JP2002097200A - 組織因子抑制因子に対する抗体 - Google Patents
組織因子抑制因子に対する抗体Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 本発明はヒト組織因子抑制因子の抗体に関す
る。 【解決手段】 本質的に組織因子抑制因子の全長を示す
ｃＤＮＡクローンの完全コード配列およびアミノ酸配列
の決定。
る。 【解決手段】 本質的に組織因子抑制因子の全長を示す
ｃＤＮＡクローンの完全コード配列およびアミノ酸配列
の決定。
Description
【０００１】（発明の背景）本発明は、組織因子抑制因
子（ＴＦＩ）あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子
（ＬＡＣＩ）として知られる凝固抑制因子に関する。更
に詳細には、本発明は全長ＴＦＩを本質的に表現してい
るｃＤＮＡクローンに関する。
子（ＴＦＩ）あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子
（ＬＡＣＩ）として知られる凝固抑制因子に関する。更
に詳細には、本発明は全長ＴＦＩを本質的に表現してい
るｃＤＮＡクローンに関する。
【０００２】哺乳動物の血液での凝固カスケードには、
２つの異なるシステム、即ち内因性システムと外因性シ
ステムとがある。後者の外因性システムは、血液が組織
スロンボプラステイン（第III 因子）（以後、組織因子
（ＴＦ）と言う）にさらされることによって活性化され
る。この組織因子は、各種の細胞のプラズマメンブレン
中で生じるリポタンパク質であり、特に脳及び肺におい
て多く存在する。プラズマ第ＶII因子あるいはその活性
体である第ＶIIａ因子がＴＦと接触すると、ＴＦととも
にカルシウム依存性複合体を形成し、これがタンパク加
水分解作用を発揮して第Ｘ因子を第Ｘａ因子にまた第Ｉ
Ｘ因子を第ＩＸａ因子に活性化する。
２つの異なるシステム、即ち内因性システムと外因性シ
ステムとがある。後者の外因性システムは、血液が組織
スロンボプラステイン（第III 因子）（以後、組織因子
（ＴＦ）と言う）にさらされることによって活性化され
る。この組織因子は、各種の細胞のプラズマメンブレン
中で生じるリポタンパク質であり、特に脳及び肺におい
て多く存在する。プラズマ第ＶII因子あるいはその活性
体である第ＶIIａ因子がＴＦと接触すると、ＴＦととも
にカルシウム依存性複合体を形成し、これがタンパク加
水分解作用を発揮して第Ｘ因子を第Ｘａ因子にまた第Ｉ
Ｘ因子を第ＩＸａ因子に活性化する。
【０００３】ＴＦによりイニシエイトされる凝固系の制
御に関するこれまでの研究により、ＴＦを血清とともに
インキュベーション（粗組織スロンボプラステイン調製
物中で）すると、その活性がｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制さ
れまたＴＦをマウスに注入した時の致死効果が阻止され
ることが明らかにされている。Ｈｊｏｒｔの精力的な研
究によって、この分野におけるそれまでの研究成果が確
認され更に研究が進められて、血清中の抑制成分が第Ｖ
II−ＴＦ複合因子を認識することが結論として示された
〔Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．
９，ｓｕｐｐｌ．２７，７６〜９７（１９５７）〕。こ
の結論は、プラズマ中で生じるＴＦの抑制にはＣａ2+の
存在が必要であり（第ＶII／ＶIIａ因子がＴＦに結合す
る際にもＣａ2+の存在が必要）ＴＦの抑制はＥＤＴＡに
よる２価のカチオンのキレート化によって阻止され及び
／又は逆転されるという事実と符合している。
御に関するこれまでの研究により、ＴＦを血清とともに
インキュベーション（粗組織スロンボプラステイン調製
物中で）すると、その活性がｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制さ
れまたＴＦをマウスに注入した時の致死効果が阻止され
ることが明らかにされている。Ｈｊｏｒｔの精力的な研
究によって、この分野におけるそれまでの研究成果が確
認され更に研究が進められて、血清中の抑制成分が第Ｖ
II−ＴＦ複合因子を認識することが結論として示された
〔Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．
９，ｓｕｐｐｌ．２７，７６〜９７（１９５７）〕。こ
の結論は、プラズマ中で生じるＴＦの抑制にはＣａ2+の
存在が必要であり（第ＶII／ＶIIａ因子がＴＦに結合す
る際にもＣａ2+の存在が必要）ＴＦの抑制はＥＤＴＡに
よる２価のカチオンのキレート化によって阻止され及び
／又は逆転されるという事実と符合している。
【０００４】最近の研究によって、プラズマあるいは血
清中でＴＦを抑制するには第ＶIIａ因子だけではなく触
媒的に活性な第Ｘａ因子と更に他の因子が必要であるこ
とが明らかにされている〔ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉｃ
ｈ、Ｂｌｏｏｄ６９，１５０〜１５５（１９８７）；Ｓ
ａｎｄｅｒｓら、Ｉｂｉｄ．，６６，２０４〜２１２
（１９８５）〕。この他の因子は組織因子抑制因子（Ｔ
ＦＩ）あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子（ＬＡ
ＣＩ）と定義されるものであり、バリウム吸着プラズマ
中に存在している。また血清を遠心して密度１．２１ｇ
／ｃｍ3とした時の浮遊液中のリポタンパク質フラクシ
ョンとともにＴＦＩ活性が分離されることから、この因
子はリポタンパク質と関連しているものと考えられる。
清中でＴＦを抑制するには第ＶIIａ因子だけではなく触
媒的に活性な第Ｘａ因子と更に他の因子が必要であるこ
とが明らかにされている〔ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉｃ
ｈ、Ｂｌｏｏｄ６９，１５０〜１５５（１９８７）；Ｓ
ａｎｄｅｒｓら、Ｉｂｉｄ．，６６，２０４〜２１２
（１９８５）〕。この他の因子は組織因子抑制因子（Ｔ
ＦＩ）あるいはリポタンパク質関連凝固抑制因子（ＬＡ
ＣＩ）と定義されるものであり、バリウム吸着プラズマ
中に存在している。また血清を遠心して密度１．２１ｇ
／ｃｍ3とした時の浮遊液中のリポタンパク質フラクシ
ョンとともにＴＦＩ活性が分離されることから、この因
子はリポタンパク質と関連しているものと考えられる。
【０００５】ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉｃｈ、Ｂｌｏｏ
ｄ６９，１５０〜１５５（１９８７）及びＰｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、１８８６〜１
８９０（１９８７）によればＨｅｐＧ２細胞（ヒトヘパ
トーマセルライン）が、プラズマ中に存在するＴＦＩと
同様の特性を有する抑制成分を分泌することが示されて
いる。
ｄ６９，１５０〜１５５（１９８７）及びＰｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、１８８６〜１
８９０（１９８７）によればＨｅｐＧ２細胞（ヒトヘパ
トーマセルライン）が、プラズマ中に存在するＴＦＩと
同様の特性を有する抑制成分を分泌することが示されて
いる。
【０００６】米国同時係属出顧Ｓｅｒ．Ｎｏ．７７，３
６６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）には、
ＨｅｐＧ２細胞から分泌された精製組織因子抑制因子が
記戴されている。この組織因子抑制因子には２つの形
態、即ちナトリウムドデシルスルフェートポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した時
に約３７，０００〜４０，０００ダルトンの位置に現わ
れるＴＦＩ1と約２５，０００〜２６，０００ダルトン
の位置に現われるＴＦＩ2との２つの形態が存在するこ
とが見出されている。ＴＦＩのアミノ酸配列のＮ−末端
部分が以下のように決定されている。
６６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）には、
ＨｅｐＧ２細胞から分泌された精製組織因子抑制因子が
記戴されている。この組織因子抑制因子には２つの形
態、即ちナトリウムドデシルスルフェートポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した時
に約３７，０００〜４０，０００ダルトンの位置に現わ
れるＴＦＩ1と約２５，０００〜２６，０００ダルトン
の位置に現われるＴＦＩ2との２つの形態が存在するこ
とが見出されている。ＴＦＩのアミノ酸配列のＮ−末端
部分が以下のように決定されている。
【化１】 （Ｘ−Ｘは未決定である） 上記米国出願明細書の記載は本明細書に引用する。
【０００７】発明の要旨本発明によれば、本質的に組織
因子抑制因子の全長を表現するｃＤＮＡクローンの完全
コード配列が見出された。最初に、ヒト胎盤及び胎児肝
λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーを、精製ＴＦＩに対
するラビットポリクローナル血清でスクリーニングし
た。免疫学的にポジティブなクローンについて、更に
125Ｉ−第Ｘａ因子結合活性をスクリーニングした。免
疫学的にかつ機能的に活性な７個のクローンが得られ
た。最も長いクローンは胎盤由来λＰ９であって１．４
キロベース（ｋｂ）であり、他の６個のクローンは１．
０ｋｂであった。部分的ＤＮＡ配列決定により、１．０
ｋｂクローンは１．４ｋｂクローンの１部分と同じ配列
を有することが明らかになった。ヌクレオチド配列分析
により、λＰ９は、１３３ｂｐの５′非コード領域、９
１２ｂｐのオープン・リーディング・フレーム、ストッ
プコドン及び３８４ｂｐの３′非コード領域を含む１４
３２塩基対（ｂｐ）のｃＤＮＡインサート配列からなる
ことが明らかにされた。
因子抑制因子の全長を表現するｃＤＮＡクローンの完全
コード配列が見出された。最初に、ヒト胎盤及び胎児肝
λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーを、精製ＴＦＩに対
するラビットポリクローナル血清でスクリーニングし
た。免疫学的にポジティブなクローンについて、更に
125Ｉ−第Ｘａ因子結合活性をスクリーニングした。免
疫学的にかつ機能的に活性な７個のクローンが得られ
た。最も長いクローンは胎盤由来λＰ９であって１．４
キロベース（ｋｂ）であり、他の６個のクローンは１．
０ｋｂであった。部分的ＤＮＡ配列決定により、１．０
ｋｂクローンは１．４ｋｂクローンの１部分と同じ配列
を有することが明らかになった。ヌクレオチド配列分析
により、λＰ９は、１３３ｂｐの５′非コード領域、９
１２ｂｐのオープン・リーディング・フレーム、ストッ
プコドン及び３８４ｂｐの３′非コード領域を含む１４
３２塩基対（ｂｐ）のｃＤＮＡインサート配列からなる
ことが明らかにされた。
【０００８】このｃＤＮＡ配列は、１８個のシステイン
及び７個のメチオニンを含む２７６個のアミノ酸からな
る３１，９５０ダルトンの蛋白質をコードしている。翻
訳されたアミノ配列により、成熟ＴＦＩ蛋白の先には約
２８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが存在する
ことが明らかにされた。ここで言う“成熟”ＴＦＩと
は、本明細書において記載するλＰ９クローンのＡＴＧ
翻訳コドンによってＴＦＩとメチオニルＴＦＩとの両者
を含むように定義されるものであり、このことは以下の
記載から理解することができよう。ＴＦＩ蛋白には、Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは普通の２０個のアミノ
酸のうちのいずれでもよい）の配列を有する３個のＮ−
結合グリコシル化部位が存在する。これらの部位は、
５′非コード領域の後の最初のメチオニンの位置をアミ
ノ酸の位置＋１とした時、Ａｓｎ１４５，Ａｓｎ１９５
及びＡｓｎ２５６の位置にある。
及び７個のメチオニンを含む２７６個のアミノ酸からな
る３１，９５０ダルトンの蛋白質をコードしている。翻
訳されたアミノ配列により、成熟ＴＦＩ蛋白の先には約
２８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが存在する
ことが明らかにされた。ここで言う“成熟”ＴＦＩと
は、本明細書において記載するλＰ９クローンのＡＴＧ
翻訳コドンによってＴＦＩとメチオニルＴＦＩとの両者
を含むように定義されるものであり、このことは以下の
記載から理解することができよう。ＴＦＩ蛋白には、Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは普通の２０個のアミノ
酸のうちのいずれでもよい）の配列を有する３個のＮ−
結合グリコシル化部位が存在する。これらの部位は、
５′非コード領域の後の最初のメチオニンの位置をアミ
ノ酸の位置＋１とした時、Ａｓｎ１４５，Ａｓｎ１９５
及びＡｓｎ２５６の位置にある。
【０００９】ＴＦＩの翻訳されたアミノ酸配列により、
該アミノ酸配列は、高度にマイナスに荷電したＮ末端部
分、高度にプラスに荷電したカルボキシ末端部分、及び
Ｋｕｎｉｔｚ型酵素抑制因子の典型的配列を有する３個
の相同ドメインからなる介在配列部分などのいくつかの
識別可能な領域を有していることが明らかにされた。相
同性についての研究から、ＴＦＩは塩基性プロテアーゼ
抑制因子遺伝子スーパーファミリーに属するものと考え
られる。
該アミノ酸配列は、高度にマイナスに荷電したＮ末端部
分、高度にプラスに荷電したカルボキシ末端部分、及び
Ｋｕｎｉｔｚ型酵素抑制因子の典型的配列を有する３個
の相同ドメインからなる介在配列部分などのいくつかの
識別可能な領域を有していることが明らかにされた。相
同性についての研究から、ＴＦＩは塩基性プロテアーゼ
抑制因子遺伝子スーパーファミリーに属するものと考え
られる。
【００１０】ｃＤＮＡクローンλＰ９を開発するために
用いた蛋白材料はヒト胎盤組織であり、この組織は通常
の外科的手法による分娩後に広く入手することができ
る。本発明において用いられているλｇｔ１１（ｌａｃ
５ ｎｉｎ５ ｃ１８５７ ｓ１００）はよく知られた
ものであって、普通に入手することのできるラムダファ
ージ発現ベクターである。その構成及び制限酵素地図
は、ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，１１９４〜１１９８（１
９８３）に記載されている。ノーザン・ブロット分析に
より、肝由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、Ｈｅ
ｐＧ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマは、
ＴＦＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズする２つの主要なｍ
ＲＮＡ（１．４ｋｂと４．４ｋｂ）を有していることが
明らかにされた。
用いた蛋白材料はヒト胎盤組織であり、この組織は通常
の外科的手法による分娩後に広く入手することができ
る。本発明において用いられているλｇｔ１１（ｌａｃ
５ ｎｉｎ５ ｃ１８５７ ｓ１００）はよく知られた
ものであって、普通に入手することのできるラムダファ
ージ発現ベクターである。その構成及び制限酵素地図
は、ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，１１９４〜１１９８（１
９８３）に記載されている。ノーザン・ブロット分析に
より、肝由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、Ｈｅ
ｐＧ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマは、
ＴＦＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズする２つの主要なｍ
ＲＮＡ（１．４ｋｂと４．４ｋｂ）を有していることが
明らかにされた。
【００１１】本明細書に記載した如き、ＴＦＩのための
ｃＤＮＡのクローニング及びその全蛋白配列及び構造の
解明により、詳細な構造−機能分析が可能となり、また
その生合成的レギュレーションの研究のための基本的知
識が得られる。しかして本発明は、第Ｘａ因子及び第Ｖ
IIａ／ＴＦ酵素複合因子を抑制することのできる試薬に
ついての血液凝固カスケード研究にとって重要なもので
ある。
ｃＤＮＡのクローニング及びその全蛋白配列及び構造の
解明により、詳細な構造−機能分析が可能となり、また
その生合成的レギュレーションの研究のための基本的知
識が得られる。しかして本発明は、第Ｘａ因子及び第Ｖ
IIａ／ＴＦ酵素複合因子を抑制することのできる試薬に
ついての血液凝固カスケード研究にとって重要なもので
ある。
【００１２】図面の詳細な記述 本明細書においては、特許請求の範囲の記載によって本
発明を形成すると考えられる対象が特に指摘され明白に
クレームされているが、以下に記述する図面についての
説明とともに本発明の好ましい態様についての記載によ
り本発明がよりよく理解されるものと考える。
発明を形成すると考えられる対象が特に指摘され明白に
クレームされているが、以下に記述する図面についての
説明とともに本発明の好ましい態様についての記載によ
り本発明がよりよく理解されるものと考える。
【００１３】図１は、125Ｉ−第Ｘａ因子を用いたλｇ
ｔ１１クローンのスクリーニングを示したものである。
クローン化ファージの溶解物（０．１ｍｌ）を、ドット
・プロット装置を用いたサクションによりニトロセルロ
ースペーパー上にスポットし、次いでニトロセルロース
ペーパーを125Ｉ−第Ｘａ因子でプローブし、以後に記
述するようにしてオートラジオグラフィーに付した。黒
いスポットとして現われているクローンが125Ｉ−第Ｘ
ａ因子と結合したポジティブ・クローンである。コント
ロールλｇｔ１１（下の右側のコーナー）及び他のクロ
ーンは125Ｉ−第Ｘａ因子と結合しなかった。
ｔ１１クローンのスクリーニングを示したものである。
クローン化ファージの溶解物（０．１ｍｌ）を、ドット
・プロット装置を用いたサクションによりニトロセルロ
ースペーパー上にスポットし、次いでニトロセルロース
ペーパーを125Ｉ−第Ｘａ因子でプローブし、以後に記
述するようにしてオートラジオグラフィーに付した。黒
いスポットとして現われているクローンが125Ｉ−第Ｘ
ａ因子と結合したポジティブ・クローンである。コント
ロールλｇｔ１１（下の右側のコーナー）及び他のクロ
ーンは125Ｉ−第Ｘａ因子と結合しなかった。
【００１４】図２は、部分的制限酵素地図及びλＰ９の
インサート配列の配列決定に用いた技法を示している。
下に示したスケールはヌクレオチドの位置を示してい
る。太い棒線はコード領域を示しており、細い棒線は
５′及び３′非コード領域を示している。制限酵素部位
は消化により確認した。矢印はｃＤＮＡの配列決走に用
いたオーバーラッピングＭ１３クローンを示している。
インサート配列の配列決定に用いた技法を示している。
下に示したスケールはヌクレオチドの位置を示してい
る。太い棒線はコード領域を示しており、細い棒線は
５′及び３′非コード領域を示している。制限酵素部位
は消化により確認した。矢印はｃＤＮＡの配列決走に用
いたオーバーラッピングＭ１３クローンを示している。
【００１５】図３および４はヒトＴＦＩ ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列及び翻訳されたアミノ酸配列を示してい
る。ヌクレオチドの番号は左側に示されており、アミノ
酸の番号は右側に示されている。下線を引いた配列は、
精製したＴＦＩ蛋白と、Ｖ8プロテアーゼとトリプシン
で消化したペプチドとを用いたアミノ酸配列分析によっ
て独立に確認された配列である。＋１のアミノ酸は、
５′非コード領域のストップコドンの後にある最初のメ
チオニンである。Ｎ−結合グリコシル化部位は星印で示
されている。
クレオチド配列及び翻訳されたアミノ酸配列を示してい
る。ヌクレオチドの番号は左側に示されており、アミノ
酸の番号は右側に示されている。下線を引いた配列は、
精製したＴＦＩ蛋白と、Ｖ8プロテアーゼとトリプシン
で消化したペプチドとを用いたアミノ酸配列分析によっ
て独立に確認された配列である。＋１のアミノ酸は、
５′非コード領域のストップコドンの後にある最初のメ
チオニンである。Ｎ−結合グリコシル化部位は星印で示
されている。
【００１６】図５は、ＴＦＩのアミノ酸配列における電
荷分布を示すグラフである。電荷は最初のアミノ酸残基
からｉ番目のアミノ酸残基までを計算したものであり、
その電荷の値がｉ番目の残基に示されている。従って、
ｉ番目の位置の値は、最初のアミノ酸残基からｉ番目の
アミノ酸残基までの全ての電荷を合計したものであり、
ｉ番目とｊ番目（ｊ＞ｉ）のアミノ酸残基における値の
差は、ｉ番目からｊ番目までのアミノ酸残基の合計電荷
を示すものである。
荷分布を示すグラフである。電荷は最初のアミノ酸残基
からｉ番目のアミノ酸残基までを計算したものであり、
その電荷の値がｉ番目の残基に示されている。従って、
ｉ番目の位置の値は、最初のアミノ酸残基からｉ番目の
アミノ酸残基までの全ての電荷を合計したものであり、
ｉ番目とｊ番目（ｊ＞ｉ）のアミノ酸残基における値の
差は、ｉ番目からｊ番目までのアミノ酸残基の合計電荷
を示すものである。
【００１７】図６は、ＴＦＩの疎水性プロファイルを示
すグラフである。アミノ酸残基の疎水性の指数をアミノ
酸残基が蛋白内に埋没された深さ（Ｘ線による結晶学的
データから得られる）として定義するコンピュータープ
ログラムによって、疎水性プロファイルを分析した〔Ｋ
ｉｎｄｅｒａら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．４，
２３〜５５（１９８５）〕。アミノ酸配列に沿った疎水
性プロファイルは、ＩＭＳＬ ＬＩｂｒａｒｙのプログ
ラムＩＣＳＳＣＵを用いることによって、滑らかになっ
た〔ＩＭＳＬ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｍａｎｕａｌ，９ｔｈ ｅｄ．，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｆｏｒ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｔａｔ
ｉｓｔｉｃａｌ Ｓｕｂｒｏｕｔｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒ
ｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ（１９８２）〕。
すグラフである。アミノ酸残基の疎水性の指数をアミノ
酸残基が蛋白内に埋没された深さ（Ｘ線による結晶学的
データから得られる）として定義するコンピュータープ
ログラムによって、疎水性プロファイルを分析した〔Ｋ
ｉｎｄｅｒａら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．４，
２３〜５５（１９８５）〕。アミノ酸配列に沿った疎水
性プロファイルは、ＩＭＳＬ ＬＩｂｒａｒｙのプログ
ラムＩＣＳＳＣＵを用いることによって、滑らかになっ
た〔ＩＭＳＬ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｍａｎｕａｌ，９ｔｈ ｅｄ．，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｆｏｒ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｔａｔ
ｉｓｔｉｃａｌ Ｓｕｂｒｏｕｔｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒ
ｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ（１９８２）〕。
【００１８】図７は、ＴＦＩの塩基性プロテアーゼ抑制
因子ドメインと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのア
ラインメントを示す。ＴＦＩ以外の他の全ての配列は、
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの蛋白配列データベース
（Ｇｅｏｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，レリース１３，Ｊｕｎｅ１
９８７）から得たものである。 １：牛塩基性プロテアーゼ抑制因子前駆体； ２：牛初乳トリプシン抑制因子； ３：牛血清塩基性プロテアーゼ抑制因子； ４：食用カタツムリ・イソ抑制因子Ｋ； ５：紅海ウミガメ塩基性プロテアーゼ抑制因子 （１〜７９のアミノ酸のみ）； ６：ウエスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ
抑制因子Ｉ； ７：リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II； ８：ケープ・コブラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子I
I； ９：ルッセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子I
I； １０：サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II
I ； １１：イースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロ
テアーゼ抑制因子Ｉホモローグ； １２：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｂ； １３：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｅ； １４：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｉ； １５：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｋ； １６：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（マイナー）； １７：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジャー）； １８：β−２−ブンガロトキシンＢ鎖； １９：ウマ・インターα−トリプシン抑制因子〔アミノ
酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２０：ブタ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２１：ウシ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２２：ヒト・α−１−マイクログロブリン／インター−
α−トリプシン抑制因子前駆体〔アミノ酸２２７〜２８
３（１）；２８４〜３５２（２）〕； ２３：ＴＦＩ〔アミノ酸４７〜１１７（１）；１１８〜
１８８（２）；２１０〜２８０（３）〕。 最良のアラインメントを達成するためには１６，１７，
１８にギャップが含まれていた。アミノ酸を示す標準的
１文字コードを用いた。
因子ドメインと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのア
ラインメントを示す。ＴＦＩ以外の他の全ての配列は、
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの蛋白配列データベース
（Ｇｅｏｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，レリース１３，Ｊｕｎｅ１
９８７）から得たものである。 １：牛塩基性プロテアーゼ抑制因子前駆体； ２：牛初乳トリプシン抑制因子； ３：牛血清塩基性プロテアーゼ抑制因子； ４：食用カタツムリ・イソ抑制因子Ｋ； ５：紅海ウミガメ塩基性プロテアーゼ抑制因子 （１〜７９のアミノ酸のみ）； ６：ウエスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ
抑制因子Ｉ； ７：リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II； ８：ケープ・コブラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子I
I； ９：ルッセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子I
I； １０：サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II
I ； １１：イースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロ
テアーゼ抑制因子Ｉホモローグ； １２：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｂ； １３：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｅ； １４：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｉ； １５：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｋ； １６：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（マイナー）； １７：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジャー）； １８：β−２−ブンガロトキシンＢ鎖； １９：ウマ・インターα−トリプシン抑制因子〔アミノ
酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２０：ブタ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２１：ウシ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミ
ノ酸１〜５７（１）；５８〜１２３（２）〕； ２２：ヒト・α−１−マイクログロブリン／インター−
α−トリプシン抑制因子前駆体〔アミノ酸２２７〜２８
３（１）；２８４〜３５２（２）〕； ２３：ＴＦＩ〔アミノ酸４７〜１１７（１）；１１８〜
１８８（２）；２１０〜２８０（３）〕。 最良のアラインメントを達成するためには１６，１７，
１８にギャップが含まれていた。アミノ酸を示す標準的
１文字コードを用いた。
【００１９】図８は、３個の肝由来セルラインから得た
ＲＮＡのノーザン・ブロット分析を示す。１レーン当り
１０μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを用いた。 レーン１：ｃｈａｎｇリバー細胞、 レーン２：ＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ細胞、 レーン３：ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞． 本明細書においては、標準的生化学命名法を用いてお
り、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ）として表わさ
れている。対応するヌクレオチドは、例えばデオキシグ
アノシン−５′−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）であ
る。ＤＮＡヌクレオチド配列は、便宜上慣用的に１本鎖
のみで示されており、１本鎖におけるＡはその相補性塩
基としてＴを内包しており、ＧはＣを内包している。ア
ミノ酸は、以下の表に示すように１文字あるいは３文字
で示されている。
ＲＮＡのノーザン・ブロット分析を示す。１レーン当り
１０μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを用いた。 レーン１：ｃｈａｎｇリバー細胞、 レーン２：ＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ細胞、 レーン３：ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞． 本明細書においては、標準的生化学命名法を用いてお
り、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ）として表わさ
れている。対応するヌクレオチドは、例えばデオキシグ
アノシン−５′−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）であ
る。ＤＮＡヌクレオチド配列は、便宜上慣用的に１本鎖
のみで示されており、１本鎖におけるＡはその相補性塩
基としてＴを内包しており、ＧはＣを内包している。ア
ミノ酸は、以下の表に示すように１文字あるいは３文字
で示されている。
【００２０】
【表１】 略 号 アミノ酸 Ａ Ａｌａ アラニン Ｃ Ｃｙｓ システイン Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｇ Ｇｌｙ グリシン Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン Ｋ Ｌｙｓ リシン Ｌ Ｌｅｕ ロイシン Ｍ Ｍｅｔ メチオニン Ｎ Ａｓｎ アスパラギン Ｐ Ｐｒｏ プロリン Ｑ Ｇｌｎ グルタミン Ｒ Ａｒｇ アルギニン Ｓ Ｓｅｒ セリン Ｔ Ｔｈｒ スレオニン Ｖ Ｖａ１ バリン Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン Ｙ Ｔｙｒ チロシン
【００２１】本明細書において記載される普通に入手し
得る制限酵素は、以下に示す制限配列及び開裂パターン
（矢印で示した）を有している。
得る制限酵素は、以下に示す制限配列及び開裂パターン
（矢印で示した）を有している。
【化２】
【００２２】本発明の好ましい態様を更に詳細に説明す
るために、以下に記述する実験を実施した。
るために、以下に記述する実験を実施した。
【００２３】例１ 材料 ヒト胎盤及び胎児肝ｃＤＮＡライブラリーをＣｌｏｎｅ
ｔｅｃｈから得た。プロトブロット（Ｐｒｏｔｏｂｌｏ
ｔ）・イムノスクリーニング・キットはＰｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃｈから講入した。制限酵素はＮｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから講入した。牛腸アルカ
リ・ホスファターゼ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー）、エキソヌクレアーゼIII 及び
Ｓ１ヌクレアーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍから購入した。ｄＮＴＰはＰ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓから購入した。５′−〔α−35Ｓ〕−チ
オ−ｄＡＴＰ（６００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）はＡｍｅｒｓ
ｈａｍから購入した。配列決定用キット（Ｓｅｑｕｅｎ
ａｓｅ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓから購入した。Ｃｈａｎｇリバー細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ１３）及びＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞
（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションから得た。ＳＫ−ＨＥＰ−１
ヘパトーマ細胞は、Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈのＧ．Ｔｒｅｍｐｅによって１９７１年に肝ア
デノカルシノーマから誘導されたものであり、現在で広
く容易に入手可能である。
ｔｅｃｈから得た。プロトブロット（Ｐｒｏｔｏｂｌｏ
ｔ）・イムノスクリーニング・キットはＰｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃｈから講入した。制限酵素はＮｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから講入した。牛腸アルカ
リ・ホスファターゼ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー）、エキソヌクレアーゼIII 及び
Ｓ１ヌクレアーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍから購入した。ｄＮＴＰはＰ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓから購入した。５′−〔α−35Ｓ〕−チ
オ−ｄＡＴＰ（６００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）はＡｍｅｒｓ
ｈａｍから購入した。配列決定用キット（Ｓｅｑｕｅｎ
ａｓｅ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓから購入した。Ｃｈａｎｇリバー細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ１３）及びＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞
（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションから得た。ＳＫ−ＨＥＰ−１
ヘパトーマ細胞は、Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈのＧ．Ｔｒｅｍｐｅによって１９７１年に肝ア
デノカルシノーマから誘導されたものであり、現在で広
く容易に入手可能である。
【００２４】125Ｉ−第Ｘａ因子は、ヨード源を用いて
放射標識することにより調製した。この比活性は２００
０ｄｐｍ／ｎｇであった。放射活性の９７％以上は１０
％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈澱可能であった。
ヨード化蛋白は、ＳｅｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＸａ（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ製）に対してそ
の触媒活性を８０％以上保持していた。
放射標識することにより調製した。この比活性は２００
０ｄｐｍ／ｎｇであった。放射活性の９７％以上は１０
％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈澱可能であった。
ヨード化蛋白は、ＳｅｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＸａ（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ製）に対してそ
の触媒活性を８０％以上保持していた。
【００２５】抗−ＴＦＩ−ＩｇセファロースTM４Ｂカラ
ムは以下のようにして調製した。即ち、成熟ＴＦＩのア
ミノ酸３−２５の配列に相当する配列を含むペプチド
（ＴＦＩ−ペプチド）を、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの固相ペ
プチド合成システムを用いて合成した。ＴＦＩ−ペプチ
ド（５ｍｇ）を、グルタルアルデヒドによりキーホール
（Ｋｅｙｈｏｌｅ）・リンペット（ｌｙｍｐｅｔ）・ヘ
モシアニン１０ｍｇに結合させてコンジュゲートを調製
した。２匹のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄホワイト・ラビッ
トに、フロイント・完全・アジュバンド１ｍｌと、上記
コンジュゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド２００μｇ）
を含むホモジェネートを皮内注射して、それぞれ免疫化
した。１ケ月後に、フロイント・不完全・アジュバント
１ｍｌとコンジュゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド１０
０μｇ）を含むホモジェネートで、２匹のラビットをそ
れぞれブースターした。３ケ月の間、１週間毎に抗血清
を採取し、１ケ月毎にブースター注射を行なった。ＴＦ
Ｉ−ペプチドに対する特異的抗体を単離するために、抗
血清をＴＦＩ−ペプチドセファロース４Ｂカラムを用い
たクロマトグラフィーに付した。カラムを、１０倍量の
ＰＢＳ（０．４Ｍ Ｎａｃｌ−０．１Ｍベンズアミジン
−１％トリトンTMＸ−１００）及びトリトンＸ−１００
を含まない同様の溶液で洗った。０．１Ｍグリシン／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ２．２で抗体を溶出させ、直ちに１／１０倍
量の１Ｍトリス−ＯＨを加えて中和し、次いで食塩水に
対して透析した。単離された抗体を、シアノゲン・ブロ
マイドで活性化させたセファロース４Ｂに製造業者（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）の指針に従って結合させ、これを細
胞培養培地からのＴＦＩの単離に用いた。
ムは以下のようにして調製した。即ち、成熟ＴＦＩのア
ミノ酸３−２５の配列に相当する配列を含むペプチド
（ＴＦＩ−ペプチド）を、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの固相ペ
プチド合成システムを用いて合成した。ＴＦＩ−ペプチ
ド（５ｍｇ）を、グルタルアルデヒドによりキーホール
（Ｋｅｙｈｏｌｅ）・リンペット（ｌｙｍｐｅｔ）・ヘ
モシアニン１０ｍｇに結合させてコンジュゲートを調製
した。２匹のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄホワイト・ラビッ
トに、フロイント・完全・アジュバンド１ｍｌと、上記
コンジュゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド２００μｇ）
を含むホモジェネートを皮内注射して、それぞれ免疫化
した。１ケ月後に、フロイント・不完全・アジュバント
１ｍｌとコンジュゲート１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド１０
０μｇ）を含むホモジェネートで、２匹のラビットをそ
れぞれブースターした。３ケ月の間、１週間毎に抗血清
を採取し、１ケ月毎にブースター注射を行なった。ＴＦ
Ｉ−ペプチドに対する特異的抗体を単離するために、抗
血清をＴＦＩ−ペプチドセファロース４Ｂカラムを用い
たクロマトグラフィーに付した。カラムを、１０倍量の
ＰＢＳ（０．４Ｍ Ｎａｃｌ−０．１Ｍベンズアミジン
−１％トリトンTMＸ−１００）及びトリトンＸ−１００
を含まない同様の溶液で洗った。０．１Ｍグリシン／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ２．２で抗体を溶出させ、直ちに１／１０倍
量の１Ｍトリス−ＯＨを加えて中和し、次いで食塩水に
対して透析した。単離された抗体を、シアノゲン・ブロ
マイドで活性化させたセファロース４Ｂに製造業者（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）の指針に従って結合させ、これを細
胞培養培地からのＴＦＩの単離に用いた。
【００２６】Ｃｈａｎｇリバー細胞を、ＢｒｏｚｅとＭ
ｉｌｅｔｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８４，１８８６〜１８９０（１９８７）に記
載された方法に従って培養した。ならし培地を、抗−Ｔ
ＦＩ−Ｉｇセファロース４Ｂカラムを用いたクロマトグ
ラフィーに付した。次いでカラムを、１０倍量のＰＢＳ
−１％トリトンＸ−１００とＰＢＳで洗った。結合した
ＴＦＩを０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２で溶出
した。イムノ・アフィニティーにより単離したＴＦＩを
更に分離用ナトリウム・ドデシルスルフェート・ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Ｓａｖａｎｔ ａｐｐａｒ
ａｔｕｓ）により精製した。最終取得物のアミノ酸を分
析した所、米国同時係属出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．７７，３６
６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）に記載さ
れたＨｅＰＧ２細胞から単離したＴＦＩと同様のＮ末端
アミノ酸配列を有していた。単離したＣｈａｎｇリバー
ＴＦＩを用いて、上記したと同じ免疫化プロトコールに
よりラビットを免疫化した。得られた抗血清は、２重免
疫拡散法テストで約１００μｇ／ｍｌの力価を示した。
この抗血清を用いてλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーの
イムノ・スクリーニングを行なった。
ｉｌｅｔｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８４，１８８６〜１８９０（１９８７）に記
載された方法に従って培養した。ならし培地を、抗−Ｔ
ＦＩ−Ｉｇセファロース４Ｂカラムを用いたクロマトグ
ラフィーに付した。次いでカラムを、１０倍量のＰＢＳ
−１％トリトンＸ−１００とＰＢＳで洗った。結合した
ＴＦＩを０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２で溶出
した。イムノ・アフィニティーにより単離したＴＦＩを
更に分離用ナトリウム・ドデシルスルフェート・ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Ｓａｖａｎｔ ａｐｐａｒ
ａｔｕｓ）により精製した。最終取得物のアミノ酸を分
析した所、米国同時係属出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．７７，３６
６号明細書（出願日：１９８７年７月２３日）に記載さ
れたＨｅＰＧ２細胞から単離したＴＦＩと同様のＮ末端
アミノ酸配列を有していた。単離したＣｈａｎｇリバー
ＴＦＩを用いて、上記したと同じ免疫化プロトコールに
よりラビットを免疫化した。得られた抗血清は、２重免
疫拡散法テストで約１００μｇ／ｍｌの力価を示した。
この抗血清を用いてλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーの
イムノ・スクリーニングを行なった。
【００２７】方法 ｃＤＮＡクローンの単離 抗体を用いた胎盤及び胎児肝ｃＤＮＡのスクリーニング
法、プラーク精製法及びλ−ファージ溶解物とＤＮＡの
調製法はＷｕｎとＫｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳＬＥＴ
Ｔ．１，１１〜１６（１９８７）に記載されている。抗
血清にあらかじめＢＮＮ９７λｇｔ１１溶解物を吸着さ
せ、ライブラリーのスクリーニング用に１／５００に希
釈した。
法、プラーク精製法及びλ−ファージ溶解物とＤＮＡの
調製法はＷｕｎとＫｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳＬＥＴ
Ｔ．１，１１〜１６（１９８７）に記載されている。抗
血清にあらかじめＢＮＮ９７λｇｔ１１溶解物を吸着さ
せ、ライブラリーのスクリーニング用に１／５００に希
釈した。
【００２８】第Ｘａ因子結合活性のスクリーニング イソプロピル−β−チオガラクトシドによってイムノ・
ポジティブλ−ファージ溶解物あるいはコントロールλ
ｇｔ１１から誘導される組換え蛋白について、その第Ｘ
ａ因子結合活性をスクリーニングした。λ−ファージ溶
解物（０．１ｍｌ）は、ドット−ブロット装置（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）を用いてニトロセルロースペーパーで濾過し
た。次いでニトロセルロースペーパーを、５ｍｇ／ｍｌ
牛血清アルブミン及び２．５ｍｇ／ｍｌ牛ガンマグロブ
リンを含むリン酸緩衝化食塩水に浸し、室温で１時間激
しく撹拌した。次いで、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンを添
加した同様の溶液に更に125Ｉ−第Ｘａ因子（１．０×
１０6ｃｍｐ／ｍｌ）を溶解した溶液で置換し、更に１
時間激しく撹拌した。次いでニトロセルロースペーパー
を、０．０５％ＴｗｅｅｎTM２０を含むリン酸緩衝化食
塩水で洗った。洗浄緩衝液を５分毎に４回交換した。次
いでニトロセルロースペーパーを空気中で乾燥し、Ｋｏ
ｄａｋ ＸＲ５ｎフィルムを用いてオートラジオグラフ
ィー用に調製した。フィルムを１週間さらした後に現像
した。
ポジティブλ−ファージ溶解物あるいはコントロールλ
ｇｔ１１から誘導される組換え蛋白について、その第Ｘ
ａ因子結合活性をスクリーニングした。λ−ファージ溶
解物（０．１ｍｌ）は、ドット−ブロット装置（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）を用いてニトロセルロースペーパーで濾過し
た。次いでニトロセルロースペーパーを、５ｍｇ／ｍｌ
牛血清アルブミン及び２．５ｍｇ／ｍｌ牛ガンマグロブ
リンを含むリン酸緩衝化食塩水に浸し、室温で１時間激
しく撹拌した。次いで、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンを添
加した同様の溶液に更に125Ｉ−第Ｘａ因子（１．０×
１０6ｃｍｐ／ｍｌ）を溶解した溶液で置換し、更に１
時間激しく撹拌した。次いでニトロセルロースペーパー
を、０．０５％ＴｗｅｅｎTM２０を含むリン酸緩衝化食
塩水で洗った。洗浄緩衝液を５分毎に４回交換した。次
いでニトロセルロースペーパーを空気中で乾燥し、Ｋｏ
ｄａｋ ＸＲ５ｎフィルムを用いてオートラジオグラフ
ィー用に調製した。フィルムを１週間さらした後に現像
した。
【００２９】ポリ（Ａ）+ＲＮＡの調製及びノーザン・
ブロッティング ＬｉｚａｒｄｉとＥｎｇｅｌｂｅｒｇのナトリウム・パ
ークロレート抽出法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９
８，１１６〜１２２，（１９７９）〕により、培養した
ｃｈａｎｇリバー細胞、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞及び
ＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ細胞から全ＲＮＡを調製し
た。製造業者の指針に従い、オリゴ（ｄＴ）−セルロー
ス（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１，タイプ７７Ｆ）
ヘのバッチ吸着によりポリ（Ａ）+ＲＮＡを単離した。
ノーザン・ブロット分析用に、それぞれのポリ（Ａ）+
ＲＮＡ１０μｇをグリオキサールで処理し〔Ｔｈｏｍａ
ｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，２５５
〜２６６（１９８３）〕、１０ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０を含む緩衝液でアガロースゲル電気泳動に付
した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙのＲＮＡラダー（１ａｄｄｅｒ）を分子量
マーカーとして用いた。ＲＮＡをニトロセルロースペー
パー上にブロットし、次いで８０℃で２時間焼いた。λ
Ｐ９クローンのインサートＤＮＡを、ニックトランスレ
ーションにより32Ｐで放射標識化し、プローブとして用
いた〔Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｄｅｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａ
ｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）〕。５０％ホルムア
ミド、５Ｘ ＳＳＣ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ
７．０、２５０μｇ／ｍｌ変性サケスペルマＤＮＡ及び
１Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ溶液を含む溶液５ｍｌ中のプロー
ブ（５×１０6ｃｐｍ）で４２℃で１６時間ハイブリダ
イズさせた。フィルターを、０．１％ナトリウムドデシ
ルスルフェート（ＳＤＳ）、２Ｘ ＳＳＳで室温で３
回、それぞれ５分間洗った。次いでニトロセルロースペ
ーパーを空気中で乾燥し、Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ−５フィ
ルム及び増感板を用いて−７０℃で３日間オートラジオ
グラフィーに付した。
ブロッティング ＬｉｚａｒｄｉとＥｎｇｅｌｂｅｒｇのナトリウム・パ
ークロレート抽出法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９
８，１１６〜１２２，（１９７９）〕により、培養した
ｃｈａｎｇリバー細胞、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞及び
ＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ細胞から全ＲＮＡを調製し
た。製造業者の指針に従い、オリゴ（ｄＴ）−セルロー
ス（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１，タイプ７７Ｆ）
ヘのバッチ吸着によりポリ（Ａ）+ＲＮＡを単離した。
ノーザン・ブロット分析用に、それぞれのポリ（Ａ）+
ＲＮＡ１０μｇをグリオキサールで処理し〔Ｔｈｏｍａ
ｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，２５５
〜２６６（１９８３）〕、１０ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０を含む緩衝液でアガロースゲル電気泳動に付
した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙのＲＮＡラダー（１ａｄｄｅｒ）を分子量
マーカーとして用いた。ＲＮＡをニトロセルロースペー
パー上にブロットし、次いで８０℃で２時間焼いた。λ
Ｐ９クローンのインサートＤＮＡを、ニックトランスレ
ーションにより32Ｐで放射標識化し、プローブとして用
いた〔Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｄｅｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａ
ｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）〕。５０％ホルムア
ミド、５Ｘ ＳＳＣ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ
７．０、２５０μｇ／ｍｌ変性サケスペルマＤＮＡ及び
１Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ溶液を含む溶液５ｍｌ中のプロー
ブ（５×１０6ｃｐｍ）で４２℃で１６時間ハイブリダ
イズさせた。フィルターを、０．１％ナトリウムドデシ
ルスルフェート（ＳＤＳ）、２Ｘ ＳＳＳで室温で３
回、それぞれ５分間洗った。次いでニトロセルロースペ
ーパーを空気中で乾燥し、Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ−５フィ
ルム及び増感板を用いて−７０℃で３日間オートラジオ
グラフィーに付した。
【００３０】他の組操えＤＮＡ法 クローン化λｇｔ１ｌＤＮＡの調製、ｐＵＣ１９プラス
ミド及びＭ１３ｍｐ１８ベクターでのサブクローニン
グ、エキソヌクレアーゼIII を用いた消化による欠失、
及びジデオキ法によるＤＮＡ配列決定〔Ｓａｎｇｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
３，６７７６〜６７８０（１９７７）〕は、ＷｕｎとＫ
ｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１，１１−１６
（１９８７）に記載された方法に従って実施した。Ｌｉ
ｐｍａｍとＰｅａｒｓｏｎによって書かれたプログラム
ＦＡＳＴＰ〔ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５〜１４
４１（１９８５）〕を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎの配列データバンク（レリース１３，１９８７
年６月）から相同性を示す蛋白のファミリーを同定し、
該ファミリー内で配列のアラインメントを行なった。
ミド及びＭ１３ｍｐ１８ベクターでのサブクローニン
グ、エキソヌクレアーゼIII を用いた消化による欠失、
及びジデオキ法によるＤＮＡ配列決定〔Ｓａｎｇｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
３，６７７６〜６７８０（１９７７）〕は、ＷｕｎとＫ
ｒｅｔｚｍｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１，１１−１６
（１９８７）に記載された方法に従って実施した。Ｌｉ
ｐｍａｍとＰｅａｒｓｏｎによって書かれたプログラム
ＦＡＳＴＰ〔ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５〜１４
４１（１９８５）〕を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎの配列データバンク（レリース１３，１９８７
年６月）から相同性を示す蛋白のファミリーを同定し、
該ファミリー内で配列のアラインメントを行なった。
【００３１】結果 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング 多数のセルラインについて、そのならし培地中にＴＦＩ
が存在するか否かをスクリーニングした。いくつかの肝
由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、ＨｅｐＧ２ヘ
パトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマが培地中にＴ
ＦＩを分泌することが見出された。初めに、ＴＦＩに対
する抗血清を用いてヒト胎児肝λｇｔ１１ｃＤＮＡライ
ブラリー（１０6プラーク・フォーミング・ユニット）
をスクリーニングし、１５個の免疫学的にポジティブな
クローンが得られた。次いで同様の方法により胎盤λｇ
ｔｌｌｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１
０ 6プラーク・フォーミング・ユニットのうち１０個の
免疫学的にポジティブなクローンが得られた。これらの
クローンをプラーク精製し、精製クローンの溶解物につ
いてＴＦＩの機能活性をテストした。イソプロピルチオ
ガラクトシドで誘導したファージの溶解物をニトロセル
ロースペーパーに吸着せしめ、125Ｉ−第Ｘａ因子結合
活性をスクリーニングした。上記の免疫学的にポジティ
ブなクローンのいくつかは、ニトロセルロースペーパー
上の125Ｉ−第Ｘａ因子と結合する能力を示したこと
が、図１により証明されている。免疫学的にポジティブ
な胎児肝クローン１５個のうち３個、及び免疫学的にポ
ジティブな胎盤クローン１０個のうち４個のクローンが
125Ｉ−第Ｘａ因子結合活性を示した。これらの免疫学
的に且つ機能的にポジティブなクローンをＥｃｏＲＩで
消化し、インサート配列のサイズをゲル電気泳動により
調べた。胎盤ライブラリー（λＰ９）から得た１つのク
ローンは約１．４ｋｂのインサート配列を有しており、
他のすべてのクローンは約１．０ｋｂのインサート配列
を有していた。部分的ＤＮＡ配列決定により、１．０ｋ
ｂクローンはより長い１．４ｋｂ胎盤クローンの１部分
の配列と同じ配列を有していることが判った。従って、
完全なＤＮＡ配列決定を行なうためにλＰ９を選択し
た。
ング 多数のセルラインについて、そのならし培地中にＴＦＩ
が存在するか否かをスクリーニングした。いくつかの肝
由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、ＨｅｐＧ２ヘ
パトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマが培地中にＴ
ＦＩを分泌することが見出された。初めに、ＴＦＩに対
する抗血清を用いてヒト胎児肝λｇｔ１１ｃＤＮＡライ
ブラリー（１０6プラーク・フォーミング・ユニット）
をスクリーニングし、１５個の免疫学的にポジティブな
クローンが得られた。次いで同様の方法により胎盤λｇ
ｔｌｌｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１
０ 6プラーク・フォーミング・ユニットのうち１０個の
免疫学的にポジティブなクローンが得られた。これらの
クローンをプラーク精製し、精製クローンの溶解物につ
いてＴＦＩの機能活性をテストした。イソプロピルチオ
ガラクトシドで誘導したファージの溶解物をニトロセル
ロースペーパーに吸着せしめ、125Ｉ−第Ｘａ因子結合
活性をスクリーニングした。上記の免疫学的にポジティ
ブなクローンのいくつかは、ニトロセルロースペーパー
上の125Ｉ−第Ｘａ因子と結合する能力を示したこと
が、図１により証明されている。免疫学的にポジティブ
な胎児肝クローン１５個のうち３個、及び免疫学的にポ
ジティブな胎盤クローン１０個のうち４個のクローンが
125Ｉ−第Ｘａ因子結合活性を示した。これらの免疫学
的に且つ機能的にポジティブなクローンをＥｃｏＲＩで
消化し、インサート配列のサイズをゲル電気泳動により
調べた。胎盤ライブラリー（λＰ９）から得た１つのク
ローンは約１．４ｋｂのインサート配列を有しており、
他のすべてのクローンは約１．０ｋｂのインサート配列
を有していた。部分的ＤＮＡ配列決定により、１．０ｋ
ｂクローンはより長い１．４ｋｂ胎盤クローンの１部分
の配列と同じ配列を有していることが判った。従って、
完全なＤＮＡ配列決定を行なうためにλＰ９を選択し
た。
【００３２】ＴＦＩ ｃＤＮＡ単離物のヌクレオチド配
列及びその予想蛋白配列 λＰ９クローンについて、制限酵素地図の作成、Ｍ１３
サブクローニング及び図２に示した技法を用いた配列決
定を実施した。エキソヌクレアーゼIII 欠失法〔Ｈｅｎ
ｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｅ２８，３５１〜３５９（１９８
４）〕により、２本のストランドの両者について全配列
を決定し、１４３２個の塩基からなることが見出され
た。その配列は図３および４に示した通りである。該配
列には、１３３塩基の５′非コード領域、９１２ヌクレ
オチドのオープン・リーディング・フレーム及び３８７
ヌクレオチドの３′非コード領域が含まれている。最初
のＡＴＧはＴＡＧＡＴＧＡ配列中のヌクレオチド１３４
にあり、その直ぐ後のＡＣＡＡＴＧＡ配列中のヌクレオ
チド１４６に第２のＡＴＧがある。真核細胞のリボゾー
ムによってイニシエートされるためのコンセンサス配列
として提案された配列、ＡＣＣＡＴＧＧ〔Ｋｏｚａｋ，
Ｃｅｌｌ，４４，２８３〜２９２（１９８２）〕とは、
上記の配列は異なるが、これらはイニシエーション配列
と考えられる。成熟蛋白のＮ末端に相当する配列の前に
２８個のアミノ酸配列がある。これら２８個のアミノ酸
からなる疎水性セグメントの組成及び長さは、シグナル
ペプチドに典型的なものである〔Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎ
ｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３，１７〜２１
（１９８３）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１８４，９９〜
１０５（１９８５）〕。シグナルペプチドはＡｌａ28−
Ａｓｐ29で開裂し、成熟蛋白を与えると考えられる。成
熟ＴＦＩとして予想されるアミノ酸配列は、１８個のシ
スティン残基及び７個のメチオニンを含む２７６個のア
ミノ酸からなる。成熟ＴＦＩの推定蛋白配列に基いて計
算される分子量３１，９５０ダルトンは、単離して得た
蛋白についてナトリウムドデシルスルフェートポリアク
リルアミドゲル電気泳動で調べた分子量３７−４０ｋＤ
ａよりもいく分小さい。この分子量の相違は、天然蛋白
でのグリコシル化の移動性を反映したものと考えられ
る。成熟蛋白に相当する推定蛋白配列は、Ａｓｎ−Ｘ−
Ｔｈｒ／Ｓｅｒの構成を有する３ケのＮ−結合グリコシ
ル化部位（アミノ酸の位置１４５，１９５及び２５６）
を有している。精製した全長ＴＦＩ及び加水分解された
２つの単離体のアミノ酸分析の結果は、ｃＤＮＡ配列か
ら推定される蛋白配列（図３および４の下線を引いた部
分）と正確にマッチする。このことは、単離したｃＤＮ
ＡクローンはＴＦＩをコードしていることを示してい
る。３′非コード領域はＡ＋Ｔを豊富に含んでいる（７
０％Ａ＋Ｔ）。このクローンには、コンセンサス・ポリ
アデニル化シグナル、ＡＡＴＡＡＡ〔Ｐｒｏｕｄｆｏｏ
ｔとＢｒｏｗｎｌｅｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２５２，３５９
〜３６２（１９８１）〕も、ポリＡテイルも見出されな
かった。これは、ライブラリー構築の間に３′末端部分
の１部分が失なわれたためと考えられる。
列及びその予想蛋白配列 λＰ９クローンについて、制限酵素地図の作成、Ｍ１３
サブクローニング及び図２に示した技法を用いた配列決
定を実施した。エキソヌクレアーゼIII 欠失法〔Ｈｅｎ
ｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｅ２８，３５１〜３５９（１９８
４）〕により、２本のストランドの両者について全配列
を決定し、１４３２個の塩基からなることが見出され
た。その配列は図３および４に示した通りである。該配
列には、１３３塩基の５′非コード領域、９１２ヌクレ
オチドのオープン・リーディング・フレーム及び３８７
ヌクレオチドの３′非コード領域が含まれている。最初
のＡＴＧはＴＡＧＡＴＧＡ配列中のヌクレオチド１３４
にあり、その直ぐ後のＡＣＡＡＴＧＡ配列中のヌクレオ
チド１４６に第２のＡＴＧがある。真核細胞のリボゾー
ムによってイニシエートされるためのコンセンサス配列
として提案された配列、ＡＣＣＡＴＧＧ〔Ｋｏｚａｋ，
Ｃｅｌｌ，４４，２８３〜２９２（１９８２）〕とは、
上記の配列は異なるが、これらはイニシエーション配列
と考えられる。成熟蛋白のＮ末端に相当する配列の前に
２８個のアミノ酸配列がある。これら２８個のアミノ酸
からなる疎水性セグメントの組成及び長さは、シグナル
ペプチドに典型的なものである〔Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎ
ｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３，１７〜２１
（１９８３）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１８４，９９〜
１０５（１９８５）〕。シグナルペプチドはＡｌａ28−
Ａｓｐ29で開裂し、成熟蛋白を与えると考えられる。成
熟ＴＦＩとして予想されるアミノ酸配列は、１８個のシ
スティン残基及び７個のメチオニンを含む２７６個のア
ミノ酸からなる。成熟ＴＦＩの推定蛋白配列に基いて計
算される分子量３１，９５０ダルトンは、単離して得た
蛋白についてナトリウムドデシルスルフェートポリアク
リルアミドゲル電気泳動で調べた分子量３７−４０ｋＤ
ａよりもいく分小さい。この分子量の相違は、天然蛋白
でのグリコシル化の移動性を反映したものと考えられ
る。成熟蛋白に相当する推定蛋白配列は、Ａｓｎ−Ｘ−
Ｔｈｒ／Ｓｅｒの構成を有する３ケのＮ−結合グリコシ
ル化部位（アミノ酸の位置１４５，１９５及び２５６）
を有している。精製した全長ＴＦＩ及び加水分解された
２つの単離体のアミノ酸分析の結果は、ｃＤＮＡ配列か
ら推定される蛋白配列（図３および４の下線を引いた部
分）と正確にマッチする。このことは、単離したｃＤＮ
ＡクローンはＴＦＩをコードしていることを示してい
る。３′非コード領域はＡ＋Ｔを豊富に含んでいる（７
０％Ａ＋Ｔ）。このクローンには、コンセンサス・ポリ
アデニル化シグナル、ＡＡＴＡＡＡ〔Ｐｒｏｕｄｆｏｏ
ｔとＢｒｏｗｎｌｅｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２５２，３５９
〜３６２（１９８１）〕も、ポリＡテイルも見出されな
かった。これは、ライブラリー構築の間に３′末端部分
の１部分が失なわれたためと考えられる。
【００３３】電荷分布、疎水性／親水性及び内部相同性 ＴＦＩの翻訳されたアミノ酸配列には、２７リシン、１
７アルギニン、１１アスパラギン酸及び２５グルタミン
酸が含まれている。蛋白にそった電荷分布は図５に示し
たようにかなり高低のあるものである。シグナルペプチ
ド領域には、２６個の中性残基とともに２個のプラスに
荷電したリシンが含まれていた。成熟蛋白のアミノ末端
領域には、高度にマイナスに荷電した配列が含まれてい
た。最初の７個の残基のうち６個はアスパラギン酸ある
いはグルタミン酸であり、この後に更に高度にマイナス
に荷電した２個のアミノ酸のダウンストリームがあり、
その後にプラスに荷電したリシン残基がある。中心部分
は一般的にマイナスに荷電している。カルボキシ末端に
は高度にプラスに荷電したセグメントがある。ＴＦＩの
アミノ酸２６５〜２９３には、６−共役アルギニン＋リ
シン残基を含むプラスに荷電した１４個のアミノ酸があ
る。
７アルギニン、１１アスパラギン酸及び２５グルタミン
酸が含まれている。蛋白にそった電荷分布は図５に示し
たようにかなり高低のあるものである。シグナルペプチ
ド領域には、２６個の中性残基とともに２個のプラスに
荷電したリシンが含まれていた。成熟蛋白のアミノ末端
領域には、高度にマイナスに荷電した配列が含まれてい
た。最初の７個の残基のうち６個はアスパラギン酸ある
いはグルタミン酸であり、この後に更に高度にマイナス
に荷電した２個のアミノ酸のダウンストリームがあり、
その後にプラスに荷電したリシン残基がある。中心部分
は一般的にマイナスに荷電している。カルボキシ末端に
は高度にプラスに荷電したセグメントがある。ＴＦＩの
アミノ酸２６５〜２９３には、６−共役アルギニン＋リ
シン残基を含むプラスに荷電した１４個のアミノ酸があ
る。
【００３４】ＴＦＩ蛋白の予想疎水性／親水性プロファ
イルは図６に示した通りである。シグナルペプチドに
は、予想されたように高度に疎水性の領域が含まれてい
る。残りの部分はむしろ親水性である。ＴＦＩの翻訳さ
れたアミノ酸配列には、いくつかの区別し得るドメイン
が含まれている。高度にマイナスに荷電したＮ末端ドメ
イン及び高度にプラスに荷電したＣ末端ドメインに加え
て、Ｋｕｎｉｔｚ型抑制因子の典型的配列（下記参照）
を有する３個の相同ドメインからなる中心部分がある。
イルは図６に示した通りである。シグナルペプチドに
は、予想されたように高度に疎水性の領域が含まれてい
る。残りの部分はむしろ親水性である。ＴＦＩの翻訳さ
れたアミノ酸配列には、いくつかの区別し得るドメイン
が含まれている。高度にマイナスに荷電したＮ末端ドメ
イン及び高度にプラスに荷電したＣ末端ドメインに加え
て、Ｋｕｎｉｔｚ型抑制因子の典型的配列（下記参照）
を有する３個の相同ドメインからなる中心部分がある。
【００３５】他の蛋白との相同性 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの配列データベースを
調べた所、ＴＦＩのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインと
は、他の公知蛋白と有意な相同性を有していないことが
見出された。しかしながら、３個の内部相同ドメイン
は、牛膵臓塩基性プロテアーゼ抑制因子（アプロチニ
ン）、毒塩基性プロテアーゼ抑制因子、インター−α−
トリプシン抑制因子（図７）などの他の塩基性プロテア
ーゼ抑制因子の配列とそれぞれ相同性を示した。これら
すべての抑制因子にはジスルフィド結合溝造が高度に保
持されており、これは注目すべき事実である。これらの
相同性から明らかなように、ＴＦＩは塩基性プロテアー
ゼ抑制因子遺伝子スーパーファミリーに属する。
ａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの配列データベースを
調べた所、ＴＦＩのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインと
は、他の公知蛋白と有意な相同性を有していないことが
見出された。しかしながら、３個の内部相同ドメイン
は、牛膵臓塩基性プロテアーゼ抑制因子（アプロチニ
ン）、毒塩基性プロテアーゼ抑制因子、インター−α−
トリプシン抑制因子（図７）などの他の塩基性プロテア
ーゼ抑制因子の配列とそれぞれ相同性を示した。これら
すべての抑制因子にはジスルフィド結合溝造が高度に保
持されており、これは注目すべき事実である。これらの
相同性から明らかなように、ＴＦＩは塩基性プロテアー
ゼ抑制因子遺伝子スーパーファミリーに属する。
【００３６】ノーザン・ブロッテング ＴＦＩ産生肝由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、
ＨｅｐＧ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ
細胞からポリ（Ａ）+ＲＮＡを精製した。変性アガロー
スゲル電気泳動によりポリ（Ａ）+ＲＮＡを溶解し、ニ
トロセルロースペーパー上にブロットし、32Ｐ−標識化
ＴＦＩ ｃＤＮＡ（λＰ９）をプローブとして用いて調
べた。図８に示したように、２つの主要なハイブリダイ
ゼーションバンドが観察された。これらはテストした３
つの全てのセルラインに見られる１．４ｋｂ ｍＲＮＡ
及び４．４ｋｂ ｍＲＮＡに対応するものである。検出
し得る量のＴＦＩを産生しない他のセルラインについて
テストしたが、プローブとのハイブリダイゼーションは
観察されなかった（データを示していない）。本明細書
の記載から、当業者にとっては本発明の思想及び範囲内
にある他の各種の例が自明であろう。これらの例の全て
は本明細書のクレームの範囲内のものである。
ＨｅｐＧ２ヘパトーマ及びＳＫ−ＨＥＰ−１ヘパトーマ
細胞からポリ（Ａ）+ＲＮＡを精製した。変性アガロー
スゲル電気泳動によりポリ（Ａ）+ＲＮＡを溶解し、ニ
トロセルロースペーパー上にブロットし、32Ｐ−標識化
ＴＦＩ ｃＤＮＡ（λＰ９）をプローブとして用いて調
べた。図８に示したように、２つの主要なハイブリダイ
ゼーションバンドが観察された。これらはテストした３
つの全てのセルラインに見られる１．４ｋｂ ｍＲＮＡ
及び４．４ｋｂ ｍＲＮＡに対応するものである。検出
し得る量のＴＦＩを産生しない他のセルラインについて
テストしたが、プローブとのハイブリダイゼーションは
観察されなかった（データを示していない）。本明細書
の記載から、当業者にとっては本発明の思想及び範囲内
にある他の各種の例が自明であろう。これらの例の全て
は本明細書のクレームの範囲内のものである。
【図１】125Ｉ−第Ｘａ因子を用いたλｇｔ１ｌクロー
ンのスクリーニングを示した写真である。
ンのスクリーニングを示した写真である。
【図２】部分的制限酵素地図及びλＰ９のインサート配
列の配列決定に用いた技法を示している。
列の配列決定に用いた技法を示している。
【図３】ヒトＴＦＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び
翻訳されたアミノ酸配列を示している。
翻訳されたアミノ酸配列を示している。
【図４】ヒトＴＦＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およ
び翻訳されたアミノ酸配列。
び翻訳されたアミノ酸配列。
【図５】ＴＦＩのアミノ酸配列における電荷分布を示す
グラフである。
グラフである。
【図６】ＴＦＩの疎水性プロファイルを示すグラフであ
る。
る。
【図７】ＴＦＩの塩基性プロテアーゼ抑制因子ドメイン
と他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメント
を示す。
と他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメント
を示す。
【図８】３個の肝由来セルラインから得たＲＮＡのノー
ザン・ブロット分析を示す写真である。
ザン・ブロット分析を示す写真である。
フロントページの続き (71)出願人 597025806 ワシントン・ユニバーシティ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉ ｎｅ アメリカ合衆国63130ミズーリ州セント・ ルイス、ワン・ブルッキングズ・ドライブ (72)発明者 ジョージ ジョン ブロズ，ジュニア アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，ウエストポイント レーン 15 (72)発明者 クニコ クサノ クレッツマー アメリカ合衆国ミズリー州 エウレカ，パ ーシモン レーン 33 (72)発明者 ツェ − チェイン ウン アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，ハントリィ ハイツ 613 Ｆターム(参考） 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA50 FA71 GA26 HA05
Claims (21)
- 【請求項１】 図３および図４で示されるアミノ酸配列
を有する組織因子抑制因子（ＴＦＩ）に対する結合特異
性を有する単離精製された抗体。 - 【請求項２】 以下から選択される組織因子抑制因子
（ＴＦＩ）領域に結合する請求項１の抗体： （ａ）図３および図４に示される精製成熟ＴＦＩのＮ末
端アミノ酸２９−５５または３１−５３、（ｂ）図３お
よび図４に示される精製成熟ＴＦＩのＣ末端アミノ酸２
６５−３０４、（ｃ）Ｖ８プロテアーゼ プラス トリ
プシン消化、図３および図４に示されるアミノ酸８２−
８８の配列を有する、ＴＦＩペプチド、（ｄ）Ｖ８プロ
テアーゼ プラス トリプシン消化、図３および図４に
示されるアミノ酸１５３−１６６の配列を有する、ＴＦ
Ｉペプチド、（ｅ）ＴＦＩのクニッツ ドメイン １を
形成する図３および図４のアミノ酸５４−１０４または
４７−１１７、（ｆ）ＴＦＩのクニッツ ドメイン ２
を形成する図３および図４のアミノ酸１２５−１７５ま
たは１１８−１８８、（ｇ）ＴＦＩのクニッツ ドメイ
ン ３を形成する図３および図４のアミノ酸２１７−２
６７または２１０−２８０。 - 【請求項３】 以下からなる群から選択されるポリペプ
チドに結合しない請求項１の抗体： 牛塩基性プロテアーゼ抑制因子前駆体、 牛初乳トリプシン抑制因子、 牛血清塩基性プロテアーゼ抑制因子、 食用カタツムリ・イソ抑制因子Ｋ、 紅海ウミガメ塩基性プロテアーゼ抑制因子、 ウエスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｉ、 リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II、 ケープ・コブラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II、 ルッセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II、 サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子III 、 イースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロテアー
ゼ抑制因子Ｉホモローグ、 ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子
Ｂ、Ｅ、ＩおよびＫ、 β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（マイナー）、 β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジャー）、 β−２−ブンガロトキシンＢ鎖、 ウマ・インターα−トリプシン抑制因子（アミノ酸１〜
５７；５８〜１２３）、 ブタ・インター−α−トリプシン抑制因子（アミノ酸１
〜５７；５８〜１２３）、 ウシ・インター−α−トリプシン抑制因子（アミノ酸１
〜５７；５８〜１２３）、 ヒト・α−１−マイクログロブリン／インター−α−ト
リプシン抑制因子前駆体（アミノ酸２２７〜２８３；２
８４〜３５２）。 - 【請求項４】 ＴＦＩの以下の領域の１種以上を含むポ
リペプチドに対して結合特異性を有する単離精製された
抗体： （ａ）図３および図４に示される精製成熟ＴＦＩのＮ末
端アミノ酸２９−５５または３１−５３、（ｂ）図３お
よび図４に示される精製成熟ＴＦＩのＣ末端アミノ酸２
６５−３０４、（ｃ）Ｖ８プロテアーゼ プラス トリ
プシン消化、図３および図４に示されるアミノ酸８２−
８８の配列を有する、ＴＦＩペプチド、（ｄ）Ｖ８プロ
テアーゼ プラス トリプシン消化、図３および図４に
示されるアミノ酸１５３−１６６の配列を有する、ＴＦ
Ｉペプチド、（ｅ）ＴＦＩのクニッツ ドメイン １を
形成する図３および図４のアミノ酸５４−１０４または
４７−１１７、（ｆ）ＴＦＩのクニッツ ドメイン ２
を形成する図３および図４のアミノ酸１２５−１７５ま
たは１１８−１８８、（ｇ）ＴＦＩのクニッツ ドメイ
ン ３を形成する図３および図４のアミノ酸２１７−２
６７または２１０−２８０。 - 【請求項５】 請求項１、２、３または４の抗体および
有効な担体、ベヒクルまたは助剤を包含する組成物。 - 【請求項６】 請求項１、２、３または４の抗体および
溶液を包含する組成物。 - 【請求項７】 ポリクロナル抗体である請求項１、２、
３または４の抗体。 - 【請求項８】 ＴＦＩペプチドカラムで精製される請求
項１、２、３または４の抗体。 - 【請求項９】 イムノアフィニティーマトリックスに結
合した請求項１、２、３または４の抗体。 - 【請求項１０】 イムノアフィニティーマトリックスが
「セファロースTM４Ｂ」である請求項９の抗体。 - 【請求項１１】 生物学的液体を、ＴＦＩに対して結合
特異性を有する抗体に結合するイムノアフィニティーマ
トリックスと接触させることからなり、ここで、生物学
的液体中のＴＦＩポリペプチドは抗体と結合する、生物
学的液体からポリペプチドを精製するための請求項９ま
たは１０のイムノアフィニティーマトリックスの使用方
法。 - 【請求項１２】 抗体をＴＦＩペプチドカラムと接触さ
せ、選択的に、ＴＦＩペプチドに対して結合特異性を有
する抗体を結合させることからなる、抗体を精製するた
めのＴＦＩペプチドカラムの使用方法。 - 【請求項１３】 生物学的液体中の第一のポリペプチド
の検出方法であって、第一のポリペプチドはＴＦＩおよ
びＴＦＩのクニッツドメインの１種以上を含むポリペプ
チドから選択され、次の工程： （ａ）前記液体を第一のポリペプチドに対して結合特異
性を有する第二のポリペプチドと接触させ、そして
（ｂ）第二のポリペプチドの存在を検定して第一のポリ
ペプチドのレベルを決定することからなる方法。 - 【請求項１４】 第二のポリペプチドが抗体である請求
項１３の方法。 - 【請求項１５】 第二のポリペプチドがＸａ因子である
請求項１３の方法。 - 【請求項１６】 第二のポリペプチドが放射性標識され
ている請求項１４または１５の方法。 - 【請求項１７】 第二のポリペプチドが125Ｉ−標識Ｘ
ａ因子である請求項１５の方法。 - 【請求項１８】 生物学的液体中の第一のポリペプチド
の検出方法であって、第一のポリペプチドはＴＦＩおよ
びＴＦＩのクニッツドメインの１種以上を包含するポリ
ペプチドから選択され、次の工程： （ａ）前記液体を第一のポリペプチドに対して結合特異
性を有する抗体、および同抗体と結合し得る第二のポリ
ペプチドと接触させ、そして（ｂ）第二のポリペプチド
の存在を検定して第一のポリペプチドのレベルを決定す
ることからなる方法。 - 【請求項１９】 第二のポリペプチドが抗体である請求
項１８の方法。 - 【請求項２０】 第二のポリペプチドが放射性標識され
ている請求項１８の方法。 - 【請求項２１】 生物学的液体が調整された細胞培養メ
ジウムである請求項１３または１８の方法。
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