KR20080068062A - 칼시토닌 유전자-관련 펩티드에 대해 지시되는 길항제 항체및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-CGRP 길항제 항체를 투여함으로써 두통 (예컨대, 편두통, 군집성 두통, 및 긴장성 두통) 및 안면 홍조를 비롯한 혈관의 운동과 관련된 증상들과 같은 CGRP 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 특징으로 한다.
Figure P1020087011418
항-CGRP 길항제 항체, 두통, 운동과 관련된 증상.

Description

칼시토닌 유전자-관련 펩티드에 대해 지시되는 길항제 항체 및 그의 사용 방법{ANTAGONIST ANTIBODIES DIRECTED AGAINST CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE AND METHODS USING SAME}
본 출원은 본원에서 참고로 인용되는, 2005년 11월 14일 출원된 미국 특허 출원 번호 제60/736,623호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 혈관의 운동과 관련된 증상(vasomotor symptom)들, 예로서, CGRP 관련 두통 (예컨대, 편두통) 및 안면 홍조의 예방, 호전, 또는 치료를 위한 항-CGRP 길항제 항체의 용도에 관한 것이다.
CGRP (칼시토닌 유전자-관련 펩티드)는 37개의 아미노산으로 이루어진 신경펩티드로서, 칼시토닌, 아드레노메둘린 및 아밀린을 포함하는 펩티드 계열에 속한다. 인간의 경우, 2가지 형태의 CGRP (α-CGRP 및 β-CGRP)가 존재하는데, 이는 유사한 활성을 갖는다. 3개의 아미노산에서 차이가 나며 차별적으로 분포된다. CGRP는 중추 신경계에서의 신경 전달 물질이고, 말초혈관에서는 효능이 있는 혈관 확장제인 것으로 보이는데, 여기에서, CGRP-함유 뉴런은 혈관과 밀접한 관계가 있다. CGRP-매개 혈관 확장은 또한 혈장 유출과 미소혈관의 혈관 확장을 일으키는 일련의 반응 중의 일부인 신경성 염증과도 관련이 있고, 편두통에도 존재한다.
CGRP는 혈관의 운동과 관련된 증상들과 관련되어 있을 수 있다고 언급된 바 있다 ([Wyon et al. Scand. J. Urol. Nephrol. 35: 92-96 (2001)]; [Wyon et al. Menopause 7(1):25-30 (2000)]). 혈관의 운동과 관련된 증상들 (VMS), 예로서, 안면 홍조 및 야간 발한은 폐경과 관련된 증상들중 가장 보편적인 것으로, 자연적 또는 수술로-유도된 폐경 이후의 모든 여성들중 60-80％에서 일어나는 것이다. 안면 홍조는 성 스테로이드 감소에 대한 중추신경계 (CNS)의 적응 반응일 수 있다 [Freedman Am. J. Human Biol. 13:453-464 (2001)]. 현재까지, 홍조를 치료하는 가장 효과적인 요법은 에스트로겐 및/또는 일부 프로게스틴을 비롯한 호르몬-기재 치료법이다. 호르몬 치료법이 홍조를 완화시키는데 효과적일 수 있지만, 모든 여성들에게 있어 적절한 것은 아니다. 관찰되는 심리적 및 감정적 증상, 예로서, 신경질, 피로감, 과민증, 불면증, 우울증, 기억력 감퇴, 두통, 불안증, 신경질 또는 집중 불가는 안면 홍조 및 야간 발한 이후의 수면 박탈에 의해 유발되는 것으로 간주된다 [Kramer et al., In: Murphy et al., 3.sup.rd Int'l Symposium on Recent Advances in Urological Cancer Diagnosis and Treatment-Proceedings, Paris, France: SCI: 3-7 (1992)].
남성 또한 스테로이드 호르몬 (안드로겐) 소퇴 이후 안면 홍조를 경험하게 된다. 사실상 연령-관련 안드로겐 감퇴의 사례 [Katovich, et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129-35] 뿐만 아니라, 전립선 암 치료와 관련된 호르몬 박탈의 극단적인 사례에서 그러하다. 이들 환자중 ⅓ 만큼이나 되는 환자들은 상당한 불쾌감 및 불편을 일으키기에 충분할 정도로 심각한 증상들을 지속적으로 빈번하게 경험할 것이다.
CGRP는 예로서, 편두통 (전조가 있거나 없는 것) 및 군집성 두통을 비롯한 모든 형태의 혈관성 두통과 같은 혈관의 운동과 관련된 다른 증상들에 관여하는, 효능이 있는 혈관 확장제이다 [Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1075, 2004]. 편두통 두통시 외부 목정맥중의 CGRP 혈청 수준은 상승한다 [Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990]. 인간 α-CGRP를 정맥 투여하는 것은 전조없는 편두통을 앓고 있는 환자에서 두통과 편두통을 유발하였고, 따라서 CGRP가 편두통에서 원인이 되는 역할을 한다고 제안되었다 [Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002].
편두통에서의 CGRP의 관여 가능성은, CGRP의 방출을 저해하거나 (예컨대, 수마트립탄), CGRP 수용체에서 길항 작용하거나 (예컨대, 이펩티드 유도체 BIBN4096BS (베링거 인겔하임(Boerhringer Ingelheim)); CGRP(8-37)), 또는 예로서 수용체 활성 막 단백질 (RAMP) 또는 수용체 성분 단백질 (RCP)(이들 둘 다는 CGRP와 그의 수용체의 결합에 영향을 미침)과 같은 하나 이상의 수용체-관련 단백질과 상호 작용을 하는 다수의 화합물의 개발과 시험에 관한 기초가 되어 왔다 [Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002]. 알파-2 아드레날린 수용체 아형 및 아데노신 A1 수용체는 또한 CGRP 방출 및 삼차 활성화를 조정 (저해)한다 [Goadsby et al., Brain 125:1392-401, 2002]. 인간에서 신경성 혈관 확장 및 삼차 통각을 저해하는 것으로 제시된 아데노신 A1 수용체 효현제 GR79236 (메트라파딜)은 또한 항-편두통 활성도 가질 수 있다 ([Arulmani et al., Cephalalgia 25:1082-1090, 2005]; [Giffin et al., Cephalalgia 23:287-292, 2003]).
상기의 이론은 신경성 염증 (예컨대, 타키키닌 NK1 수용체 길항제) 또는 삼차 활성화 (예컨대, 5HT1D 수용체 효현제)를 철저하게 저해하는 화합물을 사용하는 치료법이 편두통을 위한 급성 치료법으로서 비교적 효과가 없는 것으로 나타났다는 관찰 결과와 혼동되고, 이를 통해 일부 연구자들은 CGRP 방출을 저해하는 것이 효과적인 항-편두통 치료법의 주요 작용 기전인지에 관하여 의문을 갖게 되었다 [Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315-330, 2004].
편두통은 중증의 우발성 두통 발현과, 구역, 구토, 빛, 소음, 또는 움직임에 관한 과민증을 포함할 수 있는 관련 특질을 특징으로 하는, 복합적인 일반 신경계 용태이다. 일부 환자에서는 두통 이전에 전조가 있거나, 두통에 전조가 수반된다. 특정 환자에서는 두통의 통증이 중증일 수 있고, 편측성일 수도 있다.
편두통 발현은 일상을 파괴한다. 미국과 서유럽에서 편두통 환자의 전반적인 유병률은 총 인구의 11％ (6％ 남성; 15-18％ 여성)이다. 추가로, 개체에서 발현 빈도수의 중앙값은 1.5/개월이다. 증상을 완화시키거나 경감시키는데 사용될 수 있는 치료법은 많지만, 매달 3-4회 초과로 편두통이 발현되는 환자를 위해서는 예방학적 요법이 권고된다 [Goadsby et al. New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002].
편두통을 치료하기 위하여 사용되어 왔던 다양한 약리학적 개입과 환자들 간의 반응에 대한 변동성이 상기 질병의 다양한 성질에 대한 증거가 된다. 따라서, 세로토닌성 뿐만 아니라, 아드레날린성, 노르아드레날린성 및 도파민성 활성을 보이는, 맥각 알카로이드 (예컨대, 에르고타민, 디하이드로에르고타민, 메티세르자이드)와 같은 상대적으로 비-선택성인 약물이 80여년간 편두통 치료에 사용되어 왔다. 다른 치료법으로는 아편제 (예컨대, 옥시코돈) 및 β-아드레날린성 길항제 (예컨대, 프로프라놀롤)를 포함한다. 일부 환자들, 보통은 보다 경미한 증상을 갖고 있는 환자들은 처방전 없이 구입할 수 있는 치료약, 예로서, 하나 이상의 비-스테로이드성 소염제 (NSAID), 예로서, 아스피린, 아세트아미노펜 및 카페인의 배합물 (예컨대, 엑세드린(Excedrin)® 편두통)로 상기 증상을 조정할 수 있다.
보다 최근에 일부 편두통 환자들은, 전압-의존성 나트륨 채널 및 특정 글루타메이트 수용체 (AMPA-카이닌산)를 차단하고, GABA-A 수용체 활성을 강화시키고, 탄산 탈수효소를 차단하는 항경련제인 토피라메이트로 치료되어 왔다. 상대적으로 최근에 일부 환자에서 세로토닌 5HT-1B/1D 및/또는 5HT-1a 수용체 효현제, 예로서, 수마트립탄에 관하여 이룬 성공을 통해 연구자들은 상기 질병의 세로토닌성 병인에 관하여 제안하게 되었다. 불행하게도, 일부 환자들은 상기 치료법에 잘 반응한 반면, 그외의 환자들은 상기 효과에 대하여 상대적인 내성을 띤다.
아민성 뇌간 핵내 이온 채널의 기능장애가 본 질병의 원인이 된다고 가정하였지만, 편두통에 관한 정확한 병태생리는 여전히 잘 이해되고 있지 않다. 편두통의 한 형태인 가족성 편마비 편두통은 전압-작동 P/Q-형 칼슘 채널의 α1 서브유닛 내의 미스센스 돌연변이와 관련이 있는 것으로 나타났고, 다른 환자 집단에서는 다른 이온-채널 돌연변이 또한 발견될 수 있다고 가정할 수 있다. 혈관 확장은 편두 통의 동통 증상과 관련이 있고, 이를 악화시키는 반면, 현재는 그러한 신경혈관성 반응이 본 용태의 원인이라기 보다는 결과인 것으로 여겨지고 있다. 전반적으로, 감각성 유입을 조절하는 뇌간 경로의 기능장애가 편두통의 통합적 특질인 것으로 간주되고 있다 [Goadsby, P.J. et al., New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002].
본 출원에서는 다양한 간행물 (특허 및 특허 출원을 포함한다)이 참조되고 있다. 이러한 간행물의 전문이 참고로 인용된다.
본 발명의 간단한 요약
본 원에 개시된 본 발명은 항-CGRP 길항제 항체, 및 혈관의 운동과 관련된 증상들, 예로서, 두통, 예로서, 전조가 있거나 없는 편두통, 편마비 편두통, 군집성 두통, 편두통성 신경통, 만성 두통, 긴장성 두통, 및 다른 의학적 용태로부터 유발된 두통 (예로서, 감염 또는 종양에 기인한 두개골압 증가)을 치료 또는 예방하기 위해 항-CGRP 길항제 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 다른 혈관의 운동과 관련된 증상들로는 안면 홍조를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 적어도 하나의 운동과 관련된 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 두통 (예컨대, 편두통 및 군집성 두통)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 두통 (예컨대, 편두통 및 군집성 두통)의 발병률을 호전, 조정, 경감시키거나, 그의 발병 또는 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 두통 치료에 유용한 1종 이상의 첨가제와 배합하여 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 두통 (예컨대, 편두통 및 군집성 두통)의 발병률을 호전, 조정, 경감시키거나, 그의 발병 또는 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 그러한 첨가제로는 5-HT1-양 효현제 (및 다른 5-HT1 영역에 작용하는 효현제), 및 비-스테로이드성 소염제 (NSAIDs)가 포함된다.
항-CGRP 항체와 배합하여 사용될 수 있는 5-HT1 효현제의 일례는 트립탄으로 알려져 있는 화합물 부류, 예로서, 수마트립탄, 졸미트립탄, 나라트립탄, 리자트립탄, 엘레트립탄, 알모트립탄, 및 프로바트립탄을 포함한다. 맥각 알카로이드 및 관련 화합물은 또한 5-HT 효현제 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 두통, 예로서, 편두통 치료에 사용되어 왔다. 이들 화합물중에는 에르고타민 타르트레이트, 에르고노빈 말레이트, 및 에르골로이드 메실레이트 (예컨대, 디하이드로에르고코르닌, 디하이드로에르고크리스틴, 디하이드로에르고크립틴, 및 디하이드로에르고타민 메실레이트 (DHE 45))가 포함된다.
항-CGRP 항체와 배합되어 사용될 수 있는 NSAID의 일례로는 나프록센, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 옥사프로진, 에토돌락, 인도메타신, 케토롤락, 나부메톤, 메파남산, 및 피록시칸이 포함된다. 추가의 NSAID로는 사이클로옥시게나제-2 (COX-2) 저해제를 포함한다. 이러한 군의 일원으로는 셀레콕십; 로페콕십; 멜록시캄; JTE-522; L-745,337; NS398; 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염이 포함된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 안면 홍조의 발병률을 호전, 조정, 경감시키거나, 그의 발병 또는 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 안면 홍조 치료에 유용한 1종 이상의 첨가제와 배합하여 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 안면 홍조의 발병률을 호전, 조정, 경감시키거나, 그의 발병 또는 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 그러한 첨가제로는 에스트로겐 및/또는 프로게스틴을 비롯한 호르몬-기재 치료제가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 실시태양에서, 상기 기술된 방법들중 임의의 것에 사용되는 항-CGRP 길항제 항체는 본원에 기술된 항체들중 임의의 것이다.
몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간 CGRP를 인식한다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간 α-CGRP와 β-CGRP, 둘 모두에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간 및 래트 CGRP에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 CGRP중 아미노산 25-37을 갖는 C-말단 단편에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 CGRP중 아미노산 25-37을 갖는 C-말단 에피토프에 결합한다.
몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 모노클로날 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간화된 것이다. 몇몇 실시태양에서, 항체는 인간이다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 항체 G1 (본원에 기술된 것)이다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 항체 G1 또는 표 6에 제시한 항체 G1의 변이체의 하나 이상의 CDR(들) (예로서, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 몇몇 실시태양에서, 6개 CDR 모두)을 포함한다. 추가의 다른 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 도 5 (서열 1)에 제시한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 1) 및 도 5에 제시한 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 2)을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예로서, 면역학적으로 불활성인 불변 영역 (부분적으로 면역학적으로 불활성인 것을 포함한다), 예컨대, 보체 매개 용해를 일으키지 않는 불변 영역, 항체-의존 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않는 불변 영역, 미세아교세포를 활성화시키기 않는 불변 영역, 또는 하나 이상의 이들 활성이 경감된 불변 영역을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 불변 영역은 ([Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 번호 9809951.8)에 기재되어 있는 것과 같이 변형된다. 다른 실시태양에서, 항체는 하기 돌연변이: A330P331에서 S330S331로 (야생형 IgG2 서열을 참조하여 번호매김한 아미노산)를 포함하는 인간 중쇄 IgG2 불변 영역을 포함한다 [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]. 몇몇 실시태양에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 돌연변이: 1) A327A330P331에서 G327S330S331로; 2) E233L234L235G236에서 G236이 결실된 P233V234A235로; 3) E233L234L235에서 P233V234A235로; 4) E233L234L235G236A327A330P331에서 G236이 결실된 P233V234A235G327S330S331로; 5) E233L234L235A327A330P331에서 P233V234A235G327S330S331로; 및 6) N297에서 A297로, 또는 N을 제외한 임의의 다른 아미노산으로인 것중 어느 것을 갖는 인간 중쇄 IgG1이다. 몇몇 실시태양에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 돌연변이: G236이 결실된 E233F234L235G236에서 P233V234A235로; E233F234L235에서 P233V234A235로; 및 S228L235에서 P228E235로인 것중 어느 것을 갖는 인간 중쇄 IgG4이다.
추가의 다른 실시태양에서, 불변 영역은 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은(aglycosylated) 것이다. 몇몇 실시태양에서, 불변 영역은 올리고당 부착 잔기 (예로서, Asn297) 및/또는 불변 영역내 N-당화 인식 서열의 일부분인 인접 잔기의 돌연변이화에 의해 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것이다. 몇몇 실시태양에서, 불변 영역은 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것이다. 불변 영역은 효소적으로, 또는 당화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것일 수 있다.
항-CGRP 길항제 항체의 CGRP (예로서, 적절한 온도, 예로서, 25 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바와 같은 인간 α-CGRP)에 대한 결합 친화력 (KD)은 약 0.02 내지 약 200 nM일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 결합 친화력은 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM중 임의의 것일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 결합 친화력은 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 또는 약 50 pM중 임 의의 것의 미만이다.
항-CGRP 길항제 항체는 두통 이전에, 두통시에, 및/또는 두통 이후에 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 두통 (예컨대, 편두통 및 군집성 두통) 발현 이전에 투여될 수 있다. 항-CGRP 길항제 항체는 경구, 정맥내, 피하, 동맥내, 근육내, 심장내, 척수내, 흉부내, 복막내, 심실내, 설하, 경피적으로 및/또는 흡입에 의한 것을 비롯한, 당업계에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 투여는 전신, 예컨대, 정맥내, 또는 국소 투여일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 또다른 제제, 예로서, 또다른 두통 치료제와 함께 투여될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법들중 임의의 것에서 사용하기 위한, 예를 들면, 두통 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 항-CGRP 길항제 항체의 용도를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 포함하는, 두통 (예컨대, 편두통 및 군집성 두통) 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법들중 어느 것에서 사용하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 키트는 용기, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 본원에 기술된 항-CGRP 길항제 항체를 포함하는 조성물, 및 본원에 기술된 방법들중 어느 것에서 본 조성물을 사용하는 것에 관한 설명서를 포함한다.
본 발명은 또한 항-CGRP 길항제 항체 및 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체로부터 유래된 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 ATCC 기탁 번호 PTA-6866 및 PTA-6867을 갖는 발현 벡터에 의해 생산되는 항체 G1 (상호교환적으로 "G1"로 명명된다)이다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-6867를 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 중쇄를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-6866을 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 경쇄를 포함한다. G1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 5에 나타낸다. 항체 G1의 상보성 결정 영역 (CDR) 부분 (코티아(Chothia) 및 캐벗(Kabat) CDR을 포함한다)은 또한 도 5에 나타낸다. G1중 임의의 일부분 또는 G1 전체 영역에 관한 언급은 ATCC 기탁 번호 PTA-6866 및 PTA-6867을 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 서열, 및/또는 도 5에 도시한 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명은 또한 표 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 G1의 항체 변이체를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 서열 1의 아미노산 서열과 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상 또는 100％ 동일한 VH 도메인을 포함하는 항체이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열과 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상 또는 100 ％ 동일한 VL 도메인을 포함하는 항체이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 단편 또는 영역을 포함하는 항체이다. 하나의 실시태양에서, 단편은 항체 G1의 경쇄이다. 또다른 실시태양에서, 단편은 항체 G1의 중쇄이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 단편은 항체 G1의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 추가의 또다른 실시태양에서, 단편은 도 5에 나타낸 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 추가의 또다른 실시태양에서, 단편은 항체 G1의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 CDRs을 함유한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 서열 5에 기재된 VH CDR3, 또는 서열 5와 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수 있거나, 항체가 아닐 수도 있다)를 제공한다. 특정 실시태양에서, 그러한 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 서열 8에 기재된 VL CDR3, 또는 서열 8과 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수 있거나, 항체가 아닐 수도 있다)를 제공한다. 특정 실시태양에서, 그러한 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 하기: a) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 하나 이상의 CDR(들); b) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 중쇄로부터의 CDR H3; c) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 CDR L3; d) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDRs; e) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 중쇄로부터의 3개의 CDRs; f) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄 및 중쇄로부터의 3개의 CDRs중 임의의 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수 있거나, 항체가 아닐 수도 있다)를 제공한다. 본 발명은 추가로 하기: a) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체로부터 유래된 하나 이상의 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) CDR(들); b) 항체 G1의 중쇄로부터의 CDR H3으로부터 유래된 하나의 CDR; 및/또는 c) 항체 G1의 경쇄로부터의 CDR L3으로부터 유래된 하나의 CDR중 임의의 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수 있거나, 항체가 아닐 수도 있다)를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, CDR은 도 5에 나타낸 CDR이다. 몇몇 실시태양에서, 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체로부터 유래된 하나 이상의 CDRs는 G1 또는 그의 변이체의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 CDRs와 약 85％ 이상, 약 86％ 이상, 약 87％ 이상, 약 88％ 이상, 약 89％ 이상, 약 90％ 이상, 약 91％ 이상, 약 92％ 이상, 약 93％ 이상, 약 94％ 이상, 약 95％ 이상, 약 96％ 이상, 약 97％ 이상, 약 98％ 이상, 또는 약 99％ 이상 동일하다.
몇몇 실시태양에서, CDR은 캐벗 CDR이다. 다른 실시태양에서, CDR은 코티아 CDR이다. 다른 실시태양에서, CDR은 캐벗 및 코티아 CDR의 조합물 ("조합된 CDR" 또는 "확장된 CDR"로도 명명된다)이다. 다시 말해, 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시태양에서, CDRs는 캐벗, 코티아, 및/또는 조합된 것중 임의의 것일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 폴리펩티드 (예로서, 항체)는 KASKXaaVXaaTYVS의 아미노산 서열을 포함하는데, 여기에서, 5번 위치의 Xaa는 R, W, G, L, 또는 N이고; 여기에서, 7번 위치의 Xaa는 T, A, D, G, R, S, W, 또는 V이다. 몇몇 실시태양에서, KASKXaaVXaaTYVS의 아미노산 서열은 항체 경쇄의 CDR1이다.
몇몇 실시태양에서, 폴리펩티드 (예로서, 항체)는 XaaXaaSNRYXaa의 아미노산 서열을 포함하는데, 여기에서, 1번 위치의 Xaa는 G 또는 A이고; 여기에서, 2번 위치의 Xaa는 A 또는 H이고; 여기에서, 7번 위치의 Xaa는 L, T, I, 또는 S이다. 몇몇 실시태양에서, XaaXaaSNRYXaa의 아미노산 서열은 항체 경쇄의 CDR2이다.
몇몇 실시태양에서, 폴리펩티드 (예로서, 항체)는 EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG의 아미노산 서열을 포함하는데, 여기에서, 5번 위치의 Xaa는 E, R, K, Q, 또는 N이고; 여기에서, 8번 위치의 Xaa는 A, G, N, E, H, S, L, R, C, F, Y, V, D, 또는 P이고; 여기에서, 9번 위치의 Xaa는 S, G, T, Y, C, E, L, A, P, I, N, R, V, D, 또는 M이고; 여기에서, 12번 위치의 Xaa는 H 또는 F이고; 여기에서, 15번 위치의 Xaa는 E 또는 D이다. 몇몇 실시태양에서, EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG의 아미노산 서열은 항체 중쇄의 CDR2이다.
몇몇 실시태양에서, 폴리펩티드 (예로서, 항체)는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는데, 여기에서, 서열 1의 99번 위치의 아미노산 잔기는 L이거나, A, N, S, T, V, 또는 R에 의해 치환된 것이고; 여기에서, 서열 1의 100번 위치의 아미노산 잔기는 A이거나, L, R, S, V, Y, C, G, T, K, 또는 P에 의해 치환된 것이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간화된 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 항체는 모노클로날이다. 몇몇 실시태양에서, 항체 (또는 폴리펩티드)는 단리된 것이다. 몇몇 실시태양에서, 항체 (또는 폴리펩티드)는 실질적으로 순수한 것이다.
항체의 중쇄 불변 영역은 임의 유형의 불변 영역, 예로서, IgG, IgM, IgD, IgA, 및 IgE; 및 임의의 동종형, 예로서, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터의 것일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 항체는 본원에 기술된 변형된 불변 영역을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 단편 또는 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (단리된 것일 수 있다)를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 단편은 항체 G1의 경쇄이다. 또다른 실시태양에서, 단편은 항체 G1의 중쇄이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 단편은 항체 G1의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 추가의 또다른 실시태양에서, 단편은 항체 G1의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) 상보성 결정 영역 (CDRs)을 함유한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (단리된 것일 수 있다)이다. 몇몇 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 9 및 서열 10에 나타낸 폴리뉴클레오티드중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체 (항체 단편을 포함한다) 또는 폴리펩티드중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 (발현 및 클로닝 벡터) 및 숙주 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 벡터는 ATCC 번호가 PTA-6867인 pDb.CGRP.hFcGI이다. 다른 실시태양에서, 벡터는 ATCC 번호가 PTA-6866인 pEb.CGRP.hKGI이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 항체 또는 폴리펩티드에 결합된 CGRP 복합체이다. 몇몇 실시태양에서, 항체는 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의, 본원에 기술된 임의의 폴리펩티드 (항체, 예로서, 항체 G1의 하나 이상의 CDRs를 포함하는 항체를 포함한다) 또는 폴리뉴클레오티드, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 항체 G1이 생산될 수 있는 조건하에서 숙주 세포 또는 그의 자손을 배양하되, 여기에서, 숙주 세포는 항체 G1을 코딩하는 발현 벡터를 포함하고; 몇몇 실시태양에서는, 항체 G1을 정제하는 것을 포함하는, 항체 G1을 생성하는 방법이다. 몇몇 실시태양에서, 발현 벡터는 서열 9 및 서열 10에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 적합한 세포에서 항체 (단일 경쇄 또는 중쇄로서 별개로 발현될 수 있거나, 경쇄 및 중쇄 둘 모두가 하나의 벡터로부터 발현된 다) 또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현시킨 후, 일반적으로는 관심의 대상이 되는 항체 또는 폴리펩티드를 회수 및/또는 단리시켜 본원에 기술된 임의의 항체 또는 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항-CGRP 길항제 항체 및 폴리펩티드, 및 항체 및 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CGRP의 비정상적인 작용과 관련된 질환, 예로서, 두통 (예컨대, 편두통, 군집성 두통, 만성 두통, 및 긴장성 두통), 및 CGRP 활성에 길항 작용하여 치료되거나 예방될 수 있는 다른 용태를 치료, 예방, 호전, 조정하거나, 그의 발병률을 감소시키는데 사용될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 조성물들중 임의의 하나 이상을 포함하는 키트 및 조성물을 제공한다. 일반적으로 적합하게 포장되어 적절한 설명서와 함께 제공되는 이들 키트는 본원에 기술된 임의의 방법을 위해 사용된다.
도 1은 상이한 알라닌 치환형의 인간 α-CGRP 단편에 대한 12개의 뮤린 항체의 결합 친화력을 나타내는 표이다. 결합 친화력은 칩 상의 CGRPs를 통해 Fabs를 흐르게 함으로써 비아코어(Biacore)를 사용하여 25℃에서 측정하였다. 박스 안의 값은 알라닌 돌연변이체의 친화력이 모체 단편, 25-37 (이탤릭체)과 비교하여 손실되었음을 나타내는데, 단, 19-37 모체로부터 유래된 K35A는 제외된다. "a"는 19-37 및 25-37 단편에 대한 친화력이 상이한 센서 칩 상에서의 독립적인 측정치 2개의 평균 ± 표준 편차라는 것을 표시한다. "b"는 이상 오프 속도(biphasic offrate)에 기인한, 단순한 2분자 상호작용 모델로부터 유도된 이들의 상호작용을 나타내며, 이로써, 그의 친화력은 입체형상적 변화 모델을 사용함으로써 측정되었다. 그레이 스케일 풀이: 흰색 (1.0)은 모체의 친화력을 나타내고; 밝은 회색 (0.5 미만)은 모체보다 높은 친화력을 나타내고; 진한 회색 (2 초과)은 모체보다 낮은 친화력을 나타내고; 검은색은 어떤 결합도 검출되지 않았음을 나타낸다.
도 2A 및 2B는 CGRP 8-37 (400 nmol/kg), 항체 4901 (25 mg/kg), 및 항체 7D11 (25 mg/kg)을 투여하는 것이 30초간의 전기 펄스 자극 후 혈액 세포 유량으로서 측정되는 피부 혈류량에 미치는 효과를 나타낸다. CGRP 8-37은 전기 펄스 자극 3-5분 전에 정맥내 (i.v.)로 투여되었다. 항체는 전기 펄스 자극 72시간 전에 복강내 (IP)로 투여되었다. 그래프 상의 각각의 점은 표시된 조건하에서 처리된 래트 한마리의 AUC를 나타낸다. 그래프 상의 선은 표시된 조건하에서 처리된 래트들의 평균 AUC를 나타낸다. AUC (곡선하 면적) = Δ유량 x Δ시간. "Δ유량"은 전기 펄스 자극 후의 유량 단위의 변화량을 나타내고; "Δ시간"은 혈액 세포 유량 수준이 전기 펄스 자극 이전의 수준으로 되돌아 오는데 걸리는 소요 시간을 나타낸다.
도 3은 상이한 투여량의 항체 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2.5 mg/kg, 또는 1 mg/kg)을 투여하는 것이 30초간의 전기 펄스 자극 후 혈액 세포 유량으로서 측정되는 피부 혈류량에 미치는 효과를 나타낸다. 항체는 전기 펄스 자극 24시간 전에 정맥내 (i.v.)로 투여하였다. 그래프 상의 각각의 점은 표시된 조건하에서 처리된 래트 한마리의 AUC를 나타낸다. 그래프 상의 선은 표시된 조건하에서 처리된 래트들의 평균 AUC를 나타낸다.
도 4A 및 4B는 항체 4901 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg, i.v.), 항체 7E9 (10 mg/kg, i.v.), 및 항체 8B6 (10 mg/kg, i.v.)을 투여하는 것이 30초간의 전기 펄스 자극 후 혈액 세포 유량으로서 측정되는 피부 혈류량에 미치는 효과를 나타낸다. 항체를 정맥내 (i.v.)로 투여한 후, 투여 이후 30분, 60분, 90분, 및 120분이 경과한 후에 신경 전기 펄스 자극으로 이어졌다. Y축은, 어떤 항체도 투여하지 않았을 때 (시점 0)의 AUC 수준와 비교되는 AUC의 백분율(％)을 나타낸다. X축은 항체 투여에서 전기 펄스 자극까지의 시간(분)을 나타낸다. 시점 0과의 비교로서 "*"는 P < 0.05를 나타내고, "**"는 P < 0.01을 나타낸다. 데이타는 2원 ANOVA 및 던넷(Dunett) 다중 비교 시험을 사용하여 분석하였다.
도 5는 항체 G1의 중쇄 가변 영역 (서열 1) 및 경쇄 가변 영역 (서열 2)의 아미노산 서열을 나타낸다. 캐벗 CDRs는 볼드체의 텍스트로 되어 있고, 코티아 CDRs에는 밑줄이 그어져 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 잔기는 순차적으로 번호매김이 이루어진 것이다.
도 6은 비아코어를 사용하여 펩티드 경쟁에 의해 항체 G1의 에피토프를 지도화하는 것을 나타낸다. N-바이오티닐화된 인간 α-CGRP를 SA 센서 칩에 포획시켰다. 경쟁 펩티드의 부재하에서 G1 Fab (50 nM)를, 또는 10 uM의 경쟁 펩티드와 1시간 동안 사전-인큐베이션시킨 G1 Fab (50 nM)를 칩 상에 흐르게 하였다. G1 Fab가 칩 상의 인간 α-CGRP에 결합하는 것을 측정하였다. Y축은 경쟁 펩티드의 부재하에서의 결합과 비교되는, 경쟁 펩티드의 존재에 의해 차단되는 결합의 백분율(％)을 나타낸다.
도 7은 항체 G1 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg, i.v.) 또는 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈 20)을 투여하는 것이 30초간의 전기 펄스 자극 후 혈액 세포 유량으로서 측정되는 피부 혈류량에 미치는 효과를 나타낸다. 항체 G1 또는 비히클을 정맥내 (i.v.)로 투여한 후, 투여 이후 30분, 60분, 90분, 및 120분이 경과한 후에 신경 전기 펄스 자극으로 이어졌다. Y축은, 어떤 항체도 투여하지 않거나, 비히클을 투여하였을 때(100％로 정의됨) (시점 0)의 AUC 수준와 비교되는 AUC의 백분율(％)을 나타낸다. X축은 항체 투여에서 전기 펄스 자극까지의 시간(분)을 나타낸다. 비히클과의 비교로서 "*"는 P < 0.05를 나타내고, "**"는 P < 0.01을 나타낸다. 데이타는 2원 ANOVA 및 본페로니(Bonferroni) 사후검정을 사용하여 분석하였다.
도 8A는 항체 G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg, i.v.) 또는 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈 20)을 투여하는 것이 투여 후 24시간이 경과한 후에 30초간의 전기 펄스 자극 후 혈액 세포 유량으로서 측정되는 피부 혈류량에 미치는 효과를 나타낸다. 항체 G1 또는 비히클은 신경 전기 펄스 자극 24시간 전에 정맥내 (i.v.)로 투여되었다. Y축은 전체 곡선하 면적 (자극 시점부터 유량이 기준선으로 되돌아 올 때까지의 시간 변화에 의해 증가된 혈액 세포 유량의 변화, AUC)을 나타낸다. X축은 다양한 용량의 항체 G1을 나타낸다. 비히클과의 비교로서 "*"는 P < 0.05를 나타내고, "**"는 P < 0.01을 나타낸다. 데이타는 2원 ANOVA 및 던넷 다중 비교 시험을 사용하여 분석하였다.
도 8B는 항체 G1 (0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg, i.v.) 또는 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈 20)을 투여하는 것이 투여 후 7일이 경과한 후에 30초간 의 전기 펄스 자극 후 혈액 세포 유량으로서 측정되는 피부 혈류량에 미치는 효과를 나타낸다. 항체 G1 또는 비히클은 신경 전기 펄스 자극 7일 전에 정맥내 (i.v.)로 투여되었다. Y축은 전체 AUC를 나타낸다. X축은 다양한 용량의 항체 G1을 나타낸다. 비히클과의 비교로서 "**"는 P < 0.01을 나타내고, "***"는 P < 0.001을 나타낸다. 데이타는 2원 ANOVA 및 던넷 다중 비교 시험을 사용하여 분석하였다.
도 8C는 도 8A 및 8B로부터 얻은 데이타의 곡선 적합 분석이다. 항체 G1 또는 비히클은 신경 전기 펄스 자극 24시간 전 또는 7일 전에 정맥내 (i.v.)로 투여되었다. Y축은 전체 AUC를 나타낸다. X축은 다양한 용량의 항체 G1을 나타내는데, 이는 EC50을 측정하기 위하여 로그자 상에 "mg/kg"로 표시된다.
도 9는 항체 mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS 또는 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈 20)이 전기장 자극 후 중경막 동맥의 직경 변화에 미치는 효과를 나타낸다. 항체 mu7E9, BIBN4096BS 또는 비히클은 전기 자극에 대한 기준 반응이 확립된 이후 시점 0분에서 정맥내 (i.v.)로 투여되었다. Y축은 전기장 자극 후의 중경막 동맥의 직경 변화를 나타낸다. 휴지기의 직경은 0％에 상응한다. X축은 전기 펄스 자극 이후의 경과 시간(분)을 나타낸다. 비히클과의 비교로서 "*"는 P < 0.05를 나타내고, "**"는 P < 0.01을 나타낸다. 데이타는 2원 ANOVA 및 던넷 다중 비교 시험을 사용하여 분석하였다.
도 10은 다양한 용량의 항체 G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg, i.v.) 또 는 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈 20)이 전기장 자극 후 중경막 동맥의 직경 변화에 미치는 효과를 나타낸다. 항체 G1 또는 비히클은 전기장 자극에 앞서 7일 전에 정맥내 (i.v.)로 투여되었다. Y축은 중경막 동맥의 직경 변화를 나타낸다. 휴지기의 직경은 0％에 상응한다. X축은 자극 전압을 나타낸다. 비히클과의 비교로서 "*"는 P < 0.05를 나타내고, "**"는 P < 0.01을 나타내고, "***"는 P < 0.001을 나타낸다. 데이타는 2원 ANOVA 및 본페로니 사후검정을 사용하여 분석하였다.
도 11A는 24시간 전에 정맥내 (i.v.) 투여된 항체 mu4901 (10mg/kg) 또는 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈 20)이 모르핀에 중독된 래트에서 낼럭손 (1 mg/kg)의 피하 주사로 유도된 심부 체온 감소에 미치는 효과를 나타낸다. Y축은 기준선으로부터의 온도차를 나타낸다. X축은 낼럭손 주사 시점으로부터 측정된 시간을 나타낸다.
도 11B는 24시간 전에 정맥내 (i.v.) 투여된 항체 mu4901 (10mg/kg) 또는 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈 20)이 모르핀에 중독된 래트에서 낼럭손 (1 mg/kg)의 피하 주사로 유도된 꼬리 표면의 온도 증가에 미치는 효과를 나타낸다. Y축은 기준선으로부터의 온도차를 나타낸다. X축은 낼럭손 주사 시점으로부터 측정된 시간을 나타낸다.
본원에 개시된 본 발명은 개체에게 치료학적 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 투여하여 개체에서 혈관의 운동과 관련된 증상들, 예로서, 두통 (예컨대, 편두통, 군집성 두통, 만성 두통, 및 긴장성 두통) 또는 안면 홍조를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
본원에 개시된 본 발명은 또한 항-CGRP 길항제 항체, 및 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체로부터 유래된 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 항체 및 폴리펩티드를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다.
일반적인 기법
본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술에 속하는 분자 생물학 (재조합 기술을 포함한다), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 그러한 기법은 문헌, 예로서, ([Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths,d D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons]; [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and CC. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)])에 충분히 설명되어 있다.
정의
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치한 1개 이상의 항원 인식 부위를 통하여 표적, 예로서, 당질, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 바, 이러한 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 그의 단편 (예로서, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질 (예로서, 도메인 항체), 및 항원 인식 부위를 포함하는 변형된 형상의 임의의 다른 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 임의 부류의 항체, 예로서, IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 동종형)을 포함하며, 항체는 임의의 특정 부류일 필요는 없다. 중쇄 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5가지 주요 부류가 있으며, 이들중 몇몇은 하위부류 (동종형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 명명된다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 수득된 하나의 항체를 지칭하며, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별 항체들은 최소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연발생 돌연변이를 제외하면 동일한 것이다. 모노클로날 항체 집단은 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해서 지정된다. 추가로, 전형적으로는 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해서 지정된다. 수식어 "모노클로날"이라는 것은 동종 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특징을 언급하는 것으로, 이는 임의 특정 방법에 의해 항체가 생상되어야 한다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 먼저 [Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495]에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 예로서, 미국 특허 번호 제4,816,567호에 기재되어 있는 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들면 [McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554]에 기재되어 있는 기법을 사용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "인간화된" 항체는 인간을 제외한 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 항체를 함유하는 특이적인 키메라성 면역글로불린, 면역글로불린 쇄, 또는 그의 단편 (예로서, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항원의 다른 항원-결합 하위서열)인, 인간을 제외한 (예컨대, 뮤린) 항체 형태를 지칭한다. 대개의 경우, 인간화된 항체는 수혜자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 생물학적 활성을 갖는 마우스, 래트, 또는 래빗과 같은 인간을 제외한 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수혜자 항체)이다. 몇몇 일례로, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 인간을 제외한 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화된 항체는 수혜자 항체에서도, 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지는 않지만, 항체 성능을 추가로 개선시키고 최적화하는데 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 1개 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 모두를 포함하는데, CDR 영역 모두 또는 실질적으로 그들 모두는 인간을 제외한 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 영역 모두 또는 실질적으로 그들 모두는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한 최선으로는 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부분을, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 항체는 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 가질 수 있다. 다른 형태의 인간화된 항체는 원래의 항체와 관련하여 변경된 하나 이상의 CDRs (1, 2, 3, 4, 5, 6개)를 가지면, 이는 또한 원래의 항체로부터의 하나 이상의 CDRs"로부터 유래된" 하나 이상의 CDRs로 명명된다.
본원에서 사용되는 바, "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미하고/의미하거나, 당업계에 알려져 있거나 본원에 개시된 임의의 인간 항체 제조 기법을 사용하여 제조되었다. 인간 항체의 이러한 정의는 1개 이상의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 1개 이상의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 하나의 그러한 일례로는 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체이다. 인간 항체는 당업계에 알려져 있는 다양한 기법을 이용하여 생산될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다 ([Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314]; [Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162]; [Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381]; [Marks et al.,1991, J. Mol. Biol., 222:581]). 또한 인간 항체는 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들면, 마우스 내로 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기재되어 있다. 별법으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 제조될 수 있다 (그러한 B 림프구는 개체로부터 회수될 수 있거나, 시험관 내에서 면역화될 수 있다). 예를 들어, [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)]; [Boerner et al., 1991, J Immunol., 147(1):86-95]; 및 미국 특허 번호 제5,750,373호를 참조할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "칼시토닌 유전자-관련 펩티드" 및 "CGRP"라는 용어는 임의 형태의 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 및 CGRP의 활성중 적어도 일부를 보유하고 있는 그의 변이체를 지칭한다. 예를 들면, CGRP는 α-CGRP 또는 β-CGRP일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, CGRP는 모든 포유동물 종, 예컨대, 인간, 개, 고양이, 말, 및 소의 천연 서열 CGRP을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "항-CGRP 길항제 항체" (상호교환적으로 "항-CGRP 항체"로도 명명된다)는 CGRP에 결합할 수 있고, CGRP 생물학적 활성 및/또는 CGRP 신호화에 의해 매개되는 하류 경로(들)을 저해할 수 있는 항체를 지칭한다. 항-CGRP 길항제 항체는 CGRP 신호화에 의해 매개되는 하류 경로, 예로서, 수용체 결합 및/또는 CGRP에 대한 세포 반응의 유도를 비롯한 CGRP 생물학적 활성을 차단, 길항, 억제, 또는 경감 (현저히 하는 것을 포함한다)시키는 항체를 포함한다. 본 발명의 목적으로 위해, "항-CGRP 길항제 항체"라는 용어는 앞서 확인된 용어, 표제 및 기능 상태, 및 CGRP 그 자체와, CGRP 생물학적 활성 (임의의 두통 양상을 매개할 수 있는 그의 능력을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다), 또는 생물학적 활성의 결과를 실질적으로는 의미있을 정도로 무효화하거나, 감소시키거나, 중화시키는 특징들을 포함한다고 명확히 이해될 것이다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 CGRP에 결합하고, CGRP가 CGRP 수용체에 결합하지 못하도록 한다. 다른 실시태양에서, 항-CGRP 항체는 CGRP에 결합하고, CGRP 수용체의 활성화를 막는다. 항-CGRP 길항제 항체의 일례는 본원에서 제공한다.
본원에서 사용되는 바, "G1" 및 "항체 G1"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 기탁 번호가 ATCC PTA-6867 및 ATCC PTA-6866인 발현 벡터에 의해 생산되는 항체를 지칭한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 5에 나타낸다. 도 5에는 항체 G1의 CDR 부분 (코티아 및 캐벗 CDRs를 포함한다)은 도표로 도시되어 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 9 및 서열 10에 나타낸다. G1의 특징화는 실시예에서 기술한다.
"폴리펩티드," "올리고펩티드," "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개입될 수 있다. 또한 이 용어는 천연적으로, 또는 개재, 예를 들어, 디설피드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 기타 조작 또는 변형, 예로서, 표지화 성분의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 이러한 정의에는, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함한다) 뿐만 아니라, 당업계에 알려져 있는 기타 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기재로 하기 때문에, 폴리펩티드가 단일 쇄 또는 회합 쇄로 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예로서, 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예로서, 표지화 성분의 접합에 의해서 추가로 변형될 수 있다. 또다른 유형의 변형은, 예를 들어, "캡," 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 인터뉴클레오티드 변형, 예를 들어, 전하를 띠지 않는 결합 (예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 전하를 띠는 결합 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)이 있는 것, 펜던트 부분, 예로서, 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터 (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬레이터를 함유하는 것, 변형된 결합이 있는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등) 뿐만 아니라, 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 또한, 당 내에 통상 존재하는 임의의 하이드록실 기가 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 예를 들어 대체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 결합이 제조되도록 활성화될 수 있거나, 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나, 아민 또는 탄소수 1 내지 20의 유기 캡핑 기 부분으로 치환될 수 있다. 또다른 하이드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 유사체, □-아노머 당, 에피머 당, 예로서, 아라비노스, 자일로스 또는 라이소스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵툴로스, 비고리형 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체, 예로서, 메틸 리보시드를 비롯한, 당업계에 일반적으로 알려져 있는 리보스 또는 데옥시리보스의 유사한 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합이 대체 연결기로 대체될 수 있다. 이러한 대체 연결기에는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기에서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 에테르(-O-) 결합을 임의로 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20C), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜이다)로 대체된 실시태양을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 비롯한 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
항체의 "가변 영역"은 단독의 또는 조합된 항체 경쇄 가변 영역 또는 항체 중쇄 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각은 초가변 영역으로도 알려져 있는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 구성된다. 각 쇄에서의 CDRs는 FR에 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다. CDR을 결정하는 2가지 이상의 기법이 존재한다: (1) 교차-종 서열 가변성을 기초로 하는 접근법 ( 즉, [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기초로 하는 접근법 ([Chothia et al. (1989) Nature 342:877]; [Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)]). 본원에서 사용되는 바, CDR은 상기 접근법중 하나 또는 두개의 접근법의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.
항체의 "불변 영역"은 단독의 또는 조합된 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 나타낸다.
항체 또는 폴리펩티드에 "우선적으로 결합" 또는 "특이적으로 결합" (본원에서 상호교환적으로 사용됨)하는 에피토프는 당업계에서 잘 이해되는 용어이고, 그러한 특이적 또는 우선적 결합을 측정하는 방법 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 대체 세포 또는 물질보다 특정 세포 또는 물질과 더욱 빈번하게, 더욱 급속하게, 더 큰 지속력으로, 및/또는 더 큰 친화력으로 반응하거나 회합하는 경우에, 분자는 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 일컬어진다. 항체는, 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화력, 결합력으로, 더욱 용이하게, 및/또는 더 큰 지속력으로 결합하는 경우, 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 예를 들면, 하나의 CGRP 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 CGRP 에피토프 또는 비-CGRP 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화력, 결합력으로, 더욱 용이하게, 및/또는 더 큰 지속력으로 이러한 에피토프에 결합하는 항체이다. 이러한 정의를 판독함으로써, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 부분 또는 에피토프)가 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나, 결합하지 않을 수 있는 것으로도 이해된다. 따라서, "특이적 결합 " 또는 "우선적 결합 "은 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미하지만, 반드시 그러한 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한"은 50％ 이상 순수한 (즉, 오염물이 없는), 더욱 바람직하게는 90％ 이상 순수한, 더욱 바람직하게는 95％ 이상 순수한, 더욱 바람직하게는 98％ 이상 순수한, 더욱 바람직하게는 99％ 이상 순수한 물질을 지칭한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)에 대한 수혜자일 수 있거나 수혜자인 개별적인 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 자연적, 우연적, 또는 고의적 돌연변이로 인하여 원래의 모 세포와 반드시 완전하게 동일할 필요는 없다 (형태학적으로 또는 게놈 DNA 상보성 면에서). 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체 내에서 형질감염된 세포를 포함한다.
"Fc 영역"이라는 용어는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 규정짓기 위하여 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 Cys226 위치의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 그의 카복실-말단까지 신장되어 있는 것으로 규정지어 진다. Fc 영역에서의 잔기의 번호매김은 캐벗. [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]에서와 같은 EU 인덱스의 것이다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 및 CH3을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "Fc 수용체 " 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체와, 이러한 수용체들의 대립유전자 변이체 및 별법으로 스플라이싱된 형태 포함하는 것을 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체")를 포함하는데, 이들은 세포질 도메인에 있어서 주로 상이한, 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 ([Ravetch and Kinet, 1991,n. Rev. Immunol., 9:457-92]; [Capel et al., 1994, Immunomethods, 4: 25-34]; 및 [de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41])에서 개관된다. "FcR"는 신생아 수용체 FcRn을 포함하는데, 이는 모계 IgG의 태아로의 전달을 담당한다 ([Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587]; 및 [Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249]).
"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적의 용해를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어, 항체)에 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들면, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)]에 기재되어 있는 바와 같은 CDC 검정법을 실시할 수 있다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 1가지 이상의 효과기 기능을 갖는다. 대표적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체, BCR)의 하향-조절 등을 포함한다. 그러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 필요로 하고, 그러한 항체 효과기 기능을 평가하는, 당업계 알려져 있는 다양한 검정법을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 1개 이상의 아미노산 변형으로 인하여 천연 서열 Fc 영역의 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하나, 천연 서열 Fc 영역의 1가지 이상의 효과기 기능이 유지된다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환을 갖고, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는, 약 1 내지 약 5개 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역과 서열 동일성이 약 80％ 이상일 것이고, 가장 바람직하게는 그와의 서열 동일성이 약 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 그와의 서열 동일성이 약 95％ 이상, 약 96％ 이상, 약 97％ 이상, 약 98％ 이상, 약 99％ 이상일 것이다.
본원에서 사용되는 바, "항체-의존성 세포-매개 세포독성 " 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 중성구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다. 관심의 대상이 되는 분자의 ADCC 활성을 시험관내 ADCC 검정법, 예로서, 미국 특허 번호 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재되어 있는 것을 사용하여 평가할 수 있다. 그러한 검정법에 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 NK 세포가 포함된다. 별법으로, 또는 추가적으로, 관심의 대상이 되는 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어 [Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수도 있다.
본원에서 사용되는 바, "치료"는 유리하거나 원하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유리하거나 원하는 임상 결과는 하기의 것들중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다: 중증도 감소, 동통 세기, 및 다른 관련 증상 경감, 재발 빈도 감소, 두통을 앓는 환자의 삶의 질 향상, 및 두통 치료를 위해 필요한 다른 의약의 복용량 감소를 비롯한 임의 양상의 두통의 개선. 편두통의 경우, 다른 관련 증상으로는 구역, 구토, 및 빛, 소음, 또는 움직임에 관한 과민증이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 군집성 두통의 경우, 다른 관련 증상으로는 눈 아래 또는 눈 주변의 종창, 과도한 발한 눈물, 눈충혈, 비루 또는 비 충혈, 및 안면 홍조가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
두통의 "발병률을 감소시키는 것"은 중증도를 감소시키는 것 (예를 들면, 편두통용의 에르고타민, 디하이드로에르고타민, 또는 트립탄을 비롯한 상기 용태를 위해 일반적으로 사용되는 다른 약물 및/또는 요법에 대한 필요성 및/또는 양 (예를 들어, 이에 대한 노출)을 감소시키는 것을 포함할 수 있다), 기간을 감소시키는 것 및/또는 빈도를 감소시키는 것 (예를 들어, 개체에서 다음 우발성 발작까지의 시간을 지연시키거나 이에 대한 시간을 증가시키는 것을 포함함다)중 임의의 것을 의미한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 개체는 치료에 대한 그의 반응의 관점에서 다양할 수 있고, 따라서, 예를 들어, "개체에서 두통의 발병률을 감소시키는 방법"은 항-CGRP 길항제 항체의 투여가 그러한 특정 개체에서의 발병률의 감소를 야기할 수 있다는 합리적인 예상을 기초로 항-CGRP 길항제 항체를 투여하는 것을 반영한다.
두통 또는 두통의 하나 이상의 증상을 "호전시키는 것"은 항-CGRP 길항제 항체를 투여하지 않는 것과 비교하여 두통의 하나 이상의 증상의 감소 또는 개선을 의미한다. "호전"은 증상의 지속 기간의 단축 또는 감소를 또한 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "두통을 조정하는 것"은 (치료 전의 수준과 비교할 때) 개체에서 두통의 하나 이상의 증상의 중증도 또는 지속 기간, 또는 두통 발현 빈도를 유지시키거나 감소시키는 것을 지칭한다. 예를 들면, 개체에서 두통의 지속 기간 또는 중증도, 또는 발현 빈도는 치료 전의 수준과 비교할 때 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 또는 70％ 이상중 임의의 값까지 경감된다.
본원에서 사용되는 바, 두통의 발병을 "지연시키는 것"은 상기 질환의 진행을 미루고/미루거나, 지체시키고/시키거나, 느리게 하고/하거나, 저지하고/하거나, 안정화시키고/시키거나, 지연시키는 것을 의미한다. 이러한 지연은 병력 및/또는 치료될 개체에 따라서, 시간의 길이가 달라질 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 현저한 지연은, 개체에서 두통 (예로서, 편두통)이 발병되지 않는다는 점에서, 사실상 방지를 포함할 수 있다. 증상의 발병을 "지연시키는" 방법은 이러한 방법을 이용하지 않는 것과 비교할 때, 소정의 시간 프레임 내에 증상이 발병할 가능성을 감소시키고/시키거나 소정의 시간 프레임 내에 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 전형적으로 그러한 비교는 통계학적으로 유의한 수의 대상자를 사용하는, 임상 연구를 기초로 한다.
두통의 "발병" 또는 "진행"은 질병의 초기 소견 및/또는 그 후의 진행을 의미한다. 두통의 발병은 당업계에 잘 알려져 있는 표준 임상 기법을 사용하여 검출되고 평가될 수 있다. 그러한, 발병은 또한 검출될 수 없는 진행도 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 발병 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발병"은 발생, 재발, 및 개시를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 두통의 "개시" 또는 "발생"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 유리하거나 원하는 결과를 일으키는데 충분한 양이다. 예방학적 용도를 위한 유리하거나 원하는 결과는 예로서, 본 질환, 그의 합병증 및 본 질환 발병시 출현되는 중간의 병적 표현형의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동 증상을 비롯한 질병의 위험 제거 또는 경감, 질병의 중증도 감소, 또는 질병 개시의 지연시키는 결과를 포함한다. 치료학적 용도를 위한 유리하거나 원하는 결과는 예로서, 통증 세기, 지속 기간 또는 두통 발작 빈도를 감소시키는 것, 및 두통 (생화학적, 조직학적 및/또는 행동)과 그의 합병증 및 본 질환 발병시 출현되는 중간의 병적 표현형으로부터 유발된 하나 이상의 증상을 감소시키는 것, 본 질환을 앓는 환자의 삶의 질을 향상시키는 것, 본 질환 치료에 필요한 다른 의약의 복용량을 감소시키는 것, 또다른 의약의 효과를 증진시키는 것, 및/또는 환자에서 본 질환의 진행을 지연시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효량은 1회 이상으로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물의 유효량은 직접 또는 간접적으로 예방학적 또는 치료학적 요법을 수행하는데 충분한 양이다. 임상 환경에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물의 유효량은 또다른 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물과 함께 달성될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 하나 이상의 치료제를 투여하는 환경에서 "유효량"이 고려될 수 있고, 하나 이상의 다른 제제와 함께 원하는 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면, 단일 제제가 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다.
"개체" 또는 "대상자"는 포유동물, 더욱 바람직하게, 인간이다. 포유동물은 가축, 경기용 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 본원에서 사용되는 바, "벡터"는 숙주 세포 내에 하나 이상의 관심의 대상이 되는 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온 응축제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵생물세포, 예로서, 프로듀서 세포를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "발현 조정 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조정 서열은 구성 또는 유도성 프로모터와 같은 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 조정 서열은 전사될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용되는 바, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분과 조합될 때 상기 성분이 생물학적 활성을 유지하도록 하고, 대상자의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예로는 임의의 표준 약제학적 담체, 예로서, 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예로서, 유/수 에멀젼, 및 각종 유형의 습윤화제를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 인산염 완충 염수 또는 생리식염수 (0.9％)이다. 그러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제형화된다 (예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000]를 참조할 수 있다).
본원에서 사용되는 바, 용어 "K온"은 항원/항체 결합에 대한 속도 상수를 지칭하도록 의도된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "K오프"는 항원/항체 복합체로부터 항체의 해리에 대한 속도 상수를 지칭하도록 의도된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "KD"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하도록 의도된다.
본원에서 사용되는 바, "운동과 관련된 증상"이라는 용어는 혈관 확장과 관련된 용태를 지칭하도록 의도되며, 특히 체온 조절 기능장애에 의해 유발되는 두통 (예로서, 편두통 등), 안면 홍조(hot flushing) (또는 안면 홍조(hot flashes)), 감기 홍조, 불면증, 수면 장애, 기분장애, 과민증, 과도한 발한, 야간 발한, 주간 발한, 피로감 등을 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "홍조(flushing)," "안면 홍조(hot flush)" 및 "안면 홍조(hot flash)"는 보통 대상자에서 발현을 수반하며, 전형적으로는 급성 피부 홍조로 구성된 체온 상의 우발적 장애를 지칭하는 당업계에서 인식되는 용어이다.
A. 혈관의 운동과 관련된 증상들을 예방 또는 치료하는 방법
하나의 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체 또는 항체로부터 유래된 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 적어도 하나의 운동과 관련된 증상, 예로서, 두통 (예컨대, 편두통) 또는 안면 홍조를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 적어도 하나의 운동과 관련된 증상, 예로서, 두통 (예컨대, 편두통) 또는 안면 홍조의 발병률을 호전, 조정, 경감시키거나, 그의 발병 또는 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 두통 치료에 유용한 1종 이상의 첨가제와 배합하여 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 두통 (예컨대, 편두통)의 발병률을 호전, 조정, 경감시키거나, 그의 발병 또는 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
그러한 첨가제로는 5-HT 효현제 및 NSAIDs를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 예를 들면, 항체 및 1종 이상의 첨가제는 동시에 투여될 수 있고, 즉, 그들 개개의 치료학적 효과가 중복될 수 있도록 시간상 매우 근접하게 제공될 수 있다. 예를 들면, 항-CGRP 항체와 함께 배합되어 투여되는 5-HT 효현제 또는 NSAID의 양은 환자에서 이들 제제중 하나를 투여하고 나머지 하나는 투여하지 않을 경우와 비교할 때 두통 재발 빈도를 감소시키거나 효능 지속 기간을 더욱 장기화시키기에 충분하여야 한다. 이러한 방법은 전조가 있거나 없는 편두통; 편마비 편두통; 군집성 두통; 편두통성 신경통; 만성 두통; 긴장성 두통; 다른 의학적 용태로부터 유발된 두통 (예로서, 감염 또는 종양에 기인한 두개골압 증가); 만성 발작성 반두증; 구조적 병변과는 무관한 기타 두통; 비-혈관성 두개내 질병과 관련된 두통; 물질 투여 또는 그의 금단과 관련된 두통; 뇌외 감염과 관련된 두통; 대사성 질병과 관련된 두통; 두개골, 목, 눈, 귀, 코, 부비동, 치아, 입, 또는 다른 안면 또는 두개 구조상의 질병과 관련된 두통; 뇌신경통; 및 신경줄기 동통 및 구심차단성 동통을 비롯한 매우 다양한 부류중 임의의 것에 포함되는 두통을 치료하는데 사용될 수 있다.
당업자는 항-CGRP 항체와 배합되어 사용되는 특정 제제의 적절한 투여량을 결정할 수 있다. 예를 들면, 수마트립탄은 약 0.01 내지 약 300 mg의 투여량으로 투여될 수 있다. 비경구적으로 투여될 경우, 수마트립탄의 전형적인 투여량은 약 25 내지 약 100 mg이고, 일반적으로는 약 50 mg이 바람직하며, 경구적으로 투여될 경우, 약 6 mg의 투여량이 바람직하다. 그러나, 특정 환자 또는 특정 배합 요법에 최적화될 수 있도록 당업계의 표준 방법에 따라 이러한 투여량을 달리할 수 있다. 추가로, 예를 들면, 셀레콕십은 50 내지 500 mg의 양으로 투여될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 안면 홍조 치료에 유용한 1종 이상의 첨가제와 배합하여 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 안면 홍조의 발병률을 호전, 조정, 경감시키거나, 그의 발병 또는 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 그러한 첨가제로는 에스트로겐 및/또는 몇몇 프로게스틴을 비롯한 호르몬-기재 치료제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 기술된 모든 방법과 관련하여, 항-CGRP 길항제 항체에 대한 언급은 또한 하나 이상의 이들 제제를 포함하는 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 추가로 당업계에 잘 알려져 있는, 완충액을 비롯한 적합한 부형제, 예로서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명은 단독으로 또는 종래의 다른 치료법과 병용하여 사용될 수 있다.
항-CGRP 길항제 항체는 임의의 적합한 경료를 통해 개체에게 투여될 수 있다. 본원에 기술된 일례는 제한하고자 하는 것이 아니라, 이용가능한 기법을 예시하고자 하는 것이라는 것은 당업자에게 명백하여야 한다. 알려져 있는 방법에 따라, 예로서, 정맥내 투여, 예를 들어, 볼루스로서 또는 경시적인 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 설하, 윤활액내, 통기, 경막내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 개체에게 투여된다. 투여는 전신성, 예를 들어, 정맥내 투여일 수 있거나, 국소화될 수 있다. 제트 분무기 및 초음파 분무기를 비롯한 상업적으로 이용가능한 액체 제형용 분무기가 투여에 유용하다. 액체 제형은 직접 분무될 수 있고, 동결건조된 분말이 재구성 후 분무될 수 있다. 별법으로, 항-CGRP 길항제 항체는 탄화불소 제형 및 계량 용량 흡입기를 이용하여 에어로졸화될 수 있거나, 동결건조 및 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 부위-지정 또는 표적화된 국소 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-지정 또는 표적화된 국소 전달 기법의 예로는 C항-CGRP 길항제 항체의 다양한 이식성 저장소 공급원 또는 국소 전달 카테터, 예로서, 주입 카테터, 내재 카테터, 또는 침 카테터, 합성 그래프트, 외피 랩, 션트 및 스텐트 또는 기타 이식가능한 장치, 부위 지정 담체, 직접 주입, 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 공보 WO 00/53211 및 미국 특허 번호 제5,981,568호를 참조할 수 있다.
항-CGRP 길항제 항체의 다양한 제형이 투여에 사용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 순수하게 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제는 다양한 제형으로 존재할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 당업계에 알려져 있고, 약리학적으로 효과적인 물질의 투여를 용이하게 하는, 비교적 불활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태나 조도를 제공할 수 있나거, 희석제로서 작용할 수 있다. 적절한 부형제로는 안정화제, 습윤화 및 유화제, 오스몰 농도를 변화시키는 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부 침투 증강제를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 부형제 뿐만 아니라, 비경구 및 경구 약물 전달을 위한 제형이 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 기재되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 이러한 제제들은 주사 (예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의한 투여용으로 제형화된다. 따라서, 이러한 제제들은 약제학적으로 허용가능한 비히클, 예로서, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특정 투여 요법, 즉, 용량, 시간 조절 및 반복은 특정 개체 및 이러한 개체의 병력에 좌우될 것이다.
항-CGRP 항체는 주사 (예를 들어, 복막내, 정맥내, 피하, 근육내 등)를 비롯한 임의의 적절한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 또한 항-CGRP 항체는, 본원에 기술된 바와 같이, 흡입을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, 항-CGRP 항체의 투여를 위해, 최초의 후보물 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 전형적인 일일 투여량은, 상기 언급된 인자들에 따라 3 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg 내지 300 ㎍/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상중 임의의 범위일 수 있다. 예를 들면, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 및 약 25 mg/kg의 투여량으로 사용될 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 용태에 따라서, 원하는 증상 억제가 발생할 때까지 또는 충분한 치료 수준이 달성되어 통증이 감소될 때까지 치료가 지속된다. 대표적인 투여 요법은 항-CGRP 항체를 약 2 mg/kg의 최초 투여 후 약 1 mg/kg의 지속 용량으로 매주 투여하는 것 또는 약 1 mg/kg의 지속 용량으로 격주로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 실행자가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라, 또다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 일주일에 1-4회 투여하는 것이 고려된다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정법에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여량 요법 (사용된 CGRP 길항제(들)을 포함한다)은 경시적으로 변할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 항-CGRP 길항제 항체의 적절한 투여량은 사용되는 항-CGRP 길항제 항체 (또는 그의 조성물), 치료하고자 하는 두통 (예컨대, 편두통)의 유형 및 중증도, 제제가 예방 또는 치료의 목적으로 투여되는지 여부, 사전 요법, 환자의 병력 및 제제에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 전형적으로 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 항-CGRP 길항제 항체를 투여할 것이다. 용량 및/또는 빈도는 치료의 진행에 따라서 변할 수 있다.
반감기와 같은 실험적인 고려사항이 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예로서, 인간화 항체 또는 완전한 인간 항체를 사용하여, 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 요법의 진행에 따라 결정 및 조정될 수 있고, 반드시는 아니지만, 일반적으로 두통의 치료 및/또는 억제 및/또는 호전 및/또는 지연을 기초로 한다. 별법으로, 항-CGRP 길항제 항체의 지속적인 연속 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당업계에 알려져 있다.
하나의 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체의 투여량은 항-CGRP 길항제 항체가 1회 이상 투여된 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 항-CGRP 길항제 항체의 투여량을 증가시키면서 개체에게 제공한다. 항-CGRP 길항제 항체의 효능을 평가하기 위해, 본 질환의 지표가 이어질 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 항-CGRP 길항제 항체의 투여는, 예를 들어, 수혜자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료 또는 예방인지의 여부, 및 당업자에게 알려져 있는 기타 인자들에 따라, 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 항-CGRP 길항제 항체의 투여는 미리 선택된 기간의 시간에 걸쳐서 본질적으로 연속적일 수 있거나, 일련의 간격을 둔 투여일 수 있는데, 예를 들어, 두통 (예를 들어, 편두통) 발병 전, 발병시 또는 발병 후; 두통 발병 전; 두통 발병시; 두통 발병 전 및 발병 후; 두통 발병시 및 발병 후; 두통 발병 전 및 발병시; 또는 두통 발병 전, 발병시 및 발병 후일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 1 초과의 항-CGRP 길항제 항체가 존재할 수 있다. 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 이를 초과하는 상이한 항-CGRP 길항제 항체가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이러한 항-CGRP 길항제 항체들은 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는다. 또한 항-CGRP 길항제 항체는 다른 CGRP 길항제 또는 CGRP 수용체 길항제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 하기 CGRP 길항제가 사용될 수 있다: CGRP에 대한 안티센스 분자(CGRP를 코딩하는 핵산에 대한 안티센스 분자를 포함한다), CGRP 저해성 화합물, CGRP 구조 유사체, CGRP에 결합하는 CGRP 수용체의 우성-음성 돌연변이, 및 항-CGRP 수용체 항체이다. 항-CGRP 길항제 항체는 또한 제제의 유효성을 증강시키고/증강시키거나 보완하는 작용을 하는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 항-CGRP 길항제 항체의 치료학적 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 선택적인 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 저장용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 인산염, 시트르산염, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 염; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (예로서, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란을 포함하는 단당류, 이당류, 및 기타 당질; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트리할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체 ); 및/또는 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸린 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
항-CGRP 길항제 항체를 함유하는 리포좀은 ([Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; [Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호)에 기재된 바와 같은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증강된 리포좀이 미국 특허 번호 제5,013,556호에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜 에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로의 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀이 한정된 구멍 크기의 필터를 통과하여 압출되어, 원하는 직경의 리포좀이 산출된다.
또한 활성 성분은 코아세르베이션(coacervation) 기법 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 -마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이같은 기법은 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 제3,773,919호), L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌 -비닐 아세테이트, 분해성 락트산 -글리콜산 공중합체, 예로서, 루프론 데포트(LUPRON DEPOT)™ (락트산 -글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여에 사용될 제형은 무균성이어야 한다. 이는, 예를 들어, 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료학적 항-CGRP 길항제 항체 조성물은 일반적으로 무균 접근 포트가 있는 용기, 예를 들어 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 놓인다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여 또는 흡입 또는 통기에 의한 투여를 위하여, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌약과 같은 단위 투여 제형일 수 있다.
정제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 주요 활성 성분을 약제학적 담체, 예를 들어, 통상적인 정제화 성분 예컨대, 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산 2 칼슘 또는 검, 및 기타 약제학적 희석제, 예를 들어 물과 혼합하여, 본 발명의 화합물 또는 비-독성인 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 조성물이 형성된다. 이러한 예비제형 조성물을 균질한 것으로 지칭하는 경우, 이는 조성물이 동일하게 효과적인 단위 투여 제형 예로서, 정제, 알약 및 캡슐로 용이하게 세분될 수 있도록 활성 성분이 조성물 전반에 걸쳐 균등하게 분산된 것을 의미한다. 그 후, 이러한 고체 예비제형 조성물이 0.1 내지 약 500 mg의 본 발명의 활성 성분을 함유하는 상기 기술된 유형의 단위 투여 제형으로 세분된다. 신규 조성물의 정제 또는 환약이 코팅되거나 또다른 방식으로 조제되어, 연장된 작용의 이점을 제공하는 투여 제형을 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있고, 이때 후자는 전자를 덮어싸는 형태이다. 위에서의 붕해를 저지하는 작용을 하고, 내부 성분이 손상되지 않은 채로 십이지장 내로 통과하도록 하거나 이의 방출이 지연되도록 작용하는 장용성 층에 의해 두 성분이 분리될 수 있다. 다양한 재료가 이같은 장용성 층 또는 코팅물에 사용될 수 있고, 이같은 재료에는 다수의 중합체성 산 및 중합체성 산과 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 재료의 혼합물이 포함된다.
적합한 계면활성제로는, 특히, 비-이온성 계면활성제, 예로서, 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 기타 소르비탄 (예를 들어, 스판(Span)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)이 포함된다. 계면활성제를 포함하는 조성물은 간편하게는 0.05 내지 5％ 계면활성제를 포함할 것이며, 0.1 내지 2.5％일 수 있다. 필요하다면, 다른 성분, 예를 들어, 만니톨 또는 기타 약제학적으로 허용가능한 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
적합한 에멀젼은 인트라리피드(Intralipid)™, 리포신(Liposyn)™, 인포누트롤(Infonutrol)™, 리포푼딘(Lipofundin)™ 및 리피피산(Lipiphysan)™과 같이 상업적으로 이용가능한 지방 에멀젼을 이용하여 제조될 수 있다. 미리 혼합된 에멀젼 조성물에 활성 성분이 용해될 수 있거나, 별법적으로 활성 성분이 오일 (예를 들어, 대두유, 홍화유, 면실유, 참기름, 옥수수유 또는 아몬드유)에 용해되고, 인지질 (예를 들어, 계란 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과의 혼합 시 에멀젼이 형성될 수 있다. 에멀젼의 등장성을 조정하기 위해, 또다른 성분, 예를 들어, 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 적절한 에멀젼은 전형적으로 20％ 이하의 오일, 예를 들어 5 내지 20％를 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 lm, 특히 0.1 내지 0.5 lm의 지방 액적을 포함할 수 있고, pH 는 5.5 내지 8.0 의 범위일 수 있다.
에멀젼 조성물은 항-CGRP 길항제 항체를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두유, 계란 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 통기용 조성물은 약제학적으로 허용가능한 수성 또는 유기 용매 또는 그의 혼합물 내의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 기재된 바와 같은 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 조성물은 국소적 또는 전신적 효과를 위해 경구 경로 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여될 수 있다. 무균성인 것이 바람직한 약제학적으로 허용가능한 용매내의 조성물이 기체를 이용하여 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접 호흡될 수 있거나, 분무 장치가 안면 마스크, 텐트 또는 간헐성 양압 호흡기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물이, 바람직하게는 경구적으로 또는 비강을 통해, 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터 투여될 수 있다.
두통의 진단 또는 평가는 당업계에 잘-확립되어 있다. 평가는 주관적인 측정, 예로서, 증상에 대한 환자의 특징화에 기초하여 실시될 수 있다. 예를 들면, 편두통은 하기 기준에 기초하여 진단될 수 있다: 1) 4 내지 72시간 동안 지속되는 우발성 발현; 2) 하기 증상들중 2개를 포함하는 것: 편측성 동통, 박동성, 운동시 악화, 및 중간 또는 중증 세기의 동통; 및 3) 하기 증상들중 1개를 포함하는 것;구역 또는 구토, 및 백주공포증 또는 고성공포증. [Goadsby et al., N. Engl. J. Med. 346:257-270, 2002].
치료 효능은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, 동통 완화를 평가할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 동통 완화는 항-CGRP 항체를 투여한 후 1, 2, 또는 몇시간이 경과한 후에 주관적으로 관찰된다. 몇몇 실시태양에서, 두통 발현의 빈도는 항-CGRP 항체를 투여한 후에 주관적으로 관찰된다.
B. 항- CGRP 길항제 항체
본 발명의 방법은 항-CGRP 길항제 항체를 사용하는데, 이는 CGRP 신호화에 의해 매개되는 하류 경로, 예로서, 수용체 결합 및/또는 CGRP에 대한 세포 반응의 유도를 비롯한 CGRP 생물학적 활성을 차단, 억제, 또는 경감 (현저히 하는 것을 포함한다)시키는 임의의 항체 분자를 지칭한다.
항-CGRP 길항제 항체는 하기의 특징들중 임의의 하나 이상을 나타내어야 한다: (a) CGRP에 결합하고; (b) CGRP가 그의 수용체(들)에 결합하는 것을 차단하고; (c) CGRP 수용체 활성화 (cAMP 활성화를 포함한다)를 차단 또는 감소시키고; (d) CGRP 생물학적 활성 또는 CGRP 신호화 작용에 의해 매개되는 하류 경로를 저해하고; (e) 임의의 두통 (예컨대, 편두통) 양상을 예방, 호전 또는 치료하고; (f) CGRP 제거를 증가시키고; (g) CGRP 합성, 생산 또는 방출을 저해 (경감)시킨다. 항-CGRP 길항제 항체는 당업계에 알려져 있다. 예컨대, ([Tan et al., Clin. Sci. (Lond). 89:565-73, 1995]; 시그마(Sigma) (미국 미주리주 소재), 제품 번호 C7113 (클론 #4901); [Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993])을 참조할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, CGRP 및/또는 CGRP 신호화 작용에 의해 매개되는 하류 경로를 저해하는 방식으로 항체는 CGRP와 반응한다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간 CGRP를 인식한다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간 α-CGRP 및 β-CGRP, 둘 모두에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간 및 래트 CGRP에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 CGRP중 아미노산 25-37을 갖는 C-말단 단편에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 CGRP중 아미노산 25-37을 갖는 C-말단 에피토프에 결합한다.
본 발명에서 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질 (예로서, 도메인 항체), 인간화된 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유결합으로 변형된 항체를 비롯한 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 또다른 변형된 형상의 면역글로불린 분자를 포함할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 임의의 또다른 기원일 수 있다 (키메라 또는 인간화된 항체를 포함한다).
몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 모노클로날 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간화된 것이다. 몇몇 실시태양에서, 항체는 인간의 것이다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 항체 G1 (본원에 기술된 것)이다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 항체 G1의 하나 이상의 CDR(들) (예로서, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 몇몇 실시태양에서, 6개 CDR 모두) 또는 표 6에 제시한 항체 G1의 변이체를 포함한다. 추가의 다른 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 도 5 (서열 1)에 제시한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 1) 및 도 5에 제시한 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 2)을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예로서, 본원에 기술된 면역학적으로 불활성인 불변 영역을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 불변 영역은 [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 번호 9809951.8에 기재되어 있는 것과 같이 변형된다. 다른 실시태양에서, 항체는 하기 돌연변이: A330P331에서 S330S331로 (야생형 IgG2 서열을 참조하여 번호매김한 아미노산)를 포함하는 인간 중쇄 IgG2 불변 영역을 포함한다 [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]. 몇몇 실시태양에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 돌연변이: E233F234L235에서 P233V234A235로인 것을 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함한다. 추가의 다른 실시태양에서, 불변 영역은 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것이다. 몇몇 실시태양에서, 불변 영역은 올리고당 부착 잔기 (예로서, Asn297) 및/또는 불변 영역내 N-당화 인식 서열의 일부분인 인접 잔기의 돌연변이화에 의해 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것이다. 몇몇 실시태양에서, 불변 영역은 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것이다. 불변 영역은 효소적으로, 또는 당화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것일 수 있다.
항-CGRP 길항제 항체의 CGRP (예로서, 인간 α-CGRP)에 대한 결합 친화력 (KD)은 약 0.02 내지 약 200 nM일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 결합 친화력은 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM중 임의의 것일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 결합 친화력은 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 또는 약 50 pM중 임의의 것의 미만이다.
항체의 CGRP에 대한 결합 친화력을 측정하는 하나의 방법은 항체의 단작용성 Fab 단편의 결합 친화력을 측정함으로써 이루어진다. 단작용성 Fab 단편을 수득하기 위하여 항체 (예를 들면, IgG)를 파파인으로 절단시키거나 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 항체의 항-CGRP Fab 단편의 친화력은 HBS-EP 전개용 완충액 (0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3mM EDTA, 0.005％ v/v 계면활성제 P20)을 사용하여 사전-고정화된 스트렙트아비딘 센서 칩 (SA)가 장착된 표면 플라즈몬 공명 (비아코어3000™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템, 뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 비아코어, 인코포레이티드(Biacore INC.))에 의해 측정할 수 있다. 바이오티닐화된 인간 CGRP (또는 임의의 다른 CGRP)는 HBS-EP 완충액에 0.5 ug/mL 미만의 농도로 희석시키고, 다양한 접촉 시간을 사용하여 개개의 칩 채널을 통해 주입함으로써 2가지 범위의 항원 밀도를 달성시킬 수 있다: 상세한 동력학 연구용의 50-200 반응 단위 (RU) 및 스크리닝 검정용 800-1,000 RU. 재생 연구는 25％ v/v 에탄올중 25mM NaOH가 200회가 넘는 주입에 대하여 칩 상의 CGRP의 활성을 유지시키면서 결합된 Fab를 효과적으로 제거한다는 것을 나타냈다. 전형적으로, 정제된 Fab 샘플의 일련의 희석물 (0.1-10 x 추정 KD)을 1분 동안 100 ㎕/분으로 주입하고, 최대 2시간의 해리 시간을 허용한다. Fab 단백질의 농도는 알려져 있는 농도 (아미노산 분석에 의해 측정됨)의 Fab를 기준으로 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기천공에 의해 측정된다. BIAevaluation 프로그램을 이용하여 데이타를 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 [Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994), Methods Enzymology 6. 99-110]에 핏팅시킴으로써 동력학 회합 속도 (k온) 및 해리 속도 (k오프)가 동시에 수득된다. 평형 해리 상수 (KD) 값은 k오프/k온으로 계산된다. 이러한 프로토콜은 인간 CGRP, 또다른 척추동물 (몇몇 실시태양에서, 포유동물)의 CGRP (예로서, 마우스 CGRP, 래트 CGRP, 영장류 CGRP)를 비롯한 임의의 CGRP 뿐만 아니라, 다른 형태의 CGRP (예로서, α 및 β형)에 대한 항체의 결합 친화력을 측정하는데 사용하기에 적합하다. 항체의 결합 친화력은 일반적으로 25℃에서 측정되지만, 37℃에서도 측정될 수 있다.
항-CGRP 길항제 항체는 임의의 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 숙주 동물 면역화의 경로 및 일정은 본원에서 추가로 기술된 바와 같이, 항체 자극 및 생산에 관한 확립된 통상적인 기법을 따른다. 인간 및 마우스 항체의 생산을 위한 일반적 기법은 당업계에 알려져 있고, 본원에 기술된다.
인간을 포함하는 임의의 포유동물 대상자 또는 이들로부터의 항체 생산 세포는 인간을 비롯한 포유동물의 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기초로 작용하도록 조작될 수 있는 것으로 생각된다. 전형적으로, 본원에 기술된 것을 포함하여, 소정량의 면역원이 숙주 동물에게 복강내, 근육내, 경구, 피하, 족내, 및/또는 피부내 접종된다.
하이브리도마는 [Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497]의 일반적인 체세포 혼성화 기법을 이용하여, 또는 [Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)]에 의하여 변형된 바와 같이, 림프구 및 불멸화 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 미국 캘리포니아주에 소재하는 솔크 인스티튜트(Salk Institute)의 셀 디스트리부션 센터(Cell Distribution Center)로부터의 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 이용가능한 골수종 세포주가 혼성화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 기법은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합원을 이용하여, 또는 당업자에게 잘 알려져 있는 전기적 수단에 의해 골수종 세포와 림프구 세포를 융합시키는 것을 수반한다. 융합 후, 세포를 융합 배지로부터 분리하고, 선별 성장 배지, 예로서, 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지에서 성장시켜, 혼성화되지 않은 모체 세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 혈청이 보충되지 않은, 임의의 본원에 기술된 배지가 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는데 사용될 수 있다. 또다른 대체 세포 융합 기법으로서, EBV 불멸화 B 세포가 본 발명의 항-CGRP 모노클로날 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 원한다면, 하이브리도마를 확장 및 서브클로닝하고, 상등액을 통상적인 면역분석 절차 (예를 들어, 방사성 면역 분석법, 효소 면역 분석법, 또는 형광 면역 분석법)에 의해 항-면역원 활성에 대하여 검정한다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 CGRP에 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 일부를 생산하는 모체 하이브리도마의 모든 유도체, 자손 세포를 포함한다.
그러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 알려져 있는 절차를 이용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 성장될 수 있다. 원한다면, 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예로서, 황산암모늄 침전, 젤 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 및 초여과에 의해, 모노클로날 항체를 배양 배지 또는 체액으로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 고체상에 부착된 면역원으로 이루어진 흡착제 상에 제제를 전개시키고, 원하는 항체를 면역원으로부터 용출 또는 방출시킴으로써, 원치 않는 활성 (존재하는 경우)을 제거할 수 있다. 이작용성 또는 유도체화 제제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통한 접합), 글리타르알데히드, 숙신 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기에서, R 및 R1은 상이한 알킬 기이다)를 사용하여 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 갑상선글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합된, 인간 CGRP, 또는 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편으로 숙주 동물을 면역화시킴으로써, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 집단이 산출될 수 있다.
원한다면, 관심의 대상이 되는 항-CGRP 길항제 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)를 서열분석한 후, 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 또는 증식을 위하여 벡터내로 클로닝할 수 있다. 관심의 대상이 되는 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포내의 벡터내에서 유지될 수 있고, 그후 숙주 세포가 추후의 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"시키거나 항체의 친화력 또는 기타 특성을 개선시키기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체가 인간에서의 임상 실험 및 치료에서 사용되는 경우 면역 반응을 피하기 위해, 불변 영역은 인간 불변 영역과 더욱 유사하도록 조작될 수 있다. CGRP에 대한 더욱 큰 친화력 및 CGRP 억제에서의 더욱 큰 효능을 수득하기 위해 항체 서열을 유전자 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 항-CGRP 길항제 항체에 이루어질 수 있고, CGRP에 대한 그의 결합 능력이 여전히 유지될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
모노클로날 항체를 인간화시키는 4가지 일반적 단계가 있다. 이는 (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예측된 아미노산 서열을 결정하는 단계, (2) 인간화된 항체를 디자인하는 단계, 즉, 인간화 공정시 사용할 항체 프레임워크 영역을 결정하는 단계, (3) 실제적인 인간화 방법론/기법, 및 (4) 인간화된 항체의 형질감염 및 발현이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,816,567호; 제5,807,715호; 제5,866,692호; 제6,331,415호; 제5,530,101호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,585,089호; 및 제6,180,370호를 참조할 수 있다.
인간 불변 도메인에 융합된 설치동물 또는 변형된 설치동물 V 영역 및 그의관련 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 키메라 항체를 포함하여, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위를 포함하는 다수의 "인간화된" 항체 분자가 기술되어 있다. 예를 들어, ([Winter et al. Nature 349:293-299 (1991)], [Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989)], [Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987)], 및 [Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987)])를 참조할 수 있다. 또다른 참고 문헌에 적합한 인간 항체 불변 도메인과의 융합 전에 인간의 지지 프레임워크 영역 (FR)에 그래프트된 설치동물 CDR이 기술되어 있다. 예를 들어, ([Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988)], [Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988)], 및 [Jones et al. Nature 321:522-525 (1986)])를 참조할 수 있다. 또다른 참고 문헌에 재조합적으로 덧대어진 설치동물 프레임워크 영역에 의해 지지되는 설치동물 CDR이 기술되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 공개 0519596을 참조할 수 있다. 이러한 "인간화된" 분자는 설치동물 항-인간 항체 분자에 대한 원치 않는 면역학적 반응을 최소화하도록 디자인되고, 이때 상기 반응은 인간 수혜자에서 이러한 부분을 치료학적으로 적용하는 것에 관한 기간 및 유효성을 제한한다. 예를 들어, 항체 불변 영역은 면역학적으로 비활성이도록 (예를 들어, 보체 용해를 유발하지 않도록) 조작될 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 공보 PCT/GB99/01441; 영국 특허 출원 9809951.8을 참조할 수 있다. 또한 이용될 수 있는, 항체를 인간화시키는 또다른 방법이 ([Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991)] 및 미국 특허 번호 제6,180,377호; 제6,054,297호; 제5,997,867호; 제5,866,692호; 제6,210,671호; 및 제6,350,861호; 및 PCT 공개 공보 WO01/27160에 개시되어 있다.
추가의 또다른 별법으로, 특정 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 이용가능한 마우스를 사용하여 완전한 인간 항체를 수득할 수 있다. 더욱 바람직한 (예를 들어, 완전한 인간 항체) 또는 더욱 강력한 면역 반응이 일어나도록 디자인된 트랜스제닉 동물이 인간화된 항체 또는 인간 항체의 생성에도 사용될 수 있다. 그러한 기법의 예는 앱제닉스 인코포레이티드(bgenix, Inc.)(캘리포니아주 프리몬트 소재)로부터의 제노마우스(Xenomouse)™ 및 HuMAb-Mouse® 및 메다렉스 인코포레이티드(Medarex Inc.)(뉴저지주 프린스턴 소재)로부터의 TC 마우스(TC Mouse)™이다.
별법으로, 당업계에 알려져 있는 임의의 방법을 사용하여 항체를 재조합적으로 제조하고 발현시킬 수 있다. 또다른 별법으로, 파지 디스플레이 기술에 의해 항체를 재조합적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, (미국 특허 번호 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호; 및 제6,265,150호; 및 [Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)])를 참조할 수 있다. 별법으로, 파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al., Nature 348:552-553(1990)]이 면역화되지 않은 제공자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산하는데 사용될 수 있다. 이러한 기법에 따르면, 항체 V 도메인 유전자가 M13 또는 fd와 같은 필라멘트성 박테리오파지의 주(major) 또는 부(minor) 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임(in-frame)으로 클로닝되어, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 싱글 스트랜드 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질을 기초로 선택한 결과로, 이러한 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 또한 선택된다. 따라서, 파지는 B 세포의 성질의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다; 개관을 위해, 예를 들어 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]를 참조할 수 있다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소규모 무작위 조합 라이브러리로부터의 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 제공자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 작제될 수 있고, 항원 (자가-항원을 포함한다)의 다양한 어레이에 대한 항체는 본질적으로 ([Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)])에 기술된 기법에 따라 단리될 수 있다. 천연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다 (체세포 과다돌연변이). 도입된 변화중 일부는 더욱 높은 친화력을 부여할 것이고, 고친화력 표면 면역글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 후속 항원 접종( 동안 우선적으로 복제 및 분화된다. "쇄 셔플링"으로 알려져 있는 기술을 사용함으로써 이러한 천연 공정이 모방될 수 있다 [Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)]. 이러한 방법에서, 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 면역화되지 않은 제공자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 천연 발생 변이체 (레퍼토리)의 레퍼토리로 연속적으로 대체함으로써, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화력이 개선될 수 있다. 이러한 기법은 친화력이 pM-nM 범위인 항체 및 항체 단편이 생산되도록 한다. 초대형 파지 항체 레퍼토리 ("모든 라이브러리의 어머니(the mother-of-all libraries)"로 또한 공지됨)를 제조하기 위한 전략이 [Waterhouse et al.,Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)]에 기재되어 있다. 유전자 셔플링은 설치동물 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 또한 사용될 수 있으며, 이때 인간 항체는 출발 설치동물 항체와 유사한 친화력 및 특이성을 가진다. "에피토프 각인"으로도 지칭되는 이러한 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기법에 의해 수득된 설치동물 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자가 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 설치동물-인간 키메라가 생성된다. 항원에 대해 선택한 결과로, 기능적 항원-결합 부위가 복원될 수 있는 인간 가변 영역이 단리되고, 즉, 에피토프가 파트너의 선택을 좌우 (각인)한다. 나머지 설치동물 V 도멘인을 대체하기 위해 공정이 반복될 때, 인간 항체가 수득된다 (PCT 공개 공보 WO 93/06213 (1993년 4월 1일 공개) 참조할 수 있다). CDR 그래프트에 의한 설치동물 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기법은 설치동물 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다.
상기 논의가 인간화된 항체에 관련된 것이지만, 논의된 일반적인 원리는, 예를 들어, 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서의 사용을 위해 항체를 주문제작하는데 적용가능될 수 있다는 것이 명백하다. 본원에 기술된 항체 인간화의 하나 이상의 양상, 예를 들어, CDR 그래프트, 프레임워크 돌연변이 및 CDR 돌연변이가 조합될 수 있다는 것 또한 명백하다.
먼저 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생산 세포를 단리하고, 유전자 서열을 수득하고, 유전자 서열을 사용하여, 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포) 내에서 항체를 재조합적으로 발현시킴으로써 항체를 재조합적으로 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 또다른 방법은 식물 (예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 유액에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 유액에서 재조합적으로 항체를 발현시키는 방법은 개시되어 있다. 예를 들어, ([Peeters, et al. Vaccine 19:2756 (2001)]; [Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65 (1995)]; 및 [Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147 (1999)])를 참조할 수 있다. 항체의 유도체, 예를 들어 인간화된 항체, 단일 쇄 항체 등의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다.
면역 검정법 및 유세포측정 분류 기법, 예로서, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 또한 사용하여, CGRP에 특이적인 항체를 단리할 수 있다.
항체는 많은 상이한 담체에 결합될 수 있다. 담체는 활성 및/또는 비활성일 수 있다. 주지된 담체의 예로는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철광이 포함된다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위하여 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자는 항체를 결합시키기 위한 또다른 적합한 담체를 알고 있거나, 일상적인 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 몇몇 실시태양에서, 담체는 심근을 표적화하는 부분을 포함한다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써). 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 (예로서, PCT 공개 공보 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터) 내로 놓을 수 있고, 이어서 형질감염되지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 벡터가 형질감염되어, 재조합 숙주 세포 내에서 모노클로날 항체의 합성이 달성된다. 예를 들어, PCT 공개 공보 WO 87/04462를 참조할 수 있다. 예를 들어, 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 ([Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984)]), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 전체 또는 일부 코딩 서열을 공유결합으로 연결시킴으로써, DNA가 또한 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에서의 항-CGRP 모노클로날 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
항-CGRP 길항제 항체 및 항체로부터 유래된 폴리펩티드는 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 동정되고 특징화될 수 있는데, 여기에서, CGRP의 생물학적 활성의 경감, 호전, 또는 중화가 검출되고/검출되거나 측정된다. 예를 들면, 항-CGRP 길항제 항체는 또한 후보 제제를 CGRP와 함께 인큐베이션시키고, (a) CGRP에 결합하고; (b) CGRP가 그의 수용체(들)에 결합하는 것을 차단하고; (c) CGRP 수용체 활성화 (cAMP 활성화를 포함한다)를 차단 또는 감소시키고; (d) CGRP 생물학적 활성 또는 CGRP 신호화 작용에 의해 매개되는 하류 경로를 저해하고; (e) 임의의 두통 (예컨대, 편두통) 양상을 예방, 호전 또는 치료하고; (f) CGRP 제거를 증가시키고; (g) CGRP 합성, 생산 또는 방출을 저해 (경감)시 특징들중 임의의 하나 이상을 모니터함으로써 동정될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체 또는 폴리펩티드는 후보 제제를 CGRP와 함께 인큐베이션시키고, CGRP의 결합 및/또는 CGRP의 생물학적 활성의 부수적인 경감 또는 중화를 모니터함으로써 동정될 수 있다. 결합 검정법은 정제된 CGRP 폴리펩티드(들)를 사용하여, 또는 CGRP 폴리펩티드(들)을 자연적으로 발현시키거나, 발현시키도록 형질감염된 세포를 사용함으로써 실시도리 수 있다. 하나의 실시태양에서, 결합 검정법은 CGRP 결합에 대하여 알려져 있는 항-CGRP 길항제 항체와 경쟁하는 후보물 제제 (에컨대, 항체)의 능력이 평가되는 경쟁적 결합 검정법이다. 검정법은 ELISA 포맷을 포함하여 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 다른 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 후보 제제를 CGRP와 함께 인큐베이션시키고, 결합 및 세포 표면 상에서 발현되는 CGRP 수용체 활성화의 부수적인 저해를 모니터함으로써 동정된다.
최초의 동정 이후, 후보 항-CGRP 길항제 항체의 활성이 표적화된 생물학적 활성을 시험하는 것으로 알려져 있는 생물학적 검정법에 의해 추가로 확인 및 정련될 수 있다. 별법으로, 생물학적 검정법을 사용하여 후보물을 직접 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, CGRP는 반응성 세포에서 다수의 측정가능한 변화를 촉진시킨다. 이는 세포 (예컨대, SK-N-MC 세포)에서의 cAMP 자극을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 길항제 활성은 또한 동물 모델을 사용하여, 예로서, 래트 복재 신경의 자극에 의해 유도된 피부 혈관 확장을 측정함으로써 측정될 수 있다. [Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110: 772-776, 1993]. 두통 (예로서,, 편두통)의 동물 모델은 추가로 길항제 항체 또는 폴리펩티드의 효능을 시험하는데 사용될 수 있다. [Reuter, et al., Functional Neurology (15) Suppl.3, 2000]. 항-CGRP 길항제 항체 또는 폴리펩티드를 동정하고 특징화하는 방법중 일부를 본 실시예에서 상세하게 기술한다.
항-CGRP 길항제 항체는 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 특징화될 수 있다. 예를 들면, 한 방법은 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 지도화"이다. 예를 들면, [Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]의 제11장에 기재되어 있는 것과 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조를 해석하는 것, 경쟁 검정법, 유전자 단편 발현 검정법, 및 합성 펩티드를 기재로 한 검정법을 포함하여, 단백질 상의 에피토프 위치를 지도화하고 특징화하는 많은 방법이 당업계에 알려져 있다. 추가적인 일례로, 에피토프 지도화가 항-CGRP 길항제 항체가 결합하는 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 에피토프 지도화는 다양한 공급원, 예를 들어, 펩스캔 시스템(Pepscan Systems)(네덜란드 8219 피에이치 렐리스타드 에델헤르트베그 15 소재)으로부터 상업적으로 이용가능하다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉, 아미노산의 단일 신축물에 함유된 것일 수 있거나, 필수적으로 단일 신축물 내에 함유되지 않을 수 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형상적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이의 펩티드 (예를 들어, 아미노산 약 4-6개 이상의 길이)가 단리 또는 합성되어 (예를 들어, 재조합적으로), 항-CGRP 길항제 항체와의 결합 검정에 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 항-CGRP 길항제 항체가 결합하는 에피토프를 CGRP 서열로부터 유도된 중첩 펩티드를 사용하여 항-CGRP 길항제 항체에 의한 결합을 결정함으로써 전체적인 스크리닝에 의해 결정할 수 있다. 유전자 단편 발현 검정법에 따라, CGRP를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특정 유전자 구조에 의해 단편화시키고, CGRP의 발현된 단편과 시험되는 항체의 반응성을 측정한다. 유전자 단편은, 예를 들어, 방사성 아미노산의 존재하에, PCR에 의해 생산된 후, 시험관내에서 전사되고 단백질로 번역된다. 그 후, 방사성 표지된 CGRP 단편에 대한 항체의 결합을 면역침전 및 젤 전기영동에 의해 측정한다. 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리 (파지 라이브러리)를 이용하여 특정 에피토프가 또한 동정될 수 있다. 별법으로, 중첩 펩티드 단편의 한정된 라이브러리를 시험 항체에 결합하는 것에 대해 간단한 결합 검정으로 시험할 수 있다. 추가적인 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 에피토프 결합에 요구되고/요구되거나, 충분하고/충분하거나, 필수적인 잔기를 동정할 수 있다. 예를 들어, CGRP 폴리펩티드의 다양한 단편이 밀접하게 관련되었지만 항원성이 다른 단백질 (예로서, 뉴로트로핀 단백질 족의 또다른 구성원)로부터의 서열로 대체 (스와핑)된 돌연변이 CGRP를 사용하여 도메인 스와핑 실험이 수행될 수 있다. 돌연변이 CGRP에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정 CGRP 단편의 중요성이 평가될 수 있다.
항-CGRP 길항제 항체를 특징화하는데 사용될 수 있는 추가의 또다른 방법은 동일한 항원, 즉 CGRP 상의 다양한 단편에 결합하는 것으로 알려져 있는 다른 항체와의 경쟁 검정법을 이용하여, 항-CGRP 길항제 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는 것이다. 경쟁 검정법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
발현 벡터를 사용하여 항-CGRP 길항제 항체의 발현을 지시할 수 있다. 당업자는 생체 내에서의 외인성 단백질의 발현을 수득하기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,436,908호; 제6,413,942호; 및 제6,376,471호를 참조할 수 있다. 발현 벡터의 투여에는 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 투여, 및 국부적 투여를 비롯한, 국소 또는 전신 투여가 포함된다. 또다른 실시태양에서, 발현 벡터는 교감신경 줄기 또는 신경절에, 또는 심장 동맥, 심방, 심실, 또는 심장막 내로 직접 투여된다.
발현 벡터 또는 하위게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료학적 조성물의 표적화된 전달 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기법이 예를 들어, [Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202]; [Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994)]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542]; [Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338]에 기술되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료학적 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 DNA의 범위로 투여될 수 있다. 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 2 mg, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 DNA의 농도 범위가 유전자 요법 프로토콜시 사용될 수 있다. 치료학적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스성 또는 비-바이러스성 기원일 수 있다 (일반적으로, ([Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51]; [Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845]; [Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148])를 참조할 수 있다). 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 이용하여 이같은 코딩 서열의 발현이 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적이거나 또는 조절될 수 있다.
원하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기재 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 대표적인 바이러스-기재 비히클에는 재조합 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공개 공보 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 번호 제5,219,740호; 제4,777,127호; 영국 특허 2,200,651; 및 유럽 특허 0 345 242를 참조할 수 있다), 알파바이러스-기재 벡터 (예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터, 셈리키 산림 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수알레 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, PCT 공개 공보 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655를 참조할 수 있다). [Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147]에 기재되어 있는 사멸 아데노바이러스에 연결에 DNA를 투여하는 것 또한 사용될 수 있다.
사멸 아데노바이러스에 연결되거나 단독으로 이에 연결되지 않은 다가양이온성 응축 DNA (예를 들어, [Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147] 참조할 수 있다); 리간드-연결 DNA (예를 들어, [Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985]를 참조할 수 있다); 진핵생물 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 특허 번호 제5,814,482호; PCT 공개 공보 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338을 참조할 수 있다) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 비-바이러스성 전달 비히클 및 방법이 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA 또한 사용될 수 있다. 대표적인 네이키드 DNA 도입 방법이 PCT 공개 공보 WO 90/11092 및 미국 특허 번호 제5,580,859호에 기술되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀이 미국 특허 번호 제5,422,120호; PCT 공개 공보 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 0524968에 기술되어 있다. 추가적인 접근법이 ([Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411] 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581])에 기술되어 있다.
C. 항체 G1 및 관련 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 항체 G1 및 표 6에 나타낸 그의 변이체, 또는 항체 G1 및 표 6에 나타낸 그의 변이체로부터 유래된 폴리펩티드; 및 G1 및 그의 변이체를 코딩하는 서열 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물을 비롯한, 조성물을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 조성물은 CGRP에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 폴리펩티드 (항체일 수 있거나, 항체가 아닐 수도 있다), 및/또는 CGRP에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 조성물 은 추가로 적합한 부형제, 예로서, 당업계에 잘 알려져 있는 완충액을 비롯한, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항-CGRP 길항제 항체 및 폴리펩티드는 하기의 특징들중 임의의 (하나 이상)을 특징으로 한다: (a) CGRP에 결합하고; (b) CGRP가 그의 수용체(들)에 결합하는 것을 차단하고; (c) CGRP 수용체 활성화 (cAMP 활성화를 포함한다)를 차단 또는 감소시키고; (d) CGRP 생물학적 활성 또는 CGRP 신호화 작용에 의해 매개되는 하류 경로를 저해하고; (e) 임의의 두통 (예컨대, 편두통) 양상을 예방, 호전 또는 치료하고; (f) CGRP 제거를 증가시키고; (g) CGRP 합성, 생산 또는 방출을 저해 (경감)시킨다.
따라서, 본 발명은 하기중 어느 것, 또는 하기중 어느 것을 포함하는 조성물 (약제학적 조성물을 포함한다)을 제공한다: (a) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체; (b) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 단편 또는 영역; (c) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄 ; (d) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 중쇄; (e) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역(들); (f) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 하나 이상의 CDR(들) (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDRs); (g) 항체 G1의 중쇄로부터의 CDR H3; (h) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 CDR L3; (i) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDRs; (j) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 중쇄로부터의 3개의 CDRs; (k) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDRs 및 중쇄로부터의 3개의 CDRs; 및 (I) (b) 내지 (k)중 어느 하나를 포함하는 항체. 본 발명은 또한 상기중 임의의 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
도 5에는 항체 G1의 CDR 부분 (코티아 및 캐벗 CDRs를 포함한다)이 도표로 도시되어 있다. CDR 영역을 결정하는 것은 당업계의 기술내 포함되어 있다. 몇몇 실시태양에서, CDRs는 다른 실시태양에서, CDR은 캐벗 및 코티아 CDR의 조합물 ("조합된 CDR" 또는 "확장된 CDR"로도 명명된다)일 수 있다고 이해된다. 다시 말해, 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시태양에서, CDRs는 캐벗, 코티아, 및/또는 조합된 것중 임의의 것일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, CDRs는 캐벗 CDRs이다. 다른 실시태양에서, CDRs는 코티아 CDRs이다. 다시 말해, 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시태양에서, CDRs는 캐벗, 코티아, 및/또는 조합된 것중 임의의 것일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 CDRs와 실질적으로 동일한 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 CDRs를 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수 있거나, 항체가 아닐 수도 있다)를 포함한다. 다른 실시태양은 G1 또는 G1로부터 유래된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 CDRs와 실질적으로 동일한 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 CDR(들)을 갖는 항체를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 CDR(들)이 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 CDRs와 실질적으로 약 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일하다. 본 발명의 목적을 위해, 활성 정도는 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체와 비교하여 다양할 수 있지만 (더욱 크거나 작을 수 있다), 결합 특이성 및/또는 전반적인 활성은 일반적으로 유지된다는 것이 이해될 것이다.
본 발명은 또한 하기: G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 5개 이상의 인접 아미노산, 8개 이상의 인접 아미노산, 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 15개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 25개 이상의 인접 아미노산, 약 30개 이상의 인접 아미노산 서열중 임의의 것을 갖되, 여기에서, 아미노산중 3개 이상은 G1 (도 5) 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 가변 영역으로부터의 것인, G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수 있거나, 항체가 아닐 수도 있다)를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 가변 영역은 G1의 경쇄로부터의 것이다. 또다른 실시태양에서, 가변 영역은 G1의 중쇄로부터의 것이다. 대표적인 폴리펩티드는 G1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 둘 모두로부터의 인접 아미노산 (길이가 상기 기술된 바와 같음)을 갖는다. 또다른 실시태양에서, 5개 (5개 이상)의 인접 아미노산은 도 5에 나타낸 G1의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 것이다. 몇몇 실시태양에서, 인접 아미노산은 G1의 가변 영역으로부터의 것이다.
항-CGRP 길항제 항체 및 폴리펩티드의 CGRP (예로서, 인간 α-CGRP)에 대한 결합 친화력 (KD)은 약 0.06 내지 약 200 nM일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 결합 친화력은 약 200 nM, 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM중 임의의 것일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 결합 친화력은 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 또는 약 50 pM중 임의의 것의 미만이다.
본 발명은 또한 이들 항체 또는 폴리펩티드중 임의의 것을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질 분해성 또는 기타 분해에 의해, 상기 기술된 바와 같은 재조합 방법에 의해 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드), 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 아미노산 약 50개 이하의 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 용이하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 당업계에 알려져 있고, 상업적으로 이용가능하다. 예를 들면, 항체는 고체상 방법을 사용하여 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 생산될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제6,331,415호를 참조할 수 있다.
또다른 별법으로, 항체는 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 9 및 서열 10에 나타낸 항체 G1의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 서열 9 및 서열 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 발현 또는 증식용의 하나 이상의 벡터로 클로닝된다. 관심의 대상이 되는 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포내의 벡터내에서 유지될 수 있고, 그후 숙주 세포가 추후의 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 벡터 (발현 벡터 포함) 및 숙주 세포가 본원에 추가로 기술된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체, 예로서, G1의 단일 쇄 가변 영역 단편 ("scFv")을 포함한다. 단일 쇄 가변 영역 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결시킴으로써 제조된다. [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]. 연결 펩티드의 예는 (GGGGS)3이고, 이는 한 가변 영역의 카르복시 말단과 또다른 가변 영역의 아미노 말단 사이의 약 3.5 nm를 가교시킨다. 다른 서열의 링커가 디자인되어 사용되었다 [Bird et al. (1988)]. 이어서 링커가 추가적인 기능, 예로서, 약물의 부착 또는 고체 지지체에의 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. scFv의 합성 생산을 위해, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산을 위해, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 예로서, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 또는 예로서, 이. 콜라이(E. coli)와 같은 원핵생물인 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 관심의 대상이 되는 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 결찰과 같은 통상적인 조작에 의해 제조될 수 있다. 생성된 scFv를 당업계에 알려져 있는 표준 단백질 정제 기술을 이용하여 단리할 수 있다.
다른 형태의 단일 쇄 항체, 예로서, 디아바디(diabody) 또한 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄 상의 2개의 도메인이 쌍을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인이 또다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 이루게 되어, 2개의 항원 결합 부위가 생성된, 2가의 이중특이적 항체이다 (예컨대, [Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448]; [Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123]를 참조할 수 있다).
예를 들면, 이중특이적 항체이자, 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체는 본원에 개시된 항체를 이용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다 (예컨대, [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210]을 참조할 수 있다). 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기초로 하였고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539].
이중특이적 항체를 제조하기 위한 한 접근법에 따라서, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열로 융합된다. 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 1개 이상의 융합물 내에 존재하도록 하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및, 원한다면, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA들이 별도의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동 형질감염된다. 이것은 작제에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 동등하지 않은 비율이 최적 수율을 제공하는 경우에 실시태양들에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 더욱 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우, 또는 비율이 특별한 의미를 갖지 않는 경우, 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
한 접근법에서, 이중특이적 항체는 한쪽 팔 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른쪽 팔 내의 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 면역글로불린 경쇄가 있는 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 쇄 조합물로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다. 이러한 접근법은 1994년 3월 3일 공개된 PCT 공개 공보 WO 94/04690에 기재되어 있다.
2개의 공유결합으로 연결된 항체를 포함하는 이종접합체 항체 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 그러한 항체는 원치 않는 세포에 면역계를 표적화시키기 위해 (미국 특허 번호 제4.676,980호), 그리고 HIV 감염의 치료를 위해서 (PCT 출원 공개 공보 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089) 사용되었다. 이종접합체 항체는 임의의 용이한 가교 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적절한 가교제 및 기법은 당업계에 잘 알려져 있고, 미국 특허 번호 제4,676,980호에 기술되어 있다.
가교제가 수반되는 방법을 포함하여, 합성 단백질 화학의 알려져 있는 방법을 이용하여 시험관 내에서 키메라 또는 하이브리드 항체 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 디설파이드 교환 반응을 사용하여, 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써, 면역독소가 작제될 수 있다. 이러한 목적에 적절한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트가 포함된다.
항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 하나 이상의 CDRs, 또는 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체로부터 유래된 하나 이상의 CDRs를 포함하는 인간화된 항체는 당업계에 알려져 있는 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체를 인간화시키기 위하여 4개의 일반 단계가 사용될 수 있다.
본 발명은 성질에 현저하게 영향을 미치지 않는 기능적으로 등가인 항체 및 활성이 증강 또는 감소된 변이체를 비롯한, 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체에 대한 변형을 포함한다. 예를 들면, 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 아미노산 서열을 돌연변이화함으로써 CGRP에 대하여 원하는 결합 친화력을 갖는 항체를 수득할 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 당업계의 일상적인 실행이고, 본원에서 상세시 기술될 필요는 없다. 폴리펩티드의 변형은 실시예에서 추가로 예시된다. 변형된 폴리펩티드의 예로는 아미노산 잔기가 보존적 치환되거나, 기능적 활성을 현저하게 해롭게 변화시키지 않는 아미노산이 1개 이상 결실 또는 첨가되거나, 또는 화학적 유사체가 사용된 폴리펩티드가 포함된다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합물 뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔지의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입물의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소가 항체의 N-또는 C-말단에 융합되는 것을 포함한다.
치환 변이체에서는 항체 분자내 1개 이상의 아미노산 잔기가 제거되고, 상이한 잔기가 이 위치에 삽입된다. 치환적 돌연변이유발에 대하여 가장 관심의 대상이 되는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경 또한 고려시된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 제목하에 표 1에 제시된다. 그러한 치환으로 생물학적 활성에서의 변화가 초래되면, 표 1에서 "대표적인 치환"이라 명명된, 또는 아미노산 부류에 관하여 하기에 추가로 기술된 바와 같은, 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 스크리닝될 수 있다.
Figure 112008033817206-PCT00001
(아미노산 치환)
항체의 생물학적 성질에서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들면, 시트 또는 나선 형상과 같은, 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조; (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는 것에 대한 효과가 현저하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질을 기초로 하여 하기 군으로 분류된다 :
(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 전하를 띠지 않는 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성 (음성으로 하전): Asp, Glu;
(4) 염기성 (양성으로 하전): His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro; 및
(6) 방향족 : Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이러한 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환시킴으로써 이루어진다.
항체의 적절한 형상을 유지하는데 수반되지 않은 임의의 시스테인 잔기가, 일반적으로 세린으로, 또한 치환되어 분자의 산화적 안정성이 개선되고 비정상적인 가교가 방지될 수 있다. 역으로, 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 이의 안정성이 개선될 수 있는데, 특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에 그러하다.
아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산을 변화 또는 변형시키는 것에서 가변 영역과 같은 부위를 완전히 다시 디자인하는 것까지의 범위일 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화력 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 1개 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인에서 이루어진다. 또다른 실시태양에서, 1개 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR3 도메인에서 이루어진다. 또다른 실시태양에서, CDR 도메인은 CDR H3 및/또는 CDR L3이다.
변형은 또한 당화 및 비-당화 폴리펩티드 뿐만 아니라, 다른 번역 후의 변형, 예로서, 여러가지 당으로의 당화, 아세틸화 및 인산화가 있는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 불변 영역 내의 보존된 위치에서 당화된다 ([Jefferis and Lund, 1997, Chem, Immunol. 65:111-128]; [Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32]). 면역글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질의 기능 ([Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318]; [Wittwe and Howard, 1990, Biochem, 29:4175-4180]), 및 당단백질의 일부분 간의 분자내 상호작용에 영향을 미치고, 이것은 당단백질의 형상 및 제시된 3-차원 표면에 영향을 미칠 수 있다 ([Hefferis and Lund, 상기 문헌 ]; [Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416]). 또한 올리고당은 특정한 인식 구조를 기초로 하여 소정의 당단백질을 특정 분자에 표적화하는 역할을 할 수 있다. 항체의 당화는 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 에 영향을 미치는 것으로 또한 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 발현이 테트라사이클린-조절된 CHO 세포는 ADCC 활성이 개선된 것으로 보고되었다 ([Umana et al., 1999, Mature Biotech, 17:176-180]).
항체의 당화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 당질 부분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 당질 부분을 아스파라긴 측쇄에 효소에 의해 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 당화 부위가 생성된다. O-연결된 당화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스중 하나가 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신 또한 사용될 수 있다.
항체에 당화 부위를 부가하는 것은 항체가 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 용이하게 달성된다 (N-연결된 당화 부위의 경우). 또한 변형은 원래의 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 달성될 수 있다 (O-연결된 당화 부위의 경우).
항체의 당화 패턴은 기초를 이루는 뉴클레오티드 서열의 변경 없이 변경될 수도 있다. 당화는 항체의 발현에 사용된 숙주 세포에 주로 의존한다. 잠재적인 치료제로서의 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현에 사용된 세포 유형이 거의 천연 세포가 아니기 때문에, 항체의 당화 패턴에서의 변형을 예상할 수 있다 (예를 들어, [Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070]를 참조할 수 있다).
숙주 세포의 선택 이외에, 항체의 재조합 생산시 당화에 영향을 미치는 인자에는 성장 방식, 배지 제형, 배양물 밀도, 산소 공급, pH, 정제 계획 등이 포함된다. 올리고당 생산에 수반되는 특정 효소를 도입하거나, 과발현시키는 것을 포함하여 특정한 숙주 생물에서 달성되는 당화 패턴을 변경하기 위하여 다양한 방법이 제안되었다 (미국 특허 번호 제5,047,335호; 제5,510,261호 및 제5,278,299호). 당화, 또는 특정 유형의 당화가, 예를 들면 엔도글리코시다제 H (Endo H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 이용하여, 당단백질로부터 효소에 의해 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포가 특정 유형의 다당류의 공정에서 결함이 있도록 유전공학적으로 처리될 수 있다. 이러한 기법 및 유사 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.
다른 변형 방법은 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 알려져 있는 커플링 기술을 사용하는 것을 포함한다. 변형은, 예를 들어 면역검정법을 위한 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다. 당업계의 확립된 절차를 이용하여 변형된 G1 폴리펩티드를 제조하고, 당업계에 알려져 있는 표준 검정법을 사용하여 스크리닝할 수 있으며, 이러한 검정법의 일부는 하기 및 실시예에 기술된다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예로서, 면역학적으로 불활성이거나, 부분적으로 불활성인 것으로, 예컨대, 보체 매개 용해를 일으키지 않는 불변 영역, 항체-의존 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않는 불변 영역, 미세아교세포를 활성화시키기 않는 불변 영역, 또는 하기: 보체 매개 용해를 일으키지 않거나, 항체-의존 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않거나, 미세아교세포를 활성화시키기 않는 것중 임의의 하나 이상에서 (변형되지 않는 항체와 비교할 때) 활성이 경감된 불변 영역을 포함한다. 불변 영역의 상이한 변형을 사용하여 최적 수준 및/또는 효과지 기능의 조합을 달성할 수 있다. 예를 들면, ([Morgan et al., Immunology 86:319-324 (1995)]; [Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969 (1996)]; [Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184 (2000)]; [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989)]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998)]을 참조할 수 있다). 몇몇 실시태양에서, 불변 영역은 ([Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 번호 9809951.8)에 기재되어 있는 바와 같이 변형된다. 다른 실시태양에서, 항체는 하기 돌연변이: A330P331에서 S330S331로 (야생형 IgG2 서열을 참조하여 번호매김한 아미노산)를 포함하는 인간 중쇄 IgG2 불변 영역을 포함한다. [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]. 추가의 다른 실시태양에서, 불변 영역은 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것이다. 몇몇 실시태양에서, 불변 영역은 당화된 아미노산 잔기 또는 불변 영역내 N-당화 인식 서열의 일부분인 인접 잔기의 돌연변이화에 의해 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것이다. 예를 들면, N-당화 부위 N297은 A, Q, K, 또는 H로 돌연변이화될 수 있다 ([Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989)]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998)]을 참조할 수 있다). 몇몇 실시태양에서, 불변 영역은 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것이다. 불변 영역은 효소적으로 (예로서, 효소 PNGase에 의해 당질을 제거함으로써), 또는 당화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 N-연결 당화에 대하여 당화되지 않은 것일 수 있다.
다른 항체 변형은 1999년 11월 18일 공개된 PCT 공개 공보 WO 99/58572 (1999년 11월 18일 공개)에 기술된 바와 같이 변형된 항체를 포함한다. 이러한 항체는, 표적 분자에 지시된 결합 도메인에 더하여, 인간 면역글로불린 중쇄의 모든 또는 일부 불변 도메인과 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 효과기 도메인을 포함한다. 이러한 항체는 현저한 보체 의존성 용해, 또는 표적의 세포-매개 파괴를 유발하지 않으면서 표적 분자에 결합할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 효과기 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기초로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증성 반응 및 기타 부작용을 피하기 위하여, 장기간의 항체 요법에서 사용하는데 특히 적합하다.
본 발명은 친화력 성숙 실시태양을 포함한다. 예를 들면, 친화력 성숙 항체는 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 생산될 수 있다 ([Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783]; [Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813]; [Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155]; [Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004]; [Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9]; [Hawkins et al, 1992, J. MoI. Biol., 226:889-896]; 및WO2004/058184).
하기 방법을 사용하여 항체의 친화력을 조정하고 CDR을 특징화할 수 있다. "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"로 명명되는, 항체의 CDR을 특징화하고/특징화하거나 폴리펩티드, 예로서, 항체의 결합 친화력을 변경 (예로서, 개선)시키는 하나의 방법. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 하기와 같이 작용한다. CDR 내의 하나 이상의 아미노산 위치가 당업계에 인지된 방법을 사용하여 2개 또는 2개 초과 (예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개)의 아미노산으로 대체된다. 이것으로 클론의 소형 라이브러리가 생성되는데 (몇몇 실시태양에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 하나), 각각은 2개 이상의 구성원의 복잡성을 갖는다 (2개 이상의 아미노산이 위치마다 치환되는 경우). 일반적으로, 라이브러리는 천연 (치환되지 않은) 아미노산을 포함하는 클론 또한 포함한다. 각각의 라이브러리로부터 적은 수의 클론, 예를 들어 약 20-80개의 클론 (라이브러리의 복잡성에 따라 좌우됨)을 표적 폴리펩티드에 대한 결합 친화력에 대해 스크리닝하고, 결합이 증가되었거나, 동일하거나, 감소되었거나, 또는 결합되지 않은 후보물을 동정한다. 결합 친화력을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 약 2배 이상의 결합 친화력의 차이를 검출하는 BIAcore 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 결합 친화력을 측정한다. BIAcore는 출발 항체가 비교적 높은 친화력, 예를 들면, 약 10 nM 이하의 KD로 결합하는 경우 특히 유용하다. BIAcore 표면 플라스몬 공명을 이용하는 스크리닝이 본원의 실시예에 기술된다.
키넥사 바이오센서(Kinexa Biocensor), 섬광 근접 검정법, ELISA, ORIGEN 면역 검정법 (IGEN), 형광 소광법, 형광 전이, 및/또는 효모 디스플레이를 이용하여 결합 친화력을 측정할 수 있다. 적합한 생물학적 검정법을 이용함으로써 결합 친화력 또한 스크리닝할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치가 당업계에 인지된 돌연변이유발 방법 (이중 일부가 본원에 기술됨)을 이용하여 모든 20가지의 천연 아미노산으로 대체된다 (몇몇 실시태양에서, 한번에 하나씩). 이것으로 클론의 소형 라이브러리가 생성되는데 (몇몇 실시태양에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 하나), 각각은 20개 구성원의 복잡성을 갖는다 (모두 20가지의 아미노산이 위치마다 치환되는 경우).
몇몇 실시태양에서, 스크리닝되는 라이브러리는 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함하고, 이는 동일한 CDR 내에 또는 2개 이상의 CDR 내에 존재할 수 있다. 따라서, 라이브러리는 하나의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함한다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR 내의 2개 이상 위치에서의 치환을 포함한다. 라이브러리는 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 위치에서의 치환을 포함하는데, 상기 치환은 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 CDR에서 발견된다. 낮은 중복 코돈을 이용하여 치환이 제조된다. 예를 들어, [Balint et al., (1993) Gene 137 (1):109-18)]의 표 2 참조할 수 있다.
CDR은 CDRH3 및/또는 CDRL3일 수 있다. CDR은 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, 및/또는 CDRH3중 하나 이상일 수 있다. CDR은 캐벗 CDR, 코티아 CDR, 또는 확장된 CDR일 수 있다.
결합이 개선된 후보물을 서열분석함으로써, 친화력이 개선된 (치환이 "개선된" 것으로도 명명된다) CDR 치환 돌연변이체를 동정할 수 있다. 결합하는 후보물 또한 서열분석함으로써, 결합이 유지되는 CDR 치환을 동정할 수 있다.
수회에 걸친 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들면, 결합이 개선된 후보물 (각각 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함함)은 각각의 개선된 CDR 위치 (즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타낸 CDR 내의 아미노산 위치)에서 원래의 아미노산 및 치환된 아미노산을 적어도 함유하는 2차 라이브러리의 디자인에도 유용하다. 이러한 라이브러리의 제조, 및 스크리닝 또는 선별이 하기에 추가로 논의된다.
라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은, 결합이 개선되었거나, 동일하거나, 감소되었거나, 또는 결합되지 않은 클론의 빈도가 항체-항원 복합체의 안정성에 대한 각각의 아미노산 위치의 중요성에 관련된 정보를 제공하는 한, CDR을 특징화하는 수단 또한 제공한다. 예를 들면, CDR의 한 위치가 모든 20가지의 아미노산으로 변화되었을 때 결합을 유지한다면, 상기 위치는 항원 결합에 있어서 필요할 것 같지 않은 위치로 동정된다. 반대로, 만일 CDR의 한 위치가 적은 백분율의 치환에서만 결합을 유지한다면, 상기 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로 동정된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 방법으로 다수의 상이한 아미노산 (모든 20가지의 아미노산 포함)으로 변화될 수 있는 CDR 내의 위치, 및 변화될 수 없거나 소수의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR 내의 위치에 관한 정보를 생성한다.
친화력이 개선된 후보물들이 2차 라이브러리 내에 조합될 수 있는데, 2차 라이브러리는 이러한 위치에서의 개선된 아미노산, 원래의 아미노산을 포함하고, 원하는 스크리닝 또는 선별 방법을 사용하여 원하는, 또는 허용된 라이브러리의 복잡성에 따라, 이러한 위치에서의 추가적인 치환을 더 포함할 수 있다. 또한, 원한다면, 인접 아미노산 위치가 적어도 2개 이상의 아미노산으로 무작위화될 수 있다. 인접 아미노산의 무작위화는 돌연변이체 CDR에서의 추가적인 입체형상적 유연성을 허용할 수 있고, 이어서 이러한 유연성은 더 많은 수의 개선 돌연변이의 도입을 허용하거나 용이하게 할 수 있다. 라이브러리는 1회차 스크리닝에서 개선된 친화력을 나타내지 않은 위치에서의 치환 또한 포함한다.
BIAcore 표면 플라스몬 공명 분석법을 이용하는 스크리닝, 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보솜 디스플레이가 포함되는 당업계에 알려져 있는 임의의 선별 방법을 사용하는 선별이 포함되는, 당업계에 알려져 있는 임의의 방법을 사용하여, 결합 친화력이 개선되었고/개선되었거나 변경된 라이브러리 구성원에 대해 2차 라이브러리가 스크리닝 또는 선별된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 (예로서, G1) 또는 폴리펩티드로부터의 하나 이상의 단편 또는 부위를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 서열 2 (도 5)에 나타낸 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산 및/또는 서열 1 (도 5)에 나타낸 가변 중쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 서열 2 (도 5)에 나타낸 가변 경쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 또는 약 30개 이상의 인접 아미노산, 및/또는 서열 1 (도 5)에 나타낸 가변 중쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 또는 약 30개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 또다른 실시태양에서, 융합 폴리펩티드는 도 5의 서열 2 및 서열 1에 나타낸, G1의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 융합 폴리펩티드는 G1의 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다. 추가의 다른 실시태양에서, 융합 폴리펩티드는 항체 G1의 CDR H3 및/또는 CDR L3을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, G1 융합 단백질은 하나 이상의 G1 항체, 및 천연 분자에 부착되지 않은 또다른 아미노산 서열, 예를 들어, 또다른 부위로부터의 동종 서열 또는 이종 서열을 함유한다. 대표적인 이종 서열은 "태그," 예로서 FLAG 태그 또는 6His 태그를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 태그는 당업계에 잘 알려져 있다.
G1 융합 폴리펩티드는 당업계에 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들어 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 G1 융합 단백질은 본원에 기술된 재조합 방법을 사용하여 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 제조될 수 있지만, 화학 합성이 예를 들어 포함되는, 당업계에 알려져 있는 기타 수단에 의해서도 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 고체 지지체 (예로서, 비오틴 또는 아비딘)에 대한 커플링을 용이하게 하는 제제에 접합된 (예를 들어, 연결된) G1 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 단순함을 위하여, 일반적으로 G1 또는 항체가 언급될 것이고, 단, 이러한 방법은 본원에 기술된 임의의 CGRP 결합 실시태양에 적용된다. 일반적으로 접합은 본원에 기술된 바와 같은 성분들을 연결시키는 것을 지칭한다. 연결 (일반적으로, 적어도 투여를 위해 근접한 관계로 이러한 성분들을 고정시킴)은 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 제제와 항체가 각각 서로 반응할 수 있는 치환체를 갖는 경우, 제제와 항체 간의 직접적인 반응이 가능하다. 예를 들어, 한쪽의 친핵성 기, 예로서, 아미노 또는 설프하이드릴 기는, 다른쪽의 카르보닐-함유 기, 예로서, 무수물 또는 산 할로겐화물과, 또는 양호한 이탈기 (예를 들어, 할로겐화물)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 표지화제 (별법으로 "표지"라고 명명된다), 예로서, 형광성 분자, 방사성 분자 또는 당업계에 알려져 있는 임의의 다른 표지에 연결될 수 있다. 표지는 당업계에 알려져 있고, 이는 일반적으로 신호를 (직접 또는 간접적으로) 제공한다.
본 발명은 항체 G1, 및, 본 명세서에서 명백한 바와 같은, 본원에 기술된 임의의 또는 모든 항체 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물 (약제학적 조성물 포함) 및 키트를 또한 제공한다.
본 발명은 본 발명의 항체 및 폴리펩티드 (도 5에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함한다)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포 또한 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기의 것들중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (또는 조성물 (약제학적 조성물 포함))를 제공한다: (a) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체; (b) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 단편 또는 부위; (c) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄; (d) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 중쇄; (e) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역(들); (f) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 하나 이상의 CDR(들) (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDRs); (g) 항체 G1의 중쇄로부터의 CDR H3; (h) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 CDR L3; (i) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDRs; (j) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 중쇄로부터의 3개의 CDRs; (k) 항체 G1 또는 표 6에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDRs 및 중쇄로부터의 3개의 CDRs; 및 (I) (b) 내지 (k)중 어느 하나를 포함하는 항체. 몇몇 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 9 및 서열 10에 나타낸 폴리뉴클레오티드(들)중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체 (항체 단편 포함) 및 폴리펩티드, 예로서, 효과기 기능이 손상된 항체 및 폴리펩티드중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드중 임의의 것을 포함하는 조성물 (예로서, 약제학적 조성물)을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 조성물은 본원에 기술된 G1 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시태양에서, 조성물은 본원에 기술된 항체 또는 폴리펩티드중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 추가의 다른 실시태양에서, 조성물은 서열 9 및 서열 10에 나타낸 폴리뉴클레오티드(들)중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 발현 벡터, 및 폴리뉴클레오티드 조성물 투여는 본원에서 추가로 기술된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드중 임의의 것을 제조하는 방법을 제공한다.
임의의 그러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 싱글-스트랜드 (코딩 또는 안티센스)이거나, 더블-스트랜드일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고, 일대일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가적인 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만, 반드시 존재할 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드가 또다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있지만, 반드시 연결될 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 항체 또는 그의 일부를 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 그러한 서열의 변이체를 포함할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비하여 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에서 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 천연 항체 또는 그의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 바람직하게는 약 70％ 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 90％ 이상의 동일성을 나타낸다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 두 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 하기 설명되는 바와 같이 최대 일치하도록 정렬되었을 때, 동일하다면, "동일한" 것으로 언급된다. 두 서열 간의 비교는 비교 윈도우에서 서열들을 비교하여 서열 유사성의 국소 부위를 확인하고 비교함으로써 전형적으로 수행된다. 본원에서 사용되는 바, "비교 윈도우"은 약 20개 이상의 인접한 위치, 일반적으로 30개 내지 약 75개, 40개 내지 약 50개의 절편을 지칭하고, 여기서 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 서열이 인접한 위치의 수가 동일한 기준 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열들의 최적 정렬은, 디폴트 파라메터를 사용하여, 바이오인포매틱스 소프트웨어의 레이저진(Lasergene) 수트 내의 Megalign 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다 (위스콘신주 매디슨에 소재하는 디엔에이스타 인코포레이티드(DNASTAR, Inc.)). 이러한 프로그램은 하기의 참고문헌들에 기술된 여러 정렬 계획을 포함한다: ([Dayhoff, M.O. (1978) A Model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358]; [Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA]; [Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153]; [Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17]; [Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105]; [Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425]; [Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA]; [Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730]).
바람직하게는, "％ 서열 동일성"은 20개 이상 위치의 비교 윈도우에서 2 개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교함으로써 결정되고, 이때 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여, 20％ 이하, 일반적으로 5 내지 15％, 또는 10 내지 12％의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. ％는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 기준 서열 내의 위치의 총수 (즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 ％ 서열 동일성을 산출함으로써 계산된다.
변이체는 또한, 또는 별법으로, 천연 유전자, 또는 그의 일부 또는 보체와 실질적으로 상동성일 수 있다. 그러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 항체를 코딩하는 천연 발생 DNA 서열 (또는 상보성 서열)에 온건하게 엄격한 조건 하에 혼성화할 수 있다.
적합한 "온건하게 엄격한 조건"은 5XSSC, 0.5％ SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0) 의 용액에서 예비세정하고; 50℃-65℃, 5XSSC 에서 하룻밤 동안 혼성화시킨 후; 0.1％ SDS를 함유하는 각각의 2X, 0.5X 및 0.2XSSC 로 65℃에서 20분 동안 2회 세정하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "고도로 엄격한 조건 " 또는 "고도의 엄격성 조건"은 (1) 세정을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어, 50℃ 에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1％ 소듐 도데실 설페이트를 사용하거나; (2) 혼성화 동안에, 42℃에서 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨과 함께, 변성화제, 예로서, 포름아미드, 예를 들어 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 갖는 50％ (v/v) 포름아미드를 사용하거나; 또는 (3) 42℃ 에서 50％ 포름아미드, 5XSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산 나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5X 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2X SSC (염화나트륨/시트르산 나트륨), 55℃ 에서 50％ 포름아미드로 세정한 후, 55℃ 에서 EDTA를 함유하는 0.1XSSC 로 구성된 고도 엄격성 세척을 사용하는 것이다. 당업자는, 프로브 길이 등과 같은 인자에 적응시키기 위해 필요하다면, 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 인지할 것이다.
유전자 코드의 축퇴성의 결과로, 본원에 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드들중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 최소한의 상동성을 지닌다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용에서의 차이로 인하여 달라진 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 명확하게 구현된다. 또한, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 범주 내에 속한다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예로서, 뉴클레오티드의 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 구조 또는 기능이 변경될 수 있지만, 반드시 변경될 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술 (예로서, 혼성화, 증폭 및/또는 데이타 베이스 서열 비교)을 이용하여 확인될 수 있다.
화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 본원에 상세하게 기술될 필요가 없다. 당업자는 본원에서 제공된 서열 및 상업적으로 이용가능한 DNA 합성기를 사용하여, 원하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위하여, 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내에 삽입할 수 있고, 이어서 벡터를 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려져 있는 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 직접적인 섭취, 세포내 이입, 형질감염, F-짝짓기 또는 전기천공에 의하여 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 세포가 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 비-통합 벡터 (예로서, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어 [Sambrook et al. (1989)]를 참조할 수 있다.
별법으로, PCR은 DNA 서열이 재생산되도록 한다. PCR 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 미국 특허 번호 제4,683,195호, 제4,800,159호, 제4,754,065호, 및 제4,683,202호 뿐만 아니라, [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994)]에 기재되어 있다.
RNA는 적합한 벡터 내의 단리된 DNA를 이용하여 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA 가 RNA로 전사되면, 예를 들어, [Sambrook et al., (1989)]에 기재된 바와 같이, 당업자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터가 표준 기술에 따라서 작제될 수 있거나, 당업계에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라서 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제 능력을 가질 것이고/것이거나, 특정 제한효소에 대한 단일 표적을 가질 수 있고/있거나, 벡터를 함유하는 클론을 선별하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 지닐 수 있다. 적절한 예로는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript) (예를 들어, pBSSK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터 예로서, pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이러한 클로닝 벡터 및 다수의 기타 클로닝 벡터는 바이오래드(BioRad), 스트라테진(Strategene), 및 인비트로겐(Invitrogen)과 같은 판매업자로부터 입수가능하다.
일반적으로 발현 벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 작제물이다. 발현 벡터가 에피솜으로서 또는 염색체 DNA 의 통합 부분으로서 숙주 세포 내에서 복제가능하여야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 포함), 코스미드, 및 PCT 공개 공보 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 하기의 것들중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다: 신호 서열; 복제 기점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소 (예를 들어 프로모터, 인핸서 및 종결자). 발현 (즉, 번역)을 위하여, 하나 이상의 번역 제어 요소, 예로서, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위, 및 정지 코돈 또한 일반적으로 요구된다.
전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 기타 물질을 사용한 형질감염; 유전자총; 리포좀 매개 감염; 및 감염 (예를 들어, 벡터가 우두 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 다수의 적합한 방법의 임의의 것에 의해, 관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터가 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 좌우된다.
본 발명은 임의의 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 또한 제공한다. 이종 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 관심의 대상이 되는 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하기 위해 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비-제한적인 예로는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. PCT 공개 공보 WO 87/04462를 참조할 수 있다. 적합한 비-포유동물 숙주 세포에는 원핵생물 (예로서, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스(B. subtilis)) 및 효모 (예로서, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 및 에스. 폼베 (S. pombe); 또는 케이. 락티스(K. lactis))를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 숙주 세포 내의 상응하는 관심의 대상이 되는 내인성 항체 또는 단백질 (존재하는 경우) 보다 약 5배 더 높은 수준, 더욱 바람직하게는 10배 더 높은 수준, 더욱 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. A□1-40에 특이적으로 결합하는 것에 대해 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역검정법 또는 FACS에 의해 실행된다. 관심의 대상이 되는 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포가 동정될 수 있다.
D. 조성물
본 발명의 방법에 사용되는 조성물은 본원에 기술된 유효량의 항-CGRP 길항제 항체 또는 항-CGRP 길항제 항체 유래의 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 조성물의 일례 뿐만 아니라, 그의 제형화 방법은 이전 섹션 및 하기에 기술되어 있다. 하나의 실시태양에서, 조성물은 추가로 CGRP 길항제를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 조성물은 하나 이상의 항-CGRP 길항제 항체를 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간 CGRP를 인식한다. 추가의 다른 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간화된 것이다. 추가의 다른 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 원치않거나 바람직하지 못한 면역 반응, 예로서, 항체-매개 용해 또는 ADCC를 일으키지 않는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 항체 G1의 하나 이상의 CDR(들) (예로서, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 몇몇 실시태양에서, 6개 모두의 G1로부터의 CDRs)을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 항-CGRP 길항제 항체는 인간의 것이다.
조성물은 하나 이상의 항-CGRP 길항제 항체 (예컨대, CGRP의 상이한 에피토프를 인식하는 항-CGRP 길항제 항체 혼합물)을 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 다른 대표적인 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 하나 이상의 항-CGRP 길항제 항체, 또는 CGRP의 상이한 에피토프에 결합하는, 상이한 종의 항-CGRP 길항제 항체를 포함한다.
본 발명에서 사용된 조성물은, 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 인산염, 시트르산염, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 염; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (예로서, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란을 포함하는 단당류, 이당류, 및 기타 당질; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트리할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸린 글리콜 (PEG) 과 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제가 추가로 본원에 기술된다.
항-CGRP 길항제 항체 및 그의 조성물 또한 제제의 유효성을 증강시키고/증강시키거나 보완하는 작용을 하는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다.
E. 키트
본 발명은 또한 본 발명에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본원에 기술된 항-CGRP 길항제 항체 (예로서, 인간화된 항체) 또는 폴리펩티드를 포함하는 하나 이상의 용기, 및 본원에 기술된 본 발명의 방법중 임의의 것에 따른 사용설명서를 포함한다. 일반적으로, 이러한 설명서는 본원에 기술된 본 발명의 방법중 임의의 것에 따라 두통 (예로서, 편두통)을 치료, 호전, 또는 예방시키기 위하여 항-CGRP 길항제 항체를 투여하는 것에 관한 설명을 포함한다. 키트는 추가로 개체가 두통을 앓고 있는지 여부, 또는 개체가 두통을 앓을 위험에 있는지 여부를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 것에 관한 설명을 포함할 수 있다. 추가의 다른 실시태양은, 설명서는 두통 (예로서, 편두통)을 앓을 위험에 있는 개체에게 항-CGRP 길항제 항체를 투여하는 것에 관한 설명을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 항체는 인간화된 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 항체는 인간의 것이다. 다른 실시태양에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 추가의 다른 실시태양에서, 몇몇 실시태양에서, 항체는 항체 G1의 하나 이상의 CDR(들) (예로서, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 몇몇 실시태양에서, 6개 모두의 G1로부터의 CDRs)을 포함한다.
항-CGRP 길항제 항체에 관한 사용설명서는 일반적으로 투여량, 투여 스케줄, 및 의도하는 치료법을 위한 투여 경로와 같은 정보를 포함한다. 용기는 단위 제형, 벌크 패키지 (예컨대, 다회분-투여용 패키지) 또는 하위단위 제형일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급되는 설명서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 (예컨대 키트내 포함되어 있는 종이) 상의 서면 설명서이지만, 기계-판독식 설명서 (예로서, 자기 또는 광 저장 디스크 상에 기록된 설명서) 또한 허용가능하다.
라벨 또는 패키지 삽입물에는 두통 (예로서, 편두통)을 치료, 호전, 및/또는 예방하기 위하여 조성물이 사용된다는 것이 표시되어 있다. 설명서는 본원에 기술된 본 발명의 방법중 임의의 것을 실시하기 위하여 제조될 수 있다.
본 발명의 키트는 적합한 포장지내 존재한다. 적합한 포장지로는 바이알, 병, 자(jar), 연성 포장지 (예컨대, 밀봉 마일라(Mylar), 또는 비닐 봉투) 등을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 특정 장치, 예로서, 흡입기, 비내 투여 장치 (예컨대, 분무기) 또는 주입 장치, 예로서, 미니펌프와 함께 사용하기 위한 패키지 또한 고려시된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 피하 주사용 바늘로 관통가능한 마개를 갖는 수액용기 또는 바이알일 수 있다). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 피하 주사용 바늘로 관통가능한 마개를 갖는 수액용기 또는 바이알일 수 있다). 조성물내 적어도 하나의 활성제는 항-CGRP 길항제 항체이다. 용기는 추가로 제2의 약제학적으로 활성인 제제를 포함한다.
키트는 임의로 추가의 성분들, 예로서, 완충액 및 설명해 주는 정보를 제공할 수 있다. 보통, 키트는 용기와, 용기 상에, 또는 용기와 결합되어 있는 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다.
하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되지만, 이를 한정하지는 않는다.
실시예 1: CGRP 에 대한 모노클로날 항체의 생성 및 특징화
항-CGRP 항체 생성. 래트 및 인간 CGRP에 대한 교차-종 반응성을 갖는 항-CGRP 항체를 생성하기 위하여 다양한 시간 간격으로 보강제 (발바닥 1개당 50 ㎕, 마우스 1마리당 총 100 ㎕)중 KLH에 접합된 25-100 ㎍의 인간 α-CGRP 또는 β-CGRP로 마우스를 면역화시켰다. 면역화는 일반적으로 ([Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Methods 124:95-102]; [Kenney JS et al., 1989, J. Immunol. Methods 121:157-166]; 및 [Wicher K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:128-135])에 기재되어 있는 바와 같이 실시하였다. 마우스를 1차로 CFA (완전 프로인트 보강제)중 KLH에 접합된 50 ㎍의 인간 α-CGRP 또는 β-CGRP로 면역화시켰다. 21일 경과 후, 마우스를 2차로 IFA (불완전 프로인트 보강제)중 KLH에 접합된 25 ㎍의 인간 β-CGRP (1차로 인간 α-CGRP로 면역화된 마우스의 경우), 또는 α-CGRP (1차로 인간 β-CGRP로 면역화된 마우스의 경우)로 면역화시켰 다. 2차 면역화 후 23일이 경과한 후에 IFA중 KLH에 접합된 25 ㎍의 래트 α-CGRP를 사용하여 3차 면역화를 실시하였다. 10일 경과 후, ELISA를 사용하여 항체 역가를 시험하였다. 3차 면역화 후 34일이 경과한 후에 IFA중 25 ㎍의 펩티드 (래트 α-CGRP-KLH)를 사용하여 4차 면역화를 실시하였다. 4차 면역화 후 32일이 경과한 후에 100 ㎍ 가용성 펩티드 (래트 α-CGRP)를 사용하여 최종 추가접종을 실시하였다.
비 세포를 면역화된 마우스로부터 수득하고, 폴리에틸렌 글리콜 1500을 사용하여 10:1의 비율로 NSO 골수종 세포와 융합시켰다. 하이브리드를 20％ 말 혈청 및 2-옥살로아세테이트/피루베이트/인슐린 (시그마)을 함유하는 DMEM중 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 하이포크산틴/아미노프테린/티미딘 선별을 시작하였다. 8일째, 20％ 말 혈청을 함유하는 100 ㎕의 DMEM을 모든 웰에 가하였다. 하이브리드 상등액은 항체 포획 검정법을 사용하여 스크리닝하였다. 부류-특이 2차 항체를 사용하여 항체 부류를 결정하였다.
추가의 특징화를 위한 인간 및 래트 CGRP에 대한 이들의 결합에 기초하여 모노클로날 항체-생산 세포주 패널을 선별하였다. 이들 항체 및 특징은 하기 표 2 및 3에 나타낸다.
정제 및 Fab 단편 제조. 추가의 특징화를 위해 선별된 모노클로날 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 하이브리도마 배양물의 상등액으로부터 정제하였다. 상등액을 pH 8로 평형화하였다. 이어서, 상등액을 PBS를 사용하여 pH 8로 평형화된 단백질 A 칼럼 MabSelect (아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences) # 17-5199-02)로 로딩하였다. 칼럼을 5개 칼럼 용량의 PBS, pH 8로 세척하였다. 항체를 50 mM 시트르산염-인산염 완충액, pH 3으로 용출시켰다. 용출된 항체를 1M 인산염 완충액, pH 8로 중화시켰다. 정제된 항체를 PBS, pH 7.4로 투석시켰다. 뮤린 모노클로날 항체 표준 곡선을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 항체 농도를 측정하였다.
Fabs는 이뮤노퓨어(Immunopure) Fab 키트 (피어스(Pierce) # 44885)를 사용하여 전장의 항체의 파파인 단백질분해에 의해 제조하고, 제조업자의 설명서에 따라 유체 통과형 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. (아미노산 분석에 의해 측정된) 공지된 표준 Fab 농도를 사용한 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의해, 및 1OD=0.6 mg/ml (또는 아미노산 서열에 기초한 이론상의 등가량)을 사용한 A280에 의해 농도를 측정하였다.
Fabs의 친화력 측정. 항-CGRP Fab 단편의 친화력은 제조업자 소유의 전개용 완충액, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ v/v 폴리소르베이트 P20)와 함께 비아코어3000™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템(뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 비아코어, 인코포레이티드(Biacore INC.))을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 측정하였다. SA 칩상에 사전-고정화된 스트렙트아비딘을 통해 N-말단 바이오티닐화된 CGRP 펩티드 (뉴저지주에 소재하는 겐스트립트 코포레이션(GenScript Corporation), 또는 콜로라도주에 소재하는 글로벌 펩티드 서비스(Global Peptide Services)로부터 특별 주문된 맞춤형)를 포획하고, CGRP 표면을 통해 역가되는 항체 Fab의 결합 동역학을 측정함으로써 친화력을 측정하였다. 바 이오티닐화된 CGRP를 HBS-EP로 희석하고, 0.001 mg/ml 미만의 농도로 칩 상에 주입하였다. 개개의 칩 채널을 통한 다양한 흐름 시간을 사용하여 2가지 범위의 항원 밀도를 달성하였다: 상세한 동력학 연구용의 <50 반응 단위 (RU) 및 농도 연구 및 스크리닝용 약 800 RU. 전형적으로, 농도가 1 μM - 0.1 nM에 이르는 정제된 Fab 샘플의 일련의 2- 또는 3-배 희석물 (0.1-10 x 추정 KD)을 1분 동안 100 ㎕/분으로 주입하고, 10분간의 해리 시간을 허용하였다. 각각의 결합 사이클 후에는 표면을 25％ v/v 에탄올중 25 mM NaOH로 재생시켰고, 이를 통해 수백회의 사이클이 허용되었다. BIAevaluation 프로그램을 이용하여 데이타를 1:1 랭뮤어 결합 모델 [Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994), Methods Enzymology 6. 99-110]에 핏팅시킴으로써 동력학 회합 속도 (k온) 및 해리 속도 (k오프)가 동시에 수득하였다. 평형 해리 상수 (KD) 또는 "친화력"은 KD 비 = k오프/k온으로 계산하였다. 뮤린 Fab 단편의 친화력은 표 2 및 3에 나타낸다.
뮤린 항-CGRP 항체의 에피토프 지도화. 항-CGRP 항체가 결합하는 인간 α-CGRP 상의 에피토프를 결정하기 위하여 다양한 CGRP 단편에 대한 Fab 단편의 결합 친화력을 상기 기술된 바와 같이 SA 센서 칩 상에서 N-말단 바이오티닐화된 CGRP 단편 아미노산 19-37 및 아미노산 25-37을 포획함으로써 측정하였다. 도 1은 25℃에서 측정된 그의 결합 친화력을 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 항체 4901을 제외한 모든 항체는 인간 α-CGRP 단편 19-37 및 25-37에 결합하였는데, 그의 친화력은 전장 인간 α-CGRP (1-37)에 대한 결합 친화력과 유사하였다. 항체 4901 은 인간 α-CGRP 단편 25-37에 결합하였는데, 그의 친화력은 전장 인간 α-CGRP 단편에 결합하는 것보다 6배가 낮았고, 이는 주로 오프-속도가 손실되었기 때문이다. 상기 데이타는 이들 항-CGRP 항체가 일반적으로 CGRP의 C-말단 종단에 결합한다는 것을 시사한다.
항-CGRP 항체 결합에 관여하는 인간 α-CGRP내의 아미노산을 추가로 특징화하기 위하여 알라닌 스캐닝을 실시하였다. 단일 알라닌 치환을 갖는 인간 α-CGRP의 상이한 변이체를 펩티드 합성을 통해 생성하였다. 이들의 아미노산 서열은 비아코어 분석에 사용된 모든 다른 펩티드와 함께 표 4에 나타낸다. 이들 변이체에 대한 항-CGRP 항체의 Fab 단편의 친화력은 상기 기술된 바와 같이 비아코어를 사용하여 측정하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 12개의 항체 모두가 C-말단 에피토프를 표적하며, 아미노산 F37이 가장 중요한 잔기이다. F37의 알라닌으로의 돌연변이화는 펩티드에 대한 항-CGRP 항체의 친화력을 현저히 저하시키거나, 심지어는 펩티드에 대한 항-CGRP 항체의 결합을 완전하게 녹아웃시킨다. 그 다음으로 중요한 아미노산 잔기는 G33이지만, 친화력이 높은 항체 (7E9, 8B6, 10A8, 및 7D11)만이 상기 위치에서의 알라닌 대체에 의해 영향을 받았다. 아미노산 잔기 S34 또한 이들 4개의 친화력이 높은 항체에서 중요하되, 그보다는 적은 역할을 한다.
Figure 112008033817206-PCT00002
(인간 α-CGRP에 대한 항-CGRP 모노클로날 항체 결합 특징 및 그의 길항제 활성)
주석: 항체 4901은 상업적으로 이용가능하다 (시그마, 제품 번호 C7113).
n.d.= 미측정
Figure 112008033817206-PCT00003
(래트 α-CGRP에 대한 항-CGRP 모노클로날 항체 결합 특징 및 그의 길항제 활성)
"n.d."는 본 항체에 대하여 어떤 시험도 실시되지 않았음을 나타낸다.
Figure 112008033817206-PCT00004
Figure 112008033817206-PCT00005
(인간 α-CGRP 단편 (서열 15-40) 및 관련 펩티드 (서열 41-47)의 아미노산 서열. 서열 36-40을 제외한 모든 펩티드는 C-말단에서 아미드화되어 있다. 볼드체의 잔기는 점 돌연변이를 표시한다.)
실시예 2: 시험관내 검정법을 사용한 항- CGRP 길항제 항체의 스크리닝
cAMP 활성화 검정법 및 결합 검정법에 기초하여 세포를 사용함으로써 시험관내에서 길항제 활성에 대하여 뮤린 항-CGRP 항체를 추가로 스크리닝하였다.
cAMP 검정법에 의해 측정되는 길항제 활성. 항-CGRP 항체 (최종 농도 1-3000 nM)의 존재 또는 부재하의 5 ㎕의 인간 또는 래트 α-CGRP (최종 농도 50 nM), 또는 래트 α-CGRP 또는 인간 α-CGRP (최종 농도 0.1 nM-10 μM; c-AMP 활성화에 대항 양성 대조군)를 384-웰 플레이트 (Nunc, 카탈로그 번호 264657)로 분배하였다. 자극 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.4, 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 및 500 uM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX))중의 10 ㎕의 세포 (인간 α-CGRP가 사용될 경우, 인간 SK-N-MC, 또는 래트 α-CGRP가 사용될 경우, 래트 L6)를 플레이트의 웰에 가하였다. 플레이트를 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.
인큐베이션시킨 후, 제조업자의 설명서에 따라 히트헌터(HitHunter)™ 효소 단편 상보성 검정법 (어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems))을 사용하여 cAMP 활성화를 실시하였다. 검정법은 효소 수령체 (EA) 및 효소 공여체 (ED)로 명명되는 2개의 단편으로 구성된, 유전공학적으로 제조된 β-갈락토시다제 효소에 기초한다. 2개의 단편이 분리되어 있을 때, 효소는 불활성이다. 단편이 함께 할 경우, 이는 자발적으로 재조합되어 상보라는 공정에 의해 활성인 효소를 형성할 수 있다. EFC 검정 플랫폼은 cAMP가 항-cAMP에 의해 인식되어지는 ED-cAMP 펩티드 접합체를 사용한다. 이러한 ED 단편은 EA와 재회합함으로써 활성인 효소를 형성할 수 있다. 본 검정법에서 항-cAMP 항체는 최적으로 적정되어 ED-cAMP 접합체에 결합하고 효소 형성을 저해하게 된다. 세포 용해물 샘플내 cAMP의 수준은 항-cAMP 항체와의 결합에 대하여 ED-cAMP 접합체와 경쟁한다. 검정법에서 유리 ED 접합체의 양은 cAMP의 농도에 비례한다. 그러므로, cAMP는 β-갈락토시다제 발광 기질의 교체에 의해 정량화되는 활성 효소의 형성에 의해 측정된다. 10 ㎕의 용해 완충액 및 항-cAMP 항체 (비율 1:1)를 가한 후, 60분 동안 실온에서 인큐베이션시킴으로써 cAMP 활성화 검정법을 실시하였다. 이어서, 10 ㎕의 ED-cAMP 시약을 각각의 웰에 가하고, 60분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, 20 ㎕의 EA 시약 및 CL 혼합물 (기질 함유) (비율 1:1)을 각각의 웰에 가하고, 1-3시간 동안 또는 밤새도록 실온에서 인큐베이션시켰다. PMT 기기 상에서 1초/웰로, 또는 영상기 상에서 30초/플레이스로 플레이트를 판독하였다. α-CGRP에 의해 cAMP의 활성화를 저해하는 항체가 상기 표 2 및 3에서 동정되었다 ("예"로서 표시됨). 표 2 및 3의 데이타는 검정법에서 길항제 활성을 입증하는 항체가 일반적으로 고도의 친화력을 갖는다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 인간 α-CGRP에 대한 KD (25℃에서 측정)가 약 80 nM 이하이거나, 래트 α-CGRP에 대한 KD (37℃에서 측정)가 약 47 nM 이하인 항체가 본 검정법에서 길항제 활성을 나타내었다.
방사능 리간드 결합 검정법. 앞서 기술된 바와 같이 CGRP가 수용체에 결합하지 못하도록 차단하는 항-CGRP 항체의 IC50을 측정하기 위하여 결합 검정법을 실시하였다. ([Zimmermann et al., Peptides 16:421-4, 1995]; [Mallee et a]., J. Biol. Chem. 277:14294-8, 2002]). 총 용량 1 mL로 10 pM 125I-인간 α-CGRP를 함유하는 인큐베이션 완충액 (50 mM 트리스-HCL, pH 7.4, 5 mM MgCl2, 0.1％ BSA)중에서 SK-N-MC 세포로부터의 막 (25 ㎍)을 90분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 저해 농도 (IC50)를 측정하기 위하여 약 100배 더 높은 저장액으로부터의 항체 또는 표지되지 않은 CGRP (대조군)를 다양한 농도로 인큐베이션 완충액에 용해시키고, 막과 10 pM 125I-인간 α-CGRP와 함께 동시에 인큐베이션시켰다. 0.5％ 폴리에틸렌이민으로 차단된 유리 미세섬유 필터 (GF/B, 1 ㎛)를 통해 여과시킴으로써 인큐베이션을 종결시켰다. 용량 반응 곡선을 플롯팅하고, KI 값은 식: KI= IC50/(1+([리간드]/KD) (여기에서, 평형 해리 상수 KD = 8 pM (SK-N-MC 세포에 존재하는 바와 같이 CGRP1 수용체에 대한 인간 α-CGRP의 경우), 및 B최대 = 0.025 pmol/mg 단백질)을 사용하여 측정하였다. 기록된 IC50 값 (IgG 분자에 의해)을 결합 부위로 전환시켜 (2를 곱한다) 비아코어에 의해 측정된 친화력 (KD)과 비교할 수 있도록 하였다 (표 2를 참조할 수 있다).
표 2는 뮤린 항체 7E9, 8B6, 6H2 및 4901의 IC50을 나타낸다. 본 데이타는 항체 친화력이 일반적으로는 IC50과 상관관계에 있다는 것: 친화력이 높은 항체일 수록 (KD 값이 낮을수록) 방사능 리간드 결합 검정법에서 IC50은 더욱 낮다는 것을 시사한다.
실시예 3: 래트 복재 신경의 자극에 의해 유도된 피부 혈관 확장에 대하여 항- CGRP 길항제 항체가 미치는 효과
항-CGRP 항체의 길항제 활성을 시험하기 위하여 앞서 기술된 래트 모델을 사용하여 래트 복재 신경의 자극에 의해 유도된 피부 혈관 확장에 대하여 항-CGRP 길항제 항체가 미치는 효과를 시험하였다. [Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772-776, 1993]. 이러한 래트 모델에서 복재 신경의 전기 자극은 신경 종말로부터의 CGRP 방출을 유도하고, 이로써 피부 혈류량은 증가하게 된다. 스프라귀 다우레이(Sprague Dawley) 래트 수컷 (170-300 g, 찰스 리버 홀리스터(Charles River Hollister)로부터 입수)의 발 피부에서의 혈류량을 복재 신경 자극 후에 측정하였다. 래트를 2％ 이소플루란 마취하에 유지시켰다. 수반되는 복재 신경의 교감 섬유 자극에 기인한 혈관 수축을 최소화하기 위하여 실험 시작시 브레틸리움 토실레이트 (30 mg/kg, i.v. 투여)를 제공하였다. 온도 조절형 전기 담요에 연결된 자동 온도 조절형 직장 프로브를 사용하여 체온을 37℃로 유지시켰다. 도 3에 나타낸 시험을 제외하고는 항체, 양성 대조군 (CGRP 8-37), 및 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈 20)을 비롯한 화합물을 우측 대퇴 정맥을 통해 정맥내로 제공하고, 시험 화합물 및 대조군은 꼬리 정맥을 통해 주사하고, 도 2A 및 2B에 나타낸 시험을 위해서는 항체 4901 및 7D11을 복강내 (IP)로 주사하였다. 양성 대조군 화합물 CGRP 8-37 (혈관 확장 길항제)은 그의 반감기가 짧기 때문에 신경 자극 3-5분 전에 400 nmol/kg (200 ㎕)로 제공하였다. [Tan et al., Clin. Sci. 89:656-73, 1995]. 항체의 투여량을 달리하여 (1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 및 25 mg/kg) 제공하였다.
도 2A 및 2B에 나타낸 시험을 위해서, 항체 4901 (25 mg/kg), 항체 7D11 (25 mg/kg), 또는 비히클 대조군 (PBS with 0.01％ 트윈 20)은 전기 펄스 자극 72시간 전에 복강내 (IP) 투여하였다. 도 3에 나타낸 시험을 위해서, 항체 4901 (1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 또는 25 mg/kg) 또는 비히클 대조군 (0.01 ％ 트윈 20을 포함하는 PBS)을 전기 펄스 자극 24시간 전에 정맥내 투여하였다. 항체 또는 비히클 대조군을 투여한 후, 우측 뒷다리의 복재 신경을 외과적으로 노출시키고, 가장 가깝게 절단하고, 건조되지 못하도록 플라스틱 랩으로 덮어쌌다. 복재 신경에 의해 신경자극을 받는 부위인 뒷발 피부의 내측등쪽측 위에 레이저 도플러 프로브를 놓았다. 혈액 세포 유량으로서 측정되는 피부 혈류량은 레이저 도플러 유량계로 모니터하였다. 안정적인 기준선 유량 (편차 5％ 미만)이 5분 이상 동안 확립되었을 때, 신경을 백금 양극의 전극 상에 놓고, 60 펄스 (30초 동안 2 Hz, 10 V, 1 ms)로 전기적으로 자극시키고, 20분 후에 다시 자극시켰다. 전기 펄스 자극에 대한 각각의 유량 반응에 관한 유량-시간 곡선하 면적 (AUC, 이는 시간 변화에 의해 증가된 유량 변화이다)에 의해 피부 혈류량의 누적 변화를 추정하였다. 평균적으로 2개의 자극에 대한 혈류량 반응을 취하였다. 동물을 1 내지 3시간 동안 마취 상태로 유지시켰다.
도 2A 및 도 2B에 나타낸 것과 같이, 복재 신경 상에 전기 펄스를 가함으로써 자극받은 혈류량 증가는 대조군과 비교할 때 CGRP 8-37 (400 nmol/kg, i.v. 투여), 항체 4901 (25 mg/kg, ip 투여), 또는 항체 7D11 (25 mg/kg, ip 투여) 존재에 의해 저해되었다. CGRP 8-37은 복재 신경 자극 3-5분 전에 투여하였고; 항체는 복재 신경 자극 72시간 전에 투여하였다. 도 3에 나타낸 것과 같이, 복재 신경 상에 전기 펄스를 가함으로써 자극받은 혈류량 증가는 복재 신경 자극 24시간 전에 투여된, 상이한 용량 (1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 및 25 mg/kg)의 항체 4901 존재에 의해 저해되었다.
도 4A 및 도 4B에 나타낸 것과 같이, 항체 투여 이전에 복재 신경을 외과적으로 노출시켰다. 우측 뒷다리의 복재 신경을 외과적으로 노출시키고, 가장 가깝게 절단하고, 건조되지 못하도록 플라스틱 랩으로 덮어쌌다. 복재 신경에 의해 신경자극을 받는 부위인 뒷발 피부의 내측등쪽측 위에 레이저 도플러 프로브를 놓았다. 혈액 세포 유량으로서 측정되는 피부 혈류량은 레이저 도플러 유량계로 모니터하였다. 브레틸리움 토실레이트 주사 후 30 내지 45분이 경과한 후인, 안정적인 기준선 유량 (편차 5％ 미만)이 5분 이상 동안 확립되었을 때, 신경을 백금 양극의 전극 상에 놓고, 60 펄스 (30초 동안 2 Hz, 10 V, 1 ms)로 전기적으로 자극시키고, 20분 후에 다시 자극시켰다. 평균적으로 2개의 자극에 대한 혈류량 반응을 사용하여 전기 자극에 대한 기준선 반응 (시간 0)을 확립시켰다. 이어서, 항체 4901 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg), 항체 7E9 (10 mg/kg), 항체 8B6 (10 mg/kg), 또는 비히클 (0.01 ％ 트윈 20을 포함하는 PBS)을 정맥내 (i.v.) 투여하였다. 항체 또는 비히클 투여 후 30분, 60분, 90분, 및 120분째에 신경을 순차적으로 자극시켰다 (30초 동안 2 Hz, 10 V, 1 ms). 동물을 대략 3시간 동안 마취 상태로 유지시켰다. 전기 펄스 자극에 대한 각각의 유량 반응에 관한 유량-시간 곡선하 면적 (AUC, 이는 시간 변화에 의해 증가된 유량 변화이다)에 의해 피부 혈류량의 누적 변화를 추정하였다.
도 4A에 나타낸 것과 같이, 항체 투여 후 60분, 90분, 및 120분째에 전기 펄스 자극을 가하였을 때, 복재 신경 상에 전기 펄스를 가함으로써 자극받은 혈류량 증가는 1 mg/kg로 i.v. 투여된 항체 4901 존재에 의해 저해되었고, 항체 투여 후 30분, 60분, 90분, 및 120분째에 전기 펄스 자극을 가하였을 때, 복재 신경 상에 전기 펄스를 가함으로써 자극받은 혈류량 증가는 10 mg/kg로 i.v. 투여된 항체 4901 존재에 의해 현저하게 저해되었다. 도 4B는, 항체 투여 후 30분, 60분, 90분, 및 120분째에 전기 펄스 자극을 가하였을 때, 복재 신경 상에 전기 펄스를 가함으로써 자극받은 혈류량 증가는 항체 7E9 (10 mg/kg, i.v. 투여) 존재에 의해 현저하게 저해되었고, 항체 투여 후 30분째에 전기 펄스 자극을 가하였을 때, 항체 8B6 (10 mg/kg, i.v. 투여) 존재에 의해 현저하게 저해되었음을 나타낸다.
이러한 데이타는 래트 복재 신경의 자극에 의해 유도된 피부 혈관 확장에 의해 측정된 바, 항체 4901, 7E9, 7D11, 및 8B6이 CGRP 활성을 차단하는데 효과가 있음을 시사한다.
실시예 4. 항- CGRP 항체 G1 및 그의 변이체의 특징화
항-CGRP 항체 G1의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열을 도 5에 나타낸다. 항체 G1 및 그의 변이체의 발현 및 특징화를 위해 하기 방법을 사용하였다.
사용된 발현 벡터. [Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vector pComb3X]에 기재된 것과 유사한 IPTG 유도성 lacZ 프로모터의 조정하에 항체의 Fab 단편을 발현시키되; 그러나, 하기 추가 도메인을 부가하고 발현시키는 변형을 포함하였다: IgG2 인간 면역글로불린의 인간 카파 경쇄 불변 도메인 및 CH1 불변 도메인, Ig 감마-2 쇄 C 부위, 단백질 기탁 번호 P01859; 면역글로불린 카파 경쇄 (호모사피엔스), 단백질 기탁 번호 CAA09181.
소규모 Fab 제조. Fab 라이브러리로 형질전환된 (전기천공-적격 TG1 세포 또는 화학적으로 적격인 Top 10 세포 사용) 이. 콜라이로부터의 단일 콜로니를 사용하여 마스터 플레이트 (아가 LB + 카르베니실린 (50 ug/mL) + 2％ 글루코스), 및 각각의 웰이 1.5mL LB + 카르베니실린 (50 ug/mL) + 2％ 글루코스를 함유하는 작업 플레이트 (2 mL/웰, 96-웰/플레이트), 둘 모두에 접종하였다. 기체 투과성 접착 실 (영국 서리에 소재하는 ABgene)을 플레이트에 가하였다. 두개의 플레이트 모두 12-16시간 동안 3O℃에서 인큐베이션시키고; 작업 플레이트를 왕성하게 진탕시켰다. 마스터 플레이트는 필요할 때까지 4℃에서 저장한 반면, 작업 플레이트로부터의 세포는 펠릿화하고 (4000 rpm, 4℃, 20분), 1.0 mL LB + 카르베니실린 (50 ug/mL) + 0.5 mM IPTG에 재현탁시켜 5시간 동안 3O℃에서 왕성하게 진탕시킴으로써 Fabs가 발현되도록 유도하였다. 유도된 세포를 20분 동안 4000 rpm, 4℃에서 원심분리하고, 0.6 mL 비아코어 HB-SEP 완충액 (10 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ v/v P20)에 재현탁시켰다. 냉동 (-80℃)시키고 37℃에서 해동시킴으로써 HB-SEP 재현탁된 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 1시간 동안 4000 rpm, 4℃에서 원심분리하여 Fab-함유 상등액으로부터 파편을 분리시킨 후, 밀리포어 멀티스크린 검정법 시스템 96-웰 여과 플레이트 및 진공 매니폴드를 사용하여 여과하였다 (0.2 um). 센서 칩 상에서 CGRPs를 통해 여과된 상등액을 주사함으로써 여과된 상등액을 분석하기 위하여 비아코어를 사용하였다. Fabs를 발현시키는 친화성-선택된 클론을 마스터 플레이트로부터 구제하였는데, 이는 PCR, 서열분석, 및 플라스미드 제조를 위한 주형을 제공하였다.
대규모 Fab 제조. 동역학 파라미터를 수득하기 위하여 하기와 같이 대규모로 Fabs를 발현시켰다. 150 mL LB + 카르베니실린 (50 ug/mL) + 2％ 글루코스를 함유하는 삼각 플라스크를 친화성-선택된 Fab-발현 이. 콜라이 클론으로부터 유래된 1 mL의 밤새의 "시작자" 배양물로 접종하였다. 남은 시작자 배양물 (~3 mL)을 사용하여 서열분석 및 추가의 조작을 위한 플라스미드 DNA (QIAprep mini-prep, 퀴아젠(Qiagen) 키트)를 제조하였다. OD60Onm이 1.0에 도달할 때까지 (전형적으로 12-16시간) 왕성하게 진탕시키면서 다량의 배양물을 30℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 20분 동안 4000 rpm, 4℃에서 원심분리하여 펠릿화하고, 150 mL LB + 카르베니실린 (50 ug/mL) + 0.5 mM IPTG에 재현탁시켰다. 5시간 동안 30℃에서 발현시킨 후, 세포를 20분 동안 4000 rpm, 4℃에서 원심분리하여 펠릿화하고, 10 mL 비아코어 HBS-EP 완충액에 재현탁시키고, 1회의 냉동 (-80℃)/해동 (37℃) 사이클을 사용하여 용해시켰다. 세포 용해물을 1시간 동안 4000 rpm, 4℃에서 원심분리하여 펠릿화하고, 상등액을 수집하고, 여과하였다 (0.2um). 여과된 상등액은 PBS, pH 8로 평형화된 Ni-NTA 슈퍼플로우 세파로스 (캘리포니아주 발렌시아에 소재하는 퀴아젠) 칼럼 상에 로딩하고, 5개 칼럼 용량의 PBS, pH 8로 세척하였다. PBS (pH 8) + 300 mM 이미다졸 사용으로 상이한 분획내 개체 Fabs가 용출되었다. Fabs를 함유하는 분획을 풀링하고, PBS에서 투석시키고, 친화성을 특징화하기 앞서 ELISA에 의해 정량화하였다.
전장의 항체 제조. 전장의 항체를 발현시키기 위하여 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포유동물의 발현 벡터에서 클로닝하고, 일시적 발현을 위해 리포펙트아민을 사용하여 HEK 293 세포로 형질감염시켰다. 표준 방법을 사용함으로써 단백질 A를 사용하여 항체를 정제하였다.
벡터 pDb.CGRP.hFcGI는 G1 항체의 중쇄를 포함하는 발현 벡터이고, 중쇄의 일시적 또는 안정적 발현에 적합하다. 벡터 pDb.CGRP.hFcGI는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다: 뮤린 거대세포바이러스 프로모터 영역 (뉴클레오티드 7-612); 합성 인트론 (뉴클레오티드 613-1679); DHFR 코딩 영역 (뉴클레오티드 688-1253); 인간 성장 호르몬 신호 펩티드 (뉴클레오티드 1899-1976); G1의 중쇄 가변 영역 (뉴클레오티드 1977-2621); 하기 돌연변이: A330P331에서 S330S331로 (야생형 IgG2 서열을 참조하여 번호매김한 아미노산; ([Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]를 참조할 수 있다))을 함유하는 인간 중쇄 IgG2 불변 영역. 벡터 pDb.CGRP.hFcGI는 2005년 6월 15일 ATCC에 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 PTA-6867를 배정받았다.
벡터 pEb.CGRP.hKGI는 G1 항체의 경쇄를 포함하는 발현 벡터이고, 경쇄의 일시적 발현에 적합하다. 벡터 pEb.CGRP.hKGI는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다: 뮤린 거대세포바이러스 프로모터 영역 (뉴클레오티드 2-613); 인간 EF-1 인트론 (뉴클레오티드 614-1149); 인간 성장 호르몬 신호 펩티드 (뉴클레오티드 1160-1237); 항체 G1 경쇄 가변 영역 (뉴클레오티드 1238-1558); 인간 카파 쇄 불변 영역 (뉴클레오티드 1559-1882). 벡터 pEb.CGRP.hKGI는 2005년 6월 15일 ATCC에 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 PTA-6866를 배정받았다.
친화력 측정을 위한 비아코어 검정법. 비아코어3000™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템 (뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 비아코어, 인코포레이티드)을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 G1 모노클로날 항체 및 그의 변이체의 친화력을 측정하였다. 사전-고정화된 스트렙트아비딘 (SA 센서 칩)을 통해 N-말단 바이오티닐화된 CGRP 또는 단편을 포획하고, CGRP 표면을 통해 역가되는 항체 G1 Fab 단편 또는 변이체 또는 칩 상의 단편의 결합 동역학을 측정함으로써 친화력을 측정하였다. HBS-EP 전개용 완충액 (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ v/v 폴리소르베이트 P20)에서 모든 비아코어 검정법을 수행하였다. N-바이오티닐화된 CGRP를 HBS-EP 완충액에 0.001 mg/ml 미만의 농도로 희석시키고, 다양한 접촉 시간을 사용하여 SA 센서 칩을 통해 주입하여 CGRP 표면을 제조하였다. 포획 수준 <50 반응 단위 (RU)에 상응하는, 수용능력이 낮은 표면은 고분해능의 동력학 연구를 위해 사용된 반면, 수용능력이 높은 표면 (포획된 CGRP 약 800 RU)은 농도 연구, 스크리닝, 및 용액 친화력 측정용으로 사용되었다. 1 uM-0.1 nM (0.1-10 x 추정 KD을 목표로 함)에 이르는 농도로 항체 G1 Fab를 2- 또는 3-배 증가분으로 일련으로 히석시킴으로써 동역학 데이타를 수득하였다. 샘플을 1분 동안 100 ㎕/분으로 주입하고, 10분 이상의 해리 시간을 허용하였다. 각각의 결합 사이클 후에는 표면을 25％ v/v 에탄올중 25 mM NaOH로 재생시켰고, 이를 통해 수백회의 사이클이 허용되었다. BIAevaluation 프로그램을 이용하여 전체 역가 시리즈 (전형적으로 이중으로 생성됨)를 1:1 랭뮤어 결합 모델 [Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994), Methods Enzymology 6. 99-110]에 전체적으로 핏팅시켰다. 이를 통해 각 결합 상호작용에 대한 회합 및 해리 동력학 속도 상수 (각각 k온 및 k오프)의 유일한 쌍을 수득하였는데, 그의 비율을 통해 평형 해리 상수 (KD = k오프/k온)를 얻었다. 이러한 방식으로 측정된 친화력 (KD 값)을 표 6 및 7에 열거한다.
오프-속도가 극도로 느린 결합 상호작용에 관한 고분해능 분석. 오프-속도가 극도가 느린 결합 상호작용 (특히, 25℃에서 칩상의 인간 □-CGRP에 대한 에 관한 항체 G1 Fab 결합)에 관한 친화력은 2부 실험으로 수득하였다. 상기 기술된 프로토콜을 하기와 같이 변형하여 사용하였다. 550 nM-1 nM에 이르는 2-배 역가 시리즈 (이중)를 30초 동안 100 uL/분으로 주입하고, 단지 30초 간의 해리 단계를 허용함으로써 회합 속도 상수 (k온)를 측정하였다. 동일한 역가 시리즈를 3개의 농도로 (고, 중, 저) 이중으로 30초 동안 주입하고 2시간의 해리 단계를 허용함으로써 해리 속도 상수 (k오프)를 측정하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 두 실험 모두에서 수득한 k온 및 k오프 값을 조합함으로써 각각의 상호작용의 친화력 (KD)은 수득하였다.
비아코어에 의한 용액 친화력 측정. 래트 □-CGRP 및 F37A (19-37) 인간 □-CGRP에 대한 용액 친화력은 37℃에서 비아코어에 의해 측정하였다. 수용 능력이 높은 CGRP 칩 표면을 사용하고 (검출하기 위하여 친화력이 높은 인간 □-CGRP를 선택하였다), HBS-EP 전개용 완충액은 5 uL/분으로 흐르게 하였다. 5 nM의 일정한 농도로 (용액-기재 상호작용의 예측된 KD가 되도록 하거나, 그보다 낮도록 함) 항체 G1 Fab 단편을 3-배 일련의 희석물중 1 nM 내지 1 uM에 이르는 최종 농도로 경쟁 펩티드, 래트 □-CGRP 또는 F37A (19-37) 인간 □-CGRP와 함께 사전-인큐베이션시켰다. 용액-기재 경쟁 펩티드의 부재 또는 존재하에서 항체 G1 Fab 용액을 칩 상의 CGRP를 통해 주입하고, 용액 경쟁 결과 칩 표면에서 검출되는 결합 반응 부족을 모니터하였다. 항체 G1 Fab을 단독으로 (5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.325 및 0 nM) 칩 상의 CGRP를 통해 역가함으로써 작성된 보정 곡선을 사용하여 상기의 결합 반응을 "유리 Fab 농도"로 전환시켰다. 각 데이타 점을 생성하기 위하여 사용된 경쟁 용액-기재 펩티드의 농도에 대하여 "유리 Fab 농도"를 플롯팅하고, BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 용액 친화성 모델에 핏팅하였다. 이러한 방식으로 (간접적으로) 측정된 용액 친화력을 표 5 및 7에 나타내고, 이를 사용하여 Fabs가 SA 칩 상의 N-바이오티닐화된 CGRPs를 통해 직접 주입할 때 수득한 친화력을 확인하였다. 이들 두 방법에 의해 측정된 친화력 간에 매우 유사하게 일치한다는 것이 CGRP의 N-바이오티닐화된 버전을 칩에 테더링시키는 것인 그의 천연 용액 결합 활성을 변경시키지 않는다는 것을 확인시켜 준다.
하기 표 5는 비아코어에 의해, SA 칩 상의 N-바이오티닐화된 CGRPs를 통해 Fab 단편을 흐르게 함으로써 측정된 인간 α-CGRP, 인간 β-CGRP, 래트 α-CGRP, 및 래트 β-CGRP에 대한항체 G1의 결합 친화력을 나타낸다. 오프 속도가 극도로 느린 결합 상호작용의 친화력을 보다 잘 해석하기 위해 친화력 또한 2부 실험으로 측정하여 이러한 검정 오리엔테이션을 보완하였고, 래트 α-CGRP의 용액 친화력도 (상기 기술된 바와 같이) 측정하였다. 두개의 검정 오리엔테이션 모두에서 측정된 친화력이 매우 유사하게 일치한다는 것은 N-바이오티닐화되고, SA 칩에 테더링되었을 때에도 용액내 천연 래트 α-CGRP의 결합 친화력은 변경되지 않는다는 것을 확인시켜 준다.
Figure 112008033817206-PCT00006
(칩 상의 CGRPs를 통해 역가된 항체 G1 Fabs의 결합 친화력)
* α-CGRPs (래트 및 인간)에 대한 친화력은 고분해능의 2부 실험으로 측정하였는데, 여기에서, 해리 단계는 2시간 동안 모니터하였다 (k온, k오프, KD 값은 n회 반복한 실험의 평균값을 나타내고, 표준 편차는 분산 (％)으로 표시하였다). β-CGRPs (래트 및 인간)에 대한 친화력은 오직 20분 간의 해리 단계만을 사용하여 전체적으로 분석함으로써 측정하였는데, 이는 그의 극단적인 오프 속도 (그의 오프 속도는 본원에서 언급되는 것보다 더욱 느릴 수 있고, 그러므로 그의 친화력은 더욱더 높을 수 있다)를 정량화할 정도로 충분히 정확하지는 않았다. 항체 G1 Fab는 비아코어 검정법 (특히 25℃)의 분해 한계에 도달하는 오프 속도로 모든 CGRPs (α-래트 CGRP는 제외)로부터 극도로 느리게 해리되었다.
** 결합 반응의 부족을 측정함으로써 측정됨 용액 친화력은 용액-기재 래트 α-CGRP 경쟁자와 함께 사전-인큐베이션된 항체 G1 Fab에 대하여 칩 상의 CGRP에서 검출되었다.
하기 표 6은 항체 G1과 비교되는 아미노산 서열 변형을 갖는 항체와, 래트 α-CGRP 및 인간 α-CGRP, 둘 모두에 대한 그의 친화력을 나타낸다. 표 6에 나타낸 변이체의 모든 아미노산 치환은 G1의 서열에 관하여 기술된 것이다. Fab 단편의 결합 친화력은 SA 칩 상의 CGRPs를 통해 Fab 단편을 흐르게 함으로써 비아코어에 의해 측정되었다.
Figure 112008033817206-PCT00007
Figure 112008033817206-PCT00008
Figure 112008033817206-PCT00009
Figure 112008033817206-PCT00010
(항체 G1 변이체에 대한 아미노산 서열 및 비아코어에 의해 37℃에서 측정된 항체 G1 변이체에 대한 결합 친화력 데이타)
모든 CDRs는 캐벗 및 코티아 CDRs, 둘 모두를 포함한다. 아미노산 잔기는 순차적으로 번호매김된 것이다 (도 5를 참조할 수 있다). 모든 클론은 G1과 동일한 L3+H1+H3 서열을 갖는다.
KD = k오프/k온. 모든 k오프 값은 스크리닝 모드로 측정하되, 단, 밑줄친 것은 예외로 하며, 이는, Fab 농도 시리즈의 전체적인 분석에 의해 수득하였다 (G1은 고분해능 모드로 분석되었다). 그러므로, 밑줄친 KD 값은 k온을 측정함으로써 실험적으로 측정하였다. 다른 k온 값은 M25와 동일한 것으로 추정되었다.
n.d. = 미측정
항체 G1에 의해 인식되는 인간 α-CGRP 상의 에피토프를 결정하기 위하여 상기 기술된 바와 같은 비아코어 검정법을 사용하였다. SA 센서 칩을 통해 높은 친화력으로 포획할 수 있는 N-바이오티닐화된 버전으로 인간 α-CGRP를 구입하였다. CGRP 펩티드의 부재 또는 존재하에서 칩 상의 인간 α-CGRP에 대한 G1 Fab 단편의 결합을 측정하였다. 전형적으로, 2000:1 mol 펩티드/Fab 용액 (예컨대, 5O nM G1 Fab중 10 uM 펩티드)을 칩 상의 인간 α-CGRP를 통해 주입하였다. 도 6은 경쟁 펩티드에 의해 차단된 결합율 (％)을 나타낸다. 도 6에 나타낸 데이타는 인간 α-CGRP에 대한 G1 Fab의 결합을 100％ 차단하는 펩티드는 인간 α-CGRP의 1-37 (WT), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37), K35E (19-37), 및 K35M (19-37); β-CGRP (WT)의 1-37; 래트 α-CGRP (WT)의 1-37; 및 래트 β-CGRP (WT)의 1-37라는 것을 시사한다. 이들 펩티드 모두는 C-말단에서 아미드화된 것이다. 인간 α-CGRP의 펩티드 F37A (19-37) 및 19-37 (후자의 것은 C-말단이 아미드화되지 않은 것이다) 또한 인간 α-CGRP에 대한 G1 Fab의 결합을 약 80％ 내지 90％ 차단하였다. 인간 α-CGRP의 펩티드 1-36 (C-말단이 아미드화되지 않은 것이다)은 인간 α-CGRP에 대한 G1 Fab의 결합을 약 40％ 차단하였다. 인간 α-CGRP의 펩티드 단편 19-36 (C-말단에서 아미드화된 것이다); 인간 α-CGRP의 펩티드 단편 1-13 및 1-19 (이중 어느 것도 아미드화되지 않은 것이다); 및 인간 아밀린, 칼시토닌, 및 아드레노메둘린 (모두 C-말단에서 아미드화된 것이다)은 칩 상의 인간 α-CGRP에 대한 G1 Fab 결합과 경쟁하지 못했다. 이러한 데이타는 G1이 CGRP의 C-말단 에피토프를 표적하며, 가장 말단의 잔기 (F37)의 정체와 그의 아미드화가 결합에 중요하다는 것을 입증한다.
인간 α-CGRP의 변이체에 대한 G1 Fab의 결합 친화력 (37℃에서) 또한 측정하였다. 하기 표 7은 칩 상의 N-바이오티닐화된 인간 α-CGRP 및 변이체를 통해 G1 Fab를 적정함으로써 직접 측정된 친화력을 나타낸다. 표 7에 나타낸 데이타는 항체 G1이 가장 중요한 잔기인 F37 및 G33을 갖는 C-말단 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다. 여분의 아미노산 잔기 (알라닌)를 C-말단에 가할 때 (이는 아미드화된다), G1은 CGRP에 결합하지 못한다.
Figure 112008033817206-PCT00011
Figure 112008033817206-PCT00012
(37℃에서 측정된 인간 α-CGRP 및 변이체에 대한 G1 Fab의 결합 친화력 (그의 아미노산 서열에 대해서는 표 4를 참조할 수 있다))
상기 데이타는 항체 G1이 결합하는 에피토프는 인간 α-CGRP의 C-말단 종단 상에 위치하며, 인간 α-CGRP 상의 아미노산 33 및 37이 항체 G1의 결합에 중요하다는 것을 시사한다. 또한, 잔기 F37의 아미드화가 결합에 중요하다.
실시예 5: 래트 복재 신경의 자극에 의해 유도된 피부 혈관 확장에 대하여 항- CGRP 길항제 항체 G1 이 미치는 효과
항-CGRP 항체 G1의 길항제 활성을 시험하기 위하여 실시예 3에 기술된 래트 모델을 사용하여 래트 복재 신경의 자극에 의해 유도된 피부 혈관 확장에 대하여 항체가 미치는 효과를 시험하였다. 간단히 말하면, 래트를 2％ 이소플루란 마취하에 유지시켰다. 수반되는 복재 신경의 교감 섬유 자극에 기인한 혈관 수축을 최소화하기 위하여 실험 시작시 브레틸리움 토실레이트 (30 mg/kg, i.v. 투여)를 제공하였다. 온도 조절형 전기 담요에 연결된 자동 온도 조절형 직장 프로브를 사용하여 체온을 37℃로 유지시켰다. 우측 뒷다리의 복재 신경을 외과적으로 노출시키고, 가장 가깝게 절단하고, 건조되지 못하도록 플라스틱 랩으로 덮어쌌다. 복재 신경에 의해 신경자극을 받는 부위인 뒷발 피부의 내측등쪽측 위에 레이저 도플러 프로브를 놓았다. 혈액 세포 유량으로서 측정되는 피부 혈류량은 레이저 도플러 유량계로 모니터하였다. 주사 후 2시간 이내에 항체의 효과를 측정하는 실험에서 브레틸리움 토실레이트 주사 후 30 내지 45분이 경과한 후인, 안정적인 기준선 유량 (편차 5％ 미만)이 5분 이상 동안 확립되었을 때, 신경을 백금 양극의 전극 상에 놓고, 60 펄스 (30초 동안 2 Hz, 10 V, 1 ms)로 전기적으로 자극시키고, 20분 후에 다시 자극시켰다. 평균적으로 2개의 자극에 대한 혈류량 반응을 사용하여 전기 자극에 대한 기준선 반응 (시간 0)을 확립시켰다. 이어서, 항체 G1 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg) 또는 비히클 (10 mg/kg G1에 동량인 0.01 ％ 트윈 20을 포함하는 PBS)을 정맥내 (i.v.) 투여하였다. 항체 또는 비히클 투여 후 30분, 60분, 90분, 및 120분째에 신경을 순차적으로 자극시켰다 (30초 동안 2 Hz, 10 V, 1 ms). 동물을 대략 3시간 동안 마취 상태로 유지시켰다. 전기 펄스 자극에 대한 각각의 유량 반응에 관한 유량-시간 곡선하 면적 (AUC, 이는 시간 변화에 의해 증가된 유량 변화이다)에 의해 피부 혈류량의 누적 변화를 추정하였다.
도 7에 나타낸 것과 같이, 항체 투여 후 90분째에 복재 신경을 전기적으로 자극시켰을 때, 비히클과 비교하면 복재 신경 상에 전기 펄스를 가함으로써 자극받은 혈류량 증가는 1 mg/kg (i.v. 투여)의 항체 G1 존재에 현저하게 저해되었다. 항체 투여 후 90분 및 120분째에 복재 신경을 전기적으로 자극시켰을 때, 비히클과 비교하면 복재 신경 상에 전기 펄스를 가함으로써 자극받은 혈류량 증가는 10 mg/kg (i.v. 투여)의 항체 G1 존재에 현저하게 저해되었다.
복재 검정법으로 보다 장기간의 시점에서 항체의 효과를 측정하는 실험에서는 상기 기술된 바와 같이 복재 신경 자극용 동물을 제조하기 24시간 또는 7일 전에 지정된 투여량으로 항체를 i.v.로 래트에 주사하였다. 이러한 실험에서는 투여하기 전에 각각의 래트에서 전기 펄스 자극에 대한 기준선 반응을 확립할 수 없기 때문에 24시간 또는 7일째에 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈 20)을 투여받은 동물과 치료군을 비교하였다.
도 8A 및 도 8B에 나타낸 것과 같이, 복재 신경 자극에 의해 유발된 배내측 뒷발 피부의 혈류량 증가는 동일 시점에 투여받은 비히클 군과 비교할 때, 자극받기 24시간 또는 7일 전에 10 mg/kg 또는 3 mg/kg G1을 투여받은 동물군에서 현저하게 저해되었다.
도 8C는 50％ 최대 효과 (EC50)를 위해 필요한 투여량을 결정하는,도 8A 및 도 8B에 나타낸 투여량 반응 데이타에 적용된 곡선 적합 분석을 나타낸다. 24시간째에 EC50은 1.3 mg/kg이고, 7일째에 EC50은 그보다 약간 낮다 (0.8mg/kg).
실시예 6: 경막 동맥 (폐쇄형 뇌 윈도우 ) 검정법에서 항- CGRP 길항제 항체 G1이 급성 효과
폐쇄형 뇌 윈도우 모델: 본 실험의 목적은 항-CGRP 길항제 항체의 급성 효과를 측정하고, 이를 CGRP 수용체 길항제 BIBN4096BS의 급성 효과와 비교하는 것이었다. 실험은 앞서 기술된 바와 같이 수행하되 [Williamson et al., Cephalalgia 17(4):518-24 (1997)], 하기와 같이 변형시켰다. 스프라귀 다우레이 래트 (300-40Og)를 70mg/kg i.p. 펜토바르비탈로 마취시켰다. 20mg/kg/hr i.v. 펜토바르비탈로 마취를 유지시켰다. 모든 약물을 전달하기 위하여 목정맥을 통해 래트에 캐뉼러를 삽입하였다. 대퇴 동맥을 통해 복부 대동맥으로 나선식으로 장착된 프로브 (마이크로-팁 카테터, 밀라 인스트루먼츠(Millar Instruments))를 사용하여 혈압을 모니터하였다. 래트를 기관절개술 시키고, 호습수는 3.5 mL의 용량으로 1분당 75회 호흡하도록 유지시켰다. 정위용 기기에서 머리를 고정시키고, 두피를 제거한 후, 시상 봉합 바로 측면에 위치하는 좌측 마루 영역내 2x6mm 윈도우는 치과용 드릴로 뼈를 박막화하여 제조하였다. 미세조작장치를 사용하여 백금 양극의 전극을 표면 상에 내려 놓고, 중광유로 덮어쌌다. 전극 윈도우 측면의, 5x6 mm의 또다른 윈도우를 생성하고, 중광유로 충진시키고, 이를 통해 중경막 동맥 (MMA) 분지의 직경은 CCD 카메라 및 비디오 크기의 분석기 (리빙 시스템(Living Systems))로 연속하여 모니터하였다. 제조 후 래트는 45분 이상 동안 휴식하도록 하였다. 전기 자극에 대한 기준선 반응을 확립하고 (15 V, 10 hz, 0.5 ms 펄스, 30초), 래트에 실험 화합물 (10mg/kg mu7E9, 300 □/kg BIBN4096BS 또는 PBS 0.01％ 트윈 20)을 i.v.투여하였다. 투여 후 5 (BIBN4096BS), 30분, 60분, 90분 및 120분째에 추가의 전기 자극을 수행하였다. 모든 데이타는 차트 소프트웨어 (ADInstruments)를 사용하여 기록하였다.
도 9에 나타낸 것과 같이, 10mg/kg의 mu7E9는 투여 후 60분 이내에 전기장 자극에 의해 유발된 MMA 확장을 현저하게 차단시키고, 검정법 (120분) 기간 내내 효과를 유진시킨다. 비교한 바, BIBN4096BS는 투여 후 5분 이내에 MMA 확장을 차단하지만, 효과는 90분까지 완전하게 소멸되었다. 차단 크기는 BIBN4096BS 및 mu7E9 사이에 상용성을 띤다.
실시예 7: 경막 동맥 (폐쇄형 뇌 윈도우 ) 검정법에서 항- CGRP 길항제 항체 G1의 만성적 효과
본 실험의 목적은 항-CGRP 길항제 항체가 투여 후 7일이 경과한 후에도 여전히 전기적으로 자극받은 MMA 확장을 차단할 수 있는지 여부를 측정하였다. 래트 제조는 상기 기술된 급성 실험 (실시예 6)과 동일하되, 단, 하기와 같은 예외가 있었다. 폐쇄형 윈도우 제제를 형성하기 전에, 그리고 자극시키기 7일 전에 래트에 (10mg/kg, 3mg/kg 또는 1mg/kg G1)를 i.v. 주사하였다. 급성 실험에서와 같이 투여하기 이전에 전기 자극에 대한 기준선 확장 반응을 확립시킬 수 없는 바, 항체 군을 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈 20)이 투여된 대조군에서의 MMA 확장과 비교하였다. 래트에 45분 이상의 휴지기를 허용한 후, 30분 간격으로 경뇌막을 전기적으로 자극시켰다. 자극은 모든 30초 동안 10hz, 0.5 ms 펄스로 2.5V, 5V, 10V, 15V 및 20V에서 이루어졌다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 10 mg/kg 및 3 mg/kg의 G1은 10 내지 20 볼트 범위의 전기 자극에 의해 유발된 MMA 확장을 현저하게 차단시켰다. 이러한 데이타는 G1은 투여 후 7일까지 전기적으로 자극받은 MMA 확장을 차단시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 8: 모르핀 금단 현상의 안면 홍조 모델
모르핀 금단 현상의 래트 모델은 폐경기 안면 홍조 기전에 대하여 확립된 설치류 모델이다 ([Sipe et al., Brain Res. 1028(2): 191-202 (2004)]; [Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998)]; [Katovich et al., Brain Res. 494:85-94 (1989)]; [Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)]). 기본적으로, 피부에 모르핀 펠릿을 삽입시켜 래트를 모르핀에 중독시킨다. 중독시 동물에 낼럭손 (오피오이드 길항제)을 주사하여 즉시 금단 현상이 일어나도록 하였다. 이러한 금단 현상은 피부 온도의 증가, 심부 체온 감소, 심박수 증가 및 혈청내 황체 형성 호르몬 증가를 수반한다. 이들은 인간 안면 홍조에서 발생하는 것과 크기와 시간이 모두 유사하다 [Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)]. 추가로, 금단현상을 유도하기 앞서 에스트라디올로 래트를 치료할 경우, 안면 홍조 증상은 겸감된다 [Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998)]. 이는 모르핀 금단 현상 모델이 임상적 안면 홍조를 모사하는 것으로 여겨지기 때문이다.
찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories)로부터 난소가 절제될 래트를 주문하였다. 난소 절제술 후 7일 이상이 경과한 후에 모르핀 펠릿 (75 mg 모르핀 기재)을 피하로 삽입하여 모르핀 중독증을 일으켰다. 2일이 경과한 후에 추가의 펠릿을 삽입하였다. 다음날, 래트에 10 mg/kg 4901 [**] 또는 비히클 (PBS, 0.01％ 트윈)을 정맥내로 주사하였다. 2차 펠릿화 후 2일이 경과한 후에 래트를 케타민 (90 mg/kg)으로 마취시키고, 경미하게 구속시켰다. 표면 온도 열전대를 꼬리 기저부에 테이프로 감고, 직장 열전대를 사용하여 심부 체온을 측정한다. 데이타는 차트(Chart) 소프트웨어(ADInstruments)를 사용하여 기록하였다. 15분간의 안정적인 기준선 온도를 기록한 후, 낼럭손 (1 mg/kg)을 피하 주사하였다. 이후 60분간 연속하여 온도를 기록하였다. 생성된 결과는 도 11A 및 11B에 나타낸다.
본원에 기술된 실시예 및 실시태양은 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 그를 고려하여 다양한 변형과 변화가 당업자에게 제안될 것이며, 이는 본 출원의 정신 및 범위내 포함되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원은 마치 각 개개의 간행물, 특허, 특허 출원이 참고로 인용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 제시된 것과 같이 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에서 참고로 인용된다.
생물학적 물질의 기탁
하기의 물질들은 미국 20110-2209 버지니아주 매나서스 유니버시티 불러버드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었다:
물질 항체 번호 ATCC 기탁 번호 기탁일
pDb.CGRP.hFcGI G1 중쇄 PTA-6867 2005년 6월 15일
pEb.CGRP.hKGI G1 경쇄 PTA-6866 2005년 6월 15일
벡터 pEb.CGRP.hKGI는 G1 경쇄 가변 영역 및 경쇄 카파 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고; 벡터 pDb.CGRP.hFcGI는 하기 돌연변이: A330P331에서 S330S331로 (야생형 IgG2 서열을 참조하여 번호매김한 아미노산; ([Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]를 참조할 수 있다))을 함유하는 G1 중쇄 가변 영역 및 중쇄 IgG2 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
이러한 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다 (부다페스트 조약). 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조건하에, 그리고 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션(Rinat Neuroscience Corp.)와 ATCC 간의 협약을 조건으로 ATCC로 부터 입수가능할 것이고, 상기 협약은 관련된 미국 특허의 허여 시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개 시 (어느 것이든지 먼저인 것), 기탁된 배양물의 자손을 영구적이고 비제한적으로 공중이 입수할 수 있는 것을 보장하고, 35 USC 122항 및 이에 따른 특허상표청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정 참조와 함께 37 CFR 1.14항 포함)에 따라 자격이 있는 것으로 미국 특허상표청장에 의해 결정된 이가 자손을 입수할 수 있는 것을 보장한다.
본 출원의 양도인은 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양되었을 때 사망하거나, 손실되거나 파괴되면, 물질이 공고시에 즉시 동일한 또다른 것으로 대체될 것이라는 것에 동의하였다. 기탁된 물질의 입수가능성은 어떠한 정부의 권한 하에 이의 특허법에 따라 수여된 권리를 위반하여 발명을 실행하는 자격증으로 해석되지 않아야 한다.
항체 서열
G1 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (서열 1)
Figure 112008033817206-PCT00013
G1 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (서열 2)
Figure 112008033817206-PCT00014
Figure 112008033817206-PCT00015
G1 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열 (서열 9)
Figure 112008033817206-PCT00016
G1 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열 (서열 10)
Figure 112008033817206-PCT00017
G1 중쇄 전장의 항체 아미노산 서열 (본원에 기술된 변형된 IgG2 포함) (서열 11)
Figure 112008033817206-PCT00018
G1 경쇄 전장의 항체 아미노산 서열 (서열 12)
Figure 112008033817206-PCT00019
G1 중쇄 전장의 항체 뉴클레오티드 서열 (본원에 기술된 변형된 IgG2 포함) (서열 13)
Figure 112008033817206-PCT00020
G1 경쇄 전장의 항체 뉴클레오티드 서열 (서열 14)
Figure 112008033817206-PCT00021
Figure 112008033817206-PCT00022
인간 및 래트 CGRP의 아미노산 서열 비교 (인간 α-CGRP (서열 15); 인간 β-CGRP (서열 43); 래트 α-CGRP (서열 41); 및 래트 β-CGRP (서열 44)):
Figure 112008033817206-PCT00023
SEQUENCE LISTING <110> Rinat Neuroscience Corp. Zeller, Joerg Poulsen, Kristian Abdiche, Yasmin Pons, Jaume Sierra, Jones Rosenthal, Arnon <120> Antagonist Antibodies Directed Against Calcitonin Gene-Related Peptide and Methods of Using Same <130> PC19499A <160> 47 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of humanized antibody <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Leu Ala Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of humanized antibody <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Lys Arg Val Thr Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H1 of humanized antibody <400> 3 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 of humanized antibody <400> 4 Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ala 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H3 of humanized antibody <400> 5 Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L1 of humanized antibody <400> 6 Lys Ala Ser Lys Arg Val Thr Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 of humanized antibody <400> 7 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 of humanized antibody <400> 8 Ser Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of a humanized antibody <400> 9 gaagttcagc tggttgaatc cggtggtggt ctggttcagc caggtggttc cctgcgtctg 60 tcctgcgctg cttccggttt caccttctcc aactactgga tctcctgggt tcgtcaggct 120 cctggtaaag gtctggaatg ggttgctgaa atccgttccg aatccgacgc gtccgctacc 180 cattacgctg aagctgttaa aggtcgtttc accatctccc gtgacaacgc taagaactcc 240 ctgtacctgc agatgaactc cctgcgtgct gaagacaccg ctgtttacta ctgcctggct 300 tactttgact acggtctggc tatccagaac tactggggtc agggtaccct ggttaccgtt 360 tcctcc 366 <210> 10 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of a humanized antibody <400> 10 gaaatcgttc tgacccagtc cccggctacc ctgtccctgt ccccaggtga acgtgctacc 60 ctgtcctgca aagcttccaa acgggttacc acctacgttt cctggtacca gcagaaaccc 120 ggtcaggctc ctcgtctgct gatctacggt gcttccaacc gttacctcgg tatcccagct 180 cgtttctccg gttccggttc cggtaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctggaaccc 240 gaagacttcg ctgtttacta ctgcagtcag tcctacaact acccctacac cttcggtcag 300 ggtaccaaac tggaaatcaa a 321 <210> 11 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain full-length of a humanized antibody <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Leu Ala Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 12 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain full-length of a humanized antibody <400> 12 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Lys Arg Val Thr Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 13 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain full-length of a humanized antibody <400> 13 gaagttcagc tggttgaatc cggtggtggt ctggttcagc caggtggttc cctgcgtctg 60 tcctgcgctg cttccggttt caccttctcc aactactgga tctcctgggt tcgtcaggct 120 cctggtaaag gtctggaatg ggttgctgaa atccgttccg aatccgacgc gtccgctacc 180 cattacgctg aagctgttaa aggtcgtttc accatctccc gtgacaacgc taagaactcc 240 ctgtacctgc agatgaactc cctgcgtgct gaagacaccg ctgtttacta ctgcctggct 300 tactttgact acggtctggc tatccagaac tactggggtc agggtaccct ggttaccgtt 360 tcctccgcct ccaccaaggg cccatctgtc ttcccactgg ccccatgctc ccgcagcacc 420 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttcccaga acctgtgacc 480 gtgtcctgga actctggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 540 tcctcaggtc tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc catccagcaa cttcggcacc 600 cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag ccaagcaaca ccaaggtcga caagaccgtg 660 gagagaaagt gttgtgtgga gtgtccacct tgtccagccc ctccagtggc cggaccatcc 720 gtgttcctgt tccctccaaa gccaaaggac accctgatga tctccagaac cccagaggtg 780 acctgtgtgg tggtggacgt gtcccacgag gacccagagg tgcagttcaa ctggtatgtg 840 gacggagtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagccaagag aggagcagtt caactccacc 900 ttcagagtgg tgagcgtgct gaccgtggtg caccaggact ggctgaacgg aaaggagtat 960 aagtgtaagg tgtccaacaa gggactgcca tccagcatcg agaagaccat ctccaagacc 1020 aagggacagc caagagagcc acaggtgtat accctgcccc catccagaga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aagggattct atccatccga catcgccgtg 1140 gagtgggagt ccaacggaca gccagagaac aactataaga ccacccctcc aatgctggac 1200 tccgacggat ccttcttcct gtattccaag ctgaccgtgg acaagtccag atggcagcag 1260 ggaaacgtgt tctcttgttc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta tacccagaag 1320 agcctgtccc tgtctccagg aaagtaa 1347 <210> 14 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain full-length of a humanized antibody <400> 14 gaaatcgttc tgacccagtc cccggctacc ctgtccctgt ccccaggtga acgtgctacc 60 ctgtcctgca aagcttccaa acgggttacc acctacgttt cctggtacca gcagaaaccc 120 ggtcaggctc ctcgtctgct gatctacggt gcttccaacc gttacctcgg tatcccagct 180 cgtttctccg gttccggttc cggtaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctggaaccc 240 gaagacttcg ctgtttacta ctgcagtcag tcctacaact acccctacac cttcggtcag 300 ggtaccaaac tggaaatcaa acgcactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttccctcca 360 tctgatgagc agttgaaatc cggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 ccgcgcgagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatccgg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacc 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagttctc cagtcacaaa gagcttcaac cgcggtgagt gctaa 645 <210> 15 <211> 37 <212> PRT <213> human <400> 15 Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Lys Ala Phe 35 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> human <400> 16 Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu Ser Arg Ser Gly Gly Val Val 1 5 10 15 Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 20 25 30 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> human <400> 17 Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15 Lys Ala Phe <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> variant of fragment of human alpha-CGRP <400> 18 Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Ala Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15 Lys Ala Phe <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 19 Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15 Ala Ala Phe <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragement, variant of human alpha-CGRP <400> 20 Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15 Glu Ala Phe <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 21 Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15 Met Ala Phe <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 22 Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Phe <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 23 Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15 Lys Ala Ala <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 24 Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment of human alpha-CGRP <400> 25 Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 26 Asn Asn Ala Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 27 Asn Asn Phe Ala Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 28 Asn Asn Phe Val Ala Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 29 Asn Asn Phe Val Pro Ala Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 30 Asn Asn Phe Val Pro Thr Ala Val Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 31 Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Ala Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 32 Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Ala Ser Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 33 Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ala Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment, variant of human alpha-CGRP <400> 34 Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Ala 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment of human alpha-CGRP <400> 35 Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 36 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment of human alpha-CGRP <400> 36 Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15 Lys Ala Phe <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment of human alpha-CGRP <400> 37 Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15 Lys Ala <210> 38 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment of human alpha-CGRP <400> 38 Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Lys Ala 35 <210> 39 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment of human alpha-CGRP <400> 39 Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ser Arg Ser <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment of human alpha-CGRP <400> 40 Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala 1 5 10 <210> 41 <211> 37 <212> PRT <213> Rat <400> 41 Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Glu Ala Phe 35 <210> 42 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fragment of rat alpha-CGRP <400> 42 Ser Gly Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15 Glu Ala Phe <210> 43 <211> 37 <212> PRT <213> Human <400> 43 Ala Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ser Arg Ser Gly Gly Met Val Lys Ser Asn Phe Val Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Lys Ala Phe 35 <210> 44 <211> 37 <212> PRT <213> Rat <400> 44 Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Lys Ala Phe 35 <210> 45 <211> 32 <212> PRT <213> Human <400> 45 Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe 1 5 10 15 Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro 20 25 30 <210> 46 <211> 37 <212> PRT <213> Human <400> 46 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 47 <211> 52 <212> PRT <213> Human <400> 47 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15 Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln 20 25 30 Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser 35 40 45 Pro Gln Gly Tyr 50

Claims (16)

  1. 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된, 인간 α-CGRP에 대한 결합 친화력 (KD)이 50 nM 이하인 항체.
  2. 제1항에 있어서, 서열 1과 아미노산 서열이 90％ 이상 동일한 VH 도메인을 포함하는 항체.
  3. 제2항에 있어서, 서열 1의 99번 위치의 아미노산 잔기는 L이거나 또는 A, N, S, T, V, 또는 R에 의해 치환된 것이고, 서열 1의 100번 위치의 아미노산 잔기는 A이거나 또는 L, R, S, V, Y, C, G, T, K, 또는 P에 의해 치환된 것인 항체.
  4. 제1항에 있어서, 서열 2와 아미노산 서열이 90％ 이상 동일한 VL 도메인을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    a. 서열 3에 기재되어 있는 CDR H1;
    b. 서열 4에 기재되어 있는 CDR H2;
    c. 서열 5에 기재되어 있는 CDR H3;
    d. 서열 6에 기재되어 있는 CDR L1;
    e. 서열 7에 기재되어 있는 CDR L2;
    f. 서열 8에 기재되어 있는 CDR L3; 및
    g. 표 6에 나타낸 L1, L2 및 H2의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 CDR을 포함하는 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    a. 서열 5에 기재된 VH CDR3, 또는 서열 5와 1 또는 2개의 보존적 아미노산 치환이 상이한 서열; 및
    b. 서열 8에 기재된 VL CDR3, 또는 서열 8과 1 또는 2개의 보존적 아미노산 치환이 상이한 서열을 포함하는 항체.
  7. 서열 1과 아미노산 서열이 90％ 이상 동일한 VH 도메인 및 서열 2와 아미노산 서열이 90％ 이상 동일한 VL 도메인을 포함하는 항체.
  8. 제7항에 있어서, 항체가 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자이거나, 그로부터의 유도된 것인 항체.
  9. 제7항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-6867을 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 중쇄를 포함하는 항체.
  10. 제7항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-6866을 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 경쇄를 포함하는 항체.
  11. 제1항의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 개체에게 유효량의 항-CGRP 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 적어도 하나의 혈관의 운동과 관련된 증상(vasomotor symptom)을 예방 또는 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 혈관의 운동과 관련된 증상이 전조가 있거나 없는 편두통, 편마비 편두통, 군집성 두통, 편두통성 신경통, 만성 두통, 또는 긴장성 두통인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 혈관의 운동과 관련된 증상이 안면 홍조인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 항-CGRP 길항제 항체가 제1항 내지 제10항에 기술되어 있는 항체중 어느 한 항체인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 항-CGRP 길항제 항체가 ATCC 기탁 번호 PTA-6867 및 PTA-6866을 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 항체인 방법.
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