FI93365C - Ihmisen kudostekijäinhibiittorin DNA-klooni - Google Patents

Description

1 93365

Ihmisen kudostekijäinhibiittorin DNA-klooni Tämä keksintö liittyy veren hyytymisinhibiittoriin, 5 joka tunnetaan kudostekijäinhibiittorina (TFI), ja vaihtoehtoisesti lipoproteiiniin liittyneenä hyytymisinhibiit-w torina (LACI). Keksintö liittyy tarkemmin cDNA-klooniin, joka edustaa olennaisesti täysimittaista TFI:a.

Nisäkkäiden veressä esiintyvä hyytyrniskaskadi 10 käsittää kaksi erillään olevaa järjestelmää, joita kutsuttaan sisäiseksi ja ulkoiseksi järjestelmäksi. Jälkimmäinen järjestelmä aktivoituu veren altistuessa kudoksen trom-boplastiinille (hyytymistekijä III), jota tästä lähtien kutsutaan kudostekijäksi (TF). Kudostekijä on lipo-15 proteiini, joka syntyy monien solutyyppien solukalvossa, ja jota esiintyy erityisen runsaasti aivoissa ja keuhkoissa. Tullessaan kontaktiin TF:n kanssa veriplasman hyytymistekijä VII tai sen aktivoitu muoto, hyytymistekijä VIIa , muodostaa TF:n kanssa kalsiumista riippuvan ryhmän 20 ja sitten proteolyyttisesti aktivoi hyytymistekijä X:n hyytymistekijä Xa :ksi ja hyytymistekijä IX:n hyytymistekijä IXa:ksi.

Aikaisemmat TF:n aloittaman hyytymisen säätelyä koskevat tutkimukset osoittivat, että TF: n (kudoksen 25 tromboplastiinin raakavalmisteita käytettäessä) käsittely seerumilla esti tämän aktiivisuuden in vitro ja esti tämän kuolettavan vaikutuksen hiiriin infusoitaessa. Hjortin tekemät laajemmat tutkimukset, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 9, Suppl. 27, 76-97 (1957), vahvistivat ja laajen-30 sivat aikaisempaa työtä tällä alueella ja johtivat johtopäätökseen, että jokin inhibitorinen tekijä seerumissa tunnisti hyytymistekijä VII-TF -ryhmän. Tämän hypoteesin 93365 2 kanssa yhdenmukaisia ovat ne tosiasiat, että veriplasmassa esiintyvä TF:n inhibitio vaatii Ca2+:n läsnäolon (joka on myös tarpeellinen hyytymistekijän VII/VIIa:n kytkemisessä TF:ään) ja että tämä inhibitio voidaan estää ja/tai 5 palauttaa kelatoimalla kahdenarvoiset kationit EDTA:11a. Uudemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että TF:n inihibi-tion muodostumiseen veriplasmassa tai seerumissa ei tarvita ainoastaan hyytymistekijää VIIa, vaan myös katalyyttisesti aktiivista hyytymistekijää Xa ja erästä lisätekijää. 10 Katso Broze ja Miletich, Blood 69, 150-155 (1987) ja

Sanders et ai. Ibid., 66, 204-212 (1985). Tämä tässä yhteydessä kudostekijäinhibiittoriksi (TFI), ja vaihtoehtoisesti lipoproteiiniin liittyneeksi hyytymisinhibiit-toriksi (LACI), nimitetty lisätekijä on läsnä barium-15 imeytetyssä veriplasmassa ja se näyttää käyttäytyvän lipoproteiinien tavoin, koska TFI:n toiminnallinen aktiivisuus rikastuu lipoproteiinijakeeseen, joka jää pinnalle sentrifugoitaessa seerumia 1.21 g/cm3 tiheydellä. Brozen ja Miletichin julkaisujen, yllä ja Proc. Natl. 20 Acad. Sei. USA 84, 1886-1890 (1987), mukaan HepG2 solut (ihmisen maksakasvaimen solulinja) erittävät inhibitorista tekijää, jolla on samat ominaisuudet kuin veriplasmassa olevalla TFI:11a.

Yhtäaikaa tämän patentin kanssa heinäkuun 23. 25 päivänä 1987 jätetyssä hakemuksessa sarja n: o 77366, kuvataan HepG2 -solujen erittämä puhdistettu kudostekijäin-hibiittori. Sen huomattiin esiintyvän kahdessa muodossa, noin 37000-40000 daltonin alueella liikkuvana TFIX:na ja noin 25000-26000 daltonin alueella liikkuva TFI2 :na 30 määri tettynänatriumdodekyylisulf aattipolyakryyliamidigee- lielektroforeesilla (SDS-PAGE). TFI:n osittaiseksi N- pään aminohappojärjestykseksi määritettiin seuraava jakso: 1 15 X-X-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-Ile-Ile-Thr-Asp-Thr-Glu- 93365 3 5 16 27

Leu-Pro-Pro-Leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe-(Phe)-Ala, jossa X-X el ole määritetty. Mainitun hakemuksen kuvaus on liitetty tähän hakemukseen siihen viittaamalla.

10

Keksinnön lyhyt kuvaus Tämän keksinnön mukaan on kehitetty sellaisen cDNA-kloonin täydellinen koodittava jakso, joka edustaa olennaisesti kokonaista kudostekijäinhibiittoria (TFI).

15 Aluksi seulottiin ihmisen istukan ja sikiön maksan gamma-gtll cDNA-kirjastot puhdistettua TFI:a vastaan valmistetulla kanin polyklonaalisella antiseerumilla. Immunologisesti positiiviset kloonit seulottiin edelleen 1251-hyytymistekijää Xa sitovan aktiivisuuden suhteen.

20 Saatiin seitsemän kloonia, jotka olivat immunologisesti ja toiminnallisesti aktiivisia. Pisin klooni, istukkaper-äinen lambda-P9 oli 1.4 kiloemäksen (ke) pituinen, kun muut kuusi olivat 1.0 ke:n pituisia. Osittainen DNA:n nukleotidijärjestyksen määritys osoitti 1.0 ke:n klooneilla 25 olevan sellaisia jaksoja, jotka olivat identtisiä pidemmän 1.4 ke:n kloonin osan kanssa. Nukleotidijärjestyksen analyysi osoitti, että lambda-P9:n koostumukseen kuului 1432 emäsparin (ep) cDNA -peräinen jakso, joka sisältää 133 ep:n mittaisen 5'-ei-koodittavan alueen, 912 ep:n 30 mittaisen avoimen lukuvaiheistusjakson, pysäytyskoodisanan, ja 384 ep:n mittaisen 3'-ei-koodittavan jakson.

Tämä cDNA-jakso koodittaa 18 kysteiiniä ja 7 metioniiniä sisältävää 276 aminohaposta muodostuvaa 31950 daltönin proteiinia. Translatoitu aminohappojärjestys 35 osoittaa, että noin 28 aminohapon signaalipeptidi edeltää 93365 4 varsinaista TFI-proteiinia. "Varsinaisen" TFI:n määritelmän on tarkoitus sisältää tässä patenttihakemuksessa kuvatun lambda-P9:aan kuuluvan ATG koodisanan perusteella sekä TFI:n että metionyyli- TFI:n.

5 TFI-proteiinissa on kolme mahdollista N-välitteistä glykosylaatiokohtaa, jotka sisältävät jakson Asn-X-Ser/Thr, missä X voi olla mikä tahansa yleisistä 20 aminohaposta. Nämä kohdat ovat paikoissa Asn 145, Asn 195, ja Asn 256, kun ensimmäinen 5 ’-ei-koodittavan alueen jälkeen esiintyvä 10 metioniini määrätään aminohappoasemaksi +1.

TFI: n translatoidussa aminohappojärjestyksessä esiintyy useita toisistaan erottuvia alueita, joihin kuuluu hyvin negatiivisesti varautunut N-pää, hyvin positiivisesti varautunut karboksipää ja välittäjäosa, 15 joka koostuu 3:sta samankaltaisesta alueesta, joissa on Kunitz-tyyppisille entsyymi-inhibiittoreille tyypillisiä jaksoja. Samankaltaistutkimukseen perustuen TFI vaikuttaa olevan emäksisten proteaasi-inhibiittorien geenien super-perheen jäsen.

20 Lambda-P9 cDNA kloonia kehitettäessä alkuperäinen proteiiniaineksen lähde oli ihmisen istukan kudos. Tällaista kudosta on helposti saatavilla synnytyksen jälkeen tavallisin kirurgisin toimenpitein. Tässä patenttihakemuksessa käytetty lambda-gtll (lac5 nin5 cl857 25 S100) on hyvin tunnettu ja yleisesti saatavilla oleva lambdafagi-ilmentymisvektori. Sen rakenne ja restriktioen-donukleaasikartta on kuvattu julkaisussa Young ja Davis, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 1194-1198 (1983).

Northern-imeytystestianalyysi osoitti, että seuraa-30 vat maksaperäiset solulinjat: Chang maksa-, HepG2 mak- sakasvain-, ja SK-HEP-1 maksakasvainlinja, sisälsivät kaikki 2 TFI cDNA:n kanssa hybridisoituvaa mRNA -päälajia (1.4 ja 4.4 ke).

TFI:a vastaavan cDNA:n kloonaus ja sen koko pro-35 teiinijakson sekä rakenteellisten alueiden selvittäminen, 93365 5 kuten tässä patenttihakemuksessa on kuvattu, mahdollistavat yksityiskohtaisen rakenne-toiminnallisuusanalyysien suorituksen ja tarjoavat perustan sen biosynteettisen säätelyn tutkimukseen. Keksintö on siten lääketieteel-5 lisesti tärkeä liittyessään sellaisten veren hyytymisen perättäisiin vaiheisiin liittyvien aineiden tutkimiseen, jotka voivat inhiboida tekijän Xa ja tekijän VIIa/TF entsymaattisen kompleksin.

10 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Kun patenttikuvaus päättyy patenttivaatimuksiin, jotka erityisesti osoittavat ja yksityiskohdissaan ra jaavat vaatimuksena olevat kohteet, on oletettavissa, että keksintö on helpommin ymmärrettävissä seuraavasta keksinnön 15 piiriin ensisijaisesti kuuluvien seikkojen yksityiskoh taisesta kuvauksesta yhdessä mukanaolevien piirrosten kanssa, joissa: 20 KUVA 1. esittää lambda-gtll kloonien seulontaa 1251-hyytymistekijällä Xa . Kloonattuja faagilysaatteja (0.1 ml) imeytettiin imun avulla nitroselluloosapaperiin täpläimeytystesti(dot blot)laitetta käyttäen. Tämän jälkeen nitroselluloosapaperi testattiin käyttäen koet-25 timena 125I-hyytymistekijää Xa ja autoradiografoitiin jäljempänä esitettävällä tavalla. Kloonit, jotka ilmenevät tummina täplinä ovat positiivisia klooneja, jotka sitovat 1251-hyytymistekijää Xa. Kontrolli lambda-gtll (oikeassa alakulmassa) ja muut kloonit eivät sido 1251-hyytymis-30 tekijää Xa.

KUVA 2. esittää osittaista restriktiokarttaa ja lambda-P9:n sisältämän liittymän nukleotidijärjestyksen määritysstrategiaa. Allaoleva asteikko osoittaa nuk-35 letidiaseman. Paksu viiva esittää koodittavaa aluetta.

93365 6

Ohuet viivat esittävät 5'- ja 3'-ei-koodittavia alueita. Restriktioendonukleaasikohdat varmistettiin suorittamalla pilkkominen. Nuolet osoittavat cDNA:n nukleotidijärjestyk-sen määrityksessä käytettyjä osittain päällekkäisiä M13 5 klooneja.

KUVA 3. esittää ihmisen TFI :n cDNA: n nukleotidij är-jestyksen ja translatoidun aminohappojärjestyksen. Nukleotidit on numeroitu vasemmalta ja aminohapot oikealta.

10 Alleviivatut jaksot on varmistettu toisistaan riippumattomasti TFI -proteiinin aminohappojärjestyksen määrityksellä ja kahdella Ve proteaasi + trypsiinihajotuksesta peräisin olevalla peptidillä. Aminohapoksi +1 määrättiin ensimmäinen 5?-ei-koodittavan alueen lopetuskoodisanan 15 jälkeinen metioniini. Mahdolliset N-välitteiset glykosy- laatiokohdat on merkitty tähdellä.

KUVA 4. esittää graafisesti TFI:n aminohappojärjestyksen varausten jakautumista. Varaukset on laskettu 20 ensimmäisestä aminohapporyhmästä i:nteen ryhmään ja esitetty i:nnessä ryhmässä. Siten i:nnen aseman arvo on kaikkien ensimmäisestä i:nteen ryhmään laskettujen varausten summa ja varausten välinen ero i:nnen ja j:nnen ryhmän välillä (j>i) on i:nnen ja j:nnen ryhmän väliin jäävän 25 alueen nettovaraus.

KUVA 5. esittää graafisesti TFI:n hydrofobisuuspro-fiilia. Hydrofobisuusprofiili analysoitiin tietokoneohjelmalla, jossa aminohapporyhmien hydrofobisuusindeksi on 30 määritelty syvyydeksi, johon aminohapporyhmä asettuu proteiinin sisällä (röntgensädekristallografisten tulosten mukaan) [Kidera et ai., J. Protein Chem. 4, 23-55 (1985)]. Aminohappojärjestyksen hydrofobisuusprofiili tasoitettiin käyttämällä ICSSCU -ohjelmaa, joka oli saatu IMSL kirjas-35 tosta [IMSL Library Reference Manual, 9. painos, Institute 93365 7 for Mathematical· and Statistical Subroutine Library, Houston, Texas (1982)].

KUVA 6. esittää TFI: n emäksisiä proteaasi-inhibiit-5 torijaksojen yhtenevyyden muissa emäksisissä proteaasi-inhibiittoreissa esiintyviin jaksoihin nähden. Kaikki jaksot TFI:a lukuunottamatta saatiin National Biomedical Research Foundation Protein Database:sta (Georgetown University, Washington, D.C., julkaisu 13, kesäkuu 1987). 10 1. Naudan emäksisen proteaasi-inhibiittorin esiaste; 2.

Naudan ternimaidon trypsiini-inhibiittori; 3. Naudan seerumin emäksinen proteaasi-inhibiittori; 4. Syötävän etanan isoinhibiittori K; 5. Punaisen merikilpikonnan emäksinen proteaasi-inhibiittori (esitettynä ainoastaan 15 aminohapot 1-79); 6. Lännen hietakyyn myrkyn emäksinen proteaasi-inhibiittori I; 7. Ringhals -käärmeen myrkyn emäksinen proteaasi-inhibiittori II; 8. Kapinkobran myrkyn emäksinen proteaasi-inhibiittori II; 9. Russelinkyyn myrkyn emäksinen proteaasi-inhibiittori II; 10. Hietakyyn 20 myrkyn emäksinen proteaasi-inhibiittori III; 11. Itäisen vihreän mamban myrkyn emäksisen proteaasi-inhibiittori I:n homologi; 12. Mustan mamban myrkyn emäksinen proteaasi-inhibiittori B; 13. Mustan mamban myrkyn emäksinen proteaasi-inhibiittori E; 14. Mustan mamban myrkyn emäksinen 25 proteaasi-inhibiittori I; 15. Mustan mamban myrkyn emäksinen proteaasi-inhibiittori K; 16. -1-Bungarotoksiini B:n ketju (pienempi); 17. -1-Bungarotoksiini B:n ketju (suurempi); 18. -2-Bungarotoksiini B:n ketju; 19. Hevosen inter- -trypsiini-inhibiittori [aminohapot 1-57(1); 58- 30 123 (2)]; 20. Sian inter- -trypsiini-inhibiittori [amino

hapot 1-57(1); 58-123(2)]; 21. Naudan inter- -trypsiini-inhibiittori [aminohapot 1-57(1); 58-123(2)]; 22. Ihmisen aifa-l-mikroglobuliini/inter- -trypsiini-inhibiittorin esiaste [aminohapot 227-283(1); 284-352(2)]; 23. TFI

35 [aminohapot 44-117(1); 118-188(2);210-280(3)]. Aukkoja 93365 8 jätettiin numeroihin 16, 17 ja 18 parhaimman yhtenevyyden saavuttamiseksi. Aminohapoille käytettiin vakiintuneita yhden kirjaimen koodeja.

5 KUVA 7. esittää 3:sta maksaperäisestä solulinjasta saatujen RNA-molekyylien Northern-imeytystestianalyysiä. Kymmenen g poly(A)* RNA:ta käytettiin uraa kohti. Ura 1, Chang-maksasolu; ura 2, SK-HEP-1 maksakasvainsolu; ura 3, HepG2 maksakasvainsolu.

10 Tässä patenttihakemuksessa käytetään nukleotidiemäk-sien kuvaamiseksi vakiintunutta biokemiallista merkintätapaa, jossa adeniini merkitään (A):11a; tyrniini (T):llä; guaniini (G):llä; ja sytosiini (C):llä. Vastaavat nuk-15 leotiditovat, esimerkiksi, deoksiguanosiini-5'-trifosfaat-ti (dGTP). Kuten on tavallista DNA:n nukleotidijärjestyk-sen rakenteellisen esityksen helpottamiseksi, ainoastaan yksi säie on esitetty, jossa kirjain A yhdessä säikeessä merkitsee kirjainta T sen vastinemäksenä ja G merkitsee 20 C:tä vastinemäksenä. Aminohapot esitetään joko kolmen tai yhden kirjaimen lyhennyksinä seuraavasti:

Lyhennetty merkintä Aminohappo 25 A Ala Alaniini C Cys Kysteiini D Asp Asparagiinihappo E Glu Glutamiinihappo F Phe Fenylalaniini 30 G Gly Glysiini H His Histidiini I Ile Isoleusiini K Lys Lysiini L Leu Leusiini 35 M Met Metioniini 93365 9 N Asn Asparagiini P Pro Proliini Q Gin Glutamiini R Arg Arginlini 5 S Ser Seriini T Thr Treoniini V Vai Vallini W Trp Tryptofaani Y Tyr Tyrosiini 10 _ Tässä patenttihakemuksessa kuvatuilla yleisesti saatavilla olevilla restriktioendonukleaaseilla on seuraa-vat restriktiojaksot ja (nuolilla osoitettuina) katkaisu-15 alueet: Ί»

EcoRl GAATTC

CTTAAG

* 4*·

20 Sspl AATATT

TTATAA

4 Ψ

Clal ATCGAT

TAGCTA 25 Φ

Alul AGCT

TCGA

t «l·

Stull AGGCCT

30 TCCGGA

t

Jotta tiettyjä ensisijaisia keksinnön kattamia kohteita voitaisiin kuvata yksityiskohtaisemmin, suoritettiin seuraavassa esitetyt ja esimerkiksi tarkoitetut 35 preparatiiviset laboratoriotyöt.

93365 10

Esimerkki 1 Materiaalit ra 5

Ihmisen istukan ja sikiön maksan cDNA-kirjastot hankittiin Clonetechistä. Protoblot-immunoseulontapakkaus hankittiin Promega Biotechistä. Restriktioentsyymit olivat New Englan Biolabsista. Vasikan suolen emäksinen 10 fosfataasi, T4 DNA ligaasi, DNA polymeraasi I (Klenow), eksonukleaasi III ja SI nukleaasi olivat Boehringer Mannheimilta. dNTP:t olivat P. L. Biochemicalsista. 5'-[ -35 S]-tio-dATP (600 Ci/mmol) oli Amershamilta. Nukleotidi järjestyksen määrityspakkaus (Seguenase) oli United 15 States Biochemicalsista. Chang-maksasolut (ATCC CLL 13) ja HepG2 maksakasvainsolut (ATCC HB 8065) oli hankittu American Type Culture Collection:sta. SK-HEP-1 maksakasvainsolut eristi alunperin G. Trempe Sloan-Kettering Institute for Cancer Research:ssa vuonna 1971 maksan 20 rauhaskudossyövästä ja ne ovat nykyään laajalti ja helposti saatavilla.

1251-HyytymistekijäXa valmistettiinradioleimaamal-la Iodo-geniä käyttäen. Tässä käytetty spesifinen aktiivisuus oli 2000 dpm/ng. 10%:n trikloorietikkahapon 25 (TCA) avulla oli saostettavissa enemmän kuin 97% radioaktiivisuudesta. Jodattu valkuaisaine säilytti >80% kata-lyytisesta aktiivisuudestaan Spectrozyme Xe:ta (American Diagnostican tuote) kohtaan.

Anti TFI-Ig-Sepharose 4B pylväs valmistettiin 30 seuraavasti: Täysimittaisen TFI:n aminohappojaksoa 3-25 vastaavan jakson sisältävä peptidi (nimeltään TFI-peptidi) syntetoitiin käyttäen Biosystemsin kiinteän faasin pep-tidisynteesilaitetta. TFI-peptidi (5 mg) konjugoitiin glutaraldehydillä 10 mg:n erään reikäkotilon hemosyaniinia. 35 Kaksi Uuden Seelannin valkoista kania immuunisoitiin 93365 11

Ihonalaisella ruiskeella, jossa oli 1 ml Freundin täydellistä tehostetta sisältävää homogenaattia ja 1 ml kon-jugaattia (200 g TFI-peptidiä). Kuukautta myöhemmin kummallekin kaniineista annettiin vahvistusannos, jossa w5 oli 1 ml Freundin epätäydellistä tehostetta sisältävää homogenaattia ja 1 ml konjugaattia (100 g konjugaattia). Antiseerumi kerättiin viikottain kolmen kuukauden ajan ja vahvistusannoksia annettiin kuukausittain. Spesifisen TFI-peptidiä vastaan suunnatun vasta-aineen eristämiseksi 10 antiseerumi kromatografoltiin TFI-peptidi Sepharose 4B pylväässä. Pylväs pestiin 10 tilavuudella PBS:a (0.4 M NaCl-0.1 M bentsamidiini-1% Triton X100) ja samalla liuoksella ilman Triton X-100:aa. Vasta-aine eluoitiin 0.1 M glysiini/HCl -liuoksella, pH 2.2, neutraloitiin 15 välittömästi lisäämälllä 1/10 tilavuutta 1 M Tris-OH ja dialysoitiin saliiniliuosta vastaan. Eristetty vasta-aine kytkettiin syanogeenibromidilla aktivoituun Sepharose 4B pylvääseen valmistajan (Pharmacia) menetelmän mukaan ja sitä käytettiin TFI:n eristykseen soluviljelmäliuoksesta.

20 Chang-maksasolu viljeltiin Broze ja Miletichin,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84. 1886-1890 (1987) aikaisemmin kuvaamalla menetelmällä. Konditioitu liuos kromatografoi-tiin anti-TFI-Ig Sepharose 4B pylväässä. Pylväs pestiin 10 tilavuudella PBS-1% Triton X-100 -liuosta ja PBS-25 liuosta. Sitoutunut TFI eluoitiin 0.1 M glysiini/HCl-liuoksella pH 2.2. Immunoaffiniteettieristetty TFI puhdistettiin edelleen preparatiivisellä natriumdodekyyli-sulfaatti-polyakrylamidi-geelielektroforeesilla (Savantin laite). Lopullisen tuotteen aminohappoanalyysi osoitti 30 siinä olevan saman aminohappojärjestyksen kuin HepG2 soluista eristetyssä TFI:ssa, kuten on osoitettu tämän patenttihakemuksen kanssa yhtäaikaa jätetyssä hakemuksessa sarjan:o 77366, kirjattu 23. heinäkuuta 1987. Eristettyä Chang-maksa-TFI:a käytettiin sitten kanien immunisoin-35 tiin yllä kuvatun immunisointiprotokollan mukaan. Näin 93365 12 saadun antiseerumin tiitteri oli noin 100 g/ml kaksoi-simmunodiffuusiokokeessa. Antiseerumia käytettiin lambda-gtll cDNA-kloonikirjastojen seulomiseen.

5 Menetelmät cDNA-kloonien eristäminen. Menetelmät istukan ja sikiön maksan cDNA-kirjastojen seulomiseksi vasta-aineella, plakkien puhdistamiseksi ja lambda-faagilysaatin ja DNA:n 10 valmistamiseksi on kuvattu julkaisussa Wun ja Kretzmer, FEBS Lett. 1, 11-16 (1987). Antiseerumi esiadsorboitiin BNN97 lambda-gtl1-lysaatilla ja laimennettiin 1/500 kirjaston seulontaa varten.

15 Hyytymistekijää X. sitovan aktiivisuuden seulonta

Yhdistelmä-DNA tekniikan avulla tuotetut, immunopositiivi-sista lambdafagivalmisteista tai kontrolli lambdagtll:sta saadut isopropyyli- -tiogalaktosidin indusoimat valkuaisaineet seulottiin hyytymistekijää Xa sitovan aktiivisuuden 20 suhteen. Lambda-fagilysaatit suodatettiin nitroselluloo- sapaperin läpi käyttämällä imeytystäplätestilaitetta (Bio Rad). Tämän jälkeen nitroselluloosapaperi upotettiin huoneenlämmössä 1 tunniksi 5 mg/ml naudan seerumialbumiinia ja 2.5 mg/ml naudan gammaglobuliinia sisältävään fosfaat-25 tipuskuroituun suolaliuokseen koko ajan sekoittaen.

Liuos vaihdettiin toiseen, jossa oli 125I-hyytymistekijä Xa (1.0 x 106 cpm/ml) liuotettuna samaan liuokseen, jota oli täydennetty 0.1 mg/ml hepariinilla ja sekoittamista jatkettiin vielä tunti. Sitten nitroselluloosapaperi 30 pestiin 0.05% Tween 20 sisältävällä fosfaattipuskuroidulla saliiniliuoksella. Pesupuskuri vaihdettiin 5 minuutin välein neljä kertaa. Sitten nitroselluloosapaperi il-makuivattiin ja valmistettiin autoradiografointia varten Kodak XR5 -filmille. Filmi kehitettiin yhden viikon 35 valotuksen jälkeen.

il l llt-l dl» M * 9-1 93365 13

Poly(A)* RNA;n valmistus 1a Northern-imeytystestl-analyysi.

5 Kokonais-RNA: t valmistettiin vil j ellyistä Chang-maksasolus - ta, HepG2 maksakasvainsolusta ja SK-HEP-1 maksakasvain-solusta käyttämällä Lizardi ja Engelbergin natriumperklo-raattiuuttomenetelmää, Anal. Biochem. 98, 166-122, (1979). Poly(A)+ RNA:t eristettiin adsorboimalla annoksittain 10 oligo(dT)-selluloosaan (P-L Biochemical, tyyppi 77F) käyttäen valmistajan suosittelemaa menetelmää. Northern-imeytystestianalyysiä varten 10 g jokaista poly(A)* RNA:ta käsiteltiin glyoksaalilla [Thomas, Methods Enzymol. 100, 255-266 (1983)] ja analysoitiin agaroosi-geelielekt-15 roforeesilla 10 mM natriumfosfaattia, pH 7.0, sisältävässä puskurissa. Bethesda Research Laboratoryn RNA-tikkaita käytettiin molekyylipainomarkkeereina. RNA:t siirrettiin nitroselluloosapaperiin imeyttämällä näyte paperin läpi, jota sitten kuivattiin 80 C:ssa 2 tunnin ajan. Lambda-20 P9-kloonin sisältämän liittymän DNA radioleimattiin 32P säiekatkostranslaatiolla ja käytettiin koettimena. [Maniatis et ai. Molecular Cloning: A Laboratory Model, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1982)]. Imeytystestipaperi hybridisoitiin 5 x 106 cpm:lla koetinta 25 5 ml:ssa liuosta, joka sisälsi 50% formamidia, 5X SSC, 50 mM natriumfosfaattia, pH 7.0, 250 g/ml denaturoitua lohen maidin DNA:a, ja IX Denhardtin liuosta 42 C:ssa 16 tunnin ajan. Suodatin pestiin 0.1% natriumdodekyyli-sulfaattia ja 2X SSC sisältävällä liuoksella huoneenläm-30 mössä 3 kertaa, 5 minuuttia kerrallaan ja 0.1% SDS:ssä, 0.2 X SSC -liuoksessa, 50 C:ssa kahdesti, 5 minuuttia kerrallaan. Sen jälkeen nitroselluloosapaperi ilmakuivat-tiin, autoradiografoitiin 3 päivän ajan -70 C:ssa käyttämällä vahvistusverkkoa ja Kodak XAR-5 filmiä.

93365 14

Muita yhdistelmä-DNA -menetelmiä.

Kloonatun lambda-gtll DNA:n valmistus, edelleenkloonaus pUC19 plasmidissa ja M13mpl8 vektorissa, deleetion aikaansaaminen pilkkomalla eksonukleaasi III:11a ja DNA:n 5 nukleotidij ärj estyken määritys dideoksimenetelmällä [ Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 6776-6780, (1977)], suoritettiin kuten on kuvattu julkaisussa Wun ja Kretzmer,(ks. yllä).

Lipmanin ja Pearsonin, Science 227 1435-1441 (1985) 10 tekemää ohjelmaa FASTP käytettiin samankaltaisten valkuais-aineperheiden tunnistamiseen National Biomedical Research Foundation Sequence Data Bank:sta (julkaisu 13, kesäkuu 1987) ja jaksojen yhtenevyyden määritykseen samankaltaisten perheessä.

15

TULOKSET

cDNA-kirjastojen seulonta

Joukko solulinjoja seulottiin TFI:n esiintymisen 20 suhteen konditioidussa liuoksessa ja havaittiin, että useat maksaperäiset solulinjat, Chang-maksa, HepG2 mak-sakasvain ja SK-HEP-1 maksakasvain erittävät TFI:a liuokseen. Alkuvaiheena oli TFI:a vastaan valmistettun antiseerumin käyttö ihmisen sikiön maksan lambda-gtll cDNA-25 kirjaston seulomiseen (106 plakkeja muodostavaa yksikköä) ja näin saatiin 15 immunologisesti positiivista kloonia. Tämän jälkeen samaa menetelmää käytettiin seulomaan istukan lambda-gtll cDNA-kirjastoa. 106 plakkeja muodostavasta yksiköstä saatiin 10 immunologisesti positiivista kloonia.

30 Nämä kloonit puhdistettiin plakkipuhdistuksella ja puhdistettujen kloonien lysaateista määritettiin TFI :n toiminnallinen aktiivisuus. Isopropyylitiogalaktosidi-indusoidut fagilysaatit imeytettiin nitroselluloosapaperille ja ne seulottiin 125I-hyytymistekijää Xa sitovan aktiivisuuden 35 suhteen. Kuva 1 esittää, että jotkin näistä immunologises- 93365 15 ti aktiivisista klooneista osoittivat kykyä sitoa 125I-hyytymistekijää Xa nitroselluloosapaperille. Kaikkiaan kolme 15:sta immunologisesti positiivisesta sikiön maksan klooneista ja neljä 10:stä immunologisesti positiivisesta 5 istukan kloonista osoittivat 1251-hyytymistekijää Xa :n sitovaa aktiivisuutta. Nämä immunologisesti ja toiminnallisesti positiiviset kloonit pilkottiin EcoRl:llä ja niiden sisältämien liittymien koko arvioitiin geelielekt-roforeesilla. Yhdellä istukan kirjaston kloonin (lambda-10 P9) sisältämä liittymä oli noin 1.4 ke, kun taas muiden kloonien sisältämät liittymät olivat noin 1.0 ke. Osittainen nukleotidijärjestyksen määritys osoitti, että 1.0 ke: n kloonit sisältävät jaksoja, jotka ovat identtisiä pidemmän 1.4 ke:n istukan kloonin (lambda-P9) osien kanssa.

15 Tämän vuoksi lambda-P9 valittiin lopulliseen nukleotidijärjestyksen määritykseen.

Eristetyn TFI cDNAtn nukleotidijärjestys 1a ennustettu proteiinin aminohappojärjestys 20 Lambda-P9 kloonille tehtiin restriktiokartoitus,

Ml3 edelleenkloonaus ja kuvassa 2 esitetyn strategian mukainen nukleotidijärjestyksen määritys. Kummastakin säikeestä määritettiin täydellinen nukleotidijärjestys eksonukleaasi 111-deleetiomenetelmällä [Henikoff, Gene 25 28, 351-359 (1984)] ja niiden havaittiin olevan 1432 emäksen pituisia. Nukleotidijärjestys on esitetty kuvassa 3. Se sisältää 5'-ei-koodittavan 133 emäksen alueen, 912 emäksen avoimen lukuvaiheistusjakson, ja 3’-ei-koodittavan 387 nukleotidin alueen. Ensimmäinen ATG esiintyy nuk-30 leotidissä 134, jaksossa TAGATGA ja sitä seurasi läheisesti toinen ATG nukleotidissä 146, jaksossa ACAATGA. On mahdollista, että nämä ovat aloitusjaksoja, vaikkakin ne eroavat ehdotetusta eukaryoottisen ribosomin vaatimasta konsensus-jaksosta ACCATGG [Kozak, Cell 44. 283-292 (1986)].

35 Täysimittaisen valkuaisaineen N-pään jaksoa vastaavaa 93365 16 jaksoa edeltää kaksikymmentäkahdeksan aminohappoa. Näiden 28:n aminohapon hydrofobisen osan pituus ja koostumus ovat tyypillisiä signaalijaksoille [Von Heijne, Eur. J. Biochem. 133, 17-21 (1983); J. Mol. Biol. 184. 99-105 (1985)].

5 Signaalipeptidaasi mahdollisesti pilkkoo Ala2B-Asp29 välisen sidoksen, jonka seurauksena muodostuu lopullinen proteiini. Lopullisen TFI: n ennustettu aminohappojärjestys sisältää 276 aminohappoa, joihin lukeutuu 18 kysteiiniä ja 7 metioniinia. Lopullisen TFI:n pääteltyyn proteiinin 10 aminohappojärjestykseen perustuva 31950 daltonin massa on hiukan pienempi kuin natriumdodekyylisulfaattipolyak-rylamidigeelielektroforeesilla arvioitu 37-40 kDarin massa, ja ero luultavasti heijastaa glykosylaation aiheuttamaa vaikutusta luonnollisen valkuaisaineen liikkuvuuteen.

15 Lopullista valkuaisainetta vastaava päätelty valkuaisaineen aminohappojärjestys sisältää 3 mahdollista N-välitteistä glykosylaatiokohtaa, joissa esiintyvä järjestys ön Asn-X-Thr/Ser (aminohappojen asemat 145, 195, ja 256). Puhdistetun kokonaisen TFI:n ja kahden eristetyn proteolyyttisen 20 osasen aminohappojärjestyksen analyysit vastaavat täysin cDNA-jaksosta pääteltyä valkuaisainejaksoa (kuva 3., alleviivattu), osoittaen eristetyn cDNA-kloonin koodittavan TFI:a. 3'-Ei-koodittava alue sisältää runsaasti A+T-nukleotidipareja (70% A+T). Tästä kloonista ei löydetty 25 konsensus -polyadenylaatiosignaalia AATAAA [Proudfoot ja Brownlee, Nature 252, 359-362 (1981)] eikä poly A -häntää mahdollisesti siksi, että osa 3' pään puoleisesta alueesta on keinotekoisesti hävinnyt kirjastoa valmistettaessa.

30 Varauksen i akautuminen, hydrofobisuus/hydrof iilisyys ja sisäinen samankaltaisuus TFI:n translatortu aminohappojärjestys sisältää 27 lysiiniä, 17 arginiinia, 11 asparagiinihappoa ja 25 glutamiinihappoa. Varauksen jakautuminen proteiinissa on 35 hyvin epätasainen, kuten kuvasta 4. voidaan havaita.

93365 17

Signaalipeptidijakso sisältää 2 positiivisesti varautunutta lysiiniä, joiden lisäksi siinä on 26 neutraalia ryhmää. Lopullisen valkuaisaineen aminopään alue sisältää hyvin negatiivisesti varautuneen alueen. Kuusi ensimmäisistä 5 7:stä aminohapporyhmästä on joko asparagiinihappoa tai glutamiinihappoa, joiden jäljessä seuraa lähellä kaksi muuta negatiivisesti varautunutta aminohappoa ennenkuin positiivisesti varautunut lysiiniryhmä ilmaantuu. Molekyylin keskiosa on yleensä negatiivisesti varautunut.

10 Karboksipäässä on hyvin positiivisesti varautunut seg mentti. TFI:n aminohapot 265-293 sisältävät 14 positiivisesti varautunutta aminohapppoa mukaanlukien 6-arginiini + lysiiniryhmää.

TFI-valkuaisaineen ennustettu hydrofobisuus/hydro-15 fiilisyysprofiili on esitetty kuvassa 5. Signaalipeptidi sisältää hyvin hydrofobisen alueen, kuten odotettiinkin. Muu osa molekyylistä vaikuttaa jokseenkin hydrofiiliseltä.

TFI:n translatoitu aminohappojakso sisältää useita toisistaan erottuvia alueita. Paitsi hyvin negatiivisesti 20 varautuneesta N-pään alueesta ja hyvin positiivisesti varautuneesta C-pään alueesta, keskiosa muodostuu 3:sta samankaltaisesta alueesta, joilla on Kunitz-tyypin inhibiittoreille tyypillisiä jaksoja (ks. alla).

25 Samankaltaisuus muihin valkuaisaineisiin nähden

National Biomedical Research Foundationin aminohappo järjestystietokannasta tehdyn haun perusteella havaittiin, että TFI:n N-pään alue ja C-pään alue eivät osoita merkittävää samankaltaisuutta muihin valkuais-30 aineisiin nähden. Kuitenkin kolme sisäistä samankaltaista aluetta ovat kukin samankaltaisia muihin emäksisiin proteaasi-inhibiittoreihin nähden, mukaanlukien naudan haiman emäksinen proteaasi-inhibiittori (aprotiniini), käärmeenmyrkyn emäksiset proteaasi-inhibiittorit, ja 35 inter-OC-trypsiini-inhibiittorit (kuva 6.). On huomionar- 18 93365 voista, että disulfidisitoutumisrakenne on säilynyt hyvin kaikissa näissä inhibiittoreissa. Näihin samankaltaisiin piirteisiin perustuen on selvää, että TFI kuuluu emäksisten proteaasi-inhibiittorien geenien superperheeseen.

5

Northern-imeytystesti TFI:a tuottavista maksaperäisistä, Chang-maksasolu-jen, HepG2 maksakasvainsolujen ja SK-HEP-1 maksakasvain-solujen solulinjoista puhdistettiin poly(A)+ RNA:t. 10 Poly(A)+ RNA:t eroteltiin denaturoivalla geelielektrofo-reesilla, vyöhykkeet siirrettiin nitroselluloosapaperiin imeyttämällä näytteitä tämän läpi ja testattiin 3 2 P-merkityllä TFI-cDNA( lambda-P9 ) -koettimella. Kuten kuvasta 7. näkyy, kaksi 1.4 ke:n ja 4.4 ke:n mRNA:ta vastaavaa 15 hybridisaatiovyöhykettä havaittiin kaikissa kolmessa testatussa solulinjassa. Testattiin useita muita sellaisia solulinjoja, jotka eivät tuottaneet havaittavia määriä TFI:a ja joissa ei havaittu hybridisoitumista koettimeen (tuloksia ei ole esitetty).

20 Monien muiden sellaisten esimerkkien olemassaolo, jotka eivät poikkea keksinnön hengestä ja sen suoritustavasta, on selvää tavanomaisen ammattitaidon omaaville tämän patenttikuvauksen lukemisen jälkeen. Kaikki nämä esimerkit on tarkoitettu kuulumaan oheisten patentti-25 vaatimusten piiriin.

· I . Utit J4& I i 1"M · I

Claims (1)

19 93365 Patenttivaatimus cDNA, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen kudostekijäinhibiittoria ja on kuvion 3 mukainen 5 cDNA-sekvenssi. 10 cDNA, kännetecknat därav, att det kodar för human vävnadsfaktorinhibitor och är den i figur 3 angivna cDNA-sekvensen.