JP2003235574A - 新規クニッツ型プロテアーゼインヒビター - Google Patents
新規クニッツ型プロテアーゼインヒビターInfo
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- JP2003235574A JP2003235574A JP2002038074A JP2002038074A JP2003235574A JP 2003235574 A JP2003235574 A JP 2003235574A JP 2002038074 A JP2002038074 A JP 2002038074A JP 2002038074 A JP2002038074 A JP 2002038074A JP 2003235574 A JP2003235574 A JP 2003235574A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 新規なセリンプロテアーゼ阻害蛋白質の遺伝
子及び蛋白質と、該蛋白質に対する活性調節剤の効率的
な評価方法を提供する。 【解決手段】ヒト由来の特定な塩基配列からなるＤＮＡ
及び該ＤＮＡにコードされるクニッツ型セリンプロテア
ーゼ阻害蛋白質に関する。また本発明は該ＤＮＡ配列に
対するアンチセンス核酸、該蛋白質の活性調節物質の評
価方法に関する。本発明の蛋白質は、炎症性疾患の発症
あるいは進行に対してその原因となり得る蛋白質であ
り、炎症性疾患等の予防あるいは治療のための医薬品の
開発において、極めて有用である。
子及び蛋白質と、該蛋白質に対する活性調節剤の効率的
な評価方法を提供する。 【解決手段】ヒト由来の特定な塩基配列からなるＤＮＡ
及び該ＤＮＡにコードされるクニッツ型セリンプロテア
ーゼ阻害蛋白質に関する。また本発明は該ＤＮＡ配列に
対するアンチセンス核酸、該蛋白質の活性調節物質の評
価方法に関する。本発明の蛋白質は、炎症性疾患の発症
あるいは進行に対してその原因となり得る蛋白質であ
り、炎症性疾患等の予防あるいは治療のための医薬品の
開発において、極めて有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なセリンプロ
テアーゼ阻害蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ及び
その断片、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該発現ベクタ
ーで形質転換された形質転換細胞、該蛋白質若しくはそ
の断片に反応性を有する抗体、該蛋白質の活性または発
現を調節する物質のスクリーニング方法に関する。
テアーゼ阻害蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ及び
その断片、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該発現ベクタ
ーで形質転換された形質転換細胞、該蛋白質若しくはそ
の断片に反応性を有する抗体、該蛋白質の活性または発
現を調節する物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】プロテアーゼが生体における種々の制御
機構において重要な役割を担っていることは、これまで
の精力的な研究で多数報告されてきている。例えば、ト
ロンビンに見られる血液凝固反応系の制御、キモトリプ
シンに見られる消化酵素の発現制御、カリクレインに見
られる血管拡張反応制御、キャスパーゼやカテプシンＤ
に見られる細胞死の制御など、個体レベルから細胞レベ
ルに至るまで、プロテアーゼは多種多様な生体制御機構
の一員として重要な役割を果たしている。
機構において重要な役割を担っていることは、これまで
の精力的な研究で多数報告されてきている。例えば、ト
ロンビンに見られる血液凝固反応系の制御、キモトリプ
シンに見られる消化酵素の発現制御、カリクレインに見
られる血管拡張反応制御、キャスパーゼやカテプシンＤ
に見られる細胞死の制御など、個体レベルから細胞レベ
ルに至るまで、プロテアーゼは多種多様な生体制御機構
の一員として重要な役割を果たしている。
【０００３】そのため、これまでに報告されることのな
い新規なプロテアーゼの存在を確認し、その生化学的特
性やそれが関与する生理学的作用機序を解明する試みが
注目されている。この解明は、学術的意義のみならず、
新規プロテアーゼと特定の疾患との関連も明らかにされ
得ることで、医薬開発においても大変興味深いと言え
る。
い新規なプロテアーゼの存在を確認し、その生化学的特
性やそれが関与する生理学的作用機序を解明する試みが
注目されている。この解明は、学術的意義のみならず、
新規プロテアーゼと特定の疾患との関連も明らかにされ
得ることで、医薬開発においても大変興味深いと言え
る。
【０００４】プロテアーゼは、その標的となる蛋白質を
（特異的に）加水分解することで制御機構における重要
な役割を発揮していると考えられる。一般に、生理的条
件下での蛋白質の加水分解反応は不可逆的であり、また
この加水分解反応がいわゆるカスケード反応を誘起する
契機となることも十分に予想される。従って、プロテア
ーゼ活性が不用意に発揮される、あるいは適切な時機に
発現されない等の事象は、その加水分解反応から始まる
一連の生化学的反応の制御に異常をきたすと推察され
る。その為、プロテアーゼそれ自体の活性発現も厳格な
制御下に置かれていることは、想像に難くない。
（特異的に）加水分解することで制御機構における重要
な役割を発揮していると考えられる。一般に、生理的条
件下での蛋白質の加水分解反応は不可逆的であり、また
この加水分解反応がいわゆるカスケード反応を誘起する
契機となることも十分に予想される。従って、プロテア
ーゼ活性が不用意に発揮される、あるいは適切な時機に
発現されない等の事象は、その加水分解反応から始まる
一連の生化学的反応の制御に異常をきたすと推察され
る。その為、プロテアーゼそれ自体の活性発現も厳格な
制御下に置かれていることは、想像に難くない。
【０００５】凝固系、線溶系、補体系などで機能する種
々のセリンプロテアーゼの活性は、セリンプロテアーゼ
阻害活性を有する蛋白質によって制御されている。蛋白
性プロテアーゼ阻害剤によるプロテアーゼの制御機構
は、プロテアーゼと蛋白性プロテアーゼ阻害剤が可逆的
あるいは不可逆的に不活性な複合体を形成して安定化す
ることによる。クニッツ型のプロテアーゼ阻害剤は、可
逆的な阻害剤であり、ミカエリス型の複合体を形成して
プロテアーゼの活性を阻害する（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ
ら， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４
９；５９３−６２６（１９８０））。組織因子経路イン
ヒビター（ＴＦＰＩ）、インターαトリプシンインヒビ
ター、アプロチニン、アルツハイマーアミロイドβプロ
テイン前駆体（ＡＰＰＩ）などがクニッツ型プロテアー
ゼ阻害剤として知られている。
々のセリンプロテアーゼの活性は、セリンプロテアーゼ
阻害活性を有する蛋白質によって制御されている。蛋白
性プロテアーゼ阻害剤によるプロテアーゼの制御機構
は、プロテアーゼと蛋白性プロテアーゼ阻害剤が可逆的
あるいは不可逆的に不活性な複合体を形成して安定化す
ることによる。クニッツ型のプロテアーゼ阻害剤は、可
逆的な阻害剤であり、ミカエリス型の複合体を形成して
プロテアーゼの活性を阻害する（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ
ら， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４
９；５９３−６２６（１９８０））。組織因子経路イン
ヒビター（ＴＦＰＩ）、インターαトリプシンインヒビ
ター、アプロチニン、アルツハイマーアミロイドβプロ
テイン前駆体（ＡＰＰＩ）などがクニッツ型プロテアー
ゼ阻害剤として知られている。
【０００６】インターαトリプシンインヒビターは、１
本の軽鎖と２本の重鎖、計３本のポリペプチドがコンド
ロイチン硫酸型Ｏ結合型糖鎖で架橋された構造をとる
が、そのプロテアーゼ阻害活性は軽鎖であるＢｉｋｕｎ
ｉｎが担っている。Ｂｉｋｕｎｉｎは２つのクニッツド
メインを有し、トリプシンを強く阻害するほかにキモト
リプシン、白血球エラスターゼ、カテプシンＧ、プラス
ミンなどを阻害する（Ｇｅｂｈａｒｄら，Ｐｒｏｔｅａ
ｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ
ａｒｒｅｔｔ ａｎｄ Ｓａｌｖｅｓｅｎ．Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐ３８９−４０１（１９
８６））。Ｂｉｋｕｎｉｎは尿中トリプシンインヒビタ
ー（以下ＵＴＩ）として、この分子が阻害するプロテア
ーゼ群が病態に関与する膵炎、ショックの治療薬として
用いられている。ＴＦＰＩは３つのクニッツドメインを
有する一本鎖のポリペプチドであり、第１クニッツドメ
インで組織因子−ＶＩＩ（ａ）因子複合体と結合し、第
２クニッツドメインでＸａ因子に結合することによっ
て、外因系血液凝固機構を阻害する（Ｂｒｏｓｅら，Ｐ
ｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｖｏｌ．１０．Ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙ ＣｏｌｌｅｒＢＳ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉ
ａ，ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｐ２４３−２６８（１９
９１））。ＴＦＰＩはその外因系凝固の制御活性によ
り、血液凝固が病態に関与する敗血症や虚血性心疾患へ
の治療応用が検討されている。以上の例のように、クニ
ッツ型プロテアーゼ阻害剤は特定のプロテアーゼおよび
プロテアーゼ活性化複合体を阻害することにより、正常
および病態における生体内プロテアーゼとそのプロテア
ーゼが関わるプロテアーゼカスケードの生理活性を調節
する機能を有している。ここで言うプロテアーゼカスケ
ードの例としては、血液凝固系、線溶系の他に、キニン
−カリクレイン系、補体系などが挙げられる。
本の軽鎖と２本の重鎖、計３本のポリペプチドがコンド
ロイチン硫酸型Ｏ結合型糖鎖で架橋された構造をとる
が、そのプロテアーゼ阻害活性は軽鎖であるＢｉｋｕｎ
ｉｎが担っている。Ｂｉｋｕｎｉｎは２つのクニッツド
メインを有し、トリプシンを強く阻害するほかにキモト
リプシン、白血球エラスターゼ、カテプシンＧ、プラス
ミンなどを阻害する（Ｇｅｂｈａｒｄら，Ｐｒｏｔｅａ
ｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ
ａｒｒｅｔｔ ａｎｄ Ｓａｌｖｅｓｅｎ．Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐ３８９−４０１（１９
８６））。Ｂｉｋｕｎｉｎは尿中トリプシンインヒビタ
ー（以下ＵＴＩ）として、この分子が阻害するプロテア
ーゼ群が病態に関与する膵炎、ショックの治療薬として
用いられている。ＴＦＰＩは３つのクニッツドメインを
有する一本鎖のポリペプチドであり、第１クニッツドメ
インで組織因子−ＶＩＩ（ａ）因子複合体と結合し、第
２クニッツドメインでＸａ因子に結合することによっ
て、外因系血液凝固機構を阻害する（Ｂｒｏｓｅら，Ｐ
ｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｖｏｌ．１０．Ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙ ＣｏｌｌｅｒＢＳ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉ
ａ，ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｐ２４３−２６８（１９
９１））。ＴＦＰＩはその外因系凝固の制御活性によ
り、血液凝固が病態に関与する敗血症や虚血性心疾患へ
の治療応用が検討されている。以上の例のように、クニ
ッツ型プロテアーゼ阻害剤は特定のプロテアーゼおよび
プロテアーゼ活性化複合体を阻害することにより、正常
および病態における生体内プロテアーゼとそのプロテア
ーゼが関わるプロテアーゼカスケードの生理活性を調節
する機能を有している。ここで言うプロテアーゼカスケ
ードの例としては、血液凝固系、線溶系の他に、キニン
−カリクレイン系、補体系などが挙げられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このような背景から、
プロテアーゼの活性を制御している新規な生体分子及び
それらをコードする遺伝子を見出すこと、そして該制御
機構に作用する新しい機序に基づく医薬をスクリーニン
グする方法等の、活性調節剤、特異的抗体、あるいはア
ンチセンス核酸の開発が切望されている。
プロテアーゼの活性を制御している新規な生体分子及び
それらをコードする遺伝子を見出すこと、そして該制御
機構に作用する新しい機序に基づく医薬をスクリーニン
グする方法等の、活性調節剤、特異的抗体、あるいはア
ンチセンス核酸の開発が切望されている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、新規な遺伝子
（ｋｉ３１６とする）、当該遺伝子にコードされる新規
なセリンプロテアーゼ阻害蛋白質（ＫＩ３１６）に関す
る。また、当該遺伝子を用いて形質転換した宿主細胞、
該形質転換細胞を用いた組換えＫＩ３１６の生産方法を
提供する。
（ｋｉ３１６とする）、当該遺伝子にコードされる新規
なセリンプロテアーゼ阻害蛋白質（ＫＩ３１６）に関す
る。また、当該遺伝子を用いて形質転換した宿主細胞、
該形質転換細胞を用いた組換えＫＩ３１６の生産方法を
提供する。
【０００９】（核酸）本発明は、ＫＩ３１６（後に詳し
く述べる）をコードする遺伝子ｋｉ３１６を提供する。
遺伝子ｋｉ３１６とは具体的には、配列番号２に示すア
ミノ酸配列からなるセリンプロテアーゼ阻害蛋白質をコ
ードするＤＮＡのことであり、配列番号１に示すｃＤＮ
Ａのほか該ｃＤＮＡの由来するゲノムＤＮＡも含まれ
る。該遺伝子はヒト肺から単離同定することができる
が、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブ
リダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクロー
ニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法によ
り調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としては
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含
まれるが、特に制限はない。本発明のＤＮＡは１本鎖で
あっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡ
と結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。ま
た、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化
学発光物質等で標識されていてもよい。
く述べる）をコードする遺伝子ｋｉ３１６を提供する。
遺伝子ｋｉ３１６とは具体的には、配列番号２に示すア
ミノ酸配列からなるセリンプロテアーゼ阻害蛋白質をコ
ードするＤＮＡのことであり、配列番号１に示すｃＤＮ
Ａのほか該ｃＤＮＡの由来するゲノムＤＮＡも含まれ
る。該遺伝子はヒト肺から単離同定することができる
が、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブ
リダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクロー
ニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法によ
り調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としては
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含
まれるが、特に制限はない。本発明のＤＮＡは１本鎖で
あっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡ
と結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。ま
た、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化
学発光物質等で標識されていてもよい。
【００１０】また、ｋｉ３１６の塩基配列が提供されれ
ば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡ
およびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本
発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発
明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡ
もまた提供するものと理解すべきである。本明細書中に
おいて、「ＤＮＡ」は「ポリヌクレオチド」と同義であ
る。
ば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡ
およびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本
発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発
明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡ
もまた提供するものと理解すべきである。本明細書中に
おいて、「ＤＮＡ」は「ポリヌクレオチド」と同義であ
る。
【００１１】さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１
に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
【００１２】配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮ
Ａに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブ
リダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質がセリ
ンプロテアーゼ阻害蛋白質であれば、塩基配列のバリエ
ーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重に
よる同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在
や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異
剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ
断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列
が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列
番号１に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつセリンプロテアーゼ阻害蛋白質を
コードするＤＮＡであれば、配列番号１に示したＤＮＡ
配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものであ
る。
Ａに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブ
リダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質がセリ
ンプロテアーゼ阻害蛋白質であれば、塩基配列のバリエ
ーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重に
よる同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在
や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異
剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ
断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列
が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列
番号１に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつセリンプロテアーゼ阻害蛋白質を
コードするＤＮＡであれば、配列番号１に示したＤＮＡ
配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものであ
る。
【００１３】上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号１に
記載のＤＮＡ配列と７０％以上、好ましくは８０％以
上、更に好ましくは９０％以上の同一性を有するもので
あれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の同一性の判断に
は、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，Ｖｏｌ．３
６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．２１５；４０３−１０（１９９０））を
用いることができる。また、ハイブリダイズする程度と
しては、ストリンジェントな条件下、例えばＤＩＧ Ｄ
ＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノ
スティックス社製Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）でプ
ローブをラベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは
３７℃、より好ましくは４２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈ
ｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ
Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、例
えば５０℃、好ましくは６５℃の０．５×ＳＳＣ溶液
（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む）中でメンブレンを
洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、
０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でのサザン
ハイブリダイゼーションで、配列番号１に記載の核酸に
ハイブリダイズする程度であればよい。
記載のＤＮＡ配列と７０％以上、好ましくは８０％以
上、更に好ましくは９０％以上の同一性を有するもので
あれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の同一性の判断に
は、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，Ｖｏｌ．３
６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．２１５；４０３−１０（１９９０））を
用いることができる。また、ハイブリダイズする程度と
しては、ストリンジェントな条件下、例えばＤＩＧ Ｄ
ＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノ
スティックス社製Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）でプ
ローブをラベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは
３７℃、より好ましくは４２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈ
ｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ
Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、例
えば５０℃、好ましくは６５℃の０．５×ＳＳＣ溶液
（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む）中でメンブレンを
洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、
０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でのサザン
ハイブリダイゼーションで、配列番号１に記載の核酸に
ハイブリダイズする程度であればよい。
【００１４】配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮ
Ａあるいはその部分断片は、炎症性疾患等本発明の蛋白
質が関与する疾患の特異的プローブとして有用であると
考えられる。
Ａあるいはその部分断片は、炎症性疾患等本発明の蛋白
質が関与する疾患の特異的プローブとして有用であると
考えられる。
【００１５】本発明のＤＮＡは、ＫＩ３１６を大量に生
産するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、
酵素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現
状況を検査するために使用することができる。すなわ
ち、該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本
発明の蛋白質の発現量を、ｍＲＮＡ発現量を指標として
確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細
胞やその培養条件を決定することができるほか、本発明
の蛋白質が関連する疾患、特に炎症性疾患等の診断を行
うことも可能である。
産するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、
酵素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現
状況を検査するために使用することができる。すなわ
ち、該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本
発明の蛋白質の発現量を、ｍＲＮＡ発現量を指標として
確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細
胞やその培養条件を決定することができるほか、本発明
の蛋白質が関連する疾患、特に炎症性疾患等の診断を行
うことも可能である。
【００１６】また、本発明のＤＮＡの一部をプライマー
として使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ
ｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ
ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法によ
り、核酸配列上の異常あるいは多型を検査・診断するこ
とができる。
として使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ
ｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ
ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法によ
り、核酸配列上の異常あるいは多型を検査・診断するこ
とができる。
【００１７】また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導
入し、本発明の蛋白質の発現または活性が損なわれてい
ることによる疾患の遺伝子治療にも使用する事ができ
る。
入し、本発明の蛋白質の発現または活性が損なわれてい
ることによる疾患の遺伝子治療にも使用する事ができ
る。
【００１８】本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、
さらには該形質転換細胞を用いた組換え蛋白質ＫＩ３１
６の生産方法、あるいはＫＩ３１６の発現を特異的に抑
制する化合物の探索に大いに有用である。
さらには該形質転換細胞を用いた組換え蛋白質ＫＩ３１
６の生産方法、あるいはＫＩ３１６の発現を特異的に抑
制する化合物の探索に大いに有用である。
【００１９】本発明における形質転換細胞は当業者に公
知の技術を適用して調製することが可能であり、例え
ば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々な
ベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡ
を組み入れることが可能である。その際、遺伝子ｋｉ３
１６をプロモーターやエンハンサーに代表される発現制
御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子ｋｉ３１６の宿
主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能
である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いた
ＫＩ３１６の生産において好適に用いられる他、遺伝子
ｋｉ３１６の発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発
現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能
となる。
知の技術を適用して調製することが可能であり、例え
ば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々な
ベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡ
を組み入れることが可能である。その際、遺伝子ｋｉ３
１６をプロモーターやエンハンサーに代表される発現制
御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子ｋｉ３１６の宿
主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能
である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いた
ＫＩ３１６の生産において好適に用いられる他、遺伝子
ｋｉ３１６の発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発
現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能
となる。
【００２０】例えば、任意の候補物質と遺伝子ｋｉ３１
６を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件
下で接触させることで、候補物質の遺伝子ｋｉ３１６の
発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索
し、あるいは評価を行うことができる。
６を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件
下で接触させることで、候補物質の遺伝子ｋｉ３１６の
発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索
し、あるいは評価を行うことができる。
【００２１】また、本発明であるＤＮＡと公知の方法と
を組み合わせて、マウスまたはその他の適当な動物を基
にトランスジェニック動物を作製することが出来る。さ
らに、本発明の遺伝子ｋｉ３１６を利用すれば、ヒト以
外の動物からヒトｋｉ３１６に相当する遺伝子を破壊し
たいわゆるノックアウト動物を作製することも可能であ
る。このモデル動物の物理学的、生物学的、病理学的及
び遺伝子的特徴を分析することにより、本発明に係る遺
伝子及び蛋白質の機能を解明することが可能となる。さ
らに、そのようにして内在性遺伝子が破壊された該動物
に本発明のヒトｋｉ３１６を導入することにより、ヒト
ｋｉ３１６のみを有するモデル動物を作製することも可
能となる。
を組み合わせて、マウスまたはその他の適当な動物を基
にトランスジェニック動物を作製することが出来る。さ
らに、本発明の遺伝子ｋｉ３１６を利用すれば、ヒト以
外の動物からヒトｋｉ３１６に相当する遺伝子を破壊し
たいわゆるノックアウト動物を作製することも可能であ
る。このモデル動物の物理学的、生物学的、病理学的及
び遺伝子的特徴を分析することにより、本発明に係る遺
伝子及び蛋白質の機能を解明することが可能となる。さ
らに、そのようにして内在性遺伝子が破壊された該動物
に本発明のヒトｋｉ３１６を導入することにより、ヒト
ｋｉ３１６のみを有するモデル動物を作製することも可
能となる。
【００２２】かかるトランスジェニック動物、特に本発
明である遺伝子ｋｉ３１６あるいは蛋白質ＫＩ３１６を
大量に発現しているあるいは逆にこれらを欠いた動物を
観察すれば、遺伝子ｋｉ３１６あるいは蛋白質ＫＩ３１
６の機能を特定することが可能となる。さらに、このモ
デル動物は、該導入されたヒトＫＩ３１６をターゲット
とした薬剤の開発、評価に有用である。遺伝子ｋｉ３１
６あるいは蛋白質ＫＩ３１６に特異的に作用しあるいは
機能を補完する物質等を、生体レベルで調べることが可
能となり、この様にして得た物質は、ＫＩ３１６が特異
的に機能する生体制御に働く薬物となることが期待され
る。
明である遺伝子ｋｉ３１６あるいは蛋白質ＫＩ３１６を
大量に発現しているあるいは逆にこれらを欠いた動物を
観察すれば、遺伝子ｋｉ３１６あるいは蛋白質ＫＩ３１
６の機能を特定することが可能となる。さらに、このモ
デル動物は、該導入されたヒトＫＩ３１６をターゲット
とした薬剤の開発、評価に有用である。遺伝子ｋｉ３１
６あるいは蛋白質ＫＩ３１６に特異的に作用しあるいは
機能を補完する物質等を、生体レベルで調べることが可
能となり、この様にして得た物質は、ＫＩ３１６が特異
的に機能する生体制御に働く薬物となることが期待され
る。
【００２３】（蛋白質ＫＩ３１６）ｋｉ３１６にコード
される蛋白質ＫＩ３１６は、配列番号２に示すアミノ酸
配列からなるセリンプロテアーゼ阻害蛋白質である。
される蛋白質ＫＩ３１６は、配列番号２に示すアミノ酸
配列からなるセリンプロテアーゼ阻害蛋白質である。
【００２４】ＫＩ３１６はクニッツ型セリンプロテアー
ゼ阻害蛋白質に特徴的なクニッツドメインを有する。ク
ニッツドメインは２個あるいは３個のジスルフィド結合
（従って、４個あるいは６個のシステイン残基）を含む
５１〜６１アミノ酸からなるドメインである。クニッツ
ドメインのアミノ酸残基の保存性については、特表平９
−５０９０４８の表１４に詳細に記載されている。特表
平９−５０９０４８の表１４に示される配列に対して３
以下のミスマッチ（置換、挿入、欠失を１個のミスマッ
チとして数える）の場合にクニッツドメインと考えられ
る。配列番号２に示すアミノ酸配列の３８６〜４３６番
目の残基は表１４に示される条件を１つのミスマッチ
（Ｘ２２＝ＴｙｒまたはＰｈｅのところＡｌａ）以外は
すべて満たしている。従って、このドメインはセリンプ
ロテアーゼ阻害活性を有するクニッツドメインであるこ
とは疑い無い。一方、配列番号２に示すアミノ酸配列の
３２８〜３７８番目の残基は特表平９−５０９０４８の
表１４に示される条件を４つのミスマッチ（Ｘ１２＝Ｔ
ｙｒまたはＰｈｅのところＧｌｕ，Ｘ２２＝Ｔｙｒまた
はＰｈｅのところＨｉｓ、Ｘ３６＝ＧｌｙまたはＳｅｒ
のところＨｉｓ，Ｘ４０＝ＧｌｙまたはＡｌａのところ
Ａｒｇ）で満たしている。このドメインは、その独特な
配列から従来のクニッツ型プロテアーゼ阻害剤にないプ
ロテアーゼ阻害スペクトルを示す可能性があり、また、
後述するようにプロテアーゼ阻害以外の機能を有する可
能性もある。なお、一般に、プロテアーゼにより切断を
受ける基質アミノ酸配列において、切断により新たに生
じるＣ末端のアミノ酸残基をＰ１と呼び、その残基から
Ｎ末端側に伸長する残基をＰ２、Ｐ３、Ｐ４…、Ｃ末端
側に伸長する残基をＰ１’、Ｐ２’…と呼ぶ。クニッツ
ドメインにおいてもプロテアーゼの活性中心に結合する
残基をＰ１とし、その他の残基を同様に定義する。クニ
ッツドメインの活性中心（Ｐ１）がＡｒｇまたはＬｙｓ
のものはトリプシンを阻害し、Ｐ１＝Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、
Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＭｅｔのものはキモトリプシンを
阻害し、Ｐ１＝ＡｒａまたはＳｅｒのものはエラスター
ゼを阻害することが示唆されている（Ｌａｓｋｏｗｓｋ
ｉら， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．
４９；５９３−６２６（１９８０））。配列番号２に示
すアミノ酸配列の３８６〜４３６番目の残基においては
Ｐ１＝Ｌｙｓであり、トリプシンタイプのセリンプロテ
アーゼを阻害することが示唆された。一方、配列番号２
に示すアミノ酸配列の３２８〜３７８番目の残基におい
てはＰ１＝Ｇｌｙである点が特徴的であり、エラスター
ゼタイプのようなオキシアニオンホールが狭いタイプの
セリンプロテアーゼを阻害する可能性が示唆された。
ゼ阻害蛋白質に特徴的なクニッツドメインを有する。ク
ニッツドメインは２個あるいは３個のジスルフィド結合
（従って、４個あるいは６個のシステイン残基）を含む
５１〜６１アミノ酸からなるドメインである。クニッツ
ドメインのアミノ酸残基の保存性については、特表平９
−５０９０４８の表１４に詳細に記載されている。特表
平９−５０９０４８の表１４に示される配列に対して３
以下のミスマッチ（置換、挿入、欠失を１個のミスマッ
チとして数える）の場合にクニッツドメインと考えられ
る。配列番号２に示すアミノ酸配列の３８６〜４３６番
目の残基は表１４に示される条件を１つのミスマッチ
（Ｘ２２＝ＴｙｒまたはＰｈｅのところＡｌａ）以外は
すべて満たしている。従って、このドメインはセリンプ
ロテアーゼ阻害活性を有するクニッツドメインであるこ
とは疑い無い。一方、配列番号２に示すアミノ酸配列の
３２８〜３７８番目の残基は特表平９−５０９０４８の
表１４に示される条件を４つのミスマッチ（Ｘ１２＝Ｔ
ｙｒまたはＰｈｅのところＧｌｕ，Ｘ２２＝Ｔｙｒまた
はＰｈｅのところＨｉｓ、Ｘ３６＝ＧｌｙまたはＳｅｒ
のところＨｉｓ，Ｘ４０＝ＧｌｙまたはＡｌａのところ
Ａｒｇ）で満たしている。このドメインは、その独特な
配列から従来のクニッツ型プロテアーゼ阻害剤にないプ
ロテアーゼ阻害スペクトルを示す可能性があり、また、
後述するようにプロテアーゼ阻害以外の機能を有する可
能性もある。なお、一般に、プロテアーゼにより切断を
受ける基質アミノ酸配列において、切断により新たに生
じるＣ末端のアミノ酸残基をＰ１と呼び、その残基から
Ｎ末端側に伸長する残基をＰ２、Ｐ３、Ｐ４…、Ｃ末端
側に伸長する残基をＰ１’、Ｐ２’…と呼ぶ。クニッツ
ドメインにおいてもプロテアーゼの活性中心に結合する
残基をＰ１とし、その他の残基を同様に定義する。クニ
ッツドメインの活性中心（Ｐ１）がＡｒｇまたはＬｙｓ
のものはトリプシンを阻害し、Ｐ１＝Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、
Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＭｅｔのものはキモトリプシンを
阻害し、Ｐ１＝ＡｒａまたはＳｅｒのものはエラスター
ゼを阻害することが示唆されている（Ｌａｓｋｏｗｓｋ
ｉら， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．
４９；５９３−６２６（１９８０））。配列番号２に示
すアミノ酸配列の３８６〜４３６番目の残基においては
Ｐ１＝Ｌｙｓであり、トリプシンタイプのセリンプロテ
アーゼを阻害することが示唆された。一方、配列番号２
に示すアミノ酸配列の３２８〜３７８番目の残基におい
てはＰ１＝Ｇｌｙである点が特徴的であり、エラスター
ゼタイプのようなオキシアニオンホールが狭いタイプの
セリンプロテアーゼを阻害する可能性が示唆された。
【００２５】この様に、ＫＩ３１６はクニッツ型のセリ
ンプロテアーゼ阻害蛋白質ファミリーに認められる特徴
を高度に保持している一方、そのアミノ酸レベルの相同
性は、最も相同性の高いＡＥ００６４６４ ヒト未知遺
伝子産物との間でも６８％、次に相同性の高いＵＴＩと
の間でも５１％にとどまる。また、ＫＩ３１６は配列番
号２に示すアミノ酸配列の２２３〜２９４番目のアミノ
酸配列部位にイムノグロブリンドメインを有する。また
ＫＩ３１６は、配列番号２に示すアミノ酸配列の２９７
〜２９９番目と４６０〜４６２番目にインテグリンファ
ミリーが認識するＲＧＤ配列に類似したＡｒｇ−Ａｌａ
−ＡｓｐおよびＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｐといった配列を
有する。このようなイムグロブリンドメインやＲＧＤ類
似配列を有するクニッツ型セリンプロテアーゼ阻害蛋白
質は、上述の機能不明のＡＥ００６４６４以外にはこれ
まで知られていない。これらのイムノグロブリンドメイ
ン、ＲＧＤ類似配列、および前述の３２８〜３７８番目
のクニッツ様ドメインは、いずれも特定の標的蛋白、標
的細胞へのターゲッティングや、他の蛋白からの認識部
位といった機能を有することが示唆される。また、３２
８〜３７８番目のクニッツ様ドメインに関しては、ベー
ターブンガロトキシンＢ鎖との類似性（５３％）を有し
ており、このＢ鎖では電位依存性外向きカリウムチャネ
ル抑制作用が報告されていることから（Ｐｅｉ−Ｆｕｎ
ｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７、４６６８
−４６７５、（２０００））、何らかのチャネルの機能
抑制に関与する可能性もある。
ンプロテアーゼ阻害蛋白質ファミリーに認められる特徴
を高度に保持している一方、そのアミノ酸レベルの相同
性は、最も相同性の高いＡＥ００６４６４ ヒト未知遺
伝子産物との間でも６８％、次に相同性の高いＵＴＩと
の間でも５１％にとどまる。また、ＫＩ３１６は配列番
号２に示すアミノ酸配列の２２３〜２９４番目のアミノ
酸配列部位にイムノグロブリンドメインを有する。また
ＫＩ３１６は、配列番号２に示すアミノ酸配列の２９７
〜２９９番目と４６０〜４６２番目にインテグリンファ
ミリーが認識するＲＧＤ配列に類似したＡｒｇ−Ａｌａ
−ＡｓｐおよびＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｐといった配列を
有する。このようなイムグロブリンドメインやＲＧＤ類
似配列を有するクニッツ型セリンプロテアーゼ阻害蛋白
質は、上述の機能不明のＡＥ００６４６４以外にはこれ
まで知られていない。これらのイムノグロブリンドメイ
ン、ＲＧＤ類似配列、および前述の３２８〜３７８番目
のクニッツ様ドメインは、いずれも特定の標的蛋白、標
的細胞へのターゲッティングや、他の蛋白からの認識部
位といった機能を有することが示唆される。また、３２
８〜３７８番目のクニッツ様ドメインに関しては、ベー
ターブンガロトキシンＢ鎖との類似性（５３％）を有し
ており、このＢ鎖では電位依存性外向きカリウムチャネ
ル抑制作用が報告されていることから（Ｐｅｉ−Ｆｕｎ
ｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７、４６６８
−４６７５、（２０００））、何らかのチャネルの機能
抑制に関与する可能性もある。
【００２６】本発明のセリンプロテアーゼ阻害蛋白質
は、活性化白血球および白血球に特に多く発現している
ほか、脾臓、肺、膵臓、大腸、小腸、副腎などの重要な
臓器に発現していることが確認されており（実施例２参
照）、白血球が関わる炎症性疾患、腫瘍、冠動脈疾患、
呼吸器疾患、炎症性腸疾患の制御に関与する蛋白質であ
ると理解される。このことから、ＫＩ３１６は、内因性
のプロテアーゼ／プロテアーゼ阻害剤のバランスが崩れ
ないような生体の恒常性を担っていることが推定され、
また、そのバランスが崩れた病態においては、その病態
の発現あるいは進展に深く関わっていることが推定され
る。
は、活性化白血球および白血球に特に多く発現している
ほか、脾臓、肺、膵臓、大腸、小腸、副腎などの重要な
臓器に発現していることが確認されており（実施例２参
照）、白血球が関わる炎症性疾患、腫瘍、冠動脈疾患、
呼吸器疾患、炎症性腸疾患の制御に関与する蛋白質であ
ると理解される。このことから、ＫＩ３１６は、内因性
のプロテアーゼ／プロテアーゼ阻害剤のバランスが崩れ
ないような生体の恒常性を担っていることが推定され、
また、そのバランスが崩れた病態においては、その病態
の発現あるいは進展に深く関わっていることが推定され
る。
【００２７】以上の蛋白構造上のおよび発現組織の特徴
から、本発明のセリンプロテアーゼ阻害蛋白質は他のセ
リンプロテアーゼ阻害蛋白質分子にはない特徴的な役割
を果たしていることが強く推認される。従って、ＫＩ３
１６を標的とした医薬化合物は、従来にはない特徴を備
えた医薬となり得るものと期待される。
から、本発明のセリンプロテアーゼ阻害蛋白質は他のセ
リンプロテアーゼ阻害蛋白質分子にはない特徴的な役割
を果たしていることが強く推認される。従って、ＫＩ３
１６を標的とした医薬化合物は、従来にはない特徴を備
えた医薬となり得るものと期待される。
【００２８】なお、セリンプロテアーゼ阻害蛋白質であ
る限り、配列番号２に示す蛋白質のアミノ酸配列におい
て、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／もしくは
付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋
白質も本発明の範囲内である。
る限り、配列番号２に示す蛋白質のアミノ酸配列におい
て、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／もしくは
付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋
白質も本発明の範囲内である。
【００２９】蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
が、実質的に蛋白質全体の三次元構造（立体構造とも言
う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つか
の関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換に
ついては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、
Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、
ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタ
ミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギ
ン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン
（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン
（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニ
ン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａ
ｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒ
ｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類さ
れるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷
電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン
（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ
酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性
アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉ
ｓ）が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう
場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明にお
いてはセリンプロテアーゼ阻害蛋白質としての機能を失
わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異な
る生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミ
ノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されてい
てもなお本質的な機能を保持している例も多く認められ
ている。
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
が、実質的に蛋白質全体の三次元構造（立体構造とも言
う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つか
の関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換に
ついては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、
Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、
ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタ
ミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギ
ン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン
（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン
（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニ
ン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａ
ｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒ
ｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類さ
れるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷
電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン
（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ
酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性
アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉ
ｓ）が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう
場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明にお
いてはセリンプロテアーゼ阻害蛋白質としての機能を失
わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異な
る生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミ
ノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されてい
てもなお本質的な機能を保持している例も多く認められ
ている。
【００３０】従って、配列番号２に示したアミノ酸配列
上の幾つかのアミノ酸残基の置換、挿入、欠失等による
変異蛋白質であっても、その変異蛋白質がセリンプロテ
アーゼ阻害蛋白質としての活性を有する限り、これらは
本発明の範囲内にあるものと言うことができる。ここに
いうセリンプロテアーゼ阻害蛋白質の活性とは、セリン
プロテアーゼと結合することによって該セリンプロテア
ーゼの活性発現を調節する蛋白質をいい、幾つかのアミ
ノ酸残基が異なっていても、配列番号２に記載のアミノ
酸配列からなるＫＩ３１６と実質的に同質の機能を有す
るものは、本発明の範囲内であるといえる。従って、セ
リンプロテアーゼへの結合能または阻害活性が性質的に
同質であればよく、該活性の強弱の変動、または糖鎖結
合の相違などによる該蛋白質の分子量の量的変化などは
許容されると解されるべきである。ＫＩ３１６のセリン
プロテアーゼ阻害蛋白質としての活性は、例えば実施例
６に示す方法で確認することが出来る。
上の幾つかのアミノ酸残基の置換、挿入、欠失等による
変異蛋白質であっても、その変異蛋白質がセリンプロテ
アーゼ阻害蛋白質としての活性を有する限り、これらは
本発明の範囲内にあるものと言うことができる。ここに
いうセリンプロテアーゼ阻害蛋白質の活性とは、セリン
プロテアーゼと結合することによって該セリンプロテア
ーゼの活性発現を調節する蛋白質をいい、幾つかのアミ
ノ酸残基が異なっていても、配列番号２に記載のアミノ
酸配列からなるＫＩ３１６と実質的に同質の機能を有す
るものは、本発明の範囲内であるといえる。従って、セ
リンプロテアーゼへの結合能または阻害活性が性質的に
同質であればよく、該活性の強弱の変動、または糖鎖結
合の相違などによる該蛋白質の分子量の量的変化などは
許容されると解されるべきである。ＫＩ３１６のセリン
プロテアーゼ阻害蛋白質としての活性は、例えば実施例
６に示す方法で確認することが出来る。
【００３１】このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多型
等によって生ずる変異の様に自然界において認められる
他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発
剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換え遺伝子手法を
用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うこと
ができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白
質がセリンプロテアーゼ阻害蛋白質である限り特に制限
はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましく
は１０アミノ酸以内、さらに好ましくは１または数個以
内である。
等によって生ずる変異の様に自然界において認められる
他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発
剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換え遺伝子手法を
用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うこと
ができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白
質がセリンプロテアーゼ阻害蛋白質である限り特に制限
はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましく
は１０アミノ酸以内、さらに好ましくは１または数個以
内である。
【００３２】また本発明では、ＫＩ３１６を上述のよう
な全てのドメイン構造を有する分子全体として理解でき
るほか、特徴的なドメイン、特にセリンプロテアーゼと
の結合能を担うドメインを保持した部分ペプチドとして
理解することもできる。クニッツドメインは非常に安定
であり、全長蛋白質に比べて遺伝子工学的に生産するこ
とが容易であるという利点を有し、かつそれ自体でセリ
ンプロテアーゼ阻害活性を有する。ＫＩ３１６における
部分ペプチドも、そのセリンプロテアーゼ結合能または
阻害活性を有する限り、実質的には本発明と同等の物質
であると理解すべきである。ＫＩ３１６のクニッツドメ
インは配列番号２に示すアミノ酸配列の３８６〜４３６
番目までのアミノ酸配列からなり、この部分においてセ
リンプロテアーゼを阻害すると考えられる。配列番号２
に示すアミノ酸配列の３８６〜４３６番目のアミノ酸配
列からなる部分ペプチド、配列番号２に示すアミノ酸配
列の３２８〜３７８番目のアミノ酸配列からなる部分ペ
プチド、配列番号２に示すアミノ酸配列の３２８〜４３
６番目のアミノ酸配列からなる部分ペプチドなども本発
明の範囲内のものである。なお、ドメインとしての活性
を保持する限りにおいてアミノ酸配列の改変が許容され
る。またシグナル配列を有する蛋白質ではシグナル配列
が切断されたものが成熟蛋白として機能している場合も
ある。よって本発明の蛋白質からシグナル配列が除かれ
た成熟ペプチドも、実質的には本発明と同等の物質であ
ると理解すべきである。ＫＩ３１６の場合、配列番号２
に示されるアミノ酸配列の１３〜４１番目のアミノ酸残
基付近にシグナル配列の存在が予測されている。上記に
述べた蛋白質は、いわゆる当業者における通常の認識の
範囲にある塩の形態であっても差し支えないことは言う
までもない。
な全てのドメイン構造を有する分子全体として理解でき
るほか、特徴的なドメイン、特にセリンプロテアーゼと
の結合能を担うドメインを保持した部分ペプチドとして
理解することもできる。クニッツドメインは非常に安定
であり、全長蛋白質に比べて遺伝子工学的に生産するこ
とが容易であるという利点を有し、かつそれ自体でセリ
ンプロテアーゼ阻害活性を有する。ＫＩ３１６における
部分ペプチドも、そのセリンプロテアーゼ結合能または
阻害活性を有する限り、実質的には本発明と同等の物質
であると理解すべきである。ＫＩ３１６のクニッツドメ
インは配列番号２に示すアミノ酸配列の３８６〜４３６
番目までのアミノ酸配列からなり、この部分においてセ
リンプロテアーゼを阻害すると考えられる。配列番号２
に示すアミノ酸配列の３８６〜４３６番目のアミノ酸配
列からなる部分ペプチド、配列番号２に示すアミノ酸配
列の３２８〜３７８番目のアミノ酸配列からなる部分ペ
プチド、配列番号２に示すアミノ酸配列の３２８〜４３
６番目のアミノ酸配列からなる部分ペプチドなども本発
明の範囲内のものである。なお、ドメインとしての活性
を保持する限りにおいてアミノ酸配列の改変が許容され
る。またシグナル配列を有する蛋白質ではシグナル配列
が切断されたものが成熟蛋白として機能している場合も
ある。よって本発明の蛋白質からシグナル配列が除かれ
た成熟ペプチドも、実質的には本発明と同等の物質であ
ると理解すべきである。ＫＩ３１６の場合、配列番号２
に示されるアミノ酸配列の１３〜４１番目のアミノ酸残
基付近にシグナル配列の存在が予測されている。上記に
述べた蛋白質は、いわゆる当業者における通常の認識の
範囲にある塩の形態であっても差し支えないことは言う
までもない。
【００３３】本発明の蛋白質またはその部分断片ペプチ
ドは、該蛋白質の活性を調節する物質の探索に使用する
ことが出来る。探索を通じて得られる化合物等は、本発
明の蛋白質が関連する疾患、例えば炎症性疾患等に対す
る有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
ドは、該蛋白質の活性を調節する物質の探索に使用する
ことが出来る。探索を通じて得られる化合物等は、本発
明の蛋白質が関連する疾患、例えば炎症性疾患等に対す
る有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
【００３４】（抗体）本発明はさらにＫＩ３１６に結合
する抗体を提供する。本発明の抗体は、ＫＩ３１６全体
あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識す
る抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリク
ローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構
造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５
つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，Ｉｇ
Ｅ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれ
に属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリン
を例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）２、パ
パインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであ
っても、またキメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。
またＫＩ３１６全体あるいはその部分ペプチドを抗原と
して特異的に認識するのみでなく、ＫＩ３１６の活性を
調節する機能を有する抗体も本発明に含まれる。ＫＩ３
１６の活性を調節する機能を有する抗体とは、例えば、
ＫＩ３１６とセリンプロテアーゼの結合を阻害する中和
抗体のことである。これらの抗体は、ＫＩ３１６の研究
的あるいは臨床的な検出等に有用である。
する抗体を提供する。本発明の抗体は、ＫＩ３１６全体
あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識す
る抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリク
ローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構
造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５
つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，Ｉｇ
Ｅ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれ
に属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリン
を例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）２、パ
パインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであ
っても、またキメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。
またＫＩ３１６全体あるいはその部分ペプチドを抗原と
して特異的に認識するのみでなく、ＫＩ３１６の活性を
調節する機能を有する抗体も本発明に含まれる。ＫＩ３
１６の活性を調節する機能を有する抗体とは、例えば、
ＫＩ３１６とセリンプロテアーゼの結合を阻害する中和
抗体のことである。これらの抗体は、ＫＩ３１６の研究
的あるいは臨床的な検出等に有用である。
【００３５】（アンチセンス核酸）本発明は、生体内に
おいて核酸レベルでのＫＩ３１６生合成を抑制すること
のできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かか
るアンチセンス核酸は、ＫＩ３１６をコードするｍＲＮ
Ａを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮ
Ａへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへ
のプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段
階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮ
Ａに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与え
て蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ｋｉ３
１６の核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補す
る配列からなるものであってもよい。好ましくは、配列
番号１に記載の核酸配列に相当あるいは相補する配列か
ら成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲ
ノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造ある
いは５’末端や３’末端に非翻訳領域を含む形であると
きは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補する
アンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の
機能を有するものとなろう。
おいて核酸レベルでのＫＩ３１６生合成を抑制すること
のできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かか
るアンチセンス核酸は、ＫＩ３１６をコードするｍＲＮ
Ａを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮ
Ａへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへ
のプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段
階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮ
Ａに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与え
て蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ｋｉ３
１６の核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補す
る配列からなるものであってもよい。好ましくは、配列
番号１に記載の核酸配列に相当あるいは相補する配列か
ら成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲ
ノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造ある
いは５’末端や３’末端に非翻訳領域を含む形であると
きは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補する
アンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の
機能を有するものとなろう。
【００３６】本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲ
ＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡ
と類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例え
ば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核
酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくと
もいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然
には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する
核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有
する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアー
ゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも
１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、
ＫＩ３１６の活性発現を抑制し得る機能を有する限り、
核酸の形態に制限はない。
ＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡ
と類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例え
ば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核
酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくと
もいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然
には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する
核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有
する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアー
ゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも
１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、
ＫＩ３１６の活性発現を抑制し得る機能を有する限り、
核酸の形態に制限はない。
【００３７】また本発明では、一般的には、ステム・ル
ープを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダ
イズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形
成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつア
ンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コド
ン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプ
ライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわ
ちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセ
ンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で
好ましい。
ープを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダ
イズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形
成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつア
ンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コド
ン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプ
ライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわ
ちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセ
ンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で
好ましい。
【００３８】この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り
込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチ
センス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好まし
くは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩
基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなる
ものが好適である。
込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチ
センス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好まし
くは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩
基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなる
ものが好適である。
【００３９】本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果
は、公知の手法、例えば本発明の遺伝子の発現制御領
域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳
領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポー
ター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメ
ガ社：Ｒｉｂｏ ｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：
Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔ
ｅ Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用する系のような本発明の遺
伝子が転写または翻訳される環境下で候補物質を系に添
加し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することによ
り評価することができる。
は、公知の手法、例えば本発明の遺伝子の発現制御領
域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳
領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポー
ター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメ
ガ社：Ｒｉｂｏ ｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：
Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔ
ｅ Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用する系のような本発明の遺
伝子が転写または翻訳される環境下で候補物質を系に添
加し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することによ
り評価することができる。
【００４０】本発明のアンチセンス核酸は、生体内にお
けるｋｉ３１６の発現を抑制することができるので、Ｋ
Ｉ３１６が関連する疾患の予防・治療剤として有用であ
る。
けるｋｉ３１６の発現を抑制することができるので、Ｋ
Ｉ３１６が関連する疾患の予防・治療剤として有用であ
る。
【００４１】
【発明の実施の形態】（核酸）本発明のＤＮＡをＤＮＡ
ライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡ
ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイ
ゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイ
ムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤ
ＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等
を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション
法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩基配
列もしくはその一部を有するＤＮＡを３２Ｐ等でラベル
してプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーまたは
ゲノムＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例
えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２年）行う
ことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体
は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本
発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーも
しくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に
よっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１に記載
の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンス
プライマーを作製し、任意のＤＮＡライブラリーに対
し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｉ．等，
ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を
行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方
法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを
有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該Ｄ
ＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラ
リーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販の
ＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有
する細胞からＤＮＡライブラリーを作製するのに適した
細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ＤＮＡ
ライブラリーを作製し、利用することができる。
ライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡ
ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイ
ゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイ
ムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤ
ＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等
を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション
法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩基配
列もしくはその一部を有するＤＮＡを３２Ｐ等でラベル
してプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーまたは
ゲノムＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例
えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２年）行う
ことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体
は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本
発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーも
しくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に
よっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１に記載
の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンス
プライマーを作製し、任意のＤＮＡライブラリーに対
し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｉ．等，
ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を
行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方
法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを
有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該Ｄ
ＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラ
リーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販の
ＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有
する細胞からＤＮＡライブラリーを作製するのに適した
細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ＤＮＡ
ライブラリーを作製し、利用することができる。
【００４２】また、本明細書に開示された配列を基にホ
スホアミダイト法などの化学合成的手法により調製する
ことも可能である。
スホアミダイト法などの化学合成的手法により調製する
ことも可能である。
【００４３】本発明のＤＮＡを含む組換えベクターは、
環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。か
かる組換えベクターは、本発明のＤＮＡの全部または一
部に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよ
い。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモー
ターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目
的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコー
ドする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配
列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始
点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことであ
る。本発明の組換えベクターの好ましい一例は、発現ベ
クターである。
環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。か
かる組換えベクターは、本発明のＤＮＡの全部または一
部に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよ
い。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモー
ターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目
的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコー
ドする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配
列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始
点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことであ
る。本発明の組換えベクターの好ましい一例は、発現ベ
クターである。
【００４４】遺伝子組換えに際しては、適当な合成ＤＮ
Ａアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドン
を本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に
適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失
させることも可能である。これらは当業者が通常行う作
業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易
に加工することができる。
Ａアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドン
を本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に
適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失
させることも可能である。これらは当業者が通常行う作
業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易
に加工することができる。
【００４５】また本発明のＤＮＡを保持するベクター
は、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使
用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、
バキュロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイル
ス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に
制限はない。
は、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使
用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、
バキュロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイル
ス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に
制限はない。
【００４６】本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有の
プロモーター配列の制御下に発現させることができる。
かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進
あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。ある
いは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモー
ターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは
置き換えて使用することもできる。この場合に使用する
プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択
すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プ
ロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモータ
ー、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合
にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤ
Ｈプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳ
Ｖ４０由来プロモーター、レトロウイルスプロモーター
等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されな
い。
プロモーター配列の制御下に発現させることができる。
かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進
あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。ある
いは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモー
ターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは
置き換えて使用することもできる。この場合に使用する
プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択
すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プ
ロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモータ
ー、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合
にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤ
Ｈプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳ
Ｖ４０由来プロモーター、レトロウイルスプロモーター
等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されな
い。
【００４７】ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知で
ある（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡ
とベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られ
たそれぞれの断片を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲー
ションさせればよい。
ある（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡ
とベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られ
たそれぞれの断片を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲー
ションさせればよい。
【００４８】（蛋白質）本発明の蛋白質は、該蛋白質を
発現している細胞や組織から調製することができ、また
ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３
３Ａ型、アプライドバイオシステムズ ジャパン株式会
社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるい
は真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換
え方法によっても調製することができる。しかしなが
ら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産な
らびに組換え型蛋白質が好ましい。
発現している細胞や組織から調製することができ、また
ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３
３Ａ型、アプライドバイオシステムズ ジャパン株式会
社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるい
は真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換
え方法によっても調製することができる。しかしなが
ら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産な
らびに組換え型蛋白質が好ましい。
【００４９】前項の組換えベクターを用いて形質転換さ
せる宿主細胞には特に制限はなく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）あるいは酵母
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に代表される遺伝子工学
手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７
細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞に代表される動物細胞
など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
せる宿主細胞には特に制限はなく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）あるいは酵母
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に代表される遺伝子工学
手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７
細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞に代表される動物細胞
など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
【００５０】本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞
を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで
得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に
導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プ
ロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈
澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクシ
ョン法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験
医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月
２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を
用いても構わない。
を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで
得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に
導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プ
ロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈
澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクシ
ョン法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験
医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月
２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を
用いても構わない。
【００５１】当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するに
は、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収
し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一
般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養に
ついては各種の成書（例、「微生物実験法」社団法人日
本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年）が
あるので、それらを参考にして行うことができる。
は、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収
し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一
般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養に
ついては各種の成書（例、「微生物実験法」社団法人日
本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年）が
あるので、それらを参考にして行うことができる。
【００５２】培養混合物から本発明の蛋白質を精製する
方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法
の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。
すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾
過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎
水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の
各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォ
ーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロ
マトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切
な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を
使用して適当な順序で精製を行えば良い。
方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法
の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。
すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾
過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎
水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の
各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォ
ーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロ
マトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切
な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を
使用して適当な順序で精製を行えば良い。
【００５３】また、本発明の蛋白質を他の蛋白質（例、
免疫グロブリンのＦｃ断片）やタグ（例、グルタチオン
Ｓトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジ
ンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発
現させることも可能である。発現させた融合型は、適当
なプロテアーゼ（例、トロンビン、エンテロカイネース
その他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとし
て蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。ま
た、免疫グロブリンのＦｃ断片を用いた場合などは、二
量体形成能を賦与するなど、本発明の蛋白質の活性また
は機能を向上または修飾することが可能である。本発明
の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わ
せて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたと
きは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ま
しい。
免疫グロブリンのＦｃ断片）やタグ（例、グルタチオン
Ｓトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジ
ンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発
現させることも可能である。発現させた融合型は、適当
なプロテアーゼ（例、トロンビン、エンテロカイネース
その他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとし
て蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。ま
た、免疫グロブリンのＦｃ断片を用いた場合などは、二
量体形成能を賦与するなど、本発明の蛋白質の活性また
は機能を向上または修飾することが可能である。本発明
の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わ
せて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたと
きは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ま
しい。
【００５４】また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞
系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａ
ｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ
ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に
生産する方法の１つである。
系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａ
ｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ
ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に
生産する方法の１つである。
【００５５】この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形
態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製する
ことができるが、これらのみに制限されるものではな
く、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させる
ことも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学
修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不
溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手
法による加工が考えられる。また、用いる宿主によって
は糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認めら
れる。かかる場合にあっても、ＫＩ３１６としてのセリ
ンプロテアーゼへの結合能または阻害活性を有する限り
において、なお、本発明であると理解されたい。ＫＩ３
１６のＡｓｎ３１９およびＡｓｎ５１９がＮ型糖鎖結合
部位と予測される。
態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製する
ことができるが、これらのみに制限されるものではな
く、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させる
ことも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学
修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不
溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手
法による加工が考えられる。また、用いる宿主によって
は糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認めら
れる。かかる場合にあっても、ＫＩ３１６としてのセリ
ンプロテアーゼへの結合能または阻害活性を有する限り
において、なお、本発明であると理解されたい。ＫＩ３
１６のＡｓｎ３１９およびＡｓｎ５１９がＮ型糖鎖結合
部位と予測される。
【００５６】本発明の蛋白質は、抗体を作製するための
抗原として使用し、あるいは該蛋白質に結合する物質や
該蛋白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用す
ることができ、有用である。
抗原として使用し、あるいは該蛋白質に結合する物質や
該蛋白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用す
ることができ、有用である。
【００５７】本発明のＫＩ３１６は、上述のような形質
転換細胞、特に動物細胞を培養することにより、培養上
清中に分泌させることが可能である。一方、ＫＩ３１６
が形質転換細胞のペリプラズムまたは細胞質内に存在す
る場合は、適当な緩衝液に懸濁した細胞に対して、例え
ば超音波処理、凍結融解処理、あるいはリゾチーム処理
などを行って細胞壁および／または細胞膜を破壊した
後、遠心分離やろ過などの方法で本発明の蛋白質を含有
する膜画分を得、さらに該膜画分を適当な界面活性剤を
用いて可溶化して粗溶液を調製する。そして、当該粗溶
液から定法により目的蛋白質を単離、精製することがで
きる。
転換細胞、特に動物細胞を培養することにより、培養上
清中に分泌させることが可能である。一方、ＫＩ３１６
が形質転換細胞のペリプラズムまたは細胞質内に存在す
る場合は、適当な緩衝液に懸濁した細胞に対して、例え
ば超音波処理、凍結融解処理、あるいはリゾチーム処理
などを行って細胞壁および／または細胞膜を破壊した
後、遠心分離やろ過などの方法で本発明の蛋白質を含有
する膜画分を得、さらに該膜画分を適当な界面活性剤を
用いて可溶化して粗溶液を調製する。そして、当該粗溶
液から定法により目的蛋白質を単離、精製することがで
きる。
【００５８】（トランスジェニック動物）本発明のｋｉ
３１６を用いれば、トランスジェニック非ヒト哺乳動物
を作製することができる。このトランスジェニック非ヒ
ト哺乳動物も本願の発明に属する。該トランスジェニッ
ク非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック動物の製造に
おいて通常使用されるような定法（例、発生工学実験マ
ニュアル、講談社サイエンティフィク発行、勝木元也
編、野村達次監修、１９８７年）に従って作製すること
ができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換えベク
ターを非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個
体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み
込まれた個体を選別する。
３１６を用いれば、トランスジェニック非ヒト哺乳動物
を作製することができる。このトランスジェニック非ヒ
ト哺乳動物も本願の発明に属する。該トランスジェニッ
ク非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック動物の製造に
おいて通常使用されるような定法（例、発生工学実験マ
ニュアル、講談社サイエンティフィク発行、勝木元也
編、野村達次監修、１９８７年）に従って作製すること
ができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換えベク
ターを非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個
体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み
込まれた個体を選別する。
【００５９】具体的には、例えば、トランスジェニック
マウスの場合には、正常Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６マウスか
ら取得した前核期受精卵にｋｉ３１６遺伝子が発現可能
なように構築されたＤＮＡを直接注入する。より具体的
には、適切なプロモーターの下流にｋｉ３１６遺伝子を
接続して導入したコンストラクトを作製し、その後必要
であれば原核生物由来の配列を可能な限り除去した直鎖
状ＤＮＡを得て、これを前核期受精卵前核に微細なガラ
ス針を用いて直接注入する。該受精卵を仮親として別の
偽妊娠マウスの子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的
にＩＣＲ雌マウスを、精管を切断または結紮した雄マウ
スと交配して作製する。移植胚由来の仔の組織よりゲノ
ムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法またはサザンブロッティン
グ法にてｋｉ３１６遺伝子の導入の有無を確認しトラン
スジェニックマウスを得る。
マウスの場合には、正常Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６マウスか
ら取得した前核期受精卵にｋｉ３１６遺伝子が発現可能
なように構築されたＤＮＡを直接注入する。より具体的
には、適切なプロモーターの下流にｋｉ３１６遺伝子を
接続して導入したコンストラクトを作製し、その後必要
であれば原核生物由来の配列を可能な限り除去した直鎖
状ＤＮＡを得て、これを前核期受精卵前核に微細なガラ
ス針を用いて直接注入する。該受精卵を仮親として別の
偽妊娠マウスの子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的
にＩＣＲ雌マウスを、精管を切断または結紮した雄マウ
スと交配して作製する。移植胚由来の仔の組織よりゲノ
ムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法またはサザンブロッティン
グ法にてｋｉ３１６遺伝子の導入の有無を確認しトラン
スジェニックマウスを得る。
【００６０】また、ｋｉ３１６（またはｋｉ３１６のマ
ウス相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノ
ックアウトマウス」を作製することができる。本発明に
おける「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由
来の蛋白質をコードする内在性遺伝子がノックアウト
（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを
応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特
許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２
号公報、同５，６２７，０５９号公報 、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８
９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．
３４２，４３５−４３８，１９８９など）を用いて作製
することができ、このようなノックアウトマウスも本発
明の一態様である。
ウス相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノ
ックアウトマウス」を作製することができる。本発明に
おける「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由
来の蛋白質をコードする内在性遺伝子がノックアウト
（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを
応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特
許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２
号公報、同５，６２７，０５９号公報 、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８
９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．
３４２，４３５−４３８，１９８９など）を用いて作製
することができ、このようなノックアウトマウスも本発
明の一態様である。
【００６１】または、最近中大動物においても核移植に
よるクローン動物の作出が可能となった。これに伴い本
技術を用いたＴＧおよびＫＯ動物の作出も実際に行われ
るようになった。すなわち体細胞、あるいは生殖系列の
細胞に対しｋｉ３１６（または各動物におけるｋｉ３１
６の相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、ＥＳ細胞に対
して行うのと同様に相同組換えを行い、得られた細胞か
ら核を得て、その核を用いてクローン動物を得ることが
できる。該動物はｋｉ３１６（または各動物におけるｋ
ｉ３１６の相同遺伝子）が失われたノックアウト動物で
ある。または、上述の方法と同様、任意の動物の任意の
細胞にｋｉ３１６（または各動物におけるｋｉ３１６の
相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクローン
動物を得る事によりＴＧ動物を作製する事も可能であ
る。このようなノックアウト非ヒト動物およびトランス
ジェニック非ヒト動物はその種に関わらず本発明の一態
様である。
よるクローン動物の作出が可能となった。これに伴い本
技術を用いたＴＧおよびＫＯ動物の作出も実際に行われ
るようになった。すなわち体細胞、あるいは生殖系列の
細胞に対しｋｉ３１６（または各動物におけるｋｉ３１
６の相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、ＥＳ細胞に対
して行うのと同様に相同組換えを行い、得られた細胞か
ら核を得て、その核を用いてクローン動物を得ることが
できる。該動物はｋｉ３１６（または各動物におけるｋ
ｉ３１６の相同遺伝子）が失われたノックアウト動物で
ある。または、上述の方法と同様、任意の動物の任意の
細胞にｋｉ３１６（または各動物におけるｋｉ３１６の
相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクローン
動物を得る事によりＴＧ動物を作製する事も可能であ
る。このようなノックアウト非ヒト動物およびトランス
ジェニック非ヒト動物はその種に関わらず本発明の一態
様である。
【００６２】（抗体）本発明の抗体は、ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にし
て得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免
疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説
明する。
抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にし
て得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免
疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説
明する。
【００６３】当該新規抗体を得るには、まず動物に、免
疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイント
の完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント
（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必
要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫
後、採血を行い、抗血清を得る。抗原として用いる本発
明の蛋白質は、それが抗体の作製に使用しうる精製度の
ものであればいかなる方法で得られたものであってもよ
い。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原とし
て好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプ
チドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０
アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それを
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャ
リアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する
動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常
当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、
ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等
から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用す
ることが好ましい。
疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイント
の完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント
（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必
要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫
後、採血を行い、抗血清を得る。抗原として用いる本発
明の蛋白質は、それが抗体の作製に使用しうる精製度の
ものであればいかなる方法で得られたものであってもよ
い。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原とし
て好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプ
チドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０
アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それを
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャ
リアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する
動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常
当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、
ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等
から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用す
ることが好ましい。
【００６４】ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を
精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良
い。
精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良
い。
【００６５】モノクローナル抗体を得るには以下のよう
に行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリ
ンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコ
ール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方
法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリド
ーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗
体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択
されたクローンの培養上清を精製することによって得れ
ば良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を
適宜組み合わせて用いれば良い。
に行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリ
ンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコ
ール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方
法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリド
ーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗
体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択
されたクローンの培養上清を精製することによって得れ
ば良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を
適宜組み合わせて用いれば良い。
【００６６】また、遺伝子工学的な方法を用いても当該
新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその
部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あ
るいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから
ｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリー
を作製する。抗原と反応する抗体を産生しているクロー
ンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培
養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて
精製することができる。抗体を治療に使用する場合に
は、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗
体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例 Ｎ
ａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５；１４６−１５６（１９９
７））を免疫することにより調製することが出来る。ま
た、モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工
学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３；９９−１２１（１９９
１））。
新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその
部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あ
るいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから
ｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリー
を作製する。抗原と反応する抗体を産生しているクロー
ンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培
養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて
精製することができる。抗体を治療に使用する場合に
は、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗
体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例 Ｎ
ａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５；１４６−１５６（１９９
７））を免疫することにより調製することが出来る。ま
た、モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工
学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３；９９−１２１（１９９
１））。
【００６７】（アンチセンス核酸）アンチセンス核酸
は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａ
ｎｌｅｙ Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢｅｒｎａｌｄ Ｌ
ｅｂｌｅｕ編、ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出
版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡで
あれば、化学合成機を使用して合成し、あるいはｋｉ３
１６を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス
核酸を得ることができる。また、メチルフォスフォネー
ト型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化
学合成機（たとえばアプライドバイオシステムズ ジャ
パン株式会社製、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９
０９）を使用して合成できるものもある。この場合に
は、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を
行い、得られた合成産物を、逆相クロマトグラフィー等
を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、ア
ンチセンス核酸を得ることができる。
は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａ
ｎｌｅｙ Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢｅｒｎａｌｄ Ｌ
ｅｂｌｅｕ編、ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出
版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡで
あれば、化学合成機を使用して合成し、あるいはｋｉ３
１６を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス
核酸を得ることができる。また、メチルフォスフォネー
ト型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化
学合成機（たとえばアプライドバイオシステムズ ジャ
パン株式会社製、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９
０９）を使用して合成できるものもある。この場合に
は、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を
行い、得られた合成産物を、逆相クロマトグラフィー等
を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、ア
ンチセンス核酸を得ることができる。
【００６８】本発明のＤＮＡやアンチセンス核酸を診断
用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の
方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あ
るいは発光物質等で標識する。次に、検体からＤＮＡも
しくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被検物質と
して、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄し
て未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中
に、遺伝子ｋｉ３１６もしくはＲＮＡが含まれていれ
ば、当該アンチセンス核酸はそれらと結合する。結合形
成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、ある
いは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指
標として知ることができる。
用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の
方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あ
るいは発光物質等で標識する。次に、検体からＤＮＡも
しくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被検物質と
して、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄し
て未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中
に、遺伝子ｋｉ３１６もしくはＲＮＡが含まれていれ
ば、当該アンチセンス核酸はそれらと結合する。結合形
成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、ある
いは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指
標として知ることができる。
【００６９】本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または
組換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品
として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許
容されうる使用方法で使用することが好ましい。
組換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品
として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許
容されうる使用方法で使用することが好ましい。
【００７０】本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または
組換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もし
くは懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入し
たり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用しても
よい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補
助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、
クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にし
て使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分と
は、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、
緩衝剤等のことである。
組換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もし
くは懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入し
たり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用しても
よい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補
助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、
クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にし
て使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分と
は、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、
緩衝剤等のことである。
【００７１】本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または
組換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者
の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与
方法、その投与量を設定して使用することができる。す
なわち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あ
るいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投
与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮
下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すれ
ばよい。
組換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者
の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与
方法、その投与量を設定して使用することができる。す
なわち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あ
るいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投
与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮
下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すれ
ばよい。
【００７２】（スクリーニング方法）本発明は、本発明
の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発
明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクターまたは該組
換えベクターで形質転換された形質転換細胞を用いるこ
とを特徴とし、本発明の蛋白質の機能または発現を調節
する物質をスクリーニング方法に関する。より具体的に
は、（１）候補物質を用意し、本発明の蛋白質または該
蛋白質を発現している形質転換細胞に該候補物質を接触
させ、該候補物質が本発明の蛋白質の活性を調節する作
用を有するかどうかを判定することからなる方法、
（２）候補物質を用意し、本発明のＤＮＡを含む組換え
ベクターまたは該組換えベクターで形質転換された形質
転換細胞に該候補物質を接触させ、該候補物質がｋｉ３
１６遺伝子の発現を調節する作用を有するかどうかを判
定することからなる方法などが挙げられる。（１）の例
としては、実施例６に示す系において、候補物質存在下
／非存在下における本発明の蛋白質の活性を測定し、非
存在下に比べて存在下において本発明の蛋白質の活性を
増加または減少させる候補物質を選択する方法が挙げら
れる。（２）の例としては、ｋｉ３１６遺伝子の発現制
御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または
翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレ
ポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、本
発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で該レポー
ター遺伝子の発現量を候補物質の存在下／非存在下で測
定し、候補物質の転写促進活性または転写抑制活性を確
認する方法が挙げられる。本発明の蛋白質の活性を調節
する作用を示す物質とは、ＫＩ３１６の活性を増強（ア
ゴニスト）あるいは阻害する（アンタゴニスト）作用を
有する物質のいずれでも良い。本発明のＤＮＡの発現調
節作用を示す物質とは、遺伝子ｋｉ３１６の発現を促進
あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでもよく、
好ましくは発現を抑制する物質である。候補物質が本発
明の蛋白質の活性調節作用または本発明のＤＮＡの発現
調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる
系またはＤＮＡの発現を確認できる系に候補物質を添加
した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはＤＮＡの
発現レベルに差があるかどうかを調べればよい。ＤＮＡ
の発現レベルとは、ｋｉ３１６遺伝子のｍＲＮＡの発現
強度、蛋白質の発現強度のいづれにより検出しても良
い。また、ｋｉ３１６遺伝子またはＫＩ３１６蛋白質自
体の発現レベルではなく、代替としてレポーター遺伝子
の発現レベルを検出しても良い。レポーターアッセイ系
は、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の
発現量を指標として、該転写調節領域に作用する物質を
スクリーニングするアッセイ系をいう。転写調節領域と
しては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモータ
ー領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス
等を例示することができる。またレポーター遺伝子とし
ては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃ
ｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラ
ーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β−ガラクトシ
ダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を
利用することができる。本発明の遺伝子の発現制御領域
や５’非翻訳領域は公知の方法で取得することが可能で
ある（新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）、１９９
３年）。阻害（または抑制）する作用を有する、あるい
は増強（または促進）する作用を有するとは、蛋白質の
活性またはＤＮＡの発現レベルの測定値が、候補物質添
加群と、候補物質無添加群との間に差があることをい
う。たとえば、下記の式で計算される阻害（または抑
制）率あるいは増強（または促進）率が１０％以上、好
ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に
好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であ
ることをいう。 阻害（抑制）率あるいは増強（促進）率＝（候補物質無
添加群の測定値−候補物質添加群の測定値）の絶対値／
無添加群の測定値＊１００ ここで、測定値は蛋白質の活性を確認できる系またはＤ
ＮＡの発現を確認できる系の種類によって適宜定められ
る。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が実施例６
に示す測定系の場合には、測定値としては吸光度を用い
ることができ、候補物質添加群の測定値＞候補物質無添
加群の測定値となる場合、候補物質にはＫＩ３１６蛋白
質活性阻害作用があるといえる。測定系にバックグラウ
ンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなもの
を差し引いた値を測定値とすることは言うまでもない。
の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発
明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクターまたは該組
換えベクターで形質転換された形質転換細胞を用いるこ
とを特徴とし、本発明の蛋白質の機能または発現を調節
する物質をスクリーニング方法に関する。より具体的に
は、（１）候補物質を用意し、本発明の蛋白質または該
蛋白質を発現している形質転換細胞に該候補物質を接触
させ、該候補物質が本発明の蛋白質の活性を調節する作
用を有するかどうかを判定することからなる方法、
（２）候補物質を用意し、本発明のＤＮＡを含む組換え
ベクターまたは該組換えベクターで形質転換された形質
転換細胞に該候補物質を接触させ、該候補物質がｋｉ３
１６遺伝子の発現を調節する作用を有するかどうかを判
定することからなる方法などが挙げられる。（１）の例
としては、実施例６に示す系において、候補物質存在下
／非存在下における本発明の蛋白質の活性を測定し、非
存在下に比べて存在下において本発明の蛋白質の活性を
増加または減少させる候補物質を選択する方法が挙げら
れる。（２）の例としては、ｋｉ３１６遺伝子の発現制
御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または
翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレ
ポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、本
発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で該レポー
ター遺伝子の発現量を候補物質の存在下／非存在下で測
定し、候補物質の転写促進活性または転写抑制活性を確
認する方法が挙げられる。本発明の蛋白質の活性を調節
する作用を示す物質とは、ＫＩ３１６の活性を増強（ア
ゴニスト）あるいは阻害する（アンタゴニスト）作用を
有する物質のいずれでも良い。本発明のＤＮＡの発現調
節作用を示す物質とは、遺伝子ｋｉ３１６の発現を促進
あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでもよく、
好ましくは発現を抑制する物質である。候補物質が本発
明の蛋白質の活性調節作用または本発明のＤＮＡの発現
調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる
系またはＤＮＡの発現を確認できる系に候補物質を添加
した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはＤＮＡの
発現レベルに差があるかどうかを調べればよい。ＤＮＡ
の発現レベルとは、ｋｉ３１６遺伝子のｍＲＮＡの発現
強度、蛋白質の発現強度のいづれにより検出しても良
い。また、ｋｉ３１６遺伝子またはＫＩ３１６蛋白質自
体の発現レベルではなく、代替としてレポーター遺伝子
の発現レベルを検出しても良い。レポーターアッセイ系
は、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の
発現量を指標として、該転写調節領域に作用する物質を
スクリーニングするアッセイ系をいう。転写調節領域と
しては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモータ
ー領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス
等を例示することができる。またレポーター遺伝子とし
ては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃ
ｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラ
ーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β−ガラクトシ
ダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を
利用することができる。本発明の遺伝子の発現制御領域
や５’非翻訳領域は公知の方法で取得することが可能で
ある（新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）、１９９
３年）。阻害（または抑制）する作用を有する、あるい
は増強（または促進）する作用を有するとは、蛋白質の
活性またはＤＮＡの発現レベルの測定値が、候補物質添
加群と、候補物質無添加群との間に差があることをい
う。たとえば、下記の式で計算される阻害（または抑
制）率あるいは増強（または促進）率が１０％以上、好
ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に
好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であ
ることをいう。 阻害（抑制）率あるいは増強（促進）率＝（候補物質無
添加群の測定値−候補物質添加群の測定値）の絶対値／
無添加群の測定値＊１００ ここで、測定値は蛋白質の活性を確認できる系またはＤ
ＮＡの発現を確認できる系の種類によって適宜定められ
る。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が実施例６
に示す測定系の場合には、測定値としては吸光度を用い
ることができ、候補物質添加群の測定値＞候補物質無添
加群の測定値となる場合、候補物質にはＫＩ３１６蛋白
質活性阻害作用があるといえる。測定系にバックグラウ
ンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなもの
を差し引いた値を測定値とすることは言うまでもない。
【００７３】上述のスクリーニング方法あるいはトラン
スジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物
等は、炎症性疾患等に対する有効な治療薬または予防薬
となることが期待される。候補物質としては蛋白質、ペ
プチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化
合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織
抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質
でも公知物質でもよい。
スジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物
等は、炎症性疾患等に対する有効な治療薬または予防薬
となることが期待される。候補物質としては蛋白質、ペ
プチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化
合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織
抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質
でも公知物質でもよい。
【００７４】
【実施例】以下の実施例により本発明を更に詳述する
が、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきも
のではない。
が、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきも
のではない。
【００７５】実施例１ 新規クニッツ型プロテアーゼイ
ンヒビターＫＩ３１６のクローニング
ンヒビターＫＩ３１６のクローニング
【００７６】
（１）舌組織由来クローンＣ−ＮＴＯＮＧ２００３３１
６のクローニング （１−１）オリゴキャップ法によるｃＤＮＡライブラリ
ーの作製 （１−１−１）ｍＲＮＡ抽出 ヒト正常舌（Ｔｏｎｇｕｅ）組織より、文献（Ｊ．Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｔ．Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅ
ｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ｈａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９
８９）記載の方法により全ＲＮＡとしてｍＲＮＡを抽出
した。
６のクローニング （１−１）オリゴキャップ法によるｃＤＮＡライブラリ
ーの作製 （１−１−１）ｍＲＮＡ抽出 ヒト正常舌（Ｔｏｎｇｕｅ）組織より、文献（Ｊ．Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｔ．Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅ
ｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ｈａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９
８９）記載の方法により全ＲＮＡとしてｍＲＮＡを抽出
した。
【００７７】（１−１−２）ｃＤＮＡライブラリーの作
製 ＲＮＡよりオリゴキャップ法［Ｍ．Ｍａｒｕｙａｍａ
ａｎｄ Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ，１３８：１７１
−１７４（１９９４）］を改良した方法（ＷＯ０１／０
４２８６）によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。オ
リゴ−キャップリンカー（５’−ａｇｃａｕｃｇａｇｕ
ｃｇｇｃｃｕｕｇｕｕ ｇｇｃｃｕａｃｕｇｇ−
３’）およびオリゴｄＴプライマー（５’−ｇｃｇｇｃ
ｔｇａａｇａｃｇｇｃｃｔａｔｇ ｔｇｇｃｃｔｔｔｔ
ｔ ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ ｔｔ−３’）を用いて、Ｗ
Ｏ０１／０４２８６に記載したようにＢＡＰ（Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓ
ｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ａｃｉｄ Ｐｙｒ
ｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーショ
ン、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。次
いで、５’（５’−ａｇｃａｔｃｇａｇｔ ｃｇｇｃｃ
ｔｔｇｔｔ ｇ−３’）と３’（５’−ｇｃｇｇｃｔｇ
ａａｇ ａｃｇｇｃｃｔａｔｇ ｔ−３’）のＰＣＲプ
ライマーを用いＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａ
ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡに変換
し、ＳｆｉＩ切断した。次いで、通常は２ｋｂ以上（場
合によっては３ｋｂ以上）に分画したｃＤＮＡ断片をＤ
ｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ ＡＢ００９８６４，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎｖｅｃｔｏｒ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニ
ングし、ｃＤＮＡライブラリー（ＮＴＯＮＧ）を作製し
た。
製 ＲＮＡよりオリゴキャップ法［Ｍ．Ｍａｒｕｙａｍａ
ａｎｄ Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ，１３８：１７１
−１７４（１９９４）］を改良した方法（ＷＯ０１／０
４２８６）によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。オ
リゴ−キャップリンカー（５’−ａｇｃａｕｃｇａｇｕ
ｃｇｇｃｃｕｕｇｕｕ ｇｇｃｃｕａｃｕｇｇ−
３’）およびオリゴｄＴプライマー（５’−ｇｃｇｇｃ
ｔｇａａｇａｃｇｇｃｃｔａｔｇ ｔｇｇｃｃｔｔｔｔ
ｔ ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ ｔｔ−３’）を用いて、Ｗ
Ｏ０１／０４２８６に記載したようにＢＡＰ（Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓ
ｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ａｃｉｄ Ｐｙｒ
ｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーショ
ン、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。次
いで、５’（５’−ａｇｃａｔｃｇａｇｔ ｃｇｇｃｃ
ｔｔｇｔｔ ｇ−３’）と３’（５’−ｇｃｇｇｃｔｇ
ａａｇ ａｃｇｇｃｃｔａｔｇ ｔ−３’）のＰＣＲプ
ライマーを用いＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａ
ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡに変換
し、ＳｆｉＩ切断した。次いで、通常は２ｋｂ以上（場
合によっては３ｋｂ以上）に分画したｃＤＮＡ断片をＤ
ｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ ＡＢ００９８６４，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎｖｅｃｔｏｒ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニ
ングし、ｃＤＮＡライブラリー（ＮＴＯＮＧ）を作製し
た。
【００７８】オリゴキャップ法を改良した方法で作製し
た高全長率ｃＤＮＡライブラリーは、真核細胞での発現
が可能な発現ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を用いて作製
した。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３にはクローニング部位の上流
にＳＲαプロモーターとＳＶ４０ ｓｍａｌｌ ｔイン
トロンが組み込まれており、またその下流にはＳＶ４０
ポリＡ 付加シグナル配列が挿入されている。ｐＭＥ１
８ＳＦＬ３のクローン化部位は非対称性のＤｒａＩＩＩ
サイトとなっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相
補的なＳｆｉＩ部位を付加しているので、クローン化し
たｃＤＮＡ断片はＳＲαプロモーターの下流に一方向性
に挿入される。したがって、全長ｃＤＮＡを含むクロー
ンでは、得られたプラスミドをそのままＣＯＳ細胞など
に導入することにより、一過的に遺伝子を発現させるこ
とが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物
である蛋白質として、あるいはそれらの生物学的活性と
して実験的に解析することが可能となっている。
た高全長率ｃＤＮＡライブラリーは、真核細胞での発現
が可能な発現ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を用いて作製
した。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３にはクローニング部位の上流
にＳＲαプロモーターとＳＶ４０ ｓｍａｌｌ ｔイン
トロンが組み込まれており、またその下流にはＳＶ４０
ポリＡ 付加シグナル配列が挿入されている。ｐＭＥ１
８ＳＦＬ３のクローン化部位は非対称性のＤｒａＩＩＩ
サイトとなっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相
補的なＳｆｉＩ部位を付加しているので、クローン化し
たｃＤＮＡ断片はＳＲαプロモーターの下流に一方向性
に挿入される。したがって、全長ｃＤＮＡを含むクロー
ンでは、得られたプラスミドをそのままＣＯＳ細胞など
に導入することにより、一過的に遺伝子を発現させるこ
とが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物
である蛋白質として、あるいはそれらの生物学的活性と
して実験的に解析することが可能となっている。
【００７９】（１−２）ｃＤＮＡクローン末端配列解析
と全長塩基配列解析クローンの選択 各ｃＤＮＡライブラリーより得たクローンのプラスミド
ＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’末端の塩基配列をＤＮ
Ａシーケンシング試薬（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄ
ｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ， ｄＲｈｏｄａｍｉｎ
ｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
またはＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応
後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７０
０， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析した。
得られたデータについてはデータベース化を行った。
と全長塩基配列解析クローンの選択 各ｃＤＮＡライブラリーより得たクローンのプラスミド
ＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’末端の塩基配列をＤＮ
Ａシーケンシング試薬（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄ
ｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ， ｄＲｈｏｄａｍｉｎ
ｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
またはＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応
後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７０
０， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析した。
得られたデータについてはデータベース化を行った。
【００８０】解析されたｃＤＮＡクローンの５’末端配
列については、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅのｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓの表記があるデータを対象にした
ＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、ヒトのｍＲＮＡ配
列に同一なものは除いた。次にクラスタリングを行い、
相同性９０％以上かつコンセンサス配列が５０塩基対以
上の場合、同一グループと見なし、グループを形成させ
た。グループ内の、より５’−側に長いクローンを選択
し、選択されたクローンについては必要に応じ３’末端
配列を５’末端配列と同様の方法で解析取得した。取得
された末端配列のデータを解析し、５’末端と３’末端
の配列でコンティグを作るクローンは除いた。更に再度
前記と同様にＢＬＡＳＴによる相同性検索により公知の
ヒトのｍＲＮＡ配列に同一なものは除いた。こうして選
択したクローンより全長塩基配列解析を行うクローンを
得た。
列については、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅのｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓの表記があるデータを対象にした
ＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、ヒトのｍＲＮＡ配
列に同一なものは除いた。次にクラスタリングを行い、
相同性９０％以上かつコンセンサス配列が５０塩基対以
上の場合、同一グループと見なし、グループを形成させ
た。グループ内の、より５’−側に長いクローンを選択
し、選択されたクローンについては必要に応じ３’末端
配列を５’末端配列と同様の方法で解析取得した。取得
された末端配列のデータを解析し、５’末端と３’末端
の配列でコンティグを作るクローンは除いた。更に再度
前記と同様にＢＬＡＳＴによる相同性検索により公知の
ヒトのｍＲＮＡ配列に同一なものは除いた。こうして選
択したクローンより全長塩基配列解析を行うクローンを
得た。
【００８１】（１−３） 全長塩基配列解析
全長塩基配列解析に選抜されたクローンについて各々全
長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列は、主にカ
スタム合成ＤＮＡプライマーを用いたダイデオキシター
ミネーター法によるプライマーウォーキング法によって
決定した。すなわち、カスタム合成ＤＮＡプライマーを
用い、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のＤＮＡシーケン
シング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応
後、同社製のシーケンサーを用いてＤＮＡ塩基配列を解
析した。一部のクローンについては、Ｌｉｃｏｒ社製Ｄ
ＮＡシーケンサーも利用した。
長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列は、主にカ
スタム合成ＤＮＡプライマーを用いたダイデオキシター
ミネーター法によるプライマーウォーキング法によって
決定した。すなわち、カスタム合成ＤＮＡプライマーを
用い、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のＤＮＡシーケン
シング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応
後、同社製のシーケンサーを用いてＤＮＡ塩基配列を解
析した。一部のクローンについては、Ｌｉｃｏｒ社製Ｄ
ＮＡシーケンサーも利用した。
【００８２】また、一部のクローンについてはカスタム
プライマーを用いずｃＤＮＡ が含まれるプラスミドを
ランダムに切断するショットガン法を用いて同様にＤＮ
ＡシーケンサーでＤＮＡ塩基配列を決定した。全長塩基
配列は上記方法により決定された部分塩基配列を完全に
オーバーラップさせ最終的に確定した。
プライマーを用いずｃＤＮＡ が含まれるプラスミドを
ランダムに切断するショットガン法を用いて同様にＤＮ
ＡシーケンサーでＤＮＡ塩基配列を決定した。全長塩基
配列は上記方法により決定された部分塩基配列を完全に
オーバーラップさせ最終的に確定した。
【００８３】次に、決定された全長塩基配列から、蛋白
質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。
質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。
【００８４】（２）Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６塩基
配列 上述の方法で取得したプラスミドＣ−ＮＴＯＮＧ２００
３３１６には、２８３個のアミノ酸配列（配列番号４）
からなる新規な蛋白質をコードする、８４９塩基の塩基
配列からなるオープンリーディングフレームを含む、全
長２０３６塩基対の塩基配列（配列番号３）からなるｃ
ＤＮＡが含まれていた。
配列 上述の方法で取得したプラスミドＣ−ＮＴＯＮＧ２００
３３１６には、２８３個のアミノ酸配列（配列番号４）
からなる新規な蛋白質をコードする、８４９塩基の塩基
配列からなるオープンリーディングフレームを含む、全
長２０３６塩基対の塩基配列（配列番号３）からなるｃ
ＤＮＡが含まれていた。
【００８５】（３）Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６推定
蛋白質の相同性解析とモチーフ解析 相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏ
ｌ．、Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２１５；４０３−１
０（１９９０））を用いて、局部的な配列の一致を検索
した。配列番号４で表されるアミノ酸配列を、相同性検
索を行うｂｌａｓｔｐプログラムを用いてＧｅｎｂａｎ
ｋ蛋白質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対しＢＬＡＳＴ相同
性検索を行った。その結果、５６番から１４６番の９１
アミノ酸にわたりラットａｌｐｈａ−１−ｍｉｃｒｏｇ
ｌｏｂｕｌｉｎ／ｂｉｋｕｎｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３７０３３）との相同性が
６５％および同一性が４５％、９３番から１４３番の５
１アミノ酸にわたりラット ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏ
ｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＧｅｎＢａ
ｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０５８８９６）との
相同性が６４％および同一性が４３％みられた。またＰ
ＳＩ−ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いたＰｆａｍ，ＳＭ
ＡＲＴデータベース検索（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．；ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍｌ）によりド
メイン解析を行うことで、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１
６の９３−１４３アミノ酸領域にクニッツ型セリンプロ
テアーゼ阻害ドメインが認められた。また３０−８５ア
ミノ酸領域にも偽クニッツ配列が認められたが、その配
列は一般的なクニッツドメインに比べ５アミノ酸長く、
システイン残基が２個余分に含まれていた。
蛋白質の相同性解析とモチーフ解析 相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏ
ｌ．、Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２１５；４０３−１
０（１９９０））を用いて、局部的な配列の一致を検索
した。配列番号４で表されるアミノ酸配列を、相同性検
索を行うｂｌａｓｔｐプログラムを用いてＧｅｎｂａｎ
ｋ蛋白質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対しＢＬＡＳＴ相同
性検索を行った。その結果、５６番から１４６番の９１
アミノ酸にわたりラットａｌｐｈａ−１−ｍｉｃｒｏｇ
ｌｏｂｕｌｉｎ／ｂｉｋｕｎｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０３７０３３）との相同性が
６５％および同一性が４５％、９３番から１４３番の５
１アミノ酸にわたりラット ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏ
ｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＧｅｎＢａ
ｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０５８８９６）との
相同性が６４％および同一性が４３％みられた。またＰ
ＳＩ−ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いたＰｆａｍ，ＳＭ
ＡＲＴデータベース検索（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．；ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍｌ）によりド
メイン解析を行うことで、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１
６の９３−１４３アミノ酸領域にクニッツ型セリンプロ
テアーゼ阻害ドメインが認められた。また３０−８５ア
ミノ酸領域にも偽クニッツ配列が認められたが、その配
列は一般的なクニッツドメインに比べ５アミノ酸長く、
システイン残基が２個余分に含まれていた。
【００８６】（４）Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６ｃＤ
ＮＡ配列によるＥＳＴ情報検索 Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６の５’側塩基配列１−１
６０をｂｌａｓｔｎプログラムを用いてヒトＥＳＴデー
タベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対しＢＬＡＳＴ相同性検索を行っ
た。その結果、さらに５’側が延長されたＥＳＴクロー
ン（ＡＬ５３７４５０）が認められ、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２
００３３１６が部分長であることが示唆された。またＣ
−ＮＴＯＮＧ２００３３１６の偽クニッツドメインを含
む塩基配列１−５６０を同様にｂｌａｓｔｎプログラム
を用いてヒトＥＳＴデータベースに対しＢＬＡＳＴ相同
性検索を行った結果、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６と
は異なるＥＳＴクローン（ＡＬ５４０２４０）が認めら
れた。この配列はＣ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６には認
められないＩＩ型のイムノグロブリンドメインと新たな
クニッツドメインを含んでおり、新規クニッツ型プロテ
アーゼインヒビターＫＩ３１６の部分ｃＤＮＡ配列と予
想された。
ＮＡ配列によるＥＳＴ情報検索 Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６の５’側塩基配列１−１
６０をｂｌａｓｔｎプログラムを用いてヒトＥＳＴデー
タベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対しＢＬＡＳＴ相同性検索を行っ
た。その結果、さらに５’側が延長されたＥＳＴクロー
ン（ＡＬ５３７４５０）が認められ、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２
００３３１６が部分長であることが示唆された。またＣ
−ＮＴＯＮＧ２００３３１６の偽クニッツドメインを含
む塩基配列１−５６０を同様にｂｌａｓｔｎプログラム
を用いてヒトＥＳＴデータベースに対しＢＬＡＳＴ相同
性検索を行った結果、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６と
は異なるＥＳＴクローン（ＡＬ５４０２４０）が認めら
れた。この配列はＣ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６には認
められないＩＩ型のイムノグロブリンドメインと新たな
クニッツドメインを含んでおり、新規クニッツ型プロテ
アーゼインヒビターＫＩ３１６の部分ｃＤＮＡ配列と予
想された。
【００８７】（５）完全長ＫＩ３１６ｃＤＮＡのクロー
ニング （５−１）ＫＩ３１６Ｎ末端側ｃＤＮＡクローニング 上述のＥＳＴ情報検索により得られたＡＬ５３７４５０
配列をもとにセンスプライマー３１６−Ｓ１（５’−Ｃ
ＡＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＣＡＣ ＣＧＴ ＧＣＣ ＡＧ
−３’）を、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６配列をもと
にアンチセンスプライマー３１６−Ａ１（５’−ＣＴＧ
ＴＴＧ ＴＡＡ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＧＡ ＧＧ−
３’）を合成し、ヒト肺組織由来ＭＴＣパネル（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ）を鋳型にＰＬＡＴＩＮＵＮ Ｔａｑ ＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に
より９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の
サイクルを３５回繰り返し、１ｓｔ−ＰＣＲ反応を行っ
た。得られたＰＣＲ産物の希釈液を鋳型とし、ＡＬ５３
７４５０配列由来のセンスプライマー３１６−Ｓ２
（５’−ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＡＡ ＡＣＴ ＧＣＴ Ｔ
ＣＣ ＡＧ−３’）とＣ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６配
列由来のアンチセンスプライマー３１６−Ａ２（５’−
ＡＡＧ ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＧＧ ＴＴＡ ＣＧＧ Ｔ
Ｇ−３’）を用いて、上述と同条件で２ｎｄ−ＰＣＲ反
応を行った。得られた増幅断片はｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓ
ｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に定法に従いＴＡ
クローニングし、シークエンスによりＫＩ３１６のＮ末
端ｃＤＮＡであることを確認した。 （５−２）ＫＩ３１６Ｃ末端側ｃＤＮＡクローニング Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６配列由来のセンスプライ
マー３１６−Ｓ６（５’−ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＣＣ Ｇ
ＣＴ ＡＣＡ ＴＧＧ ＡＣ−３’）とアンチセンスプ
ライマー３１６−Ａ６（５’−ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＴＴ
ＣＣＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＣＣ−３’）を合成し、ヒ
ト肺組織由来ＭＴＣパネル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型
にＰＬＡＴＩＮＵＮ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により９４℃で３０
秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分のサイクルを３５回
繰り返し、１ｓｔ−ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣ
Ｒ産物の希釈液を鋳型とし、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３
１６配列由来のセンスプライマー３１６−Ｓ７（５’−
ＡＴＧ ＣＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＣＡ−
３’）とアンチセンスプライマー３１６−Ａ５（５’−
ＡＧＴ ＴＴＧ ＣＴＧＡＧＡ ＧＧＣ ＡＴＴ ＧＧ
−３’）を用いて、上述と同条件で２ｎｄ−ＰＣＲ反応
を行い、目的とする増幅ＤＮＡ断片を得た。さらに制限
酵素サイトを付加する目的で、２ｎｄ−ＰＣＲで得られ
た増幅ＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３
３１６配列由来のセンスプライマー３１６−Ｓ７（５’
−ＡＴＧＣＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＣＡ−
３’）とＸｈｏＩサイトを付加したアンチセンスプライ
マー３１６−Ａ４（５’−ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＧＡ Ｇ
ＣＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＣ
Ｃ ＴＴＧ−３’）を用いて、上述と同条件で３ｒｄ−
ＰＣＲ反応を行った。得られた増幅ＤＮＡ断片はｐＧＥ
Ｍ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に
定法に従いＴＡクローニングし、シークエンスによりＫ
Ｉ３１６のＣ末端側ｃＤＮＡであることを確認した。 （５−３）ＫＩ３１６発現ベクターの構築 Ｎ末端側とＣ末端側に２分割してクローニングしたｃＤ
ＮＡは重複領域中の制限酵素サイトＰｃｉＩを利用し、
発現ベクター上に完全長ｃＤＮＡとして組み込んだ。す
なわち、Ｎ末端側ｃＤＮＡが組み込まれたｐＧＥＭ−Ｔ
Ｅａｓｙを制限酵素ＡｌｗＮＩ消化、ｂｌｕｎｔｉｎ
ｇ Ｋｉｔ（宝酒造）による末端平滑化、制限酵素Ｐｃ
ｉＩ消化の順で処理することでＮ末端側ｃＤＮＡ断片を
得るとともに、Ｃ末端側ｃＤＮＡが組み込まれたｐＧＥ
Ｍ−Ｔ Ｅａｓｙを制限酵素ＰｃｉＩとＸｈｏＩで消化
し、Ｃ末端側ｃＤＮＡ断片を得た。両ｃＤＮＡ断片は発
現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＣＬＯＮＴＥＣ
Ｈ）の制限酵素サイトＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ間に３者ラ
イゲーションにより組み込むことで、完全長ｃＤＮＡと
して再構築した。さらにｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクタ
ー上のＸｈｏＩ−ＢｌｎＩサイト間の配列をｐＳｅｃＴ
ａｇ２−Ａ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のＸｈｏＩ−ＢｌｎＩ
サイト間の配列と入れ替えることでＣ末端にＨｉｓタグ
配列を付与した。こうして得られたＫＩ３１６（Ｃ末端
Ｈｉｓタグ）発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＭＨ
−ＫＩ３１６Ｉｇ（＋）には、全長２２３５塩基対の塩
基配列からなるｃＤＮＡが含まれていたが、人為的に付
加したＨｉｓタグ配列等を除くと、ＫＩ３１６蛋白質は
５７６アミノ酸配列（配列番号２）からなり、１７２８
塩基の塩基対からなるオープンリーディングフレームを
含む、全長２１５４塩基対の塩基配列（配列番号１）に
コードされていた。このＫＩ３１６発現プラスミドｐｃ
ＤＮＡ３．１（＋）ＭＨ−ＫＩ３１６Ｉｇ（＋）は、国
際微生物寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究
所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
８５９０として寄託されている。 （５−４）ＫＩ３１６蛋白質の相同性解析とモチーフ解
析 相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏ
ｌ．、Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２１５；４０３−１
０（１９９０））を用いて、局部的な配列の一致を検索
した。配列番号２で表されるＫＩ３１６アミノ酸配列
を、相同性検索を行うｂｌａｓｔｐプログラムを用いて
Ｇｅｎｂａｎｋ蛋白質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対しＢ
ＬＡＳＴ相同性検索を行った。その結果、７１番目から
５７２番の５００アミノ酸残基にわたって、ヒト未知遺
伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＥ００
６４６４）との相同性が６８％および同一性が５５％認
められ、３０１番目から４３９番の１３９アミノ酸残基
にわたって、ＵＴＩ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉ
ｏｎ：ＮＰ＿００１６２４．１）との相同性が５１％お
よび同一性が３４％みられた。また、重み行列を用いた
膜貫通予測プログラムｔｍａｐ （ＰｅｒｓｓｏｎＢ，
Ａｒｇｏｓ Ｐ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．
２３７；１８２−１９２ （１９９４））により膜貫通
ヘリックスの予測をおこなったところ、１３番目から４
１番目のアミノ酸残基の計２９残基においてシグナルペ
プチドと想定される膜貫通領域が予測された。また、Ｐ
ＳＩ−ＢＬＡＳＴのアルゴリズムを用いて、Ｐｆａｍ、
ＳＭＡＲＴデータベースを検索し（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．；ｈｔ
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍ
ｌ）、ドメインの予測を行ったところ、２２３番から２
９４番目のアミノ酸残基、計７２残基においてイムノグ
ロブリンドメインが、３２８番から３７８番目と３８６
番から４３６番のアミノ酸残基、各々５０残基にわたっ
てクニッツドメインが予測された。以上に述べたＫＩ３
１６およびＣ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６の構造の特徴
を図１に示す。
ニング （５−１）ＫＩ３１６Ｎ末端側ｃＤＮＡクローニング 上述のＥＳＴ情報検索により得られたＡＬ５３７４５０
配列をもとにセンスプライマー３１６−Ｓ１（５’−Ｃ
ＡＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＣＡＣ ＣＧＴ ＧＣＣ ＡＧ
−３’）を、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６配列をもと
にアンチセンスプライマー３１６−Ａ１（５’−ＣＴＧ
ＴＴＧ ＴＡＡ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＧＡ ＧＧ−
３’）を合成し、ヒト肺組織由来ＭＴＣパネル（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ）を鋳型にＰＬＡＴＩＮＵＮ Ｔａｑ ＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に
より９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の
サイクルを３５回繰り返し、１ｓｔ−ＰＣＲ反応を行っ
た。得られたＰＣＲ産物の希釈液を鋳型とし、ＡＬ５３
７４５０配列由来のセンスプライマー３１６−Ｓ２
（５’−ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＡＡ ＡＣＴ ＧＣＴ Ｔ
ＣＣ ＡＧ−３’）とＣ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６配
列由来のアンチセンスプライマー３１６−Ａ２（５’−
ＡＡＧ ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＧＧ ＴＴＡ ＣＧＧ Ｔ
Ｇ−３’）を用いて、上述と同条件で２ｎｄ−ＰＣＲ反
応を行った。得られた増幅断片はｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓ
ｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に定法に従いＴＡ
クローニングし、シークエンスによりＫＩ３１６のＮ末
端ｃＤＮＡであることを確認した。 （５−２）ＫＩ３１６Ｃ末端側ｃＤＮＡクローニング Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６配列由来のセンスプライ
マー３１６−Ｓ６（５’−ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＣＣ Ｇ
ＣＴ ＡＣＡ ＴＧＧ ＡＣ−３’）とアンチセンスプ
ライマー３１６−Ａ６（５’−ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＴＴ
ＣＣＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＣＣ−３’）を合成し、ヒ
ト肺組織由来ＭＴＣパネル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型
にＰＬＡＴＩＮＵＮ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により９４℃で３０
秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分のサイクルを３５回
繰り返し、１ｓｔ−ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣ
Ｒ産物の希釈液を鋳型とし、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３３
１６配列由来のセンスプライマー３１６−Ｓ７（５’−
ＡＴＧ ＣＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＣＡ−
３’）とアンチセンスプライマー３１６−Ａ５（５’−
ＡＧＴ ＴＴＧ ＣＴＧＡＧＡ ＧＧＣ ＡＴＴ ＧＧ
−３’）を用いて、上述と同条件で２ｎｄ−ＰＣＲ反応
を行い、目的とする増幅ＤＮＡ断片を得た。さらに制限
酵素サイトを付加する目的で、２ｎｄ−ＰＣＲで得られ
た増幅ＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｃ−ＮＴＯＮＧ２００３
３１６配列由来のセンスプライマー３１６−Ｓ７（５’
−ＡＴＧＣＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＣＡ−
３’）とＸｈｏＩサイトを付加したアンチセンスプライ
マー３１６−Ａ４（５’−ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＧＡ Ｇ
ＣＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＣ
Ｃ ＴＴＧ−３’）を用いて、上述と同条件で３ｒｄ−
ＰＣＲ反応を行った。得られた増幅ＤＮＡ断片はｐＧＥ
Ｍ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に
定法に従いＴＡクローニングし、シークエンスによりＫ
Ｉ３１６のＣ末端側ｃＤＮＡであることを確認した。 （５−３）ＫＩ３１６発現ベクターの構築 Ｎ末端側とＣ末端側に２分割してクローニングしたｃＤ
ＮＡは重複領域中の制限酵素サイトＰｃｉＩを利用し、
発現ベクター上に完全長ｃＤＮＡとして組み込んだ。す
なわち、Ｎ末端側ｃＤＮＡが組み込まれたｐＧＥＭ−Ｔ
Ｅａｓｙを制限酵素ＡｌｗＮＩ消化、ｂｌｕｎｔｉｎ
ｇ Ｋｉｔ（宝酒造）による末端平滑化、制限酵素Ｐｃ
ｉＩ消化の順で処理することでＮ末端側ｃＤＮＡ断片を
得るとともに、Ｃ末端側ｃＤＮＡが組み込まれたｐＧＥ
Ｍ−Ｔ Ｅａｓｙを制限酵素ＰｃｉＩとＸｈｏＩで消化
し、Ｃ末端側ｃＤＮＡ断片を得た。両ｃＤＮＡ断片は発
現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＣＬＯＮＴＥＣ
Ｈ）の制限酵素サイトＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ間に３者ラ
イゲーションにより組み込むことで、完全長ｃＤＮＡと
して再構築した。さらにｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクタ
ー上のＸｈｏＩ−ＢｌｎＩサイト間の配列をｐＳｅｃＴ
ａｇ２−Ａ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のＸｈｏＩ−ＢｌｎＩ
サイト間の配列と入れ替えることでＣ末端にＨｉｓタグ
配列を付与した。こうして得られたＫＩ３１６（Ｃ末端
Ｈｉｓタグ）発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＭＨ
−ＫＩ３１６Ｉｇ（＋）には、全長２２３５塩基対の塩
基配列からなるｃＤＮＡが含まれていたが、人為的に付
加したＨｉｓタグ配列等を除くと、ＫＩ３１６蛋白質は
５７６アミノ酸配列（配列番号２）からなり、１７２８
塩基の塩基対からなるオープンリーディングフレームを
含む、全長２１５４塩基対の塩基配列（配列番号１）に
コードされていた。このＫＩ３１６発現プラスミドｐｃ
ＤＮＡ３．１（＋）ＭＨ−ＫＩ３１６Ｉｇ（＋）は、国
際微生物寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究
所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
８５９０として寄託されている。 （５−４）ＫＩ３１６蛋白質の相同性解析とモチーフ解
析 相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏ
ｌ．、Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２１５；４０３−１
０（１９９０））を用いて、局部的な配列の一致を検索
した。配列番号２で表されるＫＩ３１６アミノ酸配列
を、相同性検索を行うｂｌａｓｔｐプログラムを用いて
Ｇｅｎｂａｎｋ蛋白質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対しＢ
ＬＡＳＴ相同性検索を行った。その結果、７１番目から
５７２番の５００アミノ酸残基にわたって、ヒト未知遺
伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＥ００
６４６４）との相同性が６８％および同一性が５５％認
められ、３０１番目から４３９番の１３９アミノ酸残基
にわたって、ＵＴＩ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉ
ｏｎ：ＮＰ＿００１６２４．１）との相同性が５１％お
よび同一性が３４％みられた。また、重み行列を用いた
膜貫通予測プログラムｔｍａｐ （ＰｅｒｓｓｏｎＢ，
Ａｒｇｏｓ Ｐ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．
２３７；１８２−１９２ （１９９４））により膜貫通
ヘリックスの予測をおこなったところ、１３番目から４
１番目のアミノ酸残基の計２９残基においてシグナルペ
プチドと想定される膜貫通領域が予測された。また、Ｐ
ＳＩ−ＢＬＡＳＴのアルゴリズムを用いて、Ｐｆａｍ、
ＳＭＡＲＴデータベースを検索し（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．；ｈｔ
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍ
ｌ）、ドメインの予測を行ったところ、２２３番から２
９４番目のアミノ酸残基、計７２残基においてイムノグ
ロブリンドメインが、３２８番から３７８番目と３８６
番から４３６番のアミノ酸残基、各々５０残基にわたっ
てクニッツドメインが予測された。以上に述べたＫＩ３
１６およびＣ−ＮＴＯＮＧ２００３３１６の構造の特徴
を図１に示す。
【００８８】実施例２ ＲＴ−ＰＣＲを用いた発現プロ
ファイルの解析 定法に従いＲＴ−ＰＣＲによるＫＩ３１６の組織発現プ
ロファイル解析を行った。解析に用いたヒトＲＮＡは以
下の通りである。ヒト冠状動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥ
Ｃ；ＴＡＫＡＲＡ社）及びヒト冠状動脈血管平滑筋細胞
（ＣＡＳＭＣ；ＴＡＫＡＲＡ社）から定法により全ＲＮ
Ａを抽出し、さらにｍＲＮＡを調製した。また、ヒト末
梢血由来白血球を５０μｇ／ｍｌのＰＨＡ存在下あるい
は非存在下で５時間培養した後に全ＲＮＡを定法により
抽出し、ｍＲＮＡを調製した。さらにヒトの肺、膵臓、
心臓、副腎、精巣、胎児肝臓、胎児腎臓、脳のｍＲＮＡ
および腎臓、肝臓、小腸、胸腺、脾臓の全ＲＮＡをＣＬ
ＯＮＴＥＣＨ社より購入し、全ＲＮＡで購入したものは
ｍＲＮＡを調製した。大腸のｍＲＮＡはＳＴＲＡＴＡＧ
ＥＮＥ社より購入した。次に、これら各ｍＲＮＡ０．１
２μｇ（白血球については全ＲＮＡ６μｇ）よりオリゴ
ｄＴプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡの合成を定法に
従って行った。逆転写酵素としてはＳｕｐｅｒＳｃｒｉ
ｐｔＩＩＲＮａｓｅ Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
また、ＰＣＲに用いたＫＩ３１６特異的なプライマーの
配列はセンスプライマーＭＣＤ０３０−Ｆ３（５’−Ｃ
ＴＴ ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＣＣＡＧＡ ＣＧＧ Ｇ−
３’）、アンチセンスプライマーＭＣＤ０３０−Ｒ３
（５’−ＴＧＴ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＡＣ Ｇ
ＡＡ ＧＣ−３’）である。解析した結果、ＫＩ３１６
は白血球・活性化白血球で強く発現していた。以上に述
べた結果を図２に示す。
ファイルの解析 定法に従いＲＴ−ＰＣＲによるＫＩ３１６の組織発現プ
ロファイル解析を行った。解析に用いたヒトＲＮＡは以
下の通りである。ヒト冠状動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥ
Ｃ；ＴＡＫＡＲＡ社）及びヒト冠状動脈血管平滑筋細胞
（ＣＡＳＭＣ；ＴＡＫＡＲＡ社）から定法により全ＲＮ
Ａを抽出し、さらにｍＲＮＡを調製した。また、ヒト末
梢血由来白血球を５０μｇ／ｍｌのＰＨＡ存在下あるい
は非存在下で５時間培養した後に全ＲＮＡを定法により
抽出し、ｍＲＮＡを調製した。さらにヒトの肺、膵臓、
心臓、副腎、精巣、胎児肝臓、胎児腎臓、脳のｍＲＮＡ
および腎臓、肝臓、小腸、胸腺、脾臓の全ＲＮＡをＣＬ
ＯＮＴＥＣＨ社より購入し、全ＲＮＡで購入したものは
ｍＲＮＡを調製した。大腸のｍＲＮＡはＳＴＲＡＴＡＧ
ＥＮＥ社より購入した。次に、これら各ｍＲＮＡ０．１
２μｇ（白血球については全ＲＮＡ６μｇ）よりオリゴ
ｄＴプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡの合成を定法に
従って行った。逆転写酵素としてはＳｕｐｅｒＳｃｒｉ
ｐｔＩＩＲＮａｓｅ Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
また、ＰＣＲに用いたＫＩ３１６特異的なプライマーの
配列はセンスプライマーＭＣＤ０３０−Ｆ３（５’−Ｃ
ＴＴ ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＣＣＡＧＡ ＣＧＧ Ｇ−
３’）、アンチセンスプライマーＭＣＤ０３０−Ｒ３
（５’−ＴＧＴ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＡＣ Ｇ
ＡＡ ＧＣ−３’）である。解析した結果、ＫＩ３１６
は白血球・活性化白血球で強く発現していた。以上に述
べた結果を図２に示す。
【００８９】実施例３ ＫＩ３１６の分泌発現
実施例１で得られた発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１
（＋）ＭＨ−ＫＩ３１６Ｉｇ（＋）を、以下の方法でＣ
ＯＳ細胞に導入した。即ち、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・
ダイアグノスティックス社）５０μｌと上記プラスミド
ＤＮＡ１２．５μｇとを添付プロトコールに従い混合
し、１５０ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖
したＣＯＳ細胞に添加した。５％ＣＯ２存在下、３７℃
で３日間培養した後に培養上清を回収した。培養上清中
に含まれるＫＩ３１６分泌タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
電気泳動後、抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ・Ｈｉｓ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ；ＱＩＡＧＥＮおよびペルオキシダーゼ標
識抗マウスイムノグロブリン抗体；ＤＡＫＯ）を用いて
ウエスタンブロッティングにて検出することで、ＫＩ３
１６の分泌発現を確認した。以上に述べた結果を図３に
示す。
（＋）ＭＨ−ＫＩ３１６Ｉｇ（＋）を、以下の方法でＣ
ＯＳ細胞に導入した。即ち、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・
ダイアグノスティックス社）５０μｌと上記プラスミド
ＤＮＡ１２．５μｇとを添付プロトコールに従い混合
し、１５０ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖
したＣＯＳ細胞に添加した。５％ＣＯ２存在下、３７℃
で３日間培養した後に培養上清を回収した。培養上清中
に含まれるＫＩ３１６分泌タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
電気泳動後、抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ・Ｈｉｓ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ；ＱＩＡＧＥＮおよびペルオキシダーゼ標
識抗マウスイムノグロブリン抗体；ＤＡＫＯ）を用いて
ウエスタンブロッティングにて検出することで、ＫＩ３
１６の分泌発現を確認した。以上に述べた結果を図３に
示す。
【００９０】実施例４ ＫＩ３１６の精製
ＫＩ３１６の精製を行うため、上述と同様の方法でＫＩ
３１６を発現させた培養上精を用意し、Ｎｉ−ＮＴＡ
（ＱＩＡＧＥＮ）による精製を行った。すなわち、培養
上清をＮｉ−ＮＴＡカラムにアプライしたのち、ＰＢＳ
（−）（ＳＩＧＭＡ）、５ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ
（−）、１０ｍＭイミダゾール／ＰＢＳの順でカラム洗
浄を行い、５０ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ（−）にてＫ
Ｉ３１６を溶出した。各精製段階で得られた画分を定法
に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳同に供し、銀染色ＩＩキ
ットワコー（和光純薬工業）にて銀染色を行い、ＫＩ３
１６の精製を確認した。得られたＫＩ３１６蛋白質溶液
はビバポア１０／２０（７５００ＭＷＣＯ；ザルトリウ
ス）を用いて濃縮し、ＰＢＳ（−）、生理食塩水（大塚
製薬）に対して十分な透析を行い、最終精製標品とし
た。以上に述べた結果を図４に示す。
３１６を発現させた培養上精を用意し、Ｎｉ−ＮＴＡ
（ＱＩＡＧＥＮ）による精製を行った。すなわち、培養
上清をＮｉ−ＮＴＡカラムにアプライしたのち、ＰＢＳ
（−）（ＳＩＧＭＡ）、５ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ
（−）、１０ｍＭイミダゾール／ＰＢＳの順でカラム洗
浄を行い、５０ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ（−）にてＫ
Ｉ３１６を溶出した。各精製段階で得られた画分を定法
に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳同に供し、銀染色ＩＩキ
ットワコー（和光純薬工業）にて銀染色を行い、ＫＩ３
１６の精製を確認した。得られたＫＩ３１６蛋白質溶液
はビバポア１０／２０（７５００ＭＷＣＯ；ザルトリウ
ス）を用いて濃縮し、ＰＢＳ（−）、生理食塩水（大塚
製薬）に対して十分な透析を行い、最終精製標品とし
た。以上に述べた結果を図４に示す。
【００９１】実施例５ 抗ＫＩ３１６抗体の作製
【００９２】（１）ＫＩ３１６の部分ペプチドの調製
ＫＩ３１６に対する抗体を作製するため、ＫＩ３１６の
Ｎ末端及びＣ末端の配列あるいはＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａ
ｎ及びＲｏｂｓｏｎの２次構造予測プログラムを用いて
解析を行い、親水性が高く構造的にはαヘリックスを含
むなど蛋白質表面に露出しているであろう配列を選び出
し、合成を行う。ペプチドの合成はＭｏｄｅｌ ４３３
Ａペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシステム
ズ ジャパン株式会社）を用いて、キャリア蛋白と結合
できるようにするため、Ｃ端にシステインを付加し合成
する。定法により樹脂よりペプチドの切り出し脱保護を
行い、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（ＣＡＰＤＥＬＬ−ＰＡＫ、
資生堂）を用いて精製を行う。
Ｎ末端及びＣ末端の配列あるいはＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａ
ｎ及びＲｏｂｓｏｎの２次構造予測プログラムを用いて
解析を行い、親水性が高く構造的にはαヘリックスを含
むなど蛋白質表面に露出しているであろう配列を選び出
し、合成を行う。ペプチドの合成はＭｏｄｅｌ ４３３
Ａペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシステム
ズ ジャパン株式会社）を用いて、キャリア蛋白と結合
できるようにするため、Ｃ端にシステインを付加し合成
する。定法により樹脂よりペプチドの切り出し脱保護を
行い、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（ＣＡＰＤＥＬＬ−ＰＡＫ、
資生堂）を用いて精製を行う。
【００９３】（２）ＫＩ３１６のペプチド免疫抗原の調
製 合成したペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍｌに溶解し、
１０ｍｇ／ｍｌのマレイミド化キーホールリンペットヘ
モシアニン（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合を行う。室温で
２時間反応後、ＮＡＰ−１０カラム（アマシャム ファ
ルマシアバイオテク）で脱塩する。蛋白濃度は使用した
ＫＬＨ量を液量で割ったものを用い、算出する。
製 合成したペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍｌに溶解し、
１０ｍｇ／ｍｌのマレイミド化キーホールリンペットヘ
モシアニン（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合を行う。室温で
２時間反応後、ＮＡＰ−１０カラム（アマシャム ファ
ルマシアバイオテク）で脱塩する。蛋白濃度は使用した
ＫＬＨ量を液量で割ったものを用い、算出する。
【００９４】（３）ＫＩ３１６抗体の作製
（３−１）ポリクローナル抗体の作製
ＫＩ３１６に対するウサギポリクローナル抗体を作製す
るため、調製した各ペプチド抗原をそれぞれ各４０μｇ
ずつ混合し、０．５ｍｌとする。その後、等量のフロイ
ンド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混合し、ウサギ
の背部皮下に投与を行う。２週間後、同量をフロインド
不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混合したものを投
与し、２週間後耳静脈より採血し抗血清を調製する。同
様に実施例４で精製したＫＩ３１６を３０μｇ／ｂｏｄ
ｙで投与し、抗血清を作製する。 （３−２）ペプチド抗体の作製 調製した各ペプチドキャリア抗原２０μｇを１００μｌ
の生理食塩水に溶解し、フロインド完全アジュバントと
等量混合を行う。ＢＡＬＢ／ｃマウス５週齢メスの腹腔
に投与し、２週間後ペプチドキャリア抗原２０μｇを１
００μｌの生理食塩水に溶解し、フロインド不完全アジ
ュバントと等量混合し同様に腹腔に投与する。１週間後
眼底より採血を行い、抗体価の上昇をウエスタンブロッ
ティングにより確認する。すなわち組換えＫＩ３１６蛋
白質を４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｔ
ＥＦＣＯ）にて電気泳動し、ミリポア社の方法にしたが
ってＰＶＤＦ膜に転写する。転写後５％スキンミルク、
０．０５％ツイーン２０を含む０．０７６Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．４）（以下Ｔ−ＰＢＳと記載）にてブロッ
キングを行う。採血した抗血清を０．５％ＢＳＡを含む
Ｔ−ＰＢＳで５００倍に希釈し、転写したＰＶＤＦ膜と
４℃で一夜反応させる。メンブレンをＴ−ＰＢＳで３回
洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリ
ン抗体（ＤＡＫＯ）を０．５％ＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳ
で５００倍に希釈し、メンブレンと室温で１時間反応さ
せる。その後、メンブレンをＴ−ＰＢＳで３回洗浄後、
ＥＣＬ（アマシャム ファルマシアバイオテク）で検出
する。以上の操作で抗体価の上昇を確認し、抗原の最終
投与３日後、脾細胞よりリンパ球を分離し、Ｓｐ２／Ｏ
−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１５８１）と混合
後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈
／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社）にした
がって細胞融合を行う。ＨＡＴ培地によりハイブリドー
マを選択し、１週間後に目的の抗体を産生しているハイ
ブリドーマのスクリーニングを行う。０．０１Ｍ炭緩衝
液（ｐＨ９．５）を用い、実施例４で精製したＫＩ３１
６を１μｇ／ｍｌに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉ
ｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μｌ／ウエル添加する。３
７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．
５％ＢＳＡを含む０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
４）（以下ＰＢＳと記載）を各ウエルに１００μｌ添加
し、ブロッキングを行う。次に培養上清を各ウエルに添
加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％ツイー
ン２０を含む生理食塩水で３回洗浄する。ペルオキシダ
ーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を１０％ウサギ
血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し各ウエルに５０
μｌ添加した。３７℃で１時間反応後、０．０５％ツイ
ーン２０を含む生理食塩水で５回洗浄し０．０１％過酸
化水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに
添加する。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で
反応を停止する。プレート分光光度計（ＮＪ−２１０
０、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定
する。この結果をもとに、ＫＩ３１６と反応する細胞を
選択し、限界希釈法によりクローニングを行う。１０日
後、同様にスクリーニングを行い、ＫＩ３１６と反応す
る抗体を産生するクローンを取得することができる。選
択したハイブリドーマは１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４
０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養後、Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養
し抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポ
ア）を用いて抗体を精製する。 （３−３）抗ＫＩ３１６モノクローナル抗体の作製 ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６週令）の腹腔に精製した
ＫＩ３１６蛋白質２０μｇをフロインド完全アジュバン
トと等量混合して投与する。初回投与２週間後に抗原２
０μｇを生理食塩水に溶解し、フロインド不完全アジュ
バントと等量混合後腹腔に投与する。さらに１週間後、
抗体価の上昇を上記（３−２）記載の方法により確認
し、最終投与を行う。マウスの腹腔に抗原１００μｇを
投与し、３日後、脾臓を摘出する。脾臓よりリンパ球を
分離し、Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ・１と１０：１で混
合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行
う。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間
後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリー
ニングを行う。（３−２）に記載の方法により抗ＫＩ３
１６抗体産生ウエルのスクリーニングを行い、ＫＩ３１
６と反応したウエルを限界希釈法によりクローニング
し、再度スクリーニングを行って抗ＫＩ３１６モノクロ
ーナル抗体１を取得することができる。ハイブリドーマ
を１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、抗体を産生させ、
Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポア）を用いて抗体を精
製する。
るため、調製した各ペプチド抗原をそれぞれ各４０μｇ
ずつ混合し、０．５ｍｌとする。その後、等量のフロイ
ンド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混合し、ウサギ
の背部皮下に投与を行う。２週間後、同量をフロインド
不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混合したものを投
与し、２週間後耳静脈より採血し抗血清を調製する。同
様に実施例４で精製したＫＩ３１６を３０μｇ／ｂｏｄ
ｙで投与し、抗血清を作製する。 （３−２）ペプチド抗体の作製 調製した各ペプチドキャリア抗原２０μｇを１００μｌ
の生理食塩水に溶解し、フロインド完全アジュバントと
等量混合を行う。ＢＡＬＢ／ｃマウス５週齢メスの腹腔
に投与し、２週間後ペプチドキャリア抗原２０μｇを１
００μｌの生理食塩水に溶解し、フロインド不完全アジ
ュバントと等量混合し同様に腹腔に投与する。１週間後
眼底より採血を行い、抗体価の上昇をウエスタンブロッ
ティングにより確認する。すなわち組換えＫＩ３１６蛋
白質を４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｔ
ＥＦＣＯ）にて電気泳動し、ミリポア社の方法にしたが
ってＰＶＤＦ膜に転写する。転写後５％スキンミルク、
０．０５％ツイーン２０を含む０．０７６Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．４）（以下Ｔ−ＰＢＳと記載）にてブロッ
キングを行う。採血した抗血清を０．５％ＢＳＡを含む
Ｔ−ＰＢＳで５００倍に希釈し、転写したＰＶＤＦ膜と
４℃で一夜反応させる。メンブレンをＴ−ＰＢＳで３回
洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリ
ン抗体（ＤＡＫＯ）を０．５％ＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳ
で５００倍に希釈し、メンブレンと室温で１時間反応さ
せる。その後、メンブレンをＴ−ＰＢＳで３回洗浄後、
ＥＣＬ（アマシャム ファルマシアバイオテク）で検出
する。以上の操作で抗体価の上昇を確認し、抗原の最終
投与３日後、脾細胞よりリンパ球を分離し、Ｓｐ２／Ｏ
−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１５８１）と混合
後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈
／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社）にした
がって細胞融合を行う。ＨＡＴ培地によりハイブリドー
マを選択し、１週間後に目的の抗体を産生しているハイ
ブリドーマのスクリーニングを行う。０．０１Ｍ炭緩衝
液（ｐＨ９．５）を用い、実施例４で精製したＫＩ３１
６を１μｇ／ｍｌに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉ
ｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μｌ／ウエル添加する。３
７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．
５％ＢＳＡを含む０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
４）（以下ＰＢＳと記載）を各ウエルに１００μｌ添加
し、ブロッキングを行う。次に培養上清を各ウエルに添
加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％ツイー
ン２０を含む生理食塩水で３回洗浄する。ペルオキシダ
ーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を１０％ウサギ
血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し各ウエルに５０
μｌ添加した。３７℃で１時間反応後、０．０５％ツイ
ーン２０を含む生理食塩水で５回洗浄し０．０１％過酸
化水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに
添加する。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で
反応を停止する。プレート分光光度計（ＮＪ−２１０
０、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定
する。この結果をもとに、ＫＩ３１６と反応する細胞を
選択し、限界希釈法によりクローニングを行う。１０日
後、同様にスクリーニングを行い、ＫＩ３１６と反応す
る抗体を産生するクローンを取得することができる。選
択したハイブリドーマは１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４
０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養後、Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養
し抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポ
ア）を用いて抗体を精製する。 （３−３）抗ＫＩ３１６モノクローナル抗体の作製 ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６週令）の腹腔に精製した
ＫＩ３１６蛋白質２０μｇをフロインド完全アジュバン
トと等量混合して投与する。初回投与２週間後に抗原２
０μｇを生理食塩水に溶解し、フロインド不完全アジュ
バントと等量混合後腹腔に投与する。さらに１週間後、
抗体価の上昇を上記（３−２）記載の方法により確認
し、最終投与を行う。マウスの腹腔に抗原１００μｇを
投与し、３日後、脾臓を摘出する。脾臓よりリンパ球を
分離し、Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ・１と１０：１で混
合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行
う。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間
後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリー
ニングを行う。（３−２）に記載の方法により抗ＫＩ３
１６抗体産生ウエルのスクリーニングを行い、ＫＩ３１
６と反応したウエルを限界希釈法によりクローニング
し、再度スクリーニングを行って抗ＫＩ３１６モノクロ
ーナル抗体１を取得することができる。ハイブリドーマ
を１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、抗体を産生させ、
Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポア）を用いて抗体を精
製する。
【００９５】実施例６ ＫＩ３１６の活性測定
ＫＩ３１６の生物活性は以下に示す活性測定系（現在実
施中）によって観察できる。これらの方法は、ＫＩ３１
６が作用する因子、生理機構等の解明、ＫＩ３１６類似
蛋白質の探索・同定に有用であるのみならず、ＫＩ３１
６の生物活性を阻害する物質、例えば中和抗体や、ＫＩ
３１６の生物活性を模倣する物質、例えばプロテアーゼ
阻害化合物等の医薬品候補物質の発見にも有用である。 セリンプロテアーゼ類の酵素阻害アッセイ セリンプロテアーゼ類は、その活性中心ポケット（オキ
シアニオンホール）の形状からエラスターゼ型、キモト
リプシン型、トリプシン型に分類できる。ＫＩ３１６が
どのタイプのセリンプロテアーゼを阻害するかを検討す
るために、合成基質を用いた酵素阻害アッセイを実施し
た。ヒト喀痰エラスターゼ（フナコシ）、ヒト膵キモト
リプシン（コスモバイオ）、ヒト膵トリプシン（コスモ
バイオ）に対する阻害活性を、合成エラスターゼ基質
（ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｖａｌ−ｐ
ＮＡ、コスモバイオ）、合成キモトリプシン基質（Ｓ−
２５８６、第一化学薬品）、合成トリプシン基質（Ｓ−
２２２２、第一化学薬品）を用いてそれぞれ検討した。
酵素濃度は，エラスターゼ２０ｎｇ／ｍＬ、キモトリプ
シン３ｎｇ／ｍＬ、トリプシン３ｎｇ／ｍＬとし、合成
基質濃度は全て０．１ｍＭとした。エラスターゼ基質の
みは溶解性が低いため５０％ＤＭＳＯ溶液として調製
し、アッセイ時のＤＭＳＯ終濃度が５％となるように添
加した。ＫＩ３１６は、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ
２、０．１％牛血清アルブミンを含む緩衝液（以下、緩
衝液Ａ）の溶液として終濃度３〜１００μｇ／ｍＬに調
製し、酵素添加後３７℃、５分間プレインキュベーショ
ンしたのち、各合成基質を添加して３７℃、９０分間イ
ンキュベートした。９０分後にアッセイ系と等量の２０
％酢酸を添加して反応を停止し、４０５ｎｍでの吸光度
を測定した。ＫＩ３１６の酵素阻害率（％）はＫＩ３１
６非存在下での吸光度を１００％、酵素非存在下での吸
光度を０％として、２点測定の平均値として算出した。
以上より得られた濃度〜阻害率曲線からプロビット法を
用いてＫＩ３１６の５０％阻害濃度（μｇ／ｍＬ）を求
め、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から得られた推定分
子量７０ｋＤａで除して５０％阻害モル濃度（ＩＣ５０
値、ｎＭ）を求めた。各酵素に対するＩＣ５０値を表１
に示す。ＫＩ３１６はエラスターゼ、キモトリプシン、
トリプシンのいずれに対しても阻害活性を示した。
施中）によって観察できる。これらの方法は、ＫＩ３１
６が作用する因子、生理機構等の解明、ＫＩ３１６類似
蛋白質の探索・同定に有用であるのみならず、ＫＩ３１
６の生物活性を阻害する物質、例えば中和抗体や、ＫＩ
３１６の生物活性を模倣する物質、例えばプロテアーゼ
阻害化合物等の医薬品候補物質の発見にも有用である。 セリンプロテアーゼ類の酵素阻害アッセイ セリンプロテアーゼ類は、その活性中心ポケット（オキ
シアニオンホール）の形状からエラスターゼ型、キモト
リプシン型、トリプシン型に分類できる。ＫＩ３１６が
どのタイプのセリンプロテアーゼを阻害するかを検討す
るために、合成基質を用いた酵素阻害アッセイを実施し
た。ヒト喀痰エラスターゼ（フナコシ）、ヒト膵キモト
リプシン（コスモバイオ）、ヒト膵トリプシン（コスモ
バイオ）に対する阻害活性を、合成エラスターゼ基質
（ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｖａｌ−ｐ
ＮＡ、コスモバイオ）、合成キモトリプシン基質（Ｓ−
２５８６、第一化学薬品）、合成トリプシン基質（Ｓ−
２２２２、第一化学薬品）を用いてそれぞれ検討した。
酵素濃度は，エラスターゼ２０ｎｇ／ｍＬ、キモトリプ
シン３ｎｇ／ｍＬ、トリプシン３ｎｇ／ｍＬとし、合成
基質濃度は全て０．１ｍＭとした。エラスターゼ基質の
みは溶解性が低いため５０％ＤＭＳＯ溶液として調製
し、アッセイ時のＤＭＳＯ終濃度が５％となるように添
加した。ＫＩ３１６は、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ
２、０．１％牛血清アルブミンを含む緩衝液（以下、緩
衝液Ａ）の溶液として終濃度３〜１００μｇ／ｍＬに調
製し、酵素添加後３７℃、５分間プレインキュベーショ
ンしたのち、各合成基質を添加して３７℃、９０分間イ
ンキュベートした。９０分後にアッセイ系と等量の２０
％酢酸を添加して反応を停止し、４０５ｎｍでの吸光度
を測定した。ＫＩ３１６の酵素阻害率（％）はＫＩ３１
６非存在下での吸光度を１００％、酵素非存在下での吸
光度を０％として、２点測定の平均値として算出した。
以上より得られた濃度〜阻害率曲線からプロビット法を
用いてＫＩ３１６の５０％阻害濃度（μｇ／ｍＬ）を求
め、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から得られた推定分
子量７０ｋＤａで除して５０％阻害モル濃度（ＩＣ５０
値、ｎＭ）を求めた。各酵素に対するＩＣ５０値を表１
に示す。ＫＩ３１６はエラスターゼ、キモトリプシン、
トリプシンのいずれに対しても阻害活性を示した。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【発明の効果】本発明のＫＩ３１６は、炎症性疾患の発
症あるいは進行に対してその原因となり得る蛋白質であ
り、炎症性疾患等の予防あるいは治療のための医薬品の
開発において、極めて有用である。
症あるいは進行に対してその原因となり得る蛋白質であ
り、炎症性疾患等の予防あるいは治療のための医薬品の
開発において、極めて有用である。
【００９８】また、遺伝子ｋｉ３１６は、アンチセンス
医薬品として、また遺伝子治療において利用することが
でき、蛋白質ＫＩ３１６は、それ自体あるいはその断片
（クニッツドメイン）を作製することにより可溶性蛋白
医薬品として有用である。さらに、ＫＩ３１６またはそ
の断片に反応性を有する抗体及びその抗体の一部、ま
た、ＫＩ３１６のセリンプロテアーゼ阻害活性を修飾す
る低分子化合物は、生体内でのＫＩ３１６機能を制御す
る医薬品として有用である。
医薬品として、また遺伝子治療において利用することが
でき、蛋白質ＫＩ３１６は、それ自体あるいはその断片
（クニッツドメイン）を作製することにより可溶性蛋白
医薬品として有用である。さらに、ＫＩ３１６またはそ
の断片に反応性を有する抗体及びその抗体の一部、ま
た、ＫＩ３１６のセリンプロテアーゼ阻害活性を修飾す
る低分子化合物は、生体内でのＫＩ３１６機能を制御す
る医薬品として有用である。
【００９９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<120> Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
<120> Helix Research Instutute Co., Ltd.
<130> Kunitz Type Serine Protease Inhibitor
<160> 8
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 2154
<212> DNA
<400> 1
gctgcctaaa ctgcttccag cttctttttt ttttttcccc ccttctgcaa taagtctgtg 60
atcagccacg ggacagaggc gccagcagcc tgcctgtgac aggcatcagg ttagctggct 120
cccactcggg tggcgcgccc aggatataaa tccgggcgcg ggcccctgct gtggctcctc 180
tccctgcaca ctcaggagag ggagcttcct tctaaagacc tttcttttat ctgaagccgc 240
acagcccggc aggctgtgct gacttggtgg aggcagcagc ggcagagcag cctgagcagc 300
agcctgagca ggaaacctgc tggggtgggg agggcaggtg tctgcagccc ctgagaagaa 360
ggccctggtg ggccccagac cctggcatcg tttcagggga ggtctttagc cgccccagcc 420
tgcaccatgt gggccccaag gtgtcgccgg ttctggtctc gctgggagca ggtggcagcg 480
ctgctgctgc tgctgctact gctcggggtg cccccgcgaa gcctggcgct gccgcccatc 540
cgctattccc acgccggcat ctgccccaac gacatgaatc ccaacctctg ggtggacgca 600
cagagtacct gcaggcggga gtgtgaggcg gaccaggagt gtgagaccta tgagaagtgc 660
tgccccaacg tatgtgggac caagagctgc gtggcggccc gctacatgga cgtgaaaggg 720
aagaagggcc cagtgggcat gcccaaggag gccacatgtg accacttcat gtgtctgcag 780
cagggctctg agtgtgacat ctgggatggc cagcccgtgt gtaagtgcaa agaccgctgt 840
gagaaggagc ccagctttac ctgcgcctcg gacggcctca cctactataa ccgctgctac 900
atggatgccg aggcctgctc caaaggcatc acactggccg ttgtaacctg ccgctatcac 960
ttcacctggc ccaacaccag ccccccacca cctgagacca ccatgcaccc caccacagcc 1020
tccccagaga cccctgagct ggacatggcg gcccctgcgc tgctcaacaa ccctgtgcac 1080
cagtcggtca ccatgggtga gacagtgagc ttcctctgtg atgtggtggg ccggccccgg 1140
cctgagatca cctgggagaa gcagttggag gatcgggaga atgtggtcat gcggcccaac 1200
catgtgcgtg gcaacgtggt ggtcaccaac attgcccagc tggtcatcta taacgcccag 1260
ctgcaggatg ctgggatcta cacctgcacg gcccggaacg tggctggggt cctgagggct 1320
gatttcccgc tgtcggtggt caggggtcat caggctgcag ccacctcaga gagcagcccc 1380
aatggcacgg ctttcccggc ggccgagtgc ctgaagcccc cagacagtga ggactgtggc 1440
gaagagcaga cccgctggca cttcgatgcc caggccaaca actgcctgac cttcaccttc 1500
ggccactgcc accgtaacct caaccacttt gagacctatg aggcctgcat gctggcctgc 1560
atgagcgggc cgctggccgc gtgcagcctg cccgccctgc aggggccctg caaagcctac 1620
gcgcctcgct gggcttacaa cagccagacg ggccagtgcc agtcctttgt ctatggtggc 1680
tgcgagggca atggcaacaa ctttgagagc cgtgaggcct gtgaggagtc gtgccccttc 1740
cccaggggga accagcgctg tcgggcctgc aagcctcggc agaagctcgt taccagcttc 1800
tgtcgcagcg actttgtcat cctgggccga gtctctgagc tgaccgagga gcctgactcg 1860
ggccgcgccc tggtgactgt ggatgaggtc ctaaaggatg agaaaatggg cctcaagttc 1920
ctgggccagg agccattgga ggtcactctg cttcacgtgg actgggcatg cccctgcccc 1980
aacgtgaccg tgagcgagat gccgctcatc atcatggggg aggtggacgg cggcatggcc 2040
atgctgcgcc ccgatagctt tgtgggcgca tcgagtgccc gccgggtcag gaagcttcgt 2100
gaggtcatgc acaagaagac ctgtgacgtc ctcaaggagt ttcttggctt gcac 2154
<210> 2
<211> 576
<212> PRT
<400> 2
Met Trp Ala Pro Arg Cys Arg Arg Phe Trp Ser Arg Trp Glu Gln Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Pro Pro Arg Ser
20 25 30
Leu Ala Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn
35 40 45
Asp Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Arg Arg
50 55 60
Glu Cys Glu Ala Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro
65 70 75 80
Asn Val Cys Gly Thr Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val
85 90 95
Lys Gly Lys Lys Gly Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp
100 105 110
His Phe Met Cys Leu Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly
115 120 125
Gln Pro Val Cys Lys Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe
130 135 140
Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp
145 150 155 160
Ala Glu Ala Cys Ser Lys Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg
165 170 175
Tyr His Phe Thr Trp Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr
180 185 190
Met His Pro Thr Thr Ala Ser Pro Glu Thr Pro Glu Leu Asp Met Ala
195 200 205
Ala Pro Ala Leu Leu Asn Asn Pro Val His Gln Ser Val Thr Met Gly
210 215 220
Glu Thr Val Ser Phe Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu
225 230 235 240
Ile Thr Trp Glu Lys Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg
245 250 255
Pro Asn His Val Arg Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu
260 265 270
Val Ile Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr
275 280 285
Ala Arg Asn Val Ala Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val
290 295 300
Val Arg Gly His Gln Ala Ala Ala Thr Ser Glu Ser Ser Pro Asn Gly
305 310 315 320
Thr Ala Phe Pro Ala Ala Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp
325 330 335
Cys Gly Glu Glu Gln Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn
340 345 350
Cys Leu Thr Phe Thr Phe Gly His Cys His Arg Asn Leu Asn His Phe
355 360 365
Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala
370 375 380
Ala Cys Ser Leu Pro Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Ala Pro
385 390 395 400
Arg Trp Ala Tyr Asn Ser Gln Thr Gly Gln Cys Gln Ser Phe Val Tyr
405 410 415
Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys
420 425 430
Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg Gly Asn Gln Arg Cys Arg Ala Cys
435 440 445
Lys Pro Arg Gln Lys Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val
450 455 460
Ile Leu Gly Arg Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg
465 470 475 480
Ala Leu Val Thr Val Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu
485 490 495
Lys Phe Leu Gly Gln Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp
500 505 510
Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Val Thr Val Ser Glu Met Pro Leu Ile
515 520 525
Ile Met Gly Glu Val Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser
530 535 540
Phe Val Gly Ala Ser Ser Ala Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val
545 550 555 560
Met His Lys Lys Thr Cys Asp Val Leu Lys Glu Phe Leu Gly Leu His
565 570 575
<210> 3
<211> 2036
<212> DNA
<400> 3
gttttctcgg tgtgtcgatg gaagagggag gaatgtgatc cgtcccagcc gccggcgggg 60
ccagagcata tctggagtgt gagacctatg agaagtgctg ccccaacgta tgtgggacca 120
agagctgcgt ggcggcccgc tacatggacg tgaaagggaa gaagggccca gtgggcatgc 180
ccaaggaggc cacatgtgac cacttcatgt gtctgcagca gggctctgag tgtgacatct 240
gggatggcca gcccgtgtgt aagtgcaaag gatggggcag ctcgtcgatg atttttttgt 300
gtttccaggc ttcctgtgtg atcctgacct tcaccttcgg ccactgccac cgtaacctca 360
accactttga gacctatgag gcctgcatgc tggcctgcat gagcgggccg ctggccgcgt 420
gcagcctgcc cgccctgcag gggccctgca aagcctacgc gcctcgctgg gcttacaaca 480
gccagacggg ccagtgccag tcctttgtct atggtggctg cgagggcaat ggcaacaact 540
ttgagagccg tgaggcctgt gaggagtcgt gccccttccc cagggggaac cagcgctgtc 600
gggcctgcaa gcctcggcag aagctcgtta ccagcttctg tcgcagcgac tttgtcatcc 660
tgggccgagt ctctgagctg accgaagagc ctgactcggg ccgcgccctg gtgactgtgg 720
atgaggtcct aaaggatgag aaaatgggcc tcaagttcct gggccaggag ccattggagg 780
tcactctgct tcacgtggac tgggcatgcc cctgccccaa cgtgaccgtg agcgagatgc 840
cgctcatcat catgggggag gtggacggcg gcatggccat gctgcgcccc gatagctttg 900
tgggcgcatc gagtgcccgc cgggtcagga agcttcgtga ggtcatgcac aagaagacct 960
gtgacgtcct caaggagttt cttggcttgc actgaagccc cccacccctc cctgccccct 1020
ccctggcctt cttccaccta tccaccccaa tgcctctcag caaactgggc gaggtcagat 1080
tagacaggct tgggacagca gggaaacatc aaccgacgtg tcacagaaaa agccacagaa 1140
ggtctcagat cagcatctat tctttgggtt caataagggg ttcatatctt ttttagctga 1200
gggggacaag aggagaagcc agtggacaca tggaagttac tcgtgaccac cagcttgctc 1260
agatattctc ctcctcccct cactggcacc acagcctccc cagagacccc tgagctggac 1320
atggcggccc ctgcgctgct caacaaccct gtgcaccagt cggtcaccat gggtgagaca 1380
gtgagcttcc tctgtgatgt ggtgggccgg ccccggcctg agatcacctg ggagaagcag 1440
ttggaggatc gggagaatgt ggtcatgcgg cccaaccatg tgcgtggcaa cgtggtggtc 1500
accaacattg cccagctggt catctataac gcccagctgc aggatgctgg gatctacacc 1560
tgcacggccc ggaacgtggc tggggtcctg agggctgatt tcccgctgtc ggtggtcagg 1620
ggtcatcagg ctgcagccac ctcagagagc agccccaatg gcacggcttt cccggcggcc 1680
gagtgcctga agcccccaga cagtgaggac tgtggcgaag agcagacccg ctggcacttc 1740
gatgcccagg ccaacaactg cctgaccttc acctttccca cagcctcctc gattgctgtg 1800
agcagaggcc actcggagtt aggggcatgg gcaatagcaa gctggcggca gagtccagcc 1860
cagcatatga cttgccctga atggaagctg ctgaaacggg tgcctttggg tggtggtcgg 1920
cttgcctctg ccctattctg tccctgcccc tccaagctga agaaggtcct tgtggggcgt 1980
cctcatttct tcctcaaata taaggaggaa gataccaatt aaaagctcat agtatc 2036
<210> 4
<211> 283
<212> PRT
<400> 4
Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala
1 5 10 15
Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile
20 25 30
Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys Cys Lys Gly Trp Gly Ser Ser Ser
35 40 45
Met Ile Phe Leu Cys Phe Gln Ala Ser Cys Val Ile Leu Thr Phe Thr
50 55 60
Phe Gly His Cys His Arg Asn Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala
65 70 75 80
Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala Ala Cys Ser Leu Pro
85 90 95
Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Ala Pro Arg Trp Ala Tyr Asn
100 105 110
Ser Gln Thr Gly Gln Cys Gln Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly
115 120 125
Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro
130 135 140
Phe Pro Arg Gly Asn Gln Arg Cys Arg Ala Cys Lys Pro Arg Gln Lys
145 150 155 160
Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg Val
165 170 175
Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg Ala Leu Val Thr Val
180 185 190
Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Gln
195 200 205
Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp Trp Ala Cys Pro Cys
210 215 220
Pro Asn Val Thr Val Ser Glu Met Pro Leu Ile Ile Met Gly Glu Val
225 230 235 240
Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser Phe Val Gly Ala Ser
245 250 255
Ser Ala Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val Met His Lys Lys Thr
260 265 270
Cys Asp Val Leu Lys Glu Phe Leu Gly Leu His
275 280
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<400> 5
agcacgagcg gccgggccac gg 22
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<400> 6
gcggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt tt 42
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<400> 7
agcatcgagt cggccttgtt g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<400> 8
gcggctgaag acggcctatg t 21
【図１】ＫＩ３１６及びＮＴＯＮＧ２００３３１６の構
造の特徴を表す。
造の特徴を表す。
【図２】ＫＩ３１６の組織発現プロファイル解析の結果
を示す。
を示す。
【図３】ＫＩ３１６のウェスタンブロッティングの結果
を示す。
を示す。
【図４】ＫＩ３１６の精製過程を銀染色により確認した
結果を示す。
結果を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ ４Ｃ０８５
43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/81 ４Ｈ０４５
Ｃ０７Ｋ 14/81 16/38
16/38 Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02
5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ
33/50 Ｎ
// Ａ６１Ｋ 38/48 45/00
39/395 48/00
Ｃ１２Ｎ 9/99
45/00 15/00 ＺＮＡＡ
48/00 5/00 Ａ
Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/547
(72)発明者 磯貝 隆夫
茨城県稲敷郡阿見町大室511−12
Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 BA13 BB03 BB20
CA25 CB01 CB17 CB21 DA12
DA13 DA14 DA20 DA36 DA37
FB01 FB02 FB03 FB04 FB07
4B024 AA01 AA11 BA19 BA44 DA02
EA04 GA11 HA12
4B063 QA18 QQ79 QQ95 QR59 QR77
QR80 QS24 QS28
4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14
BA02 CA24 CA44 CA46
4C084 AA02 AA07 AA13 AA16 DC34
NA14 ZA36 ZA59 ZA66 ZA68
ZB11 ZB26 ZC20
4C085 AA13 AA14 CC12 CC29
4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA56
EA22 EA50 FA71 FA74 GA23
GA26
Claims (10)
- 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ； （ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ； （ｂ）配列番号：１のＤＮＡとストリンジェントな条件
でハイブリダイズし、かつセリンプロテアーゼ阻害蛋白
質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡにコードされる
蛋白質。 - 【請求項３】 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質； （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
質； （ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列においてアミノ酸が
欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるセ
リンプロテアーゼ阻害蛋白質。 - 【請求項４】 請求項１に記載のＤＮＡを含む組換えベ
クター。 - 【請求項５】 請求項４に記載の組換えベクターにより
形質転換された形質転換細胞。 - 【請求項６】 請求項２または請求項３に記載の蛋白質
の発現を抑制するアンチセンス核酸。 - 【請求項７】 塩基配列が、請求項１に記載のＤＮＡの
全部または一部に相補する配列である、請求項６に記載
のアンチセンス核酸。 - 【請求項８】 請求項２または請求項３に記載の蛋白質
もしくはその部分ペプチドに対する抗体。 - 【請求項９】 請求項２または請求項３に記載の蛋白質
あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞と候補物
質とを接触させ、候補物質存在下と非存在下における該
蛋白質の活性を検出し、非存在下に比べて該蛋白質の活
性を増加または減少させる物質を選択することを特徴と
する、該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法。 - 【請求項１０】 請求項４に記載の組換えベクターまた
は請求項５に記載の形質転換細胞と候補物質とを接触さ
せ、候補物質存在下と非存在下における請求項１に記載
のＤＮＡの発現レベルを検出し、非存在下に比べて該Ｄ
ＮＡの発現を増加または減少させる物質を選択すること
を特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡの発現調節作用
を示す物質の検索方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002038074A JP2003235574A (ja) | 2002-02-15 | 2002-02-15 | 新規クニッツ型プロテアーゼインヒビター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002038074A JP2003235574A (ja) | 2002-02-15 | 2002-02-15 | 新規クニッツ型プロテアーゼインヒビター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003235574A true JP2003235574A (ja) | 2003-08-26 |
Family
ID=27779480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002038074A Withdrawn JP2003235574A (ja) | 2002-02-15 | 2002-02-15 | 新規クニッツ型プロテアーゼインヒビター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003235574A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111808922A (zh) * | 2019-04-12 | 2020-10-23 | 四川大学 | 一种细菌核糖体抑制剂筛选方法及其抑制剂 |
-
2002
- 2002-02-15 JP JP2002038074A patent/JP2003235574A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111808922A (zh) * | 2019-04-12 | 2020-10-23 | 四川大学 | 一种细菌核糖体抑制剂筛选方法及其抑制剂 |
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|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
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