DK173536B1 - cDNA-sekvens, som koder for modent humant vævsfaktorinhibitor-protein - Google Patents

Description

i DK 173536 B1 cDNA-sekvens, som koder for modent humant vaevsfaktorinhi-bi tor-protein

Den foreliggende opfindelse angår en koagulationsinhi-5 bitor betegnet vævsfaktorinhibitor (TFI) og alternativt som lipoproteinassocieret koagulationsinhibitor (LACI)

Mere specielt angår opfindelsen en cDNA-klon, der repræsenterer i det væsentlige hele TFI-forbindelsen.

10 OPFINDELSENS BAGGRUND

Koagulationsprocessen, der forekommer i pattedyrblod, omfatter to adskilte systemer - de såkaldte interne og eksterne systemer. Sidstnævnte system aktiveres, når blodet 15 udsættes for vævsthromboplastin (faktor III), i det efterfølgende betegnet vævsfaktor (TF). Vævsfaktor er et lipoprotein, der forekommer i plasmamembranen af en hel række celletyper, idet hjernen og lungerne specielt er rige herpå. Ved at komme i kontakt med TF danner plasma-20 faktor VII eller dens aktiverede form, faktor VIIa, et calciumafhængigt kompleks med TF, der herefter proteoly-tisk aktiverer faktor X til faktor Xa, og faktor IX til faktor IX3.

25 Tidlige undersøgelser over reguleringen af TF-initieret koagulering viste, at inkubation af TF (i urensede vævs-thromboplastin-præparater) med serum hæmmede dens aktivitet in vitro og forhindrede dens dødelige virkning, når den blev infunderet i mus. Yderligere undersøgelser af 30 Hjort, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 9, Suppl. 27, 76-97 (1957) bekræftede og videreudviklede tidligere arbejde inden for dette område og førte til den konklusion, at en hæmmende del i serum genkender faktor VII-TF-komplekset.

2 DK 173536 B1 I overensstemmelse med denne hypotese er de kendsgerninger, at hæmningen af TF, der forekommer i plasma, kræver tilstedeværelsen af Ca2+ (der også er nødvendig for bindingen af faktor V1I/VII3 til TF), og at hæmningen kan 5 forhindres og/eller vendes om ved chelatering af divalente kationer med EDTA. Nye undersøgelser har vist, at ikke alene faktor VIIa, men også katalytisk aktiv faktor Xa og en yderligere faktor er nødvendig for opnåelsen af TF-inhibition i plasma eller serum. Se Broze og Miletich, 10 Blood 69, 150-155 (1987) og Sanders et al., Ibid. 66, 204-212 (1985). Denne yderligere faktor, heri defineret som vævsfaktor-inhibitor (TFI) og alternativt som li-poproteinassocieret koagulationshæmmer (LACI) forefindes i bariumabsorberet plasma og synes at være associeret med 15 lipoproteiner, da TFI-funktionel aktivitet udskilles med lipoproteinfraktionen, der flyder ovenpå, når serum centrifugeres ved en massefylde på 1,21 g/cm3. Ifølge Broze og Miletic, supra, og Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1886-1890 (1987) udskiller HepG2-celler (en human hepato-20 macellelinie) en hæmmende del med samme egenskaber som den TFI, der forefindes i plasma.

I EP offentliggørelsesskrift nr. 300 988 beskrives en renset vævsfaktorinhibitor (TFI), der udskilles af HepG2-25 celler. Den viste sig at forefindes i to former, en TFIi, der vandrer ved cirka 37000-40000 dalton, og en TFI;, der vandrer ved 25000-26000 dalton, bestemt ved natriumdode-cylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE). En delvis N-terminal aminosyresekvens for TFI blev kortlagt 30 som: 1 15 X-X-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-Ile-Ile-Thr-Asp-Thr-Glu- 16 27 3 DK 173536 B1

Leu-Pro-Pro-Leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe-(Phe)-Ala, hvor X-X ikke var blevet bestemt. Indholdet af denne an-5 søgning betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved reference.

KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

10 Opfindelsen tilvejebringer således den fuldstændige kodesekvens for en cDNA-klon, der i det væsentlige repræsenterer vævsfaktor-inhibitor (TFI) af fuld størrelse.

Først blev humane placentale og fetal lever-Agtll-cDNA-15 biblioteker screenet med et polyklonalt kaninantiserum frembragt over for en renset TFI. Immunologisk positive kloner blev yderligere screenet for 1C5I-faktor Xa-bindende virkning. Der blev opnået syv kloner, der var immunologisk og funktionelt aktive. Den længste klon, 20 placenta-afledt XP9, var 1,4 kilobaser (kb) lang, mens de andre seks havde en længde på 1,0 kb. Delvis DNA-sekvensering viste, at 1,0 kb klonerne havde sekvenser identiske med en del af den længere 1,4 kb klon. Nucleo-tidsekvensanalyse viste, at XP9 bestod af en 1432 basepar 25 (pb) cDNA-insertion, der omfatter en 5'-ikke-kodende region på 133 bp, en åben læseramme på 912 bp, en stopkodon og en 3'-ikke-kodende region på 384 bp.

I overensstemmelse hermed angår opfindelsen en cDNA-30 sekvens, som koder for modent humant vævsfaktorinhibitorprotein og har den i Fig. 3 på tegningerne viste nucleo-tidsekvens.

4 DK 173536 B1 cDNA-sekvensen koder for et 31 950 dalton protein på 276 aminosyrer, som omfatter 18 cysteinrester og 7 methionin-rester. Den translaterede aminosyresekvens viser, at et signalpeptid på cirka 28 aminosyrer kommer forud for det 5 modne TFI-protein. Det skal bemærkes, at det "modne" TFI er defineret til at omfatte både TFI og methionyl-TFI på grund af den translationelle ATG-kodon i den heri beskrevne AP9-klon.

10 Der er tre potentielle N-forbundne glycosyleringssteder i TFI-proteinet med sekvensen Asn-X-Ser/Thr, hvori X kan være en vilkårlig af de almindelige 20 aminosyrer. Disse steder er ved aminosyrepositionerne Asn 145, Asn 195 og Asn 256, når den første methioninrest efter den 5'-ikke-15 kodende region betegnes aminosyreposition +1.

Den translaterede aminosyresekvens af TFI viser adskillige skelnelige domæner, herunder en højt negativt ladet N-terminal, en højt positivt ladet carboxy-terminal og en 20 mellemliggende del bestående af tre homologe domæner med sekvenser typiske for enzyminhibitorer af Kunitz-type.

Baseret på en homologiundersøgelse synes TFI at være et medlem af den basale proteaseinhibitorgen-superfamilie.

25 Den oprindelige kilde for proteinmaterialet til frembringelse af cDNA-klon λΡ9 var humant placentavæv. Dette væv kan fås i udstrakt grad efter fødsel ved almindelige kirurgiske metoder. Xgtll (lac5 nin5 cl857 S100) anvendt heri er en velkendt og almindeligt tilgængelig lambda-30 phag-ekspressionsvektor. Dens konstruktion og restrik-tionsendonucleasekort er beskrevet af Young og Davis,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194-1198 (1983).

5 DK 173536 B1

Northern blot analyse viste, at følgende leverafledte cellelinier: Chang-levercelle, HepG2 hepatoma og SK-HEP-1 hepatoma alle indeholdt to hovedarter af mRNA (1,4 og 4,4 kb), der hybridiserede med TFI-cDNA'en.

5

Kloningen af cDNA for TFI og udviklingen af hele dens proteinsekvens og strukturelle domæner som omhandlet heri muliggør detaljerede strukturfunktionelle analyser og tilvejebringer et grundlag for at studere dens biosynte- 10 tiske reguleringer. Opfindelsen er således vigtig for lægevidenskaben ved undersøgelsen af koagulationen med hensyn til midler, der er i stand til at hæmme faktor X3 og faktor VIIa/TF-enzymkompleks.

15 DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Opfindelsen beskrives nu nærmere med henvisning til tegningen, på hvilken 20 Fig. 1 viser screeningen af Agtll-kloner med 125I-f aktor Xa. Klonede phaglysater (0,1 ml) blev pletvis anbragt på et nitrocellulosepapir ved sugning under anvendelse af et dot blot apparat. Nitrocellulosepapiret blev herefter probeundersøgt med 125I-faktor X3 og autoradiograferet som 25 beskrevet nærmere. Kloner, der forekommer som mørke pletter, er positive kloner, der binder 125I-faktor Xa. Kontrol Xgtll (nedre højre hjørne) og andre kloner binder ikke 125I-faktor X3.

30 Fig. 2 viser et partielt restriktionskort og sekvenseringsstrategi for AP9-insertionerne. Skalaen forneden angiver nucleotidpositionen. Den tykke stang repræsenterer den kodende region. De tynde stænger repræsenterer 5'- og 3'-ikke-kodende regioner.

6 DK 173536 B1 3'-ikke-kodende regioner. Restriktionsendonuclease-ste-derne blev bekræftet ved nedbrydning. Pilene viser de overlappende M13-kloner, der blev anvendt til at sekven-sere cDNA'en.

5

Fig. 3 viser nucleotid-sekvensen og den translaterede aminosyresekvens af den humane TFI-cDNA. Nucleotider er nummereret på den venstre side og aminosyrer på den højre side. De understregede sekvenser er uafhængigt blevet be-10 kræftet ved aminosyresekvensanalyse af det rensede TFI-protein og to V3-protease + trypsin-nedbrudte peptider. Aminosyre + 1 blev tildelt den første methioninrest efter en stopkodon i den 5'-ikke-kodende region. Potentielle li-forbundne glycosyleringssteder er markeret med stjerner.

15

Fig. 4 er en grafisk afbildning, der viser ladningsfordelingen af aminosyresekvensen i TFI. Ladninger er beregnet fra den første rest til de i-ende rester og vist ved den i-ende rest. Således er værdien i den i-ende position op-20 summeringen af alle ladninger fra den første rest til den i-ende rest, og forskellen i ladningerne mellem den i-ende og den j-te rest (j>i) er nettoladningen af fragmentet fra den i-ende til den j-te rest.

25 Fig. 5 er en grafisk afbildning, der viser hydrofobici-tetsprofilen af TFI. Hydrofobicitetsprofilen blev analyseret ved hjælp af et computerprogram, hvor hydrofobici-tetsindekset af aminosyreresterne er defineret som den dybde, hvortil en aminosyrerest er begravet inden i et 30 protein (fra røntgen-krystallografiske data) [Kidera et al., J. Protein Chern. 4, 23-55 (1985)]. Hydrofobici tetsprofilen langs sekvensen blev udglattet under anvendelse af programmet ICSSCU i IMSL Library [IMSL Library Reference Manual, 9. udgave, Institute for Mathematical 7 DK 173536 B1 and Statistical Subroutine Library, Houston, Texas (1982)].

Fig. 6 viser en linieopstilling af de basale protease-5 inhibitordomæner af TFI med andre basale protease-inhibitorer. Alle sekvenserne bortset fra TFI blev opnået fra National Biomedical Research Foundation Protein Sequence Database (Georgetown University, Washington, D.C., U.S.A., frigivet 13. juni 1987). 1. Bovin basal prote- 10 aseinhibitor-precursor; 2. Bovint colostrura-trypsininhi-bitor; 3. Bovint serum-basal proteaseinhibitor; 4. Spiselig snegl-isoinhibitor K; 5. Rødehavsskildpadde-basal proteaseinhibitor (kun aminosyrerne 1-79 angivet): 6.

Vestlig sandhugormegift-basal proteaseinhibitor I; 7.

15 Ringhalsgift-basal proteaseinhibitor II; 8. Cape cobra gift-basal proteaseinhibitor II; 9. Russell's hugorm gift-basal proteaseinhibitor II; 10. Sandhugormegift-basal proteaseinhibitor III; 11. Østlig grøn mamba giftbasal proteaseinhibitor I homolog; 12. Sort mamba gift-20 basal proteaseinhibitor B; 13. Sort mamba gift-basal proteaseinhibitor E; 14. Sort mamba gift-basal proteaseinhibitor I; 15. Sort mamba gift-basal proteaseinhibitor K; 16. β-1-Bungarotoxin B kæde (mindre); 17. β-1-Bungaro-toxin B kæde (større); 18. β-2-Bungarotoxin B kæde; 19.

25 Heste-inter-cc-trypsininhibitor [aminosyrerne 1-57(1); 58- 123(2)]; 20. Svine-inter-a-trypsininhibitor [aminosyrerne 1-57(1); 58-123(2)]; 21. Bovin inter-a-trypsininhibitor [aminosyrerne 1-57(1); 58-123(2)]; 22. Human a-1- mikroglobulin/inter-a-trypsininhibitor-precursor [amino-30 syrerne 227-283(1); 284-352(2)]; 23. TFI [aminosyrerne 47-117(1); 118-188(2); 210-280(3)]. Mellemrum blev inkluderet i 16, 17, 18 for at opnå bedste overensstemmelse.

Der er anvendt standard et-bogstavskoder for aminosyrer.

35 Fig. 7 viser Northern blot analysen af RNA’er fra 3 lever-afledte cellelinier. 10 μg poly(A)+ RNA blev anvendt 8 DK 173536 B1 pr. bane. Bane 1: Chang-levercelle; bane 2: SK-HEP-1 he-patomacelle; bane 3: HepG2 hepatomacelle.

I denne beskrivelse med krav er anvendt standard bioke-5 misk nomenclature hvor nucleotidbaserne er betegnet som adenin (A); thymin (T); guanin (G); og cytosin (C). Tilsvarende nucleotider er for eksempel deoxyguanosin-5'-triphosphat (dGTP). Som det er almindeligt af nemheds-grunde ved den strukturelle afbildning af en DNA-10 nucleotidsekvens, er kun én streng vist, hvori A på én streng indebærer T på dens komplementære streng, og G indebærer C. Aminosyrer er vist enten ved tre bogstavs- eller et-bogstavsforkortelser på følgende måde: 15 Forkortet betegnelse_Aminosyre__ A Ala Alanin C Cys Cystein D Asp Asparaginsyre E Glu Glutaminsyre 20 F Phe Phenylalanin G Gly Glycin H His Histidin I Ile Isoleucin K Lys Lysin 25 L Leu Leucin M Met Methionin N Asn Asparagin P Pro Prolin Q Gin Glutamin 30 R Arg Arginin S Ser Serin T Thr Threonin V Val Valin W Trp Tryptophan 35 Y_Tyr_Tyrosin_ 9 DK 173536 B1

Almindeligt tilgængelige restriktionsendonucleaser beskrevet heri har følgende sekvenser og (angivet ved pile) spaltningsmønstre: 5 i

EcoRl GAATTC

GTTAAG

t 10 i

Sspl AATAAT

TTATAA

t 15

Cl al ATCGAT

TAGCTA

T

20 i

Alul AGCT

TCGA

ί 25 l

Stul AGGCCT

TCCGGA

T

30

For at belyse specifikke foretrukne udførelsesformer af opfindelsen nærmere er angivet følgende eksempler på præparativt laboratoriearbejde.

35 EKSEMPEL 1

Materialer

Human placenta- og fetal lever-cDNA-biblioteker blev op-40 nået fra Clonetech. Protoblot-immunoscreenings-udstyr blev indkøbt fra Promega Biotech. Restriktionsenzymer var fra New England Biolabs. Kalvetarm-alkalisk phosphatase,

T4 DNA-ligase, DNA-polymerase I (Klenow), exonuclease III

DK 173536 B1 10 og Sl-nuclease var fra Boehringer Mannheim. dNTP var fra P.L. Biochemicals. 5'- [a-35S]-thio-dATP (600 Ci/mml) var fra Amersham. Sekvenseringsudstyr (sequenase) var fra United States Biochemicals. Chang-leverceller (ATCC CCL 5 13) og HepG2 hepatomaceller (ATCC HB 8065) blev opnået fra the American Type Culture Collection. SK-HEP-1 hepa-toma-celler stammede oprindeligt fra en lever-adenocarcinoma fra G. Trempe fra Sloan-Kettering Institute for Cancer Research i 1971 og er nu udbredt og let 10 tilgængelig.

i:5I-faktor X3 blev fremstillet ved radiomærkning under anvendelse af Iodo-gen. Den specifikke aktivitet var 2000 dpm/ng. Mere end 97% af radioaktiviteten kunne udfældes 15 med 10% trichloreddikesyre (TCA). Det ioderede protein bibeholdt >80% af deres katalytiske aktivitet over for Spectrozyme Xa (American Diagnostica Product).

En anti-TFI-Ig-"Sepharose® 4B"-søjle blev fremstillet på 20 følgende måde: Et peptid (betegnet TFI-peptid) indeholdende en sekvens svarende til aminosyresekvensen 3-25 af det modne TFI blev syntetiseret under anvendelse af Biosystems fastfase-peptidsyntese-system. TFI-peptidet (5 mg) konjugeredes til 10 mg Keyhole albueskæl-hæmocyanin 25 ved hjælp af glutaraldehyd. To hvide kaniner af New Zealand race immuniseredes ved intradermal injektion af et homogenat indeholdende 1 ml Freund's complete adjuvant og 1 ml konjugat (200 μg TFI-peptid). En måned senere fik kaninerne atter injektion med et homogenat indeholdende 1 30 ml Freund's incomplete adjuvant og 1 ml konjugat (100 μg konjugat) . Antiserum blev opsamlet hver uge i tre måneder, og yderligere injektioner blev udført en gang om måneden. For at isolere specifikke antistoffer over for TFI-peptidet blev antiserum kromatograferet på en TFI-35 peptid-"Sepharose 4B"-søjle. Søjlen blev vasket med 10 rumfang PBS (0,4 M NaCl-0,1 M benzamidin-1% ’’Triton® X- 11 DK 173536 B1 100"), og samme opløsning uden "Triton X-100". Antistoffet blev elueret med 0,1 M glycin/HCl, pH 2,2, og derpå straks neutraliseret ved tilsætning af 1/10 rumfang Tris-OH og dialyseret over for saltvandsopløsning. Det isole-5 rede antistof blev koblet til cyanbromid-aktiveret "Sepharose 4B" efter fabrikantens (Pharmacia) anvisninger og anvendt til at isolere TFI fra celledyrkningssubstratet .

10 Chang-leverceller blev dyrket ved metoden, der tidligere er beskrevet af Broze og Miletich, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 84, 1886-1890 (1987). Det konditionerede substrat blev kromatograferet på anti-TFI-Ig-"Sepharose 4Bn-søjlen. Søjlen blev vasket med 10 rumfang PBS-1% "Triton 15 X-100" og PBS. Den bundne TFI elueredes med 0,1 M glycin- HC1, pH 2,2. Immunoaffinitetsisoleret TFI blev renset yderligere ved præparativ natriumdodecylsulfat-polyacryl-amidgel-elektroforese (Savants apparat). Aminosyreanalyse af slutproduktet viste den samme aminoterminale sekvens 20 som den TFI, der var isoleret fra HepG2-celler som beskrevet i den sideløbende danske patentansøgning PA 1988 04135. Det isolerede Chang-levercelle-TFI anvendtes herefter til at immunisere kaniner ved den ovenfor beskrevne immuniseringsforskrift. Det opnåede antiserum havde en 25 titer på cirka 100 μg/ml ved dobbelt immunodiffusionsprøvningen. Dette antiserum anvendtes ved immuno-screeningen af Agtll cDNA-biblioteker.

Metoder 30

Isolering af cDNA-kloner

Metoder til at afsøge placenta- og fetal lever-cDNA-biblioteker med antistof, plaque-rensning og fremstilling 35 af λ-phag-lysat og DNA var som beskrevet af Wun og Kretz-mer, FEBS Lett. 1, 11-16 (1987) . Antiserumet blev præ- 12 DK 173536 B1 adsorberet med BNN97 Agtll-lysat og fortyndet 1/500 til screening af biblioteket.

Screening for faktor Xa-bindende aktivitet 5

Rekombinante proteiner induceret med isopropyl-p-thio-galactosid fra immunopositive λ-phag isolater eller fra kontrol Agtll blev screenet for faktor Xa-bindende aktivitet. λ-phag-lysaterne (0,1 ml) blev filtreret gennem et 10 nitrocellulosepapir under anvendelse af et dot-blot-apparat (Bio Rad). Herefter blev nitrocellulosepapiret neddykket og omrørt i phosphatpufret saltvand indeholdende 5 mg/ml bovint serumalbumin og 2,5 mg/ml bovint gammaglobulin ved stuetemperatur i 1 time. Opløsningen blev 15 erstattet med i:5I-faktor Xa (1,0 x 106 cmp/ml) opløst i den samme opløsning tilsat 0,1 mg/ml heparin, og omrøringen fortsattes i yderligere 1 time. Herefter blev nitrocellulosepapiret vasket med phosphatpufret saltvand indeholdende 0,05% "Tween® 20". Vaskepufferen udskiftedes 20 hvert femte minut, fire gange. Herefter blev nitrocellulosepapiret lufttørret og præpareret til autoradiografi under anvendelse af "Kodak XR5"-film. Filmen blev fremkaldt efter en uges eksponering.

25 Fremstilling af poly(A) * RNA og Northern blotting

Totale RNA*er blev præpareret fra dyrket Chang-levercelle, HepG2 hepatomacelle og SK-HEP-1 hepatomacelle under anvendelse af natriumperchlorat-ekstraktionsmetoden 30 beskrevet af Lizardi og Engelberg, Anal. Biochem. 98, 116-122 (1979). Poly(A) + RNA-præparater blev isoleret ved batchvis adsorption på oligo(dT)-cellulose (P-L Biochemical, type 77F) under anvendelse af den af fabrikanten anbefalede procedure. Til Northern blot analyse blev 10 μg 35 af hver poly(A)+ RNA behandlet med glyoxal [Thomas,

Methods Enzymol. 100, 255-266 (1983)] og underkastet aga- 13 DK 173536 B1 rosegelelektroforese i en puffer indeholdende 10 mM na-triumphosphat, pH 7,0. Bethesda Research Laboratory's RNA-stige blev anvendt som molekylvægtmarkør. RNA’erne blev duppet over på et nitrocellulosepapir, som derpå 5 blev opvarmet i 2 timer ved 80 °C. Insertions-DNA'en fra AP9-klonen blev radiomærket med ^'P ved hak-translation og anvendtes som probe [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Model, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)]. Afdupningen blev hybridise-10 ret med 5 x 1015 cpm af proben i 5 ml af en opløsning indeholdende 50% formamid, 5X SSC, 50 mM natriumphosphat, pH 7,0, 250 pg/ml denatureret laksesperm-DNA og IX Den-hardt's opløsning ved 42 °C i 16 timer. Filteret blev vasket i 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 2X SSC ved stue-15 temperatur 3 gange, hver gang i 5 minutter, og i 0,1% SDS, 0,2 X SSC ved 50 °C to gange, hver gang i 5 minutter. Nitrocellulosepapiret blev lufttørret og derefter autoradiograferet i 3 dage ved -70 °C under anvendelse af Kodak XAR-5-film og intensiveringsskærm.

20

Andre rekombinant-DNA-metoder

Fremstilling af klonet Agtll DNA, subkloning i pUC19-plasmid og M13mpl8-vektor, frembringelse af deletion ved 25 exonuclease IIl-nedbrydning og DNA-sekvensering ved di-deoxymetoden [Sanger et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 83, 6776-6780 (1977)] blev gennemført som beskrevet af

Wun og Kretzmer, ovenfor.

30 Programmet FASTP skrevet af Lipman og Pearson, Science 227, 1435-1441 (1985) blev anvendt til at identificere homologe familier af proteiner fra National Biomedical Research Foundation Sequence Data Bank (frigivet 13. juni 1987) og til at stille sekvenserne på linie med den homo-35 loge familie.

14 DK 173536 B1

RESULTATER

Screening af cDNA-biblioteker 5 En række cellelinier blev screenetfor tilstedeværelsen af TFI i det konditionerede substrat, og det viste sig, at adskillige lever-afledte cellelinier, Chang-levercelle,

HepG2 hepatoma og SK-HEP-1 hepatoma, secernerer TFI i kultur. Til at begynde med anvendtes et antiserum over 10 for TFI til at screene et humant fetal-lever-Agtll cDNA-bibliotek (106 plaque-dannende enheder), og der blev opnået 15 immunologisk positive kloner. Herefter anvendtes samme metode til at screenee et placenta-Agtll cDNA-bibliotek. Ud af 106 plaque-dannende enheder opnåedes 10 15 immunologisk positive kloner. Disse kloner blev plaque-renset, og lysaterne af de rensede kloner prøvet for TFI-funktionel aktivitet. De isopropylthiogalactosid-induce-rede phag-lysater blev absorberet på nitrocellulosepapiret og screenet for den 125I-faktor Xa-bindende aktivitet.

20 Fig. 1 viser, at visse af disse immunologisk positive kloner udviste evne til at binde 125I-faktor X, på nitrocellulosepapiret. I alt udviste tre ud af 15 immunologisk positive fetal-lever-kloner, og 4 ud af 10 immunologisk positive placentakloner u5I-faktor Xa-bindende aktivitet.

25 Disse immunologisk og funktionelt positive kloner blev nedbrudt med EcoRl, og størrelsen af insertionerne blev bestemt ved gelelektroforese. Én klon fra det placentale bibliotek (AP9) havde en insertion på tilnærmelsesvis 1,4 kb, medens alle de andre kloner indeholdt insertioner på 30 tilnærmelsesvis 1,0 kb. Delvis DNA-sekvensering har vist, at 1,0 kb-klonerne indeholder sekvenser, der er identiske med en del af den længere 1,4 kb placentale klon (AP9) .

XP9 blev derfor udvalgt til fuldstændig sekvensering.

15 DK 173536 B1

Nucleotidsekvens og forudsagt proteinsekvens af TFI cDNA-isolat AP9-klonen blev underkastet restriktionskortlægning, M13-5 subkloning og sekvensering således som angivet i fig. 2.

Hele sekvensen blev bestemt på begge strenge ved hjælp af exonuclease III deletionsmetoden [Henikofff, Gene 28, 351-359 (1984)] og viste sig at bestå af 1432 baser i længden. Sekvensen er angivet i fig. 3. Den indeholder en 10 5'-ikke-kodende region på 133 baser, en åben læseramme på 912 nucleotider, og en 3'-ikke-kodende region på 387 nucleotider. Den første AT G forekommer ved nucleotid 134 i sekvensen TAGATGA, der var tæt efterfulgt af en anden AT G ved nucleotid 14 6 i sekvensen ACAATGA. Disse er mu-15 ligvis startsekvenserne, selv om de er forskellige fra den foreslåede consensussekvens for start af eukaryotisk ribosom, ACCATGG [Kozak, Cell 44, 283-292 (1986)]. 28 aminosyrer går forud for en sekvens svarende til N-terminalen af det modne protein. Længden og sammensætnin-20 gen af den hydrofobe del af disse 28 aminosyrer er typiske for signalsekvenser [Von Heijne, Eur. J. Biochem.

133, 17-21 (1983); J. Mol. Biol. 184, 99-105 (1985)]. En signalpeptidase spalter muligvis ved Ala-e-Asp^ til dannelse af et modent protein. Den forudsagte sekvens for 25 moden TFI består af 276 aminosyrer, der indeholder 18 cy-steinrester og 7 methioninrester. Den beregnede masse på 31 950 dalton baseret på den deducerede proteinsekvens for moden TFI er noget lavere end de 37-40 kDa bedømt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese af 30 isoleret protein, og forskellen afspejler sandsynligvis glycosyleringsbidraget til mobiliteten af det naturlige protein. Den deducerede proteinsekvens svarende til det modne protein indeholder tre potentielle N-forbundne gly-cosyleringssteder med sekvensen Asn-X-Thr/Ser (aminosyre-35 positionerne 145, 195 og 256). Aminosyresekvensanalyse af renset hel TFI og to isolerede proteolytiske fragmenter 16 DK 173536 B1 stemmer nøjagtigt overens med den fra cDNA-sekvensen de-cucerede proteinsekvens {fig. 3, understreget), hvilket indicerer, at den isolerede cDNA-klon koder for TFI. Den 3'-ikke-kodende region er A+T-rig (70% A+T). Hverken con-5 sensus-polyadenyleringssignalet, AATAAA [Proudfoot and Brownlee, Nature 252, 359-362 (1981)], eller poly A-halen fandtes i denne klon, hvilket muligvis skyldes kunstigt opstået tab af en del af den 3'-terminale del under konstruktionen af biblioteket.

10

Ladningsfordeling, hydrofobicitet/hydrofilicitet og indre homologi

Den translaterede aminosyresekvens af TFI indeholder 27 15 lysinrester, 17 argininrester, 11 asparaginsyrerester og 25 glutaminsyrerester. Ladningsfordelingen langs proteinet er højst uensartet som angivet i fig. 4. Signalpep-tidregionen indeholder to positivt ladede lysinrester med 26 neutrale rester. Den aminoterminale region af det mod-20 ne protein indeholder en højt negativt ladet strækning.

Seks af de første 7 rester er enten asparaginsyre eller glutaminsyre, der tæt følges af to mere negativt ladede aminosyrer neden herfor, inden en positivt ladet lysin-rest dukker op. Centerdelen af molekylet er generelt ne-25 gativt ladet. Ved carboxyterminalen er der en højt positivt ladet del. Aminosyrerne 265-293 af TFI indeholder 14 positivt ladede aminosyrerester, herunder en sekvens på 6 efter hinanden følgende arginin-lysin-rester.

30 Den forudsagte hydrofilitets/hydrofobicitetsprofil af TFI-proteinet er angivet i fig. 5. Signalpeptidet indeholder en højt hydrofob region som forventet. Resten af molekylet synes snarere at være hydrofilt.

35 Den translaterede aminosyresekvens af TFI indeholder adskillige specielle domæner. Udover det højt negativt la- DK 173536 B1 17 dede N-terminale domæne og det højt negativt ladede C-terminale domæne består centerdelen af tre homologe domæner/ der har de typiske sekvenser for inhibitorer af Ku-nitz-type {se nedenfor).

5

Homologi med andre proteiner

Ved at afsøge National Biomedical Research Foundation sekvensdatabasen blev det fundet, at det N-terminale domæne 10 og C-terminale domæne af TFI ikke udviser signifikant ho-mologi med andre kendte proteiner. De tre interne homologe domæner er imidlertid hver for sig homologe med sekvenser af andre basale proteaseinhibitorer, herunder basal bovin pancreas-proteaseinhibitor (aprotinin), basale 15 gift-proteaseinhibitorer og inter-a-trypsin-inhibitorer (fig. 6). Det er bemærkelsesværdigt, at disulfidbindingsstruktur er stærkt bevaret i alle disse tre inhibitorer.

Baseret på disse homologier er det klart, at TFI hører til den basale proteaseinhibitor-gen-superfamilie.

20

Northern blotting

Poly(A)+ RNA'er blev renset fra TFI-producerende leverafledte cellelinier, Chang-levercelle, HepG2 hepatomacel-25 ler og SK-HEP-1 hepatomaceller. Poly(A)+ RNA'erne blev opløst ved denaturerende agarosegelelektroforese, over-duppet på et nitrocellulosepapir og probeundersøgt med 32P-mærket TFI-cDNA (λΡ9) . Som vist i fig. 7 blev der observeret to større hybridiseringsbånd, der svarer til 30 mRNA'er på 1,4 kb og 4,4 kb, i alle tre afprøvede cellelinier. Adskillige andre cellelinier blev undersøgt, som ikke frembragte detekterbare mængder af TFI, og hvori der ikke blev fundet nogen hybridisering med proben (data ikke vist) .

35 18 DK 173536 B1

Forskellige andre eksempler vil efter læsning af denne beskrivelse være indlysende for fagmanden uden at gå uden for opfindelsens rammer. Sådanne yderligere eksempler skal også anses for inkluderet i opfindelsen som define-5 ret ved de efterfølgende krav.

Claims (4)

1. DK 173536 B1 1. cDNA-sekvens, som koder for modent humant vævsfaktor-inhibitor-protein og har den i Fig. 3 på tegningerne vi- 5 ste nucleotidsekvens.
2. 2. cDNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at cDNA'en er den humane vævsfaktorinhibitor-cDNA-klon λΡ9 karakteriseret som vist i restriktionskortet i Fig. 2 på 10 tegningerne.
3. 3. cDNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2, som koder for et protein, der har en masse på 37-40 kD som bedømt ved na-triumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese og har 15 den i Fig. 3 på tegningerne viste aminosyresekvens.
4. 4. cDNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2, som koder for et protein, der er methionylvævsfaktorinhibitor-proteinet indeholdende den i Fig. 3 på tegningerne viste aminosyre- 20 sekvens.