KR20210021144A - 폴리펩티드의 재조합 생산 동안의 디술피드 결합 환원의 방지 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 디술피드-함유 폴리펩티드의 재조합 생산 동안 디술피드 결합의 환원을 방지하기 위한 방법 및 수단에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항체를 포함하는 디술피드-함유 폴리펩티드를 재조합 숙주 세포 배양물로부터 수확하는 동안의 디술피드 결합 환원의 방지에 관한 것이다.

Description

폴리펩티드의 재조합 생산 동안의 디술피드 결합 환원의 방지{PREVENTION OF DISULFIDE BOND REDUCTION DURING RECOMBINANT PRODUCTION OF POLYPEPTIDES}
본 발명은 디술피드-함유 폴리펩티드의 재조합 생산 동안 디술피드 결합의 환원을 방지하기 위한 방법 및 수단에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항체가 포함되는 디술피드-함유 폴리펩티드를 재조합 숙주 세포 배양물로부터 수확하는 동안의 디술피드 결합 환원의 방지에 관한 것이다.
생명공학 산업에서, 제약 용도는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산된 다양한 단백질을 필요로 한다. 일반적으로, 원하는 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합 플라스미드의 삽입에 의해 관심 단백질을 생산하도록 조작된, 진핵생물 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 원핵생물 세포, 예컨대 박테리아 세포를 사용하여, 세포 배양에 의해 재조합 단백질이 생산된다. 단백질이 생물학적으로 활성으로 남아 있기 위해, 단백질의 형상 (이의 3차 구조 포함)이 이의 정제 및 단리 동안 유지되어야 하고, 단백질의 다중 관능기들이 분해로부터 보호되어야 한다.
포유동물 세포는, 주로 적절하게 폴딩되고 조립된 이종 단백질을 생산하는 이의 능력 및 번역후 변형에 대한 이의 역량으로 인해, 임상 용도를 위한 포유동물 단백질의 생산을 위한 우세한 시스템이 되었다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 및 다양한 기타 포유동물 공급원으로부터 수득된 세포주, 예를 들어, 마우스 골수종 (NS0), 베이비 햄스터 신장 (BHK), 인간 배아 신장 (HEK-293) 및 인간 망막 세포, 예컨대 인간 망막 세포로부터 단리된 PER.C6® 세포주 (인간 글리코실화 특성을 제공하고, 인간 생리학에 부합하는 항체를 천연적으로 생산할 수 있음)가 바이오제약 제품의 생산에 대해 관리 기관에 의해 허가되었다.
일반적으로, 생산 사이클을 시작하기 위하여, 소수의 형질전환된 재조합 숙주 세포가 수일 동안 배양물 내에서 성장하게 된다 (예를 들어, 도 23 참조). 일단 세포에 수회 라운드의 복제가 진행되면, 세포를 더 큰 용기로 옮겨서, 발효되도록 준비시킨다. 세포가 성장되는 배지, 및 생산 사이클 동안 존재하는 산소, 질소 및 이산화탄소의 수준이 생산 프로세스에 유의하게 영향을 미칠 수 있다. 각각의 세포주에 대해 특이적으로 성장 파라메터가 결정되고, 최적의 성장 및 생산 조건을 확실히 하기 위해 이러한 파라메터들을 자주 측정한다.
세포가 충분한 개수로 성장되면, 이를 대규모 생산 탱크로 옮기고, 더 오랜 기간 동안 성장시킨다. 프로세스에서의 이러한 시점에, 재조합 단백질을 수확할 수 있다. 전형적으로, 세포 배양 배지 내로 폴리펩티드를 분비하도록 세포가 조작되어서, 정제 프로세스에서의 첫번째 단계는 세포를 배지로부터 분리하는 것이다. 전형적으로, 수확은 수확된 세포 배양액 (HCCF)을 생산하기 위한 원심분리 및 여과를 포함한다. 그후, 배지를 임의의 세포 잔해물, 원치 않는 단백질, 염, 미네랄 또는 기타 바람직하지 않은 요소를 제거하는 여러 추가적인 정제 단계에 적용한다. 정제 프로세스의 말기에, 재조합 단백질은 고도로 순수하고, 인간 치료 용도에 적절하다.
이러한 프로세스가 지난 수십년 동안 많은 연구 및 개선의 대상이었지만, 재조합 단백질의 생산은 여전히 난점이 없지 않다. 따라서, 예를 들어, 디술피드 결합을 포함하는 폴리펩티드, 특히 사슬간 디술피드 결합을 포함하는 다중사슬 폴리펩티드 예컨대 항체의 재조합 생산 동안, 필요한 생물학적 활성이 있는 적절하게 폴딩된 폴리펩티드를 생산하기 위해, 제작, 회수 및 정제 프로세스 전반에 걸쳐 디술피드 결합을 보호하고 유지시키는 것이 필수적이다.
일반적으로 본 발명은 재조합 숙주 세포의 수확전 또는 수확된 배양액에 타이오레독신 또는 타이오레독신-유사 단백질의 억제제를 보충하는 단계를 포함하는, 재조합 숙주 세포에서 발현된 폴리펩티드 내의 디술피드 결합의 환원을 방지하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는 수확전 배양액에 첨가된다.
또다른 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는 수확된 배양액에 첨가된다.
추가적인 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는 타이오레독신의 직접적인 억제제이다.
모든 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는, 예를 들어, 알킬-2-이미다졸릴 디술피드 또는 나프토퀴논 스피로케탈 유도체일 수 있다.
추가적인 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는 타이오레독신 리덕타제의 특이적 억제제이다.
추가적인 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는 금 착물이고, 이때 금 착물은, 예를 들어, 오로(auro)티오글루코스 (ATG) 또는 오로티오말레이트 (ATM)일 수 있다. 유효 억제 농도는 변할 수 있지만, 전형적으로는 약 0.1 mM 내지 1 mM 사이이다. 유사하게, 최소 유효 억제 농도는 폴리펩티드의 성질 및 전체적인 상황에 따라 변하고, ATG 또는 ATM 농도가 수확전 또는 수확된 배양액 내의 타이오레독신 농도의 약 4배 이상일 때 전형적으로 도달된다.
본 발명의 이러한 양상의 또다른 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는 금속 이온이고, 이때 금속 이온은 Hg2+, Cu2+, Zn2+, Co2+ 및 Mn2+로 이루어진 군으로부터 비제한적으로 선택될 수 있다. 금속 이온이 황산구리의 형태로 첨가되는 경우, 유효 억제 농도는 일반적으로 약 5 μM 내지 약 100 μM 사이, 또는 약 10 μM 내지 약 80 μM 사이, 또는 약 15 μM 내지 약 50 μM 사이이다. 황산구리의 최소 억제 농도 또한 변하지만, 황산구리가 수확전 또는 수확된 배양액 내의 타이오레독신 농도의 약 2배 이상의 농도로 첨가되는 경우에 전형적으로 도달된다.
또다른 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는 산화제, 예를 들어, G6PD의 억제제, 예를 들어, 피리독살 5'-포스페이트, 1 플루오로-2,4 디니트로벤젠, 데히드로에피안드로스테론 (DHEA) 또는 에피안드로스테론 (EA); 시스틴 또는 시스테인이다. 전형적인 DHEA의 유효 억제제 농도는 약 0.05 mM 내지 약 5 mM 사이, 또는 약 0.1 mM 내지 약 2.5 mM 사이이다.
추가적인 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는 금속 이온의 킬레이터, 예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)이 비제한적으로 포함되는, 헥소키나제 활성의 억제제이다. 전형적으로 EDTA는 약 5 mM 내지 약 60 mM 사이, 또는 약 10 mM 내지 약 50 mM 사이, 또는 약 20 mM 내지 약 40 mM의 농도로 첨가되고 이러한 농도에서 효과적이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 헥소키나제 활성의 억제제는 소르보스-1-포스페이트, 폴리포스페이트, 6-데옥시-6-플루오로글루코스, 2-C-히드록시-메틸글루코스, 자일로스, 및 릭소스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
기타 억제제에는 시스틴, 시스테인, 및 산화된 글루타티온이 포함되고, 전형적으로 이들은 수확전 또는 수확된 배양액 내의 당해 폴리펩티드의 농도의 약 40배 이상의 농도로 첨가된다.
추가적인 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는 siRNA, 안티센스 뉴클레오티드, 또는 타이오레독신 리덕타제에 특이적으로 결합하는 항체이다.
또다른 실시양태에서, 타이오레독신 억제제는 간접적으로 타이오레독신 활성의 억제를 초래하는 수단이다. 이러한 실시양태는, 예를 들어, 재조합 숙주 세포의 수확된 배양액에 공기를 살포하는 것, 및/또는 재조합 숙주 세포의 수확된 배양액의 pH를 저하시키는 것을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 타이오레독신 활성을 억제하기 위한 간접적인 수단, 예컨대 공기 살포 및/또는 pH를 저하시키는 것이 직접적인 타이오레독신 억제제, 예컨대 상기 열거된 것들의 사용과 조합될 수 있다.
모든 실시양태에서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 항체, 또는 항체의 생물학적으로 기능성인 단편일 수 있다. 대표적인 항체 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
치료적 항체에는 항-HER2 항체; 항-CD20 항체; 항-IL-8 항체; 항-VEGF 항체; 항-CD40 항체, 항-CD11a 항체; 항-CD18 항체; 항-IgE 항체; 항-Apo-2 수용체 항체; 항-조직 인자 (TF) 항체; 항-인간 α4β7 인테그린 항체; 항-EGFR 항체; 항-CD3 항체; 항-CD25 항체; 항-CD4 항체; 항-CD52 항체; 항-Fc 수용체 항체; 항-암배아 항원 (CEA) 항체; 유방 상피 세포에 대해 지시된 항체; 결장 암종 세포에 결합하는 항체; 항-CD38 항체; 항-CD33 항체; 항-CD22 항체; 항-EpCAM 항체; 항-GpIIb/IIIa 항체; 항-RSV 항체; 항-CMV 항체; 항-HIV 항체; 항-간염 항체; 항-CA 125 항체; 항-αvβ3 항체; 항-인간 신세포 암종 항체; 항-인간 17-1A 항체; 항-인간 결장직장 종양 항체; GD3 강글리오시드에 대해 지시된 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평세포 암종; 및 항-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 및 항-HLA DR 항체가 비제한적으로 포함된다.
또다른 실시양태에서, 치료적 항체는 HER 수용체, VEGF, IgE, CD20, CD11a, CD40, 또는 DR5에 결합하는 항체이다.
추가적인 실시양태에서, HER 수용체는 HER1 및/또는 HER2, 바람직하게는 HER2이다. HER2 항체는, 예를 들어, 서열 16, 17, 18 및 19로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 치료적 항체는 CD20에 결합하는 항체이다. 항-CD20 항체는, 예를 들어, 서열 1 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 치료적 항체는 VEGF에 결합하는 항체이다. 항-VEGF 항체는, 예를 들어, 서열 20 내지 25로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다.
추가적인 실시양태에서, 치료적 항체는 CD11a에 결합하는 항체이다. 항-CD11a 항체는, 예를 들어, 서열 26 내지 29로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다.
추가적인 실시양태에서, 치료적 항체는 DR5 수용체에 결합한다. 항-DR5 항체는, 예를 들어, 아포맵(Apomab) 1.1, 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 5.2, 5.3, 6.1, 6.2, 6.3, 7.1, 7.2, 7.3, 8.1, 8.3, 9.1, 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2, 8.2, 9.2, 1.3, 2.2, 3.3, 4.3, 5.3, 6.3, 7.3, 8.3, 9.3, 및 25.3으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 아포맵 8.3 또는 아포맵 7.3이며, 가장 바람직하게는 아포맵 7.3이다.
본 발명의 방법의 또다른 실시양태에서, 재조합 숙주 세포에서 발현된 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드이다. 예를 들어, 치료적 폴리펩티드는 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬이 포함되는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄: 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자 및 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자와 같은 응고 인자; 단백질 C와 같은 항-응고 인자; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA)와 같은 플라스미노겐 활성화제; 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제(enkephalinase); RANTES (정상적으로 발현 및 분비된 T-세포 활성화에 대한 조절: regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민; 뮐러리안(Muellerian)-억제 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 베타-락타마제와 같은 미생물 단백질; DNase; IgE; CTLA-4와 같은 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티스성 인자; 골-유래 향신경성 인자 (BDNF)와 같은 향신경성 인자, 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); aFGF 및 bFGF와 같은 섬유모세포 성장 인자: 표피 성장 인자 (EGF); TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5 포함)와 같은 형질전환 성장 인자 (TGF); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD40과 같은 CD 단백질; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP): 인터페론-알파, -베타, 및 -감마와 같은 인터페론; 예를 들면 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF와 같은 콜로니 자극 인자 (CSF); 예를 들면 IL-1 내지 IL-10과 같은 인터루킨 (IL): 과산화물 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 가속화 인자; 예를 들면 AIDS 외피의 일부분과 같은 바이러스 항원; 운송 단백질; 호밍(homing) 수용체; 어드레신; 조절 단백질; CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM과 같은 인테그린; HER2, HER3 또는 HER4 수용체와 같은 종양 관련 항원; 및 상기 폴리펩티드들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
모든 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 포유동물 숙주 세포일 수 있고, 여기에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 예를 들어 포함된다.
모든 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 또한 원핵생물 숙주 세포, 예컨대 박테리아 세포일 수 있고, 여기에는 이. 콜라이 세포가 비제한적으로 포함된다.
도 1. 투석 실험: 투석 주머니 내부의 오크렐리주맵(ocrelizumab) (rhuMAb 2H7 변이체 A)이 인큐베이션 기간 동안 손상되지 않고 유지되었음을 실연하는 바이오분석기(Bioanalyzer) 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상 (각각의 레인은 시점을 나타냄).
도 2. 투석 실험: 투석 주머니 외부의 오크렐리주맵이 인큐베이션 기간 동안 환원되었음을 나타내는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상 (각각의 레인은 시점을 나타냄). 이는 도면에 묘사된 무손상 항체 (약 150 kDa)의 손실 및 항체 단편의 형성에 의해 증명된다. 48시간 시점에 (레인 7), 환원된 항체가 재산화된 것으로 나타났고, 이는 아마도 수확된 세포 배양액 (HCCF) 내의 환원 활성이 손실되는 것의 결과일 것이다. 28 kDa 마커 바로 위에 나타난 밴드는 항체의 경쇄로부터 생성되었다. 인큐베이션을 시작하기 전에 이미 상당량의 유리 경쇄가 HCCF 내에 존재하였다. HCCF 내의 과도한 유리 경쇄 및 경쇄 이량체의 존재는 오크렐리주맵을 생산하는 세포주에 대해 전형적이다.
도 3. 투석 실험으로부터의 유리 티올 수준: 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내의 정제된 오크렐리주맵은 투석 주머니 내부에 있었고, 오크렐리주맵을 함유하는 HCCF는 백의 외부에 있었다. 투석 주머니 내부 (사각형) 및 외부 (다이아몬드)의 유리 티올이 수시간 이내에 유사한 수준에 도달하였고, 이는 투석 주머니의 내부와 외부 간의 HCCF 내의 소형 분자 성분의 양호한 교환을 가리킨다.
도 4. 항체 환원에서 수반되는 타이오레독신 시스템 및 기타 반응: 타이오레독신 (Trx), 타이오레독신 리덕타제 (TrxR) 및 NADPH를 포함하는 타이오레독신 시스템은 단백질 내의 디술피드 결합의 환원을 위한 수소 공여체 시스템으로 기능한다. Trx는 티올-디술피드 교환을 통해 다수의 산화화원 반응을 촉매하는 CXXC 활성 부위 모티프가 있는 소형 단량체성 단백질이다. 산화된 Trx는 TrxR을 통해 NADPH에 의해 환원될 수 있다. 그후, 환원된 Trx가 단백질 내의 디술피드의 환원을 촉매할 수 있다. 타이오레독신 시스템에 필요한 NADPH는 펜토스 포스페이트 경로 및 당분해에서의 반응을 통해 제공된다.
도 5. 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성: 무손상 오크렐리주맵 (1 ㎎/㎖)을 PBS 내의 0.1 mM TrxR (래트 간), 5 mM Trx (인간) 및 1 mM NADPH와 함께 인큐베이션하는 것이 오크렐리주맵의 완전한 환원을 초래하였음을 실연하는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상 (각각의 레인은 시점을 나타냄); 21시간 미만 내에 오크렐리주맵이 완전히 환원되었다.
도 6. 오로티오글루코스에 의해 억제된 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성: 상기 도 5에 대한 설명에 기술된 것과 동일한 반응 혼합물에 오로티오글루코스 (ATG)를 첨가하는 것이 오크렐리주맵 환원을 효과적으로 억제하였다. 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상 (각각의 레인은 시점을 나타냄)이 이를 나타낸다.
도 7. 오로티오말레이트에 의해 억제된 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성: 상기 도 5에 대한 설명에 기술된 것과 동일한 반응 혼합물에 1 mM 농도의 오로티오말레이트 (ATM)를 첨가하는 것이 오크렐리주맵 환원을 효과적으로 억제하였다. 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상 (각각의 레인은 시점을 나타냄)이 이를 나타낸다.
도 8. 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성: 무손상 오크렐리주맵 (1 ㎎/㎖)을 10 mM 히스티딘 술페이트 완충제 내의 0.1 mM TrxR (래트 간), 5 mM Trx (인간) 및 1 mM NADPH와 함께 인큐베이션하는 것이 1시간 미만 내에 오크렐리주맵의 환원을 초래하였음을 나타내는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상 (각각의 레인은 시점을 나타냄).
도 9. CuSO 4 에 의해 억제된 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성: 도 8에 대한 설명에 기술된 것과 동일한 반응 혼합물에 50 μM 농도의 CuSO4를 첨가하는 것이 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상 (각각의 레인은 시점을 나타냄)에 나타난 바와 같이 오크렐리주맵 환원을 효과적으로 억제하였다.
도 10. 오크렐리주맵 환원: 3ℓ 발효기로부터 생성된 균질화된 CCF로부터의 HCCF를 사용한 인큐베이션 실험에서 오크렐리주맵이 환원되었음을 나타내는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상 (각각의 레인은 시점을 나타냄).
도 11. 오로티오글루오스에 의한 HCCF 내의 오크렐리주맵 환원의 억제: 도 10에 나타난 인큐베이션 실험에 대해 사용된 것과 동일한 HCCF에 1 mM 오로티오글루코스를 첨가하는 것이 오크렐리주맵의 환원을 억제하였음을 나타내는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상 (각각의 레인은 시점을 나타냄).
도 12. 오로티오말레이트에 의한 HCCF 내의 오크렐리주맵 환원의 억제: 도 10에 나타난 인큐베이션 실험에 대해 사용된 것과 동일한 HCCF에 1 mM 오로티오말레이트를 첨가하는 것이 오크렐리주맵의 환원을 억제하였음을 가리키는 바이오분석기 (각각의 레인은 시점을 나타냄)로부터의 디지털 젤-유사 영상.
도 13. HCCF 내의 환원 활성의 손실: 수회의 냉동/해동 사이클에 적용된 오크렐리주맵에 대한 대규모 제작 실행 ("베타" 실행) 중 하나로부터의 HCCF가 인큐베이션 실험에서 사용되었을 때 오크렐리주맵 환원이 실연되지 않았다. 바이오분석기 분석 (각각의 레인은 시점을 나타냄)이 이를 나타냈고, 이는 동일한 발효 뱃치(batch)로부터의 신선하게 해동된 HCCF에서 앞서 나타난 항체 환원과 대조를 이룰 수 있다.
도 14. NADPH의 첨가에 의해 복구된 HCCF 내의 손실된 환원 활성: 도 13에서 상기 기술된 조건 하에 환원 활성이 제거된 HCCF 내로 5 mM 농도의 NADPH를 첨가한 후 바이오분석기 분석법 (각각의 레인은 시점을 나타냄)에서 오크렐리주맵의 환원이 다시 관찰되었다.
도 15. 글루코스-6-포스페이트의 첨가에 의해 복구된 HCCF 내의 손실된 환원 활성: 도 13에서 상기 기술된 처리로 인해 환원 활성이 제거된 HCCF 내로 10 mM 농도의 G6P를 첨가한 후 바이오분석기 분석법 (각각의 레인은 시점을 나타냄)에서 오크렐리주맵의 환원이 다시 관찰되었다.
도 16. 오크렐리주맵 환원: 대규모 제작 실행 ("알파" 실행)으로부터의 HCCF를 사용하는 인큐베이션 실험에서 오크렐리주맵이 환원되었음을 나타내는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상.
도 17. EDTA가 오크렐리주맵 환원을 억제한다: 도 16에 환원 활성이 기술된 HCCF에 EDTA가 20 mM의 농도로 첨가된 알파 실행으로부터의 HCCF를 사용하는 인큐베이션 실험에서 오크렐리주맵의 환원이 억제되었음을 나타내는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상 (각각의 레인은 시점을 나타냄).
도 18. "베타 실행" HCCF 내의 손실된 환원 활성이 글루코스-6-포스페이트의 첨가에 의해 복구되었지만, EDTA에 의해 환원이 억제되지 않음: 환원 활성이 손실된 HCCF (도 13 참조) 내로 5 mM 농도의 G6P 및 20 mM EDTA를 첨가한 후 오크렐리주맵의 환원이 바이오분석기 분석법 (각각의 레인은 시점을 나타냄)에서 관찰되었다. 도 17에 나타난 결과와 대조적으로, EDTA의 존재가 오크렐리주맵의 환원을 차단하지 않았다.
도 19. (i) EDTA의 첨가, (ii) CuSO 4 의 첨가, 또는 (iii) pH 5.5로의 pH 조정에 의한 오크렐리주맵 환원의 억제. (i) EDTA의 첨가, (ii) CuSO4의 첨가, 또는 (iii) pH 5.5로의 pH 조정 (독립적으로 사용됨)의 3가지의 상이한 방법 모두가 오크렐리주맵 환원을 억제하는데 효과적이었다. 거의 100％의 무손상 (150 kDa) 항체가 단백질 A 용출 풀(pool) 내에 잔류하였음을 나타낸 도해된 정량적 바이오분석기 결과에 의해 이것이 실연되었다. 대조적으로, 20시간의 HCCF 유지 시간 후 대조군 HCCF에서 오크렐리주맵이 완전히 환원되었다.
도 20. 공기 살포에 의한 오크렐리주맵 환원의 억제: HCCF에 공기를 살포하는 것이 오크렐리주맵 디술피드 결합 환원을 억제하는데 효과적이었다. 거의 100％의 무손상 (150 kDa) 항체가 단백질 A 용출 풀 내에 잔류하였음을 나타내는 정량적 바이오분석기 결과에 의해 이것이 실연되었다. 대조적으로, 질소를 5시간 살포한 후 대조군 HCCF에서 오크렐리주맵이 거의 완전히 환원되었다.
도 21은 항-Her2 항체 (트라스투주맵)의 VL (서열 24) 아미노산 서열을 나타낸다.
도 22는 항-Her2 항체 (트라스투주맵)의 VH (서열 25) 아미노산 서열을 나타낸다.
도 23은 전형적인 대규모 제작 프로세스의 일부 단계들을 나타내는 개략도이다.
도 24는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 25는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 1 mM 히스티딘 술페이트 + 1 mM ATG 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 26은 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 0.6 μM ATG (6:1 ATG:TrxR) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 27은 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 0.4 μM ATG (4:1 ATG:TrxR) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 28은 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 0.2 μM ATG (2:1 ATG:TrxR) 내의 2H7 (변이체 A)+ 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 29는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 0.1 mM 오로티오말레이트 (ATM) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 30은 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 0.01 mM 오로티오말레이트 (ATM) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 31은 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 20 μM CuSO4 (4:1 Cu2+:Trx) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 32는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 10 μM CuSO4 (2:1 Cu2+:Trx) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 33은 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 5 μM CuSO4 (1:1 Cu2+:Trx) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 34는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 532 μM 시스타민 (20:1 시스타민:2H7 디술피드) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 35는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 266 μM 시스타민 (10:1 시스타민:2H7 디술피드) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 36은 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 133 μM 시스타민 (5:1 시스타민:2H7 디술피드) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 37은 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 26.6 μM 시스타민 (1:1 시스타민:2H7 디술피드) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 38은 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 (pH=7.6) + 2.6 mM 시스틴 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 39는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상이다: 10 mM 히스티딘 술페이트 + 2.6 mM GSSG (산화된 글루타티온) 내의 2H7 (변이체 A) + 1 mM NADPH + 5 μM 타이오레독신 + 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제 (재조합).
도 40 재구축된 효소 환원 시스템. pH=7.38의 50 mM 히스티딘 술페이트 완충제 내의 1 ㎎/㎖ 2H7 (변이체 A) + 10 ㎍/㎖ 헥소키나제, 50 ㎍/㎖ 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제(dehydrogenase), 5 μM 타이오레독신, 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제, 2 mM 글루코스, 0.6 mM ATP, 2 mM Mg2+, 및 2 mM NADP.
도 41 타이오레독신 시스템이 NADPH를 필요로 한다. pH=7.38의 50 mM 히스티딘 술페이트 완충제 내의 1 ㎎/㎖ 2H7 (변이체 A) + 5 μM 타이오레독신, 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제, 및 2 mM NADP.
I. 정의
본 발명에서, 항체가 포함되는 단백질의 문맥에서, 일반적으로, 또는 임의의 특정 단백질 또는 항체와 관련하여, 용어 "환원"은 단백질 또는 항체의 하나 이상의 디술피드 결합의 환원을 지칭하도록 사용된다. 따라서, 예를 들어, 용어 "오크렐리주맵 환원"은 용어 "오크렐리주맵 디술피드 결합 환원"과 상호교환가능하게 사용되고, 용어 "항체 (Ab) 환원"은 용어 "항체 (Ab) 디술피드 결합 환원"과 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "환원" 또는 "디술피드 결합 환원"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 완전 및 부분적 환원, 및 단백질 예컨대 항체 내에 존재하는 사슬간 또는 사슬내 디술피드 결합의 일부 또는 전체의 환원을 포함한다.
"단백질"은 더 높은 수준의 3차 및/또는 4차 구조를 생산하는데 충분한 사슬 길이의 아미노산들의 서열을 의미한다. 이는 이같은 구조가 없는 "펩티드" 또는 분자량이 작은 기타 약물과 구별되어야 한다. 전형적으로, 본원에서의 단백질은 분자량이 약 15-20 kD 이상, 바람직하게는 약 20 kD 이상일 것이다. 본원에서의 정의에 포함되는 단백질의 예로는 모든 포유동물 단백질, 특히, 치료적 및 진단적 단백질, 예컨대 치료적 및 진단적 항체가 포함되고, 일반적으로, 하나 이상의 사슬간 및/또는 사슬내 디술피드 결합을 포함하는 다중사슬 폴리펩티드가 포함되는, 하나 이상의 디술피드 결합을 함유하는 단백질이 포함된다.
용어 "치료적 단백질" 또는 "치료적 폴리펩티드"는, 이의 적응증 또는 작용 메커니즘과 상관 없이, 질환의 치료에서 사용되는 단백질을 지칭한다. 치료적 단백질이 임상에서 유용하기 위해서, 이는 대량으로 제작되어야 한다. 치료적 단백질 또는 기타 단백질의 "제작 규모" 생산은 생산될 단백질 및 필요에 따라 약 400L 내지 약 80,000 L 범위의 세포 배양물을 이용한다. 전형적으로, 이같은 제작 규모 생산은 약 400 L 내지 약 25,000 L 범위의 세포 배양 크기를 이용한다. 이러한 범위 내에서, 4,000 L, 약 6,000 L, 약 8,000 L, 약 10,000 L, 약 12,000 L, 약 14,000 L, 또는 약 16,000 L와 같은 특정 세포 배양 크기가 이용된다.
용어 "치료적 항체"는 질환의 치료에서 사용되는 항체를 지칭한다. 치료적 항체는 작용 메커니즘이 다양할 수 있다. 치료적 항체는 항원과 관련된 표적에 결합하여 이의 정상적인 기능을 중화할 수 있다. 예를 들어, 암 세포의 생존에 필요한 단백질의 활성을 차단하는 모노클로날 항체는 암 세포의 사망을 야기한다. 또다른 치료적 모노클로날 항체는 항원과 관련된 표적에 결합하여 이의 정상적인 기능을 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체가 세포 상의 단백질에 결합하여 세포자멸사 신호를 촉발할 수 있다. 또다른 모노클로날 항체는 질환에 걸린 조직에서만 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있다; 모노클로날 항체에 대한 독성 페이로드(payload) (효과적인 작용제), 예컨대 화학요법제 또는 방사선 작용제의 접합으로 독성 페이로드를 질환에 걸린 조직에 특이적으로 전달하기 위한 작용제가 생성될 수 있고, 이는 건강한 조직에 대한 피해를 감소시킨다. 치료적 항체의 "생물학적으로 기능성인 단편"은 무손상 항체에 귀착되는 생물학적 기능들 중 일부 또는 전체는 아니지만 하나 이상을 나타내고, 적어도 상기 활성은 표적 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다.
용어 "진단적 단백질"은 질환의 진단에서 사용되는 단백질을 지칭한다.
용어 "진단적 항체"는 질환에 대한 진단 시약으로서 사용되는 항체를 지칭한다. 진단적 항체는 특정 질환과 특이적으로 관련된 또는 특정 질환에서 증가된 발현을 나타내는 표적 항원에 결합할 수 있다. 진단적 항체는, 예를 들어, 환자로부터의 생물학적 샘플 내의 표적을 검출하는데, 또는 환자 내에서의 질환 부위, 예컨대 종양의 진단적 영상화에서 사용될 수 있다. 진단적 항체의 "생물학적으로 기능성인 단편"은 무손상 항체에 귀착되는 생물학적 기능들 중 일부 또는 전체는 아니지만 하나 이상을 나타내고, 적어도 상기 활성은 표적 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다.
"정제된"은 분자가 함유된 샘플의 80-90 중량％ 이상의 농도로 분자가 샘플 내에 존재한다는 것을 의미한다.
정제된 단백질 (항체 포함)은 바람직하게는 본질적으로 순수하고, 바람직하게는 본질적으로 균질하다 (즉, 오염 단백질 등이 없다).
"본질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 전체 중량을 기초로 약 90 중량％ 이상, 바람직하게는 약 95 중량％ 이상의 단백질을 포함하는 단백질 조성물을 의미한다.
"본질적으로 균질한" 단백질은 조성물의 전체 중량을 기초로 약 99 중량％ 이상의 단백질을 포함하는 단백질 조성물을 의미한다.
상기 주지된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 단백질은 항체이다. "항체" (Ab) 및 "면역글로불린" (Ig)은 구조적 특성이 동일한 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 한편, 면역글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 없는 기타 항체-유사 분자 양쪽 모두를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는, 예를 들어, 림프계에서 낮은 수준으로, 그리고 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체 (면역글로불린 Fc 영역이 있는 전장 항체 포함), 폴리에피토프 특이성이 있는 항체 조성물, 이중특이적 항체, 디아바디, 및 단일쇄 분자 예컨대 scFv 분자, 뿐만 아니라 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 구체적으로 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어, 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 개별적인 항체들의 혼합물이 아니라는 항체의 특성을 가리킨다. 특정 실시양태에서, 이같은 모노클로날 항체는 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 전형적으로 포함하고, 이때 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 프로세스에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선별 프로세스는 다수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀(pool)로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 예를 들어, 표적에 대한 친화력 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양에서의 항체의 생산의 개선, 생체 내에서의 항체의 면역원성의 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해, 선별된 표적 결합 서열이 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해하여야 한다. 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날(polyclonal) 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 다른 면역글로불린에 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
수식어구 "모노클로날"은 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 (예를 들어, [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (예를 들어, WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; [Marks et al., BioTechnology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368:812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)] 참조)이 예를 들어 포함되는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지부분은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편이 명확하게 포함된다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린(murine)) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및/또는 능력이 있는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종의 초가변 영역으로부터의 잔기 (공여체 항체)로 교체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 정련시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 임의적으로, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. 추가적인 상세사항은 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 참조. 하기의 리뷰 문헌 및 이에 언급된 참조문헌을 또한 참조한다: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma ＆ Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]. 인간화 항체에는 항체의 항원-결합 영역이 관심 항원으로 짧은꼬리 원숭이를 면역화시킴으로써 생산된 항체로부터 유래된 Primatized™ 항체가 포함된다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 제외한다.
"친화력 성숙된" 항체는 이의 하나 이상의 CDR/HVR 내에 하나 이상의 변경이 있어 이러한 변경(들)이 없는 어버이 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화력이 개선된 것이다. 바람직한 친화력 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 친화력이 나노놀 또는 심지어 피코몰일 것이다. 친화력 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화력 성숙이 기술되어 있다. CDR/HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이러한 도메인들은 일반적으로 항체의 가장 가변성인 부분이며, 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간에 서열 면에서 크게 상이하고 각각의 특정 항체의 이의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 양쪽 모두에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역 (HVR)으로 칭해지는 3개의 절편에 집중된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해진다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, 베타-시트 형상을 주로 채택한 4개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR들과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 수반되지는 않지만, 항체-의존적 세포형 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터(effector) 기능을 나타낸다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 칭해지는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나로 지정될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린)는 여러 클래스로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 주요 5개 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 여러 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 a, d, e, g 및 m으로 칭해진다. 면역글로불린의 여러 클래스들의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 주지되어 있고, 예를 들어, [Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 일반적으로 기술되어 있다. 항체는 항체와 1가지 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유결합 또는 비공유결합 회합에 의해 형성된 더 큰 융합 분자의 일부분일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되어, 하기에 정의되는 바와 같은 항체 단편이 아니라 실질적으로 무손상 형태인 항체를 지칭한다. 이 용어는 Fc 영역을 함유하는 중쇄가 있는 항체를 특히 지칭한다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하고, 이때 이 부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 이 부분과 정상적으로 관련된 기능을 하나 이상, 많게는 대부분 또는 전부 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 유지한다. 또다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 하나 이상을 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 생체내 반감기가 무손상 항체와 실질적으로 유사한 일가 항체이다. 예를 들어, 이같은 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 팔(arm)을 포함할 수 있다.
항체를 파파인(papain)으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 칭해지는, 각각 단일 항원-결합 부위가 있는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생산되는데, Fc라는 명칭은 이의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원 결합 부위가 있고 여전히 항원과 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 산출된다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편은, 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기들이 부가되어 있어서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 시스테인이 사이에 있는 Fab' 단편들의 쌍으로서 본래 생산되었다. 항체 단편들의 또다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비공유결합으로 회합되어 있는 이량체로 구성된다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 1개의 중쇄 가변 도메인 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 경쇄와 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 것과 유사한 "이량체성" 구조로 회합될 수 있도록 가요성 펩티드 링커(linker)에 의해 공유결합으로 연결될 수 있다. 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 규정하는 것은 이러한 형상 내이다. 총괄적으로, 6개의 CDR이 항원-결합 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 낮은 친화력이지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. scFv의 개관을 위해서는, [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조.
용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭한다. 동일한 사슬 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성하도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강요된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO93/1161; [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134]; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)가 또한 [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9: 129-134]에 기술되어 있다.
항체는 HER 수용체 패밀리의 구성원, 예컨대 HER1 (EGFR), HER2, HER3 및 HER4; CD 단백질 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD21, CD22 및 CD34; 세포 부착 분자 예컨대 LFA-1, Mol, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 av/p3 인테그린 (이의 α 또는 β 또는 서브유닛 포함) (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; 및 단백질 C가 비제한적으로 포함되는 임의의 단백질에 결합할 수 있다. 또다른 예시적인 단백질에는 인간 성장 호르몬 (hGH) 및 소 성장 호르몬 (bGH)이 포함되는 성장 호르몬 (GH); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; α-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자와 같은 응고 인자; 단백질 C와 같은 항-응고 인자; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 유로키나제 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA)와 같은 플라스미노겐 활성화제; 봄베신; 트롬빈; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나제; RANTES (정상적으로 발현 및 분비된 T-세포 활성화에 대한 조절); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-α); 인간 혈청 알부민 (HSA)과 같은 혈청 알부민; 뮐러리안-억제 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; DNase; 인히빈; 액티빈; 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류머티스성 인자; 골-유래 향신경성 인자 (BDNF)와 같은 향신경성 인자, 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); aFGF 및 bFGF와 같은 섬유모세포 성장 인자: 표피 성장 인자 (EGF); TGF-α 및 TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5 포함)와 같은 형질전환 성장 인자 (TGF); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); 에리트로포이에틴(EPO); 트롬보포이에틴 (TPO); 골유도성 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP): 인터페론-α, -β, 및 -γ와 같은 인터페론; 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF와 같은 콜로니 자극 인자 (CSF); 예를 들어 IL-1 내지 IL-10과 같은 인터루킨 (IL): 과산화물 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 가속화 인자(DAF); 예를 들어 AIDS 외피의 일부분과 같은 바이러스 항원; 운송 단백질; 호밍 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 면역부착소; 항체; 및 상기 열거된 폴리펩티드들의 중 임의의 것의 생물학적으로 활성인 단편 또는 변이체가 포함된다. 다수의 기타 항체 및/또는 기타 단백질이 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 상기 목록은 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
항체의 "생물학적으로 기능성인 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하고, 이때 이 부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 이 부분과 정상적으로 관련된 기능을 하나 이상, 많게는 대부분 또는 전부 유지한다. 한 실시양태에서, 항체의 생물학적으로 기능성인 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 유지한다. 또다른 실시양태에서, 항체의 생물학적으로 기능성인 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 하나 이상을 유지한다. 한 실시양태에서, 항체의 생물학적으로 기능성인 단편은 생체내 반감기가 무손상 항체와 실질적으로 유사한 일가 항체이다. 예를 들어, 이같은 항체의 생물학적으로 기능성인 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 팔을 포함할 수 있다.
용어 "타이오레독신 억제제" 및 "Trx 억제제"는 상호교환가능하게 사용되고, 타이오레독신 활성을 억제하는데 효과적인 모든 작용제 및 수단을 포함한다. 따라서, 타이오레독신 (Trx) 억제제에는 Trx, G6PD 및/또는 헥소키나제 효소 시스템의 임의의 성분을 차단하는 모든 작용제 및 수단이 포함된다. 이러한 문맥에서, "억제"에는 타이오레독신 활성의 완전한 제거 (차단) 및 감소가 포함되고, 따라서 단백질, 예컨대 항체에서의 디술피드 결합 환원의 완전한 제거 또는 부분적인 제거가 포함된다.
"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 예를 들어 결정시, 95 중량％ 초과, 일부 실시양태에서는 99 중량％ 초과의 항체로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 예를 들어 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 은 염색을 예를 들어 사용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제된다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 원위치(in situ) 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
용어 "단백질 A" 및 "ProA"는 상호교환가능하게 사용되고, 이의 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성에 의해 (예를 들어, 펩티드 합성에 의해 또는 재조합 기술에 의해) 생산된 단백질 A, 및 CH2/CH3 영역, 예컨대 Fc 영역이 있는 단백질에 결합하는 능력이 유지된 이의 변이체를 포함한다. Repligen, GE Healthcare 및 Fermatech로부터 상업적으로 단백질 A를 구입할 수 있다. 일반적으로 단백질 A는 고체 상 지지체 물질 상에 고정된다. 용어 "ProA"는 단백질 A가 공유결합에 의해 부착된 크로마토그래피 고체 지지체 매트릭스를 함유하는 친화성 크로마토그래피 수지 또는 컬럼을 또한 지칭한다.
용어 "크로마토그래피"는 혼합물의 개별적인 용질들이 이동상의 영향 하에 정지 매질을 통과하여 이동하는 속도에서의 차이의 결과로서, 또는 결합 및 용출 프로세스에서, 혼합물 내의 관심 용질이 혼합물 내의 다른 용질로부터 분리되는 프로세스를 지칭한다.
용어 "친화성 크로마토그래피" 및 "단백질 친화성 크로마토그래피"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 관심 단백질 또는 관심 항체가 생체특이적 리간드에 가역적으로 및 특이적으로 결합되는 단백질 분리 기술을 지칭한다. 바람직하게는, 생체특이적 리간드는 크로마토그래피 고체상 물질에 공유결합으로 부착되고, 용액이 크로마토그래피 고체상 물질에 접촉함에 따라 용액 내의 관심 단백질에 접근가능하다. 관심 단백질 (예를 들어, 항체, 효소, 또는 수용체 단백질)은 크로마토그래피 단계 동안 생체특이적 리간드 (예를 들어, 항원, 기질, 보조인자 또는 호르몬)에 대한 이의 특이적 결합 친화력을 유지하는 한편, 혼합물 내의 다른 용질 및/또는 단백질은 리간드에 감지할 수 있을 정도로 또는 특이적으로 결합하지 않는다. 고정된 리간드에 대한 관심 단백질의 결합은 관심 단백질은 고체상 매질 상의 고정된 리간드에 특이적으로 결합되어 유지되는 반면 오염 단백질 또는 단백질 불순물은 크로마토그래피 매질을 통과하도록 한다. 그후, 특이적으로 결합된 관심 단백질이 낮은 pH, 높은 pH, 높은 염, 경쟁 리간드 등으로 고정된 리간드로부터 활성 형태로 제거되고, 앞서 컬럼을 통과하도록 허용된 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 없이, 용출 완충제와 함께 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 임의의 성분이 이의 개별적인 특이적 결합 단백질, 예를 들어 항체를 정제하기 위한 리간드로서 사용될 수 있다.
용어 "비-친화성 크로마토그래피" 및 "비-친화성 정제"는 친화성 크로마토그래피가 사용되지 않은 정제 프로세스를 지칭한다. 비-친화성 크로마토그래피는 관심 분자 (예컨대 단백질, 예를 들어 항체)와 고체상 매트릭스 간의 비-특이적 상호작용에 의존하는 크로마토그래피 기술을 포함한다.
"양이온 교환 수지"는 음성 전하를 띠고, 따라서 고체상 상에 또는 이를 지나서 통과되는 수성 용액 내의 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온이 있는 고체상을 지칭한다. 고체상에 부착되어 양이온 교환 수지를 형성하는 음성 전하를 띠는 리간드는, 예를 들어, 카르복실레이트 또는 술포네이트일 수 있다. 시판되는 양이온 교환 수지에는 카르복시-메틸-셀룰로스, 아가로스 상에 고정된 술포프로필 (SP) (예를 들어, GE Healthcare의 SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™), 및 아가로스 상에 고정된 술포닐 (예를 들어, GE Healthcare의 S-SEPHAROSE FAST FLOW™)이 포함된다. "혼합 방식 이온 교환 수지"는 양이온성, 음이온성 및 소수성 모이어티(moiety)로 공유결합적으로 변형된 고체상을 지칭한다. 시판되는 혼합 방식 이온 교환 수지는 실리카 젤 고체상 지지 매트릭스에 부착된 약한 양이온 교환 기, 낮은 농도의 음이온 교환 기 및 소수성 리간드를 함유하는 BAKERBOND ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)이다.
용어 "음이온 교환 수지"는 양성 전하를 띠는, 예를 들어 하나 이상의 양성 전하를 띠는 리간드, 예컨대 4차 아미노기가 부착된 고체상을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 시판되는 음이온 교환 수지에는 DEAE 셀룰로스, QAE SEPHADEX™ 및 FAST Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare)이 포함된다.
"완충제"는 이의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH에서의 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어, 완충제의 원하는 pH에 따라 사용될 수 있는 다양한 완충제가 [Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)]에 기술되어 있다. 한 실시양태에서, 완충제의 pH는 약 2 내지 약 9, 별법적으로는 약 3 내지 약 8, 별법적으로는 약 4 내지 약 7, 별법적으로는 약 5 내지 약 7의 범위이다. 이러한 범위에서 pH를 제어할 완충제의 비-제한적인 예로는 MES, MOPS, MOPSO, 트리스(Tris), HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 및 암모늄 완충제, 뿐만 아니라 이들의 조합물이 포함된다.
"로딩(loading) 완충제"는 관심 폴리펩티드 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물을 이온 교환 수지 상에 로딩하는데 사용되는 것이다. 로딩 완충제의 전도성 및/또는 pH는 관심 폴리펩티드 분자 (및 일반적으로 하나 이상의 불순물)가 이온 교환 수지에 결합하도록 하거나 또는 관심 단백질은 컬럼을 통과하여 유동하는 한편 불순물은 수지에 결합하는 전도성 및/또는 pH이다.
"중간체 완충제"는 관심 폴리펩티드 분자를 용출시키기 전에 하나 이상의 불순물을 이온 교환 수지로부터 용출시키는데 사용된다. 중간체 완충제의 전도성 및/또는 pH는 하나 이상의 불순물은 이온 교환 수지로부터 방출되지만 유의한 양의 관심 폴리펩티드는 그렇지 않도록 하는 것이다.
본원에서 사용된 용어 "세정 완충제"는 관심 폴리펩티드 분자를 용출시키기 전에 이온 교환 수지를 세정 또는 재-평형화시키는데 사용된 완충제를 지칭한다. 편리하게, 세정 완충제 및 로딩 완충제가 동일할 수 있지만, 이것이 필수적이지는 않다.
"용출 완충제"는 관심 폴리펩티드를 고체상으로부터 용출시키는데 사용된다. 용출 완충제의 전도성 및/또는 pH는 관심 폴리펩티드가 이온 교환 수지로부터 용출되도록 하는 것이다.
"재생 완충제"는 이온 교환 수지가 재사용될 수 있도록 이온 교환 수지를 재생시키는데 사용될 수 있다. 재생 완충제의 전도성 및/또는 pH는 실질적으로 모든 불순물 및 관심 폴리펩티드를 이온 교환 수지로부터 제거하는데 필요한 전도성 및/또는 pH이다.
본원에서 사용된 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 2개의 수치 (예를 들어, 본 발명의 항체와 관련된 하나의 값 및 기준/비교물 항체와 관련된 또다른 값) 간의 유사성이 충분히 높아서, 당업자가 2개의 값 간의 차이가 상기 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정되는 생물학적 특성의 정황에서 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 없거나 없는 것으로 간주하는 것을 의미한다. 상기 2개의 값 간의 차이는, 예를 들어, 기준/비교물 값의 함수로서 약 50％ 미만, 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만, 및/또는 약 10％ 미만이다.
양 또는 수치와 관련하여 (화학적 환원 프로세스에 관해서는 아님) 본원에 사용된 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"이라는 구절은 2개의 수치 (일반적으로, 한 분자와 관련된 것 및 기준/비교물 분자와 관련된 다른 것) 간의 차이 정도가 충분히 높아서, 당업자가 2개의 값 간의 차이가 상기 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정되는 생물학적 특징의 정황에서 통계학적으로 유의한 것으로 간주하는 것을 의미한다. 상기 2개의 값 간의 차이는, 예를 들어, 기준/비교물 분자에 대한 값의 함수로서 약 10％ 초과, 약 20％ 초과, 약 30％ 초과, 약 40％ 초과, 및/또는 약 50％ 초과이다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 자신이 연결된 또다른 핵산을 운송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하도록 의도된다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이고, 이는 추가적인 DNA 절편이 내부로 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 지칭한다. 벡터의 또다른 유형은 파지 벡터이다. 벡터의 또다른 유형은 바이러스 벡터이고, 이때 추가적인 DNA 절편은 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터들은 이들이 도입된 숙주 세포 내에서 자가복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기원이 있는 박테리아 벡터, 및 에피솜 포유동물 벡터). 기타 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터들은 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터들은 본원에서 "재조합 발현 벡터", 또는 간단하게 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 서열 동일성 백분율을 달성한 후의 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열들을 정렬하기 위한 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, ％ 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 제작되었고, 소스(source) 코드가 사용자 문서와 함께 미국 저작국(U.S. Copyright Office) (Washington D.C., 20559)에 제출되어 미국 저작권 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 입수가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서의 사용에 대해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 소정의 아미노산 서열 A의 소정의 아미노산 서열 B에 대한, B와의 또는 B와 대조된 ％ 아미노산 서열 동일성(소정의 아미노산 서열 B에 대한, B와의 또는 B와 대조된 특정 ％ 아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로 별법적으로 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
100 × 분획 X/Y
[식중, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 A와 B의 정렬에서 이러한 프로그램에 의해 동일한 매치로 점수가 매겨진 아미노산 잔기의 개수이고,
Y는 B 내의 아미노산 잔기의 전체 개수이다].
아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B에 대한 ％ 아미노산 서열 동일성은 B의 A에 대한 ％ 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 ％ 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에서 기술된 바와 같이 수득된다.
"백분율 (％) 핵산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭을 도입하여, 최대 서열 동일성 백분율을 달성한 후의 기준 D 인자-코딩 서열 내의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드의 백분율로 정의된다. 백분율 핵산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그후, 더 긴 서열에 대해 서열 동일성이 계산되고, 즉, 더 짧은 서열이 더 긴 서열의 일부분과의 100％ 서열 동일성을 나타내더라도, 전체적인 서열 동일성은 100％ 미만일 것이다.
"치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지성 수단 양쪽 모두를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상에는 이미 장애에 걸린 대상, 뿐만 아니라 장애를 방지하려는 대상이 포함된다. 본원에서의 "치료"는 질환의 완화 및 특정 질환의 징후 및 증상의 완화를 포함한다.
"장애"는 단백질로의 치료가 이로울 임의의 용태이다. 여기에는 포유동물이 문제의 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적인 용태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다. 본원에서 치료될 장애의 비-제한적인 예로는 암종 및 알러지가 포함된다.
치료의 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 비-인간 고등 영장류, 기타 척추동물, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등이 포함되는, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
"간섭 RNA" 또는 "소형 간섭 RNA (siRNA)"는 표적 유전자의 발현을 감소시키는, 길이가 뉴클레오티드 약 30개 미만인 이중 가닥 RNA 분자이다. 공지된 방법을 사용하여 간섭 RNA를 확인 및 합성할 수 있고 ([Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)], WO/2003056012 및 WO2003064621), 예를 들어 Dharmacon (Lafayette, Colorado)로부터, siRNA 라이브러리가 시판된다. 빈번하게, siRNA는 유전자의 5' 말단을 표적화하도록 성공적으로 디자인될 수 있다.
II. 본 발명의 조성물 및 방법
본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 속하는 분자 생물학 등의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이같은 기술은 문헌에 충분하게 설명되어 있다. 예를 들어, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds., 1987 updated)]; [Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991)]; [Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991)]; [Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al., eds., Bartlett Publ. 1990)]; [Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990)]; [Recombinant DNA Methodology II (R. Wu et al., eds., Academic Press 1995)]; [PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991)]; [Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984)]; [Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987)]; [Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991)]; [Animal Cell Culture (J. Pollard et al., eds., Humana Press 1990)]; [Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney et al., eds., Alan R. Liss 1987)]; [Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al., eds., Wiley-Liss 1990)]; [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)] 연속 출판물; [Wirth M. and Hauser H. (1993)]; [Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996]; [Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989)]; [Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.)]; [Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al., eds. 1991)]; [Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996)]; [Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988]; [Antibody Engineering, 2nd edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995)]; 및 [Annual Review of Immunology] 연속 출판물; [Advances in Immunology] 연속 출판물.
1. 디술피드 결합 환원의 방지
본 발명은 재조합 생산 동안 단백질의 디술피드 결합의 환원을 방지하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 발효 후의 프로세싱 동안 재조합 단백질의 디술피드 결합의 환원을 방지하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 디술피드 결합을 함유하는 단백질의 대규모 생산용으로, 예컨대 제작 규모에서 가치가 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 5,000 L를 초과하는 규모의 대규모 단백질 생산에 유용하다.
디술피드 결합을 함유하는 재조합 단백질의 제작 동안 생산된 수확된 세포 배양액 (HCCF)의 프로세싱 동안 디술피드 결합 환원이 발생한다는 것이 실험적으로 발견되었다. 전형적으로, 이러한 환원은 특정 역치, 예를 들어, 약 30％ 내지 약 70％, 또는 약 40％ 내지 약 60％, 또는 약 50％ 내지 약 60％ 전체 세포 용해에 도달했을 때, 수확 작업 동안의 세포 용해, 특히 기계적인 세포 용해 후에 관찰된다. 이러한 역치는 생산된 단백질 (예를 들어 항체)의 성질, 재조합 숙주, 생산 시스템, 사용된 생산 파라메터 등에 따라 변할 것이고, 실험적으로 쉽게 결정될 수 있다.
이론적으로, 이같은 환원은 제작 프로세스 동안의 다양한 인자 및 조건으로부터 초래될 수 있고, 다양한 환원제에 의해 야기될 수 있다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 이러한 환원의 근원적인 원인이 HCCF 내의 활성 타이오레독신 (Trx) 또는 타이오레독신-유사 시스템이라는 인식을 기초로 한다.
Trx, 타이오레독신 리덕타제 (TrxR) 및 NADPH로 구성된 Trx 효소 시스템은 단백질 내의 디술피드 결합의 환원을 위한 수소 공여체 시스템이다. Trx는 티올-디술피드 교환을 통해 다수의 산화환원 반응을 촉매하는 CXXC 활성 부위 모티프가 있는 소형 단량체성 단백질이다. 산화된 Trx는 TrxR를 통해 NADPH에 의해 환원될 수 있다. 그후, 환원된 Trx가 단백질 내의 디술피드의 환원을 촉매할 수 있다. 타이오레독신 시스템에 필요한 NADPH는 펜토스 포스페이트 경로 및 당분해에서의 반응을 통해 제공된다. 본원에서 제시된 결과는 Trx 시스템의 활성에 필요한 NADPH가 헥소키나제에 의해 글루코스 및 ATP로부터 NADPH를 생성시키는 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 (G6PD) 활성에 의해 제공된다는 것을 실연한다 (도 4 참조). 이러한 세포성 효소들 (Trx 시스템, G6PD, 및 헥소키나제)이 이들의 기질과 함께 세포 용해 시 CCF 내로 방출되어, 환원이 발생하도록 한다. 따라서, Trx 효소 시스템, 또는 활성 Trx 시스템을 위한 성분, 예컨대 G6PD 및 헥소키나제 활성을 제공하는 상류 효소 시스템의 억제제에 의해 디술피드 환원이 방지될 수 있다.
이러한 효소 시스템들의 추가적인 상세사항에 대해, 또는 단백질 생산의 기타 상세사항과 관련하여, 하기의 문헌들을 예를 들어 참조한다: [Babson, A.L. and Babson, S.R. (1973) Kinetic Colorimetric Measurement of Serum Lactate Dehydrogenase Activity. Clin. Chem. 19:766-769]; [Michael W. Laird et al., "Optimization of BLyS Production and Purification from Eschericia coli", Protein Expression and Purification 39:237-246 (2005)]; [John C. Joly et al., "Overexpression of Eschericia coli Oxidoreductases Increases Recombinant Insulin-like Growth Factor-I Accumulation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2773-2777 (March 1998)]; [Dana C. Andersen et al., "Production Technologies for Monoclonal Antibodies and Their Fragments", Current Opinion in Biotechnology 15:456-462 (2004)]; [Yariv Mazor et al., "Isolation of Engineered, Full-length Antibodies from Libraries Expressed in Escherichia coli", Nature Biotech. 25, 563-565 (01 Jun 2007)]; [Laura C. Simmons et al., "Expression of Full-length Immunoglobulins in Escherichia coli: Rapid and Efficient Production of Aglycosylated Antibodies", Journal of Immunological Methods 263:133-147 (2002)]; [Paul H. Bessette et al., "Efficient Folding of Proteins with Multiple Disulfide Bonds in the Escherichia coli cytoplasm", Proc. Natl. Acad. Sci. 96(24):13703-08 (1999)]; [Chaderjian, W.B., Chin, E.T., Harris, R.J., and Etcheverry, T.M., (2005) "Effect of copper sulfate on performance of a serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed", Biotechnol. Prog. 21:550-553]; [Gordon G., Mackow M.C, and Levy H.R., (1995) "On the mechanism of interaction of steroids with human glucose 6-phosphate dehydrogenase", Arch. Biochem. Biophys. 318:25-29]; [Gromer S., Urig S., and Becker K., (2004) "The Trx System - From Science to Clinic", Medicinal Research Reviews, 24:40-89]; [Hammes G.G. and Kochavi D., (1962a) "Studies of the Enzyme Hexokinase. I. Steady State Kinetics at pH 8", J. Am. Chem. Soc. 84:2069-2073]; [Hammes G.G. and Kochavi D., (1962b) "Studies of the Enzyme Hexokinase. III. The Role of the Metal Ion", J. Am. Chem. Soc. 84:2076-2079]; [Johansson C, Lillig C.H., and Holmgren A., (2004) "Human Mitochondrial Glutaredoxin Reduces S-Glutathionylated Proteins with High Affinity Accepting Electrons from Either Glutathione or Thioredoxin Reductase", J. Biol. Chem. 279:7537-7543]; [Legrand, C., Bour, J.M., Jacob, C., Capiaumont J., Martial, A., Marc, A., Wudtke, M., Kretzmer, G., Demangel, C., Duval, D., and Hache J., (1992) "Lactate Dehydrogenase (LDH) Activity of the Number of Dead Cells in the Medium of Cultured Eukaryotic Cells as Marker", J. Biotechnol., 25:231-243]; [McDonald, M.R., (1955) "Yeast Hexokinase : ATP + Hexose --> Hexose-6-phosphate + ADP", Methods in Enzymology, 1:269-276, Academic Press, NY]; [Sols, A., DelaFuente, G., Villar-Palasi, C., and Asensio, C., (1958) "Substrate Specificity and Some Other Properties of Bakers' Yeast Hexokinase", Biochim Biophys Acta 30:92-101]; [Kirkpatrick D.L., Kuperus M., Dowdeswell M., Potier N., Donald L.J., Kunkel M., Berggren M., Angulo M., and Powis G., (1998) "Mechanisms of inhibition of the Trx growth factor system by antitumor 2-imidazolyl disulfides", Biochem. Pharmacol. 55:987-994]; [Kirkpatrick D.L., Watson S., Kunkel M., Fletcher S., Ulhaq S., and Powis G., (1999) "Parallel syntheses of disulfide inhibitors of the Trx redox system as potential antitumor agents", Anticancer Drug Des. 14:421-432]; [Milhausen, M., and Levy. H.R., (1975) "Evidence for an Essential Lysine in G6PD from Leuconostoc mesenteroides", Eur. J. Biochem. 50:453-461]; [Pleasants, J.C., Guo, W., and Rabenstein, D.L., (1989) "A comparative study of the kinetics of selenol/diselenide and thiol/disulfide exchange reactions", J. Am. Chem. Soc. 111:6553-6558]; [Whitesides, G.M., Lilburn, J.E., and Szajewski, R.P., (1977) "Rates of thioldisulfide interchange reactions between mono- and dithiols and Ellman's reagent", J. Org. Chem. 42:332-338]; 및 [Wipf P., Hopkins T.D., Jung J.K., Rodriguez S., Birmingham A., Southwick E.C., Lazo J.S., and Powis G, (2001) "New inhibitors of the Trx-TrxR system based on a naphthoquinone spiroketal natural product lead", Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2637-2641].
본 발명의 한 양상에 따르면, Trx, G6PD 및 헥소키나제 효소 시스템의 임의의 성분을 차단함으로써 디술피드 결합 환원이 방지될 수 있다. 이러한 효소 시스템들의 억제제는 본원에서 총괄적으로 "타이오레독신 억제제" 또는 "Trx 억제제"로 지칭된다. 전형적으로 Trx 억제제는 재조합 숙주 세포 및 배양 배지를 함유하는 세포 배양액 (CCF), 및/또는 원심분리, 여과 또는 유사한 분리 방법에 의한 수확 후 수득되는 수확된 세포 배양액 (HCCF)에 첨가된다. HCCF에는 무손상 숙주 세포가 없지만, 숙주 세포 단백질 및 기타 오염물 (DNA 포함)을 전형적으로 함유하며, 이들은 후속 정제 단계에서 제거된다. 따라서, Trx 억제제는 수확 전에 및/또는 수확 동안에, 바람직하게는 수확 전에 첨가될 수 있다.
별법적으로 또는 추가적으로, 재조합 단백질의 재조합 생산 동안의 발효 후 디술피드 결합 환원을 방지하기 위해 비-특이적 방법, 예컨대 공기 살포 또는 pH 조정이 또한 사용될 수 있다. 본원에서 구현되는 특정 환원 억제 방법이 하기 표 1에서 열거된다.
환원 억제 방법
방법1 목적
EDTA, EGTA 또는 시트레이트의 첨가 헥소키나제 억제
소르보스-1-포스페이트, 폴리포스페이트,
6-데옥시-6-플루오로글루코스,
2-C-히드록시-메틸글루코스, 자일로스, 또는
릭소스의 첨가		 헥소키나제 억제
에피안드로스테론 또는 데히드로에피안드로스테론
(DHEA)의 첨가		 G6PD 억제
피리독살 5'-포스페이트 또는
1-플루오로-2,4-디니트로벤젠의 첨가		 G6PD 억제
금속 이온 예컨대 Cu2+, Zn2+, Hg2+, Co2+ 또는
Mn2+의 첨가		 Trx 시스템 억제
알킬-2-이미다졸릴 디술피드 및 관련 화합물
(예를 들어, 1 메틸프로필-2-이미다졸릴 디술피드2)
또는 나프토퀴논 스피로케탈 유도체 (예를 들어,
팔마루마이신 CP1 2)의 첨가		 Trx 억제
오로티오글루코스 (ATG) 또는
오로티오말레이트 (ATM)의 첨가		 TrxR 억제
공기 살포 G6D 및 NADPH 고갈; 산화제
시스틴 산화제
산화된 글루타티온 산화제
6.0 미만으로의 pH 조정 티올-디술피드 교환 속도 및
Trx 시스템 활성의 감소
1 수확 전에 CCF에 첨가되거나 수확 직후 HCCF에 첨가됨
2 현재 시판되지 않음
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 "Trx 억제제"에는 하기의 것들이 비제한적으로 포함된다: (1) Trx의 직접적인 억제제, 예컨대 알킬-2-이미다졸릴 디술피드 및 관련 화합물 (예를 들어, 1 메틸프로필-2-이미다졸릴 디술피드) ([Kirkpatrick et al., 1998 & 1999, 상기 문헌]) 및 나프토퀴논 스피로케탈 유도체 (예를 들어, 팔마루마이신 CP1]) ([Wipf et al., 2001, 상기 문헌]); (2) TrxR의 비가역적 억제제의 예인 오로티오글루코스 (ATG) 및 오로티오말레이트 (ATM)와 같은 금 착물이 포함되는, TrxR의 특이적 억제제 (예를 들어, [Gromer et al., 2004]의 리뷰 참조); (3) 티올 및 셀레놀과 쉽게 착물을 형성할 수 있고, 따라서 본 발명의 실시양태에서 TrxR 또는 Trx의 억제제로서 사용될 수 있는 금속 이온, 예컨대 Hg2+, Cu2+, Zn2+, Co2+, 및 Mn2+; (4) G6PD의 억제제, 예를 들어, 피리독살 5'-포스페이트 및 1 플루오로-2,4 디니트로벤젠 ([Milhausen and Levy 1975, 상기 문헌]), 특정 스테로이드, 예컨대 데히드로에피안드로스테론 (DHEA) 및 에피안드로스테론 (EA) ([Gordon et al., 1995, 상기 문헌]); 및 (4) 금속 이온, 예를 들어 Mg2+의 킬레이터, 예컨대 EDTA, 및 SH 기와 반응하는 화합물, 소르보스-1-포스페이트, 폴리포스페이트, 6-데옥시-6-플루오로글루코스, 2-C-히드록시-메틸글루코스, 자일로스 및 릭소스가 포함되는, 헥소키나제 활성 (및 이에 의한 G6PD용 G6P의 생산)의 억제제 ([Sols et al., 1958, 상기 문헌]; [McDonald, 1955, 상기 문헌]); 추가적인 헥소키나제 억제제가 발명의 영문 명칭이 "Hexokinase Inhibitors"인 미국 특허 번호 5,854,067에 개시되어 있다. 이러한 억제제들이 설명을 위해서만 열거된다는 것이 이해될 것이다. 또다른 Trx 억제제가 존재하고, 단독으로 또는 다양한 조합으로 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.본 발명의 방법에서 사용하기 위한 "Trx 억제제"에는 생산 캠페인 동안의 다양한 시점에 Trx 시스템, 펜토스 포스페이트 경로 또는 헥소키나제의 효소 수준을 줄이는 것에 의해 재조합적으로 생산된 항체 또는 단백질의 환원을 감소시키거나 방지할 수 있는 시약이 또한 포함된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 siRNA, 안티센스 뉴클레오티드, 또는 항체의 사용에 의해 이러한 효소 수준 감소가 달성될 수 있다. CHO 세포에서 발견되는 바와 같은 유전자들에 대한 표적화된 siRNA 또는 안티센스 뉴클레오티드를 디자인하기 위해, 이러한 유전자 서열들이 상이한 생물 내의 효소들을 표적화하기 위한 서열을 선별하기 위해 공공 데이터베이스로부터 입수가능하다. 예를 들어, 이. 콜라이 및 마우스 Trx 시스템의 유전자에 대해 하기의 실시예 9를 참조한다.상기 논의된 억제제들을 사용하는 것에 더하여, 본 발명의 특정 실시양태에서, HCCF에 공기를 살포하여 HCCF 내의 산화성 산화환원 전위를 유지시킴으로써 정제된 재조합 단백질의 환원을 방지하는 것이 또한 가능하다. 이는 환원된 형태의 Trx 및 TrxR를 지속적으로 산화시킴으로써 글루코스, G6P 및 NADPH를 고갈시킬 수 있는 비-지향성 수단이다. 예를 들어, HCCF 탱크의 공기 살포는 분 당 약 100 ℓ 내지 약 200 ℓ, 예를 들어, 150 ℓ의 기류로 수행될 수 있다. 종점 백분율의 포화에 도달하도록 공기 살포가 수행될 수 있다; 예를 들어, HCCF가 공기로 약 100％ 포화될 때까지, HCCF가 공기로 약 30％ 포화될 때까지, 또는 HCCF가 공기로 약 100％ 내지 약 30％ 사이로 포화될 때까지 공기 살포가 계속될 수 있다. 원하는 억제성 효과에 필요한 용해 산소 (dO2)의 최소량은 생산된 항체 또는 기타 재조합 단백질에 또한 좌우될 것이다. 따라서, 예를 들어, 항체 2H7 (변이체 A)의 생산 동안 약 10％ dO2 (또는 연속 스트림에 대해 약 10 sccm)에 원하는 효과가 있을 것인 한편, 아포맵은 더 높은 (약 30％) dO2를 필요로 할 수 있다.본 발명의 추가적인 실시양태에서, 재조합 단백질의 환원을 차단하는데 사용가능한 또다른 비-지향성 방법은 HCCF의 pH를 저하시키는 것이다. 이러한 실시양태는 더 낮은 pH 값에서 특히 느린 티올-디술피드 교환의 장점을 취한다 ([Whitesides et al., 1977, 상기 문헌]; [Pleasants et al., 1989, 상기 문헌]). 따라서, Trx 시스템의 활성이 6 미만의 pH에서 유의하게 더 낮아서, 재조합 단백질, 예컨대 오크렐리주맵의 환원이 억제될 수 있다.
비-지향성 접근법들은 서로 및/또는 하나 이상의 Trx 억제제의 사용과 또한 조합될 수 있다.
세포 배양 프로세스의 완료 후, 바람직하게는 수확 전의 CCF에 또는 수확 직후의 HCCF에, 하나 이상의 Trx 억제제를 사용함으로써 및/또는 비-지향성 접근법을 적용함으로써 디술피드 결합 환원이 억제 (즉, 부분적으로 또는 완전히 차단)될 수 있다. 최적의 적용 시간 및 적용 방식, 및 유효량은 정제될 단백질의 성질, 재조합 숙주 세포, 및 사용된 특정 생산 방법에 좌우된다. 최적 파라메터의 결정은 충분히 당업자의 기술 내에 속한다.
예를 들어, 포유동물 세포 배양 프로세스, 예컨대 본원에서의 실시예에 기술된 CHO 항체 생산 프로세스에서, 황산구리 (5수화물 또는 무수 형태의 CuSO4)가 Trx 억제제로 사용된다면, 이는 약 5 μM 내지 약 100 μM, 예컨대 약 10 μM 내지 약 80 μM, 바람직하게는 약 15 μM 내지 약 50 μM 범위의 농도로 CCF 또는 HCCF를 보충하기 위해 첨가될 수 있다. 일부 세포 배양물은 구리를 이미 함유하기 때문에 (예를 들어, 본원에서의 실시예에서 사용된 CHO 세포 배양물에 대해 약 0.04 μM CuSO4), 이러한 양은 세포 배양물 내에 이미 존재하는 구리 (존재한다면)에 더한 것이다. 용해도가 문제가 되지 않는 한, 임의의 구리 (II) 염이 CuSO4 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 아세트산구리 및 염화구리 (양쪽 모두 물에 가용성임)가 CuSO4 대신 사용될 수 있다. 최소 유효 농도는 생산된 항체 및 억제제가 사용되는 단계에 또한 좌우될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 황산구리가 용해 전에 첨가되는 경우, 항체 2H7 (변이체 A)에 대한 최소 유효 농도는 약 30 μM이고, 아포맵에 대해서는 약 75 μM이며, 항체 변이체 C (표 2 참조)에 대해서는 약 50 μM이다. 황산구리가 CC 배지에 첨가되는 경우, 항체 2H7 (변이체 A)에 대한 최소 유효 농도는 약 15 μM이고, 아포맵에 대해서는 약 25 μM이며, 항체 변이체 C에 대해서는 약 20 μM이다. 한 전형적인 최소 CuSO4 억제제 농도는 2× Trx 농도 (또는 Trx 등가)이다.
세포 용해 정도, 사용된 재조합 숙주 세포, 및 생산 프로세스의 기타 파라메터에 따라, EDTA가 광범위한 농도 범위로 사용될 수 있다. 예를 들어, CHO 또는 기타 포유동물 숙주 세포를 사용하는 경우, 세포 용해 정도에 따라, 전형적으로 EDTA는 약 5 mM 내지 약 60 mM 사이, 예컨대 약 10 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 40 mM의 농도로 첨가될 수 있다. 더 낮은 정도의 세포 용해에 대해, 더 낮은 농도의 EDTA가 충분할 것인 한편, 약 75％ - 100％의 세포 용해에 대해, 필요한 EDTA 농도는 더 높고, 예를 들어, 약 20 mM 내지 약 40 mM이다. 최소 유효 농도는 생산된 항체에 또한 의존적일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항체 2H7 (변이체 A)에 대해, 최소 유효 EDTA 농도는 약 10 mM이다.
전형적으로, Trx 억제제로서의 DHEA는 더 낮은 농도, 예컨대 약 0.05 mM 내지 약 5 mM, 바람직하게는 약 0.1 mM 내지 약 2.5 mM의 농도 범위에서 효과적이다.
기타 Trx 억제제, 예컨대 오로티오글루코스 (ATG) 및 오로티오말레이트 (ATM)는 μM 농도 범위에서 디술피드 결합의 환원을 억제한다. 따라서, 예를 들어, ATG 또는 ATM는 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 농도로 첨가될 수 있다. 최소 억제 농도는 실제 조건에 따라 변하지만, ATG 및 ATM에 대해서, 이는 전형적으로 약 4× TrxR 농도이다.
모든 억제제가 과량으로 사용될 수 있고, 따라서 시스템 내의 Trx 또는 TrxR의 양을 아는 것이 항상 필요하지는 않다는 것을 유념한다.
바람직한 실시양태에서, 제작 프로세스에서 사용된 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다 ([Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]). 기타 포유동물 숙주 세포에는 하기의 것들이 비제한적으로 포함된다: SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, [Graham, et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트(buffalo rat) 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 ([Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2): 및 골수종 또는 림프종 세포 (예를 들어 Y0, J558L. P3 및 NS0 세포) (미국 특허 번호 5,807,715 참조).
본원에서의 폴리펩티드의 생산을 위한 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포주 DP12 (CHO K1 dhfr-)이다. 이는 실험 실습에서 광범위하게 사용되는, 가장 잘 알려진 CHO 세포주 중 하나이다 (예를 들어, EP 0,307,247 (1989년 3월 15일 공개) 참조). 추가적으로, 또다른 CHO-K1 (dhfr-) 세포주들이 공지되어 있고, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 생산하는데 사용되는 포유동물 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지 예컨대 햄(Ham) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM, Sigma)가 숙주 세포를 배양하는데 적절하다. 또한, [Ham and Wallace (1979), Meth. in Enz. 58:44], [Barnes and Sato (1980), Anal. Biochem. 102:255], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 또는 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; 미국 특허 번호 Re. 30,985; 또는 미국 특허 번호 5,122,469 (이들 모두의 개시내용은 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술된 배지들 중 임의의 것을 숙주 세포에 대한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이러한 배지에 필요하다면 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오시드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 GENTAMYCIN™ 약물), 미량원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 보충될 수 있다. 임의의 또다른 필요한 보충물이 당업자에게 공지된 적합한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현에 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포에서의 재조합 항체의 생산, 회수 및 정제를 위한 프로토콜은 하기의 단계들을 포함할 수 있다:
교반 탱크 생물반응기 시스템에서 세포가 배양될 수 있고, 페드-뱃치(fed batch) 배양 절차가 사용된다. 바람직한 페드-뱃치 배양에서, 포유동물 숙주 세포 및 배양 배지가 배양 용기로 먼저 공급되고, 배양 종결 전에 주기적으로 세포 및/또는 생성물을 수확하면서 또는 수확하지 않으면서, 배양 동안 추가적인 배양 영양소가 연속적으로 또는 불연속적인 증분으로 배양물에 피딩된다. 페드-뱃치 배양은 주기적으로 전체 배양물 (세포 및 배지 포함)을 제거하고 신선한 배지로 교체하는 반-연속 페드-뱃치 배양을 예를 들어 포함할 수 있다. 페드-뱃치 배양은 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포 및 모든 배양 영양소 포함)이 배양 프로세스를 시작할 때 배양 용기에 공급되는 단순한 뱃치 배양과 구별된다. 프로세스 동안 배양 용기로부터 상등액이 제거되지 않는 한, 페드-뱃치 배양은 관류 배양과 또한 구별될 수 있다 (관류 배양에서는, 세포가 예를 들어 여과, 캡슐화, 미세담체에의 고착 등에 의해 배양물에서 구속되고, 배양 배지가 연속적으로 또는 간헐적으로 도입되고 배양 용기로부터 제거된다).
추가적으로, 구현되는 특정 숙주 세포 및 특정 생산 계획에 적절할 수 있는 임의의 체계 또는 관례에 따라 배양물의 세포가 증식될 수 있다. 따라서, 단일 단계 또는 다단계 배양 절차가 사용될 수 있다. 단일 단계 배양에서는, 숙주 세포가 배양 환경 내로 접종되고, 세포 배양물의 단일 생산기 동안 프로세스들이 사용된다. 별법적으로, 다단계 배양이 사용될 수 있다. 다단계 배양에서는, 포가 다수의 단계 또는 기에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포 (가능하게는 저장물로부터 꺼내짐)가 성장 및 높은 생육력을 촉진하는데 적절한 배지 내로 접종되는 제1 단계 또는 성장기에서 세포가 성장될 수 있다. 숙주 세포 배양물에 신선한 배지를 첨가함으로써 적절한 기간 동안 세포가 성장기에서 유지될 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포 배양물의 성장기에서 포유동물 세포의 성장을 강화하도록 페드-뱃치 또는 연속 세포 배양 조건이 고안될 수 있다. 성장기에서, 성장용으로 최대화된 조건 및 기간으로 세포가 성장된다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH, 용해 산소 (dO2) 등은 특정 숙주와 함께 사용된 것이며, 당업자에게 명백할 것이다. 일반적으로, 산 (예를 들어, CO2) 또는 염기 (예를 들어, Na2CO3 또는 NaOH)를 사용하여 pH가 약 6.5 내지 7.5 사이의 수준으로 조정된다. 포유동물 세포 예컨대 CHO 세포를 배양하기 위한 적절한 온도 범위는 약 30℃ 내지 38℃ 사이이고, 적절한 dO2는 5-90％의 공기 포화이다.
특정 기에서, 세포 배양물의 생산 기 또는 단계에 접종하는데 세포가 사용될 수 있다. 별법적으로, 상기 기술된 바와 같이, 생산 기 또는 단계는 접종 또는 성장 기 또는 단계와 연속적일 수 있다.
전형적으로, 세포 배양물의 생산기 동안의 세포 배양 환경이 제어된다. 따라서, 당단백질이 생산되는 경우, 생성된 당단백질 내에서 원하는 시알산 함량이 달성되도록 포유동물 숙주 세포의 세포 특이적 생산성에 영향을 미치는 인자들이 조작될 수 있다. 바람직한 양상에서, 세포 배양물의 생산기에 대한 파라메터들이 고용되는 세포 배양물의 전이기가 세포 배양 프로세스의 생산기에 선행한다. 이러한 프로세스의 추가적인 상세사항이 미국 특허 번호 5,721.121, 및 [Chaderjian et al., Biotechnol. Prog. 21(2):550-3 (2005)]에서 확인되고, 이들의 전체적인 개시내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
발효 후, 단백질이 정제된다. 세포 잔해물로부터의 단백질의 정제를 위한 절차는 단백질의 발현 부위에 먼저 좌우된다. 일부 단백질은 세포로부터 주변의 성장 배지 내로 직접적으로 분비되게 될 수 있다; 또다른 단백질들은 세포내에서 제조된다. 후자의 단백질에 대해, 정제 프로세스의 제1 단계는 세포의 용해를 수반하고, 이는 기계적인 전단, 삼투압 충격, 또는 효소 처리를 포함하는 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 이같은 파괴로 세포의 전체 내용물이 균질화물 내로 방출되고, 또한 작은 크기로 인해 제거하기 어려운 세포하 단편들이 생산된다. 이들은 일반적으로 분별 원심분리 또는 여과에 의해 제거된다. 단백질 생산 실행 과정 중의 세포의 자연사 및 세포내 숙주 세포 단백질 및 성분들의 방출로 인해, 직접적으로 분비되는 단백질에서도 더 작은 규모이긴 하지만 동일한 문제가 발생한다.
일단 관심 단백질을 함유하는 정화된 용액이 수득되면, 세포에 의해 생산된 다른 단백질들로부터 이를 분리하는 것이 여러 크로마토그래피 기술들의 조합을 사용하여 일반적으로 시도된다. 이러한 기술들은 단백질들의 전하, 소수성 정도 또는 크기를 기초로 단백질들의 혼합물을 분리한다. 이러한 기술들 각각에 대해 여러 상이한 크로마토그래피 수지들이 이용가능하여, 수반되는 특정 단백질에 대한 정제 계획이 정확하게 맞춰지도록 한다. 이러한 분리 방법들 각각의 본질은 단백질들을 긴 컬럼의 아래쪽으로 상이한 속도로 이동하도록 하여, 단백질이 컬럼 아래쪽으로 더 이동할수록 증가되는 물리적 분리를 달성할 수 있다는 것, 또는 단백질들이 분리 매질에 선택적으로 부착된 후, 상이한 용매에 의해 차별적으로 용출되게 할 수 있다는 것이다. 일부 경우에, 불순물은 컬럼에 특이적으로 부착되고 관심 단백질은 그렇지 않은 경우에, 즉 관심 단백질은 "통과물(flow-through)" 내에 존재하는 경우에, 원하는 단백질이 불순물로부터 분리된다. 따라서, 포유동물 숙주 세포의 세포 배양물로부터의 재조합 단백질의 정제는 1회 이상의 친화성 (예를 들어 단백질 A) 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피는 단백질의 정제에 통상적으로 사용되는 크로마토그래피 기술이다. 이온 교환 크로마토그래피에서, 주변 완충제의 이온 강도가 낮다는 조건 하에, 용질 표면 상의 전하를 띤 패치(patch)가 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 반대 전하에 유인된다. 완충제의 이온 강도 (즉, 전도도)를 증가시켜 이온 교환 매트릭스의 전하를 띠는 부위에 대해 용질과 경쟁시킴으로써 용출이 일반적으로 달성된다. 용질의 용출을 달성하는 또다른 방식은 pH를 변화시킴으로써 용질의 전하를 변경시키는 것이다. 전도도 또는 pH에서의 변화는 점진적일 수 있거나 (구배 용출), 또는 단계적일 수 있다 (단계 용출). 과거에는, 이러한 변화가 진행성이었다; 즉 pH 또는 전도도가 단일 방향으로 증가 또는 감소된다.
치료적 항체의 공업적 정제의 추가적인 상세사항에 대해서는, 예를 들어, [Fahrner et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18:301-27 (2001)]를 참조하고, 이의 전체적인 개시내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
포유동물 숙주 세포에 더하여, 또다른 진핵생물 생물들이 재조합 단백질의 발현을 위한 숙주 세포로 사용될 수 있다. 효모 숙주 세포, 예컨대 통상적인 베이커(baker) 효모 또는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현을 위해, 적절한 벡터에는 2-마이크론 플라스미드를 기초로 하는, 에피솜-복제 벡터, 통합 벡터, 및 효모 인공 염색체 (YAC) 벡터가 포함된다. 이종 단백질의 재조합 생산에 적절한 또다른 효모에는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) ([Beach and Nurse, Nature. 290:140 (1981)]; EP 139,383 (1985년 5월 2일 공개)); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 번호 4,943,529; [Fleer et al., Bio/Technology, 2:968-975 (1991)]), 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; [Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)]), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906; [Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)]), 클루이베로마이세스 테르모톨레란스(K. Thermotolerans), 및 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070; [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) ([Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)]); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 예컨대 슈완니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) (EP 394,538 (1990년 10월 31일 공개)); 및 필라멘트형 진균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (WO 91/00357 (1991년 1월 10일 공개)), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주 예컨대 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans) ([Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983)]; [Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983)]; [Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)]) 및 아스페르길루스 니게르(A. niger) ([Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)])가 포함된다. 메틸영양성 효모가 본원에서 적절하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로엑케라(Kloeckera), 피치아, 사카로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis), 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 구성된 속으로부터 선택된 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 클래스의 효모들의 예시적인 특정 종의 목록을 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 확인할 수 있다. 열거된 효모들 및 기타 효모들에 대한 발현 시스템이 당업계에 주지되어 있고/있거나 시판된다.
곤충 숙주 세포, 예컨대 Sf9 세포에서의 발현을 위해, 적절한 벡터에는 배큘로바이러스 벡터가 포함된다. 식물 숙주 세포, 특히 쌍자엽 식물 숙주, 예컨대 담배에서의 발현을 위해, 적절한 발현 벡터에는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드로부터 유래된 벡터가 포함된다.
본 발명의 방법은 원핵생물 숙주 세포의 배양물에 또한 확장된다. 본 발명의 수단에 의해 보호될 항체 및 기타 단백질을 발현하는데 적절한 원핵생물 숙주 세포에는 고세균(Archaebacteria) 및 진정세균(Eubacteria), 예컨대 그람(Gram)-음성 또는 그람-양성 생물이 포함된다. 유용한 박테리아의 예로는 에쉐리키아(Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이), 바실루스(Bacillus) (예를 들어, 바실루스 서브틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla), 또는 파라코쿠스(Paracoccus)가 포함된다. 한 실시양태에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예로는 W3110 균주 ([Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325), 및 유전자형이 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR인 균주 33D3이 포함되는 이의 유도체가 포함된다 (미국 특허 번호 5,639,635). 기타 균주 및 이의 유도체, 예컨대 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적절하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적인 것이다. 유전자형이 정의된 상기 언급된 박테리아 중 임의의 것의 유도체를 구축하는 당법이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기술되어 있다. 박테리아의 세포 내에서의 레플리콘의 복제성을 고려하여 적합한 박테리아를 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410과 같은 주지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하는데 사용된 경우 이. 콜라이, 세라티아, 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적절하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해성 효소를 분비하여야 하고, 세포 배양물 내에 추가적인 프로테아제 억제제가 바람직하게 혼입될 수 있다.
비-포유동물 숙주 세포 배양물로부터의 재조합 단백질의 생산, 회수 및 정제를 위한 방법 또한 당업계에 주지되어 있다. 폴리펩티드가 비-포유동물 세포, 예를 들어, 미생물 예컨대 진균류 또는 이. 콜라이에서 생산되는 경우, 폴리펩티드는 세포 내부에서 또는 원형질막주위공간에서 회수될 것이다 ([Kipriyanov and Little, Molecular Biotechnology, 12:173-201 (1999)]; [Skerra and Pluckthun, Science, 240:1038-1040 (1988)]). 따라서, 추출 예컨대 세포 용해에 의해 단백질을 세포로부터 세포외 배지로 방출시키는 것이 필요하다. 이같은 파괴로 세포의 전체 내용물이 균질화물 내로 방출되고, 또한 작은 크기로 인해 제거하기 어려운 세포하 단편들이 생산된다. 이들은 일반적으로 분별 원심분리 또는 여과에 의해 제거된다.
기계적인 파괴 기술 예컨대 균질화 또는 헤드 밀링을 사용하여 세포 용해가 전형적으로 달성된다. 일반적으로 관심 단백질이 효과적으로 유리되지만, 이같은 기술에는 몇가지 단점이 있다 ([Engler, Protein Purification Process Engineering, Harrison eds., 37-55 (1994)]). 프로세싱 동안 종종 발생하는 온도 증가가 단백질의 불활성화를 초래할 수 있다. 또한, 생성된 현탁액이 광범위한 스펙트럼의 오염 단백질, 핵산 및 다당류를 함유한다. 핵산 및 다당류는 용액 점도를 증가시켜, 잠재적으로, 원심분리, 교차-흐름 여과 또는 크로마토그래피에 의한 후속 프로세싱을 복잡하게 한다. 이러한 오염물들과 관심 단백질의 복합적인 회합은 정제 프로세스를 복잡하게 할 수 있고, 허용가능하지 않은 낮은 수율을 초래할 수 있다. 미생물 발효 브로스 또는 균질화물로부터 이종 폴리펩티드를 정제하기 위한 개선된 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,169,908에 기술되어 있고, 이의 전체적인 개시내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
본원에 기술된 발효, 회수 및 정제 방법은 오직 설명 목적을 위한 것임이 강조된다. 본 발명의 방법은 재조합 단백질의 생산, 회수 및 정제를 위해 개발된 임의의 제작 프로세스와 조합될 수 있다.
2. 항체
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 치료 항체 및 진단 항체가 포함되는 항체의 사슬내 및/또는 사슬간 디술피드 결합의 환원을 방지하는데 사용된다. 본 발명의 범주 내의 항체는 하기의 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 트라스투주맵 (HERCEPTIN®)이 포함되는 항-HER2 항체 ([Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992)], 미국 특허 번호 5,725,856); 항-CD20 항체 예컨대 키메라 항-CD20 "C2B8" (미국 특허 번호 5,736,137) (RITUXAN®), 2H7 항체의 키메라 또는 인간화 변이체 (미국 특허 번호 5,721,108B1), 또는 토시투모맵 (BEXXAR®); 항-IL-8 ([St John et al., Chest, 103:932 (1993)], 및 국제 공개 번호 WO 95/23865); 인간화 및/또는 친화력 성숙 항-VEGF 항체 예컨대 인간화 항-VEGF 항체 huA4.6.1 AVASTIN®이 포함되는 항-VEGF 항체 ([Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992)], 국제 공개 번호 WO 96/30046, 및 WO 98/45331 (1998년 10월 15일 공개)); 항-PSCA 항체 (WO01/40309); S2C6 및 이의 인간화 변이체가 포함되는 항-CD40 항체 (WO00/75348); 항-CD11a (미국 특허 번호 5,622,700, WO 98/23761, [Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991)], 및 [Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)]); 항-IgE ([Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)], 및 국제 공개 번호 WO 95/19181); 항-CD18 (미국 특허 번호 5,622,700 (1997년 4월 22일 허여), 또는 WO 97/26912 (1997년 7월 31일 허여)); 항-IgE (E25, E26 및 E27 포함; 미국 특허 번호 5,714,338 (1998년 2월 3일 허여) 또는 미국 특허 번호 5,091,313 (1992년 2월 25일 허여), WO 93/04173 (1993년 3월 4일 공개), 또는 국제 출원 번호 PCT/US98/13410 (1998년 6월 30일 출원), 미국 특허 번호 5,714,338); 항-Apo-2 수용체 항체 (WO 98/51793 (1998년 11월 19일 공개)); cA2 (REMICADE®), CDP571 및 MAK-195가 포함되는 항-TNF-α 항체 (미국 특허 번호 5,672,347 (1997년 9월 30일 허여), [Lorenz et al., J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996)], 및 [Dhainaut et al., Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)] 참조); 항-조직 인자 (TF) (유럽 특허 번호 0 420 937 B1 (1994년 11월 9일 허여)); 항-인간 α4β7 인테그린 (WO 98/06248 (1998년 2월 19일 공개)); 항-EGFR (WO 96/40210 (1996년 12월 19일 공개)의 키메라화 또는 인간화 225 항체); 항-CD3 항체 예컨대 OKT3 (미국 특허 번호 4,515,893 (1985년 5월 7일 허여)); 항-CD25 또는 항-tac 항체 예컨대 CHI-621 (SIMULECT®) 및 (ZENAPAX®) (미국 특허 번호 5,693,762 (1997년 12월 2일 허여) 참조); 항-CD4 항체 예컨대 cM-7412 항체 ([Choy et al., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)]); 항-CD52 항체 예컨대 CAMPATH-1H ([Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)]); 항-Fc 수용체 항체 예컨대 FcγRI에 대해 지시된 M22 항체 ([Graziano et al., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)]); 항-암배아 항원 (CEA) 항체 예컨대 hMN-14 ([Sharkey et al., Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)]); huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6이 포함되는 유방 상피 세포에 대해 지시된 항체 ([Ceriani et al., Cancer Res. 55(23):5852s-5856s (1995)]; 및 [Richman et al., Cancer Res. 55(23 Supp):5916s-5920s (1995)]); C242와 같은 결장 암종 세포에 결합하는 항체 ([Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996)]); 항-CD38 항체, 예를 들어 AT 13/5 ([Ellis et al., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)]); 항-CD33 항체 예컨대 Hu M195 ([Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)]) 및 CMA-676 또는 CDP771; 항-CD22 항체 예컨대 LL2 또는 림포사이드(LymphoCide) ([Juweid et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)]); 항-EpCAM 항체 예컨대 17-1A (PANOREX®); 항-GpIIb/IIIa 항체 예컨대 앱식시맵(abciximab) 또는 c7E3 Fab (REOPRO®); 항-RSV 항체 예컨대 MEDI-493 (SYNAGIS®); 항-CMV 항체 예컨대 PROTOVIR®; 항-HIV 항체 예컨대 PRO542; 항-간염 항체 예컨대 항-Hep B 항체 OSTAVIR®; 항-CA 125 항체 오바렉스(OvaRex); 항-이디오타입 GD3 에피토프 항체 BEC2; 항-αvβ3 항체 VITAXIN®; 항-인간 신세포 암종 항체 예컨대 ch-G250; ING-1; 항-인간 17-1A 항체 (3622 W94); 항-인간 결장직장 종양 항체 (A33); GD3 강글리오시드에 대해 지시된 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평세포 암종 (SF-25); 및 항- 인간 백혈구 항원 (HLA) 항체 예컨대 스마트(Smart) ID10 및 항-HLA DR 항체 옹콜림(Oncolym) (Lym-1). 본원에서의 항체에 대한 바람직한 표적 항원은 HER2 수용체, VEGF, IgE, CD20, CD11a, 및 CD40이다.
이러한 항체들 중 다수가 암이 포함되는 다양한 질환을 치료하기 위해 임상 실습에서 광범위하게 사용된다..
특정한 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하기의 항체 및 재조합 단백질의 생산에 사용된다.
항-CD20 항체
리툭시맵(Rituximab) (RITUXAN®)은 CD20 항원에 대해 지시된, 유전자 조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 리툭시맵은 미국 특허 번호 5,736,137 (1998년 4월 7일 허여, Anderson 등)에서 "C2B8"으로 칭해진 항체이다. 리툭시맵은 재발된 또는 난치성의 저등급 또는 소포형, CD20 양성, B-세포 비-호지킨 림프종 환자의 치료에 지시된다. 시험관내 작용 메커니즘 연구는 리툭시맵이 인간 보체에 결합하여 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 통해 림프모양 B-세포주를 용해시킨다는 것을 실연하였다 ([Reff et al., Blood 83(2):435-445 (1994)]. 추가적으로, 이는 항체-의존적 세포형 세포독성 (ADCC)에 대한 분석법에서 현저한 활성을 갖는다. 더욱 최근에는, 리툭시맵은, 다른 항-CD19 및 항-CD20 항체와는 달리, 삼중수소화 티미딘 혼입 분석법에서 항-증식 효과가 있고 세포자멸사를 직접적으로 유도하는 것으로 나타났다 ([Maloney et al. Blood 88(10):637a (1996)]). 리툭시맵과 화학요법 및 독소 간의 상승작용이 또한 실험적으로 관찰되었다. 특히, 리툭시맵은 약물-저항성 인간 B-세포 림프종 세포주를 독소루비신, CDDP, VP-16, 디프테리아 독소 및 리신(ricin)의 세포독성 효과에 민감하게 한다 ([Demidem et al., Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997)]). 생체내 임상전 연구는 리툭시맵이 사이노몰거스 원숭이의 말초혈, 림프절, 및 골수로부터, 아마도 보체 및 세포-매개 프로세스를 통해, B 세포를 결핍시킨다는 것을 나타냈다 ([Reff et al., Blood 83:435-445 (1994)]).
CD20 항체에 관한 특허 및 특허 공개에는 미국 특허 번호 5,776,456, 5,736,137, 6,399,061, 및 5,843,439, 뿐만 아니라 미국 특허 출원 번호 US 2002/0197255A1, US 2003/0021781 A1, US 2003/0082172 A1, US 2003/0095963 A1, US 2003/0147885 A1 (Anderson 등); 미국 특허 번호 6,455,043 B1 및 WO00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO00/27428 (Grillo-Lopez & White); WO00/27433 (Grillo-Lopez & Leonard); WO00/44788 (Braslawsky 등); WO01/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter & White); WO01/10460 (White & Grillo-Lopez); 미국 출원 번호 US2002/0006404 및 WO02/04021 (Hanna & Hariharan); 미국 출원 번호 US2002/0012665 A1 및 WO01/74388 (Hanna, N.); 미국 출원 번호 US 2002/0058029 A1 (Hanna, N.); 미국 출원 번호 US 2003/0103971 A1 (Hariharan & Hanna); 미국 출원 번호 US2002/0009444A1, 및 WO01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO01/97858 (White. C): 미국 출원 번호 US2002/0128488A1 및 WO02/34790 (Reff, M.); WO02/060955 (Braslawsky 등); WO2/096948 (Braslawsky 등); WO02/079255 (Reff & Davies); 미국 특허 번호 6,171,586 B1, 및 WO98/56418 (Lam 등); WO98/58964 (Raju, S.); WO99/22764 (Raju, S.); WO99/51642, 미국 특허 번호 6,194,551 B1, 미국 특허 번호 6,242,195 B1, 미국 특허 번호 6,528,624 B1 및 미국 특허 번호 6,538,124 (Idusogie 등); WO00/42072 (Presta, L.); WO00/67796 (Curd 등); WO01/03734 (Grillo-Lopez 등); 미국 출원 번호 US 2002/0004587 A1 및 WO01/77342 (Miller & Presta); 미국 출원 번호 US2002/0197256 (Grewal, I.); 미국 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L.); 미국 특허 번호 6,090,365 B1, 6,287,537 B1, 6,015,542, 5,843,398, 및 5,595,721 (Kaminski 등); 미국 특허 번호 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108, 및 6,120,767 (Robinson 등); 미국 특허 번호 6,410,391B1 (Raubitschek 등); 미국 특허 번호 6,224,866 B1 및 WO00/20864 (Barbera-Guillem. E.); WO01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO00/67795 (Goldenberg); 미국 출원 번호 US 2003/01339301 A1 및 WO00/74718 (Goldenberg & Hansen); WO00/76542 (Golay 등); WO01/72333 (Wolin & Rosenblatt); 미국 특허 번호 6,368,596 B1 (Ghetie 등): 미국 출원 번호 US2002/0041847 A1 (Goldenberg, D.); 미국 출원 번호 US2003/0026801 A1 (Weiner & Hartmann); WO02/102312 (Engleman. E.); 미국 특허 출원 번호 2003/0068664 (Albitar 등); WO03/002607 (Leung, S.); WO 03/049694 및 US 2003/0185796 A1 (Wolin 등) ; WO03/061694 (Sing & Siegall); US 2003/0219818 A1 (Bohen 등); US 2003/0219433 A1 및 WO 03/068821 (Hansen 등)이 포함되고, 이들 각각은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다. 미국 특허 번호 5,849,898 및 EP 출원 번호 330,191 (Seed 등); 미국 특허 번호 4,861,579 및 EP332,865 A2 (Meyer & Weiss); 미국 특허 번호 4,861,579 (Meyer 등) 및 WO95/03770 (Bhat 등)을 또한 참조한다.
리툭시맵으로의 치료법에 관련된 공개문헌으로는 하기의 것들이 포함된다: [Perotta and Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B (1998)]; [Stashi et al., "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98(4):952-957 (2001)]; [Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 Apr., 2001)]; [Leandro et al., "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61:833-888 (2002)]; [Leandro et al., "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis & Rheumatism 44(9):S370 (2001)]; [Leandro et al., "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis & Rheumatism 46(1):2673-2677 (2002)]; [Edwards and Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology 40:205-211 (2001)]; [Edwards et al., "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem. Soc. Trans. 30(4):824-828 (2002)]; [Edwards et al., "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatism 46(9):S197 (2002)]; [Levine and Pestronk "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52:1701-1704 (1999)]; [DeVita et al., "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46:2029-2033 (2002)]; [Hidashida et al., "Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab"] (<Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; October 24-29; New Orleans, La. 2002>에서 발표됨); [Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab"] (<Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; October 24-29; New Orleans, La. 2002>에서 발표됨). [Sarwal et al., N. Eng. J. Med. 349(2):125-138 (July 10, 2003)]에는 DNA 마이크로어레이(microarray) 프로파일링(profiling)에 의해 확인된 급성 신장 동종이식편 거부에서의 분자 이질성이 보고되어 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은 인간화 2H7 항-CD20 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 인간화 2H7 항체는 표 2에 열거된 항체이다.
Figure pat00001
표 2의 항체 변이체 A, B 및 I 각각은 하기의 경쇄 가변 서열 (VL):
Figure pat00002
; 및
하기의 중쇄 가변 서열 (VH):
Figure pat00003
을 포함한다.
표 2의 항체 변이체 C, D, F 및 G 각각은 하기의 경쇄 가변 서열 (VL):
Figure pat00004
; 및
하기의 중쇄 가변 서열 (VH):
Figure pat00005
을 포함한다.
표 2의 항체 변이체 H는 서열 3 (상기)의 경쇄 가변 서열 (VL) 및 하기의 중쇄 가변 서열 (VH)을 포함한다:
Figure pat00006
.
표 2의 항체 변이체 A, B 및 I 각각은 하기의 전장 경쇄 서열을 포함한다:
Figure pat00007
.
표 2의 변이체 A는 하기의 전장 중쇄 서열을 포함한다:
Figure pat00008
.
표 2의 변이체 B는 하기의 전장 중쇄 서열을 포함한다:
Figure pat00009
.
표 2의 변이체 I는 하기의 전장 중쇄 서열을 포함한다:
Figure pat00010
.
표 2의 항체 변이체 C, D, F, G 및 H 각각은 하기의 전장 경쇄 서열을 포함한다:
Figure pat00011
.
표 2의 변이체 C는 하기의 전장 중쇄 서열을 포함한다:
Figure pat00012
.
표 2의 변이체 D는 하기의 전장 중쇄 서열을 포함한다:
Figure pat00013
.
표 2의 변이체 F는 하기의 전장 중쇄 서열을 포함한다:
Figure pat00014
.
표 2의 변이체 G는 하기의 전장 중쇄 서열을 포함한다:
Figure pat00015
.
표 2의 변이체 H는 하기의 전장 중쇄 서열을 포함한다:
Figure pat00016
.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간화 2H7 항체는 IgG Fc 내의 아미노산 변경을 더 포함하고, 야생형 IgG Fc가 있는 항체에 비해 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 바람직하게는 100배 이상, 더욱 바람직하게는 125배 이상, 더욱 더 바람직하게는 150배 내지 170배 이상만큼 증가된 인간 FcRn에 대한 결합 친화력을 나타낸다.
IgG 내의 N-글리코실화 부위는 CH2 도메인 내의 Asn297이다. 본 발명의 인간화 2H7 항체 조성물은 Fc 영역이 있는 상기 인간화 2H7 항체들 중 임의의 것의 조성물을 포함하고, 이때 조성물 내의 항체의 약 80-100％ (바람직하게는 약 90-99％)는 당단백질의 Fc 영역에 부착된, 푸코스가 없는 성숙형 코어(core) 탄수화물 구조를 포함한다. 이같은 조성물은 인간 IgG와의 상호작용에서 Fc(RIIIA (V158)만큼 효과적이지 않은 Fc(RIIIA(F158)에 대한 결합에서 의외의 개선을 나타내는 것으로 본원에서 실연되었다. Fc(RIIIA (F158)은 정상적인 건강한 흑인 및 백인종에서 Fc(RIIIA (V158)보다 더욱 통상적이다. [Lehrnbecher et al., Blood 94:4220 (1999)] 참조. 역사적으로, 가장 통상적으로 사용되는 산업용 숙주들 중 하나인 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에서 생산된 항체는 집단 내에 약 2 내지 6％의 비-푸코실화 항체를 함유한다. 그러나, YB2/0 및 Lec13은 78 내지 98％ 비-푸코실화 종이 있는 항체를 생산할 수 있다. [Shinkawa et al., J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)]에서, FUT8 활성이 더 적은 YB2/0 및 Lec13 세포에서 생산된 항체가 시험관 내에서 유의하게 증가된 ADCC 활성을 나타낸다는 것이 보고되었다. 푸코스 함량이 감소된 항체의 생산이, 예를 들어, [Li et al., (GlycoFi) "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris", in Nature Biology online publication 22 Jan. 2006]; [Niwa R. et al., Cancer Res. 64(6):2127-2133 (2004)]; US 2003/0157108 (Presta); US 6,602,684 및 US 2003/0175884 (Glycart Biotechnology); US 2004/0093621, US 2004/0110704, US 2004/0132140 (모두 Kyowa Hakko Kogyo)에 또한 기술되어 있다.
이중특이적 인간화 2H7 항체는 항체의 한쪽 팔에는 본 발명의 인간화 2H7 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 적어도 항원 결합 영역이 있고, 다른쪽 팔에는 제2 항원에 대한 V 영역 결합 특이성이 있는 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원은 CD3, CD64, CD32A, CD16, NKG2D 또는 기타 NK 활성화 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항-HER2 항체
뮤린 HER2 항체 4D5의 재조합 인간화 버젼 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, 트라스투주맵 또는 HERCEPTIN®; 미국 특허 번호 5,821,337)은 광범위한 기존의 항암 치료를 받은 HER2-과발현 전이성 유방암 환자에서 임상적으로 활성이다 ([Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)]). 트라스투주맵은 종양이 HER2 단백질을 과발현하는 전이성 유방암 환자의 치료에 대해 1998년 9월 25일 식품 의약청 (FDA)에서 시판이 허가되었다. 2006년 11월에, FDA는 헤르셉틴을 HER-2-양성, 결절-양성 유방암 환자의 애주번트 치료용으로, 독소루비신, 시클로포스파미드 및 파클리탁셀을 함유하는 치료 요법의 일부로서 허가하였다.
한 실시양태에서, 항-HER2 항체는 하기의 VL 및 VH 도메인 서열을 포함한다:
인간화 2C4 버젼 574 항체 VL (서열 16)
Figure pat00017
및 인간화 2C4 버젼 574 항체 VH (서열 17)
Figure pat00018
.
또다른 실시양태에서, 항-HER2 항체는 각각 도 21 및 도 22에 제시된 바와 같은 트라스투주맵의 VL (서열 18) 및 VH (서열 19) 도메인 서열을 포함한다.
다양한 성질이 있는 기타 HER2 항체들이 [Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937 (1991)]; [McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989)]; [Maier et al., Cancer Res. 51:5361-5369 (1991)]; [Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990)]; [Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691 -8695 (1991)]; [Bacus et al., Cancer Research 52:2580-2589 (1992)]; [Xu et al., Int. J. Cancer 53:401-408 (1993)]; WO94/00136; [Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771-2776 (1992)]; [Hancock et al., Cancer Res. 51:4575-4580 (1991)]; [Shawver et al., Cancer Res. 54:1367-1373 (1994)]; [Arteaga et al., Cancer Res. 54:3758-3765 (1994)]; [Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992)]; 미국 특허 번호 5,783,186; 및 [Klapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997)]에 기술되어 있다.
항-VEGF 항체
항-VEGF 항체는, 예를 들어, 하기의 서열들을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하기의 VL 서열 (서열 20):
Figure pat00019
; 및
하기의 VH 서열 (서열 21)을 포함한다:
Figure pat00020
.
또다른 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하기의 VL 서열 (서열 22):
Figure pat00021
; 및
하기의 VH 서열 (서열 23)을 포함한다:
Figure pat00022
.
세번째 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하기의 VL 서열 (서열 24):
Figure pat00023
; 및
하기의 VH 서열 (서열 25)을 포함한다:
Figure pat00024
.
항-CD11a 항체
인간화 항-CD11a 항체 에팔리주맵 또는 랍티바(Raptiva)® (미국 특허 번호 6,037,454)는 건선의 치료에 대해 2003년 10월 27일 식품 의약청에서 시판이 허가되었다. 한 실시양태에서 하기의 HuMHM24의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항-인간 CD11a 항체가 제공된다:
VL (서열 26):
Figure pat00025
; 및
VH (서열 27):
Figure pat00026
.
항-인간 CD11a 항체는 서열 27의 VH 및 하기 서열의 HuMHM24의 전장 경쇄:
Figure pat00027
, 또는
상기의 경쇄 및 하기 서열의 중쇄를 포함할 수 있다:
Figure pat00028
.
또한 DR5 수용체에 대한 항체 (항-DR5)가 본 발명에 따라 생산될 수 있다. 이같은 항-DR5 항체에는 PCT 공개 번호 WO 2006/083971에 개시된 모든 항체 변이체, 예컨대 아포맵 1.1, 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 5.2, 5.3, 6.1, 6.2, 6.3, 7.1, 7.2, 7.3, 8.1, 8.3, 9.1, 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2, 8.2, 9.2, 1.3, 2.2, 3.3, 4.3, 5.3, 6.3, 7.3, 8.3, 9.3, 및 25.3으로 지명된 항-DR5 항체, 특히 아포맵 8.3 및 아포맵 7.3, 바람직하게는 아포맵 7.3이 특히 포함된다. WO 2006/083971의 전체 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
3. 기타 디술피드-함유 단백질
항체에 더하여, 디술피드 결합을 포함하는 또다른 폴리펩티드들의 제작에서 본 발명의 방법의 유용성이 발견된다. 이같은 폴리펩티드의 대표적인 예로는 하기의 치료적 단백질들이 비제한적으로 포함된다: 조직 플라스미노겐 활성화제 (t-PA), 예컨대 인간 조직 플라스미노겐 활성화제 (htPA, 알테플라제, ACTIVASE®), 심근경색증 치료용 혈전용해제; 단일-볼루스(bolus) 투여를 위한 반감기가 연장되고 피브린 특이성이 있는 ht-PA 변이체인 TNKase™; 아동 및 성인에서의 성장 호르몬 결핍의 치료를 위한 재조합 인간 성장 호르몬 (rhGH, 소마트로핀, NUTROPIN®, PROTROPIN®); 및 낭성 섬유증 (CF)의 치료를 위한 재조합 인간 데옥시리보뉴클레아제 I (DNase I).
디술피드를 함유하는 생물학적으로 중요한 단백질의 예로는 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬이 포함되는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄: 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자와 같은 응고 인자; 단백질 C와 같은 항-응고 인자; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA)와 같은 플라스미노겐 활성화제; 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (정상적으로 발현 및 분비된 T-세포 활성화에 대한 조절); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민; 뮐러리안-억제 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 베타-락타마제와 같은 미생물 단백질; DNase; IgE; CTLA-4와 같은 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티스성 인자; 골-유래 향신경성 인자 (BDNF)와 같은 향신경성 인자, 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); aFGF 및 bFGF와 같은 섬유모세포 성장 인자: 표피 성장 인자 (EGF); TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5 포함)와 같은 형질전환 성장 인자 (TGF); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD40과 같은 CD 단백질; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP): 인터페론-알파, -베타, 및 -감마와 같은 인터페론; 예를 들면 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF와 같은 콜로니 자극 인자 (CSF); 예를 들면 IL-1 내지 IL-10과 같은 인터루킨 (IL): 과산화물 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 가속화 인자; 예를 들면 AIDS 외피의 일부분과 같은 바이러스 항원; 운송 단백질; 호밍 수용체; 어드레신; 조절 단백질; CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM과 같은 인테그린; HER2, HER3 또는 HER4 수용체와 같은 종양 관련 항원; 및 상기 열거된 폴리펩티드들 중 임의의 것의 단편이 포함된다.
4. 항체의 재조합 생산을 위한 일반적인 방법
재조합 DNA 기술의 주지된 기술에 의해 본원에서의 항체 및 기타 재조합 단백질이 생산될 수 있다. 따라서, 상기에서 구체적으로 확인된 항체들을 제외하고, 예를 들어, 하기에 기술된 기술들을 사용하여, 당업자는 관심 항원에 대해 지시된 항체를 생성시킬 수 있다.
항원 선택 및 제조
본원에서의 항체는 관심 항원에 대해 지시된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 질환 또는 장애를 앓고 있는 포유동물에게 항체를 투여하는 것은 이러한 포유동물에서 치료적 이점을 초래할 수 있다. 그러나, 비-폴리펩티드 항원 (예컨대 종양-관련 당지질 항원; 미국 특허 5,091,178 참조)에 대해 지시된 항체가 또한 고려된다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 이는 막횡단 분자 (예를 들어 수용체) 또는 리간드 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원에는 하기 섹션 (3)에서 기술된 단백질들이 포함된다. 본 발명에 의해 포함되는 항체들에 대한 예시적인 분자 표적에는 CD 단백질 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD40; ErbB 수용체 패밀리의 구성원 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (이의 α 또는 β 서브유닛 포함) (예를 들어 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자 예컨대 VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체: 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, 또는 본원에서 언급된 기타 항원들 중 임의의 것이 포함된다. 상기 열거된 항체들이 결합하는 항원이 본원에서의 범주 내에 특히 포함된다.
가용성 항원 또는 이의 단편 (임의적으로, 또다른 분자에 접합됨)이 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예컨대 수용체에 대해, 이의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로서 사용될 수 있다. 별법적으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로서 사용될 수 있다. 이같은 세포는 천연 공급원 (예를 들어, 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 막횡단 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다.
항체를 제조하는데 유용한 기타 항원 및 이들의 형태가 당업자에게 명백할 것이다.
폴리클로날 항체
관련 항원 및 애주번트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 폴리클로날 항체가 동물에서 바람직하게 발생된다. 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (식중, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3배 용량의 프로인트 완전 애주번트와 합하고, 이 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 동물들을 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 애주번트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅시킨다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 혈청을 분석한다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅시킨다. 바람직하게는, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합된 동일한 항원의 접합체로 동물을 부스팅시킨다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합물로서 제조될 수 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적절하게 사용하여 면역 응답을 강화시킨다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체를 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터 또는 짧은꼬리 원숭이를 상기 기술된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발시킨다. 별법적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 그 후, 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 어버이 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는 함유하는 적절한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 어버이 골수종 세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 높은 수준의 안정적인 항체 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 <Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, California USA)>로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 <American Type Culture Collection (Rockville, Maryland USA)>으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기술되어 있다 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장 중인 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성이 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 결정된다.
원하는 특이성, 친화력 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적절한 배양 배지에는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다. 바람직하게는, 본원에 기술된 단백질 A 크로마토그래피 절차가 사용된다.
통상적인 절차 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함)을 이용하여 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA가 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이같은 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내에 놓을 수 있고, 그 후 이러한 벡터를 형질감염되지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다.
예를 들어, 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 번호 4,816,567; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합으로 연결시킴으로써 DNA를 또한 변형시킬 수 있다.
전형적으로, 이같은 비-면역글로불린 폴리펩티드가 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 또는 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여 항원에 대한 특이성을 갖는 한 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 또다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체가 생성된다.
추가적인 실시양태에서, [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기술된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 모노클로날 항체가 단리될 수 있다. [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체의 단리가 각각 기술되어 있다. 후속 간행물들에는 사슬 셔플링에 의한 고친화력 (nM 범위) 인간 항체의 생산 ([Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합형 감염 및 생체내 재조합 ([Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)])이 기술되어 있다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
인간화 및 인간 항체
인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 항체 내에 도입되어 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로는 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, Winter 및 공동 연구원의 방법 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen, et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 인간화를 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용될 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)을 선택하는 것은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 FR로서 받아들여진다 ([Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)]). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 ([Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)]).
항원에 대한 높은 친화력 및 기타 유리한 생물학적 성질을 유지시키면서 항체를 인간화시키는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 바람직한 방법에 따라, 어버이 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 어버이 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 프로세스에 의해 인간화 항체가 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형상 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이들의 정밀검사로 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 자신의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 달성되도록 수용자 및 수입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 수반된다.
별법적으로, 면역화 시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기술되었다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이같은 생식계열 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 [Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)] 참조. 파지-디스플레이 라이브러리로부터 인간 항체가 또한 유래될 수 있다 ([Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]; [Vaughan et al., Nature Biotech 14:309 (1996)]).
항체 단편
항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들이 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편이 이. 콜라이으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편이 형성될 수 있다 ([Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편이 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 또다른 기술들이 당업자에게 명백할 것이다. 또다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185 참조).
다중특이적 항체
다중특이적 항체에는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성이 있다. 이같은 분자들은 일반적으로는 2개의 항원에만 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체), 추가적인 특이성이 있는 항체 예컨대 삼중특이적 항체가 본원에서 사용되는 경우의 이러한 표현에 포함된다.
이중특이적 항체의 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 하고, 이때 두 사슬은 특이성이 상이하다 ([Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
WO 96/27011에 기술된 또다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄 (예를 들어, 타이로신 또는 트립토판)로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동"이 제2 항체 분자의 경계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교된 또는 "이종접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이같은 항체들은, 예를 들어, 원치 않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해서 제안되었다. 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 다수의 가교 기술과 함께, 적절한 가교제가 당업계에 주지되어 있고, 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성시키는 절차가 기술되어 있다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그후 Fab'-TNB 유도체들 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
최근의 진보로 이. 콜라이으로부터의 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이해졌고, 이를 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산이 기술되어 있다. 각각의 Fab' 단편이 이. 콜라이으로부터 별도로 분비되었고, 시험관내에서 지향성으로 화학적 커플링되어, 이중특이적 항체가 형성되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결시켰다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후, 다시 산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 별법적인 제조 메커니즘을 제공하였다. 동일한 사슬 상의 두 도메인이 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 단편들이 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루도록 강요됨으로써, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또다른 전략이 또한 보고되었다. [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조. 별법적으로, 항체가 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]에 기술된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 간략하게, 이러한 항체는 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 직렬 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
2가를 초과하는 항체가 구현된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
면역부착소
가장 단순하고 가장 간단한 면역부착소 디자인은 부착소의 결합 도메인(들) (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인 (ECD))을 면역글로불린 중쇄의 힌지 및 Fc 영역과 조합시키는 것이다. 통상적으로, 본 발명의 면역부착소를 제조할 때, 부착소의 결합 도메인을 코딩하는 핵산이 C-말단에서 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 융합될 것이지만, N-말단 융합물 또한 가능하다.
전형적으로, 이같은 방식으로, 코딩된 키메라 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 기능적으로 활성인 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 적어도 유지할 것이다. 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단에, 또는 중쇄의 CH1 또는 경쇄의 상응하는 영역에 대해 N-말단에 직접적으로 융합물이 만들어질 수도 있다. 융합물이 만들어지는 정확한 부위는 결정적이지 않다; 특정 부위들이 주지되어 있고, 면역부착소의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 부착소 서열이 면역글로불린 G1 (IgG1)의 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역을 부착소 서열에 융합시키는 것이 가능하다. 그러나, 더욱 바람직하게는, IgG Fc를 화학적으로 규정하는 파파인 절단 부위 (즉, 중쇄 불변 영역의 첫번째 잔기를 114로 간주했을 때 잔기 216), 또는 기타 면역글로불린의 유사 부위의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작되는 서열이 융합에서 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 부착소 아미노산 서열이 IgG 중쇄의 (a) 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 또는 (b) CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합된다.
이중특이적 면역부착소의 경우, 면역부착소들이 다량체로서, 특히 이종이량체 또는 이종사량체로서 조립된다. 일반적으로, 이러한 조립된 면역글로불린들은 공지된 단위 구조를 가질 것이다. 기본적인 4쇄 구조 단위가 IgG, IgD, 및 IgE가 존재하는 형태이다. 4쇄 단위가 분자량이 더 높은 면역글로불린에서 반복된다; 일반적으로 IgM은 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 4쇄 기본 단위들의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 때때로 IgG 글로불린 또한 혈청 내에서 다량체 형태로 존재할 수 있다. 다량체의 경우, 각각의 4쇄 단위는 동일하거나 상이할 수 있다.
본원의 범주 내의 다양한 예시적인 조립된 면역부착소들이 하기에서 개략적으로 도해된다:
ACL-ACL;
ACH-(ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH);
ACL-ACH-(ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH, 또는 VLCL-VHCH);
ACL-VHCH-(ACH, ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH);
VLCL-ACH-(ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH); 및
(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2
[식중, 각각의 A는 동일하거나 상이한 부착소 아미노산 서열을 나타내고;
VL은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
VH는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
CH는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
n은 1을 초과하는 정수이고;
Y는 공유결합 가교제의 잔기를 나타낸다].
간결하게 나타내기 위해, 상기의 구조는 주요 특색만을 제시하고, 면역글로불린의 연결 (J) 또는 기타 도메인을 나타내지 않으며, 디술피드 결합이 표시되지 않는다. 그러나, 이같은 도메인들이 결합 활성에 필요한 경우, 이들이 면역글로불린 분자 내에서 차지하는 통상적인 위치 내에 존재하도록 구축될 것이다.
별법적으로, 키메라 중쇄를 포함하는 면역글로불린이 수득되도록 부착소 서열이 면역글로불린 중쇄 서열과 경쇄 서열 사이에 삽입될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 힌지와 CH2 도메인 사이에서 또는 CH2 도메인과 CH3 도메인 사이에서, 면역글로불린의 각각의 팔 내의 면역글로불린 중쇄의 3' 말단에 부착소 서열이 융합된다. 유사한 구축물이 [Hoogenboom, et al., Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991)]에서 보고되었다.
면역글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 면역부착소에 필요하지는 않지만, 부착소-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유결합으로 회합되어, 또는 부착소에 직접 융합되어, 면역글로불린 경쇄가 존재할 수 있다. 전자의 경우, 전형적으로, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA가 부착소-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 공동-발현된다. 분비 시, 하이브리드 중쇄 및 경쇄가 공유결합으로 회합되어, 2개의 디술피드-연결 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조가 제공될 것이다. 이같은 구조의 제조에 적절한 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (1989년 3월 28일 허여)에 개시되어 있다.
인-프레임(in-frame)으로 부착소 부분을 코딩하는 cDNA 서열을 면역글로불린 cDNA 서열에 융합시킴으로써 면역부착소가 가장 편리하게 구축된다. 그러나, 게놈 면역글로불린 단편에 대한 융합이 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, [Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)]; 및 [Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)] 참조). 후자 유형의 융합은 발현을 위한 Ig 조절 서열의 존재를 필요로 한다. 혼성화에 의해 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해, 비장 또는 말초혈 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터의 공개된 서열을 기초로 IgG 중쇄 불변 영역을 코딩하는 cDNA를 단리할 수 있다. 면역부착소의 "부착소" 및 면역글로불린 부분을 코딩하는 cDNA들을 선택된 숙주 세포에서의 효율적인 발현을 지시하는 플리스미드 벡터 내로 일렬로 삽입한다.
하기의 실시예들은 설명적인 목적으로만 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 참고문헌은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.
실시예
실시예에서 언급된 시판되는 시약들은 달리 지시되지 않는 한 제조사의 설명서에 따라 사용되었다. 하기의 실시예에서, 그리고 명세서 전반에 걸쳐 ATCC 접속 번호에 의해 확인되는 세포들의 공급원은 <American Type Culture Collection> (Manassas, Virginia)였다.
실시예 1
재료 및 방법의 설명
하기의 재료 및 방법이 하기의 실시예 2-8에서 사용되었다.
재료
실험 실시예에서 기술된 실험에서 사용된 재료 및 장치들에는 하기의 것들이 포함된다: 스테인레스 스틸 바이알 (미니-탱크, Flow Components (Dublin, CA); 짧은 바이알 (50 cc) 및 긴 바이알 (55 cc)); 투석 튜빙 (Spectra/Por, 6-8000 MWCO, 카탈로그# 132645), 0.22 ㎛ 필터 (Millipore Millipak Gamma Gold 카탈로그# MPGL04GH2); 포스페이트 완충 염수 (PBS, EMD, 카탈로그# 6506); 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA, Sigma, 카탈로그# E4884); α-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADPH, Calbiochem, 카탈로그# 481973); 데히드로에피안드로스테론 (DHEA, TCI, 카탈로그# D0044); 황산구리 (Sigma, 카탈로그# C8027), 글루코스-6-포스페이트 (G6P, Calbiochem, 카탈로그# 346764); 오로티오글루코스 (ATG, USP, 카탈로그# 1045508); 오로티오말레이트 (ATM, Alfa Aesar, 카탈로그# 39740); 환원된 글루타티온 (GSH, J.T. Baker, 카탈로그# M770-01); 모노브로모비만 (mBB, Fluka, 카탈로그# 69898); 히스티딘 (J.T. Baker, 카탈로그# 2080-05); 황산나트륨 (J.T. Baker, 카탈로그# 3897-05); Trx (Sigma, 카탈로그# T8690); TrxR (Sigma, 카탈로그# T9698). 모든 화학물질 및 시약을 추가적으로 정제하지 않고 제공된 대로 사용하였다. 미니-탱크에서의 경시적 연구에서 사용하기 위해 EDTA (250 mM, pH 7.5), CuSO4 (10 mM), ATG (30 mM), ATM (30 mM), NADPH (75 mM), G6P (300 mM)의 모액을 제조하였다.
세포 배양액 (CCF)의 생성
각종 환원 연구를 위한 오크렐리주맵 CCF를 생성시키기 위해, 기존에 기술된 방법 ([Chaderjian et al., 2005])과 유사한 대표적인 소규모 발효 프로세스를 사용하였다. 간략하게, 피치 블레이드 임펠러가 설비된 3 ℓ 유리 교반 탱크 Applikon® 생물반응기가 오크렐리주맵 배지 성분과 함께 접종물-트레인(train) 및 생산 배양물용으로 사용되었다. 조정된 용해 산소 (DO), pH 및 온도 프로브로 생물반응기를 준비시켰다. DO, pH, 온도, 및 진탕 속도를 디지털 제어 유닛을 사용하여 오크렐리주맵 제작 프로세스의 규정된 파라메터로 제어하였다. 접종물-트레인 및 생산 배양물 양쪽 모두에 대한 작업 부피는 1.5 ℓ였다. 일일 샘플을 NOVA Bioprofile 혈액 기체 분석기에서 분석하여, pH 및 용해 산소에 대한 온-라인(on-line) 값의 정확도를 확실하게 할 뿐만 아니라 배양물 내의 글루코스, 락테이트, 암모늄, 글루타민, 글루타메이트 및 나트륨 농도를 모니터링하였다. 세포 성장, 생육력 및 역가를 모니터링하기 위해 일일 샘플을 또한 취하였다. ViCell을 사용한 시각적인 세포 카운트에 의해서, 뿐만 아니라 충전 세포 용적 (PCV)을 기초로 하여, 세포 성장을 측정하였다. ViCell 기기 상에서의 트립판 블루 배제에 의해 배양물 생육력을 결정하였다. 상등액 샘플을 HPLC-기반 방법에 의해 분석하여, 오크렐리주맵 역가 값을 측정하였다.
수확된 세포 배양액 (HCCF) 제조
Microfluidics HC-8000 균질화기를 사용하여 고압 균질화에 의해 CCF를 완전히 용해시켰다. 기기의 압력 조절기를 4,000-8,000 psi로 설정하였고, 단일 통과 후 완전한 세포 용해 (막 파괴)가 수득되도록 CCF를 균질화기를 통과시켜 흡인하였다. 시스템에 물을 퍼징하자마자 CCF 균질화물을 수집하였다. 균질화물을 원심분리 용기로 옮기고, 20℃에서 30분 동안 4,500 rpm으로 Sorval RC-3B 로터 원심분리기에서 원심분리하였다. 원심분리액을 따라낸 후, 심층 여과하였고, 실리콘 튜빙이 있는 연동 펌프를 사용하는 0.22 ㎛ 무균성 여과가 이어져서, 균질화된 CCF로부터 최종 HCCF가 생성되었다 (100％ 세포 용해). 별법적으로, CCF를 어떠한 균질화도 없이 발효기로부터 바로 원심분리한 후, 원심분리액을 무균성 0.22 ㎛ 필터로 여과하여, HCCF가 생성되었다.
미니-탱크 취급
모든 미니-탱크의 취급에서 층류 후드가 사용되었고, HCCF 인큐베이션 실험에서 사용된 모든 재료를 오토클레이빙하거나 70％ 이소프로판올을 사용하여 세정하여 박테리아 오염을 최소화하였다.
락테이트 데히드로게나제 분석법
락테이트 데히드로게나제 분석법에 대해서, [Babson & Babson (1973)] 및 [Legrand et al., (1992)]을 참조하고, 이들은 거명에 의해 본원에 포함된다.
투석 실험
오크렐리주맵의 환원을 야기하는 성분들이 소형 분자인지 또는 거대분자 (즉, 효소)인지 여부를 결정하기 위해 투석 실험을 수행하였다. 정제 및 제형된 오크렐리주맵 (30.2 ㎎/㎖)의 3 ㎖ 샘플을 24시간 동안 1 ℓ의 포스페이트 완충 염수 (PBS, 10 mM pH 7.2)에 대해 투석하였고, 8시간 후 PBS를 교환하였다. 그후, 오크렐리주맵 샘플의 농도를 280 nm에서의 흡광도를 사용하여 1 ㎎/㎖로 조정하였다. 사용하기 전에 분취량을 -70℃에서 보관하였다. 투석 튜빙을 하룻밤 동안 0.05％ 아지드 용액에서 수화시키고, 멸균수로 세정한 후 사용하였다. 3 ℓ 발효기로부터의 CCF의 균질화로부터 수득된 HCCF를 해동시키고, 연동 펌프를 사용하여 0.22 ㎛ Millipak 필터를 통과시켜 여과하였다. 6개의 짧은 미니-탱크에 각각 30 ㎖의 HCCF를 충전하였다. 각각의 미니-탱크에, 밀봉된 투석 튜빙 내의 500 ㎕의 오크렐리주맵 샘플을 첨가하였다. 미니-탱크를 밀봉하고, 35 rpm 및 주위 온도에서 작동되는 벤치 탑(bench top) 혼합기 (Barnstead Lab-Line MAX Q 4000) 내로 로딩하였다. 각각의 시점에 대해, 1개의 미니-탱크를 혼합기로부터 제거하였고, HCCF (미니-탱크 내) 및 오크렐리주맵 샘플 (투석 주머니 내)의 분취량을 취하여, 유리 티올 분석법 및 바이오분석기 분석법 (하기 기술됨)으로 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
소규모 시험관내 시스템에서의 환원에 대한 테스트 억제제
긴 미니-탱크에 27 ㎖의 HCCF를 충전하였다. 실험 디자인에 따라, 다양한 시약 (NADPH, G6P, G6PD 또는 TrxR의 억제제)를 원하는 농도로 첨가하였고, PBS (10 mM pH 7.2)로 미니-탱크 내의 최종 부피가 30 ㎖가 되게 하였다. 미니-탱크를 밀봉하고, 35 rpm 및 주위 온도에서 작동되는 벤치 탑 혼합기 내로 로딩하였다. 각각의 샘플링 시점에, 미니-탱크의 외부를 70％ IPA로 멸균하였고, 분취량을 제거하기 위해 층류 후드 내에서 개방하였다. 그후, 미니-탱크를 재밀봉하고, 벤치 탑 혼합기 내로 다시 로딩하였다. 모든 분취량을 유리 티올 분석법 및 바이오분석기 분석법 (하기 기술됨)으로 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
시험관내 Trx/Trx리덕타제 연구
시판되는 TrxR (래트 간) 용액 (4 μM)을 물로 희석하여 2.86 μM 용액이 산출되었다. 동결건조된 Trx (인간)를 PBS (10 mM, pH 7.2)로 재구성하여 500 μM 용액이 산출되었다. 20 mM NADPH의 용액 및 10 mM ATG 및 ATM 용액을 물에서 제조하였다.
흑색 폴리프로필렌 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브에서, 437 ㎕ PBS, 25 ㎕ NADPH, 16 ㎕의 제형된 오크렐리주맵 용액 (30.2 ㎎/㎖) 및 5 ㎕ Trx를 부드럽게 혼합하였다. 17.5 ㎕ TrxR의 첨가에 의해 반응이 시작되었다. 반응물을 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 샘플링 시점에 20 ㎕ 분취량을 취하여, 바이오분석기 분석법 (하기 참조)에 의해 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 대조군 실험을 수행하여, 동일한 부피의 PBS로 반응 혼합물 내의 Trx 및/또는 TrxR를 대체함으로써 효소가 생략되었을 때 효소 경로가 활성인지를 결정하였다.
5 ㎕ ATG 또는 ATM을 첨가하면서 상기 기술된 것과 동일한 반응 조건을 사용하여 Trx 시스템의 억제를 실연하였다. Cu2+에 의한 Trx 시스템의 억제를 실연하기 위해, 2.5 ㎕의 CuSO4 (10 mM)를 반응 혼합물에 첨가하였고, 이때 효소는 동일하였지만, 상이한 완충제 (10 mM 히스티딘, 10 mM Na2SO4, 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, pH 7.0)를 사용하여 불용성 Cu3(PO4)2의 형성을 방지하였다.
유리 티올 분석법
GSH를 사용하는 표준 곡선이 PBS (10 mM, pH 6.0±0.05)에서 생성되었다. 110 mM GSH 용액으로부터, 단계 희석을 통해 0, 5.5, 11, 22, 44, 55, 110 및 550 μM의 농도로 표준물을 제조하였다. mBB의 아세토니트릴 모액 (-20℃에서 보관된10 mM)으로부터, mBB의 100 μM 용액을 PBS (10 mM, pH 10.0±0.05)에서 제조하였고, 빛이 없는 곳에서 보관하였다.
바닥이 편평한 흑색 96웰 플레이트에서, 100 ㎕의 mBB를 각각의 웰 내로 분배하였다. 표준 곡선용으로, 10 ㎕의 표준 GSH 용액을 첨가하여 8.0 ± 0.2의 작업 pH가 산출되었다. 샘플용으로, 10 ㎕의 샘플을 웰에 첨가하였다. 모든 웰은 3중으로 제조되었다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 암실에서 인큐베이션한 후, 390 nm의 여기 파장 및 490 nm의 방출 파장으로 형광 플레이트 판독기 (Molecular Devices SpectraMax® Gemini XS)를 사용하여 판독하였다. GSH 농도에 대해 플롯팅된 3개의 표준 웰의 평균 결과를 사용하여 선형 표준 곡선이 생성되었다. 3개의 샘플 웰의 평균값을 사용하여 표준 곡선의 선형 방정식으로부터 샘플 내의 유리 티올 수준을 계산하였다.
바이오분석기 분석법
Agilent 2100 바이오분석기를 사용하여 모세관 전기영동 측정을 획득하였다. 약간 변화시키면서, <Agilent Protein 230 Assay Protocol> (편람 파트 번호 G2938-90052)에 기술된 대로 샘플 제조를 수행하였다. 제조 전에 물로 HCCF 샘플을 1:4 희석하였고, 단백질 A 샘플을 1.0 g/ℓ로 희석하였다. 변성 단계의 HCCF 샘플에 대해, 제공된 2 ㎕의 변성 용액에 더하여, 24 ㎕의 50 mM 요오도아세트아미드 (IAM), 0.5％ SDS 용액을 첨가하였다. 단백질 A 샘플에 대해, IAM이 없는 0.5％ SDS, 및 2 ㎕의 변성 용액을 사용하였다. Agilent 2100 Expert 소프트웨어를 사용하여 디지털 젤-유사 영상이 생성되었다.
HCCF 유지 시간 연구용 모액
3개의 별도의 모액들이 실험실 규모의 HCCF 유지 시간 연구에서 사용되었다: (1) EDTA, 2나트륨 2수화물 (Mallinckrodt, 카탈로그# 7727-06 또는 Sigma, 카탈로그# E-5134) 및 EDTA, 4나트륨 2수화물 (Sigma, 카탈로그# E-6511)을 사용하여 제조된 EDTA (pH 7.4)의 250 mM 모액, (2) 황산구리 5수화물 (CuSO4, Sigma, 카탈로그# C-8027)의 50 mM 모액, 및 (3) 1 M 아세트산 용액 (Mallinckrodt, 카탈로그# V193).
억제제 첨가 및 세포 배양액 (CCF) 블렌딩
항체 디술피드 환원을 방지하기 위한 최종 농도의 범위를 평가하기 위해 균질화 전에 CCF에 250 mM EDTA 또는 50 mM CuSO4의 모액을 첨가하였다. 일단 최종 HCCF가 균질화된 CCF로부터 생성되면, 희석하여 세포 용해의 전체 수준을 100％ 최대값 미만으로 감소시키기 위해, 이러한 용액을 균질화되지 않은 CCF (EDTA 또는 CuSO4를 또한 함유함)로부터 생성된 HCCF와 혼합하였다. 별법적으로, 1 M 아세트산의 모액을 최종적으로 블렌딩된 HCCF 용액 (균질화된 CCF 및 균질화되지 않은 CCF)에 첨가하여, 항체 디술피드 환원을 방지하도록 용액의 pH를 감소시켰다.
약 30 내지 50 ㎖의 각각의 HCCF 용액 (EDTA. CuSO4, 아세트산 함유, 또는 대조군용의 무첨가)을 50 ㎖ 316L 스테인레스 스틸 바이알에서 유지시켰다. 바이알을 집게로 밀봉하였고, 용액을 통기시키거나 진탕하지 않았다. 바이알을 실온 (18-22℃)에서 보관하였다. 미리 결정된 시점에, 용액을 제거하고, 실험실 규모의 단백질 A 친화성 수지 상에서 정제하였다.
기타 산화제, 예를 들어, 시스틴 및 산화된 글루타티온으로 유사한 결과를 수득할 수 있다.
공기 살포
항체 디술피드 환원을 방지하기 위한, 균질화된 CCF로부터 생성된 HCCF의 공기 살포를 평가하기 위해, 3ℓ 유리 또는 15ℓ 스테인레스 스틸 용기를 사용하였다. 약 1-5 ℓ의 HCCF를 각각의 무균 용기 내로 0.22 ㎛ 무균 여과하였다. 이산화탄소의 첨가에 의해 pH를 제어하면서 또는 제어하지 않으면서 18-22℃ 및 50 rpm (15ℓ 발효기) 또는 275 rpm (3ℓ 발효기) 진탕으로 실험 조건을 유지하였다. 용해 산소 수준을 공기 포화로 증가시키기 위해 공기를 용액에 살포하거나, 또는 용액 내의 모든 용해 산소를 제거하기 위해 질소 (대조군)를 용액에 살포하였다. 각각의 용기에 대한 기류는 일정한 통기 속도가 사용되는지 또는 최소 수준의 용해 산소가 유지되는지 여부에 따라 가변적이었다. 미리 결정된 시점에, 25-50 ㎖ 샘플을 양쪽 용기로부터 제거하고, 분석 전에 실험실 규모의 단백질 A 친화성 수지 상에서 정제하였다.
단백질 A 프로세싱
수확된 세포 배양액 샘플 내의 항체를 특정 친화성 크로마토그래피 수지를 사용하여 포획 및 정제할 수 있다. 단백질 A 수지 (Millipore, Prosep-vA High Capacity)를 항체 정제용 친화성 수지로 선택하였다. 4.8 ㎖ 최종 컬럼 부피가 생성되도록 내경이 0.66 cm인 유리 컬럼 (Omnifit®) 내에 14 cm의 층 높이로 수지를 패킹(packing)하였다. AKTA Explorer 100 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare)을 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다.
수지를 350 ㎝/시 내지 560 ㎝/시 사이의 선형 유속으로 완충제 및 HCCF에 노출시켰다. 수지를 25 mM 트리스(Tris), 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.1로 평형화시켰다. 각각의 정제에 대해, 수지 1 ㎖ 당 5 내지 15 mg 사이의 항체를 수지에 로딩하였다. 고정된 단백질 A HPLC 컬럼 (Applied Biosystems, POROS A)을 사용하여 HCCF 내의 항체 농도를 결정하였다. 로딩 후, 수지를 25 mM 트리스, 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5 M TMAC, pH 7.1로 세정한 후, 0.1 M 아세트산, pH 2.9를 사용하여 항체를 용출시켰다. 용출 풀링은 컬럼 후에 인라인(inline)으로 측정된 280 nm에서의 UV 흡광도를 기초로 하였다. 정제된 용출 풀의 pH를 1 M 소듐 HEPES를 사용하여 pH 5.0-5.5로 조정하였다. 0.1 M 인산으로 수지를 재생시킨 후, 또다른 HCCF 용액의 후속 정제를 위해 동일한 또는 유사한 패킹 수지를 사용하였다.
정제된 단백질 A 풀 내의 항체 농도를 280 nm에서의 UV 분광법을 사용하여 측정하였다. 정제된 단백질 A 용출 풀을 바이오분석기 분석법에 의해 분석하여, 150 kDa 분자량의 무손상 항체의 백분율을 정량하였다.
실시예 2
투석 실험
오크렐리주맵의 환원이 소형 환원 분자에 의해 또는 거대분자 (즉, 효소)에 의해 야기되는지를 결정하기 위해 투석 실험을 디자인하여 수행하였다. 이러한 투석 실험에서, 정제된 무손상 오크렐리주맵을 분자량 차단값 (MWCO)이 7000인 투석 주머니 내에 놓고, 투석 주머니를 스테인레스 스틸 미니-탱크 내의 오크렐리주맵을 함유하는 HCCF에서 인큐베이션하였다. 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, 주머니 내부의 오크렐리주맵은 인큐베이션 기간 후에 환원되지 않은 반면 (도 1), HCCF 내의 주머니 외부의 오크렐리주맵은 인큐베이션이 시작된 후에 곧 유의하게 환원되었다. 이는 무손상 오크렐리주맵 (약 150 kDa)의 손실 및 오크렐리주맵 단편 (중쇄 및 경쇄의 다양한 조합물)의 형성에 의해 증명되었다 (도 2). 환원된 제작 실행으로부터의 단백질 A 용출 풀 내의 오크렐리주맵의 질량 분광법 분석은 이러한 관찰된 단편들이 사슬간 디술피드 결합만 환원되는 것에 의해 형성되었음을 가리켰다.
유리 티올 측정은 인큐베이션을 시작할 때 투석 주머니 내부에 유리 티올이 존재하지 않았음을 나타냈다; 그러나, 투석 주머니 내부 및 외부의 유리 티올의 수준이 인큐베이션이 시작되고 나서 5시간 이내에 유사해졌고, 이는 HCCF 내의 소형 분자 성분이 투석 주머니의 내부와 외부에서 충분히 평형을 이룬다는 것을 가리킨다 (도 3). MWCO가 7000 Da인 투석 주머니의 외부에서만 환원이 관찰되었고 내부에서는 관찰되지 않았기 때문에, 환원 분자(들)의 분자량은 7000 Da을 초과하여야 한다. 따라서, 효소 반응이 오크렐리주맵의 환원을 담당한다.
실시예 3
시험관 내에서의 Trx/TrxR에 의한 오크렐리주맵 (rhuMAb 2H7, 변이체 A)의 환원
무손상 오크렐리주맵을 Trx, TrxR, 및 NADPH와 함께 인큐베이션함으로써 시험관 내에서 오크렐리주맵을 환원시키는 Trx 시스템의 능력에 대해 Trx 시스템을 테스트하였다. 바이오분석기 결과는 오크렐리주맵이 시험관 내에서 Trx 시스템에 의해 환원되었음을 가리켰다 (도 5). 이러한 시험관내 시스템의 환원 속도는 HCCF 내에서의 속도보다 느린 것으로 보인다 (예를 들어 도 2에 나타낸 환원과 비교했을 때). Trx 시스템의 반응 속도는 효소 농도 및 완충제 시스템 양쪽 모두에 의존적이기 때문에 이는 아마도 시험관내 반응에서 사용된 효소 (Trx 및 Trx-R)의 더 낮은 농도 및/또는 완충제 시스템으로 인해서일 것이다.
실시예 4
Trx 시스템의 억제제
(i) 황산구리에 의한 재조합 항체의 환원의 억제
황산 구리는 산화성 산화환원 전위를 제공하는 능력으로 공지되어 있고, 재조합 항체 분자 내의 유리 티올 수준을 최소화하기 위해 (즉, 쌍을 이루지 않은 시스테인 수준을 최소화하기 위해) 세포 배양 프로세스에서 사용되었다 ([Chaderjian et al., 2005, 상기 문헌]). 시험관 내에서의 Trx 시스템을 억제하고, 이에 따라 오클레리주맵의 환원을 억제하는 효능에 대해 황산구리를 테스트하였다. 이러한 시험관내 환원 실험에서, 불용성 Cu3(PO4)2의 형성을 피하기 위해 완충제 시스템을 PBS에서 히스티딘 술페이트로 교환하였다. 도 8은 히스티딘 술페이트 완충제 내의 Trx 시스템에 의해 오크렐리주맵이 쉽게 환원되었음을 나타낸다 (PBS 완충제 내에서보다 더욱 빠르게 환원되었음). 이러한 반응에 CuSO4를 첨가하는 것은 오크렐리주맵 환원을 명확하게 억제하였다 (도 9).
(ii) ATG 및 ATM에 의한 HCCF 내의 재조합 항체의 환원의 억제
TrxR의 2가지 시판되는 특이적 억제제인 오로티오글루코스 (ATG) 및 오로티오말레이트 (ATM)를 시험관 내에서 Trx 시스템을 억제하고 오크렐리주맵의 환원을 억제하는 능력에 대해 테스트하였다. ATG 및 ATM 양쪽 모두 상기 기술된 분석법에서 오크렐리주맵의 환원을 효과적으로 억제할 수 있었다 (도 6 및 7 참조). 도 5의 설명문에 기술된 것과 동일한 반응 혼합물에 1 mM의 농도로 오로티오글루코스 또는 오로티오말레이트를 첨가하는 것은 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상에 나타난 바와 같이 오크렐리주맵 환원을 효과적으로 억제하였다.
Trx 시스템이 제작 실행 (환원된 항체 분자가 초래됨)에서 또는 실험실 규모 실험에서 관찰된 바와 같이 HCCF에서 활성이었고 오크렐리주맵을 환원시켰다면, 양쪽 모두의 금 화합물 (ATG 및 ATM)은 HCCF에서의 오크렐리주맵의 환원을 억제할 수 있어야 한다. 도 10은 인큐베이션 기간 후 3ℓ 발효기로부터 생성된 균질화된 CCT로부터의 HCCF에서 오크렐리주맵이 쉽게 환원되었음을 나타낸다. 그러나, 1 mM ATG 또는 ATM이 HCCF에 첨가되었을 때 오크렐리주맵 환원 이벤트가 완전히 억제되었다 (도 11 및 12). 이러한 결과들은 Trx 시스템이 HCCF에서 활성이고 오크렐리주맵의 환원을 직접적으로 담당한다는 것을 실연하였다.
실시예 5
Trx 시스템 활성을 위한 NADPH의 공급원 및 환원 메커니즘에서의 G6P 및 글루코스의 역할
Trx 시스템에 의한 디술피드의 환원은 NADPH로부터의 환원 등가물을 필요로 한다 (도 4). 모든 환원성 생합성 반응에 NADPH를 제공하는 주요 세포 대사 경로는 펜토스 포스페이트 경로이다. 항체 환원 이벤트가 일어나려면, Trx 시스템이 활성이도록 유지시키기 위해 이러한 경로 내의 효소가 HCCF 내에서 여전히 활성이어야 한다. 최소한, 펜토스 포스페이트 경로 내의 첫번째 단계 (G6PD에 의해 촉매됨)이 활성이어서, NADP+를 NADPH로 환원시키면서 G6P를 6-포스포글루코노락톤으로 전환시켜야 한다. 또한, G6P은 HCCF 내의 헥소키나제 활성에 의해 글루코스 및 아데노신 5'-트리포스페이트 (ATP)로부터 생산될 것이다. 오크렐리주맵 환원의 전체적인 메커니즘이 도 4에 요약된다.
HCCF 내의 환원 활성은 일부 경우에 일시적인 것으로 나타났고, 특정 보관 조건 하에 경시적으로 또는 다중 동결/해동 사이클 후에 억제될 수 있다. 환원 활성이 완전히 손실된 HCCF는 Trx 시스템에 의한 오크렐리주맵의 환원에서의 NADPH 및 G6P의 역할을 연구할 위한 기회를 제공하였다.
대규모 제작 실행 ("베타" 실행)으로부터의 HCCF에 수회의 동결/해동 사이클을 적용하고, 환원을 측정하도록 디자인된 실험에서 사용하였다; 동일한 발효로부터 신선하게 해동된 HCCF에서 앞서 나타난, 항체 환원을 일으키는 능력에도 불구하고, 오크렐리주맵 환원이 관찰되지 않았다 (도 13). NADPH가 이러한 비-환원 HCCF에 5 mM의 농도로 첨가되었고, 환원 이벤트가 복원되었다 (도 14). 따라서, 환원이 더 이상 발생하지 않은 HCCF에서 Trx 시스템이 여전히 무손상이면서 활성이었고, 보조인자가 공급되면 단백질 및/또는 항체를 환원시킬 수 있었다. 추가적으로, Trx 시스템이 분해 또는 불활성화되었기 때문이 아니라, NADPH 공급원이 고갈됨에 따라 (아마도 NADPH에 대해 경쟁하는 환원성 반응 모두에 의한 NADPH의 산화로 인해), 환원 활성이 경시적으로 손실되었다.
또다른 실험에서 이것이 증명되었다. 10 mM G6P를 베타 실행으로부터 반복적으로 동결-해동된 HCCF에 첨가하였다. 이러한 G6P 첨가는 Trx 시스템을 재활성화시켰고, 이에 따라 Trx 시스템이 HCCF 인큐베이션 실험에서 오클렐리주맵을 환원시켰다 (도 15). 이는 HCCF 내의 오클렐리주맵의 환원이 Trx 시스템 및 G6PD 양쪽 모두의 활성에 의해 야기되었음을 실연하였다. 또한, 베타 실행의 반복적으로 동결/해동된 HCCF에서 G6PD가 여전히 활성이었다; 이러한 반복적으로 동결/해동된 HCCF 베타 실행에서의 환원 활성의 손실은 G6P가 고갈되고, 따라서 G6P의 고갈이 NADP+→ NADPH로의 전환을 제거하기 때문인 것으로 보인다.
본 발명가들의 연구에서, 본 발명가들은 EDTA가 HCCF 인큐베이션 실험에서 오크렐리주맵 환원을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 관찰하였다. 도 16에 나타난 바와 같이, 19시간을 초과하여 주위 온도에서 12,000ℓ 규모의 오크렐리주맵 제작 실행으로부터의 HCCF (반복적으로 동결/해동되지 않았고, 환원 활성이 손실되지 않음)를 인큐베이션한 후 오크렐리주맵이 환원되었다. 그러나, 20 mM EDTA가 12 ㎘ HCCF에 첨가되고 별도의 스테인레스 스틸 미니탱크에서 유지되었을 때 환원이 완전히 억제되었다 (도 17). 당분해의 첫번째 단계에서, 헥소키나제가 Mg2+-ATP로부터 글루코스로의 포스페이트 기의 전달을 촉매하고, 이 반응은 Mg2+와 ATP의 착물형성을 필요로 한다 ([Hammes & Kochavi, 1962a & 1962b, 상기 문헌]). EDTA는 금속 이온 킬레이터, 특히 Mg2+에 대한 킬레이터이기 때문에, 이는 헥소키나제의 효과적인 억제제일 수 있다. 과량의 EDTA가 효과적으로 환원을 차단할 수 있다는 관찰은 오크렐리주맵 환원 메커니즘에서 헥소키나제 (즉, G6P를 제공함)가 수반된다는 것을 가리킨다. 이러한 이론 또는 어떠한 다른 이론에도 속박되지 않으면서, 헥소키나제 활성을 제거하고, 따라서 G6PD에 이용가능한 G6P 수준, 그리고 이어서 Trx 시스템에 이용가능한 NADPH 수준을 감소시킴으로써, EDTA는 오크렐리주맵의 환원을 차단한다.
EDTA가 신선한 HCCF에서의 오클렐리주맵의 환원을 차단하는데 매번 효과적이지만, Trx 시스템 활성이 손실된 후 G6P의 첨가에 의해 재활성화된 베타 실행 HCCF에서의 오클렐리주맵의 환원을 방지할 수 없었다. 예를 들어, 환원 활성이 완전히 손실된 베타 실행 HCCF에 5 mM G6P 및 20 mM EDTA (최종 농도)가 첨가된 HCCF 인큐베이션 실험에서 오크렐리주맵의 환원이 관찰되었다 (도 18). 그러나, G6P 및 EDTA가 첨가되지 않은 대조군 인큐베이션 실험에서는 환원이 나타나지 않았다. 이러한 이론 또는 어떠한 다른 이론에도 속박되지 않으면서, 이러한 방식으로 사용된 EDTA는 따라서 Trx 시스템 또는 G6PD를 억제할 수 없고, G6PD용으로 G6P를 생산하는 헥소키나제에 대한 억제제로서 기능할 수 있다. G6P가 없으면, Trx 시스템은 활성을 위한 필요한 NADPH를 공급받을 수 없을 것이다.
실시예 6
DHEA에 의한 재조합 항체의 환원의 억제
데히드로에피안드로스테론 (DHEA), 뿐만 아니라 유사한 기타 G6PD 억제제들은 G6PD 활성을 효과적으로 차단한다 ([Gordon et al., 1995, 상기 문헌]). NADPH의 생성을 차단함으로써, G6PD 억제제는 HCCF 내의 항체, 예를 들어, 오크렐리주맵의 환원을 또한 방지한다. 오크렐리주맵의 환원을 억제하는 DHEA의 능력이 HCCF 인큐베이션 실험에서 실연되었다. DHEA를 HCCF에 첨가하는 것이 항체 환원을 방지하였다.
DHEA는 전형적으로 약 0.05 mM 내지 약 5 mM의 농도 범위로 사용되었다. DHEA는 약 0.1 mM 내지 약 2.5 mM의 농도 범위로 또한 전형적으로 사용되었다.
실시예 7
(i) EDTA, (ii) 황산구리, 및 (iii) 아세트산 첨가에 의한 재조합 항체의 환원의 억제
4개의 상이한 HCCF를 스테인레스 스틸 바이알에서 보관하여 유지시켰다. 용액들은 세포 용해의 양 면에서 유사하였고, 이들은 균질화된 CCF로부터의 HCCF를 균질화되지 않은 CCF로부터의 HCCF로 희석함으로써 생성되었다. 예를 들어, 최초로 용해된 용액 150 ㎖를 제2 용액 50 ㎖와 각각 혼합하였다. 이러한 연구에서 평가된 4가지 HCCF 혼합물은 (1) 20 mM EDTA, (2) 30 μM CuSO4, 또는 (3) 15 mM 아세트산 (pH 5.5)을 함유하였고, (4) 대조군 용액에 대해서는 화학적 억제제가 처감되지 않았다. 4개의 혼합물 모두로부터의 오크렐리주맵 항체를 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 즉각적으로 정제한 후 (t = 0시간), 스테인레스 스틸 바이알에서의 20시간 및 40시간의 보관 후 다시 정제하였다. 정제된 단백질 A 용출 풀을 바이오분석기 분석법에 의해 분석하여, 무손상 항체 (150 kDa)의 백분율을 정량하였다. 결과는 90％를 초과하는 무손상 항체가 최초의 시점에 4개의 혼합물 모두 내에 존재하였음을 나타냈다 (도 19). 그러나, 20시간 시점에, 무손상 항체가 대조군 혼합물 (첨가물 없음)에서 검출되지 않았고, 이는 항체 디술피드 결합의 환원을 가리킨다. 3개의 다른 혼합물에서는, 90％를 초과하는 무손상 항체가 20시간 및 40시간 시점 양쪽 모두에 여전히 검출되었고, 이는 테스트된 3개의 억제제 모두에 의한 디술피드 결합 환원의 방지를 실연한다.
실시예 8
HCCF에 공기를 살포하는 것에 의한 재조합 항체의 환원의 억제
균질화된 CCF로부터 생성된 1개의 HCCF 혼합물을 2개의 분리된 10ℓ 스테인레스 스틸 발효기에서 보관하여 유지시켰다. 1개의 용기에는 공기를 살포한 반면, 다른 용기에는 질소 기체를 살포하였다. 오크렐리주맵 항체를 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 최초의 혼합물로부터 즉각적으로 정제하였다 (t = 0시간). 선택된 시점에, 50 ㎖ 샘플을 각각의 용기로부터 제거하고, 항체를 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 그후, 정제된 단백질 A 용출 풀을 바이오분석기 분석법에 의해 분석하여, 150 kDa의 무손상 항체의 백분율을 정량하였다. 결과는 약 85％의 무손상 항체가 최초의 용액 내에 존재하였음을 나타냈고 (도 20), 이는 산소 (즉, 발효기 내의 살포된 공기)에의 노출 전의 항체 디술피드 결합의 약간의 초기 환원을 가리킨다. 일단 혼합물에 공기가 2시간 동안 살포되면, 90％를 초과하는 무손상 항체가 나머지 36시간 연구에 대해 관찰되었다. 대조적으로, 혼합물에 질소 기체가 살포된 경우에는, 2시간 (28％ 150 kDa 피크) 및 6시간 (5％ 150 kDa 피크)에 측정했을 때 항체 환원 이벤트가 계속되었다. 이러한 결과들은 균질화된 CCF로부터 생성된 HCCF 혼합물이 산소에 노출되었을 때 항체에서의 디술피드 결합 환원이 방지되는 것을 실연하였다.
실시예 9
표적화 siRNA 또는 안티센스 뉴클레오티드 Trx 억제제의 디자인
CHO 세포에서 발견되는 바와 같은 유전자에 대한 표적화된 siRNA 또는 안티센스 뉴클레오티드의 디자인을 공개적으로 입수가능한 서열들 예컨대 이. 콜라이 타이오레독신 TrxA (서열 30), 이. 콜라이 타이오레독신 리덕타제 TrxB (서열 31); 마우스 타이오레독신 1 (서열 32), 마우스 타이오레독신 2 (서열 33), 마우스 타이오레독신 리덕타제 1 (서열 34), 및 마우스 타이오레독신 리덕타제 2 (서열 35)에 대한 것들을 사용함으로써 수행할 수 있다. 당업자는 상이한 생물 및/또는 세포, 예컨대 CHO 세포 내의 효소들을 표적화하기 위한 Trx 억제제를 디자인하기 위한 서열을 선택하기 위해 이러한 서열을 사용할 수 있다.
이. 콜라이 타이오레독신 TrxA의 서열은 하기와 같다:
Figure pat00029
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이. 콜라이 타이오레독신 TrxB의 서열은 하기와 같다:
Figure pat00030
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마우스 타이오레독신 1의 서열은 하기와 같다:
Figure pat00031
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마우스 타이오레독신 2의 서열은 하기와 같다:
Figure pat00032
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마우스 타이오레독신 리덕타제 1의 서열은 하기와 같다:
Figure pat00033
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마우스 타이오레독신 리덕타제 2의 서열은 하기와 같다:
Figure pat00034
.
실시예 10
시험관내 Trx/Trx 리덕타제 연구
재료 및 방법
2.86 μM 용액이 산출되도록 상업용 TrxR (래트 간) 용액 (4 μM)을 물로 희석하였다. 동결건조된 Trx (인간)를 PBS (10 mM, pH 7.2)로 재구성하여, 500 μM 용액을 산출시켰다. 20 mM NADPH의 용액 및 10 mM ATG 및 ATM 용액을 물에서 제조하였다.
흑색 폴리프로필렌 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브에서, 437 ㎕ 반응 완충제 (10 mM 히스티딘, 10 mM Na2SO4, 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, pH 7.0), 25 ㎕ NADPH, 16 ㎕의 제형된 오크렐리주맵 용액 (30.2 ㎎/㎖) 및 5 ㎕ Trx를 부드럽게 혼합하였다. 17.5 ㎕ TrxR의 첨가에 의해 반응이 시작되었다. 반응물을 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 샘플링 시점에 20 ㎕ 분취량을 취하여, 바이오분석기 분석법에 의해 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
다양한 억제제를 첨가하면서 상기 기술된 것과 동일한 반응 조건을 사용하여 Trx 시스템의 억제를 실연하였다.
1. 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성
도 24는 무손상 오크렐리주맵 (상기에서 "변이체 A"로 칭해진, 인간화 항-CD20 항체인 "2H7") (1 ㎎/㎖)을 10 mM 히스티딘 술페이트 완충제 내의 0.1 μM TrxR (래트 간), 5 μM Trx (인간) 및 1 mM NADPH와 함께 인큐베이션하는 것이 1시간 미만 내에 오크렐리주맵의 환원을 초래하였음을 나타내는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상을 나타낸다 (각각의 레인은 시점을 나타냄).
2. 오로티오글루코스에 의해 억제된 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성
오로티오글루코스 (ATG)을 상기 기술된 오크렐리주맵 혼합물에 하기의 농도로 첨가하였다: 1 mM; 0.6 μM (6:1 ATG:TrxR); 0.4 μM (4:1 ATG:TrxR); 및 0.2 μM (2:1 ATG:TrxR).
도 25-27에 나타난 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상에 의해 증명되는 바와 같이, 1 mM, 0.6 μM, 및 0.4 μM의 농도로 첨가된 오로티오글루코스는 타이오레독신 시스템에 의한 오크렐리주맵의 환원을 효과적으로 억제하였다. 그러나, 도 28에 나타난 바와 같이, 이러한 실험 조건 하에 0.2 μM의 농도로 첨가된 오로티오글루코스는 24시간 후에 오크렐리주맵 환원을 억제할 수 없었다.
3. 오로티오말레이트에 의해 억제된 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성
오로티오말레이트 (ATM)를 상기 기술된 오크렐리주맵 혼합물에 0.1 mM 및 0.01 mM의 농도로 첨가하였다. 도 29 및 30에 나타난 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상에 의해 증명되는 바와 같이, 테스트된 양쪽 농도 모두에서 ATM이 타이오레독신 시스템에 의한 오크렐리주맵의 환원을 효과적으로 억제하였다.
4. CuSO 4 에 의해 억제된 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성
CuSO4를 상기 기술된 오크렐리주맵 혼합물에 20 μM (4:1 Cu2+:Trx) ; 10 μM (2:1 Cu2+:Trx); 및 5 μM (1:1 Cu2+:Trx)의 농도로 첨가하였다. 도 31-33에 나타난 바와 같이, CuSO4가 20 μM 및 10 μM의 농도에서 오크렐리주맵의 타이오레독신-유도 환원을 효과적으로 억제하였지만 (도 31 및 32), 5 μM 농도는 완전한 환원 억제를 초래하는데 불충분하였다 (도 33).
5. 시스타민에 의해 억제된 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성
시스타민을 상기 기술된 오크렐리주맵 혼합물에 하기의 농도로 첨가하였다: 532 μM (20:1 시스타민:2H7 (변이체 A) 디술피드); 266 μM (10:1 시스타민:2H7 (변이체 A) 디술피드); 133 μM (5:1 시스타민:2H7 디술피드); 및 26.6 μM (1:1 시스타민:2H7 (변이체 A) 디술피드). 도 34-37에 나타난 바와 같이, 시스타민이 532 μM (20:1 시스타민:2H7 (변이체 A) 디술피드) 및 266 μM (10:1 시스타민:2H7 (변이체 A))의 농도에서 오크렐리주맵의 타이오레독신-유도 환원을 효과적으로 억제하였지만 (도 34 및 35), 133 μM (5:1 시스타민:2H7 (변이체 A) 디술피드) 및 26.6 μM (1:1 시스타민:2H7 (변이체 A) 디술피드) 농도는 24시간 후 오크렐리주맵의 환원을 억제하는데 불충분하였다 (도 36 및 37).
6. 시스틴에 의해 억제된 타이오레독신 시스템의 시험관내 활성
시스틴을 상기 기술된 오크렐리주맵 혼합물에 2.6 mM의 농도로 첨가하였다. 도 38에 나타난 바와 같이, 이러한 농도에서, 시스틴이 타이오레독신 시스템에 의한 오크렐리주맵의 환원을 효과적으로 억제하였다. 시스틴의 최소 유효 농도가 (또다른 억제제들의 유효 최소 농도와 같이) 실제 상황에 좌우되고, 상이한 단백질들, 예컨대 항체들에 대해 상이할 수 있으며, 첨가 시점에 따라 변할 수 있다는 것을 유념한다. 따라서, 예를 들어, 시스틴이 용해 전에 첨가되면, 최소 유효 농도는 항체 2H7 (변이체 A)에 대해 약 1.3 mM, 아포맵에 대해 약 1 mM, 항체 변이체 C에 대해 약 4.5 mM이다. 시스틴이 세포 배양 배지에 첨가되는 경우, 최소 유효 농도는 전형적으로 약간 더 높고, 2H7 (변이체 A)에 대해 약 5.2 mM, 아포맵에 대해 6 mM, 항체 변이체 C에 대해 9 mM이다. 일반적으로, 시스틴, 시스타민 및 산화된 글루타티온 (하기 참조)에 대해, 최소 유효 억제 농도는 항체 농도 (μM 단위)의 약 40×이다.
7. 산화된 글루타티온 (GSSG)에 의해 억제된 타이오레독신 시스템의 시험관 내 활성
GSSG를 상기 기술된 오크렐리주맵 혼합물에 2.6 mM의 농도로 첨가하였다. 도 39에 나타난 바와 같이, 이러한 농도에서, GSSG이 타이오레독신 시스템에 의한 오크렐리주맵의 환원을 효과적으로 억제하였다. 그러나, 산화된 글루타티온의 최소 유효 농도가 (다른 억제제들의 것과 같이) 실제 상황, 예를 들어, 생산된 단백질 (예를 들어 항체)의 성질 및 첨가 시점에 좌우된다는 것을 유념한다. 예를 들어, 2H7 (변이체 A)에 대해, 용해 전에 첨가되는 경우 최소 유효 농도는 약 1.3 mM이다.
8. 효소적 환원 시스템의 시험관내 활성
도 40은 무손상 오크렐리주맵 (인간화 항-CD20 항체인 "2H7", 변이체 A) (1 ㎎/㎖)을 pH 7.38로 완충된 50 mM 히스티딘 술페이트 내의 10 ㎍/㎖ 헥소키나제, 50 ㎍/㎖ 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 5 μM 타이오레독신, 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제, 2 mM 글루코스, 0.6 mM ATP, 2 mM Mg2+, 및 2 mM NADP와 함께 인큐베이션하는 것이 약 1시간 내에 오크렐리주맵의 환원을 초래하였음을 나타내는 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상을 나타낸다 (각각의 레인은 시점을 나타냄). 공지된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 억제제인 0.1 mM HDEA의 첨가는 환원을 억제하지 않았다.
9. 효소적 환원 시스템의 시험관내 활성이 NADPH를 필요로 한다
도 41의 바이오분석기 분석으로부터의 디지털 젤-유사 영상에 나타난 바와 같이, 무손상 오크렐리주맵 (1 ㎎/㎖)을 pH 7.38의 50 mM 히스티딘 술페이트 완충제 내의 5 μM 타이오레독신, 0.1 μM 타이오레독신 리덕타제, 및 2 mM NADP와 함께 인큐베이션하는 것은 오크렐리주맵 항체의 환원을 초래하지 않았다. NADPH를 생성시키기 위한 헥소키나제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 및 이들의 기질 없이는 오크렐리주맵의 환원이 발생할 수 없었다.
본원에서 설명적으로 기술된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적절하게 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는(comprising)", "포함되는(including)", "함유하는" 등은 개방적으로, 비제한적으로 읽혀져야 한다. 추가적으로, 본원에서 사용된 용어 및 표현은 설명의 의미로 사용되었고, 제한적이지 않으며, 이같은 용어 및 표현의 사용에는 제시된 본 발명 또는 이의 일부분의 임의의 등가물을 배제하려는 의도가 없고, 청구된 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태 및 선택 사항들에 의해 구체적으로 개시되었지만, 개시된 본원에서 구현된 본 발명의 변형 및 변동이 당업자에 의해 쉽게 이루어질 수 있고, 이같은 변형 및 변동이 본원에 개시된 본 발명의 범주 내인 것으로 간주된다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 본원에서 광범위하게 및 포괄적으로 기술되었다. 포괄적인 개시내용 내에 속하는 더 한정된 종 및 하위 그룹 각각 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 제거될 물질이 구체적으로 열거되었는지 여부와 상관 없이, 부류로부터 임의의 대상을 제거하는 것을 허용할 조건 또는 부정 제한을 각각의 본 발명의 포괄적인 설명 내에 포함한다. 또한, 발명의 특색 또는 양상이 마쿠쉬(Markush) 군의 관점에서 기술된 경우, 당업자는 마쿠쉬 그룹의 구성원들 중 임의의 개별적인구성원 또는 이들의 서브그룹의 관점에서 본 발명이 또한 기술된다는 것을 인지할 것이다. 또한, 예를 들어, '서열 1 내지 서열 100 (경계 포함)'과 같이, 본 발명의 양상에 대한 언급에서 일련의 개별적인 구성원들이 열거되는 경우, 목록의 모든 구성원을 개별적으로 열거하는 것과 등가인 것으로 의도되고, 추가적으로, 모든 개별적인 구성원이 개별적으로 청구항에서 배제되거나 청구항에 포함될 수 있음을 이해하여야 한다.
본원에서의 방법에서 서술되고/되거나 사용된 단계들은 서술되고/되거나 언급된 것과 상이한 순서로 수행될 수 있다. 단계들은 이러한 단계가 일어날 수 있는 순서의 예시일 뿐이다. 단계들은 청구된 발명의 목표를 여전히 수행하도록 임의의 원하는 순서로 일어날 수 있다.
본원에서의 본 발명의 설명으로부터, 다양한 등가물들이 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 본 발명의 개념을 실행하는데 사용될 수 있다는 것이 명백하다. 또한, 본 발명이 특정 실시양태들을 구체적으로 참조하여 기술되었지만, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에서 변화가 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 기술된 실시양태들은 모든 면에서 설명적이고, 제한적이지 않은 것으로 간주된다. 본 발명이 본원에 기술된 특정 실시양태에 한정되지 않고, 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 다수의 등가물, 재배열, 변형 및 치환이 가능하다는 것을 또한 이해하여야 한다. 따라서, 추가적인 실시양태들이 본 발명의 범주 및 하기의 청구항 내에 속한다.
본원에서 언급된 모든 미국 특허 및 출원; 외국 특허 및 출원; 과학 문헌; 도서; 및 간행물은, 각각의 개별적인 특허 또는 간행물 (도면, 도 및 표 포함)이 완전하게 기재된 것처럼 거명에 의해 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것과 같이, 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> PREVENTION OF DISULFIDE BOND REDUCTION DURING RECOMBINANT PRODUCTION OF POLYPEPTIDES <130> GNE-0246PCT <140> Not yet Assigned <141> Herewith <150> US 60/948,577 <151> 2007-07-09 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 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Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody <400> 24 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 25 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> 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tggtgtggac cttgcaaaat gatcaagccc 120 ttcttccatt ccctctgtga caagtattcc aatgtggtgt tccttgaagt ggatgtggat 180 gactgccagg atgttgctgc agactgtgaa gtcaaatgca tgccgacctt ccagttttat 240 aaaaagggtc aaaaggtggg ggagttctcc ggtgctaaca aggaaaagct tgaagcctct 300 attactgaat atgcctaa 318 <210> 33 <211> 501 <212> DNA <213> mus musculus <400> 33 atggctcagc ggctcctcct ggggaggttc ctgacctcag tcatctccag gaagcctcct 60 cagggtgtgt gggcttccct cacctctaag accctgcaga cccctcagta caatgctggt 120 ggtctaacag taatgcccag cccagcccgg acagtacaca ccaccagagt ctgtttgacg 180 acctttaacg tccaggatgg acctgacttt caagacagag ttgtcaacag tgagacacca 240 gttgttgtgg actttcatgc acagtggtgt ggcccctgca agatcctagg accgcggcta 300 gagaagatgg tcgccaagca gcacgggaag gtggtcatgg ccaaagtgga cattgacgat 360 cacacagacc ttgccattga atatgaggtg tcagctgtgc ctaccgtgct agccatcaag 420 aacggggacg tggtggacaa gtttgtgggg atcaaggacg aggaccagct agaagccttc 480 ctgaagaagc tgattggctg a 501 <210> 34 <211> 1494 <212> DNA <213> mus musculus <400> 34 atgaatggct ccaaagatcc ccctgggtcc tatgacttcg acctgatcat cattggagga 60 ggctcaggag gactggcagc agctaaggag gcagccaaat ttgacaagaa agtgctggtc 120 ttggattttg tcacaccgac tcctcttggg accagatggg gtctcggagg aacgtgtgtg 180 aatgtgggtt gcatacctaa gaagctgatg caccaggcag ctttgctcgg acaagctctg 240 aaagactcgc gcaactatgg ctggaaagtc gaagacacag tgaagcatga ctgggagaaa 300 atgacggaat ctgtgcagag tcacatcggc tcgctgaact ggggctaccg cgtagctctc 360 cgggagaaaa aggtcgtcta tgagaatgct tacgggaggt tcattggtcc tcacaggatt 420 gtggcgacaa ataacaaagg taaagaaaaa atctattcag cagagcggtt cctcatcgcc 480 acaggtgaga ggccccgcta cctgggcatc cctggagaca aagagtactg catcagcagt 540 gatgatcttt tctccttgcc ttactgcccg gggaagaccc tagtagttgg tgcatcctat 600 gtcgccttgg aatgtgcagg atttctggct ggtatcggct tagacgtcac tgtaatggtg 660 cggtccattc tccttagagg atttgaccaa gacatggcca acaaaatcgg tgaacacatg 720 gaagaacatg gtatcaagtt tataaggcag ttcgtcccaa cgaaaattga acagatcgaa 780 gcaggaacac caggccgact cagggtgact gctcaatcca caaacagcga ggagaccata 840 gagggcgaat ttaacacagt gttgctggcg gtaggaagag attcttgtac gagaactatt 900 ggcttagaga ccgtgggcgt gaagataaac gaaaaaaccg gaaagatacc cgtcacggat 960 gaagagcaga ccaatgtgcc ttacatctac gccatcggtg acatcctgga ggggaagcta 1020 gagctgactc ccgtagccat ccaggcgggg agattgctgg ctcagaggct gtatggaggc 1080 tccaatgtca aatgtgacta tgacaatgtc ccaacgactg tatttactcc tttggaatat 1140 ggctgttgtg gcctctctga agaaaaagcc gtagagaaat ttggggaaga aaatattgaa 1200 gtttaccata gtttcttttg gccattggaa tggacagtcc catcccggga taacaacaaa 1260 tgttatgcaa aaataatctg caaccttaaa gacgatgaac gtgtcgtggg cttccacgtg 1320 ctgggtccaa acgctggaga ggtgacgcag ggctttgcgg ctgcgctcaa gtgtgggctg 1380 actaagcagc agctggacag caccatcggc atccacccgg tctgtgcaga gatattcaca 1440 acgttgtcag tgacgaagcg ctctggggga gacatcctcc agtctggctg ctga 1494 <210> 35 <211> 1578 <212> DNA <213> mus musculus <400> 35 atggcggcga tggtggcggc gatggtggcg gcgctgcgtg gacccagcag gcgcttccgg 60 ccgcggacac gggctctgac acgcgggaca aggggcgcgg cgagtgcagc gggagggcag 120 cagagctttg atctcttggt gatcggtggg ggatccggtg gcctagcttg tgccaaggaa 180 gctgctcagc tgggaaagaa ggtggctgtg gctgactatg tggaaccttc tccccgaggc 240 accaagtggg gccttggtgg cacctgtgtc aacgtgggtt gcatacccaa gaagctgatg 300 catcaggctg cactgctggg gggcatgatc agagatgctc accactatgg ctgggaggtg 360 gcccagcctg tccaacacaa ctggaagaca atggcagaag ccgtgcaaaa ccatgtgaaa 420 tccttgaact ggggtcatcg cgtccaactg caggacagga aagtcaagta ctttaacatc 480 aaagccagct ttgtggatga gcacacagtt cgcggtgtgg acaaaggcgg gaaggcgact 540 ctgctttcag ctgagcacat tgtcattgct acaggaggac ggccaaggta ccccacacaa 600 gtcaaaggag ccctggaata tggaatcaca agtgacgaca tcttctggct gaaggagtcc 660 cctgggaaaa cgttggtggt tggagccagc tatgtggccc tagagtgtgc tggcttcctc 720 actggaattg gactggatac cactgtcatg atgcgcagca tccctctccg aggctttgac 780 cagcaaatgt catctttggt cacagagcac atggagtctc atggcaccca gttcctgaaa 840 ggctgtgtcc cctcccacat caaaaaactc ccaactaacc agctgcaggt cacttgggag 900 gatcatgctt ctggcaagga agacacaggc acctttgaca ctgtcctgtg ggccataggg 960 cgagttccag aaaccaggac tttgaatctg gagaaggctg gcatcagtac caaccctaag 1020 aatcagaaga ttattgtgga tgcccaggag gctacctctg ttccccacat ctatgccatt 1080 ggagatgttg ctgaggggcg gcctgagctg acgcccacag ctatcaaggc aggaaagctt 1140 ctggctcagc ggctctttgg gaaatcctca accttaatgg attacagcaa tgttcccaca 1200 actgtcttta caccactgga gtatggctgt gtggggctgt ctgaggagga ggctgtggct 1260 ctccatggcc aggagcatgt agaggtttac catgcatatt ataagcccct agagttcacg 1320 gtggcggata gggatgcatc acagtgctac ataaagatgg tatgcatgag ggagccccca 1380 caactggtgc tgggcctgca cttccttggc cccaacgctg gagaagtcac ccaaggattt 1440 gctcttggga tcaagtgtgg ggcttcatat gcacaggtga tgcagacagt agggatccat 1500 cccacctgct ctgaggaggt ggtcaagctg cacatctcca agcgctccgg cctggagcct 1560 actgtgactg gttgctga 1578

Claims (8)

  1. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 재조합 숙주 세포 배양물에서 항체를 발현시키는 단계, 및 과정 동안 항체 내의 디술피드 결합의 환원을 억제하기 위하여 세포 배양물의 생산 기 후 재조합 숙주 세포의 수확전 세포 배양액에 공기를 살포하는 단계를 포함하고, 여기서 항체는 치료적 모노클로날 항체이고, 공기를 살포하는 단계는 수확전 세포 배양액 내의 용해 산소 (dO2)의 양이 10% 이상이 될 때까지 계속되는 것인, 항체를 생산하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 숙주 세포에서 발현되는 항체가 5,000 L를 초과하는 규모로 생산되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 공기를 살포하는 단계가 수확전 세포 배양액이 공기로 30% 이상 포화될 때까지 계속되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 재조합 숙주 세포에서 발현되는 항체가 5,000 L를 초과하는 규모로 생산되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 공기를 살포하는 단계가 수확전 세포 배양액이 공기로 100% 포화 내지 30% 포화될 때까지 계속되는 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 수확전 세포 배양액 내의 용해 산소 (dO2)의 양이 30% 이상인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 재조합 숙주 세포의 수확된 세포 배양액을 제조하는 단계 및 수확된 세포 배양액으로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 수확된 세포 배양액을 제조하는 단계 및 수확된 세포 배양액으로부터 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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KR1020187010775A KR102055873B1 (ko) 2007-07-09 2008-07-08 폴리펩티드의 재조합 생산 동안의 디술피드 결합 환원의 방지
KR1020167023443A KR101851580B1 (ko) 2007-07-09 2008-07-08 폴리펩티드의 재조합 생산 동안의 디술피드 결합 환원의 방지
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KR1020197036352A KR20190140090A (ko) 2007-07-09 2008-07-08 폴리펩티드의 재조합 생산 동안의 디술피드 결합 환원의 방지

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US (11) US20090053786A1 (ko)
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JP (5) JP5687057B2 (ko)
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HU (4) HUE046992T2 (ko)
IL (6) IL202934B (ko)
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SI (4) SI3597659T1 (ko)
TR (1) TR201802088T4 (ko)
TW (4) TWI574974B (ko)
WO (1) WO2009009523A2 (ko)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL1692182T3 (pl) 2003-11-05 2010-09-30 Roche Glycart Ag Przeciwciała CD20 o zwiększonym powinowactwie wiązania z receptorem Fc oraz zwiększonej funkcji efektorowej
TW201516149A (zh) 2006-09-13 2015-05-01 Abbvie Inc 細胞培養改良
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
DK3597659T3 (da) 2007-07-09 2023-04-03 Genentech Inc Forhindring af disulfidbindingsreduktion under rekombinant produktion af polypeptider
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
TW201014605A (en) 2008-09-16 2010-04-16 Genentech Inc Methods for treating progressive multiple sclerosis
CN102257005A (zh) 2008-10-20 2011-11-23 雅培制药有限公司 在抗体纯化过程中的病毒灭活
CN105111309A (zh) 2008-10-20 2015-12-02 Abbvie公司 使用a蛋白亲和层析分离和纯化抗体
ES2864956T3 (es) * 2009-04-30 2021-10-14 Ablynx Nv Procedimiento para la producción de anticuerpos de dominio
EP2443150B1 (en) * 2009-06-17 2015-01-21 AbbVie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
ES2793348T3 (es) 2009-08-11 2020-11-13 Hoffmann La Roche Producción de proteínas en medios de cultivo celular libres de glutamina
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
US8937159B2 (en) * 2009-12-16 2015-01-20 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-HER2 antibodies and their uses
US20130028920A1 (en) * 2010-03-31 2013-01-31 Universite De Geneve Stabilized antibody preparations and uses thereof
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
CN101974535B (zh) * 2010-11-03 2012-12-19 北京天广实生物技术股份有限公司 新型抗ErbB2人源化抗体MIL12的制备及其应用
CA2821515A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-ngf compositions and use thereof
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
CN102911265B (zh) * 2011-08-05 2014-02-05 王革 一种人神经生长因子的重组变异体及其制备方法
MX365947B (es) * 2012-03-27 2019-06-19 Genentech Inc Operaciones de cosecha mejoradas para proteinas recombinadas.
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
US9650411B2 (en) 2012-08-07 2017-05-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method of purifying protein
AU2013309506A1 (en) 2012-09-02 2015-03-12 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9976163B2 (en) 2012-10-03 2018-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method for preventing reduction of polypeptide by adding amino acid to culture solution
US20140154255A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
SG11201507230PA (en) 2013-03-12 2015-10-29 Abbvie Inc Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
EP3800204A1 (en) 2013-04-16 2021-04-07 F. Hoffmann-La Roche AG Pertuzumab variants and evaluation thereof
WO2015009699A1 (en) * 2013-07-15 2015-01-22 Ketter Patrick Methods and compositions to prevent or treat bacterial infections
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
EP3077522A1 (en) * 2013-12-04 2016-10-12 Immunogen, Inc. Compositions and methods for antibody production
US9620278B2 (en) * 2014-02-19 2017-04-11 General Electric Company System and method for reducing partial discharge in high voltage planar transformers
US10647777B2 (en) * 2014-05-28 2020-05-12 Genzyme Corporation Methods of controlling the formation of disulfide bonds in protein solutions
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
AR103172A1 (es) * 2014-12-22 2017-04-19 Novartis Ag Reducción selectiva de residuos de cisteina en anticuerpos il-17
CA2938333A1 (en) * 2015-08-12 2017-02-12 Pfizer Inc. Capped and uncapped antibody cysteines, and their use in antibody-drug conjugation
US11098079B2 (en) 2015-08-13 2021-08-24 Amgen Inc. Charged depth filtration of antigen-binding proteins
BR112018013407A2 (pt) 2015-12-30 2018-12-18 Kodiak Sciences Inc anticorpos e conjugados dos mesmos
CN109311977B (zh) 2016-04-15 2022-06-14 H.伦德贝克公司 人源化的抗pacap抗体及其用途
EP3454890A4 (en) * 2016-05-10 2020-01-15 MedImmune, LLC PREVENTION OF PROTEIN DISULFIDE BOND REDUCTION
JP7181091B2 (ja) * 2016-05-10 2022-11-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ポリペプチドの組み換え産生中にトリスルフィド結合を減少させる方法
US10975409B2 (en) * 2016-06-10 2021-04-13 Lonza Ltd Method for stabilizing proteins
WO2018002036A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Zaklady Farmaceutyczne Polpharma Sa Recombinant production of monoclonal antibodies
CN106366160B (zh) * 2016-10-11 2019-06-14 厦门大学 基于二硫键精准配对构建富含二硫键多肽分子骨架的方法
WO2018091729A2 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Zaklady Farmaceutyczne Polpharma Sa Aqueous pharmaceutical formulations
JP7126269B2 (ja) 2016-11-30 2022-08-26 メレオ バイオファーマ ５ インコーポレイテッド Ｔｉｇｉｔ結合物質を含む、がんの処置のための方法
WO2018124189A1 (ja) 2016-12-28 2018-07-05 協和発酵キリン株式会社 細胞を選抜する方法
EP3615070A1 (en) 2017-04-26 2020-03-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods of antibody production that minimize disulfide bond reduction
US20230103511A1 (en) * 2017-05-09 2023-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Method of controlling the pink color generated during antibody manufacturing
US10913795B2 (en) * 2017-05-17 2021-02-09 Immunogen, Inc. Compositions and methods for antibody production
WO2019040671A1 (en) * 2017-08-22 2019-02-28 Biogen Ma Inc. METHODS OF PURIFYING ANTIBODIES HAVING REDUCED AGGREGATES OF HIGH MOLECULAR WEIGHT
TW201923069A (zh) * 2017-10-02 2019-06-16 美商拜耳保健有限責任公司 以亞硒酸鹽防止細胞培養收獲物中雙硫鍵還原之方法
TW201927335A (zh) * 2017-10-02 2019-07-16 美商拜耳保健有限責任公司 防止雙硫鍵於細胞培養收集物中還原之方法
US11447547B1 (en) 2017-12-13 2022-09-20 Amgen Inc. Method of antigen-binding protein production
CA3117430A1 (en) * 2018-05-04 2019-11-07 Sigma-Aldrich Co. Llc Engineered cells with modified host cell protein profiles
WO2020028616A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Lonza Ltd Methods for manufacturing recombinant protein comprising a disulfide bond
AU2019377526A1 (en) 2018-11-08 2021-06-10 Sutro Biopharma, Inc. E coli strains having an oxidative cytoplasm
US20220177818A1 (en) 2019-04-01 2022-06-09 The Automation Partnership (Cambridge ) Ltd. Operation process for a cell cultivation system
JP2022542863A (ja) 2019-07-24 2022-10-07 ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット 抗ｍＧｌｕＲ５抗体及びその使用
EP4041312A4 (en) 2019-10-10 2023-12-20 Kodiak Sciences Inc. METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER
CN113480652B (zh) * 2021-07-30 2023-04-07 成都景泽生物制药有限公司 一种重组cho细胞发酵培养生产重组egfr抗体活性分子的方法
WO2023049687A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods of controlling the level of dissolved oxygen (do) in a solution comprising a recombinant protein in a storage container
US20240092870A1 (en) * 2022-09-15 2024-03-21 Sanofi Methods of determining protein reduction susceptability

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060030022A1 (en) * 1999-10-05 2006-02-09 Jonathan Beckwith Compositions and methods for production of disulfide bond containing proteins in host cells

Family Cites Families (270)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US524474A (en) * 1894-08-14 Seed-planter
US670534A (en) * 1900-07-27 1901-03-26 Oliver L Carmical Seeding-machine and fertilizer-distributer.
US1369649A (en) * 1920-01-02 1921-02-22 George A Gieseler Pneumatic conveying mechanism
US2062295A (en) * 1932-11-22 1936-12-01 Niagara Sprayer And Chemical C Crop duster
US2171205A (en) * 1937-08-26 1939-08-29 Louis A Zinke Powder distributing attachment for tractors
US2193738A (en) * 1938-05-21 1940-03-12 Nat Conveyors Co Inc Pneumatic conveyer
US2559183A (en) * 1946-12-10 1951-07-03 Lawton L Barnett Transplanter drill set
US2671690A (en) * 1948-02-21 1954-03-09 Ehrenkrook Karl Von Forced air sprayer and duster
US2937049A (en) * 1949-10-18 1960-05-17 Osawa Hirosaburo Method of and an apparatus for carrying coals out of a vertical shaft with the aid of heavy liquid in the coal mine
US2814531A (en) * 1956-04-27 1957-11-26 Clough Equipment Co Balanced pneumatic conveying systems for pulverulent material
US3207560A (en) * 1962-12-26 1965-09-21 Monsanto Co Unloading device
US3197261A (en) * 1964-03-09 1965-07-27 Simpson Herbert Corp System for feeding and transporting materials
US3386474A (en) * 1965-05-26 1968-06-04 Chemagro Corp Diverter valve for finely divided solids
US3515315A (en) * 1966-01-24 1970-06-02 Kidd Designs Ltd Archie Combined seed and fertilizer drills for agricultural use
US3387895A (en) * 1966-12-29 1968-06-11 Combustion Eng Non-clogging splitter unit for dividing the flow of fluid-conveyed material
FR1558490A (ko) * 1967-12-27 1969-02-28
US3543704A (en) * 1968-08-05 1970-12-01 Deere & Co Seed planter
US3845702A (en) 1970-04-01 1974-11-05 Mies Filter Prod Inc Apparatus for cooking chicken
DE2440888C3 (de) * 1974-08-27 1978-11-23 Waeschle Maschinenfabrik Gmbh, 7980 Ravensburg Anlage zum aufeinanderfolgenden Beschicken mehrerer, hintereinander an eine pneumatische Förderleitung über Abscheider angeschlossener Entnahmestationen mit Schüttgut
US4049494A (en) 1975-09-04 1977-09-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Vaccine production process
US4036408A (en) * 1975-12-24 1977-07-19 Acf Industries, Incorporated Hopper having means for directing blasts of gas to a discharge outlet or the hopper
US4280419A (en) * 1977-03-21 1981-07-28 International Harvester Company Pneumatic system for conveying granular material
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4200412A (en) * 1978-04-20 1980-04-29 Dynamic Air Incorporated Control for pneumatic conveying system
US4264243A (en) * 1979-01-04 1981-04-28 Dundee Cement Company Constant vacuum barge unloading system
US4515893A (en) 1979-04-26 1985-05-07 Ortho Pharmaceutical Corporation Hybrid cell line for producing complement-fixing monoclonal antibody to human T cells
US4244522A (en) * 1979-08-31 1981-01-13 Deere & Company Liquid storage and distribution apparatus for agricultural implements
CA1126587A (en) * 1980-07-11 1982-06-29 Daniel W. Kelm Seed cup assembly
US4413935A (en) * 1981-06-29 1983-11-08 Combustion Engineering, Inc. Flow splitter for dividing a stream of pulverulent material into multiple streams
GB2112506A (en) * 1981-12-30 1983-07-20 Shell Int Research Distributing valve
US4943529A (en) 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
DE3239897A1 (de) * 1982-10-28 1984-05-03 Trützschler GmbH & Co KG, 4050 Mönchengladbach Verfahren und vorrichtung zur foerderung von faserfoermigen stoffen, insbesondere von in luft schwebend gefoerderten textilen faserflocken bei spinnereivorbereitungsmaschinen
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4620948A (en) 1982-12-22 1986-11-04 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
AU3145184A (en) 1983-08-16 1985-02-21 Zymogenetics Inc. High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4562779A (en) * 1984-01-26 1986-01-07 Briggs Manufacturing, Inc. Foldable drill implement
DE3420616A1 (de) * 1984-06-02 1985-12-05 Alb. Klein Gmbh & Co Kg, 5241 Niederfischbach Vorrichtung und verfahren zur steuerung eines schleusvorganges fuer ein haufwerk von schuettgutpartikeln
US5672347A (en) 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4572798A (en) 1984-12-06 1986-02-25 Cetus Corporation Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins
US4652630A (en) 1985-02-22 1987-03-24 Monsanto Company Method of somatotropin naturation
US5523215A (en) 1985-03-28 1996-06-04 Chiron Corporation Enhanced purification and expression of insoluble recombinant proteins
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4738770A (en) * 1985-11-25 1988-04-19 Cities Service Oil And Gas Corp. Apparatus and method of removal of catalyst blockage from reactor recycle pumps
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4779765A (en) * 1987-04-13 1988-10-25 Deere & Company Fertilizer divider for dual air system
US4793743A (en) * 1987-04-29 1988-12-27 Morris Rod-Weeder Company Ltd. Air seeder purging system
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
US5091313A (en) 1988-08-05 1992-02-25 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
US4872785A (en) * 1988-01-22 1989-10-10 Schrage Timothy L Shut-off means for air-actuated planter
US4843983A (en) * 1988-02-02 1989-07-04 Deere & Company Pneumatic manifold quick coupling
HUT53672A (en) 1988-02-25 1990-11-28 Gen Hospital Corp Quick immunoselective cloning process
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US4861579A (en) 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
WO1989012463A1 (en) 1988-06-21 1989-12-28 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
US4981952A (en) 1988-10-04 1991-01-01 Eli Lilly And Company Method for the purification of vitamin K-dependent proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DK167639B1 (da) * 1988-11-16 1993-12-06 Kongskilde Maskinfabrik As Maskine til saaning af granuleret materiale
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE394538T1 (de) 1989-04-28 1991-04-11 Rhein Biotech Ges. Fuer Biotechnologische Prozesse Und Produkte Mbh, 4000 Duesseldorf, De Hefezellen der schwanniomyces-gattung.
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
WO1991001367A1 (en) 1989-07-20 1991-02-07 Bioeng, Inc. Supercritical fluid disruption of and extraction from microbial cells
EP0414151B1 (en) 1989-08-21 1995-03-15 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of human nerve growth factor proteins
US5033914A (en) * 1989-09-29 1991-07-23 Cyclonaire Corporation High efficiency feeder apparatus for pneumatic conveying lines
ATE194651T1 (de) 1989-10-16 2000-07-15 Amgen Inc Stammzellenfaktor
GB2237288A (en) 1989-10-18 1991-05-01 Celltech Ltd Amplification of a heterologous gene in recombinant eukaryotic host cells
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
EP0547065B1 (en) 1990-06-29 2001-08-29 Large Scale Biology Corporation Melanin production by transformed microorganisms
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5069583A (en) * 1990-10-26 1991-12-03 Caldwell Lawrence G Device for changing flow paths in a pneumatic conveying system
GB2251249B (en) 1990-12-28 1995-06-21 Mogam Biotech Res Inst High-density medium for animal cell culture
US5494381A (en) * 1991-04-11 1996-02-27 The Young Industries, Inc. Apparatus and method for pneumatically conveying bulk materials
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
US5161473A (en) * 1991-05-17 1992-11-10 Deere & Company Seed distribution system and method for a seeding implement
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
DE69233716T2 (de) 1991-08-14 2008-10-30 Genentech Inc., San Francisco Immunglobulinvarianten für spezifische Fc-epsilon Rezeptoren
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU3144193A (en) 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
ATE295420T1 (de) 1992-02-06 2005-05-15 Chiron Corp Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5240355A (en) * 1992-05-22 1993-08-31 Nol-Tec Systems, Inc. Dense phase transporter pneumatic conveying system
AU687346B2 (en) 1992-06-30 1998-02-26 Oncologix, Inc. A combination of anti-erbB-2 monoclonal antibodies and method of using
US5456909A (en) 1992-08-07 1995-10-10 T Cell Sciences, Inc. Glycoform fractions of recombinant soluble complement receptor 1 (sCR1) having extended half-lives in vivo
CA2140280A1 (en) * 1992-08-17 1994-03-03 Avi J. Ashkenazi Bispecific immunoadhesins
ATE161192T1 (de) 1992-08-21 1998-01-15 Genentech Inc Verfahren zur behandlung einer durch lfa-1 vermittelten störung
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5379706A (en) * 1993-04-07 1995-01-10 Agco Corporation Seed distribution system for planters and drills
AU5752594A (en) * 1993-04-20 1994-11-03 Deere & Company Air separation tube for a pneumatic delivery system
US5407305A (en) * 1993-04-29 1995-04-18 Semco, Inc. Continuous dense phase conveying method utilizing high pressure gas at predetermined gas pressures within a conveying pipe
US5417972A (en) 1993-08-02 1995-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM
US5663304A (en) 1993-08-20 1997-09-02 Genentech, Inc. Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
CA2176811C (en) 1993-12-10 2008-01-29 David Tai Wai Fei Methods for diagnosis of allergy and screening of anti-allergy therapeutics
MX9602818A (es) 1994-01-18 1997-06-28 Genentech Inc Un metodo de tratamiento de infeccion parasitaria usando antagonistas ige.
WO1995023865A1 (en) 1994-03-03 1995-09-08 Genentech, Inc. Anti-il-8 monoclonal antibodies for treatment of inflammatory disorders
GB9413127D0 (en) 1994-06-30 1994-08-24 Philips Electronics Uk Ltd Data processing apparatus
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5575225A (en) * 1995-02-27 1996-11-19 Unverferth Manufacturing Company, Inc. Air-powered apparatus for filling grain drills and method of using same
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
DE19513676A1 (de) 1995-04-11 1996-10-17 Behringwerke Ag Cytoplasmatische Expression von Antikörpern, Antikörperfragmenten und Antikörperfragmentfusionsmolekülen in E.coli
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996036358A1 (en) * 1995-05-15 1996-11-21 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for inhibiting xenograft rejection
US5721121A (en) 1995-06-06 1998-02-24 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
US5830761A (en) 1995-06-07 1998-11-03 Genetics Institute, Inc. Medium and methods for culturing mammalian cho cells
AU6267896A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US5854067A (en) 1996-01-19 1998-12-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Hexokinase inhibitors
ATE222774T1 (de) 1996-01-23 2002-09-15 Genentech Inc Antikörper gegen cd 18 zur verwendung gegen gehirnschlag
US5813801A (en) * 1996-06-28 1998-09-29 Mac Equipment, Inc. Dense phase particulate conveying system and method with continuous air leakage management
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US5749682A (en) * 1996-09-10 1998-05-12 Renfro Corporation Article collection and distribution system
US5912327A (en) 1996-09-30 1999-06-15 Human Genome Sciences, Inc. Method of purifying chemokines from inclusion bodies
CA2269825A1 (en) 1996-10-24 1998-04-30 Kenneth Brigham Gene delivery and expression in areas inaccessible to direct protein delivery
BR9713055A (pt) 1996-11-15 2000-04-04 Genentech Inc Processo para isolar uma neurotrofina humana recombinante, composição de neurotrofina e processo para purificar uma neurotrofina
US6037454A (en) 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
EP1516629B1 (en) 1996-11-27 2013-04-03 Genentech, Inc. Humanized anti CD-11a antibodies
DE69739673D1 (de) * 1996-11-27 2009-12-31 Genentech Inc Affinitätsreinigung von Polypeptid-Proteinen auf einer Protein A Matrix
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
JP3957765B2 (ja) 1997-04-07 2007-08-15 ジェネンテク・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
US20020032315A1 (en) * 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
EP0981618B2 (en) 1997-05-15 2011-08-24 Genentech, Inc. Anti-apo-2 antibody
DK0999853T3 (da) 1997-06-13 2003-04-22 Genentech Inc Stabiliseret antostofformulering
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US5927217A (en) * 1997-06-16 1999-07-27 Conserva Pak Seeding Systems Metering particulate material
US6955917B2 (en) 1997-06-20 2005-10-18 Bayer Healthcare Llc Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies
EP0994903B1 (en) 1997-06-24 2005-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6368596B1 (en) 1997-07-08 2002-04-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
US5878679A (en) * 1997-08-18 1999-03-09 Deere & Company Product disconnect for metering device
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
KR100253916B1 (ko) 1997-12-29 2000-05-01 김충환 사람 인슐린 전구체의 제조방법
IL137177A0 (en) 1998-01-30 2001-07-24 Genesense Technologies Inc Oligonucleotide sequences complementary to thioredoxin or thioredoxin reductase genes and methods of using same to modulate cell growth
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2203141T3 (es) 1998-04-21 2004-04-01 Micromet Ag Polipeptidos cd19 x cd3 especificos y su utilizacion.
US6047652A (en) * 1998-05-12 2000-04-11 Case Corporation Seed planter distribution system
EP1241250A3 (en) 1998-05-15 2003-03-19 Genentech, Inc. Human dehydrogenase-like protein and nucleic acid encoding it
BR9913645A (pt) 1998-08-11 2001-09-25 Idec Pharma Corp Terapias combinadas para linfomas de células b compreendendo a administração de anticorpo anti-cd20
WO2000012537A1 (en) 1998-08-27 2000-03-09 Lg Chemical Limited Process for the preparation of active somatotropin from inclusion bodies
JP2002524104A (ja) * 1998-09-14 2002-08-06 ラース オースターガード ペダーセン 機能化免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質を製造する方法
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
US6298797B1 (en) * 1998-11-05 2001-10-09 Flexi-Coil Ltd. Nurse inductor apparatus for air seeders
AU761844C (en) 1998-11-09 2004-09-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of hematologic malignancies associated with circulating tumor cells using chimeric anti-CD20 antibody
TWI253934B (en) 1998-11-09 2006-05-01 Idec Pharma Corp Use of chimeric anti-CD20 antibody as in vitro or in vivo purging agent in patients receiving BMT or PBSC transplant
NZ539776A (en) 1999-01-15 2006-12-22 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
EP1035172A3 (en) 1999-03-12 2002-11-27 Fuji Photo Film Co., Ltd. Azomethine compound and oily magenta ink
EP1048732A1 (de) * 1999-04-26 2000-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen
EP1637160A3 (en) 1999-05-07 2006-05-03 Genentech, Inc. Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to B cell surface markers
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
PT1194167E (pt) 1999-06-09 2009-10-23 Immunomedics Inc Imunoterapia de doenças auto-imunitárias utilizando anticorpos que têm como alvo células b
ITMI991299A1 (it) 1999-06-11 2000-12-11 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite
DE19930748C2 (de) 1999-07-02 2001-05-17 Infineon Technologies Ag Verfahren zur Herstellung von EEPROM- und DRAM-Grabenspeicherzellbereichen auf einem Chip
CN101264324A (zh) 1999-07-12 2008-09-17 杰南技术公司 应用结合cd20的拮抗剂阻断对外来抗原的免疫应答
CA2379413A1 (en) 1999-07-30 2001-02-08 Genentech, Inc. Charged filtration membranes and uses therefor
WO2001010462A1 (en) 1999-08-11 2001-02-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of patients having non-hodgkins lymphoma with bone marrow involvement with anti-cd20 antibodies
US6451284B1 (en) 1999-08-11 2002-09-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Clinical parameters for determining hematologic toxicity prior to radioimmunotheraphy
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
AU6929100A (en) 1999-08-23 2001-03-19 Biocrystal Limited Methods and compositions for immunotherapy of b cell involvement in promotion ofa disease condition comprising multiple sclerosis
AUPQ296799A0 (en) 1999-09-20 1999-10-14 Unisearch Limited A cell-membrane impermeable trivalent organoarsenical derivative and use thereof
IL149116A0 (en) 1999-10-29 2002-11-10 Genentech Inc Anti-prostate stem cell antigen (psca) antibody compositions and methods of use
US20020006404A1 (en) 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US6426208B1 (en) 1999-11-12 2002-07-30 Harbor-Ucla Research And Education Institute Recombinant α-L-iduronidase, methods for producing and purifying the same and methods for treating diseases caused by deficiencies thereof
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
JP2003530316A (ja) 1999-12-22 2003-10-14 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ スクランブルした一本鎖ポリペプチドの抽出的再生法
AU2001247737A1 (en) 2000-03-24 2001-10-08 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma using a combination of an antibodyto cd20 and interleuking-2
US20030185796A1 (en) 2000-03-24 2003-10-02 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
EP1283722A1 (en) 2000-03-31 2003-02-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-cd20 for the treatment of b cell lymphoma
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
CA2405632A1 (en) 2000-04-25 2001-11-01 Idec Pharmaceutical Corporation Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas
US20030009301A1 (en) 2000-05-30 2003-01-09 M.B. Anand Integrated utility meter-reading, billing, payment and usage management system
WO2001097858A2 (en) 2000-06-20 2001-12-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Cold anti-cd20 antibody/radiolabeled anti-cd22 antibody combination
DE60139689D1 (de) 2000-06-22 2009-10-08 Univ Iowa Res Found Kombination von CpG und Antikörpern gegen CD19,CD20,CD22 oder CD40 zur Prävention oder Behandlung von Krebs.
CN1446104A (zh) 2000-07-12 2003-10-01 Idec药物公司 利用b细胞排除抗体和免疫调制抗体联合治疗b细胞恶性肿瘤的相关应用
US6548276B2 (en) 2000-09-06 2003-04-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced in vitro synthesis of active proteins containing disulfide bonds
US7041479B2 (en) * 2000-09-06 2006-05-09 The Board Of Trustess Of The Leland Stanford Junior University Enhanced in vitro synthesis of active proteins containing disulfide bonds
CN1592645A (zh) 2000-09-18 2005-03-09 拜奥根Idec公司 使用b细胞耗尽/免疫调节抗体组合治疗自身免疫病的联合疗法
US20040185535A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Giles Wilson Industrial-scale serum-free production of recombinant FVII in mammalian cells
WO2002034790A1 (en) 2000-10-20 2002-05-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
US20070292411A1 (en) * 2000-11-08 2007-12-20 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies That Immunospecifically Bind to TRAIL Receptors
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
CA2436092A1 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Modified antibodies and methods of use
US20030103971A1 (en) 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
CN1547586A (zh) 2001-02-23 2004-11-17 ���鹫˾ 提高的活性蛋白回收率
EP3088412B1 (en) * 2001-03-09 2021-05-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protein purification method
US20030040095A1 (en) 2001-03-16 2003-02-27 Achille Arini Method for the production of pharmaceutically active recombinant proteins
ES2364816T3 (es) 2001-04-02 2011-09-14 Genentech, Inc. Terapia de combinación.
JP2005500018A (ja) 2001-04-02 2005-01-06 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション ＧｎＴＩＩＩと同時発現する組換え抗体
WO2003061694A1 (en) 2001-05-10 2003-07-31 Seattle Genetics, Inc. Immunosuppression of the humoral immune response by anti-cd20 antibodies
EP1404813A4 (en) 2001-06-13 2004-11-24 Genentech Inc METHOD FOR CULTIVATING ANIMAL CELLS AND POLYPEPTIDE PRODUCTION IN ANIMAL CELLS
WO2002102312A2 (en) 2001-06-14 2002-12-27 Intermune, Inc. Combination therapy of gamma-interferon and b cell specific antibodies
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
CN1555411A (zh) 2001-08-03 2004-12-15 ���迨�����＼���ɷݹ�˾ 抗体-依赖性细胞毒性增大的抗体糖基化变体
ATE443259T1 (de) 2001-09-20 2009-10-15 Univ Texas Bestimmung der zirkulierenden therapeutischen antikörper, antigene sowie antigen-antikörper- komplexe mit elisa-tests
CN1309825C (zh) 2001-10-02 2007-04-11 诺和诺德医疗保健公司 在真核细胞中生产重组蛋白的方法
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US6852680B2 (en) 2001-10-26 2005-02-08 Ethyl Corporation Dithiocarbamates containing alkylthio and hydroxy substituents
US20060040348A1 (en) 2001-11-13 2006-02-23 Minmin Qin Methods for producing and purifying recombinant alpha-L-iduronidase
EP1463524A4 (en) 2001-12-07 2005-02-09 Chiron Corp THERAPEUTIC METHODS FOR TREATING NON-HODGKINIAN LYMPHOMA
GB0130955D0 (en) 2001-12-24 2002-02-13 Cancer Res Ventures Expression system
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003064621A2 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Ambion, Inc. HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
JP4498746B2 (ja) 2002-02-14 2010-07-07 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０抗体およびその融合タンパク質ならびに使用法
JP2005520569A (ja) * 2002-03-23 2005-07-14 リサーチ　ディベロップメント　ファンデーション バクテリア内で複数のジスルフィド結合を有する蛋白質の分泌とその利用
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
PL373256A1 (en) 2002-04-09 2005-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd. Cells with modified genome
WO2003102132A2 (en) 2002-04-26 2003-12-11 Genetech, Inc. Non-affinity purification of proteins
US20030219818A1 (en) 2002-05-10 2003-11-27 Bohen Sean P. Methods and compositions for determining neoplastic disease responsiveness to antibody therapy
US20040029229A1 (en) * 2002-05-20 2004-02-12 Reeves Philip J. High level protein expression system
WO2004001056A1 (en) 2002-06-24 2003-12-31 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Process for preparing g-csf
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
US7189811B2 (en) 2002-09-06 2007-03-13 National Institute Of Immunology Process for solubilization of recombinant proteins expressed as inclusion body
US8420789B2 (en) * 2002-09-11 2013-04-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for removing DNA contaminants from a protein-containing sample
AU2003286493A1 (en) 2002-10-18 2004-05-04 Abgenix, Inc. System and method for cleaving antibodies
US7169908B2 (en) 2003-01-09 2007-01-30 Genentech, Inc. Purification of polypeptides
PL212317B1 (pl) 2003-01-31 2012-09-28 Organon Nv Sposób izolacji bialka zawierajacego wiazania disulfidowe w natywnej konformacji
CA2515100A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-19 Micromet Ag Trimeric polypeptide construct to induce an enduring t cell response
EP3722309A1 (en) 2003-07-28 2020-10-14 Genentech, Inc. Reducing protein a leaching during protein a affinity chromatography
EP1673452B1 (en) 2003-10-10 2015-12-23 Novo Nordisk Health Care AG Method for large-scale production of a polypeptide in eukaryote cells
DE602005002829T2 (de) 2004-03-01 2008-07-10 Ares Trading S.A. Verwendung eines serumfreien zellkulturmediums zur produktion von il-18bp in säugerzellen
CN101065151B (zh) 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
US7435804B2 (en) 2004-10-19 2008-10-14 Phage Biotechnology, Inc. Method for obtaining single chain antibodies to human interferon α2b
CA2584137A1 (en) 2004-10-22 2006-06-08 Amgen Inc. Methods for refolding polypeptides
NZ554520A (en) 2004-10-22 2010-03-26 Amgen Inc Methods for refolding of recombinant antibodies
GB0425534D0 (en) 2004-11-19 2004-12-22 Celltech R&D Ltd Process for obtaining antibodies
JP2006186521A (ja) 2004-12-27 2006-07-13 Leader Electronics Corp チューナのビットエラーレート（ｂｅｒ）測定の方法および装置
US8029783B2 (en) 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
DOP2006000029A (es) 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
JP6088723B2 (ja) 2005-11-23 2017-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アッセイに関する組成物及び方法。
WO2007103521A2 (en) 2006-03-07 2007-09-13 Novartis Ag Preventing norvaline and norleucine misincorporation in recombinant proteins
TW201516149A (zh) * 2006-09-13 2015-05-01 Abbvie Inc 細胞培養改良
US9109015B2 (en) 2006-11-01 2015-08-18 Biogen Ma Inc Method of isolating biomacromolecules using low pH and divalent cations
MX2009006969A (es) 2006-12-29 2010-04-07 Gloucester Pharmaceuticals Purificacion de romidepsina.
US8467449B2 (en) * 2007-01-08 2013-06-18 Qualcomm Incorporated CAVLC enhancements for SVC CGS enhancement layer coding
US20100209434A1 (en) 2007-03-30 2010-08-19 Medimmune, Llc Antibody formulation
WO2008135498A2 (en) 2007-05-04 2008-11-13 Novo Nordisk A/S Prevention of protein degradation in mammalian cell cultures
DK3597659T3 (da) 2007-07-09 2023-04-03 Genentech Inc Forhindring af disulfidbindingsreduktion under rekombinant produktion af polypeptider
NZ582347A (en) 2007-07-12 2012-05-25 Timothea Miriam Murphy A hydroalcoholic fat emulsion and emulsifier for use therein
BRPI1010068A2 (pt) 2009-07-24 2016-03-15 Hoffmann La Roche "sistema agitador, dispositivo, método para cultivo de células animais, método para produzir um polipeptídeo, uso de um sistema agitador e dispositivos para cultivar células animais"
US9813410B2 (en) 2014-06-26 2017-11-07 Rakuten, Inc. Information processing apparatus, information processing method, and information processing program
JP2022506682A (ja) 2018-11-05 2022-01-17 アビスタ ファーマ ソリューションズ，インコーポレーテッド 化合物
IT201900007998A1 (it) 2019-06-04 2020-12-04 Benelli Armi Spa Calcio per arma

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060030022A1 (en) * 1999-10-05 2006-02-09 Jonathan Beckwith Compositions and methods for production of disulfide bond containing proteins in host cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biotechnology Progress, vol. 21(2), pp.550~553(2005) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2188302A2 (en) 2010-05-26
US20210095040A1 (en) 2021-04-01
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US20200317801A1 (en) 2020-10-08
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US11639395B2 (en) 2023-05-02
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WO2009009523A3 (en) 2009-05-14
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DE17196350T1 (de) 2018-12-27

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