JPH1175875A - ヒト組織因子抑制因子 - Google Patents
ヒト組織因子抑制因子Info
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- JPH1175875A JPH1175875A JP10181319A JP18131998A JPH1175875A JP H1175875 A JPH1175875 A JP H1175875A JP 10181319 A JP10181319 A JP 10181319A JP 18131998 A JP18131998 A JP 18131998A JP H1175875 A JPH1175875 A JP H1175875A
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- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
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- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 組織因子抑制因子（ＴＦＩ）あるいはリボタ
ンパク質関連凝固抑制因子（ＬＡＣＩ）として知られる
凝固抑制因子に関する。更に詳細には、本発明は全長Ｔ
ＦＩを本質的に表現しているｃＤＮＡクローンに関す
る。 【解決手段】 本質的に組織因子抑制因子の全長を示す
ｃＤＮＡクローンの完全コード配列およびアミノ酸配列
の決定。
ンパク質関連凝固抑制因子（ＬＡＣＩ）として知られる
凝固抑制因子に関する。更に詳細には、本発明は全長Ｔ
ＦＩを本質的に表現しているｃＤＮＡクローンに関す
る。 【解決手段】 本質的に組織因子抑制因子の全長を示す
ｃＤＮＡクローンの完全コード配列およびアミノ酸配列
の決定。
Description
【０００１】
【発明の背景】本発明は、組織因子抑制因子（ＴＦＩ）
あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子（ＬＡＣＩ）
として知られる凝固抑制因子に関する。更に詳細には、
本発明は全長ＴＦＩを本質的に表現しているｃＤＮＡク
ローンに関する。
あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子（ＬＡＣＩ）
として知られる凝固抑制因子に関する。更に詳細には、
本発明は全長ＴＦＩを本質的に表現しているｃＤＮＡク
ローンに関する。
【０００２】哺乳動物の血液での凝固カスケードには、
２つの異なるシステム、即ち内因性システムと外因性シ
ステムとがある。後者の外因性システムは、血液が組織
スロンボプラステイン（第ＩＩＩ因子）（以後、組織因
子（ＴＦ）と言う）にさらされることによつて活性化さ
れる。この組織因子は、各種の細胞のプラズマメンブレ
ン中で生じるリポタンパク質であり、特に脳及び肺にお
いて多く存在する。プラズマ第ＶＩＩ因子あるいはその
活性体である第ＶＩＩａ因子がＴＦと接触すると、ＴＦ
とともにカルシウム依存性複合体を形成し、これがタン
パク加水分解作用を発揮して第Ｘ因子を第Ｘａ因子にま
た第ＩＸ因子を第ＩＸａ因子に活性化する。
２つの異なるシステム、即ち内因性システムと外因性シ
ステムとがある。後者の外因性システムは、血液が組織
スロンボプラステイン（第ＩＩＩ因子）（以後、組織因
子（ＴＦ）と言う）にさらされることによつて活性化さ
れる。この組織因子は、各種の細胞のプラズマメンブレ
ン中で生じるリポタンパク質であり、特に脳及び肺にお
いて多く存在する。プラズマ第ＶＩＩ因子あるいはその
活性体である第ＶＩＩａ因子がＴＦと接触すると、ＴＦ
とともにカルシウム依存性複合体を形成し、これがタン
パク加水分解作用を発揮して第Ｘ因子を第Ｘａ因子にま
た第ＩＸ因子を第ＩＸａ因子に活性化する。
【０００３】ＴＦによりイニシエイトされる凝固系の制
御に関するこれまでの研究により、ＴＦを血清とともに
インキユベーシヨン（粗組織スロンボプラステイン調製
物中で）すると、その活性がｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制さ
れまたＴＦをマウスに注入した時の致死効果が阻止され
ることが明らかにされている。Ｈｊｏｒｔの精力的な研
究によつて、この分野におけるそれまでの研究成果が確
認され更に研究が進められて、血清中の抑制成分が第Ｖ
ＩＩ−ＴＦ複合因子を認識することが結論として示され
た〔Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．９，Ｓｕｐｐｌ．２７，７６〜９７（１９５７）〕
この結論は、プラズマ中で生じるＴＦの抑制にはＣａ
２＋の存在が必要であり（第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子がＴ
Ｆに結合する際にもＣａ２＋の存在が必要）ＴＦの抑制
はＥＤＴＡによる２価のカチオンのキレート化によつて
阻止され及び／又は逆転されるという事実と符合してい
る。
御に関するこれまでの研究により、ＴＦを血清とともに
インキユベーシヨン（粗組織スロンボプラステイン調製
物中で）すると、その活性がｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制さ
れまたＴＦをマウスに注入した時の致死効果が阻止され
ることが明らかにされている。Ｈｊｏｒｔの精力的な研
究によつて、この分野におけるそれまでの研究成果が確
認され更に研究が進められて、血清中の抑制成分が第Ｖ
ＩＩ−ＴＦ複合因子を認識することが結論として示され
た〔Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．９，Ｓｕｐｐｌ．２７，７６〜９７（１９５７）〕
この結論は、プラズマ中で生じるＴＦの抑制にはＣａ
２＋の存在が必要であり（第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子がＴ
Ｆに結合する際にもＣａ２＋の存在が必要）ＴＦの抑制
はＥＤＴＡによる２価のカチオンのキレート化によつて
阻止され及び／又は逆転されるという事実と符合してい
る。
【０００４】最近の研究によつて、プラズマあるいは血
清中でＴＦを抑制するには、第ＶＩＩａ因子だけではな
く触媒的に活性な第Ｘａ因子と更に他の因子が必要であ
ることが明らかにされている〔ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅ−
ｔｉｃｈ、Ｂｌｏｏｄ６９、１５０〜１５５（１９８
７）；Ｓａｎｄｅｒｓら、Ｉｂｉｄ．，６６，２０４〜
２１２（１９８５）〕。この他の因子は組織因子抑制因
子（ＴＦＩ）あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子
（ＬＡＣＩ）と定義されるものであり、バリウム吸着プ
ラズマ中に存在している。また血清を遠心して密度１．
２１ｇ／ｃｍ３とした時の浮遊液中のリポタンパク質フ
ラクシヨンとともにＴＦＩ活性が分離されることから、
この因子はリポタンパク質と関連しているものと考えら
れる。
清中でＴＦを抑制するには、第ＶＩＩａ因子だけではな
く触媒的に活性な第Ｘａ因子と更に他の因子が必要であ
ることが明らかにされている〔ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅ−
ｔｉｃｈ、Ｂｌｏｏｄ６９、１５０〜１５５（１９８
７）；Ｓａｎｄｅｒｓら、Ｉｂｉｄ．，６６，２０４〜
２１２（１９８５）〕。この他の因子は組織因子抑制因
子（ＴＦＩ）あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子
（ＬＡＣＩ）と定義されるものであり、バリウム吸着プ
ラズマ中に存在している。また血清を遠心して密度１．
２１ｇ／ｃｍ３とした時の浮遊液中のリポタンパク質フ
ラクシヨンとともにＴＦＩ活性が分離されることから、
この因子はリポタンパク質と関連しているものと考えら
れる。
【０００５】ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉｃｈ、Ｂｌｏｏ
ｄ６９、１５０〜１５５（１９８７）及びＰｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、１８８６〜１
８９０（１９８７）によればＨｅｐ Ｇ２細胞（ヒトヘ
パトーマセルライン）が、プラズマ中に存在するＴＦＩ
と同様の特性を有する抑制成分を分泌することが示され
ている。
ｄ６９、１５０〜１５５（１９８７）及びＰｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、１８８６〜１
８９０（１９８７）によればＨｅｐ Ｇ２細胞（ヒトヘ
パトーマセルライン）が、プラズマ中に存在するＴＦＩ
と同様の特性を有する抑制成分を分泌することが示され
ている。
【０００６】米国同時係属出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．７７，３
６６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）には、
Ｈｅｐ Ｇ２細胞から分泌された精製組織因子抑制因子
が記載されている。この組織因子抑制因子には２つの形
態、即ちナトリウムドデシルスルフエートポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した時
に約３７，０００〜４０，０００ダルトンの位置に現わ
れるＴＦＩ１と約２５，０００〜２６，０００ダルトン
の位置に現われるＴＦＩ２との２つの形態が再在するこ
とが見出されている。ＴＦＩのアミノ酸配列のＮ−末端
部分が以下のように決定されている。
６６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）には、
Ｈｅｐ Ｇ２細胞から分泌された精製組織因子抑制因子
が記載されている。この組織因子抑制因子には２つの形
態、即ちナトリウムドデシルスルフエートポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した時
に約３７，０００〜４０，０００ダルトンの位置に現わ
れるＴＦＩ１と約２５，０００〜２６，０００ダルトン
の位置に現われるＴＦＩ２との２つの形態が再在するこ
とが見出されている。ＴＦＩのアミノ酸配列のＮ−末端
部分が以下のように決定されている。
【化１】 （Ｘ−Ｘは未決定である） 上記米国出願明細書の記載は本明細書に引用する。
【０００７】発明の要旨 本発明によれば、本質的に組織因子抑制因子の全長を表
現するｃＤＮＡクローンの完全コード配列が見出され
た。最初に、ヒト胎盤及び胎児肝λｇｔ１１ｃＤＮＡラ
イブラリーを、精製ＴＦＩに対するラビツトポリクロー
ナル血清でスクリーニングした。免疫学的にポジテイブ
なクローンについて、更に１２５Ｉ−第Ｘａ因子結合活
性をスクリーニングした。免疫学的にかつ機能的に活性
な７個のクローンが得られた。最も長いクローンは胎盤
由来λＰ９であつて１．４キロベース（ｋｂ）であり、
他の６個のクローンは１．０ｋｂであつた。部分的ＤＮ
Ａ配列決定により、１．０ ｋｂクローンは１．４ｋｂ
クローンの１部分と同じ配列を有することが明らかにな
つた。ヌクレオチド配列分析により、λＰ９は、１３３
ｂｐの５′非コード領域、９１２ｂｐのオープン・リー
デイング・フレーム、ストツプコドン及び３８４ｂｐの
３′非コード領域を含む１４３２塩基対（ｂｐ）のｃＤ
ＮＡインサート配列からなることが明らかにされた。
現するｃＤＮＡクローンの完全コード配列が見出され
た。最初に、ヒト胎盤及び胎児肝λｇｔ１１ｃＤＮＡラ
イブラリーを、精製ＴＦＩに対するラビツトポリクロー
ナル血清でスクリーニングした。免疫学的にポジテイブ
なクローンについて、更に１２５Ｉ−第Ｘａ因子結合活
性をスクリーニングした。免疫学的にかつ機能的に活性
な７個のクローンが得られた。最も長いクローンは胎盤
由来λＰ９であつて１．４キロベース（ｋｂ）であり、
他の６個のクローンは１．０ｋｂであつた。部分的ＤＮ
Ａ配列決定により、１．０ ｋｂクローンは１．４ｋｂ
クローンの１部分と同じ配列を有することが明らかにな
つた。ヌクレオチド配列分析により、λＰ９は、１３３
ｂｐの５′非コード領域、９１２ｂｐのオープン・リー
デイング・フレーム、ストツプコドン及び３８４ｂｐの
３′非コード領域を含む１４３２塩基対（ｂｐ）のｃＤ
ＮＡインサート配列からなることが明らかにされた。
【０００８】このｃＤＮＡ配列は、１８個のシステイン
及び７個のメチオニンを含む２７６個のアミノ酸からな
る３１，９５０ダルトンの蛋白質をコードしている。翻
訳されたアミノ配列により、成熟ＴＦＩ蛋白の先には約
２８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが存在する
ことが明らかにされた。ここで言う″成熟″ＴＦＩと
は、本明細書において記載するλＰ９クローンのＡＴＧ
翻訳コドンによつてＴＦＩとメチオニルＴＦＩとの両者
を含むように定義されるものであり、このことは以下の
記載から理解することができよう。ＴＦＩ蛋白には、Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは普通の２０個のアミノ
酸のうちのいずれでもよい）の配列を有する３個のＮ−
結合グリコシル化部位が存在する。これらの部位は、
５′非コード領域の後の最初のメチオニンの位置をアミ
ノ酸の位置＋１とした時、Ａｓｎ１４５、Ａｓｎ１９５
及びＡｓｎ２５６の位置にある。
及び７個のメチオニンを含む２７６個のアミノ酸からな
る３１，９５０ダルトンの蛋白質をコードしている。翻
訳されたアミノ配列により、成熟ＴＦＩ蛋白の先には約
２８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが存在する
ことが明らかにされた。ここで言う″成熟″ＴＦＩと
は、本明細書において記載するλＰ９クローンのＡＴＧ
翻訳コドンによつてＴＦＩとメチオニルＴＦＩとの両者
を含むように定義されるものであり、このことは以下の
記載から理解することができよう。ＴＦＩ蛋白には、Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは普通の２０個のアミノ
酸のうちのいずれでもよい）の配列を有する３個のＮ−
結合グリコシル化部位が存在する。これらの部位は、
５′非コード領域の後の最初のメチオニンの位置をアミ
ノ酸の位置＋１とした時、Ａｓｎ１４５、Ａｓｎ１９５
及びＡｓｎ２５６の位置にある。
【０００９】ＴＦＩの翻訳されたアミノ酸配列により、
該アミノ酸配列は、高度にマイナスに荷電したＮ末端部
分、高度にプラスに荷電したカルボキシ末端部分、及び
Ｋｕｎｉｔｚ型酵素抑制因子の典型的配列を有する３個
の相同ドメインからなる介在配列部分などのいくつかの
識別可能な領域を有していることが明らかにされた。相
同性についての研究から、ＴＦＩは塩基性プロテアーゼ
抑制因子遺伝子スーパーフアミリーに属するものと考え
られる。
該アミノ酸配列は、高度にマイナスに荷電したＮ末端部
分、高度にプラスに荷電したカルボキシ末端部分、及び
Ｋｕｎｉｔｚ型酵素抑制因子の典型的配列を有する３個
の相同ドメインからなる介在配列部分などのいくつかの
識別可能な領域を有していることが明らかにされた。相
同性についての研究から、ＴＦＩは塩基性プロテアーゼ
抑制因子遺伝子スーパーフアミリーに属するものと考え
られる。
【００１０】ｃＤＮＡクローンλＰ９を開発するためて
用いた蛋白材料はヒト胎盤組織であり、この組織は通常
の外科的手法による分娩後に広く入手することができ
る。本発明において用いられているλｇｔ１１（ ｌａ
ｃ ５ ｎｉｎ ５ ｃ１８５７ Ｓ１００）はよく知
られたものであつて、普通に入手することのできるラム
ダフアージ発現ベクターである。その構成及び制限酵素
地図は、ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，１１９４〜１１９
８（１９８３）に記載されている。ノーザン・ブロツト
分析により、肝由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバ
ー、Ｈｅｐ Ｇ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパ
トーマは、ＴＦＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズする２つ
の主要なｍＲＮＡ（１．４ｋｂと４．４ｋｂ）を有して
いることが明らかにされた。
用いた蛋白材料はヒト胎盤組織であり、この組織は通常
の外科的手法による分娩後に広く入手することができ
る。本発明において用いられているλｇｔ１１（ ｌａ
ｃ ５ ｎｉｎ ５ ｃ１８５７ Ｓ１００）はよく知
られたものであつて、普通に入手することのできるラム
ダフアージ発現ベクターである。その構成及び制限酵素
地図は、ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，１１９４〜１１９
８（１９８３）に記載されている。ノーザン・ブロツト
分析により、肝由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバ
ー、Ｈｅｐ Ｇ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパ
トーマは、ＴＦＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズする２つ
の主要なｍＲＮＡ（１．４ｋｂと４．４ｋｂ）を有して
いることが明らかにされた。
【００１１】本明細書に記載した如き、ＴＦＩのための
ｃＤＮＡのクローニング及びその全蛋白配列及び構造の
解明により、詳細な構造−機能分析が可能となり、また
その生合成的レギユレーシヨンの研究のための基本的知
識が得られる。しかして本発明は、第Ｘａ因子及び第Ｖ
ＩＩａ／ＴＦ酵素複合因子を抑制することのできる試薬
についての血液凝固カスケード研究にとつて重要なもの
である。
ｃＤＮＡのクローニング及びその全蛋白配列及び構造の
解明により、詳細な構造−機能分析が可能となり、また
その生合成的レギユレーシヨンの研究のための基本的知
識が得られる。しかして本発明は、第Ｘａ因子及び第Ｖ
ＩＩａ／ＴＦ酵素複合因子を抑制することのできる試薬
についての血液凝固カスケード研究にとつて重要なもの
である。
【００１２】図面の詳細な記述 本明細書においては、特許請求の範囲の記載によつて本
発明を形成すると考えられる対象が特に指摘され明白に
クレームされているが、以下に記述する図面についての
説明とともに本発明の好ましい態様についての記載によ
り本発明がよりよく理解されるものと考える。
発明を形成すると考えられる対象が特に指摘され明白に
クレームされているが、以下に記述する図面についての
説明とともに本発明の好ましい態様についての記載によ
り本発明がよりよく理解されるものと考える。
【００１３】図１は、１２５Ｉ−第Ｘａ因子を用いたλ
ｇｔ１１クローンのスクリーニングを示したものであ
る。クローン化フアージの溶解物（０．１ｍｌ）を、ド
ツト・プロツト装置を用いたサクシヨンによりニトロセ
ルロースペーパー上にスポツトし、次いでニトロセルロ
ースペーパーを１２５Ｉ−第Ｘａ因子でプローブし、以
後に記述するようにしてオートラジオグラフイーに付し
た。黒いスポツトとして現われているクローンが１２５
Ｉ−第Ｘａ因子と結合したポジテイブ・クローンであ
る。コントロールλｇｔ１１（下の右側のコーナー）及
び他のクローンは１２５Ｉ−第Ｘａ因子と結合しなかつ
た。
ｇｔ１１クローンのスクリーニングを示したものであ
る。クローン化フアージの溶解物（０．１ｍｌ）を、ド
ツト・プロツト装置を用いたサクシヨンによりニトロセ
ルロースペーパー上にスポツトし、次いでニトロセルロ
ースペーパーを１２５Ｉ−第Ｘａ因子でプローブし、以
後に記述するようにしてオートラジオグラフイーに付し
た。黒いスポツトとして現われているクローンが１２５
Ｉ−第Ｘａ因子と結合したポジテイブ・クローンであ
る。コントロールλｇｔ１１（下の右側のコーナー）及
び他のクローンは１２５Ｉ−第Ｘａ因子と結合しなかつ
た。
【００１４】図２は、部分的制限酵素地図及びλＰ９の
インサート配列の配列決定に用いた技法を示している。
下に示したスケールはヌクレオチドの位置を示してい
る。太い棒線はコード領域を示しており、細い棒線は
５′及び３′非コード領域を示している。制限酵素部位
は消化により確認した。矢印はｃＤＮＡの配列決定に用
いたオーバーラツピングＭ１３クローンを示している。
インサート配列の配列決定に用いた技法を示している。
下に示したスケールはヌクレオチドの位置を示してい
る。太い棒線はコード領域を示しており、細い棒線は
５′及び３′非コード領域を示している。制限酵素部位
は消化により確認した。矢印はｃＤＮＡの配列決定に用
いたオーバーラツピングＭ１３クローンを示している。
【００１５】図３および４はヒトＴＦＩ ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列及び翻訳されたアミノ酸配列を示してい
る。ヌクレオチドの番号は左側に示されており、アミノ
酸の番号は右側に示されている。下線を引いた配列は、
精製したＴＦＩ蛋白と、Ｖ８プロテアーゼとトリプシン
で消化したペプチドとを用いたアミノ酸配列分析によつ
て独立に確認された配列である。＋１のアミノ酸は、
５′非コード領域のストツプコドンの後にある最初のメ
チオニンである。Ｎ−結合グリコシル化部位は星印で示
されている。
クレオチド配列及び翻訳されたアミノ酸配列を示してい
る。ヌクレオチドの番号は左側に示されており、アミノ
酸の番号は右側に示されている。下線を引いた配列は、
精製したＴＦＩ蛋白と、Ｖ８プロテアーゼとトリプシン
で消化したペプチドとを用いたアミノ酸配列分析によつ
て独立に確認された配列である。＋１のアミノ酸は、
５′非コード領域のストツプコドンの後にある最初のメ
チオニンである。Ｎ−結合グリコシル化部位は星印で示
されている。
【００１６】図５は、ＴＦＩのアミノ酸配列における電
荷分布を示すグラフである。電荷は最初のアミノ酸残基
から１番目のアミノ酸残基までを計算したものであり、
その電荷の値がｉ番目の残基に示されている。従つて、
ｉ番目の位置の値は、最初のアミノ酸残基からｉ番目の
アミノ酸残基までの全ての電荷を合計したものであり、
ｉ番目とｊ番目（ｊ＞ｉ）のアミノ酸残基における値の
差は、ｉ番目からｊ番目までのアミノ酸残基の合計電荷
を示すものである。
荷分布を示すグラフである。電荷は最初のアミノ酸残基
から１番目のアミノ酸残基までを計算したものであり、
その電荷の値がｉ番目の残基に示されている。従つて、
ｉ番目の位置の値は、最初のアミノ酸残基からｉ番目の
アミノ酸残基までの全ての電荷を合計したものであり、
ｉ番目とｊ番目（ｊ＞ｉ）のアミノ酸残基における値の
差は、ｉ番目からｊ番目までのアミノ酸残基の合計電荷
を示すものである。
【００１７】図６は、ＴＦＩの疎水性プロフアイルを示
すグラフである。アミノ酸残基の疎水性の指数をアミノ
酸残基が蛋白内に埋没された深さ（Ｘ線による結晶学的
データから得られる）として定義するコンピユータープ
ログラムによつて、疎水性プロフアイルを分析した〔Ｋ
ｉｎｄｅｒａら、Ｊ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．４，２
３〜５５（１９８５）〕。アミノ酸配列に沿つた疎水性
プロフアイルは、ＩＭＳＬ ＬＩｂｒａ−ｒｙのプログ
ラムＩＣＳＳＣＵを用いることによつて、滑らかになつ
た〔ＩＭＳＬ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｍａｎｕａｌ，９ｔｈ ｅｄ．，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｆｏｒ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄＳｔａｔｉ
ｓｔｉｃａｌ Ｓｕｂｒｏｕｔｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒ
ｙ， Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ（１９８２）〕。
すグラフである。アミノ酸残基の疎水性の指数をアミノ
酸残基が蛋白内に埋没された深さ（Ｘ線による結晶学的
データから得られる）として定義するコンピユータープ
ログラムによつて、疎水性プロフアイルを分析した〔Ｋ
ｉｎｄｅｒａら、Ｊ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．４，２
３〜５５（１９８５）〕。アミノ酸配列に沿つた疎水性
プロフアイルは、ＩＭＳＬ ＬＩｂｒａ−ｒｙのプログ
ラムＩＣＳＳＣＵを用いることによつて、滑らかになつ
た〔ＩＭＳＬ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｍａｎｕａｌ，９ｔｈ ｅｄ．，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｆｏｒ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄＳｔａｔｉ
ｓｔｉｃａｌ Ｓｕｂｒｏｕｔｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒ
ｙ， Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ（１９８２）〕。
【００１８】図７は、ＴＦＩの塩基性プロテアーゼ抑制
因子ドメインと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのア
ラインメントを示す。ＴＦＩ以外の他の全ての配列は、
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの蛋白配列データベース
（Ｇｅｏｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，レリース１３，Ｊｕｎｅ１
９８７）から得たものである。 １：牛塩基性プロテアーゼ抑制因子前駆体； ２：牛初乳トリプシン抑制因子； ３：牛血清塩基性プロテアーゼ抑制因子； ４：食用カタツムリ・イソ抑制因子； ５：紅海ウミガメ塩基性プロテアーゼ抑制因子（１〜７
９のアミノ酸のみ）； ６：ウエスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ
抑制因子Ｉ； ７：リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子ＩＩ； ８：ケープ・コブラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
Ｉ； ９：ルツセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
Ｉ； １０：サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
ＩＩ； １１：イースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロ
テアーゼ抑制因子Ｉホモローグ； １２：ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｂ； １３：ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｅ； １４：ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｉ； １５：プラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｋ； １６：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（マイナー）； １７：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジヤー）； １８：β−２−ブンガロトキシンＢ鎖； １９：ウマ・インターα−トリプシン抑制因子〔アミノ
酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２０：ブタ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２５（２）〕； ２１：ウシ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２２：ヒト・α−１−マイクログロブリン／インター−
α−トリプシン抑制因子前駆体〔アミノ酸２２７〜２８
３（１）；２８４〜５５２（２）〕； ２３：ＴＦＩ〔アミノ酸４７〜１１７（１）；１１８〜
１８８（２）；２１０〜２８０（３）〕。 最良のアラインメントを達成するためには１６，１７，
１８にギヤツプが含まれていた。アミノ酸を示す標準的
１文字コードを用いた。
因子ドメインと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのア
ラインメントを示す。ＴＦＩ以外の他の全ての配列は、
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの蛋白配列データベース
（Ｇｅｏｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，レリース１３，Ｊｕｎｅ１
９８７）から得たものである。 １：牛塩基性プロテアーゼ抑制因子前駆体； ２：牛初乳トリプシン抑制因子； ３：牛血清塩基性プロテアーゼ抑制因子； ４：食用カタツムリ・イソ抑制因子； ５：紅海ウミガメ塩基性プロテアーゼ抑制因子（１〜７
９のアミノ酸のみ）； ６：ウエスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ
抑制因子Ｉ； ７：リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子ＩＩ； ８：ケープ・コブラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
Ｉ； ９：ルツセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
Ｉ； １０：サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
ＩＩ； １１：イースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロ
テアーゼ抑制因子Ｉホモローグ； １２：ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｂ； １３：ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｅ； １４：ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｉ； １５：プラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｋ； １６：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（マイナー）； １７：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジヤー）； １８：β−２−ブンガロトキシンＢ鎖； １９：ウマ・インターα−トリプシン抑制因子〔アミノ
酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２０：ブタ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２５（２）〕； ２１：ウシ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２２：ヒト・α−１−マイクログロブリン／インター−
α−トリプシン抑制因子前駆体〔アミノ酸２２７〜２８
３（１）；２８４〜５５２（２）〕； ２３：ＴＦＩ〔アミノ酸４７〜１１７（１）；１１８〜
１８８（２）；２１０〜２８０（３）〕。 最良のアラインメントを達成するためには１６，１７，
１８にギヤツプが含まれていた。アミノ酸を示す標準的
１文字コードを用いた。
【００１９】図８は、３個の肝由来セルラインから得た
ＲＮＡのノーザン・ブロツト分析を示す。１レーン当り
１０μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いた。 レーン１：Ｃｈａｎｇリバー細胞、 レーン２：ＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ細胞、 レーン３：ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞． 本明細書においては、標準的生化学命名法を用いてお
り、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ）として表わさ
れている。対応するヌクレオチドは、例えばデオキシグ
アノシン−５′−トリホスフエート（ｄＧＴＰ）であ
る。ＤＮＡヌクレオチド配列は、便宜上慣用的に１本鎖
のみで示されており、１本鎖におけるＡはその相補性塩
基としてＴを内包しており、ＧはＣを内包している。ア
ミノ酸は、以下の表に示すように１文字あるいは３文字
で示されている。
ＲＮＡのノーザン・ブロツト分析を示す。１レーン当り
１０μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いた。 レーン１：Ｃｈａｎｇリバー細胞、 レーン２：ＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ細胞、 レーン３：ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞． 本明細書においては、標準的生化学命名法を用いてお
り、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ）として表わさ
れている。対応するヌクレオチドは、例えばデオキシグ
アノシン−５′−トリホスフエート（ｄＧＴＰ）であ
る。ＤＮＡヌクレオチド配列は、便宜上慣用的に１本鎖
のみで示されており、１本鎖におけるＡはその相補性塩
基としてＴを内包しており、ＧはＣを内包している。ア
ミノ酸は、以下の表に示すように１文字あるいは３文字
で示されている。
【００２０】
【表１】
【００２１】本明細書において記載される普通に入手し
得る制限酵素は、以下に示す制限配列及び開裂パターン
（矢印で示した）を有している。
得る制限酵素は、以下に示す制限配列及び開裂パターン
（矢印で示した）を有している。
【化２】
【００２２】本発明の好ましい態様を更に詳細に説明す
るために、以下に記述する実験を実施した。
るために、以下に記述する実験を実施した。
【００２３】例１ 材料 ヒト胎盤及び胎児肝ｃＤＮＡライブラリーをＣｌｏｎｅ
ｔｅｃｈから得た。プロトブロツト（ｐｒｏｔｏｂｌｏ
ｔ）・イムノスクリーニング・キツトはＰｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃｈから講入した。制限酵素はＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから講入した。牛腸アルカ
リ・ホスフアターゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及
びＳ１ヌクレアーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍから講入した。ｄＮＴＰはＰ．Ｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。５′−〔α−３５Ｓ〕
−チオ−ｄＡＴＰ（６００Ｃｉ／ｍｍｏｌ ）はＡｍｅ
ｒｓｈａｍから購入した。配列決定用キツト（Ｓｅｑｕ
ｅｎａｓｅ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。Ｃｈａｎｇリバー細
胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３）及びＨｅｐ Ｇ２ヘパト
ーマ細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）は、アメリカン
・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンから得た。ＳＫ−
ＨＥＰ−１
ｔｅｃｈから得た。プロトブロツト（ｐｒｏｔｏｂｌｏ
ｔ）・イムノスクリーニング・キツトはＰｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃｈから講入した。制限酵素はＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから講入した。牛腸アルカ
リ・ホスフアターゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及
びＳ１ヌクレアーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍから講入した。ｄＮＴＰはＰ．Ｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。５′−〔α−３５Ｓ〕
−チオ−ｄＡＴＰ（６００Ｃｉ／ｍｍｏｌ ）はＡｍｅ
ｒｓｈａｍから購入した。配列決定用キツト（Ｓｅｑｕ
ｅｎａｓｅ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。Ｃｈａｎｇリバー細
胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３）及びＨｅｐ Ｇ２ヘパト
ーマ細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）は、アメリカン
・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンから得た。ＳＫ−
ＨＥＰ−１
【表４／】ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈの
Ｇ．Ｔｒｅｍｐｅによつて１９７１年に肝アデノカルシ
ノーマから誘導されたものであり、現在で広く容易に入
手可能である。
Ｇ．Ｔｒｅｍｐｅによつて１９７１年に肝アデノカルシ
ノーマから誘導されたものであり、現在で広く容易に入
手可能である。
【００２４】１２５Ｉ−第Ｘａ因子は、ヨード源を用い
て放射標織することにより調製した。この比活性は２０
００ｄｐｍ／ｎｇであつた。放射活性の９７％以上は１
０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈澱可能であつ
た。ヨード化蛋白は、ＳｅｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＸａ
（Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ製）に
対してその触媒活性を８０％以上保持していた。
て放射標織することにより調製した。この比活性は２０
００ｄｐｍ／ｎｇであつた。放射活性の９７％以上は１
０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈澱可能であつ
た。ヨード化蛋白は、ＳｅｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＸａ
（Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ製）に
対してその触媒活性を８０％以上保持していた。
【００２５】抗−ＴＦＩ−ＩｇセフアロースＴＭ４Ｂカ
ラムは以下のようにして調製した。即ち、成熟ＴＦＩの
アミノ酸３−２５の配列に相当する配列を含むペプチド
（ＴＦＩーペプチド）を、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの固相ペ
プチド合成システムを用いて合成した。ＴＦＩ−ペプチ
ド（５ｍｇ）を、グルタルアルデヒドによりキーホール
（Ｋｅｙｈｏｌｅ）・リンペツト（ｌｙｍｐｅｔ）・ヘ
モシアニン１０ｍｇに結合させてコンジユゲートを調製
した。２匹のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄホワイト・ラビツ
トに、フロイント・完全・アジユバンド１ｍｌと、上記
コンジユゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド２００μｇ）
を含むホモジエネートを反内注射して、それぞれ免疫化
した。１ケ月後に、フロイント・不完全・アジユバント
１ｍｌとコンジユゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド１０
０μｇ）を含むホモジエネートで、２匹のラビツトをそ
れぞれブースターした。３ケ月の間、１週間毎に抗血清
を採取し、１ケ月毎にブースター注射を行なつた。ＴＦ
Ｉ−ペプチドに対する特異的抗体を単離するために、抗
血清をＴＦＩ−ペプチドセフアロース４Ｂカラムを用い
たクロマトグラフイーに付した。カラムを、１０倍量の
ＰＢＳ（０．４ＭＮａＣｌ−０．１Ｍベンズアミジン−
１％ トリトンＴＭＸ−１００） 及びトリトンＸ−
１００を含まない同様の溶液で洗つた。０．１Ｍグリシ
ン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２で抗体を溶出させ、直ちに１／
１０倍量の１Ｍトリス−ＯＨを加えて中和し、次いで食
塩水に対して透析した。単離された抗体を、シアノゲン
・ブロマイドで活性化させたセフアロース４Ｂに製造業
者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の指針に従つて結合させ、こ
れを細胞培養培地からのＴＦＩの単離に用いた。
ラムは以下のようにして調製した。即ち、成熟ＴＦＩの
アミノ酸３−２５の配列に相当する配列を含むペプチド
（ＴＦＩーペプチド）を、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの固相ペ
プチド合成システムを用いて合成した。ＴＦＩ−ペプチ
ド（５ｍｇ）を、グルタルアルデヒドによりキーホール
（Ｋｅｙｈｏｌｅ）・リンペツト（ｌｙｍｐｅｔ）・ヘ
モシアニン１０ｍｇに結合させてコンジユゲートを調製
した。２匹のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄホワイト・ラビツ
トに、フロイント・完全・アジユバンド１ｍｌと、上記
コンジユゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド２００μｇ）
を含むホモジエネートを反内注射して、それぞれ免疫化
した。１ケ月後に、フロイント・不完全・アジユバント
１ｍｌとコンジユゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド１０
０μｇ）を含むホモジエネートで、２匹のラビツトをそ
れぞれブースターした。３ケ月の間、１週間毎に抗血清
を採取し、１ケ月毎にブースター注射を行なつた。ＴＦ
Ｉ−ペプチドに対する特異的抗体を単離するために、抗
血清をＴＦＩ−ペプチドセフアロース４Ｂカラムを用い
たクロマトグラフイーに付した。カラムを、１０倍量の
ＰＢＳ（０．４ＭＮａＣｌ−０．１Ｍベンズアミジン−
１％ トリトンＴＭＸ−１００） 及びトリトンＸ−
１００を含まない同様の溶液で洗つた。０．１Ｍグリシ
ン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２で抗体を溶出させ、直ちに１／
１０倍量の１Ｍトリス−ＯＨを加えて中和し、次いで食
塩水に対して透析した。単離された抗体を、シアノゲン
・ブロマイドで活性化させたセフアロース４Ｂに製造業
者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の指針に従つて結合させ、こ
れを細胞培養培地からのＴＦＩの単離に用いた。
【００２６】Ｃｈａｎｇリバー細胞を、ＢｒｏｚｅとＭ
ｉｌｅｔｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８４，１８８６〜１８９０（１９８７）に
記載された方法に従つて培養した。ならし培地を、抗−
ＴＦＩ−Ｉｇセフアロース４Ｂカラムを用いたクロマト
グラフイーに付した。次いでカラムを、１０倍量のＰＢ
Ｓ−１％トリトンＸ−１００とＰＢＳで洗つた。結合し
た。ＴＦＩを０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２で
溶出した。イムノ・アフイニテイーにより単離したＴＦ
Ｉを更に分離用ナトリウム・ドデシルスルフエート・ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓａｖａｎｔａｐｐａ
ｒａｔｕｓ）により精製した。最終取得物のアミノ酸を
分析した所、米国同時係属出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．７７，３
６６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）に記載
されたＨｅｐ Ｇ２細胞から単離したＴＦＩと同様のＮ
末端アミノ酸配列を有していた。単離したＣｈａｎｇリ
バーＴＦＩを用いて、上記したと同じ免疫化プロトコー
ルによりラビツトを免疫化した。得られた抗血清は、２
重免疫拡散法テストで約１００μｇ／ｍｌの力価を示し
た。この抗血清を用いてλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリ
ーのイムノ・スクリーニングを行なつた。
ｉｌｅｔｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８４，１８８６〜１８９０（１９８７）に
記載された方法に従つて培養した。ならし培地を、抗−
ＴＦＩ−Ｉｇセフアロース４Ｂカラムを用いたクロマト
グラフイーに付した。次いでカラムを、１０倍量のＰＢ
Ｓ−１％トリトンＸ−１００とＰＢＳで洗つた。結合し
た。ＴＦＩを０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２で
溶出した。イムノ・アフイニテイーにより単離したＴＦ
Ｉを更に分離用ナトリウム・ドデシルスルフエート・ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓａｖａｎｔａｐｐａ
ｒａｔｕｓ）により精製した。最終取得物のアミノ酸を
分析した所、米国同時係属出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．７７，３
６６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）に記載
されたＨｅｐ Ｇ２細胞から単離したＴＦＩと同様のＮ
末端アミノ酸配列を有していた。単離したＣｈａｎｇリ
バーＴＦＩを用いて、上記したと同じ免疫化プロトコー
ルによりラビツトを免疫化した。得られた抗血清は、２
重免疫拡散法テストで約１００μｇ／ｍｌの力価を示し
た。この抗血清を用いてλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリ
ーのイムノ・スクリーニングを行なつた。
【００２７】方法 ｃＤＮＡクローンの単離 抗体を用いた胎盤及び胎児肝ｃＤＮＡのスクリーニング
法、プラーク精製法及びλ−フアージ溶解物とＤＮＡの
調整法はＷｕｎとＫｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳＬＥＴ
Ｔ．１，１１〜１６（１９８７）に記載されている。抗
血清にあらかじめＢＮＮ９７λｇｔ１１溶解物を吸着さ
せ、ライブラリーのスクリーニング用に１／５００に希
釈した。
法、プラーク精製法及びλ−フアージ溶解物とＤＮＡの
調整法はＷｕｎとＫｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳＬＥＴ
Ｔ．１，１１〜１６（１９８７）に記載されている。抗
血清にあらかじめＢＮＮ９７λｇｔ１１溶解物を吸着さ
せ、ライブラリーのスクリーニング用に１／５００に希
釈した。
【００２８】第Ｘａ因子結合活性のスクリーニング イ
ソプロピル−β−チオガラクトシドによつてイムノ・ポ
ジテイブλ−フアージ溶解物あるいはコントロールλｇ
ｔ１１から誘導される組換え蛋白について、その第Ｘａ
因子結合活性をスクリーニングした。λ−フアージ溶解
物（０．１ｍｌ）は、ドツト−ブロツト装置（ＢｉｏＲ
ａｄ）を用いてニトロセルロースペーパーで濾過した。
次いでニトロセルロースペーパーを、５ｍｇ／ｍｌ牛血
清アルブミン及び２．５ｍｇ／ｍｌ牛ガンマグロブリン
を含むリン酸緩衝化食塩水に浸し、室温で１時間激しく
攪拌した。次いで、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンを添加し
た同様の溶液に更に１２５Ｉ−第Ｘａ因子（１．０×１
０６ｃｍｐ／ｍｌ）を浴解した溶液で置換し、更に１時
間激しく攪拌した。次いでニトロセルロースペーパー
を、０．０５％ＴｗｅｅｎＴＭ２０を含むリン酸緩衝化
食塩水で洗つた。洗浄緩衝液を５分毎に４回交換した。
次いでニトロセルロースペーパーを空気中で乾燥し、Ｋ
ｏｄａｋ ＸＲ５ｎフイルムを用いてオートラジオグラ
フイー用に調製した。フイルムを１週間、さらした後に
現像した。
ソプロピル−β−チオガラクトシドによつてイムノ・ポ
ジテイブλ−フアージ溶解物あるいはコントロールλｇ
ｔ１１から誘導される組換え蛋白について、その第Ｘａ
因子結合活性をスクリーニングした。λ−フアージ溶解
物（０．１ｍｌ）は、ドツト−ブロツト装置（ＢｉｏＲ
ａｄ）を用いてニトロセルロースペーパーで濾過した。
次いでニトロセルロースペーパーを、５ｍｇ／ｍｌ牛血
清アルブミン及び２．５ｍｇ／ｍｌ牛ガンマグロブリン
を含むリン酸緩衝化食塩水に浸し、室温で１時間激しく
攪拌した。次いで、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンを添加し
た同様の溶液に更に１２５Ｉ−第Ｘａ因子（１．０×１
０６ｃｍｐ／ｍｌ）を浴解した溶液で置換し、更に１時
間激しく攪拌した。次いでニトロセルロースペーパー
を、０．０５％ＴｗｅｅｎＴＭ２０を含むリン酸緩衝化
食塩水で洗つた。洗浄緩衝液を５分毎に４回交換した。
次いでニトロセルロースペーパーを空気中で乾燥し、Ｋ
ｏｄａｋ ＸＲ５ｎフイルムを用いてオートラジオグラ
フイー用に調製した。フイルムを１週間、さらした後に
現像した。
【００２９】ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの調製及びノーザン・
ブロツテイング ＬｉｚａｒｄｉとＥｎｇｅｌｂｅｒｇのナトリウム・パ
ークロレート抽出法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９
８，１１６〜１２２，（１９７９）〕により、培養した
Ｃｈａｎｇリバー細胞、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞及び
ＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ細胞から全ＲＮＡを調製し
た。製造業者の指針に従い、オリゴ（ｄＴ）−セルロー
ス（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，タイプ７７Ｆ）へ
のバッチ吸着によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。ノ
ーザン・ブロツト分析用に、それぞれのポリ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡ１０μｇをグリオキサールで処理し〔Ｔｈｏｍａ
ｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，２５５
〜２６６（１９８３）〕、１０ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０を含む緩衝液でアガロースゲル電気泳動に付
した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙのＲＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）を分子量マ
ーカーとして用いた。ＲＮＡをニトロセルロースペーパ
ー上にブロツトし、次いで８０℃で２時間焼いた。λＰ
９クローンのインサートＤＮＡを、ニツクトランスレー
シヨンにより３２Ｐで放射標識化し、プローブとして用
いた〔Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｄｅｌ，Ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｒｂ
ｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）〕。５０％ホルムアミ
ド、５ＸＳＳＣ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０、２５０μｇ／ｍｌ変性サケスペルマＤＮＡ及び１
Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ溶液を含む溶液５ｍｌ中のプロープ
（５×１０６ｃｐｍ）で４２℃で１６時間ハイブリダイ
ズさせた。フイルターを、０．１％ナトリウムドデシル
スルフエート（ＳＤＳ）、２ Ｘ ＳＳＳで室温で３
回、それぞれ５分間洗つた。次いでニトロセルロースペ
ーパーを空気中で乾燥し、ＫｏｄａｋＸＡＲ−５フイル
ム及び増感板を用いて−７０℃で３日間オートラジオグ
ラフイーに付した。
ブロツテイング ＬｉｚａｒｄｉとＥｎｇｅｌｂｅｒｇのナトリウム・パ
ークロレート抽出法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９
８，１１６〜１２２，（１９７９）〕により、培養した
Ｃｈａｎｇリバー細胞、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞及び
ＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ細胞から全ＲＮＡを調製し
た。製造業者の指針に従い、オリゴ（ｄＴ）−セルロー
ス（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，タイプ７７Ｆ）へ
のバッチ吸着によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。ノ
ーザン・ブロツト分析用に、それぞれのポリ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡ１０μｇをグリオキサールで処理し〔Ｔｈｏｍａ
ｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，２５５
〜２６６（１９８３）〕、１０ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０を含む緩衝液でアガロースゲル電気泳動に付
した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙのＲＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）を分子量マ
ーカーとして用いた。ＲＮＡをニトロセルロースペーパ
ー上にブロツトし、次いで８０℃で２時間焼いた。λＰ
９クローンのインサートＤＮＡを、ニツクトランスレー
シヨンにより３２Ｐで放射標識化し、プローブとして用
いた〔Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｄｅｌ，Ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｒｂ
ｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）〕。５０％ホルムアミ
ド、５ＸＳＳＣ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０、２５０μｇ／ｍｌ変性サケスペルマＤＮＡ及び１
Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ溶液を含む溶液５ｍｌ中のプロープ
（５×１０６ｃｐｍ）で４２℃で１６時間ハイブリダイ
ズさせた。フイルターを、０．１％ナトリウムドデシル
スルフエート（ＳＤＳ）、２ Ｘ ＳＳＳで室温で３
回、それぞれ５分間洗つた。次いでニトロセルロースペ
ーパーを空気中で乾燥し、ＫｏｄａｋＸＡＲ−５フイル
ム及び増感板を用いて−７０℃で３日間オートラジオグ
ラフイーに付した。
【００３０】他の組換えＤＮＡ法 クローン化λｇｔ１１ＤＮＡの調製、ｐＵＣ１９プラス
ミド及びＭ１３ｍｐ１８ベクターでのサブクローニン
グ、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた消化による欠
失、及びジデオキ法によるＤＮＡ配列決定〔Ｓａｎｇｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８３，６７７６〜６７８０（１９７７）〕は、Ｗｕｎと
Ｋｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１，１１−１
６（１９８７）に記載された方法に従つて実施した。Ｌ
ｉｐｍａｍとＰｅａｒｓｏｎによつて書かれたプログラ
ムＦＡＳＴＰ〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５〜１
４４１（１９８５）〕を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎの配列データバンク（レリース１３，１９８７
年６月）から相同性を示す蛋白のフアミリーを同定し、
該フアミリー円で配列のアラインメントを行なつた。
ミド及びＭ１３ｍｐ１８ベクターでのサブクローニン
グ、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた消化による欠
失、及びジデオキ法によるＤＮＡ配列決定〔Ｓａｎｇｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８３，６７７６〜６７８０（１９７７）〕は、Ｗｕｎと
Ｋｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１，１１−１
６（１９８７）に記載された方法に従つて実施した。Ｌ
ｉｐｍａｍとＰｅａｒｓｏｎによつて書かれたプログラ
ムＦＡＳＴＰ〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５〜１
４４１（１９８５）〕を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎの配列データバンク（レリース１３，１９８７
年６月）から相同性を示す蛋白のフアミリーを同定し、
該フアミリー円で配列のアラインメントを行なつた。
【００３１】結果 ｃＤＮＡライブラリーのスクリー
ニング 多数のセルラインについて、そのならし培地中にＴＦＩ
が存在するか否かをスクリーニングした。いくつかの肝
由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、ＨｅｐＧ２ヘ
パトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマが培地中にＴ
ＦＩを分泌することが見出された。初めに、ＴＦＩに対
する抗血清を用いてヒト胎児肝λｇｔ１１ｃＤＮＡライ
ブラリー（１０６プラーク・フオーミング・ユニツト）
をスクリーニングし、１５個の免疫学的にポジテイブな
クローンが得られた。次いで同様の方法により胎盤λｇ
ｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１
０６プラーク・フオーミング・ユニツトのうち１０個の
免疫学的にポジテイブなクローンが得られた。これらの
クローンをプラーク精製し、精製クローンの溶解物につ
いてＴＦＩの機能活性をテストした。イソプロピルチオ
ガラクトシドで誘導したフアージの溶解物をニトロセル
ロースペーパーに吸着せしめ、１２５Ｉ−第Ｘａ因子結
合活性をスクリーニングした。上記の免疫学的にポジテ
イブなクローンのいくつかは、ニトロセルロースペーパ
ー上の１２５Ｉ−第Ｘａ因子と結合する能力を示したこ
とが、図１により証明されている。免疫学的にポジテイ
ブな胎児肝クローン１５個のうち３個、及び免疫学的に
ポジテイブな胎盤クローン１０個のうち４個のクローン
が１２５Ｉ−第Ｘａ因子結合活性を示した。これらの免
疫学的に且つ機能的にポジテイブなクローンをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、インサート配列のサイズをゲル電気泳動に
より調べた。胎盤ライプラリー（λＰ９）から得た１つ
のクローンは約１．４ｋｂのインサート配列を有してお
り、他のすべてのクローンは約１．０ｋｂのインサート
配列を有していた。部分的ＤＮＡ配列決定により、１．
０ｋｂクローンはより長い１．４ｋｂ胎盤クローンの１
部分の配列と同じ配列を有していることが判つた。従つ
て、完全なＤＮＡ配列決定を行なうためにλＰ９を選択
した。
ニング 多数のセルラインについて、そのならし培地中にＴＦＩ
が存在するか否かをスクリーニングした。いくつかの肝
由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、ＨｅｐＧ２ヘ
パトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマが培地中にＴ
ＦＩを分泌することが見出された。初めに、ＴＦＩに対
する抗血清を用いてヒト胎児肝λｇｔ１１ｃＤＮＡライ
ブラリー（１０６プラーク・フオーミング・ユニツト）
をスクリーニングし、１５個の免疫学的にポジテイブな
クローンが得られた。次いで同様の方法により胎盤λｇ
ｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１
０６プラーク・フオーミング・ユニツトのうち１０個の
免疫学的にポジテイブなクローンが得られた。これらの
クローンをプラーク精製し、精製クローンの溶解物につ
いてＴＦＩの機能活性をテストした。イソプロピルチオ
ガラクトシドで誘導したフアージの溶解物をニトロセル
ロースペーパーに吸着せしめ、１２５Ｉ−第Ｘａ因子結
合活性をスクリーニングした。上記の免疫学的にポジテ
イブなクローンのいくつかは、ニトロセルロースペーパ
ー上の１２５Ｉ−第Ｘａ因子と結合する能力を示したこ
とが、図１により証明されている。免疫学的にポジテイ
ブな胎児肝クローン１５個のうち３個、及び免疫学的に
ポジテイブな胎盤クローン１０個のうち４個のクローン
が１２５Ｉ−第Ｘａ因子結合活性を示した。これらの免
疫学的に且つ機能的にポジテイブなクローンをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、インサート配列のサイズをゲル電気泳動に
より調べた。胎盤ライプラリー（λＰ９）から得た１つ
のクローンは約１．４ｋｂのインサート配列を有してお
り、他のすべてのクローンは約１．０ｋｂのインサート
配列を有していた。部分的ＤＮＡ配列決定により、１．
０ｋｂクローンはより長い１．４ｋｂ胎盤クローンの１
部分の配列と同じ配列を有していることが判つた。従つ
て、完全なＤＮＡ配列決定を行なうためにλＰ９を選択
した。
【００３２】ＴＦＩ ｃＤＮＡ単離物のヌクレオチド配
列及びその予想蛋白配列 λＰ９クローンについて、制限酵素地図の作成、Ｍ１３
サブクローニング及び，図２に示した技法を用いた配列
決定を実施した。エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失法〔Ｈ
ｅｎｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｅ２８，３５１〜３５９（１９
８４）〕により、２本のストランドの両者について全配
列を決定し、１４３２個の塩基からなることが見出され
た。その配列は図３および４に示した通りである。該配
列には、１３３塩基の５′非コード領域、９１２ヌクレ
オチドのオープン・リーデイング・フレーム及び３８７
ヌクレオチドの３′非コード領域が含まれている。最初
のＡＴＧはＴＡＧＡＴＧＡ配列中のヌクレオチド１３４
にあり、その直ぐ後のＡＣＡＡＴＧＡ配列中のヌクレオ
チド１４６に第２のＡＴＧがある。真核細胞のリボゾー
ムによつてイニシエートされるためのコンセンサス配列
として提案された配列、ＡＣＣＡＴＧＧ〔Ｋｏｚａｋ，
Ｃｅｌｌ，Ａ４，２８３〜２９２（１９８２）〕とは、
上記の配列は異なるが、これらはイニシエーシヨン配列
と考えられる。成熟蛋白のＮ末端に相当する配列の前に
２８個のアミノ酸配列がある。これら２８個のアミノ酸
からなる疎水性セグメントの組成及び長さは、シグナル
ペプチドに典型的なものである〔Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎ
ｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３，１７〜２１
（１９８３）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４，９９〜
１０５（１９８５）〕。シグナルペプチドはＡｌａ２８
−Ａｓｐ２９で開裂し、成熟蛋白を与えると考えられ
る。成熟ＴＦＩとして予想されるアミノ酸配列は、１８
個のシステイン残基及び７個のメチオニンを含む２７６
個のアミノ酸からなる。成熟ＴＦＩの推定蛋白配列に基
いて計算される分子量３１，９５０ダルトンは、単離し
て得た蛋白についてナトリウムドデシルスルフエートポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で調べた分子量３７〜４
０ｋＤａよりもいく分小さい。この分子量の相違は、天
然蛋白でのグリコシル化の移動性を反映したものと考え
られる。成熟蛋白に相当する推定蛋白配列は、Ａｓｎ−
Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒの構成を有する３ケのＮ−結合グリ
コシル化部位（アミノ酸の位置１４５，１９５及び２５
６）を有している。精製した全長ＴＦＩ及び加水分解さ
れた２つの単離体のアミノ酸分析の結果は、ｃＤＮＡ配
列から推定される蛋白配列（図３および４の下線を引い
た部分）と正確にマツチする。このことは、単離したＣ
ＤＮＡクローンはＴＦＩをコードしていることを示して
いる。３′非コード領域はＡ＋Ｔを豊富に含んでいる
（７０％Ａ＋Ｔ）。このクローンには、コンセンサス・
ポリアデニル化シグナル、ＡＡＴＡＡＡ〔Ｐｒｏｕｄｆ
ｏｏｔとＢｒｏｗｎｌｅｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２５２，３
５９〜３６２（１９８１）〕も、ポリＡテイルも見出さ
れなかつた。これは、ライブラリー構築の間に３′末端
部分の１部分が失なわれたためと考えられる。
列及びその予想蛋白配列 λＰ９クローンについて、制限酵素地図の作成、Ｍ１３
サブクローニング及び，図２に示した技法を用いた配列
決定を実施した。エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失法〔Ｈ
ｅｎｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｅ２８，３５１〜３５９（１９
８４）〕により、２本のストランドの両者について全配
列を決定し、１４３２個の塩基からなることが見出され
た。その配列は図３および４に示した通りである。該配
列には、１３３塩基の５′非コード領域、９１２ヌクレ
オチドのオープン・リーデイング・フレーム及び３８７
ヌクレオチドの３′非コード領域が含まれている。最初
のＡＴＧはＴＡＧＡＴＧＡ配列中のヌクレオチド１３４
にあり、その直ぐ後のＡＣＡＡＴＧＡ配列中のヌクレオ
チド１４６に第２のＡＴＧがある。真核細胞のリボゾー
ムによつてイニシエートされるためのコンセンサス配列
として提案された配列、ＡＣＣＡＴＧＧ〔Ｋｏｚａｋ，
Ｃｅｌｌ，Ａ４，２８３〜２９２（１９８２）〕とは、
上記の配列は異なるが、これらはイニシエーシヨン配列
と考えられる。成熟蛋白のＮ末端に相当する配列の前に
２８個のアミノ酸配列がある。これら２８個のアミノ酸
からなる疎水性セグメントの組成及び長さは、シグナル
ペプチドに典型的なものである〔Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎ
ｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３，１７〜２１
（１９８３）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４，９９〜
１０５（１９８５）〕。シグナルペプチドはＡｌａ２８
−Ａｓｐ２９で開裂し、成熟蛋白を与えると考えられ
る。成熟ＴＦＩとして予想されるアミノ酸配列は、１８
個のシステイン残基及び７個のメチオニンを含む２７６
個のアミノ酸からなる。成熟ＴＦＩの推定蛋白配列に基
いて計算される分子量３１，９５０ダルトンは、単離し
て得た蛋白についてナトリウムドデシルスルフエートポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で調べた分子量３７〜４
０ｋＤａよりもいく分小さい。この分子量の相違は、天
然蛋白でのグリコシル化の移動性を反映したものと考え
られる。成熟蛋白に相当する推定蛋白配列は、Ａｓｎ−
Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒの構成を有する３ケのＮ−結合グリ
コシル化部位（アミノ酸の位置１４５，１９５及び２５
６）を有している。精製した全長ＴＦＩ及び加水分解さ
れた２つの単離体のアミノ酸分析の結果は、ｃＤＮＡ配
列から推定される蛋白配列（図３および４の下線を引い
た部分）と正確にマツチする。このことは、単離したＣ
ＤＮＡクローンはＴＦＩをコードしていることを示して
いる。３′非コード領域はＡ＋Ｔを豊富に含んでいる
（７０％Ａ＋Ｔ）。このクローンには、コンセンサス・
ポリアデニル化シグナル、ＡＡＴＡＡＡ〔Ｐｒｏｕｄｆ
ｏｏｔとＢｒｏｗｎｌｅｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２５２，３
５９〜３６２（１９８１）〕も、ポリＡテイルも見出さ
れなかつた。これは、ライブラリー構築の間に３′末端
部分の１部分が失なわれたためと考えられる。
【００３３】電荷分布、疎水性／親水性及び内部相同性 ＴＦＩの翻訳されたアミノ酸配列には、２７リシン、１
７アルギニン、１１アスパラギン酸及び２５グルタミン
酸が含まれている。蛋白にそつた電荷分布は図５に示し
たようにかなり高低のあるものである。シグナルペプチ
ド領域には、２６個の中性残基とともに２個のプラスに
荷電したリシンが含まれていた。成熟蛋白のアミノ末端
領域には、高度にマイナスに荷電した配列が含まれてい
た。最初の７個の残基のうち６個はアスパラギン酸ある
いはグルタミン酸であり、この後に更に高度にマイナス
に荷電した２個のアミノ酸のダウンストリームがあり、
その後にプラスに荷電したリシン残基がある。中心部分
は一般的にマイナスに荷電している。カルボキシ末端に
は高度にプラスに荷電したセグメントがある。 ＴＦＩ
のアミノ酸２６５〜２９３には、６−共役アルギニン＋
リシン残基を含むプラスに荷電した１４個のアミノ酸が
ある。
７アルギニン、１１アスパラギン酸及び２５グルタミン
酸が含まれている。蛋白にそつた電荷分布は図５に示し
たようにかなり高低のあるものである。シグナルペプチ
ド領域には、２６個の中性残基とともに２個のプラスに
荷電したリシンが含まれていた。成熟蛋白のアミノ末端
領域には、高度にマイナスに荷電した配列が含まれてい
た。最初の７個の残基のうち６個はアスパラギン酸ある
いはグルタミン酸であり、この後に更に高度にマイナス
に荷電した２個のアミノ酸のダウンストリームがあり、
その後にプラスに荷電したリシン残基がある。中心部分
は一般的にマイナスに荷電している。カルボキシ末端に
は高度にプラスに荷電したセグメントがある。 ＴＦＩ
のアミノ酸２６５〜２９３には、６−共役アルギニン＋
リシン残基を含むプラスに荷電した１４個のアミノ酸が
ある。
【００３４】ＴＦＩ蛋白の予想疎水性／親水性プロフア
イルは図６に示した通りである。シグナルペプチドに
は、予想されたように高度に疎水性の領域が含まれてい
る。残りの部分はむしろ親水性である。ＴＦＩの翻訳さ
れたアミノ酸配列には、いくつかの区別し得るドメイン
が含まれている。高度にマイナスに荷電したＮ末端ドメ
イン及び高度にプラスに荷電したＣ末端ドメインに加え
て、Ｋｕｎｉｔｚ型抑制因子の典型的配列（下記参照）
を有する３個の相同ドメインからなる中心部分がある。
イルは図６に示した通りである。シグナルペプチドに
は、予想されたように高度に疎水性の領域が含まれてい
る。残りの部分はむしろ親水性である。ＴＦＩの翻訳さ
れたアミノ酸配列には、いくつかの区別し得るドメイン
が含まれている。高度にマイナスに荷電したＮ末端ドメ
イン及び高度にプラスに荷電したＣ末端ドメインに加え
て、Ｋｕｎｉｔｚ型抑制因子の典型的配列（下記参照）
を有する３個の相同ドメインからなる中心部分がある。
【００３５】他の蛋白との相同性 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの配列データベースを
調べた所、ＴＦＩのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインと
は、他の公知蛋白と有意な相同性を有していないことが
見出された。しかしながら、３個の内部相同ドメイン
は、牛膵臓塩基性プロテアーゼ抑制因子（アプロチニ
ン）、毒塩基性プロテアーゼ抑制因子、インター−α−
トリプシン抑制因子（図７）などの他の塩基性プロテア
ーゼ抑制因子の配列とそれぞれ相同性を示した。これら
すべての抑制因子にはジスルフイド結合構造が高度に保
持されており、これは注目すべき事実である。これらの
相同性から明らかなように、ＴＦＩは塩基性プロテアー
ゼ抑制因子遺伝子スーパーフアミリーに属する。
ａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの配列データベースを
調べた所、ＴＦＩのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインと
は、他の公知蛋白と有意な相同性を有していないことが
見出された。しかしながら、３個の内部相同ドメイン
は、牛膵臓塩基性プロテアーゼ抑制因子（アプロチニ
ン）、毒塩基性プロテアーゼ抑制因子、インター−α−
トリプシン抑制因子（図７）などの他の塩基性プロテア
ーゼ抑制因子の配列とそれぞれ相同性を示した。これら
すべての抑制因子にはジスルフイド結合構造が高度に保
持されており、これは注目すべき事実である。これらの
相同性から明らかなように、ＴＦＩは塩基性プロテアー
ゼ抑制因子遺伝子スーパーフアミリーに属する。
【００３６】ノーザン・ブロツテング ＴＦＩ産生肝由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、
ＨｅｐＧ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ
細胞からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。変性アガロー
スゲル電気泳動によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶解し、ニ
トロセルロースペーパー上にプロツトし、３２Ｐ−標識
化ＴＦＩ ｃＤＮＡ（λＰ９）をプローブとして用いて
調べた。図８に示したように、２つの主要なハイブリダ
イゼーシヨンバンドが観察された。これらはテストした
３つの全てのセルラインに見られる１．４ｋｂｍＲＮＡ
及び４．４ｋｂｍＲＮＡに対応するものである。検出し
得る量のＴＦＩを産生しない他のセルラインについてテ
ストしたが、プローブとのハイブリダイゼーシヨンは観
察されなかつた（データを示していない）。本明細書の
記載から、当業者にとつては本発明の思想及び範囲円に
ある他の各種の例が自明であろう。これらの例の全ては
本明細書のクレームの範囲内のものである。
ＨｅｐＧ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ
細胞からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。変性アガロー
スゲル電気泳動によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶解し、ニ
トロセルロースペーパー上にプロツトし、３２Ｐ−標識
化ＴＦＩ ｃＤＮＡ（λＰ９）をプローブとして用いて
調べた。図８に示したように、２つの主要なハイブリダ
イゼーシヨンバンドが観察された。これらはテストした
３つの全てのセルラインに見られる１．４ｋｂｍＲＮＡ
及び４．４ｋｂｍＲＮＡに対応するものである。検出し
得る量のＴＦＩを産生しない他のセルラインについてテ
ストしたが、プローブとのハイブリダイゼーシヨンは観
察されなかつた（データを示していない）。本明細書の
記載から、当業者にとつては本発明の思想及び範囲円に
ある他の各種の例が自明であろう。これらの例の全ては
本明細書のクレームの範囲内のものである。
【図１】 １２５Ｉ−第Ｘａ因子を用いたλｇｔ１１
クローンのスクリーニングを示した写真である。
クローンのスクリーニングを示した写真である。
【図２】 部分的制限酵素地図及びλＰ９のインサー
ト配列の配列決定に用いた技法を示している。
ト配列の配列決定に用いた技法を示している。
【図３】 ヒトＴＦＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
及び翻訳されたアミノ酸配列を示している。
及び翻訳されたアミノ酸配列を示している。
【図４】ヒトＴＦＩｃＤＮＡのヌクレオチド配列および
翻訳されたアミノ酸配列。
翻訳されたアミノ酸配列。
【図５】 ＴＦＩのアミノ酸配列における電荷分布を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図６】 ＴＦＩの疎水性プロフアイルを示すグラフ
である。
である。
【図７】 ＴＦＩの塩基性プロテアーゼ抑制因子ドメ
インと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメ
ントを示す。
インと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメ
ントを示す。
【図８】 ３個の肝由来セルラインから得たＲＮＡの
ノーザン・ブロツト分析を示す写真である。
ノーザン・ブロツト分析を示す写真である。
【手続補正書】
【提出日】平成１０年６月１０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 ヒト組織因子抑制因子
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】本発明は、組織因子抑制因子（ＴＦＩ）
あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子（ＬＡＣＩ）
として知られる凝固抑制因子に関する。更に詳細には、
本発明は全長ＴＦＩを本質的に表現しているｃＤＮＡク
ローンに関する。
あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子（ＬＡＣＩ）
として知られる凝固抑制因子に関する。更に詳細には、
本発明は全長ＴＦＩを本質的に表現しているｃＤＮＡク
ローンに関する。
【０００２】哺乳動物の血液での凝固カスケードには、
２つの異なるシステム、即ち内因性システムと外因性シ
ステムとがある。後者の外因性システムは、血液が組織
スロンボプラステイン（第ＩＩＩ因子）（以後、組織因
子（ＴＦ）と言う）にさらされることによって活性化さ
れる。この組織因子は、各種の細胞のプラズマメンブレ
ン中で生じるリポタンパク質であり、特に脳及び肺にお
いて多く存在する。プラズマ第ＶＩＩ因子あるいはその
活性体である第ＶＩＩａ因子がＴＦと接触すると、ＴＦ
とともにカルシウム依存性複合体を形成し、これがタン
パク加水分解作用を発揮して第Ｘ因子を第Ｘａ因子にま
た第ＩＸ因子を第ＩＸａ因子に活性化する。
２つの異なるシステム、即ち内因性システムと外因性シ
ステムとがある。後者の外因性システムは、血液が組織
スロンボプラステイン（第ＩＩＩ因子）（以後、組織因
子（ＴＦ）と言う）にさらされることによって活性化さ
れる。この組織因子は、各種の細胞のプラズマメンブレ
ン中で生じるリポタンパク質であり、特に脳及び肺にお
いて多く存在する。プラズマ第ＶＩＩ因子あるいはその
活性体である第ＶＩＩａ因子がＴＦと接触すると、ＴＦ
とともにカルシウム依存性複合体を形成し、これがタン
パク加水分解作用を発揮して第Ｘ因子を第Ｘａ因子にま
た第ＩＸ因子を第ＩＸａ因子に活性化する。
【０００３】ＴＦによりイニシエイトされる凝固系の制
御に関するこれまでの研究により、ＴＦを血清とともに
インキュベーション（粗組織スロンボプラステイン調製
物中で）すると、その活性がｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制さ
れまたＴＦをマウスに注入した時の致死効果が阻止され
ることが明らかにされている。Ｈｊｏｒｔの精力的な研
究によって、この分野におけるそれまでの研究成果が確
認され更に研究が進められて、血清中の抑制成分が第Ｖ
ＩＩ−ＴＦ複合因子を認識することが結論として示され
た〔Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．９，ｓｕｐｐｌ．２７，７６〜９７（１９５
７）〕。この結論は、プラズマ中で生じるＴＦの抑制に
はＣａ２＋の存在が必要であり（第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因
子がＴＦに結合する際にもＣａ２＋の存在が必要）ＴＦ
の抑制はＥＤＴＡによる２価のカチオンのキレート化に
よって阻止され及び／又は逆転されるという事実と符合
している。
御に関するこれまでの研究により、ＴＦを血清とともに
インキュベーション（粗組織スロンボプラステイン調製
物中で）すると、その活性がｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制さ
れまたＴＦをマウスに注入した時の致死効果が阻止され
ることが明らかにされている。Ｈｊｏｒｔの精力的な研
究によって、この分野におけるそれまでの研究成果が確
認され更に研究が進められて、血清中の抑制成分が第Ｖ
ＩＩ−ＴＦ複合因子を認識することが結論として示され
た〔Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．９，ｓｕｐｐｌ．２７，７６〜９７（１９５
７）〕。この結論は、プラズマ中で生じるＴＦの抑制に
はＣａ２＋の存在が必要であり（第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因
子がＴＦに結合する際にもＣａ２＋の存在が必要）ＴＦ
の抑制はＥＤＴＡによる２価のカチオンのキレート化に
よって阻止され及び／又は逆転されるという事実と符合
している。
【０００４】最近の研究によって、プラズマあるいは血
清中でＴＦを抑制するには第ＶＩＩａ因子だけではなく
触媒的に活性な第Ｘａ因子と更に他の因子が必要である
ことが明らかにされている〔ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉ
ｃｈ、Ｂｌｏｏｄ６９，１５０〜１５５（１９８７）；
Ｓａｎｄｅｒｓら、Ｉｂｉｄ．，６６，２０４〜２１２
（１９８５）〕。この他の因子は組織因子抑制因子（Ｔ
ＦＩ）あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子（ＬＡ
ＣＩ）と定義されるものであり、バリウム吸着プラズマ
中に存在している。また血清を遠心して密度１．２１ｇ
／ｃｍ３とした時の浮遊液中のリポタンパク質フラクシ
ョンとともにＴＦＩ活性が分離されることから、この因
子はリポタンパク質と関連しているものと考えられる。
清中でＴＦを抑制するには第ＶＩＩａ因子だけではなく
触媒的に活性な第Ｘａ因子と更に他の因子が必要である
ことが明らかにされている〔ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉ
ｃｈ、Ｂｌｏｏｄ６９，１５０〜１５５（１９８７）；
Ｓａｎｄｅｒｓら、Ｉｂｉｄ．，６６，２０４〜２１２
（１９８５）〕。この他の因子は組織因子抑制因子（Ｔ
ＦＩ）あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子（ＬＡ
ＣＩ）と定義されるものであり、バリウム吸着プラズマ
中に存在している。また血清を遠心して密度１．２１ｇ
／ｃｍ３とした時の浮遊液中のリポタンパク質フラクシ
ョンとともにＴＦＩ活性が分離されることから、この因
子はリポタンパク質と関連しているものと考えられる。
【０００５】ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉｃｈ、Ｂｌｏｏ
ｄ６９，１５０〜１５５（１９８７）及びＰｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、１８８６〜１
８９０（１９８７）によればＨｅｐＧ２細胞（ヒトヘパ
トーマセルライン）が、プラズマ中に存在するＴＦＩと
同様の特性を有する抑制成分を分泌することが示されて
いる。
ｄ６９，１５０〜１５５（１９８７）及びＰｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、１８８６〜１
８９０（１９８７）によればＨｅｐＧ２細胞（ヒトヘパ
トーマセルライン）が、プラズマ中に存在するＴＦＩと
同様の特性を有する抑制成分を分泌することが示されて
いる。
【０００６】米国同時係属出顧Ｓｅｒ．Ｎｏ．７７，３
６６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）には、
ＨｅｐＧ２細胞から分泌された精製組織因子抑制因子が
記戴されている。この組織因子抑制因子には２つの形
態、即ちナトリウムドデシルスルフェートポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した時
に約３７，０００〜４０，０００ダルトンの位置に現わ
れるＴＦＩ１と約２５，０００〜２６，０００ダルトン
の位置に現われるＴＦＩ２との２つの形態が存在するこ
とが見出されている。ＴＦＩのアミノ酸配列のＮ−末端
部分が以下のように決定されている。
６６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）には、
ＨｅｐＧ２細胞から分泌された精製組織因子抑制因子が
記戴されている。この組織因子抑制因子には２つの形
態、即ちナトリウムドデシルスルフェートポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した時
に約３７，０００〜４０，０００ダルトンの位置に現わ
れるＴＦＩ１と約２５，０００〜２６，０００ダルトン
の位置に現われるＴＦＩ２との２つの形態が存在するこ
とが見出されている。ＴＦＩのアミノ酸配列のＮ−末端
部分が以下のように決定されている。
【化１】 （Ｘ−Ｘは未決定である） 上記米国出願明細書の記載は本明細書に引用する。
【０００７】発明の要旨 本発明によれば、本質的に組織因子抑制因子の全長を表
現するｃＤＮＡクローンの完全コード配列が見出され
た。最初に、ヒト胎盤及び胎児肝λｇｔ１１ ｃＤＮＡ
ライブラリーを、精製ＴＦＩに対するラビットポリクロ
ーナル血清でスクリーニングした。免疫学的にポジティ
ブなクローンについて、更に１２５Ｉ−第Ｘａ因子結合
活性をスクリーニングした。免疫学的にかつ機能的に活
性な７個のクローンが得られた。最も長いクローンは胎
盤由来λＰ９であって１．４キロベース（ｋｂ）であ
り、他の６個のクローンは１．０ｋｂであった。部分的
ＤＮＡ配列決定により、１．０ｋｂクローンは１．４ｋ
ｂクローンの１部分と同じ配列を有することが明らかに
なった。ヌクレオチド配列分析により、λＰ９は、１３
３ｂｐの５′非コード領域、９１２ｂｐのオープン・リ
ーディング・フレーム、ストップコドン及び３８４ｂｐ
の３′非コード領域を含む１４３２塩基対（ｂｐ）のｃ
ＤＮＡインサート配列からなることが明らかにされた。
現するｃＤＮＡクローンの完全コード配列が見出され
た。最初に、ヒト胎盤及び胎児肝λｇｔ１１ ｃＤＮＡ
ライブラリーを、精製ＴＦＩに対するラビットポリクロ
ーナル血清でスクリーニングした。免疫学的にポジティ
ブなクローンについて、更に１２５Ｉ−第Ｘａ因子結合
活性をスクリーニングした。免疫学的にかつ機能的に活
性な７個のクローンが得られた。最も長いクローンは胎
盤由来λＰ９であって１．４キロベース（ｋｂ）であ
り、他の６個のクローンは１．０ｋｂであった。部分的
ＤＮＡ配列決定により、１．０ｋｂクローンは１．４ｋ
ｂクローンの１部分と同じ配列を有することが明らかに
なった。ヌクレオチド配列分析により、λＰ９は、１３
３ｂｐの５′非コード領域、９１２ｂｐのオープン・リ
ーディング・フレーム、ストップコドン及び３８４ｂｐ
の３′非コード領域を含む１４３２塩基対（ｂｐ）のｃ
ＤＮＡインサート配列からなることが明らかにされた。
【０００８】このｃＤＮＡ配列は、１８個のシステイン
及び７個のメチオニンを含む２７６個のアミノ酸からな
る３１，９５０ダルトンの蛋白質をコードしている。翻
訳されたアミノ配列により、成熟ＴＦＩ蛋白の先には約
２８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが存在する
ことが明らかにされた。ここで言う“成熟”ＴＦＩと
は、本明細書において記載するλＰ９クローンのＡＴＧ
翻訳コドンによってＴＦＩとメチオニルＴＦＩとの両者
を含むように定義されるものであり、このことは以下の
記載から理解することができよう。ＴＦＩ蛋白には、Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは普通の２０個のアミノ
酸のうちのいずれでもよい）の配列を有する３個のＮ−
結合グリコシル化部位が存在する。これらの部位は、
５′非コード領域の後の最初のメチオニンの位置をアミ
ノ酸の位置＋１とした時、Ａｓｎ１４５，Ａｓｎ１９５
及びＡｓｎ２５６の位置にある。
及び７個のメチオニンを含む２７６個のアミノ酸からな
る３１，９５０ダルトンの蛋白質をコードしている。翻
訳されたアミノ配列により、成熟ＴＦＩ蛋白の先には約
２８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが存在する
ことが明らかにされた。ここで言う“成熟”ＴＦＩと
は、本明細書において記載するλＰ９クローンのＡＴＧ
翻訳コドンによってＴＦＩとメチオニルＴＦＩとの両者
を含むように定義されるものであり、このことは以下の
記載から理解することができよう。ＴＦＩ蛋白には、Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは普通の２０個のアミノ
酸のうちのいずれでもよい）の配列を有する３個のＮ−
結合グリコシル化部位が存在する。これらの部位は、
５′非コード領域の後の最初のメチオニンの位置をアミ
ノ酸の位置＋１とした時、Ａｓｎ１４５，Ａｓｎ１９５
及びＡｓｎ２５６の位置にある。
【０００９】ＴＦＩの翻訳されたアミノ酸配列により、
該アミノ酸配列は、高度にマイナスに荷電したＮ末端部
分、高度にプラスに荷電したカルボキシ末端部分、及び
Ｋｕｎｉｔｚ型酵素抑制因子の典型的配列を有する３個
の相同ドメインからなる介在配列部分などのいくつかの
識別可能な領域を有していることが明らかにされた。相
同性についての研究から、ＴＦＩは塩基性プロテアーゼ
抑制因子遺伝子スーパーファミリーに属するものと考え
られる。
該アミノ酸配列は、高度にマイナスに荷電したＮ末端部
分、高度にプラスに荷電したカルボキシ末端部分、及び
Ｋｕｎｉｔｚ型酵素抑制因子の典型的配列を有する３個
の相同ドメインからなる介在配列部分などのいくつかの
識別可能な領域を有していることが明らかにされた。相
同性についての研究から、ＴＦＩは塩基性プロテアーゼ
抑制因子遺伝子スーパーファミリーに属するものと考え
られる。
【００１０】ｃＤＮＡクローンλＰ９を開発するために
用いた蛋白材料はヒト胎盤組織であり、この組織は通常
の外科的手法による分娩後に広く入手することができ
る。本発明において用いられているλｇｔ１１（１ａｃ
５ ｎｉｎ５ ｃ１８５７ ｓ１００）はよく知られた
ものであって、普通に入手することのできるラムダファ
ージ発現ベクターである。その構成及び制限酵素地図
は、ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，１１９４〜１１９８（１
９８３）に記載されている。ノーザン・ブロット分析に
より、肝由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、Ｈｅ
ｐＧ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマは、
ＴＦＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズする２つの主要なｍ
ＲＮＡ（１．４ｋｂと４．４ｋｂ）を有していることが
明らかにされた。
用いた蛋白材料はヒト胎盤組織であり、この組織は通常
の外科的手法による分娩後に広く入手することができ
る。本発明において用いられているλｇｔ１１（１ａｃ
５ ｎｉｎ５ ｃ１８５７ ｓ１００）はよく知られた
ものであって、普通に入手することのできるラムダファ
ージ発現ベクターである。その構成及び制限酵素地図
は、ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，１１９４〜１１９８（１
９８３）に記載されている。ノーザン・ブロット分析に
より、肝由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、Ｈｅ
ｐＧ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマは、
ＴＦＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズする２つの主要なｍ
ＲＮＡ（１．４ｋｂと４．４ｋｂ）を有していることが
明らかにされた。
【００１１】本明細書に記載した如き、ＴＦＩのための
ｃＤＮＡのクローニング及びその全蛋白配列及び構造の
解明により、詳細な構造一機能分析が可能となり、また
その生合成的レギュレーションの研究のための基本的知
識が得られる。しかして本発明は、第Ｘａ因子及び第Ｖ
ＩＩａ／ＴＦ酵素複合因子を抑制することのできる試薬
についての血液凝固カスケード研究にとって重要なもの
である。
ｃＤＮＡのクローニング及びその全蛋白配列及び構造の
解明により、詳細な構造一機能分析が可能となり、また
その生合成的レギュレーションの研究のための基本的知
識が得られる。しかして本発明は、第Ｘａ因子及び第Ｖ
ＩＩａ／ＴＦ酵素複合因子を抑制することのできる試薬
についての血液凝固カスケード研究にとって重要なもの
である。
【００１２】図面の詳細な記述 本明細書においては、特許請求の範囲の記載によって本
発明を形成すると考えられる対象が特に指摘され明白に
クレームされているが、以下に記述する図面についての
説明とともに本発明の好ましい態様についての記載によ
り本発明がよりよく理解されるものと考える。
発明を形成すると考えられる対象が特に指摘され明白に
クレームされているが、以下に記述する図面についての
説明とともに本発明の好ましい態様についての記載によ
り本発明がよりよく理解されるものと考える。
【００１３】図１は、１２５Ｉ−第Ｘａ因子を用いたλ
ｇｔ１１クローンのスクリーニングを示したものであ
る。クローン化ファージの溶解物（０．１ｍｌ）を、ド
ット・プロット装置を用いたサクションによりニトロセ
ルロースペーパー上にスポットし、次いでニトロセルロ
ースペーパーを１２５Ｉ−第Ｘａ因子でプローブし、以
後に記述するようにしてオートラジオグラフィーに付し
た。黒いスポットとして現われているクローンが１２５
Ｉ−第Ｘａ因子と結合したポジティブ・クローンであ
る。コントロールλｇｔ１１（下の右側のコーナー）及
び他のクローンは１２５Ｉ−第Ｘａ因子と結合しなかっ
た。
ｇｔ１１クローンのスクリーニングを示したものであ
る。クローン化ファージの溶解物（０．１ｍｌ）を、ド
ット・プロット装置を用いたサクションによりニトロセ
ルロースペーパー上にスポットし、次いでニトロセルロ
ースペーパーを１２５Ｉ−第Ｘａ因子でプローブし、以
後に記述するようにしてオートラジオグラフィーに付し
た。黒いスポットとして現われているクローンが１２５
Ｉ−第Ｘａ因子と結合したポジティブ・クローンであ
る。コントロールλｇｔ１１（下の右側のコーナー）及
び他のクローンは１２５Ｉ−第Ｘａ因子と結合しなかっ
た。
【００１４】図２は、部分的制限酵素地図及びλＰ９の
インサート配列の配列決定に用いた技法を示している。
下に示したスケールはヌクレオチドの位置を示してい
る。太い棒線はコード領域を示しており、細い棒線は
５′及び３′非コード領域を示している。制限酵素部位
は消化により確認した。矢印はｃＤＮＡの配列決走に用
いたオーバーラッピングＭ１３クローンを示している。
インサート配列の配列決定に用いた技法を示している。
下に示したスケールはヌクレオチドの位置を示してい
る。太い棒線はコード領域を示しており、細い棒線は
５′及び３′非コード領域を示している。制限酵素部位
は消化により確認した。矢印はｃＤＮＡの配列決走に用
いたオーバーラッピングＭ１３クローンを示している。
【００１５】図３および４はヒトＴＦＩ ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列及び翻訳されたアミノ酸配列を示してい
る。ヌクレオチドの番号は左側に示されており、アミノ
酸の番号は右側に示されている。下線を引いた配列は、
精製したＴＦＩ蛋白と、Ｖ８プロテアーゼとトリプシン
で消化したペプチドとを用いたアミノ酸配列分析によっ
て独立に確認された配列である。＋１のアミノ酸は、
５′非コード領域のストップコドンの後にある最初のメ
チオニンである。Ｎ−結合グリコシル化部位は星印で示
されている。
クレオチド配列及び翻訳されたアミノ酸配列を示してい
る。ヌクレオチドの番号は左側に示されており、アミノ
酸の番号は右側に示されている。下線を引いた配列は、
精製したＴＦＩ蛋白と、Ｖ８プロテアーゼとトリプシン
で消化したペプチドとを用いたアミノ酸配列分析によっ
て独立に確認された配列である。＋１のアミノ酸は、
５′非コード領域のストップコドンの後にある最初のメ
チオニンである。Ｎ−結合グリコシル化部位は星印で示
されている。
【００１６】図５は、ＴＦＩのアミノ酸配列における電
荷分布を示すグラフである。電荷は最初のアミノ酸残基
からｉ番目のアミノ酸残基までを計算したものであり、
その電荷の値がｉ番目の残基に示されている。従って、
ｉ番目の位置の値は、最初のアミノ酸残基からｉ番目の
アミノ酸残基までの全ての電荷を合計したものであり、
ｉ番目とｊ番目（ｊ＞ｉ）のアミノ酸残基における値の
差は、ｉ番目からｊ番目までのアミノ酸残基の合計電荷
を示すものである。
荷分布を示すグラフである。電荷は最初のアミノ酸残基
からｉ番目のアミノ酸残基までを計算したものであり、
その電荷の値がｉ番目の残基に示されている。従って、
ｉ番目の位置の値は、最初のアミノ酸残基からｉ番目の
アミノ酸残基までの全ての電荷を合計したものであり、
ｉ番目とｊ番目（ｊ＞ｉ）のアミノ酸残基における値の
差は、ｉ番目からｊ番目までのアミノ酸残基の合計電荷
を示すものである。
【００１７】図６は、ＴＦＩの疎水性プロファイルを示
すグラフである。アミノ酸残基の疎水性の指数をアミノ
酸残基が蛋白内に埋没された深さ（Ｘ線による結晶学的
データから得られる）として定義するコンピュータープ
ログラムによって、疎水性プロファイルを分析した〔Ｋ
ｉｎｄｅｒａら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．４，
２３〜５５（１９８５）〕。アミノ酸配列に沿った疎水
性プロファイルは、ＩＭＳＬ ＬＩｂｒａｒｙのプログ
ラムＩＣＳＳＣＵを用いることによって、滑らかになっ
た〔ＩＭＳＬ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｍａｎｕａｌ，９ｔｈ ｅｄ．，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｆｏｒ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｔａｔ
ｉｓｔｉｃａｌ Ｓｕｂｒｏｕｔｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒ
ｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ（１９８２）〕。
すグラフである。アミノ酸残基の疎水性の指数をアミノ
酸残基が蛋白内に埋没された深さ（Ｘ線による結晶学的
データから得られる）として定義するコンピュータープ
ログラムによって、疎水性プロファイルを分析した〔Ｋ
ｉｎｄｅｒａら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．４，
２３〜５５（１９８５）〕。アミノ酸配列に沿った疎水
性プロファイルは、ＩＭＳＬ ＬＩｂｒａｒｙのプログ
ラムＩＣＳＳＣＵを用いることによって、滑らかになっ
た〔ＩＭＳＬ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｍａｎｕａｌ，９ｔｈ ｅｄ．，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｆｏｒ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｔａｔ
ｉｓｔｉｃａｌ Ｓｕｂｒｏｕｔｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒ
ｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ（１９８２）〕。
【００１８】図７は、ＴＦＩの塩基性プロテアーゼ抑制
因子ドメインと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのア
ラインメントを示す。ＴＦＩ以外の他の全ての配列は、
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの蛋白配列データベース
（Ｇｅｏｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，レリース１３，Ｊｕｎｅ１
９８７）から得たものである。 １：牛塩基性プロテアーゼ抑制因子前駆体； ２：牛初乳トリプシン抑制因子； ３：牛血清塩基性プロテアーゼ抑制因子； ４：食用カタツムリ・イソ抑制因子； ５：紅海ウミガメ塩基性プロテアーゼ抑制因子（１〜７
９のアミノ酸のみ）； ６：ウエスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ
抑制因子Ｉ； ７：リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子ＩＩ； ８：ケープ・コブラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
Ｉ； ９：ルッセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
Ｉ； １０：サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
ＩＩ； １１：イースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロ
テアーゼ抑制因子Ｉホモローグ； １２：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｂ； １３：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｅ； １４：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｉ； １５：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｋ； １６：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（マイナー）； １７：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジャー）； １８：β−２−ブンガロトキシンＢ鎖； １９：ウマ・インターα−トリプシン抑制因子〔アミノ
酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２０：ブタ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２１：ウシ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２２：ヒト・α−１−マイクログロブリン／インター−
α−トリプシン抑制因子前駆体〔アミノ酸２２７〜２８
３（１）；２８４〜３５２（２）〕； ２３：ＴＦＩ〔アミノ酸４７〜１１７（１）；１１８〜
１８８（２）；２１０〜２８０（３）〕。 最良のアラインメントを達成するためには１６，１７，
１８にギャップが含まれていた。アミノ酸を示す標準的
１文字コードを用いた。
因子ドメインと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのア
ラインメントを示す。ＴＦＩ以外の他の全ての配列は、
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの蛋白配列データベース
（Ｇｅｏｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，レリース１３，Ｊｕｎｅ１
９８７）から得たものである。 １：牛塩基性プロテアーゼ抑制因子前駆体； ２：牛初乳トリプシン抑制因子； ３：牛血清塩基性プロテアーゼ抑制因子； ４：食用カタツムリ・イソ抑制因子； ５：紅海ウミガメ塩基性プロテアーゼ抑制因子（１〜７
９のアミノ酸のみ）； ６：ウエスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ
抑制因子Ｉ； ７：リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子ＩＩ； ８：ケープ・コブラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
Ｉ； ９：ルッセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
Ｉ； １０：サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
ＩＩ； １１：イースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロ
テアーゼ抑制因子Ｉホモローグ； １２：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｂ； １３：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｅ； １４：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｉ； １５：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｋ； １６：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（マイナー）； １７：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジャー）； １８：β−２−ブンガロトキシンＢ鎖； １９：ウマ・インターα−トリプシン抑制因子〔アミノ
酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２０：ブタ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２１：ウシ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２２：ヒト・α−１−マイクログロブリン／インター−
α−トリプシン抑制因子前駆体〔アミノ酸２２７〜２８
３（１）；２８４〜３５２（２）〕； ２３：ＴＦＩ〔アミノ酸４７〜１１７（１）；１１８〜
１８８（２）；２１０〜２８０（３）〕。 最良のアラインメントを達成するためには１６，１７，
１８にギャップが含まれていた。アミノ酸を示す標準的
１文字コードを用いた。
【００１９】図８は、３個の肝由来セルラインから得た
ＲＮＡのノーザン・ブロット分析を示す。１レーン当り
１０μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いた。 レーン１：ｃｈａｎｇリバー細胞、 レーン２：ＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ細胞、 レーン３：ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞． 本明細書においては、標準的生化学命名法を用いてお
り、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ）として表わさ
れている。対応するヌクレオチドは、例えばデオキシグ
アノシン−５′−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）であ
る。ＤＮＡヌクレオチド配列は、便宜上慣用的に１本鎖
のみで示されており、１本鎖におけるＡはその相補性塩
基としてＴを内包しており、ＧはＣを内包している。ア
ミノ酸は、以下の表に示すように１文字あるいは３文字
で示されている。
ＲＮＡのノーザン・ブロット分析を示す。１レーン当り
１０μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いた。 レーン１：ｃｈａｎｇリバー細胞、 レーン２：ＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ細胞、 レーン３：ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞． 本明細書においては、標準的生化学命名法を用いてお
り、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ）として表わさ
れている。対応するヌクレオチドは、例えばデオキシグ
アノシン−５′−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）であ
る。ＤＮＡヌクレオチド配列は、便宜上慣用的に１本鎖
のみで示されており、１本鎖におけるＡはその相補性塩
基としてＴを内包しており、ＧはＣを内包している。ア
ミノ酸は、以下の表に示すように１文字あるいは３文字
で示されている。
【００２０】
【表１】
【００２１】本明細書において記載される普通に入手し
得る制限酵素は、以下に示す制限配列及び開裂パターン
（矢印で示した）を有している。
得る制限酵素は、以下に示す制限配列及び開裂パターン
（矢印で示した）を有している。
【化２】
【００２２】本発明の好ましい態様を更に詳細に説明す
るために、以下に記述する実験を実施した。
るために、以下に記述する実験を実施した。
【００２３】例１ 材料 ヒト胎盤及び胎児肝ｃＤＮＡライブラリーをＣｌｏｎｅ
ｔｅｃｈから得た。プロトブロット（Ｐｒｏｔｏｂｌｏ
ｔ）・イムノスクリーニング・キットはＰｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃｈから講入した。制限酵素はＮｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから講入した。牛腸アルカ
リ・ホスファターゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及
びＳｌヌクレアーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍから購入した。ｄＮＴＰはＰ．Ｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。５′−〔α−３５Ｓ〕
−チオ−ｄＡＴＰ（６００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）はＡｍｅ
ｒｓｈａｍから購入した。配列決定用キット（Ｓｅｑｕ
ｅｎａｓｅ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。Ｃｈａｎｇリバー細胞
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１３）及びＨｅｐＧ２ヘパトーマ細
胞（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションから得た。ＳＫ−ＨＥＰ−
１ヘパトーマ細胞は、Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈのＧ．Ｔｒｅｍｐｅによって１９７１年に肝
アデノカルシノーマから誘導されたものであり、現在で
広く容易に入手可能である。
ｔｅｃｈから得た。プロトブロット（Ｐｒｏｔｏｂｌｏ
ｔ）・イムノスクリーニング・キットはＰｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃｈから講入した。制限酵素はＮｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから講入した。牛腸アルカ
リ・ホスファターゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及
びＳｌヌクレアーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍから購入した。ｄＮＴＰはＰ．Ｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。５′−〔α−３５Ｓ〕
−チオ−ｄＡＴＰ（６００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）はＡｍｅ
ｒｓｈａｍから購入した。配列決定用キット（Ｓｅｑｕ
ｅｎａｓｅ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。Ｃｈａｎｇリバー細胞
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１３）及びＨｅｐＧ２ヘパトーマ細
胞（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションから得た。ＳＫ−ＨＥＰ−
１ヘパトーマ細胞は、Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈのＧ．Ｔｒｅｍｐｅによって１９７１年に肝
アデノカルシノーマから誘導されたものであり、現在で
広く容易に入手可能である。
【００２４】１２５Ｉ−第Ｘａ因子は、ヨード源を用い
て放射標識することにより調製した。この比活性は２０
００ｄｐｍ／ｎｇであった。放射活性の９７％以上は１
０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈澱可能であっ
た。ヨード化蛋白は、ＳｅｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＸａ
（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ製）に対
してその触媒活性を８０％以上保持していた。
て放射標識することにより調製した。この比活性は２０
００ｄｐｍ／ｎｇであった。放射活性の９７％以上は１
０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈澱可能であっ
た。ヨード化蛋白は、ＳｅｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＸａ
（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ製）に対
してその触媒活性を８０％以上保持していた。
【００２５】抗−ＴＦＩ−ＩｇセファロースＴＭ４Ｂカ
ラムは以下のようにして調製した。即ち、成熟ＴＦＩの
アミノ酸３−２５の配列に相当する配列を含むペプチド
（ＴＦＩ−ペプチド）を、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの固相ペ
プチド合成システムを用いて合成した。ＴＦＩ−ペプチ
ド（５ｍｇ）を、グルタルアルデヒドによりキーホール
（Ｋｅｙｈｏｌｅ）・リンペット（ｌｙｍｐｅｔ）・ヘ
モシアニン１０ｍｇに結合させてコンジュゲートを調製
した。２匹のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄホワイト・ラビッ
トに、フロイント・完全・アジュバンド１ｍｌと、上記
コンジュゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド２００μｇ）
を含むホモジェネートを皮内注射して、それぞれ免疫化
した。１ケ月後に、フロイント・不完全・アジュバント
１ｍｌとコンジュゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド１０
０μｇ）を含むホモジェネートで、２匹のラビットをそ
れぞれブースターした。３ケ月の間、１週間毎に抗血清
を採取し、１ケ月毎にブースター注射を行なった。ＴＦ
Ｉ−ペプチドに対する特異的抗体を単離するために、抗
血清をＴＦＩ−ペプチドセファロース４Ｂカラムを用い
たクロマトグラフィーに付した。カラムを、１０倍量の
ＰＢＳ（０．４ＭＮａｃ１−０．１Ｍベンズアミジン−
１％トリトンＴＭＸ−１００）及びトリトンＸ−１００
を含まない同様の溶液で洗った。０．１Ｍグリシン／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ２．２で抗体を溶出させ、直ちに１／１０倍
量の１Ｍトリス−ＯＨを加えて中和し、次いで食塩水に
対して透析した。単離された抗体を、シアノゲン・ブロ
マイドで活性化させたセファロース４Ｂに製造業者（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）の指針に従って結合させ、これを細
胞培養培地からのＴＦＩの単離に用いた。
ラムは以下のようにして調製した。即ち、成熟ＴＦＩの
アミノ酸３−２５の配列に相当する配列を含むペプチド
（ＴＦＩ−ペプチド）を、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの固相ペ
プチド合成システムを用いて合成した。ＴＦＩ−ペプチ
ド（５ｍｇ）を、グルタルアルデヒドによりキーホール
（Ｋｅｙｈｏｌｅ）・リンペット（ｌｙｍｐｅｔ）・ヘ
モシアニン１０ｍｇに結合させてコンジュゲートを調製
した。２匹のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄホワイト・ラビッ
トに、フロイント・完全・アジュバンド１ｍｌと、上記
コンジュゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド２００μｇ）
を含むホモジェネートを皮内注射して、それぞれ免疫化
した。１ケ月後に、フロイント・不完全・アジュバント
１ｍｌとコンジュゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド１０
０μｇ）を含むホモジェネートで、２匹のラビットをそ
れぞれブースターした。３ケ月の間、１週間毎に抗血清
を採取し、１ケ月毎にブースター注射を行なった。ＴＦ
Ｉ−ペプチドに対する特異的抗体を単離するために、抗
血清をＴＦＩ−ペプチドセファロース４Ｂカラムを用い
たクロマトグラフィーに付した。カラムを、１０倍量の
ＰＢＳ（０．４ＭＮａｃ１−０．１Ｍベンズアミジン−
１％トリトンＴＭＸ−１００）及びトリトンＸ−１００
を含まない同様の溶液で洗った。０．１Ｍグリシン／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ２．２で抗体を溶出させ、直ちに１／１０倍
量の１Ｍトリス−ＯＨを加えて中和し、次いで食塩水に
対して透析した。単離された抗体を、シアノゲン・ブロ
マイドで活性化させたセファロース４Ｂに製造業者（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）の指針に従って結合させ、これを細
胞培養培地からのＴＦＩの単離に用いた。
【００２６】Ｃｈａｎｇリバー細胞を、ＢｒｏｚｅとＭ
ｉｌｅｔｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８４，１８８６〜１８９０（１９８７）に記
載された方法に従って培養した。ならし培地を、抗−Ｔ
ＦＩ−Ｉｇセファロース４Ｂカラムを用いたクロマトグ
ラフィーに付した。次いでカラムを、１０倍量のＰＢＳ
−１％トリトンＸ−１００とＰＢＳで洗った。結合した
ＴＦＩを０．１Ｍグリシン／ＨＣ１、ｐＨ２．２で溶出
した。イムノ・アフィニティーにより単離したＴＦＩを
更に分離用ナトリウム・ドデシルスルフェート・ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Ｓａｖａｎｔ ａｐｐａｒ
ａｔｕｓ）により精製した。最終取得物のアミノ酸を分
析した所、米国同時係属出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．７７，３６
６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）に記載さ
れたＨｅＰＧ２細胞から単離したＴＦＩと同様のＮ末端
アミノ酸配列を有していた。単離したＣｈａｎｇリバー
ＴＦＩを用いて、上記したと同じ免疫化プロトコールに
よりラビットを免疫化した。得られた抗血清は、２重免
疫拡散法テストで約１００μｇ／ｍｌの力価を示した。
この抗血清を用いてλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーの
イムノ・スクリーニングを行なった。
ｉｌｅｔｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８４，１８８６〜１８９０（１９８７）に記
載された方法に従って培養した。ならし培地を、抗−Ｔ
ＦＩ−Ｉｇセファロース４Ｂカラムを用いたクロマトグ
ラフィーに付した。次いでカラムを、１０倍量のＰＢＳ
−１％トリトンＸ−１００とＰＢＳで洗った。結合した
ＴＦＩを０．１Ｍグリシン／ＨＣ１、ｐＨ２．２で溶出
した。イムノ・アフィニティーにより単離したＴＦＩを
更に分離用ナトリウム・ドデシルスルフェート・ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Ｓａｖａｎｔ ａｐｐａｒ
ａｔｕｓ）により精製した。最終取得物のアミノ酸を分
析した所、米国同時係属出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．７７，３６
６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）に記載さ
れたＨｅＰＧ２細胞から単離したＴＦＩと同様のＮ末端
アミノ酸配列を有していた。単離したＣｈａｎｇリバー
ＴＦＩを用いて、上記したと同じ免疫化プロトコールに
よりラビットを免疫化した。得られた抗血清は、２重免
疫拡散法テストで約１００μｇ／ｍｌの力価を示した。
この抗血清を用いてλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーの
イムノ・スクリーニングを行なった。
【００２７】方法 ｃＤＮＡクローンの単離 抗体を用いた胎盤及び胎児肝ｃＤＮＡのスクリーニング
法、プラーク精製法及びλ−ファージ溶解物とＤＮＡの
調製法はＷｕｎとＫｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳＬＥＴ
Ｔ．１，１１〜１６（１９８７）に記載されている。抗
血清にあらかじめＢＮＮ９７λｇｔ１１溶解物を吸着さ
せ、ライブラリーのスクリーニング用に１／５００に希
釈した。
法、プラーク精製法及びλ−ファージ溶解物とＤＮＡの
調製法はＷｕｎとＫｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳＬＥＴ
Ｔ．１，１１〜１６（１９８７）に記載されている。抗
血清にあらかじめＢＮＮ９７λｇｔ１１溶解物を吸着さ
せ、ライブラリーのスクリーニング用に１／５００に希
釈した。
【００２８】第Ｘａ因子結合活性のスクリーニング イソプロピル−β−チオガラクトシドによってイムノ・
ポジティブλ−ファージ溶解物あるいはコントロールλ
ｇｔ１１から誘導される組換え蛋白について、その第Ｘ
ａ因子結合活性をスクリーニングした。λ−ファージ溶
解物（０．１ｍｌ）は、ドットーブロット装置（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）を用いてニトロセルロースペーパーで濾過し
た。次いでニトロセルロースペーパーを、５ｍｇ／ｍｌ
牛血清アルブミン及び２．５ｍｇ／ｍｌ牛ガンマグロブ
リンを含むリン酸緩衝化食塩水に浸し、室温で１時間激
しく撹拌した。次いで、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンを添
加した同様の溶液に更に１２５Ｉ−第Ｘａ因子（１．０
×１０６ｃｍｐ／ｍｌ）を溶解した溶液で置換し、更に
１時間激しく撹拌した。次いでニトロセルロースペーパ
ーを、０．０５％ＴｗｅｅｎＴＭ２０を含むリン酸緩衝
化食塩水で洗った。洗浄緩衝液を５分毎に４回交換し
た。次いでニトロセルロースペーパーを空気中で乾燥
し、Ｋｏｄａｋ ＸＲ５ｎフィルムを用いてオートラジ
オグラフィー用に調製した。フィルムを１週間さらした
後に現像した。
ポジティブλ−ファージ溶解物あるいはコントロールλ
ｇｔ１１から誘導される組換え蛋白について、その第Ｘ
ａ因子結合活性をスクリーニングした。λ−ファージ溶
解物（０．１ｍｌ）は、ドットーブロット装置（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）を用いてニトロセルロースペーパーで濾過し
た。次いでニトロセルロースペーパーを、５ｍｇ／ｍｌ
牛血清アルブミン及び２．５ｍｇ／ｍｌ牛ガンマグロブ
リンを含むリン酸緩衝化食塩水に浸し、室温で１時間激
しく撹拌した。次いで、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンを添
加した同様の溶液に更に１２５Ｉ−第Ｘａ因子（１．０
×１０６ｃｍｐ／ｍｌ）を溶解した溶液で置換し、更に
１時間激しく撹拌した。次いでニトロセルロースペーパ
ーを、０．０５％ＴｗｅｅｎＴＭ２０を含むリン酸緩衝
化食塩水で洗った。洗浄緩衝液を５分毎に４回交換し
た。次いでニトロセルロースペーパーを空気中で乾燥
し、Ｋｏｄａｋ ＸＲ５ｎフィルムを用いてオートラジ
オグラフィー用に調製した。フィルムを１週間さらした
後に現像した。
【００２９】ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの調製及びノーザン・
ブロッティング ＬｉｚａｒｄｉとＥｎｇｅｌｂｅｒｇのナトリウム・パ
ークロレート抽出法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９
８，１１６〜１２２，（１９７９）〕により、培養した
ｃｈａｎｇリバー細胞、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞及び
ＳＫ−ＨＥＰ−ｌヘパトーマ細胞から全ＲＮＡを調製し
た。製造業者の指針に従い、オリゴ（ｄＴ）−セルロー
ス（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，タイプ７７Ｆ）
へのバッチ吸着によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。
ノーザン・ブロット分析用に、それぞれのポリ（Ａ）＋
ＲＮＡ１０μｇをグリオキサールで処理し〔Ｔｈｏｍａ
ｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，２５５
〜２６６（１９８３）〕、１０ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０を含む緩衝液でアガロースゲル電気泳動に付
した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙのＲＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）を分子量
マーカーとして用いた。ＲＮＡをニトロセルロースペー
パー上にブロットし、次いで８０℃で２時間焼いた。λ
Ｐ９クローンのインサートＤＮＡを、ニックトランスレ
ーションにより３２Ｐで放射標識化し、プローブとして
用いた〔Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｄｅ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）〕。５０％ホル
ムアミド、５Ｘ ＳＳＣ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０、２５０μｇ／ｍｌ変性サケスペルマＤＮＡ
及び１Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ溶液を含む溶液５ｍｌ中のプ
ローブ（５×１０６ｃｐｍ）で４２℃で１６時間ハイブ
リダイズさせた。フィルターを、０．１％ナトリウムド
デシルスルフェート（ＳＤＳ）、２Ｘ ＳＳＳで室温で
３回、それぞれ５分間洗った。次いでニトロセルロース
ペーパーを空気中で乾燥し、Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ−５フ
ィルム及び増感板を用いて−７０℃で３日間オートラジ
オグラフィーに付した。
ブロッティング ＬｉｚａｒｄｉとＥｎｇｅｌｂｅｒｇのナトリウム・パ
ークロレート抽出法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９
８，１１６〜１２２，（１９７９）〕により、培養した
ｃｈａｎｇリバー細胞、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞及び
ＳＫ−ＨＥＰ−ｌヘパトーマ細胞から全ＲＮＡを調製し
た。製造業者の指針に従い、オリゴ（ｄＴ）−セルロー
ス（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，タイプ７７Ｆ）
へのバッチ吸着によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。
ノーザン・ブロット分析用に、それぞれのポリ（Ａ）＋
ＲＮＡ１０μｇをグリオキサールで処理し〔Ｔｈｏｍａ
ｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，２５５
〜２６６（１９８３）〕、１０ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０を含む緩衝液でアガロースゲル電気泳動に付
した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙのＲＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）を分子量
マーカーとして用いた。ＲＮＡをニトロセルロースペー
パー上にブロットし、次いで８０℃で２時間焼いた。λ
Ｐ９クローンのインサートＤＮＡを、ニックトランスレ
ーションにより３２Ｐで放射標識化し、プローブとして
用いた〔Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｄｅ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）〕。５０％ホル
ムアミド、５Ｘ ＳＳＣ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０、２５０μｇ／ｍｌ変性サケスペルマＤＮＡ
及び１Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ溶液を含む溶液５ｍｌ中のプ
ローブ（５×１０６ｃｐｍ）で４２℃で１６時間ハイブ
リダイズさせた。フィルターを、０．１％ナトリウムド
デシルスルフェート（ＳＤＳ）、２Ｘ ＳＳＳで室温で
３回、それぞれ５分間洗った。次いでニトロセルロース
ペーパーを空気中で乾燥し、Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ−５フ
ィルム及び増感板を用いて−７０℃で３日間オートラジ
オグラフィーに付した。
【００３０】他の組操えＤＮＡ法 クローン化λｇｔ１１ＤＮＡの調製、ｐＵＣ１９プラス
ミド及びＭ１３ｍｐ１８ベクターでのサブクローニン
グ、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた消化による欠
失、及びジデオキ法によるＤＮＡ配列決定〔Ｓａｎｇｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８３，６７７６〜６７８０（１９７７）〕は、Ｗｕｎと
Ｋｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１，１１−１
６（１９８７）に記載された方法に従って実施した。Ｌ
ｉｐｍａｍとＰｅａｒｓｏｎによって書かれたプログラ
ムＦＡＳＴＰ〔ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５〜１
４４１（１９８５）〕を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎの配列データバンク（レリース１３，１９８
７年６月）から相同性を示す蛋白のファミリーを同定
し、該ファミリー内で配列のアラインメントを行なっ
た。
ミド及びＭ１３ｍｐ１８ベクターでのサブクローニン
グ、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた消化による欠
失、及びジデオキ法によるＤＮＡ配列決定〔Ｓａｎｇｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８３，６７７６〜６７８０（１９７７）〕は、Ｗｕｎと
Ｋｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１，１１−１
６（１９８７）に記載された方法に従って実施した。Ｌ
ｉｐｍａｍとＰｅａｒｓｏｎによって書かれたプログラ
ムＦＡＳＴＰ〔ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５〜１
４４１（１９８５）〕を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎの配列データバンク（レリース１３，１９８
７年６月）から相同性を示す蛋白のファミリーを同定
し、該ファミリー内で配列のアラインメントを行なっ
た。
【００３１】結果 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング 多数のセルラインについて、そのならし培地中にＴＦＩ
が存在するか否かをスクリーニングした。いくつかの肝
由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、ＨｅｐＧ２ヘ
パトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマが培地中にＴ
ＦＩを分泌することが見出された。初めに、ＴＦＩに対
する抗血清を用いてヒト胎児肝λｇｔ１１ｃＤＮＡライ
ブラリー（１０６プラーク・フォーミング・ユニット）
をスクリーニングし、１５個の免疫学的にポジティブな
クローンが得られた。次いで同様の方法により胎盤λｇ
ｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１
０６プラーク・フォーミング・ユニットのうち１０個の
免疫学的にポジティブなクローンが得られた。これらの
クローンをプラーク精製し、精製クローンの溶解物につ
いてＴＦＩの機能活性をテストした。イソプロピルチオ
ガラクトシドで誘導したファージの溶解物をニトロセル
ロースペーパーに吸着せしめ、１２５Ｉ−第Ｘａ因子結
合活性をスクリーニングした。上記の免疫学的にポジテ
ィブなクローンのいくつかは、ニトロセルロースペーパ
ー上の１２５Ｉ−第Ｘａ因子と結合する能力を示したこ
とが、図１により証明されている。免疫学的にポジティ
ブな胎児肝クローン１５個のうち３個、及び免疫学的に
ポジティブな胎盤クローン１０個のうち４個のクローン
が１２５Ｉ−第Ｘａ因子結合活性を示した。これらの免
疫学的に且つ機能的にポジティブなクローンをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、インサート配列のサイズをゲル電気泳動に
より調べた。胎盤ライブラリー（λＰ９）から得た１つ
のクローンは約１．４ｋｂのインサート配列を有してお
り、他のすべてのクローンは約１．０ｋｂのインサート
配列を有していた。部分的ＤＮＡ配列決定により、１．
０ｋｂクローンはより長い１．４ｋｂ胎盤クローンの１
部分の配列と同じ配列を有していることが判った。従っ
て、完全なＤＮＡ配列決定を行なうためにλＰ９を選択
した。
ング 多数のセルラインについて、そのならし培地中にＴＦＩ
が存在するか否かをスクリーニングした。いくつかの肝
由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、ＨｅｐＧ２ヘ
パトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマが培地中にＴ
ＦＩを分泌することが見出された。初めに、ＴＦＩに対
する抗血清を用いてヒト胎児肝λｇｔ１１ｃＤＮＡライ
ブラリー（１０６プラーク・フォーミング・ユニット）
をスクリーニングし、１５個の免疫学的にポジティブな
クローンが得られた。次いで同様の方法により胎盤λｇ
ｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１
０６プラーク・フォーミング・ユニットのうち１０個の
免疫学的にポジティブなクローンが得られた。これらの
クローンをプラーク精製し、精製クローンの溶解物につ
いてＴＦＩの機能活性をテストした。イソプロピルチオ
ガラクトシドで誘導したファージの溶解物をニトロセル
ロースペーパーに吸着せしめ、１２５Ｉ−第Ｘａ因子結
合活性をスクリーニングした。上記の免疫学的にポジテ
ィブなクローンのいくつかは、ニトロセルロースペーパ
ー上の１２５Ｉ−第Ｘａ因子と結合する能力を示したこ
とが、図１により証明されている。免疫学的にポジティ
ブな胎児肝クローン１５個のうち３個、及び免疫学的に
ポジティブな胎盤クローン１０個のうち４個のクローン
が１２５Ｉ−第Ｘａ因子結合活性を示した。これらの免
疫学的に且つ機能的にポジティブなクローンをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、インサート配列のサイズをゲル電気泳動に
より調べた。胎盤ライブラリー（λＰ９）から得た１つ
のクローンは約１．４ｋｂのインサート配列を有してお
り、他のすべてのクローンは約１．０ｋｂのインサート
配列を有していた。部分的ＤＮＡ配列決定により、１．
０ｋｂクローンはより長い１．４ｋｂ胎盤クローンの１
部分の配列と同じ配列を有していることが判った。従っ
て、完全なＤＮＡ配列決定を行なうためにλＰ９を選択
した。
【００３２】ＴＦＩ ｃＤＮＡ単離物のヌクレオチド配
列及びその予想蛋白配列 λＰ９クローンについて、制限酵素地図の作成、Ｍ１３
サブクローニング及び図２に示した技法を用いた配列決
定を実施した。エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失法〔Ｈｅ
ｎｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｅ２８，３５１〜３５９（１９８
４）〕により、２本のストランドの両者について全配列
を決定し、１４３２個の塩基からなることが見出され
た。その配列は図３および４に示した通りである。該配
列には、１３３塩基の５′非コード領域、９１２ヌクレ
オチドのオープン・リーディング・フレーム及び３８７
ヌクレオチドの３′非コード領域が含まれている。最初
のＡＴＧはＴＡＧＡＴＧＡ配列中のヌクレオチド１３４
にあり、その直ぐ後のＡＣＡＡＴＧＡ配列中のヌクレオ
チド１４６に第２のＡＴＧがある。真核細胞のリボゾー
ムによってイニシエートされるためのコンセンサス配列
として提案された配列、ＡＣＣＡＴＧＧ〔Ｋｏｚａｋ，
Ｃｅ１１，４４，２８３〜２９２（１９８２）〕とは、
上記の配列は異なるが、これらはイニシエーション配列
と考えられる。成熟蛋白のＮ末端に相当する配列の前に
２８個のアミノ酸配列がある。これら２８個のアミノ酸
からなる疎水性セグメントの組成及び長さは、シグナル
ペプチドに典型的なものである〔Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎ
ｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３，１７〜２１
（１９８３）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１８４，９９〜
１０５（１９８５）〕。シグナルペプチドはＡｌａ２８
−Ａｓｐ２９で開裂し、成熟蛋白を与えると考えられ
る。成熟ＴＦＩとして予想されるアミノ酸配列は、１８
個のシスティン残基及び７個のメチオニンを含む２７６
個のアミノ酸からなる。成熟ＴＦＩの推定蛋白配列に基
いて計算される分子量３１，９５０ダルトンは、単離し
て得た蛋白についてナトリウムドデシルスルフェートポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で調べた分子量３７−４
０ｋＤａよりもいく分小さい。この分子量の相違は、天
然蛋白でのグリコシル化の移動性を反映したものと考え
られる。成熟蛋白に相当する推定蛋白配列は、Ａｓｎ−
Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒの構成を有する３ケのＮ−結合グリ
コシル化部位（アミノ酸の位置１４５，１９５及び２５
６）を有している。精製した全長ＴＦＩ及び加水分解さ
れた２つの単離体のアミノ酸分析の結果は、ｃＤＮＡ配
列から推定される蛋白配列（図３および４の下線を引い
た部分）と正確にマッチする。このことは、単離したｃ
ＤＮＡクローンはＴＦＩをコードしていることを示して
いる。３′非コード領域はＡ＋Ｔを豊富に含んでいる
（７０％Ａ＋Ｔ）。このクローンには、コンセンサス・
ポリアデニル化シグナル、ＡＡＴＡＡＡ〔Ｐｒｏｕｄｆ
ｏｏｔとＢｒｏｗｎｌｅｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２５２，３
５９〜３６２（１９８１）〕も、ポリＡテイルも見出さ
れなかった。これは、ライブラリー構築の間に３′末端
部分の１部分が失なわれたためと考えられる。
列及びその予想蛋白配列 λＰ９クローンについて、制限酵素地図の作成、Ｍ１３
サブクローニング及び図２に示した技法を用いた配列決
定を実施した。エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失法〔Ｈｅ
ｎｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｅ２８，３５１〜３５９（１９８
４）〕により、２本のストランドの両者について全配列
を決定し、１４３２個の塩基からなることが見出され
た。その配列は図３および４に示した通りである。該配
列には、１３３塩基の５′非コード領域、９１２ヌクレ
オチドのオープン・リーディング・フレーム及び３８７
ヌクレオチドの３′非コード領域が含まれている。最初
のＡＴＧはＴＡＧＡＴＧＡ配列中のヌクレオチド１３４
にあり、その直ぐ後のＡＣＡＡＴＧＡ配列中のヌクレオ
チド１４６に第２のＡＴＧがある。真核細胞のリボゾー
ムによってイニシエートされるためのコンセンサス配列
として提案された配列、ＡＣＣＡＴＧＧ〔Ｋｏｚａｋ，
Ｃｅ１１，４４，２８３〜２９２（１９８２）〕とは、
上記の配列は異なるが、これらはイニシエーション配列
と考えられる。成熟蛋白のＮ末端に相当する配列の前に
２８個のアミノ酸配列がある。これら２８個のアミノ酸
からなる疎水性セグメントの組成及び長さは、シグナル
ペプチドに典型的なものである〔Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎ
ｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３，１７〜２１
（１９８３）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１８４，９９〜
１０５（１９８５）〕。シグナルペプチドはＡｌａ２８
−Ａｓｐ２９で開裂し、成熟蛋白を与えると考えられ
る。成熟ＴＦＩとして予想されるアミノ酸配列は、１８
個のシスティン残基及び７個のメチオニンを含む２７６
個のアミノ酸からなる。成熟ＴＦＩの推定蛋白配列に基
いて計算される分子量３１，９５０ダルトンは、単離し
て得た蛋白についてナトリウムドデシルスルフェートポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で調べた分子量３７−４
０ｋＤａよりもいく分小さい。この分子量の相違は、天
然蛋白でのグリコシル化の移動性を反映したものと考え
られる。成熟蛋白に相当する推定蛋白配列は、Ａｓｎ−
Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒの構成を有する３ケのＮ−結合グリ
コシル化部位（アミノ酸の位置１４５，１９５及び２５
６）を有している。精製した全長ＴＦＩ及び加水分解さ
れた２つの単離体のアミノ酸分析の結果は、ｃＤＮＡ配
列から推定される蛋白配列（図３および４の下線を引い
た部分）と正確にマッチする。このことは、単離したｃ
ＤＮＡクローンはＴＦＩをコードしていることを示して
いる。３′非コード領域はＡ＋Ｔを豊富に含んでいる
（７０％Ａ＋Ｔ）。このクローンには、コンセンサス・
ポリアデニル化シグナル、ＡＡＴＡＡＡ〔Ｐｒｏｕｄｆ
ｏｏｔとＢｒｏｗｎｌｅｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２５２，３
５９〜３６２（１９８１）〕も、ポリＡテイルも見出さ
れなかった。これは、ライブラリー構築の間に３′末端
部分の１部分が失なわれたためと考えられる。
【００３３】電荷分布、疎水性／親水性及び内部相同性 ＴＦＩの翻訳されたアミノ酸配列には、２７リシン、１
７アルギニン、１１アスパラギン酸及び２５グルタミン
酸が含まれている。蛋白にそった電荷分布は図５に示し
たようにかなり高低のあるものである。シグナルペプチ
ド領域には、２６個の中性残基とともに２個のプラスに
荷電したリシンが含まれていた。成熟蛋白のアミノ末端
領域には、高度にマイナスに荷電した配列が含まれてい
た。最初の７個の残基のうち６個はアスパラギン酸ある
いはグルタミン酸であり、この後に更に高度にマイナス
に荷電した２個のアミノ酸のダウンストリームがあり、
その後にプラスに荷電したリシン残基がある。中心部分
は一般的にマイナスに荷電している。カルボキシ末端に
は高度にプラスに荷電したセグメントがある。ＴＦＩの
アミノ酸２６５〜２９３には、６−共役アルギニン＋リ
シン残基を含むプラスに荷電した１４個のアミノ酸があ
る。
７アルギニン、１１アスパラギン酸及び２５グルタミン
酸が含まれている。蛋白にそった電荷分布は図５に示し
たようにかなり高低のあるものである。シグナルペプチ
ド領域には、２６個の中性残基とともに２個のプラスに
荷電したリシンが含まれていた。成熟蛋白のアミノ末端
領域には、高度にマイナスに荷電した配列が含まれてい
た。最初の７個の残基のうち６個はアスパラギン酸ある
いはグルタミン酸であり、この後に更に高度にマイナス
に荷電した２個のアミノ酸のダウンストリームがあり、
その後にプラスに荷電したリシン残基がある。中心部分
は一般的にマイナスに荷電している。カルボキシ末端に
は高度にプラスに荷電したセグメントがある。ＴＦＩの
アミノ酸２６５〜２９３には、６−共役アルギニン＋リ
シン残基を含むプラスに荷電した１４個のアミノ酸があ
る。
【００３４】ＴＦＩ蛋白の予想疎水性／親水性プロファ
イルは図６に示した通りである。シグナルペプチドに
は、予想されたように高度に疎水性の領域が含まれてい
る。残りの部分はむしろ親水性である。ＴＦＩの翻訳さ
れたアミノ酸配列には、いくつかの区別し得るドメイン
が含まれている。高度にマイナスに荷電したＮ末端ドメ
イン及び高度にプラスに荷電したＣ末端ドメインに加え
て、Ｋｕｎｉｔｚ型抑制因子の典型的配列（下記参照）
を有する３個の相同ドメインからなる中心部分がある。
イルは図６に示した通りである。シグナルペプチドに
は、予想されたように高度に疎水性の領域が含まれてい
る。残りの部分はむしろ親水性である。ＴＦＩの翻訳さ
れたアミノ酸配列には、いくつかの区別し得るドメイン
が含まれている。高度にマイナスに荷電したＮ末端ドメ
イン及び高度にプラスに荷電したＣ末端ドメインに加え
て、Ｋｕｎｉｔｚ型抑制因子の典型的配列（下記参照）
を有する３個の相同ドメインからなる中心部分がある。
【００３５】他の蛋白との相同性 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの配列データベースを
調べた所、ＴＦＩのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインと
は、他の公知蛋白と有意な相同性を有していないことが
見出された。しかしながら、３個の内部相同ドメイン
は、牛膵臓塩基性プロテアーゼ抑制因子（アプロチニ
ン）、毒塩基性プロテアーゼ抑制因子、インター−α−
トリプシン抑制因子（図７）などの他の塩基性プロテア
ーゼ抑制因子の配列とそれぞれ相同性を示した。これら
すべての抑制因子にはジスルフィド結合溝造が高度に保
持されており、これは注目すべき事実である。これらの
相同性から明らかなように、ＴＦＩは塩基性プロテアー
ゼ抑制因子遺伝子スーパーファミリーに属する。
ａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの配列データベースを
調べた所、ＴＦＩのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインと
は、他の公知蛋白と有意な相同性を有していないことが
見出された。しかしながら、３個の内部相同ドメイン
は、牛膵臓塩基性プロテアーゼ抑制因子（アプロチニ
ン）、毒塩基性プロテアーゼ抑制因子、インター−α−
トリプシン抑制因子（図７）などの他の塩基性プロテア
ーゼ抑制因子の配列とそれぞれ相同性を示した。これら
すべての抑制因子にはジスルフィド結合溝造が高度に保
持されており、これは注目すべき事実である。これらの
相同性から明らかなように、ＴＦＩは塩基性プロテアー
ゼ抑制因子遺伝子スーパーファミリーに属する。
【００３６】ノーザン・ブロッテング ＴＦＩ産生肝由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、
ＨｅｐＧ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ
細胞からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。変性アガロー
スゲル電気泳動によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶解し、ニ
トロセルロースペーパー上にブロットし、３２Ｐ−標識
化ＴＦＩ ｃＤＮＡ（λＰ９）をプローブとして用いて
調べた。図８に示したように、２つの主要なハイブリダ
イゼーションバンドが観察された。これらはテストした
３つの全てのセルラインに見られる１．４ｋｂ ｍＲＮ
Ａ及び４．４ｋｂ ｍＲＮＡに対応するものである。検
出し得る量のＴＦＩを産生しない他のセルラィンについ
てテストしたが、プローブとのハイブリダイゼーション
は観察されなかった（データを示していない）。本明細
書の記載から、当業者にとっては本発明の思想及び範囲
内にある他の各種の例が自明であろう。これらの例の全
ては本明細書のクレームの範囲内のものである。
ＨｅｐＧ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ
細胞からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。変性アガロー
スゲル電気泳動によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶解し、ニ
トロセルロースペーパー上にブロットし、３２Ｐ−標識
化ＴＦＩ ｃＤＮＡ（λＰ９）をプローブとして用いて
調べた。図８に示したように、２つの主要なハイブリダ
イゼーションバンドが観察された。これらはテストした
３つの全てのセルラインに見られる１．４ｋｂ ｍＲＮ
Ａ及び４．４ｋｂ ｍＲＮＡに対応するものである。検
出し得る量のＴＦＩを産生しない他のセルラィンについ
てテストしたが、プローブとのハイブリダイゼーション
は観察されなかった（データを示していない）。本明細
書の記載から、当業者にとっては本発明の思想及び範囲
内にある他の各種の例が自明であろう。これらの例の全
ては本明細書のクレームの範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】１２５Ｉ−第Ｘａ因子を用いたλｇｔ１１クロ
ーンのスクリ−ニングを示した写真である。
ーンのスクリ−ニングを示した写真である。
【図２】部分的制限酵素地図及びλＰ９のインサート配
列の配列決定に用いた技法を示している。
列の配列決定に用いた技法を示している。
【図３】ヒトＴＦＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び
翻訳されたアミノ酸配列を示している。
翻訳されたアミノ酸配列を示している。
【図４】ヒトＴＦＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およ
び翻訳されたアミノ酸配列。
び翻訳されたアミノ酸配列。
【図５】ＴＦＩのアミノ酸配列における電荷分布を示す
グラフである。
グラフである。
【図６】ＴＦＩの疎水性プロファイルを示すグラフであ
る。
る。
【図７】ＴＦＩの塩基性プロテアーゼ抑制因子ドメイン
と他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメント
を示す。
と他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメント
を示す。
【図８】３個の肝由来セルラインから得たＲＮＡのノー
ザン・ブロット分析を示す写真である。
ザン・ブロット分析を示す写真である。
フロントページの続き (72)発明者 ジョージ ジョン ブロズ，ジュニア アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，ウエストポイント レーン 15 (72)発明者 クニコ クサノ クレッツマー アメリカ合衆国ミズリー州 エウレカ，パ ーシモン レーン 33 (72)発明者 ツェ − チェイン ウン アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，ハントリィ ハイツ 613
Claims (2)
- 【請求項１】 図３および図４で示されるアミノ酸配列
を有するヒト組織因子抑制因子。 - 【請求項２】 グリコシル化されている請求項１記載の
ヒト組織因子抑制因子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US123753 | 1987-11-23 | ||
| US07/123,753 US4966852A (en) | 1987-07-23 | 1987-11-23 | DNA clone of human tissue factor inhibitor |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63183423A Division JP2836823B2 (ja) | 1987-11-23 | 1988-07-22 | ヒト組織因子抑制因子のｄｎａクローン |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001226122A Division JP4025035B2 (ja) | 1987-11-23 | 2001-07-26 | 組織因子抑制因子に対する抗体 |
| JP2004120081A Division JP2004201696A (ja) | 1987-11-23 | 2004-04-15 | ヒト組織因子抑制因子 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1175875A true JPH1175875A (ja) | 1999-03-23 |
| JP3565714B2 JP3565714B2 (ja) | 2004-09-15 |
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ID=22410671
Family Applications (5)
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|---|---|---|---|
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| JP18131998A Expired - Lifetime JP3565714B2 (ja) | 1987-11-23 | 1998-05-25 | ヒト組織因子抑制因子 |
| JP2001226122A Expired - Lifetime JP4025035B2 (ja) | 1987-11-23 | 2001-07-26 | 組織因子抑制因子に対する抗体 |
| JP2004120081A Pending JP2004201696A (ja) | 1987-11-23 | 2004-04-15 | ヒト組織因子抑制因子 |
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|---|---|---|---|
| JP63183423A Expired - Lifetime JP2836823B2 (ja) | 1987-11-23 | 1988-07-22 | ヒト組織因子抑制因子のｄｎａクローン |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP2004120081A Pending JP2004201696A (ja) | 1987-11-23 | 2004-04-15 | ヒト組織因子抑制因子 |
| JP2005124415A Withdrawn JP2005306875A (ja) | 1987-11-23 | 2005-04-22 | 組織因子抑制因子に対する抗体 |
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| CA (1) | CA1341223C (ja) |
| DE (1) | DE3851511T2 (ja) |
| DK (1) | DK173536B1 (ja) |
| ES (1) | ES2063769T3 (ja) |
| FI (1) | FI93365C (ja) |
| IE (1) | IE65393B1 (ja) |
| IL (1) | IL87171A (ja) |
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| NZ (1) | NZ225535A (ja) |
| PT (1) | PT88076B (ja) |
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| US5378614A (en) * | 1989-08-18 | 1995-01-03 | Novo Nordisk A/S | Vector and method for making tissue factor pathway inhibitor (TFPI) analogues in yeast |
| DK408089D0 (da) * | 1989-08-18 | 1989-08-18 | Novo Nordisk As | Proteiner |
| ES2086521T3 (es) * | 1990-01-25 | 1996-07-01 | Univ Washington | Proteina hibrida laci-factor x. |
| PT98779B (pt) * | 1990-08-27 | 1999-06-30 | Monsanto Co | Processo para a preparacao de uma composicao anticoagulante contendo inibidor sulfatados e metodos para a sua utilizacao |
| DK261490D0 (da) * | 1990-10-31 | 1990-10-31 | Novo Nordisk As | New pharmaceutical compound |
| US5346991A (en) * | 1991-06-13 | 1994-09-13 | Genentech, Inc. | Tissue factor mutants useful for the treatment of myocardial infarction and coagulopathic disorders |
| US5276015A (en) * | 1992-03-18 | 1994-01-04 | Washington University | Method of inhibiting microvascular thrombosis |
| US6063764A (en) * | 1992-06-01 | 2000-05-16 | Washington University & Chiron Corp. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| US20030171292A1 (en) | 1992-06-01 | 2003-09-11 | Creasey Abla A. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| US5455338A (en) * | 1993-11-05 | 1995-10-03 | Zymogenetics, Inc. | DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto |
| US6057287A (en) | 1994-01-11 | 2000-05-02 | Dyax Corp. | Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof |
| HUP0501111A2 (en) | 2001-10-15 | 2007-12-28 | Chiron Corp | Treatment of severe pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor |
| DK1941867T3 (da) | 2002-06-07 | 2012-01-02 | Dyax Corp | Polypeptid med modificeret Kunitz domæne |
| US7153829B2 (en) | 2002-06-07 | 2006-12-26 | Dyax Corp. | Kallikrein-inhibitor therapies |
| US7235530B2 (en) | 2004-09-27 | 2007-06-26 | Dyax Corporation | Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof |
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| CN102348462B (zh) | 2008-12-19 | 2015-06-17 | 巴克斯特国际公司 | Tfpi抑制剂和使用方法 |
| WO2010080833A1 (en) | 2009-01-06 | 2010-07-15 | Dyax Corp. | Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors |
| CA3168591A1 (en) | 2010-01-06 | 2011-07-14 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Plasma kallikrein binding proteins |
| CN105566490A (zh) | 2010-03-19 | 2016-05-11 | 巴克斯特国际公司 | Tfpi抑制剂及使用方法 |
| KR102502293B1 (ko) | 2011-01-06 | 2023-02-21 | 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 | 혈장 칼리크레인 결합 단백질 |
| AR086924A1 (es) | 2011-06-15 | 2014-01-29 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-receptor de epo humano y los metodos para su utilizacion |
| AU2013235741C1 (en) | 2012-03-21 | 2017-12-21 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | TFPI inhibitors and methods of use |
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|---|---|---|---|---|
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