LV12251B - 2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2h)-ona pielietojums medikamenta ražošanai, kas paredzēts alcheimera slimības profilaksei un/vai terapijai - Google Patents

Description

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VERWENDUNG VON 2-PHENYL-l,2-BENZISOSELENAZOL-3(2H)-ONE ZUR HERSTELLUNG EINER PHAR-MAZEUTISCHEN ZUBEREITUNG FClR DIE BEHANDLUNG DER ALZHEIMER-KRANKHEIT

Die vorliegende Erfindung betrifft eine prāventive und/oder therapeutische pharmazeutische Zubereitung fur die Behandlung der Alzheimer-Krankheit, die als Viirkstoff ein 2-Phenyl-l;2-Benzisoselenazol-3(2H)-one enthālt, wobei dieser Wirkstoff die Neuronentoxizitāt, die durch das E-Amyloid-Protein induziert wird, verringert.

In einigen Lāndern werden Acetylcholinsterase-Inhibitoren, so zum Beispiel Physostigmin oder Tetrahydroaminoakridin (THA), als vorbeugende und/oder therapeutische Arzneimittel fūr die Alzheimer-Krankheit verwendet. Dabei konnten jedoch keine Erfolge verzeichnet werden. Ebenso wurde der Versuch unternommen, 5-HT-Antagonisten, die auf das Nervensystem wirken, zu entwickeln, jedoch ist deren Mechanismus noch nicht vollstāndig aufgeklārt.

Die pathologischen Merkmale der Alzheimer-Krankheit umfassen senile Plagues und eine Anhāufung von PHFs (gepaarte schraubenformige Fasern) im Gehirn.

Das E-Amyloid-Protein, das nachfolgend auch mit AE bezeichnet ist und das den Hauptbestandteil der senilen Plaques darstellt, ist ein unlosliches Peptid, bestehend aus etwa 40 Aminosāuren-Resten. Es wurde festgestellt, daS das AjS seinerseits Neuronen biochemisch schādigt und daS insbesondere geronnenes, nicht gelostes AE diesen Effekt hervorruft. 2

Somit war die Entwicklung einer Substanz erwūnscht, die dem Fortschreiten der senilen Demenz vom Alzheimer-Typ vorbeugt und/oder sie heilt, wobei diese Substanz aus einer pharmazeutischen Zubereitung besteht, die das durch toxisches Αβ herbeigefūhrte Absterben von Neuronen unterdrūckt.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fūhrten zwei weitreichende Studien zur Entwicklung niedermolekularer Verbindungen durch, die imstande sind, die BlutfluSgrenze des Gehirns zu ūberwinden und die die Neuronentoxizitāt des Αβ zu reduzieren. Hierbei wurde ūberraschend festgestellt, daS das 2-Phenyl-l,2-Benzisoselenazol-3(2H)-one (im folgenden auch kurz als Verbindung A bezeichnet) eine hervorragende, die vorliegende Erfindung vervollstāndigende Wirkung aufweist.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung A hemmt das durch die Anwesenheit von Αβ begrūndete Absterben von Neuronen. Somit ist die erfindungsgemāSe Verwendung der Verbindung A als vorbeugende und/oder therapeutische pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit geeignet. Αβ wurde als Hauptbestandteil des senilen Plaques, einem pathologischen Herkmal der Alzheimer-Krankheit, identifiziert. Es besteht aus 39-40 Aminosāure-Resten. Desweiteren ist bekannt, daS das Αβ neurotoxisch wirkt und somit den Zellentod hervorruft. Erst kūrzlich vmrde herausgefunden, daS das durch das neurotoxische Αβ induzierte Absterben von PC12-Zellen in Gegenwart von Αβ unterdrūckt wird, wenn die Verbindung A (Ebselen) hinzugefugt wird. Von daher ist zu erwarten, daS die Verbindung A eine hervorragende vorbeugende und/oder therapeutische pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit darstellt. 3 LV 12251

Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung A kann durch ein in der japanischen Patentschrift (kokoku) Nr. 2-38591 (japanische Offenlegung (kokai) Nr. 57-67568) offenbartes Verfahren synthetisiert werden.

Die Verbindung A kann in verschiedenen Formen, wie z. B. als Tablette, Kapsel, Puder, Granulat, Sirup und Injektion, durch Anwendung bekannter Herstellungstechniken unter Verwendung von Zusatzstoffen, Trāgern, Bindemitteln, Sprengmitteln und Losungsmitteln dargereicht werden.

Die folgende Tabelle gibt beispielhaft die Zusammensetzung einer Tablette wieder:

Verbindung A 50 mg Carboxymethylcellulose 25 mg Stārke 5 mg kristalline Cellulose 40 mg Maonesiumstearat 2 mq Gesamt 122 mg

Die Verbindung A behālt ihre primār beanspruchte Wirkung bei jeder Art der Darreichung, so z. B. bei der ūblichen oralen Anwendung oder bei der peroralen Anwendung, beispielsweise bei einer Injektion.

Im Falle der oralen Anwendung liegt die Dosis der Verbindung A fūr einen Erwachsenen zwischen 100 und 2.000 mg/Tag, vorzugsweise zwischen 200 und 1.000 mg/Tag, wobei diese Dosis abhāngig von der klinischen Situation des Patienten entsprechend erhoht oder verringert werden kann.

Bei der Ūberprūfung der Toxizitāt der Verbindung A vmrden LD50_Werte kei Māusen und Ratten ermittelt. GemāS den Versuchen der Erfinder lagen die bei den Māusen ermittelten LD50-Werte bei > 6.810 mg/kg bei oraler Anwendung und bei 740 mg/kg bei intraperitonealer Anwendung. Die bei Ratten festgestellten LDS0-Werte lagen 4 bei > 6.810 mg/kg bei oraler Anwendung und bei 580 mg/kg bei intraperitonealer Anwendung. Diese LDS0-Werte beweisen, daS somit die Verbindung A sehr sicher ist.

Selbst dann, wenn eine hohe Dosis der Verbindung A den Māusen oder Ratten verabreicht vmrde, konnten keine problematischen Nebeneffekte beobachtet werden.

Die vorliegende Erfindung wird nunmehr anhand von Beispielen nāher beschrieben, wobei diese Beispiele die vorliegende Erfindung nicht eingrenzen.

Beispiel 1

Wirkung der Verbindung A als Inhibitor des durch A£ induzierten Neuronenabsterbens in Anwesenheit von A£:

Kultivierte PC12-Zellen (die von Ratten abstammen, Chromaffiner Tumor) wurden in einer 100 mm Schale (von Corning hergestellt) unterkultiviert, die mit Polylysin iiberzogen ist und die ein DMEM-Medium enthālt, welches mit 10 % FCS and 5 % Pferdeserum (Produkt von Sigma) versetzt ist. Mit anderen Worten, die PC12-Zellen (1 χ 106 Zellen/Schale) wurden in einer mit Polylysin beschichteten 100 mm Schale angezuchtet. Um Unterschiede der PC12-Zellen aufzuzeigen, wuchsen die PC12-Zellen sieben Tage lang in einem DMEM-Medium, das 5 % FCS, 50 ng/ml NGF und 1 % Pferdeserum enthielt, heran. Die PC12-Zellen vrnrden dann durch Pipettierung abgeschert und in einem geeigneten Medium suspendiert, um so eine Zellsuspension zu erstellen. Die Zellsuspension vmrde in jede Vertiefung. einer mit Polylysin beschichteten Schale mit 96 Vertiefungen (1 χ 104 Zellen/Vertiefung) eingebracht. Hiernach vmrde das Aj3 (Bachem Feinchemikalien AG) hinzugefugt, so daS eine Endkonzentration von 10 μΜ erreicht wurde. Die Verbindung A vmrde nun ebenfalls hinzugefugt, so. daE eine Endkonzentration von 0,1, 1,0 oder 2,5 μΜ erreicht vmrde. Als Kontrollsubstanz vmrde 5 LV 12251 eine Verbindung B (Verbindung A substituiert mit Schwefel, keine gluthation-peroxidase-āhnliche Wirkung; 2-Phenyl-1,2-Benzothiazol-3(2H)-one; durch Nattermann zur Verfūgung gestellt) in der gleichen Konzentration und auf die 5 gleiche Weise hinzugefūgt. Die Zellen wurden fūr 48 Stunden nach Hinzufūgen der Verbindung A oder der Verbindung B kultiviert.

Ein MTT-Reagens (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-10 Diphenyl-Tetrazolium-Bromid) wurde den so behandelten Zellen zugesetzt. Die Inkubation wurde fūr 4 Stunden ausgefūhrt und die Zellen wurden lysiert. Die nachfolgende Verarbeitung wurde unter Anwendung des sogenannten MTT-Verfahrens durchgefūhrt, das kolorimetrisch auf der Basis 15 einer Reduktionsreaktion des Reagens arbeitet, um dadurch die Lebensfāhigkeit der Zellen in der Suspension (Behl, C. et al., Celi, 77: 817-827, 1994) zu ermitteln.

Verbindung B

Verbindung A 35 6

Tabelle 1:

Wirkung der Verbindungen A und B auf das Absterben von Zellen von PC12-Neuronen hinzugefūgte Substanzen (μΜ) Lebensfāhigkeit ---------------------------- der Zellen T-Test

AjS Verbindung Verbindung (% der Kontrolle) (Student) A B lh. 10 10 15 + 9,5 _ 10 H o - 45 2,1 * 10 - H O 14 ± 4,5 10 H o - 59 _+ 14,5 * * 10 - H O 13 + 1,0 10 2,5 - 6 6 + 4,5 ★ * * 10 - 2,5 10 +. 5,0 *: P <. 0,01, **: P < 0,002, *** P < 0,0001, n=6

Der T-Test wurde an den Gruppen durchgefuhrt, denen das AjS (ΙΟμΜ) zugesetzt wurde. wie der Tabelle 1 eindeutig zu entnehmen ist, wurde das Absterben der Neuronen von dem AjS verursacht, wobei die Absterberate durch das Hinzufūgen der Verbindung B nicht unterdruckt werden konnte. Wenn jedoch die Verbindung A in einer Menge von 0,1 μΜ, 1 μΜ oder 2,5 μΜ hinzugefvigt wurde, konnte in allen Fāllen das Neuronenabsterben signifikant unterdruckt werden (P <. 0,0082, P <. 0,0018 und P < 0,0001).

Beispiel 2

Kultivierte PC12-Zellen (die von Ratten abstammen, Chromaffiner Tumor) wurden in einer 100 mm Schale (von Corning hergestellt) unterkultiviert, die mit Polylysin 7 LV 12251 beschichtet ist und die ein DMEM-Medium enthālt, welches mit 10 % FCS and 5 % Pferdeserum (Produkt von Sigma) versetzt ist. Mit anderen Worten, die PC12-Zellen (1 χ 10δ Zellen/Schale) vmrden in einer mit Polylysin beschichteten 100 mm Schale angezūchtet. Um Unterschiede der PC12-Zellen aufzuzeigen, v/uchsen die PC12-Zellen sieben Tage lang in einem DMEM-Medium, das 5 % FCS, 50 ng/ml NGF und 1 % Pferdeserum enthielt, heran. Die PC12-Zellen vmrden dann durch Pipettierung abgeschert und in einem geeigneten Medium suspendiert, um so eine Zellsuspension zu erstellen. Die Zellsuspension wurde in jede Vertiefung einer mit Polylysin ūberzogenen 60 mm Schale mit 96 Vertiefungen (1 χ 104 Zellen/Vertiefung) gebettet. Nachdem die Adhāsion der Zellen bestātigt war, wurde das folgende Verfahren durchgefūhrt

Die so anhaftenden PC12-Zellen vmrden in einem DMEM-Medium angeordnet. 10 μΜ SNAP und 2,5 μΜ der Verbindung A vmrden den Zellen zugesetzt. Bei einer Kontrollgruppe vmrde nur SNAP hinzugefūgt. Jede Probe vmrde fūr 3 Stunden inkubiert. Hiernach vmrde jede PC12-enthaltende Probe mit einer vorbereiteten DCFH-DA-Losung (Molecular Probes,

Inc.) in DMSO (1 mg/413 μΐ) versetzt, so daS eine Endkonzentration von 5 μΜ erzielt vmrde. Die Proben vmrden dann fūr 30 Minuten inkubiert. Die Zellen vmrden unter Verwendung von Trypsin-EDTA entfernt und durch Zentrifugieren (1.000 rpm x 5 min.) wiedergewonnen. Die wiedergewonnenen Zellen vmrden in 50 μΐ PBS(-) suspendiert, wobei sie mit Eis gekūhlt vmrden. Die Menge intrazellulāren Wasserstoffperoxids vmrde mit einem DurchfluSzytometer bestimmt. Die Zellsuspension vmrde einer FACS (Fluorescence-activated celi sorting) unterworfen und die Menge der durch Peroxide oxidierten, fluoreszierenden Substanz, 21,71-Dichlorofluorescein (DCFH) vmrde gemessen. Als Ergebnis vmrde festgestellt, daS im Fall des Zusatzes von SNAP die Entstehung von Wasserstoffperoxid 1,3 - 1,4 mal hoher war, als in dem Fall, in dem kein SNAP hinzugefūgt vmrde. Desweiteren δ vrnrde die durch deri Zusatz von SNAP erhohte Entstehung von Wasserstoffperoxid deutlich durch einen Zusatz von 2,5 μΜ der Verbindung A (P < 0,0015) unterdrūckt.

Tabelle 2:

Wirkung der Verbindung A auf die unterdruckte Entstehung von Wasserstoffperoxid hervorgerufen durch NO (in den PCl2-Zellen, die mit SNAP versetzt wurden)

behandelt mit Mengen der erzeugten H2O2 (% log Fluoreszenz der Kontrolle) SNAP Verbindung B (*) (μΜ) (μΜ) 0 0 100,0 10 0 135,8 ± 5,25 10 2,5 45,7 + 6,03 SNAP: S-Nitroso-N-Acetyl-DL !- Penicillinamin ★ * : P < 0,0015 [in Ūbereinstimmung mit dem Student T-Test in bezug auf SNAP (10 μΜ); n=3] Es ist berūcksichtigt, daS das von dem AjS abstammende NO die Entstehung von Wasserstoffperoxid beschleunigt. Wie jedoch der Tabelle 2 entnommen werden kann, wurde die Entstehung von Wasserstoffperoxid zufriedenstellend durch den Zusatz von 2.5 μΜ der Verbindung A unterdrūckt. Kūrzlich wurde hervorgehoben, daE bei der Alzheimer-Krankheit die Apoptosis mit dem Neuronenabsterben in Zusammenhang stehen kann. Desweiteren vrnrde berichtet, daS das Neuronenabsterben durch das AS hervorgerufen wird und daS die Neurotoxizitāt durch die Entstehung von Wasserstoffperoxid verursacht wird (Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 90 :7951-7955, 1993). 9 LV 12251

Wie vorstehend beschrieben, wird die durch das AS induzierte Entstehung von Wasserstoffperoxid deutlich durch den Zusatz der Verbindung A unterdruckt. Daher konnte aufgezeigt werden, daS die Verbindung A exzellente prāventive oder therapeutische Wirkungen auf die Alzheimer-Krankheit besitzt. Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung A stellt somit eine beson-ders nūtzliche prāventive oder therapeutische Zubereitung fūr senile Dementia, insbesondere fūr die Alzheimer-Krankheit, dar.

Die in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Abkūrzungen bedeuten folgendes:

Polylysin ist ein Lysin-Polypetid mit variabler Kettenlānge; DMEM bedeutet Delbecco's modified Eagle’s medium; DCFH ist 2',71-Dichlorfluorescein; FCS bedeutet fetal calf serum; DMSO ist Dimethylsulfoxid;

Trypsin EDTA ist ein Komplexbildner auf der Basis von Āthylendiamintetraessigsāure und NO ist Stickoxid.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung und/oder zur Heilung der Alzheimer-Erkrankung. Die erfindungsgemāEe pharmazeutische Zubereitung enthālt als Wirkstoff 2-Phenyl-1,2-Benzisoselenazol-3(2H)-one (bezeichnet als Verbindung A) , dessen Wirksamkeit in der Verringerung der durch jS-Amyloid-Protein induzierten Neuronentoxizitāt begrundet ist. 10 LV 12251

Patentanspriiche 1. Verwendung von 2-Phenyl-l,2-Benzisoselenazol-3(2H)-one zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Prophylaxe und/oder Therapie von Demenz. 2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Prophylaxe und/oder Therapie von seniler Demenz. -3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Prophylaxe und/oder Therapie von Demenz des Alzheimer-Types. 4. Pharmazeutische Zubereitung, aadurch gekennzeichnet, daS die Zubereitung als Wirkstoff ein 2-Phenyl-l,2-Benzisoselenazol-3(2H)-one als Wirkstoff enthālt und daS die pharmazeutische Zubereitung zur Prophylaxe und/oder Therapie der Alzheimer-Krankheit anwendbar ist. 5. Pharmazeutisches Mittel nach einem der vorangehenden Ansprūche, dadurch gekennzeichnet, daS das pharmazeutische Mittel als Tablette, Kapsel, Puder, Granulat, Sirup oder als Injektion anwendbar ist.

Claims (5)

1. LV 12251 IZGUDROJUMA FORMULA 1. 2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-ona pielietojums tāda medikamenta ražošanai, kas paredzēts demences profilaksei un/vai terapijai.
2. 2. Pielietojums saskaņā ar 1. punktu, tāda medikamenta ražošanai, kas paredzēts senilās demences profilaksei un/vai terapijai.
3. 3. Pielietojums saskaņā ar 1. vai 2. punktu, tāda medikamenta ražošanai, kas paredzēts Alcheimera tipa demences profilaksei un/vai terapijai.
4. 4. Medikaments atšķiras ar to, ka kā bioloģiski aktīvu vielu satur 2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-onu un medikamentu izmanto Alcheimera slimības profilaksei un/vai terapijai.
5. 5. Medicīniskais līdzeklis saskaņā ar vienu no iepriekšminētajiem punktiem atšķiras ar to, ka medicīniskais līdzeklis pielietojams tablešu, kapsulu, pulvera, granulu, sīrupa vai injekciju veidā.