DK175431B1 - Antistoffer som binder fragmenter af vævsfaktorinhibitor (TFI), sammensætninger omfattende disse antistoffer, og fremgangsmåde til anvendelse af en immunoaffinitetsmatrix omfattende et sådant antistof til at oprense et polypeptid fra et biologisk fluidum - Google Patents

Description

DK 175431 B1 j ' i

Antistoffer som binder fragmenter af vævsfaktorinhibitor (TFI), sammensætninger omfattende disse antistoffer, og fremgangsmåde tii anvendelse af en immunoaffinitetsmatrix omfattende et sådant antistof til at oprense et polypeptid fra et biologisk fluidum 5

Den foreliggende opfindelse angår en koagulationsinhibitor betegnet vævsfaktorinhibitor (TFI) og alternativt som lipoproteinassocieret koagulationsinhibitor (LACI) Mere specielt angår opfindelsen en cDNA-klon, der repræsenterer i det væsentlige hele TFI-forbindelsen.

10

OPFINDELSENS BAGGRUND

Koagulationsprocessen, der forekommer i pattedyrblod, omfatter to adskilte systemer - de såkaldte interne og eksterne systemer. Sidstnævnte system aktiveres, når blodet udsættes for vævsthromboplastin (faktor III), i det efter-15 følgende betegnet vævsfaktor (TF). Vævsfaktor er et lipoprotein, der forekommer i plasmamembranen af en hel række celletyper, idet hjernen og lungerne specielt er rige herpå. Ved at komme i kontakt med TF danner plasmafaktor VII eller dens aktiverede form, faktor VIla, et calciumafhængigt kompleks med TF, der herefter proteolytisk aktiverer faktor X til faktor Xg, og fak-20 tor IX til faktor IXa.

Tidlige undersøgelser over reguleringen af TF-initieret koagulering viste, at inkubation af TF (i urensede vævsthromboplastin-præparater) med serum hæmmede dens aktivitet in vitro og forhindrede dens dødelige virkning, når den blev infunderet i mus. Yderligere undersøgelser af Hjort, Scand. J. din.

25 Lab. Invest. 9, Suppl. 27, 76-97 (1957) bekræftede og videreudviklede tidligere arbejde inden for dette område og førte til den konklusion, at en hæmmende del i serum genkender faktor VII-TF-komplekset. I overensstemmelse med denne hypotese er de kendsgerninger, at hæmningen af TF, der forekommer i plasma, kræver tilstedeværelsen af Ca2+ (der også er nødvendig 3 o for bindingen af faktor Vll/Vlla til TF), og at hæmningen kan forhindres og/eller vendes om ved chelatering af divalente kationer med EDTA. Nye undersøgelser har vist, at ikke alene faktor Vlla, men også katalytisk aktiv faktor Xa og en yderligere faktor er nødvendig for opnåelsen af TF-inhibition i plas- I DK 175431 B1

I 2 I

I ma eller serum. Se Broze og Miletich, Blood 69,150-155 (1987) og Sanders I

et al., Ibid. 66, 204-212 (1985). Denne yderligere faktor, heri defineret som I

I vævsfaktorinhibitor (TF!) og alternativt som lipoproteinassocieret koagulati- I

I onshæmmer (LACI) forefindes i bariumabsorberet plasma og synes at være I

I 5 associeret med lipoproteiner, da TFI-funktionel aktivitet udskilles med lipopro- I

I teinfraktionen, der flyder ovenpå, når serum centrifugeres ved en massefylde I

I på 1,21 g/cm3. Ifølge Broze og Miletic, supra, og Proc. Natl. Acad. Sci. USA I

I 84,1886-1890 (1987) udskiller HepG2-celler (en human hepatomacellelinie) I

I en hæmmende del med samme egenskaber som den TFI, der forefindes i I

I ίο plasma. I

Η I EP offentliggørelsesskrift nr. 300 988 beskrives en renset vævsfaktorinhibi- I tor (TFI), der udskilles af HepG2-celler. Den viste sig at forefindes i to former, I en TFIi, der vandrer ved cirka 37000-40000 dalton, og en TFI2, der vandrer I ved 25000-26000 dalton, bestemt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid- I 15 gel-elektroforese (SDS-PAGE). En delvis N-terminal aminosyresekvens for TFI blev kortlagt som:

I 1 15 I

X-X-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-lle-lle-Thr-Asp-Thr-Glu- 16 27 I 20 Leu-Pro-Pro-Leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe-(Phe)-Ala I hvor X-X ikke var blevet bestemt. Indholdet af denne ansøgning betragtes I som inkorporeret i denne beskrivelse ved reference.

I KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

I I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er den fuldstændige I 25 kodesekvens af en cDNA-klon, der i det væsentlige repræsenterer vævsfak- torinhibitor (TFI) af fuld størrelse, blevet udviklet.

I Først blev humane placentale og fetal lever-Agtll-cDNA-biblioteker screenet med et polyklonalt kaninantiserum frembragt over for en renset TFI. Immuno- I logisk positive kloner blev yderligere screenet for 125l-faktor Xa-bindende virk- I 30 ning. Der blev opnået syv kloner, der var immunologisk og funktionelt aktive.

Den længste klon, placenta-afledt ΛΡ9, var 1,4 kilobaser (kb) lang, mens de ___;_; · ·— ϊίτ-.τ··.;.,^.^—·τβπτ. - ·" ν · Τ'. .♦:*-· ··?=?·?►♦_Jaig.jal.'.i'T'ry Ύ ^.^rx.T'J.vim DK 175431 B1 3 -s andre seks havde en længde på 1,0 kb. Delvis DNA-sekvensering viste, at 1,0 kb klonerne havde sekvenser identiske med en del af den længere 1,4 kb klon. Nucleotidsekvensanalyseviste, atAP9 bestod afen 1432 basepar(pb) cDNA-insertion, der omfatter en 5’-ikke-kodende region på 133 bp, en åben 5 læseramme på 912 bp, en stopkodon og en 3'-ikke-kodende region på 384 bp.

cDNA-sekvensen koder for et 31 950 dalton protein på 276 aminosyrer, som omfatter 18 cysteinrester og 7 methioninrester. Den translaterede aminosy-resekvens viser, at et signalpeptid på cirka 28 aminosyrer kommer forud for 10 det modne TFI-protein. Det skal bemærkes, at det "modne” TFI er defineret til at omfatte både TFI og methionyl-TFI på grund af den translationelle ATG-kodon i den heri beskrevne AP9-klon.

Der er tre potentielle N-forbundne glycosyleringssteder i TFI-proteinet med sekvensen Asn-X-Ser/Thr, hvori X kan være en vilkårlig af de almindelige 20 15 aminosyrer. Disse steder er ved aminosyrepositionemé Asn 145, Asn 195 og Asn 256, når den første methioninrest efter den 5-ikke-kodende region betegnes aminosyreposition +1.

Den translaterede aminosyresekvens af TFI viser adskillige skelnelige domæner, herunder en højt negativt ladet N-terminal, en højt positivt ladet car-20 boxy-terminal og en mellemliggende del bestående af tre homologe domæner med sekvenser typiske for enzyminhibitorer af Kunitz-type. Baseret på en homologiundersøgelse synes TFI at være et medlem af den basale protea-seinhibitorgen-superfamilie.

Den oprindelige kilde for proteinmaterialet til frembringelse af cDNA-klon AP9 25 var humant placentavæv. Dette væv kan fås i udstrakt grad efter fødsel ved almindelige kirurgiske metoder. Agtll (Iac5 nin5 c1857 S100) anvendt heri er en velkendt og almindeligt tilgængelig lambda-phag-ekspressionsvektor.

Dens konstruktion og restriktionsendonucleasekort er beskrevet af Young og Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,1194-1198 (1983).

30 Northern blot analyse viste, at følgende leverafledte cellelinien Chang- levercelle, HepG2 hepatoma og SK-HEP-1 hepatoma, alle indeholdt to hovedarter af mRNA (1,4 og 4,4 kb), der hybridiserede med TFI-cDNA’en.

I DK 175431 B1

Kloningen af cDNA for TFI og udviklingen af hele dens proteinsekvens og I strukturelle domæner som omhandlet heri muliggør detaljerede strukturfunk- I tionelle analyser og tilvejebringer et grundlag for at studere dens biosynte- tiske reguleringer. Opfindelsen er således vigtig for lægevidenskaben ved I 5 undersøgelsen af koagulationen med hensyn til midler, der er i stand til at I hæmme faktor Xg og faktor Vlla/TF-enzymkompleks.

Den foreliggende opfindelse angår specielt antistoffer som binder fragmenter H af vævsfaktorinhibitor (TFI), som defineret i krav 1 -4.

H Desuden angår opfindelsen særlige udfcrelsesformer af disse antidtoffer, 10 som defineret i krav 6-9.

Endvidere angår opfindelsen sammensætninger omfattende disse antistoffer, som defineret i krav 4 og 5, og en fremgangsmåde til anvendelse af en im- H munoaffinitetsmatrix omfattende et sådant antistof til at oprense et polypeptid fra et biologisk fluidum, som defineret i krav 10.

I 15 DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

I Opfindelsen beskrives nu nærmere med henvisning til tegningen, på hvilken I Fig. 1 viser screeningen af Agtll-kloner med 125l-faktor Xa. Klonede phaglysa- I ter (0,1 ml) blev pletvis anbragt på et nitrocellulosepapir ved sugning under I anvendelse af et dot blot apparat. Nitrocellulosepapiret blev herefter pro- I 20 beundersøgt med 125l-faktor Xa og autoradiograferet som beskrevet nærme- I re. Kloner, der forekommer som mørke pletter, er positive kloner, der binder I 125l-faktor Xa. Kontrol Agtll (nedre højre hjørne) og andre kloner binder ikke I 125l-faktor Xg.

I Fig. 2 viser et partielt restriktionskort og sekvenseringsstrategi for AP9- I 25 insertioneme. Skalaen forneden angiver nucleotidpositionen. Den tykke I stang repræsenterer den kodende region. De tynde stænger repræsenterer I 5’- og 3-ikke-kodende regioner. Restriktionsendonuclease-stedeme blev be- kræftet ved nedbrydning. Pilene viser de overlappende M13-kloner, der blev I anvendt til at sekvensere cDNA’en.

. ......π-*-*—rvr- - --~^. - y - — --' " ^ ’ '—.’V·»·»·:- MUt^ DK 175431 B1 5

Fig. 3 viser nucleotid-sekvensen og den translaterede aminosyresekvens af I

den humane TFI-cDNA. Nucleotider er nummereret på den venstre side og aminosyrer på den højre side. De understregede sekvenser er uafhængigt blevet bekræftet ved aminosyresekvensanalyse af det rensede TFI-protein 5 og to Vs-protease + trypsin-nedbrudte peptider. Aminosyre + 1 blev tildelt den første methioninrest efter en stopkodon i den 5’-ikke-kodende region. Potentielle N-forbundne glycosyleringssteder er markeret med stjerner.

Fig. 4 er en grafisk afbildning, der viser ladningsfordelingen af aminosyrese-kvensen i TFI. Ladninger er beregnet fra den første rest til de i-ende rester og 10 vist ved den i-ende rest. Således er værdien i den i-ende position opsummeringen af alle ladninger fra den første rest til den i-ende rest, og forskellen i ladningerne mellem den i-ende og den j-te rest (j>i) er nettoladningen af fragmentet fra den i-ende til den j-te rest.

j

Fig. 5 er en grafisk afbildning, der viser hydrofobicitetsprofilen af TFI. Hydro-15 fobicitetsprofilen blev analyseret ved hjælp af et computerprogram, hvor hy-drofobicitetsindekset af aminosyreresterne er defineret som den dybde, hvortil en aminosyrerest er begravet inden i et protein (fra røntgen-krystallografiske data) [Kidera et al., J. Protein Chem. 4, 23-55 (1985)]. Hydrofobicitetsprofilen langs sekvensen blev udglattet under anvendelse af programmet 20 ICSSCU i IMSL Library [IMSL Library Reference Manuai, 9. udgave, Institute for Mathematical and Statistical Subroutine Library, Houston, Texas (1982)].

Fig. 6 viser en linieopstilling af de basale protease-inhibitordomæner af TFI med andre basale protease-inhibitorer. Alle sekvenserne bortset fra TFI blev opnået fra National Biomedical Research Foundation Protein Sequence Da-25 tabase (Georgetown University, Washington, D.C., U.S.A., frigivet 13. juni 1987). 1. Bovin basal proteaseinhibitor-precursor; 2. Bovint colostrum-trypsininhibitor; 3. Bovint serum-basal proteaseinhibitor; 4. Spiselig snegl-isoinhibitor K; 5. Rødehavsskildpadde-basal proteaseinhibitor (kun aminosy-reme 1-79 angivet); 6. Vestlig sandhugorm gift-basal proteaseinhibitor I; 7.

30 Ringhalsgift-basal proteaseinhibitor II; 8. Cape cobra gift-basal proteaseinhibitor II; 9. Russell’s hugorm gift-basal proteaseinhibitor II; 10. Sandhugorm gift-basal proteaseinhibitor III; 11. Østlig grøn mamba gift-basal proteaseinhibitor I homolog; 12. Sort mamba gift-basal proteaseinhibitor B; 13. Sort I DK 175431 B1 mamba gift-basal proteaseinhibitor E; 14. Sort mamba gift-basal protease- I inhibitor I; 15. Sort mamba gift-basal proteaseinhibitor K; 16. β-1- I Bungarotoxin B kæde (mindre); 17. β-1-Bungarotoxin B kæde (større); 18. β- 2-Bungarotoxin B kæde; 19. Heste-inter-a-trypsininhibitor [aminosyreme 1- I 5 57(1); 58-123(2)]; 20. Svine-inter-a-trypsininhibitor [aminosyreme 1-57(1); I 58-123(2)]; 21. Bovin inter-a-trypsininhibitor [aminosyreme 1-57(1); 58- I 123(2)]; 22. Human α-1-mikroglobulin/inter-a-trypsininhibitor-precursor [ami- I nosyreme 227-283(1); 284-352(2)]; 23. TFI [aminosyreme 47-117(1); 118- I 188(2); 210-280(3)]. Mellemrum blev inkluderet i 16,17,18 for at opnå bed- I ίο ste overensstemmelse. Der er anvendt standard et-bogstavs-koder for ami- nosyrer.

I Fig. 7 viser Northern blot analysen af RNA'er fra 3 lever-afledte cellelinier. 10 I pg poly(A)+ RNA blev anvendt pr. bane. Bane 1: Chang-levercelle; bane 2: I SK-HEP-1 hepatomacelle; bane 3: HepG2 hepatomacelle.

15 I denne beskrivelse med krav er anvendt biokemisk standardnomenclatur, hvor nucleotidbaseme er betegnet som adenin (A); thymin (T); guanin (G); og I cytosin (C). Tilsvarende nucleotider er for eksempel deoxyguanosin-5’- triphosphat (dGTP). Som det er almindeligt af nemhedsgrunde ved den struk-

I tureile afbildning af en DNA-nucleotidsekvens, er kun én streng vist, hvori A

I 20 på én streng indebærer T på dens komplementære streng, og G indebærer I C. Aminosyrer er vist enten ved tre bogstavs- eller et-bogstavsforkortelser på I følgende måde: I Forkortet betegnelse Aminosyre I A Ala Alanin I 25 C Cys Cystein I D Asp Asparaginsyre E Glu Glutaminsyre F Phe Phenylalanin | G Gly Glycin 30 H His Histidin I I Ile Isoleucin I K Lys Lysin I L Leu Leucin 7 DK 175431 B1 M Met Methionin N Asn Asparagin P Pro Prolin Q Gin Glutamin 5 R Arg Arginln S Ser Serin T Thr Threonin V Val Valin W Trp Tryptophan ίο Y_lyr__Tyrosin_

Almindeligt tilgængelige restriktionsendonucleaser beskrevet heri har følgende sekvenser og (angivet ved pile) spaltningsmønstre: i

EcoR1 GAATTC

15 GI I AA G

r i

Ssp1 AAT AAT

TTATAA

20 T

i

Cla1 ATCGAT

TAGCTA

T

25 i

Alu1 AGCT

TCGA

t l

30 Stu1 AGGCCT

' TCCGGA T

For at belyse specifikke foretrukne udførelsesformer af opfindelsen nærmere ér angivet følgende eksempler på præparativt laboratoriearbejde.

I DK 175431 B1 I EKSEMPEL 1

Materialer

Human placenta- og fetal lever-cDNA-biblioteker blev opnået fra Clonetech.

Protoblot-immunoscreenings-udstyr blev indkøbt fra Promega Biotech. Re- 5 striktionsenzymer var fra New England Biolabs. Kalvetarm-alkalisk phospha- tase, T4 DNA-ligase, DNA-polymerase I (Klenow), exonuclease III og S1- nuclease var fra Boehringer Mannheim. dNTP var fra P.L. Biochemicals. 5’- [a-35S]-thio-dATP (600 Ci/mml) var fra Amersham. Sekvenseringsudstyr (se-

quenase) var fra United States Biochemicals. Chang-leverceller (ATCC CCL

I 10 13) og HepG2 hepatomaceller (ATCC HB 8065) blev opnået fra the Ameri- can Type Culture Collection. SK-HEP-1 hepatoma-celler stammede oprinde- H ligt fra en lever-adenocarcinoma fra G. Trempe fra Sloan-Kettering Institute for Cancer Research i 1971 og er nu udbredt og let tilgængelig.

I 125l-faktor Xg blev fremstillet ved radiomærkning under anvendelse af lodo- 15 gen. Den specifikke aktivitet var 2000 dpm/ng. Mere end 97% af radioaktivi- teten kunne udfældes med 10% trichloreddikesyre (TCA). Det ioderede pro- tein bibeholdt >80% af deres katalytiske aktivitet over for Spectrozyme Xg (American Diagnostica Product).

I En anti-TFI-lg-"Sepharose® 4B"-søjle blev fremstillet på følgende måde: Et I 20 peptid (betegnet TFI-peptid) indeholdende en sekvens svarende til aminosy- I resekvensen 3-25 af det modne TFI blev syntetiseret under anvendelse af

Biosystems fastfase-peptidsyntese-system. TFI-peptidet (5 mg) konjugere- I des til 10 mg Keyhole albueskæl-hæmocyanin ved hjælp af glutaraldehyd. To hvide kaniner af New Zealand race immuniseredes ved intradermal injektion I 25 af et homogenat indeholdende 1 ml Freund’s complete adjuvant og 1 ml kon- jugat (200 pg TFI-peptid). En måned senere fik kaninerne atter injektion med et homogenat indeholdende 1 ml Freund's incomplete adjuvant og 1 ml kon- I jugat (100 pg konjugat). Antiserum blev opsamlet hver uge i tre måneder, og I yderligere injektioner blev udført en gang om måneden. For at isolere speci- 30 fikke antistoffer over for TFI-peptidet blev antiserum kromatograferet på en

I TFI-peptid-"Sepharose 4B”-søjle. Søjlen blev vasket med 10 rumfang PBS

I (0,4 M NaCI-0,1 M benzamidin-1% Triton® X-100"), og samme opløsning I uden Triton X-100”. Antistoffet blev elueret med 0,1 M glycin/HCI, pH 2,2, og ____ . ..-.. _: ,.ν -is _· - ^ ^ΠΤιΐ —> DK 175431 Β1 9 derpå straks neutraliseret ved tilsætning af 1/10 rumfang Tris-OH og dialyseret over for saltvandsopløsning. Det isolerede antistof blev koblet til cyan-bromid-aktiveret "Sepharose 4B" efter fabrikantens (Pharmacia) anvisninger og anvendt til at isolere TFI fra celledyrkningssubstratet.

5 Chang-leverceller blev dyrket ved metoden, der tidligere er beskrevet af Bro-ze og Miletich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,1886-1890 (1987). Det konditionerede substrat blev kromatograferet på anti-TFI-lg-"Sepharose 4B"-søjlen.

Søjlen blev vasket med 10 rumfang PBS-1% Triton X-100" og PBS. Den bundne TFI elueredes med 0,1 M glycin-HCI, pH 2,2. Immunoaffinitetsisoleret io TFI blev renset yderligere ved præparativ natriumdodecylsulfat-polyacryl-amidgel-elektroforese (Savants apparat). Aminosyreanalyse af slutproduktet viste den samme amino-endestillede sekvens som den TFI, der var isoleret fra HepG2-celler som beskrevet i den sideløbende danske patentansøgning PA1988 04135. Det isolerede Chang-levercelle-TFI anvendtes herefter til at 15 immunisere kaniner ved den ovenfor beskrevne immuniseringsforskrift. Det opnåede antiserum havde en titer på cirka 100 pg/ml ved dobbelt immunodif-fusions-prøvningen. Dette antiserum anvendtes ved immuno-screeningen af Agtll cDNA-biblioteker.

Metoder 2 o Isolering af cDNA-kloner

Metoder til at afsøge placenta- og fetal lever-cDNA-biblioteker med antistof, plaque-rensning og fremstilling af λ-phag-lysat og DNA var som beskrevet af Wun og Kretzmer, FEBS Lett. 1,11-16 (1987). Antiserumet blev prae-adsorberet med BNN97 Agtll-lysat og fortyndet 1/500 til screening af bibliote-25 ket.

Screening for faktor Xa-bindende aktivitet

Rekombinante proteiner induceret med isopropyl-p-thio-galactosid fra immu-nopositive λ-phag isolater eller fra kontrol Agtll blev screenet for faktor Xa-bindende aktivitet. A-phag-lysateme (0,1 ml) blev filtreret gennem et nitrocel- 3 o lulosepapir under anvendelse af et dot-blot-apparat (Bio Rad). Herefter blev nitrocellulosepapiret neddykket og omrørt i phosphatpufret saltvand indehol- I DK 175431 B1

I ίο I

dende 5 mg/ml bovint serumalbumin og 2,5 mg/ml bovint gammaglobulin ved stuetemperatur i 1 time. Opløsningen blev erstattet med 125l-faktor Xa (1,0 x 106 cmp/ml) opløst i den samme opløsning tilsat 0,1 mg/ml heparin, og omrø- ringen fortsattes i yderligere 1 time. Herefter blev nitrocellulosepapiret vasket 5 med phosphatpufret saltvand indeholdende 0,05% "Tween® 20". Vaskepuf- H feren udskiftedes hvert femte minut, fire gange. Herefter blev nitrocellulose- papiret lufttørret og præpareret til autoradiografi under anvendelse af "Kodak I XR5"-film. Filmen blev fremkaldt efter en uges eksponering.

Fremstilling af poly(A)+ RNA og Northern blotting ίο Totale RNA'er blev præpareret fra dyrket Chang-levercelle, HepG2 hepato- macelle og SK-HEP-1 hepatomacelle under anvendelse af natriumperchlorat- ekstraktionsmetoden beskrevet af Lizardi og Engelberg, Anal. Biochem. 98, 116-122 (1979). Poly(A)+ RNA-præparater blev isoleret ved batchvis adsorp- tion på oligo(dT)-cellulose (P-L Biochemical, type 77F) under anvendelse af 15 den af fabrikanten anbefalede procedure. Til Northern blot analyse blev 10 pg af hver poly(A)+ RNA behandlet med glyoxal [Thomas, Methods Enzymol.

I 100,255-266 (1983)] og underkastet agarosegelelektroforese i en puffer in- deholdende 10 mM natriumphosphat, pH 7,0. Bethesda Research Laborato- ry’s RNA-stige blev anvendt som molekylvægtmarkør. RNA’eme blev duppet I 20 over på et nitrocellulosepapir, som derpå blev opvarmet i 2 timer ved 80 °C.

I Insertions-DNA'en fra ÅP9-klonen blev radiomærket med 32P ved hak-

H translation og anvendtes som probe [Maniatis et al., Molecular Cloning: A

I Laboratory Model, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)].

I Afdupningen blev hybridiseret med 5 x 106 cpm af proben i 5 ml af en opløs- 25 ning indeholdende 50% formamid, 5X SSC, 50 mM natriumphosphat, pH 7,0, 250 μg/ml denatureret laksesperm-DNA og 1X Denhardt’s opløsning ved 42

I °C i 16 timer. Filteret blev vasket i 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS), 2X SSC

I ved stuetemperatur 3 gange, hver gang i 5 minutter, og i 0,1 % SDS, 0,2 X

I SSC ved 50 °C to gange, hver gang i 5 minutter. Nitrocellulosepapiret blev I 3 0 lufttørret og derefter autoradiograferet i 3 dage ved -70 °C under anvendelse af Kodak XAR-5-film og intensiveringsskærm.

11 DK 175431 B1

Andre rekombinant-DNA-metoder

Fremstilling af klonet Agtll DNA, subkloning i pUC19-plasmid og M13mp18-vektor, frembringelse af deletion ved exonuclease I Il-nedbrydning og DNA-sekvensering ved dideoxymetoden [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5 83, 6776-6780 (1977)] blev gennemført som beskrevet af Wun og Kretzmer, ovenfor.

Programmet FASTP skrevet af Lipman og Pearson, Science 227,1435-1441 (1985) blev anvendt til at identificere homologe familier af proteiner fra National Biomedical Research Foundation Sequence Data Bank (frigivet 13. juni 10 1987) og til at stille sekvenserne på linie med den homologe familie.

RESULTATER

Screening af cDNA-biblioteker

En række cellelinier blev screenet for tilstedeværelsen af TFI i det konditionerede substrat, og det viste sig, at adskillige lever-afledte cellelinier, Chang-15 levercelle, HepG2 hepatoma og SK-HEP-1 hepatoma, secernerer TFI i kultur. Til at begynde med anvendtes et antiserum over for TFI til at screene et humant fetal-lever-Agtll cDNA-bibliotek (106 plaque-dannende enheder), og der blev opnået 15 immunologisk positive kloner. Herefter anvendtes samme metode til at screenee et placenta-Agtll cDNA-bibliotek. Ud af 106 plaque-20 dannende enheder opnåedes 10 immunologisk positive kloner. Disse kloner blev plaque-renset, og lysateme af de rensede kloner prøvet for TFI-funktionel aktivitet. De isopropylthiogalactosid-inducerede phag-lysater blev absorberet på nitrocellulosepapiret og screenet for den 125l-faktor Xa-bindende aktivitet. Fig. 1 viser, at visse af disse immunologisk positive kloner 25 udviste evne til at binde 125l-faktor Xg på nitrocellulosepapiret. I alt udviste tre ud af 15 immunologisk positive fetal-lever-kloner, og 4 ud af 10 immunologisk positive placentakloner 125l-faktor Xa-bindende aktivitet. Disse immunologisk og funktionelt positive kloner blev nedbrudt med EcoR1, og størrelsen af in-sertionerne blev bestemt ved gelelektroforese. Én klon fra det placentale bib-30 liotek (AP9) havde en insertion på tilnærmelsesvis 1,4 kb, medens alle de andre kloner indeholdt insertioner på tilnærmelsesvis 1,0 kb. Delvis DNA-sekvensering har vist, at 1,0 kb-kloneme indeholder sekvenser, der er identi-

I DK 175431 B1 I

I 12 I

I ske med en del af den længere 1,4 kb placentale klon (λΡ9). ΛΡ9 blev derfor I

I udvalgt til fuldstændig sekvensering. I

I Nucleotidsekvens og forudsagt proteinsekvens af TFI cDNA-isolat I

I AP9-klonen blev underkastet restriktionskortlægning, M13-subkloning og se- I

I 5 kvensering således som angivet i fig. 2. Hele sekvensen blev bestemt på I

I begge strenge ved hjælp af exonuclease III deletionsmetoden [Henikofff, Ge- I

I ne 28, 351-359 (1984)] og viste sig at bestå af 1432 baser i længden. Se- I

I kvensen er angivet i fig. 3. Den indeholder en 5’-ikke-kodende region på 133 I

I baser, en åben læseramme på 912 nucleotider, og en 3’-ikke-kodende region I

I 10 på 387 nucleotider. Den første ATG forekommer ved nucleotid 134 i sekven- I

I sen TAGATGA, der var tæt efterfulgt af en anden ATG ved nucleotid 146 i I

I sekvensen ACAATGA. Disse er muligvis startsekvenserne, selv om de er I

I forskellige fra den foreslåede consensussekvens for start af eukaryotisk ribo- I

I som, ACCATGG [Kozak, Cell 44, 283-292 (1986)]. 28 aminosyrer går forud I

I 15 for en sekvens svarende til N-terminalen af det modne protein. Længden og I

I sammensætningen af den hydrofobe del af disse 28 aminosyrer er typiske for I

I signalsekvenser [Von Heijne, Eur. J. Biochem. 133,17-21 (1983); J. Mol. I

I Biol. 184, 99-105 (1985)]. En signalpeptidase spalter muligvis ved Ala28- I

I Asp2g til dannelse af et modent protein. Den forudsagte sekvens for moden I

I 20 TFI består af 276 aminosyrer, der indeholder 18 cysteinrester og 7 methio- I

I ninrester. Den beregnede masse på 31 950 dalton baseret på den deducere- I

I de proteinsekvens for moden TFI er noget lavere end de 37-40 kDa bedømt I

I ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese af isoleret protein, I

I og forskellen afspejler sandsynligvis glycosyleringsbidraget til mobiliteten af I

I 25 det naturlige protein. Den deducerede proteinsekvens svarende til det modne I

I protein indeholder tre potentielle N-forbundne glycosyleringssteder med se- I

I kvensen Asn-X-Thr/Ser (aminosyrepositioneme 145,195 og 256). Aminosy- I

I resekvensanalyse af renset hel TFI og to isolerede proteolytiske fragmenter I

I stemmer nøjagtigt overens med den fra cDNA-sekvensen decucerede prote- I

I 30 insekvens (fig. 3, understreget), hvilket indicerer, at den isolerede cDNA-klon I

I koder for TFI. Den 3-ikke-kodende region er A+T-rig (70% A+T). Hverken I

I consensus-polyadenyleringssignalet, AATAAA [Proudfoot and Brownlee, Na- I

I ture 252, 359-362 (1981)], eller poly A-halen fandtes i denne klon, hvilket mu- I

13 DK 175431 B1 ligvis skyldes kunstigt opstået tab af en del af den 3-terminale del under konstruktionen af biblioteket.

Ladningsfordeling, hydrofobicitet/hydrofilicitet og indre homologi

Den translaterede aminosyresekvens af TFI indeholder 27 lysinrester, 17 ar-5 gininrester, 11 asparaginsyrerester og 25 glutaminsyrerester. Ladningsfordelingen langs proteinet er højst uensartet som angivet i fig. 4. Signalpeptid regionen indeholder to positivt ladede lysinrester med 26 neutrale rester. Den aminoterminale region af det modne protein indeholder en højt negativt ladet strækning. Seks af de første 7 rester er enten asparaginsyre eller glutaminsy-10 re, der tæt følges af to mere negativt ladede aminosyrer neden herfor, inden en positivt ladet lysinrest dukker op. Centerdelen af molekylet er generelt negativt ladet. Ved carboxyterminalen er der en højt positivt ladet del. Aminosy-reme 265-293 af TFI indeholder 14 positivt ladede aminosyrerester, herunder en sekvens på 6 efter hinanden følgende arginin-lysin-rester.

15 Den forudsagte hydrofilitets/hydrofobicitetsprofil af TFI-proteinet er angivet i fig. 5. Signalpeptidet indeholder en højt hydrofob region som forventet. Resten af molekylet synes snarere at være hydrofilt.

Den translaterede aminosyresekvens af TFI indeholder adskillige specielle domæner. Udover det højt negativt ladede N-terminale domæne og det højt 20 negativt ladede C-terminale domæne består centerdelen af tre homologe domæner, der har de typiske sekvenser for inhibitorer af Kunitz-type (se nedenfor).

Homologi med andre proteiner

Ved at afsøge National Biomedical Research Foundation sekvensdatabasen 25 blev det fundet, at det N-terminale domæne og C-terminale domæne af TFI ikke udviser signifikant homologi med andre kendte proteiner. De tre interne homologe domæner er imidlertid hver for sig homologe med sekvenser af andre basale proteaseinhibitorer, herunder basal bovin pancreas-proteaseinhibitor (aprotinin), basale gift-proteaseinhibitorer og inter-a-trypsin-30 inhibitorer (fig. 6). Det er bemærkelsesværdigt, at disulfidbindingsstruktur er

I DK 175431 B1 I

I 14 I

I stærkt bevaret i alle disse tre inhibitorer. Baseret på disse homologier er det I

I klart, at TFI hører til den basale proteaseinhibitor-gen-superfamilie. I

I Northern blotting I

I Poly(A)+ RNA'er blev renset fra TFI-producerende lever-afledte cellelinier, I

I 5 Chang-levercelle, HepG2 hepatomaceller og SK-HEP-1 hepatomaceller. Po- I

I ly(A)+ RNA'erne blev opløst ved denaturerende agarosegelelektroforese, I

I overduppet på et nitrocellulosepapir og probeundersøgt med 32P-mærket I

I TFI-cDNA (λΡ9). Som vist i fig. 7 blev der observeret to større hybridise- I

I ringsbånd, der svarer til mRNA'er på 1,4 kb og 4,4 kb, i alle tre afprøvede I

I 10 cellelinier. Adskillige andre cellelinier blev undersøgt, som ikke frembragte I

I detekterbare mængder af TFI, og hvori der ikke blev fundet nogen hybridise- I

I ring med proben (data ikke vist). I

I Forskellige andre eksempler vil efter læsning af denne beskrivelse være ind- I

I lysende for fagmanden uden at gå uden for opfindelsens rammer. Sådanne I

I 15 yderligere eksempler skal også anses for inkluderet i opfindelsen som define- I

I ret ved de efterfølgende krav. I

Claims (10)

1. Isoleret og renset antistof som har en bindingsspecificitet for vævsfaktorinhibitor (TFI) med en aminosyresekvens som vist i Fig. 3 og binder til en vævsfaktorinhibitor (TFI)-region valgt blandt: 5 (a) de N-terminale aminosyrer 29-55 eller 31-53 i renset moden TFI som vist i Fig. 3; (b) de C-terminale aminosyrer 265-304 i renset moden TFI som vist i Fig. 3; (c) et V8 protease plus trypsin-nedbrudt peptid af TFI med sekvensen af aminosyreme 82-88 som vist i Fig. 3; 10 (d) et V8 protease plus trypsin-nedbrudt peptid af TFI med sekvensen af aminosyreme 153-166 som vist i Fig. 3; (e) aminosyreme 54-104 eller 47-117 i Fig. 3, som danner Kunitz domæne 1 i TFI; (f) aminosyreme 125-175 eller 118-188 i Fig. 3, som danner Kunitz domæne 15. i TFI; og (g) aminosyreme 217-267 eller 210-280 i Fig. 3, som danner Kunitz domæne 3 i TFI.

2. Isoleret og renset antistof ifølge krav 1, som har en bindingsspecifici- ' 20 tet for vævsfaktorinhibitor (TFI) med en aminosyresekvens som vist i Fig. 3 og som ikke binder et polypeptid valgt blandt bovin basal proteaseinhibitor-precursor, bovint colostrum-trypsininhibitor, bovint serum-basal proteaseinhi-bitor, spiselig snegl-isoinhibitorK, rødehavsskildpadde-basal proteaseinhibi-tor, vestlig sandhugorm gift-basal proteaseinhibitor I, ringhalsgift-basal pro-25 teaseinhibitor II, Cape cobra gift-basal proteaseinhibitor II, Russell’s hugorm gift-basal proteaseinhibitor II, sandhugorm gift-basal proteaseinhibitor III, østlig grøn mamba gift-basal proteaseinhibitor I homolog, sort mamba giftbasale proteaseinhibitorer B, E, I og K, β-1-bungarotoxin B kæde (mindre), β- 1-bungarotoxin B kæde (større), β-2-bungarotoxin B kæde, heste-inter-a- I DK 175431 B1 I I 16 I I trypsininhibitor (aminosyreme 1-57 og 58-123), svine-inter-a-trypsininhibitor I I (aminosyreme 1-57 og 58-123), bovin inter-a-trypsininhibitor (aminosyreme I 1-57 og 58-123), og human α-1-mikroglobulin/inter-a-trypsininhibitor-precur- I I sor (aminosyreme 227-283 og 284-352). I I 5 i

3. Antistof som har en bindingsspecificitet for et polypeptid omfattende I I en eller flere af de følgende regioner i TFI: I I (a) de N-terminale aminosyrer 29-55 eller 31-53 i renset moden TFI som vist I I i Fig. 3; I 10 (b) de C-terminale aminosyrer 265-304 i renset moden TFI som vist i Fig. 3; I (c) et V8 protease plus trypsin-nedbrudt peptid af TFI med sekvensen af I I aminosyreme 82-88 som vist i Fig. 3; I I (d) et V8 protease plus trypsin-nedbrudt peptid af TFI med sekvensen af I I aminosyreme 153-166 som vist i Fig. 3; I I 15 (e) aminosyreme 54-104 eller 47-117 i Fig. 3, som danner Kunitz domæne 1 I 'TFI; I (f) aminosyreme 125-175 eller 118-188 i Fig. 3, som danner Kunitz domæne I 2 i TFI; og I (g) aminosyreme 217-267 eller 210-280 i Fig. 3, som danner Kunitz domæne I 20 3 i TFI.

4. Sammensætning omfattende et antistof ifølge krav 1,2 eller 3 og et effektivt bærestof, fortyndingsmedium eller hjælpemiddel.

5. Sammensætning omfattende et antistof ifølge krav 1,2 eller 3 og en I opløsning. DK 175431 B1

6. Antistof ifølge krav 1,2 eller 3 som er et polyklonalt antistof.

7. Antistof ifølge krav 1, 2 eller 3 som er renset på en TFI-peptid- * kolonne. 5

8. Antistof ifølge krav 1,2 eller 3 konjugeret til en immunoaffinitetsmatrix.

9. Antistof ifølge krav 8, hvor den nævnte immunoaffinitetsmatrix er "Sepharose® 4B". 10

10. Fremgangsmåde til anvendelse af en immunoaffinitetsmatrix ifølge krav 8 ellert 9 til at oprense et polypeptid fra et biologisk fluidum. 4 t