0 nM) preko KPPG na čipu. "Slobodne koncentracije” se grafički prikažu u odnosu na koncentraciju kompetitivnog peptida na bazi rastvora, koji se koristi za generisanje svakog podatka i fitovanje u model afiniteta u rastvoru, korišćenjem softvera BIAevaluation sofware. Na ovaj način određeni afiniteti u rastvoru (indirektno), prikazani su Tabelama 5 i 7, i koriste se za vrednovanje afiniteta dobijenih kada se Fab injektiraju direktno preko N-biotinilovanih KPPG na SA čipu. Bliska saglasnost između afiniteta određenih pomoću ove dve metode, potvrđuje da vezivanje N-biotinilovane verzije KPPG za čip ne menja njegovu urođenu aktivnsot vezivanja.

Tabela 5 u nastavku, pokazuje afinitete vezivanja antitela G1 za humani a-KPPG, za humani p-KPPG, za pacovski α-KPPG i za pacovski p-KPPG, određene pomoću Biacore, sa protokom Fab fragmenata preko N-biotinilovanih KPPG na SA čipu. Da bi se bolje izdvojili afiniteti interakcija vezivanja sa ekstremno niskim brzinama, afiniteti su određeni takođe u eksperimentu iz dva dela da budu komplementarni ovom testu orijentacije, pa je takođe određen i afinitet rastvora interakcije pacovskog α-KPPG (kao što je opisano gore) Bliska saglasnost afiniteta merenih u oba testa orijentacije potvrđuje da afinitet vezivanja nativnog pacovskog α-KPPG u rastvoru nije promenjen kada se N-biotiniluje i veže za SA čip.

TABELA 5.

Afiniteti vezivanja antitela G1 Fab titrisanih preko KPPG na čipu

Napomene: * Afiniteti za α-KPPG (pacovski i humani) određeni su u eksperimentu visoke rezolucije iz dva dela, gde je faza disocijacije praćena 2 h (vrednosti k^, kon i Kd su prošek za n ponovljenih eksperimenata, sa standardnom devijacijomiskazanom kao varijanca u procentima). Afiniteti za p-KPPG (pacovski i humani) određeni su globalnom analizom, koristeći za fazu disocijacije samo 20 min, što nije dovoljno tačno za kvantitativno iskazivanje ekstremno niskih brzina (koje su verovatno sporije nego što se ovde navodi, pa su stoga verovalno njihovi afiniteti viši). Antitelo G1 Fab disocira ekstremno sporo sa svih KPPG (izuzev pacovskog α-KPPG) sa brzinama koje se približavaju granici rezolucije testa Biacore (naročito na 25°C).

** Afinitet rastvora je određen merenjem smanjivanja odgovora vezivanja, detektovanog na KPPG na čipu za antitelo G1 Fab, prthodno inkubiranom sa pacovskim α-KPPG kompetitorom u rastvoru

Tabela 6 niže, pokazuje antitela sa varijacijom sekvencije aminokiselina u poređenju sa antitelom G1, i njihove afinitete i prema pacovskom α-KPPG i humanom α-KPPG. Sve supstitucije aminokiselina u varijantama prikazanim u Tabeli 6 su opisane relativno prema sekvenciji G1. Afiniteti vezivanja Fab fragmenata određeni su pomoću Biacore, u protoku preko KPPG na SA čipu.

TABELA 6.

Sekvencije aminokiselina i podaci za afinitete vezivanja varijanata antitela G1, određeni na 37°C pomoću Biacore

Napomene: Clone = klon; rat = pacov; human=humani; n.d. = nije određivano

Napomene- Clone = klon; rat = pacov; human=humani; n.d. = nije određivano; no binding = nema vezivanja.

Svi CDR uključuju i Kabat-ove i Chotia-eve CDR. Ostaci aminokisehna su numerisam sekvencijalno (videti Sliku 5). Svi kloni imaju sekvencije L3+H1+H3 identične sa G1.

Kd = koff/kon. Sve vrednosti koff su određene u ispitivanju, izuzev onih koje su podvučene, a koje su dobijene globalnom analizom serija koncentracije Fab (G1 je analiziran sa visokom rezolucijom). Podvučene vrednosti KD su prema tome određene eksperimentalno, merenjem kon. Druge vrednosti kon su procenjene kao da su iste kao za M25.

Da bi se odredio epitop na humanom α-KPPG, koga prepoznaje antitelo G1, moraju se koristiti Biacore testovi, opisani gore. Humani α-KPPG je dobavljen u biotinilovanoj verziji, kako bi se obezbedio njegov visoki afinitet zahvatanja preko SA senzorskog čipa. Određeno je vezivanje Fab fragmenta G1 za humani a-KPPG na čipu, u odsustvu ili u prisustvu KPPG peptida. Tipično, injektira se 2000: 1 mol peptida/rastvor Fab (npr. 10 µM peptid u 50 nM G1 Fab) preko humanog α-KPPG na čipu. Slika 6 prikazuje procenat vezivanja blokiran sa kompetitivnim peptidom. Podaci prikazani na Slici 6 ukazuju da 100% blokiraju G1 Fab u humanom α-KPPG peptidi 1-37 (WT), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37), K35E i K35M (19-37) humanog α-KPPG; 1-37 fi-KPPG (WT); 1-37 pacovskog α-KPPG (WT) i 1-37 pacovskog p-KPPG (WT). Svi ovi peptidi su amidovani na C-terminusu Peptidi F37A (19-37) i 19-37 (poslednji nije amidovan na C-terminusu) humanog α-KPPG takođe blokiraju vezivanje G1 Fab za humani α-KPPG sa oko 80% do 90%. Peptid 1-36 (nije amidovan na C-terminusu) humanog α-KPPG blokira oko 40% vezivanje G1 Fab za humani α-KPPG. Peptidni fragment 19-36 (amidovan na C-terminusu) humanog α-KPPG; peptidni fragmenti 1-13 i 1-19 humanog α-KPPG (ni jedan od njih nije amidovan na C-terminusu); i humani amilin, kalcitonin i adrenomedulin (svi amidovani na C-terminusu) ne nadmeću se u vezivanju G1 Fab sa humanim α-KPPG na čipu, Ovi podaci pokazuju da G1 cilja epitop C-terminala KPPG, i da je i identitet glavnine ostatka terminala (F37) i njegovo amidovanje od značaja za vezivanje.

Određeni su takode i afiniteti vezivanja G1 Fab za varijante humanog α-KPPG (na 37°C). Tabela 7 niže prikazuje afinitete merene direktno titrisanjem G1 Fab preko N-biotinilovanog humanog α-KPPG i njegovih varijanti na čipu. Podaci u Tabeli 7 pokazuju da se antitelo G1 Fab vezuje za epitop C-terminala, stim da su

F37 i G33 najznačajniji ostaci. G1 se ne vezuje za KPPG kada se doda ekstra ostatak aminokiseline (alanin) na C-terminal (koji je amidovan).

TABELA 7.

Afiniteti vezivanja G1 Fab za humani α-KPPG i varijante, mereno na 37°C (videti Tabelu 4 za njihove sekvencije aminokiselina)

Gornji podaci pokazuju da je epitop za koji se vezuje antitelo G1 na kraju C-terminala humanog α-KPPG, i da su aminokiseline 33 i 37 na humanom α-KPPG značajne za vezivanje antitela G1. Takođe, amidovanje ostatka F37 je od značaja za vezivanje.

Primer 5.

Efekat anti-KPPG antagonističkog antitela G1 na vazodilataciju kože izazvanu stimulacijom nerva safene pacova.

Da bi se testirala antagonistička aktivnost anti-KPPG antitela G1, efekat ovog antitela na vazodilataciju kože, preko stimulacije nerva safene pacova, testiran je na modelu pacova, opisanom u Primeru 3. Ukratko, pacovi se drže pod anestezijom sa 2% izofluranom. Na početku eksperimenta daje se bretilijum tozilat (30 mg/kg, ordiniranje i. v. ), kako bi se na minimum svela vazokonstrikcija usled propratne stimulacije simpatetičkih vlakana nerva safene. Telesna temperatura se održava na 37°C, korišćenjem rektalne probe povezane termostatski sa kontrolisanom temperaturom grejnog ćebeta, Nerv satena desne zadnje noge se hirurški otvori, zaseče proksimalno i pokrije plastičnim zavojem da se spreči sušenje. Proba laserskog Doppler-a se stavi preko medio-dorsalne strane kože zadnje noge, koja predstavlja region inerviran nervom satene. Protok krvi kroz kožu meri se kao fluks krvnih zrnaca, a prati se merenjem protoka sa laserskim Doppler-om. U eksperimentima u kojima se određuju efekti antitela, unutar dva sata od injektiranja, a 30-40 min posle injekcije bretilijum tozilata, kada se tokom poslednjih 5 min uspostavi stabilan osnovni ili početni fluks (varijacije manje od 5%), nerv se smesti preko platinskih bipolarnih elektroda, pa se električno stimuliše (2Hz, 10 V, 1 ms, tokom 30 s), pa ponovo posle 20 min. Prosečan odgovor fluksa proticanja krvi na ove dve stimulacije koristi se za utvrđivanje odgovora osnovne linije (vreme 0) na električnu stimulaciju. Zatim se intravenski ordinira antitelo G1 (1 mg/kg ili 10 mg/kg) ili tečni nosač (PBS sa 0, 01% TWEEN 20, jednake zapremine kao 10 mg/kg G1). Posle toga nerv se stimuliše (2Hz, 10 V, 1 ms, tokom 30 s) u 30. min, u 60. min u 90. min i u 120. min, nakon ordiniranja antitela. Životinje se održavaju pod anestezijom tokom približno 3 h. Kumulativna promena u protoku krvi kroz kožu ocenjuje se preko površine ispod krive (PIK, koja je jednaka promeni fluksa pomnoženoj sa promenom vremena) za svaki odgovor fluksa na stimulaciju električnim pulsem

Kao što pokazuje Slika 7, protok krvi, koji raste posle stimulacije primenom električnog pulsa na nerv satene, biva inhibiran u prisustvu antitela G1, sa 1 mg/kg (ordiniran i. v. ), u poređenju sa tečnim nosačem, kada je nerv satene električno stimulisan u 90. min posle ordiniranja antitela. Protok krvi, stimulisan primenom električnog pulsa na nerv satene, značajno je inhibiran u prisustvu antitela G1, sa 10 mg/kg (ordiniran i.v. ), u poređenju sa tečnim nosačem, kada je nerv satene električno stimulisan u 90. min i 120. min posle ordiniranja antitela.

U eksperimentima određivanja efekta antitela u dužim vremenima testa sa satenom, pacovi su injektirani i. v. sa naznačenim dozama antitela 24 h ili 7 dana pre preparisanja nerva safene životinje za stimulaciju, kao što je opisano gore. U ovim eksperimentima bilo je nemoguće utvrditi odgovor osnovne linije kod pacova pojedinačno, na stimulaciju električnim pulsem pre doziranja, tako da su te tretirane grupe poređene sa životinjama koje su dozirane sa tečnim nosačem (PBS, 0, 01% TWEN 20) 24 h ili 7 dana

Kao što pokazuju Slike 8A i 8B protok krvi se povećava u koži dorso-medijalnog dela zadnje noge, nakon izazivanja stimulacije nerva safene, ali je isti značajno inhibiran u grupama životinja koje su dozirane ili sa 10 mg/kg ili sa 3 mg/kg G1, bilo 24 h ili 7 dana pre stimulacije, u poređenju sa grupom koja je primila tečni nosač u istim vremenima.

Slika 8C predstavlja analizu fitovanja krive primenjenu na podatke doza-odgovor, koji su prikazani na Slikama 8A i 8B, za određivanje potrebne doze za 50% maksimalnog efekta (EC50) Vrednost EC50 za 24 h je 1, 3 mg/kg, a EC50 za 7 dana je malo niža (0, 8 mg/kg)

Primer 6.

Akutni efekat anti-KPPG antagonističkog antitela G1. u testu na duralnu arteriju (zatvoren kraniialni prozor)

Model zatvorenog kranijalnog prozora: Svrha ovog eksperimenta je određivanje akutnog efekta anti-KPPG antagonističkog antitela i poređenje sa akutnim efektom antagonista KPPG receptora BIBN4096BS. Eksperimenti su obavljeni kao što je ranije opisano (VViHiamson et al., Cephalgia 17(4). 518-24 (1997)), ali uz sledeće modifikacije. Pacovi Sprague Dawley (300-400 g) su anestezirani sa 70 mg/kg pentobarbitala, i. p. Anestezija se održava sa 20 mg/kg pentobarbitala i. p. Pacovima su uvedene kanile kroz jugularnu venu, za davanje svih lekova. Krvni pritisak je praćen pomoću probe (kateter sa mikro vrhom, Lillar instruments) uvučene kroz femoralnu arteriju u abdominalnu aortu. Pacovima je obavljena traheotomija, a brzina disanja održavana na 75 udaha na minut, sa zapreminom od 3, 5 ml_. Posle fiksiranja glave u stereotaktički instrument i uklanjanja skalpa, napravljen je prozor 2x6 mm na levoj temenoj strani, lateralno od sagitalnog šava, istanjivanjem kosti sa stomatološkom bušilicom. Koristeći mikromanipulator, platinska bipolarna elektroda je spuštena do površine, pa prekrivena gustim mineralnim uljem. Lateralno od prozora sa elektrodom, napravljen je drugi prozor od 5x6 mm i napunjen gustim mineralnim uljem, kroz koji je mogao kontinualno da se prati prečnik grane srednje meningealne arterije (SMA), pomoću CCD kamere i video analizatora dimenzija (Living Systems). Pacovi se odmaraju ne manje od 45 min posle ove preparacije. Utvrdi se odgovor osnovne linije na električnu stimulaciju (15 V, 10 Hz, puls od 0, 5 ms, tokom 30 s), pa se zatim pacovi doziraju i v. sa eksperimentalnim jedinjenjem (10 mg/kg mu7E9, 300 pg/kg BIBN4096BS ili PBS 0, 01% TVVEEN 20). Dodatna električna stimulacija se obavlja u 5. (BIBN4096BS), 30, 60, 90 i 120. min posle doziranja. Svi podaci se registruju koristeći softver za pisače (ADInstruments).

Kao što pokazuje Slika 9, mu7E9, sa 10 mg/kg, značajno blokira dilataciju SMA, izazvanu stimulacijom sa električnim poljem, unutar 60 min posle doziranja i održava taj efekat tokom trajanja testa (120 min). Za poređenje, BIBN4096BS blokira dilataciju MMA tokom 5 min od doziranja, ali efekat se potpuno izgubi za 90 min. Veličina bloka je uporedna između BIBN4096BS i mu7E9.

Primer 7.

Hronični efekat anti-KPPG antagonističkog antitela G1 u testu duralne arterije (zatvoren kraniialni prozor)

Svrha ovog eksperimenta je određivanje da li anti-KPPG antagonističko antitelo može još uvek da blokira električno stimuiisanu dilataciju MMA, 7 dana posle doziranja. Preparisanje pacova bilo je identično kao u gore opisanom akutnom eksperimentu (Primer 6), uz sledeče izuzetke. Pacovi su injektirani i. v. (10 mg/kg, 3 mg/kg ili 1 mg/kg G1) 7 dana pre preparisanja zatvorenog kramjalnog prozora i stimulacije Nije bilo moguće određivanje osnovne linije dilatacionog odgovra na električnu stimulaciju, pre doziranja kao u akutnom eksperimentu, tako da su grupe sa antitelom poređene sa dilatacijom SMA u tečnom nosaču (PBS, 0, 01%

TVVEEN 20), sa kojim je dozirana kontrolna grupa. Pošto se pacovi ostave da se odmore ne manje od 45 min, dura se električno stimuliše u intervalima od 30 min. Stimulacije su bile sa 2, 5 V, 5 V, 10 V, 15 V i 20 V, sve sa 10 Hz i pulsevima od 0, 5 ms u trajanju 30 s.

Kao što je pokazano na Slici 10, G1 sa 10 mg/kg i 3 mg/kg značajno blokira dilataciju SMA izazvanu električnom stimulacijom u opsegu između 10 V i 20 V. Ovi podaci pokazuju da G1 može da blokira električno stimulisanu dilataciju SMA i do 7 dana posle doziranja.

Primer 8.

Nastup crvenila i vrućine na moedlu odvikavanja od morfiiuma Model odvikavanja od morfijuma kod pacova je priznati model na glodarima za mehanizme nastupa crvenila i vrućine u menopauzi (Sipe et al., Brain Res. 1028(2). 191-202 (2004); Merchenthaler et al. Maturitas 30, 307-316 (1998); Katovich et al., Brain Res. 494, 85-94 (1989); Simpkins et al., Life Sciences 32, 1957-1966 (1983)). U osnovi, pacovi se naviknu na morfijum implatacijom morfijumskih peleta pod kožu. Nakon uspostavljanja zavisnosti životinje se injektiraju sa naloxone-om (antagonist opijata) koji ih odmah odvikava. Ovo odvikavanje prati povišenje temperature kože, sniženje temperature tela, porast broja otkucaja srca i povećanje hormona luteinizacije u serumu. Sve ovo je slično po veličini i vremenu onome što se događa prilikom nastupa crvenila i vrućine kod humanih bića (Simpkins et al., Life Sciences 32, 1957-1966 (1983)). Pored toga, ako se pacovi pre izazivanja odvikavanja tretiraju sa estradiolom, simptomi nastupa crvenila i vrućine se smanjuju (Merchenthaler et al., Maturitas 30, 307316 (1988)). Zbog toga se veruje da model odvikavanja od morfijuma klinički imitira nastupe crvenila i vrućine.

Pacovi sa odstranjenim jajnicima su dobijeni iz Charles River Laboratories. Ne manje od 7 dana posle odstranjivanja jajnika izazove se zavisnost od morfijuma, potkožnom implantacijom pelete morfijuma (75 mg morfijumske baze). Posle 2 dana implantiraju se još dve pelete. Sledećeg dana pacovima se intravenozno da injekcija, ili 10 mg/kg 4901 [**] ili tečnog nosača (PBS, 0, 01% TWEEN). Dva dana posle drugog usađivanja peleta pacovi se anesteziraju sa ketaminom (90 mg/kg) i blago fiksiraju. Termopar za površinsko merenje temperature se prilepi na bazu repa, a rektalm termopar se koristi za merenje telesne temperature. Podaci se registruju korišćenjem softvera Chart software (ADInstruments). Posle 15 min registrovanja stabilne osnovne temperature, potkožno se injektira naloxone (1 mg/kg). Temperatura se kontinualno registruje tokom sledećih 60 min. Rezultati su prikazani na Slikama 11A i 11B.

Podrazumeva se da su primeri i realizacije koji su ovde opisani dati samo u svrhu ilustracije, a da njihove različite modifikacije ili izmene mogu biti predložene od strane osoba verziranih u stanje tehnike, ali treba da su u duhu i domenu ove prijave. Sve publikacije, patenti i patentne prijave koji su ovde citirani, činom navođenja su u celini i u sve svrhe i u istom obimu ovde ugrađeni, kao i svaka pojedinačna publikacija, patent ili patentna prijava koja je specifično i pojedinačno naznačena, samim navođenjem je ovde ugrađena.

DEPONOVANJE BIOLOŠKOG MATERIJALA

Sledeći materijali su deponovani u American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA (ATCC):

Vektor pEb CGRP-hKGI je polinukleotid koji kodira laki lanac varijabilnog regiona G1 i laki lanac konstantnog regiona kapa; a vektor pDb. CGRP. hFcGI je polinukleotid koji kodira teški lanac varijabilnog regiona i teški lanac konstantnog regiona lgG2, koji sadrži sledeće mutacije: A330P331 u S330S331 (numeracija aminokiselina je kao što je navedeno u sekvenciji divljeg tipa lgG2: videti Eur. J. Immunol. 29, 2613-2624 (1999)).

Ova deponovanja su načinjena u skladu sa odredbama Budimpeštanskog međunarodnog ugovora, Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations thereunder. Ovim je obezbeđeno održavanje vitalne kulture depozita za 30 godina od dana deponovanja. Depozit je dostupan iz ATCC u skladu sa Budimpeštanskim međunarodnim ugovorom, i predmet je dogovora između Rinat Neuriscience Corp. i ATCC, kojim je obezbeđena permanentna i neograničena javna dostupnost potomaka ove deponovane kulture, nakon priznavanja relevantnog U. S. patenta, ili nakon otvaranja za javnost bilo koje U. S. ili strane patentne prijave, bez obzira koja je prva, i obezbeđuje dostupnost potomaka onome koga određuje U. S. Commisioner of Patents and Trademarks, u skladu sa 35 USC Section 122 i objavljenim pravilima tog opunomoćenika (uključujući 37 CFR Section 1. 14, sa posebnim osvrtom na 886 OG 638).

Podnosioci ove patentne prijave su se složili da kultura deponovanih materijala, ako se desi da izumre ili se izgubi ili uništi kultivisanjem pod pogodnim uslovima, da će posle upozorenja ti materijali odmah biti zamenjeni sa drugim, istim takvim. Dostupnost deponovanom materijalu se ne treba shvatiti kao licenca za korišćenje ovog pronalaska, i kršenju prava koja proističu iz autoriteta bilo koje vlade, u skladu sa njenim patentnim zakonima.

SEKVENCIJE ANTITELA

Claims (16)

1.    Antitelo, naznačeno time, što ima afinitet vezivanja (KD) za humani α-KPPG od 50 nM ili manji, meren rezonancijom površinskog plazmona na 37°C.

2.    Antitelo prema Zahtevu 1, naznačeno time, što što sadrži Vh domen koji je najmanje 90% identičan sa sekvencijom aminokiselina SEQ ID NO: 1.

3.    Antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što ostatak aminokiseline u položaju 99 u SEQ ID NO: 1 predstavlja L, ili je supstituisan sa A, N, S, T, V ili R, a ostatak aminokiseline u položaju 100 u SEQ IS NO: 1 predstavlja A, ili je supstituisan sa L, R, S, V; Y; C, G, T, K ili P.

4. Antitelo prema Zahtevu 1, naznačeno time, što sadrži VL domen koji je najmanje 90% identičan sa sekvencijom aminokiselina SEQ ID NO: 2.

5. Antitelo prema Zahtevu 1, naznačeno time, što sadrži najmanje jedan CDR koji se bira iz grupe koju čine: i g. varijante L1, L2 i H2, prikazane u Tabeli 6.

6.    Antitelo prema Zahtevu 1, naznačeno time, što sadrži: a.    Vh CDR3, kako je dat u SEQ ID NO: 5, ili sekvenciju koja se od SEQ ID NO: 5 razlikuje za 1 ili 2 konzervativne supstitucije aminokiselina; i b.    VL CDR3, kako je dat u SEQ ID NO: 8, ili sekvenciju koja se od SEQ ID NO: 8 razlikuje za 1 ili 2 konzervativne supstitucije aminokiselina.

7.    Antitelo, naznačeno time, što sadrži Vh domen, koji je najmanje 90% identičan sa sekvencijom aminokiselina SEQ ID NO: 1, i VL domen. koji je najmanje 90% identičan sa sekvencijom aminokiselina SEQ ID NO: 2.

8.    Antitelo prema Zahtevu 7, naznačeno time, što to antitelo predstavlja molekul IgG, IgM, lgE, IgA ili IgD, ili je izvedeno iz njih.

9.    Antitelo prema Zahtevu 7, naznačeno time, što sadrži teški lanac dobijen pomoću vektora ekspresije čiji je ATCC Accession No. PTA-6867

10.    Antitelo prema Zahtevu 7, naznačeno time, što sadrži laki lanac dobijen pomoću vektora ekspresije čiji je ATCC Accession No. PTA-6866.

11.    Farmaceutski preparat, naznačen time. što sadrži antitelo prema Zahtevu 1 i farmaceutski prihvatljiv dodatak.

12.    Postupak za prevenciju ili tretiranje najmanje jednog vazomotornog simptoma kod neke osobe, naznačen time, što se toj osobi ordinira efikasna količina anti-KPPG antagonističkog antitela,

13.    Postupak prema Zahtevu 12, naznačen time, što pomenuti vazomotorni simptom predstavlja migrena, sa ili bez aure, hemiplegična migrena, klaster glavobolja, migrenska neuralgija, hronićna glavobolja ili tenziona glavobolja.

14.    Postupak prema Zahtevu 12, naznačen time, što pomenuti vazomotorni sistem predstavlja nastup crvenila i vrućine.

15. Postupak prema Zahtevu 12, naznačen time, što anti-KPPG antagonističko antitelo predstavlja bilo koje od antitela opisanih u Zahtevima 1 do 10.

16. Postupak prema Zahtevu 12, naznačen time, što anti-KPPG