JP2836823B2 - ヒト組織因子抑制因子のｄｎａクローン - Google Patents
ヒト組織因子抑制因子のｄｎａクローンInfo
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、組織因子抑制因子（TFI）あるいはリポタ
ンパク質関連凝固抑制因子（LACI）として知られる凝固
抑制因子に関する。更に詳細には、本発明は全長TFIを
本質的に表現しているcDNAクローンに関する。
ンパク質関連凝固抑制因子（LACI）として知られる凝固
抑制因子に関する。更に詳細には、本発明は全長TFIを
本質的に表現しているcDNAクローンに関する。
哺乳動物の血液での凝固カスケードには、２つの異な
るシステム、即ち内因性システムと外因性システムとが
ある。後者の外因性システムは、血液が組織スロンボプ
ラステイン（第III因子）（以後、組織因子（TF）と言
う）にさらされることによつて活性化される。この組織
因子は、各種の細胞のプラズマメンブレン中で生じるリ
ポタンパク質であり、特に脳及び肺において多く存在す
る。プラズマ第VII因子あるいはその活性体である第VII
a因子がTFと接触すると、TFとともにカルシウム依存性
複合体を形成し、これがタンパク加水分解作用を発揮し
て第Ｘ因子を第X a因子にまた第IX因子を第IX a因子に
活性化する。
るシステム、即ち内因性システムと外因性システムとが
ある。後者の外因性システムは、血液が組織スロンボプ
ラステイン（第III因子）（以後、組織因子（TF）と言
う）にさらされることによつて活性化される。この組織
因子は、各種の細胞のプラズマメンブレン中で生じるリ
ポタンパク質であり、特に脳及び肺において多く存在す
る。プラズマ第VII因子あるいはその活性体である第VII
a因子がTFと接触すると、TFとともにカルシウム依存性
複合体を形成し、これがタンパク加水分解作用を発揮し
て第Ｘ因子を第X a因子にまた第IX因子を第IX a因子に
活性化する。
TFによりイニシエイトされる凝固系の制御に関するこ
れまでの研究により、TFを血清とともにインキユベーシ
ヨン（粗組織スロンボプラステイン調製物中で）する
と、その活性がin vitroで抑制されまたTFをマウスに注
入した時の致死効果が阻止されることが明らかにされて
いる。Hjortの精力的な研究によつて、この分野におけ
るそれまでの研究成果が確認され更に研究が進められ
て、血清中の抑制成分が第VII−TF複合因子を認識する
ことが結論として示された〔Scand.J.Clin.Lab.Invest.
9,Suppl.27,76〜97（1957）〕。この結論は、プラズマ
中で生じるTFの抑制にはCa2+の存在が必要であり（第VI
I/VII a因子がTFに結合する際にもCa2+の存在が必要）T
Fの抑制はEDTAによる２価のカチオンのキレート化によ
つて阻止され及び／又は逆転されるという事実と符合し
ている。
れまでの研究により、TFを血清とともにインキユベーシ
ヨン（粗組織スロンボプラステイン調製物中で）する
と、その活性がin vitroで抑制されまたTFをマウスに注
入した時の致死効果が阻止されることが明らかにされて
いる。Hjortの精力的な研究によつて、この分野におけ
るそれまでの研究成果が確認され更に研究が進められ
て、血清中の抑制成分が第VII−TF複合因子を認識する
ことが結論として示された〔Scand.J.Clin.Lab.Invest.
9,Suppl.27,76〜97（1957）〕。この結論は、プラズマ
中で生じるTFの抑制にはCa2+の存在が必要であり（第VI
I/VII a因子がTFに結合する際にもCa2+の存在が必要）T
Fの抑制はEDTAによる２価のカチオンのキレート化によ
つて阻止され及び／又は逆転されるという事実と符合し
ている。
最近の研究によつて、プラズマあるいは血清中でTFを
抑制するには第VII a因子だけではなく触媒的に活性な
第X a因子と更に他の因子が必要であることが明らかに
されている〔BrozeとMiletich、Blood69、150〜155（19
87）;Sandersら、Ibid.,66,204〜212（1985）〕。この
他の因子は組織因子抑制因子（TFI）あるいはリポタン
パク質関連凝固抑制因子（LACI）と定義されるものであ
り、バリウム吸着プラズマ中に存在している。また血清
を遠心して密度1.21g/cm3とした時の浮遊液中のリポタ
ンパク質フラクシヨンとともにTFI活性が分離されるこ
とから、この因子はリポタンパク質と関連しているもの
と考えられる。
抑制するには第VII a因子だけではなく触媒的に活性な
第X a因子と更に他の因子が必要であることが明らかに
されている〔BrozeとMiletich、Blood69、150〜155（19
87）;Sandersら、Ibid.,66,204〜212（1985）〕。この
他の因子は組織因子抑制因子（TFI）あるいはリポタン
パク質関連凝固抑制因子（LACI）と定義されるものであ
り、バリウム吸着プラズマ中に存在している。また血清
を遠心して密度1.21g/cm3とした時の浮遊液中のリポタ
ンパク質フラクシヨンとともにTFI活性が分離されるこ
とから、この因子はリポタンパク質と関連しているもの
と考えられる。
BrozeとMiletich、Blood69、150〜155（1987）及びPr
oc.Natl.Acad.Sci,USA84、1886〜1890（1987）によれば
Hep G2細胞（ヒトヘパト−マセルライン）が、プラズマ
中に存在するTFIと同様の特性を有する抑制成分を分泌
することが示されている。
oc.Natl.Acad.Sci,USA84、1886〜1890（1987）によれば
Hep G2細胞（ヒトヘパト−マセルライン）が、プラズマ
中に存在するTFIと同様の特性を有する抑制成分を分泌
することが示されている。
米国同時係属出願Ser.No.77,366号明細書（出願日:19
87年７月23日）には、Hep G2細胞から分泌された精製組
織因子抑制因子が記載されている。この組織因子抑制因
子には２つの形態、即ちナトリウムドデシルスルフエー
トポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で測
定した時に約37,000〜40,00ダルトンの位置に現われるT
FI1と約25,000〜26,000ダルトンの位置に現われるTFI2
との２つの形態が存在することが見出されている。TFI
のアミノ酸配列のＮ−末端部分が以下のように決定され
ている。
87年７月23日）には、Hep G2細胞から分泌された精製組
織因子抑制因子が記載されている。この組織因子抑制因
子には２つの形態、即ちナトリウムドデシルスルフエー
トポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で測
定した時に約37,000〜40,00ダルトンの位置に現われるT
FI1と約25,000〜26,000ダルトンの位置に現われるTFI2
との２つの形態が存在することが見出されている。TFI
のアミノ酸配列のＮ−末端部分が以下のように決定され
ている。
（Ｘ−Ｘは未決定である） 上記米国出願明細書の記載は本明細書に引用する。
発明の要旨 本発明によれば、本質的に組織因子抑制因子の全長を
表現するcDNAクローンの完全コード配列が見出された。
表現するcDNAクローンの完全コード配列が見出された。
最初に、ヒト胎盤及び胎児肝λgt11cDNAライブラリー
を、精製TFIに対するラビツトポリクローナル血清でス
クリーニングした。免疫学的にポジテイブなクローンに
ついて、更に125I−第X a因子結合活性をスクリーニン
グした。免疫学的にかつ機能的に活性な７個のクローン
が得られた。最も長いクローンは胎盤由来λP9であつて
1.4キロベース（kb）であり、他の６個のクローンは1.0
kbであつた。部分的DNA配列決定により、1.0kbクローン
は1.4kbクローンの１部分と同じ配列を有することが明
らかになつた。ヌクレオチド配列分析により、λP9は、
133bpの５′非コード領域、912bpのオープン・リーデイ
ング・フレーム、ストツプコドン及び384bpの３′非コ
ード領域を含む1432塩基対（bp）のcDNAインサート配列
からなることが明らかにされた。
を、精製TFIに対するラビツトポリクローナル血清でス
クリーニングした。免疫学的にポジテイブなクローンに
ついて、更に125I−第X a因子結合活性をスクリーニン
グした。免疫学的にかつ機能的に活性な７個のクローン
が得られた。最も長いクローンは胎盤由来λP9であつて
1.4キロベース（kb）であり、他の６個のクローンは1.0
kbであつた。部分的DNA配列決定により、1.0kbクローン
は1.4kbクローンの１部分と同じ配列を有することが明
らかになつた。ヌクレオチド配列分析により、λP9は、
133bpの５′非コード領域、912bpのオープン・リーデイ
ング・フレーム、ストツプコドン及び384bpの３′非コ
ード領域を含む1432塩基対（bp）のcDNAインサート配列
からなることが明らかにされた。
このcDNA配列は、18個のシステイン及び/7個のメチオ
ニンを含む276個のアミノ酸からなる31,950ダルトンの
蛋白質をコードしている。翻訳されたアミノ配列によ
り、成熟TFI蛋白の先には約28個のアミノ酸からなるシ
グナルペプチドが存在することが明らかにされた。ここ
で言う“成熟"TFIとは、本明細書において記載するλP9
クローンのATG翻訳コドンによつてTFIとメチオニルTFI
との両者を含むように定義されるものであり、このこと
は以下の記載から理解することができよう。
ニンを含む276個のアミノ酸からなる31,950ダルトンの
蛋白質をコードしている。翻訳されたアミノ配列によ
り、成熟TFI蛋白の先には約28個のアミノ酸からなるシ
グナルペプチドが存在することが明らかにされた。ここ
で言う“成熟"TFIとは、本明細書において記載するλP9
クローンのATG翻訳コドンによつてTFIとメチオニルTFI
との両者を含むように定義されるものであり、このこと
は以下の記載から理解することができよう。
TFI蛋白には、Asn−Ｘ−Ser/Thr（Ｘは普通の20個の
アミノ酸のうちのいずれでもよい）の配列を有する３個
のＮ−結合グリコシル化部位が存在する。これらの部位
は、５′非コード領域の後の最初のメチオニンの位置を
アミノ酸の位置＋１とした時、Asn145、Asn195及びAsn2
56の位置にある。
アミノ酸のうちのいずれでもよい）の配列を有する３個
のＮ−結合グリコシル化部位が存在する。これらの部位
は、５′非コード領域の後の最初のメチオニンの位置を
アミノ酸の位置＋１とした時、Asn145、Asn195及びAsn2
56の位置にある。
TFIの翻訳されたアミノ酸配列により、該アミノ酸配
列は、高度にマイナスに荷電したＮ末端部分、高度にプ
ラスに荷電したカルボキシ末端部分、及びKunitz型酵素
抑制因子の典型的配列を有する３個の相同ドメインから
なる介在配列部分などのいくつかの識別可能な領域を有
していることが明らかにされた。
列は、高度にマイナスに荷電したＮ末端部分、高度にプ
ラスに荷電したカルボキシ末端部分、及びKunitz型酵素
抑制因子の典型的配列を有する３個の相同ドメインから
なる介在配列部分などのいくつかの識別可能な領域を有
していることが明らかにされた。
相同性についての研究から、TFIは塩基性プロテアー
ゼ抑制因子遺伝子スーパーフアミリーに属するものと考
えられる。
ゼ抑制因子遺伝子スーパーフアミリーに属するものと考
えられる。
cDNAクローンλP9を開発するために用いた蛋白材料は
ヒト胎盤組織であり、この組織は通常の外科的手法によ
る分娩後に広く入手することができる。本発明において
用いられているλgt11（lac5 nin5 c1857 s100）はよく
知られたものであつて、普通に入手することのできるラ
ムダフアージ発現ベクターである。その構成及び制限酵
素地図は、YoungとDavis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80,11
94〜1198（1983）に記載されている。
ヒト胎盤組織であり、この組織は通常の外科的手法によ
る分娩後に広く入手することができる。本発明において
用いられているλgt11（lac5 nin5 c1857 s100）はよく
知られたものであつて、普通に入手することのできるラ
ムダフアージ発現ベクターである。その構成及び制限酵
素地図は、YoungとDavis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80,11
94〜1198（1983）に記載されている。
ノーザン・ブロツト分析により、肝由来セルライン、
即ちChangリバー、Hep G2ヘパトーマ及びSK−HEP−１ヘ
パトーマは、TFI cDNAとハイブリダイズする２つの主要
なmRNA（1.4kbと4.4kb）を有していることが明らかにさ
れた。
即ちChangリバー、Hep G2ヘパトーマ及びSK−HEP−１ヘ
パトーマは、TFI cDNAとハイブリダイズする２つの主要
なmRNA（1.4kbと4.4kb）を有していることが明らかにさ
れた。
本明細書に記載した如き、TFIのためのcDNAのクロー
ニング及びその全蛋白配列及び構造の解明により、詳細
な構造−機能分析が可能となり、またその生合成的レギ
ユレーシヨンの研究のための基本的知識が得られる。
ニング及びその全蛋白配列及び構造の解明により、詳細
な構造−機能分析が可能となり、またその生合成的レギ
ユレーシヨンの研究のための基本的知識が得られる。
しかして本発明は、第X a因子及ひ第VII a/TFI酵素複
合因子を抑制することのできる試薬についての血液凝固
カスケード研究にとつて重要なものである。
合因子を抑制することのできる試薬についての血液凝固
カスケード研究にとつて重要なものである。
図面の詳細な記述 本明細書においては、特許請求の範囲の記載によつて
本発明を形成すると考えられる対象が特に指摘され明白
にクレームされているが、以下に記述する図面について
の説明とともに本発明の好ましい態様についての記載に
より本発明がよりよく理解されるものと考えられる。
本発明を形成すると考えられる対象が特に指摘され明白
にクレームされているが、以下に記述する図面について
の説明とともに本発明の好ましい態様についての記載に
より本発明がよりよく理解されるものと考えられる。
第１図は、125I−第X a因子を用いたλgt11クローン
のスクリーニングを示したものである。
のスクリーニングを示したものである。
クローン化フアージの溶解物（0.1ml）を、ドツト・
プロツト装置を用いたサクシヨンによりニトロセルロー
スペーパー上にスポツトし、次いでニトロセルロースペ
ーパーを125I−第Xa因子でプローブし、以後に記述する
ようにしてオートラジオグラフイーに付した。黒いスポ
ツトとして現われているクローンが125I−第X a因子と
結合したポジテイブ・クローンである。コントロールλ
gt11（下の右側のコーナー）及び他のクローンは125I−
第X a因子と結合しなかつた。
プロツト装置を用いたサクシヨンによりニトロセルロー
スペーパー上にスポツトし、次いでニトロセルロースペ
ーパーを125I−第Xa因子でプローブし、以後に記述する
ようにしてオートラジオグラフイーに付した。黒いスポ
ツトとして現われているクローンが125I−第X a因子と
結合したポジテイブ・クローンである。コントロールλ
gt11（下の右側のコーナー）及び他のクローンは125I−
第X a因子と結合しなかつた。
第２図は、部分的制限酵素地図及びλP9のインサート
配列の配列決定に用いた技法を示している。下に示した
スケールはヌクレオチドの位置を示している。太い棒線
はコード領域を示しており、細い棒線は５′及び３′非
コード領域を示している。制限酵素部位は消化により確
認した。矢印はcDNAの配列決定に用いたオーバーラツピ
ングΜ13クローンを示している。
配列の配列決定に用いた技法を示している。下に示した
スケールはヌクレオチドの位置を示している。太い棒線
はコード領域を示しており、細い棒線は５′及び３′非
コード領域を示している。制限酵素部位は消化により確
認した。矢印はcDNAの配列決定に用いたオーバーラツピ
ングΜ13クローンを示している。
第３図は、ヒトTFI cDNAのヌクレオチド配列及び翻訳
されたアミノ酸配列を示している。ヌクレオチドの番号
は左側に示されており、アミノ酸の番号は右側に示され
ている。下線を引いた配列は、精製したTFI蛋白と、V8
プロテアーゼとトリプシンで消化したペプチドとを用い
たアミノ酸配列分析によつて独立に確認された配列であ
る。＋１のアミノ酸は、５′非コード領域のストツプコ
ドンの後にある最初のメチニオンである。Ｎ−結合グリ
コシル化部位は星印で示されている。
されたアミノ酸配列を示している。ヌクレオチドの番号
は左側に示されており、アミノ酸の番号は右側に示され
ている。下線を引いた配列は、精製したTFI蛋白と、V8
プロテアーゼとトリプシンで消化したペプチドとを用い
たアミノ酸配列分析によつて独立に確認された配列であ
る。＋１のアミノ酸は、５′非コード領域のストツプコ
ドンの後にある最初のメチニオンである。Ｎ−結合グリ
コシル化部位は星印で示されている。
第４図は、TFIのアミノ酸配列における電荷分布を示
すグラフである。電荷は最初のアミノ酸残基からｉ番目
のアミノ酸残基までを計算したものであり、その電荷の
値がｉ番目の残基に示されている。従つて、ｉ番目の位
置の値は、最初のアミノ酸残基からｉ番目のアミノ酸残
基までの全ての電荷を合計したものであり、ｉ番目とｊ
番目（ｊ＞ｉ）のアミノ酸残基における値の差は、ｉ番
目からｊ番目までのアミノ酸残基の合計電荷を示すもの
である。
すグラフである。電荷は最初のアミノ酸残基からｉ番目
のアミノ酸残基までを計算したものであり、その電荷の
値がｉ番目の残基に示されている。従つて、ｉ番目の位
置の値は、最初のアミノ酸残基からｉ番目のアミノ酸残
基までの全ての電荷を合計したものであり、ｉ番目とｊ
番目（ｊ＞ｉ）のアミノ酸残基における値の差は、ｉ番
目からｊ番目までのアミノ酸残基の合計電荷を示すもの
である。
第５図は、TFIの疎水性プロフアイルを示すグラフで
ある。アミノ酸残基の疎水性の指数をアミノ酸残基が蛋
白内に埋没された深さ（Ｘ線による結晶学的、データか
ら得られる）として定義するコンピュータープログラム
によつて、疎水性プロフアイルを分析した〔Kideraら、
J.Protein Chem.4,23〜55（1985）〕。アミノ酸配列に
沿つた疎水性プロフアイルは、IMSL LIbraryのプログラ
ムICSSCUを用いることによつて、滑らかになつた〔IMSL
Library Reference Manual,9th ed.,Institute for Ma
thematical and Statistical Subroutine Library,Hous
ton,Texas（1982）〕。
ある。アミノ酸残基の疎水性の指数をアミノ酸残基が蛋
白内に埋没された深さ（Ｘ線による結晶学的、データか
ら得られる）として定義するコンピュータープログラム
によつて、疎水性プロフアイルを分析した〔Kideraら、
J.Protein Chem.4,23〜55（1985）〕。アミノ酸配列に
沿つた疎水性プロフアイルは、IMSL LIbraryのプログラ
ムICSSCUを用いることによつて、滑らかになつた〔IMSL
Library Reference Manual,9th ed.,Institute for Ma
thematical and Statistical Subroutine Library,Hous
ton,Texas（1982）〕。
第６図は、TFIの塩基性プロテアーゼ抑制因子ドメイ
ンと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメン
トを示す。TFI以外の他の全ての配列は、National Biom
edical Research Foundationの蛋白配列データベース
（Geogetown University,Washington,D.C.,レリース13,
June1987）から得たものである。
ンと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメン
トを示す。TFI以外の他の全ての配列は、National Biom
edical Research Foundationの蛋白配列データベース
（Geogetown University,Washington,D.C.,レリース13,
June1987）から得たものである。
1:牛塩基性プロテアーゼ抑制因子前駆体； 2:牛初乳トリプシン抑制因子； 3:牛血清塩基性プロテアーゼ抑制因子； 4:食用カタツムリ・イソ抑制因子； 5:紅海ウミガメ塩基性プロテアーゼ抑制因子（１〜79の
アミノ酸のみ）； 6:ウエスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑
制因子I; 7:リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II; 8:ケープ・コブラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II; 9:ルツセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II; 10:サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子III; 11:イースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロテ
アーゼ抑制因子Ｉホモローグ； 12:ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因
子B; 13:ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因
子E; 14:ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因
子I; 15:ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因
子K; 16:β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（マイナー）； 17:β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジャー）； 18:β−２−ブンガロトキシンＢ鎖； 19:ウマ・インターα−トリプシン抑制因子〔アミノ酸
１〜57（１）;58〜123（２）〕； 20:ブタ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミノ
酸１〜57（１）;58〜123（２）〕； 21:ウシ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミノ
酸１〜57（１）;58〜123（２）〕； 22:ヒト・α−１−マイクログロブリン／インター−α
−トリプシン抑制因子前駆体〔アミノ酸227〜283
（１）;284〜352（２）〕； 23:TFI〔アミノ酸47〜117（１）;118〜188（２）;210〜
280（３）〕。
アミノ酸のみ）； 6:ウエスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑
制因子I; 7:リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II; 8:ケープ・コブラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II; 9:ルツセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子II; 10:サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子III; 11:イースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロテ
アーゼ抑制因子Ｉホモローグ； 12:ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因
子B; 13:ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因
子E; 14:ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因
子I; 15:ブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因
子K; 16:β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（マイナー）； 17:β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジャー）； 18:β−２−ブンガロトキシンＢ鎖； 19:ウマ・インターα−トリプシン抑制因子〔アミノ酸
１〜57（１）;58〜123（２）〕； 20:ブタ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミノ
酸１〜57（１）;58〜123（２）〕； 21:ウシ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミノ
酸１〜57（１）;58〜123（２）〕； 22:ヒト・α−１−マイクログロブリン／インター−α
−トリプシン抑制因子前駆体〔アミノ酸227〜283
（１）;284〜352（２）〕； 23:TFI〔アミノ酸47〜117（１）;118〜188（２）;210〜
280（３）〕。
最良のアラインメントを達成するためには16,17,18に
ギヤツプが含まれていた。
ギヤツプが含まれていた。
アミノ酸を示す標準的１文字コードを用いた。
第７図は、３個の肝由来セルラインから得たRNAのノ
ーザン・ブロツト分析を示す。１レーン当り10μｇのポ
リ（Ａ）+RNAを用いた。
ーザン・ブロツト分析を示す。１レーン当り10μｇのポ
リ（Ａ）+RNAを用いた。
レーン1:Changリバー細胞、 レーン2:SK−HEP−１ヘパトーマ細胞、 レーン3:HepG2ヘパトーマ細胞． 本明細書においては、標準的生化学命名法を用いてお
り、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ）として表わさ
れている。対応するヌクレオチドは、例えばデオキシグ
アノシン−５′−トリホスフエート（dGTP）である。DN
Aヌクレオチド配列は、便宜上慣用的に１本鎖のみで示
されており、１本鎖におけるＡはその相補性塩基として
Ｔを内包しており、ＧはＣを内包している。アミノ酸
は、以下の表に示すように１文字あるいは３文字で示さ
れている。
り、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ）として表わさ
れている。対応するヌクレオチドは、例えばデオキシグ
アノシン−５′−トリホスフエート（dGTP）である。DN
Aヌクレオチド配列は、便宜上慣用的に１本鎖のみで示
されており、１本鎖におけるＡはその相補性塩基として
Ｔを内包しており、ＧはＣを内包している。アミノ酸
は、以下の表に示すように１文字あるいは３文字で示さ
れている。
本明細書において記載される普通に入手し得る制限酵
素は、以下に示す制限配列及び開裂パターン（矢印で示
した）を有している。
素は、以下に示す制限配列及び開裂パターン（矢印で示
した）を有している。
本発明の好ましい態様を更に詳細に説明するために、
以下に記述する実験を実施した。
以下に記述する実験を実施した。
例 １ 材 料 ヒト胎盤及び胎児肝cDNAライブラリーをClonetechか
ら得た。プロトブロツト（protoblot）・イムノスクリ
ーニング・キツトはPromega Biotechから購入した。制
限酵素は、New England Biolabsから購入した。牛腸ア
ルカリ・ホスフアターゼ、T4DNAリガーゼ、DNAポリメラ
ーゼＩ（クレノー）、エキソヌクレアーゼIII及びS1ヌ
クレアーゼは、Boehringer Mannheimから購入した。dNT
PはP.L.Biochemicalsから購入した。５′−〔α−35S〕
−チオ−dATP（600Ci/m mol）はAmershamから購入し
た。配列決定用キツト（Sequenase）はUnited States B
iochemicalsから購入した。Changリバー細胞（ATCC CCL
13）及びHep G2ヘパトーマ細胞（ATCC HB8065）は、ア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンから得
た。SK−HEP−１ヘパトーマ細胞は、Sloan−Kettering
Institute for Cancer ResearchのG.Trempeによつて197
1年に肝アデノカルシノーマから誘導されたものであ
り、現在で広く容易に入手可能である。
ら得た。プロトブロツト（protoblot）・イムノスクリ
ーニング・キツトはPromega Biotechから購入した。制
限酵素は、New England Biolabsから購入した。牛腸ア
ルカリ・ホスフアターゼ、T4DNAリガーゼ、DNAポリメラ
ーゼＩ（クレノー）、エキソヌクレアーゼIII及びS1ヌ
クレアーゼは、Boehringer Mannheimから購入した。dNT
PはP.L.Biochemicalsから購入した。５′−〔α−35S〕
−チオ−dATP（600Ci/m mol）はAmershamから購入し
た。配列決定用キツト（Sequenase）はUnited States B
iochemicalsから購入した。Changリバー細胞（ATCC CCL
13）及びHep G2ヘパトーマ細胞（ATCC HB8065）は、ア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンから得
た。SK−HEP−１ヘパトーマ細胞は、Sloan−Kettering
Institute for Cancer ResearchのG.Trempeによつて197
1年に肝アデノカルシノーマから誘導されたものであ
り、現在で広く容易に入手可能である。
125I−第X a因子は、ヨード源を用いて放射標識する
ことにより調製した。この比活性は2000dpm/ngであつ
た。放射活性の97％以上は10％トリクロロ酢酸（TCA）
により沈澱可能であつた。ヨード化蛋白は、Sepectrozy
meXa（American Diagnostica製）に対してその触媒活性
を80％以上保持していた。
ことにより調製した。この比活性は2000dpm/ngであつ
た。放射活性の97％以上は10％トリクロロ酢酸（TCA）
により沈澱可能であつた。ヨード化蛋白は、Sepectrozy
meXa（American Diagnostica製）に対してその触媒活性
を80％以上保持していた。
抗−TFI−Igセフアロース 4Bカラムは以下のように
して調製した。即ち、成熟TFIのアミノ酸３−25の配列
に相当する配列を含むペプチド（TFI−ペプチド）を、B
iosystemの固相ペプチド合成システムを用いて合成し
た。TFI−ペプチド（5mg）を、グルタルアルデヒドによ
りキーホール（Keyhole）・リンペツト（lympet）・ヘ
モシアニン10mgに結合させてコンジユゲートを調製し
た。２匹のNew Zealandホワイト・ラビツトに、フロイ
ント・完全・アジユバンド1mlと、上記コンジユゲート1
ml（TFI−ペプチド200μｇ）を含むホモジエネートを皮
内注射して、それぞれ免疫化した。１ケ月後に、フロイ
ント・不完全・アジユバント1mlとコンジユゲート1ml
（TFI−ペプチド100μｇ）を含むホモジエネートで、２
匹のラビツトをそれぞれブースターした。３ケ月の間、
１週間毎に抗血清を採取し、１ケ月毎にブースター注射
を行なつた。TFI−ペプチドに対する特異的抗体を単離
するために、抗血清をTFI−ペプチドセフアロース4Bカ
ラムを用いたクロマトグラフイーに付した。カラムを、
10倍量のPBS（0.4M NaCl−0.1Mベンズアミジン−１％ト
リトン Ｘ−100）及びトリトンＸ−100を含まない同様
の溶液で洗つた。0.1Μのグリシン/HCl、pH2.2で抗体を
溶出させ、直ちに1/10倍量の１Μトリス−OHを加えて中
和し、次いで食塩水に対して透析した。単離された抗体
を、シアノゲン・ブロマイドで活性化させたセフアロー
ス4Bに製造業者（Pharmacia）の指針に従つて結合さ
せ、これを細胞培養培地からのTFIの単離に用いた。
して調製した。即ち、成熟TFIのアミノ酸３−25の配列
に相当する配列を含むペプチド（TFI−ペプチド）を、B
iosystemの固相ペプチド合成システムを用いて合成し
た。TFI−ペプチド（5mg）を、グルタルアルデヒドによ
りキーホール（Keyhole）・リンペツト（lympet）・ヘ
モシアニン10mgに結合させてコンジユゲートを調製し
た。２匹のNew Zealandホワイト・ラビツトに、フロイ
ント・完全・アジユバンド1mlと、上記コンジユゲート1
ml（TFI−ペプチド200μｇ）を含むホモジエネートを皮
内注射して、それぞれ免疫化した。１ケ月後に、フロイ
ント・不完全・アジユバント1mlとコンジユゲート1ml
（TFI−ペプチド100μｇ）を含むホモジエネートで、２
匹のラビツトをそれぞれブースターした。３ケ月の間、
１週間毎に抗血清を採取し、１ケ月毎にブースター注射
を行なつた。TFI−ペプチドに対する特異的抗体を単離
するために、抗血清をTFI−ペプチドセフアロース4Bカ
ラムを用いたクロマトグラフイーに付した。カラムを、
10倍量のPBS（0.4M NaCl−0.1Mベンズアミジン−１％ト
リトン Ｘ−100）及びトリトンＸ−100を含まない同様
の溶液で洗つた。0.1Μのグリシン/HCl、pH2.2で抗体を
溶出させ、直ちに1/10倍量の１Μトリス−OHを加えて中
和し、次いで食塩水に対して透析した。単離された抗体
を、シアノゲン・ブロマイドで活性化させたセフアロー
ス4Bに製造業者（Pharmacia）の指針に従つて結合さ
せ、これを細胞培養培地からのTFIの単離に用いた。
Changリバー細胞を、BrozeとMiletich,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA84,1886〜1890（1987）に記載された方法に従
つて培養した。ならし培地を、抗−TFI−Igセフアロー
ス4Bカラムを用いたクロマトグラフイーに付した。次い
でカラムを、10倍量のPBS−１％トリトンＸ−100とPBS
で洗つた。結合したTFIを0.1Μグリシン/HCl、pH2.2で
溶出した。イムノ・アフイニテイーにより単離したTFI
を更に分離用ナトリウム・ドデシルスルフエート・ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（Savant apparatus）によ
り精製した。最終取得物のアミノ酸を分析した所、米国
同時係属出願Ser,No.77,366号明細書（出願日:1987年７
月23日）に記載されたHep G2細胞から単離したTFIと同
様のＮ末端アミノ酸配列を有していた。単離したChang
リバーTFIを用いて、上記したと同じ免疫化プロトコー
ルによりラビツトを免疫化した。得られた抗血清は、２
重免疫拡散法テストで約100μg/mlの力価を示した。こ
の抗血清を用いてλgt11cDNAライブラリーのイムノ・ス
クリーニングを行なつた。
d.Sci.USA84,1886〜1890（1987）に記載された方法に従
つて培養した。ならし培地を、抗−TFI−Igセフアロー
ス4Bカラムを用いたクロマトグラフイーに付した。次い
でカラムを、10倍量のPBS−１％トリトンＸ−100とPBS
で洗つた。結合したTFIを0.1Μグリシン/HCl、pH2.2で
溶出した。イムノ・アフイニテイーにより単離したTFI
を更に分離用ナトリウム・ドデシルスルフエート・ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（Savant apparatus）によ
り精製した。最終取得物のアミノ酸を分析した所、米国
同時係属出願Ser,No.77,366号明細書（出願日:1987年７
月23日）に記載されたHep G2細胞から単離したTFIと同
様のＮ末端アミノ酸配列を有していた。単離したChang
リバーTFIを用いて、上記したと同じ免疫化プロトコー
ルによりラビツトを免疫化した。得られた抗血清は、２
重免疫拡散法テストで約100μg/mlの力価を示した。こ
の抗血清を用いてλgt11cDNAライブラリーのイムノ・ス
クリーニングを行なつた。
方法 cDNAクローンの単離 抗体を用いた胎盤及び胎児肝cDNAのスクリーニング
法、プラーク精製法及びλ−フアージ溶解物とDNAの調
製法は、WunとKretzmer,FEBS LETT1,11〜16（1987）に
記載されている。抗血清にあらかじめBNN97λgt11溶解
物を吸着させ、ライブラリーのスクリーニング用に1/50
0に希釈した。
法、プラーク精製法及びλ−フアージ溶解物とDNAの調
製法は、WunとKretzmer,FEBS LETT1,11〜16（1987）に
記載されている。抗血清にあらかじめBNN97λgt11溶解
物を吸着させ、ライブラリーのスクリーニング用に1/50
0に希釈した。
第X a因子結合活性のスクリーニング イソプロピル−β−チオガラクトシドによつてイムノ
・ポジテイブλ−フアージ溶解物あるいはコントロール
λgt11から誘導される組換え蛋白について、その第X a
因子結合活性をスクリーニングした。λ−フアージ溶解
物（0.1ml）は、ドツト−ブロツト装置（Bio Rad）を用
いてニトロセルロースペーパーで濾過した。次いでニト
ロセルロースペーパーを、5mg/ml牛血清アルブミン及び
2.5mg/ml牛ガンマグロブリンを含むリン酸緩衝化食塩水
に浸し、室温で１時間激しく撹拌した。次いで、0.1mg/
mlヘパリンを添加した同様の溶液に更に125I−第X a因
子（1.0×106cmp/ml）を溶解した溶液で置換し、更に１
時間激しく撹拌した。次いでニトロセルロースペーパー
を、0.05％Tween 20を含むリン酸緩衝化食塩水で洗つ
た。洗浄緩衝液を５分毎に４回交換した。次いでニトロ
セルロースペーパーを空気中で乾燥し、Kodak XR5nフイ
ルムを用いてオートラジオグラフイー用に調製した。フ
イルムを１週間さらした後に現像した。
・ポジテイブλ−フアージ溶解物あるいはコントロール
λgt11から誘導される組換え蛋白について、その第X a
因子結合活性をスクリーニングした。λ−フアージ溶解
物（0.1ml）は、ドツト−ブロツト装置（Bio Rad）を用
いてニトロセルロースペーパーで濾過した。次いでニト
ロセルロースペーパーを、5mg/ml牛血清アルブミン及び
2.5mg/ml牛ガンマグロブリンを含むリン酸緩衝化食塩水
に浸し、室温で１時間激しく撹拌した。次いで、0.1mg/
mlヘパリンを添加した同様の溶液に更に125I−第X a因
子（1.0×106cmp/ml）を溶解した溶液で置換し、更に１
時間激しく撹拌した。次いでニトロセルロースペーパー
を、0.05％Tween 20を含むリン酸緩衝化食塩水で洗つ
た。洗浄緩衝液を５分毎に４回交換した。次いでニトロ
セルロースペーパーを空気中で乾燥し、Kodak XR5nフイ
ルムを用いてオートラジオグラフイー用に調製した。フ
イルムを１週間さらした後に現像した。
ポリ（Ａ）+RNAの調製及びノーザン・ブロツテイング LizardiとEngelbergのナトリウム・パークロレート抽
出法〔Anal.Biochem.98,116〜122,（1979）〕により、
培養したChangリバー細胞、HepG2ヘパトーマ細胞及びSK
−HEP−１ヘパトーマ細胞から全RNAを調製した。製造業
者の指針に従い、オリゴ（dT）−セルロース（Ｐ−Ｌ−
Biochemical,タイプ77F）へのバツチ吸着によりポリ
（Ａ）+RNAを単離した。ノーザン・ブロツト分析用に、
それぞれのポリ（Ａ）+RNA10μｇをグリオキサールで処
理し〔Thomas,Methods Enzymol.100,252〜266（198
3）〕、10mMリン酸ナトリウム、pH7.0を含む緩衝液でア
ガロースゲル電気泳動に付した。Bethesda Research La
boratoryのRNAラダー（ladder）を分子量マーカーとし
て用いた。RNAをニトロセルロースペーパー上にブロツ
トし、次いで80℃で２時間焼いた。λP9クローンのイン
サートDNAを、ニツクトランスレーシヨンにより32Pで放
射標識化し、プローブとして用いた〔Maniatisら、Mole
cular Cloning:A Laboratory Model,Cold Spring Labor
atory Harbor,N.Y.,（1982）〕。50％ホルムアミド、5X
SSC,50mMリン酸ナトリウム、pH7.0、250μg/ml変性サ
ケスペルマDNA及び1X Denhard溶液を含む溶液5ml中のプ
ローブ（５×106cpm）で42℃で16時間ハイブリダイズさ
せた。フイルターを、0.1％ナトリウムドデシルスルフ
エート（SDS）、2X SSSで室温で３回、それぞれ５分間
洗つた。次いでニトロセルロースペーパーを空気中で乾
燥し、KodakXAR−５フイルム及び増感板を用いて−70℃
で３日間オートラジオクラフイーに付した。
出法〔Anal.Biochem.98,116〜122,（1979）〕により、
培養したChangリバー細胞、HepG2ヘパトーマ細胞及びSK
−HEP−１ヘパトーマ細胞から全RNAを調製した。製造業
者の指針に従い、オリゴ（dT）−セルロース（Ｐ−Ｌ−
Biochemical,タイプ77F）へのバツチ吸着によりポリ
（Ａ）+RNAを単離した。ノーザン・ブロツト分析用に、
それぞれのポリ（Ａ）+RNA10μｇをグリオキサールで処
理し〔Thomas,Methods Enzymol.100,252〜266（198
3）〕、10mMリン酸ナトリウム、pH7.0を含む緩衝液でア
ガロースゲル電気泳動に付した。Bethesda Research La
boratoryのRNAラダー（ladder）を分子量マーカーとし
て用いた。RNAをニトロセルロースペーパー上にブロツ
トし、次いで80℃で２時間焼いた。λP9クローンのイン
サートDNAを、ニツクトランスレーシヨンにより32Pで放
射標識化し、プローブとして用いた〔Maniatisら、Mole
cular Cloning:A Laboratory Model,Cold Spring Labor
atory Harbor,N.Y.,（1982）〕。50％ホルムアミド、5X
SSC,50mMリン酸ナトリウム、pH7.0、250μg/ml変性サ
ケスペルマDNA及び1X Denhard溶液を含む溶液5ml中のプ
ローブ（５×106cpm）で42℃で16時間ハイブリダイズさ
せた。フイルターを、0.1％ナトリウムドデシルスルフ
エート（SDS）、2X SSSで室温で３回、それぞれ５分間
洗つた。次いでニトロセルロースペーパーを空気中で乾
燥し、KodakXAR−５フイルム及び増感板を用いて−70℃
で３日間オートラジオクラフイーに付した。
他の組換えDNA法 クローン化λgt11DNAの調製、pUC19のプラスミド及び
Μ13mp18ベクターでのサブクローニング、エキソヌクレ
アーゼIIIを用いた消化による欠失、及びジデオキ法に
よるDNA配列決定〔Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA8
3,6776〜6780（1977）〕は、WunとKretzmer,FEBS Lett.
1,11−16（1987）に記載された方法に従つて実施した。
Μ13mp18ベクターでのサブクローニング、エキソヌクレ
アーゼIIIを用いた消化による欠失、及びジデオキ法に
よるDNA配列決定〔Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA8
3,6776〜6780（1977）〕は、WunとKretzmer,FEBS Lett.
1,11−16（1987）に記載された方法に従つて実施した。
LipmamとPearsonによつて書かれたプログラムFASTP
〔Science,227,1435〜1441（1985）〕を用いて、Nation
al Biochemical Research Foundationの配列データバン
ク（レリース13,1987年６月）から相同性を示す蛋白の
フアミリーを同定し、該フアミリー内で配列のアライメ
ントを行なつた。
〔Science,227,1435〜1441（1985）〕を用いて、Nation
al Biochemical Research Foundationの配列データバン
ク（レリース13,1987年６月）から相同性を示す蛋白の
フアミリーを同定し、該フアミリー内で配列のアライメ
ントを行なつた。
結果 cDNAのライブラリーのスクリーニング 多数のセルラインについて、そのならし培地中にTFI
が存在するか否かをスクリーニングした。いくつかの肝
由来セルライン、即ちChangリバー、HepG2ヘパトーマ及
びSK−HEP1ヘパトーマが培地中にTFIを分泌することが
見出された。初めに、TFIに対する抗血清を用いてヒト
胎児肝λgt11cDNAライブラリー（106プラーク・フオー
ミング・ユニツト）をスクリーニングし、15個の免疫学
的にポジテイブなクローンが得られた。次いで同様の方
法により胎盤λgt11cDNAライブラリーをスクリーニング
した。106プラーク・フオーミング・ユニットのうち10
個の免疫学的にポジテイブなクローンが得られた。これ
らのクローンをプラーク精製し、精製クローンの溶解物
についてTFIの機能活性をテストした。イソプロピルチ
オガラクトシドで誘導したフアージの溶解物をニトロセ
ルロースペーパーに吸着せしめ、125I−第X a因子結合
活性をスクリーニングした。上記の免疫学的にポジテイ
ブなクローンのいくつかは、ニトロセルロースペーパー
上の125I第X a因子と結合する能力を示したことが、第
１図により証明されている。免疫学的にポジテイブな胎
児肝クローン15個のうち３個、及び免疫学的にポジテイ
ブな胎盤クローン10個のうち４個のクローンが125I−第
X a因子結合活性を示した。これらの免疫学的に且つ機
能的にポジテイブなクローンをEcoRIで消化し、インサ
ート配列のサイズをゲル電気泳動により調べた。胎盤ラ
イブラリー（λP9）から得た１つのクローンは約1.4kb
のインサート配列を有しており、他のすべてのクローン
は約1.0kbのインサート配列を有していた。部分的DNA配
列決定により、1.0kbクローンはより長い1.4kb胎盤クロ
ーンの１部分の配列と同じ配列を有していることが判つ
た。従つて、完全なDNA配列決定を行なうためにλP9を
選択した。
が存在するか否かをスクリーニングした。いくつかの肝
由来セルライン、即ちChangリバー、HepG2ヘパトーマ及
びSK−HEP1ヘパトーマが培地中にTFIを分泌することが
見出された。初めに、TFIに対する抗血清を用いてヒト
胎児肝λgt11cDNAライブラリー（106プラーク・フオー
ミング・ユニツト）をスクリーニングし、15個の免疫学
的にポジテイブなクローンが得られた。次いで同様の方
法により胎盤λgt11cDNAライブラリーをスクリーニング
した。106プラーク・フオーミング・ユニットのうち10
個の免疫学的にポジテイブなクローンが得られた。これ
らのクローンをプラーク精製し、精製クローンの溶解物
についてTFIの機能活性をテストした。イソプロピルチ
オガラクトシドで誘導したフアージの溶解物をニトロセ
ルロースペーパーに吸着せしめ、125I−第X a因子結合
活性をスクリーニングした。上記の免疫学的にポジテイ
ブなクローンのいくつかは、ニトロセルロースペーパー
上の125I第X a因子と結合する能力を示したことが、第
１図により証明されている。免疫学的にポジテイブな胎
児肝クローン15個のうち３個、及び免疫学的にポジテイ
ブな胎盤クローン10個のうち４個のクローンが125I−第
X a因子結合活性を示した。これらの免疫学的に且つ機
能的にポジテイブなクローンをEcoRIで消化し、インサ
ート配列のサイズをゲル電気泳動により調べた。胎盤ラ
イブラリー（λP9）から得た１つのクローンは約1.4kb
のインサート配列を有しており、他のすべてのクローン
は約1.0kbのインサート配列を有していた。部分的DNA配
列決定により、1.0kbクローンはより長い1.4kb胎盤クロ
ーンの１部分の配列と同じ配列を有していることが判つ
た。従つて、完全なDNA配列決定を行なうためにλP9を
選択した。
TFI cDNA単離物のヌクレオチド配列及びその予想蛋白配
列 λP9クローンについて、制限酵素地図の作成、Μ13サ
ブクローニング及び第２図に示した技法を用いた配列決
定を実施した。エキソヌクレアーゼIII欠失法〔Henikof
f,Gene28,351〜359（1984）〕により、２本のストラン
ドの両者について全配列を決定し、1432個の塩基からな
ることが見出された。その配列は第３図に示した通りで
ある。該配列には、133塩基の５′非コード領域、912ヌ
クレオチドのオープン・リーデイング・フレーム及び38
7ヌクレオチドの３′非コード領域が含まれている。最
初のATGはTAGATGA配列中のヌクレオチド134にあり、そ
の直ぐ後のACAATGA配列中のヌクレオチド146に第２のAT
Gがある。真核細胞のリボゾームによつてイニシエート
されるためのコンセンサス配列として提案された配列、
ACCATGG〔Kozak,Cell,44,283〜292（1982）〕とは、上
記の配列は異なるが、これらはイニシエーシヨン配列と
考えられる。成熟蛋白のＮ末端に相当する配列の前に28
個のアミノ酸配列がある。これら28個のアミノ酸からな
る疎水性セグメントの組成及び長さは、シグナルペプチ
ドに典型的なものである〔Von Heijne,Eur.J.Biochem.1
33,17〜21（1983）;J.Mol.Biol.184,99〜105（198
5）〕。ジグナルペプチドはAla28−Asp29で開裂し、成
熟蛋白を与えると考えられる。成熟TFIとして予想され
るアミノ酸配列は、18個のシステイン残基及び７個のメ
チオニンを含む276個のアミノ酸からなる。成熟TFIの推
定蛋白配列に基いて計算される分子量31,950ダルトン
は、単離して得た蛋白についてナトリウムドデシルスル
フエートポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた分子
量37〜40kDaよりもいく分小さい。この分子量の相違
は、天然蛋白でのグリコシル化の移動性を反映したもの
と考えられる。成熟蛋白に相当する推定蛋白配列は、As
n−Ｘ−Thr/Serの構成を有する３ケのＮ−結合グリコシ
ル化部位（アミノ酸の位置145,195及び256）を有してい
る。精製した全長TFI及び加水分解された２つの単離体
のアミノ酸分析の結果は、cDNA配列から推定される蛋白
配列（第３図の下線を引いた部分）と正確にマツチす
る。このことは、単離したcDNAクローンはTFIをコード
していることを示している。３′非コード領域はＡ＋Ｔ
を豊富に含んでいる（70％Ａ＋Ｔ）。このクローンに
は、コンセンサス・ポリアデニル化シグナル、AATAAA
〔ProudfootとBrownlee,Nature,252,359〜362（198
1）〕も、ポリＡテイルも見出されなかつた。これは、
ライブラリー構築の間に３′末端部分の１部分が失なわ
れたためと考えられる。
列 λP9クローンについて、制限酵素地図の作成、Μ13サ
ブクローニング及び第２図に示した技法を用いた配列決
定を実施した。エキソヌクレアーゼIII欠失法〔Henikof
f,Gene28,351〜359（1984）〕により、２本のストラン
ドの両者について全配列を決定し、1432個の塩基からな
ることが見出された。その配列は第３図に示した通りで
ある。該配列には、133塩基の５′非コード領域、912ヌ
クレオチドのオープン・リーデイング・フレーム及び38
7ヌクレオチドの３′非コード領域が含まれている。最
初のATGはTAGATGA配列中のヌクレオチド134にあり、そ
の直ぐ後のACAATGA配列中のヌクレオチド146に第２のAT
Gがある。真核細胞のリボゾームによつてイニシエート
されるためのコンセンサス配列として提案された配列、
ACCATGG〔Kozak,Cell,44,283〜292（1982）〕とは、上
記の配列は異なるが、これらはイニシエーシヨン配列と
考えられる。成熟蛋白のＮ末端に相当する配列の前に28
個のアミノ酸配列がある。これら28個のアミノ酸からな
る疎水性セグメントの組成及び長さは、シグナルペプチ
ドに典型的なものである〔Von Heijne,Eur.J.Biochem.1
33,17〜21（1983）;J.Mol.Biol.184,99〜105（198
5）〕。ジグナルペプチドはAla28−Asp29で開裂し、成
熟蛋白を与えると考えられる。成熟TFIとして予想され
るアミノ酸配列は、18個のシステイン残基及び７個のメ
チオニンを含む276個のアミノ酸からなる。成熟TFIの推
定蛋白配列に基いて計算される分子量31,950ダルトン
は、単離して得た蛋白についてナトリウムドデシルスル
フエートポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた分子
量37〜40kDaよりもいく分小さい。この分子量の相違
は、天然蛋白でのグリコシル化の移動性を反映したもの
と考えられる。成熟蛋白に相当する推定蛋白配列は、As
n−Ｘ−Thr/Serの構成を有する３ケのＮ−結合グリコシ
ル化部位（アミノ酸の位置145,195及び256）を有してい
る。精製した全長TFI及び加水分解された２つの単離体
のアミノ酸分析の結果は、cDNA配列から推定される蛋白
配列（第３図の下線を引いた部分）と正確にマツチす
る。このことは、単離したcDNAクローンはTFIをコード
していることを示している。３′非コード領域はＡ＋Ｔ
を豊富に含んでいる（70％Ａ＋Ｔ）。このクローンに
は、コンセンサス・ポリアデニル化シグナル、AATAAA
〔ProudfootとBrownlee,Nature,252,359〜362（198
1）〕も、ポリＡテイルも見出されなかつた。これは、
ライブラリー構築の間に３′末端部分の１部分が失なわ
れたためと考えられる。
電荷分布、疎水性／親水性及び内部相同性 TFIの翻訳されたアミノ酸配列には、27リシン、17ア
ルギニン、11アスパラギン酸及び25グルタミン酸が含ま
れている。蛋白にそつた電荷分布は第４図に示したよう
にかなり高低のあるものである。シグナルペプチド領域
には、26個の中性残基とともに２個のプラスに荷電した
リシンが含まれていた。成熟蛋白のアミノ末端領域に
は、高度にマイナスに荷電した配列が含まれていた。最
初の７個の残基のうち６個はアスパラギン酸あるいはグ
ルタミン酸であり、この後に更に高度にマイナスに荷電
した２個のアミノ酸のダウンストリームがあり、その後
にプラスに荷電したリシン残基がある。中心部分は一般
的にマイナスに荷電している。カルボキシ末端には高度
にプラスに荷電したセグメントがある。TFIのアミノ酸2
65〜293には、６−共役アルギニン＋リシン残基を含む
プラスに荷電した14個のアミノ酸がある。
ルギニン、11アスパラギン酸及び25グルタミン酸が含ま
れている。蛋白にそつた電荷分布は第４図に示したよう
にかなり高低のあるものである。シグナルペプチド領域
には、26個の中性残基とともに２個のプラスに荷電した
リシンが含まれていた。成熟蛋白のアミノ末端領域に
は、高度にマイナスに荷電した配列が含まれていた。最
初の７個の残基のうち６個はアスパラギン酸あるいはグ
ルタミン酸であり、この後に更に高度にマイナスに荷電
した２個のアミノ酸のダウンストリームがあり、その後
にプラスに荷電したリシン残基がある。中心部分は一般
的にマイナスに荷電している。カルボキシ末端には高度
にプラスに荷電したセグメントがある。TFIのアミノ酸2
65〜293には、６−共役アルギニン＋リシン残基を含む
プラスに荷電した14個のアミノ酸がある。
TFI蛋白の予想疎水性／親水性プロフアイルは第５図
に示した通りである。シグナルペプチドには、予想され
たように高度に疎水性の領域が含まれている。残りの部
分はむしろ親水性である。
に示した通りである。シグナルペプチドには、予想され
たように高度に疎水性の領域が含まれている。残りの部
分はむしろ親水性である。
TFIの翻訳されたアミノ酸配列には、いくつかの区別
し得るドメインが含まれている。高度にマイナスに荷電
したＮ末端ドメイン及び高度にプラスに荷電したＣ末端
ドメインに加えて、Kunitz型抑制因子の典型的配列（下
記参照）を有する３個の相同ドメインからなる中心部分
がある。
し得るドメインが含まれている。高度にマイナスに荷電
したＮ末端ドメイン及び高度にプラスに荷電したＣ末端
ドメインに加えて、Kunitz型抑制因子の典型的配列（下
記参照）を有する３個の相同ドメインからなる中心部分
がある。
他の蛋白との相同性 National Biochemical Research Foundationの配列デ
ータベースを調べた所、TFIのＮ末端ドメインとＣ末端
ドメインとは、他の公知蛋白と有意な相同性を有してい
ないことが見出された。しかしながら、３個の内部相同
ドメインは、牛膵臓塩基性プロテアーゼ抑制因子（アプ
ロチニン）、毒塩基性プロテアーゼ抑制因子、インター
−α−トリプシン抑制因子（第６図）などの他の塩基性
プロテアーゼ抑制因子の配列とそれぞれ相同性を示し
た。これらすべての抑制因子にはジスルフイド結合構造
が高度に保持されており、これは注目すべき事実であ
る。これらの相同性から明らかなように、TFIは塩基性
プロテアーゼ抑制因子遺伝子スーパーフアミリーに属す
る。
ータベースを調べた所、TFIのＮ末端ドメインとＣ末端
ドメインとは、他の公知蛋白と有意な相同性を有してい
ないことが見出された。しかしながら、３個の内部相同
ドメインは、牛膵臓塩基性プロテアーゼ抑制因子（アプ
ロチニン）、毒塩基性プロテアーゼ抑制因子、インター
−α−トリプシン抑制因子（第６図）などの他の塩基性
プロテアーゼ抑制因子の配列とそれぞれ相同性を示し
た。これらすべての抑制因子にはジスルフイド結合構造
が高度に保持されており、これは注目すべき事実であ
る。これらの相同性から明らかなように、TFIは塩基性
プロテアーゼ抑制因子遺伝子スーパーフアミリーに属す
る。
ノーザン・ブロツテング TFI産生肝由来セルライン、即ちChangリバー、HepG2
ヘパトーマ及びSK−HEP−１ヘパトーマ細胞からポリ
（Ａ）+RNAを精製した。変性アガロースゲル電気泳動に
よりポリ（Ａ）+RNAを溶解し、ニトロセルロースペーパ
ー上にブロツトし、32P−標識化TFI cDNA（λP9）をプ
ローブとして用いて調べた。第７図に示したように、２
つの主要なハイブリダイゼーシヨンバンドが観察され
た。これらはテストした３つの全てのセルラインに見ら
れる1.4kb mRNA及び4.4kb mRNAに対応するものである。
検出し得る量のTFIを産生しない他のセルラインについ
てテストしたが、プローブとのハイブリダイゼーシヨン
は観察されなかつた（データを示していない）。
ヘパトーマ及びSK−HEP−１ヘパトーマ細胞からポリ
（Ａ）+RNAを精製した。変性アガロースゲル電気泳動に
よりポリ（Ａ）+RNAを溶解し、ニトロセルロースペーパ
ー上にブロツトし、32P−標識化TFI cDNA（λP9）をプ
ローブとして用いて調べた。第７図に示したように、２
つの主要なハイブリダイゼーシヨンバンドが観察され
た。これらはテストした３つの全てのセルラインに見ら
れる1.4kb mRNA及び4.4kb mRNAに対応するものである。
検出し得る量のTFIを産生しない他のセルラインについ
てテストしたが、プローブとのハイブリダイゼーシヨン
は観察されなかつた（データを示していない）。
本明細書の記載から、当業者にとつては本発明の思想
及び範囲内にある他の各種の例が自明であろう。これら
の例の全ては本明細書のクレームの範囲内のものであ
る。
及び範囲内にある他の各種の例が自明であろう。これら
の例の全ては本明細書のクレームの範囲内のものであ
る。
第１図は、125I−第X a因子を用いたλgt11クローンの
スクリーニングを示した写真である。 第２図は、部分的制限酵素地図及びλP9のインサート配
列の配列決定に用いた技法を示している。 第３図は、ヒトTFI cDNAのヌクレオチド配列及び翻訳さ
れたアミノ酸配列を示している。 第４図は、TFIのアミノ酸配列における電荷分布を示す
グラフである。 第５図は、TFIの疎水性プロフアイルを示すグラフ図で
ある。 第６図は、TFIの塩基性プロテアーゼ抑制因子ドメイン
と他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメント
を示す。 第７図は、３個の肝由来セルラインから得たRNAのノー
ザン・ブロツト分析を示す写真である。
スクリーニングを示した写真である。 第２図は、部分的制限酵素地図及びλP9のインサート配
列の配列決定に用いた技法を示している。 第３図は、ヒトTFI cDNAのヌクレオチド配列及び翻訳さ
れたアミノ酸配列を示している。 第４図は、TFIのアミノ酸配列における電荷分布を示す
グラフである。 第５図は、TFIの疎水性プロフアイルを示すグラフ図で
ある。 第６図は、TFIの塩基性プロテアーゼ抑制因子ドメイン
と他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメント
を示す。 第７図は、３個の肝由来セルラインから得たRNAのノー
ザン・ブロツト分析を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クニコ クサノ クレッツマー アメリカ合衆国ミズリー州 エウレカ, パーシモン レーン 33 (72)発明者 ツェ − チェイン ウン アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，ハントリィ ハイツ 613 (56)参考文献 特開 昭61−205487（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−183424（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ 84（1987−４）ｐ．1886− 1890 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/12 C12N 21/02 C07K 14/435 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】第２図の制限酵素地図で示されるヒト組織
因子抑制因子のcDNAクローンλP9。 - 【請求項２】第３図で示されるヌクレオチド配列を有す
るヒト組織因子抑制因子のcDNA。 - 【請求項３】グリコシル化されていない第３図で示され
るアミノ酸配列を有するヒト組織因子抑制因子。 - 【請求項４】以下に示されるアミノ酸配列をコードする
ヒト組織因子抑制因子遺伝子。
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|---|---|---|---|
| US07/123,753 US4966852A (en) | 1987-07-23 | 1987-11-23 | DNA clone of human tissue factor inhibitor |
| US123753 | 1987-11-23 |
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| US5378614A (en) * | 1989-08-18 | 1995-01-03 | Novo Nordisk A/S | Vector and method for making tissue factor pathway inhibitor (TFPI) analogues in yeast |
| DK0439442T3 (da) * | 1990-01-25 | 1996-07-08 | Univ Washington | Faktor X-LACI-hybridprotein |
| PT98779B (pt) * | 1990-08-27 | 1999-06-30 | Monsanto Co | Processo para a preparacao de uma composicao anticoagulante contendo inibidor sulfatados e metodos para a sua utilizacao |
| DK261490D0 (da) * | 1990-10-31 | 1990-10-31 | Novo Nordisk As | New pharmaceutical compound |
| US5346991A (en) * | 1991-06-13 | 1994-09-13 | Genentech, Inc. | Tissue factor mutants useful for the treatment of myocardial infarction and coagulopathic disorders |
| US5276015A (en) * | 1992-03-18 | 1994-01-04 | Washington University | Method of inhibiting microvascular thrombosis |
| US6063764A (en) * | 1992-06-01 | 2000-05-16 | Washington University & Chiron Corp. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| US20030171292A1 (en) | 1992-06-01 | 2003-09-11 | Creasey Abla A. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| US5455338A (en) | 1993-11-05 | 1995-10-03 | Zymogenetics, Inc. | DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto |
| US6057287A (en) | 1994-01-11 | 2000-05-02 | Dyax Corp. | Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof |
| IL161407A0 (en) | 2001-10-15 | 2004-09-27 | Chiron Corp | Treatment of severe pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
| DK2311432T3 (en) | 2002-06-07 | 2015-02-02 | Dyax Corp | Modified Kunitz domain polypeptides and their use in reducing ischemia or the onset of a systemic inflammatory response associated with a surgical procedure |
| US7153829B2 (en) | 2002-06-07 | 2006-12-26 | Dyax Corp. | Kallikrein-inhibitor therapies |
| US7235530B2 (en) | 2004-09-27 | 2007-06-26 | Dyax Corporation | Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof |
| DK1981519T3 (en) | 2005-12-29 | 2018-02-19 | Dyax Corp | protease inhibition |
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| ES2983470T3 (es) | 2010-03-19 | 2024-10-23 | Takeda Pharmaceuticals Co | Inhibidores del TFPI y métodos de uso |
| KR102502293B1 (ko) | 2011-01-06 | 2023-02-21 | 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 | 혈장 칼리크레인 결합 단백질 |
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| EA201891388A1 (ru) | 2015-12-11 | 2018-11-30 | Дайэкс Корп. | Ингибиторы калликреина плазмы и их применение для лечения обострения наследственного ангионевротического отека |
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| Chen | Structural and functional study of human kallistatin | |
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