PT88076B

PT88076B - Processo para a preparacao de vectores de dna do inibidor do factor de tecido humano

Info

Publication number: PT88076B
Application number: PT88076A
Authority: PT
Inventors: Tze-Chein Wun; George John Broze Jr; Kuniko Kusano Kretzmer
Original assignee: Monsanto Co
Priority date: 1987-11-23
Filing date: 1988-07-22
Publication date: 1993-01-29
Also published as: NZ225535A; NO310466B1; CA1341223C; EP0318451B1; FI883487A0; JPH01165383A; KR930000274B1; FI883487A; ATE111518T1; JP2005306875A; FI93365C; DE3851511D1; NO20013608D0; NO883270L; JPH1175875A; IL87171A0; IE65393B1; DK413488D0; DK413488A; FI93365B

Description

MONSANTO COMPANY e WASHINGTON UNIVERSITY «PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE VECTORES DE DNA DO INIBIDOR DO FACTOR DE TECIDO HUMANO”

Este invento está relacionado com um inibidor da coagulação conhecido por inibidor de factor de tecido (TFl) e alternativamente como inibidor de coagulação associado a lipoproteina (lACl), Mais particularmente, o invento relaciona-se com um clone de cDNA que representa i

essencialmente TFI de tamanho completo.

A cascada de coagulação que ocorre no sangue de mamíferos compreende dois sistemas distintos - os chamados sistemas intrínseco e extrínseco, 0 último sistema é activado por exposição do sangue à tromboplastina de tecido (Factor III), daqui em diante referido como factor de tecido (TF), 0 factor de tecido e uma lipoproteina que surge na membrana plasmáti®. de muitos tipos de células e em que o cérebro e o pulmão são particularmente ricos. Quando em contacto com TF, Factor VII do plama ou a sua forma activada, Factor VII , forma um complexo dependente de cálcio Q.

com TF e em seguida activa proteoliticamente o Factor X para

Factor X e o Factor IX para Factor IX .

a a

Os primeiros estudos relativos à regulação da coagulação iniciada por TF mostraram que a incubação de TF (em preparação bruta de tromboplastina de tecido) com soro inibia a sua actividade in vitro e evitava o seu efeito letal quando infundido em ratinhos. Estudos extensivos realizados por Hjort, Scand, J, Clin, Lab, Invest. 9. Suppl. 27, 76-97 (1957) confirmaram e ampliaram o trabalho anteriormente realizado na área e levaram à conclusão de que uma fracção inibidora do soro reconhecia o complexo Factor VII-Tf, Consistentes com esta hipótese são os factos de a inibição da TF que ocorre no plasma requerer a presença de Ca^{2 +} (que também é necessário para a ligação do Factor VIl/VII a TF) e que a inibição pode ser evitada e/ou revertida por quclatação de catiões divalentes com EDTA, Investigações mais recentes mostraram que não sé o Factor VII mas também o Factor X cataliticamente actia a

-3vo e um factor adicional são necessários para dar origem à inibição de TF no plasma ou soro. Ver Broze e Miletich,

Blood 69, 150-155 (1987) e Sanders et al., Ibid, 66, 204-212 (1985). Este factor adicional, aqui definido como inibidor do factor de tecido (TFl) e alternativamente como inibidor da coagulação associada a lipoproteina (LACl), está presente em plasma adsorvido a bário, e parece estar associa do com lipoproteinas, uma vez que a actividade funcional de TFI e segregada juntamente com a fracção de lipoproteina que flutua quando o soro é centrifugado a uma densidade de o

1,21 g/cm . De acordo com Broze e Miletich, supra e Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 1886-1890 (1987), células Hep G2 (uma linha de células de hepatoraa humano) segregam uma num inibidor com as mesmas caracteristicas de TPI presente em plasma.

No pedido de patente copendente Ser, No. 77 3^6 entregue em 23 de Julho 1987, é divulgado um inibidor do factor de tecido (TFl) que foi secretado por células Hep G2. Observou-se existir em duas formas, uma TFIj, migrando a cerca de 37-^0 000 daltons e um TFIg a cerca de 25-26 000 daltons, conforme determinado por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE). Para o TFI determinou-se a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal:

Sc-X-Glu-Eflu-Asp-Glu-Glu-His-Tre-Ile-Ile-Tre-Asp-Tre-Glu^ ¹⁶

Leu-Pro-Pro-Leu-Li s-Leu-Me t-Hi s-S er-Fen-(Fen)-Ala²‘ em que X-X não foi determinado. A divulgação do referido pedido está aqui incluido como referencia.

Breve descrição do invento

De acordo com o presente invento foi desenvolvida a sequência completa codificadora de um done de cDNA representando essencialmente o inibidor do factor de tecido (TFl) de tamanho completo.

Inicialmente, as bibliotecas de cDNA de placenta humana e fígado fetal em^gtll foram despistadas com um anti-soro policlonal de coelho contra TFI purificado. Os clones imunologicamente positivos foram ainda despistados por actividade de ligação a I-Factor X_&. Obtiveram-se sete clones imunológica e funcionalmente activos. 0 clone maior, |s,P9 derivado de placenta, tinha 1,4 Kilobases (kb) de comprimento enquanto que os outros seis tinham 1,0 kb de comprimento. A sequenciação parcial do

DNA mostrou que os clones de 1,0 kb têm sequências idênticas a parte do clone de 1,4 kb, A análise da sequência de nuclec tideos mostrou que }^P9 consistia numa inserção de cDNA com 1432 pares de bases (pb) que inclui uma região 5’ não codificadora de 133 pb, uma grelha de leitura aberta de 912 pb, um codão de paragem e uma região 3’ não codificadora de 384 pb.

A sequência de cDNA codifica uma proteina de 31 950 Daltons de 276 aminoácidos que inclui 18 cisteinas e 7 metioninas. A sequência de aminoácidos traduzida msotra que um peptideo sinal de cerca de 28 aminoácidos precede a proteina TFI madura. Compreende-se que o TFT maduro e definido de modo a incluir TFI e metionil-TFI devido ao codão de tradução ATG no clone j£P9 aqui descrito.

Existem três potenciais sitios de glicosilação ligada em N na proteina TFI com a sequência Asn-X-Ser/Tre, em que X pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos comuns. Estes sitios estão nas posições de aminoáci dos. Asn 145, Asn 195 θ Asn 256, quando a primeira metioni na após a região não codificadora 5’ ó designada posição de aminoácido +1.

A sequência de aminoácidos traduzida de TFI mostra vários domínios discerniveis, incluindo uma terminação N altamente carregada negativamente, uma terminação carboxilo altamente carregada positivamente e uma porção interveniente consistindo em 3 domínios homólogos com sequências tipicas dos inibidores de enzimas tipo Kunitz. Baseado num estudo de homologia, TFI parece ser um membro da superfamilia de genes inibidores das proteases básicas.

A fonte original do material proteico para a criação do clone de cDNA P9 foi tecido de placenta humana. Tal tecido consegue-se fácilmente após ex pulsao por processos cirúrgicos convencionais. 0 ^.gt 11 (lac 5 min 5 cl 851 S100) aqui usado ó um vector de expres são do fago lambda fácilmente adquirido e bem conhecido.

A sua construção e mapa de endonucleases de restrição está descrito por Young e Davis, Proc. Natl, Acad, Sei. USA 80 1194-1198 (1983).

A análise de transferências Northern mostrou que as linhas celulares derivadas do figado figado Chang hapatoma Hep G2 e hepatoma SK-HEP-1, todas contêm 2 especies principais de mRNA (1,4 e 4,4 kb) que hibridam com o cDNA de TFI.

A clonagem do cDNA de TFI e criação de toda a sua sequência proteica e domínios estruturais conforme aqui divulgado permite análises estrituro-funcionais detalhadas e proporciona uma base para o estudo da regulação da sua biosintese. 0 invento é portanto importante para a ciência médica no estudo da cascata de coagulação relativamente a agentes que são capazes de inibir o Factor X e o complexo enzimático Factor VXI /IF. a a

Descrição Detalhada do Invento

Se bem que a especificação termine com reivindicações apontando particularmente e reivindincando distintamente o tema do presente invento, pensa-se que o invento será melhor compreendido a partir da descrição detalhada que se segue relativa a execuções preferidas do invento tomadas em conjunto com os desenhos juntos, em que:

125

Fig. 1 mostra o despiste de clones de gtll com ο I-Factor Xa. Lisados de fagos clonados (0,1 ml) foram aplicados pontualmente num papel de nitrocelulose por sucção usando um aparelho de dot-blot”. 0 papel de nitrocelulose foi então sondado com o I-Factor X e autorradiogra cL fado como descrito adiante. Os clones que surgem como manchas escuras são clones positivos que ligam o I-Factor

X .kgtll (canto inferior direito) e outros clones que não ^a i?5 ligam I-Factor X são as testemunhas, a

Fig. 2 mostra um mapa de restrição parcial e a estratégia de sequenciação para as inserções de P9* A escala ao fundo indica a posição dos nucleotideos. A barra larga representa a região codificadora. As barras estreitas representam regiões não codificadoras 5’ e 3*. Os sitios de endonucleares de restrição foram confirmados por digestão. As setas mostram os clones M13 sobreponiveis usados para sequenciar o cDNA.

FIG, 3 mostra a sequência de nucleotideos e a sequência de aminoácidos traduzida do cDNA de TFI humano. Os nucleotideos estão numerados à esquerda e os aminoácidos à direita. As sequências sublinhadas foram confirmadas independentemente por análise da sequência de aminoácidos da proteina TFI purificada e tbie peptideos V8 digeridos com protease+tripsina. 0 aminoácido +1 foi apontado como a primeira metionina após um codão de paragem da região não codificadora 5’. Os anteriores asteriscos marcam potenciais sitios de glicosilação ligada a N.

FIG, 4 é uma representação gráfica que mostra a distribuição de carga da sequência de aminoácidos em TFI. As cargas estão calculadas a partir do primeiro resíduo até aos i-os e apresentadas no residuo i-o. Assim o valor da posição i-o é o somático de todas as cargas desde o primeiro residuo até ao residuo i-o e a diferença das cargas entre o residuo i-o e o j-o ( j^i) é a carga total do fragmento desde o residuo i-o até ao residuo j-o.

FIG. 5 é uma representação gráfica que mostra o perfil de hidrofobicidade do TFI. 0 perfil de hidrofobicidade foi analisado por um programa de computador pelo qual o indice de hidrofobicidade dos resíduos de aminoácidos é definido como a profundidade a que um residuo de aminoácidos está escondido dentro de uma proteína (a partir dos dados cristã lográficos por raios X) /~Kidera, et al., J, Frotein Chem 4, 23-55 (1985)J· 0 perfil de hidrofobicidade ao longo da sequência foi aplanado usando o programa ICSSCU na IMSL Library /“IMSL Library Reference Manual, 9th ed,, Instituto for Mathematical and Statistical Subroutine Library, Houston, Texas (1982) 7·

FIG. 6 mostra um alinhamento dos domínios de inibidor de proteases básicas do TFI com outros inibidores de proteases básicas. Todas as sequências excepto TFI foram obtidas do National Biomedical Research Foundation Protein Sequenc Database (Georgetown University, Washington, D.C. saida 13 Junho de 1987).

1, Precursor de inibidor de proteases básicas bovino; 2.

Inibidor da tripsina de colostrum bovino; 3. Inibidor de proteases básicas de soro bovino; 4. Isoinibidor K de cobra comestível; 5. Inibidor de proteases básicas de tartaruga do mar vermelho (apresentados apenas às aminoácidos 1-79)? 6, Inibidor I de proteases básicas do veneno de víbora da areia Ocidental; 7. Inibidor II de proteases básicas do veneno de ringhals; 8. Inibidor II de proteases básicas do veneno de cobra do Cabo; 9» Inibidor II de proteases básicas do veneno de víbora de Russell; 10, Inibidor III de proteases básicas do veneno de víbora da areia; 11, Homologo do inibidor I de proteases básicas do veneno de mamba verde Oriental; 12, Inibidor 13 de proteases básicas do veneno de mamba preta; 13. Inibidor E de proteases básicas do veneno de mamba preta; lí). Inibidor I de proteases básicas do veneno de mamba preta; 15. Inibidor k de proteases básicas do veneno de mamba preta; ló. Cadeia B de p-l-Bungarotoxina (menor);

17. Cadeia B de p-l-Bungarotoxina (”major^H); 18, Cadeia B de p-2-Bungarotoxina; 19. Inibidor de inter-CX»- tripsina de cavalo /aminoácidos 1-57 (l); 58-123 (2) 7; 20»

Inibidor da inter-tZ-tripsina de porco /aminoácidos 1-57 (l); 58-123 (²)_7; 21. Inibidor da inter-*^-tripsina de bovino /aminoácidos 1-57 (l); 58-123 (2)J\ 22, Precursor do inibidor da bC-i__microglobulina/inter-^(.-tripsina humana /aminoácidos 227-283 (l); 284-352 (2)_7; 23. TFI /“aminoácidos 47-117 (l) ; 118-188 (2); 210-280 (3).7. Fizeram-se interrupções em ló, 17, 18 para se conseguir o melhor alinhamento. Usaram-se códigos convencionais de uma única letra para os aminoácidos.

FIG, 7 mostra a análise de transferências Northern de RNAs de 3 linhas celulares derivadas do fígado. Usou-se por calha 10 ug de RNA poli (a)⁺. Calha 1, célula Chang do fígado calha 2, célula de hepatoma SK-HEP-1-; calha 3, célula de hepatoma HepG2.

Usou-se aqui raomenclatura bioquímica convencional em que as bases de nucleotideos são designadas por adenina (a)j timina (t); guanina (g)j e citosina (c). Os nucleotideos correspondentes são, por exemplo, desoxiguanosina-5’-trifosfato (dGTP), Por conveniência como é convencional na representação estrutural de uma sequência de nucleotideos do DNA apenas se mostra uma cadeia em que A numa cadeia implica T no seu complemento e G implica C, Os aininoácidos estão representados por abreviaturas de três letras ou de uma letra como se segue:

10Designaçao abreviada

Aminoácido

A	Ala	Alanina
C	Cys	Cisteina
D	Asp	Ácido aspártico
E	Glu	Ácido glutâmico
F	Phe	Fenilalanina
G	Gly	Glicina
H	His	Histidina
I	Ile	Isoleucina
K	Lys	Lisina
L	Leu	Leucina
M	Met	Metionina
N	Asn	Asparagina
P	Pro	Prolina
Q	Gin	Glutamina
R	Arg	Arginina
S	Ser	Serina
T	Thr	Treonina
V	Vai	Valina
w	Trp	Triptofano
Y	Tyr	Tirosina

As endonucleases de restrição comuns aqui descritas têm as sequências de restrição e padrões de clivagem (indicado por setas) que se seguem:


EcoRl	GAATTC CTTAAG t
Sspl	aaÁtt TTATAA f
Clal	A^CGAT TAGCTA t
Alui	AC&T TCGA t I
Stul	AGGCCT TCCGGA

Para ilustrar as execuções preferi das especificas do invento mais detalhadamente, realizou-se o trabalho laboratorial preparativo e exemplificativo que se segue.

EXEMPLO 1

Materiais

As bibliotecas de cDNA de placenta e fígado fetal humanos foram adquiridas à Clometech, 0 Kit” de imunodespiste em ”protoblot« foi adquirido à Promega Biotech. As enzimas de restrição foram da New England Biolabs. A fosfatase alcalina de inestino de vitela, DNA-ligase de T4, DNA-polimerase I (Klenow), exonuclease III e nuclease SI foram da Boehringer Mannheim, dnTPs foram da P.L. Biochemicals.

5'-/ -³⁵S 7-ti°“dATP (ÓOO Ci/mmol) foi de Amersham. 0 Kit de sequenciação (sequenase) foi da United States Biochemicals. As células Chang de fígado (ATCC CCL 13) e células de hepatoma HepG2 (ATCC HB 80Ó5) foram obtidas da American Type Culture Collection. Células de hepatoma SK-HEP-1 foram originalmente obtidas de um adenocarcinoma do fígado por G. Trempe do Sloan, Kettering Institute for Câncer Research em 1971 e podem agora ser fácilmente cons< das.

.i

125

I-Factor X foi preparado por marcação radioactiva usando lodo-gen. A actividade especifi ca foi de 2000 dpm/ng. Mais de 97% da actividade radioactividade precipitou com 10% de ácido tricloroacético (TCA).

A proteina iodinada manteve ^80% da sua actividade catalítica contra Spectrozyme X (produto da American Diagnostica,

SL

Uma coluna de Ig anti-TFI-Sepharose 4b foi preparada como se segue; Sintetizou-se um peptídeo (designado peptídeo TFl) contendo uma sequência correspondente à sequência dos aminoácidos 3-25 do TFI maduro usando o sistema de síntese de peptideos em fase sólida da Biosystem. 0 peptídeo ΤΠ (5 mg) foi conjugado com 10 mg de hemocianina de lapa usando glutaraldeido. Dois coelhos brancos Nova Zelândia foram imunizados por injecção intradérmica com um homogenato contendo 1 ml de adjuvante completo de Freund e 1 ml de conjugado (200 gg de peptideo TFl). Um mês mais tarde os coelhos receberam um homogenato contendo 1 ml de adjuvante incompleto de Freund e 1 ml de conjugado (lOO jig de conjugado). Colheu-se anti-soro semanalmente durante 3 meses e deram-se injecçpes de mermória mensalmente. Para isolar anticorpos específicos contra o peptideo TFI o anti-soro foi cromatografado numa coluna de peptideo TFI-Sephraose 4b. A coluna foi lavada com 10 volumes de PBS (0,4 M NaCl -0,1 M benzamidina-1% Triton® X-100) e a mesma solução sem Triton-X100. 0 anticorpo foi eluido com 0,1 M glicina/HCl, pH 2,2, imediatamente neutralizada pela adição de l/lO de volume de 1M Tris-OIT e dialisado contra solução salina. 0 anticorpo isolado foi açodado a Sepharose 4b activada com brometo de cianogénio segundo o método do fabricante (Pharmacia) e usado para isolar TFI a partir do meio de cultura celular.

As células Chang do fígado foram cultivadas pelo método descrito anteriormente por Broze e Miletich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 1886-1890 (1987). 0 meio condicionado foi cromatografado na coluna de Ig anti-TFI-Sepharose 4b. A coluna foi lavada com 10 volumes de PBS-1% Triton X-100 e PBS. 0 TFI ligado foi eluido com 0,1 M glicina/HCl, pH 2,2. 0 TFI isolado por imunoafinidade foi ainda purificado por electroforese preparativa em gel de dodecilsulfato de sédio-poliacrilamida (sistema Savant). A análise de aminoácidos do produto final mostrou a mesma sequência terminal amino do TFI isolado a partir de células Hep G2 como descrito no pedido copendente, Ser. N5 77 3^6, entregue em 23 de Julho de 1987. 0 TFI isolado de fígado Chang foi então usado para imunizar coelhos pelo protocolo de imunização descrito atrás. 0 anti-soro obtido tinha um titulo de cerca de 100 no teste de duplas imunodifusão

-14Este anti-soro foi usado no despiste imune das bibliotecas de cDNA em y^gtll.

Métodos

Isolamento de clones de cDNA

Os métodos para despiste das bibliotecas de cDNA de placenta e de fígado fetal usando anticorpo, purificação por placas e preparação de liados e DNA do fago^/foram como descrito por Wun e Kretzmer, FEBS Lett.l. ll-lé (1987). 0 anti -soro foi pré-adsorvido com lisado BNN97^gtll e diluído 1/500 para despiste da biblioteca.

Despiste da actividade de ligação ao factor X ct

Proteínas recombinantes induzidas pelo isopropil-B-tiogalactosido de isolados do fago/^imuno-positivos ou de ^gtll testemunha foram despistadas quanto à actividade de ligação ao Factor X , Os lisados de fago (o;l ml) foram filtrados através de um papel de nitrocelulose usando um sistema de dot-blot” (BioRad). 0 papel de nitrocelulose foi então imerso e agitado num tampão de fosfatos salino contendo 5 mg/ml de albumina do soro bovina e 2,5 mg/ml de gama globulina bovina à temperatura ambiente lo 5 durante 1 h. A solução foi substituída por I-Factor X ^a(l,0 x 10 cpm/ml) dissolvido na mesma solução suplementada com 0,1 mg/ml de heparina e a agitação continuou durante mais uma hora, 0 papel de nitrocelulose foi então lavado Θ com tampão de fosfatos salino contendo 0,05% de Tween 20.

tampão de lavagem foi mudado de 5 em 5 min,, 4 vezes.

papel de nitrocelulose foi então seco ao ar e preparado para auto-radiografia usando filme Kodak XR5. 0 filme foi revelado após 1 semana de exposição.

Preparação de RNA poli (A) + e transferências Northern

Prepararam-se RNAs totais a partir de células Chang de fígado, células de hepatoma HepG2 e células de hepatoma SK-HEP-1 usando o método de extracção com perclorato de sódio de Lizardo e Engelberg, Anal. Biochem. 98, 116-122, (1979). Os RNAs poli (á)⁺ foram isolados por adsorção em bloco a oligo (dt)-celulose (P.L. Biochemical, tipo 77F) usando o processo recomendado pelo fabricante. Para a análise de transferências Northern, 10 pg de cada RNA poli(A)⁺ foram tratados com glioxal / Thomas, Enzymol. 100, 255-266 (1983) 7 ⁶ sujeitos a electroforese em gel de agarose num tampão contendo 10 mM fosfato de sódio, pH 7»0. Como marcador de pesos moleculares usou-se a escada de RNA de Bethesda Research Laboratory.

Os RNAs foram transferidos para papel de nitrocelulose que foi então incubado a 80° durante 2 h. 0 DNA de inserção do clone de Z P9 foi marcado radi activamente com P por nick-translation” e usado como sonda / Maniatis et al., Molecular Cloning i A Laboratory Mode1, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)_7. A transferência foi hibridada com 5 x 10 cpm da sonda em 5 ml de uma solução contendo 50$ de fonnamida, x SSC, 50 mM fosfato de sódio, Ph 7,0, 250 yg/ml de DNA de esperma de salmão desntaurado e solução de Denhardt 1 x a 42°C durante 16 h. 0 filtro foi lavado em 0,1$ de dodecilsulfato de sódio (SDS), 2 x SSC à temperatura ambien te 3 vezes, de cada vez 5 min., e em 0,1$ SDS, 0,2 x SSC a

50° duas vezes, 5 min. , de cada vez. 0 papel de nitrocelulose foi seco ao ar, auto-radiografado durante 3 dias, a -70°C usando filme Kodak XAR-5 e écran intensificador.

Outros métodos de DNA recombinante. A preparação de DNA de gtll clonado, subclonagem, no plasmideo pUC19 e vector M13mpl8, produção de delecções por digestão com exonuclease III e sequenciação de DNA pelo método didesoxi /“Sanger et al., Proc, Natl. Acad, Sei.

USA 83, 6776-678O (1977)_7 foram efectuados como descrito por Wan e Kretzmer, supra.

O programa FASTP escrito por

Lipman e Pearson, Science 227 1^35-1^1 (1985), foi usado para identificar familias homólogas de proteinas do Nationa: Biomedical Research Foundation Sequence Data Bank (saida 13, Junho 1987) β para alinhar as sequências dentro da família homóloga.

RESULTADOS

Despiste das Bibliotecas de cDNA.

Uma série de linhas celulares foram despistadas relativamente ã presença de TFI nos meios condicionados e encontrou-se que várias linhas celulares derivadas do fígado, fígado Chang, hepatoma Hep G2 e hepatoma SK-HEP-1 secretam TFI em cultura. Inicialmente usou-se um anti-soro contra TFI para despistar uma biblioteca de 6 cDNA de fígado fetal humano em K gtll (10 unidades formadoras de placas) e obtiveram-se 15 clones imunologicamente positivos. Subsequentemente, o mesmo método foi usado para despistar uma biblioteca cDNA de placenta em Kgtll. Das 10 uniades formadoras de placas obtiveram-se 10 clones imunologicamente positivos. Estes clones foram purificados por placas e os lisados dos clones purificados foram testados quanto à actividade funcional de TFI. Os lisados fágico induzidos com isopropiltiogalactosido foram adsorvidos a papel de nitrocelulose e testados quanto à actividade de 125 ligaçao ao I-Factor X . A Figura 1 demonstra que alguns 3.

destes clones imunologicamente positivos mostraram capaci125 dade de ligação ao I-Factor X no papel de nitrocelulose &

Ao todo, 3 dos 15 clones de figado fetal imunologicamente positivos e 4 dos 10 clones de placenta imunologicamente positivos mostraram actividade de ligação, a I-Factor X . Estes clones imunológica e funcionalmente positivos foram digeridos com EcoRI e o tamanho das inserções foi calculado por electroforese em gel. Um clone da biblioteca de placenta (^P9) tinha uma inserção de 1,4 kb enquanto que todos os outros clones contêm inserções de aprodmadamente 1,0 kb. A sequenciação parcial de DNA mostrou que os clones de 1,0 kb continham sequências idênticas a parte do clone de placenta mais longo de 1,4 kb (Àj?9). 0 7 P9 foi então seleccionado para sequenciação completa.

Sequencia de nucleotideos e sequência proteica prevista para o isolado de cDNA de TFI clone %P9 foi sujeito a mapeamento por restrição, subclonagem em M13 e sequenciação pela estratégia mostrada na Figura 2. Toda a sequência foi deter· minada em ambas as cadeias pelo método de delecção com exonuclease III /“Hemikoff, Gene 28 351-359 (1984) 7 ® encontrou-se consistir em 1432 bases de comprimento. A sequên· cia está apresentada na Figura 3. Ela contem uma região 5’ não codificadora de 133 bases, uma grelha de leitura aberta de 912 nucleotideos e uma região não codificadora 3’ de 387 nucleotideos. C primeiro ATG surge no nucleotideo 134 na

sequência TAGATGA que se seguiu de perto por um segundo ATG no nucleotideo 146 na sequência ACAATGA. Estas são possivelmente as seuqências de iniciação, se bem que difiram da sequência consensus proposta para a iniciação pelo ribossoma eucariótico, ACCATGG / Kozak, Cell 44, 283-292 (1986) 7, Vinte e oito aminoácidos precedem uma sequência que corresponde à terminação N da proteina madura.

comprimento e composição do segmento hidrofóbico destes 28 aminoácidos são tipicos das sequências sinal / Von Heijine, Eur. J. Brochem, 133, 17-21 (1983) ; J. Mol. Biol. 184, 99-105 (l985)_w7. Uma peptiAla dase sinal possivelmente corta em 28-Asp2p para dar origem a uma proteina madura. A sequência prevista para o TFI maduro consiste nos 276 aminoácidos que contêm 18 resíduos cisteina e 7 metioninas. A massa calculada de 31 950 Daltons baseado na sequência de proteina deduzida para o TFI maduro e algo menor que os 37-40 KDa calculado por elec troforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida de proteina isolado e a diferença provavelmente reflecte o contributo da glicosilação para a mobilidade da proteina natural. A sequência de proteina deduzida correspondendo à proteina Imadura contem 3 potenciais sitios de glicosilação ligada a N com a sequência Asn-X-Tre/Ser (posições de aminoácidos l45, 195 e 256). A análise da sequência de aminoácidos de TFI total purificado e de dois fragementos proteoliticos isolados estão exactamente de acordo com a sequência de proteina deduzida a partir da sequência de cDNA (Figura 3» sublinhado), indicando que o clone de cDNA isolado codifica TFI. A região não codificadora 3’ θ rica em A+T (7θ% A+T)l' Neste clone não se encontrou nem sinal consensus de poliadenilação, ΑΑΤΑΔΑ /Proudfoot e Brownlee, Nature 252.359-362 (l98l)_7 nem a cauda poli A. possivelmente devido à perda de parte da porção terminal 3’ durante a construção da biblioteca.

-19Distribuiçao de carga, hidrofobicidade/liidrofilicidade e homologia interna

A sequência de aminoácidos traduzida do TFI contem 27 bisinas, 17 argininas, 11 ácidos aspárticos e 25 ácidos glutâmicos. A distribuição de cargas ao longo da proteina é altamente irregular como se mostra na Figura 4, A região do peptideo sinal contem 2 lisinas carregadas positivamente com 26 residuos neutros. A região amino-terminal da proteina madura contem um segmento altamente carregado negativamente. Seis dos 7 primeiros residuos são ácido aspártico ou ácido glutâmico que são seguidos de perto por mais dois aminoácidos carregados negativamente a jusante antes de aparecer um residuo lisina positivamente carregado. A porção central da molécula está geralmente carregada negativamente, j^a terminação carboxilo existe um segmento altamente carregado positivamente. Os aminoácidos 2Ó5 a 293 do TFI contêm l4 residuos de aminoácidos carregados positivamente incluindo 6 residuos consequtivos arginina+lisina.

perfil de hidrofilicidade/hidrofobicidade previsto da proteina TFI está apresentado na Figura 5. θ peptideo sinal contem uma região altamente hidrofébica conforme esperado. 0 resto da molécula surge muito hidrofilica.

A sequência de aminoácidos traduzida do TFI contém vários dominios discerniveis. Para alé& do dominio N-terminal altamente carregado negativamente e do dominio C-terminal altamente carregado positivamente, a porção central consiste em 3 dominios homólogos que têm an sequências tipicas dos inibidores tipo Kuvitz (ver abaixo).

Homologia com outras proteinas

Ao investigar-se a base de dados sobre sequências do National Biomedical Research Foundation encontrou-se que o dominio N-terminal e o domínio C-terminal do TFI não apresentam homologia significativa com outras proteinas. Os 3 dominios homólogos internos, no entanto, são homólogos uns dos outros relativamente às sequências dos outros inibidores de proteases básicas incluin o inibidor de proteases básicas bovino (aprotinina), inibilo dores de proteases básicas de venenos e inibidores de inter-^ú-tripsina (Figura 6). Deve-se notar que a estrutura de ligações dissulfureto é altamente conservada em todos estes inibidores. Com base nestas homologias é claro que TFI pertence à superfamilia de genes de inibidores das proteases básicas.

Transferência Northern

Purificaram-se RNAs poli(A)⁺ a partir de linhas celulares derivadas do figado e produtoras de TFI, figado Chang, hepatoma Hep G2 e células de hepatoma

SK-HEP-1. Os RNAs poli(A)⁺ foram resolvidos por electrof ore.

se desnaturante em agarose, transferência para um papel de nitrocelulose e sondados com cDNA de TFI Qp 9) marcado com 32

P. Como se mostra na Figura 7, observaram-se duas manchas principais de liibridação que correspondiam a mRNAs de 1,4 kb e 4,4 kb ngs três linhas celulares testadas. Várias outras linhas celulares foram testadas que não produzem quantidades detectáveis de TFI e em que não se encontrou liibridação com a sohda (resultados não apresentados).

Vários outros exemplos serão apa rentes para os familiarizados com o assunto após leitura da presente divulgação sem se afsatarem do espirito e âm bito do invento. Pretende-se que todos estes exemplos se jam incluídos no âmbito das reivindicações apensas.

Claims

REIVINDICAÇÕES:

is, - Processo para a preparação de vectores de DNA recombinante caracterizado por se incluir nos referidos vectores sequências de DNA do inibidor do factor de tecido humano À,P9 com as caracteristicas que se mostram no mapa de restrição na Fig.
2 seguinte:

0.6 0.8

1.4Kb

FIG.2

25. - Processo para a preparação de vectores de DNA recombinante caracterizado por se incluir nos referidos vectores sequências de cDNA do inibidor do factor de tecido humano tendo a sequência de nucleotideos mostrada na Fig.3 seguinte:
3-· - Processo para a preparação de vectores de DNA recombinante caracterizado por se incluir nos referidos vectores sequências de DNA que consistem em sequências codificadoras do inibidor do factor de tecido humano.
4s. - Processo para a preparação de inibidor do factor de tecido humano tendo a sequência de aminoácidos como se mostra na Fig. 3 anterior caracterizado por se utilizar vectores de DNA recombinante preparados de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3·
5^&. - Processo de acordo com a Rei vindicação 4, caracterizado por se preparar uma proteina que não é glicosilada.
6-, - Processo de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por se preparar uma proteina que é glicosilada.