DK174754B1 - Humane vævsfaktorinhibitor (TFI), antistof med bindingsspecificitet herfor, fremgangsmåde til anvendelse af en TFI-peptid-kolonne til at oprense et antistof og fremgangsmåder til detektion af TFI eller et polypeptid omfattende.... - Google Patents

Description

i DK 174754 B1

Human vævsfaktorinhibitor (TFI), antistoffer med bindingsspecificitet herfor, fremgangsmåde til anvendelse af en TFI-peptid-kolonne til at oprense et antistof og fremgangsmåder til detektion af TFI eller et poly-peptid omfattende et eller flere Kunitz-domæner af TFI i et biologisk flu-5 idum

Den foreliggende opfindelse angår en human koagulationsinhibitor betegnet vævsfaktorinhibitor (TFI) og alternativt som lipoproteinassocieret koagulationsinhibitor (LACI) samt antistoffer med bindingsspecificitet herfor. Endvidere 10 angår opfindelsen en fremgangsmåde til anvendelse af en TFI-peptid-kolonne til at oprense et antistof over for TFI og fremgangsmåder til detektion af TFI eller et polypeptid omfattende et eller flere Kunitz-domæner af TFI i et biologisk fluidum.

15 OPFINDELSENS BAGGRUND

Koagulationsprocessen, der forekommer i pattedyrblod, omfatter to adskilte systemer - de såkaldte interne og eksterne systemer. Sidstnævnte system aktiveres, når blodet udsættes for vævsthromboplastin (faktor III), i det efter-20 følgende betegnet vævsfaktor (TF). Vævsfaktor er et lipoprotein, der forekommer i plasmamembranen af en hel række celletyper, idet hjernen og lungerne specielt er rige herpå. Ved at komme i kontakt med TF danner plasmafaktor VII eller dens aktiverede form, faktor Vlla, et calciumafhængigt kompleks med TF, der herefter proteolytisk aktiverer faktor X til faktor Xa, og fak-25 tor IX til faktor IXa.

Tidlige undersøgelser over reguleringen af TF-initieret koagulering viste, at inkubation af TF (i urensede vævsthromboplastin-præparater) med serum hæmmede dens aktivitet in vitro og forhindrede dens dødelige virkning, når 30 den blev infunderet i mus. Yderligere undersøgelser af Hjort, Scand. J. din.

Lab. Invest 9, Suppl. 27, 76-97 (1957) bekræftede og videreudviklede tidligere arbejde inden for dette område og førte til den konklusion, at en hæmmende del i serum genkender faktor VII-TF-komplekset. I overensstemmelse 2 DK 174754 B1 med denne hypotese er de kendsgerninger, at hæmningen af TF, der forekommer i plasma, kræver tilstedeværelsen af Ca2+ (der også er nødvendig for bindingen af faktor Vll/Vlla til TF), og at hæmningen kan forhindres og/eller vendes om ved chelatering af divalente kationer med EDTA. Nye un-5 dersøgelser har vist, at ikke alene faktor VIla, men også katalytisk aktiv faktor Xa og en yderligere faktor er nødvendig for opnåelsen af TF-inhibition i plasma eller serum. Se Broze og Miletich, Blood 69, 150-155 (1987) og Sanders et al., Ibid. 66, 204-212 (1985). Denne yderligere faktor, heri defineret som vævsfaktorinhibitor (TFI) og alternativt som lipoproteinassocieret koagulati-10 onshæmmer (LACI) forefindes i bariumabsorberet plasma og synes at være associeret med lipoproteiner, da TFI-funktionel aktivitet udskilles med lipopro-teinfraktionen, der flyder ovenpå, når serum centrifugeres ved en massefylde på 1,21 g/cm3. Ifølge Broze og Miletic, supra, og Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1886-1890 (1987) udskiller HepG2-celler (en human hepatomacellelinie) 15 en hæmmende del med samme egenskaber som den TFI, der forefindes i plasma.

I EP offentliggørelsesskrift nr. 300 988 beskrives en renset vævsfaktorinhibitor (TFI), der udskilles af HepG2-celler. Den viste sig at forefindes i to former, 20 en TFh, der vandrer ved cirka 37000-40000 dalton, og en TFb, der vandrer ved 25000-26000 dalton, bestemt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE). En delvis N-terminal aminosyresekvens for TFI blev kortlagt som: 25 1 15 X-X-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-lle-lle-Thr-Asp-Thr-Glu- 16 27

Leu-Pro-Pro-Leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe-(Phe)-Ala, 30 hvor X-X ikke var blevet bestemt. Indholdet af denne ansøgning betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved reference.

DK 174754 B1 3

KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Opfindelsen bygger på tilvejebringelsen af den fuldstændige kodesekvens for en cDNA-klon, der i det væsentlige repræsenterer vævsfaktorinhibitor (TFI) 5 af fuld størrelse.

Først blev humane placentale og fetal lever-Agtll-cDNA-biblioteker screenet med et polyklonalt kaninantiserum frembragt over for en renset TFI. Immunologisk positive kloner blev yderligere screenet for 125l-faktor Xa-bindende virk-10 ning. Der blev opnået syv kloner, der var immunologisk og funktionelt aktive.

Den længste klon, placenta-afledt λΡ9, var 1,4 kilobaser (kb) lang, mens de andre seks havde en længde på 1,0 kb. Delvis DNA-sekvensering viste, at 1,0 kb klonerne havde sekvenser identiske med en del af den længere 1,4 kb klon. Nucleotidsekvensanalyse viste, at AP9 bestod af en 1432 basepar (pb) 15 cDNA-insertion, der omfatter en 5'-ikke-kodende region på 133 bp, en åben læseramme på 912 bp, en stopkodon og en 3'-ikke-kodende region på 384 bp.

cDNA-sekvensen koder for et 31 950 dalton protein på 276 aminosyrer, som 20 omfatter 18 cysteinrester og 7 methioninrester. Den translaterede aminosy-resekvens viser, at et signalpeptid på cirka 28 aminosyrer kommer forud for det modne TFI-protein. Det skal bemærkes, at det "modne’' TFI er defineret til at omfatte både TFI og methionyl-TFI på grund af den translationelle ATG-kodon i den heri beskrevne AP9-klon.

25

Der er tre potentielle N-forbundne glycosyleringssteder i TFI-proteinet med sekvensen Asn-X-Ser/Thr, hvori X kan være en vilkårlig af de almindelige 20 aminosyrer. Disse steder er ved aminosyrepositionerne Asn 145, Asn 195 og Asn 256, når den første methioninrest efter den 5’-ikke-kodende region be-3 0 tegnes aminosyreposition +1.

Den translaterede aminosyresekvens af TFI viser adskillige skelnelige domæner, herunder en højt negativt ladet N-terminal, en højt positivt ladet car- 4 DK 174754 B1 boxy-terminal og en mellemliggende del bestående af tre homologe domæner med sekvenser typiske for enzyminhibitorer af Kunitz-type. Baseret på en homologiundersøgelse synes TFI at være et medlem af den basale protea-seinhibitorgen-superfamilie.

5

Den oprindelige kilde for proteinmaterialet til frembringelse af cDNA-klon AP9 var humant placentavæv. Dette væv kan fås i udstrakt grad efter fødsel ved almindelige kirurgiske metoder. Agtll (Iac5 nin5 c1857 S100) anvendt heri er en velkendt og almindeligt tilgængelig lambda-phag-ekspressionsvektor.

10 Dens konstruktion og restriktionsendonucleasekort er beskrevet af Young og Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,1194-1198 (1983).

Northern blot analyse viste, at følgende leverafledte cellelinier: Chang-levercelle, HepG2 hepatoma og SK-HEP-1 hepatoma alle indeholdt to hove-15 darter af mRNA (1,4 og 4,4 kb), der hybridiserede med TFi-cDNA’en.

Kloningen af cDNA for TFI og udviklingen af hele dens proteinsekvens og strukturelle domæner som omhandlet heri muliggør detaljerede strukturfunktionelle analyser og tilvejebringer et grundlag for at studere dens biosynte-20 tiske reguleringer. Opfindelsen er således vigtig for lægevidenskaben ved undersøgelsen af koagulationen med hensyn til midler, der er i stand til at hæmme faktor Xa og faktor Vlla/TF-enzymkompleks.

Den foreliggende opfindelse angår specielt human vævsfaktorinhibitor (TFI) 25 med den i Fig. 3 på tegningerne viste proteinaminosyresekvens.

Desuden angår opfindelsen et isoleret og renset antistof der har en bindingsspecificitet for vævsfaktorinhibitor (TFI) med en aminosyresekvens som vist i Fig. 3.

30

Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til anvendelse af en TFI-peptid-kolonne til at oprense et antistof over for den i Fig. 3 på tegningerne viste proteinaminosyresekvens.

DK 174754 B1 5

Opfindelsen angår yderlige fremgangsmåder til detektion af et første poly-peptid i et biologisk fluidum, hvor det nævnte første polypeptid er valgt blandt TFI og et polypeptid omfattende et eller flere Kunitz-domæner af TFI, hvor én fremgangsmåde ifølge opfindelsen omfatter følgende trin: 5 (a) man bringer det nævnte fluidum i kontakt med et andet polypep tid, der har en bindingsspecificitet for det nævnte første polypeptid, og (b) man prøver for tilstedeværelsen af det nævnte andet polypeptid for at bestemme niveauet af det nævnte første polypeptid; 10 og en anden fremgangsmåde ifølge opfindelsen omfatter følgende trin: (a) man bringer det nævnte fluidum i kontakt med et antistof, der har en bindingsspecificitet for det nævnte første polypeptid, og et andet polypeptid, der er i stand til at binde det nævnte antistof, og (b) man prøver for tilstedeværelsen af det nævnte andet polypeptid 15 for at bestemme niveauet af det nævnte første polypeptid.

DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Opfindelsen beskrives nu nærmere med henvisning til tegningen, på hvilken 20

Fig. 1 viser screeningen af Agtll-kloner med 12Sl-faktor X* Klonede phaglysa-ter (0,1 ml) blev pletvis anbragt på et nitrocellulosepapir ved sugning under anvendelse af et dot blot apparat. Nitrocellulosepapiret blev herefter pro-beundersøgt med 125l-faktor Xa og autoradiograferet som beskrevet nærme-25 re. Kloner, der forekommer som mørke pletter, er positive kloner, der binder 125l-faktor Xa. Kontrol Agtll (nedre højre hjørne) og andre kloner binder ikke 125l-faktor Xa.

Fig. 2 viser et partielt restriktionskort og sekvenseringsstrategi for AP9-30 insertioneme. Skalaen forneden angiver nucleotidpositionen. Den tykke stang repræsenterer den kodende region. De tynde stænger repræsenterer 5‘- og 3’-ikke-kodende regioner. Restriktionsendonuclease-stederne blev be- 6 DK 174754 B1 kræftet ved nedbrydning. Pilene viser de overlappende M13-kloner, der blev anvendt til at sekvensere cDNA'en.

Fig. 3 viser nucleotid-sekvensen og den translaterede aminosyresekvens af 5 den humane TFl-cDNA. Nucleotider er nummereret på den venstre side og aminosyrer på den højre side. De understregede sekvenser er uafhængigt blevet bekræftet ved aminosyresekvensanalyse af det rensede TFI-protein og to Ve-protease + trypsin-nedbrudte peptider. Aminosyre +1 blev tildelt den første methioninrest efter en stopkodon i den 5'-ikke-kodende region. Poten- 1 o tielle N-forbundne glycosyleringssteder er markeret med stjerner.

Fig. 4 er en grafisk afbildning, der viser ladningsfordelingen af aminosyrese-kvensen i TFI. Ladninger er beregnet fra den første rest til de i-ende rester og vist ved den i-ende rest. Således er værdien i den i-ende position opsumme-15 ringen af alle ladninger fra den første rest til den i-ende rest, og forskellen i ladningerne mellem den i-ende og den j-te rest (j>i) er nettoladningen af fragmentet fra den i-ende til den j-te rest.

Fig. 5 er en grafisk afbildning, der viser hydrofobicitetsprofilen af TFI. Hydro- 2 o fobicitetsprofilen blev analyseret ved hjælp af et computerprogram, hvor hy- drofobicitetsindekset af aminosyreresterne er defineret som den dybde, hvortil en aminosyrerest er begravet inden i et protein (fra røntgen-krystallografiske data) [Kidera et al., J. Protein Chem. 4, 23-55 (1985)]. Hydrofobicitetsprofilen langs sekvensen blev udglattet under anvendelse af programmet 25 ICSSCU i IMSL Library [IMSL Library Reference Manual, 9. udgave, Institute for Mathematical and Statistical Subroutine Library, Houston, Texas (1982)].

Fig. 6 viser en linieopstilling af de basale proteaseinhibitordomæner af TFI med andre basale proteaseinhibitorer. Alle sekvenserne bortset fra TFI blev 30 opnået fra National Biomedical Research Foundation Protein Sequence Database (Georgetown University, Washington, D.C., U.S.A., frigivet 13. juni 1987). 1. Bovin basal proteaseinhibitor-precursor; 2. Bovint colostrum-try psi ni n hi bitor; 3. Bovint serum-basal proteaseinhibitor; 4. Spiselig snegl-isoinhibitor K; 5. Rødehavsskildpadde-basal proteaseinhibitor (kun aminosy-35 rerne 1-79 angivet); 6. Vestlig sandhugorm gift-basal proteaseinhibitor I; 7.

DK 174754 B1 7

Ringhalsgift-basal proteaseinhibitor II; 8. Cape cobra gift-basal proteaseinhi-bitor II; 9. Russell’s hugorm gift-basal proteaseinhibitor II; 10. Sandhugorm gift-basal proteaseinhibitor III; 11. Østlig grøn mamba gift-basal proteaseinhibitor I homolog; 12. Sort mamba gift-basal proteaseinhibitor B; 13. Sort 5 mamba gift-basal proteaseinhibitor E; 14. Sort mamba gift-basal proteaseinhibitor I; 15. Sort mamba gift-basal proteaseinhibitor K; 16. β-1-Bungarotoxin B kæde (mindre); 17. β-1-Bungarotoxin B kæde (større); 18. β-2-Bungarotoxin B kæde; 19. Heste-inter-a-trypsininhibitor [aminosyrerne 1-57(1); 58-123(2)]; 20. Svine-inter-a-trypsininhibitor [aminosyrerne 1-57(1); 10 58-123(2)]; 21. Bovin inter-a-trypsininhibitor [aminosyrerne 1-57(1); 58- 123(2)]; 22. Human α-1-mikroglobulin/inter-a-trypsininhibitor-precursor [aminosyrerne 227-283(1); 284-352(2)]; 23. TFI [aminosyrerne 47-117(1); 118-188(2); 210-280(3)]. Mellemrum blev inkluderet i 16, 17, 18 for at opnå bedste overensstemmelse. Der er anvendt standard et-bogstavs-koder for ami-15 nosyrer.

Fig. 7 viser Northern blot analysen af RNA'er fra 3 lever-afledte cellelinier. 10 pg poly(A)+ RNA blev anvendt pr. bane. Bane 1: Chang-levercelle; bane 2: SK-HEP-1 hepatomacelle; bane 3: HepG2 hepatomacelle.

20 I denne beskrivelse med krav er anvendt biokemisk standardnomenclatur, hvor nucleotidbaserne er betegnet som adenin (A); thymin (T); guanin (G); og cytosin (C). Tilsvarende nucleotider er for eksempel deoxyguanosin-5’-triphosphat (dGTP). Som det er almindeligt af nemhedsgrunde ved den struk-25 tureile afbildning af en DNA-nucleotidsekvens, er kun én streng vist, hvori A på én streng indebærer T på dens komplementære streng, og G indebærer C. Aminosyrer er vist enten ved tre bogstavs- eller et-bogstavsforkortelser på følgende måde: 30 Forkortet betegnelse___Aminosyre_ A Ala Alanin C Cys Cystein D Asp Asparaginsyre E Glu Glutaminsyre 35 F Phe Phenylalanin 8 DK 174754 B1 G Gly Glycin H His Histidin I Ile Isoleucin K Lys Lysin 5 L Leu Leucin M Met Methionin N Asn Asparagin P Pro Prolin Q Gin Glutamin 10 R Arg Arginin S Ser Serin T Thr Threonin V Val Valin W Trp Tryptophan 15 Y_Tyr_Tyrosin_

Almindeligt tilgængelige restriktionsendonucleaser beskrevet heri har følgende sekvenser og (angivet ved pile) spaltningsmønstre: 20 i

EcoR1 GAATTC

GTTAAG

T

25 i

Ssp1 AATAAT

TTATAA

T

30 1

Cla1 ATCGAT

TAGCTA

T

35 i

Alu1 AGCT

TCGA

T

40 i

Stu1 AGGCCT

TCCGGA

T

DK 174754 B1 9

For at belyse specifikke foretrukne udførelsesformer af opfindelsen nærmere er angivet følgende eksempler på præparativt laboratoriearbejde.

EKSEMPEL 1 5

Materialer

Human placenta- og fetal lever-cDNA-biblioteker blev opnået fra Clonetech. Protoblot-immunoscreenings-udstyr blev indkøbt fra Promega Biotech. Re-10 striktionsenzymer var fra New England Biolabs. Kalvetarm-alkalisk phosphatase, T4 DNA-ligase, DNA-polymerase I (Klenow), exonuclease III og S1-nuclease var fra Boehringer Mannheim. dNTP var fra P.L. Biochemicals. 5’-[a-35S]-thio-dATP (600 Ci/mml) var fra Amersham. Sekvenseringsudstyr (se-quenase) var fra United States Biochemicals. Chang-leverceller (ATCC CCL 15 13) og HepG2 hepatomaceller (ATCC HB 8065) blev opnået fra the Ameri can Type Culture Collection. SK-HEP-1 hepatoma-celler stammede oprindeligt fra en lever-adenocarcinoma fra G. Trempe fra Sloan-Kettering Institute for Cancer Research i 1971 og er nu udbredt og let tilgængelig.

20 125l-faktor Xa blev fremstillet ved radiomærkning under anvendelse af lodo-gen. Den specifikke aktivitet var 2000 dpm/ng. Mere end 97% af radioaktiviteten kunne udfældes med 10% trichloreddikesyre (TCA). Det ioderede protein bibeholdt >80% af deres katalytiske aktivitet over for Spectrozyme Xa (American Diagnostica Product).

25

En anti-TFI-lg-"Sepharose® 4B"-søjle blev fremstillet på følgende måde: Et peptid (betegnet TFI-peptid) indeholdende en sekvens svarende til aminosy-resekvensen 3-25 af det modne TFl blev syntetiseret under anvendelse af Biosystems fastfase-peptidsyntese-system. TFI-peptidet (5 mg) konjugere-30 des til 10 mg Keyhole albueskæl-hæmocyanin ved hjælp af glutaraldehyd. To hvide kaniner af New Zealand race immuniseredes ved intradermal injektion af et homogenat indeholdende 1 ml Freund’s complete adjuvant og 1 ml kon-jugat (200 pg TFI-peptid). En måned senere fik kaninerne atter injektion med et homogenat indeholdende 1 ml Freund’s incomplete adjuvant og 1 ml kon-35 jugat (100 pg konjugat). Antiserum blev opsamlet hver uge i tre måneder, og yderligere injektioner blev udført en gang om måneden. For at isolere sped- 10 DK 174754 B1 fikke antistoffer over for TFI-peptidet blev antiserum kromatograferet på en TFI-peptid-MSepharose 4B"-søjle. Søjlen blev vasket med 10 rumfang PBS (0,4 M NaCI-0,1 M benzamidin-1% "Triton© X-100"), og samme opløsning uden "Triton X-100". Antistoffet blev elueret med 0,1 M glycin/HCI, pH 2,2, og 5 derpå straks neutraliseret ved tilsætning af 1/10 rumfang Tris-OH og dialyseret over for saltvandsopløsning. Det isolerede antistof blev koblet til cyan-bromid-aktiveret "Sepharose 4B" efter fabrikantens (Pharmacia) anvisninger og anvendt til at isolere TFI fra celledyrkningssubstratet.

1 o Chang-leverceller blev dyrket ved metoden, der tidligere er beskrevet af Bro- ze og Miletich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1886-1890 (1987). Det konditionerede substrat blev kromatograferet på anti-TFI-lg-"Sepharose 4B"-søjlen.

Søjlen blev vasket med 10 rumfang PBS-1% 'Triton X-100" og PBS. Den bundne TFI elueredes med 0,1 M glycin-HCI, pH 2,2. Immunoaffinitetsisoleret 15 TFI blev renset yderligere ved præparativ natriumdodecylsulfat-polyacryl-amidgel-elektroforese (Savants apparat). Aminosyreanalyse af slutproduktet viste den samme amino-endestillede sekvens som den TFI, der var isoleret fra HepG2-celler som beskrevet i den sideløbende danske patentansøgning PA 1988 04135. Det isolerede Chang-levercelle-TFI anvendtes herefter til at 20 immunisere kaniner ved den ovenfor beskrevne immuniseringsforskrift. Det opnåede antiserum havde en titer på cirka 100 pg/ml ved dobbelt immunodif-fusions-prøvningen. Dette antiserum anvendtes ved immuno-screeningen af Agtll cDNA-biblioteker.

2 5 Metoder

Isolering af cDNA-kloner

Metoder til at afsøge placenta- og fetal lever-cDNA-biblioteker med antistof, 30 plaque-rensning og fremstilling af λ-phag-lysat og DNA var som beskrevet af Wun og Kretzmer, FEBS Lett. 1, 11-16 (1987). Antiserumet blev præ-adsorberet med BNN97 Agtll-lysat og fortyndet 1/500 til screening af biblioteket.

DK 174754 B1 11

Screening for faktor Xa-bindende aktivitet

Rekombinante proteiner induceret med isopropyl-p-thio-galactosid fra immu-nopositive λ-phag isolater eller fra kontrol Agtll blev screenet for faktor Xa-5 bindende aktivitet, λ-phag-lysaterne (0,1 ml) blev filtreret gennem et nitrocellulosepapir under anvendelse af et dot-blot-apparat (Bio Rad). Herefter blev nitrocellulosepapiret neddykket og omrørt i phosphatpufret saltvand indeholdende 5 mg/ml bovint serumalbumin og 2,5 mg/ml bovint gammaglobulin ved stuetemperatur i 1 time. Opløsningen blev erstattet med 125l-faktor Xa (1,0 x ίο 106 cmp/ml) opløst i den samme opløsning tilsat 0,1 mg/ml heparin, og omrøringen fortsattes i yderligere 1 time. Herefter blev nitrocellulosepapiret vasket med phosphatpufret saltvand indeholdende 0,05% "Tween® 20". Vaskepufferen udskiftedes hvert femte minut, fire gange. Herefter blev nitrocellulosepapiret lufttørret og præpareret til autoradiografi under anvendelse af "Kodak 15 XR5"-film. Filmen blev fremkaldt efter en uges eksponering.

Fremstilling af poly(A)* RNA og Northern blotting

Totale RNA'er blev præpareret fra dyrket C hang-levercelle, HepG2 hepato-20 macelle og SK-HEP-1 hepatomacelle under anvendelse af natriumperchlorat-ekstraktionsmetoden beskrevet af Lizardi og Engelberg, Anal. Biochem. 98, 116-122 (1979). Poly(A)+ RNA-præparater blev isoleret ved batchvis adsorption på oligo(dT)-cellulose (P-L Biochemical, type 77F) under anvendelse af den af fabrikanten anbefalede procedure. Til Northern blot analyse blev 10 25 μg af hver poly(A)+ RNA behandlet med glyoxal [Thomas, Methods Enzymol.

100, 255-266 (1983)] og underkastet agarosegelelektroforese i en puffer indeholdende 10 mM natriumphosphat, pH 7,0. Bethesda Research Laboratory’s RNA-stige blev anvendt som molekylvægtmarkør. RNA'erne blev duppet over på et nitrocellulosepapir, som derpå blev opvarmet i 2 timer ved 80 °C.

30 Insertions-DNA'en fra AP9-klonen blev radiomærket med 32P ved hak-translation og anvendtes som probe [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Model, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)]. Afdupningen blev hybridiseret med 5 x 106 cpm af proben i 5 ml af en opløsning indeholdende 50% formamid, 5X SSC, 50 mM natriumphosphat, pH 7,0, 35 250 pg/ml denatureret laksesperm-DNA og 1X Denhardt’s opløsning ved 42

°C i 16 timer. Filteret blev vasket i 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 2X SSC

12 DK 174754 B1 ved stuetemperatur 3 gange, hver gang i 5 minutter, og i 0,1% SDS, 0,2 X SSC ved 50 °C to gange, hver gang i 5 minutter. Nitrocellulosepapiret blev lufttørret og derefter autoradiograferet i 3 dage ved -70 °C under anvendelse af Kodak XAR-5-film og intensiveringsskærm.

5

Andre rekombinant-DNA-metoder

Fremstilling af klonet Ågtll DNA, subkloning i pUC19-plasmid og M13mp18-vektor, frembringelse af deletion ved exonuclease I Il-nedbrydning og DNA-10 sekvensering ved dideoxymetoden [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6776-6780 (1977)] blev gennemført som beskrevet af Wun og Kretzmer, ovenfor.

Programmet FASTP skrevet af Lipman og Pearson, Science 227,1435-1441 15 (1985) blev anvendt til at identificere homologe familier af proteiner fra Natio nal Biomedical Research Foundation Sequence Data Bank (frigivet 13. juni 1987) og til at stille sekvenserne på linie med den homologe familie.

RESULTATER

20

Screening af cDNA-biblioteker

En række cellelinier blev screenet for tilstedeværelsen af TFI i det konditionerede substrat, og det viste sig, at adskillige lever-afledte cellelinier, Chang-25 levercelle, HepG2 hepatoma og SK-HEP-1 hepatoma, secernerer TFI i kultur. Til at begynde med anvendtes et antiserum over for TFI til at screene et humant fetal-lever-Agtll cDNA-bibliotek (106 plaque-dannende enheder), og der blev opnået 15 immunologisk positive kloner. Herefter anvendtes samme metode til at screenee et placenta-Agtll cDNA-bibliotek. Ud af 10® plaque-30 dannende enheder opnåedes 10 immunologisk positive kloner. Disse kloner blev plaque-renset, og lysaterne af de rensede kloner prøvet for TFI-funktionel aktivitet. De isopropylthiogalactosid-inducerede phag-lysater blev absorberet på nitrocellulosepapiret og screenet for den 125l-faktor Xa-bindende aktivitet. Fig. 1 viser, at visse af disse immunologisk positive kloner 35 udviste evne til at binde 125l-faktor Xg på nitrocellulosepapiret, I alt udviste tre ud af 15 immunologisk positive fetal-lever-kloner, og 4 ud af 10 immunologisk * 13 DK 174754 B1 positive placentakloner 125l-faktor Xa-bindende aktivitet. Disse immunologisk og funktionelt positive kloner blev nedbrudt med EcoR1, og størrelsen af in-sertionerne blev bestemt ved gelelektroforese. Én klon fra det placentale bibliotek (AP9) havde en insertion på tilnærmelsesvis 1,4 kb, medens alle de 5 andre kloner indeholdt insertioner på tilnærmelsesvis 1,0 kb. Delvis DNA-sekvensering har vist, at 1,0 kb-klonerne indeholder sekvenser, der er identiske med en del af den længere 1,4 kb placentale klon (λΡ9). λΡ9 blev derfor udvalgt til fuldstændig sekvensering.

10 Nucleotidsekvens og forudsagt proteinsekvens af TFI cDNA-isolat AP9-klonen blev underkastet restriktionskortlægning, M13-subkloning og sekvensering således som angivet i fig. 2. Hele sekvensen blev bestemt på begge strenge ved hjælp af exonuclease III deletionsmetoden [Henikofff, Ge-15 ne 28, 351-359 (1984)] og viste sig at bestå af 1432 baser i længden. Sekvensen er angivet i fig. 3. Den indeholder en 5’-ikke-kodende region på 133 baser, en åben læseramme på 912 nucleotider, og en 3’-ikke-kodende region på 387 nucleotider. Den første ATG forekommer ved nucleotid 134 i sekvensen TAGATGA, der var tæt efterfulgt af en anden ATG ved nucleotid 146 i 20 sekvensen ACAATGA. Disse er muligvis startsekvenserne, selv om de er forskellige fra den foreslåede consensussekvens for start af eukaryotisk ribosom, ACCATGG [Kozak, Cell 44, 283-292 (1986)]. 28 aminosyrer går forud for en sekvens svarende til N-terminalen af det modne protein. Længden og sammensætningen af den hydrofobe del af disse 28 aminosyrer er typiske for 25 signalsekvenser [Von Heijne, Eur. J. Biochem. 133, 17-21 (1983); J. Mol.

Biol. 184, 99-105 (1985)]. En signalpeptidase spalter muligvis ved Ala2e-Asp29 til dannelse af et modent protein. Den forudsagte sekvens for moden TFI består af 276 aminosyrer, der indeholder 18 cysteinrester og 7 methio-ninrester. Den beregnede masse på 31 950 dalton baseret på den deducere-30 de proteinsekvens for moden TFI er noget lavere end de 37-40 kDa bedømt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese af isoleret protein, og forskellen afspejler sandsynligvis glycosyleringsbidraget til mobiliteten af det naturlige protein. Den deducerede proteinsekvens svarende til det modne protein indeholder tre potentielle N-forbundne glycosyleringssteder med se-35 kvensen Asn-X-Thr/Ser (aminosyrepositioneme 145, 195 og 256). Aminosy-resekvensanalyse af renset hel TFI og to isolerede proteolytiske fragmenter 14 DK 174754 B1 / stemmer nøjagtigt overens med den fra cDNA-sekvensen decucerede proteinsekvens (fig. 3, understreget), hvilket indicerer, at den isolerede cDNA-klon koder for TFI. Den 3’-ikke-kodende region er A+T-rig (70% A+T). Hverken consensus-polyadenyleringssignalet, AATAAA [Proudfoot and Brownlee, Na-5 ture 252, 359-362 (1981)], eller poly A-halen fandtes i denne klon, hvilket muligvis skyldes kunstigt opstået tab af en del af den 3’-terminale del under konstruktionen af biblioteket.

Ladningsfordeling, hydrofobicitet/hydrofilicitet og indre homologi 10

Den translaterede aminosyresekvens af TFI indeholder 27 lysinrester, 17 ar-gininrester, 11 asparaginsyrerester og 25 glutaminsyrerester. Ladningsfordelingen langs proteinet er højst uensartet som angivet i fig. 4. Signalpeptidre-gionen indeholder to positivt ladede lysinrester med 26 neutrale rester. Den 15 aminoterminale region af det modne protein indeholder en højt negativt ladet strækning. Seks af de første 7 rester er enten asparaginsyre eller glutaminsy-re, der tæt følges af to mere negativt ladede aminosyrer neden herfor, inden en positivt ladet lysinrest dukker op. Centerdelen af molekylet er generelt negativt ladet. Ved carboxyterminalen er der en højt positivt ladet del. Aminosy-20 rerne 265-293 af TFI indeholder 14 positivt ladede aminosyrerester, herunder en sekvens på 6 efter hinanden følgende arginin-lysin-rester.

Den forudsagte hydrofilitets/hyd rof o b i ci tets prof i I af TFI-proteinet er angivet i fig. 5. Signalpeptidet indeholder en højt hydrofob region som forventet. Re-25 sten af molekylet synes snarere at være hydrofilt.

Den translaterede aminosyresekvens af TFI indeholder adskillige specielle domæner. Udover det højt negativt ladede N-terminale domæne og det højt negativt ladede C-terminale domæne består centerdelen af tre homologe 30 domæner, der har de typiske sekvenser for inhibitorer af Kunitz-type (se nedenfor).

Homologi med andre proteiner

35 Ved at afsøge National Biomedical Research Foundation sekvensdatabasen blev det fundet, at det N-terminale domæne og C-terminale domæne af TFI

DK 174754 B1 15 ikke udviser signifikant homologi med andre kendte proteiner. De tre interne homologe domæner er imidlertid hver for sig homologe med sekvenser af andre basale proteaseinhibitorer, herunder basal bovin pancreas-proteaseinhibitor (aprotinin), basale gift-proteaseinhibitorer og inter-a-trypsin-5 inhibitorer (fig. 6). Det er bemærkelsesværdigt, at disulfidbindingsstruktur er stærkt bevaret i alle disse tre inhibitorer. Baseret på disse homologier er det klart, at TFI hører til den basale proteaseinhibitor-gen-superfamilie.

Northern blotting 10

Poly(A)+ RNA'er blev renset fra TFI-producerende lever-afledte cellelinier, Chang-levercelle, HepG2 hepatomaceller og SK-HEP-1 hepatomaceller. Po-ly(A)+ RNA'erne blev opløst ved denaturerende agarosegelelektroforese, overduppet på et nitrocellulosepapir og probeundersøgt med 32P-mærket 15 TFI-cDNA (AP9). Som vist i fig. 7 blev der observeret to større hybridise-ringsbånd, der svarer til mRNA'er på 1,4 kb og 4,4 kb, i alle tre afprøvede cellelinier. Adskillige andre cellelinier blev undersøgt, som ikke frembragte detekterbare mængder af TFI, og hvori der ikke blev fundet nogen hybridise-ring med proben (data ikke vist).

20

Forskellige andre eksempler vil efter læsning af denne beskrivelse være indlysende for fagmanden uden at gå uden for opfindelsens rammer. Sådanne yderligere eksempler skal også anses for inkluderet i opfindelsen som defineret ved de efterfølgende krav.

Claims (16)

1. Human vævsfaktorinhibitor (TFI) med den i Fig. 3 på tegningerne viste proteinaminosyresekvens.

2. Human vævsfaktorinhibitor ifølge krav 1 som er uglycosyleret.

3. Human vævsfaktorinhibitor ifølge krav 1 som er glycosyleret.

4. Isoleret og renset antistof der har en bindingsspecificitet for vævsfaktorinhibitor (TFI) med en aminosyresekvens som vist i Fig. 3.

5. Antistof ifølge krav 4 som er konjugeret til en immunoaffini-tetsmatrix.

6. Antistof ifølge krav 5, hvor den nævnte immunoaffinitetsmatrix er "Sepharose® 4B".

7. Fremgangsmåde til anvendelse af en TFI-peptid-kolonne til at oprense et antistof over for den i Fig. 3 på tegningerne viste proteinaminosyresekvens.

8. Fremgangsmåde til detektion af et første polypeptid i et biologisk fluidum, hvor det nævnte første polypeptid er valgt blandt TFI og et polypeptid omfattende et eller flere Kunitz-domæner af TFI, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: (a) man bringer det nævnte fluidum i kontakt med et andet polypep-2 o tid der har en bindingsspecificitet for det nævnte første polypeptid, og (b) man prøver for tilstedeværelsen af det nævnte andet polypeptid for at bestemme niveauet af det nævnte første polypeptid.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvor det nævnte andet polypeptid er et antistof. 2 5

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvor det nævnte andet polypeptid er factor Xa. DK 174754 B1

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9 eller 10, hvor det nævnte andet polypeptid er radiomærket.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor det nævnte andet polypeptid er 125l-mærket factor Xa.

13. Fremgangsmåde til detektion af et første polypeptid i et biologisk fluidum, hvor det nævnte første polypeptid er valgt blandt TFI og et polypeptid omfattende et eller flere Kunitz-domæner af TFI, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: (a) man bringer det nævnte fluidum i kontakt med et antistof der har 10 en bindingsspecificitet for det nævnte første polypeptid, og et andet polypeptid der er i stand til at binde det nævnte antistof, og (b) man prøver for tilstedeværelsen af det nævnte andet polypeptid for at bestemme niveauet af det nævnte første polypeptid.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, hvor det nævnte andet polypep-15 tid er et antistof.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13, hvor det nævnte andet polypeptid er radiomærket.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 8 eller 13, hvor det nævnte biologiske fluidum er konditioneret cellekulturmedium.