EA015526B1 - Антагонистические антитела против пептида, связанного с геном кальцитонина, и способы их применения - Google Patents

Антагонистические антитела против пептида, связанного с геном кальцитонина, и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA015526B1
EA015526B1 EA200801094A EA200801094A EA015526B1 EA 015526 B1 EA015526 B1 EA 015526B1 EA 200801094 A EA200801094 A EA 200801094A EA 200801094 A EA200801094 A EA 200801094A EA 015526 B1 EA015526 B1 EA 015526B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
antibodies
sequence
binding
sccr
Prior art date
Application number
EA200801094A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801094A1 (ru
Inventor
Джоэрг Зеллер
Кристиан Тодд Поулсен
Ясмина Нубия Абдич
Хауме Понс
Сьерра Джонс Колльер
Арнон Розенталь
Original Assignee
Ринат Ньюросайенс Корп.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37909474&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA015526(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ринат Ньюросайенс Корп. filed Critical Ринат Ньюросайенс Корп.
Publication of EA200801094A1 publication Critical patent/EA200801094A1/ru
Publication of EA015526B1 publication Critical patent/EA015526B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/4045—Indole-alkylamines; Amides thereof, e.g. serotonin, melatonin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

В данном изобретении раскрыты способы профилактики или лечения расстройств, ассоциированных с пептидом, связанным с геном кальцитонина (CGRP), таких как вазомоторные симптомы, включая головную боль (например, мигрень, кластерную головную боль и головную боль напряжения) и приливы крови, путем введения антагонистического антитела против CGRP. Также описано антагонистическое антитело G1 и антитела, являющиеся производными от G1, против CGRP.

Description

Настоящее изобретение относится к применению антагонистических антител против ССКР для профилактики, снижения интенсивности или лечения вазомоторных симптомов, таких как головные боли, связанные с ССКР (например, мигрень), и приливы крови.
Предшествующий уровень техники
ССКР (пептид, связанный с геном кальцитонина) представляет собой нейропептид из 37 аминокислот, который относится к семейству пептидов, включающих кальцитонин, адреномедуллин и амилин. У людей существуют две формы ССКР (α-ССКР и β-ССКР), обладающих подобной активностью. Они отличаются по трем аминокислотам и демонстрируют различное распределение. По меньшей мере два подтипа рецепторов ССКР также могут являться причиной разных активностей. ССКР представляет собой нейромедиатор в центральной нервной системе, и показано, что он является сильным сосудорасширяющим агентом в периферических тканях, где нейроны, содержащие ССКР, тесно ассоциированы с кровеносными сосудами. Опосредованное ССКР расширение кровеносных сосудов также ассоциировано с нейрогенным воспалением как часть каскада событий, приводящих в результате к транссудации плазмы и расширению кровеносных сосудов микроциркуляторного русла, и присутствует при мигрени.
Отмечали, что ССКР возможно связан с вазомоторными симптомами (\Ууоп с1 а1. 8еапб. 1. Иго1. Νορίποί. 35: 92-96 (2001); \Ууоп с1 а1. Мепораике 7(1):25-30 (2000)). Вазомоторные симптомы (ΥΜ8), такие как приливы крови и ночная потливость, представляют собой наиболее обычные симптомы, ассоциированные с менопаузой, возникающие у 60-80% всех женщин после естественной или вызванной хирургическим вмешательством менопаузы. Приливы крови вероятно представляют собой адаптивную реакцию центральной нервной системы (ЦНС) на снижение уровня половых стероидных гормонов (Ргеебтап Ат. 1. Нитап Βίο1. 13:453-464 (2001)). К настоящему времени наиболее эффективные способы лечения приливов крови представляют собой гормональные способы лечения, включающие эстрогены и/или некоторые прогестины. Г ормональные способы лечения могут быть эффективны для уменьшения интенсивности приливов крови, но не подходят для всех женщин. Считают, что наблюдаемые психологические и эмоциональные симптомы, такие как нервозность, утомляемость, возбудимость, бессонница, депрессия, потеря памяти, головная боль, тревога, нервозность или неспособность концентрироваться, вызваны лишением сна из-за прилива крови и ночной потливости (Кгатег е1 а1., 1п: Мигрйу е1 а1., 3.кир.гб 1п!'1 8утрокшт оп Кеееп! Абуапеек ίη иго1одюа1 Сапсег Э|адпо818 апб Тгеа1теп1-Ргоееебтд8, Рапк, Ргапсе: 8С1: 3-7 (1992)).
Мужчины также испытывают приливы крови вследствие снижения концентрации стероидных гормонов (андрогенов). Это возникает в случаях возрастного снижения уровня андрогенов (Ка1оу1ей, е1 а1., Ргоееебшдк оГ Ле 8ое1е1у Гог Ехрептеп1а1 Вю1оду & Меб1еше, 1990, 193(2): 129-35), а также в экстремальных случаях гормональной депривации, ассоциированной со способами лечения рака предстательной железы (Вегепбкеп, е1 а1., Еигореап 1оигпа1 оГ Рйагтаео1оду, 2001, 419(1): 47-54). Одна треть этих пациентов испытывает устойчивые и частые, достаточно тяжелые симптомы, вызывающие значительный дискомфорт и неудобство.
ССКР представляет собой сильный сосудорасширяющий агент, который вовлечен в патологию других вазомоторных симптомов, таких как все формы сосудистой головной боли, включая мигрени (с аурой или без нее) и кластерную головную боль. ЭиЛат, Ν. Епд1. 1. Меб. 350:1073-1075, 2004. Сывороточные уровни ССКР в наружной яремной вене повышаются у пациентов во время мигрени. СоабкЬу е1 а1., Апп. №ига1. 28:183-7, 1990. Внутривенное введение человеческого α-ССКР вызывало головную боль и мигрень у пациентов, страдающих мигренью без ауры, свидетельствуя о том, что ССКР является причиной мигрени. Ьаккеп е1 а1., СерНа1а1ща 22:54-61, 2002.
Возможное вовлечение ССКР в мигрень составляет основу для разработки и тестирования ряда соединений, ингибирующих высвобождение ССКР (например, суматриптан), оказывающих антагонистическое действие в отношении рецептора ССКР (например, дипептидное производное ΒΙΒΝ4096Β8 (Воегйппдег 1пде1йе1т); ССКР(8-37)), или взаимодействующих с одним или более чем одним из белков, ассоциированных с рецептором, таких как мембранный белок, модифицирующий рецепторную активность (КАМР), или белок-компонент рецептора (КСР), оба из которых влияют на связывание ССКР с его рецепторами. Β^а^η, 8. е1 а1., Тгепбк ш Р11агтаео1ощеа1 8е1епее8 23:51-53, 2002. Подтипы α-2 адренорецепторов и аденозиновых А1 рецепторов также контролируют (ингибируют) высвобождение ССКР и тригеминальную активацию (СоабкЬу е1 а1., Β^а^η 125:1392-401, 2002). Агонист аденозинового А1 рецептора СК79236 (метрафадил), который, как было продемонстрировано, ингибирует нейрогенное расширение кровеносных сосудов и тригеминальную ноцицепцию у людей, могут также обладать противомигренозной активностью (Аги1таш е1 а1., Серйа1а1д1а 25:1082-1090, 2005; ΟίΓΓίπ е1 а1., Серйа1а1д1а 23:287-292, 2003).
Эту теорию опровергает наблюдение того, что лечение соединениями, которые исключительно ингибируют нейрогенное воспаление (например, антагонисты тахикининового ΝΚ1 рецептора) или триге
- 1 015526 минальную активацию (например, агонисты рецептора 5НТШ). как продемонстрировано, относительно неэффективно в качестве способов лечения мигрени, приводя некоторых исследователей к вопросу о том, является ли ингибирование высвобождения ССКР первичным механизмом действия эффективных способов противомигренозного лечения. Ати1таш е! а1., Еиг. 1. Рйаттаео1. 500:315-330, 2004.
Мигрень представляет собой распространенное сложное неврологическое состояние, характеризующееся тяжелыми эпизодическими приступами головной боли и ассоциированными симптомами, которые могут включать тошноту, рвоту, чувствительность к свету, звукам или движению. У некоторых пациентов головной боли предшествует аура или сопровождает ее. Головная боль может быть тяжелой и также может быть односторонней у некоторых пациентов.
Приступы мигрени нарушают ежедневный образ жизни. В США и Западной Европе общая доля лиц, страдающих мигренью, составляет 11% от общей численности населения (6% мужчин; 15-18% женщин). Кроме того, средняя частота приступов у индивида составляет 1,5/месяц. Хотя существует множество способов лечения для уменьшения интенсивности или уменьшения симптомов, профилактическое лечение рекомендуется для пациентов, у которых в месяц случается более 3-4 приступов мигрени. СоабкЬу е! а1. Хеи Еи§1. 1. Меб. 346(4): 257-275, 2002.
Различные фармакологические способы вмешательства, которые используют для лечения мигрени, и различия в реакции среди пациентов представляют собой доказательство многообразной природы данного расстройства. Таким образом, такие относительно неизбирательные лекарства, как алкалоиды спорыньи (например, эрготамин, дигидроэрготамин, метисергид), которые проявляют серотонинергическую, а также адренергическую, норадренергическую и дофаминергическую активность, использовали в течение более восьми лет для лечения мигрени. Другие способы лечения включают опиаты (например, оксикодон) и Р-адренергические антагонисты (например, пропранолол). Некоторые пациенты, обычно пациенты, имеющие более слабые симптомы, способны контролировать свои симптомы с использованием лекарственных средств, отпускаемых без рецепта, таких как один или более чем один нестероидный противовоспалительный агент (Ν8ΑΙΌ), такой как комбинация аспирина, ацетаминофена и кофеина (например, Ехеебтш® Мщгаш).
Относительно недавно некоторых пациентов, страдающих мигренью, лечили топираматом, представляющим собой противосудорожное средство, блокирующее потенциалозависимые натриевые каналы и некоторые глутаматные рецепторы (АМРА-каинат), усиливающее активность рецептора А-типа γаминомасляной кислоты (САВА-А) и блокирующее карбоангидразу. Относительно недавний успех применения агонистов серотониновых рецепторов 5НТ-1В/Ш и/или 5НТ-1а, таких как суматриптан, у некоторых пациентов привел исследователей к предположению о серотонинергической этиологии этого расстройства. К сожалению, хотя у некоторых пациентов обнаруживалась хорошая реакция на лечение, другие оставались относительно резистентными к его действиям.
Выдвинуто предположение о том, что дисфункция ионного канала в аминергических ядрах ствола мозга лежит в основе этого расстройства, однако точная патофизиология мигрени пока хорошо не изучена. Продемонстрировано, что одна из форм мигрени, представляющая собой семейную гемиплегическую мигрень, ассоциирована с миссенс-мутациями в а1-субъединице потенциалозависимого кальциевого канала Р/О-типа, и весьма вероятно, что другие мутации ионного канала также могут быть обнаружены в других группах пациентов. Хотя расширение кровеносных сосудов ассоциировано с болевыми симптомами мигрени и усиливает их, такими как нейрососудистые явления, в настоящее время считают, что они представляют собой скорее результат, а не причину состояния. В целом дисфункцию путей ствола мозга, модулирующую сенсорный вход, рассматривают как общий признак мигрени. СоабкЬу, Р.1. е! а1., Хеи Епд1. 1. Меб. 346(4): 257-275, 2002.
В данной заявке на изобретение сделана ссылка на различные публикации (включая патенты и заявки на патенты). Описания этих публикаций включены здесь путем ссылки.
Краткое изложение сущности изобретения
Раскрытое здесь изобретение относится к антагонистическим антителам против ССКР и способам применения антагонистических антител против ССКР для лечения или профилактики вазомоторных симптомов, таких как головные боли, такие как мигрень с аурой или без нее, гемиплегическая мигрень, кластерные головные боли, мигренозная невралгия, хронические головные боли, головные боли напряжения и головные боли, возникающие в результате других медицинских состояний (таких как инфекция или повышенное черепное давление в результате опухоли). Другие вазомоторные симптомы включают приливы крови.
В одном из аспектов в настоящем изобретении предложен способ лечения или профилактики по меньшей мере одного вазомоторного симптома у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против ССКР.
В одном из аспектов в настоящем изобретении предложен способ лечения или профилактики головной боли (например, мигрени и кластерной головной боли) у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против ССКР.
В еще одном аспекте в изобретении предложен способ уменьшения интенсивности, контроля, сни
- 2 015526 жения частоты или сдерживания развития или прогрессирования головной боли (например, мигрени и кластерной головной боли) у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против СОРР.
В еще одном аспекте в изобретении предложены способы уменьшения интенсивности, контроля, снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования головной боли (например, мигрени и кластерной головной боли) у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против СОРР в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным агентом, полезным для лечения головной боли. Такие дополнительные агенты включают 5НТ (5-гидрокситриптамин)1-подобные агонисты (и агонисты, действующие в других сайтах 5-НТ1) и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (Ν8ΑΙΌ).
Примеры агонистов 5-НТ1, которые могут быть использованы в комбинации с антителом против СОРР, включают класс соединений, известных как триптаны, такие как суматриптан, золмитриптан, наратриптан, ризатриптан, элетриптан, алмотриптан и фроватриптан. Также известно, что алкалоиды спорыньи и родственные соединения обладают агонистической активностью в отношении 5-НТ и используются для лечения головной боли, такой как мигрень. К таким соединениям относятся эрготамина тартрат, эргоновина малеат и эрголоида мезилаты (например, дигидроэргокорнин, дигидроэргокристин, дигидроэргокриптин и дигидроэрготамина мезилат (ЭНЕ 45)).
Примеры Ν8ΑΙΌ, которые могут быть использованы в комбинации с антителом против СОРР, включают напроксен, флурбипрофен, кетопрофен, оксапрозин, этодолак, индометацин, кеторолак, набуметон, мефенамовая кислота и пироксикан. Дополнительные Ν8ΑΙΌ включают ингибиторы циклооксигеназы-2 (СОХ-2). Члены этой группы включают целекоксиб; рофекоксиб; мелоксикам; ТТЕ-522; Ь745,337; N8398 и их фармацевтически приемлемые соли.
В еще одном аспекте в изобретении предложен способ уменьшения интенсивности, контроля, снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования приливов крови у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против СОРР.
В еще одном аспекте в изобретении предложены способы уменьшения интенсивности, контроля, снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования приливов крови у индивида, включающие введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против СОРР в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным агентом, полезным для лечения приливов крови. Такие дополнительные агенты включают гормональное лечение, включая эстрогены и/или прогестины, но не ограничены ими.
В одном из воплощений антагонистическое антитело против СОРР, используемое в любом из вышеописанных способов, представляет собой любое из описанных здесь антител.
В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против СОРР распознает человеческий СОРР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против СОРР связывается с человеческим α-СОРР и β-СОРР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против СОРР связывается с человеческим и крысиным СОРР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против СОРР связывается с С-концевым фрагментом, имеющим аминокислоты 25-37 СОРР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против СОРР связывается с С-концевым эпитопом в пределах аминокислот 25-37 СОРР.
В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против СОРР представляет собой моноклональное антитело. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против СОРР является гуманизированным. В некоторых воплощениях антитело является человеческим. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против СОРР представляет собой антитело О1 (как здесь описано). В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против СОРР содержит один или более чем один гипервариабельный участок (СЭР) (например, один, два, три, четыре, пять или в некоторых воплощениях все шесть СЭР) антитела О1 или вариантов О1, представленных в табл. 6. В других воплощениях антагонистическое антитело против СОРР содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную на фиг. 5 (8ЕО ΙΌ N0: 1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную на фиг. 5 (8Е0 ΙΌ N0: 2).
В некоторых воплощениях антитело содержит модифицированную константную область, такую как константную область, являющуюся иммунологически инертной (включая частично иммунологически инертную), например, не запускающую лизис, опосредованный системой комплемента, не стимулирующую антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ЛЭСС), не активирующую микроглию или у которой одна или более чем одна из этих активностей снижена. В некоторых воплощениях константная область модифицирована, как описано в Еиг. 1. ^шииоЕ (1999) 29:2613-2624; международной заявке № РСТ/ОВ 99/01441 и/или заявке на патент Великобритании № 9809951.8. В других воплощениях антитело содержит константную область тяжелой цепи человеческого включающую следующие мутации: А330Р331 на 83308331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательность ^О2 дикого типа). Еиг. 1. Iттиηо1. (1999) 29:2613-2624. В некоторых воплощениях константная область тяжелой цепи антитела представляет собой тяжелую цепь человеческого !дС1 с любой из следующих
- 3 015526 мутаций:
1) А327А330Р331 на 632783308331;
2) Е233Ь234Ь2356236 на Р233У234А235 с делецией 6236;
3) Е233Ь234Ь235 на Р233У234А235;
4) Е233Ь234Ь2356236А327А330Р331 на Р233У234А235632783308331 с делецией 6236;
5) Е233Ь234Ь235А327А330Р331 на Р233У234А235632783308331 и
6) N297 на А297 или любую другую аминокислоту, за исключением N.
В некоторых воплощениях константная область тяжелой цепи антитела представляет собой тяжелую цепь человеческого 1д64 с любой из следующих мутаций: Е233Е234Ь2356236 на Р233У234А235 с делецией 6236; Е233Е234Ь235 на Р233У234А235 и 8228Ь235 на Р228Е235.
В других воплощениях константная область агликозилирована для Ν-связанного гликозилирования. В некоторых воплощениях константная область агликозилирована для Ν-связанного гликозилирования путем мутации остатка, по которому происходит присоединение олигосахарида (такого как А§п297) и/или фланкирующих остатков, которые представляют собой часть последовательности, распознающей Ν-гликозилирование, в константной области. В некоторых воплощениях константная область агликозилирована для Ν-связанного гликозилирования. Константная область может быть агликозилирована для Ν-связанного гликозилирования ферментативно или путем экспрессии в клетках-хозяевах, дефектных по гликозилированию.
Аффинность связывания (Кс) антагонистического антитела против С6ЯР в отношении С6ЯР (такого как человеческий а-С6ЯР, измеренная посредством поверхностно-плазмонного резонанса, при подходящей температуре, такой как 25 или 37°С) может составлять от приблизительно 0,02 до приблизительно 200 нМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания составляет приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500, приблизительно 100, приблизительно 60, приблизительно 50, приблизительно 20, приблизительно 15, приблизительно 10, приблизительно 5 или приблизительно 2 пМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 250, приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500, приблизительно 100 или приблизительно 50 пМ.
Антагонистическое антитело против С6КР может быть введено до, во время и/или после возникновения головной боли. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против С6КР вводят перед приступом головной боли (например, мигрени и кластерной головной боли). Введение антагонистического антитела против С6КР может быть осуществлено любым из способов, известных в данной области, включая пероральный, внутривенный, подкожный, внутриартериальный, внутримышечный, внутрисердечный, интраспинальный, внутригрудной, внутрибрюшинный, интравентрикулярный, подъязычный, трансдермальный способ, и/или путем ингаляции. Введение может быть системным, например внутривенным, или местным.
В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против С6ЯР может быть введено в комбинации с другим агентом, таким как другой агент для лечения головной боли.
В еще одном аспекте в изобретении предложено применение антагонистического антитела против С6КР для изготовления лекарственного средства для применения в любом из описанных здесь способов, например, для лечения или профилактики головной боли.
В еще одном аспекте в изобретении предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения головной боли (например, мигрени и кластерной головной боли), содержащая эффективное количество антагонистического антитела против С6КР в комбинации с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым эксципиентом.
В еще одном аспекте в изобретении предложен набор для применения в любом из описанных здесь способов. В некоторых воплощениях набор содержит контейнер, композицию, содержащую вышеописанное антагонистическое антитело против С6КР, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, и инструкции по применению композиции в любом из описанных здесь способов.
В настоящем изобретении также предложены антагонистические антитела против С6КР и полипептиды, имеющие происхождение из антитела 61 или его вариантов, представленных в табл. 6. Соответственно, в одном из аспектов изобретение представляет собой антитело 61 (взаимозаменяемым образом называемое 61), которое продуцируется экспрессирующими векторами, имеющими номера РТА-6866 и РТА-6867 в Американской коллекции типовых культур АТСС. Например, одно из воплощений представляет собой антитело, включающее тяжелую цепь, продуцируемую экспрессирующим вектором, имеющим номер РТА-6867 в АТСС. Еще один аспект представляет собой антитело, включающее легкую цепь, продуцируемую экспрессирующим вектором, имеющим номер РТА-6866 в АТСС. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи 61 показаны на фиг. 5. Фрагменты гипервариабельного участка (СЭЯ) антитела 61 (включающей СЭЯ Чотиа и Кабата) также показаны на фиг. 5. Понятно, что ссылка на любую часть или целую область 61 охватывает последовательности, продуцируемые экспрессирующими векторами, имеющими номера РТА-6866 и РТА-6867 в АТСС, и/или последовательности, представленные на фиг. 5. В изобретении также предложены варианты
- 4 015526 антитела 01 с аминокислотными последовательностями, представленными в табл. 6.
В одном из аспектов изобретение представляет собой антитело, включающее домен Ун, который по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичен по аминокислотной последовательности с 8Е0 ГО N0: 1.
В еще одном аспекте изобретение представляет собой антитело, включающее домен Уь, который по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичен по аминокислотной последовательности с 8Е0 ГО N0: 2.
В еще одном аспекте изобретение представляет собой антитело, включающее фрагмент или область антитела 01 или его вариантов, представленных в табл. 6. В одном из воплощений фрагмент представляет собой легкую цепь антитела 01. В еще одном воплощении фрагмент представляет собой тяжелую цепь антитела 01. В еще одном воплощении фрагмент содержит одну или более чем одну вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 01. В еще одном воплощении фрагмент содержит одну или более чем одну вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи, представленную на фиг. 5. В еще одном воплощении фрагмент содержит один или более чем один ΟΌΒ легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 01.
В еще одном аспекте в изобретении предложены полипептиды (которые могут представлять собой или не представлять собой антитело), включающие Ун 0ΌΒ3, как представлено в 8Е0 ГО N0: 5, или последовательность, которая отличается от 8Е0 ГО N0: 5 по 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотным заменам. В конкретном воплощении такие аминокислотные замены представляют собой консервативные замены.
В еще одном аспекте в изобретении предложены полипептиды (которые могут представлять собой или не представлять собой антитело), включающие Уь 0ΌΒ3, как представлено в 8Е0 ГО N0: 8, или последовательность, которая отличается от 8Е0 ГО N0: 8 по 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотным заменам. В конкретном воплощении такие аминокислотные замены представляют собой консервативные замены.
В еще одном аспекте изобретения предложены полипептиды (которые могут представлять собой антитело или могут не представлять собой антитело), включающие любой один или более чем один из следующих: а) один или более чем один ΟΌΒ антитела 01 или его вариантов, представленных в табл. 6; б) СЭВ Н3 тяжелой цепи антитела 01 или его вариантов, представленных в табл. 6; в) ΟΌΒ Ь3 легкой цепи антитела 01 или его вариантов, представленных в табл. 6; г) три ΟΌΒ легкой цепи антитела 01 или его вариантов, представленных в табл. 6; д) три ΟΌΒ тяжелой цепи антитела 01 или его вариантов, представленных в табл. 6; е) три ΟΌΒ легкой цепи и три СЭВ тяжелой цепи антитела 01 или его вариантов, представленных в табл. 6. В изобретении также предложены полипептиды (которые могут представлять собой антитело или могут не представлять собой антитело), включающие любой один или более чем один из следующих: а) один или более чем один (один, два, три, четыре, пять или шесть) ΟΌΒ, имеющих происхождение из антитела 01 или его вариантов, представленных в табл. 6; б) ΟΌΒ, имеющий происхождение из ΟΌΒ Н3 тяжелой цепи антитела 01; и/или в) ΟΌΒ, имеющий происхождение из СЭВ Ь3 легкой цепи антитела 01. В некоторых воплощениях ΟΌΒ представляет собой ΟΌΒ, представленный на фиг. 5. В некоторых воплощениях один или более чем один ΟΌΒ, имеющий происхождение из антитела 01 или его вариантов, представленных в табл. 6, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 86%, по меньшей мере приблизительно на 87%, по меньшей мере приблизительно на 88%, по меньшей мере приблизительно на 89%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98%, или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичен по меньшей мере одному, по меньшей мере двум, по меньшей мере трем, по меньшей мере четырем, по меньшей мере пяти или по меньшей мере шести ΟΌΒ 01 или его вариантов.
В некоторых воплощениях ΟΌΒ представляет собой СЭВ Кабата. В других воплощениях СЭВ представляет собой ΟΌΒ Чотиа. В других воплощениях СЭВ представляет собой комбинацию ΟΌΒ Кабата и Чотиа (также называемую комбинированный ΟΌΒ или расширенный СЭВ). Другими словами, для любого из данных воплощений, содержащих более чем один ΟΌΒ, ΟΌΒ может представлять собой любой из ΟΌΒ Кабата, Чотиа и/или комбинированный.
В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) содержит аминокислотную последовательность КА8КХааУХааТУУ8, где Хаа в положении 5 представляет собой В, ^, 0, Ь или N и где Хаа в положении 7 представляет собой Т, А, Ό, 0, В, 8, или V. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность КА8КХааУХааТУУ8 представляет собой 0ΌΒ1 легкой цепи антитела.
В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) содержит аминокислотную последова
- 5 015526 тельность ХааХааЗИКУХаа, где Хаа в положении 1 представляет собой С или А; где Хаа в положении 2 представляет собой А или Н; и где Хаа в положении 7 представляет собой Ь, Т, I или З. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность ХааХааЗИКУХаа представляет собой ί.ΌΡ2 легкой цепи антитела.
В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) содержит аминокислотную последовательность Е1КЗХааЗОХааХааАТХааУАХааАУ1<С. где Хаа в положении 5 представляет собой Е, К, К, Р или Ν; где Хаа в положении 8 представляет собой А, С, Ν, Е, Н, З, Ь, К, С, Ε, Υ, V, Ό или Р; где Хаа в положении 9 представляет собой З, С, Т, Υ, С, Е, Ь, А, Ρ, I, Ν, К, V, Ό или М; где Хаа в положении 12 представляет собой Н или Ε; где Хаа в положении 15 представляет собой Е или Ό. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность ΕIЯЗXааЗ^XааXааАТXааΥАXааАVКС представляет собой СЭК2 тяжелой цепи антитела.
В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) содержит аминокислотную последовательность ЗЕР ΙΌ N0: 1, где аминокислотный остаток в положении 99 ЗЕР ΙΌ N0: 1 представляет собой Ь или замещен на А, Ν, З, Т, V или К; и где аминокислотный остаток в положении 100 в ЗЕр ΙΌ N0: 1 представляет собой А или замещен на Ь, К, З, V, Υ, С, С, Т, К или Р.
В некоторых воплощениях антитело по изобретению представляет собой человеческое антитело. В других воплощениях антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых воплощениях антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых воплощениях антитело (или полипептид) является выделенным. В некоторых воплощениях антитело (или полипептид) является, по существу, чистым.
Константная область тяжелой цепи антител может иметь любой из типов константной области, такой как 1дС, 1дМ, Ι§Ό, 1дА и 1дЕ; и любой изотип, такиой как 1дС1, 1§С2, 1§С3 и 1§С4.
В некоторых воплощениях антитело содержит модифицированную константную область, описанную здесь.
В еще одном аспекте в изобретении предложен полинуклеотид (который может быть выделен), включающий полинуклеотид, кодирующий фрагмент или область антитела С1, или его варианты, представленные в табл. 6. В одном из воплощений фрагмент представляет собой легкую цепь антитела С1. В еще одном воплощении фрагмент представляет собой тяжелую цепь антитела С1. В еще одном воплощении фрагмент содержит одну или более чем одну вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела С1. В еще одном воплощении фрагмент содержит один или более чем один (т.е. один, два, три, четыре, пять или шесть) гипервариабельный участок (СОК) легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела С1.
В еще одном аспекте изобретение представляет собой полинуклеотид (который может быть выделен), включающий полинуклеотид, кодирующий антитело С1 или его варианты, представленные в табл. 6. В некоторых воплощениях полинуклеотид включает любой или оба полинуклеотида, представленные в ЗЕр ΙΌ N0: 9 и ЗЕр ΙΌ N0: 10.
В еще одном аспекте в изобретении предложены полинуклеотиды, кодирующие любое из описанных здесь антител (включая фрагменты антител) или полипептидов.
В еще одном аспекте в изобретении предложены векторы (включая экспрессирующие и клонирующие векторы) и клетки-хозяева, включающие любые из раскрытых здесь полинуклеотидов. В некоторых воплощениях вектор представляет собой рОЬ.С’СКР.йЕсСЕ имеющий № РТА-6867 АТСС. В других воплощениях вектор представляет собой рЕЬ.ССКР.ЬКСф имеющий № РТА-6866 АТСС.
В еще одном аспекте изобретение представляет собой клетку-хозяина, включающую полинуклеотид, кодирующий любое из описанных здесь антител.
В еще одном аспекте изобретение представляет собой комплекс ССКР, связанного с любыми описанными здесь антителами или полипептидами. В некоторых воплощениях антитело представляет собой антитело С1 или его варианты, представленные в табл. 6.
В еще одном аспекте изобретение представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество любого из описанных здесь полипептидов (включая антитела, такие как антитело, включающее один или более чем один СОК антитела С1) или полинуклеотидов и фармацевтически приемлемый эксципиент.
В еще одном аспекте изобретение представляет собой способ получения антитела С1, включающий культивирование клетки-хозяина или ее потомства в условиях, которые обеспечивают продуцирование антитела С1, где клетка-хозяин содержит экспрессирующий вектор, кодирующий антитело С1; и в некоторых воплощениях очистку антитела С1. В некоторых воплощениях экспрессирующий вектор включает одну или обе полинуклеотидные последовательности, представленные в ЗЕр ΙΌ N0: 9 и ЗЕр ΙΌ N0: 10.
В еще одном аспекте в изобретении предложены способы получения любого из описанных здесь антител или полипептидов путем экспрессии одного или более чем одного полинуклеотида, кодирующего антитело (которые могут быть экспрессированы раздельно в виде одной легкой или тяжелой цепи, или легкая и тяжелая цепь, обе, экспрессируются с одного вектора) или полипептид в подходящей клетке, как правило, с последующим извлечением и/или выделением интересующего антитела или полипептида.
Антагонистическое антитело против ССКР и полипептиды, а также полинуклеотиды, кодирующие
- 6 015526 антитела и полипептиды по настоящему изобретению, могут быть использованы для лечения, профилактики, уменьшения интенсивности, контроля или снижения частоты заболеваний, ассоциированных с аномальной функцией ССКР, таких как головная боль (например, мигрень, кластерная головная боль, хроническая головная боль и головная боль напряжения) и другие состояния, которые можно лечить или предупреждать посредством антагонистической активности в отношении ССКР.
В еще одном аспекте в изобретении предложены наборы и композиции, содержащие любую одну или более чем одну из описанных здесь композиций. Эти наборы, как правило, находящиеся в подходящей упаковке и снабженные подходящими инструкциями, полезны для любых из описанных здесь способов.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлена таблица, демонстрирующая аффинности связывания 12 мышиных антител в отношении различных аланинзамещенных фрагментов человеческих α-ССКР. Аффинности связывания измеряли при 25°С с использованием В1асоге при помощи потока РаЬ через ССКР на чипе. Значения в рамке представляют потерю аффинности аланиновых мутантов по отношению к родительскому фрагменту 25-37 (курсив) за исключением К35А, который получен из родительского 19-37. а означает аффинности в отношении фрагментов 19-37 и 25-37 и представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение для двух независимых измерений на различных сенсорных чипах. Ь означает данные взаимодействия, отклоняющиеся от модели простого бимолекулярного взаимодействия из-за бифазного аномального режима, так что их аффинности определяли с использованием модели конформационного изменения. Шкала полутонов: белый (1,0) означает родительскую аффинность; светло-серый (менее чем 0,5) означает более высокую аффинность по сравнению с родительской; темно-серый (более 2) означает более низкую аффинность по сравнению с родительской и черный означает отсутствие связывания.
На фиг. 2А и 2В показан эффект введения ССКР 8-37 (400 нмоль/кг), антитело 4901 (25 мг/кг) и антитело 7Ό11 (25 мг/кг) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с. ССКР 8-37 вводили внутривенно (в.в.) за 3-5 мин до стимуляции электрическим импульсом. Антитела вводили внутрибрюшинно (в.б.) за 72 ч до стимуляции электрическим импульсом. Каждая точка на графиках представляет собой площадь под кривой (АИС) для крысы, которую лечили в указанных условиях. Каждая линия на графиках представляет собой среднюю АИС для крыс, которых лечили в указанных условиях. АИС (площадь под кривой) равна Дпоток х Двремя. Дпоток представляет собой изменение единиц потока после стимуляции электрическим импульсом; и Двремя представляет собой период времени для уровня потока клеток крови для возвращения к уровню до стимуляции электрическим импульсом.
На фиг. 3 показан эффект введения различных доз антитела 4901 (25, 5, 2,5 или 1 мг/кг) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с. Антитела вводили внутривенно (в. в.) за 24 ч до стимуляции электрическим импульсом. Каждая точка на графике представляет собой АИС для одной крысы, которую лечили в указанных условиях. Линия на графике представляет собой среднюю АИС для крыс, которых лечили в указанных условиях.
На фиг. 4А и 4В показан эффект введения антитела 4901 (1 или 10 мг/кг, в.в.), антитела 7Е9 (10 мг/кг, в.в.) и антитела 8В6 (10 мг/кг, в.в.) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с. Антитела вводили внутривенно (в.в.) с последующей стимуляцией электрическим импульсом через 30, 60, 90 и 120 мин после введения антитела. Ось Υ представляет процент АИС по сравнению с уровнем АИС без введения антитела (время 0). Ось X представляет период времени (минуты) между введением антител и стимуляцией электрическим импульсом. * означает Р<0,05 и ** означает Р<0,01 по сравнению со временем 0. Данные анализировали с использованием одностороннего АЫОУА и теста множественных сравнений Даннета.
На фиг. 5 представлена аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (8ЕО Ш N0: 1) и вариабельной области легкой цепи (8ЕО Ш N0: 2) антитела С1. СЭК Кабата выделены жирным шрифтом, а СЭК Чотиа подчеркнуты. Аминокислотные остатки вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи пронумерованы последовательно.
На фиг. 6 представлено картирование эпитопа антитела С1 посредством пептидной конкуренции с использованием В1асоге. Ν-Биотинилированный человеческий α-ССКР прикрепляли к сенсорному чипу 8А. С1 РаЬ (50 нМ) в отсутствие конкурентного пептида или после предварительной инкубации в течение 1 ч с 10 мкМ конкурентного пептида пропускали через чип. Измеряли связывание С1 РаЬ с человеческим α-ССКР на чипе. Ось Υ представляет процент связывания, блокируемого вследствие присутствия конкурирующего пептида, по сравнению со связыванием в отсутствие конкурирующего пептида.
На фиг. 7 показан эффект введения антитела С1 (1 или 10 мг/кг, в.в.) или разбавителя (забуференного фосфатом физиологического раствора (РВ8), 0,01% Т\гееп 20) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с. Антитело С1 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) с последующей стимуляцией нерва электрическим импульсом через 30, 60, 90 и 120 мин после введения антитела. Ось Υ представляет процент АИС по сравнению с уровнем АИС без введения антитела или разбавителя (определенного как 100%) (время 0). Ось X пред
- 7 015526 ставляет период времени (минуты) между введением антитела и стимуляцией электрическим импульсом. * означает Р<0,05 и ** означает Р<0,01 по сравнению с разбавителем. Данные анализировали с использованием двухстороннего ΑΝΟνΑ и апостериорного теста Бонферрони.
На фиг. 8А показан эффект введения антитела С1 (1, 3 или 10 мг/кг, в.в.) или разбавителя (РВ8, 0,01% Тетееп 20) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с через 24 ч после введения дозы. Антитело С1 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) за 24 ч до стимуляции нерва электрическим импульсом. Ось Υ представляет общую площадь под кривой (изменение потока клеток крови, умноженное на изменение времени от стимуляции до возвращения потока до базового уровня, АИС). Ось X представляет различные дозы антитела 01. * означает Р<0,05 и ** означает Р<0,01 по сравнению с разбавителем. Данные анализировали с использованием одностороннего ΑΝΟνΑ и теста множественного сравнения Данна.
На фиг. 8В показан эффект введения антитела 01 (0,3, 1, 3 или 10 мг/кг, в.в.) или разбавителя (РВ8, 0,01% Тетееи 20) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с через 7 суток после введения дозы. Антитело 01 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) за 7 суток до стимуляции нерва электрическим импульсом. Ось Υ представляет общую АИС. Ось X представляет различные дозы антитела 01. ** означает Р<0,01 и *** означает Р<0,001 по сравнению с разбавителем. Данные анализировали с использованием одностороннего ΑΝΟνΑ и теста множественного сравнения Данна.
На фиг. 8С представлен анализ подгонки кривой с данными из фиг. 8А и 8В. Антитело 01 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) за 24 ч или 7 суток до стимуляции нерва электрическим импульсом. Ось Υ представляет общую АИС. Ось X представляет различные дозы антитела 01 в мг/кг в логарифмической шкале для определения средней эффективной концентрации ЕС50.
На фиг. 9 показан эффект антитела ти7Е9 (10 мг/кг), ΒΙΒΝ4096Β8 или разбавителя (РВ8, 0,01% Тетееи 20) на изменение диаметра средней менингеальной артерии после стимуляции электрическим полем. Антитело ти7Е9, ΒΙΒΝ4096Β8 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) в момент времени 0 мин после оценки базового ответа на электрическую стимуляцию. Ось Υ представляет изменение диаметра средней менингеальной артерии после стимуляции электрическим полем. Диаметр в свободном состоянии соответствует 0%. Ось X представляет время (минуты) стимуляции электрическим импульсом. * означает Р<0,05 и ** означает Р<0,01 по сравнению с разбавителем. Данные анализировали с использованием одностороннего ΑΝΟνΑ и теста множественного сравнения Даннета.
На фиг. 10 показан эффект различных доз антитела 01 (1, 3 или 10 мг/кг, в. в.) или разбавителя (ΡΒ8, 0,01% Тетееи 20) на изменение диаметра средней менингеальной артерии после стимуляции электрическим полем. Антитело 01 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) за 7 суток до стимуляции электрическим полем. Ось Υ представляет изменение диаметра средней менингеальной артерии. Диаметр в спокойном состоянии соответствует 0%. Ось X представляет стимулирующее напряжение. * означает Р<0,05, ** означает Р<0,01 и *** означает Р<0,001 по сравнению с разбавителем. Данные анализировали с использованием двухстороннего ΑΝΟνΑ и апостериорного теста Бонферрони.
На фиг. 11А показан эффект антитела ти4901 (10 мг/кг) или разбавителя (ΡΒ8, 0,01% Т\тееп 20), введенного внутривенно (в.в.) за 24 ч, на уменьшение внутренней температуры, вызванное подкожной инъекцией налоксона (1 мг/кг) у крыс, страдающих зависимостью от морфина. Ось Υ представляет разницу температур, исходя из базового значения. Ось X представляет время, измеренное с момента инъекции налоксона.
На фиг. 11В показан эффект антитела ти4901 (10 мг/кг) или разбавителя (ΡΒ8, 0,01% Т\тееп 20), введенного внутривенно (в.в.) за 24 ч, на увеличение поверхностной температуры хвоста, вызванное подкожной инъекцией налоксона (1 мг/кг) у крыс, страдающих зависимостью от морфина. Ось Υ представляет разницу температур, исходя из базового значения. Ось X представляет время, измеренное с момента инъекции налоксона.
Подробное описание изобретения
В раскрытом здесь изобретении предложены способы лечения и/или профилактики вазомоторных симптомов, таких как головная боль (например, мигрень, кластерная головная боль, хроническая головная боль и головная боль напряжения) или прилив крови, у индивида путем введения указанному индивиду терапевтически эффективного количества антагонистического антитела против С0КР.
В раскрытом здесь изобретении также предложены антагонистические антитела против С0КР и полипептиды, имеющие происхождение из 01, или его варианты, представленные в табл. 6. В изобретении также предложены способы получения и применения этих антител и полипептидов.
Общие способы.
При практическом применении настоящего изобретения, если не указано иначе, используют общепринятые способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные технологии), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах знаний специалиста в данной области техники. Такие способы полностью описаны в литературе, такой как Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога(оту Мапиа1, кесопб ебйюп (8атЬтоок е( а1., 1989) Со14 8ртшд НагЬог Ргекк; 011допие1ео(1б 8уп(йек1к (МТ 0ай, еб., 1984); МеШобк ίη Мо1еси1аг Е^оду. Нитапа Ргекк; Се11 ЕЫоду: А ЬаЬота(огу №1еЬоок (ТЕ. Се1
- 8 015526
118, ей., 1998) Леайеш1с Ргекк; Ашта1 Се11 СиНиге (К.1. Ргеккпеу, ей., 1987); 1п1гойисйоп 1о Се11 апй Т1ккие СиНиге (1.Р. Ма!кег апй Р.Е. КоЬейк, 1998) Р1епит Ргекк; Се11 апй Т1ккие СиИше: ЬаЬога1огу Ргосейигек (А. Ооу1е. РВ. Сг1ГП(Нк. и И.С. №\\ό11, ейк., 1993-1998) 1. \Уйеу апй 8опк; Ме!койк ш Епхушо1оду (Асайетк Ргекк, 1пс.); НапйЬоок оГ Ехрептеп!а1 1ттипо1оду (И.М. \Уек апй СС. В1аск^е11, ейк.); Сепе ТгапкГег Уес1огк Гог МаттаИап Се11к (1.М. М111ег апй М.Р. Са1ок, ейк., 1987); Сиггеп! 'Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (Р.М. АикиЬе1 е! а1., ейк., 1987); РСК: Тке Ро1утегаке Скат Кеасйоп, (МиШк е! а1., ейк., 1994); Сиггеп! Рго1осо1к ш 1ттипо1оду (РЕ. Сокдап е! а1., ейк., 1991); 8ког1 Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (\Уйеу апй 8опк, 1999); 1ттипоЫо1оду (С.А. 1апе\уау апй Р. Тгауегк, 1997); Ап!1Ьой1ек (Р. Ршск, 1997); АпИЬой1ек: а ргасйса1 арргоаск (Ό. Сайу., ей., 1КЬ Ргекк, 1988-1989); Мопос1опа1 ап!1Ьой1ек: а ргасйса1 арргоаск (Р. 8керкегй апй С Иеап, ейк., ОхГогй Ишуегкйу Ргекк, 2000); Икшд ап!1Ьой1ек: а 1аЬога!огу тапиа1 (Е. Наг1оте апй И. Ьапе (Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1999); Тке Ап!1Ьой1ек (М. ΖηικΙΙί и ΡΌ. Сарга, ейк., Напгоой Асайетк РиЬкккегк, 1995).
Определения.
Антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и так далее, по меньшей мере через один сайт распознавания антигена, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Использованный здесь термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, а также их фрагменты (такие как РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, Ру), одну цепь (8сРу), их мутанты, слитые белки, включающие фрагмент антитела (такие как доменные антитела), и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, включающую сайт распознавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, такое как 1дС, 1дА или 1дМ (или их подкласс), и антитело не обязательно должно принадлежать к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела, иммуноглобулины можно отнести к различным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов 1дА, 1дИ, 1дЕ, 1дС и 1дМ, и некоторые из них дополнительно могут быть разделены на подклассы (изотипы), например 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА1 и 1дА2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, названы α, δ, ε, γ и μ соответственно. Хорошо известны структуры и трехмерные конфигурации субъединиц различных классов иммуноглобулинов.
Использованный здесь термин моноклональное антитело относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела, включающие популяцию, идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут быть представлены в минорных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны, направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность препаратам поликлонального антитела, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. Определение моноклональное указывает на природу антитела, получаемого, по существу, из гомогенной популяции антител, и не должен рассматриваться как требующий, чтобы антитела были получены каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены гибридомным способом, впервые описанным Кок1ег апй Мйк!ет, 1975, Ыа!иге, 256:495, или могут быть получены способами рекомбинантной ДНК, такими как описано в патенте США № 4816567. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек, создаваемых с использованием способов, описанных, например, в МсСаГГейу е! а1., 1990, №1!иге, 348:552-554.
Используемые здесь гуманизированные антитела относятся к формам антител, не являющихся человеческими (например, мышиным), представляющим собой специфические химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Ру, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2 или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, имеющую происхождение из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Большей частью гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельного участка (СИК) реципиента замещены остатками СИК видов, не являющихся человеческими (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, обладающие желаемой специфичностью, аффинностью и биологической активностью. В некоторых случаях остатки каркасной области Ру (РК) человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Кроме того, гуманизированное антитело может включать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентном антителе, ни в последовательностях донорного СИК или каркасной области, а включены для дополнительного улучшения и оптимизации функции антитела. Как правило, гуманизированное антитело включает, по существу, все по меньшей мере из одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все области СИК соответствуют областям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все области РК представляют собой области консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело оптимально также включает, по меньшей мере, фрагмент константной области или домен (Рс) иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Антитела могут иметь Рс-области, модифи
- 9 015526 цированные, как описано в №0 99/58572. Другие формы гуманизированных антител имеют один или более чем один СЭК (один, два, три, четыре, пять, шесть), которые изменены относительно исходного антитела, которые также названы как один или более чем один СОК, имеющий происхождение из одного или более чем одного СОК. исходного антитела.
Используемое здесь человеческое антитело означает антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или полученного с использованием любого из способов получения человеческих антител, известных в данной области техники или раскрытых здесь. Это определение человеческого антитела включает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или по меньшей мере один полипептид легкой цепи человеческого иммуноглобулина. Один из таких примеров представляет собой антитело, включающее полипептиды легкой цепи мышиного антитела и полипептиды тяжелой цепи человеческого антитела. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных способов, известных в данной области техники. В одном из воплощений человеческое антитело выбрано из фаговой библиотеки, экспрессирующей человеческие антитела (Уаидйап е! а1., 1996, Иа1иге Вю!есйпо1оду, 14:309-314; 8йее1х е! а1., 1998, ΡΝΆ8, (И8А) 95:6157-6162; НоодепЬоот апй №1Шег, 1991, 1. Мо1. Вю1., 227:381; Магкх е! а1., 1991, 1. Мо1. Вю1., 222:581). Человеческие антитела также могут быть получены путем введения локуса человеческого иммуноглобулина трансгенным животным, например мышам, в которых гены эндогенных иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. Этот подход описан в патентах США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016. Альтернативно, человеческое антитело может быть получено путем иммортализации человеческих В-лимфоцитов, которые продуцируют антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты могут быть выделены у индивидуума или могут быть иммунизированы ίη уйго). См., например, Со1е е! а1., Мопос1опа1 ап!1Ьой1е§ апй Сапсег Тйегару, А1ап К. Ыхх. р. 77 (1985); Воегпег е! а1., 1991, 1. 1ттипо1, 147 (1):86-95 и патент США № 5750373.
Использованный здесь термин пептид, связанный с геном кальцитонина и СОКР относится к любой форме пептида, связанного с геном кальцитонина, и его вариантам, которые сохраняют по меньшей мере часть активности СОКР. Например, СОКР может представлять собой α-СОКР или β-СОКР. Использованный здесь СОКР включает все виды нативной последовательности СОКР млекопитающих, например человека, собаки, кошки, лошади и быка.
Использованный здесь термин антагонистическое антитело против СОКР (взаимозаменяемым образом называемое антитело против СОКР) относится к антителу, способному связываться с СОКР и ингибировать биологическую активность СОКР и/или последующий(ие) сигнальный(ые) путь(и), опосредованный(ые) СОКР. Антагонистическое антитело против СОКР охватывает антитела, которые блокируют, оказывают антагонистическое действие, подавляют или уменьшают (в том числе существенно) биологическую активность СОКР, включая последующие сигнальные пути, опосредованные СОКР, такие как связывание рецептора и/или индуцирование клеточного ответа на СОКР. Для задач настоящего изобретения понятно, что термин антагонистическое антитело против СОКР охватывает все ранее идентифицированные термины, наименования и функциональные состояния и характеристики, посредством которых сам СОКР, биологическая активность СОКР (включая его способность опосредовать любые виды головной боли, но не ограниченные ею) или проявления биологической активности, по существу, сводятся к нулю, уменьшаются или нейтрализуются в любой значимой степени. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против СОКР связывает СОКР и предотвращает связывание СОКР с рецептором СОКР. В других воплощениях антитело против СОКР связывает СОКР и предотвращает активацию рецептора СОКР. Здесь приведены примеры антагонистических антител против СОКР.
Используемые здесь термины О1 и антитело О1 используют взаимозаменяемым образом для ссылки на антитело, продуцируемое экспрессирующими векторами, имеющими номера РТА-6867 АТСС и РТА-6866 АТСС. Аминокислотная последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи представлена на фиг. 5. Фрагменты СЭК антитела О1 (включая СЭК Чотиа и Кабата) схематически показаны на фиг. 5. Полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепи, представлены в 8Е0 ГО N0: 9 и 8Е0 ГО N0: 10. Характеристика О1 описана в примерах.
Термины полипептид, олигопептид, пептид и белок используют здесь взаимозаменяемым образом для ссылки на полимеры аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, может включать модифицированные аминокислоты и может быть прерван фрагментами, не являющимися аминокислотами. Эти термины также охватывают аминокислотный полимер, модифицированный естественным путем или путем вмешательства; например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидизация, ацетилирование, фосфорилирование или любая другая манипуляция или модификация, такая как конъюгирование с метящим компонентом. Также в определение включены, например, полипептиды, содержащие один или более чем один аналог аминокислоты (включающий, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области техники. Следует понимать, что поскольку полипептиды по изобретению основаны на антителе, данные полипептиды могут существовать в виде единичных цепей или ассоциированных цепей.
- 10 015526
Используемые здесь взаимозаменяемым образом полинуклеотид или нуклеиновая кислота относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания и/или их аналоги или любой субстрат, который может быть включен в полимер посредством ДНК- или РНК-полимеразы. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если присутствует модификация нуклеотидной структуры, она может быть произведена перед или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, таким образом как конъюгирование с метящим компонентом. Другие типы модификаций включают, например, кэпы, замещение одного или более чем одного из встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации незаряженными связями (например метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т.д.) и заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), содержащие боковые группировки, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-Ь-лизин и т.д.), со вставками (например, акридин, псорален и т.д.), содержащие хелатообразователи (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), содержащие алкилаторы, с модифицированными связями (например, α-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть замещена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами, или активирована с получением дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или может быть конъюгирована с твердыми носителями. 5'- и З'-концевая группа ОН может быть фосфорилирована или замещена аминами или органическими кэпирующими группировками из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть преобразованы до стандартных защитных групп. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы рибозных или дезоксирибозных сахаров, которые в общем известны в данной области техники, включая, например, 2'-О-метил-, 2'-О-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидорибозу, карбоциклические аналоги сахаров, αаномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и неосновные нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одна или более чем одна фосфодиэфирная связь может быть замещена альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают воплощения, в которых фосфат замещен на Р(О)8 (тиоат), Р(8)8 (дитиоат), (Ο)ΝΚ2 (амидат), Р(О)К, Р(О)ОК, СО или СН2 (формацеталь), в которых каждый К или К' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С), возможно содержащий эфирную (-О-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил, но не ограничены ими. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предшествующее описание применимо ко всем упомянутым здесь полинуклеотидам, включая РНК и ДНК.
Вариабельная область антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, одной или в комбинации. Вариабельные области каждой из тяжелой и легкой цепей состоят из четырех каркасных областей (ЕК), связанных тремя областями, определяющими комплементарность (СЭК), также известными как гипервариабельные участки. СЭК в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости посредством ЕК и вместе с СЭК другой цепи вносят вклад в формирование антигенсвязывающего сайта антител. Существуют по меньшей мере два способа определения СЭК: (1) подход, основанный на вариабельности последовательности между видами (т.е. КаЬа! с1 а1. Бсциспссх о£ Рго1еш8 о£ 1ттипо1од1са1 1п1сгск1 (5(Н еб., 1991, Ναΐίοηαΐ ΙηΜίΙιιΚδ о£ Неа11й, Ве111С5ба ΜΌ)); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антигенантитело (Л1-1а/|каш е1 а1. (1997) 1. Мо1ес. Вю1. 273:927-948)). Использованный здесь СОК может относиться к СЭК, определенному любым из подходов или комбинацией обоих подходов.
Константная область антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, одной или в комбинации.
Эпитоп, который предпочтительно связывается или специфически связывается (используют здесь взаимозаменяемым образом) с антителом или полипептидом, представляет собой термин, хорошо понятный в данной области техники, и способы определения такого специфического или предпочтительного связывания хорошо известны в данной области техники. Считают, что молекула демонстрирует специфическое связывание или предпочтительное связывание, если она взаимодействует или ассоциирует чаще, быстрее, с большей продолжительностью и/или большей аффинностью с конкретной клеткой или веществом по сравнению с альтернативными клетками или веществами. Антитело специфически связывается или предпочтительно связывается с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью по сравнению с его связыванием с другими веществами. Например, антитело, которое специфически или предпочтительно связывается с эпитопом СОКР, представляет собой антитело, которое связывается с этим эпитопом с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью по сравнению с его связыванием с
- 11 015526 другими эпитопами ССКР или эпитопами, отличающимися от эпитопов ССКР. При прочтении этого описания также должно быть понятно, что, например, антитело (или группировка или эпитоп), которое специфически или предпочтительно связывается с первой мишенью, может специфически или неспецифически или предпочтительно связываться со второй мишенью. Само по себе специфическое связывание или предпочтительное связывание не обязательно требует (хотя может включать) исключительное связывание. Как правило, но не обязательно, ссылка на связывание означает предпочтительное связывание.
Использованный здесь по существу чистый относится к веществу, которое по меньшей мере на 50% является чистым (то есть не содержит примесей), более предпочтительно по меньшей мере на 90% является чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 95% является чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 98% является чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 99% является чистым.
Клетка-хозяин включает индивидуальную клетку или культуру клеток, которая может представлять собой или представляет собой реципиент для вектора(ов) для включения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и это потомство не обязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или по комплементарности геномной ДНК) исходной родительской клетке вследствие природной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные ίη νίνο полинуклеотидом(ами) по изобретению.
Термин Тс-область используют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. Тс-область может представлять собой Тс-область нативной последовательности или Тс-область варианта. Хотя связи Тс-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Тс-область тяжелой цепи человеческого 1дС обычно определяют как продолжающуюся от аминокислотного остатка в положении Сук226 или от Рго230 до его карбоксильного конца. Нумерация остатков в Тс-области представляет собой нумерацию как в европейском индексе (ЕЙ) в соответствии с КаЬа!. КаЬа! е! а1., 8ес.|иепсе5 о£ РгоЮпъ о£ 1типо1од1са1 1п1сгс51. 5ΐΗ Ей. РиЬйс НеаНН Зстсс. Ναΐίοηαΐ ΙηκίίΙυίοκ о£ НеаНН, ВеШекйа, Мй., 1991. Тс-область имммуноглобулина, как правило, включает два константных домена: СН2 и СН3.
Использованный здесь Тс-рецептор и ТсК описывает рецептор, который связывается с Тсобластью антитела. Предпочтительный ТсК представляет собой нативную последовательность человеческого ТсК. Кроме того, предпочтительный ТсК представляет собой рецептор, который связывается с антителом 1дС (γ-рецептор), и включает рецепторы подклассов ТсуК!, ТсуКИ и ТсуКШ, включая аллельные варианты и формы, возникающие в результате альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы ТсуКИ включают ТсуКЛА (активирующий рецептор) и ТсуКПВ (ингибирующий рецептор), имеющие сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются в основном по их цитоплазматическим доменам. Обзор ТсК приведен в КатеГОН апй Ктс1, 1991, Апп. Кет. 1ттипо1., 9:457-92; Саре1 с! а1., 1994, 1ттипотеШоЙ8, 4:25-34; и йе Наак е! а1., 1995, 1. ЬаЬ. С1ш. Мей., 126:330-41. ТсК также включает неонатальный рецептор ТсКп, который ответственен за перенос материнских 1дС эмбриону (Оиует е! а1., 1976, 1. 1ттипо1., 117:587; и К1т е! а1., 1994, 1. 1ттипо1., 24:249).
Комплементзависимая цитотоксичность и СЭС относятся к лизису мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (С1с.|) с молекулой (например, антителом), находящейся в комплексе с когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть осуществлен анализ СЭС, например, как описано Саххапо-8ап1ого е! а1., 1. 1ттипо1. МеШойк, 202:163 (1996).
Функциональная Тс-область обладает по меньшей мере одной эффекторной функцией Тс-области нативной последовательности. Примеры эффекторных функций включают связывание С1с.|; комплементзависимую цитотоксичность (СЭС); связывание с Тс-рецептором; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЭСС); фагоцитоз; отрицательную негативную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток; ВСК) и так далее. Для таких эффекторных функций, как правило, требуется, чтобы Тс-область была объединена со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и она может быть оценена с использованием различных анализов, известных в данной области техники для оценки таких эффекторных функций антитела.
Тс-область нативной последовательности включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Тс-области, обнаруживаемой в природе. Вариант Тсобласти включает аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Тс-области модификацией по меньшей мере одной аминокислоты, но в то же время сохраняет по меньшей мере одну эффекторную функцию Тс-области нативной последовательности. Предпочтительно вариант Тс-области имеет замену по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с Тсобластью нативной последовательности или с Тс-областью родительского полипептида, например приблизительно от одной до десяти замен аминокислот и предпочтительно приблизительно от одной до пяти замен аминокислот в Тс-области нативной последовательности или в Тс-области родительского полипептида. Вариант Тс-области здесь предпочтительно обладает по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности с Тс-областью нативной последовательности и/или с Тс-областью роди
- 12 015526 тельского полипептида и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с Ес-областью нативной последовательности и/или с Ес-областью родительского полипептида.
Используемая здесь антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность и ЛИСС относится к клеточноопосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Ес-рецепторы (ЕсВ) (например, клетки натуральные киллеры (ΝΚ), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис этой клеткимишени. Активность АИСС интересующей молекулы может быть оценена с использованием анализа АИСС ίη νΐίτο, такого как описано в патенте США № 5500362 или 5821337. Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и клетки ΝΚ. Альтернативно или дополнительно, активность АИСС интересующей молекулы может быть оценена ш νίνο, например, в животной модели, такой как раскрыто в Эупек с1 а1., 1998, ΡΝΑ8 (И8А), 95:652-656.
Использованный здесь термин лечение представляет собой подход для достижения благоприятных или желаемых клинических результатов. Для задач данного изобретения благоприятные или желаемые клинические результаты включают один или более чем один из следующих: улучшение состояния при любом виде головной боли, включая уменьшение тяжести, уменьшение интенсивности боли и другие ассоциированные симптомы, уменьшающие частоту рецидивов, улучшение качества жизни лиц, страдающих головной болью, и уменьшение дозы других лекарственных препаратов, требующихся для лечения головной боли, но не ограничены ими. Для мигрени другие ассоциированные симптомы включают тошноту, рвоту и чувствительность к свету, звуку и/или движению, но не ограничены ими. Для кластерной головной боли другие ассоциированные симптомы включают припухлость под глазами или вокруг глаз, чрезмерное слезовыделение, красные глаза, ринорею или заложенность носа и покраснение лица, но не ограничены ими.
Снижение частоты головной боли означает любое из уменьшения частоты (которая может включать уменьшение потребности и/или количества (например, воздействия) других лекарств и/или способов лечения, как правило, применяемых при данном состоянии, включающих, например, эрготамин, дигидроэрготамин или триптаны при мигрени), длительности и/или частоты (включающих, например, задержку или увеличение времени следующей эпизодической атаки у индивида). Как понятно специалисту в данной области техники, индивиды могут отличаться с точки зрения их ответа на лечение, и, например, термин способ снижения частоты головной боли у индивида сам по себе отражает введение антагонистического антитела против ССКР, основываясь на рациональном ожидании того, что такое введение вероятно может вызывать такое снижение частоты у такого конкретного индивида.
Уменьшения интенсивности головной боли или одного или более чем одного симптома головной боли означает уменьшение или улучшение одного или более чем одного симптома головной боли по сравнению с отсутствием введения антагонистического антитела против ССКР. Уменьшение интенсивности также включает укорочение или уменьшение длительности симптома.
Использованный здесь термин контроль головной боли относится к поддержанию или уменьшению тяжести или длительности одного или более чем одного симптома головной боли или частоты приступов головной боли у индивида (по сравнению с уровнем перед лечением). Например, длительность или тяжесть головной боли или частота приступов уменьшается, по меньшей мере, приблизительно на любое из следующих: 10, 20, 30, 40, 50, 60 или 70% у индивида по сравнению с уровнем до лечения.
Использованный здесь термин замедление развития головной боли означает задержку, воспрепятствование, сдерживание, торможение, стабилизацию и/или отсрочку развития заболевания. Это замедление может иметь варьирующую длительность по времени, зависит от истории заболевания и/или индивидуума, которого лечат. Как очевидно специалистам в данной области техники, достаточное или значительное замедление, может, в сущности, охватывать профилактику, так что у индивидуума не развивается головная боль (например, мигрень). Способ, который замедляет развитие симптома, представляет собой способ, который снижает вероятность развития симптома в данный период времени и/или снижает степень симптомов в данный период времени по сравнению с тем, когда этот способ не применяют. Такие сравнения, как правило, основаны на клинических исследованиях с использованием статистически значимого количества субъектов.
Развитие или прогрессирование головной боли означает исходные проявления и/или прогрессирование расстройства. Развитие головной боли может быть обнаружимо и оценено с использованием стандартных клинических способов, таких как хорошо известные в области техники. Тем не менее, развитие также относится к прогрессированию, которое может быть необнаружимым. Для задачи данного изобретения развитие или прогрессирование относится к биологическому течению симптомов. Развитие включает возникновение, рецидив и начало. Использованный здесь термин начало или возникновение головной боли включает исходное возникновение и/или рецидив.
Использованный здесь термин эффективная доза или эффективное количество лекарства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для того, что
- 13 015526 бы привести к благоприятным или желаемым результатам. Для профилактического применения благоприятные или желаемые результаты включают результаты, такие как устраняющие или снижающие риск, уменьшающие тяжесть или задерживающие начало заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, проявляющиеся при развитии заболевания. Для терапевтического применения благоприятные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как уменьшение интенсивности боли, длительности или частоты приступов головной боли и уменьшение одного или более чем одного симптома, возникающего в результате головной боли (биохимического, гистологического и/или поведенческого), включая ее осложнения и промежуточные патологические фенотипы, представленные при развитии заболевания, увеличение качества жизни индивидов, страдающих этим заболеванием, снижение дозы других лекарственных средств, требующихся для лечения заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства и/или замедление прогрессирования заболевания пациентов. Эффективная доза может быть введена в виде одного или более чем одного введения. Для задач изобретения эффективная доза лекарства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для осуществления профилактического или терапевтического прямого или опосредованного лечения. Как следует из клинического контекста, эффективная доза лекарства, соединения или фармацевтической композиции может быть достигнута или не достигнута в сочетании с другим лекарством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, эффективная доза может быть рассмотрена в контексте введения одного или более чем одного терапевтического агента, и один агент может быть рассмотрен как вводимый в эффективном количестве, если в сочетании с одним или более чем одним другим агентом может быть достигнут желаемый результат.
Индивидуум или субъект представляет собой млекопитающее, более предпочтительно человека. Млекопитающие также включают сельскохозяйственных животных, спортивных животных, питомцев, приматов, лошадей, собак, кошек, мышей и крыс, но не ограничены ими.
Использованный здесь вектор означает конструкцию, которая способна доставлять и предпочтительно экспрессировать один или более чем один интересующий ген или последовательность в клеткехозяине. Примеры векторов включают вирусные векторы, голые ДНК или РНК экспрессирующие векторы, плазмиду, космиду или фаговые векторы, ДНК или РНК экспрессирующие векторы, ассоциированные с катионными конденсирующими агентами, ДНК или РНК экспрессирующие векторы, инкапсулированные в липосомах, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты, но не ограничены ими.
Используемая здесь последовательность, контролирующая экспрессию означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты. Последовательность, контролирующая экспрессию, может представлять собой промотор, такой как конститутивный или индуцибельный промотор, или энхансер. Последовательность, контролирующая экспрессию, функционально связана с транскрибируемой последовательностью нуклеиновой кислоты.
Используемый здесь фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтически приемлемый эксципиент включает любое вещество, которое при объединении с активным ингредиентом дает этому ингредиенту возможность сохранять биологическую активность и не является реактивным в отношении иммунной системы субъекта. Примеры включают любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как забуференный фосфатом физиологический раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода, и различные типы увлажнителей, но не ограничены ими. Предпочтительные разбавители для введения в аэрозоле или парентерального введения представляют собой забуференный фосфатом физиологический раствор или нормальный (0,9%) физиологический раствор. Композиции, содержащие такие носители, готовят хорошо известными общепринятыми способами (см., например, Ροιηίη^Ιοπ'δ Рйагтасеийса1 8сюпсс5. 181й οάίΐίοπ. А. Сеппаго, ей., Маск РиЫщЫпд Со., Еа§1оп, РА, 1990; и Кеттд1оп, Т1зе 8е1епсе апй РгасИсе οί Рйагтасу 201й Ей. Маск РиЬйзЫпд, 2000).
Предполагают, что используемый здесь термин коп относится к константе скорости ассоциации антитела с антигеном.
Предполагают, что используемый здесь термин ко££ относится к константе скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.
Предполагают, что используемый здесь термин Кс относится к равновесной константе диссоциации взаимодействия антитело-антиген.
Предполагают, что использованный здесь термин вазомоторный симптом относится к состояниям, связанным с расширением кровеносных сосудов, и включает головную боль (такую как мигрень и другие), прилив крови (или приступообразное ощущение жара), приливы, бессонницу, расстройства сна, расстройства настроения, раздражимость, чрезмерную потливость, ночную потливость, дневную потливость, утомление и т. п, вызванное в том числе терморегуляторной дисфункцией, но не ограничен ими.
Использованные здесь термины прилив, прилив крови и приступообразное ощущение жара представляют собой известные в области техники термины, относящиеся к эпизодическому расстройству температуры тела, обычно состоящему из внезапного прилива крови к коже, обычно сопровождаемому потоотделением у субъекта.
- 14 015526
А. Способы профилактики или лечения вазомоторных симптомов.
В одном из аспектов в изобретении предложен способ лечения или профилактики по меньшей мере одного вазомоторного симптома, такого как головная боль (например, мигрень) или приливы крови, у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против ССКР или полипептидов, имеющих происхождение из данного антитела.
В еще одном аспекте в изобретении предложен способ уменьшения интенсивности, контроля, снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования по меньшей мере одного вазомоторного симптома, такого как головная боль (например, мигрень) или приливы крови, у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против ССКР.
В еще одном аспекте в изобретении предложены способы уменьшения интенсивности, контроля, снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования головной боли (например, мигрени) у индивида, включающие введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против ССКР в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным агентом, полезным для лечения головной боли.
Такие дополнительные агенты включают агонисты 5-НТ и Х8АГО, но не ограничены ими. Например, одновременно может быть введено антитело и по меньшей мере один дополнительный агент, т. е. они могут быть введены в достаточно близкие моменты времени для того, чтобы дать возможность перекрывания их индивидуальных терапевтических эффектов. Например, количество агониста 5-НТ или Х8АГО, вводимого в комбинации с антителом против ССКР, должно быть достаточным для снижения частоты рецидивов головной боли у пациентов или обеспечения более длительной эффективности по сравнению с введением любого из этих агентов в отсутствие другого. Этот способ может быть использован для лечения головных болей, относящихся к любому из широкого разнообразия классов, включая мигрень с аурой или без нее, гемиплегическую мигрень, кластерные головные боли, мигренозную невралгию, хронические головные боли, головные боли напряжения и головные боли, возникающие в результате других медицинских состояний (таких как инфекция или повышенное черепное давление из-за опухоли); хроническую пароксизмальную гемикранию; смешанную головную боль, не ассоциированную со структурным нарушением; головную боль, ассоциированную с несосудистым внутричерепным расстройством; головную боль, ассоциированную с введением вещества или синдромом его отмены; головную боль, ассоциированную с нецефалической инфекцией; головную боль, ассоциированную с метаболическим расстройством; головную боль, ассоциированную с заболеванием черепа, шеи, глаз, ушей, носа, носовых пазух, зубов, ротовой полости или другой лицевой или черепной структуры; черепные невралгии; и боль нервного ствола и деафферентационная боль.
Специалист в данной области техники способен определить подходящие дозы конкретных агентов, применяемых в комбинации с антителом против ССКР. Например, суматриптан может быть введен в дозе от приблизительно 0,01 до приблизительно 300 мг. При непарентеральном введении типичная доза суматриптана составляет от приблизительно 25 до приблизительно 100 мг, причем приблизительно 50 мг, как правило, является предпочтительной, и при парентеральном введении предпочтительная доза составляет приблизительно 6 мг. Тем не менее, эти дозы могут варьировать в соответствии со способами, стандартными в данной области техники, таким образом, что они оптимизированы для конкретного пациента или для конкретной комбинированной терапии. Дополнительно, например, целекоксиб может быть введен в количестве от 50 до 500 мг.
В еще одном аспекте в изобретении предложены способы уменьшения интенсивности, контроля, снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования приливов крови у индивида, включающие введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против ССКР в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным агентом, полезным для лечения приливов крови. Такие дополнительные агенты включают гормональные способы лечения, включающие эстрогены и/или некоторые прогестины, но не ограничены ими.
В отношении всех описанных здесь способов ссылка на антагонистические антитела против ССКР также включает композиции, содержащие один или более чем один из этих агентов. Эти композиции дополнительно могут содержать подходящие эксципиенты, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты, включая буферы, которые хорошо известны в данной области техники. Настоящее изобретение может быть использовано самостоятельно или в комбинации с другими обычными способами лечения.
Антагонистическое антитело против ССКР может быть введено индивиду любым подходящим путем. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что описанные здесь примеры не предназначены ограничивать объем изобретения, а иллюстрируют доступные способы. Соответственно, в некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР вводят индивиду в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение, например в виде болюса или путем непрерывной инфузии в течение периода времени, путем внутримышечного, внутрибрюшинного, внутриспинномозгового, подкожного, интраартикулярного, подъязычного, внутрисуставного введения, путем инсуффляции, внутриоболочечного, перорального введения, путем ингаляции или местным путем. Введение может быть системным, например внутривенное введение, или локальным. Для введения полезны
- 15 015526 имеющиеся в продаже распылители жидких препаратов, включая струйные распылители и ультразвуковые распылители. Жидкие препараты можно распылять непосредственно, и лиофилизированный порошок можно распылять после разведения. Альтернативно, антагонистическое антитело против С6ЯР можно распылять в виде аэрозоля с использованием фторуглеродного препарата и ингалятора с отмеренными дозами, или ингалировать в виде лиофилизированного и измельченного порошка.
В одном из воплощений антагонистическое антитело против С6ЯР вводят способами сайтспецифической или целевой локальной доставки. Примеры способов сайт-специфической или целевой локальной доставки включают различные имплантируемые депо-источники антагонистического антитела против С6ЯР или катетеры для локальной доставки, такие как катетеры для инфузии, постоянный катетер или игольчатый катетер, синтетические имплантаты, адвентициальные аппликаторы, шунты и стенты или другие имплантируемые устройства, сайт-специфические носители, прямую инъекцию или непосредственное применение. См., например, публикацию заявки РСТ АО 00/53211 и патент США № 5981568.
Для введения могут быть использованы различные препараты антагонистического антитела против С6ЯР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против С6ЯР может быть введено в чистом виде. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против С6ЯР и фармацевтически приемлемый эксципиент могут находиться в различных лекарственных формах. Фармацевтически приемлемые эксципиенты известны в данной области техники и представляют собой относительно инертные вещества, которые облегчают введение фармакологически эффективного вещества. Например, эксципиент может обеспечивать форму или консистенцию или действовать в качестве разбавителя. Подходящие эксципиенты включают стабилизаторы, увлажнители и эмульгаторы, соли для изменения осмолярности, инкапсулирующие агенты, буферы и усилители проницаемости кожи, но не ограничены ими. Эксципиенты, а также препараты для парентеральной и непарентеральной доставки лекарства приведены в Яетίη^Ιοη. ТНе 8с1епсе апй Ргасйсе οί Рйагтасу 20(Н Ей. Маск РиЫЕЫпд (2000).
В некоторых воплощениях такие агенты готовят для введения путем инъекции (например, внутрибрюшинной, внутривенной, подкожной, внутримышечной и т.п.). Соответственно, эти агенты можно объединять с фармацевтически приемлемыми разбавителями, такими как физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и т.п. Конкретная схема введения доз, т.е. доза, время введения и повторность, будет зависеть от конкретного индивида и истории болезни данного индивида.
Антитело против С6ЯР может быть введено с использованием любого подходящего способа, включая инъекцию (например, внутрибрюшинную, внутривенную, подкожную, внутримышечную и т.п.). Антитела против С6ЯР также могут быть введены путем ингаляции, как здесь описано. Как правило, для введения антител против С6ЯР исходная предполагаемая доза может составлять приблизительно 2 мг/кг. Для задачи настоящего изобретения типичная суточная доза может находиться в диапазоне от 3 до 30 мкг/кг, до 300 мкг/кг, до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. Например, может быть использована доза приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 2,5 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг и приблизительно 25 мг/кг. Для повторных введений в течение нескольких суток или более длительного введения, в зависимости от состояния, лечение поддерживают до достижения желаемого подавления симптомов или до достижения достаточных терапевтических уровней, например для уменьшения боли. Пример схемы введения доз включает введение исходной дозы, составляющей приблизительно 2 мг/кг, с последующей еженедельной поддерживающей дозой приблизительно 1 мг/кг антитела против С6ЯР, или с последующей поддерживающей дозой приблизительно 1 мг/кг через неделю. Тем не менее, могут быть полезны другие схемы введения доз в зависимости от картины фармакокинетического разложения, которую практикующий врач желает достичь. Например, в некоторых воплощениях рассматривают дозу от одного до четырех раз в неделю. Ход такого способа лечения легко контролировать обычными методами и анализами. Схема введения дозы (включающая применяемый(е) антагонист(ы) С6ЯР) может варьировать в течение времени.
Для задачи настоящего изобретения подходящая доза антагонистического антитела против С6ЯР зависит от используемого антагонистического антитела против С6ЯР (или его композиции), типа и тяжести головной боли (например, мигрени), которую лечат, вводят ли агент для профилактических или терапевтических задач, предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на агент и решения лечащего врача. Обычно клинический врач вводит антагонистическое антитело против С6ЯР до достижения дозы, которая позволит достичь желаемый результат. Доза и/или частота может варьировать в процессе лечения.
В определение дозы, как правило, вносят вклад эмпирические факторы, такие как период полувыведения. Например, для увеличения периода полувыведения антитела и для предотвращения атаки антител иммунной системой хозяина могут быть использованы антитела, которые совместимы с иммунной системой человека, такие как гуманизированные антитела или полностью человеческие антитела. Частота введения может быть определена и подобрана во время курса лечения и, как правило, но необязательно, основана на лечении, и/или подавлении, и/или уменьшении интенсивности, и/или сдерживания головной боли (например, мигрени). Альтернативно, могут быть подходящими препараты антагонистических антител против С6ЯР с длительным непрерывным высвобождением. В данной области техники
- 16 015526 известны различные препараты и устройства для достижения длительного высвобождения.
В одном из воплощений дозы антагонистического антитела против СОРР могут быть определены эмпирически для индивидуумов, которым осуществляют одно или более чем одно введение антагонистического антитела против СОРР. Индивидуумам вводят увеличивающиеся дозы антитела против СОРР. Для оценки эффективности антагонистического антитела против СОРР можно руководствоваться индикатором заболевания.
Введение антагонистического антитела против СОРР в соответствии со способом по настоящему изобретению может быть непрерывным или периодическим в зависимости, например, от физиологического состояния реципиента, от того, является ли задача введения терапевтической или профилактической, и других факторов, известных практикующим врачам. Введение антагонистического антитела против СОРР может быть, по существу, непрерывным в течение заданного периода времени или может быть в виде серий разделенных по времени доз, например перед, во время или после развития головной боли (например, мигрени); перед; во время; перед и после; во время и после; перед и во время или перед, во время и после развития головной боли. Введение может быть перед, во время и/или после любого события, вероятно приводящего к головной боли.
В некоторых воплощениях может присутствовать более чем одно антагонистическое антитело против СОРР. Может присутствовать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или более различных антагонистических антител против СОРР. Как правило, такие антагонистические антитела против СОРР могут иметь совместимые виды активности, которые не влияют отрицательно друг на друга. Антагонистическое антитело против СОРР также может быть использовано совместно с другими антагонистами СОРР или антагонистами рецептора СОРР. Например, может быть использован один или более чем один из следующих антагонистов СОРР: антисмысловая молекула, направленная на СОРР (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую СОРР), соединение-ингибитор СОРР, структурный аналог СОРР, доминантно-негативная мутация рецептора СОРР, связывающего СОРР, и антитело против рецептора СОРР. Антагонистическое антитело против СОРР также может быть использовано в сочетании с другими агентами, которые служат для усиления и/или дополнения эффективности агентов.
Терапевтические препараты антагонистического антитела против СОРР, используемые в соответствии с настоящим изобретением, готовят для хранения путем смешивания антитела, имеющего желательную степень чистоты, с возможными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Реттд1оп, Т11С 8с1епсе апб Ргасбсе о£ Рйагтасу 20111 Еб. Маск РиЫщЫпд (2000)), в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и могут содержать буферы, такие как фосфатный, цитратный буфер и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутил- или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и метакрезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (менее чем примерно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Ζη-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как Τ^εεΝ™, РЬиР0№С8™ или полиэтиленгликоль (РЕО).
Липосомы, содержащие антагонистическое антитело против СОРР, готовят способами, известными в данной области техники, такими, как описано в Ерйеш, е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 82:3688 (1985); Н^апд, е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8сг И8А 77:4030 (1980); и патентах США №№ 4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем нахождения в системе кровообращения раскрыты в патенте США № 5013556. Особенно полезные липосомы могут быть приготовлены способом обращенно-фазового выпаривания липидной композиции, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и РЕО-производное фосфатидилэтаноламина (РЕО-РЕ). Липосомы экструдируют через фильтры с определенными размерами пор для получения липосом с желаемым диаметром.
Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулы, приготовленные, например, способами коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатиновые микрокапсулы и микрокапсулы из поли-(метилметацилата), соответственно, в коллоидных системах доставки лекарства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях.
Такие способы описаны в РепипдЮп, Т11е 8с1епсе апб Ргасбсе о£ Рйагтасу 20(Н Еб. Маск РиЬШЫпд (2000).
Могут быть приготовлены препараты с длительным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с длительным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных
- 17 015526 полимеров, содержащих антитело, где матрицы находятся в виде оформленных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с длительным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли-(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поливиниловый спирт, полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и 7-этил-Ь-глутамата, нераспадаемый этиленвинилацетат, распадаемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как ЕиРК0Х ЭЕР0Т™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот, и лейпролида ацетата), изобутирата ацетата сахарозы и поли-Э-(-)-3-гидроксибутировая кислота.
Препараты, предназначенные для применения для введения ίη νίνο, должны быть стерильными. Это легко осуществить, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Терапевтические композиции антагонистического антитела против ССКР, как правило, помещают в контейнер, имеющий стерильное отверстие для доступа, например контейнер для внутривенного раствора или пузырек, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции.
Композиции по настоящему изобретению могут находиться в стандартных лекарственных формах, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии, или суппозитории для перорального, парентерального или ректального введения или введения путем ингаляции или инсуффляции.
Для приготовления твердых композиций, таких как таблетки, действующее начало смешивают с фармацевтическим носителем, например общепринятыми ингредиентами для таблетирования, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, дикальцийфосфат или смолы, и другими фармацевтическими разбавителями, например водой, с получением твердой композиции предварительного препарата, содержащей гомогенную смесь соединения по настоящему изобретению или ее нетоксичную фармацевтически приемлемую соль. Ссылка на такие композиции предварительных препаратов, как на гомогенные, означает, что активный ингредиент равномерно диспергирован по всей композиции таким образом, что композиция может быть легко разделена на равные эффективные стандартные лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Такую твердую композицию предварительного препарата затем делят на лекарственные формы описанного выше типа, содержащие от 0,1 до примерно 500 мг активного ингредиента по настоящему изобретению. Таблетки или пилюли новой композиции могут быть покрыты или приготовлены каким-либо иным способом с получением лекарственной формы, обеспечивающей преимущество длительного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать внутренний компонент дозы и внешний компонент дозы, причем последний компонент представлен в форме оболочки поверх первого компонента. Два компонента могут быть разделены энтеросолюбильным слоем, который служит для обеспечения устойчивости к разложению в желудке и позволяет внутреннему компоненту пройти интактным в двенадцатиперстную кишку, или для задержки его высвобождения. Для таких энтеросолюбильных слоев или оболочек может быть использовано множество материалов, включая множество полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими веществами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.
Подходящие поверхностно-активные агенты включают, в частности, неионные агенты, такие как полиоксиэтиленсорбитаны (например, Т\уссп™ 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например, Зрап™ 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным агентом обычно содержат от 0,05 до 5% поверхностно-активного агента и могут содержать от 0,1 до 2,5%. Понятно, что при необходимости могут быть добавлены другие ингредиенты, например маннит или другие фармацевтически приемлемые разбавители.
Подходящие эмульсии могут быть приготовлены с использованием имеющихся в продаже жировых эмульсий, таких как Шгайрхб™, Ырокуп™, ΙηΓοηπίτοΙ™, ЫроГипЛп™ и Ыр1рйукапТМ. Активный ингредиент может быть либо растворен в предварительно смешанной эмульсионной композиции, или, альтернативно, он может быть растворен в масле (например, соевом масле, сафлоровом масле, хлопковом масле, кунжутном масле, кукурузном масле или миндальном масле) и эмульсии, образованной при смешивании с фосфолипидом (например, яичными фосфолипидами, соевыми фосфолипидами или соевым лецитином) и водой. Понятно, что могут быть добавлены другие ингредиенты, например глицерин или глюкоза, для регулировки тоничности эмульсии. Подходящие эмульсии, как правило, содержат до 20% масла, например от 5 до 20%. Жировая эмульсия может содержать капли жира от 0,1 до 1,0 мкм, в частности от 0,1 до 0,5 мкм, и иметь рН в диапазоне от 5,5 до 8,0.
Эмульсионные композиции могут представлять собой композиции, приготовленные путем смешивания антагонистического антитела против ССКР с [п1га1|р|4™ или его компонентами (соевым маслом, яичными фосфолипидами, глицерином и водой).
Композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых водных или органических растворителях или их смеси и порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты, как описано выше. В некоторых воплощениях композиции вводят пероральным или назальным респираторным путем для получения локального или системного эффекта. Композиции в предпочтительно стерильных фармацевтически приемлемых растворителях можно распылять с использованием газов. Распыляемые раство
- 18 015526 ры можно вдыхать непосредственно из распылителя, или распылитель может быть прикреплен к маске, палатке или дыхательному аппарату пульсирующего положительного давления. Композиции в виде раствора, суспензии или порошка могут быть введены предпочтительно перорально или назально из устройств, которые доставляют лекарственную форму подходящим образом.
Диагностика или оценка головной боли хорошо известна в данной области техники. Оценка может быть осуществлена на основе субъективных измерений, таких как характеристика симптомов пациентом. Например, мигрень можно диагностировать на основе следующих критериев: 1) эпизодические приступы головной боли, длящиеся от 4 до 72 ч; 2) по двум из следующих симптомов: односторонняя боль, пульсирующая боль, аггравация при движении и боль умеренной или сильной интенсивности; и 3) одному из следующих симптомов: тошнота или рвота, и фотофобия или фонофобия. СоабкЬу е! а1., Ν. Епд1. ί. Меб. 346:257-270, 2002.
Эффективность лечения может быть оценена с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. Например, может оценивать купирование боли. Соответственно, в некоторых воплощениях купирование боли субъективно обнаруживают после 1,2 или нескольких часов после введения антитела против ССКР. В некоторых воплощениях частоту приступов головной боли субъективно обнаруживают после введения антитела против ССКР.
Б. Антагонистические антитела против ССКР.
В способах по изобретению применяют антагонистическое антитело против ССКР, которое относится к любой молекуле антитела, блокирующей, подавляющей или уменьшающей (в том числе существенно) биологическую активность ССКР, включая последующие сигнальные пути, опосредованные ССКР, такие как связывание рецептора и/или индуцирование клеточного ответа на ССКР.
Антагонистическое антитело против ССКР должно демонстрировать любую одну или более чем одну из следующих характеристик: (а) связывание с ССКР; (б) блокирование связывания ССКР с его рецептором(ами); (в) блокирование или уменьшение активации рецептора ССКР (включая активацию сАМР); (г) ингибирование биологической активности ССКР или последующих путей, опосредованных сигнальной функцией ССКР; (д) профилактика, уменьшение интенсивности или лечение любого вида головной боли (например, мигрени); (е) увеличение клиренса ССКР и (ж) ингибирование (снижение) синтеза, продукции или высвобождения ССКР. Антагонистические антитела против ССКР известны в данной области техники. См., например, Тап е! а1., С11п. 8с1. (Ьопб). 89:565-73, 1995; 81дта (МЦюшт, И8), продукт № С7113 (клон #4901); Р1оигбе е! а1., Рерббек 14:1225-1229, 1993.
Для задач изобретения антитело взаимодействует с ССКР таким образом, чтобы ингибировать ССКР и/или последующие пути, опосредованные сигнальной функцией ССКР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР распознает человеческий ССКР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР связывается с человеческим α-ССКР и β-ССКР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР связывает человеческий и крысиный ССКР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР связывает С-концевой фрагмент, имеющий аминокислоты 25-37 ССКР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР связывает С-концевой эпитоп по аминокислотам 25-37 ССКР.
Антитела, полезные по настоящему изобретению, могут охватывать моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антитела (например, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, Ρν, Рс и т.д.), химерные антитела, биспецифические антитела, гетероконъюгированные антитела, одноцепочечные (8сΡν) их мутанты, слитые белки, включающие фрагмент антитела (например, доменное антитело), гуманизированные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена, имеющий требуемую специфичность, включающий варианты гликозилирования антител, варианты антител по аминокислотной последовательности и ковалентно модифицированные антитела. Антитела могут быть мышиными, крысиными, человеческими или имеющими любое другое происхождение (включая химерные или гуманизированные антитела).
В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР представляет собой моноклональное антитело. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР является гуманизированным. В некоторых воплощениях антитело является человеческим. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР представляет собой антитело С1 (как здесь описано). В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР содержит один или более чем один СОК (например, один, два, три, четыре, пять или в некоторых воплощениях все шесть СОК) антитела С1 или варианты С1, представленные в табл. 6. В других воплощениях антагонистическое антитело против ССКР содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленной на фиг. 5 (8ЕО Ш N0: 1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленной на фиг. 5 (8Е0 Ш N0: 2).
В некоторых воплощениях антитело содержит модифицированную константную область, такую как описанная здесь константная область, которая является иммунологически инертной. В некоторых воплощениях константная область модифицирована, как описано в Еиг. 1. 1ттипо1. (1999) 29:2613-2624; заявке РСТ № РСТ/СВ 99/01441; и/или завке на патент Великобритании № 9809951.8. В других воплощениях антитело содержит константную область тяжелой цепи человеческого 1дС2, включающую сле- 19 015526 дующие мутации: А330Р331 на 83308331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательность 1дС2 дикого типа) Еиг. ί. 1ттипо1. (1999) 29:2613-2624. В некоторых воплощениях антитело содержит константную область 1дС4. включающую следующие мутации: Е233Е234Б235 на Р233У234А235. В других воплощениях константная область агликозилирована для Ν-гликозилирования. В некоторых воплощениях константная область агликозилирована для Ν-гликозилирования путем мутации остатка присоединения олигосахарида (такого как Азп297) и/или фланкирующих остатков, которые представляют собой часть последовательности, распознающей Ν-гликозилирование, в константной области. В некоторых воплощениях константная область агликозилирована для Ν-гликозилирования. Константная область может быть агликозилирована для Ν-гликозилирования ферментативно или путем экспрессии в клетке-хозяине, дефицитном по гликозилированию.
Аффинность связывания (Кс) антагонистического антитела против ССВР в отношении ССВР (такого как человеческий α-ССВР) может составлять от приблизительно 0,02 до приблизительно 200 нМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания представляет собой любую из приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500, приблизительно 100, приблизительно 60, приблизительного 40, приблизительно 20, приблизительно 15, приблизительно 10, приблизительно 5 или приблизительно 2 пМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания составляет менее чем любое значение из приблизительно 250, приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500, приблизительно 100 или приблизительно 50 пМ.
Один из путей определения аффинности связывания антитела с ССВР заключается в измерении аффинности связывания монофункциональных фрагментов ЕаЬ антитела. Для получения монофункциональных фрагментов ЕаЬ антитело (например 1дС) можно расщеплять папаином или рекомбинантно экспрессировать. Аффинность ЕаЬ фрагмента антитела против ССЕР может быть определена посредством поверхностного плазмонного резонанса (система поверхностного плазмонного резонанса (8РЕ) В1асоге3000™, В1асоге, ГИС, Ркса1а\гау ΝΙ), оборудованного сенсорными чипами с предварительно иммобилизованным стрептавидином (8А) с использованием буфера для анализа НВ8-ЕР (0,01М НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15 №С1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% об./об. поверхностно-активного вещества Р20). Биотинилированный человеческий ССЕР (или любой другой ССЕР) можно развести в буфере НВ8-ЕР до концентрации менее чем 0,5 мкг/мл и ввести в каналы отдельного чипа, используя различные периоды времени контакта, с достижением двух диапазонов плотности антигена, либо 50-200 единиц реакции (ВИ) для подробных кинетических исследований, либо 800-1000 ВИ для скрининговых анализов. Исследования регенерации продемонстрировали, что 25 мМ №ОН в 25% об./об. этаноле эффективно удаляет связанный ЕаЬ, в то же время сохраняя активность ССВР на чипе в течение более 200 инъекций. Типично, серийные разведения (охватывающие концентрации 0,1-10х относительно оцененной Кс) очищенных образцов ЕаЬ вводят в течение 1 мин со скоростью 100 мкл/мин и дают возможность для диссоциации в течение до 2 ч. Концентрацию белков ЕаЬ определяют путем твердофазного иммуноферментного анализа (ЕБ18А) и/или электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8Э8-РАСЕ) с использованием известной концентрации ЕаЬ (определенной в соответствии с аминокислотным анализом) в качестве стандарта. Кинетические скорости ассоциации (коп) и скорости диссоциации (ко££) определяют одновременно путем подгонки данных в целом к модели связывания Лэнгмюра 1:1 (Кагкзоп, В. Вооз, Н. Еадегз1ат, Ь. Ре1ег8зоп, В. (1994). МеШобз Епхуто1оду 6. 99-110) с использованием программы В1Аега1иа1юп. Величины равновесной константы диссоциации (Кс) рассчитывают как ко££/коп. Этот протокол подходит для использования при определении аффинности связывания антитела с любым ССВР, включая человеческий ССВР, ССВР другого млекопитающего (такой как мышиный ССВР, крысиный ССВР, ССВР примата), а также различные формы ССВР (такие как форма α и β). Аффинность связывания антитела, как правило, измеряют при 25°С, но также ее можно измерять при 37°С.
Антагонистические антитела против ССВР могут быть получены любым способом, известным в данной области техники. Путь и схему иммунизации животного-хозяина, как правило, выбирают в соответствии с установленными и общепризнанными способами стимуляции и продукции антитела, как здесь дополнительно описано. Общие способы продукции человеческих и мышиных антител хорошо известны в данной области техники и описаны здесь.
Понятно, что любой субъект-млекопитающее, включая людей или их клетки, продуцирующие антитело, может быть подвергнуто манипуляции для того, чтобы служить в качестве основы для продукции гибридомных клеточных линий млекопитающего, включая человека. Типично, животное-хозяин инокулируют внутрибрюшинно, внутримышечно, перорально, подкожно, внутриподошвенно и/или внутрикожно количеством иммуногена, в том числе, как описано здесь.
Гибридомы могут быть получены из лимфоцитов и иммортализованных клеток миеломы с использованием общего способа гибридизации соматических клеток КоЫег, В. апб М1181:ет, С. (1975) №1иге 256:495-497 или модифицированного Виск, Ό.^., е1 а1., 1п Убго, 18:377-381 (1982). При гибридизации могут быть использованы имеющиеся линии миеломы, включая Х63-Ад8.653 и линии из 8а1к ГпзбМе, Се11 П181пЬи1юп СегИет 8ап П1едо, Са11£., И8А, но не ограниченные ими. Как правило, способ включает
- 20 015526 слияние клеток миеломы и лимфоидных клеток с использованием вещества, способствующего слиянию клеток, такого как полиэтиленгликоль, или электрическими средствами, хорошо известными специалисту в данной области техники. После слияния клетки отделяют от среды для слияния и выращивают в селективной среде для роста, такой как гипоксантин-аминоптерин-тимидиновая (НАТ) среда для удаления негибридизированных родительских клеток. Любые описанные здесь среды, дополненные сывороткой или без нее, могут быть использованы для культивирования гибридом, секретирующих моноклональные антитела. В качестве еще одной альтернативы способа слияния клеток для продукции моноклональных антител против СОКР по настоящему изобретению могут быть использованы ЕВУ иммортализованные В-клетки. При желании гибридомы размножают и субклонируют и супернатанты исследуют в отношении активности против иммуногена общепринятыми способами иммуноанализа (например, радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ или флуоресцентный иммуноанализ).
Гибридомы, которые могут быть использованы в качестве источника антител, охватывают все производные, клетки-предшественники родительских гибридом, которые продуцируют моноклональное антитела, специфичные в отношении СОКР, или их фрагмент.
Гибридомы, которые продуцируют такие антитела, могут быть выращены ш У1!го или ш у1уо с использованием известных способов. При желании моноклональные антитела могут быть выделены из культуральных сред или жидкостей организма общепринятыми способами очистки иммуноглобулина, такими как осаждение сульфатом аммония, гель-электрофорез, диализ, хроматография и ультрафильтрация. Если присутствует нежелательная активность, она может быть удалена, например, путем пропускания препарата над адсорбентами, приготовленными из иммуногена, прикрепленного к твердой фазе, и элюции или высвобождения желаемых антител с этого иммуногена. Иммунизация животного-хозяина человеческим СОКР или фрагментом, содержащим аминокислотную последовательность-мишень, конъюгированную с белком, который является иммуногенным для иммунизированных видов, например гемоцианином лимфы улитки, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или соевым ингибитором трипсина, с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например малеимидобензоил-сульфосукцинимидного эфира (конъюгация через цистеиновые остатки), Νгидроксисукцинимида (через лизиновые остатки), глутарового альдегида, янтарного ангидрида, 80С12 или К1N=С=NК, где К и К1 представляют собой различные алкильные группы, может дать популяцию антитела (например, моноклонального антитела).
При желании интересующее антагонистическое антитело против СОКР (моноклональное или поликлональное) может быть секвенировано, и полинуклеотидная последовательность затем может быть клонирована в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующая интересующее антитело, может поддерживаться в векторе в клетке-хозяине, и клетка-хозяин затем может быть выращена и заморожена для последующего применения. Альтернативно, полинуклеотидная последовательность может быть использована для генетической манипуляции для гуманизации антитела или для улучшения аффинности или других характеристических антител. Например, константная область может быть сконструирована таким образом, чтобы иметь большее сходство с константными областями человеческого антитела для того, чтобы избежать иммунного ответа, когда антитело применяют в клинических испытаниях и способах лечения людей. Может быть желательно генетически манипулировать с последовательностью антитела для достижения большей аффинности в отношении СОКР и большей эффективности в ингибировании СОКР. Специалисту в данной области техники понятно, что в антагонистическом антителе против СОКР могут быть осуществлены изменения одного или более чем одного полинуклеотида с сохранением его способности связывания с СОКР.
Существуют четыре общие стадии гуманизации моноклонального антитела. Эти стадии представляют собой: (1) определение нуклеотида и предполагаемой аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепи исходного антитела, (2) конструирование гуманизированного антитела, т.е. определение того, какую каркасную область антитела использовать в способе гуманизации, (3) действительные способы/методы гуманизации, и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела. См., например, патенты США №№ 4816567; 5807715; 5866692; 6331415; 5530101; 5693761; 5693762;5585089 и 6180370.
Описано множество молекул гуманизированного антитела, включающих антигенсвязывающий сайт, имеющий происхождение из иммуноглобулина, не являющегося человеческим, включая химерные антитела, имеющие У-области или модифицированные У-области антител грызунов и их ассоциированные гипервариабельные участки (СОК), слитые с константными доменами человеческого антитела. См., например, №ш!ег е! а1. Мииге 349:293-299 (1991), ЬоЬидйо е! а1. Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А 86:4220-4224 (1989), 8йа\\ е! а1. 1. 1ттипо1. 138:4534-4538 (1987) и Вгоип е! а1. Сапсег Кек. 47:3577-3583 (1987). В других ссылках описаны СОК грызунов, перенесенные в поддерживающую каркасную область (ЕК) человеческого антитела перед слиянием с подходящим константным доменом человеческого антитела. См., например, К1есйтапп е! а1. ΝηΙιιΐΌ 332:323-327 (1988), Уегйоеуеп е! а1. 8с1епсе 239:1534-1536 (1988) и 1опех е! а1. №!иге 321:522-525 (1986). В другой ссылке описаны СОК грызунов, поддерживаемые рекомбинантно покрытыми каркасными областями антител грызунов. См., например, публикацию европейской заявки на патент № 0519596. Эти гуманизированные молекулы сконструированы для минимиза
- 21 015526 ции нежелательного иммунологического ответа в отношении молекул антител грызунов против человеческого антитела, которые ограничивают длительность и эффективность терапевтических применений этих группировок в отношении реципиентов-людей. Например, константная область антитела может быть сконструирована таким образом, чтобы быть иммунологически инертной (например, она не запускает лизис комплемента). См., например, публикацию РСТ № РСТ/ОВ 99/01441; заявку на патент Великобритании № 9809951.8. Другие способы гуманизации антител, которые могут также быть использованы, раскрыты в ОаидНеПу е! а1., №с1. Ас1бк Кек. 19:2471-2476 (1991) и в патентах США №№ 6180377; 6054297; 5997867; 5866692; 6210671 и 6350861 и в публикации РСТ № АО 01/27160.
В еще одной альтернативе полностью человеческие антитела могут быть получены с использованием имеющихся в продаже мышей, которые сконструированы для экспрессии специфических белков человеческих иммуноглобулинов. Трансгенные животные, которые сконструированы для продукции более желательного (например, полностью человеческие антитела) или более устойчивого иммунного ответа, также могут быть использованы для конструирования гуманизированных или человеческих антител. Примеры такого способа представляют собой Хепотоике™ из АЬдешх, 1пс. (Егетоп!, СА) и НиМАЬМоике® и ТС Мойке™ из Мебагех, 1пс. (РгтсеФп, N1).
Альтернативно, антитела могут быть получены рекомбинантным путем и экспрессированы с использованием любого способа, известного в данной области техники. В еще одной альтернативе антитела могут быть получены рекомбинантным путем с использованием технологии фагового дисплея. См., например, патенты США №№ 5565332; 5580717; 5733743 и 6265150 и Ат!ег е! а1., Аппи. Кеу. 1ттипо1. 12:433-455 (1994). Альтернативно, технология фагового дисплея (МсСаГГеПу е! а1., №1!иге 348:552-553 (1990)) может быть использована для получения человеческих антител и фрагментов антител ш νί!ΐΌ из наборов генов вариабельного (V) домена иммуноглобулина неиммунизированных доноров. В соответствии с этим способом гены ν-домена антитела клонированы внутри рамки в ген основного или минорного белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как М13 или Гб, и представлены как функциональные фрагменты антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку эта нитевидная частица содержит одноцепочеченую копию ДНК фагового генома, отбор, основанный на функциональных свойствах антител, также приводит в результате к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющее эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств В-клетки. Фаговый дисплей может быть проведен во множестве форматов; обзор см., например, в 1оЬпкоп, Кеуш 8. апб СЫктеей, Бау|б 1., Сштеп! Ор1шоп ш 8!гис1ига1 В1о1оду 3:564-571 (1993). Несколько источников сегментов ν-генов могут быть использованы для фагового дисплея. С1асккоп е! а1., №!иге 352:624-628 (1991) выделил разнообразный ряд антител против оксазолона из небольшой, полученной путем случайной комбинации библиотеки ν-генов, происходящей из селезенок иммунизированных мышей. Может быть сконструирован набор ν-генов неиммунизированных доноров-людей, и антитела на разнообразный ряд антигенов (включая аутоантиген) могут быть выделены, по существу, в соответствии со способами, описанными в Магк е! а1., Б Мо1. Вю1. 222:581-597 (1991), или ОпГГйй е! а1., ЕМВО Б 12:725-734 (1993). При естественном иммунном ответе гены антитела аккумулируют мутации с высокой степенью (соматическая гипермутация). Некоторые из введенных изменений приводят к более высокой аффинности, и В-клетки, представляющие высокоаффинный поверхностный иммуноглобулин, предпочтительно реплицируются и дифференцируются при последующей антигенной стимуляции. Этот естественный процесс может быть имитирован путем использования способа, известного как перетасовка цепей (Магкк, е! а1., Вю/Тесйпо1. 10:779-783 (1992)). В этом способе аффинность первичных человеческих антител, полученных при помощи фагового дисплея, может быть улучшена путем последовательного замещения генов ν-областей тяжелой и легкой цепи наборами встречающихся в природе вариантов (наборы) генов ν-домена, полученных от неиммунизированных доноров. Этот способ дает возможность для продукции антител и фрагментов антител, имеющих аффинности в диапазоне пМ-нМ. Стратегия получения очень крупных фаговых наборов антител (также известных как мать всех библиотек (Не то1йег-оГ-а11 НЬгапек)) описана в Аа!ег1тоике е! а1., №с1. Ас1бк Кек. 21:2265-2266 (1993). Перетасовка генов также может быть использована для получения человеческих антител из антител грызунов, где человеческое антитело имеет аффинности и специфичности, подобные исходному антителу грызуна. В соответствии с этим способом, который также называют как эпитопный импринтинг, ген ν-домена тяжелой или легкой цепи антител грызуна, полученных способом фагового дисплея, заменяют набором человеческих генов ν-домена, с получением химер грызун-человек. Отбор антигена приводит в результате к выделению вариабельных областей человеческого антитела, способных востанавливать функциональный антигенсвязывающий сайт, т.е. эпитоп направляет выбором партнера (делает отпечаток). При повторении способа для замены оставшегося ν-домена грызуна получают человеческое антитело (см. заявку РСТ № АО 93/06213, опубликованную 1 апреля 1993 г.). В отличие от традиционной гуманизации антител грызунов путем переноса СОК в этом способе предложены полностью человеческие антитела, у которых отсутствуют остатки каркасной области или СОК грызунов.
Понятно, что хотя вышеприведенное обсуждение относится к гуманизированным антителам, общие обсуждаемые принципы применимы для получения антител для применения, например, у собак, кошек, приматов, лошадей и коров. Кроме того, понятно, что один или более чем один описанный здесь аспект
- 22 015526 гуманизации антитела можно объединить, например перенос СЭВ. мутацию каркасной области и мутацию ΟΌΒ.
Антитела могут быть получены рекомбинантным путем сначала путем выделения антител и клеток, продуцирующих антитело, у животных-хозяев, получения последовательности гена и с использованием последовательности гена рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках яичников китайского хомячка (СНО)). Другой способ, который может быть использован, заключается в экспрессии последовательности антитела в растениях (например, табаке) или трансгенном молоке. Способы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке были раскрыты. См., например, Рее!егк е! а1. Уассше 19:2756 (2001); ЬопЬегд N. аиб Ό. Никхаг 1п1.Веу.1ттипо1 13:65 (1995); и Ро11оск, е! а1., I. 1ттипо1. Мебюбк 231:147(1999). Способы получения производных антител, например гуманизированных антител, одноцепочечных и т.д., известны в данной области техники.
Иммуноанализы и способы сортировки путем проточной цитометрии, такие как клеточная сортировка с флуоресцентной активацией (РАС8), также могут быть использованы для выделения антител, специфичных в отношении С0ВР.
Антитела могут быть связаны со множеством различных носителей. Носители могут быть активными и/или инертными. Примеры хорошо известных носителей включают полипропилен, полистирол, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, стекло, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Носитель может быть растворимым или нерастворимым в зависимости от задач изобретения. Специалисту в данной области техники известны другие подходящие носители для связывания антител, или он способен оценить такие носители с использованием стандарных экспериментов. В некоторых воплощениях носитель содержит группировку, которая нацелена на миокард.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют с использованием обычных способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы (такие как экспрессирующие векторы, раскрытые в публикации заявки РСТ № \¥0 87/04462), которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки Е. сой, клетки С08 обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые не продуцируют иначе белок иммуноглобулин, с достижением синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. См., например, публикацию заявки РСТ № XV0 87/04462. ДНК также может быть модифицирована, например, путем замещения кодирующей последовательности на константные домены человеческой тяжелой и легкой цепи вместо гомологичных мышиных последовательностей, Моткоп е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8сР 81:6851 (1984), или путем ковалентного присоединения к последовательности, кодирующей иммуноглобулин, всей или части кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида. Таким образом, получают химерные или гибридные антитела, которые здесь обладают специфичностью связывания моноклинального антитела против С0ВР.
Антагонистические антитела против С0ВР и полипептиды, имеющие происхождение из антител, могут быть идентифицированы или охарактеризованы с использованием способов, изестных в данной области техники, посредством чего обнаруживают и/или измеряют сокращение, уменьшение интенсивности или нейтрализацию биологической активности С0ВР. Например, антагонистическое антитело против С0ВР также может быть идентифицировано путем инкубации агента-кандидата с С0ВР и обнаружения любой одной или более чем одной из следующих характеристик: (а) связывание с С0ВР; (б) блокирование связывания С0ВР с его рецептором(ами); (в) блокирование или уменьшение активации рецептора С0ВР (включая активацию сАМР); (г) ингибирование биологической активности С0ВР или последующих путей, опосредованных сигнальной функцией С0ВР; (д) профилактика, уменьшение интенсивности или лечение любого вида головной боли (например, мигрени); (е) увеличение клиренса С0ВР и (ж) ингибирование (уменьшение) синтеза, продукции или высвобождения С0ВР. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против С0ВР или полипептид идентифицируют путем инкубации агента-кандидата с С0ВР и обнаружения связывания и/или сопутствующего уменьшения или нейтрализации биологической активности С0ВР. Анализ связывания может быть осуществлен с очищенным(и) полипептидом(ами) С0ВР или с клетками, экспрессирующими в природе, или трансфицированными для экспрессии полипептида(ов) С0ВР. В одном из воплощений анализ связывания представляет собой конкурентный анализ связывания, в котором оценивают способность антитела-кандидата конкурировать с известным антагонистом против С0ВР за связывание с С0ВР. Анализ может быть проведен в различных форматах, включая формат ЕЬ18А. В других воплощениях антагонистическое антитело против С0ВР идентифицируют путем инкубации агента-кандидата с С0ВР и обнаружения связывания и сопутствующего ингибирования активации рецептора С0ВР, экспрессируемого на поверхности клетки.
После исходной идентификации активность антагонистического антитела-кандидата против С0ВР может быть дополнительно подтверждена и оптимизирована при помощи биоанализов, известных для тестирования целевых биологических активностей. Альтернативно, биоанализы могут быть использованы для непосредственного скрининга кандидатов. Например, С0ВР стимулирует ряд измеряемых изменений в реагирующих клетках. Эти изменения включают стимуляцию с АМР в клетке (например, клетки
- 23 015526 δΚ-Ν-МС), но не ограничены ими. Антагонистическая активность также может быть измерена с использованием животных моделей, таких как измерение расширения кровеносных сосудов кожи, вызванного стимуляцией подкожного нерва крысы. Ексой е! а1., Βτ. 1. РНагтасо1. 110: 772-776, 1993. Животные модели головных болей (таких как мигрень) дополнительно могут быть использованы для тестирования эффективности антагонистических антител или полипептидов. Веи1ет, е! а1., Еипсйопа1 №иго1о§у (15) 8ирр1. 3, 2000. Некоторые из способов идентификации и характеристики антагонистического антитела против С0КР или полипептида подробно описаны в примерах.
Антагонистические антитела против С0КР могут быть охарактеризованы с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. Например, один из способов заключается в идентификации эпитопа, по которому осуществляется связывание, или эпитопное картирование. Существует множество известных в данной области техники способов для картирования и характеризации расположения эпитопов на белках, включающих распознавание кристаллической структуры комплекса антителоантиген, конкурентные анализы, анализы экспрессии генных фрагментов и анализы, основанные на синтетических пептидах, описанные, например, в СНар!ег 11 оГ Нат1оте апб Ьапе, Икшд АпйЬоб1ек, а ЬаЬота!огу Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота1оту Ргекк, Со1б 8ртшд НагЬог, Νονν Уогк. 1999. В дополнительном примере картирование эпитопа может быть использовано для определения последовательности, с которой связывается антагонистическое антитело против С0КР. Картирование эпитопа имеется в продаже от различных источников, например Рерксап 8ук1етк (ЕбеШетЩед 15, 8219 РН Ье1ук1аб, ТНе №1йег1апбк). Эпитоп может представлять собой линейный эпитоп, т.е. содержащийся в единичной цепи аминокислот, или конформационный эпитоп, образованный трехмерным взаимодействием аминокислот, которые не обязательно могут располагаться в одной цепи. Могут быть выделены или синтезированы (например, рекомбинантным путем) пептиды, имеющие различную длину (например, длину по меньшей мере в 4-6 аминокислот), и использованы для анализов связывания с антагонистическим антителом против С0КР. В еще одном примере эпитоп, с которым связывается антагонистическое антитело против С0КР, может быть определен в систематическом скрининге с использованием перекрывающихся пептидов, имеющих происхождение из последовательности С0КР, и определении связывания с антагонистическим антителом против С0КР. В соответствии с анализами экспрессии генного фрагмента открытую рамку считывания, кодирующую С0КР, фрагментируют либо случайным образом, либо посредством специфических генетических конструкций и определяют реактивность экспрессированных фрагментов С0КР с тестируемым антителом. Генные фрагменты, например, могут быть получены путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) и затем транскрибированы и транслированы в белок ш ν 11го в присутствии радиоактивных аминокислот. Связывание антител с фрагментами С0КР, меченными радиоактивными изотопами, затем определяют путем иммунопреципитации и гель-электрофореза. Некоторые эпитопы также могут быть идентифицированы с использованием крупных библиотек случайных пептидных последовательностей, представленных на поверхности фаговых частиц (фаговых библиотек). Альтернативно, определенная библиотека перекрывающихся пептидных фрагментов может быть тестирована в отношении связывания с тестируемым антителом в простых анализах связывания. В дополнительном примере мутагенез антигенсвязывающего домена, эксперименты с обменом доменами и сканирующий аланином мутагенез могут быть осуществлены для идентификации остатков, требуемых, достаточных и/или необходимых для связывания с эпитопом. Например, эксперименты с обменом доменами могут быть осуществлены с использованием мутантного С0КР, в котором различные фрагменты полипептида С0КР замещены (обмен) последовательностями близкородственного, но антигенно отличающегося белка (такого как еще один член семейства белков нейротрофина). Путем оценки связывания антитела с мутантным С0КР можно оценить важность конкретного фрагмента С0КР для связывания антитела.
В еще одном способе, который может быть использован для характеристики антагонистического антитела против С0КР, конкурентные анализы применяют с другими антителами, которые, как известно, связываются с тем же самым антигеном, т.е. различными фрагментами на С0КР, определяют связывается ли антагонистическое антитело против С0КР с тем же самым эпитопом, как другие антитела. Конкурентные анализы хорошо известны специалистам в данной области техники.
Экспрессирующий вектор может быть использован для прямой экспрессии антагонистического антитела против С0КР. Специалисту в данной области техники известно введение экспрессирующих векторов для достижения экспрессии экзогенного белка ш νί\Ό. См., например, патенты США №№ 6436908; 6413942 и 6376471. Введение экспрессирующих векторов включает местное или системное введение, включая инъекцию, пероральное введение, пушку для частиц или введение через катетер, и местное введение. В еще одном воплощении экспрессирующий вектор вводят непосредственно в симпатический ствол или ганглии или в коронарную артерию, предсердие, желудочек или перикард.
Также можно использовать нацеленную доставку терапевтических композиций, содержащих экспрессирующий вектор или субгеномные полинуклеотиды. Опосредованные рецептором способы доставки ДНК описаны, например, в Гтбей е! а1., Тгепбк БюШсНиоЕ (1993) 11:202; СЫои е! а1., 0епе ТНегареиЦск: Ме11юбк апб АррНсайопк Οί Эйес1 0епе ТгапкГег Ц.А. Ао1ГГ, еб.) (1994); Аи е! а1., Г Бю1. СНет. (1988) 263:621; А и е! а1., ί. Βϊθ1. СНет. (1994) 269:542; 2епке е1 а1., Ргос. №11. Асаб. δα. И8А (1990) 87:3655; Аи е! а1., ί. Бю1. СНет. (1991) 266:338. Терапевтические композиции, содержащие полинуклео
- 24 015526 тид, вводят в диапазоне от приблизительно 100 нг до приблизительно 200 мг ДНК для местного введения в протоколе генной терапии. Также в протоколе генной терапии могут быть использованы диапазоны концентрации ДНК, составляющие от приблизительно 500 нг до приблизительно 50 мг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2 мг, от приблизительно 5 до приблизительно 500 мкг и от приблизительно 20 г до приблизительно 100 мкг ДНК. Терапевтические полинуклеотиды и полипептиды могут быть доставлены с использованием разбавителей для генной доставки. Разбавитель для генной доставки может иметь вирусное или невирусное происхождение (см. в общем 1о11у, Сапсег Сепе ТЬегару (1994) 1:51; К1тига, Нитап Сепе ТЬегару (1994) 5:845; Соппе11у, Нитап Сепе ТЬегару (1995) 1:185; и КарШ1, №1иге СепеЕск (1994) 6:148). Экспрессия таких кодирующих последовательностей может быть индуцирована с использованием эндогенных промоторов млекопитающего или гетерологичных промоторов. Экспресия кодирующей последовательности может быть конститутивной или контролируемой.
Вирусные векторы для доставки желаемого полинуклеотида и экспрессии в желаемой клетке хорошо известны в данной области техники. Примеры вирусных носителей включают рекомбинантные ретровирусы (см., например, публикации заявок РСТ №№ АО 90/07936; АО 94/03622; АО 93/25698; АО 93/25234; АО 93/11230; АО 93/10218; АО 91/02805; патенты США №№ 5219740 и 4777127; патент СВ № 2200651 и европейский патент № 0345242), векторы, основанные на альфавирусах (например, векторы на основе вируса синдбис, вирусе лихорадки леса Семлики (АТСС УК-67; АТСС УК-1247), вирусе РоссРивер (АТСС УК-373; АТСС УК-1246) и вирусе венесуэльского энцефалита лошадей (АТСС УК-923; АТСС УК-1250; АТСС УК-1249; АТСС УК-532)), и векторы на основе аденоассоциированного вируса (ААУ) (см., например, публикации заявок РСТ №№ АО 94/12649, АО 93/03769; АО 93/19191; АО 94/28938; АО 95/11984 и АО 95/00655), но не ограничены ими. Также может быть использовано введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано в Сипе1, Нит. Сепе ТЬег. (1992) 3:147.
Также могут быть использованы невирусные носители для доставки и способы, включающие поликатионную конденсированную ДНК, связанную или несвязанную с убитым аденовирусом (см., например, Сипе1, Нит. Сепе ТЬег. (1992) 3:147); связанную с лигандом ДНК (см., например, Аи, 1. Вю1. СЬет. (1989) 264:16985); клетки-носители для доставки в эукариотическую клетку (см., например, патент США № 5814482; публикации заявок РСТ №№ АО 95/07994; АО 96/17072; АО 95/30763 и АО 97/42338) и нейтрализацию ядерного заряда или слияние с клеточными мембранами, но не ограничены ими. Также могут быть использованы депротеинизированные ДНК. Примеры способов введения депротеинизированной ДНК описаны в публикации заявки РСТ № АО 90/11092 и патенте США № 5580859. Липосомы, которые могут действовать в качестве носителей для доставки, описаны в патенте США № 5422120; публикациях заявок РСТ №№ АО 95/13796; АО 94/23697; АО 91/14445 и ЕР 0524968. Дополнительные подходы описаны в РЬШр, Мо1. Се11 Вю1. (1994) 14:2411 и в Аойепйш, Ргос. №11. Асай. 8сг (1994) 91:1581.
В. Антитело С1 и родственные антитела, полипептиды, полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева.
Данное изобретение охватывает композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие антитело С1 и его варианты, представленные в табл. 6, или полипептид, имеющий происхождение из антитела С1 и его вариантов, представленных в табл. 6; и полинуклеотиды, включающие последовательности, кодирующие С1 и его варианты или полипептид. Использованные здесь композиции содержат одно или более чем одно антитело или полипептид (который может представлять собой или не представлять собой антитело), связывающийся с ССКР, и/или один или более чем один полинуклеотид, включающий последовательности, кодирующие одно или более чем одно антитело или полипептид, связывающийся с ССКР. Эти композиции дополнительно могут содержать подходящие эксципиенты, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты, включая буферы, которые хорошо известны в данной области техники.
Антагонистические антитела против ССКР и полипептиды по изобретению характеризуются любой (одной или более чем одной) из следующих характеристик: (а) связывание с ССКР; (б) блокирование связывания ССКР с его рецептором(ами); (в) блокирование или уменьшение активации рецептора ССКР (включая активацию сАМР); (г) ингибирование биологической активности ССКР или последующих путей, опосредованных сигнальной функцией ССКР; (д) профилактика, уменьшение интенсивности или лечение любого вида головной боли (например, мигрени); (е) увеличение клиренса ССКР и (ж) ингибирование (уменьшение) синтеза, продукции или высвобождения ССКР.
Соответственно, в изобретении предложено любое из следующих, или композиции (включая фармацевтические композиции), содержащие любое из следующих: (а) антитело С1 или его варианты, представленные в табл. 6; (б) фрагмент или область антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (в) легкую цепь антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (г) тяжелую цепь антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (д) одну или более чем одну вариабельную область(и) легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (е) один или более чем один СЭК (один, два, три, четыре, пять или шесть СЭК) антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (ж) СЭК Н3 тяжелой цепи антитела С1; (з) СЭК Ь3 легкой цепи антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (и) три СЭК легкой цепи антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (к) три СЭК тяжелой цепи антитела С1 или его вариантов, представленных в табл.
- 25 015526
6; (л) три СОК легкой цепи и три СОК тяжелой цепи антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6; и (м) антитело, включающее любое одно из (б)-(л). В изобретении также предложены полипептиды, включающие любое одно или более чем одно из приведенных выше.
Фрагменты СОК антитела С1 (включая СОК Чотиа и Кабата) схематически изображены на фиг. 5. Определение областей СОК находится в пределах знаний специалиста в данной области техники. Понятно, что в некоторых воплощениях СОК может представлять собой комбинацию СОК Кабата и Чотиа (также называемую комбинированный СОК или расширенный СОК). В некоторых воплощениях СОК представляют собой СОК Кабата. В других воплощениях СОК представляют собой СОК Чотиа. Другими словами, в воплощениях с более чем одним СОК, СОК могут представлять собой любые из СОК Кабата, Чотиа, комбинированных СОК или их комбинаций.
В некоторых воплощениях в изобретении предложен полипептид (который может представлять собой или не представлять собой антитело), который содержит по меньшей мере один СОК, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или все шесть СОК, по существу, идентичные по меньшей мере одному СОК, по меньшей мере двум, по меньшей мере трем, по меньшей мере четырем, по меньшей мере пяти или всем шести СОК С1 или его вариантов, представленных в табл. 6. Другие воплощения включают антитела, которые имеют по меньшей мере два, три, четыре, пять или шесть СОК, по существу, идентичные по меньшей мере двум, трем, четырем, пяти или шести СОК С1 или имеющие происхождение из С1. В некоторых воплощениях по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть СОК по меньшей мере приблизительно на 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны по меньшей мере одному, двум, трем, четырем, пяти или шести СОК С1 или его вариантов, представленных в табл. 6. Понятно, что для задач изобретения специфичность связывания и/или общая активность, как правило, сохраняются, хотя степень активности может варьировать по сравнению с С1 или его вариантами, представленными в табл. 6 (может быть больше или меньше).
В изобретении также предложен полипептид (который может представлять собой или не представлять собой антитело), который содержит аминокислотную последовательность С1 или его вариантов, представленных в табл. 6, имеющий любое из следующего: по меньшей мере 5 смежных аминокислот, по меньшей мере 8 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 10 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 15 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 20 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 25 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 30 смежных аминокислот последовательности С1 или его вариантов, представленных в табл. 6, где по меньшей мере 3 из аминокислот происходят из вариабельной области С1 (фиг. 5) или его вариантов, представленных в табл. 6. В одном из воплощений вариабельная область происходит из легкой цепи С1. В еще одном воплощении вариабельная область происходит из тяжелой цепи С1. Пример полипептида имеет смежные аминокислоты (длины описаны выше) из вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепей С1. В еще одном воплощении 5 (или более) смежных аминокислот происходят из гипервариабельного участка (СОК) С1, представленного на фиг. 5. В некоторых воплощениях смежные амино кислоты происходят из вариабельной области С1.
Аффинность связывания (Кс) антагонистического антитела против ССКР и полипептида в отношении ССКР (такого как человеческий α-ССКР) может составлять от приблизительно 0,06 до приблизительно 200 нМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания составляет любое значение из приблизительно 200, 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500, приблизительно 100, приблизительно 60, приблизительно 50, приблизительно 20, приблизительно 15, приблизительно 10, приблизительно 5 или приблизительно 2 пМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания составляет менее чем любое значение из приблизительно 250, приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500, приблизительно 100 или приблизительно 50 пМ.
В изобретении также предложены способы получения любого из этих антител или полипептидов. Антитела по изобретению могут быть получены способами, известными в данной области техники. Полипептиды могут быть получены путем протеолитического или иного расщепления антител рекомбинантными способами (т. е. единичные или слитые полипептиды), как описано выше, или путем химического синтеза. Полипептиды антител, в особенности более короткие полипептиды длиной приблизительно до 50 аминокислот, для удобства получают химическим синтезом. Способы химического синтеза известны в данной области техники и имеются в продаже. Например, антитело может быть получено при помощи автоматического полипептидного синтезатора с использованием твердофазного способа. См. также патенты США №№ 5807715; 4816567 и 6331415.
В еще одном альтернативном воплощении антитела могут быть получены рекомбинантным путем с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. В одном из воплощений полинуклеотид включает последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела С1, представленного в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10. В еще одном воплощении полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 9 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10, клонируют в одном или более чем одном векторе для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующая интересующее антитело, может сохраняться в векторе в клетке-хозяине, и эту
- 26 015526 клетку-хозяин затем можно размножать и замораживать для будущего применения. Здесь дополнительно описаны векторы (включающие экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева.
Данное изобретение также охватывает одноцепочечные фрагменты вариабельной области (кеРу) антител по изобретению, таких как С1. Одноцепочечные фрагменты вариабельной области получают путем связывания вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи с использованием короткого связывающего пептида. Βιγ6 е! а1. (1988) 8е1епее 242:423-426. Пример связывающего пептида представляет собой (СССС8)3, который образует мостик длиной приблизительно 3,5 нм между карбоксильным концом одной вариабельной области и аминоконцом другой вариабельной области. Разработаны и применяют линкеры других последовательностей. Βιγ6 е! а1. (1988). В свою очередь, линкеры могут быть модифицированы для дополнительных функций, таких как присоединение лекарств или присоединение к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты могут быть получены либо рекомбинантным, либо синтетическим путем. Для синтетического получения кеРу можно применять автоматический синтезатор. Для рекомбинантной продукции кеРу подходящая плазмида, содержащая полинуклеотид, кодирующий кеРу, может быть введена в подходящую клетку-хозяин, являющуюся либо эукариотической, такой как клетки дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих, либо прокариотической, такой как Е. ео11. Полинуклеотиды, кодирующие интересующую кеРу, могут быть получены при помощи стандартных манипуляций, таких как лигирование полинуклеотидов. Получающаяся в результате кеРу может быть выделена с использованием стандартных способов очистки белков, известных в данной области техники.
Также охватываются другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой двухвалентные биспецифические антитела, в которых домены УН и УЪ экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для обеспечения возможности объединения двух доменов на одной и той же цепи, тем самым вынуждая домены объединяться с комплементарными доменами другой цепи и образуя два антигенсвязывающих сайта (см., например, НоШдег, Р., е! а1. (1993) Ргое. №111. Аеаб 8е1. И8А 90:6444-6448; РоЦак, КД., е! а1. (1994) 81гие!иге 2:1121-1123).
Например, биспецифические антитела, моноклональные антитела, обладающие специфичностями связывания в отношении по меньшей мере двух различных антигенов, могут быть получены с использованием раскрытых здесь антител. Способы получения биспецифических антител известны в данной области техники (см., например, 8игекй е! а1., 1986, МеЙюбк ш Еп/уто1оду 121:210). Традиционно, рекомбинантное получение биспецифических антител основано на коэкспрессии пар тяжелая цепь-легкая цепь двух иммуноглобулинов, где две тяжелые цепи имеют разную специфичность (М111к!еш апб Сие11о, 1983, №!иге 305, 537-539).
В соответствии с одним из подходов получения биспецифических антител вариабельные домены антитела, имеющие желаемые специфичности связывания (антигенсвязывающие центры антитела), подвергают слиянию с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Слияние предпочтительно осуществляют с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, включающим по меньшей мере часть шарнирной области СН2 и СН3. Предпочтительно, чтобы константная область первой тяжелой цепи (СН1), содержащая сайт, необходимый для связывания с легкой цепью, присутствовала по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелых цепей иммуноглобулинов и, если желательно, легких цепей иммуноглобулинов, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает значительную гибкость в выборе взаимных соотношений трех полипептидных фрагментов в воплощениях, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, обеспечивают оптимальные выходы. Тем не менее, можно встраивать кодирующие последовательности двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит в результате к высоким выходам, или когда эти соотношения не имеют конкретной значимости.
В одном из подходов биспецифические антитела состоят из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина с первой специфичностью связывания, с одной стороны, и пары тяжелая цепь-легкая цепь гибридного иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания), с другой стороны. Эта асимметричная структура с легкой цепью иммуноглобулина только в одной половине биспецифичной молекулы облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновой цепи. Этот подход описан в заявке РСТ № \¥О 94/04690, опубликованной 3 марта 1994 г.
Гетероконъюгатные антитела, включающие два ковалентно связанных антитела, также находятся в объеме данного изобретения. Такие антитела используют для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения инфекции вируса иммунодефицита (ВИЧ) (публикация РСТ №№ XV О 91/00360 и XVО 92/200373; ЕР 03089). Гетероконъюгатные антитела могут быть получены с использованием любых удобных способов перекрестного сшивания. Подходящие сшивающие агенты и способы перекрестного сшивания хорошо известны в данной области техники и описаны в патенте США № 4676980.
Химерные или гибридные антитела также могут быть получены ш ν 11го с использованием извест
- 27 015526 ных химических способов синтеза белка, включая те, в которые вовлечены сшивающие агенты. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы с использованием реакции дисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолят и метил-4-меркаптобутиримидат.
Гуманизированное антитело, включающее один или более чем один СОК антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6, или один или более чем один СОК, имеющий происхождение из антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6, может быть получено с использованием любых способов, известных в данной области техники. Например, четыре общие стадии могут быть использованы для гуманизации моноклонального антитела.
Данное изобретение охватывает модификации антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6, включающие функционально эквивалентные антитела, которые не влияют значительно на их свойства, и варианты, которые обладают повышенной или пониженной активностью и/или аффинностью. Например, аминокислотная последовательность антитела С1 или его вариантов, представленных в табл. 6, может быть мутирована с получением антитела, обладающего желаемой аффинностью связывания с ССКР. Модификация полипептидов представляет собой стандартную практику в данной области техники, и нет необходимости подробно описывать ее здесь. Модификация полипептидов проиллюстрирована в примерах.
Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды, имеющие консервативные замены аминокислотных остатков, одну или более чем одну делецию или добавление аминокислот, которые не приводят к существенным неблагоприятным изменениям функциональной активности, или применение химических аналогов.
Вставки в аминокислотную последовательность включают слияния с амино- и/или карбоксильным концом, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или множества аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры вставок по концу включают антитело с Ν-концевым метионильным остатком или антитело, слитое с эпитопным концом. Другие варианты вставки в молекулу антитела включают слияние с Ν- или С-концом антитела фермента или полипептида, которое увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки крови.
Варианты с заменой включают удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка из молекулы антитела и встраивание вместо него различных остатков. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают гипервариабельные области, но также рассматриваются изменения ТК. Консервативные замены представлены в табл. 1 под заголовком консервативные замены. Если такие замены приводят в результате к изменению биологической активности, то могут быть осуществлены более значительные изменения, обозначенные в табл. 1 как примеры замен, или как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислот, и продукты могут быть отобраны и подвергнуты скринингу.
Таблица 1
Замены аминокислот
Исходный остаток Консервативные замены Примеры замен
А1а (А) Уа1 Уа1; Беи; Не
Аг§ (К) Ьуз Буз; 61п; Азп
Азп (Ν) О1п С1п; Ηΐβ; Азр; Буз; Аг§
Азр (Ό) О1и С1и; Азп
Суз (С) 8ег 8ег; А1а
С1п(Р) Азп Азп; С1и
О1и (Е) Азр Азр; С1п
С1у(С) А1а А1а
ΗΪ3 (Н) Аг§ Азп; О1п; Буз; Аг§
11е(1) Ьеи Беи; Уа1; Ме1; А1а; РЬе;
- 28 015526
Норлейцин
Ьеи (Ь) Не Норлейцин; Не; Уа1; Ме!; А1а; РЬе
ЬУ8(К) Аг§ Аг§; С1п; Азп
Ме1 (М) Ьеи Ьеи; РЬе; Не
РЬе (Г) Туг Ьеи; Уа1; Не; А1а; Туг
Рго (Р) А1а А1а
8ег(8) ТЬг ТЬг
ТЬг(Т) 8ег 8ег
Тгр (ЗУ) Туг Туг; РЬе
Туг(¥) РЬе Тгр; РЬе; ТЬг; 8ег
Уа1 (V) Ьеи Не; Ьеи; Ме1; РЬе; А1а; Норлейцин
Значительные модификации биологических свойств антитела осуществляют путем выбора замен, которые значительно отличаются по их эффекту в отношении поддержания (а) структуры полипептидного каркаса в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (б) заряда или гидрофобности молекулы в сайте мишени или (в) объема боковой цепи. Встречающиеся в природе остатки разделяют на группы, основываясь на общих свойствах боковой цепи:
(1) неполярные: норлейцин, Ме1, А1а, Уа1, Ьеи, Не;
(2) полярные без заряда: Суз, 8ег, ТЬг, Азп, Ст;
(3) кислые (отрицательно заряженные): Азр, С1и;
(4) основные (положительно заряженные): Ьуз, Агд;
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: С1у, Рго и (6) ароматические: Тгр, Туг, РЬе, Н1з.
Неконсервативные замены осуществляют путем замены представителя одного из этих классов на представители другого класса.
Любой цистеиновый остаток, не вовлеченный в поддержание правильной конформации антитела, также может быть заменен, как правило, на серин, с улучшением стабильности молекулы к окислению и предотвращением аномального перекрестного связывания. Наоборот, цистеиновая(ые) связь(и) может(гут) быть введена(ы) в антитело для улучшения его стабильности, в частности, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Ρν-фрагмент.
Модификации аминокислот могут варьировать от замены или модификации одной или более чем одной аминокислоты до полного реконструирования области, такой как вариабельная область. Изменения в вариабельной области могут изменять аффинность и/или специфичность связывания. В некоторых воплощениях в домене СОК осуществляют замены не более чем 1-5 консервативных аминокислот. В других воплощениях в домене СОК осуществляют замены не более чем 1-3 консервативных аминокислот. В других воплощениях домен СОК представляет собой СОК Н3 и/или СОКЕ3.
Модификации также включают гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды, обладающие другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Антитела гликозилированы в консервативных положениях в их константных областях (Дейепз апб Ьипб, 1997, СЬет. 1ттипо1. 65:111-128; ШпдЬ1 апб Мотзоп, 1997, Т1ЬТЕСН 15:26-32). Олигосахаридные боковые цепи иммуноглобулинов влияют на функцию белка (Воуб е! а1., 1996, Мо1. 1ттипо1. 32:1311-1318; Ш1И\уе апб Но^агб, 1990, ВюсЬет. 29:4175-4180) и внутримолекулярное взаимодействие между фрагментами гликопротеина, что может оказать влияние на конформацию и презентируемую трехмерную поверхность гликопротеина (Нейепз апб Ьипб, выше; Шузз апб Шадпег, 1996, Сиггеп! 0рт. Вю1есЬ. 7:409-416). Олигосахариды также могут служить для нацеливания данного гликопротеина на некоторые молекулы, основываясь на специфических распознающих структурах. Также сообщали о том, что гликозилирование антител оказывает влияние на антителозависимую клеточную цитотоксичность (АОСС). В частности, сообщали о том, что клетки яичника китайского хомячка (СНО) с регулируемой тетрациклином экспрессией β(1,4)Χацетилглюкозаминилтрансферазы III (СпТШ), катализируемым гликозилтрансферазой образованием разрезанного пополам СIсNАс, обладают улучшенной активностью А ОСС (Цтапа е! а1, 1999, Ма1иге Вю1есЬ. 17:176-180).
Гликозилирование антител, как правило, является либо ^связанным, либо О-связанным. N Гликозилирование относится к присоединению углеводной группировки к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин, аспарагин-Х-треонин и аспарагин-Хцистеин, где X представляет собой любую аминокислоту за исключением пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводной группировки к бо
- 29 015526 ковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-Гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров Ν-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, наиболее обычно серину или треонину, хотя также может быть использован 5-гидроксипролин или 5гидроксилизин.
Добавление сайтов гликозилирования в антитело для удобства осуществляют путем изменения аминокислотной последовательности, так чтобы она содержала одну или более чем одну из вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов Ν-гликозилирования). Изменение также может быть осуществлено путем добавления одного или более чем одного остатка серина или треонина к последовательности исходного антитела, или замены на него (для сайтов О-гликозилирования).
Тип гликозилирования антител также может быть изменен без изменения исходной нуклеотидной последовательности. Гликозилирование в значительной степени зависит от клетки-хозяина, используемой для экспрессии антитела. Поскольку тип клетки, используемой для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов, например антител, в качестве потенциальных терапевтических агентов, редко является нативным, можно ожидать изменения типа гликозилирования антител (см., например, Нке е! а1., 1997, 1. Вю1. Скет. 272:9062-9070).
В дополнение к выбору клеток-хозяев, факторы, влияющие на гликозилирование при рекомбинантной продукции антител, включают способ выращивания, приготовление сред, плотность культуры, насыщение кислородом, рН, схемы очистки и тому подобное. Для изменения типа гликозилирования, достигаемого в конкретном организме-хозяине, предложены различные способы, включающие введение или сверхэкспрессию некоторых ферментов, вовлеченных в продукцию олигосахарида (патенты США №№ 5047335; 5510261 и 5278299). Гликозилирование или некоторые типы гликозилирования могут быть ферментативно удалены из гликопротеина, например, с использованием эндогликозидазы Н (Епйо Н), Νгликозидазы Р, эндогликозидазы Р1, эндогликозидазы Р2, эндогликозидазы Р3. Дополнительно, рекомбинантная клетка-хозяин может быть сконструирована путем генетической инженерии таким образом, чтобы быть дефектной по процессингу некоторых типов полисахаридов. Эти и подобные способы хорошо известны в данной области техники.
Другие способы модификации включают применение методик сочетания, известных в данной области техники, включая ферментативные средства, окислительное замещение и хелатообразование, но не ограничиваясь ими. Модификации могут быть использованы, например, для присоединения меток для иммуноанализа. Модифицированные полипептиды С1 получают с использованием способов, признанных в данной области техники, и могут быть отобраны с использованием стандартных анализов, известных в данной области техники, некоторые из которых описаны ниже и в примерах.
В некоторых воплощениях изобретения антитело включает модифицированную константную область, такую как константная область, которая иммунологически инертна или частично инертна, например, не запускает комплементопосредованный лизис, не стимулирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЭСС) или не активирует микроглию; или обладает пониженными активностями (по сравнению с немодифицированным антителом) в любом одном или более чем одном из следующего: запуск комплементопосредованного лизиса, стимуляция антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЭСС) или активация микроглии. Различные модификации константной области могут быть использованы для достижения оптимального уровня и/или комбинации эффекторных функций. См., например, Могдап е! а1., 1ттипо1оду 86:319-324 (1995); Ьипй е! а1., 1. 1ттипо1оду 157:4963-9 157:4963-4969 (1996); 1йикод1е е! а1., 1. 1ттипо1оду 164:4178-4184 (2000); Тао е! а1., 1. 1ттипо1оду 143: 2595-2601 (1989); и 1еПспк е! а1. 1ттипо1одюа1 Кеу1е^к 163:59-76 (1998). В некоторых воплощениях константная область модифицирована, как описано в Еиг. 1. 1ттипо1. (1999) 29:2613-2624; заявке на патент РСТ № РСТ/СВ 99/01441 и/или заявке на патент ИК № 9809951.8. В других воплощениях антитело включает константную область тяжелой цепи человеческого 1дС2а, содержащую следующие мутации: А330Р331 на 83308331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательность 1дС2а дикого типа). Еиг. 1. 1ттипо1. (1999) 29:2613-2624. В других воплощениях константная область агликозилирована для Ν-гликозилирования. В некоторых воплощениях константная область агликозилирована для Ν-гликозилирования путем мутации гликозилированного аминокислотного остатка или фланкирующих остатков, представляющих собой часть последовательности распознавания Ν-гликозилирования в константной области. Например, сайт для Ν-гликозилирования Ν297 может быть мутирован до А, О, К или Н. См. Тао е! а1., 1. 1ттипо1оду 143: 2595-2601 (1989); и 1еГГепк е! а1., 1ттипо1од1са1 Кеу1е^к 163:5976 (1998). В некоторых воплощениях константная область агликозилирована для Ν-гликозилирования. Константная область может быть агликозилирована для Ν-гликозилирования ферментативным путем (таким как удаление углевода при помощи фермента РNСазы) или путем экспрессии в клетке-хозяине, дефектной по гликозилированию.
Другие модификации антитела включают антитела, которые модифицированы, как описано в публикации РСТ № \¥О 99/58572, опубликованной 18 ноября 1999 г. Эти антитела включают, в дополнение к связующему домену, направленному на молекулу-мишень, эффекторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу, гомологичную всему константному домену тяжелой цепи че
- 30 015526 ловеческого иммуноглобулина или его части. Эти антитела способны связываться с молекулой-мишенью без запуска существенного комплементзависимого лизиса или клеточноопосредованного разрушения мишени. В некоторых воплощениях эффекторный домен способен специфически связываться с БсЯп и/или БсуЯНЬ. Они, как правило, основаны на химерных доменах, имеющих происхождение из двух или более чем двух доменов СН2 тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. Антитела, модифицированные таким образом, особенно подходят для применения в длительной терапии антителами для того, чтобы избежать воспаления и других отрицательных реакций, присущих обычной терапии антителами.
Данное изобретение включает аффинно зрелые воплощения. Например, аффинно зрелые антитела могут быть получены способами, известными в данной области техники (Магкк е1 а1., 1992, В1о/ТесЬпо1оду, 10:779-783; ВагЬак е! а1., 1994, Ргос Асай. 8с1, И8А 91:3809-3813; 8сЫеге(а1., 1995, 6епе, 169:147-155; Уе1!оп е! а1., 1995, 1. 1ттипо1., 155:1994-2004; 1аск§оп е! а1., 1995, 1. 1ттипо1., 154(7):3310-9; НамЗстз е! а1. 1992, 1. Мо1. Вю1., 226:889-896 и АО 2004/058184).
Следующие способы могут быть использованы для коррекции аффинности антитела и характеризации СОЯ. Один из путей характеризации СОЯ антитела и/или изменения (такого как улучшение) аффинности связывания полипептида, такого как антитело, называют библиотечный сканирующий мутагенез. Как правило, библиотечный сканирующий мутагенез действует следующим образом. Одно или более чем одно положение аминокислоты в СОЯ заменяют двумя или более чем двумя (например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) аминокислотами с использованием признанных в данной области техники способов. Это создает небольшие библиотеки клонов (в некоторых воплощениях по одной для каждого положения аминокислоты, которую анализируют), каждый из которых состоит из комплекса двух или более чем двух членов (если в каждом положении заменены две или более чем две аминокислоты). Как правило, библиотека также включает клон, включающий нативную (не подвергнутую замене) аминокислоту. Небольшое количество клонов, например приблизительно 20-80 клонов (в зависимости от комплексности библиотеки), из каждой библиотеки отбирают в отношении аффинности связывания с полипептидом-мишенью (или другой мишенью связывания) и идентифицируют кандидаты, обладающие повышенным, таким же, пониженным связыванием или отсутствием связывания. Способы определения аффинности связывания хорошо известны в данной области техники. Аффинность связывания может быть определена с использованием поверхностно-плазмонного резонансного анализа В1асоге, который обнаруживает не менее чем 2-кратные различия в аффинности связывания. В частности, В1асоге является полезным, когда исходное антитело уже связывается с относительно высокой аффинностью, например с Кс, составляющей приблизительно 10 нМ или ниже. Отбор с использованием поверхностноплазмонного резонанса В1асоге описан здесь в примерах.
Аффинность связывания может быть определена с использованием биосенсора Ктеха, сцинтилляционных анализов близкого расстояния, ЕЬ18А, иммуноанализа ОЯI6ЕN (16Е№), флуоресцентного гашения, флуоресцентного переноса и/или дрожжевого дисплея. Аффинность связывания также может быть выбрана с использованием подходящего биоанализа.
В некоторых воплощениях осуществляют замену в каждом положении аминокислоты в СОЯ (в некоторых воплощениях по одной) всеми 20 природными аминокислотами с использованием признанных в данной области техники способов мутагенеза (некоторые из которых описаны здесь). Это создает небольшие библиотеки клонов (в некоторых воплощениях по одной для каждого положения аминокислоты, которую анализируют), каждую с комплексом из 20 членов (если все 20 аминокислот заменены в каждом положении).
В некоторых воплощениях библиотека, в которой производят отбор, включает замены в двух или более чем двух положениях, которые могут быть в одном и том же СОЯ или в двух или более чем двух СОЯ. Таким образом, библиотека может включать замены в двух или более чем двух положениях в одном СОЯ. Библиотека может включать замену в двух или более чем двух положениях в двух или более чем двух СОЯ. Библиотека может включать замену в 3, 4, 5 или более положениях, причем указанные положения обнаружены в двух, трех, четырех, пяти или шести СОЯ. Замена может быть осуществлена с использованием кодонов с низкой избыточностью. См., например, табл. 2 в Ва1т! е! а1., (1993), 6епе 137(1): 109-18).
СОЯ может представлять собой 0ΌΒΗ3 и/или СПЯБ3. СОЯ может представлять собой один или более чем один из СОЯЫ, СПЯБ2, СПЯБ3, СОЯН1, 0ΌΒΗ2 и/или 0ΌΒΗ3. СОЯ может представлять собой СОЯ Кабата, СОЯ Чотиа или расширенный СОЯ.
Кандидаты, обладающие улучшенным связыванием, могут быть секвенированы, таким образом давая возможность для идентификации мутанта по замене в СОЯ, приводящем в результате к улучшенной аффинности (также называемого улучшенной заменой). Кандидаты, которые связываются, также могут быть секвенированы, таким образом давая возможность для идентификации замены в СОЯ, которая сохраняет связывание.
Могут быть проведены множественные раунды отбора. Например, кандидаты (каждый из которых включает замену аминокислоты в одном или более чем одном положении в одном или более чем одном СОЯ), обладающие улучшенным связыванием, также полезны для конструирования второй библиотеки, содержащей, по меньшей мере, исходную и замененную аминокислоту в каждом улучшенном положе
- 31 015526 нии СОК (то есть положение аминокислоты в СОК, по которому мутант, подвергнутый замене, демонстрирует улучшенное связывание). Получение и скрининг или отбор этой библиотеки дополнительно обсуждается ниже.
Библиотечный сканирующий мутагенез также предоставляет средство для характеристики СОК, поскольку частота клонов, обладающих улучшенным связыванием, таким же связыванием, пониженным связыванием или отсутствием связывания, также дает информацию, касающуюся важности положения каждой аминокислоты для стабильности комплекса антитело-антиген. Например, если положение СОК сохраняет связывание при замене на все 20 аминокислот, такое положение идентифицируют как положение, которое вряд ли необходимо для связывания антигена. Наоборот, если положение СОК сохраняет связывание только при небольшом проценте замен, такое положение идентифицируют как положение, которое является важным для функции СОК. Таким образом, способы библиотечного сканирующего мутагенеза дают информацию, касающуюся положений в СОК, которые могут быть заменены на множество различных аминокислот (включая все 20 аминокислот), и положений в СОК, которые не могут быть заменены или которые могут быть заменены только некоторыми аминокислотами.
Кандидаты, обладающие улучшенной аффинностью, могут быть комбинированы во второй библиотеке, которая включает улучшенную аминокислоту, исходную аминокислоту в этом положении, и дополнительно могут включать дополнительные замены в этом положении в зависимости от комплексности библиотеки, которая желательна или допустима с использованием желаемого способа скрининга или отбора. В дополнение, если желательно, положение соседней аминокислоты можно рандомизировать по меньшей мере до двух или более чем двух аминокислот. Рандомизация соседних аминокислот может обеспечивать дополнительную конформационную гибкость в мутантном СОК, которая, в свою очередь, может обеспечивать или облегчать введение большего количества улучшенных мутаций. Библиотека также может включать замену в положениях, которые не демонстрировали улучшенную аффинность в первом раунде скрининга.
Во второй библиотеке отбирают или выбирают члены библиотеки, обладающие улучшенной и/или измененной аффинностью связывания, с использованием любого из способов, известных в данной области техники, включая скрининг с использованием поверхностно-плазмонного резонансного анализа Ыасоге, и отбор с использованием любого из известных в данной области техники способов, включая фаговый дисплей, дрожжевой дисплей и рибосомальный дисплей.
Данное изобретение также охватывает слитые белки, включающие один или более чем один фрагмент или область антитела (такого как С1) или полипептида по изобретению. В одном из воплощений предложен слитый полипептид, который включает по меньшей мере 10 соседних аминокислот вариабельной области легкой цепи, представленной в ЗЕр ΙΌ N0: 2 (фиг. 5), и/или по меньшей мере 10 аминокислот вариабельной области тяжелой цепи, представленной в ЗЕр ΙΌ N0: 1 (фиг. 5). В других воплощениях предложен слитый полипептид, который включает по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25 или по меньшей мере приблизительно 30 соседних аминокислот вариабельной области легкой цепи, представленной в ЗЕр ΙΌ N0: 2 (фиг. 5), и/или по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25 или по меньшей мере приблизительно 30 соседних аминокислот вариабельной области тяжелой цепи, представленной в ЗЕр ΙΌ N0: 1 (фиг. 5). В еще одном воплощении слитый полипептид включает вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи С1, как представлено в ЗЕр ΙΌ N0: 2 и ЗЕр ΙΌ N0: 1 на фиг. 5. В еще одном воплощении слитый полипептид включает один или более чем один СОК С1. В других воплощениях слитый полипептид включает СОК Н3 и/или СОК Ь3 антитела С1. Для целей данного изобретения слитый белок С1 содержит одно или более чем одно антитело С1 и другую аминокислотную последовательность, к которой в нативной молекуле оно не присоединено, например гетерологичную последовательность или гомологичную последовательность из другой области. Примеры гетерологичных последовательностей включают метку, такую как метку БЬАС или метку 6Н1К, но не ограничены ими. Метки хорошо известны в данной области техники.
Слитый полипептид С1 может быть получен с использованием способов, известных в данной области техники, например синтетических или рекомбинантных. Как правило, слитые белки С1 по изобретению получают с помощью экспрессирующего полинуклеотида, кодирующего их, с использованием описанных здесь рекомбинантных способов, хотя они также могут быть получены с использованием других средств, известных в данной области техники, включая, например, химический синтез.
В изобретении также предложены композиции, включающие антитела или полипептиды, происходящие из С1, конъюгированные (например, связанные) с агентом, который облегчает связывание с твердым носителем (таким как биотин или авидин). Для простоты, как правило, ссылаются на С1 или антитела, понимая, что эти способы применимы к любому из описанных здесь воплощений связывания ССКР. Конъюгация, как правило, относится к связыванию этих компонентов, как описано здесь. Связывание (которое, как правило, фиксирует эти компоненты в тесной ассоциации, по меньшей мере, для введения) может быть достигнуто различными путями. Например, возможно прямое взаимодействие между агентом и антителом, когда каждый несет заместитель, способный вступать во взаимодействие с другим. На
- 32 015526 пример нуклеофильная группа, такая как амино или сульфгидрильная группа, на одном может быть способна к взаимодействию с карбонилсодержащей группой, такой как ангидрид или галогенангидрид, или с алкильной группой, содержащей хорошую уходящую группу (например, галогенид), на другом.
Антитело или полипептид по изобретению может быть связан с метящим агентом (альтернативно называемым метка), таким как флуоресцентная молекула, радиоактивная молекула или любые другие метки, известные в данной области техники.
В данной области техники известны метки, которые, как правило, обеспечивают (либо прямо, либо опосредованно) сигнал.
В изобретении также предложены композиции (включая фармацевтические композиции) и наборы, включающие антитело О1, и, как следует из данного описания, любые или все из описанных здесь антител и/или полипептидов.
В изобретении также предложены выделенные полинуклеотиды, кодирующие антитела и полипептиды по изобретению (включая антитело, включающее полипептидные последовательности вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи, представленные на фиг. 5), а также векторы и клетки-хозяева, включающие полинуклеотид.
Соответственно, в изобретении предложены полинуклеотиды (или композиции, включая фармацевтические композиции), включающие полинуклеотиды, кодирующие любое из следующих: (а) антитело О1 или его варианты, представленные в табл. 6; (б) фрагмент или область антитела О1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (в) легкую цепь антитела О1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (г) тяжелую цепь антитела О1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (д) одну или более чем одну вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела О1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (е) один или более чем один СОР (один, два, три, четыре, пять или шесть СОР) антитела О1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (ж) СОР Н3 тяжелой цепи антитела О1; (з) СОР Ь3 легкой цепи антитела О1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (и) три СОР легкой цепи антитела О1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (к) три СОР тяжелой цепи антитела О1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (л) три СОР легкой цепи и три СОР тяжелой цепи антитела О1 или его вариантов, представленных в табл. 6; и (м) антитело, включающее любое из (б)-(л). В некоторых воплощениях полинуклеотид включает любой или оба из полинуклеотид(ов), представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 9 и 8ЕО ΙΌ. N0: 10.
В еще одном аспекте изобретения предложены полинуклеотиды, кодирующие любые из описанных здесь антител (включая фрагменты антител) и полипептидов, таких как антитела и полипептиды, обладающие нарушенной эффекторной функцией. Полинуклеотиды могут быть получены с использованием способов, известных в данной области техники.
В еще одном аспекте изобретения предложены композиции (такие как фармацевтические композиции), включающие любой из полинуклеотидов по изобретению. В некоторых воплощениях композиция включает экспрессирующий вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий антитело О1, как описано здесь. В другом воплощении композиция включает экспрессирующий вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий любое из описанных здесь антител или полипептидов. В других воплощениях композиция включает любой или оба из полинуклеотидов, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 9 и 8Е0 ΙΌ N0: 10. Экспрессирующие векторы и введение полинуклеотидных композиций дополнительно описано здесь.
В еще одном аспекте изобретения предложен способ получения любого из описанных здесь полинуклеотидов.
Полинуклеотиды, комплементарные любой из таких последовательностей, также охватываются настоящим изобретением. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК (геномную, кДНК или синтетическую) или РНК. Молекулы РНК включают молекулы человеческой РНК, которые содержат нитроны и соответствуют молекуле ДНК один к одному, и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. Дополнительные кодирующие или не кодирующие последовательности не обязательно присутствуют, но могут присутствовать в полинуклеотиде по настоящему изобретению, и полинуклеотид не обязательно, но может быть связан с другими молекулами и/или материалами носителя.
Полинуклеотиды могут включать нативную последовательность (то есть эндогенную последовательность, кодирующую антитело или его фрагмент) или могут включать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотида содержат одну или более чем одну замену, добавку, делецию и/или вставку, так что иммунореактивность кодируемого полипептида не уменьшается по сравнению с нативной иммунореактивной молекулой. Эффект на иммунореактивность кодируемого полипептида, как правило, может быть оценен, как описано здесь. Варианты предпочтительно демонстрируют по меньшей мере приблизительно 70% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% идентичность и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% идентичность с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей нативное антитело или его фрагмент.
Считают, что две полинуклеотидные или полипептидные последовательности идентичны, если последовательность нуклеотидов или аминокислот в двух последовательностях одинакова при их совмещении для максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения двух последовательностей,
- 33 015526 как правило, осуществляют в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательности. Используемое здесь окно сравнения относится к сегменту, составляющему по меньшей мере приблизительно 20 соседних положений, обычно от 30 до приблизительно 75, от 40 до приблизительно 50, в котором последовательность можно сравнивать с последовательностью сравнения, имеющей то же самое количество соседних положений после оптимального совмещения двух последовательностей.
Оптимальное совмещение последовательностей для сравнения может быть осуществлено с использованием программы Медайдп в пакете Ьакегдепе биоинформационного программного обеспечения (ΌΝΑδΤΑΗ, 1пс., Майкоп, №1) с использованием параметров по умолчанию. Эта программа включает несколько схем совмещения, описанных в следующих ссылках: ЭауйоГГ. М.0. (1978) А тойе1 оГ еуо1ийопагу сйапде т рго!е1пк - Майтсек Гог йе!есйпд й1к!ап! ге1а!юпкЫрк. 1п ОауйоГГ, М.0. (ей.) АЙак оГ Рго!ет 8едиепсе апй 8!гис!иге, №Нопа1 Вютей1са1 Кекеагсй Еоипйайоп, №акйтДоп ОС, Уо1. 5, 8ирр1. 3, рр. 345358; Нет 1., 1990, Ишйей Арргоасй, !о Айдптеп! апй Рйу1одепек рр. 626-645 Ме!йойк ш Епхуто1оду уо1. 183, Асайетю Ргекк, 1пс., 8ап П1едо, СА; Шддтк, Ц.О. апй 8йагр, Р.М., 1989, САВ108 5:151-153; Муегк, К№, апй Мийег №., 1988, САВ108 4:11-17; КоЫпкоп, Ε.Ό., 1971, СотЬ. Тйеог. 11:105; 8ап!ои, Ν., №к, М, 1987, Мо1. Вю1. Еуо1. 4:406-425; 8пеа1й, Р.Н.А. апй 8ока1, К.К., 1973, №ппепса1 Тахопоту !йе Рппс1р1ек апй Ргасйсе оГ №ппепса1 Тахопоту, Егеетап Ргекк, 8ап Егапаксо, СА; №11Ьиг, №1. апй Ыртап, Ό.Ε, 1983, Ргос. №!1. Асай. 8οΐ. И8А 80:726-730.
Предпочтительно процент идентичности последовательности определяют путем сравнения двух оптимально совмещенных последовательностей в окне сравнения, состоящего по меньшей мере из 20 положений, где фрагмент полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может включать добавки или делеции (то есть пробелы), составляющие 20% или менее, обычно от 5 до 15% или от 10 до 12% по сравнению с последовательностью сравнения (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального совмещения двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотные остатки имеются в обеих последовательностях, с получением количества положений, по которым обнаружено соответствие, деления этого количества положений, по которым обнаружено соответствие, на общее количество положений в последовательности сравнения (то есть размер окна) и умножения результатов на 100 с получением процента идентичности последовательности.
Варианты могут также, или альтернативно, быть, по существу, гомологичными нативному гену или его фрагменту или комплементу. Такие полинуклеотидные варианты способны гибридизоваться в умеренно строгих условиях с обнаруживаемой в природе последовательностью ДНК, кодирующей нативное антитело (или комплементарную последовательность).
Подходящие умеренно строгие условия включают предварительное промывание в растворе 5х88С (цитрат натрия с хлоридом натрия), 0,5% додецилсульфата натрия (8Ό8), 1,0 мМ этилендиаминтетраксусную кислоту (ЭДТА) (рН 8,0); гибридизацию при 50-65°С, 5х88С, в течение ночи; с последующим промыванием дважды при 65°С в течение 20 мин каждым из 2х, 0,5х и 0,2х88С, содержащим 0,1% 8Ό8.
Используемые здесь сильно строгие условия или условия высокой строгости представляют собой условия, при которых: (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру для промывания, например 0,015М хлорид натрия/0,0015М цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°С; (2) при гибридизации используют денатурирующий агент, такой как формамид, например 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% Е1со11/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ буфера фосфата натрия при рН 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°С; или (3) используют 50% формамид, 5х88С (0,75М №С1, 0,075М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5х раствор Денхарта, обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% 8Ό8 и 10% сульфат декстрана при 42°С, с промывками при 42°С в 0,2х88С (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°С, с последующей промывкой в условиях высокой строгости, состоящих из 0,1х88С, содержащей ЭДТА, при 55°С. Специалисту в данной области техники понятно, каким образом устанавливать температуру, ионную силу и так далее, что необходимо для приспособления к факторам, таким как длина зонда и тому подобное.
Специалисту в данной области техники понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, как описано здесь. Некоторые из этих полинуклеотидов обладают минимальной гомологией с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, варьирующие ввиду различий в использовании кодонов, специально охватываются настоящим изобретением. Кроме того, аллели генов, включающих предложенные здесь полинуклеотидные последовательности, входят в объем настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменены в результате одной или более чем одной мутации, такой как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Получающиеся в результате мРНК и белок не обязательно имеют, но могут иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных способов (таких как гибридиза
- 34 015526 ция, амплификация и/или сравнение последовательностей в базе данных).
Полинуклеотиды по изобретению могут быть получены с использованием химического синтеза, рекомбинантных способов или полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способы химического полинуклеотидного синтеза хорошо известны в данной области техники, и нет необходимости описывать их здесь подробно. Специалист в данной области техники может использовать предложенные здесь последовательности и коммерческий ДНК-синтезатор для получения желаемой последовательности ДНК.
Для получения полинуклеотидов с использованием рекомбинантных способов полинуклеотид, включающий желаемую последовательность, может быть встроен в подходящий вектор, а вектор, в свою очередь, может быть введен в подходящую клетку-хозяин для репликации и амплификации, как дополнительно обсуждается здесь. Полинуклеотиды могут быть введены в клетки-хозяева способами, известными в данной области техники. Клетки трансформируют путем введения экзогенного полинуклеотида посредством прямого поглощения, эндоцитоза, трансфекции, Р-скрещивания или электропорации. После введения экзогенный полинуклеотид может поддерживаться в клетке в виде неинтегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрированного в геном клетки-хозяина. Амплифицированный таким образом полинуклеотид может быть выделен из клетки-хозяина с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. См., например, 8атЬгоок е! а1. (1989).
Альтернативно, ПЦР дает возможность для репродукции последовательностей ДНК. Технология ПЦР хорошо известна в данной области техники и описана в патентах США №№ 4683195, 4800159, 4754065 и 4683202, а также в РСВ: Т1е Ро1утегаке Сйат Веасйоп, МиШк е! а1. ебк., Вшкаиктег Ргекк, Вок!оп (1994).
РНК может быть получена путем использования выделенной ДНК в подходящем векторе и встраивания его в подходящую клетку-хозяин. Когда клетки реплицируются, и ДНК транскрибируется в РНК, РНК затем может быть выделена с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, как изложено, например, в 8атЬгоок е! а1. (1989).
Подходящие клонирующие векторы могут быть сконструированы в соответствии со стандартными способами или могут быть выбраны из большого количества клонирующих векторов, доступных в данной области техники. Хотя выбранный клонирующий вектор может варьировать в соответствии с клеткой-хозяином, которую предполагается использовать, полезные клонирующие векторы, как правило, обладают способностью к саморепликации, могут нести одну мишень для конкретной рестриктазы, и/или могут нести гены для маркера, который может быть использован при отборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например рИС18, рИС19, В1иекспр1 (например, рВ8 8К+) и его производные, тр18, тр19, рВВ322, рМВ9, Со1Е1, рСВ1, ВР4, фаговые ДНК, и шаттл-векторы, такие как р8А3 и рАТ28. Эти и многие другие клонирующие векторы доступны из коммерческих источников, таких как ВюВаб, 81га1едепе и 1пуйгодеп.
Экспрессирующие векторы, как правило, представляют собой способные реплицироваться полинуклеотидные конструкции, содержащие полинуклеотид по изобретению. Предполагают, что экспрессирующий вектор должен реплицироваться в клетках-хозяевах либо в виде эписом, либо в виде интегральной части хромосомной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы включают плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и экспрессирующий(е) вектор(ы), раскрытые в публикации РСТ № ν0 87/04462, но не ограничены ими. Векторные компоненты, как правило, могут включать одно или более чем одно из следующего: сигнальную последовательность; ориджин репликации; один или более чем один маркерный ген; подходящие элементы, контролирующие транскрипцию (такие как промоторы, энхансеры и терминатор), но не ограничены ими. Для экспрессии (то есть трансляции) также обычно требуется один или более чем один элемент, контролирующий трансляцию, такой как сайты связывания рибосом, сайты инициации трансляции и стопкодоны.
Векторы, содержащие интересующие полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяин любым из ряда подходящих средств, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, диэтиламиноэтил(ДЭАЭ)-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию и инфекцию (например, когда вектор представляет собой инфекционный агент, такой как вирус коровьей оспы). Выбор встраиваемых векторов или полинуклеотидов часто зависит от свойств клетки-хозяина.
В изобретении также предложены клетки-хозяева, включающие любой из описанных здесь полинуклеотидов. Любые клетки-хозяева, способные к сверхэкспрессии гетерологичных ДНК, могут быть использованы с целью выделения генов, кодирующих интересующее антитело, полипептид или белок. Не ограничивающие примеры клеток-хозяев млекопитающих включают клетки С08, НеЬа и СНО, но не ограничены ими. См. также публикацию РСТ № ν0 87/04462. Подходящие клетки-хозяева, отличные от клеток млекопитающих, включают прокариоты (такие как Е. сой или В. киЬйШк) и дрожжи (такие как 8. сегеу1кае, 8. ротЬе или К. 1асйк). Предпочтительно клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне приблизительно в 5 раз больше, более предпочтительно в 10 раз больше, еще более предпочтительно в 20 раз больше относительно уровня соответствующего интересующего эндогенного антитела или белка, если они присутствуют в клетках-хозяевах. Отбор клеток-хозяев для специфического связывания с Ап 1-40
- 35 015526 осуществляют путем иммуноанализа или при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (РАС8). Может быть идентифицирована клетка, сверхэкспрессирующая антитело или белок, представляющие интерес.
Г. Композиции.
Композиции, используемые в способах по изобретению, содержат эффективное количество описанного здесь антагонистического антитела против ССКР или полипептида, являющегося производным антагонистического антитела против ССКР. Примеры таких композиций, а также того, как их готовить, также описаны ранее и будут описаны ниже. В одном из воплощений композиция дополнительно содержит антагонист ССКР. В еще одном воплощении композиция содержит одно или более чем одно антагонистическое антитело против ССКР. В других воплощениях антагонистическое антитело против ССКР распознает человеческий ССКР. В других воплощениях антагонистическое антитело против ССКР является гуманизированным. В другом воплощении антагонистическое антитело против ССКР содержит константную область, которая не запускает ненужный или нежелательный иммунный ответ, такой как антителоопосредованный лизис или АЭСС. В других воплощениях антагонистическое антитело против ССКР содержит один или более чем один СОК антитела С1 (такой как один, два, три, четыре, пять или в некоторых воплощениях все шесть СОК С1). В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против ССКР представляет собой человеческое антитело.
Понятно, что композиции могут содержать более чем одно антагонистическое антитело против ССКР (например, смесь антагонистических антител против ССКР, которые распознают различные эпитопы ССКР). Другие примеры композиций содержат более чем одно антагонистическое антитело против ССКР, которые распознают тот(те) же самый(ые) эпитоп(ы), или различные виды антагонистических антител против ССКР, которые связываются с различными эпитопами ССКР.
Композиция, используемая в настоящем изобретении, дополнительно может содержать фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы (Кеттд1оп: ТНе 8с1епсе апб ргасЕсе о£ РНагтасу 20111 Еб. (2000) Ырршсой \νί11ί;·ιιιΐ5 апб ΧνίΠοίΓδ, Еб. К.Е. Нооуег.) в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы не токсичны для реципиентов в данных дозах и концентрациях и могут содержать буферы, такие как фосфатный, цитратный буфер и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадециддиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензэтония; фенол, бутил- или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метилили пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и метакрезол); низкомолекулярные (меньше чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелатообразователи, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Ζπ-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как ΤνΒΒΝ™, Р^υКΟNIС8™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Фармацевтически приемлемые эксципиенты дополнительно описаны здесь.
Антагонистическое антитело против ССКР и их композиции также могут быть использованы в сочетании с другими агентами, которые служат для усиления и/или дополнения эффективности агентов.
Д. Наборы.
В изобретении также предложены наборы для применения в способах по настоящему изобретению. Наборы по изобретению включают один или более чем один контейнер, содержащий описанное здесь антагонистическое антитело против ССКР (такое как гуманизированное антитело) или полипептид и инструкции по применению в соответствии с любым из описанных здесь способов по изобретению. Как правило, эти инструкции содержат описание введения антагонистического антитела против ССКР для лечения, уменьшения интенсивности или профилактики головной боли (такой как мигрень) в соответствии с любым из описанных здесь способов. Набор дополнительно может содержать описание выбора индивидуума, подходящего для лечения, основываясь на идентификации того, страдает ли индивидуум головной болью или имеет риск возникновения головной боли. В других воплощениях инструкции содержат описание введения индивидууму, имеющему риск возникновения головной боли (такой как мигрень), антагонистического антитела против ССКР.
В некоторых воплощениях антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых воплощениях антитело представляет собой человеческое антитело. В других воплощениях антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых воплощениях антитело содержит один или более чем один СОК антитела С1 (такой как один, два, три, четыре, пять или в некоторых воплощениях все шесть СИКС1).
Инструкции, относящиеся к применению антагонистического антитела против ССКР, как правило, включают информацию, касающуюся дозы, схемы введения доз и пути введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут представлять собой стандартные дозы, контейнеры, содержащие большее количество компонента (например, многодозовые упаковки) или субъединичные дозы. Инструкции, по
- 36 015526 ставляемые в наборах по изобретению, типично представляют собой инструкции, написанные на этикетке или вкладыше в упаковку (например, бумажный лист, включенный в набор), но также приемлемы машиночитаемые инструкции (например, инструкции, записанные на магнитный носитель или оптический накопительный диск).
Этикетка или вкладыш в упаковку указывает, что композицию применяют для лечения, уменьшения интенсивности и/или профилактики головной боли (такой как мигрень). Инструкции могут быть приведены для практического применения любого из описанных здесь способов.
Наборы по изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает флаконы, бутыли, сосуды, пластичные упаковки (например, запаяный Му1аг или полиэтиленовые мешки) и т.п., но не ограничены ими. Также охватываются упаковки для применения в комбинации со специфическим устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, распылитель) или устройство для инфузии, такое как мини-насос. Набор может быть выполнен с возможностью стерильного доступа к содержимому (например, контейнер может представлять собой упаковку с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). Контейнер также может быть выполнен с возможностью стерильного доступа к содержимому (например, контейнер может представлять собой упаковку с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой антагонистическое антитело против ССКР. Контейнер дополнительно может содержать второй фармацевтически активный агент.
Наборы возможно могут включать дополнительные компоненты, такие как буферы, и интерпретируемую информацию. Как правило, набор содержит контейнер и этикетку или вкладыш(и) в упаковку на контейнере или в ассоциации с ним.
Следующие примеры предложены для иллюстрации, но не для ограничения изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение и характеристика моноклональных антител против ССКР.
Получение антител против ССКР. Для получения антител против ССКР, обладающих перекрестной реактивностью в отношении крысиного и человеческого ССКР, мышей иммунизировали 25-100 мкг человеческого α-ССКР или β-ССКР, конъюгированного с КЬН в адъюванте (50 мкл на подушечку лапы, 100 мкл суммарно на мышь), с различными интервалами.
Иммунизацию, как правило, осуществляли, как описано в СеегНдк Н.Ь е! а1., 1989, 1. 1ттипо1. Ме1Ьойк 124:95-102; Кеппеу 1.8. е! а1., 1989, 1. 1ттипо1. МеФойк 121:157-166; и АкЬег К. е! а1., 1989, 1п1. АгсЬ. А11егду Арр1. 1ттипо1. 89:128-135. Мышей сначала иммунизировали 50 мкг человеческого α-ССКР или β-ССКР, конъюгированного с КЬН в СРА (полном адъюванте Фрейнда). Через 21 сутки мышей повторно иммунизировали 25 мкг человеческого β-ССКР (для мышей, которых первоначально иммунизировали человеческим α-ССКР) или α-ССКР (для мышей, которых первоначально иммунизировали β-ССКР), конъюгированным с КЬН в 1РА (неполном адъюванте Фрейнда). Через 23 дня после второй иммунизации осуществляли третью иммунизацию 25 мкг крысиного α-ССКР, конъюгированного с КЬН в 1РА. Через 10 суток титры антитела тестировали с использованием ЕЫ8А. После третьей иммунизации через 34 дня провели четвертую иммунизацию 25 мкг пептида (крысиный α-ССКР-КЬН). Окончательную бустер-иммунизацию осуществляли 100 мкг растворимого пептида (крысиный α-ССКР) через 32 дня после четвертой иммунизации.
Спленоциты получали у иммунизированной мыши и подвергали слиянию с клетками миеломы Ы8О в соотношении 10:1 с использованием полиэтиленгликоля 1500. Гибриды наносили в 96-луночные планшеты в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (ОМЕМ), содержащей 20% лошадиную сыворотку крови и 2-оксалоацетат/пируват/инсулин (81дта), и начинали отбор с использованием гипоксантина/аминоптерина/тимидина. На 8 сутки во все лунки добавляли 100 мкл ОМЕМ, содержащей 20% лошадиную сыворотку. Супернатанты гибридов отбирали посредством иммуноанализа с захватом антитела. Определение класса антитела осуществляли с использованием класс-специфичных вторичных антител.
Отбирали панель линий клеток, продуцирующих моноклональное антитело, на основе их связывания с человеческим и крысиным ССКР для дополнительного определения характеристик. Эти антитела и характеристики представлены ниже в табл. 2 и 3.
Очистка и получение фрагмента РаЬ. Моноклональные антитела, отобранные для дополнительного определения характеристик, очищали из супернатантов культур гибридомы с использованием аффинной хроматографии с белком А. Супернатанты уравновешивали до рН 8. Затем супернатанты наносили на колонку с белком А МаЬ8е1ес! (АтегкЬат Вккскпсек # 17-5199-02), уравновешенную РВ8 до рН 8. Колонку промывали 5 объемами колонки РВ8 с рН 8. Антитела элюировали 50 мМ цитрат-фосфатным буфером, рН 3. Элюированные антитела нейтрализовали 1М фосфатным буфером, рН 8. Очищенные антитела подвергали диализу с РВ8, рН 7,4. Концентрации антитела определяли посредством 8Э8-РАСЕ с использованием стандартной кривой для мышиного моноклонального антитела.
РаЬк получали путем папаинового протеолиза полноразмерного антитела с использованием набора
- 37 015526
1ттипориге РаЬ (Р1егее # 44885) и очищали путем пропускания через хроматографическую колонку с белком А в соответствии с указаниями производителя. Концентрации определяли путем ЕБ18А и/или электрофореза в 8Б8-РАСЕ с использованием в качестве стандарта известной концентрации РаЬ (определенной путем аминокислотного анализа), и при А280 с использованием 1ΟΌ=0,6 мг/мл (или теоретического эквивалента на основе аминокислотной последовательности).
Определение аффинности РаЬ. Аффинности моноклональных антител против ССКР определяли при 25 или 37°С с использованием системы поверхностно-плазмонного резонанса Β^аеο^е3000™ (8РК) (1Иаеоге, ШС, Р1кеа^ау N1) с использованием буфера для анализа от производителя ΗΒ8-1-Τ (10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 150 мМ ЖС1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% об./об. поверхностно-активного вещества Р20). Аффинность определяли путем связывания пептидов ССКР с биотинилированием по Ν-концу (заказанных в Сеп8епр1 СогрогаИоп, Νϊ'\ν 1егкеу или С1оЬа1 РерИде 8етеек, Со1огадо) через предварительно иммобилизованный стрептавидин на чипе 8А и измерения кинетики связывания антитела РаЬ, титрованного на поверхности ССКР. Биотинилированный ССКР разбавляли в ΗΒ8-ЕР и вводили в чип в концентрации менее чем 0,001 мг/мл. С использованием различного времени потока через отдельные каналы чипа достигали двух диапазонов плотности антигена: <50 единиц реакции (КИ) для подробных кинетических исследований и приблизительно 800 Ки для исследований концентрации и скрининга. Двух- или трехкратные серийные разведения типично в концентрациях от 1 мкМ до 0,1 нМ (с целью получения оцененной 0,1-10х величины Ко) очищенных фрагментов РаЬ вводили в течение 1 мин при 100 мкл/мин и обеспечивали время диссоциации 10 мин. После каждого цикла связывания поверхности регенерировали, используя 25 мМ ΝηΟΙ I в 25% об./об. этаноле, который выдерживал сотни циклов.
Кинетические скорости ассоциации (коп) и скорости диссоциации (коГГ) получали одновременно путем подгонки данных в 1:1 модели связывания Лэнгмюра (Каг1ккоп, К. Коок, Н. Ра§егк1ат, Б. Ре1егккоп, В. (1994). МеШодк Еп/уто1о§у 6. 99-110) с использованием программы ΒIАеνа1иаΐ^οη. Общие значения равновесной константы диссоциации (Ко) или аффинности рассчитывали из соотношения Ко=коГГ/коп. Аффинности для мышиных РаЬ фрагментов представлены в табл. 2 и 3.
Эпитопное картирование мышиных антител против ССКР. Для определения эпитопа, по которому антитела против ССКР связываются с человеческим α-ССКР, аффинности связывания фрагментов РаЬ с различными фрагментами ССКР измеряли, как описано выше путем присоединения биотинилированных по Ν-концу фрагментов ССКР к сенсорному чипу 8А по аминокислотам 19-37 и аминокислотам 25-37. На фиг. 1 представлены их аффинности связывания, измеренные при 25°С. Как показано на фиг. 1, все антитела, за исключением антитела 4901, связываются с фрагментами 19-37 и 25-37 человеческого αССКР с аффинностью, подобной их аффинности связывания с полноразмерным человеческим α-ССКР (1-37). Антитело 4901 связывается с фрагментом 25-37 человеческого α-ССКР с аффинностью, которая в шесть раз ниже, чем связывание с полноразмерным фрагментом человеческого α-ССКР в основном ввиду потери диссоциации. Данные свидетельствуют о том, что эти антитела против ССКР, как правило, связываются с С-концом ССКР.
Сканирование аланином осуществляли для того, чтобы дополнительно охарактеризовать аминокислоты в человеческом α-ССКР, вовлеченные в связывание антител против ССКР. Различные варианты человеческого α-ССКР с единичными аланиновыми заменами получали путем пептидного синтеза. Их аминокислотные последовательности представлены в табл. 4 наряду со всеми другими пептидами, используемыми в анализе Β^аеο^е. Аффинности фрагментов РаЬ антител против ССКР в отношении этих вариантов определяли с использованием Β^аеο^е, как описано выше. Как показано на фиг. 1, все 12 антител нацелены на С-концевой эпитоп, причем аминокислота Р37 представляет собой наиболее ключевой остаток. Мутация Р37 на аланин значительно снижала аффинность или даже полностью нокаутировала связывание антител против ССКР с пептидом. Следующий наиболее важный аминокислотный остаток представляет собой С33, однако аланиновая замена в этом положении оказывала влияние только на высокоаффинные антитела (7Е9, 8В6, 10А8 и 7Ό11). Аминокислотный остаток 834 также играет существенную, но меньшую роль в связывании этих четырех высокоаффинных антител.
Таблица 2
Характеристики связывания моноклональных антител против ССКР с человеческим α-ССКР и их антагонистическая активность
Антитела
Ко для человеческого а-СОКР при 25°С (нМ)
Ко для человеческого α-ССЖР при 37°С (нМ)
Клеточное блокирование связывания человеческого α-СОКР с его рецептором при 25°С (измеренное путем активации сАМР)
7Е9
8В6
10А8
7ϋ11
6Н2
4901
1,0
0,9
1,2
3ζθ
5,4
139 есть есть есть есть есть есть
1С50 (нМ сайты связывания) при 25°С (комнатная темп.), измеренная в анализе связывания с радиолигандом 2,5
4,0
н.о.
н.о.
12,9
- 38 015526
Таблица 3 Характеристики связывания моноклональных антител против ССВР с крысиным α-ССВР и антагонистическая активность
н.о. означает, что для данного антитела тестирование не проводилось
Таблица 4 Аминокислотные последовательности фрагментов человеческого α-ССВР (8Е^ ΙΌ ΝΟ: 15-40) и родственных пептидов (8Е^ ΙΌ ΝΟ: 41-47). Все пептиды амидированы по С-концу, за исключением 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 36-40. Остатки, выделенные жирным шрифтом, указывают на точечные мутации
ССКР
Аминокислотная последовательность
8ΕρΐϋΝΟ
1-37 (ДТ) Υ37 :
АСОТАТСУТНКЬАСЬЬ8К.8СОУУККХЕУРТХУ08КАР νΤΗΚΕΑ(3ΕΕ8Κ8ΟθννΚΝΝΡνΡΤΝνθ8ΚΑΡ
19-37 δΟΟννΚΝΝΡνΡΙΝΥΟδΚΑΡ
- 39 015526
Р29А (19-37) 8ΟθννΚΝΝΡνΑΤΝνα8ΚΑΡ 18
К35А (19-37) 86θννΚΝΝΡνΡΤΝνθ8ΑΑΡ 19
КЗ 5Е (19-37) 86θννΚΝΝΡνΡΤΝνθ8ΕΑΡ 20
К35М (19-37) 8ΟθννΚΝΝΡνΡΤΝνθ8ΜΑΡ 21
Κ35ζ) (19-37) δΟΟννΚΝΝΡνΡΤΝνΟδρΑΡ 22
Р37А (19-37) δΟΟννΚΝΝΡνΡΤΝνΟδΚΑΑ 23
Ί2Λ ΝΓ\ΤΠΛ7ΠΓΓΝΤλΖΓ4ς’ν ΛΓΛ χία νι ± χι ν χ_ιυινατ.1 τν· 24
25-37 ΝΝΡνΡΤΝνϋδΚΑΡ 25
Р27А (25-37) ΝΝΑνΡΤΝνΟδΚΑΡ 26
У28А (25-37) ΝΝΡΑΡΤΝνΟδΚΑΡ 27
Р29А (25-37) ΝΝΡνΑΤΝνΟδΚΑΡ 28
ТЗОА (25-37) ΝΝΡνΡΑΝνΟδΚΑΡ 29
N31А (25-37) ΝΝΡνΡΤΑνΟδΚΑΡ 30
У32А (25-37) ΝΝΡνΡΤΝΑΟδΚΑΡ 31
ОЗЗА (25-37) ΝΝΡνΡΤΝνΑδΚΑΡ 32
834А (25-37) ΝΝΡνΡΤΝνΟΑΚΑΡ 33
Р37А (25-37) ΝΝΡνΡΤΝνΟδΚΑΑ 34
26-37 ΝΡνΡΤΝνΟδΚΑΡ 35
19-37-СООН δΟΟννΚΝΝΡνΡΤΝνΟδΚΑΡ 36
19-36-СООН δΟΟννΚΝΝΡνΡΊΝνΟδΚΑ 37
1-36-СООН ΑΟϋΤΑΤΟνΤΗΙ^ΑΟΕΕδΚδασννΚΝΝΡνΡΤΝνσδΚΆ 38
1-19-СООН ΑΟϋΤΑΤΟνΤΗΚΕΑΟΕΕδΚδ 39
1-13-СООН АСОТАТСУТНКЬА 40
крысиный а (1-37) δΟΝΤΑΤΟνΤΗΚΕΑΟΕΕδΚδσοννΚΟΝΡνΡΤΝνΟδΕΑΡ 41
крысиный а (19-37) δΟΟννΚϋΝΡνΡΤΝνΟδΕΑΡ 42
человеческий β (1-37) ΑΟΝΤΑΤΟνΤΗΚΕΑΟΕΕδΚδΟσΜνΚδΝΡνΡΤΝνΟδΚΑΡ 43
крысиный β (1-37) δαΝΤΑΤΟνΤΗΚΕΑΟΕΕδΚδΟσννΚΟΝΡνΡΤΝνΟδΚΑΡ 44
человеческий кальцитонин (1-32) ΟθΝΡδΤΟΜΡΟΤΥΤί^ΟΡΝΚΡΗΤΕΡρΤΑΐανΟΑΡ 45
человеческий амилин (1-37) ΚΟΝΤΑΤΟΑΤρΚΕΑΝΡΕνΗδδΝΝΡΟΑΙΕδδΤΝνσδΝΤΥ 46
человеческий адреномедуллин (1-52) ΥΚ9δΜΝΝΡ06ΕΚδΡ6αΚΡ6ΤΟΤνρΚΕΑΡΙ(2ΙΥρΡΤΟΚΟ ΚϋΝΥΑΡΚδΚΙδΡρσΥ 47
Пример 2. Скрининг антагонистических антител против СОКР с использованием анализов ш νί!ΐΌ.
Мышиные антитела против СОКР подвергали дополнительному скринингу в отношении антагонистической активности ш νίΐΐΌ с использованием анализа клеточной активации сАМР и анализа связывания.
Антагонистическую активность измеряли с использованием анализа с АМР. 5 мкл человеческого или крысиного α-СОКР (конечная концентрация 50 нМ) в присутствии или в отсутствие антитела против СОКР (конечная концентрация 1-3000 нМ), либо крысиного α-СОКР, либо человеческого α-СОКР (конечная концентрация 0,1 нМ-10 мкМ в качестве положительного контроля для активации с АМР) дозировали в 384-луночный планшет (Νιιικ, кат. № 264657). 10 мкл клеток (человеческий δΚ-Ν-МС, если используют человеческий α-СОКР, или крысиный Р6 из АТСС, если используют крысиный α-СОКР) в стимулирующем буфере (20 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 146 мМ №С1, 5 мМ КС1, 1 мМ СаС12, 1 мМ МдС12 и 500 мкМ 3-изобутил-1-метилксантина (1ВМХ)) добавляли в лунки планшета. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин.
После инкубации активацию сАМР осуществляли с использованием анализа ферментативной фрагментарной комплементации НйНип!:ег™ (Аррйеб ВюкуДетк) в соответствии с инструкциями производителя. Анализ основан на генетически сконструированном ферменте β-галактозидазе, состоящем из двух фрагментов, называемых ферментативным акцептором (ЕА) и ферментативным донором (ΕΏ). Когда два фрагмента разделены, фермент не активен. Когда фрагменты находятся вместе, они могут спон
- 40 015526 танно рекомбинироваться с образованием активного фермента в процессе, называемом комплементацией. В платформе для анализа ЕРС используют пептидный конъюгат ЕЭ-сАМР, в котором с АМР распознается антителами против сАМР. Этот фрагмент ЕЭ способен к реассоциации с ЕА с образованием активного фермента. В анализе антитело против сАМР оптимально титруют для связывания с конъюгатом ЕЭ-сАМР и ингибирования образования фермента. Уровни сАМР в образцах клеточного лизата конкурируют с конъюгатом ЕЭ-сАМР за связывание с антителом против сАМР. Количество свободного конъюгата ЕЭ в анализе пропорционально концентрации с АМР. Таким образом, сАМР измеряют по образованию активного фермента, которое количественно оценивают по расходу люминесцентного субстрата β-галактозидазы. Анализ активации сАМР осуществляли путем добавления 10 мкл буфера для лизиса и антитела против сАМР (отношение 1:1) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 60 мин. Затем в каждую лунку добавляли по 10 мкл реагента ЕЭ-сАМР и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. После инкубации в каждую лунку добавляли по 20 мкл реагента ЕА и смеси СЬ (содержащей субстрат) (отношение 1:1) и инкубировали в течение 1-3 ч или в течение ночи при комнатной температуре. Планшет считывали с частотой 1 с/лунку в аппарате РМТ или 30 с/позицию в аппарате для визуализации. Антитела, ингибирующие активацию сАМР посредством α-СОРР, идентифицировали в табл. 2 и 3 выше (обозначение есть). Данные в табл. 2 и 3 указывают на то, что антитела, демонстрирующие антагонистическую активность в данном анализе, как правило, обладают высокой аффинностью. Например, антитела, имеющие Кс (определенную при 25°С) приблизительно 80 нМ или менее в отношении человеческого α-СОРР, или имеющие Кс (определенную при 37°С) приблизительно 47 нМ или менее в отношении крысиного α-СОРР, продемонстрировали антагонистическую активность в этом анализе.
Анализ связывания радиолиганда. Анализ связывания осуществляли для измерения Ιί.'50 антитела против СОРР при блокировании связывания СОРР с рецептором, как описано ранее. Ζ^тте^таηи е! а1., Рерйбек 16:421-4, 1995; Ма11ее е! а1., I. Вю1. СЕет. 277:14294-8, 2002. Мембраны (25 мкг) клеток 8К-№ МС инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре в буфере для инкубации (50 мМ Тп5НС1, рН 7,4, 5 мМ МдС12, 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА)), содержащем 10 пМ 125Ιчеловеческого α-СОРР в общем объеме 1 мл. Для определения средних ингибирующих концентраций (ΙΟ50), антитела или немеченный СОРР (в качестве контроля) из раствора с приблизительно 100-кратной концентрацией растворяли до различных концентраций в буфере для инкубации и инкубировали одновременно с мембранами и 10 пМ 125Ьчеловеческого α-СОРР. Инкубацию останавливали путем фильтрации через фильтр из стекломикроволокна (ОР/В, 1 мкм), которые блокировали 0,5% полиэтиленимином. Строили кривые зависимости доза-ответ и значения К1 определяли с использованием уравнения КЩСЧ/П+Нлиганд|/К|,); где равновесная константа диссоциации Кс=8 пМ для человеческого α-СОРР с рецептором СОРР1, как представлено в клетках 8К-№МС, и максимальная величина связывания Втах=0,025 пмоль/мг белка. Приведенное значение Ιί.'50 (в выражении для молекул ^О) переводили на сайты связывания (путем умножения на 2) так, чтобы его можно было сравнить с аффинностями (Кв), определенными в В1асоге (см. табл. 2).
В табл. 2 представлены Ιί.'50 для мышиных антител 7Е9, 8В6, 6Н2 и 4901. Данные указывают на то, что аффинность антитела, как правило, коррелирует с Κ.’50: антитела с более высокой аффинностью (более низкие значения Кс) имеют более низкие Ιί.'50 в анализе связывания радиолиганда.
Пример 3. Действие антагонистических антител против СОРР на расширение кровеносных сосудов в коже, вызванное путем стимуляции подкожного нерва крысы.
Для тестирования антагонистической активности антител против СОРР действие антител на расширение сосудов кожи путем стимуляции подкожного нерва крысы тестировали с использованием ранее описанной крысиной модели. Ексо!! е! а1., Вг. I. Рйагтасо1. 110:772-776, 1993. В этой крысиной модели электрическая стимуляция подкожного нерва вызывала высвобождение СОРР из нервных окончаний, приводя в результате к увеличению кровотока в коже. Кровоток в коже лап самцов крыс 8ргадие 0\\'а1еу (170-300 г, из С11аг1е5 Р1уег НоШйег) измеряли после стимуляции подкожного нерва. Крыс поддерживали в состоянии анестезии с 2% изофлураном. Бретилия тозилат (30 мг/кг, вводимый в.в.) давали в начале эксперимента для минимизации сужения кровеносных сосудов ввиду сопутствующей стимуляции симпатических волокон подкожного нерва. Температуру тела поддерживали при 37°С, используя ректальный зонд, термостатически связанного с контролируемой по температуре нагревающей пластиной. Соединения, включающие антитела, положительный контроль (СОРР 8-37) и разбавитель (РВ8, 0,01% Тетееп 20), вводили внутривенно через правую бедренную вену за исключением эксперимента, представленного на фиг. 3, тестируемое соединение и контроль инъецировали через хвостовую вену, и для экспериментов, представленных на фиг. 2А и 2В, антитела 4901 и 7Ό11 инъецировали внутрибрюшинно (в.б.). Соединение СОРР 8-37 (антагонист расширения кровеносных сосудов) в качестве положительного контроля вводили ввиду его короткого периода полувыведения за 3-5 мин до стимуляции нерва при 400 нмоль/кг (200 мкл). Тап е! а1., С1т. 8сг 89:656-73, 1995. Антитела вводили в различных дозах (1, 2,5, 5, 10 и 25 мг/кг).
Для экспериментов, представленных на фиг. 2 А и 2В, антитело 4901 (25 мг/кг), антитело 7Ό11 (25
- 41 015526 мг/кг) или разбавитель в качестве контроля (РВЗ с 0,01% Т\уееп 20) вводили внутрибрюшинно (в.б.) за 72 ч до стимуляции электрическим импульсом. Для экспериментов, представленных на фиг. 3, антитело 4901 (1, 2,5, 5 или 25 мг/кг) или разбавитель в качестве контроля (РВЗ с 0,01% Т\уссп 20) вводили внутривенно за 24 ч до стимуляции электрическим импульсом. После введения антител или разбавителя в качестве контроля подкожный нерв правой задней конечности извлекали хирургическим путем, проксимально надрезали и покрывали пластиковой оберткой для предотвращения высыхания. Лазерный доплеровский зонд помещали на медио-дорсальную сторону кожи задней конечности, представляющей собой область, иннервируемую подкожным нервом. Кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови, контролировали с использованием лазерного доплеровского измерителя потока. Когда установился стабильный базовый поток (менее чем 5% варьирование) в течение по меньшей мере 5 мин, нерв помещали на платиновые биполярные электроды и подвергали электрической стимуляции 60 импульсами (2 Гц, 10 В, 1 мс, в течение 30 с) и затем вновь через 20 мин. Кумулятивное изменение кровотока в коже оценивали по площади под кривой зависимости потока от времени (АИС, эквивалентной изменению потока, умноженному на изменение времени) для каждого ответа в виде изменения потока на стимуляцию электрическим импульсом. Получали средний ответ в виде кровотока для двух стимуляций. Животных поддерживали в состоянии анестезии в течение периода от 1 до 3 ч.
Как показано на фиг. 2 А и 2В, увеличение кровотока, стимулированное применением электрических импульсов на подкожный нерв, ингибировалось присутствием ССКР 8-37 (400 нмоль/кг, вводимого в.в.), антитела 4901 (25 мг/кг, вводимого в.б.) или антитела 7Ό11 (25 мг/кг, вводимого в.б.) по сравнению с контролем. ССКР 8-37 вводили за 3-5 мин до стимуляции подкожного нерва; и антитела вводили за 72 ч до стимуляции подкожного нерва. Как показано на фиг. 3, увеличение кровотока, стимулированное путем применения электрических импульсов на подкожный нерв, ингибировалось присутствием антитела 4901 в различных дозах (1, 2,5, 5 и 25 мг/кг), вводимого внутривенно за 24 ч до стимуляции подкожного нерва.
Для экспериментов, представленных на фиг. 4А и 4В, подкожный нерв извлекали хирургическим путем перед введением антитела. Подкожный нерв правой задней конечности извлекали хирургическим путем, проксимально надрезали и покрывали пластиковой оберткой для предотвращения высыхания. Лазерный доплеровский зонд помещали на медио-дорсальную сторону кожи задней конечности, представляющей собой область, иннервируемую подкожным нервом. Кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови, контролировали с использованием лазерного доплеровского измерителя потока. Через 30-45 мин после инъекции бретилия тозилата, когда устанавливался стабильный базовый поток (менее чем 5% варьирование) в течение по меньшей мере 5 мин, нерв помещали на платиновые биполярные электроды и подвергали электрической стимуляции (2 Гц, 10 В, 1 мс, в течение 30 с) и затем вновь через 20 мин. Среднее значение для ответа в виде кровотока для этих двух стимуляций использовали для установления базового ответа (время 0) на электрическую стимуляцию. Антитело 4901 (1 или 10 мг/кг), антитело 7Е9 (10 мг/кг), антитело 8В6 (10 мг/кг) или разбавитель (РВЗ с 0,01% Туееп 20) затем вводили внутривенно (в.в.). Нерв последовательно стимулировали (2 Гц, 10 В, 1 мс, в течение 30 с) через 30, 60, 90 и 120 мин после введения антитела или разбавителя. Животных поддерживали в состоянии анестезии в течение приблизительно 3 ч. Кумулятивное изменение кровотока в коже оценивали по площади под кривой зависимости потока от времени (АИС, которая равна изменению потока, умноженному на изменение времени) для каждого ответа в виде потока на стимуляцию электрическими импульсами.
Как показано на фиг. 4А, увеличение кровотока, стимулированное путем применения электрических импульсов на подкожный нерв, значительно ингибировалось в присутствии антитела 4901, вводимого в.в в количестве 1 мг/кг, когда стимуляцию электрическим импульсом применяли через 60, 90 и 120 мин после введения антитела, и увеличение кровотока, стимулированное путем применения электрических импульсов на подкожный нерв, значительно ингибировалось в присутствии антитела 4901, вводимого в.в. в количестве 10 мг/кг, когда стимуляцию электрическим импульсом применяли через 30 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин после введения антитела. На фиг. 4В показано, что увеличение кровотока, стимулированное путем применения электрических импульсов на подкожный нерв, значительно ингибировалось в присутствии антитела 7Е9 (10 мг/кг, вводимого в.в.), когда стимуляцию электрическим импульсом применяли через 30, 60, 90 и 120 мин после введения антитела, и в присутствии антитела 8В6 (10 мг/кг, вводимого в.в.), когда стимуляцию электрическим импульсом применяли через 30 мин после введения антитела.
Эти данные указывают на то, что антитела 4901, 7Е9, 7Ό11 и 8В6 являются эффективными для блокирования активности ССКР, измеренной по расширению кровеносных сосудов, вызванному стимуляцией подкожного нерва крысы.
Пример 4. Характеристика антитела против ССКР С1 и его вариантов.
Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела против ССКР С1 представлены на фиг. 5. Следующие способы использовали для экспрессии и определения характеристик антитела С1 и его вариантов.
Использовали экспрессирующий вектор. Экспрессию ЕаЬ-фрагмента антител осуществляли под контролем промотора 1ас2, индуцируемого изопропилтиогалактозидом (ИПТГ), подобного описанному в
- 42 015526
ВагЬак (2001) РНаде Фкр1ау: а 1аЬога1огу тапиа1, Со1й 8рппд НагЬог, ΝΥ, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк рд 2.10. Уес1ог рСотЬ3Х), однако, модификации включали добавление и экспрессию следующих дополнительных доменов: константного домена легкой цепи κ-человеческого антитела и константного домена СН1 человеческого иммуноглобулина 1дС2, С-области у-2 цепи 1д, номер белка Р01859; легкой цепи к иммуноглобулина (Ното кар1епк), номер белка САА09181.
Получение ТаЬ в небольшом масштабе. Начиная с Е. сой, трансформированной библиотекой ТаЬ (с использованием компетентных к электропорации клеток ТС1 или химически компетентных клеток Тор 10), единичные колонии использовали для инокуляции основного планшета (агар Луриа-Бертани (ЬВ) + карбенициллин (50 мкг/мл) + 2% глюкоза) и рабочего планшета (2 мл/лунку, 96-луночный планшет, содержащий 1,5 мл ЬВ + карбенициллин (50 мкг/мл) + 2% глюкоза). Планшет покрывали газопроницаемой адгезивной пленкой (АВдепе, 8штеу, ИК). Оба планшета инкубировали при 30°С в течение 12-16 ч; рабочий планшет интенсивно встряхивали. Основной планшет хранили при 4°С до использования, тогда как клетки рабочего планшета осаждали центрифугированием (4000 об/мин, 4°С, 20 мин) и ресуспендировали в 1,0 мл ЬВ + карбенициллин (50 мкг/мл) + 0,5 мМ ИПТГ для того, чтобы вызвать экспрессию ТаЬ путем интенсивного встряхивания в течение 5 ч при 30°С. Индуцированные клетки центрифугировали при 4000 об/мин, 4°С в течение 20 мин и ресуспендировали в 0,6 мл буфера В1асоге НВ-8ЕР (10 мМ Нерек рН 7,4,150 мМ №С1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% об./об. Р20). Лизис клеток, ресуспендированных в НВ8Р, осуществляли путем одного цикла замораживания (приблизительно 80°С), затем оттаивания при 37°С. Клеточные лизаты центрифугировали при 4000 об/мин, 4°С в течение 1 ч для отделения клеточного дебриса от супернатантов, содержащих ТаЬ, которые затем фильтровали (0,2 мкм) с использованием 96луночного фильтрационного планшета системы мультискринингового анализа М1Шроге и вакуумной системы. В1асоге использовали для анализа фильтрованных супернатантов путем их инъекции через ССКР на сенсорном чипе. Клоны с отобранной аффинностью, экспрессирующие ТаЬ, извлекали из основного планшета с получением матричной ДНК для ПЦР, секвенирования и получения плазмиды.
Крупномасштабное получение ТаЬ. Для получения кинетических параметров ТаЬ экспрессировали в крупном масштабе следующим образом. В колбу Эрленмейера, содержащую 150 мл ЬВ+карбенициллин (50 мкг/мл)+2% глюкозу, инокулировали 1 мл стартовой ночной культуры из клона с отобранной аффинностью Е. сой, экспрессирующего ТаЬ. Оставшуюся часть стартовой культуры (приблизительно 3 мл) использовали для получения плазмидной ДНК (набор Ц1 Аргер т1ш-ргер, Ц1адеп) для секвенирования и дополнительной манипуляции. Значительную часть культуры инкубировали при 30°С при интенсивном встряхивании до достижения (ОЭ600нм 1,0 (типично 12-16 ч). Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин, 4°С в течение 20 мин и ресуспендировали в 150 мл ЬВ + карбенициллин (50 мкг/мл) + 0,5 мМ ИПТГ. После экспрессии в течение 5 ч при 30°С клетки осаждали путем центрифугирования при 4000 об/мин, 4°С в течение 20 мин, ресуспендировали в 10 мл буфера Ыасоге НВ8-ЕР и лизировали с использованием одного цикла замораживания (-80°С)/оттаивания (37°С). Клеточные лизаты осаждали путем центрифугирования 4000 об/мин, 4°С в течение 1 ч и супернатант собирали и фильтровали (0,2 мкм). Фильтрованные супернатанты наносили на колонки из сефарозы №-ОТА кирегПого (Ц1адеп, Уа1епс1а. СА), уравновешенные в РВ8, рН 8, затем промывали 5 объемами колонки РВ8, рН 8. Индивидуальные ТаЬ элюировали в различных фракциях РВ8 (рН 8) + 300 мМ имидазол. Фракции, содержащие ТаЬ, объединяли и диализировали в РВ8, затем количественно оценивали путем ЕЫ8А перед характеристикой аффинности.
Препарат полноразмерного антитела. Для экспрессии полноразмерных антител вариабельные области тяжелой и легкой цепей клонировали в экспрессирующих векторах млекопитающих и трансфицировали с использованием липофектамина в клетки НЕК 293 для временной экспрессии. Антитела очищали с использованием белка А с использованием стандартных способов.
Вектор рЭЬ.ССКР.11РсС1 представляет собой экспрессирующий вектор, включающий тяжелую цепь антитела С1, и подходит для временной или стабильной экспрессии тяжелой цепи. Вектор рЭЬ.ССКР.11РсС1 имеет нуклеотидные последовательности, соответствующие следующим областям: области промотора мышиного цитомегаловируса (нуклеотиды 7-612); синтетического интрона (нуклеотиды 613-1679); области, кодирующей дегидрофолатредуктазу (ДГФР) (нуклеотиды 688-1253); сигнальному пептиду человеческого гормона роста (нуклеотиды 1899-1976); вариабельной области тяжелой цепи С1 (нуклеотиды 1977-2621); константной области тяжелой цепи человеческого 1дС2, содержащей следующие мутации: А330Р331 на 83308331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательность 1дС2 дикого типа; см. Еиг. 1. 1ттипо1. (1999) 29:2613-2624). Вектор рПЬ.ССКР.НРсС1 депонирован в АТСС 15 июля 2005 г. и ему присвоен номер РТА-6867 в АТСС.
Вектор рЕЬ.ССКР.НКС1 представляет собой экспрессирующий вектор, включающий легкую цепь антитела С1 и подходящий для временной экспрессии легкой цепи. Вектор рЕЬ.ССКР.НКС1 имеет нуклеотидные последовательности, соответствующие следующим областям: области промотора мышиного цитомегаловируса (нуклеотиды 2-613); интрону человеческого ЕТ-1 (нуклеотиды 614-1149); сигнальному пептиду человеческого гормона роста (нуклеотиды 1160-1237); легкой цепи вариабельной области антитела С1 (нуклеотиды 1238-1558); константной области человеческой цепи каппа (нуклеотиды 1559-1882).
- 43 015526
Вектор рЕЬ.ССКР.ЬКСГ депонирован в АТСС 15 июля 2005 г. и ему присвоен номер РТА-6866 в АТСС.
Анализ В1асоге для определения аффинности. Аффинности моноклонального антитела С1 и его вариантов определяли при 25 или 37°С с использованием системы поверхностно-плазмонного резонанса В1асоге3000™ (8РК) (В1асоге, ГИС, Р1кса^ау Ν1). Аффинность определяли путем связывания ССКР с биотинилированием по Ν-концу или фрагментов через предварительно иммобилизированный стрептавидин (сенсорный чип 8А) и измерения кинетики связывания РаЬ фрагментов антитела С1 или вариантов путем титрования через ССКР или фрагмент на чипе. Все анализы В1асоге проводили в буфере НВ8-ЕР (10 мМ НЕРЕ8 рН 7,4, 150 мМ №С1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% об./об. полисорбата Р20). Поверхности ССКР готовили путем разбавления Ν-биотинилированного ССКР до концентрации менее чем 0,001 мг/мл в буфере НВ8-ЕР и его введения через сенсорный чип 8А с использованием различных времен контакта. Для кинетических исследований высокого разрешения использовали поверхности с низкой емкостью, соответствующие уровню захвата <50 единиц реакции (КИ), тогда как для исследования концентраций, отбора и определения аффинности раствора использовали поверхности с высокой емкостью (приблизительно 800 КИ для захваченного ССКР). Кинетические данные получали путем серийного разведения РаЬ антитела С1 с двух- или трехкратным шагом до концентраций 1 мкМ-0,1 нМ (с целью получения оцененной 0,1-10х величины Кс). Образцы, как правило, вводили в течение 1 мин при 100 мкл/мин и оставляли по меньшей мере на 10 мин для диссоциации. После каждого цикла связывания поверхности регенерировали 25 мМ №ЮН в 25% об./об. этаноле, который выдерживал сотни циклов. Полные серии титрования (типично получаемые в двух параллелях) в общем подгоняли к модели связывания Лэнгмюра 1:1 с использованием программы оценки В1Аеуа1иа!юп. Это позволяло получить уникальную пару констант скоростей ассоциации и диссоциации (соответственно коп и коГГ) для каждого связующего взаимодействия, причем это отношение позволило получить равновесную константу диссоциации (Кс=коГГ/коп). Определенные таким образом аффинности (значения Кс) представлены в табл. 6 и 7.
Высокоразрешающий анализ связывающих взаимодействий с экстремально низкими диссоциациями. Для взаимодействий с экстремально низкими диссоциациями (в частности, связывание РаЬ антитела С1 с человеческим α-ССКР на чипе при 25°С) аффинности определяли в двухстадийном эксперименте. Описанный выше протокол использовали со следующими модификациями. Константу скорости ассоциации (коп) определяли путем введения в 2-кратных сериях титрования (в двух параллелях) от 550 до 1 нМ в течение 30 с при 100 мкл/мин и давали возможность для фазы диссоциации только 30 с. Константу скорости диссоциации (коГГ) определяли путем введения трех концентраций (высокой, средней и низкой) в одних и тех же сериях титрования в двух параллелях в течение 30 с и давали возможность для фазы диссоциации в течение 2 ч. Аффинность (Кс) для каждого взаимодействия получали путем комбинирования значений коп и коГГ, полученных в обоих типах экспериментов, как показано в табл. 5.
Определение аффинности в растворе с использованием В1асоге. Афинность в растворе для антитела С1 в отношении крысиного α-ССКР и Р37А (19-37) человеческого α-ССКР измеряли с использованием В1асоге при 37°С. Использовали чип ССКР с высокой емкостью поверхности (для целей обнаружения выбран высокоаффинный человеческий а-ССКР) и буфер НВ8-ЕР пропускали при 5 мкл/мин. Фрагмент РаЬ антитела С1 при постоянной концентрации 5 нМ (которая должна составлять ожидаемое значение 1<и или меньше для взаимодействия в растворе) предварительно инкубировали с конкурентным пептидом крысиным α-ССКР или Р37А (19-37) человеческого α-ССКР, в конечной концентрации от 1 нМ до 1 мкМ в трехкратных серийных разведениях. Растворы РаЬ антитела С1 в отсутствие или в присутствии конкурентного пептида в растворе вводили через ССКР на чип и контролировали уменьшение ответов в виде связывания, обнаруженных на поверхности чипа в результате конкуренции в растворе. Эти ответы в виде связывания превращали в концентрации свободного РаЬ с использованием калибровочной кривой, которую строили путем титрования одного РаЬ антитела С1 (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 и 0 нМ) через ССКР на чипе. Концентрации свободного РаЬ откладывали на графике в зависимости от концентрации конкурентного пептида в растворе, используемого для получения каждой точки данных и подгонки к модели аффинности в растворе с использованием программного обеспечения В1Аеуа1иа!юп. Аффинности в растворе, определенные (опосредованно) таким образом, представлены в табл. 5 и 7 и использованы для подтверждения аффинностей, полученных при введении РаЬк непосредственно через Νбиотинилированный ССКР на чипе 8А. Тесное соответствие между аффинностями, определенными этими двумя способами, подтверждает, что связывние Ν-биотинилированного варианта ССКР с чипом не меняет активности связывания нативного раствора.
В табл. 5 ниже показаны аффинности связывания антитела С1 с человеческим α-ССКР, человеческим β-ССКР, крысиным α-ССКР и крысиным β-ССКР, определенные с использованием В1асоге путем пропускания фрагментов РаЬ через Ν-биотинилированные ССКР на чипе 8А. Для лучшего определения аффинностей связывающих взаимодействий с экстремально низкими диссоциациями, аффинности также определяли в двухстадийном эксперименте для дополнения направленности данного анализа, также определяли аффинность в растворе взаимодействия крысиного α-ССКР (как описано выше). Тесное соответствие аффинностей, измеренных в обоих направлениях анализа, подтверждает, что аффинность связывания нативного крысиного α-ССКР в растворе не меняется, когда он подвергнут биотинилированию
- 44 015526 по Ν-концу и связыванию с чипом 8А.
Таблица 5 связывания ЕаЬ антитела С1,
ССВР на чипе
ССЖР на чипе Темп. (°С) коп(1/Мс) кой(1/с) Ко (нМ)
Человеческий а-ССКР 25 1,86х103 7,80x10'6 0,042 (7%, п=4)*
Человеческий а-ССКР 37 5,78x103 3,63x10'3 0,063 (4%, п=2)*
Человеческий β-ССКР 37 4,51x1ο3 6,98x103 0,155
Крысиный а-СОКР 25 5,08x104 6,18x10’5 1,22(12%, п=2)*
Крысиный а-ССКР 37 1,55х1О3 3,99x10’4 2,57* (раствор Ко=10 (50% п=4)**
Крысиный β-ССКР 37 5,16х103 7,85х10'3 0,152
* Аффинности в отношении α-ССВР (крысиного и человеческого) определяли в высокоразрешающем двухстадийном эксперименте, в котором фазу диссоциации контролировали в течение 2 ч (значения для коп, ко££ и Ко представляют среднее из п повторных экспериментов со стандартным отклонением, выраженным в виде процента дисперсии). Аффинности в отношении β-ССВР (крысиных и человеческих) определяли общим анализом с использованием только 20-минутной фазы диссоциации, которая не была достаточно точной для количественной оценки их экстремальных диссоциаций (их диссоциации вероятно медленнее, чем указанные здесь, и, таким образом, их аффинности вероятно выше). ЕаЬ антитела С1 чрезвычайно медленно диссоциировали из всех ССВР (за исключением крысиного α-ССВР) с диссоциациями, которые приближаются к пределу разделения для анализа В1асоге (в особенности при 25°С).
**Аффинность в растворе определяли путем измерения уменьшения ответов в виде связывания, обнаруженных с использованием ССВР на чипе, для ЕаЬ антитела С1, предварительно инкуби рованного с конкурентным крысиным α-ССВР в растворе.
В табл. 6 ниже представлены антитела, имеющие отличие по аминокислотной последовательности по сравнению с антителом С1, и их аффинности в отношении крысиного α-ССВР и человеческого αССВР. Описаны все аминокислотные замены вариантов, представленных в табл. 6, относительно последовательности С1. Аффинности связывания фрагментов ЕаЬ определяли с использованием В1асоге путем их пропускания через ССВР на чипе 8А.
- 45 015526
Таблица 6
Аминокислотные последовательности и данные по аффинности связывания для вариантов антитела 01, определенные при 37°С с использованием Н1асоге
Клон Ы Ь2 Н2 НС-РАУЗ а-крысиный коц(1/с) а-крысиный Ко (нМ) а-человеческий кой(1/с) а-человече ский Ко (нМ)
61 3.99x10'4 2,57 З.бЗхЮ'5 0,063
М1 АЮОЬ 1,10x10'3 1,73x10’4
М2 Ь99А А100К 2.6x10’3 58 3.1Х10’4 3
М3 Ь99А А1008 2.0х10'3 61 2.1Х10'4 Ь2
М4 Ь99А АЮОУ 1,52x10'3 84,4 6,95x10'5 0,43
М5 Ь99А Α100Υ 7,3 5x10‘4 40,8 3,22x10’5 0,20
Мб Ь99И 7,84х10’4 43,6 1,ЗЗх10‘4 0,83
М7 β99Ν А100С 9,18x10'4 51,0 2,43x10'4 1,52
М8 Ι>99Ν А1006 7,45x10'4 41,4 9,20x10'5 0,58
М9 Ι.99Ν ΑΙΟΟΥ н.о. н.о. 1,00x10‘5 0,06
М10 Ь998 А1008 1,51хЮ'3 83,9 1,73x10'4 1,08
МИ Ь998 А100Т 4,83x10’3 268,3 2,83х10'4 1,77
М12 Ь998 АЮОУ 1,94x10'3 107,8 Ι,ΟΙχΙΟ’4 0,63
М13 Ь99Т А1006 1,84x10’3 102,2 1,86x104 1,16
М14 Ь99Т А100К н.о. н.о. 1,00x105 0,06
М15 Ь99Т А100Р 1,15x10'3 63,9 1,5 8x10’5 0,10
М16 Ь99Т А1008 9,96x10’4 55,3 1,65x10’4 1,03
М17 Ь99Т АЮОУ 2,06x10’3 114,4 1,85x10’4 1,16
- 46 015526
М18
М19
М20
К28А
М21
М22
М23
К28А
К28А
К28О
М24
К28Ь
М25
Κ28Ν
М26
Κ28Ν
А57О
М27
М28
М29
М30
М31
М32 мзз
Κ28Ν ТЗОА
Κ28Ν
ТЗОР
Κ28Ν
ТЗОО
Κ28Ν
ТЗОС
Κ28Ν
ТЗОО
Κ.28Ν
ТЗОО
Κ28Ν ТЗОО
Е54К
Α57Ν
М34
Κ28Ν ТЗОО
М3 5
М36
М3 7
М3 8
М39
Κ28Ν ТЗОО
Κ28Ν ТЗОК
Κ28Ν
Т308
Κ28Ν ТЗОА
Κ28Ν
Е54К
А57Е
Е54К
А57О
Е54К
А57Н
Е54К
Α57Ν 8580
Е54К Α57Ν 858Т
Е54К
А578
А57О
М40
Κ28Ν
М41
Κ28Ν
О50А Ь56Т
С50А Ь56Т
О50А
Ь56Т
М42
Κ28Ν
О50А Ь56Т
М43
Κ28Ν
О50А
Ь56Т
Α57Ν 858Υ Е54К А57Ь Е54К
Α57Ν
Е64Р
Е54К
Α57Ν Н61Г
Е54К
Α57Ν
Ь99У АЮОО
Ь99У
АЮ0К
Ь99К
АЮОЬ
Ь998
Ь99Т
Ь99Т АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т АЮОУ
Ь99Т АЮОУ
Ь99Т А ЮРУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т
АЮОУ
Ь99Т АЮОУ
Ь99Т АЮОУ
1,22хЮ’3
67,8
7,03x10’3
0,44
н.о.
н.о.
1,00x10’3
0,06
1,44x10’
80,0
1,3 6x10’4
0,85
6,95x10’4
Ι,ΙΟχΙΟ’3
7,99x10’4
1,04x10’3
1,4x10’3
9,24x10’4
3,41х10’3
1,25x10’3
3,59x10’3
6,38хЮ’3
3,61х10’3
2,96хЮ’3
9,22x10’
2,17x10’3
3,99x10’3
4,79x10’3
1,45хЮ’3
5,11х10'3
9,95х10’3
0,36
4,53х10'3
7,52x10’3
4,53х10’3
15,2
61,1
44,4
57,8
51,3
189,4
69,4
199,4
354,4
200,6
164,4
512,2
120,6
221,7
266,1
80,6
283,9
20000,0
251,7
417,8
251,7
1,42x104
1,16хЮ4
1,3 0x10’4
1,48x1ο·4
1,4x10’4
1,48x10’4
3,57x10’4
9,96хЮ’5
3,80х10’4
5,90x10'4
3,47x10’4
2,71 хЮ’4
7,50хЮ’4
6,46x10’4
3,39x10’4
2,39x10’4
2,26х10’4
2,18x10’4
4,25x10’4
1,28x10’3
2,10x10’4
4,17x10’4
2,63x10’4
0,93
ЪЗ
0,93
2,23
0,62
2,38
3,69
2,17
1,69
4,69
4,04
2,12
1,49
1,41
1,36
2,66
8,00
1,31
2,61
1,64
- 47 015526
858С
М44 Κ.28Ν Ο50Α Ь56Т Е54К Α57Ν 858Е Ь99Т АЮОУ бЛЗхЮ’3 443 2.10хЮ4 2,05
М45 Β28Ν Ο50Α Ь56Т Е54К Α57Ν 858Е Ε64ϋ Ь99Т АЮОУ 5.58хЮ'3 259 2.11хЮ4 1,85
М46 Κ28Ν С50А Ь56Т Е54К Α57Ν 858Е Н61Р Ь99Т АЮОУ 2,94хЮ'3 163,3 5,39хЮ4 3,37
М47 Κ28Ν О50А Ь56Т Е54К Α57Ν 8580 Ь99Т АЮОУ 8,23хЮ’3 457,2 3,32хЮ4 2,08
М48 Κ28Ν С50А Ь56Т Е54К Α57Ν 85 8Ь Ь99Т АЮОУ 0,0343 1905,6 8,42хЮ4 5,26
М49 Κ28Ν О50А Ь56Т Е54К Α57Ν 85 8Υ Н61Г Ь99Т АЮОУ 0,0148 822,2 5,95хЮ'4 3,72
М50 Β28Ν О50А Ь56Т Е54К А57В Ь99Т АЮОУ 5,ЗОхЮ'3 294,4 4,06хЮ'4 2,54
М51 Β28Ν Ь561 Е54К А57О Ь99Т АЮОУ 1,18хЮ’3 65,6 1,31x1ο4 0,82
М52 Κ28Ν Ь561 Е54К Α57Ν 858А Ь99Т АЮОУ 2,29хЮ'3 127,2 2,81 хЮ'4 1,76
М53 Κ28Ν Ь561 Е54К Α57Ν 8580 Ь99Т АЮОУ 1,91хЮ'3 106,1 3,74хЮ4 2,34
М54 Κ28Ν ТЗОА О50А Е54К Α57Ν 858Р Ь99Т АЮОУ 2,16хЮ’3 120,0 1,79х10’3 11,19
М55 Κ28Ν ТЗОА Ь568 Е54К Α57Ν 858Е Ε64ϋ Ь99Т АЮОУ 5,85хЮ'3 325,0 4,78хЮ4 2,99
М56 Κ28Ν Τ30ϋ Ь568 Е54К Α57Ν Н61Р Ь99Т АЮОУ 9,35хЮ’3 519,4 4,79хЮ'4 2,99
М57 Κ28Ν Τ30ϋ Ь568 Е54К Α57Ν 858Е Ь99Т АЮОУ 0.0104 1,200 3.22хЮ’4 3,08
М58 Κ28Ν Τ30ϋ Ь568 Е54К Α57Ν 8581 Н61Е Ь99Т АЮОУ Отсутствие связывания н.о. 1,95хЮ'3 12,19
М59 Κ28Ν Τ30ϋ Ь568 Е54К Α57Ν 858Ν Н61Г Ь99Т АЮОУ 0,0123 683,3 5,24хЮ4 3,28
М60 Κ28Ν Ь568 Е54К Ь99Т 0,0272 1511,1 9,11хЮ’4 5,69
- 48 015526
Τ30ϋ Α57Ν 858К. Н61Р АЮОУ
М61 Κ28Ν ТЗОО А51Н Ε54ζ) Α57Ν Н61Р Ь99Т АЮОУ 5,21хЮ'3 289,4 4,59x10’4 2,87
М62 Κ28Ν ТЗОО А51Н Ь56Т Е54К Α57Ν 858Е Ъ99Т АЮОУ 5.75x10’3 242 5.57х10'4 5,86
М63 Κ28Ν ТЗОО О50А Е54К Α57Ν 858Т Ь99Т АЮОУ 2,65x10’3 147,2 1,50х10’3 9,38
М64 Κ28Ν ТЗОО О50А Е54К Α57Ν 858У Ь99Т АЮОУ 0,0234 1300,0 1,32x10’3 8,25
М65 Κ28Ν ТЗОО С50А Ь561 Е54К А57С Ь99Т АЮОУ 4,07x10'3 226,1 8,03x10'4 5,02
М66 Κ28Ν ТЗОО Ь561 Е54К А57Е Ь99Т АЮОУ 5,11x10'3 283,9 5,20x10'4 3,25
М67 Κ28Ν ТЗОО Ь561 Е54К А57Е Ь99Т АЮОУ 1,71х103 95,0 8,20х10’4 5,13
М68 Κ28Ν ТЗОО Ь561 Е54К Α57Ν 858ϋ Ε64ϋ Ь99Т АЮОУ 6,76x10’3 375,6 4,28x10’4 2,68
М69 Κ28Ν ТЗОО Ь561 Е54К Α57Ν 85 8Е Ь99Т АЮОУ 1,81х10'3 100,6 7,33x10’4 4,58
М70 Κ28Ν ТЗОО Ь561 Е54К А578 Ь99Т АЮОУ 6,07x10'3 337,2 5,59x10’4 3,49
М71 Κ28Ν ТЗОО Ь561 Е54К Α57Υ Ь99Т АЮОУ 2,12х10'3 117,8 1,28x10'3 8,00
М72 Κ28Ν ТЗОО Ь568 Е54К Ь99Т АЮОУ 3,95x10'3 219,4 4,00x10’4 2,50
М73 Κ28Ν ТЗОО Ь568 Е54К Α57Ν 858Υ Ε64ϋ Ь99Т АЮОУ 3,00x10’3 166,7 2,55x10’4 1,59
М74 Κ28Ν ТЗОО Ь568 Е54К А578 Ь99Т АЮОУ 6,03x10’3 335,0 5,97x10’4 3,73
М75 Κ28Ν ТЗОО Ь568 Е54К А57У Ь99Т АЮОУ 1,87x10’2 1038,9 1,16x10'3 7,25
М76 Κ28Ν Т308 О50А Ь56Т А57О Ь99Т АЮОУ 1,16x10'3 64,4 3,64x10’4 2,28
М77 Κ28Ν Т308 О50А Ь56Т Е54К Α57ϋ Ь99Т АЮОУ 0,0143 794,4 4,77x10’4 2,98
М78 Κ28Ν Т308 О50А Ь56Т Ε54Κ Α57Ν 858Τ Ь99Т АЮОУ 0,167 9277,8 1,31хЮ'3 8,19
М79 Κ28Ν Т308 О50А Ь56Т Ε54Κ Α57Ρ Ь99Т АЮОУ 0,19 10555,6 1,29x10'3 8,06
М80 Κ28Ν Т308 Ь561 Ε54Κ Α57Ν 858У Ь99Т АЮОУ 0,0993 5516,7 2,09x103 13,06
М81 Κ28Ν Т308 Ь568 Ε54Κ Α57Ν 858Ε Ь99Т АЮОУ 4,29x10’3 238,3 4,90x10'4 3,06
М82 Κ28Ν Т30У А51Н Ь56Т Α57Ν Ь99Т АЮОУ 6,99x10'3 388,3 8,77x10’4 5,48
М83 Κ28Ν ТЗОУ А51Н Ь56Т Ε54Κ Α57Ν 858Μ Η61Ρ Ь99Т АЮОУ Отсутствие связывания н.о. 9,33x10’4 5,83
М84 Κ28Ν ТЗОУ А51Н Ь56Т Ε54Ν Α57Ν Ь99Т АЮОУ 1,76x10’2 977,8 1,08x10’3 6,75
Все СЭК включают СЭК Кабата и Чотиа. Аминокислотные остатки пронумерованы последовательно (см. фиг. 5). Все клоны имеют последовательности Ь3+Н1+Н3, идентичные С1.
Кп=кой/коп. Все значения кой- определяли в режиме скрининга, за исключением подчеркнутых, которые получены путем общего анализа серий концентраций РаЬ (С1 анализировали в режиме высокого разрешения). Таким образом, подчеркнутые значения Ко определяли экспериментально путем измерения коп. Оценили, что другие значения коп являются такими же, как М25.
н. о. означает не определено
- 49 015526
Для определения эпитопа на человеческом α-ССКР, распознаваемом антителом С1, использовали вышеописанные анализы В1асоге. Человеческий α-СОКР приобретен в виде ^биотинилированного варианта для того, чтобы дать возможность для его высокоаффинного захвата посредством сенсорного чипа 8А. Определяли связывание фрагмента РаЬ С1 с человеческим α-ССКР на чипе в отсутствие или в присутствии пептида ССКР. Как правило, 2000:1 моль пептид/раствор РаЬ (например, 10 мкМ пептида в 50 нМ РаЬ С1) вводили через человеческий α-ССКР на чипе. На фиг. 6 представлен процент связывания, блокированного конкурирующим пептидом. Данные, представленные на фиг. 6, указывают на то, что пептиды, блокирующие 100% связывания РаЬ С1 с человеческим α-ССКР, представляют собой 1-37 (ДТ), 8-37, 26-37, Р29А (19-37), К35А (19-37), К35Е (19-37) и К35М (19-37) человеческого α-ССКР; 1-37 β-ССКР (ДТ); 1-37 крысиного α-ССКР (ДТ) и 1-37 крысиного β-ССКР (ДТ). Все эти пептиды амидированы по С-концу. Пептиды Р37А (19-37) и 19-37 (последний не амидирован по С-концу) человеческого α-ССКР также блокировали приблизительно от 80 до 90% связывания РаЬ С1 с человеческим α-ССКР. Пептид 1-36 (не амидирован по С-концу) человеческого α-ССКР блокировал приблизительно 40% связывания РаЬ С1 с человеческим α-ССКР. Пептидный фрагмент 19-36 (амидирован по С-концу) человеческого α-ССКР; пептидные фрагменты 1-13 и 1-19 человеческого α-ССКР (ни один из которых не амидирован по С-концу); и человеческий амилин, кальцитонин и адреномедуллин (все амидированы по Сконцу) не конкурировали за связывание РаЬ С1 с человеческим α-ССКР на чипе. Эти данные демонстрируют, что С1 нацелен на С-концевой эпитоп ССКР и что для связывания важны как идентичность самого последнего остатка (Р37), так и его амидирование.
Также определяли аффинности связывания РаЬ С1 с вариантами человеческого α-ССКР (при 37°С). В табл. 7 ниже представлены аффинности, измеренные непосредственно путем титрования РаЬ С1 через ^биотинилированный человеческий α-ССКР, и варианты на чипе. Данные в табл. 7 указывают на то, что антитело С1 связывается с С-концевым эпитопом, причем Р37 и С33 представляют собой наиболее важные остатки. С1 не связывается с ССКР, когда избыточный аминокислотный остаток (аланин) добавлен к С-концу (который является амидированным).
Таблица 7 Аффинности связывания РаЬ С1 с человеческим α-ССКР и вариантами, измеренные при 37°С (см. табл. 4 в отношении их аминокислотных последовательностей)
ССКР на чипе кОп(1/Мс) ко»(1/с) Ко(нМ)
1-37 (ДТ) 4,68x105 7,63x10'5 0,16 (высокое разрешение Ко=0,06)
19-37 4,60х105 7,30x10'5 0,16
25-37 3,10х105 8,80x10‘5 0,28
Р27А (25-37) 3,25х105 1,24х10’4 0,38
У28А (25-37) 3,32х105 9,3 8x10'5 0,28
Р29А (25-37) 2,26x105 1,78x10'4 0,79
ТЗОА (25-37) 1,79x105 8,41х10'5 0,47
N31А (25-37) 2,17x105 1,14x10'4 0,53
У32А (25-37) 2,02x105 3,46х10’4 1,71
СЗЗА (25-37) 2,07x105 0,0291 141
834А (25-37) 2,51х105 7,64x104 3,04
К35А (19-37) 2,23х105 2,97x10'4 1,33
К35Е (19-37) 5,95x104 15,79x10’4 9,73
К35М (19-37) 2,63x105 1,34x10’4 0,51
КЗ 5(^(19-37) 1,95х105 2,70x1ο4 1,38
Р37А (25-37) 8,90x104 8,48x10'3 95 (раствор КО=172 нМ)
38А (25-3 8А) - - Связывание не обнаружено
Вышеприведенные данные указывают на то, что эпитоп, который связывает антитело С1, находится на С-конце человеческого α-ССКР, и аминокислоты 33 и 37 человеческого α-ССКР важны для связывания антитела С1. Кроме того, для связывания важно амидирование остатка Р37.
Пример 5. Действие антагонистического антитела против ССКР С1 на расширение кровеносных сосудов в коже, вызванное путем стимуляции подкожного нерва крысы.
Для тестирования антагонистической активности антитела против ССКР С1 действие антител на расширение кровеносных сосудов кожи путем стимуляции подкожного нерва крысы тестировали с использованием крысиной модели, описанной в примере 3. Кратко, крыс поддерживали в состоянии ане
- 50 015526 стезии с 2% изофлураном. Бретилия тозилат (30 мг/кг, вводимый в.в.) давали в начале эксперимента для минимизации сужения кровеносных сосудов ввиду сопутствующей стимуляции симпатических волокон подкожного нерва. Температуру тела поддерживали при 37°С путем использования ректального зонда, термостатически связанного с контролируемым по температуре нагревающим одеялом. Подкожный нерв правой задней конечности извлекали хирургическим путем, проксимально надрезали и покрывали пластиковой оберткой для предотвращения высыхания. Лазерный доплеровский зонд помещали на медиодорсальную сторону кожи задней конечности, представляющей собой область, иннервируемую подкожным нервом. Кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови, контролировали с использованием лазерного доплеровского измерителя потока. В экспериментах по определению действий антитела в течение 2 ч после инъекции через 30-45 мин после инъекции бретилия тозилата, когда устанавливался стабильный базовый поток (варьирование менее 5%) в течение по меньшей мере 5 мин, нерв помещали на платиновые биполярные электроды и подвергали электрической стимуляции (2 Гц, 10 В, 1 мс, в течение 30 с) и затем вновь через 20 мин. Средний ответ в виде кровотока для этих двух стимуляций использовали для оценки базового ответа (время 0) на электрическую стимуляцию. Затем внутривенно (в.в.) вводили антитело С1 (1 или 10 мг/кг) или разбавитель (РВ8 с 0.01% Тетееп 20, объем, равный 10 мг/кг С1). Нерв затем стимулировали (2 Гц, 10 В, 1 мс, в течение 30 с) через 30, 60, 90 и 120 мин после введения антитела. Животных поддерживали в состоянии анестезии в течение периода приблизительно 3 ч. Кумулятивное изменение кровотока в коже оценивали по площади под кривой зависимости потока от времени (АИС, эквивалентной изменению потока, умноженному на изменение времени) для каждого ответа в виде изменения потока на стимуляцию электрическим импульсом.
Как показано на фиг. 7, увеличение кровотока, стимулированное применением электрических импульсов на подкожный нерв, ингибировалось присутствием антитела С1 в количестве 1 мг/кг (вводимого в.в.) по сравнению с разбавителем, когда подкожный нерв электрически стимулировали через 90 мин после введения антитела. Увеличение кровотока, стимулированное путем применения электрических импульсов на подкожный нерв, значительно ингибировалось присутствием антитела С1 в количестве 10 мг/кг (вводимого в.в.) по сравнению с разбавителем, когда подкожный нерв электрически стимулировали через 90 и 120 мин после введения антитела.
В экспериментах по определению действий антител в более длительные моменты времени в анализе на подкожном нерве, крысам в.в. инъецировали указанные дозы антитела за 24 ч или 7 суток до подготовки животного к стимуляции подкожного нерва, как описано выше. В этих экспериментах невозможно было определить у отдельных крыс базовый ответ на стимуляцию электрическим импульсом перед введением дозы, так что группы, подвергнутые обработке, сравнивали с животными, которым вводили дозу разбавителя (РВ8, 0,01% Т\гееп 20) за 24 ч или 7 суток.
Как показано на фиг. 8А и 8В, кровоток, увеличенный в дорсо-медиальной области кожи задней конечности вследствие стимуляции подкожного нерва, значительно ингибировался в группах животных, которым вводили дозы 10 или 3 мг/кг С1 за 24 ч или 7 суток до стимуляции по сравнению с группами, которым вводили дозы разбавителя в те же моменты времени.
На фиг. 8С представлен анализ подгонки кривой, примененный в отношении данных зависимости доза-ответ, представленных на фиг. 8 А и 8В, для определения дозы, требующейся для средней эффективной дозы (ЕС50). ЕС50 на 24 ч составляет 1,3 мг/кг, и ЕС50 на 7 суток немного ниже (0,8 мг/кг).
Пример 6. Острый эффект антагонистического антитела против ССКР С1 в анализе на дуральной артерии (закрытое черепное окно).
Модель закрытого черепного окна: Задача данного эксперимента заключалась в определении острого эффекта антагонистических антител против ССКР и его сравнении с острым эффектом антагониста рецептора ССКР В1В№096В8. Эксперименты осуществляли, как описано ранее (А1Шаткоп е! а1., СерЬа1а1д1а 17(4):518-24 (1997)) со следующими модификациями. Крыс 8ргадие Оа\\'1еу (300-400 г) подвергали анестезии путем в.б. введения 70 мг/кг фенобарбитала. Анестезию поддерживали с использованием 20 мг/кг/ч в. в. фенобарбитала. Крысам через яремную вену вводили канюлю для доставки всех лекарств. Давление крови контролировали при помощи зонда (катетер с микронаконечником, М111аг 1п81гитеп18), вставленного через бедренную артерию в брюшную аорту. Крыс подвергали трахеотомии и частоту дыхания поддерживали на уровне 75 вдохов/мин при объеме 3,5 мл. После фиксации головы в стереотаксической установке и удаления кожи черепа готовили окно 2x6 мм в левой теменной области латерально к сагиттальному шву путем истончения кости при помощи бормашины. С использованием микроманипулятора платиновый биполярный электрод опускали на поверхность и покрывали тяжелым минеральным маслом. Латерально к окну электрода готовили и покрывали тяжелым минеральным маслом еще одно окно 5x6 мм, через которое непрерывно при помощи камеры с зарядовой связью (ССЭ) и видеоанализатора плотности (ЬМпд 8у81етк) контролировали диаметр ветви средней артерии мозговой оболочки (ММА). Крыс тестировали в течение по меньше 45 мин после подготовки. Оценивали базовый ответ на электрическую стимуляцию (15 В, 10 Гц, импульсы 0,5 мс, 30 с) и крысам затем в.в. водили дозу экспериментального соединения (10 мг/кг ти7Е9, 300 мкг/кг В1В№096В8 или РВ8 0,01% Т\гееп 20). Дополнительную электрическую стимуляцию осуществляли через 5 (ВГВЫ4096В8), 30, 60, 90 и 120 мин после
- 51 015526 введения дозы. Все данные регистрировали с использованием программного обеспечения для построения графиков (АВЫкйитепй).
Как показано на фиг. 9, ти7Е9 в концентрации 10 мг/кг значительно блокирует расширение ММА, вызванное стимуляцией электрическим полем в течение 60 мин после введения дозы, и сохраняет этот эффект на протяжении всего анализа (120 мин). Для сравнения, ВШШ096ВЗ блокирует расширение ММА в течение 5 мин после введения дозы, но этот эффект полностью исчезал в течение 90 мин. Величина блокирования была сравнима у ВШШ096ВЗ и ти7Е9.
Пример 7. Длительный эффект антагонистического антитела против ССКР С1 в анализе дуральной артерии (закрытое черепное окно).
Задача этого эксперимента заключалась в определении того, может ли антитело против ССКР блокировать электрически стимулированное расширение ММА в течение 7 суток после введения дозы. Подготовка крыс была идентична вышеописанному эксперименту (пример 6) со следующими исключениями. Крысам в.в. инъецировали (10, 3 или 1 мг/кг С1) за 7 суток перед созданием закрытого черепного окна и стимуляцией. Невозможно было определить базовый ответ в виде расширения кровеносных сосудов на электрическую стимуляцию перед введением дозы как в вышеописанном эксперименте, так что группы, которым вводили антитело, сравнивали в отношении расширения ММА с контрольной группой, которой вводили дозу разбавителя (РВЗ, 0,01% Туееп 20). После того как крыс оставляли не менее чем на 45 мин, твердую мозговую оболочку подвергали электрической стимуляции с 30-минутными интервалами. Стимуляции осуществляли импульсами 2,5, 5, 10, 15 и 20 В, все с частотой 10 Гц, длительностью 0,5 мс в течение 30 с.
Как показано на фиг. 10, С1 в концентрации 10 мг/кг и 3 мг/кг значительно блокировал расширение ММА, вызванное электрической стимуляцией в диапазоне от 10 до 20 В. Эти данные демонстрируют, что С1 может блокировать электрически стимулируемое расширение ММА вплоть до 7 суток после введения дозы.
Пример 8. Модель приливов после отмены морфина.
Крысиная модель отмены морфина представляет собой общепринятую модель на грызунах для анализа механизмов прилива крови при менопаузе (З1ре е! а1., Вгаш Кек. 1028(2): 191-202 (2004); МегсйепЛа1ег е! а1., Ма!ип!ак 30:307-316 (1998); Ка1от1с11 е! а1., Вгат Кек. 494:85-94 (1989); З1тркшк е! а1., ЫГе Заепсек 32:1957-1966 (1983)). В сущности у крыс вызывают привыкание к морфину путем имплантации морфиновых капсул под кожу. После возникновения привыкания животным инъецируют налоксон (опиоидный антагонист), который немедленно приводит их в абстинентное состояние. Это абстинентное состояние сопровождается повышением температуры кожи, снижением внутренней температуры тела, увеличением частоты пульса и увеличением концентрации в сыворотке крови лютеинизирующего гормона. Эти показатели по силе и времени протекания подобны тем, которые наблюдают при приливах крови у людей (З1трктк е! а1., ЫГе Зс1епсек 32:1957-1966 (1983)). Кроме того, если крыс обработать эстрадиолом перед тем, как вызвать абстинентное состояние, симптомы приливов крови уменьшаются (МегсйепЛа1ег е! а1., Ма!ип!ак 30:307-316 (1998)). Полагают, что вследствие этого модель отмены морфина имитирует клиническую картину прилива крови.
Крысы, подвергнутые овариэктомии, приобретены в Сйаг1ек Кгуег ЬаЬога!опек. Не меньше чем через 7 суток после овариэктомии зависимости от морфина добивались путем подкожной имплантации морфиновой капсулы (75 мг морфинового основания). Через двое суток имплантировали еще 2 капсулы. На следующие сутки крысам внутривенно инъецировали 10 мг/кг 4901 [**] или разбавитель (РВЗ, 0,01% !уееп). Через двое суток после второго введения капсулы крыс подвергали анестезии кетамином (90 мг/кг) и слегка придерживали. Термопарный датчик для регистрации поверхностной температуры прикрепляли к основанию хвоста, а ректальный термопарный датчик использовали для измерения внутренней температуры. Данные регистрировали с использованием программного обеспечения Скай (ΛΌΙπк!гитеп!к). После регистрации стабильной базовой температуры в течение 15 мин подкожно инъецировали налоксон (1 мг/кг). Температуру регистрировали непрерывно в течение следующих 60 мин. Результаты представлены на фиг. 11А и 11В.
Понятно, что описанные здесь примеры и воплощения приведены только для иллюстративных целей, и что различные модификации или изменения в их свете могут быть предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и объем данной заявки на изобретение. Все цитированные здесь публикации, патенты и заявки на патенты включены здесь для всех целей путем ссылки в том же объеме, как если бы для каждой индивидуальной публикации, патента или заявки на патент специфически и индивидуально было указано, что она включена путем ссылки.
Депонирование биологического материала.
Следующие материалы депонированы в Американской коллекции типовых культур, 10801 Ипгуегкйу Вои1е\'агй Мапаккак, ЫгЦша 20110-2209, (1ЗА(АТСС):
- 52 015526
Материал Антитело №______№ АТСС Дата депонирвоания рОЬ.СОКР.ЬГсО1 тяжелая цепь 01 РТА-6867 15 июля 2005 рЕЬ.СОКР.БКО1 легкая цепь 01 РТА-6866 15 июля 2005
Вектор рЕЬ.СОКР.йКО1 предсталяет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи к О1; и вектор рПЬ.СОКР.йЕсО1 представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи О1 и константную область тяжелой цепи 1дО2, содержащий следующие мутации: А330Р331 на 83308331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательность 1дО2 дикого типа; см. Еиг. 1. 1ттипо1. (1999) 29:2613-2624).
Эти депонирования сделаны в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры и инструкциями к нему (Будапештский договор). Это обеспечивает поддержание жизнеспособной культуры в органе по депонированию в течение 30 лет с даты депонирования. Депонирование сделано в АТСС по условиям Будапештского договора и является предметом соглашения между Кта! №игокс1епсе Согр. и АТСС, обеспечивающих постоянный и неограниченный доступ к потомству культуры в орган по депонированию лицам после выдачи соответствующего патента США или после выкладки заявки для опубликования любой заявки на патент США или иностранной заявки, в зависимости от того, какая будет опубликована первой, и обеспечивает доступ к потомству лица, определенному комиссаром по патентам и товарным знакам США как правомочное для этого в соответствии с 35 и8С 8есйоп 122 и СоттЕкюпег'к ги1ек ригкиап! 1йеге1о (включая 37 СЕК 8есйоп 1.14 с конкретной ссылкой на 886 0О 638).
Правопреемник настоящей заявки на патент согласен, что если культура материалов, находящихся в органе по депонированию, погибнет либо будет утрачена или разрушена при культивировании в подходящих условиях, материалы немедленно будут заменены на такие же по уведомлении. Доступность депонированного материала не следует рассматривать как лицензию на практическое применение изобретения в нарушение прав, предоставляемых органами власти в соответствии с патентными законами.
Последовательности антитела
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи О1 (8ЕР Ιϋ Ν0: 1) ΕναΓνΕ56βθΓνθΡΘβδΙΚΙδΟΑΑ5(3ΡΤΕδΝΥννΐ5νννΗΟΑΡΘΚΟίΕνννΑΕ}Κ8ΕδΟΑ3ΑΤΗΥΑΕΑνΚά
ΚΡΤΙδΗϋΝΑΚΝδΓΥΕΟΜΝδΙΚΑΕΟΤΑνΥΥόΙΑΥΕΟΥΟΙΑίαΝΥννοαΘΤίντνδδ
Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи О1 (8ЕР Ιϋ Ν0: 2)
ΕΐνΐταδΡΑΤΓ8ΓδΡΘΕΚΑΤΙδΟΚΑδΚΚντΤΥνδννΥααΚΡααΑΡΚΓΓΙΥΘΑ8ΝΗΥΙΟΙΡΑΚΡ8<38αδΘΤΟΡ ΤΙΤΙδδΓΕΡΕΟΕΑνΥΥΟδΟδΥΝΥΡΥΤΕΘαθΤΚίΕΙΚ
О1' СОК Н1 (расширенный СОК) (8Ер Ιϋ Ν0: 3)
ΟΡΤΓ8ΝΥΨΙ8
О1 СОК Н2 (расширенный СОК) (8Ер Ιϋ Ν0: 4)
ΕΙΚ8Ε8ΟΑ8ΑΤΗΥΑΕΑΥΚΟ
О1 СОК Н3 (8ЕД) Ιϋ Ν0: 5) УЕОУОЬАЩОТ
О1 СОК Ь1 (8ЕР Ιϋ Ν0: 6) ΚΑδΚΚνΤΤΥνδ
О1 СОК 1,2 (8ЕР Ιϋ Ν0: 7) ОАЗЫКУЬ
О1 СОК 1,3 (8ЕР Ιϋ Ν0: 8) 8Ο8ΥΝΥΡΥΤ
Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи О1 (8ЕР Ш Ν0: 9)
СААЗттсАостззттзААТссбзтззтсстстезттсАзссАЗЗтззттссстзсзтстзтсстзс ЗСТЗСТТССЗЗТТТСАССТТСТССААСТАСТЗЗАТСТССТЗЗЗТТСЗТСАЗбСТССТЗЗТАААЗОТСТ ЗЗААТЗЗбТТЗСТЗАААТССОТТССЗААТССЗАСЗСЗТССЗСТАСССАТТАСЗСТЗААбСТЗТТААА ЗЗТСЗТТТСАССАТСТСССЗТЗАСААСЗСТААЗААСТСССТЗТАССТЗСАеАТЗААСТСССТЗСЗТЗ СТЗААЗАСАССЗСТЗТТТАСТАСТЗССТЗЗСТТАСТТТЗАСТАСЗЗТСТЗЗСТАТССАбААСТАСТСЗ (ЗОТСАССеТАСССТСеТТАСССТТТССТСС
Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи О1 (8ЕР Ш Ν0: 10) ЗАААТСЗТТСТЗАСССАСТССССЗЗСТАСССТЗТСССТЗТССССАЗЗТЗААСЗТЗСТАСССТЗТССТЗС АААЗСТТССАААСЗЗЗТТАССАССТАСЗТТТССТЗЗТАССАЗСАОАААСССбЗТСАЗбСТССТСЗТСте СТЗАТСТАСЗВТЗСТТССААССЗТТАССТСЗЗТАТСССАЗСТСЗТТТСТССЗЗТТССЗЗТТССЗСТАССЗ АСТТСАСССТЗАССАТСТССТСССТЗЗААСССЗААСАСТТСЗСТЗТТТАСТАСТЗСАЗТСАЗТССТАСАА СТАССССТАСАССТТСЗСТСАЗЗЗТАССАААСТЗЗАААТСААА
- 53 015526
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи полноразмерного антитела С1 (включающего описанный здесь модифицированный 1дС2) (8ЕЭ Ю N0: 11)
ΕναίνΕ8Θ6ΘΐναΡΘΟδΙΚΙδΟΑΑ3ΘΡΤΡ8ΝΥννΐ3νννκαΑΡΘΚΘΙΕνννΑΕΙΗ5Ε30ΑδΑΤΗΥΑΕΑνΚ6Κ ΡΤΙδΡΟΝΑΚΝδΙΥΙΟΜΝδΙΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΙΑΥΕΟΥΟυχίαΝΥννοαΘΤίντνδδΑδΤΚΟΡδνΕΡΙΑΡΟδΚδ ΤδΕδΤΜΙΘΟίνΚΟΥΡΡΕΡντνδννΝδΘΑίΤδανΗΤΕΡΑνίαδδΟίΥδΙδδνντνΡδδΝΕΟΤαΤΥΤΟΝνΟΗ ΚΡδΝΤΚνοΚΤνΕΚΚΟΟνΕΟΡΡΟΡΑΡΡνΑΘΡδνΕΙΕΡΡΚΡΚΟΤΙΜΙδΚΤΡΕνΤΟνννονδΗΕΟΡΕναΡΝννΥ νΟΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΒΕΕαΕΝδΤΕΡννδνίΤννΗαοννίΝβΚΕΥΚΟΚνδΝΚΟίΡδδΙΕΚΤΙδΚΤΚααΡΕΕΡαν
ΥΤΙΡΡ3ΡΕΕΜΤΚΝαν31ΤΟΐνΚΟΕΥΡ301ΑνΕ\ΛΕ8ΝθαΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡΜ108Ο6δΡΡΙΥ5ΚΙ-Τν0Κ8Κνν β0ΘΝνΡ808νΜΗΕΑΙ.ΗΝΗΥΤ0Κ81.81.8ΡΘΚ
Аминокислотная последовательность легкой цепи полноразмерного антитела С1 (8ЕЭ Ю N0: 12)
Εΐ\/ίΤ08ΡΑΤΕ3Ε3ΡΘΕΚΑΤΕ3ΟΚΑδΚΗνΤΤΎν8ννΥΟ0ΚΡβΟΑΡΚΕίΙΥΘΑ8Νί?ΥίΟΐΡΑΚΡ8Θ8Θ8ΘΤ0 ΡΤΙ-Τ!8δΙ_ΕΡΕ0ΕΑνΥΥΟ8Ω3ΥΝΥΡΥΤΡβΟβΤΚΙ-Ε]ΚΕΤνΑΑΡ8\/Ε!ΕΡΡ80ΕΟΙ_Κ8(3ΤΑ8ννο1_Ι-ΝΝΡΥΡ ΗΕΑΚν0ννΚν0ΝΑΕβ80ΝδΩΕ8νΤΕ008Κ08ΤΥ8Ι_5δΤΙΤΙ-8ΚΑ0ΥΕΚΗΚνΥΑ0ΕνΤΗ(2β1_88ΡνΤΚ3Ρ 1ЧВ0ЕС
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи полноразмерного антитела С1 (включающего описанный здесь модифицированный Е;С2) (8ЕЭ Ю N0: 13)
СААбггсА<зстасттсААТСсббтсбТсетстсеттсд(ЗссАсегееттссстссстстстсстос ОСТССТТССССТТТСАССТТСТССААСТАСТбСАТСТССТССОТТССТСАСССТССТСОТАААСеТС ТССААТ6С0ТТ6СТСАААТСССТТСС6ААТСС0АССС0ТССССТАСССАТГАС0СТ0ААССТСТТАА АбОТССТТТСАССАТСТСССбТСАСААСССТААСААСТСССТеТАССТССАСАТСААСТСССТССбТ ССТСААеАСАСС6СТСТТТАСТАСтеССТСеСПАСТТТСАСТАС6СТСТ66СТАТССА0ААСТАСТ6 СССТСАСССТАСССТССТТАСССТТТССТСССССТССАССААСОССССАТСТбТСТТСССАСТееС СССАТССТСССССАбСАССТСССАбАССАСАСССССССТОСССТОССТССТСААССАСТАСТТССС АеААССТ0Т6АСС(ЗТСТССТ6СААСТСТ66С6СТСТ6АССА6СССС6Т(ЗСАСАССТТСССАССТСТ ССТССАОТССТСАеСТСТСТАСТСССТСАССАСССТССТСАССОТеССАТССАбСААСТТССеСАС ССАСАССТАСАССТССААСеТАОАТСАСААеССААеСААСАССААССТСвАСААСАСССТССАСАе ААДеТСТТОТеТССАСТеТССАССТТеТССАОССССТССАОТООСССбАССАТССОТОТТССТОТТС ССТССАААСССАААСеАСАСССТСАТСАТСТССАСААССССАСАебТСАССТСЗТСТСОТбСТСЗСАС СТСТСССАСОАССАСССАОАССТСЗСАбТТСААСТСОТАТСТССАССЗСАеТССАСеТеСАСААСССС ААСАССААЗССААСАСАСОАССАСТТСААСТССАССТТСАСАСТСеТСАОСеТССТСАСССТССТе САССАбСАСТСССТеААСССАААССАСТАТААОТСТААССТСТССААСААСССАСТСССАТССАСС АТССАСААСАССАТСТССААбАССААСОСАСАСССААеАСАСССАСАССТСТАТАСССТССССССА ТССАОАСАС(ЗАСАТ(ЗЛССААСААССА(3(ЗТ<ЭТСССТСАССТСТСТС(ЗТСААСССАТТСТАТССАТСС<3 АСАТССССеТССАбТСаСАСТССААСОСАСАСССАСАОААСААСТАТААСАССАССССТССААТСС ТСОАСТСССАСбСАТССТТСТТССТСТАТТССААСЗСТСАСССТббАСААеТССАОАТбеСАССАССе АААСеТбПСТСТТСТТССеТСАТССАССАСеСССТССАСААССАСТАТАСССАбААСАСССТСТСС СТОТСТССАСОЛААОТАА
Нуклеотидная последовательность легкой цепи полноразмерного антитела С1 (8Е0 Ю N0: 14)
ОАААТСеТТСТСАСССАеТСССССССТАСССТСТСССТСТССССАООТСААССТССТАСССТСТССТ ОСАААеСТТССАААСбСеТТАССАССТАСбТТТССТССТАССАеСАОАААСССССТСАСССТССТСС ТСТеСТбАТСТАСССТССТГССААССбТТАССТСОбТАТСССАССТСеТТТСТССебТТССбОТТСС ССТАСССАСТТСАСССТСАССАТСТССТСССТССААССССЗААСАСТТСССТеТТТАСТАСТССАОТС АСТССТАСААСТАССССТАСАССТТС(ЗеТСАО<ЗСТАССАААСТС6АААТСАААСеСАСТСТе<ЗСТСС АССАТСТеТСТТСАТСТТСССТССАТСТСАТбАССАСТТСАААТССеСААСТеССТСТеТТСТеТССС ТбСТСААТААСТТСТАТСССССЗСеАОСССАААбТАСАСтеОААеСТеСАТААСССССТССААТССО бТААСТСССАССАеАСТСТСАСАОАССАССАСАССААСеАСАССАССТАСАСССТСАССАЗСАССС ТвАСССТСА(ЗСАААвСА(ЗАСТАСОАвАААСАСАААвТСТАСвССГ(ЗСОААвТСАСССАТСАС(ЗвСС ТСАСТТСТССАЗТСАСАААСАССТТСААССбСССТОАОТССТАА
Сравнение аминокислотной последовательности человеческого и крысиного ССКР (человеческий α-ССКР (8Е() 10 N0: 15); человеческий β-ССКР (8Ер 10 N0: 43); крысиный α-ССКР (8Е() 10 N0: 41) и крысиный β-ССКР (8ЕР ΙΏ N0: 44)):
- 54 015526
ΝΗ2-Α0ρΤΑΤ0νΤΗΗ1_Α011δΠ300ννΚΝ’ΝΡνΡΤΝν08ΚΑΡ-00ΝΗ2 (человеческий α-ССКР) ΝΗ2-ΑΟΝΤΑΤθνΤΗΚΙΑ0113Ρ5θαΜνΚ8ΝΡνΡΤΝν68ΚΑΕ-ΟΟΝΗ2 (человеческий β-ССКР) ΝΗ2-^θΝ7ΑΤθνΤΗΡΙΑΟί18Η36(3ννΚρ1ΝΕνΡΤΝνΘ8^ΑΡ-ΟΟΝΗ2 (крысиный α-ССКР)
ΝΗ2-'30ΝΤΑΤθνΤΗΠΙΑΟ118Η3Ο0ννΚρ;ΝΕνΡΤΝνθ8ΚΑΡ-0ΟΝΗ2 (крысиный β-ССКР)
Перечень последовательностей <110> Ринат Ньюросайенс Корп.
Зеллер, Джоэрг
Поулсен, Кристиан
Абдич, Ясмин
Понс, Хауме
Сьерра, Джонс Розенталь, Арнон <120> Антагонистические антитела против пептида, связанного с геном кальцитонина, и способы их применения <130> РС19499А <160> 47 <170> РаЬепЫп версия 3.3 <210> 1 <211> 122 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вариабельная область <400> 1 цепи гуманизированного антитела
С1и 1 Уа1 С1п Деи Уа1 5 С1и Зег С1у
Зег Деи Агд Деи 20 Зег Суз А1а А1а
Тгр Не Зег 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40
А1а С1и 50 11е Агд Зег С1и Зег 55 Азр
А1а 65 Уа1 Дуз 61у Агд РЬе 70 ТЬг Не
Деи Туг Деи С1п МеЬ 85 Азп Зег Деи
Туг Суз Деи А1а 100 Туг РЬе Азр Туг
С1у С1п С1у 115 ТЬг Деи Уа1 ТЬг Уа1 120
<210> 2 <211> 107 <212> ПРТ
С1у С1у 10 Деи Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
Зег 25 61у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Азп Туг
Рго С1у Дуз С1у Деи 45 С1и Тгр Уа1
А1а Зег А1а ТЬг 60 Нхз Туг А1а С1и
Зег Агд Азр 75 Азп А1а Дуз Азп Зег 80
Агд А1а 90 61и Азр ТЬг А1а Уа1 95 Туг
С1у 105 Деи А1а Не С1п Азп 110 Туг Тгр
Зег Зег
- 55 015526 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела <400> 2
С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег Ьуз Агд Уа1 ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
Уа.1 Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг С1у А1а Зег Азп Агд Туг Ьеи С1у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег СЬу Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
61и Авр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Зег С1п Зег Туг Азп Туг Рго Туг
85 90 95
ТНг РЬе С1у 61п С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 3 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СОК Н1 гуманизированного антитела <400> 3
С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азп Туг Тгр 11е Зег
1 5 10
<210> 4
<211> 19
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<22 0> <223> СОК Н2 гуманизированного антитела
<400> 4
С1и Не Агд Зег С1и Зег Азр А1а Зег А1а ТЬг ΗΪ3 Туг А1а С1и А1а
1 5 ю 15
Уа1 Ьуз С1у
- 56 015526 <210> 5 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> СЬК НЗ гуманизированного антитела <400> 5
Туг РЬе Авр Туг С1у Ьеи А1а Не С1п Авп Туг
5 10 <210> 6 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СЭК Ь1 гуманизированного антитела <400>6
Ьув А1а Зег Ьув Агд Уа1 ТЬг ТЬг Туг Уа1 Зег 1 510 <210>7 <211>7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СОВ Ь2 гуманизированного антитела <400> 7
С1у А1а Зег Азп Агд Туг Ьеи
5
<210> <211> <212> <213> 8 9 ПРТ Искусственная последовательность
<220> <223> СОК ЬЗ гуманизированного антитела
<400> 8
Зег С1п Зег Туг Авп Туг Рго Туг ТЬг
1 5
<210> <211> <212> <213> 9 366 ДНК Искусственная последовательность
- 57 015526 <220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела <400> 9
даадббсадс ЪддЬЪдааЬс сддбддЪддЪ сбддЪЪсадс саддбддЪЪс ссбдсдбсЪд 60
Ъссбдсдсбд аЬЬссддЬЪЪ сассЪЬсбсс ааобасбдда ЬсбссбдддЪ Ьсдбсаддсб 120
ссбддЪааад дЬсЪддаабд ддббдсЪдаа аЪсодЪЬссд ааЪссдасдс дЪссдсбасс 180
саЪЪасдсЕд аадсбдЕЕаа аддЪсдЪЪЬс ассаЪсбссс дбдасаасдс Ьаадаасбсс 240
сЪдЪассбдс адабдаасбс ссбдсд-Ьдсб даадасассд С'Ьд'ЬЪ'Ьасба сЬдссЪддсЕ 300
ЪасЪЕЪдасб асддбсЪддс ЪаЪссадаас ЬасбддддЪс адддбассс-Ь ддЪЕассдЪЪ 360
Ъсобсс 366
<210> 10 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела <400> 10
дааабсдЪЪс ЬдасссадЪс сссддсбасс с'ЬдЪссс'ЬдЪ ссссаддбда аодЕдсбасо 60
сЪдЬссбдса аадсЪЕссаа асдддЪЬасс ассЕасдЬЕЬ ссЕддЕасса дсадааассс 120
ддЕсаддсЪс сЪсдЪс-ЬдсЪ даЪсЪасддб дсЕЕссаасс дЪЪассЪсдд ЪабсссадсЕ 180
сдЪЪЕсбссд дб'Ьссдд'Ь'Ьа сддбассдас ЪЪсасссбда ссаЕсЕссЕс ссЕддаассс 240
даадасЬЪсд сЪд'Ь'ЬЬас'Ьа сбдоадЪсад ЪссЕасаасЕ ассссЪасас сббсддЪсад 300
ддбассааас Сддааабсаа а 321
<210> 11 <211> 448 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полноразмерная тяжелая цепь гуманизированного антитела <400> 11
С1и 1 Уа1 С1 η Ьеи Уа1 5 С1и Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25 С1у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Азп Туг
Тгр Не Зег 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
А1а (31и Не Агд Зег С1и Зег Азр А1а Зег А1а ТЬг Н±з Туг А1а С1и
- 58 015526
55 60
А1а Уа1 65 Ьуз С1у Агд РЬе 70 ТЬг 11е вес Агд Азр 75 Азп А1а Ьуз Азп Зег 80
Ьей Туг Ьей С1П Мей 85 Азп Зег Ьей Агд А1а 90 С1и Азр ТЬг А1а Уа1 95 Туг
Туг Суз Ьей А1а 100 Туг РЬе Азр Туг С1у 105 Ьей А1а Не С1п Азп 110 Туг Тгр
С1у С1п С1у 115 ТЬг Ьей Уа1 ТЬг Уа1 120 Зег Зег А1а Зег ТЬг 125 Ьуз С1у Рго
Зег Уа1 130 РЬе Рго Ьей А1а Рго 135 Суз Зег Агд Зег ТЬг 140 Зег С1и Зег ТЬг
А1а 145 А1а Ьей С1у Суз Ьей 150 Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе 155 Рго С1и Рго Уа1 ТЬг 160
Уа1 Зег Тгр Азп Зег 165 С1у А1а Ьей ТЬг Зег 170 С1у Уа1 Нхз ТЬг РЬе 175 Рго
А1а Уа1 Ьей С1п 180 Зег Зег С1у Ьей Туг 185 Зег Ьей Зег Зег Уа1 190 Уа1 ТЬг
Уа1 Рго Зег 195 Зег Азп РЬе С1у ТЬг 200 С1п ТЬг Туг ТЬг Суз 205 Азп Уа1 Азр
Н1з Ьуз 210 Рго Зег Азп ТЬг Ьуз 215 Уа1 Азр Ьуз ТЬг Уа1 220 С1и Агд Ьуз Суз
Суз 225 Уа1 С1и Суз Рго Рго 230 Суз Рго А1а Рго Рго 235 Уа1 А1а С1у Рго Зег 240
Уа1 РЬе Ьей РЬе Рго 245 Рго Ьуз Рго Ьуз Азр 250 ТЬг Ьей МеЕ 11е Зег 255 Агд
ТЬг Рго С1и Уа1 260 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 265 Азр Уа1 Зег Нхз С1и 270 Азр Рго
С1и Уа1 С1п 275 РЬе Азп Тгр Туг Уа1 280 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 285 Нхз Азп А1а
Ьуз ТЬг 290 Ьуз Рго Агд С1и С1и 295 С1п РЬе Азп Зег ТЬг 300 РЬе Агд Уа1 Уа1
Зег Уа1 Ьей ТЬг Уа1 Уа1 Нхз С1п Азр Тгр Ьей Азп С1у Ьуз С1и Туг
- 59 015526
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег 325 Азп Ьуз С1у Ьеи Рго 330 Зег Зег 11е С1и Ьуз 335 ТЬг
Не Зег Ьуз ТЬг 340 Ьуз С1у С1п Рго Агд 345 С1и Рго С1п Уа1 Туг 350 ТЬг Ьеи
Рго Рго Зег 355 Агд С1и С1и МеЕ ТЬг 360 Ьуз Азп С1п Уа1 Зег 365 Ьеи ТЬг Суз
Ьеи Уа1 370 Ьуз С1у РЬе Туг Рго 375 Зег Азр 11е А1а Уа1 380 С1и Тгр С1и Зег
Азп 385 С1у С1п Рго С1и Азп 390 Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг 395 Рго Рго МеЕ Ьеи Азр 400
Зег Азр С1у Зег РЬе 405 РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз 410 Ьеи ТЬг νβΐ Азр Ьуз 415 Зег
Агд Тгр С1п С1п 420 С1у Азп Уа1 РЬе Зег 425 Суз Зег Уа1 МеЕ Нхз 430 СЯи А1а
Ьеи Нхз Азп 435 Нхз Туг ТЬг С1п Ьуз 440 Зег Ьеи Зег Ьеи Зег 445 Рго С1у Ьуз
<210> 12 <211> 214 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полноразмерная легкая цепь гуманизированного антитела <400> 12
С1и 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п 5 Зег Рго А1а ТЬг Ьеи 10 Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег Ьуз Агд Уа1 ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
Уа1 Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг С1у А1а Зег Азп Агд Туг Ьеи С1у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Зег С1п Зег 90 Туг Азп Туг Рго 95 Туг
85
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а
100 105 110
Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п Ьеи Ьуз Зег С1у
115 120 125
ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд С1и А1а
130 135 140
Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег ё1у Азп Зег С1п
145 150 155 160
61и Зег Уа1 ТЬг С1и ё1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег
165 170 175
Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и Ьуз Н1з Ьуз Уа1 Туг
180 185 190
А1а Суз С1и Уа1 ТЬг Н±з С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег
195 200 205
РЬе Азп Агд С1у С1и Суз
210 <210> 13 <211> 1347 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полноразмерная тяжелая цепь гуманизированного антитела <400> 13
даад-Ь-Ьсадс ЕддЬЬдааЬС сддЬддЕддЬ сЬддЕЕсадс саддЕддЪЕс сс-ЬдсдЕсЬд 60
ЬссЕдсдсЪд сЬЕссддЬЕЬ сассЕЕсЕсс аасЬасЪдда ЬсЬссЕдддЕ ЪсдЕсаддсЕ 120
ссЬддЬааад дЪсЕддааЪд ддЫхдсЕдаа аЕссдЬЬссд ааЕссдасдс дЬссдсЕасс 180
саЪЕасдсБд аадсЬдЪЕаа аддЪсдЪЪЬс ассаЪсСссс дЬдасаасдс ЪаадаасЬсс 240
сЬдЬассЕдс адаЕдаасЬс ссЪдсдЪдсЕ даадасассд с'ЬдЫх'ЬасЬа с'Ьдсс'ЬддсЬ 300
ЕасЕЕЕдасЬ асддЕсЬддс ЕаЕссадаас ЪасЕддддЕс адддЬасссЕ ддЕЕассдЬЕ 360
ЬссЕссдссЕ ссассааддд сссаЬсЪдЬс ЬБсссасЕдд ссссаБдсЪс ссдсадсасс 420
Ессдададса садссдсссЬ дддсЬдссЕд д-ЬсааддасЕ асЕЕсссада ассБдЬдасс 480
д'Ьд'ЬссЬдда асЕсЬддсдс ВсЬдассадс ддсдЕдсаса ссЕЕсссадс ЬдЕссЕдсад 540
- 61 015526
ЕссЕсаддЕс ЕсЕасЕсссЕ садсадсдЕд дЕдассдЕдс саЕссадсаа сЕЕсддсасс 600
садассЕаса ссЕдсаасдЕ адаЕсасаад ссаадсааса ссааддЕсда саадассдЕд 660
дададааадЕ дЕЕдЕдЕдда дЕдЕссассЕ ЕдЕссадссс сЕссадЕддс сддассаЕсс 720
дЕдЕЕссЕдЕ ЕсссЕссааа дссаааддас асссЕдаЕда ЕсЕссадаас сссададдЕд 780
ассЕдЕдЕдд ЕддЕддасдЕ дЕсссасдад дасссададд ЕдсадЕЕсаа сЕддЕаЕдЕд 840
дасддадЕдд аддЕдсасаа сдссаадасс аадссаадад аддадсадЕЕ саасЕссасс 900
ЕЕсададЕдд ЕдадсдЕдсЕ дассдЕддЕд сассаддасЕ ддсЕдаасдд аааддадЕаЕ 960
аадЕдЕаадд ЕдЕссаасаа дддасЕдсса ЕссадсаЕсд адаадассаЕ сЕссаадасс 1020
аадддасадс саадададсс асаддЕдЕаЕ асссЕдсссс саЕссадада ддадаЕдасс 1080
аадаассадд ЕдЕсссЕдас сЕдЕсЕддЕд аадддаЕЕсЕ аЕссаЕссда саЕсдссдЕд 1140
дадЕдддадЕ ссаасддаса дссададаас аасЕаЕаада ссассссЕсс ааЕдсЕддас 1200
ЕссдасддаЕ ссЕЕсЕЕссЕ дЕаЕЕссаад сЕдассдЕдд асаадЕссад аЕддсадсад 1260
ддааасдЕдЕ ЕсЕсЕЕдЕЕс сдЕдаЕдсас даддсссЕдс асаассасЕа Еасссадаад 1320
адссЕдЕссс ЕдЕсЕссадд ааадЕаа 1347
<210> 14 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полноразмерная легкая цепь гуманизированного антитела <400> 14
даааЕсдЕЕс ЕдасссадЕс сссддсЕасс сЕдЕсссЕдЕ ссссаддЕда асдЕдсЕасс 60
сЕдЕссЕдса аадсЕЕссаа асдддЕЕасс ассЕасдЕЕЕ ссЕддЕасса дсадааассс 120
ддЕсаддсЕс сЕсдЕсЕдсЕ даЕсЕасддЕ дсЕЕссаасс дЕЕассЕсдд ЕаЕсссадсЕ 180
сдЕЕЕсЕссд дЕЕссддЕЕс сддЕассдас ЕЕсасссЕда ссаЕсЕссЕс ссЕддаассс 240
даадасЕЕсд сЕдЕЕЕасЕа сЕдсадЕсад ЕссЕасаасЕ ассссЕасас сЕЕсддЕсад 300
ддЕассааас ЕддаааЕсаа асдсасЕдЕд дсЕдсассаЕ сЕдЕсЕЕсаЕ сЕЕсссЕсса 360
ЕсЕдаЕдадс адЕЕдаааЕс сддаасЕдсс ЕсЕдЕЕдЕдЕ дссЕдсЕдаа ЕаасЕЕсЕаЕ 420
ссдсдсдадд ссааадЕаса дЕддааддЕд даЕаасдссс ЕссааЕссдд ЕаасЕсссад 480
дададЕдЕса сададсадда садсааддас адсассЕаса дссЕсадсад сасссЕдасс 540
сЕдадсааад садасЕасда дааасасааа дЕсЕасдссЕ дсдаадЕсас ссаЕсадддс 600
сЕдадЕЕсЕс садЕсасааа дадсЕЕсаас сдсддЕдадЕ дсЕаа 645
<210> 15 <211> 37 <212> ПРТ
- 62 015526 <213> человек <400> 15
А1а Суз Азр ТЬг А1а ТЬг Суз Уа1 ТЬг Нхз Агд Ьеи А1а С1у Ьеи Ьеи
1 5 10 15
8ег Агд Зег СЯу С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1
20 25 30
<31у 8ег Ьуз А1а РЬе
35
<210> 16
<211> 30
<212> ПРТ
<213> человек
<400> 16
Уа1 ТЬг • Нхз Агд Ьеи А1а СЯу Ьеи Ьеи Зег Агд Зег С1у СЯу Уа1 Уа1
1 5 10 15
Ьуз Азп . Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп νπΐ СЯу Зег Ьуз А1а РЬе
20 25 30
<210> 17
<211> 19
<212> ПРТ
<213> человек
<400> 17
Зег СЯу С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег
1 5 10 15
Ьуз А1а РЬе <210> 18 <211> 19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> вариант фрагмента человеческого альфа-ССКР <400> 18
Зег С1у С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азп Азп РЬе Уа1 А1а ТЬг Азп Уа1 С1у 8ег 1 5 10 15
Ьуз А1а РЬе
- 63 015526 <210> 19 <211> 19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400>19
Зег СЯу С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 СЯу Зег
5 1015
А1а А1а РЬе <210> 20 <211>19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400>20
Зег С1у С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег
5 1015
С1и А1а РЬе <210> 21 <211>19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400>21
Зег С1у С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег
5 1015
МеЬ А1а РЬе <210> 22 <211>19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400> 22
- 64 015526
Зег СХу С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег 1 5 1015
С1п А1а РЬе <210>23 <211>19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400>23
Зег С1у С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег
5 1015
Ьуз А1а А1а <210>24 <211>14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
ΖΟΟΠ4 <223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400>24
Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег Ьуз А1а РЬе А1а 1510 <210>25 <211>13 <212> ПРТ.
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент человеческого альфа-ССКР <400>25
Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег Ьуз А1а, РЬе 1 510 <210> 26 <211>13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400> 26
- 65 015526
Азп Азп А1а Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег Ьуз А1а РЬе 1 510 <210>27 <211>13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400>27
Азп Азп РЬе А1а Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег Ьуз А1а РЬе 1510 <210> 28 <211>13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400>28
Азп Азп РЬе Уа1 А1а ТЬг Азп Уа1 С1у Зег Ьуз А1а РЬе 1 510 <210>29 <211>13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400>29
Азп Азп РЬе Уа1 Рго А1а Азп Уа1 С1у Зег Ьуз А1а РЬе 1 510 <210>30 <211>13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР <400> 30
Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг А1а Уа1 С1у Зег Ьуз А1а РЬе
1
<210> 31
<211> 13
<212> ПРТ
- 66 015526
<2ЬЗ> Искусственная последовательность
<220> <223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР
<400> ЗЬ
Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп А1а С1у Зег Ьуз А1а РЬе
Ь 5 10
<2Ь0> <2ЬЬ> <212> <2ЬЗ> 32 13 ПРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР
<400> 32
Азп Азп РЬе УаЬ Рго ТЬг Азп УаЬ А1а Зег Ьуз АЬа РЬе
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 33 13 ПРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР
<400> 33
Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 СЬу АЬа Ьуз АЬа РЬе
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 34 13 ПРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Фрагмент, вариант человеческого альфа-ССКР
<400> 34
Азп Азп РЬе УаЬ Рго ТЬг Азп УаЬ СЬу Зег Ьуз АЬа АЬа
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 35 12 ПРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Фрагмент человеческого альфа-ССКР
<400> 35
Азп РЬе УаЬ Рго ТЬг Азп УаЬ СЬу Зег Ьуз АЬа РЬе
- 67 015526
510 <210>36 <211>19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент человеческого альфа-ССКР <400> 36
Зег С1у С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег
1 5 10 15
Ьуз А1а РЬе
<210> 37 <211> 18 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент человеческого альфа-ССКР <400>37
Зег С1у С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азп Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег 1 5 1015
Ьуз А1а <210>38 <211>36 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент человеческого альфа-ССКР <400>38
А1а Суз Азр ТЬг А1а ТЬг Суз Уа1 ТЬг Нтз Агд Ьеи А1а С1у Ьеи Ьеи 15 1015
ЗбГ АГСГ Зег (11ν (11-ν- Л7я1 17я1 Τ.νο Дсп Дсп ΌΚω ΛΖη,Ί ГИ.п Л__. тт-1 —-----э ---7-— ~ — ~~3 ' —— · — — —· ··»»·· Л+1-ГЛЛ Л- ллч— ГОА. & Λ. V ХЛ4.4. Л.О1Х V СХ..Х
2530
С1у Зег Ьуз А1а
<210> 39
<211> 19
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент человеческого альфа-ССКР <400>39
А1а Суз Азр ТЬг А1а ТЬг Суз Уа1 ТЬг Нхз Агд Ьеи А1а С1у Ьеи Ьеи 15 1015
Зег Агд Зег <210>40 <211>13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент человеческого альфа-ССКР <400>40
А1а Суз Азр ТЬг АЬа ТЬг Суз Уа1 ТЬг Нхз Агд Ьеи АЬа 1 510 <210>41 <211>37 <212> ПРТ <213> Крыса <400>41
Зег 1 Суз Азп ТЬг АЬа 5 ТЬг Суз Уа1 ТЬг Нхз 10 Агд Ьеи АЬа С1у Ьеи 15 Ьеи
Зег Агд Зег С1у 20 С1у Уа! Уа1 Ьуз Азр 25 Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг 30 Азп Уа1
С1у Зег С1и 35 А1а РЬе
<210>42 <211>19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент крысиного альфа-ССКР <400> 42
Зег С1у С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азр Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1 С1у Зег
5 10 15
С1и АЬа РЬе
- 69 015526 <210>43 <211>37 <212> ПРТ <213> Человек <400>43
А1а Суз I Азп ТЬг А1а ТЬг Суз Уа1 ТЬг ΗΪ3 Агд Ьеи А1а С1у Ьеи Ьеи
1 5 10 15
Зег Агд Зег С1у С1у МеЕ Уа1 Ьуз Зег Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1
20 25 30
С1у Зег Ьуз А1а РЬе
35
<210> 44
<211> 37
<212> ПРТ
<213> Крыса
<400> 44
Зег Суз Азп ТЬг А1а ТЬг Суз Уа1 ТЬг Н1з Агд Ьеи А1а 61у Ьеи Ьеи
1 5 10 15
Зег Агд Зег С1у С1у Уа1 Уа1 Ьуз Азр Азп РЬе Уа1 Рго ТЬг Азп Уа1
25 30
С1у Зег Ьуз А1а РЬе <210>45 <211>32 <212> ПРТ <213> Человек <400>45
Суз С1у Азп Ьеи Зег ТЬг Суз МеЕ Ьеи С1у ТЬг Туг ТЬг С1п Азр РЬе
1 5 10 15
Азп Ьуз РЬе ΗΪ3 ТЬг РЬе Рго С1п ТЬг А1а Не С1у Уа1 С1у А1а Рго
20 25 30
<210> 46
<211> 37
<212> ПРТ
<213> Человек
<400> 46
Ьуз Суз Азп ТЬг А1а ТЬг Суз А1а ТЬг С1п Агд Ьеи А1а Азп РЬе Ьеи
1 5 10 15
- 70 015526
Уа1 Нхз Зег Зег 20 Азп Азп РИе С1у А1а 25 Не Ьей Зег Зег ТЬг 30 Азп Уа1
С1у Зег Азп 35 ТИг Туг
<210> 47
<211> 52
<212> ПРТ
<213> Человек
<400> 47
Туг Агд 1 С1п Зег МеЕ 5 Азп Азп РЬе С1п С1у 10 Ьей Агд Зег РЬе 61у 15 Суз
Агд РИе С1у ТЬг 20 Суз ТЪг Уа1 С1п Ьуз 25 Ьей А1а Нхз С1п 11е 30 Туг С1п
РЬе ТИг Азр 35 Ьуз Азр Ьуз Азр Азп 40 Уа1 А1а Рго Агд Зег 45 Ьуз 11е Зег
Рго С1п С1у Туг

Claims (21)

1. Антагонистическое антитело против СОРР, обладающее аффинностью связывания (Ко) с человеческой α-формой пептида, связанного с геном кальцитонина (α-СОРР), составляющей 50 нМ или менее, измеренной с использованием поверхностного плазмонного резонанса при 37°С, где указанное антитело содержит:
а) УН СЭР3 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 5 или последовательностью, отличающейся от 8Е0 ГО N0: 5 по 1 или 2 консервативным аминокислотным заменам; и
б) Уь СЭР3 с последовательностью 8Е0 ГО N0: 8 или последовательностью, отличающейся от 8Е0 ГО N0: 8 по 1 или 2 консервативным аминокислотным заменам.
2. Антагонистическое антитело против СОРР по п.1, которое связывается с С-концевым фрагментом, имеющим аминокислоты 25-37 СОРР.
3. Антагонистическое антитело против СОРР по п.2, которое связывается с С-концевым эпитопом в пределах аминокислот 25-37 СОРР.
4. Антитело по любому из пп.1-3, дополнительно содержащее по меньшей мере один гипервариабельный участок (СЭР), выбранный из группы, состоящей из:
в) СЭР Н1 с последовательностью 8Е() ГО N0: 3;
г) СЭР Н2 с последовательностью 8Е() ГО N0: 4;
д) СЭР Е1 с последовательностью 8Е() ГО N0: 6;
е) СЭР Е2 с последовательностью 8Е() ГО N0: 7 и
ж) варианты Ь1, Ь2 и Н2, как представлено в табл. 6.
5. Антитело по любому из пп.1-4, содержащее домен УН, который по меньшей мере на 90% идентичен аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1, и домен Уь, который по меньшей мере на 90% идентичен аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 2.
6. Антитело по п.5, где аминокислотный остаток в положении 99 в 8Е0 ГО N0: 1 представляет собой Ь или замещен А, N 8, Т, У или Р и где аминокислотный остаток в положении 100 в 8Е0 ГО N0: 1 представляет собой А или замещен Ь, Р, 8, У, Υ, С, О, Т, К или Р.
7. Антитело по любому из пп.1-6, представляющее собой молекулу ЦО, ЦМ, ЦЕ, ЦА или ЦО или их производное.
8. Антитело по любому из пп.1-7, содержащее тяжелую цепь, продуцируемую экспрессирующим вектором, имеющим номер РТА-6867 в Американской коллекции типовых культур (АТСС).
9. Антитело по любому из пп.1-7, содержащее легкую цепь, продуцируемую экспрессирующим вектором, имеющим номер РТА-6866 в АТСС.
10. Антитело по любому из пп.1-9, состоящее из последовательности тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 11 и последовательности легкой цепи 8Е0 ГО N0: 12.
11. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-10 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
- 71 015526
12. Применение антагонистического антитела против ССКР по любому из пп.1-10 для профилактики или лечения мигрени с аурой или без нее, гемиплегической мигрени, кластерной головной боли, мигренозной невралгии, хронической головной боли или головной боли напряжения.
13. Применение антагонистического антитела против ССКР по любому из пп.1-10 в изготовлении лекарственного средства для профилактики или лечения мигрени с аурой или без нее, гемиплегической мигрени, кластерной головной боли, мигренозной невралгии, хронической головной боли или головной боли напряжения.
14. Выделенный полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий антитело С1, содержащее тяжелую и легкую цепь, как они определены в п.10, или его варианты, представленные в табл. 6, или его фрагмент.
15. Выделенный полинуклеотид по п.14, где фрагмент выбран из:
(а) легкой цепи антитела С1, (б) тяжелой цепи антитела С1, (в) фрагмента, содержащего одну или более чем одну вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела С1, (г) фрагмента, содержащего любую одну, две, три, четыре, пять или шесть областей, определяющих комплементарность, легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела С1.
16. Выделенный полинуклеотид по п.14, включающий любой или оба полинуклеотида с последовательностями 81Д) ΙΌ ΝΟ: 13 и 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 14.
17. Выделенный полинуклеотид по п.14, включающий любой или оба полинуклеотида с последовательностями 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 9 и 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 10.
18. Вектор, включающий полинуклеотид по любому из пп.14-17.
19. Вектор по п.18, депонированный как АТСС № 6867 или как АТСС № 6866.
20. Клетка-хозяин, включающая полинуклеотид по любому из пп.14-17 или вектор по любому из пп.18 или 19.
21. Способ получения антитела С1, содержащего тяжелую и легкую цепь, как они определены в п.10, или его вариантов, представленных в табл. 6, или его фрагмента, включающий стадии (а) экспрессии полинуклеотида по любому из пп.14-17 или вектора по любому из пп.18 или 19 в подходящей клетке-хозяине и, при необходимости, (б) извлечения и/или выделения указанного антитела или его фрагмента.
EA200801094A 2005-11-14 2006-11-02 Антагонистические антитела против пептида, связанного с геном кальцитонина, и способы их применения EA015526B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73662305P 2005-11-14 2005-11-14
PCT/IB2006/003181 WO2007054809A2 (en) 2005-11-14 2006-11-02 Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801094A1 EA200801094A1 (ru) 2008-10-30
EA015526B1 true EA015526B1 (ru) 2011-08-30

Family

ID=37909474

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801094A EA015526B1 (ru) 2005-11-14 2006-11-02 Антагонистические антитела против пептида, связанного с геном кальцитонина, и способы их применения

Country Status (38)

Country Link
US (20) US8007794B2 (ru)
EP (6) EP1957106B2 (ru)
JP (1) JP5123197B2 (ru)
KR (2) KR101250049B1 (ru)
CN (2) CN101309704B (ru)
AP (1) AP2008004467A0 (ru)
AU (1) AU2006313434B2 (ru)
BR (1) BRPI0618705B8 (ru)
CA (1) CA2626120C (ru)
CR (1) CR9975A (ru)
CU (1) CU23872B1 (ru)
CY (3) CY1120249T1 (ru)
DK (3) DK3045182T3 (ru)
EA (1) EA015526B1 (ru)
EC (1) ECSP088451A (ru)
ES (3) ES2664854T3 (ru)
GE (1) GEP20115333B (ru)
HK (2) HK1125837A1 (ru)
HR (2) HRP20180752T1 (ru)
HU (3) HUE036944T2 (ru)
IL (3) IL190876A (ru)
LT (3) LT3045182T (ru)
LU (2) LUC00119I2 (ru)
MA (1) MA30136B1 (ru)
ME (1) ME00419B (ru)
MY (1) MY153249A (ru)
NL (1) NL300997I2 (ru)
NO (3) NO344099B1 (ru)
NZ (1) NZ568237A (ru)
PL (3) PL3045182T3 (ru)
PT (3) PT3045182T (ru)
RS (3) RS20080200A (ru)
SI (3) SI2380592T1 (ru)
SV (1) SV2008002905A (ru)
TN (1) TNSN08213A1 (ru)
UA (1) UA94244C2 (ru)
WO (1) WO2007054809A2 (ru)
ZA (1) ZA200803484B (ru)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9708393B2 (en) 2011-05-20 2017-07-18 Alderbio Holdings Llc Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to prevent or inhibit photophobia or light aversion in subjects in need thereof, especially migraine sufferers
US9855332B2 (en) 2011-05-20 2018-01-02 Alderbio Holdings Llc Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to treat diarrhea in subjects with diseases or treatments that result in elevated CGRP levels
US10066009B2 (en) 2011-05-20 2018-09-04 Alderbio Holdings Llc Anti-CGRP compositions and use thereof
RU2707745C2 (ru) * 2015-04-24 2019-11-29 Эмджен Инк. Способы лечения или профилактики мигренозной головной боли
RU2742826C2 (ru) * 2012-01-26 2021-02-11 Кристофер Дж. Соарес Пептидные антагонисты пептидных гормонов из семейства кальцитонина (cgrp) и их применение
US11390654B2 (en) 2016-09-02 2022-07-19 Christopher Joseph Soares Use of CGRP receptor antagonists in neuroprotection and neurological disorders
US11639380B2 (en) 2019-01-08 2023-05-02 H. Lundbeck A/S Acute treatment and rapid treatment of headache using anti-CGRP antibodies
US12122821B2 (en) 2013-07-03 2024-10-22 H. Lundbeck A/S Regulation of glucose metabolism using anti-CGRP antibodies

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS20080200A (en) 2005-11-14 2009-07-15 Rinat Neuroscience Corp., Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
PL2265288T3 (pl) * 2008-03-04 2017-01-31 Labrys Biologics Inc Sposoby leczenia bólu zapalnego
ES2689322T3 (es) * 2008-03-04 2018-11-13 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Métodos para tratar el dolor crónico
EP2278880B1 (en) 2008-04-09 2012-10-10 Pherin Pharmaceuticals, Inc. Steroid treatment for hot flashes
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
US8491016B2 (en) 2009-03-16 2013-07-23 Colder Products Company Aseptic coupling devices
WO2011024113A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Rinat Neuroscience Corporation Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide
AR081434A1 (es) 2010-06-10 2012-08-29 Lilly Co Eli Anticuerpo del peptido relacionado con el gen calcitonina (cgrp), composicion farmaceutica que lo comprende, uso de dicho anticuerpo para preparar un medicamento util para tratar dolor de osteoartritis o migranas y fragmento de union a antigeno de dicho anticuerpo
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
MX2013008980A (es) 2011-02-10 2013-11-01 Sony Corp Dispositivo de procesamiento de imagenes y metodo de procesamiento de imagenes.
US20150017166A1 (en) * 2013-07-03 2015-01-15 Alderbio Holdings Llc Regulation of glucose metabolism using anti-cgrp antibodies
WO2015013188A1 (en) 2013-07-23 2015-01-29 Colder Products Company Aseptic coupling devices
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
LT3119431T (lt) * 2014-03-21 2024-03-12 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonistiniai antikūnai, nukreipti prieš peptidą, susijusį su kalcitonino genu, ir jų panaudojimo būdai
US10556945B2 (en) 2014-03-21 2020-02-11 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
EP3142699A4 (en) * 2014-05-16 2017-11-22 Salk Institute for Biological Studies Compositions and methods for treating metabolic disorders
US12053630B2 (en) 2014-08-17 2024-08-06 Coloplast A/S Implantable pulse generator with automatic jump-start
EP3180069B1 (en) 2014-08-17 2020-05-13 Nine Continents Medical, Inc. Miniature implatable neurostimulator system for sciatic nerves and their branches
MX2017003247A (es) 2014-09-15 2017-11-30 Amgen Inc Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas.
JO3669B1 (ar) * 2015-01-06 2020-08-27 Ferring Bv بيبتيدات مضَادَّة لببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين
AR104847A1 (es) * 2015-06-17 2017-08-16 Lilly Co Eli Formulación de anticuerpo anti-cgrp
CA2999809A1 (en) * 2015-09-24 2017-03-30 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Preventing, treating, and reducing (persistent) post-traumatic headache
US20190031748A1 (en) * 2016-01-28 2019-01-31 Eli Lilly And Company Cgrp antibodies and uses thereof
US11492386B2 (en) 2016-02-01 2022-11-08 Eli Lilly And Company Parathyroid hormone-anti-RANKL antibody fusion compounds
SG10202109689QA (en) 2016-04-15 2021-10-28 Alder Biopharmaceuticals Inc Humanized anti-pacap antibodies and uses thereof
CA3031028C (en) * 2016-07-25 2024-02-13 Lu Wang Affinity chromatography wash buffer
WO2018055574A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Treating refractory migraine
AU2017331592A1 (en) * 2016-09-23 2019-04-11 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Treating cluster headache
CN106442967B (zh) * 2016-09-27 2018-05-15 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法
GB2557655A (en) 2016-12-14 2018-06-27 Teva Pharma Medical injection device packaging
JP7195262B2 (ja) 2017-03-02 2022-12-23 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター インコーポレイティッド カルシトニン遺伝子関連ペプチドを指向する抗体に応答性の頭痛患者の選択方法
US11400136B2 (en) 2017-06-19 2022-08-02 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating a microbial infection
US11426706B2 (en) 2017-06-21 2022-08-30 Cephalon, Inc. Cation exchange chromatography wash buffer
CN111566126A (zh) 2018-01-12 2020-08-21 美国安进公司 Pac1抗体及其用途
CN112040949A (zh) * 2018-02-23 2020-12-04 瑞美德生物医药科技有限公司 降钙素基因相关肽(cgrp)拮抗剂抗体
US11295402B2 (en) 2018-03-28 2022-04-05 Bank Of America Corporation Blockchain-based property repair
US11475422B2 (en) 2018-03-28 2022-10-18 Bank Of America Corporation Blockchain-based property management
US10498808B2 (en) 2018-03-28 2019-12-03 Bank Of America Corporation Blockchain-based property management
EP3774881A1 (en) 2018-04-02 2021-02-17 Amgen Inc. Erenumab compositions and uses thereof
US10899826B1 (en) 2018-09-13 2021-01-26 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Pharmaceutical compositions for an anti-CGRP antagonist antibody
MX2021003329A (es) 2018-09-20 2021-06-08 Teva Pharmaceuticals Int Gmbh Resorte de inyección para jeringa precargada desgastada e inyector automático.
MX2021008035A (es) * 2018-12-31 2021-12-10 United Neuroscience Ltd Inmunógenos peptídicos dirigidos al péptido relacionado con el gen de la calcitonina (cgrp) y sus formulaciones para la prevención y el tratamiento de la migraña.
US11781687B2 (en) 2019-08-27 2023-10-10 Colder Products Company Single-use genderless aseptic fluid couplings
EP4027984A4 (en) * 2019-09-09 2023-10-18 The University of Chicago COMBINATION THERAPY FOR THE TREATMENT OF MIGRAINES
CN112274302B (zh) * 2020-11-24 2021-07-13 四川大学华西医院 一种多单元可调的智能化椎间融合器
IT202000029459A1 (it) * 2020-12-03 2022-06-03 Alberto Chiarugi Terapia dei disturbi emotivi
CA3212151A1 (en) 2021-03-02 2022-09-09 Cgrp Diagnostics Gmbh Treatment and/or reduction of occurrence of migraine
WO2023026205A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Cgrp Diagnostics Gmbh Preventative treatment of migraine
AU2023208958A1 (en) * 2022-01-21 2024-08-29 Luis Héctor BARBEITO ERBA Active immunization for reducing osteoarthritic, neuropathic, and cancer pain
AU2023223603A1 (en) 2022-02-28 2024-08-22 Tridem Bioscience Gmbh & Co Kg A CONJUGATE CONSISTING OF OR COMPRISING AT LEAST A ß-GLUCAN OR A MANNAN.

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050234054A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-20 Boehringer Ingelheim International Gmbh Selected CGRP-antagonists, process for preparing them and their use as pharmaceutical compositions

Family Cites Families (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
JPS62129297A (ja) * 1985-08-09 1987-06-11 Toyo Jozo Co Ltd カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US4814567A (en) 1987-07-08 1989-03-21 Darko Jorge Lazaneo Dragicevic Electro-thermic resonance system for heating liquid
US5422120A (en) 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0832980B1 (en) 1989-01-23 2002-06-19 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US6673776B1 (en) 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
EP1026253B2 (en) 1989-03-21 2012-12-19 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
IE71195B1 (en) 1989-07-10 1997-02-12 Amylin Corp Use of an amylin antagonist for the manufacture of a medicament for the treatment of obesity and essential hypertension and related disorders
JP4041535B2 (ja) 1989-08-18 2008-01-30 オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド 標的細胞にベクター構造体を運搬する組換レトロウィルス
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
ZA911974B (en) 1990-03-21 1994-08-22 Res Dev Foundation Heterovesicular liposomes
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2089661C (en) 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
JP3534749B2 (ja) 1991-08-20 2004-06-07 アメリカ合衆国 アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
ATE181571T1 (de) 1991-09-23 1999-07-15 Medical Res Council Methoden zur herstellung humanisierter antikörper
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
AU3144193A (en) 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
DE4139664A1 (de) 1991-12-02 1993-06-03 Diagen Inst Molekularbio Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0650370A4 (en) 1992-06-08 1995-11-22 Univ California METHODS AND COMPOSITIONS TARGETED ON SPECIFIC TISSUES.
WO1993025698A1 (en) 1992-06-10 1993-12-23 The United States Government As Represented By The Vector particles resistant to inactivation by human serum
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
CA2140280A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Avi J. Ashkenazi Bispecific immunoadhesins
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
CA2145641C (en) 1992-12-03 2008-05-27 Richard J. Gregory Pseudo-adenovirus vectors
DE4242396C2 (de) 1992-12-09 1995-01-05 Helopharm Petrik Co Kg Aralkyldiaminderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
US5981568A (en) 1993-01-28 1999-11-09 Neorx Corporation Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells
WO1994021665A1 (en) 1993-03-24 1994-09-29 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Cloned receptors and methods for screening
DK0695169T3 (da) 1993-04-22 2003-03-17 Skyepharma Inc Multivesikulære liposomer med indkapslet cyclodextrin og farmakologisk aktive forbindelser samt fremgangsmåder til anvendelse af disse
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
ATE304604T1 (de) 1993-06-24 2005-09-15 Frank L Graham Adenovirus vektoren für gentherapie
GB9316989D0 (en) * 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
EP0716148B1 (en) 1993-09-15 2004-01-02 Chiron Corporation Recombinant alphavirus vectors
RU2162342C2 (ru) 1993-10-25 2001-01-27 Кэнджи Инк. Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его применения
RO116341B1 (ro) 1993-11-16 2001-01-30 Depotech Corp La Jolia Lipozom multivezicular si procedeu de obtinere a acestuia
JPH07196700A (ja) 1994-01-06 1995-08-01 Sando Yakuhin Kk 抗カルシトニン抗体及びその作製方法、並びに該抗体を用いたカルシトニンの測定方法
US6436908B1 (en) 1995-05-30 2002-08-20 Duke University Use of exogenous β-adrenergic receptor and β-adrenergic receptor kinase gene constructs to enhance myocardial function
DE69535669T2 (de) 1994-05-09 2008-12-04 Oxford Biomedica (Uk) Ltd. Retrovirale vektoren mit verminderter rekombinationsrate
JPH10504457A (ja) 1994-08-16 1998-05-06 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド カルシトニンレセプター
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
FR2732222B1 (fr) 1995-03-28 1997-04-25 Oreal Utilisation d'un antagoniste de cgrp pour le traitement des prurits et des dysesthesies oculaires et palpebraux
FR2732220B1 (fr) 1995-03-28 1997-04-25 Oreal Utilisation d'un antagoniste de cgrp pour traiter les lichens et les prurits et composition obtenue
FR2732221B1 (fr) 1995-03-28 1997-04-25 Oreal Utilisation d'un antagoniste de cgrp pour traiter les rougeurs cutanees d'origine neurogene et composition obtenue
EP0737471A3 (fr) 1995-04-10 2000-12-06 L'oreal Utilisation d'un sel d'une métal alcalino-terreux comme inhibiteur de TNF-alpha dans une composition unique et composition obtenue
FR2732598B1 (fr) 1995-04-10 1997-05-09 Oreal Utilisation de sel de metaux alcalino-terreux pour le traitement des prurits et des dysesthesies oculaires ou palpebraux
CA2761116A1 (en) * 1995-04-27 1996-10-31 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
WO1997009046A1 (en) * 1995-09-05 1997-03-13 Smithkline Beecham Corporation Compounds and methods
AU2731797A (en) 1996-04-15 1997-11-19 University Of Miami Molecular clone of cgrp receptor component protein and uses thereof
EP0953052B1 (en) 1996-05-06 2009-03-04 Oxford BioMedica (UK) Limited Crossless retroviral vectors
US5746694A (en) 1996-05-16 1998-05-05 Wilk; Peter J. Endoscope biopsy channel liner and associated method
AU6596096A (en) 1996-07-23 1998-02-10 Smithkline Beecham Corporation Calcitonin gene-related peptide receptor component factor (houdc44)
US6586458B1 (en) * 1996-08-16 2003-07-01 Pozen Inc. Methods of treating headaches using 5-HT agonists in combination with long-acting NSAIDs
JP3734315B2 (ja) 1996-08-26 2006-01-11 株式会社小松製作所 曲げ加工方法および曲げ加工装置
CA2264942A1 (en) * 1996-09-09 1998-03-12 Smithkline Beecham Corporation Compounds and methods
EA004037B1 (ru) 1996-09-10 2003-12-25 Др. Карл Томэ ГмбХ Модифицированные аминокислоты и лекарственное средство на их основе
WO1998056779A1 (en) 1997-06-13 1998-12-17 Smithkline Beecham Corporation 4-sulfinyl benzamides as calcitonin gene-related peptide receptor antagonists
US6063768A (en) 1997-09-04 2000-05-16 First; Eric R. Application of botulinum toxin to the management of neurogenic inflammatory disorders
US20030069231A1 (en) 1999-10-12 2003-04-10 Klaus Rudolf Modified aminoacids, pharmaceuticals containing these compounds and method for their production
AU9692198A (en) 1997-10-10 1999-05-03 Kevin J. Donahue Gene delivery compositions and methods
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
GB9809839D0 (en) * 1998-05-09 1998-07-08 Glaxo Group Ltd Antibody
US6552043B1 (en) 1998-09-30 2003-04-22 Merck Sharpe & Dohme Ltd. Benzimidazolinyl piperidines as CGRP ligands
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1031350A1 (en) 1999-02-23 2000-08-30 Warner-Lambert Company Use of a gabapentin-analog for the manufacture of a medicament for preventing and treating visceral pain
US6313097B1 (en) * 1999-03-02 2001-11-06 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Antagonists of calcitonin gene-related peptide
WO2000053211A2 (en) 1999-03-09 2000-09-14 University Of Southern California Method of promoting myocyte proliferation and myocardial tissue repair
US6521609B1 (en) 1999-08-10 2003-02-18 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Use of CGRP antagonists and CGRP release inhibitors for combating menopausal hot flushes
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
US20020162125A1 (en) † 2001-03-06 2002-10-31 Anne-Marie Salmon Methods and compositions for the modulation of neurogenic inflammatory pain and physical opiate withdrawal
JP4603261B2 (ja) 2001-09-27 2010-12-22 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション ヒト化カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体をコードする単離ｄｎａ分子、関連する非ヒトトランスジェニック動物及びアッセイ方法
US6767056B2 (en) 2002-01-14 2004-07-27 Shin Yeh Enterprise Co., Ltd. Settee with a foldable tray-support unit
US7026312B2 (en) 2002-03-14 2006-04-11 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Substituted piperidines, pharmaceutical compositions containing these compounds, their use and processes for the preparation thereof
WO2003085089A2 (en) 2002-03-29 2003-10-16 Schering Corporation Human monoclonal antibodies to interleukin-5 and methods and compositions comprising same
WO2003093472A2 (de) 2002-05-06 2003-11-13 Grünenthal GmbH Cgrp bindende nukleinsäuren
US20040110170A1 (en) 2002-05-18 2004-06-10 The Regents Of The University Of California Cloning and characterization of calcitonin gene related peptide receptors
US7345065B2 (en) 2002-05-21 2008-03-18 Allergan, Inc. Methods and compositions for alleviating pain
PL374017A1 (en) * 2002-06-05 2005-09-19 Bristol-Myers Squibb Company Calcitonin gene related peptide receptor antagonists
CN1678634A (zh) * 2002-06-28 2005-10-05 多曼蒂斯有限公司 免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体
RS52750B (sr) 2002-08-12 2013-08-30 Birkir Sveinsson Upotreba cgrp antagonista za lečenje psorijaze
DE10250082A1 (de) 2002-10-25 2004-05-13 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Ausgewählte CGRP-Antagonisten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
AU2003298816C1 (en) 2002-12-02 2010-12-16 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to Tumor Necrosis Factor and uses thereof
KR101250818B1 (ko) 2002-12-24 2013-04-15 리나트 뉴로사이언스 코프. 항-ｎｇｆ 항체 및 그것을 이용하는 방법
WO2004087649A2 (en) * 2003-03-14 2004-10-14 Merck & Co., Inc. Benodiazepine spirohydantoin cgrp receptor antagonists
AU2004222378B2 (en) * 2003-03-14 2008-08-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Carboxamide spirohydantoin CGRP receptor antagonists
AU2004222328B2 (en) 2003-03-14 2009-10-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Aryl spirohydantoin CGRP receptor antagonists
DE602004013563D1 (de) * 2003-03-14 2008-06-19 Merck & Co Inc Rantagonisten
AU2004221891B2 (en) * 2003-03-14 2009-11-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Monocyclic anilide spirohydantoin CGRP receptor antagonists
JO2355B1 (en) 2003-04-15 2006-12-12 ميرك شارب اند دوم كوربوريشن Hereditary calcitonin polypeptide receptor antagonists
CA2522024A1 (en) 2003-04-15 2004-10-28 Merck & Co., Inc. Cgrp receptor antagonists
WO2004097421A2 (en) 2003-04-29 2004-11-11 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with calcitonin receptor-like receptor (calcrl)
CN100418948C (zh) 2003-07-15 2008-09-17 麦克公司 羟基吡啶cgrp受体抗拮抗剂
DE102004008261B3 (de) 2004-02-20 2005-09-29 Mtu Friedrichshafen Gmbh Verfahren zur Steuerung und Regelung einer Brennkraftmaschinen-Generator-Einheit
WO2005084672A1 (de) 2004-03-03 2005-09-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Ausgewählte cgrp-antagonisten, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung als arzneimittel
DE102004015723A1 (de) 2004-03-29 2005-10-20 Boehringer Ingelheim Pharma Ausgewählte CGRP-Antagonisten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
DE102004018794A1 (de) * 2004-04-15 2005-10-27 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Ausgewählte CGRP-Antagonisten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
JP2007533685A (ja) 2004-04-20 2007-11-22 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 偏頭痛を治療するためのセロトニン再吸収阻害剤と組合わせたｃｇｒｐアンタゴニストの使用
DE102004027912A1 (de) 2004-06-09 2005-12-29 Grünenthal GmbH Substituierte Cyclopenten-Verbindungen
US7384930B2 (en) 2004-11-03 2008-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Constrained compounds as CGRP-receptor antagonists
TWI432196B (zh) 2005-01-18 2014-04-01 Euro Celtique Sa 內臟痛的治療
EP1770091A1 (de) 2005-09-29 2007-04-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG CGRP-Antagonisten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
WO2007025212A2 (en) 2005-08-25 2007-03-01 Wex Pharmaceuticals, Inc. Use of sodium channel blockers for the treatment of visceral pain or pain caused by cancer treatment
DE602006012513D1 (de) 2005-08-26 2010-04-08 Healthpartners Res Foundation Verfahren zur behandlung von kopfschmerzen durch verabreichung von oxytocin
JP2009508970A (ja) 2005-09-21 2009-03-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 疼痛の局所造影および治療のためのシステム、組成物並びに方法
US8168592B2 (en) 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
RS20080200A (en) 2005-11-14 2009-07-15 Rinat Neuroscience Corp., Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
DE602006019304D1 (de) 2005-11-18 2011-02-10 Merck Sharp & Dohme Spirohydantoin-aryl-cgrp-rezeptorantagonisten
WO2007076336A1 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Eli Lilly And Company Treatment of migraine with anti-cgrp antibodies
US7834000B2 (en) 2006-06-13 2010-11-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated CGRP receptor antagonists
ATE469895T1 (de) 2006-07-21 2010-06-15 Vertex Pharma Cgrp-rezeptorantagonisten
ES2689322T3 (es) 2008-03-04 2018-11-13 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Métodos para tratar el dolor crónico
PL2265288T3 (pl) 2008-03-04 2017-01-31 Labrys Biologics Inc Sposoby leczenia bólu zapalnego
WO2010006168A2 (en) 2008-07-09 2010-01-14 University Of Rochester Methods of treating cancer using and agent that modulates activity of the calcitonin-gene related peptide ("cgrp") receptor
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
WO2011024113A1 (en) 2009-08-28 2011-03-03 Rinat Neuroscience Corporation Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide
AR081434A1 (es) 2010-06-10 2012-08-29 Lilly Co Eli Anticuerpo del peptido relacionado con el gen calcitonina (cgrp), composicion farmaceutica que lo comprende, uso de dicho anticuerpo para preparar un medicamento util para tratar dolor de osteoartritis o migranas y fragmento de union a antigeno de dicho anticuerpo
BR112013029959A8 (pt) 2011-05-20 2021-09-08 Alderbio Holdings Llc Anticorpos anti-cgrp e anti-cgrpr e seu uso para prevenir ou inibir fotofobia ou aversão à luz, composição farmacêutica compreendendo os referidos anticorpos, bem como sequência de ácido nucleico e célula recombinante
EP3662932B1 (en) 2011-05-20 2021-04-07 H. Lundbeck A/S Anti-cgrp compositions and use thereof
US10249132B2 (en) 2012-10-29 2019-04-02 Netent Product Services Ltd. Architecture for multi-player, multi-game, multi-table, multi-operator and multi-jurisdiction live casino gaming
LT3119431T (lt) 2014-03-21 2024-03-12 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonistiniai antikūnai, nukreipti prieš peptidą, susijusį su kalcitonino genu, ir jų panaudojimo būdai
US10556945B2 (en) 2014-03-21 2020-02-11 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050234054A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-20 Boehringer Ingelheim International Gmbh Selected CGRP-antagonists, process for preparing them and their use as pharmaceutical compositions

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALINT R.F. ET AL.: "ANTIBODY ENGINEERING BY PARSIMONIOUS MUTAGENESIS" GENE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 137, no. 1, 27 December 1993 (1993-12-27), pages 109-118, XP002031537 ISSN: 0378-1119 page 110, right-hand column *
BUCKLEY T.L. ET AL.: "THE PARTIAL INHINITION OF INFLAMMATORY RESPONSES INDUCED BY CAPSAICIN USING THE FAB FRAGMENT OF A SELECTIVE CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE ANTISERUM IN RABBIT SKIN" NEUROSCIENCE, NEW YORK, NY, US, vol. 48, no. 4, 1992, pages 963-968, XP000563679 ISSN: 0306-4522 the whole document *
DAVIES J. ET AL.: "Affinity improvement of single antibody VH domains: residues in all three hypervariable regions affect antigen binding" IMMUNOTECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS BV, NL, vol. 2, no. 3, September 1996 (1996-09), pages 169-179, XP004070292 ISSN: 1380-2933 abstract *
FROBERT Y. ET AL.: "A sensitive sandwich enzyme immunoassay for calcitonin gene-related peptide (CGRP): characterization and application". PEPTIDES 1999, vol. 20, no. 2, 1999, pages 275-284, XP002430636 ISSN: 0196-9781 the whole document *
HOLT L.J. ET AL.: "Domain antibodies: proteins for therapy" TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, vol. 21, no. 11, November 2003 (2003-11), pages 484-490, XP004467495 ISSN: 0167-7799 abstract *
LITTLE M. ET AL.: "Of mice and men: hybridoma and recombinant antibodies" IMMUNOLOGY TODAY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, vol. 21, no. 8, 1 August 2000 (2000-08-01), pages 364-370, XP004215163 ISSN: 0167-5699 abstract *
TAN K.K. ET AL.: "Calcitonin gene-related peptide as an endogenous vasodilator: immunoblockade studies in vivo with an anti-calcitonin gene-related peptide monoclonal antibody and its Fab' fragment". CLINICAL SCIENCE (LONDON, ENGLAND: 1979) DEC 1995, vol. 89, no. 6, December 1995 (1995-12), pages 565-573, XP009082539 ISSN: 0143-5221 the whole document *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10765746B2 (en) 2011-05-20 2020-09-08 Alderbio Holdings Llc Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to treat diarrhea in subjects with diseases or treatments that result in elevated CGRP levels
US11111289B2 (en) 2011-05-20 2021-09-07 H. Lundbeck A/S Anti-CGRP compositions and use thereof
US10066009B2 (en) 2011-05-20 2018-09-04 Alderbio Holdings Llc Anti-CGRP compositions and use thereof
US10179809B2 (en) 2011-05-20 2019-01-15 Alderbio Holdings Llc Anti-CGRP compositions and use thereof
US10189895B2 (en) 2011-05-20 2019-01-29 Alderbio Holdings Llc Anti-CGRP compositions and use thereof
US10208112B2 (en) 2011-05-20 2019-02-19 Alderbio Holdings Llc Anti-CGRP compositions and use thereof
US10214582B2 (en) 2011-05-20 2019-02-26 Alderbio Holdings Llc Anti-CGRP compositions and use thereof
US9708393B2 (en) 2011-05-20 2017-07-18 Alderbio Holdings Llc Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to prevent or inhibit photophobia or light aversion in subjects in need thereof, especially migraine sufferers
US10533048B2 (en) 2011-05-20 2020-01-14 Alderbio Holdings Llc Anti-CGRP compositions and use thereof
US11325967B2 (en) 2011-05-20 2022-05-10 H. Lundbeck A/S Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to prevent or inhibit photophobia or light a version in subjects in need thereof, especially migraine sufferers
US10266587B2 (en) 2011-05-20 2019-04-23 Alderbio Holdings Llc Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to prevent or inhibit photophobia or light aversion in subjects in need thereof, especially migraine sufferers
US9855332B2 (en) 2011-05-20 2018-01-02 Alderbio Holdings Llc Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to treat diarrhea in subjects with diseases or treatments that result in elevated CGRP levels
US11027018B2 (en) 2011-05-20 2021-06-08 The University Of Iowa Research Foundation Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to treat diarrhea in subjects with diseases or treatments that result in elevated CGRP levels
RU2742826C2 (ru) * 2012-01-26 2021-02-11 Кристофер Дж. Соарес Пептидные антагонисты пептидных гормонов из семейства кальцитонина (cgrp) и их применение
US12122821B2 (en) 2013-07-03 2024-10-22 H. Lundbeck A/S Regulation of glucose metabolism using anti-CGRP antibodies
RU2707745C2 (ru) * 2015-04-24 2019-11-29 Эмджен Инк. Способы лечения или профилактики мигренозной головной боли
US11390654B2 (en) 2016-09-02 2022-07-19 Christopher Joseph Soares Use of CGRP receptor antagonists in neuroprotection and neurological disorders
US12103951B2 (en) 2016-09-02 2024-10-01 Christopher Joseph Soares Use of CGRP receptor antagonists in neuroprotection and neurological disorders
US11639381B2 (en) 2019-01-08 2023-05-02 H. Lundbeck A/S Treatment of headache using anti-CGRP antibodies
US11639380B2 (en) 2019-01-08 2023-05-02 H. Lundbeck A/S Acute treatment and rapid treatment of headache using anti-CGRP antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
IL190876A (en) 2012-06-28
US20150050267A1 (en) 2015-02-19
US20170240624A1 (en) 2017-08-24
KR101250049B1 (ko) 2013-04-04
US9890211B2 (en) 2018-02-13
US20160168244A1 (en) 2016-06-16
SV2008002905A (es) 2011-07-05
KR20080068062A (ko) 2008-07-22
NO20190202A1 (no) 2008-05-19
IL248025A0 (en) 2016-11-30
HK1125837A1 (en) 2009-08-21
US20150361173A1 (en) 2015-12-17
NO344605B1 (no) 2020-02-10
HRP20180753T1 (hr) 2018-08-24
US20150361171A1 (en) 2015-12-17
HK1225627B (zh) 2017-09-15
EP3045182B1 (en) 2018-03-07
US20120009192A1 (en) 2012-01-12
EP3178493A1 (en) 2017-06-14
EP2380592A2 (en) 2011-10-26
US20170240623A1 (en) 2017-08-24
AU2006313434A1 (en) 2007-05-18
RS57192B1 (sr) 2018-07-31
NO20081854L (no) 2008-05-19
LUC00126I1 (ru) 2019-07-09
AU2006313434B2 (en) 2011-10-27
US9115194B2 (en) 2015-08-25
LT3045182T (lt) 2018-05-10
ES2433251T5 (es) 2020-03-13
DK1957106T4 (da) 2019-10-28
UA94244C2 (ru) 2011-04-26
MA30136B1 (fr) 2009-01-02
CN103421114B (zh) 2017-09-22
LUC00126I2 (ru) 2019-12-27
LUC00119I2 (ru) 2020-07-10
CR9975A (es) 2008-06-02
US20190092841A1 (en) 2019-03-28
NZ568237A (en) 2011-11-25
US9346881B2 (en) 2016-05-24
ES2664854T3 (es) 2018-04-23
CY1120249T1 (el) 2019-07-10
US8597649B2 (en) 2013-12-03
JP5123197B2 (ja) 2013-01-16
CU20080088A7 (es) 2012-06-21
US20090220489A1 (en) 2009-09-03
HUS1900035I1 (hu) 2019-07-29
PT2380592T (pt) 2018-06-06
US20150361172A1 (en) 2015-12-17
BRPI0618705B8 (pt) 2021-05-25
NL300997I1 (nl) 2019-07-03
ZA200803484B (en) 2009-03-25
KR20110114705A (ko) 2011-10-19
LT2380592T (lt) 2018-05-10
EP3069731A1 (en) 2016-09-21
BRPI0618705A2 (pt) 2011-09-06
US20150291690A1 (en) 2015-10-15
PL2380592T3 (pl) 2018-07-31
DK1957106T3 (da) 2013-11-04
JP2009515942A (ja) 2009-04-16
MY153249A (en) 2015-01-29
EP2380592A3 (en) 2012-06-06
NL300997I2 (nl) 2019-11-28
RS57194B1 (sr) 2018-07-31
US9266951B2 (en) 2016-02-23
EP3842458A1 (en) 2021-06-30
US20180162931A1 (en) 2018-06-14
LTPA2019015I1 (lt) 2019-08-26
GEP20115333B (en) 2011-11-25
IL219503A0 (en) 2012-06-28
HUE036940T2 (hu) 2018-08-28
CU23872B1 (es) 2013-03-27
SI1957106T2 (sl) 2019-09-30
US9890210B2 (en) 2018-02-13
EP1957106B1 (en) 2013-10-16
CA2626120C (en) 2012-12-04
EP1957106A2 (en) 2008-08-20
US8586045B2 (en) 2013-11-19
SI2380592T1 (en) 2018-06-29
US20220056114A1 (en) 2022-02-24
SI3045182T1 (en) 2018-08-31
EP2380592B1 (en) 2018-03-07
US20170240625A1 (en) 2017-08-24
US20200247878A1 (en) 2020-08-06
US9365648B1 (en) 2016-06-14
LUC00119I1 (ru) 2019-05-15
CA2626120A1 (en) 2007-05-18
DK3045182T3 (en) 2018-03-19
CY2019019I2 (el) 2019-11-27
IL190876A0 (en) 2008-11-03
EP3045182A1 (en) 2016-07-20
PL1957106T5 (pl) 2019-11-29
CY1120267T1 (el) 2019-07-10
US10329343B2 (en) 2019-06-25
HRP20180752T1 (hr) 2018-06-15
EP1957106B2 (en) 2019-07-24
ES2433251T3 (es) 2013-12-10
CN103421114A (zh) 2013-12-04
SI1957106T1 (sl) 2014-02-28
CN101309704A (zh) 2008-11-19
ME00419B (me) 2011-10-10
EA200801094A1 (ru) 2008-10-30
ES2664421T3 (es) 2018-04-19
WO2007054809A2 (en) 2007-05-18
US20240158481A1 (en) 2024-05-16
US8007794B2 (en) 2011-08-30
US20140147438A1 (en) 2014-05-29
US20170081395A1 (en) 2017-03-23
PT1957106E (pt) 2013-12-26
CN101309704B (zh) 2012-10-10
US8734802B1 (en) 2014-05-27
BRPI0618705B1 (pt) 2018-02-06
NO344099B1 (no) 2019-09-02
TNSN08213A1 (fr) 2009-10-30
WO2007054809A3 (en) 2007-08-09
US9328168B2 (en) 2016-05-03
US9884908B2 (en) 2018-02-06
PT3045182T (pt) 2018-06-05
US20130216535A1 (en) 2013-08-22
CY2019019I1 (el) 2019-11-27
US20170240622A1 (en) 2017-08-24
DK2380592T3 (en) 2018-03-19
AP2008004467A0 (en) 2008-06-30
US9884907B2 (en) 2018-02-06
US9340614B2 (en) 2016-05-17
HUE036944T2 (hu) 2018-08-28
LTC2380592I2 (lt) 2020-05-11
PL1957106T3 (pl) 2014-03-31
RS20080200A (en) 2009-07-15
NO2019043I1 (no) 2019-12-09
ECSP088451A (es) 2008-07-30
PL3045182T3 (pl) 2018-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015526B1 (ru) Антагонистические антитела против пептида, связанного с геном кальцитонина, и способы их применения
UA123759C2 (uk) Застосування моноклонального антитіла, яке інгібує шлях пов&#39;язаного з геном кальциноніну пептиду (cgrp), для лікування або зниження частоти випадків мігренозного головного болю у суб&#39;єкта
NZ724442B2 (en) Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
ND4A Extension of term of a eurasian patent