CZ31799A3

CZ31799A3 - Použití 2-fenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-onu k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení Alzheimerovy nemoci

Info

Publication number: CZ31799A3
Application number: CZ99317A
Authority: CZ
Inventors: Ikuo Maruyama; Kazuhiro Abeyama; Hiroyuki Masayasu
Original assignee: A. Nattermann & Cie. Gmbh
Priority date: 1996-08-27
Filing date: 1997-04-07
Publication date: 1999-11-17
Also published as: PT826370E; PL321796A1; IL127113A0; EE9900007A; ATE219361T1; TW501925B; WO1998008831A1; DE59707550D1; SI9720060A; US5948800A; FI982689A; AU3529897A; EP0826370B1; IL127113A; AU3866997A; LV12251B; DE19733690A1; DK0826370T3; LV12251A; BR9711259A

Description

Použití 2-fenyl-l,2-benzisoselenazol-3(2H)-onu k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení Alzheimerovy nemoci

Oblast techniky

Předložený vynález se týká použití 2-fenyl-l,2benzisoselenazol-3(2H)-onu k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení Alzheimerovy nemoci, speciálně preventivního a/nebo <

terapeutického farmaceutického přípravku pro léčení Alzheimerovy nemoci, který jako účinnou látku obsahuje 2-fenyl1,2-benzisoselenazol-3(2H)-on, přičemž tato účinná látka snižuje neuronovou toxicitu, která je způsobovaná b-amyloidproteinem.

Dosavadní stav techniky

V některých zemích jsou acetylcholinsterázové inhibitory jako například physostigmin nebo tetrahydroaminoakridin (THA) používány jako preventivní a/nebo terapeutická léčiva pro Alzheimerovu nemoc. Přitom však nebyly zaznamenány žádné úspěchy. Byly též prováděny pokusy vyvinout 5-HT-antagonisty, které působí na nervový systém, avšak jejich mechanismus ještě není zcela uspokojivě vysvětlen.

Patologickými znaky Alzheimerovy nemoci jsou senilní plaky a nahromadění se PHF (dvojice šroubovitých vláken) v mozku.

b-amyloid-protein, který bude dále označován jako Αβ a který je hlavní složkou senilních plaků, je nerozpustný peptid, • · · · · · 9 • 9 9 * · 9 9 9 • · · · · · • 9 9 9 9 9 · 9 9 • 9 9 9 9

9999 99 99 999 skládající se z přibližně 40 aminokyselinových zbytků. Bylo zjištěno, že Αβ biochemicky poškozuje neurony a že zejména volný nerozpuštěný Αβ vyvolává tento efekt.

Proto by bylo žádoucí vyvinout látku, která by předcházela šíření se senilní demence Alzheimerova typu a/nebo by ji léčila, přičemž tato látka by se skládala z farmaceutických přípravků, které by potlačovaly odumírání neuronů vyvolané toxickým Αβ.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití 2-fenyl-l,2-benzisoselenazol3(2H)-onu k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení Alzheimerovy nemoci. Byly provedeny dvě podrobné studie směřující k nalezení nízkomolekulárních sloučenin, které by byly - schopné překonat hematoencefalitickou bariéru a snížit neuronovou toxicitu Αβ. Přitom bylo překvapivě zjištěno, že 2fenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-on (dále bude zkráceně označován jako sloučenina A) má vynikající účinek, na kterém je vynález založen.

Sloučenina A podle předloženého vynálezu inhibuje odumírání neuronů, způsobené přítomností Αβ. Z tohoto důvodu je vhodné použít sloučeninu A jako preventivní a/nebo terapeutický farmaceutický přípravek k léčení Alzheimerovy nemoci.

Αβ byl identifikován jako hlavní složka senilních plaků, což je patologický prvek Alzheimerovy nemoci. Skládá se z 39 až 40

9 9 · · · · 9 · • 9 9 9 9 · 9 · 4 • · · 9 9 · · · · 9

999 4 9 9 94 944 944

9 9 4 9 4 9

4444 9 9 94 999 9 4 99 aminokyselinových zbytků. Dále je známo, že Αβ agreguje a působí neurotoxicky a vyvolává tak odumírání buněk. Nedávno bylo zjištěno, že odumírání buněk PC12 v přítomnosti Αβ je potlačeno, pokud je přidána sloučenina A (ebselen). Proto lze očekávat, že sloučenina A představuje vynikající preventivní a/nebo terapeutický farmaceutický přípravek k ošetřování Alzheimerovy nemoci.

Sloučenina A podle předloženého vynálezu je možné syntetizovat podle postupu, který je popsán v japonském patentovém spise (kokoku) č. 2-38591 (zveřejněná japonské přihláška patentu (kokai) č. 57-67568).

Sloučenina A může být podávána různými způsoby jako například tabletami, kapslemi, prášky, granuláty, sirupy a injekcemi za použití známých technik vytváření přípravků spolu s aditivy, mezi něž patří vehikula, vazebná činidla, uvolňovací činidla a rozpouštěcí činidla.

Následující tabulka ukazuje příklad složení tablety :

sloučenina A	50	mg
karboxymethylcelulóza	25	mg
škrob	5	mg
krystalická celulóza	40	mg
stearan horečnatý	2	mg
Celkem	122	mg

9 9 9 9 9 9 99 · · • 9 · · 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9» 9 9999

999 999 99 999 999

9 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 99 99

Sloučenina A si zachová svůj primárně požadovaný účinek při libovolném způsobu podáni, tedy například i při obvyklé orální aplikaci nebo při perorální aplikaci, například injekcí.

V případě orální aplikace se dávka sloučeniny A pohybuje u dospělých mezi 100 až 2000 mg/den, výhodně mezi 200 a 1000 mg/den, přičemž tato dávka může být v závislosti na klinickém stavu pacienta odpovídajícím způsobem zvýšena nebo snížena.

Toxicita sloučeniny A byla zkoumána stanovením hodnoty LD₅₀ u myší a krys. Podle pokusů vynálezců činily u myší zjištěné hodnoty LD₅₀ > 6,810 mg/kg při orálním podávání a 740 mg/kg při intraperitoneálním podávání. U krys byly zjištěné hodnoty LD₅₀> 6,810 mg/kg při orálním podávání a 580 mg/kg při intraperitoneálním podávání. Tyto hodnoty LD₅₀ dokazují, že sloučenina je velmi bezpečná.

I v případě, že myším nebo krysám byla podána velká dávka sloučeniny A, nebyly pozorovány problematické vedlejší efekty.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález bude dále blíže popsán na základě příkladů, přičemž tyto příklady nikterak neomezují předložený vynález.

Příklad 1

Účinek sloučeniny A jako inhibitoru odumírání neuronů v přítomnosti Αβ • · «· φφ » · Φ <

• Φ 1

Buňky PC12 (které pocházejí z krys, chromafinní tumor) byly kultivovány a subkultivovány v 100 mm misce (výrobce Corning), která byla potažena polylysinem a která obsahovala médium DMEM, ke kterému bylo přidáno 10 % FCS a 5 % koňského séra (výrobce Sigma). Buňky PC12 (1 χ 10⁶ buňek na misku) byly naočkovány do 100 mm misky, která byla potažena vrstvou polylysinu. Aby bylo možné indukovat diferenciaci buněk PC12, rostly buňky PC12 po dobu sedmi dní v médiu DMEM, které obsahovalo 5 % FCS, 50 ng/ml NGF a 1% koňského séra. Buňky PC12 byly potom pipetací odděleny a byly suspendovány ve vhodném médiu, aby se získala buněčná suspenze. Buněčná suspenze byla potom naočkována do každé jamky misky s 96 jamkami (1 χ 10⁴ buněk na jamku), které byly potaženy polylysinem. Poté byl přidán Αβ (Bachem Feinchemikalien AG) tak, aby nakonec bylo dosaženo koncentrace 10 μΜ. Byla také přidána sloučenina A tak, aby byla dosažena výsledná koncentrace 0,1, 1,0 nebo 2,5 μΜ. Jako kontrolní látka byla se stejnou koncentrací a stejným způsobem přidána sloučenina B (sloučenina A, -substituovaná sírou; bez účinku podobného účinku glutathion-peroxidázy); 2-fenyl-l,2benzothiazol-3(2H)-on; dodavatel Nattermann). Po přidání sloučeniny A nebo sloučeniny B byly buňky 48 hodin kultivovány.

K takto připraveným buňkám bylo přidáno MTT činidlo (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazolium bromid). Následná inkubace trvala čtyři hodiny a byla provedena lýze buněk. Následné zpracování bylo provedeno pomocí tzv. MTT postupu, který je založen na kolorimetrickém efektu redukčních reakcí činidla, aby se zjistila životnost buněk v suspenzi (Behl, C. a kol., Cell, 77: 817-827, 1994).

sloučenina A sloučenina B

Tabulka 1:

Účinek sloučenin A a B na odumírání buněk PC12-neuronů.

přidané sloučeniny (μΜ)životnost Studentův -----------------------buněk T-test sloučenina (% kontroly) ~

Αβ	A	B
lh.10
10	-	-	15 + 9,5
10	0,1	-	45 + 2,1
10	-	0,1	14 + 4,5
10	1,0	-	59 + 14,5
10	-	1,0	13 + 1,0
10	2,5	-	66 + 4,5
10	-	2,5	10 + 5,0

	-	• · • 7 - • ···	·· • · · • · · • · · • • · ·	• · · • · · · · 9 · · · • · · · · • · · 9 · · · ·	·· ·· • · · • · 9 99 9 999 9 9 9 9 9 9
* :	P < 0,01
* * .	P < 0,002
*** .	P < 0,0001
n=6
T-test byl proveden u skupin,	ve kterých	byl	přidán Αβ	(10 μΜ).
Jak	zřetelně vyplývá z Tabulky 1, bylo	odumírání	neuronů
způsobeno Αβ, přičemž míra	odumírání	nemohla být	snížena

přidáním sloučeniny B. Jakmile však byla přidána sloučenina A v množství 0,1 μΜ, 1 μΜ nebo 2,5 μΜ, bylo ve všech případech podstatným způsobem potlačeno odumírání neuronů (P < 0,0082, P < 0,0018 a P < 0,0001).

Příklad 2

Buňky PC12- (které pocházejí z krys, chromafinní tumor) byly kultivovány a subkultivovány v 100 mm misce (výrobce Corning), která byla potažena polylysinem a která obsahovala médium DMEM, ke kterému bylo přidáno 10 % FCS a 5 % koňského séra (výrobce Sigma). Buňky PC12 (1 χ 10⁶ buňek na misku) byly naočkovány do 100 mm misky, která byla potažena vrstvou polylysinu. Aby byla indukována diferenciace buněk PC12, rostly buňky PC12 po dobu sedmi dní v médiu DMEM, které obsahovalo 5 % FCS, 50 ng/ml NGF a 1% koňského séra. Buňky PC12 byly potom pipetováním odděleny a byly suspendovány ve vhodném médiu, aby se získala buněčná suspenze. Buněčná suspenze byla naočkována do každé jamky 60 mm misky s 96 jamkami (1 χ 10⁴ buněk na jamku), která byly potaženy polylysinem. Poté, co byla potvrzena adheze buněk, byl vykonán následující postup.

Takto přichycené buňky PC12 byly umístěny do média DMEM. K buňkám bylo přidáno 10 μΜ SNAP a 2,5 μΜ sloučeniny A. Do kontrolních skupin byl přidán pouze SNAP. Každý vzorek byl tři hodin inkubován. Poté byl do každého vzorku obsahujícího PC12 přidán předem připravený roztok DCFH-DA (Molecular Probes, lne.) v DMSO (1 mg/ 413 μΐ) tak, aby konečná koncentrace činila 5 μΜ. Vzorky potom byly 30 minut inkubovány. Použitím trypsinuEDTA byly buňky odstraněny a odděleny centrifugací (1000 ot/min po 5 minut). Získané buňky byly suspendovány v 50 μΐ PBS(-), přičemž byly ochlazovány ledem. Množství mezibuněčného peroxidu vodíku bylo stanoveno průtokovým cytometrem. Buněčná suspenze byla podrobena FACS (fluorescence-activated cell sorting fluorescenčně aktivované třídění buněk) a bylo měřeno množství fluoreskující látky 2', 7'-dichlorofluoresceinu (DCFH), která byla zoxidovaná peroxidem. Jako výsledek bylo zjištěno, že v případě přidání SNAP byl vznik peroxidu vodíku 1,3 - 1,4 vyšší než v případě, kdy nebyl přidán žádný SNAP. Kromě toho byl zvýšený vznik peroxidu vodíku, který byl přičítán přidání SNAP, významně potlačen přidáním 2,5 μΜ sloučeniny A (P < 0,0015).

Tabulka 2:

Účinek sloučeniny A na potlačení vzniku peroxidu vodíku, vyvolaný oxidem NO (v buňkách PC12, ke kterým byl přidán SNAP)

SNAP vystaveno působení množství vytvořeného

H₂O₂ (% log fluorescence sloučenina B • · ♦ · ·« ·· • · · · 9

9 9 9 • 9 99 9 9 • · · ·· » · · · ··

99

999 999

9

9 99

(μΜ)	(μΜ)	kontrolního vzorku)
		(*)
0	0	100,0
10	0	135,8 + 5,25
10	2,5	45,7 + 6,03

SNAP: S-nitroso-N-acetyl-DL-penicilinamin **: P < 0,0015 (v souladu se Studentovým T-testem vzhledem k SNAP (10 μΜ); n=3)

Bylo zohledněno, že z Αβ pocházející NO urychluje vznik peroxidu vodíku. Jak je však možné vyčíst z tabulky 2, byl vznik peroxidu vodíku uspokojivě potlačen přidáním 2,5 μΜ sloučeniny A.

Nedávno bylo zjištěno, že u Alzheimerovy nemoci může být apoptóza v souvislosti s odumíráním neuronů. Krom toho bylo také publikováno, že odumírání neuronů je vyvoláváno Αβ a že neurotoxicita je způsobována vznikem peroxidu vodíku (Proč. Nati. Acad. Sci. USA., 90:7951-7955, 1993).

Jak již bylo výše popsáno, je vznik peroxidu vodíku způsobovaný Αβ znatelně potlačen přidáním sloučeniny A. Proto bylo prokázáno, že sloučenina A má vynikající preventivní nebo terapeutický účinek na Alzheimerovu nemoc.

··· · · • ·

• · ·· ··

Sloučenina A podle předloženého vynálezu tedy představuje obzvláště užitečný preventivní nebo terapeutický přípravek pro senile dementia, zejména pro Alzheimerovu nemoc.

V předložené přihlášce znamenají použité zkratky následující:

Polylysin je lysinový polypeptid s proměnnou délkou řetězce; DMEM znamená Delbecco's modified Eagle's medium;

DCFH je 27'-dichlorfluorescein;

FCS znamená fetal calf sérum (fetální telecí sérum);

DMSO je dimethylsulfoxid;

trypsin EDTA je komplexotvorné činidlo na bázi kyseliny ethylendiamintetraoctové;

NO je oxid dusitý.

Zastupuj e

JUDr. O. Švorčík, v.r

JUDr. O. Švorčík, advokát 120 00 Praha 2, Hálkova 2

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití 2-fenyl-l,2-benzisoselenazol-3(2H)-onu k výrobě farmaceutického přípravku k profylaxi a/nebo terapii demence.
2. Použití podle nároku 1 k výrobě farmaceutického přípravku k profylaxi a/nebo terapii senilní demence.
3. Použití podle nároku 1 nebo 2 k výrobě farmaceutického přípravku k profylaxi a/nebo terapii demence Alzheimerova typu.
4. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje 2-fenyl-l, 2-benzisoselenazol-3(2H)-on a farmaceutický přípravek lze použít k profylaxi a/nebo terapii Alzheimerovy nemoci.
5. Farmaceutický prostředek podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že prostředek lze použít jako tabletu, kapsli, prášek, granulát, sirup nebo jako injekci.

Zastupuje: