KR930000274B1

KR930000274B1 - 인간 조직 인자 억제제의 dna의 클론.

Info

Publication number: KR930000274B1
Application number: KR1019880009237A
Authority: KR
Inventors: 존 브로우즈 2세 조즈; 구사노 크렐스머 구니꼬; 체인 운 세
Original assignee: 몬산토 캄파니; 아놀드 하비 콜; 워싱턴 유니버시티; 에드워드 레스리 멕코르디
Priority date: 1987-11-23
Filing date: 1988-07-22
Publication date: 1993-01-14
Also published as: NZ225535A; NO310466B1; CA1341223C; EP0318451B1; PT88076B; FI883487A0; JPH01165383A; FI883487A; ATE111518T1; JP2005306875A; FI93365C; DE3851511D1; NO20013608D0; NO883270L; JPH1175875A; IL87171A0; IE65393B1; DK413488D0; DK413488A; FI93365B

Abstract

내용 없음.

Description

인간 조직 인자 억제제의 DNA의 클론

제1도는 125 I - 제Xa인자로 표지된 λgtll클론의 방사선 사진이고,

제2도는 P9삽입자(inserts)의 부분적인 제한지도와 삽입순서에 대한 것이며,

제3도는 인간 TFI cDNA의 뉴클레오타이드 서열과 번역된 아미노산 서열에 관한 것이며,

제4도는 TFI에서 아미노산 서열의 하전된 상태를 나타내는 그래프이고,

제5도는 TFI의 소수성 정도를 나타내는 그래프이며,

제6도는 TFI의 기본적인 프로테아제 저해제의 영역과 다른 기본적인 프로테아제 저해제를 정렬시킨 것이고,

제7도는 간에서 채취한 세가지의 세포주로부터 분리한 RNA를 노던 블로트분석 (Nothern blot analysis)한것을 나타내는 것이다.

본 발명은 조직 인자 억제제(TFI)로서 알려진 응혈억제제와 응혈 저해제가 결합된 리포프로테인(LACI)과 같은 응혈저해제에 관한 것으로, 특히 완전한 크기의 TFI를 발현하는 cDNA클론에 관한 것이다. 포유동물의 혈액에서 일어나는 응혈과정은 두개의 명확한 체계, 즉 내적요인응고계와 외적요인응고계로 구분되는 것으로, 후자의 외적요인 응고계는 본 발명에서 조직인자(TF)로 기재하고 있는 조직트롬보플라스틴(제Ⅲ인자)과 혈액이 접촉함으로써 반응이 시작된다.

조직인자는 많은 세포종의 혈장막에서 생성되는 리포프로테인으로 뇌와 폐에 특히 풍부하게 존재한다. 혈액과 TF가 접촉하면 혈장 제Ⅶ인자 혹은 이것의 활성화 형태, 즉 제Ⅶa인자는 TF와 칼슘의 존형복합체를 형성한 다음, 단백질 가수분해적으로 제X인자를 활성화 제X인자(Xa)로, 제Ⅸ인자를 활성화 제Ⅸ인자(Ⅸa)로 활성화 시킨다.

일찌기 TF의 조절-초기 응혈에 관한 연구에서, 혈청과 TF(조 조직 트롬보플라스틴 조제중)를 반응시키면 시험관내에서 TF의 활성이 억제되었으며 그것을 쥐에 투여했을때 쥐의 치사효과를 방지할 수 있음이 밝혀진바 있다. Scand. j. Clin. Lab. Invest. 9, Suppl. 27, 76-97(1957)에서 히졸트(Hjort)등은 종래의 연구결과를 확인하고 이 분야의 연구를 더욱 확장하여 더욱 확장하여 제Ⅶ인자와 TF의 복합체는 혈정에서 저해를 일으키는 일부분이라는 결론을 이끌어 낸바 있다. 이 가정은 혈장에서 일어나는 TF의 저해는 Ca⁺⁺를 필요로하며(또한 제Ⅶ/Ⅶa인자가 TF에 결합하는 것이 필요하다), EDTA와 2가의 양이온이 킬레이트를 형성하므로서 저해가 방지되거나 저해를 일으키게 된다는 사실과 일치하는 것이다. 최근의 연구에서 제Ⅶa인자 뿐만 아니라, 촉매적으로 활성인 제Xa인자가 부가적인 인자가 혈장이나 혈청에서 TF저해 유발에 필요하다는 것이밝혀진바 있다(브로즈(Broze)와 밀레티크( Miletich)의 Blood 69, 150-155(1 987)과 산더스(Sanders)등의 Ibid., 66, 204-212(1985)를 참조).

이와 같은 부가적인 인자를 본 발명에서는 조직 인자 저해제(TFI)로, 응혈저해제가 결합된 리포프로테인(LACI)으로 기재하며, 이들은 바름이 흡착된 형태로 혈장에 존재하며 혈청을 1.21g/cm³의 밀도에서 원심분리했을 때 TFI의 생리활성이 리포프로테인과 함께 분리되는 것으로 보아 리포프로테인과 결합되어 있는 것으로 판단된다.

브로즈와 밀레티크등은 Supra와 Proc. Natl. Acad, Sci. USA 84, 1886-18 90(1987)기재에서와 같이 HepG2세포(인간간종양세포주)가 혈장에 존재하는 TFI와 같은 특성을 같은 특성을 갖는 저해물질을 분비함을 밝힌바 있다.

1987. 7. 23.출원되어 계류중인 미국특허 출원특허 제77,366호에서 정제된 조직 인자 저해제(TFI)는 HepG2세포로 부터 분비된다는 것을 기재하고 있다. TFI는 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)시에 약 37,000-40, 000달톤으로 이동하는 TFI₁과 약 25,000-26,000달톤으로 이동하는 TFI₂의 두가지 형태로 존재한다. TFI의 부분적인 N-말단 아미노산 서열은

으로 X-X부분은 확인되지 않았다.

본 발명에 의해 완전한 크기의 조직 인자저해제(TFI)를 발현하는 cDNA클론의 완전한 유전정보 서열이 밝혀졌다.

우선 인간의 태반과 태아간 λgtll cDNA라이브러리를 정제 TFI를 생산하는 토끼의 폴리클로날(Polyclonal)항혈청과 함께 분리한 다음, 125 I - 제Xa인자 결합할성에 대하여 면역학적으로 양성인 클론을 더욱 선별하여 면역학적으로 활성이고 기능적으로 활성인 일곱개의 클론을 얻었다. 가장 긴 클론, 즉 태반에서 유래된 λP9는 1.4Kb 길이인 반면, 나머지 여섯개는 1.0Kb이었다. 1.0Kb인 클론의 DNA서열은 더길은 1.4Kb클론의 일부분과 서열이 같은 것으로 확인되었다. 뉴클레오타이트 서열 분석결과, λP9의 1432염기쌍(bp) cDNA삽입체로 구성되어 있으며 5'-말단에 133bp의 비암호부분, 912bp의 유전정보 함유 부분, 정지코돈과 384bp의 3'-말단 비암호화 부분을 포함하고 있음을 알수 있었다.

cDNA서열은 18개의 시스테인과 7개의 메티오닌을 포함하여 276개의 아미노산으로된 31,950달톤의 단백질로 되어있다. 번역된 아미노산 서열은 28개의 아미노산으로된 시그널 펩타이드(Signal Peptide)가 성숙된 TFI 단백질 앞에 위치하는 것을 보여준다. 성숙된 TFI는 본 발명에서 기재된 λP9에서 ATG번역코돈에 의한 TFI와 메티오닐 TFI를 포함하는 것으로 정의한다. Asn-X-Ser/Thr서열을 가진 TFI 단백질에는 잠재적인 N-결합 글리코실화(glycosylation)부위가 있으며, 여기에서 X는 보통 20개의 아미노산중 어떤것일 수 있다.

이 위치는 5'-말단의 비암호와 부위 이후의 첫번째 메틴오닌을 아미노산의 +1위치로 정할 때 145번째의 Asn, 195번째의 Asn, 256번째의 Asn에 위치하게 된다. TFI의 번역된 아미노산 서열은 음이온으로 매우 하전된 N-말단, 양이온으로 매우하전된 카르복시-말단, 전형적인 쿠니츠(Kunitz)형의 효소억제제 서열과 동일한 부분이 3개로 구성된 중간단백질을 포함하여 여러 가지의 식별할 수 있는 부분을 보여준다. 동질성 실험을 근거로 할 때, TFI는 많은 기본적인 프로테아제 억제제 유전자 군으로 될 수 있다.

λP9의 cDNA클론을 얻기위한 단백질 물질의 기본적인 자원은 인간의 태반조직으로, 이 조직은 통상적인 외과수술 방법에 의해 채취 한후 광범위하게 이용할 수 있으며, 본 발명에서 사용한 λgtll(lac5 nin5 c1857 S100)은 공지된 것으로 λ파이지 발현 벡터로서 보통 사용될 수 있다. 또한 λgtll의 구조와 제한효소 지도는 영(Young)과 데이비스(Davis)등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194-1198(1983)에 기재되어 있다.

노던블로트분석(Northen bolt analysis)결과, 간에서 얻은 세포주, 즉 창간장세포, HepG2간종양세포, SK-HEP-1 간종양세포 등 모두는 TFI cDNA와 하이브리다이즈(hybridize)되는 2개의 주된 mRAN(1.4Kb와 4.4Kb)를 포함하는 것을 보여준다.

본 발명의 기재와 같이 TFI를 위한 cDNA의 클로닝과 그것의 모든 단백질 서열과 구조의 확인은 더욱 상세한 구조-기능분석을 가능하게 하며 그것의 생합성에 있어서 조절에 관한 연구에 기초를 제공한다. 따라서 본 발명은 의학에 있어서 제Xa인자와 제Ⅶa인자/TF효소복합체를 저해할 수 있는 제제에 대한 응혈과정의 연구에 중요한 것이다.

본 발명을 첨부한 도면과 함께 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

제1도는 125-제Xa인자로 λgtll클론을 스크리닝한 것을 나타내는 것이다. 클론화된 파이지의 용해물(0.1ml)을 작은점으로 만드는 블로트 장치(dot blot appar atus)를 사용하여 흡인에 의해 니트로셀룰로오즈 페이퍼상에 점으로 찍은 다음, 니트로셀룰로오즈 페이퍼를 125 I-제Xa인자로 표시하고 후술하는 방법으로 자동방사선 사진촬영을 하였다. 검은색 반점으로 나타나는 클론은 125 I-제Xa인자와 결합하는 양성클론이며 대조 λgtll(아랫쪽 오른쪽 구석)과 다른 클론들은 125 I-제Xa인자와 결합하지 않는 것이다.

제2도는 λP9삽입자의 부분적인 제한지도와 삽입순서를 나타내는 것이다. 밑부분의 눈금은 뉴클레오타이드의 위치를 나타내는 것이며, 굵은 선은 암호부분을 표시하는 것이고, 가는 선은 5'-말단과 3'-말단의 비암호부분을 표시하는 것이다.

제한효소의 위치는 소화를 시켜 확인하였으며, 화살표는 cDNA의 서열을 확인하기 위해 사용된 중첩되는 M13 콜론을 나타내는 것이다.

제3도는 인간 TFI cDNA의 뉴클레오타이드 서열과 번역된 아미노산 서열을 나타내는 것이며 뉴클레오타이드 번호는 오른쪽에 기재하였다. 밑줄친 서열은 정체된 TF I단백질과 두 개의 V₈프로테아제+트립신으로 소화시킨 펩타이드의 아미노산 서열 분석에 의해 각각 확인한 것이다. 아미노산 +1은 5'-말달의 비암호부분이 끝나는 코돈 다음에 나타나는 첫번째 메티오닌으로 지정하였다. 잠재적인 N-결합 글리코실화 위치는 별표로 표시하였다.

제4도는 TFI에 있어서 아미노산 서열의 하전된 상태를 나타내는 그래프이다. 하전량은 첫번째 잔기로부터 i번째 잔기까지를 계산하여 i번째 잔기에 표시하였다. 따라서 i번째 위치와 수치는 첫번째 잔기에서부터 i번째 잔기의 모든 하전량을 합한것이고 i번째 잔기와 j번째 잔기 (j＞i)사이의 하전량의 차이가 i번째부터 j번째까지 단편의 순하전량이다.

제5도는 TFI의 소수성 정도를 나타내는 그래프로서, 소수성 정도는 아미노산 잔기의 소수성율이 단백질내에 묻혀있는(X-선 결정학적 자료로부터) 깊이로 정의한 것인 관계로 컴퓨터 프로그램에 의해 분석했다.[Kidera등, J. Protein Chem. 4, 23-55 (1985)].

염기서열에 따른 소수성 정도는 IMSL라이브러리에 있는 프로그램 ICSSCU[ IMSL라이브러리 레프런스매뉴얼, 9판, Institute for Mathematical and Statistical Subroutine Library, Houston, Texas(1982)]를 사용하여 행하였다.

제6도는 다른 기본적인 프로테아제 저해제와 TFI의 기본적인 프로테아제 저해제 부분을 일치시켜 놓은것이다. TFI를 제외한 모든것의 서열은 내셔날 바이오메디칼 리서치 화운데이션 프로테인 시퀀 데이타베이스(조지타운대학, 와싱턴, D.C.,에서 1987. 6. 13. 양도)에서 얻었다. 1. 소의 기본적인 프로테아제 저해제 전구체 2. 소의 초유에서 얻은 트립신 저해제 ; 3. 소형철의 기본적인 프로테아제 저해제 ; 4. 식용 달팽이의 이소 억제제K(isoinhibitor K) ; 5. 붉은 바닷거북의 기본적인 프로테아제 억제제 (1-79번의 아미노산만 기재 하였다) ; 6. 서부 사막의 독사에 분리한 독의 기본적인 프로테아제 억제제I ; 7. 방울뱀독의 기본적인 프로테아제 억제제II ; 8. 케이프코브라독의 기본적인 프로테아제 저해제II ; 9. 러셀 독사독의 기본적인 프로테아제 저해제II ; 10. 사막에서 사는 독사독의 기본적인 프로테아제 저해제III ; 11. 동부 초원에 사는 맘바독의 기본적인 프로테아제 저해제I의 동족체 ; 12. 검은 맘바독의 기본적인 프로테아제 저해제B ; 13,14,15 각각은 검은 맘바독의 기본적인 프로테아제 저해제E, I, K ; 16. β-1-분가로톡신(Bun-garotoxin) B사슬(작은것) ; 17. β-1-분가로톡신 B사슬(큰것 ) ; 18. β-1-분가로톡신 B사슬 ; 19. 말의 인터-α-트립신 저해제[아미노산 1-57 (1) : 58-123(1)] ; 20. 돼지의 인터-α-트립신저해제[아미노산 1-57(1) ; 58-1 23(2)] ; 21. 소의 인터-α-트립신 저해제[아미노산 1-57(1) ; 58-123(2)] ; 22.인간의 α-1-마이크로글로블린/인터-α-트립신 저해제 전구체[아미노산 227-283 (1) ; 284-352(2)] ; 23. TFE[아미노산 47-117(1) ; 118-188(2) ; 210-280( 3)] 빈곳은 가장 잘 정열시키기 위하여 16,17,18에 포함되어있다. 아미노산에 대하여는 하나로된 문자 기호를 사용하였다.

제7도는 3종류의 간에서 유래된 세포주로부터의 RAN에 대한 노더른 볼로트 분석을 나타내는 것이다. 10μg의 폴리(A)＋RAN를 각각 레인에 사용하였으며, 1번 레인은 창(Chang)간장 세포, 2번레인은 SK-HEP-1간중앙세포, 3번레인 HepG2 간종양세포에서 분리한 것이다.

뉴클레오타이드 염기를 아데닌은(A), 티민은(T), 구아닌은(G), 시토신은 (C)의 표준 생화학 명명법을사용하여 정하였다.

상응하는 뉴클레오타이드는, 예를들어 데옥시구아노신-5'-트리포스페이트 dG TP로 기재하는 것과 같이기재하였다.

DNA 뉴클레오타이드 서열의 구조를 편리하게 표현하기 위해 하나의 스트랜드상에서 A는 그것의 다른 한 스트랜드에 T를 함유하며 G는 C를 함유하는 것을 하나의 스트랜드로만 나타내었다. 아미노산은 다음과같이 세문자 혹은 한 문자로된 된 약어로 표시하였다.

약 어 아미노산

A Ala 알라닌

C Cys 시스테인

D Asp 아스파르트산

E Glu 글루탐산

F Phe 페닐알라닌

G Gly 글리신

H His 히스티딘

I Ile 이소루이신

K Lys 라이신

L Leu 루이신

M Met 메티오닌

N Asn 아스파라긴

P Pro 프롤린

Q Gln 글루타민

R Arg 아르기닌

S Ser 세린

T Thr 트레오닌

V Val 발린

W Trp 트립토판

Y Tyr 티로신

본 발명에서 보통 이용할 수 있는 제한 효소는 다음과 같은 인식 부위를 절단하는 것으로 절단위치(화살표로 표시)를 다음과 기재하였다.

다음의 실시예에서 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

재료 ; 인간의 태반과 태아의 간장 cDNA라이브러리는 클론테크(Cloneteck)로부터, 프로트블로트 면역선별 장치는 Promega Bioteck로부터, 제한요소는 New Engl and Biolabs에서 구입하였다. 송아지 내장의 알카린 포스파타아제, T₄DNA리가아제, DNA폴리머라제 I(클레노우), 엑소-뉴크리어아제 III와 Sl뉴클리어아제는 Boehringe r Mannheim에서 구입하였으며, dNTP는 P. L. Biochemicals에서, 5'-[α-³⁵S]-티오-dATP(600ci/미리몰)은 Amersham, 염기 서열을 결정하는 장치(시쿼나제)는 Unite d States Biochemicals로부터 구입하였다.

창(Chang)간장세포(ATCC CCL 13)와 HepG2간종양세포(ATCC HB 8065)는 ATCC로부터 분양받았으며, SK-HEP-1 간종양 세포는 1971년에 G. Trempe of Sloan-Ketteri ng Institute가 암연구를 위하여 간의 아데노카르시노마로부터 분리한 것으로 현재는 광범위하게 그리고 쉽게 이용할 수 있는 것이다.¹²⁵I-제Xa인자는 요오드-겐(Io do-gen)을 사용하여 방사능 표지시켜 제조했으며, 비방사능은 2000dpm/n g이었다. 97%이상의 방사능은 10%의 트리클로로아세트산(TCA)에 침전되며, 요오드로 표지된 단백질은 스펙트로자임(Spectozyme) Xa(American Diagnostica사 제품)에 대해 80%이상의 촉매능을 보유한다.

항-TFI-Ig 세파오로스

4B컬럼은 다음과 같은 방법으로 제조하였다 ; 성숙된 TFI의 3-25번째 아미노산 서열에 상응하는 서열을 포함하는 펩타이드(TFI-펩타이드)를 바이오시스템의 고상 펩타이드 합성 방법을 사용하여 합성한다. TFI-펩타이드 (5mg)를 10mg의 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole lympet hemocyanin)에 글루타르알데하이드를 이용하여 결합시켰다. 두파리의 뉴질랜드산 흰 1ml의 Freund 완전 보조제와 1ml의 결합제(200μg의 TFI-펩타이드)를 함유하는 균질액을 피하주사하여 면역시켰다.

한달후에 토끼를 1ml의 Freund 불완전 보조제와 1ml의 결합제(100μg의 결합제)를 함유하는 균질액으로 더욱 면역시켰다. 더욱 면역시키기 위한 주사(부스터 주입)을 매달 행하면서 3개월동안 매주 항혈청을 체취하였다. TFI-펩타이드에 대한 특이 항체를 분리하기 위하여 항혈청을 TFI-펩타이드 세파로오스 4B컬럼상에서 크로마토그래피를 행하였다.

컬럼을 10배의 용적량의 PBS(0.4M NaCl-0.1M 벤즈아미딘-1%트리톤

X-100)로 세척한 다음, 트리톤X-100이 함유되지 않은 같은 용액으로 세척한다. 항체를 0.1M글리신/HCl, pH2.2로 용출시킨 다음, 1M의 트리스-OH 1/10배의 용적량을 첨가하여 즉각 중화시키고 생리식염수로 투석한다. 분리된 항체를 시아노겐 브로마이드로 활성화된 세파로오스 4B에 산업적으로 사용되는 방법을 사용되는 방법을 사용하여 결합시켜 세포 배양 배지로 부터 TFI를 분리하는데 사용했다.

창(Chang)간장 세포는 브로즈와 미레티크, Proc. Natl. Acad Sci. USA 84, 1 886-1890(1987)에 기재된 방법으로 배양한 다음, 순화배지를 항-TFI-Ig세파로오스 4B컬럼상에서 크로마토그래피하였다. 컬럼을 10배의 용적량의 PBS-1% 트리톤 X-100으로 세척한후 PBS로 다시 세척한다.

결합된 TFI를 0.1M글리신/HCl, pH2.2로 용출시킨다. 면역 친화성 크로마토그래피로 분리된 TFI를 소듐 도데실설페이트로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Savant장치)으로 더욱 정제했다. 최종 제품의 아미노산 분석결과, 1987년 6월 23일 출원되어 계류중인 미국특허 출원번호 제77,366호에 기재된 바와같은 HepG2세포로부터 분리된 TFI의 N-말단 염기서열과 같았다. 그 다음에 분리된 창(Chang) 간장 TFI를 상술한 면역화 방법에 의해 토끼를 면역화시키기위해 사용했다. 얻은 항혈청은 이중 면역확산 실험에서 약 100μg/ml의 역가를 가지며 이항혈청을 λgtll cDNA라이브러리의 면역분리(immuno-screening)를 위해 사용했다.

[방법]

CDNA클론의 분리 ; 항체를 사용하여 태반과 태아간 cDNA라이브러리를 선별하는 방법, 플라그(Plague)정제, λ파아지용해물과 DNA의 제조는 Wun과 Kretzmer등의 FEBS Lett. 1, 11-16(1987)에 기재된 방법과 같은 방법으로 행하였다. 항헐청을 BNN 97λgtll 용해물과 미리 결합시킨 다음, 라이브러리를선별하기 위해 1/500로 희석하였다.

제Xa인자 결합능의 실험 ; 면역양성인 λ파아지 단리물이나 대조 λgtll로부터 이소프로필-β-티오갈락토시이드에 의해 유도된 재조합 단백질을 제Xa인자 결합능을 측정하기 위해 선별했다. λ파아지 용해물(0.1ml)돗트블로트(dot-blot)장치 (Bio rad)를 사용하여 니트로셀룰로오즈로 여과한 다음, 니트로셀룰로오즈페이퍼를 5mg/ ml의 소혈청 알부민과 2.5mg/ml의 소감마 글로블린을 함유하는 인산염 완충생리식염 용액에 침출시킨 후에 실온에서 1시간동안 교반하였다.

용액을 0.1mg/ml의 헤파린이 보충되고¹²⁵l-제Xa인자(1.0×10⁶Cmp/ml)라 용해된 용액으로 교환한 다음, 한시간 동안 더 교반시켰다. 그 다음에 니트로셀룰로오스 페이퍼를 0.05%트윈

20(Tween

20)이 함유된 인산염 완충용액을 매 5분마다 교환하면서 세척한 다음, 니트로셀룰로오스 페이퍼를 통풍건조하여 코닥XR5필름을 사용하는 방사선 사진에 이용하였다.

필름은 1주일동안 노출시켜 촬영하였다.

폴리 (A)⁺RAN의 제조와 노던 블로팅 ; 전체의 RAN를 리자디(Lizardi)와 엔겔베르그(Engelberg)가 Anal. Biochem. 98, 116-122, (1979).에서 언급한 과염소산나트륨 추출방법을 사용하여 배양된 창(Chang)간장 세포, HepG2 간종양세포와 SK-HEP-1 간종양세포로부터 제조하였다. 폴리(A)⁺RAN는산업적으로 이용되는 방법을 사용하여 올리고(dT)-셀룰로오즈(P-L Biochemical, type 77F)상에서 회분식 흡착으로 분리하였다.

노던 블로트 분석을 위해 폴리(A)⁺RAN각 10μg을 글리옥살로 처리한 다음[ T homas, MethodsEnzymol. 100, 255-266(1983)], 10mM의 소듐포스테이트를 함유하는 완충용액, pH 7.0에서 아가로오스겔 전기영동을 행하였다. Bethesda Resea rch Hoboratory's RAN ladder을 분자량 표식자로 사용했다.

RAN를 니트로셀룰로오스 페이퍼상에 트랜스블로트(transblot)한다음, 80℃에서 2시간동안 소성시켰다.λP9 클론의 삽입 DHA를 트랜스테이션(nick translation)에 의해 32P로방사능 표지시키고 표식자로 사용하였다[Maniatis등, Lalecular Cloni ng : A Laboratory Model, Cold spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., ( 1982)]. 블로트를 50%와 포름아미드, 5X SSC, 50mM소듐 포스페이트, pH7.0, 250μg/ml 변성된 연어 정자 DNA, 1X Denhardt의 용액을 함유하는 용액을 5ml에서 5×10⁶Cpm의 표식자로 42℃에서 16시간동안 하이브리다이즈 시켰다.

여과기를 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 2Z SSC로 실온에서 5분간씩 3회 세척한 다음, 0.1% SDS 0.2×SSC로 50℃에서 5분씩 2회 세척한 후, 니트로셀루로오즈를 통풍건조시키고 코닥 XAR-5 필름을 사용하여 -70℃에서 3일 동안 방사선 촬영을 하여 선별을 확인하였다. 다른 제조합 DNA방법 ; 콜론화된 λgtll DNA의 제조, pUC19 플라스미드와 M13mp18벡터의 서브클로닝, 액소-뉴클리어아제III로 소화시켜유전자를 삭제시키는것, 다이데옥시 방법[Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6776-6780(1977)]에 의한 DNA서열 확인등은 Wun과 Kretzmer의 Supra에 기재된 것과 같이 행하였다.

Lipman과 Pearson의 Science 227 1435-1441(1985)에 기재된 프로그램 FASTP를 National Biomedical Research Foundation Sequence Databank(1987년 7월 31일 독립)로부터 구한 단백질이 동질의 군임을 확인하기 위해 사용하였으며 동질의군내에서 서열을 맞추기 위해 사용했다.

[결과]

cDNA 라이브러리의 선별 ; 순화배지에서 TFI의 존재를 확인하기 위해 많은 종류의 세포주를 선별하였으나 간에서 유도된 여러가지 세포주, 측 창(Chang)간장, HepG2간종양, SK-HEP-1간종양세포가 배양에서 TFI를 분비하를 발견하였다. 맨먼저 TFI에 항혈청을 인간 태아 간 λgtll cDNA라이브러리 (10⁶플라그를 형성하는 유니트)를 선별하기 위해 사용하여 15개의 면역 양성인 클론을 얻었으며, 태반 λgtll cDN A 라이브러리를 선별하기 위해 같은 방법을 사용하여 10개의 면역양성인 클론을 얻었다.

이 클론을 플라그로정제하였고 정제된 클론의 용해물을 TFI의 생리활성을 측정을 위해 실험하였다. 파아지 용해물에서 유도된 이소프로필티오갈락토시이드를 니트로셀룰로오즈 페이퍼상에 흡착시키고¹²⁵I-제Xa인자 결합능을 실험하였다. 제1도는 면역양성 클론이 니트로셀루로오즈 페이퍼상의¹²⁵I-제Xa인자와의 결합능을 나타내는 것으로, 15개의 면역양성 태아간 클론중 3개와 10개의 면역양성 태반 클론중 4개가¹²⁵I-제 Xa인자결합능을 나타내였다. 이 면역양성이며 활성을 나타내는 클론을 EcpRI으로 소환시킨 후 삽입체의크기를 겔전기영동으로 측정하였다.

태반 라이브러리(λP9)로부터 얻은 하나의 클론은 약 1.4Kb의 삽입체를 함유하는 반면 나머지 두개는 약1.0Kb의 삽입체를 포함한다. 1.0Kb클론의 부분적인 염기배열은 1.4Kb의 태반 클론(λP9)의 염기와 동일한 염기서열을 가지고 있음을 보여준다. 따라서 λP9은 완전한 서열로 선택된 것이다.

분리된 TFI cDNA의 뉴클레오타이드 서열과 변역된 단백질 서열 ; λP9클론의 제한지도와 삽입순서에 의한 M13서브클로닝과 삽입서열을 제2도에 나타내였다.

모든 서열은 액소뉴클리어아제 Ⅱ결실(deletion)방법[Henikoff, Gene28, 351 -359(1984)]으로 두개의 스트랜드(Strand)에서 결정하였으며 길이가 1432개의 염기로 구성된 것임을 확인하여 그 서열을 제3도에 표시하였다. 그것은 133개의 염기의 5'-말단 비암호화 부분, 912개의 뉴클레오타이드후레임 암호해독부분,387개의 뉴클레오타이드 3'말단 비암호화부분을 포함하고 있는 것이다. 첫번째 ATG는 TAGATGA서열내의 134번째 뉴클레어타이드에서 발생되고 ACAATGA서열내의 146번째 뉴클레오타이드에서 두번째 ATG가발생 된다. 비록 두개의 ATG는 진핵생물 리보솜에 의한 번역개시 서열, 즉 ACCATGC[Kozak, Cell 44,283-292(1986)]와는 다르지만 개시서열이 될수 있다. 25개의 아미노산은 N-말단의 성숙된 단백질에 상응하는 서열앞에 있다. 이 28개의 아미노산으로된 소수성 단편의 길이와 조성은 전형적인 시그널 서열(Sig nalsequence)[Von Heijne, Eur. J. Biochrm. 133, 17-21(1983) ; J. Mo l. Biol. 184, 99-105(1985)]이다. 시그널 펩티다제는 Ala₂₈-Asp₂₉사이를 절단하여 성숙된 단백질을 만든다.

이와같은 성숙된 TFI의 서열은 18개의 시스테인 잔기와 7개의 메티오닌을 포함하는 276개의 아미노산으로 구성되어 있다. 성숙된 TFI에 대해 추측된 단백질서열을 근거로 계산된 분자량 즉, 31,950달톤은 분리된 단백질의 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 계산된 37-40KDa보다 다소 적은데, 이 차이는 원래 단백질의 잔기에 글피코실화 정도에 따른 영향일 것으로 판단된다. 성숙된 단백질에 상응하는 추측된 단백질 서열은 Asn-X-Thr/Ser외 서열(145, 195, 256번째 아미노산 위치)을 가진 3개의 잠재적인 N-결합 글리코실화위치가 포함되어 있다. 정제된 전체 TFI의 아미노산 서열분석과 두개의 분리된 가수분해 단편은 cDNA서열로부터 추측된 단백질 서열(제3도 밑줄친 부분), 즉 분리된 cDNA클론에서 TFI를 암호화하는 단백질 서열과 정확하게 일치한다. 3'-비암호화부분은 A+T가 풍부하다( 70% A+T). 통상적인 폴리아데닐레이션 신호, AATAAA[Pround-foot and Brownlee. Nature 252, 359-362(1981)]나 폴리 A의 끝부분 모두는 이 클론에서 발견되지 않았으며, 그 이유는 라이브러리의 제조시 3'말단 부분이 인공적으로 손실된 것으로 판단된다.

하전량의 분포, 소수성/친수성도와 내부의 동질성 ; TFI의 변역된 아미노산 서열은 27개의 라이신, 17개의 아르기닌, 11개의 아스파르트산, 25개의 글루탐산을 포함한다. 단백질에 따른 하전량은 제4도에 나타나있는 것과 같이 평균과 되어 있지 않다.

시그널 펩타이드 부분은 26개의 중성잔기를 가진 2개의 양전하로 하전된 라이신을 함유하며, 성숙된 단백질의 아미노말단은 부분은 높은 음전하로 하전된 부분을 가지고 있다. 처음 7개의 잔기중 여섯개는 양전하로 하전된 라이신 잔기 앞에 하부에 높은 음전화로 하전돈 2개의 아미노산에 밀접하게 뒤따르고 있는 아스파르트산이나 글루탐산이다. 분자의 중앙 부분은 거의 음전하로하전되어 있으며, 카르복시 말단에는 높은양전하로하전된 단편이 있다. TFI의 265-293번째 아미노산은 6개의 연속적인 아르기닌 +라이신 잔기를 포함하여 14개의 음전하로 하전된 아미노산을 포함한다.

TFI단백질의 추측된 소수성/친수성도는 제5도에 나타내었으며, 시그널 펩타이드는 기대했던 것같이 높은 소수성인 부분을 포함하고 있으나 분자의 나머지 부분은 거의 친수성을 나타내었다. TFI의 번역된 아미노산 서열은 여러가지의 인식할 수 있는 영역을 포함한다. 높은 음전하로 하전된 N-말단부분과 높은 양전하로 하전전 C-말단부분 뿐만 아니라, 중앙 부분은 Kunitz-type저해제의 전형적인 서열(밑부분 참조)을가지는 3부분의 동질성 부분으로 구성되어 있다.

다른 단백질과의 동질성 ; National Biomedical Reserach Foundatoin seque nce database를 조사함으로써 TFl의 N-말단과 C-말단부분은 다른 공지의 단백질과 동질성을 나타내지 않았지만, 3개의 내부 동일부분은 췌장에서 분리한 기본적인 프로테아제 저해제(아프로티닌), 독사독의 기본적인 프로테아제 저해제와 인터-α-트립신 저해제의 염기서열과 각각 동일하였다. 다이설파이드 결합구조가 모든 이 저해제에서 존재한다는 것이 주목할만 하다. 이 동질성을 근거로 할때 TFI는 기본적인 프로테아제 저해제 유전자 군에 포함됨이 명백하다.

노던 블로팅 ; 폴리(A)+RAN는 TFI를 생산하는 간장 유래 세포주, 즉 창(Chan g)간장, HepG2 간종양, SK-HEP-1 간종양 세포에서 정제하였다. 폴리(A)+RAN를 변성 아가로스 겔 전기영동으로 용해시키고 니트로셀룰로오즈 페이퍼상으로 이동분획시킨다음,³²P-표지된 TFI cDNA(λP9)로 탐침하였다. 제7도에 나타난 바와같이 실험된 모든 세포주내에서 1.4kb와 4.4Kb의 mRNA에 상응하는 두개의 혼성화 주밴드가 관찰되었다. TFI를 검출할 수 있는 양을 생산하지 않는 여러개의 다른 세포주를 실험하였지만 탐과혼성화를 이루는 것은 발견되지 않았다.

Claims

제2도의 제한 지도에 표현된 바와같은 특징을 갖는 λP9의 인간조직 인자 억제제 cDNA클론.
제3도의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 인간 조직 인자 억제제의 cDNA.
제3도의 단백질 아미노산 서열을 갖는 인간 조직 인자 억제제.
제3항에 있어서, 단백질은 비글리코실화 된것임을 특징으로 하는 인간 조직 인자 억제제.
제3항에 있어서, 단배질은 글리로실화 된것임을 특징으로 하는 인간 조직 인자 억제제.
인간 조직 인자 억제제를 암호화하는 서열로구성된 DNA 서열.