FI119622B - 2-fenyyli-1,2-bentsoisoselenatsol-3(2H)-onin käyttö Alzheimerin taudin hoitoon tarkoitettujen farmaseuttisten valmisteiden valmistukseen - Google Patents

Description

2-fenyyli-1^2-bentsIsoseteoatsol4(2H)onin. käyttö Alzheimerin taudin hoitoon tarkoitettujen farmaseuttisten valmisteiden valmistukseen

Esillä oleva keksintö koskee: 2-fenyylM ;,2-bentsisösetenatsoi-3(2H)-5 onin käyttöä Alzheimerin taudin ehkäisyyn ja/tai terapiaan tarkoitetun farmaseuttisen valmisteen valmistukseen. Vaikuttava aine alentaa β-amyloidiprote-iinin indusoimaa neuronitoksisuutta.

Joissakin maissa Alzheimerin taudin ehkäisevinä ja/tai terapeuttisina lääkkeinä käytetään asetyylikolinesteraasi-inhibiittoreita, kuten esimerkiksi 10 fysostigmiiniä tai tetFahydroaminoakhdiinia (THA). Niillä ei kuitenkaan ole saatu myönteisiä tuloksia. Samoin on suoritettu kokeita hermostoon vaikuttavien 5-HT-antagonistien kehittämiseksi; niiden vaikutusmekanismia ei ole kuitenkaan vielä täydellisesti selvitetty.

Alzheimerin taudin patologiset tunnusmerkit käsittävät patologisia 15 plakkeja aivoissa ja PHF:ien (parilliset kierteiset säikeet) kerääntymistä aivoihin.

β-amyloidi-proteiini, josta seuraavassa käytetään myös nimitystä Αβ ja joka on pääasiallisena aineosana seniileissä plakeissa, on liukenematon peptidi, joka koostuu noin 40 aminohappotähteestä. On todettu, että Αβ puo-20 lestaan vaurioittaa biokemiallisesti neuroneja ja että varsinkin koaguloitunut, ei-liueniiut Αβ aiheuttaa tämän vaikutuksen,

Siten sellaisen substanssin kehittäminen oli toivottua, joka estää Alzheimerin taudin etenemistä ja/tai parantaa sitä, jolloin tämä substanssi muodostuu farmaseuttisesta valmisteesta, joka estää toksisen Afi:n aiheut-25 tamaa neuronien kuolemista.

Tämä saavutetaan patenttivaatimuksen 1 mukaisella, 2-fenyy|i-1,2-bentsisoselenatsol-3(2H)-onin käytöllä.

Keksinnön mukainen käyttö perustuu siihen, että 2~fenyy!i-1,2-bent-sisöselenatsol-3(2H)-oni pystyy läpäisemään veri-aivoesteen ja alentamaan 30 Αβ-n neuronitoksisuutta. Todettiin yllättäen,· että 2-fenyyli-1,2-bentsisoselenat-sol-3(2H)-onflla (seuraavassa käytetään lyhyesti myös nimitystä yhdiste A) on huomattava Alzheimerin tautiin liittyvä vaikutus.

Esillä olevassa keksinnössä käytetty yhdiste A estää Αβ:η läsnäoloon perustuvaa neuronien kuolemista. Siten yhdiste A sopii keksinnön mu-35 kaisesti käytettäväksi ennaltaehkäisevän ja/tai terapeuttisen farmaseuttisen valmisteen valmistamiseen Alzheimerin taudin hoitamiseksi.

2

Seniilin plakin - Alzheimerin taudin patologisen tunnusmerkin - pääasialliseksi aineosaksi tunnistettiin AS. Se käsittää 39 - 40 aminohappotähdettä. Lisäksi on tunnettua, että AS vaikuttaa neurotoksisesti ja siten aiheuttaa soiukuolemaa. Vasta äskettäin on keksitty, että AS:n neurotoksisesti indusoima 5 PC12~soiujen kuoleminen Afkn läsnä ollessa vähenee, kun lisätään yhdistettä A (Ebseien).

Esillä olevassa keksinnössä käytetty yhdiste A voidaan syntetisoida JP-patenttijulkaisussa (kokoku) nro 2-38591 (JP-hakemusjulkaisu (kokai) nro 57-67568) esitetyllä menetelmällä.

10 Yhdisteen A valmisteet voidaan valmistaa erilaisiin muotoihin, kuten esim. tableteiksi, kapseleiksi* jauheiksi rakeiksi, siirapeiksi ja injektiovalmis-teiksi, käyttäen tunnettuja valmistusmeneteimiä ja käyttäen lisäaineita, kantaja-aineita, sideaineita, hajoamista edistäviä aineita ja liuottimia.

Seuraavassa taulukossa on esimerkkinä tabletin koostumus: 15 Yhdiste A 50 mg

Karboksimetyylisefiuloosa 25 mg Tärkkelys 5 mg

Kiteinen selluloosa 40 mg

Maanesiumstearaatti___2 mg 20 Yhteensä 122 mg

Yhdiste A .säilyttää ilmoitetun alkuperäisen vaikutuksensa kaikissa valmistemuodoissa, kuten esimerkiksi suun kautta otettuna tai peroraaiisesti annostettuna, esimerkiksi injektoituna.

Oraalisessa käytössä yhdisteen A annos aikuiselle henkilölle on 25 100 - 2 000 mg/päivä, edullisesti 200 - 1 000 mg/päivä, jolloin tätä annosta voidaan potilaan kliinisestä tilanteesta riippuen korottaa tai aientaa.

Yhdisteen A myrkyllisyyden testaamiseksi mitattiin hiirten ja rottien LDso-arvot. Keksijöiden suorittamien kokeiden mukaan hiirillä saadut LD5o-arvot olivat oraalisessa käytössä > 6 810 mg/kg ja intraperitoneaalisessa 30 käytössä 740 mg/kg. Rotilla määritetyt LDso-arvot olivat > 6 810 mg/kg oraalisessa käytössä ja 580 mg/kg intraperitoneaalisessa käytössä. Nämä LDso-arvot osoittavat siten, että yhdiste A on erittäin turvallinen.

Ei edes silloin, kun 'hiirille tai rotille annettiin suuri annos yhdistettä A, voitu havaita mitään ongelmia aiheuttavia sivuvaikutuksia.

35 Esillä olevaa keksintöä kuvataan nyt esimerkkien avulla.

3

Esimerkki!

Yhdisteen A vaikutus inhibiittorina AB:n läsnä ollessa tapahtuvaan AB:n indusoimaan neuronikuolemaan:

Viljellyistä PC12-soluista (peräisin rottien kromilla värjäytyvistä 5 kasvaimista) tehtiin aliviljelmä 100 mm:n polyiysiiniliä päällystetyssä lasimäljassa (valmistaja: Corning) DMEM-väliaineeseen, jossa oli lisänä 10 % FCS:ää ja 5 % hevosen seerumia (Sigman tuote). Toisin sanoen PC12-soluja (1 X 106 Sölua/malja) kasvatettiin polyiysiiniliä päällystetyssä 100 mm;n maljassa. PC12-so!ujen erojen osoittamiseksi PC12-soluja kasvatettiin ensin 7 10 päivää DMEM-väliaineessa, joka sisälsi 5 % FCS:ää, 50 ng/ml N'öF:ä.ä ja 1 % hevosen seerumia. PC12-soiut erotettiin sitten pipetoimaila ja suspendoitiin sopivaan väliaineeseen solususpension saamiseksi. Soiususpensiota lisättiin polyiysiiniliä päällystetyn maljan jokaiseen 96 syvennykseen (1 x 1Ό4 solua/ syvennys). Tämän jälkeen lisättiin Aft:aa (Bachem Feinchemikalien AG) 10 μΜ 15 ioppukonsentraation saamiseksi. Samoin nyt lisättiin yhdistettä A siten, että saatiin loppukonsentraatio 0,1, 1,0 tai 2,5 pM. Kontroliisubstanssiksi lisättiin samana konsentraationa ja samalla tavalla yhdistettä B (yhdiste A, jossa Se korvattu Sillä; yhdisteellä B ei ole giutationiperoksidaasinkaltaista vaikutusta; 2-fe nyy I i-1,2-bentsotiat s o l-3(2 H )-o n i, toimittaja: Nattermann). Soluja viljeltiin 20 yhdisteen A tai yhdisteen B lisäämisen jälkeen 48 tuntia, Näin käsiteltyihin soluihin lisättiin sitten MTT-reagenssia (3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoiiumbromidi). Viljelmää inkuboitiin 4 tuntia ja solut lysoitiin. Jatkokäsittely suoritettiin ns, MTT-meneteimällä, jossa kolon metrisesi! määritetään reagenssin pelkistysreaktioon perustuen suspen-25 siossa olevien solujen elossa pysyminen (Behl, C, et ai., Cell, 77: 817-827, 1994).

° __ °

Yhdiste Ä Yhdiste B

4

Taulukko 1

Yhdisteiden Aja B vaikutus PC12-hermosolujen kuolemiseen

Lisätyt aineet (μΜ) Solujen elossa pysyminen T-koe 5 Ali Yhdiste Yhdiste (% kontrollista) (Student)

A B

1h. 10 10 - - 15 ±9,5 10 0,1 - 45 + 2,1 10 10 * 0,1 14+4,5 10 1,0 - 59+14,5 10 - 1,0 13+1,0 10 2,5 - 66 + 4,5 10 - 2,5 10 + 5,0 15 * P< 0,01, ** P < 0,002, *** P < 0,0001, n = 6 T-koe suoritettiin ryhmillä, joihin oli lisätty Alkaa (10 μΜ),

Kuten taulukosta 1 yksiselitteisesti iimenee, niin neuronien kuolemisen aiheutti Αβ, jolloin kuolleisuuden määrää ei voitu estää lisäämällä yhdistettä B, Kuitenkin, kun yhdistettä A lisättiin määränä 0,1 μΜ, 1 μΜ tai 2,5 μΜ, 20 voitiin kaikissa tapauksissa neuronien kuolemista merkittävästi estää (P < 0,0082, P < 0,0018 ja P < 0,0001},

Esimerkki 2

Viljellyistä PC12-soIuista (peräisin rottien kromilla värjäytyvistä kasvaimista) tehtiin aliviljelmä 100 mm:n polylysiinillä päällystetyssä lasimaljassa 25 (valmistaja: Corning) DMEM-väliaineeseen, jossa oli lisänä 10 % FCS:ää ja 5 % hevosen seerumia (Sigman tuote). Toisin sanoen PC12-soluja (1 x 105 solua/rnap) kasvatettiin polylysiinillä päällystetyssä 100 mm:n maljassa. PC12-so!ujen erojen osoittamiseksi PC12-soluja kasvatettiin ensin 7 päivää PMEM-välialneessa, joka sisälsi 5 % FCS:ää, 50 ng/ml N(3F:ää ja 1 % hevo-30 sen seerumia. PC12-so!ut erotettiin sitten pipetoimalla ja suspendoitiin sopivaan väliaineeseen soiususpension saamiseksi. Solususpensiota lisättiin poly-lysiiniilä päällystetyn 60 mm:n maljan jokaiseen 96 syvennykseen (1 x 104 solua/syvennys). Kun solujen todettiin kiinnittyneen, meneteltiin seuraavasti.

5 Näin kiinnittyneet PC12-solut lisättiin DMEM-väliajneeseen. Soluille lisättiin 10 μΜ SNAPttä ja 2,5 μΜ yhdistettä A. KontrolliFyhmässä lisättiin vain SNAP:tä. Jokaista näytettä inkuboitiin 3 tuntia. Tämän jälkeen jokaiseen PC12-pitoiseen näytteeseen lisättiin etukäteen valmistettua DCFH-DA-liuosta 5 {Molecular Probes, Inc.) DMSO:ssa (1 mg/413 μΙ) 5 μΜ loppukonsentraation saamiseksi. Sitten näytteitä inkuboitiin 30 minuuttia. Solut poistettiin käyttäen irypsiini-EDTA:ta ja otettiin talteen linkoamalla (1 000 r/min, 5 min). Talteen-otetut solut suspendoitiin 50 pkaan PBS(-):ää samalla jäähdyttäen jäillä. Intra-sellulaarisen vetyperoksidin määrä määritettiin läpivirtaussytometrillä. Solusus-10 pensioile suoritettiin FADS (fluorescence-activated cell sorting) ja peroksidien hapettaman fluoresoivan aineen, 2',7’-dikloorifluoresiinin (DGFH) määrä mitattiin. Tulokseksi saatiin, että SNAP-lisäyksen tapauksessa vetyperoksidin muodostus oli 1,3 - 1,4 kertaa suurempi kuin siinä tapauksessa, että SNAP:tä ei lisätty. Lisäksi SNAP-lisäyksen korottamaa vetyperoksidin muodostusta aiensi 15 seivästi yhdisteen A 2,5 μΜ-lisäys (P < 0,0015).

Taulukko 2

Yhdisteen A vaikutus NO:n aiheuttaman H202-nnuodostuksen alenemiseen {PG12“Soluissa, joihin oli lisätty SNAP:tä) Käsitelty Tuotettu H202-määrä 20 (% log kontrollin fluore senssi) SNAPdlä Yhdisteellä B f) (μΜ) (μΜ) 0 0 100,0 25 10 0 135,8 + 5,25 10 2,5 45,7 ±6,03 SNAP: S-nitroso-N-asetyyli-DL-penisiliinamtini ** P < 0,0015 [yhtäpitävä Student T-testin kanssa koskien SNAP:tä (10 μΜ); 30 n = 3]

On otettu huomioon, että Alirsta peräisin oieva NO edistää vetyperoksidin muodostusta. Kuten taulukosta 2 kuitenkin voidaan nähdä, hiin lisäämällä yhdistettä A (2,5 μΜ) voitiin kuitenkin tyydyttävästi estää vetyperoksidin muodostusta.

6

Lyhyesti esitettynä; Alzheimerin taudissa apoptosis voi olla yhteydessä neuronien kuolemiseen. Edelleen on ilmoitettu, että Αβ aiheuttaa neuronien kuolemista ja että neurötoksisuus johtuu vetyperoksidin muodostumisesta (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:7951-7955,1993).

5 Kuten edellä kuvattiin, yhdisteen A lisääminen ehkäisee seivästi Αβ;η indusoimaa vetyperoksidin muodostumista. Täten voitiin osoittaa, että yhdisteellä A on erittäin hyvä ehkäisevä tai terapeuttinen vaikutus Alzheimerin tautiin. Esillä olevassa keksinnössä käytettyä yhdistettä A on siten pidettävä erityisen hyödyllisenä ehkäisevänä tai terapeuttisena vaimisteena seniilin 10 dementian, varsinkin Alzheimerin taudin käsittelyssä.

Esillä olevassa tekstissä käytetyt lyhenteet merkitsevät seuraavaa:

Polyiysiini on lysiinipoiypeptidi, jonka ketjunpituus vaihtelee; DMEM on Deibecco’s modified Eagle's medium; DCFH on 2‘,7,-dlkloorif!uoreseiini; 15 FCS on fetal calf serum; DMSO on dimetyylisulfoksidi;

Trypsiini-EDTA on etyleenidiamiinitetraetikkahappoon perustuva kompleksinmuodostaja: NO on typpioksidi.

20 Esillä oleva keksinnön kohteena on siten farmaseuttinen valmiste

Alzheimerin taudin hoitamiseen ja/tai parantamiseen. Keksinnön mukainen farmaseuttinen valmiste sisältää vaikuttavana aineena 2-fenyyli-1,2-bentsiso-selenatsol-3{2H)-onia (käytetään nimitystä yhdiste A), jonka vaikutus perustuu β-amyloidipröteeiinin indusoiman neuronltöksisuuden alentamiseen.

Claims (2)

1, 2-fenyyli~1,2-bentsisoselenaisoi“3(2H)~onin käyttö Alzheimerin taudin ehkäisyyn ja/tai terapiaan tarkoitetun farmaseuttisen valmisteen valmistukseen, 5

2, Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että farmaseuttista valmistetta voidaan antaa tabletin, kapselin, jauheen, rakeiden, siirapin tai injektiovaimisteen muodossa.