NO344099B1

NO344099B1 - Antagonistantistoff rettet mot calcitonin genrelatert peptid, og anvendelser av samme

Info

Publication number: NO344099B1
Application number: NO20081854A
Authority: NO
Inventors: Arnon Rosenthal; Joerg Zeller; Kristian Todd Poulsen; Yasmina Noubia Abdiche; Jaume Pons; Sierra Jones Collier
Original assignee: Teva Pharmaceuticals Int Gmbh
Priority date: 2005-11-14
Filing date: 2008-04-16
Publication date: 2019-09-02
Also published as: US20090220489A1; US20170240622A1; TNSN08213A1; CN103421114B; EP3178493A1; ME00419B; US20170240623A1; US20170240624A1; US9884907B2; KR20110114705A; ES2433251T5; US20180162931A1; KR20080068062A; NO344605B1; US9328168B2; DK1957106T4; EP1957106B2; EP3045182B1; CA2626120A1; US20150361171A1

Description

Område for oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anti-CGRP antagonist antistoff.

Bakgrunn for oppfinnelsen.

CGRP (kalsitonin genrelatert peptid) er et neuropeptid på 37 aminosyrer, som tilhører en familie av peptider som inkluderer kalsitonin, adrenomedullin og amylin. I mennesker eksisterer to former av CGRP (α-CGRP og β-CGRP) med tilsvarende aktiviteter. De varierer med tre aminosyrer og oppviser forskjellige distribusjon. I det minste to CGRP reseptor subtyper kan også bidra til forskjellige aktiviteter. CGRP er en neurotransmitter i det sentrale nervesystem, og den er blitt vist å være en potent vasodilator i periferien, hvor CGRP-inneholdende neuroner er nært assosiert med blodkarene. CGRP-mediert vasodilasjon er også assosiert med neurogenisk inflammasjon, som en del av en kaskade av hendelser som resulterer i ekstravasasjon av plasma og vasodilasjon av mikrovaskulaturen, og som er foreliggende i migrene.

Tan et al, Clinical Science, 1995, Vol.89, sider 565-573 beskriver immnunblokkade av CGRP i en hudvasodilateringsmodell.

CGRP har blitt angitt for sin mulige sammenheng til vasomotorsymptomer (Wyon et al. Scand. J. Urol. Nephrol.35: 92-96 (2001); Wyon et al. Menopause 7(1):25-30 (2000)). Vasomotorsymptomer (VMS), så som hetetokter og nattsvette, er de mest vanlige symptomer assosiert med menopause, og foregår i 60 % til 80 % av alle kvinner etter naturlig eller kirurgisk indusert menopause, Varmetokter er sannsynlig å være en adaptiv respons av det sentrale nervesystem (CNS) til en nedgang i kjønnsstereoider (Freedman Am. J. Human Biol.13:453-464 (2001)). I dag er de mest effektive terapier for varmetokter hormonbaserte behandlinger, inkluderende østrogener og/eller noen progestiner. Hormonbehandlinger kan være effektiv for å lindre varmetokter, men er ikke gunstig for alle kvinner. Fysiologiske og følelsesmessige symptomer som er observert, så som nervøshet, utmattelse, irriterbarhet, insomnia, depresjon, hukommelsestap, hodepine, angst, nervøsitet og manglende evne til å konsentrere seg vurderes å være forårsaket av søvnnedsettelsen som følger varme tokter og nattsvette (Kramer et al., In: Murphy et al., 3.sup.rd Int'l Symposium on Recent Advances in Urological Cancer Diagnosis and Treatment-Proceedings, Paris, France: SCI: 3-7 (1992)).

Menn opplever også varmetokter etter steroid hormon (androgen) reduksjon. Dette er tilfellet for aldersassosiert androgennedgang (Katovich, et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129-35) og likeledes i ekstreme tilfeller av hormonmangel assosiert med behandlinger for prostatacancer, (Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology, 2001, 419(1): 47-54). Så mange som en tredjedel av disse pasienter vil oppleve vedvarende og hyppige symptomer som er tilstrekkelig alvorlige til å forårsake betydelig ubehag og besvær.

CGRP er en potent vasodilator som har blitt implisert i patologien av andre vasomotorsymptomer, så som alle former for vaskulær hodepine, inkluderende migrene (med eller uten utstråling) og kluster hodepine. Durham, N. Engl. J. Med.350:1073-1075, 2004. Serumnivåene av CGRP i den ytre jugulare vene er forhøyet i pasienter under migrene hodepine. Goadsby et al., Ann. Neurol.28:183-7, 1990. Intravenøs administrering av human ɑ-CGRP indusert hodepine og migrene i pasienter som lider av migrene med utstråling, antyder at CGRP har en forårsakende funksjon i migrene. Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002.

Mulig CGRP-involvering i migrene har vært basis for utvikling og testing av et antall forbindelser som inhiberer frigivelse av CGRP (for eksempel sumatriptan), som antagoniserer ved CGRP-reseptoren (for eksempel dipeptid derivativ BIBN4096BS (Boerhringer Ingelheim): CGRP (8-37)), eller interagerer med en eller flere av reseptorassosierte proteiner, så som reseptoraktivitet membranprotein (RAMP) eller reseptorkomponent protein (RCP), som begge påvirker binding av CGRP til dets reseptorer. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Alfa-2 adrenoseptor subgrupper og adenosin A1 reseptorer kontrollerer også (inhiberer) CGRP frigivelse og trigeminal aktivering (Goadsby et al., Brain 125:1392-401, 2002). Adenosin A1 reseptorantagonisten GR79236 (metrafadil), som er blitt vist å inhibere neurogenisk vasodilasjon og trigeminal nocisepsjon i mennesker, kan også ha antimigrene aktivitet (Arulmani et al., Cephalalgia 25:1082-1090, 2005; Giffin et al., Cephalalgia 23:287-292, 2003.)

Det som forbløffer med denne teori er observasjonen at behandling med forbindelser som eksklusivt inhiberer neurogenisk inflammasjon (for eksempel takykinin NK1 reseptorantagonister) eller trigeminal aktivering (for eksempel 5HT1D reseptor agonister) har blitt vist å være relativt ueffektive som akutte behandlinger for migrene, noe som har ført noen forskere til å spørre om inhibering av frigivelse av CGRP er den primære virkningsmekanisme for effektiv antimigrene behandlinger. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol.500:315-330, 2004.

Migrene er en kompleks vanlig nevrologisk tilstand som er karakterisert med alvorlige, episodiske angrep av hodepine og assosierte trekk, som kan inkludere kvalme, oppkast, følsomhet til lys, lyd og bevegelse. I noen pasienter kommer hodepine foran eller ledsages av en utstråling. Hodepinesmerten kan være alvorlig og kan også være ensidig i visse pasienter.

Migreneangrep er ødeleggende for det daglige liv. I USA og vesteuropa er den totale hyppighet av migrene 11 % av den generelle populasjon (6 % menn; 15-18 % kvinner). Videre, den mediane frekvens av angrep i et individ er 1,5/mnd. Idet det er et antall behandlinger tilgjengelig for å lindre eller redusere symptomene, så er preventiv terapi anbefalt for de pasienter som har mer enn 3-4 angrep av migrene per mnd. Goadsby et al. New Engl. J. Med.346(4): 257-275, 2002.

Variasjonen av farmakologiske intervensjoner som er blitt anvendt for å behandle migrene og variabiliteten i responser blant pasienter er et testament for den forskjellige natur av denne forstyrrelse. Således, slike relativt ikke-selektive medikamenter som ergot alkaloider (for eksempel ergotamin, dihydroergotamin, metysergid), som oppviser serotonerge, og likeledes adrenerge, noradrenerge og dopaminerg aktiviteter, har blitt anvendt i løpet av de siste åtti år for å behandle migrene. Andre behandlinger inkluderer opiater (for eksempel oksycodon) og β-adrenerge antagonister (for eksempel propranolol). Noen pasienter, vanligvis de med færre symptomer, er i stand til å regulere deres symptomer med medikamenter som ikke er på resept, så som en eller flere ikke-steroidale antiinflammatoriske midler (NSAIDer), så som en kombinasjon av aspirin, acetaminofen og kaffein (for eksempel Excedrin® Migrene).

I det siste har noen migrenepasienter blitt behandlet med topiramat, et antikonvulserende middel som blokkerer spenningsavhengige natriumkanaler og visse glutamatreseptorer (AMPA-kainat), potenserer GAMA-A reseptor aktivitet, og blokkerer karbonisk anhydrase. Den relativt nylige suksess med serotinin 5HT-1B/1D og/eller 5HT-1a reseptoragonister, så som sumatriptan, har i noen pasienter ført forskerne til å foreslå en serotonergisk etiologi av forstyrrelsen. Dessverre, idet noen pasienter responderer godt til denne behandling er andre relativt resistente til dets effekter.

Det er blitt postulert at en dysfunksjon av en ionekanal i den aminerge hjernestammekjerne er den underliggende grunn til forstyrrelsen, men den presise patofysiologi av migrene er ikke godt forstått. En form for migrene, familiær hemiplagisk migrene, har blitt vist å være assosiert med missense mutasjoner i α1-subenheten av den spenningsgenererte P/Q-type kalsiumkanal, og det er dermed sannsynlig at andre ionekanalmutasjoner også vil finnes i andre populasjoner av pasienter.

Idet dilasjon av blodkarene er assosiert med og forverrer smertesymptomene av migrene er slike nevrovaskulære hendelser nå tenkt å være et resultat av, i stedet for årsak til, tilstanden. Samlet, dysfunksjon av hjernestamme reaksjonsveier som modulerer sensoriske input vurderes å være et forenende trekk av migrene.

Goadsby, P.J. et al., New Engl. J. Med.346(4): 257-275, 2002.

Frobert beskriver CGRP i publikasjonen Frobert Y., et al., A sensitive sandwich enzyme immunoassay for calcitonin gene-related peptide (CGRP): characterization and application, Peptides, 1999, vol.20, nr.2, side 275-284,

Kort sammendrag av oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anti-CGRP antagonist antistoff som angitt i krav 1. Andre aspekter av oppfinnelsen er angitt i kravene 2-8.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et anti-CGRP antagonist antistoff, kjennetegnet ved at det omfatter et VH -domene som har aminosyresekvens SEQ ID NO: 1 og et VL -domene som har aminosyresekvens SEQ ID NO: 2.

I noen utførelser vil anti-CGRP antagonist antistoffet gjenkjenne en human CGRP. I noen utførelser binder anti-CGRP antagonist antistoffet både human α-CGRP og β-CGRP. I noen utførelser binder anti-CGRP antagonist antistoffet CGRP fra menneske og rotte. I noen utførelser binder anti-CGRP antagonist antistoffet den C-terminale fragment som har aminosyre 25-37 av CGRP. I noen utførelser binder anti-CGRP antagonist antistoffet en C-terminal epitop med aminosyre 25-37 av CGRP.

I noen utførelser er anti-CGRP antagonist antistoffet antistoff G1 (som beskrevet heri). Anti-CGRP antagonist antistoffet aminosyresekvensen av tungkjede variabel region vist i figur 5 (SEQ ID NO: 1) og aminosyresekvensen av lettkjede variabel region vist i figur 5 (SEQ ID NO: 2).

I noen utførelser omfatter anti-CGRP-antagonist antistoffet en modifisert konstant region, så som en konstant region som er immunologisk inert (inkluderende partielt immunologisk inert), for eksempel som ikke utløser komplementmediert lysering, som ikke stimulerer antistoff avhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC), som ikke aktiverer mikroglia eller som har redusert en eller flere av disse aktiviteter. I noen utførelser er den konstante region modifisert som beskrevet i Eur. J. Immunol.

(1999) 29:2613-2624; WO99/58572. I andre utførelser omfatter anti-CGRP-antagonist antistoffet en human tungkjede IgG2 konstant region omfattende følgende mutasjoner: A330P331 til S330S331 (aminosyre nummerering med referanse til villtype IgG2 sekvensen). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. I noen utførelser er tungkjede kontakt region av antistoffet en human tungkjede IgG1 med enhver av følgende mutasjoner: 1) A327A330P331 til G327S330S331; 2) E233L234L235G236 til P233V234A235 med G236 deletert; 3) E233L234L235 til P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 til P233V234A235G327S330S331 med G236 deletert; 5) E233L234L235A327A330P331 til P233V234A235G327S330S331; og 6) N297 til A297 eller enhver annen aminosyre med unntak av N. I noen utførelser er tungkjede konstant region av anti-CGRP-antagonist antistoffet en human tungkjede IgG4 med enhver av følgende mutasjoner: E233F234L235G236 til P233V234A235 med G236 deletert; E233F234L235 til P233V234A235; og S228L235 til P228E235.

I ytterligere utførelser er den konstante region aglykosylert for N-bundet glykosylering. I Noen utførelser er den konstante region aglykosylert for N-bundet glykosylering ved mutasjon av oligosakkarid tilfestingsenheten (så som Asn297) og/eller flankeringsenheter som er en del av N-glykosylerings gjenkjenningssekvensen i den konstante region. I noen utførelser er den konstante region aglykosylert for N-koblet glykosylering. Den konstante region kan være aglykosylert for N-koblet glykosylering enzymatisk eller ved ekspresjon i en glykosylerings manglende vertscelle.

Bindingsaffiniteten (KD) av et anti-CGRP antagonist antistoff til CGRP (så som human α-CGRP målt med overflate plasmon resonans ved en egnet temperatur, så som 25 eller 37 °C) kan være ca 0,02 til ca 200 nM. I noen utførelser er bindingsaffiniteten enhver av ca 200 nM, ca 100 nM, ca 50 nM, ca 10nM, ca 1nM, ca 500 pM, ca 100 pM, ca 60 pM, ca 50 pM, ca 20 pM, ca 15 pM, ca 10 pM, ca 5 pM, eller ca 2 pM. I noen utførelser er bindingsaffiniteten mindre enn enhver av ca 250 nM, ca 200 nM, ca 100 nM, ca 50 nM, ca 10 nM, ca 1 nM, ca 500 pM, ca 100 pM, eller ca 50 pM.

Anti-CGRP antagonist antistoffet kan administreres før, under, og/eller etter hodepine. I noen utførelser administreres anti-CGRP antagonist antistoffet før angrepet av hodepinen (for eksempel migrene og kluster hodepine). Administrering av et anti-CGRP antagonist antistoff kan være ved ethvert middel kjent innen fagfeltet, inkluderende: oralt, intravenøst, subcutanøst, intraarterielt, intramuskulært, intrakardialt, intraspinalt, intratorasikalt, intraperitonialt, intraventrikulært, sublingualt, transdermalt og/eller via inhalering. Administreringen kan være systemiske, for eksempel intravenøs eller lokalisert.

I noen utførelser kan anti-CGRP antagonist antistoffet administreres i forbindelse med et ytterligere middel, så som et annet middel for å behandle hodepine.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også anti-CGRP antagonist antistoff avledet fra antistoff G1 Antistoff G1 (som også benevnes ”G1”) produseres av ekspresjonsvektorer som har ATCC katalognummer PTA-6866 og PTA-6867.

Aminosyresekvensene av tungkjede- og lettkjede-variable regioner av G1 er vist i figur 5. Den komplementaritetsbestemmende region (CDR) porsjoner av antistoff G1 (inkluderende Chothia og KABAT CDRer) er også vist i figur 5. Det skal forsås at referanse til en porsjon eller hele regionen av G1 omfatter sekvensene produsert av ekspresjonsvektorene som har ATCC katalognummer PTA-6866 og PTA-6867, og/eller sekvensene som er avbildet i figur 5. Antistoffvarianter av G1 med aminosyresekvensen er avbildet i tabell 6.

Oppfinnelsen er et VH-domene som er 100 % identisk til aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 1, og et VL –domene som er 100 % identisk i aminosyresekvens til SEQ ID NO: 2.

I en utførelse omfatter anti-CGRP antagonist antistoffet et fragment eller en region av antistoffet G1.Fragmentet inneholder de variable regioner fra en lettkjede og en tungkjede av antistoffet G1. Fragmentet inneholder variable regioner fra en lettkjede og en tungkjede vist i figur 5.

I noen utførelser er CDRen en Kabat CDR. I andre utførelser er CDRen en Chothia CDR. I andre utførelser er CDRen en kombinasjon av en Kabat og en Chothia CDR (også benevnt ”kombinert CDR” eller ”forlenget CDR”). Med andre ord, for en gitt utførelse inneholdende mer enn en CDR kan CDRene være enhver av Kabat, Chothia og/eller kombinert.

I noen utførelser blir anti-CGRP antagonist antistoffet isolert. I noen utførelser er anti-CGRP-antagonist antistoffet i hovedsak rent.

Tungkjede konstant region av anti-CGRP-antagonist antistoffene kan være fra enhver type konstant region, så som IgG, IgM, IgD, Iga og IgE; og enhver isotype så som IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4.

I noen utførelser omfatter anti-CGRP-antagonist antistoffet en modifisert kontant region som beskrevet heri.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et polynukleotid (som isoleres) omfattende et polynukleotid som koder for et anti-CGRP-antagonist antistoff ifølge oppfinnelsen. I en utførelse omfatter polynukleotidet et polynukleotid som koder for et fragment eller en region av antistoffet G1. Fragmentet inneholder de variable regioner fra en lettkjede og en tungkjede av antistoffet G1.

Polynukleotidet (som kan være isolert) kan omfatteet polynukleotid som koder for antistoff G1 Polynukleotidet omfatter enten en av eller begge polynukleotidene vist i SEQ ID NO: 9 og SEQ ID NO 10.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen vektorer (inkludert ekspresjon- og kloningsvektorer) og vertceller som omfatter enhver av polynukleotidene som koder for et anti-CGRP antistoff ifølge oppfinnelsen. I noen utførelser er vektoren pDb.CGRP.hFcGI som har ATCC No. PTA-6867. I andre utførelser er vektoren pEb.CGRP.hKGI som har ATCC No. PTA-6866.

I et ytterligere aspekt vedrører oppfinnelsen en vertcelle omfattende et polynukleotid som koder for et anti-CGRP-antagonist antistoff ifølge oppfinnelsen.

I noen utførelser er antistoffet antistoff G1.

I et ytterligere aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å generere antistoff G1 omfattende å dyrke en vertcelle eller avkom derav under betingelser som muliggjør produksjon av antistoff G1, hvor vertcellen omfatter en ekspresjonsvektor som koder for antistoff G1; og, i noen utførelser, rense antistoffet G1.

Ekspresjonsvektoren en eller begge polynukleotidsekvensene vist i SEQ ID NO:9 og SEQ ID NO:10.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å generere anti-CGRP-antagonist ifølge oppfinnelsen ved å uttrykke en eller flere polynukleotider som koder for antistoffet (som kan separat uttrykkes som en enkel lett- eller tungkjede, eller både en lett- og en tungkjede uttrykkes fra en vektor) i en egnet celle, generelt etterfulgt av gjenvinning og/eller isolering av antistoffet av interesse.

Anti-CGRP antagonist antistoffet, og polynukleotider som koder for antistoff ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å behandle, hindre, lindre, regulere eller redusere forekomst av sykdommer assosiert med avvikende funksjon av CGRP, så som hodepine (for eksempel migrene, kluster hodepine, kronisk hodepine og spenningshodepine) og andre tilstander som kan behandles eller hindres ved å antagonisere CGRP-aktivitet.

Kort beskrivelse av figurene.

Figur 1 er en tabell som viser bindingsaffiniteter av 12 murine antistoffer for forskjellige alanin-substituerte humane ɑ-CGRP-fragmenter. Bindingsaffinitetene ble målt ved 25 °C ved anvendelse av Biacore ved å flyte Faber over CGRPen på chipen.

De innrammete verdier representerer tap av affinitet av alaninmutanter relativt til morfragmentet, 25-37 (kursiv), med unntak av K35A som var avledet fra et 19-37 opphav. "<a>" indikerer affiniteter for 19-37 og 25-37 fragmenter er gjennomsnittsverdi ± standard avvik for to uavhengige målinger på forskjellige sensor chiper. "<b>" indikerer at disse interaksjoner er avledet fra en enkel bimolekylær interaksjons modell på grunn av en bifasisk offrate, slik at deres affiniteter ble bestemt ved anvendelse av en konformasjonsforandringsmodell. Gråskalering: hvitt (1.0) indikerer moraffinitet; lysgrå (mindre enn 0,5) indikerer høyere affinitet enn opphav; mørk grå (mer enn 2) indikerer lavere affinitet enn opphav; og svart indikerer at ingen binding ble detektert.

Figurer 2A og 2B viser effekten av administrering av CGRP 8-37 (400 nmol(kg), antistoff 4901 (25 mg/kg) og antistoff 7D11 (25 mg/kg) på hudblodstrømning målt som blodcelle fluks etter elektrisk pulsstimulering i 30 sekunder. CGRP 8-37 ble administrert intravenøst (i.v) 3-5 min før elektrisk pulsstimulering. Antistoff ble administrert intraperitonialt (i.p) 72 timer før elektrisk pulsstimulering. Hvert punkt i grafene representerer AUC av en rotte behandlet under betingelsene som angitt. Hver linje i grafene representerer gjennomsnitt AUC av rotte behandlet under betingelsen som angitt. AUC (areal under kurven) er lik�fluks x �tid. ”�fluks” representerer forandringen i fluksenheter etter elektrisk pulsstimulering; og ”�tid” representerer tidsperioden det tar for blodcellerefluksnivåer å returnere til nivået før elektrisk pulsstimulering.

Figur 3 viser effekten av administrering av forskjellig dosering av antistoff 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg eller 1 mg/kg) på hud blodstrømning målt som blodcellefluks etter elektrisk pulsstimulering i 30 sekunder. Antistoffene ble administrert intravenøst (i.v) 24 timer før elektrisk pulsstimulering, hvert punkt i grafen representerer AUC av en rotte behandlet under betingelsene angitt. Linjen i grafen representerer gjennomsnitt AUC av rotter behandlet under betingelsene angitt.

Figurer 4A og 4B viser effekten av administrering av antistoff 4901 (1 mg/kg eller 10 mg/kg, i.v), antistoff 7E9 (10 mg/kg, i.v) og antistoff 8B6 (10 mg/kg, i.v) på hud blodstrømning målt som blodcellefluks etter elektrisk pulsstimulering i 30 sekunder. Antistoffene ble administrert intravenøst (i.v) etterfulgt av elektrisk pulsstimulering ved 30 min, 60 min, 90 min og 120 min etter antistoff administrering. Y-aksen representerer prosent AUC sammenlignet med nivå av AUC idet intet antistoff ble administrert (tid 0). X-aksen representerer tid (minutter) for perioden mellom administrering av antistoff og elektrisk pulsstimulering. ”*” angir P< 0,05, og ”**” angir P < 0,01, som sammenlignet med tid 0. Data ble analysert ved anvendelse av en enveis ANOVA med en Dunnet's Multippel sammenligningstest.

Figur 5 viser aminosyresekvensen av tungkjede variabel region (SEQ ID NO:1) og lettkjede variabel region (SEQ ID NO:2) av antistoff G1. Kabat CDRer er i uthevet tekst, og Chothia CDRer er understreket. Aminosyreenhetene for tungkjede og lettkjede variabel region er nummerert sekvensvis.

Figur 6 viser epitopkartlegging av antistoff G1 med peptidkonkurranse ved anvendelse av Biacore. N-biotinylert human ɑ-CGRP ble fanget på SA sensor chip. G1 Fab (50 nM) i fravær av et konkurrerende peptid eller preinkubert i 1 time med 10 μM av et konkurrerende peptid fikk flyte på chipen. Binding av G1 Fab til human ɑ-CGRP på chipen ble målt. Y-aksen representerer prosentbinding blokkert av nærvær av det konkurrerende peptid sammenlignet med binding i fravær av det konkurrerende peptid.

Figur 7 viser effekten av administrering av antistoff G1 (1 mg/kg eller 10 mg/kg, i.v) eller vehikkel (PBS, 0,01 % Tween 20) på hudblodstrømning målt som blodcellefluks etter elektrisk pulsstimulering i 30 sekunder. Antistoff G1 eller vehikkel ble administrert intravenøst (i.v) etterfulgt av nerveelektrisk pulsstimulering ved 30 min, 60 min, 90 min og 120 min etter antistoff administrering.

Y-aksen representer prosent AUC sammenlignet med nivå av AUC idet intet antistoff eller vehikkel (definert som 100 %) ble administrert (tid 0). X-aksen representerer tid (minutter) for perioden mellom administrering av antistoff og elektrisk pulsstimulering. ”*” angir P < 0,05, og ”**” angir P < 0,01, sammenlignet med vehikkel. Data ble analysert ved anvendelse av en toveis ANOVA og Benferroni post-tester.

Figur 8A viser effekten av administrering av antistoff G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg eller 10 mg/kg, i.v) eller vehikkel (PBS, 0,01 % Tween 20) på hudblodstrømning målt som blodcellefluks etter elektrisk pulsstimulering i 30 sekunder 24 timer etter dosering.

Antistoff G1 eller vehikkel ble administrert intravenøst (i.v) 24 timer før elektrisk pulsstimulering av nerve. Y-akse representerer totalt areal under kurve (forandring i blodcellefluks multiplisert med forandring i tid fra stimulering inntil fluks returnerer til baselinje, AUC). X-aksen representerer forskjellige doseringer av antistoff G1. ”*” angir P < 0,05, og ”**” angir P < 0,01, sammenlignet med vehikkel. Data ble analysert ved anvendelse av enveis ANOVA og Dunns multiple sammenligningstest.

Figur 8B viser effekten av administrering av antistoff G1 (0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg eller 10 mg/kg, i.v) eller vehikkel (PBS, 0,01 % Tween 20) på hudblodstrømning målt som blodcellefluks etter elektrisk pulsstimulering i 30 sekunder 7 dager etter dosering. Antistoff G1 eller vehikkel ble administrert intravenøst (i.v) 7 dager før elektrisk pulsstimulering av nerve. Y-akse representerer total AUC. X-akse representerer forskjellige doseringer av antistoff G1. ”**” angir P < 0,01, og ”***” angir P < 0,001, sammenlignet med vehikkel. Data ble analysert ved anvendelse av enveis ANOVA og Dunn's multiple sammenligningstest.

Figur 8 C er en kurvetilpasningsanalyse av dataene fra figurer 8A og 8B. Antistoff G1 eller vehikkel ble administrert intravenøst (i.v) enten 24 timer eller 7 dager før elektrisk pulsstimulering av nerve. Y-akse representerer total AUC. X-akse representerer forskjellige doseringer av antistoff G1 i ”mg/kg” på en logaritmisk skala for å bestemme EC50.

Figur 9 viser effekten av antistoff mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS eller vehikkel (PBS, 0,01 % Tween 20) på forandring i diameter av den midtre meningeale arterie etter elektrisk feltstimulering. Antistoff mu7E9, BIBN4096BS eller vehikkel ble administrert intravenøst (i.v) ved tidspunkt 0 minutter etter en baselinjerespons til elektrisk stimulering ble etablert. Y-aksen representerer forandring i diameter av den midtre meningeale arterie etter elektrisk feltstimulering. Hvilende diameter korresponderer til 0 %. X-akse representerer tid (minutter) av elektrisk pulsstimulering. ”*” angir P < 0,5 og ”**” angir P < 0,01, sammenlignet med vehikkel. Data ble analysert ved anvendelse av enveis ANOVA og Dunett's multiple sammenligningstest.

Figur 10 viser effekten av varierende doseringer av antistoff G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg eller 10 mg/kg, i.v) eller vehikkel (PBS, 0,01 % tween 20) på forandring i diameter av den midtre meningeale arterie etter stimulering med elektrisk felt. Antistoff G1 eller vehikkel ble administrert intravenøst (i.v) 7 dager før stimulering med elektrisk felt. Y-aksen representerer forandring i diameter av den midtre meningeale arterie. Hvilediameter korresponderer til 0 %. X-akse representerer stimuleringsspenning. ”*” indikerer P < 0,05, ”**” indikerer P < 0,01, og ”***” indikerer P < 0,001, sammenlignet med vehikkel. Data ble analysert ved anvendelse av toveis ANOVA og Benferroni – posttester.

Figur 11A viser effekten av antistoff mu4901 (10 mg/kg) eller vehikkel (PBS, 0,01 % Tween 20), administrert intravenøst (i.v) 24 timer før, på reduksjon i kjernetemperatur indusert med subkutanøs injeksjon av naloxon (1 mg/kg) i morfinavhengige rotter. Y-aksen representerer temperaturforskjeller fra baselinje. X-aksen representerer tid målt fra punktet med naloxon injeksjon.

Figur 11B viser effekten av antistoff mu4901 (10 mg/kg) eller vehikkel (PBS, 0,01 % Tween 20), administrert intravenøst (i.v) 24 timer før, på økning i haleoverflatetemperatur indusert med subkutanøs injeksjon av naloxon (1 mg/kg) i morfinavhengige rotter. Y-aksen representerer temperaturforskjell fra baselinje. X-akse representerer tid målt fra tidspunkt for naloxon injeksjon.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen som beskrives heri tilveiebringer anti-CGRP antagonist antistoff omfattende et VH -domene som har aminosyresekvens SEQ ID NO: 1 og et VL -domene som har aminosyresekvens SEQ ID NO: 2. Anti-CGRP antagonist antistoffet kan være avledet fra G1. Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å fremstille slike anti-CGRP antagonist antistoff.

Generelle teknikker.

Praktiseringen av foreliggende oppfinnelse vil benytte, med mindre annet er angitt, konvensjonelle teknikker innen molekylær biologi (inkluderende rekombinante teknikker), mikrobiologi, cellebiologi, biokjemi og immunologi, som er innen den fagkyndiges kompetanse. Slike teknikker er forklart fullstendig i litteraturen, så som Kloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987);

Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definisjoner.

Et ”antistoff” er et immunoglobulin molekyl i stand til spesifikk binding til et mål, så som et karbohydrat, polynukleotid, lipid, polypeptid etc, gjennom i det minste et antigengjenkjennende sete, lokalisert i den variable region av immunoglobulin molekyl. Som anvendt heri, termen omfatter ikke kun intakte polyklonale eller monoklonale antistoff, men også fragmenter derav (så som Fab, Fab', F(ab')2, Fv), enkeltkjede (ScFv), mutanter derav, fusjonsproteiner omfattende en antistoff porsjon (så som domeneantistoff), og andre modifiserte konfigurasjoner av immunoglobulin molekylet som omfatter et antigjenkjennende sete. Et antistoff inkluderer et antistoff av enhver klasse, så som IgG, IgA eller IgM (og underklasser derav), og antistoffet trenger ikke å være av en bestemt klasse. Avhengig av antistoff aminosyresekvensen av den konstante domene av dets tungkjeder, kan immunoglobuliner tillånes forskjellige klasser. Der er fem hovedklasser av immunoglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, og flere av disse kan være ytterligere delt i undergrupper (isotyper), for eksempel IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 og IgA2. Tungkjede konstante domener som korresponderer til forskjellige klasser av immunoglobuliner er benevnt alfa, delta, epsilon, gamme og my, respektivt. Subenhetsstrukturene og tredimensjonale konfigurasjoner av forskjellige klasser av immunoglobuliner er godt kjent.

Som anvendt heri refererer ”monoklonalt antistoff” til et antistoff oppnådd fra en populasjon av i hovedsak homogent antistoff, det vil si de individuelle antistoff som omfatter populasjonen er identiske med unntak av mulige naturlige forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Monoklonale antistoff er meget spesifikke, og de er rettet mot et enkelt antigenisk sete. Videre, i motsetning til polyklonale antistoffpreparater, som typisk inkluderer forskjellige antistoff rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), er hvert monoklonalt antistoff rettet mot en enkelt determinant på antigenet. Bestemmelsen ”monoklonal” indikerer karakteren av antistoffet idet den er opptatt fra en i hovedsak homogen populasjon av antistoff, og skal ikke vurderes som at det krever produksjon av antistoffet på noen bestemt metode. For eksempel, de monoklonale antistoff som skal anvendes i samsvar med oppfinnelsen kan fremstilles med hybridomametoden som først ble beskrevet av Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495, eller kan fremstilles med rekombinante DNA-metoder så som beskrevet i US patent nr 4,816,567. De monoklonale antistoff kan også isoleres fra fagbiblioteker generert ved anvendelse av teknikker beskrevet i McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554, for eksempel.

Som anvendt heri, termen ”humaniserte” antistoff refererer til former av ikke-human (for eksempel murine) antistoff som er spesifikke kimeriske immunoglobuliner, immunoglobulinkjeder, eller fragmenter derav (så som Fv, Fab, Fab', F(ab')2 eller andre antigenbindende subsekvenser av antistoff) som inneholder minimale sekvenser avledet fra ikke-human immunoglobulin. For det meste er humaniserte antistoff humane immunoglobuliner (mottaker antistoff) hvor enhetene fra en komplementær bestemmende region (CDR) av mottaker er erstattet av enheter fra CDR av en ikke-human art (donor antistoff) så som mus, rotte eller kanin som har den ønskete spesifisitet, affinitet og biologiske aktivitet. I noen tilfeller blir Fv rammeverkregion (FR) enheter av det humane immunoglobulin erstattet med korresponderende ikke-humane enheter. Videre, humanisert antistoff kan omfatte enheter som verken finnes i mottak antistoffet eller i den importerte CDR eller rammeverksekvenser, men er inkludert for ytterligere å raffinere og optimalisere antistoff ytelse. Generelt, humanisert antistoff vil omfatte i hovedsak alle eller i det minste en av, typisk to, variable domener, hvor alle eller i hovedsak alle av CDR-regionene korresponderer til de for et ikke-humant immunoglobulin og alle eller i hovedsak alle FR-regioner er de fra et humant immunoglobulin konsensus sekvens. Det humaniserte antistoff vil optimalt også omfatte i det minste en porsjon av en immunoglobulin konstant region eller domene (Fc), typisk det for et humant immunoglobulin. Antistoff kan ha Fc-regioner modifisert som beskrevet i WO 99/58572. Andre former av humanisert antistoff fra en eller flere CDRen (en, to, tre, fire, fem, seks) som er forandret med hensyn til det opprinnelige antistoff, som også benevnes som en eller flere CRDer ”avledet fra ”en eller flere CDRer fra det opprinnelige antistoff.

Som anvendt heri, termen ”human antistoff” betyr et antistoff som har en aminosyresekvens korresponderende til det for et antistoff produsert av et menneske og/eller har blitt fremstilt ved anvendelse av noen av teknikkene som fremstilles humane antistoff kjent innen fagfeltet eller beskrevet heri. Definisjonen av et humant antistoff inkluderer antistoff omfattende i det minste en human tungkjede polypeptid eller i det minste en human lettkjede polypeptid. Et slikt eksempel er et antistoff som omfatter murin lettkjede og human tungkjede polypeptider. Humane antistoff kan produseres ved anvendelse av forskjellige teknikker kjent innen fagfeltet. I en utførelse utvelges det humane antistoff fra et fagbibliotek, hvor fagbiblioteket uttrykker humane antistoff (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Humane antistoff kan også fremstilles ved å introdusere humane immunoglobulin loki til transgene dyr, for eksempel mus hvor de endogene immunoglobulingener har blitt partielt eller fullstendig inaktive. Denne tilnærming er beskrevet i US patenter nr 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825;

5,625,126; 5,633,425; og 5,661,016. Alternativt kan det humane antistoff fremstilles ved å imortalisere humane B-lymfocytter som produserer et antistoff rettet mot et målantigen (så som B-lymfocytter kan gjenvinnes fra et individ, eller kan ha blitt immunisert in vitro). Se for eksempel Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; og U.S. Patent No.5,750,373.

Som anvendt heri, termen ”kalsitonin genrelatert peptid” og ”CGRP” refererer til enhver form av kalsitonin genrelatert peptid og varianter derav som opprettholder i det minste delvis aktiviteten av CGRP. For eksempel kan CGRP være ɑ-CGRP eller β-CGRP. Som anvendt heri, CGRP inkluderer alle pattedyrarter av nativ sekvens CGRP, for eksempel human, kanine, feline, equine og bovin.

Som anvendt heri, termen ”anti-CGRP antagonist antistoff” (som noen ganger benevnes ”anti-CGRP antistoff”) refererer til et antistoff som er i stand til å binde til CGRP og inhibere CGRP biologisk aktivitet og/eller nedstrøms reaksjonsveier mediert med CGRP signalering. Et anti-CGRP antagonist antistoff omfatter antistoff som blokkerer, antagoniserer, undertrykker eller reduserer (inkluderende signifikant) CGRP biologisk aktivitet, inkluderende nedstrøms reaksjonsveier mediert med CGRP signalering, så som reseptorbinding og/eller utløsing av en cellulær respons til CGRP. For formålet med foreliggende oppfinnelse skal det eksplisitt forstås at termen ”anti-CGRP antagonist antistoff” omfatter alle de tidligere identifiserte termer, titler og funksjonelle former og karakteristika hvor CGRP i seg selv, en CGRP biologisk aktivitet (inkluderende men ikke begrenset til dets evne til å mediere ethvert aspekt av hodepine), og konsekvensene av den biologiske aktivitet, er i hovedsak nullifisert, redusert, eller nøytralisert i enhver meningsfull grad. I noen utførelser vil en anti-CGRP antagonist antistoff binde CGRP og hindre CGRP binding til en CGRP reseptor. I andre utførelser vil anti-CGRP antistoff binde CGRP og hindre aktivering av CGRP reseptor. Eksempler på anti-CGRP antagonist antistoff er tilveiebrakt heri. Som anvendt heri, termene ”G1” og ”antistoff G1” anvendes om hverandre for å referere til et antistoff produsert med ekspresjonsvektorer som har deponeringsnumre ATCC PTA6867 og ATCC PTA6866. Aminosyresekvensen av tungkjede og lettkjede variable regioner er vist i figur 5. CDR-porsjonene av antistoff G1 (inkluderende Chothia og Kabat CDRer) er i diagramform avbildet i figur 5.

Polynukleotidene som koder for tung- og lettkjede variable regioner er vist i SEQ ID NO:9 og SEQ ID NO-10. Karakteriseringen av G1 er beskrevet i eksempelet.

Termene ”polypeptid”, ”oligopeptid”, ”peptid” og ”protein” anvendes om hverandre heri for å referere til polymerer av aminosyrer av enhver lengde. Polymeren kan være lineær eller forgrenet, den kan omfatte modifiserte aminosyrer, og den kan være avbrutt av ikke-aminosyrer. Termene omfatter også en aminosyrepolymer som har blitt modifisert naturlig eller med intervensjon; for eksempel disulfid bindingsdannelse, glykosylering, lipidering, acetylering, fosforylering eller enhver annen manipulasjon eller modifikasjon, så som konjugering med markørkomponent. Også inkludert i definisjonen er for eksempel polypeptider inneholdende en eller flere analoger av en aminosyre (inkluderende for eksempel ikke-naturlige aminosyrer, etc), og likeledes andre modifiseringer kjent innen fagfeltet.

”Polynukleotid” eller ”nukleinsyre” som anvendt om hverandre heri refererer til polypeptider av nukleotider av enhver mengde, og inkluderer DNA og RNA. Nukleotidene kan være deoksyribonukleotider, ribonukleotider, modifiserte nukleotider eller baser, og/eller deres analoger, eller ethvert substrat som kan inkorporeres til en polymer med DNA- eller RNA-polymerase. Et polynukleotid kan omfatte modifiserte nukleotider, så som metylerte nukleotider og deres analoger. Som foreliggende kan modifisering av nukleotidstrukturen bevirkes før eller etter sammenstilling av polymeren. Sekvensen av nukleotidene kan være avbrutt av ikke-nukleotid komponenter. Et polynukleotid kan være ytterligere modifisert etter polymerisering, så som ved konjugasjon med en markørkomponent. Andre typer modifiseringer inkluderer, for eksempel ”caps”, substituert med en eller flere av de naturlige forekommende nukleotider med en analog, internukleotidmodifiseringer så som for eksempel de som uladete koblinger (for eksempel metylfosfonater, fosfortriestere, fosforamydater, karbamater, etc) og med ladete bindinger (for eksempel fosforotioater, fosforoditioater, etc), de som inneholder pendant enheter så som for eksempel proteiner (for eksempel nukleaser, toksiner, antistoff, signalpeptider, ply-L-lysin, etc), de med interkalatorer (for eksempel akridin, psoralen, etc), de som inneholder kelatorer (for eksempel metaller, radioaktive metaller, boroksidative metaller, etc) de som inneholder alkylatorer, de med modifiserte bindinger (for eksempel alfa anomeriske nukleinsyrer, etc), og likeledes umodifiserte former av polynukleotidene. Videre, enhver av hydroksylgruppene som opprinnelig foreligger i sukkerene kan erstattes for eksempel fosfonatgrupper, fosfatgrupper, beskyttet med standard beskyttende grupper, eller aktivert for å fremstille yterligere bindinger til ytterligere nukleotider, eller kan være konjugert til faststoff støttemedier.5 ' og 3 '-terminal OH kan være fosforylert eller substituert med aminer eller organiske capping gruppe enheter av fra 1 til 20 karbonatomer. Andre hydroksyler kan også være derivatisert til standard beskyttende grupper. Polynukleotider kan også inneholde analoge former av ribose eller deoksyribose i sukkeret som er generelt kjent innen fagfeltet, inkluderende for eksempel 2 '-O-metyl-, 2 '-O-allyl, 2 '-fluor eller 2 '-azido-ribose, karbosykliske sukkeranaloger, alfa-anomeriske sukkere, epimeriske sukkere så som arabinose, zyloser eller lyxoser, pyranosesukkere, furanosesukkere, sedoheptuloser, asykliske analoger og abasiske nukleotidanaloger så som metylribosid. En eller flere fosfordiesterkoblinger kan erstattes med alternative koblingsgrupper. Disse alternative koblingsgrupper inkluderer men er ikke begrenset til, utførelser hvor fosfat er erstattet av P(O)S(“tioat”), P(S)S (“ditioat”), (O)NR2 (“amidat”), P(O)R, P(O)OR’, CO eller CH2 (“formacetal”), hvor hver R eller R’ er uavhengig H eller substituert eller ikkesubstituert alkyl (1-20 C) valgfritt inneholdende en eter (-O-) kobling, aryl, alkenyl, sykloalkyl, sykloalkenyl eller araldyl. Ikke alle koblinger i et polynukleotid trenger å være identiske. Den foregående beskrivelse appliseres til alle polynukleotider referert til heri, inkluderende RNA og DNA.

En ”variabel region” av et antistoff refererer til den variable region av antistoff lettkjede eller variable region av antistoff tungkjede, enten alene eller i kombinasjon. De variable regioner av tung- og lettkjede består hver av fire rammeverkregioner (Fr) forbudet med tre komplementaritets bestemmende regioner (CDRer) også kjent som hypervariable regioner. CDRene i hver kjede holdes sammen i nærhet med FRene og, hvor CDRene fra den andre kjede bidrar til dannelse av det antigenbindende sete til antistoffene.

Der er i det minste to teknikker for å bestemme CDRer: (1) en tilnærming basert på krysspesifikke sekvensvariabilitet (det vil si Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); og (2) en løsning basert på krystallografiske studier av antigen-antistoff-komplekser Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol.273:927-948)). Som anvendt heri, en CDR kan refererer til CDRer definert av enhver løsning eller ved en kombinasjon av de to tilnærminger.

En ”konstant region” av et antistoff refererer til den konstante region av antistoff lettkjede eller den konstante region av antistoff tungkjede, en enten alene eller i kombinasjon.

En epitop som ”fortrinnsvis binder” eller ”spesifikt binder” (anvendt om hverandre heri) til et antistoff eller et polypeptid er en term som er godt forstått innen fagfeltet, og fremgangsmåter for å bestemme slike spesifikke eller foretrukne bindinger er også godt kjent innen feltet. Et molekyl sies å oppvise ”spesifikk binding” eller ”preferensiell binding” dersom det reagerer eller assosierer mer hyppig, mer hurtig, med større varighet og/eller med større affinitet med en bestemt celle eller substans enn den gjør med alternative celler eller substanser. Et antistoff ”spesifikt binder” eller ”preferensielt binder” til et mål dersom den binder med større affinitet, aviditet, mer enkelt og/eller med større varighet enn den binder til andre CGRP-epitoper eller ikke-CGRP epitoper. Det skal også forstås at ved lesing av denne fusjon så kan et antistoff (eller enhet eller epitop) som spesifikt eller differensielt binder til et første mål kan, eller trenger ikke, spesifikt eller preferensielt å binde til et andre mål. Som sådan, ”spesifikk binding” eller ”preferensiell binding” krever ikke nødvendigvis (selv om det kan inkludere) eksklusiv binding. Generelt, men ikke nødvendigvis, referanse til binding betyr preferensiell binding. Som anvendt heri, ”i hovedsak ren” referer til materialet som er minst 50 % rent (det vil si fri fra kontaminanter), mer fortrinnsvis minst 90 % rent, mer fortrinnsvis minst 955 rent, mer fortrinnsvis minst 98 % rent, mer fortrinnsvis minst 99 % rent.

En ”vertcelle” inkluderer en individuell celle eller cellekultur som kan være eller som har vært en mottaker for vektor(er) for inkorporering av polynukleotid innskudd.

Vertcelle inkluderer avkommet av en enkelt vertcelle, og avkommet trenger ikke nødvendigvis å være fullstendig identisk (i morfologi eller i genomisk DNA komplement) til den opprinnelige mor-celle på grunn av naturlig, tilfeldig eller overveid mutasjon. En vertcelle inkluderer celler transfektert in vivo med polynukleotid(er) ifølge oppfinnelsen.

Termen ”Fc-region” anvendes for å definere en C-terminal region av et immunoglobulin tungkjede. ”Fc-regionen” kan være en nativ sekvens Fc-region eller en variant Fc-region. Selv om grensene for Fc-regionen av en immunoglobulin tungkjede kan variere, er den humane IgG tungkjede Fc-region vanligvis definert å strekke seg fra en aminosyreenhet ved posisjon Cys226, eller fra Pro230, til karboksylterminus derav. Nummereringen av enheter i Fc-regionen er ifølge EU-indeksen som i Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Fcregionen av et immunoglobulin omfatter generelt to konstante domener, CH2 og CH3.

Som anvendt heri, ”Fc-reseptor” og ”FcR” beskriver en reseptor som binder til Fcregionen av et antistoff. Den foretrukne FcR er en nativ sekvens human FcR. Videre, en foretrukket FcR er en som binder et IgG antistoff (en gammareseptor) og inkluderer reseptorer av underklassene FcγRI, FcγRII, og FcγRIII, inkluderende alleliske varianter og alternative spleiseformer av disse reseptorer. FcγRII-reseptorene inkluderer FcγRIIA (en "aktiverende reseptor") og FcγRIIB (en "inhiberende reseptor"), som har tilsvarende aminosyresekvenser som avviker primært i de sytoplasmiske domener derav. En oversikt over FcRer er gitt i Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; and de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. “FcR” also includes the neonatal receptor, FcRn, which is responsible for the transfer of maternal IgGs to the fetus (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

”Komplement avhengig cytotoksisitet” og ”CDC” refererer til lysering av et mål i nærvær av en komplement. Komplementaktiveringsreaksjonsveien injiseres av binding av den første komponent av komplementsystemet (C1q) til et molekyl (for eksempel et antistoff) kompleksert med et kognat antigen. For å undersøke komplementaktivering benyttes en CDC-analyse, for eksempel som beskrevet i Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), kan utføres.

En ”funksjonell Fc-region” oppviser i det minste en effektorfunksjon av en nativ sekvens Fc-region. Representative ”effektorfunksjoner” inkluderer C1q-binding; komplementavhengig cytotoksisitet (CDC); Fc-reseptorbinding; antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC); fagocytose; nedregulering av celleoverflatereseptorer (for eksempel B-celle reseptor; BCR), etc. Slike effektorfunksjoner krever generelt at Fc-regionen kombineres med et bindingsdomene (for eksempel et antistoff variabelt domene) og kan analyseres ved anvendelse av forskjellige analyser kjent innen fagfeltet for å evaluere slike antistoff effektorfunksjoner.

En ”nativ sekvens FC-region” omfatter en aminosyresekvens som er identisk tiol aminosyresekvensen av en Fc-region som finnes i naturen. En ”variant Fc-region” omfatter en aminosyresekvens som avviker fra tilsvarende for en nativ sekvens Fcregion med i det minste en aminosyremodifisering, men som opprettholder i det minste en effektorfunksjon av den native sekvens Fc-region. Fortrinnsvis, variant Fcregionen har i det minste en aminosyresubstituering sammenlignet med en nativ sekvens Fc-region eller til Fc-regionen av et mor-polypeptid, for eksempel fra ca 1 til ca 10 aminosyresubstitueringer, og fortrinnsvis fra ca 1 til ca 5 aminosyresubstitueringer i en nativ sekvens Fc-region eller i Fc-regionen av mor-polypeptidet. Variant Fc-region heri vil fortrinnsvis oppvise i det minste ca 80 % sekvensidentitet med en nativ sekvens Fc-region og/eller med en Fc-region av et mor-polypeptid, og mer fortrinnsvis minst ca 90 % sekvensidentitet dermed, mer fortrinnsvis minst ca 95 %, minst ca 96 %, minst ca 97 %, minst ca 98 %, minst ca 99 % sekvensidentitet dertil.

Som anvendt heri, termene ”antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet” og ”ADCC” refererer til en cellemediert reaksjon hvor ikke-spesifikke cytotoksiske celler som uttrykker Fc-reseptorer (FcRer) (for eksempel naturlige drepeceller (NK), nautrofiler og makrofager) gjenkjenner bundet antistoff på en målcelle og deretter forårsaker lysering av målcellen. ADCC-aktivitet av et aktuelt molekyl kan undersøkes ved anvendelse av en in vitro ADCC-analyse, så som den som er beskrevet i US patent 5,500,362 eller 5,821,337. Nyttige effektorceller for slike analyser inkluderer perifer blodmononukleære celler (PBMC) og NK-celler. Alternativt, eller i tillegg, ADCC-aktivitet av et aktuelt molekyl kan undersøkes in vivo, for eksempel i en dyremodell så som den som er beskrevet i Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

Som anvendt heri, ”behandling” er en tilnærming for å oppnå nyttige eller ønskete kliniske resultater. For formålet med denne oppfinnelse, nyttige eller ønskete kliniske resultater inkluderer, men er ikke begrenset til, en av følgende: Forbedring i ethvert aspekt av en hodepine inkluderende å redusere alvorlighet og lindre smerteintensitet, og andre assosierte symptomer, redusere frekvens av forekomst, øke livskvaliteten til de som lider av hodepine, og redusere dosering av andre medikamenter nødvendig for å behandle hodepine. For migrene kan andre assosierte symptomer inkludere, men er ikke begrenset til, kvalme, oppkast, og følsomhet for lys, lyd og/eller bevegelse. For kluster hodepine kan andre assosierte symptomer inkludere, men er ikke begrenset til, oppsvulming under eller rundt øynene, utstrakte tårer, røde øyner, Rhinorrhea eller nasal forstoppelse, og rødmet ansikt.

”Redusere forekomst” av hodepine betyr å redusere alvorligheten (som kan inkludere og redusere behov for og/eller mengden av for eksempel eksponering til andre medikamenter og/eller terapier som generelt anvendes for denne tilstand, inkluderende for eksempel ergotamin, dihydroergotamin eller triptaner for migrene), varighet, og/eller hyppighet (inkluderende for eksempel å forsinke eller øke tiden til neste episodiske angrep i et individ).

Som det skal forstås av fagkyndige innen fagfeltet, individer kan variere i termer av deres respons til behandling, og, som sådan, for eksempel, en ”fremgangsmåte for å redusere hyppighet av hodepine i et individ” reflekterer å administrere anti-CGRP antagonist antistoffer basert på en rimelig forventing om at slik administrering sannsynlig kan forårsake en slik reduksjon i hyppighet for det bestemte individ.

”Lindre” hodepine eller en eller flere symptomer av hodepine betyr å redusere eller forbedre en eller flere symptomer av hodepine sammenlignet med en ikke-administrering av anti-CGRP antagonist antistoff. ”Lindre” inkluderer også å forkorte eller redusere varigheten av et symptom.

Som anvendt heri, ”regulere hodepine” refererer til å opprettholde eller redusere alvorligheten eller varigheten av en eller flere symptomer av hodepine eller hyppigheten av hodepineangrep i et individ (sammenlignet med nivået før behandling). For eksempel, varigheten eller alvorligheten av hodesmerter, eller hyppigheten av angrep reduseres med i det minste ca 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % eller 70 % i individet sammenlignet med nivået før behandling.

Som anvendt heri, ”forsinke” utviklingen av hodepine betyr å utsette, hindre, senke, hemme, stabilisere og/eller utsette progresjonen av sykdommen. Denne forsinkelse kan være av varierende tidslengde, avhengig av historien av sykdommen og/eller individene som behandles. Slik det vil være åpenbart for en fagkyndig vil en tilstrekkelig eller signifikant forsinkelse, i effekt, omfatte hindring, det vil si at individet ikke utvikler hodepine (for eksempel migrene). En fremgangsmåte som ”forsinker” utvikling av symptomene er en fremgangsmåte som reduserer sannsynligheten for å utvikle symptomet innen en gitt tidsramme og/eller redusere graden av symptomene i en gitt tidsramme, sammenlignet ved av man ikke bruker metoden. Slike sammenligninger er typisk basert på kliniske studier, ved anvendelse av en statistisk signifikant antall individer.

”Utvikling eller ”progresjon” av hodepine betyr innledende manifestasjoner og/eller påfølgende progresjon av forstyrrelsen. Utvikling av hodepine kan detekteres og undersøkes ved anvendelse av standard kliniske teknikker godt kjent innen fagfeltet. Imidlertid, utvikling refererer også til progresjon som kan være ikke-detekterbar. For formålet med denne oppfinnelse, utvikling eller progresjon refererer til det biologiske forløp av symptomene. ”Utvikling” inkluderer forekomst, tilbakekomst og start. Som anvendt heri ”start” eller ”forekomst” av hodepine inkluderer den innledende start og/eller tilbakevending.

Som anvendt heri, en ”effektiv dosering” eller ”effektiv mengde” av medikament, forbindelse eller farmasøytisk sammensetning er en mengde som er tilstrekkelig for å effektuere nyttige eller ønskete resultater. For profylaktisk anvendelse inkluderer nyttige eller ønskete resultater, resultater slik at man eliminerer eller reduserer risikoen, redusere alvorligheten, eller forsinker start av sykdommen, inkluderende biokjemiske, histologisk og/eller atferdssymptomer av sykdommen, dets komplikasjoner og mellomliggende patologiske fenotyper som presenteres under utvikling av sykdommen. For terapeutisk anvendelse inkluderer nyttige eller ønskete resultater kliniske resultater så som redusert smerteintensitet, varighet, eller hyppighet av hodepineangrepene, og redusering av en eller flere symptomer resulterende av hodepine (biokjemiske, histologiske og/eller atferdsmessige), inkluderende dets komplikasjoner og mellomliggende patologiske fenotyper som presenteres under utvikling av sykdommen, øket livskvalitet for de som lider av sykdommen, redusering av dosering av andre medisineringer som er nødvendig for å behandle sykdommen, forsterke effekten av annen medisinering, og/eller forsinke progresjonen av sykdommen i pasienten. En effektiv dosering kan administreres i en eller flere administreringer. Formålet med denne oppfinnelse, en effektiv dosering av medikament, forbindelse eller farmasøytisk sammensetning er en mengde som er tilstrekkelig til å oppnå en profylaktisk eller terapeutisk behandling enten direkte eller indirekte. Slik det skal forstås av den kliniske kontekst, en effektiv dosering av et medikament, forbindelse eller farmasøytisk sammensetning kan, men trenger ikke, oppnås i forbindelse med et annet medikament, forbindelse eller farmasøytisk sammensetning.

Således, en ”effektiv dosering” kan vurderes i konteksten av å administrere en eller flere terapeutiske midler, og et enkelt middel kan vurderes å gi en effektiv mengde dersom, i forbindelse med en eller flere andre midler, et ønsket resultat kan, er oppnådd.

Et ”individ” er et pattedyr, mer fortrinnsvis et menneske. Pattedyr inkluderer også, men er ikke begrenset til, gårdsdyr, sportsdyr, kjæledyr, primater, hester, hunder, katter, mus og rotter.

Som anvendt heri, termen ”vektor” betyr et konstrukt, som er i stand til å avgi, å fortrinnsvis uttrykke, en eller flere gener eller sekvenser i en vertcelle. Eksempler på vektorer inkluderer, men er ikke begrenset til, virale vektorer, nakne DNA eller RNA ekspresjonsvektorer, plasmid, kosmid eller fagvektorer, DNA- eller RNA-ekspresjonsvektorer assosiert med kationiske kondenserende midler, DNA- eller RNA-ekspresjonsvektorer innkapslet i liposomer, og visse eukaryote celler, så som produsentceller.

Som anvendt heri termen ”ekspresjonskontrollsekvens” betyr en nukleinsyresekvens som dirigerer transkripsjon av en nukleinsyre. En ekspresjonskontrollsekvens kan være en promotor, så som en konstitutiv eller en induserbar promotor, eller en enhenser. Ekspresjonskontrollsekvensen er funksjonelt koblet til nukleinsyresekvensen som skal transkriberes.

Som anvendt heri, ”farmasøytisk akseptabel bærer” eller ”farmasøytisk akseptabel eksipient” inkluderer ethvert materiale som, idet de kombineres med en aktiv ingrediens, muliggjør at ingrediensen opprettholder sin biologiske aktivitet og er ikkereaktiv med individets immunsystem. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til, enhver av de standard farmasøytiske bærere så som fosfatbufret saltløsning, vann, emulsjoner så som olje/vann – emulsjoner, og forskjellige typer fuktmidler. Foretrukne fortynningsmidler for aerosol eller parenteral administrering er fosfatbufret saltløsning eller normal (0,9 %) saltløsning.

Sammensetninger omfattende slike bærere formuleres med godt kjente konvensjonelle metoder (se for eksempel Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000).

Termen "kon" som anvendt heri, er tiltenkt å referere til hastighetskonstanten for assosiasjon av et antistoff til et antigen.

Termen "koff" som anvendt heri er tiltenkt å referere til hastighetskonstanten for dissosiasjon av et antistoff fra antistoff/antigen-komplekser.

Termen "kD" som anvendt heri er tiltenkt å referere til likevektsdissosiasjonskonstanten av en antistoff antigen-interaksjon.

Som anvendt heri, termen ”vasomotorsymptom” er tiltenkt å referere til tilstanden relatert til vasodilasjon og inkluderer, men er ikke begrenset til, hodepine (så som migrene, … andre), varmetokter, kaldtokter, insomnia, søvnforstyrrelser, humørforstyrrelser, irriterbarhet, utstrakt svetting, nattsvette, dagsvette, utmattelse og lignende, forårsaket interalia av termoregulatorisk dysfunksjon.

Som anvendt heri, termene ”tokter”, ”varmetokt” er termer som gjenkjennes innen fagfeltet som refererer til en episodisk forstyrrelse i kroppstemperatur som typisk omfatter en hurtig rødming av hud, vanligvis ledsaget av perspirasjon i et individ.

B. Anti-CGRP antagonist antistoff.

Et anti-CGRP antagonist antistoff refererer til ethvert antistoffmolekyl som blokkerer, undertrykker eller reduserer (inkluderende signifikant) CGRP biologisk aktivitet, inkluderende nedstrøms reaksjonsveier mediert med CGRP signalering, så som reseptorbindig og/eller utløsning av en cellulær respons til CGRP.

Et anti-CGRP antagonist antistoff skal oppvise en eller flere av følgende karakteristika: (a) binde til CGRP; (b) blokkere CGRP fra å binde til dets reseptor(er); (c) blokkere eller redusere CGRP reseptoraktivering (inkluderende cAMP aktivering); (d) inhibere CGRP biologisk aktivitet eller nedstrømsreaksjonsveier mediert av CGRP signaleringsfunksjon; (e) hindre, lindre eller behandle ethvert aspekt av hodepine (for eksempel migrene); (f) øke klarning av CGRP; og (g) inhibere (redusere) CGRP syntese, produksjon eller frigivelse. Anti-CGRP antagonist antistoff er kjent innen fagfeltet. Se for eksempel Tan et al., Clin. Sci. (Lond).89:565-73, 1995; Sigma (Missouri, US), produkt nummer C7113 (klon #4901); Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993.

Anti-CRGP antagonist antistoffet ifølge oppfinnelsen reagerer med CGRP på en måte som inhiberer CGRP og/eller nedstrøms reaksjonsveier mediert av CGRP signalering og funksjon. I noen utførelser gjenkjenner anti-CGRP antagonist antistoffet human CGRP. I noen utførelser binder anti-CGRP antagonist antistoffet til både human α-CGRP og β-CGRP. I noen utførelser binder anti-CGRP antagonist antistoffet human og rotte CGRP. I noen utførelser binder anti-CGRP antagonist antistoffet den C-terminale fragment som har aminosyre 25-37 av CGRP. I noen utførelser binder anti-CGRP antagonist antistoffet en C-terminal epitop med aminosyren 25-37 av CGRP.

Anti-CGRP antagonist antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte antistoff fragmenter (for eksempel Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, etc), enkeltkjede (ScFv), fusjonsproteiner omfattende en antistoffgen (for eksempel et domene antistoff), og ethvert annet modifisert konfigurasjon av immunoglobulinmolekylet som omfatter et antigengjenkjennende sete ifølge oppfinnelsen, inkluderende glykosyleringsvarianter av antistoffene, aminosyresekvensvarianter av antistoffene, og kovalent modifisert antistoff.

I noen utførelser er anti-CGRP antagonist antistoffet et antistoff G1 (som beskrevet heri). Anti-CGRP antagonist antistoffet aminosyresekvensen av tungkjede variabel region vist i figur 5 (SEQ ID NO:1) og aminosyresekvensen av lettkjede variabel region vist i figur 5 (SEQ ID NO: 2).

I noen utførelser omfatter antistoffet en modifisert konstant region, så som en konstant region som er immunologisk inert som beskrevet heri. I noen utførelser er den konstante region modifisert som beskrevet i Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; og WO99/58572. I andre utførelser omfatter antistoffet en human tungkjede IgG2 konstant region omfattende følgende mutasjoner: A330P331 til S330S331 (aminosyrenummerering med referanse til villtype IgG2 sekvens) Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624.

I noen utførelser omfatter antistoffet en konstant region av IgG4 omfattende følgende mutasjoner: E233F234L235 til P233V234A235. I andre utførelser er den konstante region aglykosylert fra N-koblet glykosylering. I noen utførelser er den konstante region aglykosylert for N-koblet glykosylering ved mutasjon av oligosakkarid tilfestingsenheten (så som Asn297) og/eller flankeringsenheter som er del av N-glykosylerings gjenkjenningssekvensen i den konstante region. I noen utførelser er den konstante region aglykosylert fra N-koblet glykosylering. Den konstante region kan aglykosyleres for n-koblet glykosylering enzymatisk eller ved uttrykking i en glykosyleringsmanglende vertcelle.

Bindingsaffiniteten (KD) av et anti-CGRP antagonist antistoff til CGRP (så som human α-CGRP) kan 0,02 til ca 200 nM. I noen utførelser er bindingsaffiniteten ca 200 nM, ca 100 nM, ca 50 nM, ca 10 nM, ca 1 nM, ca 500 pM, ca 100 pM, ca 60 pM, ca 50 pM, ca 20 pM, ca 15 pM, ca 10 pM, ca 5 pM, eller ca 2 pM. I noen utførelser er bindingsaffiniteten mindre enn ca 250 nM, ca 200 nM, ca 100 nM, ca 50 nM, ca 10 nM, ca 1 nM, ca 500 pM, ca 100 pM, eller ca 50 pM.

En måte å bestemme bindingsaffiniteten av antistoff til CGRP er ved å måle bindingsaffiniteten monofunksjonelle Fab-fragmenter av antistoffet. For å oppnå monofunksjonelle Fab-fragmenter kan et antistoff (for eksempel IgG) smeltes med papain eller uttrykkes rekombinant. Affiniteten av et anti-CGRP Fab-fragment av et antistoff kan måles med overflateplasmonressonans (Biacore3000™ overflate plasmonressonans (SPR system), Biacore, INC, Piscataway NJ) utstyrt med preimmobilisert streptavidin sensor chips (SA) ved anvendelse av HBS-EP kjørebuffer (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % vol/vol surfaktant P20). Biotinylert human CGRP (eller en annen CGRP) kan fortynnes inn i HPS-EP buffer til en konsentrasjon på mindre enn 0,5 μg/ml og injiseres over de individuelle chip-kanaler ved anvendelse av forskjellige kontakttider, for å oppnå to områder av antigentetthet, enten 50-200 responsenheter (RU) for detaljerte kinetiske studier eller 800-1000 RU for screeningsanalyser. Regenereringsstudier har vist at 25 mM NaOH i 25 % vol/vol etanol effektivt fjerner bundet Fab mens man holder aktiviteten av CGRP på chipen for over 200 injeksjoner.

Typisk, serielle fortynninger (i konsentrasjonsområdene fra 0,1- 10 x estimert KD) av rensete Fab-prøver injiseres i et min ved 100 μl/min og dissosiasjonstider opptil 2 timer tillates. Konsentrasjonene av Fab-proteinet bestemmes med ELISA og/eller SDS-PAGE elektroforese ved anvendelse av en Fab av kjent konsentrasjon (som bestemt ved aminosyreanalyser) som en standard. Kinetiske assosiasjonsrater (koff) og dissosiasjonsrater (koff) oppnås samtidig ved å tilpasse dataene globalt til en 1:1 Langmuir bindingsmodell (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6.99-110) ved anvendelse av BIA evaluation programmet. Likevekst dissosiasjonskonstanten (KD) verdier beregnes som koff / kon. Denne protokoll er hensiktsmessig for anvendelse ved bestemmelse av bindingsaffinitet av et antistoff til ethvert CGRP, inkluderende humant CGRP, CGRP av et annet pattedyr (så som mus CGRP, og rotte CGRP, primat CGRP), og likeledes forskjellige former av CGRP (så som ɑ og β formene). Bindingsaffinitet av et antistoff måles generelt ved 25 °C, men kan også måles ved 37 °C.

Antistoffene kan bindes til mange forskjellige bærere. Bærere kan være aktive og/eller inerte. Eksempler på godt kjente bærere inkluderer polypropylen, polystyren, polyetylen, dekstran, nylon, amylaser, glass, naturlige og modifiserte celluloser, polyakrylamider, agaroser og magnetitt. Naturen av bærere kan være enten løselig eller uløselig. Fagkyndige innen feltet vil kjenne til andre egnete bærere for binding av antistoff, eller vil være i stand til å sikre slike ved anvendelse av rutinemessig eksperimentering. I noen utførelser omfatter bæreren en enhet som er rettet mot myokardium.

C. Antistoff G1 og relaterte antistoff, polypeptider, polynukleotider, vektorer og vertceller.

Foreliggende oppfinnelse omfatter antistoff G1 og polynukleotidets omfattende sekvenser som koder for G1.

Anti-CGRP antagonist antistoff ifølge oppfinnelsen er karakterisert av enhver (en eller flere) med følgende karakteristika: (a) binder til CGRP; (b) blokkerer CGRP fra binding til dets reseptor(er), (C) blokkerer eller reduserer CGRP reseptoraktivering (inkluderende cAMP aktivering); (d) inhiberer CGRP biologisk aktivitet eller nedstrøms reaksjonsveier mediert med CGRP signaleringsfunksjon; (e) hindrer, lindrer, eller behandler ethvert aspekt av hodepine (for eksempel migrene); (f) øker klarning av CGRP; og (g) inhiberer (reduserer) CGRP syntese, produksjon eller frigivelse.

Således, anti-CGRP antagonisten ifølge oppfinnelsen kan omfatte enhver av følgende; (a) antistoff G1; (b) et fragment eller en region av antistoff G1; (c) en lettkjede og en tungkjede av antistoff G1 eller dets varianter vist i tabell 6; (e) en eller flere variable region(er) fra en lettkjed

CDR-porsjonen av antistoff G1 (inkluderende Chotia og Kabat CDRer) er i diagramform avbildet i figur 5. Bestemmelse av CDR-regioner er innen kompetansen til den fagkyndige. Det skal forstås at i noen utførelser kan CDRer være en kombinasjon av Kabat og Chotia CDR (også benevnt ”kombinerte CDRer” eller ”forlengete CDRer”). I noen utførelser er CDRene Kabat CDRene. I andre utførelser er CDRene Chotia CDRer. Med andre ord, i utførelser med mer enn en CDR kan CDRene være enhver av Kabat, Chotia, kombinasjon CDRer, eller kombinasjoner derav.

Bindingsaffinitet (KD) av et anti-CGRP antagonist antistoff til CGRP (så som human ɑ-CGRP) kan være ca 0,06 til ca 200 nM. I noen utførelser er bindingsaffiniteten enhver av ca 200 nM, 100 nM, ca 50 nM, ca 10 nM, ca 1 nM, ca 500 pM, ca 100 pM, ca 60 pM, ca 50 pM, ca 20 pM, ca 15 pM, ca 10 pM, ca 5 pM, eller ca 2 pM. I noen utførelser er bindingsaffiniteten mindre enn en av ca 250 nM, ca 200 nM, ca 100 nM, ca 50 nM, ca 10 nM, ca 1 nM, ca 500 pM, ca 100 pM, eller ca 50 pM.

Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å fremstille enhver av disse anti-CGRP antagonist antistoffifølge oppfinnelsen. Anti-CGRP antagonist antistoffene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles med prosedyrer kjent innen fagfeltet. Polypeptidene av antistoffene, spesielt kortere polypeptider opptil ca 50 aminosyrer, fremstilles konvensjonelt med kjemisk syntese. Fremgangsmåter for kjemisk syntese er godt kjent innen fagfeltet, og er kommersielt tilgjengelig. For eksempel, et antistoff kan produseres med en automatisert polypeptidsyntetiserer som benytter en faststoffasemetode. Se også US patent nr 5,807,715; 4,816,567; and 6,331,415.

I et ytterligere alternativ kan antistoffene fremstilles rekombinant ved anvendelse av prosedyrer som er godt kjent innen fagfeltet. I en utførelse, et polynukleotid omfatter en sekvens som koder for tungkjeden og/eller lettkjede variabel region av antistoff G1 vist i SEQ ID NO: 9 og SEQ ID NO: 10. I en annen utførelse, polynukleotidet omfatter nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO: 9 og SEQ ID NO: 10 klonet inn i en eller flere vektorer for ekspresjon eller propagering. Sekvensen som koder for antistoffet av interesse kan opprettholdes i en vektor i en vertscelle og vertscellen kan deretter ekspanderes og fryses for fremtidig bruk. Vektorer (inkluderende ekspresjonsvektorer) og vertsceller er ytterligere beskrevet heri.

Oppfinnelsen omfatter også enkeltkjede variable regionfragmenter (scFv) av anti-CGRP antagonist antistoff ifølge oppfinnelsen, så som G1. Enkeltkjede variabel region fragmenter fremstilles ved å koble lette og/eller tungkjede variable regioner ved anvendelse av et kort linking peptid. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Et eksempel på et linking peptid er (GGGGS)3 som danner bro tilnærmet 3,5 nM mellom karboksyterminalen av en variabel region og aminoterminalen av den andre variable region. Linkere med andre sekvenser har blitt konstruert og anvendes. Bird et al. (1988). Linkere kan deretter modifiseres på ytterligere funksjoner, så som tilfesting av medikamenter eller tilfesting til faststoffstøttemedier. Enkeltkjede varianter kan produseres enten rekombinant eller syntetisk. For syntetisk provisjon av scFv kan en automatisert syntetiserer anvendes. For rekombinant produksjon av scFv kan et egnet plasmid inneholdende polynukleotid som koder for scFv introduseres i en egnet vertscelle, enten aukariot, så som gjær, plante, insekt eller mammalsk celle, eller prokariot, så som E-coli. Polynukleotider som koder for de aktuelle scFv kan fremstilles ved rutinemessige manipulasjoner så som ligering av polynukleotider. Det resulterende scFV kan isoleres ved anvendelse av standard proteinrenseteknikker kjent innen fagfeltet.

I noen utførelser av oppfinnelsene kan anti-CGRP antagonist antistoffet omfatte en modifisert kontakt region, så som en konstant region som er immunologisk inert eller partielt inert, for eksempel som ikke utløser komplementmediert lysering, som ikke stimulerer antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC), eller som ikke aktiverer mikroglia; eller har reduserte aktiviteter (sammenlignet med ikke-modifisert antistoff) i en eller flere av følgende: å utløse komplementmediert lysering, stimulere antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC) eller aktivere mikroglia.

Forskjellige modifiseringer av den konstante region kan anvendes for å oppnå optimalt nivå og/eller kombinasjon av effektorfunksjoner. Se for eksempel Morgan et al., Immunology 86:319-324 (1995); Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969 (1996); Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). I noen utførelser er den kontante region modifisert som beskrevet i Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; PCT Application No.

PCT/GB99/01441; og/eller UK Patent Application No.9809951.8. I andre utførelser omfatter anti-CGRP antagonist antistoffet en human tungkjede IgG2 konstant region omfattende følgende mutasjoner: A330P331 til S330S331 (aminosyrenummerering med referanse til villtype IgG2 sekvens). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. I andre utførelser er den konstante region aglykosylert for N-koblet glykosylering. I noen utførelser er den konstante region aglykosylert for N-koblet glykosylering ved å mutere den glykosylerte aminosyreenhet eller flankerende enheter som er del av N-glykosylerings gjenkjenningssekvensen i den konstante region. For eksempel kan N-glykosyleringssetet N297 glykosyleres til A, Q, K eller H. Se Tao et al., J.

Immunology 143: 2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). I noen utførelser er den kontakte region aglykosylert for N-koblet glykosylering. Den konstante region kan være aglykosylert for N-koblet glykosylering enzymatisk (så som ved fjerning av karbohydrat med enzymet PNGase), eller ved ekspresjon i en glykosyleringsmanglende vertscelle.

Andre antistoffmodifiseringer inkluderer antistoffer som har blitt modifisert som beskrevet i PCT publikasjon WO99/58572, av 18. november 1999. Disse antistoff omfatter, i tillegg til et bindingsdomene rettet ved målmolekylet, en effektordomene som har en aminosyresekvens i hovedsak homolog til hele eller deler av en konstant domene av et humant immunoglobulin tungkjede. Disse antistoff er i stand til å binde til målmolekylet uten å utløse signifikant komplementavhengig lysering, eller cellemediert ødeleggelse av målet. I noen utførelser er effektordomene i stand til spesifikk binding av FcRn og eller FcγRIIb. Disse er typisk basert på kimeriske domener avledet fra to eller flere humane immunoglobulin tungkjede CH2 domener. Antistoff modifisert på denne måte er spesielt egnet for anvendelse i kronisk antistoff terapi, for å unngå inflammasjon og andre skadelige reaksjoner på konvensjonell antistoffterapi.

Sammensetninger omfattende antistoff avledet fra G1 kan være konjugert (for eksempel koblet) til et middel som fremmer kobling til et faststoffstøttemedium (så som biotin eller avidin). For enkelhets skyld, referanse vil generelt bli gjort til G1 eller antistoff med den forståelde at disse fremgangsmåter kan appliseres til en vilkårlig av de CGRP bindingsutførelser beskrevet heri. Konjugering refererer generelt til å koble disse komponenter som beskrevet heri. Linking (som generelt er å feste disse komponenter i nær assosiasjon i det minste for administrering) kan oppnås på en rekke måter. For eksempel, en direkte reaksjon mellom et middel og et antistoff er mulig idet hver oppviser en substituent i stand til å reagere med den andre. For eksempel, en nukleofilgruppe, så som en amino eller sulfidydrylgruppe, på en kan være i stand til å reagere med en karbonyl-inneholdende gruppe, så som en anhydrid eller et syrehalid, eller med en alkylgruppe inneholdende en god avgangsgruppe (for eksempel et halid) på den andre.

Et anti-CGRP antagonist antistoff ifølge oppfinnelsen kan kobles til et markørmiddel (alternativt benevnt ”markør”) så som et fluoriserende molekyl, et radioaktivt molekyl eller andre markører kjent innen fagfeltet. Markører kjent innen fagfeltet vil generelt tilveiebringe (enten direkte eller indirekte) et signal.

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolerte polynukleotider som koder for anti-CGRP antagonist antistoffene av polypeptidene ifølge oppfinnelsen (inkluderende et antistoff omfattende polypeptidsekvensen av lettkjede og tungkjede variabel regioner vist i figur 5), omfattende vektorer eller vertsceller omfattende polynukleotidet.

Således, oppfinnelsen tilveiebringer polynukleotider som koder for anti-CGRP antagonist antistoffene ifølge oppfinnelsen omfattende polynukleotider som koder for enhver av følgende: (a) antistoff G1; (b) et fragment eller en region av antistoffet G1; (c) en lettkjede og en tungkjede av antistoff G1 av den variable region fra en lettkjede og en tungkjede av antistoff G1 eller dets varianter vist i tabell 6; (f) en eller flere CDRer (1, 2, 3, 4, 5 eller 6 CDRer) av antistoff G1. I noen utførelser omfatter polynukleotidet enten en av eller begge polynukleotidene vist i SEQ ID NO:9 og SEQ ID NO:10.

I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polynukleotider som koder for enhver av anti-CGRP antagonist antistoffene ifølge oppfinnelsne.

Polynukleotidene kan fremstilles med prosedyrer kjent innen fagfeltet.

Polynukleotider som er komplementære til enhver av slike sekvenser er også omfattet av foreliggende oppfinnelse. Polynukleotider kan være enkelttrådet (kodene eller antisense) eller dobbelttrådet, og kan være DNA (genomisk, cDNA eller syntetisk) eller RNA- molekyler. RNA-molekyler inkluderer HnRNA-molekyler, som inneholder introner, og korresponderer til et DNA-molekyl på en en-til-en måte, og RNA-molekylet som ikke inneholder introner. Ytterligere kodende eller ikke-kodende sekvenser kan, men trenger ikke, være foreliggende innen et polynukleotid ifølge oppfinnelsen, og et polynukleotid kan, men trenger ikke, være koblet til andre molekyler og/eller støttemateriale.

Egnete kloningsvektorer kan konstrueres i samsvar med standard teknikker, eller kan utvelges fra et stort antall kloningsvektorer tilgjengelig innen fagfeltet. Idet kloningsvektoren som utvelges kan varierer i samsvar med vertscellen tiltenkt å anvendes, vil nyttige kloningsvektorer generelt ha evne til å selvreplikere, kan oppvise et enkelt mål for et bestemt restriksjonsendonuklease og/eller kan være gener for en markør som kan anvendes i å selektere kloner inneholdende vektoren. Egnete eksempler inkluderer plasmider og bakterielle viruser, for eksempel pUC18, pUC19, Bluescript (e.g., pBS SK+) og dets derivater, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, fag DNAser, og shuttle vektorer så som pSA3 og pAT28. Disse og mange andre kloningsvektorer er tilgjengelige fra kommersielle leverandører så som BioRad, Strategene, og Invitrogen.

Ekspresjonsvektorer er generelt replikerbare polynukleotidkonstrukter som inneholder et polynukleotid som koder for anti-CGRP antagonist antistoffet i samsvar med oppfinnelsen. Det er underforstått at en ekspresjonsvektor må være replikerbar i vertsceller enten som episomer eller som en integrert del av det kromosomale DNA. Egnete ekspresjonsvektorer inkluderer men er ikke begrenset til plasmider, virale vektorer, inkluderende adenovirus, adenoassosierte virus, retrovirus, kosmider og ekspresjonsvektor(er) beskrevet i PCT publikasjon WO87/04462.

Vektorkomponenter kan generelt inkluderes, men er ikke begrenset til, en eller flere av følgende: en signalsekvens; et replikasjonsorego; en eller flere markørgener; egnete transkripsjonsregulerende elementer (så som promotorer, enhensere og terminator). For ekspresjon (det vil si translasjon) er en eller flere translasjonsregulerende momenter vanligvis også nødvendig, så som Ribisombindende seter, translasjonsinjiserende seter, og stopp kodon.

Vektorer inneholdende polynukleotidene som koder for anti-CGRP antagonist antistoffet ifølge oppfinnelsen kan introduseres inn i vertscellen med enhver av et antall egnete midler, inkluderende elektroporering, transfeksjon som benytter kalsiumklorid, rubidiumklorid, kalisumfosfat, DEAE-dekstran eller andre substanser; mikroprosjektilbombadering; lipofeksjon; og infeksjon (hvor vektoren er et infeksiøst middel så som et vaksinevirus). Valg av introduserende vektorer eller polynukleotider vil ofte avhenge av egenskapene til vertscellen.

Oppfinnelsen tilveiebringer også vertsceller omfattende enhver av polynukleotidene som koder for anti-CGRP antagonist antistoffet ifølge oppfinnelsen. Enhver av vertscelle i stand til å overuttrykke heterologe DNAer kan anvendes for formålet med å isolere genene som koder for antistoff, polypeptid eller protein av interesse. Ikkebegrensende eksempler på mammalske vertsceller inkluderer men er ikke begrenset til COS, HeLa, og CHO celler. Se også PCT publikasjon. WO 87/04462. Egnete ikkemammalske vertsceller inkluderer prokariote (så som E-coli eller B-subtillis) og gjær (så som S. cerevisae, S. pombe; eller K. lactis). Fortrinnsvis uttrykker vertscellene CDNAene ved et nivå av ca 5 ganger høyere, mer fortrinnsvis 10 ganger høyere, enda mer foretrukket 20 gangerhøyere enn for det korresponderende endogene antistoff eller protein av interesse, dersom foreliggende, i vertscellen. Screening av vertscellene for en spesifikk binding til A 1-40 effektueres med en immunanalyse eller FACS. En celle som overuttrykker anti-CGRP antagonist antistoffet av interesse kan identifiseres.

Eksempler

Eksempel 1: Generering og karakterisering av monoklonale antistoff rettet mot CGRP.

Generering av anti-CGRP antistoff. For å generere anti-CGRP antistoff som har kryss species reaktivitet for rotte og menneske CGRP, ble mus immunisert med 25-100 µg av human α-CGRP eller β-CGRP konjugert til KLH i adjuvant (50 µl per fotpote, 100 µl totalt per mus) ved forskjellige intervaller. Immuniseringen ble generelt utført som beskrevet i Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Methods 124:95-102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol. Methods 121:157-166; og Wicher K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.89:128-135. Musene ble først immunisert med 50 μg human α-CGRP eller β-CGRP konjugert til KLH i CFA (komplett Freund's adjuvant). Etter 21 dager ble musene immunisert for andre gang med 25 μg human β-CGRP (for mus som først var immunisert med human α-CGRP) eller α-CGRP (for mus som først var immunisert med human β-CGRP) konjugert til KLH i IFA (ukomplett Freund's adjuvant). Tjuetre dager etter den andre immunisering ble den tredje immunisering utført med 25 μg rotte α-CGRP konjugert til KLH i IFA. Ti dager senere ble antistoff titer testet ved anvendelse av ELISA. Fjerde immunisering ble utført med 25 μg av peptidet (rotte α-CGRP-KLH) i IFA 34 dager etter den tredje immunisering. Final booster ble utført med 100 μg løselig peptid (rotte α-CGRP) 32 dager etter den fjerde immunisering.

Splenocytter ble opptatt fra den immuniserte mus og fusjonert med NSO myelomaceller i et forhold av 10:1, med polyetylenglykol i 1500. Hybridene ble utsådd i 96 brønns plater i DMEM inneholdende 20 % hesteserum og 2-oksaloacetat/pyruvat/-insulin (Sigma), og hypoksantin/aminoefterin/tymidin-seleksjon startet. Ved dag 8 ble 100 µl DMEM inneholdende 20 % hesteserum tilsatt til alle brønnene. Supernatantene fra hybridene ble screenet ved anvendelse av antistoff fangende immunoanalyse. Bestemmelse av antistoffklasse ble utført med klassespesifikke andre antistoff.

Et panel av monoklonal antistoffproduserende cellelinjer ble selektert basert på deres binding til human og rotte CGRP for ytterligere karakterisering. Disse antistoff og karakteristika er vist nedenfor i tabeller 2 og 3.

Rensing og preparering av Fab-fragment. Monoklonale antistoff selektert for ytterligere karakterisering ble renset fra supernatanter av hybridomakulturer ved anvendelse av protein A affinitets kromatografi. Supernatantene ble ekvilibrert til pH 8. Supernatantene ble deretter applisert på protein A kolonne (MabSelect (Amersham Biosciences # 17-5199-02) ekvilibrert med PBS til pH 8. Kolonnen ble vasket med 5 kolonnevolum PBS, pH 8. Antistoffene ble eluert med 50 mM sitratfosfatbuffer, pH3. De eluerte antistoff ble nøytralisert med 1M fosfatbuffer, pH 8. De rensete antistoff ble dialysert med PBS, pH 7,4. Antistoffkonsentrasjonene ble bestemt med SDS-PAGE, ved anvendelse av en murin monoklonal antistoff standardkurve.

Fabene ble fremstilt med papain proteolyse av fullstendig antistoff ved anvendelse av Immunopure Fab kitt (Pierce # 44885) og renset med strømning gjennom protein A kromatografi ved å følge leverandørens instruksjoner. Konsentrasjonene ble bestemt med ELISA og/eller SDS-PAGE elektroforese ved anvendelse av en standard Fab av kjent konsentrasjon (bestemt med aminosyreanalyser), og med A280 ved anvendelse av 10D=0,6 mg/ml (eller teoretisk ekvivalent basert på aminosyresekvensen).

Affinitetsbestemmelse av Faber. Affiniteten av de anti-CGRP monoklonale antistoff ble bestemt ved enten 25 °C eller 37 °C ved anvendelse av Biacore 3000™ overflate plasmonresonans (SPR) systemet (Biacore, INC, Piscataway NJ) med leverandørens egen kjørebuffer, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % vol/vol polysorbat P20). Affinitet ble bestemt ved å fange N-terminalt biotinylert CGRP peptider (tilgjengelig fra GenScript Corporation, New Jersey eller Global Peptide Services, Colorado) via preimmobilisert streptavidin på SA-chip, og måle bindingskinetikk av antistoff Fab titrert over CGRP-overflaten. Biotinylert CGRP ble fortynnet i HBS-EP og injisert over en konsentrasjon på mindre enn 0,001 mg/ml.

Ved anvendelse av variabel strømningstid over de individuelle chip-kanaler, ble to områder av antigen tetthet oppnådd: < 50 responsenheter (RU) for detekterte kinesiske studier og ca 800 RU for konsentrasjonsstudier og screening. To- eller tregangers serielle fortynninger typisk ved konsentrasjoner i området 1 μM – 0,1 nM (med sikte på 0,1 - 10 x estimert KD)av rensete Fab-fragmenter ble injisert i ett minutt ved 100 μl/min og dissosiasjonstider på 10 minutter ble tillatt. Etter hver bindingssyklus ble overflater regenerert med 25 mM NaOH i 25 % vol/vol etanol, som ble tolerert over 100 sykluser. Kinetiske assosiasjonshastighet ((kon) og dissosiasjonshastighet (koff) ble oppnådd samtidig ved å tilpasse dataene til en 1:1 Langmuir bindingsmodell (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) ved anvendelse av BIA evalueringsprogrammet. Globale dissosiasjonskonstanter (KD) eller ”affiniteter” ble beregnet fra forholdet KD = koff/kon. Affinitet av de murine Fab-fragmenter er vist i tabeller 2 og 3.

Epitopkartlegging av de murine anti-CGRP antistoff. For å bestemme den epitop som anti-CGRP antistoff binder til på human α-CGRP ble bindingsaffiniteter av Fabfragmentene til forskjellige CGRP-fragmenter målt som beskrevet over ved å fange N-terminalt biotinylert CGRP-fragment aminosyrer 19-37 og aminosyrer 25-37 på en SA sensor chip. Figur 1 viser deres bindingsaffiniteter målt ved 25 °C. Som vist i figur 1, alle antistoff, med unntak av antistoff 4901, binder til humane α-CGRP fragmenter 19-37 og 25-37 med affinitet tilsvarende deres bindingsaffinitet til fullengde human α-CGRP (1-37). Antistoff 4901 binder til human α-CGRP fragment 25-37 med seks ganger lavere affinitet enn binding til fullengde human α-CGRP fragment, som hovedsakelig skyldes et tap av off-hastighet. Dataene indikerer at disse anti-CGRP antistoff generelt binder til den C-terminale ende av CGRP.

Allanin-skanning ble utført for ytterligere å karakterisere aminosyrer i human α-CGRP involvert i binding av anti-CGRP antistoff. Forskjellige varianter av human α-CGRP med enkle allaninsubstitueringer ble generert med peptidsyntese. Deres aminosyresekvenser er vist i tabell 4 sammen med alle de andre peptider anvendt i Biacore analysene. Affiniteter av Fab-fragmenter av anti-CGRP antistoffene til disse varianter ble bestemt ved anvendelse av Biacore som beskrevet over. Som vist i figur 1, alle 12 antistoff rettet seg mot en C-terminal epitop, hvor aminosyre F37 er den kritiske enhet. Mutasjon av F37 til alanin senket signifikant affiniteten eller fullstendig slo ut binding av anti-CGRP antistoff til peptidet. Den nest mest viktige aminosyreenhet er G33, men kun høyaffinitetsantistoffene (7E9, 8B6, 108A og 7D11) ble påvirket av allaninerstatning ved denne posisjon. Aminosyreenhet S34 spiller også en signifikant, men i mindre grad funksjon i binding av disse fore høyaffinitets antistoff.

Tabell 2.

Karakteristika av anti-CGRP monoklonale antistoff sin binding til human α-CGRP og deres antagonist aktivitet.

Bemerk: Antistoff 4901 er kommersielt tilgjengelig (Sigma, Produkt No. C7113). n.d. = ikke bestemt

Tabell 3.

Karakterisering av de anti-CGRP monoklonale antistoffs' binding til rotte α-CGRP og antagonist aktivitet

"n.d." indikerer at ingen test ble utført for antistoffet.

Tabell 4.

Aminosyresekvenser av humane α-CGRP fragmenter (SEQ ID NO:15-40) og relaterte peptider (SEQ ID NO:41-47). Alle peptider er C-terminalt amidert med unntak av SEQ ID NO:36-40. Enheter som er uthevet indikerer punktmutasjoner.

Eksempel 2. Screening av anti-CGRP antagonist antistoff ved anvendelse av in vitro analyser.

Murine anti-CGRP antistoff ble ytterligere screenet for antagonist aktivitet in vitro ved anvendelse av cellebasert cAMP aktivitetsanalyse og bindingsanalyse.

Antagonist aktivitet målt med cAMP analyse. 5 μl human eller rotte α-CGRP (final konsentrasjon 50 nM) i nærvær eller fravær av et anti-CGRP antistoff (final konsentrasjon 1-3000 nM), eller rotte α-CGRP eller human α-CGRP (final konsentrasjon 0,1 nM - 10 μM; som en positiv kontroll for cAMP aktivering) ble dispensert til en 384-brønns plate plate (Nunc, Cat. No.264657). Ti mikroliter av celler (humane SK-N-MC dersom human α-CGRP anvendes, eller rotte L6 fra ATCC dersom rotte α-CGRP anvendes) i stimuleringsbuffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, og 500 μM 3-Isobutyl-1-metylksantin (IBMX)) ble tilsatt til brønnene i platen. Platen ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter.

Etter inkubering ble cAMP-aktivering utført ved anvendelse av HitHunter<TM>enzymfragment kompletteringsanalyse (Applied Biosystems) v ed å følge leverandørens instruksjoner. Analysen er basert på et genetisk konstruert β-galaktosidase enzym som består av to fragmenter, benevnt enzymaktivator (EA) og enzymdonor (ED). Idet de to fragmenter er separert er enzymet inaktivt. Idet fragmentene er sammen kan de rekombineres spontant og danne aktivt enzym med en prosess benevnt komplementering. EFC-analyseplattformen benytter et ED CRP peptidkonjugat hvor cAMP gjenkjennes av anti-cAMP. Dette ED-fragment er i stand til resassosiering med EA for å danne aktivt enzym. I analysen titreres anti-cAMP antistoffet optimalt for å binde ED cAMP konjugater og inhibere enzymdannelse. Nivåer av cAMP i cellelysatprøver konkluderer med ED cAMP-konjugater for binding til anti-Camp antistoffet. Mengden av fritt ED-konjugat i analysen er proporsjonal til konsentrasjonen av cAMP. Derfor måles cAMP med dannelse av aktivt enzym som kvantifiseres med turnover av β-galaktosidase kommuniserende substrat. cAMP aktiveringsanalysen ble utført ved tilsetning av 10 μl lyseringsbuffer og anti-cAMP antistoff (1:1 forhold) etterfulgt av inkubering ved romtemperatur i 60 min. Deretter ble 10 μl ED cAMP reagens tilsatt til hver brønn, og det ble inkubert i 60 minutter ved romtemperatur. Etter inkuberingen ble 20 μl EA-reagens og CL-blanding (inneholdende substratet) (1:1 forhold) tilsatt til hver brønn, og det ble inkubert i 1-3 timer eller natten over ved romtemperatur. Platen ble avlest ved 1 sekund/brønn på PMT-instrument eller 30 sekunder/plass på imager. Antistoffene som inhiberer aktivering av cAMP med α-CGRP ble identifisert (referert til som ”ja”) i tabeller 2 og 3 ovenfor. Dataene i tabeller 2 og 3 indikerer at antistoffene som oppviser antagonistaktivitet i analysen generelt har høy affinitet. For eksempel, antistoff som har KD (bestemt ved 25 °C) på ca 80 nM er mindre til human α-CGRP eller som har KD (bestemt ved 37 °C) på ca 47 nM eller mindre til rotte α-CGRP viste antagonist aktivitet i denne analysen.

Radioligandbindingsanalyse. Bindingsanalyse ble utført for å måle IC50 av anti-CGRP antistoff i blokkering av CGRP fra binding til reseptoren som beskrevet tidligere. . Zimmermann et al., Peptides 16:421-4, 1995; Mallee et al., J. Biol. Chem.

277:14294-8, 2002.

Membraner (20 μg) fra SK-N-MC celler ble inkubert i 90 minutter ved romtemperatur i inkuberingsbuffer (50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 5 mM MgCL2, 0,1 % BSA) inneholdende 10 pM<125>I-human α-CGRP i et totalt volum av 1 ml. For å bestemme inhiberingskonsentrasjoner (IC50). Ble antistoff eller umerket CGRP (som en kontroll), fra en ca 100 gangers høyere forrådsløsning oppløst ved forskjellige konsentrasjoner i inkuberingsbufferen og inkubert for samme tid med membranet og 10 pM og<125>I-human α-CGRP. Inkubering ble terminert ved filtrering gjennom et glassmikrofiberfilter (GF/B, 1 μm) som har blitt blokkert med 0,5 % polyetylemimin. Doseresponskurver ble plottet og Ki verdier ble bestemt ved anvendelse av ligningen Ki = IC50/(1+( (ligand )/KD); hvor likevektsdissosiasjonskonstanten KD = 8 pM for human α-CGRP til CGRP1 reseptor som foreliggende i SK-N-MC celler, og Bmax = 0,025 pmol/mg protein. Den rapporterte IC50 verdi (i termer av IgG molekyler) ble omdannet til bindingsseter (ved å multiplisere den med 2) slik at den kan sammenlignes med affinitetene (KD) bestemt med Biacore (se tabell 2).

Tabell 2 viser IC50 av murine antistoff 7E9, 8B6, 6H2 og 4901. Dataene indikerer at antistoff affinitet generelt er korrelert med IC50: hvor antistoff med høyere affinitet (lavere KD verdier) har lavere IC50 i radioligandbindingsanalysen.

Eksempel 3: Effekt av anti-CGRP antagonist antistoff på vasodilatering i hud indusert med stimulering av rotte safenøs nerve.

For å teste antagonist aktivitet av anti-CGRP antistoff ble effekten av antistoffene på hud-vasodilatering ved stimulering av rotte safenøs nerve testet ved anvendelse av en rottemodell som er beskrevet tidligere. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772-776, 1993. I denne rottemodell vil elektrisk stimulering av safenøs nerve indusere frigjørelse av CGRP fra nerveendene, resulterende i en økning i gjennomstrømning av blod i hud. Blodgjennomstrømning i fothud av hannkjønn Sprague Dwaley rotter (170-300 g, fra Charles River Hollister) ble målt etter stimulering av safenøs nerve. Rottene ble opprettholdt under anestesi med 2 % isofluran.

Bretylium tosylat (30 mg/kg administrert i.v) ble gitt ved starten av eksperimentet for å minimere vasokonstruksjon på grunn av ledsagende stimulering av sympatetiske fibre av den safenøse nerve. Kroppstemperaturen ble opprettholdt ved 37 °C ved anvendelse av en rektal probe termostatisk tilkoblet til en temperaturkontrollert vannpute. Forbindelser, inkluderende antistoff, positiv kontroll (CGRP 8-37) og vehikkel (PBS, 0,01 % Tween 20) ble gitt intravenøst gjennom den høyre femorale vene, med unntak av eksperimentet vist i figur 3 hvor testforbindelsen og kontroll ble injisert gjennom halevene, og for eksperimenter vist i figur 2A og 2B, hvor antistoff 4901 og 7D11 ble injisert intraperitonialt (IP). Positiv kontrollforbindelse CGRP 8-37 (vasodilatasjonsantagonist), ble på grunn av sin korte halveringstid gitt 3-5 min før nervestimulering ved 400 nM/kg (200 μl). ). Tan et al., Clin. Sci.89:656-73, 1995. Antistoffene blir gitt i forskjellige doseringer (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg og 25 mg/kg).

For eksperimenter vist i figur 2A og 2B ble antistoff 4901 (25 mg/kg, antistoff 7D11 (25 mg/kg), vehikkelkontroll (PBS med 0,01 % Tween 20) administrert intraperitonialt (IP) 72 timer før stimulering med elektrisk puls. For eksperiment vist i figur 3 ble antistoff 4901 (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg eller 25 mg/kg eller vehikkel kontroll (PBS med 0,01 % Tween 20) ble administrert intravenøst 24 timer før stimulering ved elektrisk puls. Etter administrering av antistoffene eller vehikkelkontroll, ble den safenøse nerve av det høyre bakben eksponert kirurgisk, kuttet proksimalt og dekket med plastomslag for å hindre tørking. En laser doppler-probe ble plassert over den medio-dorsale side av bakputehuden, som er regionen som er innervert av den safenøse nerve. Hudblodstrømning, målt som blodcellefluks, ble monitorert med et laser doppler – strømningsmåler. Idet en stabil baselinjefluks (mindre enn 5 % variasjon) var etablert i minst 5 min, ble nerven plassert over platina bipolare elektroder og elektrisk stimulert med 60 pulser (2 Hz, 10 V, 1 ms, i 30 sek) og deretter igjen 20 minutter senere. Kumulativ forandring i hudblodstrømning ble stimulert med arealet under fluks-tid-kurve (AUS, som er lik forandringen i fluks multiplisert med forandringen i tid) for hver fluksrespons i forhold til elektrisk pulsstimulering. Gjennomsnitt av blodstrømrespons til de to simuleringer ble tatt. Dyrene ble holdt under anestesi på en periode på fra 1 til 3 timer.

Som vist i figurer 2A og figur 2B ble blodstrømningsøkning stimulert ved å forsyne elektriske pulser på safenøs nerve inhibert i nærvær av CGRP 8-37 (400 nM/kg, administrert i.V), antistoff 4901 (25 mg/kg, administrert i.p), eller antistoff 7D11 (25 mg/kg, administrert i-v) sammenlignet med kontroll. CGRP 8-37 ble administrert 3-5 min før stimulering av safenøs nerve; og antistoff ble administrert 72 timer før stimulering av safenøs nerve. Som vist i figur 3, blodstrømningsøkning stimulert ved å applisere elektriske pulser på safenøs nerve ble inhibert ved nerve av antistoff 4901 i forskjellige doseringer (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg og 25 mg/kg) administrert intravenøst ved 24 t før stimulering av safenøs nerve.

For eksperimenter vist i figur 4A og 4B ble den safenøse nerve eksponert kirurgisk før administrering av antistoff. Den safenøse nerve av den høyre bakfot ble eksponert kirurgisk, kuttet proksimalt og dekket med plastomslag for å hindre tørking. En laser doppler-probe ble plassert over den mediodorsale side av bakpotehuden, som er den region som er invertert av den safenøse nerve. Hudblodstrømning, målt som blodcellefluks, ble monitorert med en laser doppler-strømningsmåler.30 til 45 minutter etter injeksjon av bretylium tosylat, idet en stabil baselinjefluks (mindre enn 5 % variasjon) var etablert i minst 5 min, ble nerven plassert over platina bipolare elektroder og elektrisk stimulert (2Hz, 10 V, 1 ms i 30 sek) og igjen 20 minutter senere. Gjennomsnitt av blodstrømfluks respons til disse to stimuleringer ble anvendt for å etablere baselinjerespons (tid 0) til elektrisk stimulering. Antistoff 4901 (1 mg/kg eller 10 mg/kg) antistoff 7E9 (10 mg/kg), antistoff 8B6 (10 mg/kg) eller vehikkel (PBS med 0,01 % Tween 20) ble deretter administrert intravenøst (i.v).

Nerven ble deretter stimulert (2 Hz, 10 V, 1 ms, i 30 sek) ved 30 min, 60 min, 90 min og 120 min etter administrering av antistoff eller vehikkel. Dyrene ble holdt under anestesi i en periode på tilnærmet 3 timer. Kumulativ forandring i hudblodstrømning ble estimert av arealet under fluks-tid-kurven (AUC, som er lik forandring i fluks multiplisert med forandring i tid) for hver fluksrespons til elektrisk pulsstimuleringer.

Som vist i figur 4A, blodstrømningsøkning stimulert ved å administrere elektriske pulser på safenøs nerve ble signifikant inhibert av nærvær av antistoff 49011 mg/kg administrert i.v, idet stimulering med elektrisk puls ble applisert ved 60 min, 90 min og 120 min etter administrering av antistoff, og blodstrømningsøkning stimulert ved å applisere elektriske pulser på safenøs nerve ble signifikant inhibert ved nærvær av antistoff 490110 mg/kg administrert i.v, idet elektrisk pulsstimulering ble aktivisert ved 30 min, 60 min, 90 min og 120 min etter antistoff administrering. Figur 4B viser at blodstrømningsøkning stimulert ved å applisere elektriske pulser på safenøs nerve ble signifikant inhibert ved nærvær av antistoff 7E9 (10 mg/kg, administrert i.v) idet elektrisk pulsstimulering ble applisert ved 30 min, 60 min, 90 min og 120 min etter antistoffadministrering, og ved nærvær av antistoff 8B6 (10 mg/kg, administrert i.v) idet elektrisk pulsstimulering ble applisert ved 30 min etter antistoffstimulering.

Disse data indikerer at antistoff 4901, 7E9, 7D11 og 8B6 er effektive i å blokkere CGRP-aktivitet som målt ved hud vasodilatasjon indusert med stimulering av rotte safenøs nerve.

Eksempel 4. Karakterisering av anti-CGRP antistoff G1 og dets varianter.

Aminosyresekvenser for tungkjede variabel region og lettkjede variabel region av anti-CGRP antistoff G1 er vist i figur 5. De følgende metoder ble anvendt for ekspresjon og karakterisering av antistoff G1 og dets varianter.

Ekspresjonsvektor som ble benyttet. Ekspresjon av Fab. Fragmentet av antistoffene var under kontroll av en IPTG-induserbar lacZ promotor tilsvarende til den som er beskrevet i Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vektor pComb3X), imidlertid inkluderte modifikasjoner addisjon og ekspresjon av følgende ytterligere domener: human kappa lettkjede konstant domene og CH1 konstant domene av IgG2 human immunoglobulin, Ig gamma-2 kjede C-region, proteinkatalognummer P01859; immunoglobulin kappa lettkjede (menneske), proteinkatalognummer CAA09181.

Preparering av småskala Fab. Fra E-coli transformert (enten ved anvendelse av elektroporeringskompetente TTG1-celler eller kjemisk kompetent topp 10 celler) med et Fab-bibliotek, ble enkelkolonier anvendt for å innokulere både en masterplate (agar LB karbenicillin (50 μg/ml) 2 % glukose) og en arbeidsplate (2 ml/brønn, 96 brønns plate) hvor hver brønn inneholdt1,5 ml LB karbenicillin (50 μg/ml 2 % glukose. En gasspermeabel adhesiv forsegling (ABgene, Surrey, UK) ble applisert til platen. Begge plater ble inkubert ved 30 °C i 12-16 t; og arbeidsplaten ble ristet kraftig. Masterplaten ble lagret ved 4 °C til behov, idet cellene fra arbeidsplaten ble penetrert (4000 rpm, 4 °, 20 min) og resuspendert i 1,0 ml 11+ karbenicillin (50 ug/ml) 0.5 mM IPTG for å indusere ekspresjon av Faber ved kraftig risting i 5 t ved 30 °C. Induserte celler ble sentrifugert ved 4000 rpm, 4 °C i 20 min, og resuspendert i 0,6 ml Biacore HB-SEP buffer (10 mM Hepes pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % v/v P20). Lysering av HB-SEP resuspenderte celler ble utført med frysing (-80 °C) og deretter tining ved 37 °C. Cellelysatet ble sentrifugert ved 4000 rpm, 4 °C i 1 time for å separere debris fra Fab-inneholdende supernatanter, som deretter ble filtrert (0,2 μm) ved anvendelse av Millipore MultiScreen Assay System 96-Well Filtration Plate og vakuum manifold. Biacore ble anvendt for å analysere filtrerte supernatanter ved injisere de over CGRPer på sensor chipen. Affinitetsselekterte kloner som uttrykker Faber ble reddet fra masterplaten, som tilveiebrakte templat DNA for PCR, sekvensering og plasmidpreparering.

Storskala Fab preparering. For å oppnå kinetiske parametere ble Faber uttrykt på større skala som følger. Erlenmeyer flasker inneholdende 150 ml LB karbenicillin (50 ug/ml) 2 % glukose ble innokkulert med 1 ml av en “starter” natten over kultur fra en affinitets selektert Fab-uttrykkende E-coli klon. Det resterende av start kulturen (tilnærmet 3 ml) ble anvendt for å preparere plasmid DNA (QIAprep mini-prep, Qiagen kit) for sekvensering og ytterligere manipulering. Den store kultur ble inkubert ved 30 °C med kraftig omrøring inntil en OD600nm på 1,0 ble oppnådd (typisk 12 - 16 t). Cellene ble pelletert ved sentrifugering ved 4000 rpm, 4 °C i 20 min, og resuspendert i 150 ml LB karbenicillin (50 ug/ml) 0,5 mM IPTG. Etter 5 t ekspresjon ved 30 °C ble cellene penetrert ved sentrifugering ved 4000 rpm, 4 °C i 20 min, resuspendert i 10 ml Biacore HBS-EP buffer, og lysert ved anvendelse av en enkel fryse (-80 °C)/tine (37 °C) syklus. Cellelysatene ble pelletert ved sentrifugering ved 4000 rpm, 4 °C i 1 time, og supernatanten ble samlet og filtrert (0,2 μm). De filtrerte supernatanter ble applisert på Ni-NTA superflow sefarose (Qiagen, Valencia. CA) kolonne ekvilibrert med PBS, pH 8, og deretter vasket med 5 kolonnevolum av PBS, pH 8. Individuelle Faber eluert i forskjellige fraksjoner med PBS (pH 8) 300 mM imidazol. Fraksjoner inneholdende Fabene ble samlet og dialysert i PBS, deretter kvantifisert med ELISA før affinitetskarakterisering.

Preparering av fullstendig antistoff. For ekspresjon av fullstendige antistoff ble tunge og lettkjede variable regioner klonet i mammalske ekspresjonsvektorer og transfektert ved anvendelse av lipofektamin inn i HEK 293 celler for transient ekspresjon. Antistoffene ble renset ved anvendelse av protein A ved anvendelse av standard metoder.

Vektor pDb.CGRP.hFcGI er en ekspresjonsvektor omfattende tungkjeden av G1 antistoffet, og er egnet for transient og stabil ekspresjon av tungkjeden. Vektor pDb.CGRP.hFcGI har nukleotidsekvenser korresponderende til de følgende regioner: murin cytomegalovirus promotor region (nukleotider 7-612); et syntetisk intron (nukleotider 613-1679); DHFR kodende region (nukleotider 688-1253; human vekst hormon signalpeptid (nukleotid 1899-1976), tungkjede variabel region av G1 (nukleotider 1977-2621); human tungkjede IgG2 konstant region inneholdende følgende mutasjoner: A330P331 til S330S331 (aminosyrenummerering med referanse til villtype IgG2 sekvens; se Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). Vektor pDb.CGRP.hFcGI ble deponert ved ATCC den 15. juli 2005, og ble tilegnet ATCC katalognummer PTA-6867.

Vektor pEb.CGRP.hKGI er en ekspresjonsvektor omfattende lettkjede av G1 antistoffet, og er egnet for transient ekspresjon av lettkjeden. Vektor Eb.CGRP.hKGI har nukleotidsekvenser korresponderende til følgende regioner: murin cytomegalovirus promotor region (nukleotider 2-613); human EF-1 intron (nukleotider 614-1149); human veksthormon signalpeptid (nukleotider 1160-1237); antistoff G1 lettkjede variabel region (nukleotider 1238-1558); human kappa kjede konstant region (nukleotider 1559-1882). Vektor pEb.CGRP.hKGI ble deponert ved ATCC den 15 kuli, 2005, og ble tilordnet ATCC katalognummer PTA-6866

Biacore analyse for affinitetsbestemmelse. Affiniteter av G1 monoklonalt antistoff og dets varianter ble bestemt ved enten 25 °C eller 37 °C ved anvendelse av Biacore3000™ overflate plasmonressonans (SPR) system. (Biacore, INC, Piscataway NJ). Affinitet ble bestemt ved å oppta N-terminalt biotinylert CGRP eller fragmenter via preimmobilisert streptavidin (SA sensor chip), og måle bindingskinetikk av antistoff G1 Fab-fragmenter eller varianter titrert over CGRP eller fragment på chipen. Alle Biacore-analyser ble utført i HBS-EP kjørebuffer (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % v/v polysorbat P20). CGRP-overflate ble preparert ved å fortynne N-biotinylert CGRP til en konsentrasjon på mindre enn 0,001 mg/ml i HBS-EP buffer, og injisere denne over SA sensor chip ved anvendelse av variable kontakttider. Lavkapasitetsoverflate, korresponderende til opptaksnivåer <50 responsenheter (RU) ble anvendt for høyoppløselige kinetiske studier, mens høykapasitetsoverflate (ca 800 RU av opptatt CGRP) ble anvendt for konsentrasjonsstudier, screening, og løsningsaffinitets bestemmelser. Kinetiske data ble opptatt ved å fortynne antistoff G1 Fab serielt i to- eller tre gangers økninger til konsentrasjoner i området 1uM-0,1nM (for å nå 0,1-10 x estimert KD). Prøvene ble typisk injisert i 1 min ved 100 μl/min og dissosiasjonstider på minst 10 minutter ble tillatt. Etter hver bindingssyklus ble overflatene regenerert med 2525mM NaOH i 25% v/v etanol, som ble tolerert i over 100 sykluser. En fullstendig titreringsserie (typisk generert i duplikat) ble tilpasset globalt til en 1:1 Langmuir bindingsmodell ved anvendelse av BIAevaluerings programmet.

Dette returnerte et unikt par av assosiasjons- og dissosiasjons kinetiske hastighetskonstanter (respektivt, kon og koff) for hver bindingsinteraksjon, hvis forhold gav likevekts dissosiasjonskonstanten (KD = koff/kon). Affiniteter (KD verdier) bestemt på denne måte er angitt i tabeller 6 og 7.

Høyoppløsningsanalyser av bindingsinteraksjoner med ekstremt lave off-hastigheter. For interaksjoner med ekstremt lave off-hastigheter (spesielt antistoff G1 Fab-binding til human -CGRP på chipen ved 25 °C), affiniteter ble oppnådd i et todelt eksperiment. Protokollen beskrevet over ble anvendt med følgende kodifiseringer. Assosiasjonshastighet konstanten (kon) ble bestemt ved injisering av to gangers titrerings serie (i duplikat) i området 550 nM-1 nM i 30 sec ved 100 μl/min og gitt kun en 30 sek dissosiasjonsfase. Dissosiasjonshastighetskonstanten (koff) ble bestemt ved å injisere tre konstruksjoner (høy, medium og lav) av de samme titreringsserier i duplikat i 30 sekunder og tillatt en 2 timers dissosieringsfase. Affiniteten (KD) av hver interaksjon ble oppnådd ved å kombinere kon og koff verdier oppnådd i begge typer eksperimenter, som vist i tabell 5.

Bestemmelse av løsningsaffinitet for Biacore. Løsningsaffiniteten av antistoff G1 for rotte -CGRP og F37A (19-37) human -CGRP ble målt med Biacore ved 37 °C. En høykapasitet CGRP chip overflate ble anvendt (høyaffinitet human -CGRP ble valgt for deteksjonsformål) og HBS-EP kjørebuffer fikk strømme ved 5 μl/min.

Antistoff G1 Fab-fragment ved en konstant konsentrasjon av 5 nM (for å være ved eller under den forventede KD av den løsningsbaserte interaksjon) ble preinkubert med konkurrerende peptid, enten rotte -CGRP eller F37A (19-37) human -CGRP, ved finale konsentrasjoner i området 1 nM til 1 uM i 3 gangers serielle fortynninger. Antistoff G1 Fab-løsninger i fravær eller nærvær av løsningsbasert konkurrerende peptid, ble injisert over CGRP på chipen og delesjon av bindingsresponser detektert ved chip overflaten som et resultat av løsningskonkurransen ble monitorert. Disse bindingsresponser ble omdannet til ”frie Fab-konsentrasjoner” ved anvendelse av en kalibreringskurve, som ble utført ved å titrere antistoff G1 Fab alene (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 og 0 nM) over CGRPen på chipen. ”Frie Fabkonsentrasjoner” ble plottet mot konsentrasjonen av konkurrerende løsningsbasert peptid anvendt for og genererer hvert datapunkt og tilpasse til en løsningsaffinitetsmodell ved anvendelse av BIAevaluerings programvaren. Løsningsaffinitetene som ble bestemt (indirekte på denne måte) er vist i tabeller 5 og 7, og ble anvendt for å validere affiniteten oppnådd idet Fabere injiseres direkte over N-biotinylated CGRPer på en SA chip. Det nærmeste samsvar mellom affinitetene bestemt med disse to metoder bekrefter at festing av en N-biotinylert versjon av CGRP til chipen ikke forandrer dets native løsnings bindingsaktivitet.

Tabell 5 nedenfor viser bindingsaffiniteten av antistoff G1 til human α-CGRP, human β-CGRP, rotte α-CGRP, og rotte β-CGRP bestemt med Biacore, ved å strømme Fab-fragmentene over N-biotinylert CGRPer på en SA chip. For å bedre oppløse affinitetene av bindingsinteraksjonene med ekstremt langsomme off-hastigheter, ble affinitetene også bestemt i et todelt eksperiment for å komplementere denne analyseorientering, hvor også løsningsaffiniteten av rotte α-CGRP interaksjonen ble bestemt (som beskrevet over). Det nære samsvar av affinitetene målt i begge analyseorienteringer bekrefter at bindingsaffiniteten av nativ rotte α-CGRP i en løsning ikke forandres idet den er N-biotinylert og festet til en SA-chip.

Tabell 5.

Bindingsaffiniteter av antistoff G1 Faber titrert over CGRPer på chipen.

*Affiniteter for α-CGRPer (rotte og menneske) ble bestemt i et høyoppløselig todelt eksperiment hvor dissosiasjonsfasen ble monitorert i 2 timer (verdiene for kon, koff, og KD representerer gjennomsnittlige av n-replikerte eksperimenter med standard avvik uttrykt som en prosent varians). Affiniteter for β-CGRPer (rotte og menneske) ble bestemt ved global analyseriing ved anvendelse kun av en 20 minutters dissosiasjonsfase, som ikke var tilstrekkelig nøyaktig til å kvantifisere deres ekstreme offhastigheter (deres off-hastigheter er sannsynligvis langsommere enn angitt her og derfor er deres affiniteter sannsynligvis enda høyere). Antistoff G1 Fab dissosierte ekstremt langsomt fra alle CGRPer (med unntak av α-rat CGRP) med off-hastigheter som nærmer seg oppløsningsgrensen for Biacore analysen (spesielt ved 25 °C).

**Løsningsaffinitet bestemt ved å måle deplesjon av bindingsresponser detektert ved CGRP på chipen for antistoff G1 fab pre-inkubert med løsningsbasert rotte α-CGRP kompetitor.

Tabell 6 nedenfor viser antistoff som har aminosyresekvens variasjon sammenlignet med antistoff G1 og deres aktiviteter til både rotte α-CGRP og menneske α-CGRP. Alle aminosyreseubstituenter av variantene vist i tabell 6 er beskrevet relativt til sekvensen av G1. Bindingsaffinitetene av Fab-fragmentene ble bestemt med Biacore ved å strømme disse over CGRPer på en SA-chip.

Tabell 6.

Aminosyresekvenser og bindingsaffinitetsdata for antistoff G1-varianter bestemt ved 37 °C med Biacore.

Alle CDRer inkluderer både Kabat og Chotia CDRer. Aminosyreenheter er nummerert sekvensvis (se figur 5). Alle kloner har L3 H1 H3-sekvensene identiske til G1.

KD = koff/kon. Alle koff – verdier ble bestemt i en screeningsmodus med unntak av de som er understreket, oppnådd ved global analyse av en Fab konsentrasjonsserie (G1 ble analysert i høyoppløsningsmodus). Understreket KD –verdier ble derfor bestemt eksperimentelt ved å måle kon. Andre kon –verdier ble estimert til å være samme som M25.

n.d. = ikke bestemt.

For å bestemme epitopen for human α-CGRP som gjenkjennes av antistoff G1 ble Biacore analyser som beskrevet over anvendt. Human α-CGRP ble innkjøpt som en N-biotinylert versjon for å muliggjøre dets høyaffinitetsfanging via SA sensor chips. Binding av G1 Fab fragmenter til human α-CGRP på chipen i fravær eller nærvær av en CGRP peptid ble bestemt. Typisk, et 2000:1 mol peptid/Fab-løsning (for eksempel 10 μM peptid i 50nM G1 Fab) ble injisert over human α-CGRP på chipen. Figur 6 viser prosentandel binding blokkert ved konkurrerende peptid. Dataene vist i figur 6 indikerer at peptidene blokkerer 100 % binding av G1 Fab til human α-CGRP er 1-37 (WT), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37), K35E (19-37), og K35M (19-37) avhuman α-CGRP; 1-37 av β-CGRP (WT); 1-37 av rotte α-CGRP (WT); og 1-37 av rotte β-CGRP (WT).

Alle disse peptider er amidert ved C-terminus. Peptider F37A (19-37) og 19-37 (det siste ikke amidert ved C-terminus) av human α-CGRP blokkerte også ca 80 % til 90 % av binding av G1 Fab til human α-CGRP. Peptid 1-36 (ikke amidert ved C-terminus) av human α-CGRP blokkerte ca 40 % avbinding avG1 Fab til human α-CGRP. Peptidfragment 19-36 (amidert ved C-terminus) av human α-CGRP; peptidfragmenter 1-13 og 1-19 av human α-CGRP (ingen av disse er amidert ved C-terminus); og human amylin, kalsitonin, og adrenomedullin (alle amidert ved C-terminus) konkluderte ikke med binding av G1 Fab til human α-CGRP på chipen.

Disse data viser at G1 målrettes mot en C-terminal epitop av CGRP og at både identiteten av de fleste terminale enheter (F37) og dets amidering er viktig for binding.

Bindingsaffiniteter av G1 Fab til varianter av human α-CGRP (ved 37 °C) ble også bestemt. Tabell 7 nedenfor viser affinitetene som målt direkte med titrering av G1 Fab over N-biotinylated human α-CGRP og varianter på chipen. Data i tabell 7 indikerer at antistoff G1 binder til en C-terminal epitop med F37 og G33 som de viktigste enheter. G1 binder ikke til CGRP idet en ekstra aminosyreenhet (alanin) er tilføyd ved den samme terminale del (som er amidert).

Tabell 7.

Bindingsaffiniteter av G1 Fab til human α-CGRP og varianter målt ved 37 °C (se tabell 4 for deres aminosyresekvenser).

Dataene ovenfor indikerer at epitopen som antistoff G1 binder er på den C-terminale ende av human α-CGRP, og aminosyrer 33 og 37 på human α-CGRP er viktig for binding av antistoff G1. Videre, amidering av enheter F37 er viktig for binding.

Eksempel 5: effekt av anti-CGRp antagonist antistoff G1 på vasodilasjon av hud indusert ved stimulering av rotte safenøs nerve.

For å teste antagonist aktivitet av anti-CGRP antistoff G1, ble effekten av antistoffet på hud vasodilasjon ved stimulering av rotte safenøs nerve testet ved anvendelse av en rottemodell som beskrevet i eksempel 3. Kort forklart, rotter ble opprettholdt med anestesi med 2 % isofluran. Bretylium tosylat (30 mg/kg, administrert i.v) ble gitt ved starten av eksperimentet for å minimere vasokonstruksjon som skyldes ledsagende stimulering av sympatetiske fibre av safenøs nerve. Kroppstemperatur ble opprettholdt ved 37 °C ved anvendelse av en rektal probe termostatisk forbudet til en temperaturregulert varmeteppe. Den safenøse nerve i den høyrebakfot ble eksponert kirurgisk, kuttet proksimalt og dekket med plastomslag for å hindre tørking. En laser doppler – probe ble plassert over den medio-dorsale side av bakputehuden, som er regionen invertert av den safenøse nerve. Hudblodstrømning, målt som blodcellefluks ble monitorert med en laser doppler-strømningsmåler. I eksperimenter for å bestemme effekten av antistoff innen 2 timer etter injeksjon 30 til 45 minutter etter bretylium tosylat injeksjon, idet en stabil baselinjerefluks (mindre enn 5 % variasjon) var etablert i minst 5 min, ble nerven plassert over platina bipolare elektroder og elektrisk stimulert (2Hz, 10V, 1 ms, i 30 sek) og igjen 20 minutter senere. Gjennomsnittlig blodstrømnings fluksrespons til disse to stimuleringer ble anvendt for å etablere baselinjerespons (tid 0) for elektrisk stimulering. Antistoff G1 (1 mg/kg eller 10 mg/kg) eller vehikkel (PBS med 0,01 % Tween 20 likt volum til 10 mg/kg G1) ble deretter administrert intravenøst (i.v). Nerven ble deretter stimulert (2Hz, 10V, 1 ms, i 30 sek) ved 30 min, 60 min, 90 min, og 120 etter antistoff administrering. Dyrene ble holdt under anestesi for en periode på tilnærmet 3 timer. Kumulativ forandring i hudblodstrømning ble stimulert av arealet under fluks-tid-kurven (AUC), som er lik forandring i fluks multiplisert med forandring i tid) for hver fluks respons til stimulering av elektrisk puls.

Som vist i figur 7, blodstrømningsøkning stimulert ved å applisere elektriske pulser på safenøs nerve ble signifikant inhibert ved nærvær av antistoff G1 ved 1 mg/kg (administrert i-v) sammenlignet med vehikkel, idet den safenøse nerve ble elektrisk stimulert ved 90 min etter antistoff administrering. Blodstrømningsøkning stimulert ved å applisere elektroniske pulser på safenøs nerve ble signifikant inhibert ved nærvær av antistoff G1 ved 10 mg/kg (administrert i.v.) sammenlignet med vehikkel, idet den safenøse nerve ble elektrisk stimulert ved 90 minutter og 120 minutter etter administrering av antistoff.

I eksperimenter for å bestemme effektene av antistoff ved lengre tidspunkter i den safenøse analyse ble rotter injisert i.v med de indikerte doseringer av antistoff 24 timer eller 7 dager før preparering av dyret for stimulering av safenøs nerve som beskrevet over. I disse eksperimenter var det umulig å etablere en baselinjerespons i individuelle rotter til elektrisk pulsstimulering før dosering, så behandlete grupper ble sammenlignet med dyr dosert med vehikkel (PBS, 0,01 % Tween 20) ved 24 timer eller 7 dager.

Som vist i figurer 8A og 8B ble blodstrømningsøkninger i den dorso-mediale bakpotehud fremkalt med stimulering av safenøs nerve signifikant inhibert i grupper av dyr dosert med enten 10 mg/kg eller 3 mg/kg G1 ved enten 24 timer eller 7 dager før stimulering sammenlignet med vehikkelgrupper dosert ved de samme tidspunkt.

Figur 8C representerer en kurvetilpasningsanalyse applisert på doserespons dataene representert i figurene 8A og 8B for å bestemme dose som er nødvendig for 50 % maksimal effekt (EC50). EC50 ved 24 timer er 1,3 mg/kg og EC50 ved 7 dager er noe lavere (0,8 mg/kg).

Eksempel 6: Akutt effekt av anti-CGRP antagonist antistoff G1 i en dural arterie (lukket kranialt vindu) analyse.

Lukket kranial vindusmodell: formålet med dette eksperiment var å bestemme den akutte effekt av anti-CGRP antagonist antistoff og sammenligne denne med den akutte effekt av CGRP reseptor antagonisten BIBN4096BS Eksperimentet ble utført som tidligere beskrevet (Williamson et al., Cephalalgia 17(4):518-24 (1997)) med følgende modifiseringer. Sprague Dawley rotter (300-400 g) ble anestisert med 70 mg/kg i.pentobarbital. Anestesi ble opprettholdt med 20 mg/kg/t i.v pentobarbital. Rotter ble kanylert gjennom den jugulare vene for avgivelse av alle medikamenter. Blodtrykk ble monitorert med en probe (mikrotipp kateter, millar Instruments) tredd gjennom den femorale arterie og inn i den abdominale aorta. Rottene ble trakeotomisert og pusterate ble opprettholdt ved 75 pustinger per minutt ved et volum av 3,5 ml. Etter fiksering av hodet i et stereotaktisk instrument, og fjerning av skalpen ble et 2 x 6 mm vindu i det venstre parientale areal like lateralt i forhold til det sagitale sutur utført ved tynning av benet med en tannlegebor. Ved anvendelse av en mikromanipulator, ble en platina bipolar elektrode senket til overflaten og dekket med tynn mineralolje. Lateralt i forhold til elektrodevinduet ble et ytterligere vindu på 5 x 6 mm kreert og fylt med tung mineralolje hvor igjennom diameteren av en forgrening av den midtre meningiale arterie (MMA) kontinuerlig monitorert med et CCD-kamera og en video dimensjonsanalyserer (Living systems). Rottene fikk hvile i ikke mer enn 45 minutter etter prepareringen. En baselinjerespons til elektrisk stimulering ble etablert (15 V, 10 hz, 0,5 ms pulser, 30 sekunder) og deretter ble rottene dosert i.v med eksperimentell forbindelse (10mg/kg mu7E9, 300 g/kg BIBN4096BS eller PBS 0,01%Tween 20). Ytterligere elektriske stimuleringer ble utført ved 5 (BIBN4096BS), 30, 60, 90 og 120 minutter etter dosering. Alle data ble registrert ved anvendelse av diagram programvare (ADInstruments).

Som vist i figur 9 blokkerer 9 mu7E9 ved 10mg/kg signifikant MMA-dilatering fremkalt ved elektrisk feltstimulering innen 60 minutter etter dosering, og effekten opprettholdes gjennom varigheten av analysen (120 minutter). Til sammenligning blokkerer BIBN4096BS MMA-dilatering i 5 minutter med dosering men effekten er fullstendig vekke etter 90 minutter. Størrelsen på blokkeringen er sammenlignbar mellom BIBN4096BS og mu7E9.

Eksempel 7: Kronisk effekt av anti-CGRP antagonist antistoff G1 i en dural arterie (lukket kranialt hode) analyse.

Formålet med dette eksperiment var å bestemme om anti-CGRP antistoff fremdeles kunne blokkere elektrisk stimulert MMA-utvidelse 7 dager etter dosering; preparering av rottene var identisk til ovenfor beskrevet akutt eksperiment (eksempel 6) med følgende unntak. Rottene ble injisert i.v (10 mg/kg, 3 mg/kg eller 1 mg/kg G1) 7 dager før etablering av det lukkete kraniale vindu prep og stimulering. Det var umulig å etablere en baselinje utvidelsesrespons til elektrisk stimulering før dosering som i det akutte eksperiment så antistoffgruppene ble sammenlignet til utvidelse av MMA i en vehikkel (PBS, 0,01 % Tween 20) dosert kontrollgruppe. Etter at rottene fikk hvile i ikke mer enn 45 minutter ble dyrene elektrisk stimulert ved 30 minutters intervaller. Stimuleringen var ved 2,5 V, 5 V, 10 V, 15 V og 20 V, alle ved 10 Hz, 0,5 ms pulser i 30 sekunder.

Som vist i figur 10 blokkerer G1 ved 10 mg/kg og 3 mg/kg signifikant MMA utvidelse fremkalt ved elektrisk stimulering i området 10 til 20 volt. Disse data viser at G1 kan blokkere elektrisk stimulert MMA utvidelse opp til 7 dager etter dosering.

Eksempel 8: Morfinfjerning, hetetoktmodell.

Morfinfjerning rottemodell er en etablert gnagermodell for menopausale hetetoktmekanismer Sipe et al., Brain Res.1028(2):191-202 (2004); Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998); Katovich et al., Brain Res.494:85-94 (1989); Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Rottene blir gjort avhengige av morfin ved å implantere morfinpellets under huden. Ved avhengighet blir dyrene injisert med naloxon (Opioid antagonist) som sender dem i abstinens umiddelbart. Denne abstinens ledsages av en hudtemperaturøkning, en kjernetemperatur senking, en økning i hjerterytme og en økning i serum luteiniserende hormon. Disse er alle tilsvarende i størrelse og timing i det som forekommer i varmetokter i menneske (Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Videre, dersom rottene behandles med østradiol før man induserer abstinens blir symptomene av varmetokter redusert (Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998)). Dette er grunnen til at morfinabstinens modellen antas å etterligne kliniske varmetokter.

Ovarieektomiserte rotter ble innkjøpt fra Charles River Laboratories. Ikke mindre enn 7 dager etter ovarieektomi ble morfinavhengighet etablert ved å implantere en morfinpellet (35 mg morfinbase) subkutanøst.2 dager senere ble ytterligere 2 pellet implantert. De påfølgende dager ble rottene injisert intravenøst med enten 10 mg/kg 4901 [**] eller vehikkel (PBS, o,01 % Tween). To dager etter den andre pellet ble rottene anestisert med ketamin (90 mg/kg) og lysbegrenset. En overflatetemperaturtermometer ble tapet til basen av halen og et rektalt termometer anvendes for å måle kjernetemperatur. Data ble registrert ved anvendelse av Chart programvare (ADInstruments). Etter registrering i 15 minutter av stabil baselinjetemperatur ble naloxon (1 mg/kg) injisert subkutanøst. Temperaturen ble registrert kontinuerlig i de neste 60 minutter. Resultatene er vist i figurer 11A og 11B.

Deponering av biologisk materiale.

Følgende materialer har blitt deponert ved American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA (ATCC):

Materiale Antistoff Nr. ATCC katalog Nr. Dato for deponering pDb.CGRP.hFcGI G1 tungkjede PTA-6867 Juli 15, 2005 pEb.CGRP.hKGI G1 lettkjede PTA-6866 Juli 15, 2005

Vektoren pEb.CGRP.hKGI er et polynukleotid som koder for G1 lettkjede variabel region og lettkjede kappa konstant region; og vektor pDb.CGRP.hFcGI er et polynukleotid som koder for G1| tungkjede variabel region og tungkjede IgG2 konstant region inneholdende følgende mutasjoner: A330P331 til S330S331 (amino syrenummerering med referanse til villtype IgG2 sekvens; se Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624).

Disse deponeringer ble utført under bestemmelsene under Budapest traktaten for International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder (Budapest Treaty). Dette sikrer opprettholdelse av en levedyktig kultur av deponeringen i 30 år fra dato for deponering. Deponeringen vil være tilgjengelig ved ATCC under termene av Budapest traktaten, og er i samsvar med en avtale mellom Rinat Neuroscience Corp. og ATCC, som sikrer permanent og ubegrenset tilgjengelighet til avkom av kulturen av deponeringen til det offentlige ved forsikring av tilhørende US patent eller som er åpen for offentligheten for enhver US eller fremmed patentsøknad, den som kommer først, og sikrer tilgjengelighet av avkom for en som er bestemt av U.S. Commissioner of Patents and Trademarks å ha rett dertil i samsvar med 35 USC Section 122 og Commissioner's rules pursuant thereto (including 37 CFR Section 1.14 with particular reference to 886 OG 638).

Innehaver av foreliggende søknad har akseptert at dersom kulturen av materialet som er deponert skulle dø ut eller tapes eller ødelegges ved dyrkning under egnete betingelser så vil materialene hurtig erstattes med tilsvarende. Tilgjengelighet til deponert materiale skal ikke forstås som å være en lisens til å praktisere oppfinnelsen og de rettigheter som er oppnådd av myndighetene i samsvar med deres patentlover.

Antistoffsekvenser

G1 tungkjede variabel region aminosyresekvenser (SEQ ID NO:1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESD ASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWG QGTLVTVSS

G1 lettkjede variabel region aminosyresekvens (SEQ ID NO:2) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIK

G1 CDR H1 (forlenget CDR) (SEQ ID NO:3)

GFTFSNYWIS

G1 CDR H2 (forlenget CDR) (SEQ ID NO:4)

EIRSESDASATHYAEAVKG

G1 CDR H3 (SEQ ID NO:5)

YFDYGLAIQNY

G1 CDR L1 (SEQ ID NO:6)

KASKRVTTYVS

G1 CDR L2 (SEQ ID NO:7)

GASNRYL

G1 CDR L3 (SEQ ID NO:8)

SQSYNYPYT

G1 tungkjede variabel region nukleotidsekvens (SEQ ID NO:9) GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTG CGTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGG TTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATC CGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCC CGTGACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAA GACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGA ACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCC

G1 lettkjede variabel region nukleotidsekvens (SEQ ID NO:10) GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGT GCTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACC AGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTT ACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCT GACCATCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCC TACAACTACCCCTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAA

G1 tungkjede fullstendig antistoff aminosyresekvens (Inkluderende modifisert IgG2 som beskrevet heri) (SEQ ID NO:11) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESD ASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCV ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

G1 lettkjede fullstendig antistoff aminosyresekvens (SEQ ID NO:12) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

G1 tungkjede fullstendig antistoff nukleotidsekvens (inkluderende modifisert IgG2 som beskrevet heri) (SEQ ID NO:13) GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTG CGTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGG TTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATC CGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCC CGTGACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAA GACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGA ACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCC CATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGA ACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCT CAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCA CCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACA AGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAG TGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGA TCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGAC CCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAA GACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCT GACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTC CAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACA GCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAA GAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCC AATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAG TCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTG CACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA

G1 lettkjede fullstendig antistoff nukleotidsekvens (SEQ ID NO:14) GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGT GCTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACC AGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTT ACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCT GACCATCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCC TACAACTACCCCTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAACGCACTG TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGG AACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAG CAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG CCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA

Aminosyresekvens sammenligning av human og rotte CGRP (human α-CGRP (SEQ ID NO:15); human β-CGRP (SEQ ID NO:43); rotte α-CGRP (SEQ ID NO:41); og rotte β-CGRP (SEQ ID NO:44)):

NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-CONH2 (human α-CGRP)

NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-CONH2 (human β-CGRP)

NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-CONH2 (rotte α-CGRP) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF-CONH2 (rotte β-CGRP)

SEQUENCE LISTING

Claims

Patentkrav

1. Anti-CGRP antagonist antistoff, karakterisert ved at det omfatter et VH -domene som har aminosyresekvens SEQ ID NO: 1 og et VL -domene som har aminosyresekvens SEQ ID NO: 2.

2. Antistoff i samsvar med krav 1, omfattende en tungkjede som omfatter aminosyresekvens SEQ ID NO: 11 og en lettkjede som omfatter aminosyresekvens SEQ ID NO: 12.

3. Polynukleotid, karakterisert ved at det omfatter et polynukleotid som koder for lettkjeden og tungkjeden av antistoffet ifølge krav 1 eller 2.

4. Isolert polynukleotid i samsvar med krav 3, omfattende (i) SEQ ID NO 9 og 10 eller (ii) SEQ ID NO 13 og 14.

5. Vektor, karakterisert ved at den omfatter polynukleotidet ifølge ethvert av kravene 3 til 4.

6. Vektor i samsvar med krav 5, hvor vektoren er deponert som med ATCC katalognummer PTA-6867 og ATCC katalognummer PTA-6866.

7. Vertscelle, karakterisert ved at den omfatter polynukleotidet i samsvar med ethvert av kravene 3 til 4 eller vektoren i samsvar med kravene 5 eller 6.

8. Fremgangsmåte for å generere antistoffet ifølge ethvert av de foregående krav, omfattende trinnene å uttrykke polynukleotidet ifølge ethvert av kravene 3 til 4 eller vektoren ifølge krav 5 eller 6 i en vertscelle og (b) valgfritt gjenvinne og/eller isolere antistoffet eller fragment derav.