DE3851511T2 - DNA-Klon für menschlichen Gewebefaktorinhibitor. - Google Patents
DNA-Klon für menschlichen Gewebefaktorinhibitor.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft einen Gerinnungsinhibitor, der als Gewebsfaktorinhibitor (tissue factor inhibitor, TFI) und alternativ als Lipoprotein-assoziierter Koagulationsinhibitor (LACI) bekannt ist. Insbesondere betrifft die Erfindung einen cDNA-Klon, der im wesentlichen den gesamten TFI repräsentiert.
- Die Gerinnungskaskade, die im Blut der Säuger zu finden ist, umfaßt zwei unterschiedliche Systeme - das sogenannte intrinsiche und das extrinsische System. Das letztere System wird durch Einwirken von Gewebsthromboplastin (Faktor III), nachfolgend als Gewebsfaktor (tissue factor, TF) bezeichnet, auf Blut aktiviert. Der Gewebsfaktor ist ein Lipoprotein, welches in der Plasmamembran vieler Zelltypen entsteht und von welchem im Gehirn und in der Lunge besonders viel vorhanden ist. Nach Berührung mit TF bildet Plasma-Faktor VII oder seine aktivierte Form, Faktor VIIa, einen Calcium-abhängigen Komplex mit TF und aktiviert dann proteolytisch Faktor X zu Faktor Xa und Faktor IX zu Faktor IXa.
- Frühere Untersuchungen betreffend die Regulierung der TF-initiierten Gerinnung zeigten, daß eine Inkubation von TF (in rohen Gewebsthromboplastinpräparationen) mit Serum seine Aktivität in vitro inhibierte und seine tödliche Wirkung bei Infusion in Mäuse verhinderte. Umfassende Untersuchungen von Hjort, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 9, Suppl. 27, 76-97 (1957) bestätigten und erweiterten frühere Arbeiten auf diesem Gebiet und führten zu dem Schluß, daß eine inhibitorisch wirkende Komponente im Serum den Faktor VII-TF-Kornplex erkannte. Mit dieser Hypothese stimmen die Tatsachen überein, daß die Inhibition von TF, die im Plasma auftritt, die Anwesenheit von Ca²&spplus; erfordert (welches auch für die Bindung von Faktor VII/VIIa an TF nötig ist), und daß eine Inhibition durch Chelierung von divalenten Kationen mit EDTA verhindert und/oder umgekehrt werden kann. Jüngere Untersuchungen zeigten, daß nicht nur Faktor VIIa, sondern auch katalytisch aktiver Faktor Xa und ein zusätzlicher Faktor für die Erzeugung einer TF-Inhibition in Plasma oder Serum nötig sind. Vgl. Broze and Miletich, Blood 69, 150-155 (1987), und Sanders et al., Ibid., 66, 204-212 (1985). Dieser zusätzliche Faktor, hier als Gewebsfaktorinhibitor (TFI) definiert und alternativ als Lipoprotein-assoziierter Gerinnungsinhibitor (LACI) bezeichnet, ist in Barium-adsorbiertem Plasma vorhanden und scheint mit Lipoproteinen assoziiert zu sein, da TFI-funktionelle Aktivität mit der Lipoproteinfraktion, die oben schwimmt, abgetrennt wird, wenn Serum mit einer Dichte von 1,21 g/cm³ zentrifugiert wird. Gemäß Broze und Miletich, supra, und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1886-1890 (1987), scheiden HepG2-Zellen (eine Hepatomzellinie vom Menschen) eine inhibitorisch wirkende Komponente mit denselben Charakteristika ab, wie der im Plasma vorhandene TFI.
- In der gleichzeitig schwebenden Anmeldung U.S. Ser. Nr. 77,366, eingereicht am 23. Juli 1987 (Prioritätsdokument von EP 0 300 988) ist ein gereinigter Gewebsfaktorinhibitor (TFI) geoffenbart, der von HepG2-Zellen abgeschieden wurde. Es wurde festgestellt, daß er in zwei Formen existiert, einem TFI&sub1;, der bei etwa 37-40.000 Dalton wandert, und einen TFI&sub2; bei etwa 25-26.000 Dalton wandert, wie mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) festgestellt. Eine teilweise N-terminale Aminosäuresequenz für das TFI wurde als
- angegeben, wobei X-X nicht bestimmt worden war. Die Offenbarung dieser Anmeldung ist durch Hinweis darauf hierin mit einbezogen.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die vollständige Kodiersequenz eines cDNA-Klons, der im wesentlichen den gesamten Gewebsfaktorinhibitor (TFI) darstellt, entwickelt.
- Zuerst wurden Plazenta- und Fötalleber-λgt11 cDNA-Banken vom Menschen mit einem polyklonalen Antiserum aus Kaninchen, das gegen einen gereinigten TFI immunisiert worden war, gescreent. Immunologisch positive Klone wurden auf eine ¹²&sup5;I-Faktor Xa-Bindungsaktivität weiter gescreent. Sieben Klone wurden erhalten, die immunologisch und funktionell aktiv waren. Der längste Klon, von der Plazenta stammender λP9, war 1,4 Kilobasen (kb) lang, während die anderen sechs 1,0 kb lang waren. Partielle DNA-Sequenzierung zeigte, daß die 1,0 kb-Klone Sequenzen aufwiesen, die mit einem Teil des längeren 1,4 kb-Klons identisch waren. Die Nucleotidsequenzanalyse zeigte, daß λP9 aus einem 1432 Basenpaar (bp) cDNA-Insert bestand, das einen 5'-nichtkodierenden Bereich von 133 bp, einen offenen Leserahmen von 912 bp, ein Stop-Kodon und einen 3'-nichtkodierenden Bereich von 384 bp aufweist.
- Die cDNA-Sequenz kodiert für ein 31.950 Dalton Protein von 276 Aminosäuren, welches 18 Cysteine und 7 Methionine aufweist. Die translatierte Aminosäuresequenz zeigt, daß ein Signalpeptid von etwa 28 Aminosäuren dem reifen TFI-Protein vorausgeht. Es ist verständlich, daß das "reife" TFI so definiert ist, daß es sowohl TFI als auch Methionyl-TFI aufgrund des ATG-Translationskodons im hier beschriebenen λP9-Klon umfaßt.
- Es gibt drei potentielle N-verbundene Glykosilierungsstellen im TFI-Protein mit der Sequenz Asn-X-Ser/Thr, wobei X jede der üblichen 20 Aminosäuren sein kann. Diese Stellen sind an den Aminosäurepositionen Asn 145, Asn 195 und Asn 256, wenn dem ersten Methionin nach dem 5'-nichtkodierenden Bereich die Aminosäureposition +1 zugeteilt wird.
- Die translatierte Aminosäuresequenz von TFI zeigt mehrere unterscheidbare Domänen, inklusive einem stark negativ geladenen N-Terminus, einem stark positiv geladenen Carboxy-Terminus und einem dazwischen befindlichen Teil bestehend aus 3 homologen Domänen mit Sequenzen, die typisch für Enzyminhibitoren des Kunitz- Typs sind. Aufgrund einer Homologieuntersuchung scheint TFI ein Mitglied der basischen Proteaseinhibitorgen-Superfamilie zu sein.
- Die ursprüngliche Quelle des Proteinmaterials zur Entwicklung des cDNA-Klons λP9 war Plazentagewebe vom Menschen. Solches Gewebe ist nach der Entbindung mittels herkömmlicher chirurgischer Verfahren in großen Mengen erhältlich. Der hier verwendete λgt11 (lac5 nin5 c1857 S100) ist ein gut bekannter und allgemein erhältlicher Lambda-Phagen-Expressionsvektor. Seine Konstruktion und Restriktionsendonucleasekarte ist von Young und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194-1198 (1983) beschrieben.
- Eine Northern blot-Analyse zeigte, daß die folgenden von der Leber stammenden Zellinien:
- Chang-Leber, HepG2-Hepatom und SK-HEP-1 Hepatom alle 2 Hauptspezies von mRNA (1,4 und 4,4 kb) enthielten, welche mit der TFI-cDNA hybridisierten.
- Die Klonierung der cDNA für TFI und die Entwicklung ihrer gesamten Proteinsequenz und strukturellen Domänen, wie hierin geoffenbart, gestattet detaillierte Struktur-funktionelle Analysen und schafft eine Grundlage zur Untersuchung seiner biosynthetischen Regulation. Die Erfindung ist somit für die Medizin bei der Untersuchung der Gerinnungskaskade im Hinblick auf Mittel, die Faktor Xa und den enzymatischen Faktor VIIa/TF-Komplex inhibieren können, von Bedeutung.
- Obwohl die Beschreibung mit Ansprüchen endet, die den Gegenstand, der als die vorliegende Erfindung angesehen wird, besonders herausstreichen und genau beanspruchen, nimmt man an, daß die Erfindung aus der folgenden detaillierten Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen besser verständlich ist, worin
- Fig. 1 das Screenen von λgt11-Klonen mit ¹²&sup5;I-Faktor Xa zeigt. Klonierte Phagenlysate (0,1 ml) wurden auf einem Nitrocellulosepapier durch Saugen unter Verwendung eines Dot-Blot-Apparats gesehen. Das Nitocellulosepapier wurde dann mit ¹²&sup5;I-Faktor Xa als Sonde untersucht und wie nachfolgend beschrieben autoradiographiert. Die Klone, die als dunkle Flecken aufscheinen, sind positive Klone, die ¹²&sup5;I-Faktor Xa binden. Ein Kontrollλgt11 (untere rechte Ecke) und andere Klone binden ¹²&sup5;I-Faktor Xa nicht.
- Fig. 2 zeigt eine teilweise Restriktionskarte und die Sequenzierungsstrategie für die λP9-Inserts. Die Skala am Boden zeigt die Nucleotidposition an. Der dicke strich bedeutet den Kodierbereich. Der dünne strich bedeutet die 5'- und 3'-nichtkodierenden Bereiche. Die Restriktionsendonucleasestellen wurden durch Verdau bestätigt. Die Pfeile zeigen die überlappenden M13-Klone, die zur Sequenzierung der cDNA verwendet wurden.
- Fig. 3 zeigt die Nucleotidsequenz und die translatierte Aminosäuresequenz der TFI-cDNA vom Menschen. Die Nucleotide sind an der linken Seite numeriert und die Aminosäuren auf der rechten. Die unterstrichenen Sequenzen wurden unabhängig voneinander durch Aminosäuresequenzanalyse des gereinigten TFI-Proteins und zwei V&sup8; Protease + Trypsin-verdaute Peptide bestätigt. Aminosäure + 1 wurde dem ersten Methionin nach einem Stopkodon des 5'-nichtkodierenden Bereichs zugeteilt. Potentielle N-verbundene Glycosylierungsstellen sind mit einem Sternchen bezeichnet.
- Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die die Ladungsverteilung der Aminosäuresequenz im TFI zeigt. Die Ladungen sind vom ersten Rest zu den i-ten-Resten berechnet und am i-ten-Rest angezeigt. So ist der Wert der i-ten-Position die Summe aller Ladungen vom ersten Rest bis zum i-ten-Rest und die Differenz der Ladungen zwischen dem i-ten- und j-ten-Rest (j > i) ist die Nettoladung des Fragments vom i-ten- bis zum j-ten-Rest.
- Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, die das Hydrophobieprofil von TFI zeigt. Das Hydrophobieprofil wurde mittels eines Computerprogramms analysiert, wobei der Hydrophobieindex der Aminosäurereste als die Tiefe definiert ist, die zu welcher ein Aminosäurerest in einem Protein vergraben ist (aus Röntgenstrukturanalysedaten) [Kidera et al., J. Protein Chem. 4, 23-55 (1985)]. Das Hydrophobieprofil entlang der Sequenz wurde unter Verwendung des Programmes ICSSCU in IMSL Library [IMSL Library Reference Manual, 9. Ausgabe, Institute for Mathematical and Statistikal Subroutine Library, Houston, Texas (1982)] geglättet.
- Fig. 6 zeigt ein Alignment der basischen Proteaseinhibitor- Bereiche von TFI mit anderen basischen Proteaseinhibitoren. Alle Sequenzen, außer TFI, wurden von der National Biomedical Research Foundation Protein Sequence Database (Georgetown University, Washington, D.C., Ausgabe 13, Juni 1987) erhalten. 1. Basischer Rinderproteaseinhibitorvorläufer; 2. Rinderkolostrumtrypsininhibitor; 3. Basischer Proteaseinhibitor aus Rinderserum;
- 4. Isoinhibitor K der eßbaren Schnecke; 5. Basischer Proteaseinhibitor der Schildkröte vom Roten Meer (nur die Aminosäuren 1-79 dargestellt); 6. Basischer Proteaseinhibitor I vom Gift der Westlichen Sandviper; 7. Basischer Proteaseinhibitor II von Ringhals-Gift; 8. Basischer Proteaseinhibitor II vom Gift der Kap-Cobra; 9. Basischer Proteaseinhibitor II vom Gift der Russell-Viper; 10. Basischer Proteaseinhibitor III vom Gift der Sandviper; 11. Basisches Proteaseinhibitor I-Homolog vom Gift der östlichen Grünen Mamba; 12. Basischer Proteaseinhibitor B vom Gift der Schwarzen Mamba; 13. Basischer Proteaseinhibitor E vom Gift der Schwarzen Mamba; 14. Basischer Proteaseinhibitor I vom Gift der Schwarzen Mamba; 15. Basischer Proteaseinhibitor K vom Gift der Schwarzen Mamba; 16. β-1-Bungarotoxin-B-Kette (minor); 17. β-1-Bungarotoxin-B-Kette (major); 18. β-2-Bungarotoxin-B-Kette; 19. Inter-α-Trypsininhibitor vom Pferd [Aminosäuren 1-57 (1); 58-123 (2)]; 20. Inter-α-Trypsininhibitor vom Schwein [Aminosäuren 1-57 (1); 58-123 (2)]; 21. Inter-α-Trypsininhibitor vom Rind [Aminosäuren 1-57 (1); 58-123 (2)]; 22. α-1-Microglobulin/inter-α- Trypsininhibitor-Vorläufer vom Menschen [Aminosäuren 227-283(1); 284-352 (2)]; 23. TFI [Aminosäuren 47-117 (1); 118-188 (2); 210-280 (3)]. Lücken wurden in 16, 17, 18 inkludiert, um das beste Alignment zu erreichen. standard-Einbuchstabencodes für Aminosäuren werden verwendet.
- Fig. 7 zeigt die Northern blot-Analyse der RNAs von 3 aus der Leber stammenden Zellinien. Zehn ug poly(A)&spplus; RNA wurden pro Bahn verwendet. Bahn 1: Chang-Leberzelle; Bahn 2: SK-Hep-1 Hepatom- Zelle; Bahn 3: HepG2 Hepatom-Zelle.
- Es wird hierin die biochemische Standardnomenklatur verwendet, in welcher die Nucleotidbasen als Adenin (A); Thymin (T); Guanin (G); und Cytosin (C) bezeichnet werden. Entsprechende Nucleotide sind beispielsweise Desoxyguanosin-5'-triphosphat (dGTP). Wie es der Einfachheit halber bei der strukturellen Darstellung einer DNA-Nucleotidsequenz herkömmlich ist, ist nur ein Strang gezeigt, bei welchem A an einem Strang T auf seinem Complement bedeutet und G C bedeutet. Die Aminosäuren sind entweder durch dreibuchstabige oder einbuchstabige Abkürzungen wie folgt gezeigt: Abgekürzte Bezeichnung Aminosäure A Ala Alanin C Cys Cystein D Asp Asparaginsäure E Glu Glutaminsäure F Phe Phenylalanin G Gly Glycin H His Histidin I Ile Isoleucin K Lys Lysin L Leu Leucin M Met Methionin N Asn Asparagin P Pro Prolin Q Gln Glutamin R Arg Arginin S Ser Serin T Thr Threonin V Val Valin W Trp Tryptophan Y Tyr Tyrosin
- Die hierin beschriebenen, allgemein erhältlichen Restriktions- Endonucleasen weisen die folgenden Restriktionssequenzen und (durch Pfeile angedeuteten) Spaltungsmuster auf:
- Um besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung genauer zu veranschaulichen, wurden die folgenden, als Beispiel dienenden Herstellungsarbeiten im Labor durchgeführt.
- Plazenta- und Fötalleber-cDNA-Banken vom Menschen wurden von Clonetech erhalten. Der Protoblot-Immunoscreening-Kit wurde von Promega-Biotech gekauft. Die Restriktionsenzyme stammten von New England Biolabs. Aus dem Kälberdarm stammende alkalische Phosphatase, T4-DNA-Ligase, DNA-Polymerase I (Klenow), Exonuclease III und S1-Nuclease stammten von Boehringer Mannheim. Die dNTPs stammten von P.L. Biochemicals. 5'-[α-³&sup5;S)-thio-dATP (600 Ci/mmol) stammte von Amersham. Der Sequenzierungskit (Sequenase) stammte von United States Biochemicals. Chang-Leberzellen (ATCC CCL 13) und HepG2-Hepatomzellen (ATCC HB 8065) wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Die SK-MEP-1 Hepatomzellen wurden ursprünglich aus einem Leber-Adenocarcinom von G. Trempe vom Sloan-Kettering Institute for Cancer Research im Jahre 1971 erhalten und sind nun vielerorts und leicht erhältlich.
- ¹²&sup5;1-Faktor Xa wurde durch radioaktive Markierung unter Verwendung von Iodo-gen hergestellt. Die spezifische Aktivität betrug 2000 dpm/ng. Mehr als 97% der Radioaktivität war mit 10% Trichloressigsäure (TCA) ausfällbar. Das jodierte Protein behält > 80% der katalytischen Aktivität für Spectrozyme Xa (Produkt von American Diagnostica) bei.
- Eine Anti-TFI-Ig Sepharose® 4B-Säule wurde, wie folgt, hergestellt: Ein Peptid (TFI-Peptid genannt), welches eine der Aminosäuresequenz 3-25 des reifen TFI entsprechende Sequenz enthielt, wurde unter Verwendung des Festphasen-Peptidsynthesesystems von Biosystem synthetisiert. Das TFI-Peptid (5 mg) wurde zu 10 mg Keyhole-Lympet-Hemocyanin durch Glutaraldehyd konjugiert. Zwei weihe Neuseeland-Kaninchen wurden jeweils durch intradermale Injektion mit einem Homogenat, das 1 ml komplettes Freund Adjuvans und 1 ml Konjugat (200 ug TFI-Peptid) enthielt, immunisiert. Einen Monat später erhielt jedes der Kaninchen einen Booster mit einem Homogenat, das 1 ml unvollständiges Freund Adjuvans und 1 ml Konjugat (100 ug Konjugat) enthielt. 3 Monate lang wurde jede Woche Antiserum gesammelt, und Booster-Injektionen wurden monatlich durchgeführt. Zur Isolierung von spezifischem Antikörper gegen TFI-Peptid wurde das Antiserum auf einer TFI-Peptid-Sepharose 4B- Säule chromatographiert. Die Säule wurde mit 10 Volumen PBS (0,4 M NaCl-0,1 M Benzamidin-1% Triton® X-100) und derselben Lösung ohne Triton X-100 gewaschen. Der Antikörper wurde mit 0,1 M Glycin/HCl, pH 2,2, eluiert, durch Zugabe von 1/10 Volumen 1 M Tris-OH sofort neutralisiert und gegen Kochsalzlösung dialysiert. Der isolierte Antikörper wurde an mit Cyanogenbromid aktivierte Sepharose 4B mittels der Methode des Herstellers (Pharmacia) gekoppelt und zur Isolierung von TFI aus dem Zellkulturmedium verwendet.
- Chang-Leberzellen wurden mittels des zuvor von Broze und Miletich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1886-1890 (1987) beschriebenen Verfahrens gezüchtet. Das konditionierte Medium wurde auf der anti-TFI-Ig Sepharose 4B-Säule chromatographiert. Die Säule wurde mit 10 Volumen PBS-1% Triton X-100 und PBS gewaschen. Der gebundene TFI wurde mit 0,1 M Glycin/HCl, pH 2,2, eluiert. Der mittels Immunoaffinität isolierte TFI wurde durch präparative Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (Savant-Apparat) isoliert. Die Aminosäureanalyse des Endprodukts zeigte dieselbe Amino-terminale Sequenz wie der von HepG2-Zellen isolierte TFI, wie in der gleichzeitig schwebenden Anmeldung U.S. Ser. No. 77,366, eingereicht am 23. Juli 1987 (Prioritätsdokument von EP 0 300 988), beschrieben. Der isolierte Chang-Leber-TFI wurde dann zur Immunisierung von Kaninchen mittels des oben beschriebenen Immunisierungsprotokolls verwendet. Das erhaltene Antiserum hatte einen Titer von etwa 100 ug/ml im Doppelimmunodiffusionstest. Dieses Antiserum wurde beim Immuno-Screening von λgt11 cDNA-Banken verwendet.
- Isolierung der cDNA-Klone. Die Verfahren zum Screenen der Plazenta- und Fötalleber-cDNA-Banken mit Antikörper, Plaque- Reinigung und die Herstellung von λ-Phagenlysat und DNA waren so, wie von Wun und Kretzmer, FEBS Lett. 1, 11-16 (1987) beschrieben. Das Antiserum wurde mit BNN97 λgt11-Lysat vor-adsorbiert und 1/500 zum Screenen der Bank verdünnt.
- Durch Isopropyl-β-thiogalactosid aus immuno-positiven λ-Phagen-Isolaten oder aus Kontroll-λgt11 induzierte rekombinante Proteine wurden auf Factor Xa-Bindungsaktivität gescreent. Die λ-Phagen-Lysate (0,1 ml) wurden durch ein Nitrocellulosepapier unter Verwendung eines Dot-Blot-Apparats (Bio Rad) filtriert. Das Nitrocellulosepapier wurde dann in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung, enthaltend 5 mg/ml Rinder-Serumalbumin und 2,5 mg/ml Rinder-Gammaglobulin bei Raumtemperatur 1 h lang untergetaucht und bewegt. Die Lösung wurde durch ¹²&sup5;I-Faktor Xa (1,0 · 10&sup6; cmp/ml) ersetzt, der in derselben Lösung, die mit 0,1 mg/ml Heparin ergänzt worden war, gelöst war, und es wurde noch eine Stunde lang weiterbewegt. Das Nitrocellulosepapier wurde dann mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Tween® 20, gewaschen. Der Waschpuffer wurde alle 5 min gewechselt, und zwar 4 mal. Das Nitrocellulosepapier wurde dann luftgetrocknet und für die Autoradiographie unter Verwendung von Kodak XR5-Film vorbereitet. Der Film wurde nach 1 Woche Belichtung entwickelt.
- Herstellung von poly(A)&spplus; RNA und Northern Blotting. Gesamt- RNAs wurden aus gezüchteter Chang-Leberzelle, HepG2-Hepatom-Zelle und SK-HEP-1-Hepatom-Zelle unter Verwendung des Natriumperchlorat- Extraktionsverfahrens von Lizardi und Engelberg, Anal. Biochem. 98, 116-122 (1979) hergestellt. Poly(A)&spplus; RNAs wurden durch chargenweise Adsorption auf oligo(dT)-Cellulose (P-L Biochemical, Typ 77F) unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Verfahrens isoliert. Für die Northern Blot-Analyse wurden jeweils 10 ug poly(A)&spplus; RNA mit Glyoxal [Thomas, Methods Enzymol. 100, 255-266 (1983)] behandelt und einer Agarose-Gelelektrophorese in einem Puffer, enthaltend 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, unterzogen. Die RNA-Leiter von Bethesda Research Laboratory wurde als Molekulargewichtsmarkierer verwendet. Die RNAs wurden auf ein Nitrocellulosepapier geblottet, welches dann bei 80º 2 h lang gebacken wurde. Die Insert-DNA des λP9-Klons wurde mit ³²P mittels Nick-Translation radioaktiv markiert und als Sonde verwendet [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Model, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1982)]. Der Blot wurde mit 5 · 10&sup6; cpm der Sonde in 5 ml Lösung, enthaltend 50% Formamid, 5 · SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 250 ug/ml denaturierte Lachs- Sperma-DNA und 1X Denhardt-Lösung bei 42º 16 h lang hybridisiert. Der Filter wurde in 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 2X SSC, bei Raumtemperatur dreimal gewaschen, jedes Mal 5 min lang, und in 0,1% SDS, 0,2 X SSC, bei 50º zweimal, jedes Mal 5 min lang. Das Nitrocellulosepapier wurde dann luftgetrocknet, 3 Tage lang bei -70º unter Verwendung von Kodak XAR-5-Film und einem Verstärkerschirm autoradiographiert.
- Andere rekombinante DNA-Verfahren. Die Herstellung von klonierter λqt11 DNA, das Subklonieren von pUC19-Plasmid und M13mp18-Vektor, die Generierung und Deletion durch Exonuclease III-Verdau und DNA-Sequenzierung mittels des Didesoxy-Verfahrens [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6776-6780 (1977)] wurden wie von Wun und Kretzmer, supra, beschrieben, durchgeführt.
- Das von Lipman und Pearson, Science 227 1435-1441 (1985) geschriebene Programm FASTP wurde zur Identifizierung homologer Protein-Familien von der National Biomedical Research Foundation Sequence Data Bank (Ausgabe 13, Juni 1987) und zum Alignment der Sequenzen innerhalb der homologen Familie verwendet.
- Eine Anzahl von Zellinien wurde auf das Vorhandensein von TFI in den konditionierten Medien gescreent, und man stellte fest, daß mehrere von der Leber stammende Zellinien, Chang-Leber, HepG2 Hepatom, und SK-HEP-1 Hepatom, TFI in der Kultur abscheiden. Anfangs wurde ein Antiserum gegen TFI verwendet, um eine Fötalleber-λgt11 cDNA-Bank vom Menschen (10&sup6; Plaque-bildende Einheiten) zu screenen, und 15 immunologisch positive Klone wurden erhalten. Danach wurde dasselbe Verfahren zum Screenen einer Plazenta-λgt11 cDNA-Bank verwendet. Von 10&sup6; Plaque-bildenden Einheiten wurden 10 immunologisch positive Klone erhalten. Diese Klone wurden Plaque-gereinigt, und die Lysate der gereinigten Klone wurden auf die funktionelle Aktivität von TFI getestet. Die mit Isopropylthiogalactosid induzierten Phagen-Lysate wurden auf dem Nitrocellulosepapier absorbiert und auf die ¹²&sup5;I-Faktor Xa Bindungsaktivität gescreent. Fig. 1 zeigt, daß einige dieser immunologisch positiven Klone die Fähigkeit aufwiesen, den ¹²&sup5;I-Faktor Xa auf dem Nitrozellulosepapier zu binden. Insgesamt zeigten 3 von 15 immunologisch positiven Fötalleberklonen und 4 von 10 immunologisch positiven Plazentaklonen eine ¹²&sup5;I-Faktor Xa-Bindungsaktivität Diese immunologisch und funktionell positiven Klone wurden mit EcoRI verdaut, und die Größe der Inserts wurde mittels Gelelektrophorese bestimmt. Ein Klon aus der Plazenta-Bank (λP9) hatte ein Insert von etwa 1,4 kb, während alle anderen Klone Inserts von etwa 1,0 kb enthielten. Partielle DNA-Sequenzierung zeigte, daß 1,0 kb-Klone Sequenzen enthalten, die mit einem Teil des längeren 1,4 kb Plazenta-Klons (λP9) identisch sind. Die λP9 wurde daher zur vollständigen Sequenzierung ausgewählt.
- Der λP9-Klon wurde einer Restriktionskartierung, M13-Subklonierung und Sequenzierung mittels der in Fig. 2 gezeigten Strategie unterzogen. Die gesamte Sequenz wurde an beiden Strängen mittels der Exonuclease III-Deletionsmethode [Henikoff, Gene 28, 351-359 (1984)] bestimmt, und man fand, daß sie eine Länge von 1432 Basen hatte. Die Sequenz ist in Fig. 3 gezeigt. Sie enthält einen 5'-nichtkodierenden Bereich von 133 Basen, einen offenen Leserahmen von 912 Nucleotiden und einen 3'-nichtkodierenden Bereich von 387 Nucleotiden. Das erste ATG erscheint am Nucleotid 134 in der Sequenz TAGATGA, auf welche knapp ein zweites ATG am Nucleotid 146 in der Sequenz ACAATGA folgte. Dies sind möglicherweise die Initiierungssequenzen, obwohl sie sich von der vorgeschlagenen Konsens-Sequenz zur Initiierung durch eukaryontisches Ribosom ACCATGG [Kozak, Cell 44, 283-292 (1986)] unterscheiden.
- Achtundzwanzig Aminosäuren gehen einer Sequenz voraus, die dem N-Terminus des reifen Proteins entspricht. Die Länge und Zusammensetzung des hydrophoben Segments dieser 28 Aminosäuren sind typisch für Signalsequenzen [Von Heijne, Eur. J. Biochem. 133, 17-21 (1983); J. Mol. Biol. 184, 99-105 (1985)]. Eine Signal- Peptidase schneidet möglicherweise bei Ala&sub2;&sub8;-Asp&sub2;&sub9;, um zu einem reifen Protein zu führen. Die für reifen TFI vorhergesagte Sequenz besteht aus 276 Aminosäuren, die 18 Cysteinreste und 7 Methionine enthalten. Die berechnete Masse von 31.950 Dalton, basierend auf der abgeleiteten Proteinsequenz für reifen TFI, ist etwas geringer als die 37-40 kDa, die durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gel-Elektrophorese des isolierten Proteins bestimmt wurden, und die Differenz spiegelt wahrscheinlich den Beitrag der Glycosylierung zur Mobilität des natürlichen Proteins wider. Die dem reifen Protein entsprechende abgeleitete Proteinsequenz enthält 3 potentielle N-verbundene Glycosylierungsstellen mit der Sequenz Asn-X-Thr/Ser (Aminosäurepositionen 145, 195 und 256). Eine Aminosäuresequenzanalyse von gereinigtem komplettem TFI und zwei isolierten proteolytischen Fragmenten paßt genau zu der Proteinsequenz, die von der cDNA-Sequenz abgeleitet ist (Fig. 3, unterstrichen), was anzeigt, daß der isolierte cDNA-Klon für TFI kodiert. Der 3'-nichtkodierende Bereich ist A+T-reich (70% A+T), In diesem Klon wurden weder das Konsens-Polyadenylierungssignal, AATAAA [Proudfoot und Brownlee, Nature 252, 359-362 (1981)], noch der poly-A-Schwanz gefunden, was möglicherweise auf den Artefaktverlust eines Teils des 3'-terminalen Bereichs während der Herstellung der Bank zurückzuführen ist.
- Die translatierte Aminosäuresequenz des TFI enthält 27 Lysine, 17 Arginine, 11 Asparaginsäuren und 25 Glutaminsäuren. Die Ladungsverteilung entlang des Proteins ist, wie in Fig. 4 gezeigt, sehr ungleichmäßig. Der Signalpeptidbereich enthält 2 positiv geladene Lysine mit 26 neutralen Resten. Der Amino-terminale Bereich des reifen Proteins enthält eine stark negativ geladene Schleife. Sechs der ersten 7 Reste sind entweder Asparaginsäure oder Glutaminsäure, auf welche zwei mehr negativ geladene Aminosäuren stromabwärts knapp folgen, bevor ein positiv geladener Lysinrest erscheint. Der Mittelteil des Moleküls ist im allgemeinen negativ geladen. Am Carboxyterminus befindet sich ein stark positiv geladenes Segment. Die Aminosäuren 265 bis 293 des TFI enthalten 14 positiv geladene Aminosäuren, einschließlich eines 6-konsekutiven Arginin+Lysin-Rests.
- Das vorhergesagte Hydrophilie/Hydrophobie-Profil des TFI-Proteins ist in Fig. 5 gezeigt. Das Signalpeptid enthält, wie erwartet, einen stark hydrophoben Bereich. Der Rest des Moleküls erscheint ziemlich hydrophil.
- Die translatierte Aminosäuresequenz von TFI enthält mehrere unterscheidbare Domänen. Neben der stark negativ geladenen N-terminalen Domäne und der stark positiv geladenen C-terminalen Domäne besteht der Mittelteil aus 3 homologen Domänen, die die typischen Sequenzen der Inhibitoren vom Kunitz-Typ aufweisen (siehe unten).
- Beim Durchsuchen der Sequenzdatenbasis der National Biomedical Research Foundation fand man, daß die N-terminale Domäne und die C-terminale Domäne des TFI keine signifikante Homologie mit anderen bekannten Proteinen zeigen. Die 3 inneren homologen Domänen sind jedoch jede mit den Sequenzen anderer basischer Proteaseinhibitoren homolog, einschließlich dem basischen Proteaseinhibitor von Rinderpankreas (Aprotinin), den basischen Proteaseinhibitoren von Gift und den Inter-α-Trypsin-Inhibitoren (Fig. 6). Es ist bemerkenswert, daß die Disulfidbindungsstruktur bei allen diesen Inhibitoren stark konserviert ist. Aufgrund dieser Homologien ist es klar, daß TFI zur Superfamilie des basischen Proteaseinhibitorgens gehört.
- Poly(A)&spplus; RNAs wurden von TFI-erzeugenden, von der Leber stammenden Zellinien, Chang Leber, HepG2 Hepatom und SK-HEP-1 Hepatom-Zellen, gereinigt. Die Poly(A)&spplus; RNAs wurden durch denaturierende Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt, durch Blotten auf ein Nitrocellulosepapier übertragen und mit ³²P-markierter TFI-cDNA (λP9) als Sonde untersucht. Wie in Fig. 7 gezeigt, wurden zwei Haupt-Hybridisierungsbanden beobachtet, die mRNAs von 1,4 kb und 4,4 kb in allen drei getesteten Zellinien entsprachen. Mehrere andere Zellinien wurden getestet, die keine nachweisbaren Mengen an TFI erzeugen und in welchen keine Hybridisierung mit der Sonde festgestellt wurde (Daten nicht gezeigt).
Claims (4)
1. cDNA-Sequenz, die für ein reifes
Humangewebsfaktorinhibitorprotein kodiert, mit der in Fig. 3 der Zeichnungen
gezeigten Nucleotidsequenz.
2. cDNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
cDNA der Humangewebsfaktorinhibitor-cDNA-Klon λP9 ist,
gekennzeichnet wie in der Restriktionskarte der Fig. 2 der
Zeichnungen gezeigt.
3. cDNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, welche für
ein Protein mit einer Masse von 37-40 kDalton kodiert, wie durch
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt und
mit der in Fig. 3 der Zeichnungen gezeigten Aminosäuresequenz.
4. cDNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, welche für
ein Protein kodiert, das das Methionylgewebsfaktorinhibitorprotein
ist, welches die in Fig. 3 der Zeichnungen gezeigte
Aminosäuresequenz enthält.
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