NO310466B1 - cDNA-sekvens som koder for modent humanvevsfaktorinhibitorprotein - Google Patents

Description

Den trinnvise koagulering som oppstår i pattedyrblod omfatter to forskjellige systemer; det såkalte indre system og det såkalte ytre system. Det sistnevnte system aktiveres ved eksponering av blod mot vevthromboplastin (faktor III) , heretter referert til som vevfaktor (TF). Vevfaktor er et lipoprotein som oppstår i plasmamembranen til mange celle-typer, og som hjernen og lungene er særlig rik på. Etter å

ha kommet i kontakt med TF, danner plasmafaktor VII eller dens aktiverte form, faktor VII , et kalsiumavhengig kompleks med TF, og aktiverer så faktor X til faktor X cl, og faktor IX til faktor IXa^, proteolytisk.

Tidligere undersøkelser vedrørende reguleringen av TF-initiert koagulering viste at inkubasjon av TF (i urene pre-parater av vevthromboplastin) med serum inhiberte dens aktivitet in vitro og forhindret dens dødelige virkning når den ble sprøytet inn i mus. Grundige undersøkelser av Hjort, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 9, Suppl. 27, 76-97 (1957), bekreftet og videreutviklet tidligere arbeide på dette område, og førte til den konklusjon at en inhibitorrest i serum gjenkjente faktor VII-TF-komplekset. I overensstemmelse med denne hypotese er de fakta at inhiberingen av TF som oppstår i plasma, krever tilstedeværelse av Ca 2+ (som også er nød-vendig for bindingen av faktor VII/VII til TF), og at inhibering kan forhindres og/eller reverseres ved chelatdannelse av divalente kationer med EDTA. Nyere undersøkelser har vist at ikke bare faktor VII a, men også katalytisk aktiv faktor X clog en ytterligere faktor er påkrevet for frembringelsen

av TF-inhibering i plasma eller serum. Se Broze og Miletich, Blood 69, 150-155 (1987), og Sanders et al., Ibid., 66, 204-212 (1985). Denne ytterligere faktor, her definert som vevfaktorinhibitor (TFI), og eventuelt som lipoproteinfor-bundet koagulasjonsinhibitor' (LACl), er til stede i barium-absorbert plasma og synes å være forbundet med lipoproteiner,

ettersom TFI funksjonell aktivitet segregerer med lipopro-teinreaksjonen som flyter opp når serum sentrifugeres ved en densitet på 1,21 g/cm<*>. Ifølge Broze og Miletich, supra, og Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84, 1886-1890 (1987), utskiller HepG2-celler (en human hepatomcellelinje) en inhibitorrest med de samme egenskaper som TFI som er til stede i plasma. ;I US patentsøknad nr. 77.366 er det beskrevet en renset vevfaktorinhibitor (TFI) som ble utskilt fra HepG2-celler. Den ble funnet å foreligge i to former, en TFI^, som migrerte ved ca. 37.000-40.000 dalton, og en TFI2, ved ca. 25.000-26.000 dalton, bestemt ved hjelp av natriumdodecylsulfatpoly-acrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE). En partiell N-termi-nal aminosyresekvens for TFI ble fastsatt til: ; hvor X-X ikke var blitt bestemt. ;Ifølge foreliggende oppfinnelse er det blitt utviklet ;en cDNA-sekvens som koder for modent himianvevsfaktorinibitorprotein, kjennetegnet ved at den har nukleotidsekvensen som vist i figur 3 i tegningene. ;Innledningsvis ble humane placenta- og fosterlever-\gtll-cDNA-samlingen gjennomsøkt med et polyklonalt antiserum fra kanin fremkalt mot en renset TFI. Immunologisk positive kloner ble videre undersøkt med hensyn på<1>25I-faktor X cL-bindende aktivitet. Det ble erholdt syv kloner som var immunologisk og funksjonelt aktive. Den lengste klon, placentautvunnet A.P9, var 1,4 kilobåser (kb) lang, mens de øvrige seks var 1,0 kb lange. Partiell DNA-sekvensering viste at 1,0 kb-klonene har sekvenser som er identiske med en del av den lengre 1,4 kb klon. Nukleotidsekvensanalyse viste at X<p>9 besto av en 1432 basepar (bp) lang cDNA-inn-føyning som omfatter et 5<1->ikke-kodende område av 13 3 bp, ;en åpen leseramme av 912 bp, et stoppkodon og et 3'-ikke-kodende område av 38 4 bp. ;cDNA-sekvenser koder for et 31.950 dalton protein av 275 aminosyrer som omfatter 18.cysteiner og 7 methioniner. Den translaterte aminosyresekvens viser at et signalpeptid av ca. 2 8 aminosyrer er forløper for det fullt ferdige TFI-protein. Det vil forståes at det "fullt ferdige" TFI defin-eres slik at det omfatter både TFI og methionyl-TFI i kraft av ATG translasjonskodonet i den her beskrevne \<p>9-klon. ;Det er tre potensielle N-bundne glycosyleringssteder ;i TFI-proteinet med sekvensen Asn-X-Ser/Thr, hvor X kan være hvilken som helst av de 20 vanlige aminosyrene, Disse stedene er i aminosyreposisjonene Asn 145, Asn 195 og Asn 256, når det første methionin etter det 5'-ikke-kodende område er betegnet aminosyreposisjon +1. ;Den translaterte TFI-aminosyresekvens oppviser flere områder som kan skjelnes fra hverandre, inkludert en sterkt negativt ladet N-ende, en sterkt positivt ladet carboxylende og en mellomliggende del bestående av 3 homologe områder med sekvenser som er typiske for enzyminhibitorer av Kunitz-type. Basert på en homologiundersøkelse synes TFI å være et medlem av den ledende genoverfamilie av proteaseinhibitorer. ;Den opprinnelige kilde for proteinmaterialet for utvikling av cDNA-klonen A.P9, var humant placentavev. Slikt vev er alminnelig tilgjengelig etter avlevering ved konven-sjonelle kirurgiske fremgangsmåter. Den Agtll (lac5 nin5 cl857 S100) som her er brukt, er en godt kjent og ålment tilgjengelig lambdafag-ekspresjonsvektor. Dens konstruksjon og restriksjonsendonukleasekart er beskrevet av Young og Davis, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 8J), 1194-1198 (1983). ;"Northern blot"-analyse viste at de følgende cellelinjer utvunnet fra lever: Chang-lever, HepG2-hepatom og SK-HEP-1-hepatom, alle inneholdt 2 hovedarter av mRNA (1,4 og 4,4 kb) som hybridiserte.med TFI-cDNA. ;Kloningen av cDNA for TFI og utvikling av dens hele proteinsekvens og strukturområder, slik det her er beskrevet, muliggjør nærmere struktur/funksjons-analyser og gir et grunnlag for å undersøke dens biosyntetiske reguleringer. Oppfinnelsen er således viktig for medisinsk vitenskap i undersøkelsen av koagulasjonskaskaden når det gjelder midler som er i stand til å inhibere faktor X a og faktor VIIa/TF enzymatisk kompleks. ;Selv om beskrivelsen etterfølges av krav som særlig peker ut og klart krever gjenstanden som ansees for å ut-gjøre foreliggende oppfinnelse, formodes det at oppfinnelsen vil bli bedre forstått ut fra den etterfølgende nærmere be-skrivelse av foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, sett i sammenheng med de ledsagende tegninger, hvor: Fig. 1 viser screeningen av Agtll-kloner med 12 5I-faktor X a. Klonede faglysater (0,1 ml) ble avsatt i flekker på et nitrocellulosepapir ved oppsuging under anvendelse av et "dot blot"-apparat. Nitrocellulosepapiret ble så under-125 ;søkt med I-faktor X aog autoradiografert som beskrevet nedenunder. Klonene som kom til syne som mørke flekker er positive kloner som binder 125I-faktor X . Kontroll-Xgtll ;3 125 ;(nedre høyre hjørne) og andre kloner binder ikke I-fak- ;tor X . ;a ;Fig. 2 viser et partielt restriksjonskart og sekven-serings strategi for \P9-innføyelsene. Skalaen nederst angir nukleotidposisjonen. Den tykke stolpe representerer det kodende område. De tynne stolpene representerer 5'- og 3'-ikke-kodende områder. Restriksjonsendonukleasestedene ble bekreftet ved oppløsning. Pilene viser de overlappende M13-kloner som ble brukt til å sekvensere cDNA-en. Fig. 3 viser nukleotidsekvensen og den translaterte aminosyresekvens til den humane TFI-cDNA. Nukleotider er nummerert til venstre og aminosyrer til høyre. De under-strekede sekvenser er blitt uavhengig bekreftet ved hjelp av aminosyresekvensanalyse av det rensede TFI-protein og to peptider oppløst med Vg-protease + trypsin. Aminosyre + 1 ble tildelt det første methionin etter et stoppkodon i det 5'-ikke-kodende område. Potensielle N-bundne glycosyleringssteder er avmerket ved hjelp av stjerner. Fig. 4 er en grafisk fremstilling som viser ladningsfordelingen til aminosyresekvensen i TFI. Ladninger er beregnet ut fra den første rest til de i-ende rester og vist ved den i-ende rest. Verdien til en i-ende posisjon er således summen av alle ladninger fra den første rest til den i-ende rest, og ladningsforskjellen mellom den i-ende og den j-ende rest (j>i) er nettoladningen til fragmentet fra den i-ende til den j-ende rest. Fig. 5 er en grafisk fremstilling som viser hydrofobisitetsprofilen til TFI. Hydrofobisitetsprofilen ble analy-sert ved hjelp av et datamaskinprogram hvorved hydrofobisi-tettallet til aminosyrerestene er definert som den dybde som en aminosyrerest er "begravd" i inne i et protein (fra røntgenkrystallografiske data) [Kidera et al., J. Protein Chem. , 23-55 (.1985)]. Hydrofobisitetsprof ilen langs sekvensen ble jevnet ut ved å bruke programmet ICSSCU i IMSL Library [IMSL Library Reference Manual, 9. utg., Institute for Mathematical and Statistical Subroutine Library, Houston, Texas (1982)]. Fig. 6 viser en oppstilling av områdene i TFI for grunnproteaseinhibitor sammen med andre grunnproteaseinhibitorer. Alle sekvensene bortsett fra TFI ble erholdt fra National Biomedical Research Foundation Protein Sequence Database (Georgetown University, Washington, D.C., offentliggjort 13. juni 1987). 1. Forløper for bovin grunnproteaseinhibitor. 2. Bovin råmelk-trypsininhibitor. 3. Bovin serum-grunnproteaseinhibitor. 4. Vinbergsnegle isoinhibitor K. 5. Røde-havskilpaddegrunnproteaseinhibitor (bare aminosyrene 1-79 til stede). 6. Vestlig sandviper-gift-grunnproteaseinhibitor I. 7. Spyttende kobra gift-grunnproteaseinhibitor II. 8. Kapp-kobra gift-grunnproteaseinhibitor II. 9. Russells huggorm gift-grunnproteaseinhibitor II. 10. Sandviper gift-grunnproteaseinhibitor III. 11. Østlig grønn; mamba gift-grunnproteaseinhibitor I homolog. 12. Svart, mamba gif t-grunnproteaseinhibitor B. 13. Svart mamba gift-grunnproteaseinhibitor E. 14. Svart mamba gift-grunnproteaseinhibitor I. 15. Svart mamba gif t-grunnproteaseinhibitor K. 16. (3-1-bungarotoksin B-kjede (mindre). 17. |3-l-bungarotoksin B-kjede (større). 18. (3-2-bungarotoksin B-kjede. 19. Hest inter-a-trypsininhibitor [aminosyrene 1-57(1), 58-123 (2)]. 20. Gris inter-a-trypsininhibitor [aminosyrene 1-57(1), 58-123(2)]. 21. Bovin inter-a-trypsininhibitor (aminosyrene 1-57(1), 58-123(2)]. 22. Human a-l-mikroglobulin/inter-a- ;trypsininhibitor-forløper [aminosyrene 227-283(1), 284-352 (2)]. 23.TFI[aminosyrene 47-117(1), 118-188(2), 210-280(3)]. Det ble tatt med åpninger i 16, 17 og 18 for å oppnå best sammenstilling. Standard énbokstav.koder for aminosyrer er anvendt. ;Fig. 7 viser "Northern blot"-analyse av RNA-er fra 3 cellelinjer utvunnet fra lever. 10 ug poly(A)<+>RNA ble anvendt pr. felt. Felt 1, Chang levercelle. Felt 2, SK-HEP-1-hepatomcelle. Felt 3, HepG2-hepatomcelle. ;Det er her anvendt standard biokjemisk nomenklatur hvor nukleotidbasene er betegnet som adenin (A), thymin (T), guanin (G) og cytosin (C). Tilsvarende nukleotider er f.eks. deoxyguanosin-5'-trifosfat (dGTP). Som vanlig er for å gjøre strukturfremstillingen av en DNA-nukleotidsekvens enklere, ;er bare en tråd vist hvor A på en tråd innebærer T på dens komplement, og G innebærer C. Aminosyrer er vist enten ved hjelp av trebokstav- eller enbokastavforkortelser som vist nedenunder: ; ; Vanlig tilgjengelige restriksjonsendonukleaser som ;her er beskrevet, har følgende restriksjonssekvenser og (vist ved hjelp av piler) spaltingsmønstere: ; ; For å illustrere bestemte foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen nærmere, ble det følgende preparative labo-ratoriearbeide utført som skal tjene som eksempler. ;Eksempel 1 ;Materialer ;Human placenta- og fosterlever-cDNA-samlinger ble erholdt fra Clonetech. "Protoblot Immuno Screening"-prøvesettet ble innkjøpt fra Promega Biotech. Restriksjonsenzymer var fra New England Biolabs. Alkalisk fosfatase fra kalvetarm, T4-DNA-ligase, DNA-polymerase I (Klenow), exonuklease III og Sl-nuklease var fra Boehringer Mannheim. dNTP-er var fra P.L. Biochemicals. 5'-[ct- 3 5S]-thio-dATP (600 Ci/mmol) var fra Amersham. Sekvenseringssett (Sequenase) var fra United States Biochemicals. Chang leverceller (ATCC CCL 13) og HepG2-hepatomceller (ATCC HB 8065) ble erholdt fra American Type Cul-tyre Collection. SK-HEP-l-hepatomceller var opprinnelige utvunnet fra et leveradenokarcinom av G. Trempe ved Sloan-Kettering Institute for Cancer Research i 1971 og er nå alminnelig og lett tilgjengelig. ;125 ;I-Faktor X clble fremstilt ved radioaktiv merking under anvendelse av "jod-gen". Den spesifikke aktivitet var 200 dpm/ng. Mer enn 97% av radioaktiviteten var utfellbar med 10% trikloreddiksyre (TCA). Det joderte protein beholdt mer ;enn 80% av sin katalytiske aktivitet mot Spectrozyme Xcl. ;En kolonne med anti-TFI-Ig-Sepharose<®>4B ble fremstilt på følgende måte: Et peptid (kalt TFI-peptid) inneholdende en sekvens som svarer til aminosyresekvensen 3-25 i det fullt ferdige TFI, ble syntetisert ved å bruke Biosystems fastfase-peptidsyntesesystem. TFI-peptidet (5 mg) ble konjugert til 10 mg Keyhole limpet hemocyanin ved hjelp av glutaraldehyd. To New Zealand hvite kaniner ble hver immunisert ved intra-dermal injeksjon med et homogenat som inneholdt 1 mm av Freunds fullstendige adjuvans og 1 mm konjugat (200 ug TFI-peptid) . En måned senere ble hver av kaninene gitt en ny injeksjon med et homogenat som inneholdt 1 mm av Freunds ufullstendige adjuvans og 1 mm konjugat (100 ug konjugat). Antiserum ble oppsamlet hver uke i 3 måneder og nye injek-sjoner ble utført månedlig. For å isolere spesifikt antistoff mot TFI-peptid, ble antiserumet kromatografert på en TFI-peptid Sepharose<®>4B kolonne. Kolonnen ble vasket med ;10 volumdeler PBS (0,4 M NaCl, 0,1 M benzamidin, 1% Triton<®>X-100) og den samme oppløsning uten Triton<®>X-100. Anti-stoffet ble eluert med 0,1 M glycin/HCl, pH 2,2, nøytrali-sert øyeblikkelig ved å tilsette 1/10 volum av IM Tris-OH ;og dialysert mot saltoppløsning. Det isolerte antistoff ble koblet til cyanbromid-aktivert Sepharose<®>4B etter produsen-tens metode og brukt til å isolere TFI fra cellekulturmediet. ;Chang leverceller ble dyrket ved hjelp av metoden som er beskrevet tidligere av Broze og Miletich, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 8j4; 1886-1890 (1987). Det kondisjonerte medium ;ble kromatografert på anti-TFI-Ig Sepharose<®>4B kolonne. Kolonnen ble vasket med 10 volumdeler PBS/1% Triton<®>X-100 og PBS. Den bundne TFI ble eluert med 0,1 M glycin/HCl, pH 2,2. Den immunoaffinitets-isolerte TFI ble ytterligere renset ved hjelp av preparativ elektroforese på natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel (Savant-apparat). Aminosyreanalyse av sluttproduktet viste den samme aminoendesekvens som hos den TFI som ble isolert fra HepG2-celler, slik som beskrevet i US patentsøknad nr. 77.366. Den isolerte Chang lever-TFI ble så brukt til å immunisere kaniner ved hjelp av immuni-seringsfremgangsmåten beskrevet ovenfor. Det erholdte anti- ;serum hadde en titer på ca. 100 yg/ml i den doble immuno-diffusjonstesten. Dette antiserum ble anvendt i den immuno-logiske screening av \ gtll-cDNA-samlinger. ;Metoder ;Isolering av cDNA- kloner. Metoder for screening av placenta-og fosterlever-cDNA-samlingene med antistoff, plakk-rensing og fremstilling av A-fag-lysat og DNA var som beskrevet av Wun og Kretzmer, FEBS Lett, 1, 11-16 (1987) . Antiserumet ;ble foradsorbert med BNN97 Agtll-lysat og fortynnet 1/500 ;for screening av samlingen. ;Screening av faktor X^bindingsaktivitet. ;Rekombinante proteiner indusert ved hjelp av isopropyl-3-thiogalactosid fra immunopositive K- fag-isolater eller fra kontroll \gtll ble undersøkt med hensyn på faktor Xa bindingsaktitivet. A.-fag-lysatene (0,1 mm) ble filtrert gjennom et nitrocellulosepapir under anvendelse av et "dot blot"-apparat. Nitrocellulosepapiret ble så senket ned og omrørt i en fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 5 mg/ml bovint serumalbumin og 2,5 mg/ml bovint gammaglobulin ved værelse-125 temperatur i 1 time. Oppløsningen ble erstattet med I-faktor X cl(1,0 x 10^ cmp/ml) oppløst i den samme oppløsning supplert med 0,1 mg/ml heparin, og omrøringen ble fortsatt i ytterligere 1 time. Nitrocellulosepapiret ble så vasket med fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 0,05% Tv/een<®>20. Vaskebufferen ble byttet hvert 5. minutt, 4 ganger. Nitrocellulosepapiret ble så lufttørket og preparert for auto-radiografi under anvendelse av Kodak XR5-film. Filmen ble fremkalt etter 1 ukes eksponering. ;Fremstilling av poly( A)+- RNA og " Northern blotting". Totale RNA-er ble fremstilt fra dyrket Chang levercelle, HepG2-hepatomcelle og SK-HEP-l-hepatomcelle under anvendelse av natrium-perkloratekstraksjonsmetoden til Lizardi og Engelberg, Anal. Biochem. , JJ8, 116-122 (1979). Poly (A)+-RNA-er ble isolert ;ved satsvis adsorpsjon på oligo(dT)-cellulose (type 77F) ;under anvendelse av fremgangsmåten anbefalt av produsenten. ;For "Northern blot"-analyse ble hver gang 10 ug poly(A)<+->;RNA behandlet med glyoxal [Thomas, Methods Enzymol., 100, 255-266 (1983) ] og underkastet agarosegelelektroforese i en buffer som inneholdt 10 mM natriumfosfat, pH 7,0. Bethesda Research Laboratory's RNA-"stige" ble brukt som en molekyltvektmarkør. RNA-ene ble transblottet til et nitrocellulosepapir som så ble oppvarmet ved 80°C i 2 timer. Den innføyde DNA i "^P9-klon ble radioaktivt merket med<32>P ved "nick"-translasjon og brukt som en søker [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Model, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., ;(1982)]. Blotten ble hybridisert med 5 x IO<6>cpm av søkeren ;i 5 ml av en oppløsning som inneholdt 50% formamid, 5X SSC, ;50 mM natriumfosfat, pH 7,0, 250 yg/ml denaturert lakse-sperm-DNA og IX Denhardts oppløsning ved 42°C i 16 timer. Filteret ble vasket i 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 2X ;SSC ved værelsetemperatur 3 ganger, hver gang 5 minutter, og ;i 0,1% SDS, 0,2 X SSC ved 50°C to ganger, hver gang 5 minutter. Nitrocellulosepapiret ble så lufttørket, autoradiografert i 3 dager ved -70°C under anvendelse av Kodak XAR-5-film og forsterkerskjerm. ;Andre metoder for rekombinant DNA. Fremstilling av klonet A.gtll-DNA, subkloning i pUC19-plasmid og Ml3mpl8-vektor, generering av fjernelse ved hjelp av oppløsning med exonuklease III, og DNA-sekvensering ved dideoxymetode [Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 83, 6776-6780 (1977)] ;ble utført som beskrevet av Wun og Kretzmer, se ovenfor. ;Programmet FASTP skrevet av Lipman og Pearson, Science, 227, 1435-1441 (1985) ble brukt til å identifisere homologe familier av proteiner fra National Biomedical Research Foundation Sequence Data Bank (offentliggjort 13. juni 1987) og til å stille sekvensene på linje innenfor homolog-familien. ;Resultater ;Screening av cDNA- samlinger ;Et antall cellelinjer ble undersøkt med hensyn på tilstedeværelse av TFI i de kondisjonerte medier, og det ble funnet at flere cellelinjer utvunnet fra lever, Chang-lever, HepGt-hepatom og SK-HEP-l-hepatom utskiller TFI i kultur. ;Først ble et antiserum mot TFI brukt til å undersøke en ;human fosterlever j^gtll-cDNA-samling (10^ plakkdannende enheter) , og 15 immunologisk positive kloner ble erholdt. Deretter ble den samme metode brukt til å undersøke en placenta-Agtll-cDNA-samling. Av 10 plakkdannende enheter ble det erholdt 10 immunologisk positive kloner. Disse klonene ble plakkrenset og lysatene av de rensede kloner ble testet med hensyn på funksjonell aktivitet av TFI. Isopropylthiogalac-tosid-induserte faglysater ble absorbert på nitrocellulosepapiret og undersøkt med hensyn på 125I-faktor Xclbindings-aktiviteten. Figur 1 viser at noen av disse immunologisk positive kloner oppviste evne til å binde<125>I-faktor Xcl på nitrocellulosepapiret. Totalt oppviste 3 av 15 immunologisk positive fosterleverkloner, og 4 av 10 immunologisk ;125 ;positive placentakloner, I-faktor X abindingsaktivitet. Disse immunologisk og funksjonelt positive kloner ble opp- ;løst med EcoRI og størrelsen på innføyelsene ble beregnet ved hjelp av gelelektroforese. 1 klon fra placentasamling ;(Ap9) hadde en innføyelse av omtrent 1,4 kb, men alle de ;øvrige klonene inneholdt innføyelser med omtrent 0,1 kb. Partiell DNA-sekvensering har vist at 1,0 kb kloner inneholder sekvenser som er identiske med en del av den lengste ;1,4 kb placentaklon (Åp9). XP9 ble derfor valgt ut for fullstendig sekvensering. ;Nukleotidsekvens og forutsagt proteinsekvens for TFI- cDNA-isolat ;XP9-klonen ble underkastet restriksjonskartlegging, ;en Ml3-subkloning og sekvensering ved hjelp av strategien som er vist i figur 2. Hele sekvensen ble bestemt på begge trådene ved hjelp av fjernelsemetoden med exonuklease III [Henikoff, Gene, 28, 351-359 (1984)] og funnet å bestå av 1432 baser i lengde. Sekvensen er vist i figur 3. Den inneholder et 5<1->ikke-kodende område med 133 baser, en åpen leseramme med 912 nukleotider og et 3'-ikke-kodende område med 387 nukleotider. Det første ATG opptrer ved nukleotid 134 ;i sekvensen TAGATGA, som like etter ble fulgt av en andre ATG nukleotid 146 i sekvensen ACAATGA. Disse er muligens initieringssekvensene, selv om de adskiller seg fra den fore-slåtte konsensussekvens for initiering ved hjelp av eukaryo-tisk ribosom, ACCATGG [Kozak, Cell, _44, 283-292 (1986)]. 28 aminosyrer kommer forut for en sekvens som svarer til N-enden i det fullt ferdige protein. Lengden og sammensetningen av det hydrofobe segment av disse 28 aminosyrene er typisk for signalsekvensen [Von Heijne, Eur. J. Biochem., 133, 17-21 (1983); J. Mol. Biol., 184, 99-105 (1985)]. En signal-peptidase spalter muligens ved Ala2g-Asp2<j # slik at et fullt ferdig protein oppstår. Sekvensen som er forutsagt for den fullt ferdige TFI, består av 276 aminosyrer som inneholder 18 cysteinrester og 7 methioniner. Den beregnede masse på 31.950 dalton ble basert på den utledede proteinsekvens for fullt ferdig TFI, er noe lavere enn de 37-40 kDa som er beregnet ved hjelp av natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-elektrof orese av isolert protein, og forskjellen gjenspeiler muligens bidraget fra glycosylering til det naturlige pro-teins immobilitet. Den utledede proteinsekvens som svarer til det fullt ferdige protein, inneholder 3 potensielle N-bundne glycosyleringssteder med sekvensen Asn-X-Thr/Ser (aminosyreposisjonene 145, 195 og 256). Aminosyresekvensanalyse av renset hel TFI og to isolerte proteolytiske frag-menter stemmer nøyaktig overens med proteinsekvensen utledet fra cDNA-sekvensen (figur 3, understreket), noe som indikerer at den isolerte cDNA-klon koder for TFI. Det 3<1->ikke-kodende område er A+T-rikt (70% A+T). Hverken konsensuspolyadeny-leringssignal, AATAAA [Proudfoot and Brownlee, Nature, 252, 359-362 (1981)], eller poly A-halen ble funnet i denne klon, muligens på grunn av artefakttap av del av 3'-endedelen under oppbygning av samlingen. Ladningsfordeling, hydrofobositet/ hydrofilisitet og indre homologi Den translaterte aminosyresekvens til TFI inneholder 27 lysinrester, 17 argininrester, 11 asparaginsyrerester og 25 glutaminsyrerester. Ladningsfordelingen langs proteinet er svært ujevn, som vist i figur 4. Signalpeptidområdet inneholder 2 positivt ladede lysinrester sammen med 26 nøy-trale rester. Aminoendeområdet i det fullt ferdige protein inneholder en sterkt negativt ladet strekning. 6 av de første 7 rester er enten asparaginsyre eller glutaminsyre som nært etterfølges av 2 mer negativt ladede aminosyrer ned-strøms, før det opptrer en positivt ladet lysinrest. Midtdelen av molekylet er vanligvis negativt ladet. Ved carboxyl-enden er det et svært positivt ladet segment. Aminosyrene 265 - 293 i TFI inneholder 14 positivt ladede aminosyrer, inkludert 6 på hverandre følgende arginin- + lysinrester. ;Den forutsagte hydrofilisitet/hydrofobisitets-profil til TFI-protein er vist i figur 5. Signalpeptidet inneholder et svært hydrofobt område som forventet. Resten av molekylet synes å være heller hydrofilt. ;TFI's translaterte aminosyresekvens inneholder flere områder som lar seg skjelne, fra hverandre. Ved siden av det svært negativt ladede N-endeområde og det svært positivt ladede C-endeområde, består midtdelen av 3 homologe områder som har de typiske sekvenser for inhibitorer av Kunitz-type (se nedenunder). ;Homologi med andre proteiner ;Ved å søke i National Biomedical Research Foundation sekvensdatabase, ble det funnet at N-endeområdet og C-endeområdet i TFI ikke oppviser signifikant homologi med andre kjente proteiner. De 3 indre homologe områder er imidlertid hver homologe med sekvensene i andre grunnproteaseinhibitorer, inkludert bovin bukspyttkjertel-grunnproteaseinhibitor (aprotinin), huggorm-grunnproteaseinhibitorer og inter-a-trypsin-inhibitorer (figur 6). Det er verd å legge merke til at disulfidbindingstruktur er godt bevart i alle disse inhibitorer. Basert på disse homologier, er det klart at TFI tilhører gen-overfamilien med grunnproteaseinhibitorer. ;" Northern blotting" ;Poly(A)+ RNA-er ble renset fra TFI-produserende celle linjer utvunnet fra lever, Chang-lever, HepG2-hepatom og SK-HEP-l-hepatomceller. Poly(A)+ RNA-ene ble oppløst ved hjelp av denaturerende agarosegelelektroforese, "trans- ;32 blottet" til et nitrocellulosepapir og prøvet med P-merket TFI-cDNA (AP9). Som vist i figur 7, ble det iakttatt to hoved-bånd med hybridisering som svarer til mRNA-er med 1,4 kb og 4,4 kb, i alle tre cellelinjene som ble testet. Det ble testet flere andre cellelinjer som ikke produserer påvisbare mengder TFI, og hvor ingen hybridisering med søkeren ble funnet (data ikke vist). *

Claims (4)

1. cDNA-sekvens som koder for modent humanvevsfaktorinhibitorprotein,karakterisert vedat den har nukleotidsekvensen som vist i figur 3 i tegningene.

2. cDNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert vedatcDNA-eterhumanvevsfaktoirnhibitor-cDNA-klonenÅP9 som er kjennetegnet som vist i restriksjonskartet i figur 2 i tegningene.

3. cDNA-sekvens ifølge hvilket som helst av kravene 1 og 2, karakterisert vedat den koder for et protein med en molekylvekt på 3 7-40 kD som beregnet ved hjelp av natriumdodecylsulfatpolyakrylarmdgelelektroforese, og har aminosyresekvensen som vist i figur 3 i tegningene.

4. cDNA-sekvens ifølge hvilket som helst av kravene 1 og 2,karakterisert vedat den koder for et protein som er metionylvevsfaktor-inhibitorproteinet som inneholder aminosyresekvensen som vist i figur 3 i tegningene.